Mutaciones y Citogenética molecular Taller de Citogenética y Evolución IES T-004 “Gral. T. de Luzuriaga” Normal Superior Tunuyán Mendoza Dr. Jorge Valdez
Temario
Mutaciones y Sustancias genotóxicas. Tests para identificación de compuestos genotóxicos. Citogenética molecular. Microscopia de Fluorescencia. Pintado de cromosomas. Sondas. Bandeo. Automatización en citogenética humana.
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Mutaciones génicas
Sustituciones de bases: cambio o sustitución de una base por otra en el ADN. – Transiciones: cambio de una purina (Pu) por otra purina, o bien cambio de una pirimidina (Pi) por otra pirimida. – Transversiones: cambio de una purina (Pu) por una pirimidina (Pi) o cambio de una pirimidina (Pi) por una purina (Pu).
Inserciones o adiciones y deleciones de nucleótidos: – Son ganancias de uno o más nucleótidos (inserciones o adiciones) y de pérdidas de uno o más nucleótidos (deleciones). Tienen como consecuencia cambios en el cuadro o pauta de lectura cuando el número de nucleótidos ganado o perdido no es múltiplo de tres.
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Mutaciones génicas
Duplicaciones: consiste en la repetición de un segmento de ADN del interior de un gen.
Inversiones: un segmento de ADN del interior de un gen se invierte, para ello es necesario que se produzcan dos giros de 180º , uno para invertir la secuencia y otro para mantener la polaridad del ADN.
Transposiciones: un segmento de un gen cambia de posición para estar en otro lugar distinto del mismo gen o en otro lugar del genoma.
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Sustancias genotóxicas
Sustancia dañina para el ADN. – Pueden unirse directamente al ADN o actuar indirectamente mediante la afectación de las enzimas involucradas en la replicación del ADN y causando, en consecuencia, mutaciones que pueden o no desembocar en un cáncer. – Las sustancias genotóxicas no son necesariamente cancerígenas, pero la mayor parte de los cancerígenos son genotóxicos.
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Klug, capítulo 15, punto 4. 15.4 Las mutaciones inducidas se producen por daños del DNA causados por agentes químicos y radiaciones.
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Mutágenos son agentes naturales o artificiales que inducen mutaciones. – Toxinas de hongos – Luz ultravioleta – Contaminantes industriales – Rayos X
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Análogos de Base pueden sustituir a las purinas o a las pirimidinas durante la síntesis de los ácidos nucleicos (Figure 15.5).
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Derivado del uracilo
Mutaciones y Citogen茅tica Molecular. Taller de Citog. y Evoluci贸n. IES Figure 16.5
Agentes alquilantes (Gases mostaza) Fue uno de los primeros grupos mutagénicos descubiertos. Estos agentes químicos ceden un grupo alquilo como CH3 o CH3-CH2 a grupos amino o ceto de los nucleótidos, alterando las afinidades de apareamiento .(Figure 16.6).
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Mutaciones y Citogen茅tica Molecular. Taller de Citog. y Evoluci贸n. IES Figure 16.6
El gas mostaza se usó en la 1er GM
La exposición al gas mostaza no es fatal. Mató a menos del 5% de las personas que estuvieron expuestas. Se presentan quemaduras de segundo y tercer grado, infecciones respiratorias, enfisema y cancer de pulmón y respiratorio.
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Colorantes de acridina
Causan mutaciones por cambio de marco de lectura, intercalando entre purinas y pirimidinas.
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http://web.educastur.princast.es/proyectos/biogeo_ov/2BCH/B4_INFORMACION/T411_MUTACIONES/informacion.htm
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Radiación UV
Crea dímeros de pirimidina entre dos residuos de timina que distorsionan la conformación del DNA y se tiende a crear errores durante la replicación (Figure 16.8).
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Mutaciones y Citogen茅tica Molecular. Taller de Citog. y Evoluci贸n. IES Figure 16.8
Ionizing radiation in la forma de rayos X , gamma rays, y cosmicos son mutagénicos (Figure 16.9).
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Mutaciones y Citogen茅tica Molecular. Taller de Citog. y Evoluci贸n. IES Figure 16.9
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Importancia de los estudios genotóxicos
El incremento en el grado de mutación de las células germinales (óvulos, espermatozoides y sus precursores) lo cual puede provocar el aumento de la incidencia de las enfermedades genéticas en futuras generaciones.
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Importancia de los estudios genotóxicos La existencia de una estrecha relación entre la inestabilidad genómica de células somáticas con el cáncer y las enfermedades degenerativas crónicas. El origen ambiental del cáncer.
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Tests para identificación de compuestos genotóxicos
Se conocen dos grupos de carcinógenos: – Inducción de daño genético Genotóxicos. – Otros que no parecen producir mutaciones.
Se detectan con bioensayos animales y pruebas de genotoxicidad.
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Regulación
ICH (Conferencia Internacional sobre la Armonización), OECD (Organización para la Cooperación y el Desarrollo) y EPA (Agencia para la Protección del Ambiente en Estados Unidos), exigen ensayos – in vitro que determine daño a nivel de genes, de elección el ensayo de Ames, – in vivo que determine daño a nivel de los cromosomas.
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Test de Ames El test de Ames se usa para asignar la mutagenicidad de un compuesto. El test de Ames usa cerca de una docena de cepas de Salmonella typhimurium seleccionadas por su incremento a la sensitividad a mutágenos y su habilidad de revelar la presencia de tipos específicos de mutaciones.
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Mutaciones y Citogen茅tica Molecular. Taller de Citog. y Evoluci贸n. IES Figure 16.10
Muchos carcinógenos conocidos se clasificaron como mutágenos fuertes por el test de Ames.
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Tests in vitro para identificación de compuestos genotóxicos
Ensayo de aberraciones cromosómicas en cultivo de linfocitos de sangre periférica humana. – Estudio in vitro que determina daño a nivel de cromosomas. – Las aberraciones estructurales pueden ser cromosómicas o cromatídicas. La mayoría de los mutágenos químicos dan lugar a aberraciones cromatídicas, aunque también pueden producirse aberraciones cromosómicas.
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Estudios genotóxicos in vivo Ensayo cometa en leucocitos de ratón. Micronúcleos de célula ósea. Morfología de la cabeza del espermatozoide.
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Ensayo cometa en ratón
Las rupturas de simple cadena y la formación de sitios lábiles al álcali en el ADN han sido parámetros ampliamente utilizados para la detección de genotoxicidad y han sido demostrados sus implicaciones en enfermedades degenerativas y el cáncer. En 1988 Singh y col. desarrollaron la variante alcalina de la electroforesis de células individuales (ensayo cometa), para la detección de este tipo de daño proporcionando por primera vez datos a nivel de célula individual siendo más rápido, sensible y económico con respecto a otros estudios genotoxicológicos como, intercambio de cromáticas hermanas, elusión alcalina y el ensayo de micronúcleos.
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Ensayo cometa en ratón
Supuesto efecto citotóxico del glifosato en linfocitos de ratón. La primer figura corresponde al control.
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Micronúcleos de médula ósea
Permite detectar lesiones provocadas por la sustancia de ensayo en los cromosomas o el aparato mitótico de eritroblastos mediante el análisis de eritrocitos tomados de la médula ósea y/o la sangre periférica de animales (por lo general roedores). Determina daño en los cromosomas en un sistema vivo. Los animales se someten a la sustancia y se extrae la médula a las cuatro semanas.
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Estudios in vivo. Morfología de la cabeza del espermatozoide Permite determinar la inducción de daño a nivel de las células germinales masculinas. La espermatogénesis manifiesta gran resistencia al daño.
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Tomado de http://www.sertox.com.ar/img/item_full/23003.pdf
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Ejemplo de ensayo de compuestos citotóxicos
Estudios de genotoxicidad de antibióticos antitumorales en células eucariotas – Alejandro D. Bolzán, Martha S. Bianchi, Julieta Sánchez BAG. Journal of Basic and Applied Genetics versión ISSN 1852-6233. 22 (1) 2011
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Bandeo de cromosomas y citogenĂŠtica molecular
Bandeo de cromosomas
Se pueden detectar los cromosomas según un patrón que está dado por bandas alternantes.
http://www.ucm.es/info/genetica/AVG/practicas/cariotipo/
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Cariotipo por bandeo G
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Significado del patrón de bandeo
Bandeo Q – Patrón muy informativo, necesita de fluorescencia (Quinacrina)
Bandeo G – Presenta el mismo patrón que el bandeo Q, con algunas diferencias. Se realiza una digestión con tripsina y una tinción con Giemsa
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Tipos de bandas
El bandeo G y Q son bandas que están relacionadas con la composición del ADN. – Bandas G oscuras son ricas en AT – Se considera que las bandas G y Q contienen pocos genes y que son regiones que tienden a la represión génica. – Las bandas G claras contienen la mayoría de los genes de mantenimiento, son activas y se replican precozmente.
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Otros bandeos
Bandeo C – Tiñe la heterocromatina constitutiva. Sólo tiñe regiones centroméricas y los bloques de heterocromatina C de los cromosomas 1, 9 y 16 y del brazo largo del Y
Bandeo R – Es el inverso del G (o Q)
Bandeo N – Tiñe los organizadores nucleolares (13, 15, 21 y 22)
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Hibridación in situ
Si un gen está clonado, se puede usar como una prueba para hibridar cromosomas. – Son radioactivas o fluorescentes.
Si hay grupos clonados de diferentes cromosomas, o de diferentes regiones, se pueden marcar con diferentes tinciones fluorescentes y “pintar” el cromosoma.
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Hibridización in situ
Tinciones de cromosomas in situ con una prueba específica para un gen presente en simple copia en cada set de cromosomas, en este caso una proteína muscular en el cromosoma 11. Sólo un locus muestra un punto fluorescente correspondiente a la prueba asociada al gen de la proteína muscular.
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Principios del FISH
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Cariotipo humano
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Combinación de técnicas Bandeo
Multiplex FISH Se observan translocaciones
Hibridación Genómica Comparativa
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Comparación Hibridación Genómica Comparativa
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Automatizaci贸n en citogen茅tica humana
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http://www.metasystems-international.com/ikaros
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