LAMP metoda - budućnost jednostavnije amplifikacije nukleinskih kiselina?

AUTORKA: MILICA OGNJANOVIĆ

Kada je početkom 2020. godine proglašena pandemija koronavirusa metoda za amplifikaciju nukleinskih kiselina, lančana reakcija polimeraze iliti PCR (polymerase chain reaction), tačnije real-time RT-PCR je najšire korišćena za otkrivanje zaraženih koronavirusom, najviše zbog svoje visoke osetljivosti i visoke specifičnosti. Međutim, i pored ove široke upotrebe, metoda je imala niz mana – dobijanje lažno negativnih rezultata, posebna oprema i organizacija laboratorije, kao i posebno obučeno osoblje koje je neophodno za izvođenje metode. Zbog svega toga, naučnici i kompanije su tokom vremena na više načina pokušavali da unaprede dijagnostiku koronavirusa pomoću real-time RT-PCR-a, koristeći različite prajmere, probe i ciljne regione za amplifikciju kojima bi se povećala osetljivost i pojednostavilo izvođenje, a samo jedan od primera ovih napora bilo je osmišljavanje OSN-qRT-PCR-a (one-step singletube nested quantitative real-time PCR). Ipak, neki drugi naučnici i kompanije okrenuli su se unapređivanju metoda za amplifikaciju koje su jednostavnije za izvođenje, a najpoznatija i ona koja je imala najviše uspeha bila je takozvana LAMP metoda.

A šta je zapravo LAMP metoda?

Loop-mediated isothermal amplification ili skraćeno LAMP je jedna od metoda izotermalne amplifikacije nukleinskih kiselina, pa se za izvođenje amplifikacije koristi jedna, fiksna temperatura, što je samo jedan od razloga jednostavnosti izvođenja ove metode. Razvili su je naučnici japanske kompanije Eiken Chemical Co., Ltd tokom 1998. godine, u vreme kada je PCR uveliko bio poznata i sve više primenjivana metoda.

LAMP metodu karakteriše visoka specifičnost, što je posledica upotrebe 4-6 prajmera posebno dizajniranih da prepoznaju 6-8 različitih regiona u ciljnoj DNK sekvenci, u poređenju sa samo 2 u tipčnom PCR-u, kao i činjenice da se nakon LAMP amplifikacije dobije oko milijardu kopija, za razliku od milion kopija koje se dobijaju nakon PCR amplifikacije. Važno je napomenuti da je za ispravno izvođenje amplifikacije dizajn prajmera odlučujući korak, odnosno potrebno je izvršiti optimizaciju u zavisnosti od koncentracije, lokacije nukleotidnih parova, razdaljine između DNK regiona, i onemogućiti da prajmeri pri izvođenju reakcije međusobno formiraju dvolančane strukture. Zbog svega ovoga, pri dizajniranju prajmera za izvođenje LAMP metode mogu se koristiti neki od dostupnih onlajn softevera poput PrimerExplorer ili LAMP Designer Optigene.

Za izvođenje LAMP metode nije potrebna faza denaturacije DNK molekula koja postoji u PCR metodi, jer Bst DNK polimeraza koje se koristi u ovoj metodi osim svoje polimerazne aktivnosti pokazuje i aktivnost za razdvajanje lanaca DNK molekula. Čitava reakcija se dešava, kao što je gore pomenuto, na jednoj temperaturi, obično 60-65ºC, pa je za izvođenje LAMP-a moguće koristiti i suva ili vodena kupatila, tako da nije potrebna upotreba termociklera za preciznu izmenu temperature u zavisnosti od faze reakcije, koji je neophodan za izvođenje PCR-a. Takođe, LAMP metoda ne zahteva prethodno izdvajanje DNK ili RNK molekula, što ovu metodu čini još jednostavnijom i bržom za izvođenje od PCR metode.

Reakcija LAMP metode obično je podeljena na tri faze: stvaranje početnog materijala za reakciju, ciklična amplifikacija i elongacija kombinovana sa reciklizacijom (2). Najvažniji korak u prvoj fazi je stvaranje šablona u obliku jednolančane strukture nalik na petlju (videti Sliku 1),

Slika 1. Shematski prikaz jednolančane DNK strukture nalik na petlju, šablon koji je neophodan za dalju reakciju amplifikacije pomoću LAMP metode

a ostale faze eksponencijalnu amplifikaciju ovog šablona i zamenu lanaca, što dovodi do stvaranja mešavne dvolančane DNK, a kao krajnji proizvod dobija se kompleksna struktura prikazana na Slici 2.

Slika 2. Krajnji proizvod amplifikacije sa 6 petlji

Vremenom, razvijeno je nekoliko varijanti LAMP metode, uključujući reverzna transkriptaza LAMP (RT-LAMP), multipleks LAMP (M-LAMP), kao i real-time LAMP. Kao i kod RT-PCR, reakciju reverzne transkripcije moguće je izvesti kombinovanjem reverzne transkriptaze sa DNK polimerazom, ali se može koristiti i polimeraza koje poseduje i aktvnost revezne transkriptaze, poput Bst 3.0 ili OmniAmp.

Postoji više mogućih načina za detekciju proizvoda dobijenih bilo kojom varijantom LAMP metode, pa se tako može koristiti kolorimetrijska detekcija uz pomoć fluorescentnih boja, UV zračenje, elektroforeza na agaroznom gelu, test lateralnog protoka, turbidimetrija, real-time fluorescencija i detekcija pomoću softvera na smartfonu.

LAMP metoda u dijagnostici COVID-19

Imajući u vidu da je za amplifikaciju pomoću LAMP metode potrebno 15-60 minuta, ali i da nije potrebna dodatna oprema i oragnizacija laboratorije, te je stoga dostupnija i pogodnija za korišćenje, naučnici su u saradnji sa biotehnloškim kompanijama od početka pandemije koronavirusa pokušavali da razviju i unaprede testove za detekciju virusa. Cilj je bio da se razviju brzi testovi koji bi koristili reverznu transkriptazu, pomoću kojih bi mogle da se detektuju čak i male koncentracije virusa u uzorku i koji bi bili moguća zamena za „zlatni standard” realtime RT-PCR za dijagnostiku COVID-19.

Koji su nedostaci metode?

Iako postoje brojne, gorenavedene, prednosti LAMP metode kao metode amplifikacije u odnosu na PCR, ova metoda itekako ima nedostatke koje je važno napomenuti. Pri korišćenju ove metode postoji rizik od unakrsne kontaminacije uzorka za analiziranje materijalom koji je prisutan u aerosolu. Stoga se preporučuje ventilacija prostorija u kojima se izvodi analiziranje, a različiti uzorci analiziraju se odvojeno, što ponekad nije moguće. Još jedan od nedostataka je što se proizvodi amplifikacije ne mogu koristiti za dalja genetička ispitivanja, kao što je sekvenciranje. Takođe, napomenuli smo da je za ispravno izvođenje amplifikacije dizajn prajmera od ključne važnosti, međutim, treba naglasti i da je za pravilan dizajn prajmera potrebno poznavati varijacije genomskih sekvenci od interesa. Ukoliko ovi podaci nisu dostupni, najpre se mora izvesti sekvenciranje kako bi se utvrdila varijacija ciljnog gena od interesa za amplifikaciju LAMP metodom, što će produžiti vreme testiranja ili ograničiti mogućnost primene.

LAMP metoda, najzad, novija je od PCR metode i samim tim daleko manje istražena i razvijena, ali uz sve prednosti koje ova metoda poseduje, naučnici predviđaju dalji razvoj testova na bazi ove metode, razvoj i poboljšanja ove metode i veliki potencijal za njenu primenu u budućnosti.

Literatura

1.Soroka M, Wasowicz B, Rymaszewska A. Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP): The Better Sibling of PCR? Cells. 2021 Jul 29;10(8):1931. doi: 10.3390/cells10081931. PMID: 34440699; PMCID: PMC8393631.

2.Eiken Genome Site (http://loopamp.eiken.co.jp/e/lamp/, pristupljeno 11.3.2022)

3.Masato Inaba, Yuki Higashimoto, Yoko Toyama, Tomoya Horiguchi, Masaya Hibino, Mitsunaga Iwata, Kazuyoshi Imaizumi, Yohei Doi, Diagnostic accuracy of LAMP versus PCR over the course of SARS-CoV-2 infection, International Journal of Infectious Diseases, Vol. 107, 2021, p.195-200.