1.-TITULO
Extensión para PCR en tiempo real de la práctica ‘Investigación de OGMs’. Práctica 1. 2.-OBJETO Realización de una práctica de investigación de OGMs mediante seguimiento de las reacciones de PCR en tiempo real.
3.-ALCANCE Alumnado del módulo “Ensayos Biotecnológicos” correspondiente al CFGS “Laboratorio de Análisis y de Control de Calidad”
4.-REFERENCIAS • •
Biotechnology Explorer™ GMO Investigator™ Kit (Catalog #166-‐2500EDU. BIO-‐RAD) Biotechnology Explorer™ GMO Investigator™ Kit: A Quantitative Real-‐Time PCR Extension.
5.-DESCRIPCION 5.1.- Fundamento La PCR convencional es ideal para detectar la presencia del ADN correspondientes al par de cebadores objetivo. Esta técnica detecta el producto amplificado (amplicón) por un análisis a punto final, esto es, haciendo correr el ADN en un gel de agarosa después de que las reacciones se han completado. Si la secuencia de ADN diana no está allí, no aparecerá el amplicón en el gel de agarosa. Si al menos una única molécula de ADN que contiene la secuencia de ADN diana está en la muestra, la amplificación después de 25-‐30 ciclos es suficiente para generar amplicones detectables a través electroforesis. Por lo tanto, la PCR convencional se un ensayo altamente sensible para detectar una secuencia específica de ADN, lo que es útil para el diagnóstico de enfermedades, especialmente las de tipo viral. Es también un ensayo rápido, altamente sensible y específico para la detección de microbios en muestras ambientales. Mediante el uso de la transcriptasa inversa, la PCR convencional se ha convertido también en el estándar para la detección de dianas de ARN, ensayo útil para el análisis de la expresión génica en investigación y diagnóstico médico. En este caso, la transcriptasa inversa genera ADN a partir de una plantilla de ARN, formando un molde para la amplificación de polimerasa PCR.
La PCR en tiempo real se basa en los mismos principios que la PCR convencional. La reacción requiere dos cebadores para ahorquillar la región de destino (amplicón), y una ADN polimerasa tal como Taq. Sin embargo, la PCR en tiempo real permite que la acumulación de producto amplificado sea detectada y medida a medida que la reacción tiene lugar, en "tiempo real". La diferencia es la adición de una sustancia química que emite fluorescencia, lo que permite aue la amplificación del producto sea monitorizada a medida que tiene lugar la reacción despolimerización usando termocicladores especializados equipados con módulos de detección de fluorescencia. La fluorescencia medida refleja la cantidad de producto amplificado en cada ciclo. Los resultados pueden ser cualitativos (presencia o ausencia de una secuencia) o cuantitativos (número de copias de ADN). A medida que las reacciones de PCR se suceden, el colorante I de la SYBR®Green se une con el ADN de doble hebra generado por el proceso de PCR. Con cada ciclo de la reacción de PCR, la cantidad de ADN de doble cadena producida y la fluorescencia aumentan. Eventualmente, la fluorescencia emitida por las reacciones alcanzan el nivel mínimo de detección del instrumento y continua aumentando con cada ciclo. Finalmente, cuando las reacciones de PCR se quedan sin reactivos, la fluorescencia deja de aumentar. Son reactivos limitantes los nucleótidos, los cebadores, el ADN molde, la ADN polimerasa, y el colorante fluorescente I de la SYBR®Green. 5.2 Material necesario.
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5.2.1 Equipamiento. Termociclador PCR en tiempo real.
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5.2.2 Materiales OGM Investigator kit (166-‐2500EDU)
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5.2.3 Reactivos Small DNA Electrophoresis Reagent Pack (166-‐0450EDU) iQ SYBR Green Supermix (170-‐8880EDU) Agua ultrapura para PCR sin impurezas biológicamente activas 5.2.4.- Disoluciones
5.3 Procedimiento operativo. 5.3.1. Programación del termociclador. Siguiendo las instrucciones del equipo utilizado, se debe programar el termociclador según el siguiente protocolo: Volumen de la reacción: 25 µl La temperatura cumbre será 95-‐100ºC Ciclo 1: 95ºC durante 4min. Ciclo 2: 94ºC durante 1min.
59ºC durante 1min.
72ºC durante 2min.
Repetir segundo ciclo 40 veces. Ciclo 3: Análisis de la curva de fusión. Programar el termociclador para calentar las muestras desde 55ºC a 95ºC en incrementos de 0.5ºC y recolectar los datos (o leer las muestras) después de 10s para cada incremento. Alternativamente, utilizar el equipo para la recolección de datos para análisis de curva de fusión. Guardar el protocolo en la librería del equipo. 5.3.2. Preparación de reactivos 1. Localizar los reactivos siguientes: •
iQ SYBR®Green Supermix
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Control de ADN OGM positivo (a partir de ahora OGM(+).)
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Cebadores de plantas
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Cebadores de OGM
2. Descongelar en hielo todos los reactivos y homogenizar en vórtex o mediante golpecitos en los tubos. 3. Centrifugar para que las disoluciones se vayan al fondo de los tubos (10 segundos a velocidad máxima) 4. Mantener en hielo. 5.3.3. Preparación de las muestras de ADN 5. Colocar el control de ADN OGM(+). 6. Etiquetar ocho tubos con tapón roscado para las siguientes diluciones estándar: sin diluir (1), 1/10, 1/100, 10-‐3, 10-‐4, 10-‐5, 10-‐6 y CSM (control sin molde). 7. Añadir 50 µl de control OGM(+) al tubo #1 para la muestra sin diluir. 8. Añadir 90 µl de agua destilada estéril a cada uno de los tubos #2 a #8. 9. Añadir 10 µl de control OGM(+) al tubo #2 para obtener la dilución 1/10. Mezclar repetidamente con la ayuda de la micropipeta para asegurarse de que todo el ADN ha sido vertido y mezclado a conciencia. Homogenizar mediante vórtex durante al menos 10s. ó dando 20 golpecitos al tubo. 10. Preparar las diluciones seriadas de ADN: a. Transferir 10 µl del ADN diluido desde el tubo #2 al tubo #3. Homogenizar concienzudamente. b. Transferir 10 µl del ADN diluido desde el tubo #3 al tubo #4. Homogenizar concienzudamente. c. Transferir 10 µl del ADN diluido desde el tubo #4 al tubo #5. Homogenizar concienzudamente. d. Transferir 10 µl del ADN diluido desde el tubo #5 al tubo #6. Homogenizar concienzudamente.
e. Transferir 10 µl del ADN diluido desde el tubo #6 al tubo #7. Homogenizar concienzudamente. f.
El tubo #8 se deja sin añadir molde para la CSM. En cada caso, se debe mezclar repetidamente con la ayuda de la micropipeta para asegurarse de que todo el ADN ha sido vertido y mezclado a conciencia. Homogenizar mediante vórtex durante al menos 10s. ó dando 20 golpecitos al tubo.
5.3.4. Preparación de los tubos de PCR 11. Por cada serie de dilución utilizar una tira de tubos de PCR de 8 pocillos. Etiquetar cada tubo con el nombre del molde y la referencia del nivel de dilución, poniendo atención en escribir únicamente en los laterales de los tubos. Por ejemplo, la tira de ocho tubos para el grupo que analiza los cebadores de plantas con el control de ADN OGM(+) serian etiquetados del siguiente modo: PMM.1, PMM.1/10, PMM.1/100, PMM.10-‐3, PMM.10-‐ 4, PMM.10-‐5, PMM.10-‐6 y PMM.CSM. Asegurarse de que las reacciones están programadas en el termociclador en la forma exacta. 5.3.5. Preparación de los mastermix 12. Para cada serie de dilución de ocho tubos se precisan 150µl de iQ SYBR®Green 2x y 1.5µl de cebadores, ya sean del fotosistema II (a partir de ahora PSII) de plantas o del OGM Rojo en función del plan de trabajo. Todos los pasos siguientes se deben realizar en hielo. 13. Etiquetar dos tubos de tapón roscado según lo indicado a continuación: •
“PMM” para ‘mastermix plantas’
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“GMM” para ‘mastermix OGM’
14. Añadir 150 µl del iQ SYBR®Green supermix a ambos tubos. 15. Añadir 1.5µl de cebadores de plantas al tubo etiquetado “PMM”. Pipetear repetidas veces para garantizar que el ADN es liberado en el tubo; homogenizar a conciencia, girar hacia abajo. 16. Añadir 1.5µl de cebadores de OGMs al tubo etiquetado GMM. Pipetear repetidas veces para garantizar que el ADN es liberado en el tubo; homogenizar a conciencia, girar hacia abajo. 5.3.6. Adición del mastermix al tubo de PCR 17. Distribuir 12.5µl del mastermix de plantas (PMM) a cada uno de los 8 tubos de la tira correspondiente. 18. Distribuir 12.5µl del mastermix de OGMs (GMM) a cada uno de los 8 tubos de la tira correspondiente. 19. La configuración de la placa1 completa debería ser similar a la indicada en la imagen siguiente:
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Para una placa de termociclador de 48 pocillos. Si se dispone de un termociclador con placa de 96 pocillos se puede ampliar la práctica poniendo más reacciones con distintos mastermixes (PMM, GMM) o haciendo más réplicas.
Configuración de la placa. Las columnas 1-‐3 representan muestras con mastermix de plantas (PMM), las columnas 4-‐6 representan muestras con mastermix de OGMs (GMM).
5.3.7. Adición de muestras de ADN a los tubos 20. Añadir 12.5µl del tubo #1 (sin diluir) a los tubos de reacción apropiados. ATENCION: usar una punta de pipeta nueva en cada caso. Homogenizar cada reacción generosamente mediante algunos movimientos suaves de pipeteo ascendentes/descendentes. Se debe recordar que se realizará una lectura óptica por lo que es importante no introducir burbujas en la mezcla de reacción. 21. Repetir el paso anterior hasta completar todas las diluciones (tubos #2 a #7) así como para la reacción del control sin molde (#8). 22. Una vez completadas la placa debería mostrar la siguiente configuración:
Configuración de la placa. Las columnas 1-‐3 representan muestras con mastermix de plantas (PMM), las columnas 4-‐6 representan muestras con mastermix de OGMs (GMM). Las filas A-‐G representan la adición de controles GMO(+) a las concentraciones indicadas. La fila H representa el control sin molde.
5.3.8. Reacción de PCR 23. Lanzar las reacciones en el termociclador a tiempo real. 24. Observar las reacciones de PCR en tiempo real y su progresión durante los sucesivos ciclos. (De exisitir la posibilidad, es una buena idea conectar el ordenador al cañón de
proyección del laboratorio). 5.3.9. Creación de curvas estándar 25. Prácticamente todos los equipos de PCR en tiempo real disponen de software para la creación de curvas estándar. Síganse las instrucciones del manual del usuario del equipo a utilizar. Otra alternativa es trasvasar los datos a una hoja de cálculo y generar la curva en él, o directamente sobre papel semilogarítmico. Representar los valores CT sobre el eje x, y los valores logarítmicos sobre el eje y. El factor de dilución puede ser usado para el eje y, o también un número arbitrario de copias: 10 copias del ADN molde de inicio en la dilución 10-‐6, 100 copias del molde de inicio en la dilución 10-‐5, etc. Se obtienen dos curvas, una para las reacciones que utilizan cebadores de plantas (PMM) y otra para las que usan cebadores de OGMs (GMM). 5.3.10. Análisis por electroforesis en gel. Se debe recordar que la técnica de PCR en tiempo real proporciona información específica sobre la cantidad de molde de partida, mientras que la electroforesis en gel de agarosa ofrece información sobre el tamaño de los amplicones producidos. Los cebadores de plantas de esta práctica producen un amplicón de unos 455pb, y los de OGMs producen 2 amplicones de 203 y 225pb. Sin embargo, en usencia de molde de partida (como ocurre en el tubo #8 CSM o en la dilución 10-‐6), los mismos cebadores producirán un amplicón de dímeros de cebador de un tamaño mucho menor. La gráficas de PCR en tiempo real obtenidas para el producto de PCR buscado y para el artefacto de dímeros de cebador son muy semejantes, mientras que los patrones de bandas obtenidas en gel de agarosa para esos dos productos son completamente distintos. Así las cosas, para ganar experiencia en la interpretación de resultados de PCR en tiempo real que puedan contener tanto los amplicones esperados como artefactos diméricos, es muy recomendable separar por electroforesis en gel de agarosa los productos de la PCR en tiempo real. 26. Preparar geles de agarosa al 3% con suficientes vías como para analizar al menos una serie completa de diluciones con cebadores de plantas y una serie completa de diluciones con cebadores de OGMs (ambas incluyendo el CSM), más una vía adicional para la regla molecular de ADN. Esto es, al menos 17 vías. 27. Añadir 6 µl de tampón de carga Orange G a cada tubo de reacción de 25 µl que vaya a ser cargado en el gel. 28. Añadir 50 µl de tampón de carga Orange G al vial de la regla molecular de pesos para PCR. Mezclar bien y centrifugar. 29. Cargar 20 µl de cada muestra de PCR y 20 µl de regla molecular en el gel de agarosa. 30. Correr el gel de agarosa a 100V durante 30min. 31. Analizar los resultados.
Esquema grรกfico
6.- Tratamiento de datos (Resultados esperados) Los productos descritos en esta sección crean una serie de diluciones del ADN molde. Las reacciones de PCR en tiempo real mostrarán una serie de curvas semejantes a las mostradas en el gráfico siguiente. El ADN #1 (sin diluir), más concentrado, da curvas que aparecen “de forma temprana”, por ejemplo, antes del ciclo 10. Las más diluidas aparecen después (más a la derecha). Como quiera que las curvas de amplificación obtenidas en los equipos de PCR en tiempo real son dependientes y proporcionales a la concentración inicial de ADN, a medida que el ADN va siendo más diluido, las curvas van estando cada vez más desplazadas hacia la derecha, tal y como se muestra en el siguiente ejemplo.
Gráfico de amplificación de PCR en tiempo real. Rojo=10x; verde=100x; azul=1000x; amarillo=10.000x; rosa=100.000x; cian=1.000.000x. No se muestran en este gráfico la muestra sin diluir (1x) ni el control sin molde (CSM). Obsérvese que los datos de fluorescencia se muestran es escala logarítmica.
7.- Notas de seguridad y medioambiente 8.- Anexos