1.2
Pozorovací techniky ve světelné mikroskopii
Mikroskopovací techniky
V histologii vyšetřujeme převážně vzorky průsvitné (histologické řezy, živé buňky a buněčné kultury v kultivačních miskách, tenké výbrusy kostí a zubů). Podle toho, které fyzikální a optické jevy jsou převažujícím zdrojem kontrastu při utváření mikroskopického obrazu, rozlišujeme několik technik.
1 Pozorování ve světlém poli
Použití: Nejčastější a rutinní metoda v histopatologii pro pozorování barvených řezů. Princip: Světlo z viditelné oblasti (400–760 nm) prochází předmětem rovnoběžně s osou mikroskopu či s malým sklonem k ní. Světlo, které neinteraguje se vzorkem, prochází do objektivu a vytváří světlé části obrazu. Světlo vychýlené preparátem vytváří tmavší části obrazu.
2 Pozorování v tmavém poli nebo v šikmém osvětlení
Světlé pole – tenké střevo
3 Polarizační mikroskopie
Tmavé pole – povrch kovu
Použití: Přítomnost či pohyb shluků koloidních částic či bakterií na hranici či pod hranicí rozlišovací schopnosti světelného mikroskopu. Otěr kovových implantátů. Princip: Paprsky, které neinteragují s preparátem, jsou vyřazeny z tvorby obrazu. Základní zorné pole je tmavé a v něm svítí detaily předmětu, které vyvolaly vychýlení paprsků. V případě šikmého osvitu je osvětlení v jednom směru skloněno mimo optickou osu a obraz vzbuzuje dojem plasticity. Použití: Krystaly (např. oxalátové nebo urátové) v biologických tkáních. Odlišení dvojlomu u kolagenu typu I a kolagenu typu III. Orientace krystalů hydroxyapatitu v kostní matrix. Princip: Přirozené světlo je průchodem prvním filtrem (polarizátorem) před preparátem polarizováno ve směru, který neprochází zkříženým druhým filtrem (analyzátorem) za preparátem. Obraz vytváří jen světlo, jehož směr polarizace je stočen optickou aktivitou preparátu v prostoru mezi filtry.
4 Fázový kontrast
Polarizace kolagenu typu I a III
Použití: Pozorování nebarvených preparátů, živých buněk v médiu (např. vyšetření spermiogramu), buněčných kultur. Princip: Zavedení fázového posunu mezi nulté maximum a vyšší maxima v primárním interferenčním obrazu mikroskopu. Při pozitivním fázovém kontrastu se detaily s vyšším indexem lomu či vyšší tloušťkou jeví jako tmavé, u negativního je tomu naopak. Ve výsledném obraze vzniká dojem plasticity.
5 Nomarského diferenciální interferenční kontrast (DIC) Použití: Zviditelnění průhledných nekontrastních detailů jako u fázového kontrastu. Princip: Rozdíl optických drah souběžně běžících paprsků polarizovaného světla při průchodu různými částmi preparátu (např. organelami) vede ke vzájemnému zpomalení a k relativním fázovým posunům. Dle lokálního indexu lomu a rozměrů fázových objektů v preparátu dochází k interferenci paprsků za vzniku rozdílu intenzit světla, které jsou již zdrojem kontrastu. Jedna strana objektu je přitom zvýrazněná, na opačné straně vzniká stín, což obrazu dodává dojem plasticity.
6 Fluorescenční mikroskopie
Fázový kontrast – sliznice žaludku
Nomarského DIC – nebarvený preparát chrupavky
Použití: Fluoresceční značení protilátek používaných v imunohistochemii. Značení prób nukleových kyselin k detekci oblastí chromozomů aj. Princip: Specifický průkaz molekul fluorochromů (fluoroforů), tj. látek, které se při osvitu zářením kratší vlnové délky excitují a reagují emisí záření o vyšší vlnové délce. Kromě uměle syntetizovaných molekul existují i přirozeně se vyskytující fluorescenční látky (hemoglobin, vitamín A).
7 Konfokální mikroskopie
484
Fluorescence – cévy mozku
Použití: Nejčastěji v kombinaci s fluorescenční mikroskopií pro studium organel, receptorů, membrán. Princip: Z tvorby obrazu jsou pomocí konfokálních clon vyloučeny paprsky pocházející z oblasti nad a pod zaostřeným intervalem rovin. Výsledkem je tenký optický řez buňkami a tkáněmi. Optické řezy mají výborný kontrast, neboť světlo ze zobrazované roviny není rušeno světlem přicházejícím z ostatních rovin. Ze série takových řezů lze pořizovat mikroskopické trojrozměrné rekonstrukce. Konfokální mikroskop – neurony v mozku