Se ora si vuole individuare all’interno della genoteca la colonia batterica che contiene un particolare frammento genico sarà necessario usare una sonda che la riconosca e ce la renda evidente. Una sonda è costituita da una breve sequenza di una ventina di basi complementare al DNA di interesse, marcata mediante l’impiego di isotopi radioattivi o di un composto fluorescente. Una sonda viene in genere costruita tramite trascrizione inversa a partire dall’mRNA con formazione di cDNA (DNA complementare) oppure, conoscendo la sequenza amminoacidica della proteina codificata dal gene che ci interessa, è possibile assemblare direttamente un breve filamento di DNA sintetico. Il processo di appaiamento della sonda al DNA di interesse è detto ibridazione. In generale si forma DNA ibrido quando si appaiano filamenti di DNA (o di DNA ed RNA) di provenienza diversa.
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Amplificazione DNA: PCR
La clonazione del DNA tramite proliferazione di un batterio nel quale è stato introdotto un vettore ricombinante (plasmide o fago) contenente il segmento genico di interesse non è l’unica modalità per ottenere un numero elevato di segmenti di DNA identici (amplificazione DNA). Il metodo più rapido ed economico per ottenere molte copie di una sequenza di DNA è infatti la reazione a catena della polimerasi (PCR). Si tratta di un sistema in vitro, che non prevede cioè l'uso di cellule ed è basato sull'attività dell’enzima DNA-polimerasi. Le DNApolimerasi sono enzimi in grado di legare in successione ordinata i nucleotidi e di costruire quindi filamenti di DNA complementari ad un primo filamento che fa da stampo. Le DNApolimerasi utilizzate attualmente sono tutte estratte da batteri che vivono in condizioni di temperatura estreme, in modo da essere termostabili. La "Taq-polimerasi" ad esempio, è in grado di lavorare ad alte temperature, fino anche a 92°C, temperatura alla quale avviene il processo di denaturazione del DNA. In passato questa DNA-polimerasi veniva estratta da Thermophilus aquaticus, un batterio che vive nelle acque termali calde. Attualmente viene invece prodotta in batteri geneticamente modificati per l'espressione e la sintesi dell'enzima. La PCR prevede che il DNA venga riscaldato per dividere i due filamenti della doppia elica (denaturazione), premessa indispensabile per poterlo copiare. Se la polimerasi usata non fosse termoresistente, ad ogni ciclo si dovrebbe aggiungere nuovo enzima per sostituire quello inattivato dal calore. Il campione di DNA da amplificare viene posto in una soluzione contenente DNA polimerasi, nucleotidi (dNTP, desossinucleotidi trifosfati) e primer.
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