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M. CAVALLA


INTRODUCTION ....................................................................................................................................... 1 TECHNIQUES MICROSCOPIQUES ...................................................................................................... 1 ETAT FRAIS ET COLORATIONS .....................................................................................................................1 MICROSCOPIE A FOND CLAIR.......................................................................................................................1 MICROSCOPIE A CONTRASTE DE PHASE .......................................................................................................2 MICROSCOPIE A FOND NOIR ........................................................................................................................2 MICROSCOPIE A FLUORESCENCE .................................................................................................................2 I. LES ALGUES........................................................................................................................................... 3 1. DEFINITION : ...........................................................................................................................................3 2. DISTRIBUTION : .......................................................................................................................................3 3. CLASSIFICATION : ...................................................................................................................................3 4. STRUCTURE : ...........................................................................................................................................4 5. REPRODUCTION : .....................................................................................................................................5 6. CARACTERISTIQUES DES GROUPES D'ALGUES : ........................................................................................6 II. LES CHAMPIGNONS MICROSCOPIQUES .................................................................................. 13 1. DESCRIPTION - CLASSIFICATION : .........................................................................................................13 2. HABITATS : ...........................................................................................................................................13 3. ISOLEMENT ET CULTURE: ......................................................................................................................14 4. QUELQUES OBSERVATIONS : .................................................................................................................15 IV. LES PROCARYOTES ....................................................................................................................... 18 4.1. LE CYCLE DE L'AZOTE ........................................................................................................................18 4.2 LES BACTERIES PHOTOTROPHES : ........................................................................................................22 4.3. LES CYANOBACTERIES : .....................................................................................................................23 4.4 LES ACTINOMYCETES .........................................................................................................................25 4.5. BACTERIES DU SOUFRE ET DU FER : ....................................................................................................26 4.6. AUTRES PROCARYOTES : ....................................................................................................................28 V. PROTOZOAIRES ................................................................................................................................ 29 1. HABITAT - ISOLEMENT - RECOLTE : ......................................................................................................29 2. OBSERVATIONS MICROSCOPIQUES :.......................................................................................................29 3. CLASSIFICATION -SYSTEMATIQUE DES PROTISTES : ..............................................................................29 4. QUELQUES INDIVIDUS DES DIFFERENTS GROUPES .................................................................................32 MILIEUX DE CULTURE ........................................................................................................................ 38


INTRODUCTION La microbiologie étudie les organismes vivants de petite taille, dont beaucoup se rencontrent sous la forme d'une cellule unique. Parmi tous les ouvrages actuels, beaucoup traitent de manière exhaustive du monde des procaryotes d'intérêt médical, mais peu proposent un aperçu plus général des organismes unicellulaires ou pluricellulaires microscopiques. C'est pour combler en partie ce manque que cet ouvrage est proposé.

TECHNIQUES MICROSCOPIQUES

Etat frais et colorations De nombreuses caractéristiques structurales (mode de groupement, morphologie, mobilité) ou écologiques (tropismes, trophismes) des organismes unicellulaires sont visibles sur un état frais, c'est-à-dire dans une goutte d'eau entre lame et lamelle. Contraste de phase

Cette technique d'observation s'applique d'autant plus aux organismes aquatiques, puisqu'il s'agit de les observer dans des conditions proches de celles de leur milieu naturel. Le contraste de phase permet de visualiser les structures peu réfringentes. Pour d'autres formes de vie microscopiques et pour mettre en évidence des détails structuraux, il est presque indispensable d'utiliser des colorations. La coloration est dite vitale lorsqu'elle ne tue pas les microorganismes. C'est le cas de la coloration au rouge neutre dilué, qui permet de mettre en évidence les vacuoles acides de certains microorganismes.

Rouge neutre

D'autres colorations sont réalisées sur des cellules vivantes ou après fixation. Elles permettent de mieux visualiser les détails de la structure des mycètes (coloration au bleu coton ou à la lactofuchsine à 0,1%), les matières de réserve des protozoaires (glycogène) ou des algues (amidon en général) par le lugol, ou les noyaux (vert de méthyle).

Lactofuchsine

Bleu de crésyl

Vert de méthyle

Microscopie à fond clair Cette technique s'applique bien aux organismes réfringents, mais les structures plus fines ne sont pas visibles. En diaphragmant ou en abaissant le condenseur du microscope, il est cependant possible d'améliorer le contraste et de mettre en évidence ces structures, mais en perdant un peu des couleurs. 1


Microscopie à contraste de phase Le contraste de phase et ses techniques dérivées améliorent la résolution dans l'observation des objets microscopiques peu réfringents, tels que bon nombre de cellules vivantes.

Microscopie à fond noir

Microscopie à fluorescence Les organismes chlorophylliens émettent une fluorescence rouge lorsqu'ils sont exposés aux rayonnements ultraviolets. La cellulose fluoresce jaune. La coloration à l'acridine orange permet de mettre en évidence la répartition de l'ADN et de l'ARN dans la cellule.

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I. LES ALGUES

1. Définition : Les algues sont des organismes eucaryotes (excluant les cyanobactéries, qui sont des procaryotes phototrophes) dépourvus de racines, de tige (absence de tissus vasculaires) et de feuilles, mais possédant de la chlorophylle ainsi que d'autres pigments accessoires pour réaliser la photosynthèse productrice d'oxygène. Les cyanobactéries (ex algues bleues ou Cyanophycées) sont généralement étudiées ensemble car bien que ne possédant pas de noyau, elles ont beaucoup d'affinités avec les algues vraies. Les algues sont classées dans le groupe des thallophytes, dans le règne végétal, mais du fait de la diversité des formes, certaines espèces phytoplanctoniques sont classées dans le règne des protistes qui regroupe les eucaryotes unicellulaires. La taille des algues peut varier de la cellule microscopique unique, à quelques cellules en colonie et jusqu’à 75 m (laminaires, sargasses) pour certaines formes multicellulaires. 2. Distribution : La plupart des algues se développent en milieu aquatique d'eau douce, saline ou saumâtre, mais certaines sont terrestres et sont capables de se développer à même le sol ou sur le tronc des arbres. Dans l'eau, les algues ainsi que de petites plantes forment le phytoplancton, le zooplancton étant constitué par des animaux et des protistes non phototrophes. Certaines algues se développent sur des rochers humides, sur le tronc des arbres (Pleurococcus, Chlorophyte), ou sur un sol mouillé (Nostoc, Cyanobactérie). D'autres sont des endosymbiotes de protozoaires (Zooxanthelles chez Paramecium bursaria), de plantes (Anabaena chez Azolla, Cycas), d'hydraires, de bryozoaires, de mollusques, vers ou coraux chez lesquels elles se développent dans le cytoplasme. Des algues vivent en symbiose avec des champignons pour former les lichens. Les algues et les cyanobactéries sont parmi les premiers organismes apparus sur Terre. Aux USA au voisinage des grands lacs, on a trouvé des cyanobactéries fossiles ressemblant à des oscillaires dans des terrains cambriens de 2 milliards d'années.

La présence d'algues se manifeste par un foisonnement pigmenté dans les étangs pour les microalgues en suspension, et par des amas verts chevelus pour les algues filamenteuses. 3. Classification : Il existe plusieurs classifications différentes, mais les algues peuvent être réparties dans sept embranchements distribués dans deux règnes (protistes, végétal). 3


Caractéristiques importantes des groupes d'algues Embranchement (Règne) Chlorophytes (Protistes)

Nom commun algues vertes

Charophytes (Protistes)

Nombre d’espèces 7500

250

Représentants

Pigments

Réserves

Paroi

Habitat

Chlorella, Scenedesmus, Spirogyra, Ulva Chara, Nitella

Chlorophylles a,b Xanthophylles Carotènes

Sucres, amidon, fructane

Cellulose, mannanes, protéines, CaCO3 Cellulose, CaCO3

eau douce, saumâtre, salée et terrestre

absente

eau douce, saumâtre, salée et terrestre eau douce, saumâtre, salée et terrestre

Euglenophytes (Protistes)

Euglènes

700

Euglena, Phacus

Chrysophytes (Protistes)

algues brunjaune, vertjaune et diatomées algues brunes

6000

Dinobryon, Surirella

1500

Laminaria, Fucus

Rhodophytes (Plantes)

algues rouges

3900

Gracilaria, Gelidium, Chondrus

Pyrrhophytes (Protistes)

dinoflagellés, dinophytes

1100

Gymnodinium, Ceratium, Alexandrium

Cyanophytes (Procaryotes)

Cyanobactéries, algues bleues

Phaeophytes (Plantes)

Anabaena, Nostoc, Microcystis

Chlorophylles a,b amidon Xanthophylles Carotènes Chlorophylles a,b paramylon, Xanthophylles huiles, Carotènes sucres Chlorophylles a, Chrysolamic1, c2, Carotènes narine, fucoxanthine, huiles xanthophylles Chlorophylles a,b laminarine, Xanthophylles mannitol, Carotènes huiles Chlorophylles a amidon rarement d floridéen Xanthophylles carotènes, zéaxanthine, phycocyanine C, phycoérythrine Chlorophylles a, c1, amidon, c2, carotènes, fu- glycanes, coxanthine, péridihuiles nine, dinoxanthine

Cellulose, silice, CaCO3

eau douce et saumâtre

cellulose, alginate, fucoïdane cellulose, xylanes, galactanes, CaCO3

eau salée et saumâtre

cellulose ou absente

eau douce, saumâtre ou salée

eau douce, saumâtre et salée

Chlorophylles a, allophyco-cyanines, phycocyanine, phycoérythrine, phycoérythrocyanine

Remarque : Les Cyanophytes ou Cyanobactéries ont été ajoutées à titre de comparaison. 4. Structure : Le corps végétatif des algues est appelé un thalle. Il peut être constitué d'une cellule unique jusqu'à un grand nombre de cellules associées. - Les thalles les moins élaborées sont unicellulaires, coloniaux (cœnobes) ou filamenteux non ramifiés. il n'y a pas de communications cytoplasmiques entre les cellules. - Les thalles intermédiaires sont des filaments plus ou moins ramifiés, dont les cellules communiquent entre elles (plasmodesmes). On distingue une partie rampante et une partie dressée. - Les thalles fucoïdes (Fucus) sont les plus complexes, ils sont ramifiés et très structurés. Structure cellulaire d'une spirogyre

Chloroplaste en hélice Noyau Paroi cellulaire Limite entre 2 cellules

Gangue gélatineuse 4


Mis à part le groupe des Euglènes, chaque cellule possède une paroi, le plus souvent composée de cellulose. Les Euglènes ne possèdent pas de paroi rigide, ce qui leur donne une mobilité de forme caractéristique au cours de leur déplacement qui s'appelle le mouvement euglénoïde. Le noyau n'est présent que chez les eucaryotes (les cyanobactéries sont des procaryotes). La chlorophylle est contenue dans des chloroplastes chez les eucaryotes et dans des membranes lamellaires chez les cyanobactéries. Les Euglènes peuvent perdre leurs chloroplastes et donner des individus dépigmentés hétérotrophes peu différents des protozoaires flagellés (Peranema). Certaines algues unicellulaires mobiles (Euglènes, Chlamydomonas) possèdent un stigma, tache orangée qui rempli le rôle de photorécepteur et permet au micro-organisme de se diriger. Les flagelles sont présents en permanence chez certaines cellules comme Chlamydomonas ou les Euglènes. Chez d'autres espèces, ils sont absents ou présents seulement sur les spores. Des Cyanobactéries (Anabaena, Nostoc) sont capables de fixer l'azote atmosphérique grâce à la nitrogénase contenue dans les hétérocystes. La paroi de ces cellules spécialisées est plus épaisse pour protéger l'enzyme de l'oxygène qui lui est nocif. L'hétérocyste n'est pas capable de photosynthèse, mais est en relation avec les cellules somatiques adjacentes qui lui fournissent les matières carbonées en échange de composés azotés.

Cultivée dans un milieu riche en azote, la cyanobactérie ne produit pas d'hétérocystes. Par contre, dans un milieu pauvre en azote, ces cellules spécialisées se forment et le filament flotte grâce à des vésicules de gaz pour se rapprocher de l'interface avec l'air. 5. Reproduction : 5.1/ Reproduction asexuée : Elle peut être de 3 types : - fragmentation : le thalle se sépare en deux parties qui redonneront chacune un nouveau thalle. - sporulation : des spores peuvent être formées dans les cellules végétatives ordinaires ou dans des structures spécialisées appelées sporanges. Scenedesmus quadricauda x 1000 - scission binaire : division du noyau puis du cytoplasme. La forme caractéristique du cœnobe de Scenedesmus quadricauda provient de deux divisions successives par scission binaire. Les divisions suivantes provoquent la fragmentation de cette forme coloniale. Chez les cyanobactéries (Oscillatoria), des zones plus sensibles aux cassures appelées Hormogonies (flèches) sont présentes et favorisent ce mode de reproduction asexuée. Oscillatoria x 1000 contraste de phase 5


5.2/ Reproduction sexuée : Dans la reproduction sexuée, il y a fusion de gamètes mâle et femelle pour produire un zygote diploïde. Des œufs se forment dans les cellules réceptrices identiques aux cellules somatiques (Spirogyra) ou dans des cellules végétatives femelles peu modifiées nommées oogones (Fucus). Les spermatozoïdes sont produits dans des structures mâles spécialisées appelées anthéridies. Reproduction sexuée chez Spirogyra. ZY : zygospore ; FM : filament mâle ; FF : filament femelle ; TC : tube copulateur De la même façon que chez les Spirogyres, Œdogonium est capable de former des spores, mais à la différence des premières, la reproduction s’effectue au sein du même filament d’algue, entre deux cellules adjacentes. En laissant ces algues dans un bocal, près d’une fenêtre du laboratoire et en observant régulièrement cette préparation, on peut voir des spores se former. Avec un peu d’habitude, elles sont visibles à l’œil nu. 6. Caractéristiques des groupes d'algues : 6.1. Les Chlorophytes ou algues vertes : Elles présentent une grande diversité de forme, depuis le type unicellulaire jusqu'au type en colonie ou filaments. Certaines espèces ont un crampon qui leur permet de se fixer. Les algues vertes filamenteuses (Zygnématales) forment des masses chevelues et plus ou moins gluantes au toucher dans les mares - leur développement est le plus important au printemps, mais elles sont présentes en toutes saisons dans les points d’eau bien éclairés : mares, étangs et même dans les bassins des jets d’eau en association avec d’autres algues filamenteuses comme la diatomée Melosira.

Spirogyra et Mougeotia

Zygnema

Différentes espèces de Chlorophytes filamenteuses x 200.

Cladophora

Oedogonium

Spirogyra

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Melosira (ce n'est pas une chlorophyte mais une diatomĂŠe filamenteuse) Les Chlorophytes non filamenteuses peuvent ĂŞtre isolĂŠes ou bien en colonies plus ou moins importantes.

Pediastrum , Chlorophyte coloniale x 400

Pediastrum

Volvulina

Scenedesmus quadricauda

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Scenedesmus spp.

Spirotaenia

Volvox

Ankistrodesmus

Coelastrum

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Les Desmidiées

Closterium x 400

Cosmarium x 400

Pleurotaenium x 100

Staurastrum x 400

6.2. Les Charophytes Chara et Nitella peuvent être confondues avec des plantes aquatiques car elles sont ramifiées. Elles peuvent recouvrir la vase des mares ou des ruisseaux peu profonds. Nitella 6.3. Les Diatomées et les Chrysophytes: Les Diatomées forment la majeure partie du phytoplancton dans les zones les plus froides de l'océan et représentent la seule source d'alimentation pour les animaux vivant dans ces régions. On peut trouver jusqu'à 1 000 000 de diatomées par litre d'eau de mer. Les diatomées sont présentes depuis 200 millions d'années. Les diatomées possèdent une couche externe de silice que l'on nomme la frustule. Lorsque les diatomées meurent, leur contenu cellulaire se décompose et il ne reste plus que cette paroi externe qui sédimente et qui forme une roche que l'on appelle la diatomite ou terre de diatomées ("diatomaceous earth"). On peut observer de nombreuses diatomées ainsi que des silicoflagellés dans la diatomite que l'on trouve par exemple en Auvergne. La terre de diatomées ou Diatomite est utilisée comme abrasif, comme additif dans les décapants, les huiles décolorantes et désodorisantes et les engrais. Elle est également employée en tant que filtre pour les piscines, comme isolant thermique (briques réfractaires) et phonique et comme additif à la peinture pour augmenter la visibilité nocturne des signaux indicateurs et des plaques d'immatriculation. Les diatomées sont un indicateur de la pollution de l'eau. Les tolérances de différentes espèces ont été déterminées vis à vis de facteurs environnementaux (concentration en sels, pH, éléments nutritifs, azote, température).

Gyrosigma x 200 et détail du noyau x 400 (coloration au vert de méthyle)

Navicula x 400 en contraste de phase C’est une diatomée mobile dont le déplacement rappelle celui d’un navire vu de dessus.

Cocconeis est un genre de petite taille. Cellules vivantes et squelette siliceux (frustule) x 1000

Epithemiax1000, diatomée vivant en épiphyte sur ses congénères (ici sur les diatomées de grande taille Synedra et Cymatopleura elliptica)

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La diatomée filamenteuse Melosira x 200 et 400 Melosira varians est une espèce formant des colonies filamenteuses. Chaque cellule est cylindrique.

Tabellaria x 200, elle forme des colonies en palissade qui se fragmentent pour donner cet aspect en escalier. On peut aussi trouver des individus isolés

Fragillaria x 400

Gomphonema constrictum, diatomée pédonculée (x 400 et x 1000). Les membres de ce genre sont fixés par un style gélatineux simple ou ramifié.

Surirella spiralis x1000 et Surirella capronii x 1000. Les individus de ce genre comptent parmi les plus beaux.

Amphora sp. x 1000

Cymatopleura sp. x1000 et Cymatopleura elliptica x 400. Certaines espèces sont mobiles.

Caloneis x 400

Dinobryon x 400 (Chrysophyte)

Pour se procurer ce genre de spécimens, il suffit de récolter le dépôt brun-doré qui se forme à la surface des eaux stagnantes sous le couvert des arbres, dans les étangs ou les ruisseaux calmes. Toutes ces diatomées proviennent du même prélèvement, à la surface d’un cours d’eau peu rapide de sous-bois. Dans un prélèvement, on peut observer au moins une vingtaine d’espèces différentes de diatomées, sans compter les autres algues, cyanobactéries et protozoaires.

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6.4. Les Pyrrophytes ou Dinoflagellés : Gymnodinium, une Dinophycée marine responsable de "marées rouges" où l'eau peut contenir jusqu'à 46 millions de cellules d'algues par litre d'eau. Lors de la mort des cellules, la libération de substances toxiques provoque une grave pollution des coquillages et de la faune aquatique. Peridinium et Ceratium sont des Dinoflagellés d'eau douce.

Peridinium x 400

Ceratium x 400

6.5. Les Rhodophytes ou Algues rouges: Les Rhodophytes ne comptent pas de microalgues, mais seulement des espèces marines de grande taille comme Chondrus crispus (la mousse d'Irlande), qui produit des polysaccharides (carraghénanes) utilisés comme épaississants alimentaires, ainsi que pour immobiliser enzymes et cellules. 6.6. Les Euglenophytes Les cellules d’euglènes sont souvent déformables et la plupart d’entre elles possèdent un flagelle avant qui leur permet également de se mouvoir en l’agitant un peu comme un lasso.

Représentants du genre Euglena, noter la présence du stigma orangé x 400 et x 100 Le métabolisme des Euglènes est polyvalent. En présence de lumière, ils sont photo-autotrophes, et en absence de lumière ou après la perte de leur chloroplaste, ils deviennent organotrophes et sont en particulier capables de métaboliser le lactate. Cette propriété particulière, partagée avec les hépatocytes, en fait un modèle privilégié d'étude.

Phacus sp. x 400 et x 200

Détail du stigma et du fouet antérieur d'Euglena sp.

Euglena fusca, Anneaux clairs constitués de paramylon, un polysaccharide de réserve.

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Trachelomonas

Phacus pyrum

Phacus helicoïdes

Euglena rubra (syn. E. sanguinea) est chargé de pigments caroténoïdes et forme des efflorescences rouges à la surface des plans d'eau.

Détail des inclusions cytoplasmiques. Les carotéoïdes (dont l'astaxanthine) sont inclus dans des chromatophores pourpres. Les grosses inclusions correspondent à des granules de paramylon.

6.7. Les Phaeophytes Les algues brunes sont des espèces marines, elles ne comptent pas de microalgues mais certaines comme le Fucus produisent des polysaccharides de haute viscosité comme l’Agar-agar ou les Alginates. Cet embranchement regroupe les représentants des algues ayant le thalle le plus complexe. 12


II. LES MYCÈTES OU CHAMPIGNONS MICROSCOPIQUES

1. Description - Classification : L'identification repose encore principalement sur l'aspect du thalle (corps du champignon), la présence et les caractères morphologiques des organes reproducteurs (sexués ou non). Le terme "levure" décrit une morphologie fongique et non un groupe de la classification. De nombreuses levures se trouvent à l'état libre sur les végétaux (elles permettent leur fermentation dans la fabrication du vin, du levain comme c'est le cas de Saccharomyces ou Kluyveromyces), sur la peau (Candida albicans) ou dans le tube digestif (c'est le cas de Cryptococcus neoformans saprophyte des fientes de pigeon, mais responsable d'atteintes respiratoires pour les personnes immunodéprimées). Les levures du genre Rhodotorula entrent dans la composition des aliments pour les poissons. Etant riches en caroténoides, elles favorisent la coloration des truites saumonées et des poissons exotiques. Pour les levures, l'identification est morphologique (filamentation, formation de chlamydospores, présence d'une capsule) et biochimique (auxanogramme, phénol-oxydase, réduction du triphényl tétrazolium, résistance à l'actidione...) Détail des asques de la rouille du rosier Phragmidium sp. x 1000 2. Habitats : Les champignons microscopiques font partie intégrante de notre cadre de vie. On les rencontre dans l'air (Cladosporium, Rhodotorula), dans le sol, l'eau, à la surface des végétaux et des animaux. Ils interviennent dans la fabrication des aliments : La levure de boulangerie ou levure de bière Saccharomyces cerevisiae, Geotrichum candidum, Penicillium roqueforti et P. camemberti en fromagerie, certains Mucors pour la fabrication de produits fermentés asiatiques ; et aussi dans leur détérioration : Penicillium italicum sur les citrons, Mucorales sur les tomates ou le pain, Botrytys sur le raisin, à l'apex des courgettes et sur le chou ; sur le rebord des fenêtres en bois (Aureobasidium, Alternaria, Chaetomium), sur les confitures (Penicillium, Aspergillus). Les champignons peuvent être saprophytes en intervenant dans la dégradation des composés organiques du sol ainsi que d'autres substrats, ou bien parasites comme c'est le cas des Dermatophytes (para13


sites de l'homme et des animaux), des Entomophtorales (parasites d'insectes) et des champignons phytopathogènes (parasites de plantes). Les dermatophytes forment un groupe de champignons pathogènes pour l'homme et les animaux chez qui ils développent des teignes tondantes et des atteintes dermatologiques (pied d'athlète) et sont une profonde cause d'inconfort. Le Dermatophyte Microsporum canis, macro et microconidies x 400 Certaines espèces de moisissures poussent en symbiose avec des algues pour former les Lichens, ou associées aux racines des arbres pour la fixation d'azote (mycorhizes). Lichens sur un tronc Certains germes sont utilisés dans l’industrie comme germes tests de produits d’imprégnation des tissus contre l’attaque des cellulolytiques : Trichoderma viride, Chætomium globosum et Myrothecium verrucaria. Trichoderma viride est de plus utilisé pour produire industriellement des cellulases. En culture, ce champignon dégage souvent une odeur caractéristique de noix de coco. Aspergillus niger est utilisé industriellement dans la production de glucose oxydase et d'acide citrique. 3. Isolement et culture: 3.1 Cas général : Les moisissures s'isolent assez aisément sur les milieux de culture classiques : Sabouraud, Czapek ou PDA additionnés d'antibiotiques. Chaque genre forme une colonie ou thalle caractéristique, le plus souvent coloré. Certaines espèces comme les Mucor poussent en 48 H à 30°C, mais d'autres ont besoin de 7 à 15 jours pour se développer et sporuler (dermatophytes). Les moisissures peuvent s'observer directement à partir d'échantillons ou de produits pathologiques, ou après leur mise en culture, ce qui permet l'isolement et le développement des organes reproducteurs. Techniques d'observation : A partir d'une culture sur boîte, prélever avec des pinces fines une parcelle de gélose où le champignon s'est bien développé, déposer sur une lame et passer doucement à la flamme pour faire fondre l'agar sans dénaturer la moisissure, recouvrir d'une lamelle et lutter au vernis à ongles. Cette technique permet de conserver quelques temps l'objet à examiner. La technique des décalques au scotch est simple à réaliser et elle permet de conserver la topographie de l'échantillon : déposer sur une lame de verre 1 goutte de bleu lactique ou de lactofuchsine (fuchsine à 0,1% dans l'acide lactique), découper un ruban de scotch (pas de scotch "invisible" qui est opaque au microscope !) sans le souiller avec les doigts et appliquer le côté collant sur la culture à examiner, tamponner doucement puis retirer. Rincer ce prélèvement avec quelques gouttes d'alcool absolu qui prévient la formation d'éventuelles bulles d'air au contact du colorant et permet d'éliminer l'excès de spores. 3.2 Exemple d’isolement de champignons, les moisissures cellulolytiques du sol : Les champignons contribuent largement à la dégradation aérobie de la cellulose dans le sol, et en particulier dans les terrains acides, et lorsqu’il s’agit de dégrader la cellulose qui est enrobée par de la lignine comme c’est le cas du bois. Les espèces des genres Fusarium (Deutéromycète) et Chætomium (Ascomycète) sont prédominantes. D’autres espèces peuvent aussi se rencontrer, comme les Zygomycètes du genre Mortierella ou les Deutéromycètes : Trichoderma viride, Aspergillus fumigatus et Asp. nidulans, Botrytis cinerea, Rhizoctonia solani, Humicola sp., Stachybotrys sp., Cladosporium herbarum, Aspergillus terreus, Aspergillus niger, Penicillium luteum., Diplodia, Myrothecium verrucaria, Sporotrichum, Acremonium charticola, Beauveria, Epicoccum, Papulospora, Phoma, Piyhomyces, Scopulariopsis, Ulocladium. 14


Une technique d’isolement des germes cellulolytiques facile à mettre en œuvre est celle mise au point par S. Winograsky au début du siècle. Elle consiste à appliquer sur un gel minéral de silice, une solution nutritive ne contenant pas de source de carbone. Celle-ci est apportée sous forme de cellulose. Silico-gel au papier (Technique de Winogradsky) : Dans une boîte de silico-gel, déposer 2 mL de la solution de Winogradsky et 1 mL de nitrate de sodium à 1% préalablement portés à ébullition. Porter les plaques à l'étuve à 45-50°C jusqu'à évaporation presque complète de l'eau (2 heures) Appliquer une rondelle de papier filtre (substance énergétique) sur le silico-gel. Prélever à l'aide d'une pipette Pasteur boutonnée humectée, de petites particules de terre de la grosseur d'une tête d'épingle et les déposer sur le papier filtre en les alignant régulièrement et en les espaçant de 1 cm environ. Recouvrir la boîte et mettre à incuber pendant 7-15 jours dans une chambre humide à l'étuve à 28 °C. Prélever à l'aide d'une pince un fin lambeau de papier, dans une goutte d'eau, le dilacérer sur une lame, fixer à l'alcool à 95°, colorer au violet de gentiane ou à l'érythrosine, laver, égoutter, sécher, observer. On peut observer des bactéries du genre Cytophaga qui donne des colonies jaunes en gelée et des champignons des espèces précédemment citées. Stachybotrys x 400 4. Quelques observations : LES MYCETES

Aspergillus glaucus

Aspergillus clavatus

Aspergillus terreus

Aspergillus niger

Alternaria

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Botrytys

Chaetomium (pÊrithèce et spores)

Cladosporium

Fusarium

Humicola

Mucor

Actinomucor

Rhizopus

Paecylomyces

Penicillium

Penicillium

Scopulariopsis

Stachybotrys

Trichoderma

Verticillium

Geotrichum

Phragmidium (rouille du rosier)

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Candida albicans (milieu RAT : chlamydospores)

Candida non albicans (milieu RAT)

Cryptococcus neoformans (coloration à l'encre de Chine)

Microsporum canis (Dermatophyte)

Epidermophyton flocosum (Dermatophyte)

Trichophyton mentagrophytes (Dermatophyte)

Oïdium du frêne (Cléistothèque)

Oïdium du frêne (Asques)

Oïdium du frêne (Anamorphe)

Histoplasma (sol)

Rhinocladiella

Saccharomyces cerivisiae

Acremonium

Eurotium chevalieri. Tête aspergillaire et asques

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IV. LES MICROORGANISMES PROCARYOTES

Introduction Les procaryotes sont des microorganismes dépourvus d'enveloppe nucléaire et dont le niveau d'organisation cellulaire est en général plus simple que celui des eucaryotes (vrai noyau). On les appelle bactéries. Dans l'environnement, ils interviennent dans les cycles de transformation de la matière et sont présents dans le sol, l'air, ainsi que dans les milieux contenant de l'eau. Certains groupes bactériens peuvent causer des maladies, alors que d'autres sont des producteurs d'antibiotiques. Beaucoup sont des auxiliaires utiles en agronomie ou en industrie agroalimentaire. 4.1. Le cycle de l'azote

La Nitrification Les composés azotés organiques sont oxydés dans le sol par les microorganismes. Les germes du genre Bacillus interviennent essentiellement dans l'ammonification. L'ammoniaque ainsi formée est oxydée en nitrite par Nitrosomonas, puis en nitrate par Nitrobacter. Le nitrate est utilisé par les végétaux ou par les autres microorganismes pour leurs synthèses grâce à une nitrate réductase assimilatrice.

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La Dénitrification En anaérobiose, l'azote nitrique est réduit en NO2-, NO, N2O puis N2 par des bactéries des genres Pseudomonas, Micrococcus, Thiobacillus, Achromobacter ou Bacillus. On parle de "respiration nitrates" grâce à une nitrate réductase dissimilatrice stade azote. Certains germes comme Escherichia coli ou Enterobacter aerogenes sont capables de "respirer" les nitrates en anaérobiose et produisent des nitrites (nitrate réductase dissimilatrice stade nitrites). Fixation de l'azote atmosphérique Les procaryotes sont les seuls organismes capables de puiser l’azote dans l'immense réservoir qu’est l’atmosphère. La fixation peut être réalisée soit librement, soit en symbiose (association profitable aux deux organismes impliqués). Ces germes peuvent réaliser les réactions aboutissant à la conversion de l’azote moléculaire en azote organique. La fixation symbiotique d’azote chez les légumineuses peut produire 100 à 300 kg d'azote par hectare et par an et chez les organismes libres de 1 à 3 kg. L'enzyme responsable de la fixation est la nitrogénase qui transforme l'azote moléculaire de l'atmosphère en ammoniaque. Les systèmes enzymatiques de la nitrogénase isolés de microorganismes variés présentent beaucoup de similitudes. Leur propriété la plus remarquable est leur extrême sensibilité à l’oxygène. Certains éléments sont nécessaires à l’état de traces à l’activité de cette enzyme, c’est le cas en particulier du Molybdène et du Nickel. Dans la composition de la nitrogénase, le Molybdène peut dans certains cas être remplacé par le Vanadium. 4 1 1/ Fixation libre : L’aptitude à la fixation d’azote est largement répandue parmi les bactéries du sol et de l’eau. Pratiquement tous les groupes physiologiques présentent des individus capables de fixer l’azote de façon plus ou moins efficace. Bactéries sulfureuses Chromatium

Anaérobies strictes Clostridium Méthanogènes

Fixation libre d'azote Procaryotes phototrophes Autotrophes Bactéries cyanobactéries non sulfureuses Rhodopseudomonas Anabaena Azotobacter Rhodospirillum Tricodesmium Beijerinckia Gleothece Xanthobacter autotrophicus Calothrix Alcaligenes latus Nostoc Derxia gummosa Anaérobies facultatifs Klebsiella pneumoniae Bacillus polymyxa Erwinia

Bactéries sulfurogènes Desulfovibrio Desulfotomaculum

Archaebactéries méthanogènes Methanosarcina Methanococcus

Micro aérophiles Azospirillum Aquaspirillum Arthrobacter

Actinomycètes Frankia

a/ Exemple des Azotobacteriaceae: Il semble que de nombreux germes soient capables de fixer l’azote, mais que les conditions de leur milieu habituel n’induisent pas ce système enzymatique. Alors que la plupart des fixateurs d’azote ne peuvent le faire que sous des pressions d’oxygène réduites, le groupe des Azotobacter est totalement adapté à une atmosphère oxygénée. Azotobacter chroococcum, A. vinelandii, Beijerinckia indica, Derxia gummosa et Azomonas agilis appartiennent aux bactéries qui peuvent être facilement isolées par ensemencement à partir d’eau ou de terre d’un milieu nutritif manquant d’azote. La rhizosphère de certaines plantes contient une accumulation de bactéries fixatrices d’azote, c’est le cas de Azotobacter paspali sur la surface des racines de Paspalum notatum, et Azospirillum lipoferum dans la rhizosphère de Digitaria decumbens. Azotobacter sp. coloration à la safranine x 1000 19


Azotobacter : En forme de larges cellules ovoïdes, de 2 µm ou plus de diamètre, Gram négatif. Les cellules sont souvent par paires ou en chaînes de taille variable. Elles forment des kystes. Aérobies. Germes fixateurs d'azote non symbiotiques (10 mg d'N atmosphérique/g de glucose consommé) dans les sols déficients en azote. La présence de molybdène ou de vanadium est indispensable à la fixation d'azote. Présence d'une oxydase dont l'activité est exceptionnellement élevée, ce qui permet de protéger la nitrogènase de l’oxygène atmosphérique qui lui est inhibiteur. Présence intracellulaire de poly-ß-hydroxybutyrate. Production de mélanine. b/ Isolement : Technique de la terre moulée : La fixation libre d’azote peut facilement être mise en évidence par la technique de la terre moulée (Beijerinck): Réaliser un mélange de terre pauvre en azote et tamisée + 5 % amidon (+ éventuellement 5 % CaCO3 et 0,5 % KH2PO4). Mouiller avec de l’eau jusqu’à obtention d’une pâte molle, mais pas trop. Lisser la surface au moyen d’une spatule puis incuber à 30 °C en chambre humide. Au bout de 48 heures : observer en profondeur Clostridium qui se développe en dégageant du gaz et produit des boursouflures de la terre ; observer en surface Azotobacter qui se développe en formant de petites tâches hyalines, brillantes et humides. Au bout de 8 jours, les colonies d’Azotobacter sont devenues brunes (formation des kystes mélaniques). Technique des Silico-gels (Winogradsky) : (voir plus loin pour la fabrication des silico-gels). Utilisation de l'azote atmosphérique Ajouter sur les plaques de silico-gel 1 mL de la solution standard de Winogradsky à laquelle on a ajouté 0,3 g/mL de CaCO3 (pour émailler la surface du gel) et 0,1 g/mL de glucose. Prélever à l'aide d'une pipette Pasteur boutonnée humectée, de petites particules de terre et les déposer en les alignant régulièrement et en les espaçant de 1 cm environ. Recouvrir la boîte et mettre à incuber à 30 °C en chambre humide pendant 8 jours. Les bactéries observées forment des colonies blanches, bombées, crémeuses qui brunissent par la suite. Il s'agit d'Azotobacter chroococcum qui est capable de former des kystes ronds et contenant des réserves lipidiques. Les kystes peuvent être colorés par différentes techniques : - Coloration à la violamine selon Winogradsky : (violamine 2R 1 g ; phénol 5 g ; eau distillée 100 mL) Un frottis sec et fixé est coloré pendant 45 secondes, rincé et contre coloré avec du cristal violet dilué (0,05%) pendant 1 minute. - Coloration à l'acridine orange : Les cellules sont suspendues dans une solution d'acridine orange à 0,01% dans l'eau. Une goutte de cette solution est déposée sur une lame et recouverte de 2 gouttes d'huile de paraffine. Les gouttes sont alors étalées comme pour un frottis sanguin. La préparation est montée avec une lamelle et examiné en microscopie à fluorescence : les cellules végétatives sont vertes et les kystes ont une partie centrale verte et une enveloppe rouge. 4 1 2 Fixation symbiotique : La fixation symbiotique d’azote peut être réalisée par différentes associations d’organismes : les racines des plantes peuvent être colonisées par des Actinomycètes (Frankia avec Alnus, Casuarina, Myrica), des champignons (mycorhizes), ou des bactéries (Rhizobium). L’association peut se faire entre une cyanobactérie et une bryophyte (Anthoceros, Blasia, Caricula), une fougère ou pteridophyte (Azolla avec la cyanobactérie Anabaena azolla), des angiospermes (Gunnera), des gymnospermes (Agathis, Cycas, Macrozamia) ou des lichens (Collena, Lichina, Peltigera).

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a/ Rhizobium Les Rhizobium sont des bacilles gram négatif. Ce sont des germes mobiles, aérobies, capables de coloniser les racines de légumineuses en formant un cordon d’infection le long des poils absorbants. Il se développe par la suite des nodosités contenant le germe sous forme de bactéroïdes de formes diverses (en Y, en X, en massue). Certaines espèces peuvent former des nodules de tige (caulinaires), c’est le cas de Azorhizobium caulinodans pour la plante Sesbania, dont les nodules forment des chapelets le long de la tige. Les lipides sont stockés dans la cellule sous forme de granules de poly-ß-hydroxybutyrate. De nombreuses sources de carbone peuvent être utilisées. Il y a production de grandes quantités de polysaccharides exocellulaires. Activité fixatrice d’azote en symbiose avec les racines de légumineuses par l’intermédiaire d’une nitrogénase. La nitrogénase est protégée de l’oxygène qui lui est toxique par l’intermédiaire d’un pigment symbiotique, la Leghémoglobine (la plante code pour la globine et la bactérie pour l’hème), ce qui explique la coloration rouge des nodosités actives. Rhizobium leguminosarum var.trifolii x 1000 dans un nodule de trèfle Isolement de Rhizobium sp.: Il est possible d’isoler Rhizobium sp. en culture pure à partir de nodosités de légumineuses en suivant ce protocole (l’espèce de la bactérie dépend de la plante hôte) : La plante utilisée devra être prélevée sur un sol de préférence sableux, pauvre en azote, favorisant la fixation de l’azote atmosphérique (la bactérie utilise préférentiellement l’azote nitrique du sol lorsqu’il est présent). - Déterrer des plants de trèfle ou d'autres légumineuses et rincer les racines à l’eau courante pour éliminer la terre. - Repérer les nodosités et les prélever au moyen d’un scalpel ou de ciseaux. - Broyer une nodosité sur une lame de verre, colorer au bleu de méthylène ou à l’érythrosine et observer. - Transférer les autres nodules dans un tube à hémolyse et recouvrir 10 à 15 minutes avec de l’eau de javel diluée contenant quelques gouttes de savon liquide. - Rincer plusieurs fois avec de l’eau physiologique stérile et ne garder finalement que 0,5 mL environ. - Broyer les nodosités près de la flamme à l’aide d’un agitateur en verre stérile. - Faire un isolement du broyat sur boîtes de Pétri contenant du milieu YEM. - Après 3 à 5 jours d’incubation à 30 °C, les colonies de Rhizobium sont blanches, de 2 à 4 mm de diamètre, circulaires, convexes, semi translucides, mucilagineuses. Les bactéries ont perdu leur aspect de bactéroïdes et sont en culture des bacilles Gram négatif. b/ Frankia Frankia appartient au groupe des Actinomycètes. La fixation d'azote a lieu dans des vésicules à l'extrémité des hyphes. Cette bactérie filamenteuse forme des nodules sur les racines d'aulne, pouvant atteindre la taille d'une balle de tennis. Ces nodules sont visibles au bord des cours d'eau, sur les racines dégagées d'aulnes. Elles sont immergées en hiver et à l'air libre pendant la saison sèche. Nodules formés par Frankia sp. sur des racines d'Aulne

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4.2 Les bactéries phototrophes : 4.2 1/ Description – Classification Les bactéries phototrophes sont des microorganismes procaryotes capables de réaliser la photosynthèse. Procaryotes phototrophes Photosynthèse aérobie Bactéries pourpres Bactéries vertes Non sulfureuses Rhodospirillum Rhodopseudomonas Rhodobacter Rhodocyclus Rhodomicrobium Heliobacterium

Sulfureuses Thiospirillum Chromatium Thiocapsa Amoebobacter Thiopedia Ectothiorhodospira

Non sulfureuses Chloroflexus

Sulfureuses Chlorobium Prosthecochloris Pelodictyon Chlorochromatium Pelochromatium

Photosynthèse anaérobie Cyanobactéries Anaboena Oscillatoria

4.2.2. Habitat : Les bactéries phototrophes sont présentes dans la plupart des milieux liquides. Dans les lacs et les étangs, elles sont trouvées à des profondeurs différentes en fonction de leur comportement vis à vis de l'oxygène, de leurs besoins en H2S et de leur équipement pigmentaire qui leur permet de capter la lumière à une profondeur plus ou moins grande. 4.2.3. Observation directe - Enrichissement : L'observation d'un prélèvement de sédiment noir au bord d'un étang (à 15-20 cm de profond) permet d'observer diverses espèces de bactéries phototrophes dont certaines ont une forme ou un mode de groupement ou de déplacement caractéristique. Les cellules rondes de Thiopedia rosea forment des colonies rouges en "carré". Chromatium est un gros bacille incurvé, large et arrondi, contenant des inclusions de soufre et il se déplace grâce à deux flagelles polaires.

Thiopedia rosea x 1000 Chromatium sp. x 1000

Rhodospirillum rubrum x 1000 et x 100 autour de grains de fécule de pomme de terre

Enrichissement en colonne de Winogradsky : Pour l'observation des bactéries phototrophes, outre l'observation directe qui demande une bonne connaissance des espèces rencontrées, une technique d'enrichissement utilisée depuis longtemps est la réalisation d'une colonne de Winogradsky.

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Bactéries filamenteuses blanches Zone aquatique aérobie

Algues vertes Cyanobactéries

Zone aquatique anaérobie

Rhodospirillum (bactéries non sulfureuses pourpres) Chromatium (bactéries sulfureuses pourpres)

Chlorobium (bactéries sulfureuses vertes) Sédiments anaérobies

Desulfovibrio, Clostridium

Il s'agit de mélanger des sédiments noirs avec de la matière organique (papier, fécule de pomme de terre, vitamine B12, ...) au fond d'une éprouvette de 1 litre haute, ajouter du plâtre (sulfate de calcium) ou du Rhodospirillum thiosulfate comme réserve de soufre, recouvrir d'une fine couche de sable et remplir l'éprouvette à ras bord avec de l'eau provenant du même milieu. Ce montage est éclairé en permanence avec une ampoule de 60 Chromatiaceae W. Au bout de quelques jours la matière organique noircit par production d'H2S (essentiellement par Desulfovibrio). Pratiquement tout l'oxygène du milieu est consommé par les germes aérobies et il se forme des gradients contraires d'oxygène dissout et de sulfure d'hydrogène. Les bactéries phototrophes possédant des vésicules de gaz se placent à la hauteur qui leur convient le mieux dans la colonne et elles forment ainsi des anneaux verts ou rouges. Les bactéries sulfureuses vertes se développent en premier mais elles sont rapidement supplantées par les bactéries phototrophes pourpres sulfureuses et non sulfureuses. On peut également trouver dans cette colonne des algues, des cyanobactéries et divers ciliés. (La composition de milieux de culture pour ces bactéries est donnée plus loin).

4.3. Les Cyanobactéries : De même que les algues vertes, les cyanobactéries peuvent être sous forme de cellules isolées, de cœnobe (Microcystis) ou de filaments (Nostoc, Anabaena).

Merismopedia x 400

Microcystis aeruginosa x 200

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Oscillatoria x 400 et x 100 En plus de la chlorophylle a, les cyanobactéries contiennent un pigment bleu : la phycocyanine, et un pigment rouge : la phycoérythrine.

4.3.1. Description : Les cyanobactéries possèdent deux types de morphologie : rondes ou filamenteuses. Ce sont des procaryotes phototrophes. Certains membres peuvent également fixer l'azote atmosphérique tel Anabaena sp. grâce à la nitrogénase contenue dans les hétérocystes (cellules spécialisées dans la fixation d'azote). La paroi des hétérocystes est plus épaisse pour protéger l'enzyme de l'oxygène qui lui est nocif. L'hétérocyste n'est pas capable de photosynthèse, mais il est en relation avec les cellules somatiques adjacentes qui lui fournissent les matières carbonées en échange de composés azotés. Anaboena flos aquae x 400 Cultivée dans un milieu riche en azote, la cyanobactérie ne produit pas d'hétérocystes. Par contre, dans un milieu pauvre en azote, ces cellules spécialisées se forment et le filament flotte grâce à des vésicules de gaz pour se rapprocher de l'interface avec l'air. La fixation libre d’azote par les cyanobactéries est d’importance considérable, elle a été montrée chez au moins 40 espèces de cyanobactéries en culture pure. La fixation peut également se faire en symbiose avec des champignons (lichens), des plantes ou des fougères (Azolla).

Nostoc (Cyanobactérie, en vert) dans des racines aériennes chez Cycas, faible grossissement

Nostoc (Cyanobactérie) dans un parenchyme de Cycas (x 400)

Nostoc libre recouvrant un sol après la pluie.

Anabœna, ainsi que des Oscillaires (Oscillatoria) peuvent être isolées à partir d'un sol recouvert épisodiquement par de l'eau (fond des flaques). Un voile bleu-vert se développe à la surface du sol, emprisonnant des bulles d'air. On trouve aussi des cyanobactéries sur le sable des berges des rivières où elles forment une croûte qui sèche et se réimbibe régulièrement. 24


Les cyanobactéries recouvrent au fond des rivières les galets d'une couche noire et visqueuse (Gleocapsa) et le sable de filaments bruns (photo). Microcystis aeruginosa forme une poussière verte à la surface des plants d'eau au mois d'août. 4.4 Les Actinomycètes 4.4.1. Description : Les Actinomycètes sont des germes filamenteux, souvent ramifiés, présentant une grande diversité. Ils comprennent : Actinomycètes Actinomyces Arachnia Bacterionema Rothia Agromyces

Mycobactéries Mycobacterium

Fixateurs d'azote Frankia

Actinoplanes Actinoplanes Streptosporangium

Nocardias Nocardia Rhodococcus

Streptomycètes Streptomyces Streptoverticillum

Micromonosporas Micromonospora Thermoactinomyces Thermomonospora

Sporichthya Microcellobispora Kitasatoa Chainia

Dermatophilus Dermatophilus Geodermatophilus

Le genre Streptomyces : Les germes du genre Streptomyces sont des bactéries aérobies, Gram positif, capables d'utiliser de nombreux composés organiques comme seule source de carbone et l'azote sous forme minérale. Ces bactéries forment un mycélium très ramifié, structure unique chez les procaryotes. A maturité, le mycélium aérien produit des chaînes de spores. Les Streptomyces possèdent des éléments intégratifs, des plasmides linéaires géants, des plasmides conjugatifs et des transposons. La taille de leur génome est importante (de 6,5 à 8 Mb) et il pourrait exister sous forme linéaire ou circulaire. Il présente une grande instabilité génétique. Les colonies sont caractéristiques, rondes et poudreuses, le plus souvent colorées et légèrement enfoncées dans la gélose. Des pigments diffusibles peuvent être présents. Un grand nombre de souches produisent des antibiotiques. Les Actinomycètes répandent une odeur terreuse ou de moisi, parfois fruitée. Colonies pigmentées de Streptomyces 4.4.2. Habitat : Les Actinomycètes sont abondants dans les sols riches en matière organique en décomposition avec formation d'humus, le pH optimum se situe autour de 6,8-8,5. La température optimum de la plupart des espèces est comprise entre 25 et 35°C. La résistance des spores est de plus de 10 ans en terre desséchée ou sur les graines. 4.4.3. Isolement de Streptomycètes - Observation : La chitine, l'amidon, le glycérol, l'arginine, l'asparagine, la caséine et les nitrates permettent un bon développement des Streptomycètes alors que les bactéries et champignons poussent faiblement. Pour enrichir un prélèvement de sol en Streptomycètes, suivre le protocole suivant : - Prélever un échantillon de sol à une dizaine de cm en dessous de la surface. - Laisser le sol se déshydrater à l'abri de la poussière, à température ambiante pendant une durée plus ou moins longue (de quelques jours à quelques mois). - Transférer quelques grammes de terre dans un tube stérile, reboucher et mettre à incuber dans un bainmarie à 50°C pendant 1 heure. 25


- Suspendre 1 g de cet échantillon dans 10 mL d'eau physiologique stérile, agiter et laisser décanter, cette suspension constitue la dilution 10-1. Faire des dilutions au 1/10° jusqu'à 10-4. - Étaler 100 µL des dilutions 10-2 à 10-4 sur milieu de Kuster-glycérol en boîtes de Pétri de 90 mm. - Incuber au moins une semaine à l'étuve à 30°C. Au bout de quelques jours, des colonies colorées et typiques des Streptomycètes vont apparaître. D'autres bactéries se développent (Bacillus, autres Actinomycètes tel que Micromonospora, ...) La technique de décalque au scotch donne de très bons résultats avec un ruban adhésif de bonne qualité optique. Déposer le calque sur une goutte de bleu de méthylène ou de violet cristal et observer à l'immersion. Les hyphes sont beaucoup plus petits que ceux des champignons. La formation de crosses et de chaînes de spores est caractéristique :

Streptomyces cellulolytique, crosses et vrilles x 1000

Streptoverticillium Spores en chaînettes x 1000

4.5. Bactéries du soufre et du fer : 4.5.1. Oxydation du soufre : Le soufre élémentaire et/ou les sulfures sont oxydés en sulfate. Soit en conditions anaérobies par les bactéries phototrophes telles que Chromatium, Rhodobacter, ou Chlorobium, soit en conditions aérobies par Thiobacillus thiooxydans et Th. sp. dans les milieux acides, Thiothrix, Sulfolobus et Beggiatoa dans les milieux neutres. Thiothrix forme des colonies en rosettes ou "queues d'agneaux" dans les eaux très polluées, à la surface de la vase. Beggiatoa (photo ci-contre) s'observe facilement dans des prélèvements de vase, à 20 cm sous la surface de l'eau. C'est une bactérie filamenteuse incolore contenant de nombreuses inclusions de soufre dans son cytoplasme. Elle peut être trouvée fixée sur des algues vertes filamenteuses et associée à Thiopedia rosea. Beggiatoa est phylogénétiquement proche d'Oscillatoria, une cyanobactérie d'eau douce. Achromatium oxaliferum est une bactérie sulfureuse ronde, non photosynthétique. Elle contient des inclusions de soufre et de carbonate de calcium. Les corps microbiens sont de grande taille (jusqu'à 100 µm) et leurs inclusions peuvent faire penser qu'il s'agit de minéraux plus que de bactéries. Ces bactéries se rencontrent à la surface des sédiments. Achromatium oxaliferum x 400 4.5.2. Sulfato-réducteurs (Anaérobies strictes) : Les bactéries sulfato-réductrices se trouvent essentiellement dans les sédiments noirs et la vase où la matière organique est décomposée en atmosphère anaérobie (jusqu'à 107 sulfato-réducteurs/mL de sédiments). Le sulfure d'hydrogène dégagé correspond au produit terminal de la respiration des sulfates. 26


Desulfovibrio produit du soufre et du sulfure d'hydrogène par décomposition du sulfate contenu dans l'eau de mer. Cette bactérie intervient également indirectement dans la corrosion du fer en libérant des protons à partir de l'hydrogène moléculaire. Les ions ferriques formés précipitent les sulfures pour former FeS et donner leur couleur noire aux sédiments. Pour enrichir les bactéries sulfato-réductrices, ensemencer un milieu nutritif contenant du lactate et du sulfate ainsi qu'un grand clou qui procure au milieu un potentiel redox suffisamment bas par polarisation cathodique. Le soufre élémentaire doit être réduit en sulfure par Desulfuromonas acetoxidans qui ne peux pas réduire le sulfate en sulfite. Cette réaction est couplée avec l'oxydation de substrats tels que l'acétate ou l'éthanol. Le soufre élémentaire ainsi que d'autres substrats comme le thiosulfate, le sulfite ou le DMSO peuvent être réduits par des bactéries aérobies facultatives telles que Campylobacter, Proteus, Pseudomonas ou Salmonella peuvent également réduire le sulfure, le sulfite ou le thiosulfate mais pas le thiosulfate. 4.5.3. Oxydation du Fer : Ces bactéries sont capables de se développer sur le fer ferreux pour former des précipités complexes de fer ferrique. Parmi elles se trouvent les genres Gallionella, Thiobacillus, Crenothrix, Siderococcus, Siderocapsa, Siderocystis ou Toxothrix. Gallionella ferruginea : Cette petite bactérie sécrète à son flan concave un polymère qui prend une forme hélicoïdale et lui permet de faibles mouvements. Gallionella ferruginea x 1000 Leptothrix ochracea est une bactérie engainée, régulièrement trouvée avec Gallionella, avec laquelle elles forment un floculat de couleur rouille dans les cours d'eau. Il semble que son rôle dans l'oxydation du fer soit remis en cause depuis peu car dans cet habitat les ions ferreux sont capables de s'oxyder d'euxmêmes.

Filament de Leptothrix ochracea recouverts de précipité de fer et de manganèse x 1000

Masses colorées de Leptothrix au niveau d'une source ferrugineuse.

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4.6. Autres procaryotes : Zooglea ramigera produit une capsule et permet aux cellules de rester associées en colonies digitées. Cette matrice constitue le "floc" des boues activées.

Sphaerotilus natans est une bactérie qui forme des filaments. Les corps bactériens sont inclus dans une gaine. Avec d'autres bactéries filamenteuses telles que Beggiatoa ou Microthrix, elle est responsable du colmatage des filtres des centrales d'épuration et empêche également la décantation des flocs. Sphaerotilus natans forme des colonies chevelues à la sortie des égouts. Sphaerotilus natans x 400 (contraste de phase)

Nevskia ramosa forme des dépôts blanchâtres en se développant à la surface des plans d'eau (Neuston)

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V. PROTOZOAIRES

1. Habitat - Isolement - Récolte : Certains protozoaires se rencontrent à l'état libre dans l'eau. D'autres font partie de la flore digestive de diverses espèces comme la grenouille, les termites ou les ruminants. D'autres encore sont des parasites comme Trypanosoma (maladie du sommeil) ou Plasmodium (Malaria). Pour récolter les espèces d'eau douce, il faut prélever la surface de la vase, les plantes d'étang ou d'aquarium en flacons transparents et laisser décanter. Dans les bois, les feuilles des arbres tombent dans les points d'eau et leur décomposition produit une odeur désagréable, mais ce milieu est très riche en ciliés. Le voile de surface qui se forme en laissant macérer du foin ou divers végétaux dans de l'eau, contient de très nombreux ciliés et autres rotifères. Un milieu de culture facile à réaliser consiste à stériliser un grain de blé ou de riz dans 5 mL d'eau en tube de verre et à ensemencer ce milieu en prélevant un cilié sous le microscope. Le cilié va se diviser, alimenté par les bactéries cotransférées qui se développent grâce à l'amidon du grain de céréale. Les protozoaires d'intérêt médical sont prélevés et fixés en laboratoire spécialisé. 2. Observations microscopiques : Les espèces libres de l'eau s'observent à proximité des débris organiques. Pour les observer à partir d'un prélèvement en flacon de vase ou de plantes aquatiques, il faut prélever à l'aide d'une pipette Pasteur les débris végétaux du fond ou la couche de surface, les déposer sur une lame de verre, laisser reposer quelque instants pour permettre aux rhizopodes de se fixer, et observer au faible grossissement (cette technique permet aussi d'observer le zooplancton sans l'écraser). Pour une observation plus fine, il est nécessaire de recouvrir d'une lamelle. Les ciliés et les rotifères sont fortement mobiles et s'observent facilement. Les amibes et autres rhizopodes se trouvent concentrés autours des débris, ils ont une réfringence particulière, mais ils se voient mieux en contraste de phase. 3. Classification -Systématique des protistes : Les protistes regroupent des organismes unicellulaires, végétaux (algues unicellulaires), fongiques et animaux (protozoaires). On retrouve dans cette classification des algues (Chrysophycées, Chrysomonadines, Chloromonadines, Silicoflagellés, Diatomées, Dinobryon, Synura, Dictyocha, Cryptomonas, Euglènes, Algues vertes (Chlamydomonas), Volvox) et des microorganismes également classés parmi les champignons (Dictyostelium discoïdum, Acrasia, Myxomycètes). La classification des protistes n'est pas totalement fixée, de par l'hétérogénéité de ses membres.

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Classification simplifiée : Embranchement Sarcodina ou Rhizopodes

Classe

Ordre

Mastigophora ou Flagellés Sporozoa ou Sporozoaires Suctoria Euciliata Cilipphora ou Ciliés

Hétérotriches Holotriches Péritriches Hypotriches

Caractéristiques

Représentants Amoeba Arcella, Difflugia Peranema, Leishmania, Trypanosoma, Giardia, Trichomonas Plasmodium, Toxoplasma Acineta, Tokophrya Stentor, Blepharisma Litonotus, Paramecium Vorticella Aspidisca, Euplotes, Stylonychia

Classification récente : (D'après P. de Puytorac, J. Grain et J.P. Mignot, Précis de Protistologie, Boubée, 1987) Embranchement ou Sous-embranchement Classe Sous-Classe Caractéristiques Phylum ou Sub-Phylum Karyoblastea grande amibe Karyoblasta d'eau douce Lobosea pseudopodes Gymnamoebia Pas de thèque, Amoebozoa Rhizopoda lobés Testacealobosia Amibes testacées Filosea pseudopodes filiformes, thèque ou non Acarpomyxea amibes unicellulaires très ramifiées. Mycetozoa Protosteiliea formation d'un pseudoplasmode, fructification. très proches des champignons inférieurs. Guttulinea Myxogastrea Myxomycètes Plasmodiophorea parasites des plantes (racines de crucifères) Granuloreticulosa Granuloreticulosea filopodes réticulés granuleux Labyrinthulea colonies en forme Labyrinthomorpha de réseau, cellules fusiformes Actinopoda pseuHeliozoa Cryptaxohelidea dopodes et axopodes Phaneraxohelidea Acanthara Acantharea squelette de sulfate de strontium Polycystina Polycystinea Radiolaires, capsule centrale perforée Phaeodara Phaeodarea Radiolaires Dinoflagellidea Dinoflagellés, Dinoflagellata Péridiniens Chromomastigophora flagellés, le plus Oligomastigophora Mastigophora : flagellés, le plus souvent pigmentés souvent pigmentés

Prymnesea Proteromonadea

Cryptomonadea Euglenidea

Représentants Pelomyxa palustris Entamoeba histolytica Arcella, Difflugia Vampyrella

Dictyostelium discoïdum

Acrasia Myxomycètes

Foraminifères Labyrinthulea

Héliozoaires : Actinophrys

Acanthaires

Gymnodinium, Ceratium Chrysophycées, Chrysomonadines, Chloromonadines, Silicoflagellés, Diatomées, Dinobryon, Synura, Dictyocha

marines, planctoniques flagellés aplastidiés, commensaux du tube digestif des reptiles et batraciens Cryptomonas Euglènes

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Phytomonadea

Algues vertes

Choanomonadea

flagellés aplastidiés

Kinetoplastidea

Bodo, Trypanosoma, Leishmania

Metamastigophora zooflagellés libres ou commensaux

Retortamonadea

commensaux ou parasites

Diplomonadea Oxymonadea

Parabasala

Trichomonadea Hypermastiginea

Giardia commensaux ou symbiontes (termites, crapauds, lézards) stades amiboïdes Trichomonas microfaune intes- Cryptocercus tinale des termites et de flagellés endocommensaux du tube digestif des poissons et amphibiens, ampoule rectale des Anoures petits protistes benthiques, proches des flagellés tous parasites, production de spores de dissémination Gregarines

Opalinatea

Opalinata

Pseudociliata

Sporozoa

Blastogregarinea

parasites de Polychètes

Gregarinea

parasites d’invertébrés parasites

Coccidea

Eimeria chez la poule, Toxoplasma Plasmodium

Hematozoea Microsporea

Microspora : protozoaires intracellulaires de petite taille Myxozoa : parasites sporulés

Rudimicrosporea Myxosporea

parasites de poissons parasites d’invertébrés

Actinosporea Acetospora : parasites d'invertébrés marin Ciliophora Ciliés, deux types de noyaux

Pediastrum, Chlamydomonas, Volvox

Haplosporea Paramyxea Prostomata

Protostomatea Vestibulifera Colpodea Karyorelicta formes Trachelocercea essentiellement marines Loxodea Protoheterotrichea Protocruzidea Polyhymenophora Heterotrichea ciliature du péristome importante Spirotrichea Hypostomata

Phyllopharyngea

Nassophorea Oligohymenophorea

Litonotus, Coleps, Colpoda Loxodes

Stentor, Spirostomum, Metopus, Stylonychia, Euplotes, Tintinnides Crytophoria Rhynchodia Chonotrichia Suctoria Peniculia Scuticociliatia Peritrichia Astomatia Hymenostomatia

Tokophrya Paramecium Vorticella, Ophrydium Tetrahymena, Ichthyophthirius

Apostomatia

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4. Quelques individus des différents groupes 4.1. Phylum des Rhizopoda (Amibes) Les rhizopodes sont subdivisés en différentes classes. Amibes testacées ou Testacealobosia.

Arcella vulgaris x 400.

Difflugia x 200 et détail des pseudopodes x 400

Arcella gibosa présente un test bosselé.

Centropyxis x 200

Cyphoderia x 200 (pseudopodes filiformes visibles) et test vide x 400

Grandes amibes Karyoblasta

Thecamoeba x 400

Amoeba x 400 (Contraste de phase)

Déplacement d'une petite amibe : Naegleria x 400 (Contraste de phase)

Amibe Filosea (pseudopodes filiformes) x 200 et x 400 ayant phagocyté une diatomée (orange)

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4.2. Phylum des Actinopoda (Héliozoaires)

Actinophrys (Héliozoaires) x 400

Gymnophrys x 400

4.3. Phylum des Mastigophora

Trypanosoma gambiens x 400, agent responsable de la maladie du sommeil

Peranema, un protozoaire flagellé x 400

4.4. Phylum des Ciliophora (les ciliés) Subphylum 1 : Prostomata

Coleps x 400

Tokophrya, (acinétien) x 400

Litonotus x 200

Subphylum 3 : Polyhymenophora

Spirostomum x 100. Le plus grand des ciliés d'eau douce

Loxophyllum x 400

Colpoda x 400

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Paramecium x 100 et x 400

c

a

n n

Paramecium bursaria x 400

Paramecium bursaria x 400 en négatif. Les algues endosymbiotiques (a) sont bien visibles, ainsi que les deux noyaux (n), le cytostome (c) ainsi que les trichocystes (t)

t

Deux grandes paramécies au milieu de petits Colpidium (prélèvement à l'automne dans un point d'eau forestier contenant beaucoup de feuilles en décomposition)

Stentor x 400, cilié péritriche fréquent dans les boues activées des centrales d'épuration.

Stentor coeruleus est pigmenté en bleu

Stentor igneus est de couleur rose

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Opercularia x 200 et x 400 en microscopie à fond clair et en contraste de phase.

Vaginicola X 400

Pyxicola X 400

Les ciliés suivants sont généralement regroupés dans le groupe des Hypotriches car leurs cils sont regroupés en paquets ou cirres et servent de pattes pour leur locomotion. Ces microorganismes marchent littéralement sur les algues filamenteuses et autres particules.

Stylonichia x 400

Stylonichia x 200

Halteria x 400 35


Euplotes x 200 (contraste de phase) et x 400 (noyau en "C" coloré au vert de méthyle)

Subphylum 4 : Hypstomata

Vorticella dont le pédoncule déployé peut se replier en cas de contact ou de stress. X 400

Ophrydium, un protozoaire colonial dont les individus se situent à la surface d'une matrice cellulosique qu'ils sécrètent pour former des colonies de plusieurs cm de diamètre fixées ou dérivant à la surface des plans d'eau. Leur couleur verte provient de l'association symbiotique avec des zoochlorelles. 4.5. Phylum des Sporozoa

Plasmodium, l'agent du paludisme, dans des hématies humaines. Stade de l'anneau x 1000 36


LES METAZOAIRES A côté des formes unicellulaires ou coloniales, de nombreux organismes multicellulaires sont fréquemment rencontrés dans les préparations microscopiques provenant d'un l'environnement hydrique. En voici quelques exemples :

Un Gastrotriche x 400 (contraste de phase).

Philodina x 200 (rotifère)

Monostila x 200(rotifère)

Cyclope x 100 (crustacé copépode)

Nauplie x 200 (larve de crustacé)

Cypris x 200 (crustacé ostracode)

Daphnie x 100 (crustacé cladocère)

Vers plats (douves et planaires) x 100

Des hydres (x 100)

Nématode (vers rond) x 100

Vers oligochètes x 100 et x 200.Ce sont des vers segmentés. Chaque segment porte 2 faisceaux de soies

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Milieux de culture Composition des milieux de culture pour les algues Milieu de croissance pour les Euglènes : (Greenblatt et Schiff, J. Ptotozoal, 6, 23-28, 1959) Mélanger 1 volume de Meb 2x et 1 volume de Schiff 2x. Rajouter au besoin Fungizone et Peni-Streptomycine. Ce milieu convient bien aux Euglènes, mais j'ai eu des contaminations (levures, Fusarium). Il est possible de synchroniser les cultures par des éclairs. Milieu de Bristol pour la croissance des algues d'eau douce (Chlorella) NaNO3 10 mL à 25 g/L Oligo-éléments : CaCl2, 2H2O 10 mL à 2,5 g/L ZnSO4, 7H2O 0,882 g MgSO4, 7H2O 10 mL à 7,5 g/L MnCl2, 4H2O 0,144 g K2HPO4 10 mL à 7,5 g/L MoO3 0,071 g NaCl 10 mL à 2,5 g/L CuSO4, 5H2O 0,157 g KH2PO4 10 mL à 17,5 g/L Co(NO3)2, 6H2O 0,049 g 1 mL de (KOH 3,1 g ; EDTA 5,0 g/50mL) H3BO3 1,142 g H2SO4 0,05 mL Eau qsp 100 mL FeSO4, 7H2O 1 mL à 2,49 mg/50mL oligo-éléments 1 mL Eau distillée qsp 1000 mL pH 7,0 Cultiver à 20-25°C sous agitation ou aération faible, à proximité d'une source lumineuse. Milieu de culture pour les Desmidiées Ajouter à partir des solutions stock : 10 ml MgSO4, 7H2O (0.1g/100ml), 10 ml K2HPO4 (0.1g/100ml), 10 ml KNO3 (1.0g/ml), 20 ml extrait de terre 50 x, Compléter à 1 Litre avec de l'eau distillée Tamponner avec de l'HEPES 1M, ajuster à pH 7.5, la concentration finale dans le milieu doit être de l'ordre de 10-20 mM. Stériliser. Extrait de terre 50 x : 100 g de sol dans 400 ml d'eau, faire bouillir 30 minutes, puis décanter jusqu'à obtenir un liquide clair jaunâtre. Stériliser en aliquotes. Composition des milieux de culture pour les moisissures Sabouraud chloramphénicol Peptone Extrait de levure Extrait de malt Glucose Phosphate monopotassique Phosphate disodique Agar Chloramphénicol Eau distillée qsp pH 6,4

10 g 2g 1g 20 g 0,5 g 0,5 g 13 g 0,5 g 1 litre

Czapek Saccharose 30 g Nitrate de sodium 3,0 g Sulfate de magnésium 0,5 g Chlorure de potassium 0,5 g Sulfate de fer (II) 0,01 g Phosphate dipotassique 1,0 g Extrait de levure 5,0 g Agar 13,0 g Eau distillée qsp 1 litre pH 4,0 Ajouter éventuellement 30 mg de Streptomycine et 2 mg d'auréomycine.

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PDA - Pommes de terre épluchées, coupées en cubes 2 kg - Glucose 20 g - Gélose 15 g - Eau distillée qsp 1000 ml pH4,0 Laisser macérer les pommes de terre dans 500 ml d'eau pendant au moins 1/2 heure puis faire bouillir 1/2 heure. Filtrer sur gaze, ajouter les autres ingrédients et stériliser. Milieux pour germes cellulolytiques : Technique des silico-gels : Les plaques de silico-gels permettent l'étude de divers métabolismes énergétiques bactériens, associées à une solution saline à laquelle on a ajouté la substance énergétique à étudier. Préparation : Mélanger en parties égales une solution commerciale de silicate de sodium diluée au 1/3 et une solution d'acide chlorhydrique diluée au 1/4, en versant le silicate dans l'acide sous agitation. Répartir dans des boîtes de pétri de 9 cm à raison de 20 mL par boîte et laisser les gels se former sur une paillasse durant 24 heures. Laver les gels à l'eau courante durant 24 heures de façon à éliminer l'excès d'acidité du milieu. Les plaques peuvent être stérilisées par immersion rapide dans de l’eau bouillante. Utilisations : Solution saline standard de Winogradsky : - KH2PO4 5g - MgSO4 2,5 g - NaCl 2,5 g - Fe2(SO4)3 0,05 g - MnSO4 0,05 g - Eau distillée 1000 mL Ajuster le pH à 7,2 Milieu pour la différenciation des champignons cellulolytiques (Milieu de Eggins et Pugh) (NH4)2SO4 0,5 g L-Asparagine 0,5 g KH2PO4 1,0 g KCl 0,5 g MgSO4 0,2 g CaCl2 0,1 g Extrait de levure 0,5 g Agar 20 g Cellulose 10 g Eau distillée 1000 mL pH 6,2 La cellulose est ajoutée sous forme d'une suspension à 4%, après ébullition des autres constituants. Le milieu est clarifié par les champignons cellulolytiques. Incuber à 28° C pendant 4 à 10 jours, les colonies de germes cellulolytiques apparaissent au milieu d’un halot clair.

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Composition des milieux de culture pour les bactéries fixatrices d'azote Azotobacter chroococcum pousse sur le milieu suivant : Glucose 20 g K2HPO4 0,8 g KH2PO4 0,2 g MgSO4, 7 H2O 0,5 g FeCl3, 6 H2O 0,1 g CaCO3 20g Na2MoO4, 2 H2O 0,05 g Agar 20 g Eau distillée qsp 1000 mL pH 7,5. Les colonies productrices d'acides dissolvent le carbonate de calcium, au contraire d'Azotobacter qui n'en produit pas. L'addition de 0,1 à 0,2 mL de butanol-1 pour 100mL de milieu favorise l'enkystement de certaines souches. Il est recommandé d'utiliser un sol dont le pH est au dessus de 7,5 (la bactérie est présente dans environ 100% des sols avec 100 à 10 000 germes par gramme de sol). Azotobacter chroococcum est très pléomorphique en culture. Milieu de culture YEM pour Rhizobium : - Mannitol 10,0 - KH2PO4 0,5 - MgSO4, 7 H2O 0,2 - NaCl 0,1 - CaCO3 4,0 - Extrait de levure 0,4 - Agar 15,0 - Eau qsp 1000 mL pH 6,8-7,0 Stériliser 20 minutes à 120 °C. Ce milieu n’étant pas spécifique, on peut rajouter du Rouge Congo qui est un colorant vital, à la concentration de 25 mg/l final. Il permet de différencier les colonies de Rhizobium non colorées ou légèrement rosées, et les colonies des autres bactéries éventuellement présentes dans la rhizosphère qui sont rouges. Composition des milieux de culture pour les bactéries phototrophes Milieu de culture pour les bactéries sulfureuses Mileux de culture pour Chromatium spp Solution I : Oligo-éléments NH4Cl 0.1 g Eau distillée 1L KH2PO4 0.1 g NaEDTA 5,2 g MgCl2 0.05 g FeCl2, 4H2O 1,5 g Agar 20 g ZnCl2 70 mg Eau 780 mL MnCl2, 4H2O 100 mg H3BO3 6 mg Solution II : CoCl2, 6H2O 190 mg CuCl2, 2H2O 17 mg NaHCO3 2g NiCl2, 6H2O 25 mg Eau 100 mL Na2MoO4, 2H2O 188 mg VoSO4, 2H2O 30 mg 40


Solution III : Na2S, 9H2O Eau

Na2WO4, 2H2O

2 mg

1g 100 mL

Stériliser séparément 15 minutes à 120°C, refroidir à 50 °C et mélanger II et III dans I. Répartir en tubes de 16 mm Il est également conseillé d'ajouter de la vitamine B12 à raison de 20 µg/L et 1 mL/L de solution d'oligoéléments. Milieu de culture pour les bactéries non-sulfureuses Milieux de culture pour Rhodopseudomonas et Rhodospirillum NH4Cl 0.5 g MgSO4, 7H2O 0.4 g CaCl2, 2H2O 0.05 g NaCl 0.4 g Sodium-hydrogène Malate 1.5 g Extrait de levure 0.1 g Eau qsp 1000 mL Amener au pH choisi avec le tampon phosphate suivant : Na2HPO4, 12 H2O 0.1 M (35.85 g/l) , NaH2PO4, 2H2O 0.1 M (15.6 g/l) pH 5.0-6.0 favorise Rhodopseudomonas acidophila (pH max=5.5)et Rhodomicrobium vannielii pH 7.0 favorise Rhodospirillum rubrum et Rhodopseudomonas palustris. Milieu de culture pour Anabœna (cyanobactérie fixatrice d'azote) K2HPO4 MgSO4, 7H2O CaCl2, 2H2O Na2CO3 EDTA de Fer 1000 x Oligo-éléments 1000 x Eau distillée qsp

39 mg 75 mg 36 mg 20 mg 1 mL 1 mL 1000 mL

EDTA de Fer 1000 x : Na2-EDTA FeSO4, 7H2O (ou Ferrique)

0,6% 0,5%

Oligo-éléments 1000 x : MnSO4, 4H2O MoO3 H3BO3 ZnSO4, 7H2O CuSO4, 5H2O pointe de spatule/100 mL Co(NO3)2, 6H2O pointe de spatule/100 mL

0,2% 0,02% 0,3% 0,02% 1 petite 1 petite

Composition des Milieux d'isolement des Actinomycètes Milieu gélosé AGly : Phosphate bi-potassique Asparaginate de sodium Glycérol Solution d'oligo-éléments Gélose Eau distillée pH 7,0 Solution d'oligo-éléments : Molybdate de potassium ou sodium

1g 1g 10 g 1 mL 15 g 1000 mL

0,05 g 41


Borate de sodium Nitrate de cobalt Sulfate de cadmium Sulfate de cuivre Sulfate de zinc Sulfate de manganèse Perchlorure de fer Eau distillée qsp

0,05 g 0,05 g 0,05 g 0,05 g 0,05 g 0,05 g 1 goutte 1000 mL

Ensemencer par des suspensions-dilutions de terre et incuber 7 jours à 28°C. Les colonies d'actinomycètes sont incrustées dans la gélose, elles ont un aspect corné farineux (surface pulvérulente), aux bords frangés, souvent irréguliers et au centre proéminent. Milieu de Bennett : Glucose Extrait de levure Peptone Extrait de viande Agar Eau distillée

10 g 2g 2g 1g 20 g 1000 mL

pH 7,3 Milieu de Kuster amidon ou glycérol : Amidon (ou glycérol Caséine (ou sa peptone) KNO3 NaCl K2HPO4 Oligo-éléments Agar Eau distillée qsp

5g 10 g) 0,3 g 2g 2g 2g 1 mL 18 g 1000 mL

Solution d'oligo-éléments : Sulfate de magnésium Carbonate de calcium Sulfate ferreux Eau distillée qsp

5g 2g 1g 100 mL

pH 7,0

Composition des milieux de culture pour bactéries du soufre Milieu de culture pour Thiobacillus Thiooxidans NH4Cl 0,1 g KH2PO4 3,0 g MgCl2, 6H2O 0,1 g CaCl2, 2H2O 0,14 g Soufre en poudre 10,0 g Eau distillée qsp 1000 mL Dissoudre tous les ingrédients sauf le soufre, ajuster pH 4,2 et autoclaver. Stériliser le soufre à part dans un flacon. Avant l'emploi, déposer le soufre à la surface du milieu autoclavé. Ajouter éventuellement 0,01 % d'extrait de levure stérilisé à part. Milieu de culture pour Beggiatoa Oligo-éléments : 42


CaSO4 (solution saturée) 20 mL EDTA 0,2 g NH4Cl 0,45 mg FeSO4, 7H2O 0,7 g K2HPO4 0,1 mg ZnSO4, 7H2O 0,01 g MgSO4, 7H2O 0,2 mg MnSO4, 4H2O 2 mg Solution d'oligo-éléments 5 mL CuSO4, 5H2O 5 µg Na-acétate 0,5 g H3BO3 10 mg Bouillon nutritif (Difco) 0,5 g Co(NO3)2 1 mg Agar 10 g Na2MoO4, 2H2O 1 mg Catalase filtrée 0,22 µm 15 000 - 35 000 unités Eau qsp 1000 mL Eau distillée qsp 1000 mL Ajuster pH 7,4 avant d'autoclaver. La catalase est ajoutée au moment de l'emploi. Milieu pour Desulfovibrio solution 1 : K2HPO4 NH4Cl Na2SO4 CaCl2, 2H2O MgSO4, 7H2O DL-Na lactate Extrait de levure Resazurine Eau distillée

0,5 g 1,0 g 1,0 g 0,1 g 2,0 g 2,0 g 1,0 g 1,0 mg 980 mL

solution 3 : Thioglycolate de sodium Acide ascorbique Eau distillée

0,1 g 0,1 g 10 mL

solution 2 : FeSO4, 7H2O Eau distillée

0,5 g 10 mL

Faire bouillir la solution 1 puis refroidir sous azote. Ajouter les solutions 2 et 3, ajuster pH 7,8 NaOH et distribuer en tubes d'anaérobiose. Bien répartir le précipité gris. Autoclaver. Le thioglycolate et l'ascorbate sont des agents réducteurs. Le développement de Desulfovibrio est visible par l'apparition d'un précipité noir de sulfure de fer après 15 jours à 30 °C. Composition de quelques milieux de culture pour les protozoaires Milieu F/2 pour les protistes marins Ajouter à 1 litre d'eau de mer autoclavée NaNO3 (75,0 g/l) 1.0 ml NaH2PO4 (5,0 g/l) 1.0 ml F/2 oligo-éléments 1.0 ml F/2 vitamines (stériles filtrées) 0.5 ml F/2 oligo-éléments (stériles filtrés): Na2EDTA (4,36 g/l) FeCl3x6H2O (3,15 g/l) 1ml of CuSO4, 5H2O (0,98 g/100ml) 1ml of ZnSO4, 7H2O (2,20 g/100ml) 1ml of CoCl2, 6H2O (1,0 g/100ml) 1ml of MnCl2, 4H2O (1,80 g/100ml) 1ml of NaMoO4, 2H20 (0,63 g/100ml) F/2 vitamines (stériles filtrées): biotine (0,1 mg/100ml) vitamine B12 (0,1 mg/100ml) thiamine HCL (20 mg/100ml) Pour obtenir un bon rendement cellulaire, tamponner avec HEPES (stock 1M), ajuster à pH 7.5, la concentration finale doit être autour de 10-20 mM.

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Milieux WCG et WCL pour de nombreux protistes d'eau douce Le milieu WCL semble permettre une meilleure pousse que le milieu WCG. . Ajouter à 1 litre d'eau distillée stérile : WCG K2HPO4 (8,71 g/l) 0,25 ml CaCl2, 2H2O (36,76 g/l) 0,1 ml MgSO4, 7H2O (36,97 g/l) 0,25 ml NaNO3 (75,0 g/l) 0,29 ml NaHCO3 (12,6 g/l) 0,05 ml H3BO3 (6,0 g/l) 0,25 ml Na2EDTA (100 mM Stock) 0,05 ml Fe/EDTA/oligo-éléments F/2 0,25 ml F/2 vitamines 0,5 ml WCL CaCl2, 2H2O (36,76 g/l) 1,0 ml MgSO4, 7H2O (36,97 g/l) 1,0 ml NaNO3 (75,0 g/l) 1,0 ml NaHCO3 (12,6 g/l) 1,0 ml H3BO3 (6,0 g/l) 0,5 ml KCl (7,45 g/l) 1,0 ml NaH2PO4, H2O (5,0 g/l) 1,0 ml NH4Cl (2,65 g/l) 1,0 ml Fe/EDTA/oligo-éléments F/2 1,0 ml F/2 vitamines 1,0 ml Dans les 2 cas tamponer avec HEPES 1M, ajuster à pH 7.5, concentration finale 10-20 mM.

Techniques de coloration des protozoaires Nigrosine à 1% dans l'eau : Observations générales, rangées ciliaires, flagelles, inclusions. Mettre les cellules dans 1 goutte d'eau, à l'extrémité d'une lame de verre. Ajouter 2 gouttes de nigrosine. Avec une pipette Pasteur, faire un frottis en étalant la goutte sur toute la lame. Laisser sécher et observer. Rouge neutre à 1g/l dans l'eau ou Bleu de crésyl brillant à 1 pour 50 000 dans l'eau : Coloration vitale des vacuoles digestives et des inclusions cytoplasmiques. Mettre 1 goutte de colorant dans 1 goutte de protozoaires. Observer entre lame et lamelle. Paramecium, coloration vitale au rouge neutre x 400 (vacuoles digestives) Encre de Chine : Permet l'observation des courants d'eau autour d'un cilié, des vacuoles digestives en coloration vitale. Mettre 1 goutte de la suspension d'encre de Chine (quelques gouttes d'encre de Chine dans l'eau) avec quelques gouttes de culture de protozoaires. Attendre 15 à 30 minutes et observer entre lame et lamelle. Les particules d'encre de Chine sont ingérées et permettent de localiser les vacuoles digestives. Vert de méthyle acétique : (vert de méthyle à 1% dans l'acide acétique 1%) Mélanger 3 gouttes de culture de protozoaires et 1 goutte de vert de méthyle, attendre 1 à 2 minutes et observer entre lame et lamelle. Si la préparation est trop colorée, enlever l'excédent de colorant à la pipette Pasteur ou éliminer l'excédent de liquide en utilisant du papier filtre comme buvard. Les rotifères ne prennent pas directement le colorant et ils apparaissent clairs et lumineux dans la préparation. Lugol : Colore les inclusions cytoplasmiques et le noyau en brun, les réserves amylacées en bleu et le hyaloplasme en jaune. Mélanger 1 goutte de culture et 1 goutte de lugol, observer entre lame et lamelle. Acide picrique à saturation dans l'eau : Il provoque l'éjection des trichocystes chez la paramécie. Mélanger une goutte de culture à une goutte d'acide picrique et observer entre lame et lamelle ou placer une goutte de culture entre lame et lamelle et à l'aide d'une pipette, déposer sur le bord une goutte d'acide picrique. Observer. Chlorure de nickel à 1 pour 10 000 dans l'eau : Il provoque l'arrêt des mouvements ciliaires après 2 à 3 minutes de contact. Mélanger 1 goutte de culture et 1 goutte de réactif, observer entre lame et lamelle. La carboxyméthyl cellulose soluble ou l'albumine épaississent le milieu pour ralentir les mouvements des ciliés. 44


Biblio : http://www.microscopies.com/DOSSIERS/Magazine/Articles/Walter-Dioni-GALA-2/GALA-2.htm

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Atlas de Microbiologie