Генетична Генетична інженерія інженерія тварин тварин Генотерапія Генотерапія
1
Культивування Культивуваннятваринних твариннихклітин клітинin invitro vitro Обробка трипсином
Суспензія клітин
Посів
Повторна обробка трипсином
Повторні цикли обробки трипсином та посівів
Фрагмент тканини Клони клітин
Ріст клітин на середовищі
2
Селективні Селективнімаркери маркеридля длятваринних твариннихклітин клітин
Ген
Гени: Тимідинкінази – ТК+ Гіпоксантингуанозинфосфорибозилтрансферази - ГГФРТ+ Аденінфосфорибозилтрансферази – АФРТ+ Дигідрофолатредуктази – ДГФР+ Селективне середовище Принцип селекції
ТК+, ГГРФТ+
з гіпоксантином, аміноптерином та тимідином (НАТ)
Аміноптерин блокує синтез пуринів de novo; лише ТК+ та ГГРФТ+- клітини утворюють колонії на середовищі НАТ, оскільки можуть використати гіпоксантин та тимідин як попередники тиміну і пуринів
АФРТ+
З азасерином та аденіном
Азасерин блокує синтез пуринів de novo; лише АФРТ+-клітини можуть використати аденін із середовища і рости на ньому
ДГФР+
З метатриксатом
Метатриксат – антагоніст фолієвої кислоти. У присутності метатриксату 3 ростуть лише ДГФР+ -клітини
Гібридизація Гібридизаціясоматичних соматичнихклітин клітинтварин тварин
ТКГГФРТ+
ГГФРТТК+
Середовище НАТ
Спонтанне злиття соматичних клітин тварин відбувається з частотою 10-6 -10-7
Збільшення частоти злиття клітин до 10-2 – 10-3 досягається при обробленні: •
поліетиленгліколем
•
інактивованим парагрипозним вірусом Сендай
•
електроімпульсами
Утворення багатоядерних клітин Батьківські клітини гинуть
Ростуть лише гібриди ТК+ ГГФРТ+
Поділ
Усі ядра одночасно вступлять у мітоз
Гібридні клітини
Гібридні клітини
Дочірні клітини містять по одному ядру з хромосомами обох (декількох) батьківських клітин
4
Гібридизація Гібридизаціясоматичних соматичнихклітин клітинтварин тварин
ТКГГФРТ+
ГГФРТТК+
Немає обмежень на те, які клітини можуть зливатися (ембріональні і спеціалізовані, нормальні і ракові, клітини різних видів тощо) Обидва батьківських геноми можуть зберігати в гібриді функціональну активність
Хромосомні набори гібридних клітин часто нестабільні
Середовище НАТ
Втрата частини хромосом Батьківські клітини гинуть
Ростуть лише гібриди ТК+ ГГФРТ+
Виникнення клітин з різними комбінаціями хромосом Гібридна клітина людини і миші Втрата хромосом
Гібридні клітини
людини Клітинні лінії, які несуть якусь одну з хромосом людини 5
Перенесення Перенесеннягенів генівза задопомогою допомогоюклітинних клітиннихфрагментів фрагментів Для перенесення використовують тільки ядро, або тільки цитоплазму клітини-партнера
Проводять енуклеацію клітин. Наприклад культивування клітин на середовищі з цитохалазином зумовлює переміщення ядра на периферію клітини. При центрифугуванні таких клітин утворюється цитопласт (клітина без ядра) і каріопласт (ядро, оточене тонким шаром цитоплазми)
Ядро з частиною цитоплазми може бути видалене з клітини за допомогою відсмоктування мікропіпеткою. Так отримують так звані “половинки” клітин
Енуклеація
Ооцит, позбавлений ядра
Каріопласт
Донор ядра
Проводять реконструкції клітин, клітин, зливаючи цитопласти та каріопласти
Перенесення ядра
Реконструйована яйцеклітина Електрозлиття
Переносять генетичну інформацію за допомогою ізольованих хромосом
Клітини синхронізують щодо стадії клітинного поділу (треба, щоб більшість клітин була у стадії мітозу). Потім проводять ультрацентрифугування та виділяють фракцію метафазних хромосом. Клітини реципієнти інкубують із суспензією ізольованих хромосом. Шляхом фагоцитозу хромосоми можуть потрапляти у клітини 6
Приклад Прикладвикористання використанняреконструкції реконструкціїклітин клітиндля дляклонування клонуванняхребетної хребетної тварини тварини Провели енуклеацію яйцеклітин вівці породи Шотландська чорноморда
“Половинки” “Половинки” яйця злили з клітинами молочної залози вівці породи Фінндорсет, Фінндорсет, яка знаходилася в останньому триместрі вагітності Донорне ядро та реципієнтна цитоплазма повинні бути на однакових стадіях клітинного циклу – G0
Злиті клітини поміщали в агар, а потім у перев’ перев’язані язані яйцеводи самок Через 6 діб культивування ембріони вимивали з яйцеводів і ті, що розвинулися до стадії морули або бластоцисти, переносили в матку сургатної матері, де вони розвивалися до народження.
Із 277 реконструйованих яйцеклітин отримано 1 живе ягня (Доллі) В інших експериментах донорними були також клітини з внутрішньої клітинної маси бластоцисти, які культивували in vitro 7
Перенесення Перенесеннягенів генівввклітини клітинитварин тваринза задопомогою допомогоюпрепаратів препаратів ізольованої ізольованоїДНК ДНК Са-преципітатний метод (метод котрансформації): •
ДНК з геном, який бажають перенести в тваринну клітину, змішують з фрагментом ДНК вірусу герпесу простого з ТК+ -геном та ДНК-носієм (ДНК печінки миші) у фосфатному буфері. Після додавання Ca++ утворюється осад фосфату кальцію, який зв’язує ДНК. Осад (преципітат) піпеткою наносять на шар TK-клітин, які культивують in vitro • Потім їх переносять на середовище для селекції ТК+-трансформантів. Серед них від 50 до 80% несуть крім ТК+-гена бажаний ген
Мікроін’єкції декількох сотень копій лінеаризованих молекул рекомбінантної ДНК у чоловічий пронуклеус заплідненої яйцеклітини
Електропорація
Злиття клітин з ліпосомами, “навантаженими” рекомбінанною ДНК, або ендоцитоз ліпосом 8
Схема Схемаотримання отриманнятрасгенних трасгеннихмишей мишейза за допомогою мікроін ’ єкцій ДНК в допомогою мікроін’єкцій ДНК в яйцеклітини яйцеклітини
1. Коструювання рек ДНК 2. Ін’єкції лінійної ДНК за допомогою мікропіпетки в чоловічий пронуклеус заплідненої яйцеклітини 3. Перенесення ембріона в організм псевдовагітної самки 4. Розвиток ембріона до народження 5. Аналіз чи нащадки є трансгенними (Саузернгібридизація, ПЛР) 6. Зазвичай: •
у 70 % особин трансгени є в усіх клітинах організму
• у 30 % особин трансген міститься в частині соматичних клітин, тобто 9 вони є мозаїками
Отримання Отриманнятрансгенних трансгеннихмишей мишейззгеном геном гормона гормонаросту ростущурів щурів
Сконструйовано плазміду, в якій регуляторна ділянка гена металотеонеїну І злита зі структурною частиною гена гормону росту щура
Металотеонеїн зв’язує іони багатьох металів і особливо Zn2+. Промотор його гена активується за присутності Zn2+ та експресується в клітинах печінки
По 600 копій фрагмента плазміди з гормоном росту щура перенесено у чоловічі пронуклеуси 170 запліднених яйцеклітин, які імплантовано в організм самок мишей
Отримано 7 нащадків, які несли у своєму геномі злитий ген
6 з 7 мали більші розміри тіла, ніж звичайні миші, а в клітинах їхньої печінки виявлено підвищений вміст мРНК злитого гена, а в крові – високий рівень гормону росту
Гормон росту в таких тварин продукувався клітинами печінки, а не гіпофіза
Р. Пальмітер
Трансгенна миша з геном гормону росту щура
10
Уведення Уведеннятрансгенів трансгеніввв плюрипотентні плюрипотентні ембріональні ембріональністовбурові стовбурові клітини клітини Клітини виділяють з бластоцисти Трансформують їх in vitro
Відбирають трансформовані клітини за функцією маркерних генів. Трансформовані клітини переносять у бластоцисти Інший метод – інкубація ембріональних клітин in vitro у присутності фібробластів, які продукують рекомбінантні вірусні частинки. Вірусні частинки переносять трансген в клітини ембріонів
Трансгенна миша
Потім заражені вірусним вектором ембріони переносять в організм псевдовагітної самки
Нащадки-химери, що містять трансген лише в частині клітин, схрещують з диким типом і отримують нащадків, в усіх клітинах яких міститься трансген 11
Використання Використаннятрансгенних трансгеннихтварин тварин 1. Трансгенні тварини – моделі для вивчення
Генетики тварин, зокрема онтогенетики
Можливих змін фізіологічного статусу у лабораторних та сільськогосподарських тварин внаслідок впливу трансгенів
Захворювань людини (з цією метою найчастіше використовують тварин з нокаутами певних генів)
2. Трансгенні ссавці, в молоці яких нагромаджуються білки, що мають терапевтичне значення (інтерферон, імуноглобуліни, фактори VIII, ІХ, фібриноген, лактоферин тощо) У цьому разі гени клонують з використанням регуляторних послідовностей генів, продукти яких (білки) секретують епітеліальні клітини молочної залози: • казеїнів • β – лактоглобулінів • α-лактальбумінів
12
Отримання Отриманнянокаутних нокаутнихтварин тварин Ген Х Клонування у вектор копії гена Х з інсерцією гена neoR
Х:: neoR
ТК+ Трансформація клітин рекомбінантною ДНК
ТК+ Заміщення за рахунок подвійного кросинговеру нормального гена в хромосомі на його мутантний алель
Отримання трансгенних тварин за схемами, наведеними на попередніх слайдах
Селекція мутантних клітин 13
Платформи Платформи редагування редагування геномів: геномів: ZFN ZFN
ZFN (Zinc-finger nuclease), в яких домен зв’язування ZFбілків з ДНК злитий з нуклеазним доменом ендонуклеази рестрикції FokI
14
Цинкові Цинкові пальці пальці Zn
2+
N
C
Цинковий палець (ZF, zinc finger) — невеликий структурний мотив білків, що стабілізується одним або більше іонами Zn2+, зв’язаними координаційними зв’язками з амінокислотними залишками білка Зазвичай ZF складається з: •
~ 30 аминокислот і містить: 1 α-спіраль
2 короткі антипаралельні β-ланцюги α-спіраль знаходиться С-кінці мотиву, а βланцюги– на N-кінці Zn2+ зв’язує (ZF -клас Cys2His2 ):
Взаємодія 3 ZF-мотивів з ДНК
•
2 залишки His
•
2 залишки Cys
ZF - белкові модулі білків, що взаємодіють з ДНК, РНК, іншими білками та з невеликими молекулами
Специфічність Специфічність зв зв’’язування язування ZF ZF зз ДНК ДНК
C
N
Взаємодія ZF-мотиву з ДНК
Конструюють принаймні 6пальцеві ZFP
Первинні контакти з нуклеотидами в ДНК формують амінокислотні залишки (АК) (1), 3 і 6 відносно початку αспіралі АК (−1), 3 і 6 формують контакти з трьома нуклеотидами підряд в одному ланцюзі, а залишок в позиції 2 з нуклеотидом в протилежному ланцюзі Зазвичай кажуть, що кожен ZF зв'язує 3 п.н. Однак принаймні 3 ZF підряд потрібні для забезпечення адекватного зв'язування зі специфічною послідовністю в ДНК Корисність ZFP полягає у здатності розпізнавати достатньо довгі послідовності, які є унікальні у великому геномі
Платформи Платформи редагування редагування геномів: геномів: TALEN TALEN Нуклеотиди -RVD A - NI C - HD G - NN T - NG D, aспарагінова к-та; G, гліцин; H, гістидин; I, iзолейцин; N, aспарагін
•
•
TALEN (Transcription activator-like effector nucleases). TALEN походять від TALE (Transcription activator-like effectors), в яких домен зв’язування з ДНК цих транскрипційних факторів злитий з нуклеазним доменом ендонуклеази рестрикції FokI TALE містить 18 повторень по 34 ак. Повторення варіюють в позиціях 12 і 13. (RVD -Repeat Variable Diresidue). Різні RVD переважно зв’язуються з певними нуклеотидами. Fok1 функціонує як димер •
TALEN взаємодіє з протилежними ланцюгами ДНК у специфічних сайтах і вносить двониткові розриви 17
Платформи Платформи редагування редагування геномів: геномів: CRISPR/Cas9 CRISPR/Cas9 • Нуклеаза Cas9 скеровується до її ДНК-мішені за допомогою спарювання послідовності ДНКмішені з однонитковою РНКгідом (gRNA ) ( • Мотив PAM розміщений downstream до сайту зв”язування gRNA необхідний для дії Cas9 •
Cas9/gRNA вносить двониткові розриви в ДНК (DSB), які є тригерами репарації 18
Хоумінгових Хоумінгових ендонуклеаз ендонуклеаз (менгануклеази) (менгануклеази) Відносно невеликі ензими - < 40 kDa, < 300 амінокислотних залишків Дуже великі розміри сайтів впізнавання - 14 - 40 п.н. Послідовності сайтів впізнавання асиметричні, або частково симетричні Такі сайти можуть зустрічатися лише 1 раз в геномі • у геномі S. cerevisiae розміром ~ 13×106 п.н. є 1 cайт для I-SceI Сайт впізнавання I-CreI з Chlamidomonas reinhardtii (30 п.н.): 5’-CTGGGTTCAAAACGTCGTGAGACAGTTTGG-3’ 3’-GACCCAAGTTTTGCAGCACTCTGTCAAACC-5’
АБО:
CTGGGTTCAAAACGTCGTGAGACAGTTTGG (-10/-14)
Редагування геномів шляхом індукування гомологічної рекомбінації Інсерція гена (А) або корекція його нуклеотидної послідовності (Б) може бути здійснена після уведення в клітини генетичної конструкції, що містить ділянки, гомологічні до ендогенних послідовностей, що оточують ДР Частота корекції мутації зменшується зі збільшенням віддалі між ДР і сайтом корекції У разі, якщо ДР відбувся між двома прямими повтореннями нуклеотидів (В) то гомологічна рекомбінація делецію одного з повторень разом з ділянкою, що містить ДР
Редагування геномів індукуванням негомологічної рекомбінації Репарація ДР може проходити за механізмом «з’єднання негомологічних кінців» (non-homologous end joining, NHEJ)
Така репарація неминуче призводить до зміни нуклеотидної послідовності у ділянці двониткового розриву – невеликих делецій чи інсерцій Репарація NHEJ корисна, якщо треба інактивувати певний небажаний ген (гени вірусів, онкогени тощо) Однак, у багатьох випадках негомологічне з’єднання кінців є небажаним способом репарації двониткового розриву, бо суттєво знижує ефективність проходження запланованого процесу генного заміщення
Генна Геннатерапія терапія Генна терапія – виправлення генетичних дефектів, які є причинами захворювань людини
• Мутацій у лініях зародкових клітин • Соматичних мутацій • Змін, зумовлених появою чужорідного генетичного матеріалу, наприклад, у наслідок інфекції •
!
Стратегії Стратегії генної генної терапії: терапії:
У У тих тих випадках, випадках, коли коли клітини клітини втратили втратили функцію функцію певного певного гена гена іі це це єє причиною причиною хвороби, хвороби, треба треба цю цю функцію функцію відновити відновити –– внести внести вв клітину клітину ген, ген, здатний здатний її її забезпечити, забезпечити, або або «виправити» «виправити» нуклеотидну нуклеотидну послідовність послідовність гена гена іі відновити відновити його його функцію функцію • Коли Коли хвороби хвороби єє наслідком наслідком надлишкової надлишкової активності активності гена, гена, не не властивої властивої нормальній нормальній клітині клітині –– треба треба цю цю активність активність пригнітити пригнітити • Клітини Клітини модифікують модифікують так, так, щоб щоб посилити посилити імунну імунну відповідь відповідь організму організму на на появу появу інфекційного інфекційного агента агента або або утворення утворення пухлини пухлини Стратегії генної терапії не передбачають використання генеративних клітин і тому генетичні зміни, що виникли як результат генної терапії, НЕ ПЕРЕДАЮТЬСЯ НАЩАДКАМ 22
Генна Геннатерапія терапія in in vivo vivo Використовують Використовують векторні векторні системи, системи, здатні здатні переносити переносити гени гени уу певні певні типи типи клітин клітин (тканин) (тканин) Генетична Генетична трансформація трансформація відбувається відбувається вв організмі організмі хворого хворого
Ліпосоми з ДНК
Ін’єкція в тканини
Рекомбінантний вірус
Системна інфузія Рекомбінантна плазміда 23
Генна Геннатерапія терапія ex ex vivo vivo Виділяють Виділяють клітини клітини від від хворого, хворого, культивують культивують їх їх in in vitro vitro,, генетично генетично трансформують трансформують Трансформорвані Трансформорвані клітини клітини переносять переносять вв організм організм хворого хворого
Рекомбінантна плазміда
Ліпосома з ДНК
Фібробласти
Стовбурові клітини 24
0,7
8,2
7,8
9,1
64,1
Невірусні Невірусні вектори вектори для для перенесення перенесення ДНК ДНК вв тваринні тваринні клітини клітини
Невірусні вектори можуть бути безпечніші , хоча часто менш ефективні, ніж вірусні Використання для трансформації тваринних клітин очищеної (naked) нуклеїновой кислоти (ДНК , рідше РНК) •
Терапевтичний ген включений в плазмідну ДНК
Бомбардування клітин (клаптиків тканин) металічними частинками, на поверхню яких нанесено ДНК , що несе трансген Рецептор-опосередоване поглинання. ДНК приєднана до білка, який впізнається рецепторами клітинної поверхні та проникає в клітину разом з білком Ліпосома
Використання інкапсульованих клітин. Цілі клітини, сконструйовані для експресії та секреції потрібного білка, інкапсулюють у пористий полімерний шар і вводяться локально Перенесення ДНК у складі ліпосом. Ліпосоми заповнюються ДНК підчас їх формування. Ліпосоми зливаються з клітинними мембранами і вміст ліпосом потрапляє в клітину (ліпофекція). Ліпофекція ефективна, але досить неспецифічна, оскільки ліпосоми мають тенденцію зливатися з мембраною будь-якої клітини
Хімічна структура катіонних та нейтральних ліпідів •Ліпосомальні композиції, що використовуються для доставки ДНК, як правило, включають суміш нейтрального та катіонного ліпідів •Катіонні ліпіди (такі як DOTMA, DOSPA, DOTAP, DMRIE та DC-холестерин) відіграють активну роль у зв'язуванні та перенесенні ДНК. Вони містять катіонну групу, гідрофобниий «хвіст» і лінкерну ділянку •Нейтральні ліпіди (такі як фосфоліпіди DSPC і DOPE, і холестерин) функціонують як допоміжні, 28 підвищуючи стабільність наночастинок та ефективність перенесення ДНК
Перенесення ДНК -полімерних комплексів. комплексів. Зв’ Зв’язу язування з позитивно зарядженим полімером захищає негативно заряджену ДНК. Такі комплекси часто поглинаються клітинами в культурі і можуть бути використані для генної терапії ex vivo
Хімічна структура деяких полімерних векторів ДНК, які широко використовуються в дослідженнях з доставки генів та в клінічних випробуваннях •Полі (L-лізин) і поліетиленімін (PEI) •Полімери на основі метакрилату, наприклад полі [(2-диметиламіно) етилметакрилат] ( pDMAEMA) •Полімери на основі вуглеводів, наприклад, хітозан та β-циклодекстрин, що містять полікатіони •Дендримери поліамідаміну (PAMAM) 29 •Деградабельні полімери полі (β-аміноефірів)
Характеристика Характеристика вірусних вірусних векторів векторів Аденовіруси
Аденоасоційовані віруси
Ретровіруси
Лентивіруси
HSV-1
Геном
Двониткова ОднонитДНК кова ДНК
РНК
РНК
Двониткова ДНК
Діаметр / капсид
70-100 нм
20-25 нм
80 – 120 нм
80 – 120 нм
150-200 нм
Ліміти вставок (т.п.н,)
Покоління: 1- 5, 2 – 1014, 3 - 30
~ 4,7
7 - 10
~10
~40-50
Інфікують діляться; діляться; клітини, не діляться не діляться які:
не діляться
діляться; не діляться
діляться; не діляться
Стан геному
Епісомальний
Епісомальний (>90%)
Інтегрований
Інтегрований
Епісомальний
Експресія
Тимчасова
Довготривала в клітинах, які не діляться
Довготривала Довготривала Довготривала в клітинах, які не діляться
Характеристика Характеристика вірусних вірусних векторів векторів
Аденовіруси
Аденоасоційовані віруси
Ретровіруси
Лентивіруси
HSV-1
Головні переваги
Високий титр, ефективна трансдукція
Широкий тропізм, низька імуногенність, тривала експресія
Інтеграція в геном клітини, що зумовлює тривалу експресію
Псевдотипування забезпечує широкий тропізм
Літична/латентна дія; широкий тропізм і сильний нейротропізм
Головні обмеження
Капсид викликає сильну імунну відповідь
Мала місткість векторів
Зумовлює інсерційний мутагенез
Зумовлює інсерційний мутагенез
Нестійкі
Проблеми генотерапії на основі вірусних векторів Імуногенність вірусних векторів Білки капсиду і сама ДНК викликають імунну відповідь Генотоксичність вірусних векторів Випадкова інтеграція у геном може викликати: •Індукцію експресії онкогенів, або інактивацію супресорів онкогенів •Мутації, геномні перебудови •Зміни експресії господаря
генів
Низька місткість векторів
клітин
Псевдотипування, Циклічна зміна серотипів рекомбінантних вірусів Ретельне тестування векторів на різних моделях; Видалення усіх зайвих послідовностей, що можуть мати небажану промоторну (енхансерну, термінаторну, рекомбіногенну) активність Розділення трансгена на частини Використання інтеїнів
Генна терапія SCID
X-зчеплений важкий комбінований імунодефіцит (Severe immunodeficiency, SCID). Найбільш розповсюджений тип SCID
combined
Рецесивний генетичний синдром. Навіть за стерильних умов діти живуть у середньому не більше 2-3 років. Зустрічність – 1/2×105 (у США – від 40 до 100 випадків щороку) Більшість випадків SCID зумовлені мутаціями гена Ххромосоми IL-2Rγ , що кодує спільний гамма-ланцюг (γ c ) рецепторів інтерлейкінів IL-2 , IL4, IL-7, IL-9, IL-15 і IL-21 , задіяних у розвиток і диференціацію T - і B -клітин .
Девід Веттер (1971 – 1984) – «хлопчик в бульбашці»
Мутації зумовлюють дефекти інтерлейкінового сигналювання і, як наслідок, порушення розвитку і функціонування імунної системи з відсутністю Т- і NR - клітин і нефункціональними В-клітинами
• Помер Девід від лімфоми Беркіта, яка виникла після трансплантації кісткового мозку від старшої сестри Кетрін • Спочатку Девід захворів на інфекційний мононуклеоз, який зазвичай викликає герпетичний вірус Епштейна-Барр • Патологоанатомічний розтин показав, що кістковий мозок Кетрін ніс вірус ЕпштейнаБарр. Його не виявили під час передопераційного обстеження • Потрапивши в організм Девіда, вірус призвів до появи в його тілі ракових пухлин
34
Генна Геннатерапія терапіядефіциту дефіцитуаденозиндезамінази аденозиндезамінази(ADA) (ADA) Початкові етапи катаболізму пуринових нуклеотидів АМФ Н2О
5’-нуклеотидаза
Рі
Аденозин
Н2О
Аденозиндезаміназа
NH3
Інозин
Н 2О
Нуклеозидаза
Рибоза
Гіпоксантин
….
Аденозин-дезаміназа – ключовий фермент катаболізму пуринових нуклеотидів Каталізує дезамінування аденозину з утворенням інозину Ген ADA міститься в 20 хромосомі людини Мутації гена ADA зумовлюють дефіцит аденозиндезамінази, що призводить до значного накопичення дАТФ – потужного негативного ефектора рибонуклеотид редуктази, що каталізує утворення дезоксирибонуклеотидів з рибонуклеотидів і відігає критичну роль у регулюванні синтезу ДНК Це, в свою чергу, призводить до дефіциту інших дНТФ , що прігнічує синтез ДНК Оскільки розвиток Т-клітин і В-клітини є одними з найбільш мітотично активних клітин, вони дуже чутливі до цього стану 35
Генна Геннатерапія терапіядефіциту дефіцитуаденозиндезамінази аденозиндезамінази(ADA) (ADA) Дефіцит аденозиддезамінази (ADA або ADA-SCID) - аутосомно-рецесивне моногенне порушення обміну пуринів, що спричиняє імунодефіцит
Початкові етапи катаболізму пуринових нуклеотидів АМФ Н2О
5’-нуклеотидаза
Рі
Аденозин
Н2О
Аденозиндезаміназа
Трапляється рідше ніж в 1 випадку на 100 000 живонароджених дітей На нього припадає ~ 15% випадків важкого комбінованого імунодефіциту (SCID, severe combined immunodeficiency) Оскільки Т-клітини проліферують і розвиваються в тимусі, уражені особи мають, як правило, малий, недостатньо розвинений тимус. Як наслідок, імунна система дуже слабка або повністю відсутня
NH3
Інозин
Н 2О
Нуклеозидаза
Рибоза
Гіпоксантин
….
Хворі діти народжуються у гетерозиготних батьків, в яких знижена активність ADA
ADA-недостатність лікують за допомогою пересадки кісткового мозку 36
Схема Схемаex exvivo vivoгенної генноїтерапії терапіїдефіциту дефіцитуADA ADA Виділення від пацієнта мононуклеарних клітин
Час життя зрілих Тлімфоцитів невеликий і вони поступово заміщаються новими ADA- клітинами
Тому потрібні повторні уведення ADA+ - клітин, або уведення стовбурових клітин крові з нормальним геном ADA
Вирощування клітин у культурі за умов, які сприяють розмноженню Т-клітин
Трансфекція Т-клітин in vitro ретровірусним вектором, який містить нормальний ген ADA (ADA+) і ген neo як маркер
Повторні уведення Т-лімфоцитів в організм пацієнта (7 разів протягом 10 місяців)
Підвищення активності ADA та помітне покращення стану пацієнтів
37
Генна Геннатерапія терапіяex exvivo vivoродинної родинноїгіперхолестеролемії гіперхолестеролемії
Це рецесивна хвороба, викликана мутацією гена, який кодує рецептор ліпопротеїнів низької густини (LPL-R)
Відсутність рецепторів на клітинах печінки зумовлює нагромадження холестерину в крові, ранні атеросклероз та інфаркти міокарду
Одна з найважливіших функцій печінки – секреція білків у кров
Видалення частини печінки можливе, оскільки вона має здатність до регенерації
Видалення частини печінки пацієнта для отримання гепатоцитів
Перенесення у гепатоцити кДНК нормального гена LPL-R за допомогою ретровірусного вектора
Уведення рекомбінантних гепатоцитів у печінку пацієнта через ворітну вену
Зменшення вмісту LPL-R і холестерину в крові пацієнта
Гепатоцити мають невелику тривалість життя, тому доцільним є використання у генній терапії стовбурових клітин печінки38
Приклади Прикладигенної генноїтерапії терапіїin invivo vivo
Гемофілія IX, який Гемофілія В В зумовлена зумовлена недостатністю недостатністю фактора фактора IX, який виділяють виділяють уу кров кров клітини клітини печінки печінки
Рекомбінантну Рекомбінантну молекулу молекулу зз кДНК кДНК гена гена фактора фактора ІХ, ІХ, сконструйовану сконструйовану на на основі основі аденовірусного аденовірусного вектора, вектора, уводять уводять вв печінку печінку через через ворітну ворітну вену вену
Аденовіруси Аденовіруси здатні здатні інфікувати інфікувати гепатоцити гепатоцити (немає (немає потреби потреби проводити проводити гепатектомію) гепатектомію)
Спостерігається Спостерігається зростання зростання концентрації концентрації фактора фактора ІХ ІХ вв крові крові та та нормальне нормальне зсідання зсідання крові крові
Муковісцидоз CFTR, який Муковісцидоз зумовлюють зумовлюють мутації мутації вв гені гені CFTR, який кодує кодує трансмембранний трансмембранний білок білок хлоридного хлоридного каналу каналу
Аденовірусним Аденовірусним вектором вектором зз нормальним нормальним геном геном CFTR CFTR інфікують інфікують клітини клітини епітелію епітелію носової носової порожнини хворого порожнини хворого
Спостерігають Спостерігають покращення покращення функціонування функціонування епітеліальних епітеліальних клітин клітин
М М’’язева язева дистрофія дистрофія Дюшенна Дюшенна зумовлена зумовлена мутаціями мутаціями гена гена дистрофіну. дистрофіну. Для Для нормального нормального функціонування м’язів принаймні 10% функціонування м’ язів принаймні 10% міобластів міобластів повинні повинні нести нести нормальний нормальний ген ген дистрофіну дистрофіну
Аденовруси Аденовруси здатні здатні інфікувати інфікувати міобласти міобласти
В В аденовірусний аденовірусний вектор вектор клонують клонують вкорочений вкорочений але але функціональний функціональний ген ген дистрофіну дистрофіну (мініген, (мініген, повний повний ген ген занадто занадто великий великий для для такого такого вектора) вектора) та та уводять уводять його його уу міобласти міобласти
Від Від 55 до до 50% 50% таких таких міобластів міобластів експресували експресували мінідистрофін мінідистрофін
39
Опрацювання ефективних векторних систем для генної терапії • вірусних • невірусних 0,1
59,2
• Лабораторні та клінічні випробування процедур генної терапії in vivo та ex vivo на піддослідних тваринах і людях • протягом 1989 – 2015 років проведено більше 2200 таких випробувань Опрацювання технології виробництва препаратів для генної терапії Впровадження препаратів для генної терапії у медичну практику • 9 препаратів з них 5 на40 основі вірусних векторів
Продукти генної терапії, впроваджені у медичну практику Продукт
Тип
Використовується для лікування
Впроваджено
Strimvelis
Вірусний ex-vivo: гаммаретровірус
ADA -SCID недостатність аденозиндезамінази (ADA) – тяжкого комбінованого імунодефіциту (SCID)
2016 – EU
Imlygic
Вірусний:oноколітичний HSV-1
Неоперабельна меланома
2015 – US
Kynamro
Невірусний: aнтисенс-олігонуклеотид
Гомозиготна родинна гіперхолестеринемія
2013 – US
Glybera
Вірусний: AAV1
Родинна недостатність ліпопротеїн-ліпази
2012 – EU
Macugen
Невірусний:РНК- аптамер, антагоніст VEGF
Неоваскулярна (волога) форма макулярної (плямистої) дегенерації сітківки
2006 – EU 2004 – US
Gendicine
Вірусний: Ad5-p53
Ракові утворення голови і шиї
2003 – Китай
Vitravene
Невірусний: РНК-олігонуклеотид
Цитомегаловірусний ретиніт (запалення сітківки)
1998 – US (припинено у 2002)
Oncorine
Вірусний: oноколітичний Ad5
Ракові утворення голови і шиї
2005 – Китай
Neovasculgen
Рекомбінантна плазміда з геном VEGF (фактора росту ендотелію судин)
Захворювання периферійних артерій
2011 – Росія
Етичні Етичніта таправові правовіпроблеми проблеми генної генної терапії терапії Правовий захист унікальної генетичної інформації кожної людини Інформація про геном кожної конкретної людини повинна охоронятися Не можна допускати дискримінації людини через її генетичні особливості Правовий статус ембріона людини Заборона репродуктивного клонування людини 42