Le métagénome : quand l'intestin parle aux articulations Pr Thierry Schaeverbeke Département de Rhumatologie, Hôpital Pellegrin, CHU Bordeaux
3 grands socles pour expliquer les maladies Immunité Pasteur : ouvre la traque des maladies infectieuses
Metchnikov : le macrophage : 1ère pierre du système immunitaire Burnet : sélection thymique : discrimination du soi non soi
Mendel : Les bases de la génétique
Koch : identification du BK. Postulat pour l’identification d’un agent infectieux causal
Environnement Génétique
Beadle & Tatum : Crick & Watson : Morgan : Un gène = une Structure de Gènes portés par enzyme l’ADN en double des chromosomes Mutations Avery, Mac Carthyhélice Exploration individuelle Déséquilibre de & Mc Leod : ADN liaison = support de des gènes l’hérédité
Classer les bactéries par leur génome • Taxonomie et phylogénie du monde bactérien à partir des séquences de l’ARNr 16s : – Prémices en 1975 – PCR gène rRNA 16s : début 1990
Darwin
Séquences ADN 16s • Développement de la PCR universelle : Portions hautement conservées -> amorces Zone variable Analysée par séquençage
• Estimation de la proportion de bactéries inconnues = > 80% – Des bactéries disparues ? – Des bactéries issues de milieux inaccessibles ? – Des bactéries simplement incultivables ? • Premières tentatives d’utilisation de PCR universelles pour détecter des germes incultivables : – Tropheryma whippelii (1991)
Les séquenceurs nouvelle génération
• Années 90 : consortium génome humain ➔ Nécessité d’améliorer les techniques de séquençage
• Développement d’outil permettant un séquençage rapide de l’ADN ➔ Séquenceur NGS Analyse simultanée de 230.000 fragments d’ADN Permet l’analyse de l’ensemble des gènes contenus dans un milieu = métagénome
Fractionnement aléatoire de l’ADN en fragments courts
Extraction de l’ADN Échantillon
Analyse bioinformatique Séquençage
Reconstitution et analyse du microbiome
Identification par comparaison des séquences aux banques d’ADN
= Reconstitution de l’ADN génomique par recouvrement
La microbiologie : à l’aube d’une nouvelle vie ? • Il y a 15 ans, nous connaissions 2000 bactéries • Aujourd’hui, nous en connaissons plus de 10.000 • Et demain ? Les prédictions vont de 100 à 150.000 !!!
De quoi fournir des explications à bon nombre de maladies dites « idiopathiques » ?
Raoult D. Dépasser Darwin, 2010
1 Description du microbiome
voies aériennes
bouche
Pour chaque cellule eucaryote « à nous », nous hébergeons : 100 bactéries
intestin
1000 virus
vagin
peau
Le métagénome intestinal Notre tube digestif contient : – 1014 bactéries = microbiote intestinal – = 10x le nb de nos propres cellules – = 1,2 kg… • • • •
Plusieurs centaines d’espèces différentes / personne 90% de germes anaérobies incultivables = 100 à 150 x le nb de gènes contenus dans le génome humain ≈ 60 espèces retrouvées chez 90% des sujets testés
• Fonctions multiples : – Digestion – Apports énergétiques – Apports en acides aminés essentiels – Éducation du système immunitaire – Compétition avec les entéropathogènes – Reproduction …
La constitution du microbiote intestinal chez le nouveau né • Contamination lors du passage par la filière génitale de la mère : – Flore d’origine digestive : E. coli, entérocoques – Flore d’origine vaginale : Lactobacillus, Prevotella
• Lactation : – Translocation de bifidobactéries du tube digestif vers la glande mammaire – Passage de bifidobactéries dans le colostrum et le lait, directement injectés à l’enfant – Colonisation du tube digestif de l’enfant par les bifidobactéries – Implantation plus tardive de Clostridium et de Bacteroides
• Chez l’enfant né par césarienne et nourrit au lait artificiel : colonisation digestive plus lente, germes différents… risque majoré pour asthme, allergies… Favier C.F. Applied Environ Microbiol 2002; 68: 219-226 Perez P.F. Pediatrics 2007; 119: e724-732 Mackie R. J Clin Nutrit 1999; 69: 1035S-45S
Microbiome intestinal Système immunitaire de l’hôte
environnement
Compétition entre bactéries
Génétique de l’hôte
Âge gestationnel à la naissance
Statut socioéconomique
Allaitement au sein
Géographie Occidentalisation
Alimentatio n
Traitements antibiotiques
Naissance voies naturelles / césarienne
Grande stabilité par la suite chez le sujet sain • Déclin des bifidobactéries chez les personnes âgées au profit des entérobactéries et des clostridii • La diversité des bifidobacteries baisse et se limite à deux espèces : – Bifidobacterium longum – Bifidobacterium adolescentis
• Chute de bifidobactéries impliquées dans la stimulation du système immunitaire -> conséquences ? • Baisse des Bacteroides et modification du ratio Firmicutes/Bacteroidetes Zoetendal E.G. Applied and Environ Microbiol 64: 3854-3859
van Tongeren S.P. Appl Environ Microbiol 2005; 71: 6438-6442 Woodmansey E.J. J Appl Microbiol 2007; 102: 1178-1186 Mariat D. BMC Microbiol2009; 9: 123
95% des bactéries du microbiote intestinal appartiennent à 4 phylums
FIRMICUTES 50 % à 75 % Clostridii +++, SFB Lactobacillus Ruminococacae Enterococcus Mollicutes
ACTINOBACTERIES 1 % à 10 %
bifidobactéries Collinsella–Atopobium
BACTEROIDETES 10 % à 50 %
Bacteroides Prevotella Porphyromonas
PROTEOBACTERIES <1% Escherichia coli
Variation interindividuelle de la proportion respective des 4 phylums et des espèces au sein de chaque phylums
FIRMICUTES
BACTEROIDETES
ACTINOBACTERIES
PROTEOBACTERIES
Diversité taxonomique du microbiote intestinal
Relative stabilité fonctionnelle à l’échelon génomique
Cho I. Nature 2012 Mar. 13;13(4):260–270.
Organisation structurelle du microbiote humain
Commensalisme
Espèces en transit profitant de la niche écologique
Parasitisme
Dialogue hôte microbiote
Mutualisme
Espèces partageant une guilde fonctionnelle avec le noyau phylogénétique
Energie
Symbiose
Espèces du noyau phylogénétique
Noyau fonctionnel
Spécificité individuelle
Espèces potentiellement pathogènes
Tap J. Environ Microbiol. 2009 Oct;11(10):2574-84
2 Implication du microbiote intestinal en pathologie
Microbiote intestinal et maladies mĂŠtaboliques
Microbiote intestinal et maladies inflammatoires
Microbiotes spĂŠcifiques des MICI
Qin J. Nature. 2010 Mar 4;464(7285):59-65
6 témoins sains
6 patients Crohn
OTU = Operational Taxinomic Unit = espèces phylogénétiquement proches Manichanh C. Gut 2006;55:205–211
MICI = apparition de pathogènes ou déséquilibre du microbiote? OTUs exclusivement retrouvées chez des sujets sains :
Noyau dur d’OTUs retrouvées chez tous les sujets :
Lachnospiraceae (7 OTUs) Ruminococcaceae (4 OTUs) Eubacteriaceae (2 OUTs)
Faecalibacterium Bacteroides Parabacteroides Alistipes Subduligralinum
= noyau phylogénique sain
OTU = Operational Taxinomic Unit
(4 OTUs) (2 OTUs) (1 OTU) (1 OTU) (1 OTU)
OTUs retrouvées aussi bien chez les sujets sains que chez les patients atteints de Crohn = 48 OTUs
Lepage P. Inflam. Bowel Dis. 2005; 11: 473-480 Gophna U. J Clin Microbiol 2006; 44: 4136-4141 Manichanh C. Gut 2006; 55: 205-211
Eckburg P.B. Science 2005; 308: 1635-1638 Gill S.R. Science 2006; 312: 1355-1359 Li W. Bioinformatics 2006; 22: 1658-1659
Fonction anti-inflammatoire de Faecalibacterium prausnitzii ?
Miquel S. Curr Opin Microbiol 2013;16(3):255â&#x20AC;&#x201C;61.
Un microbiote « colitogénique » ? • Souris TRUC (Tbet-/- x Rag-/-) = modèle de RCH • Le profil immunitaire des souris TRUC sélectionne un microbiote digestif spécifique • Transfert de cette flore à des souris sauvages : transmission de la RCH
Garrett WS. Cell 2007;131:33-45
R么le de la flore intestinale dans les arthrites exp茅rimentales
Modèle murin KO pour IL-1ra IL-1ra-/-
cage non stérile
IL-1ra-/-
IL-1ra-/-
axénique
lactobacillus
• IL-1ra-/- : arthrites spontanées • IL-1ra-/- axéniques : pas d’arthrite • IL-1ra-/- gnotobiotique pour lactobacillus bifidus : – Arthrites identiques aux animaux non axéniques – Déséquilibre balance Treg/Th17 médié par TLR2 et TLR4
Lactobacillus = bactéries gram+ anaérobies facultatives, commensales vagin et intestin Lactobacillus bifidus = essentiel de la flore intestinale du nourrisson élevé au sein Abdollahi-Roodsaz S. et al. J. Clin. Invest. 2008; 118, 205–216
Effet protecteur de la flore intestinale sur des modèles animaux d’arthrite Rat CIA/AA
Rat CIA/AA
Cages non stérile
Germ-free
• Arthrite à l’adjuvant : – Arthrite modérée et transitoire chez les rats élevés en ambiance normale – Arthrite sévère chez 100% des rats axéniques
Effet protecteur de la flore digestive ? Kohashi O. et al. Infect. Immun. 1979; 26, 791–794
Rôle de la flore digestive dans l’orientation du système immunitaire Souris gnotobiotique = flore contrôlée = souris axéniques (germ free) chez lesquelles on introduit des souches bactériennes connues
Bacteroides fragilis
↑ FoxP3 ↑ Treg
• Fragilité vis-à-vis des entéropathogènes • Résistance à l’arthrite expérimentale et à l’EAE
↑ TCD4+ • Protection contre les entéropathogènes ↑ Th17 Bactéries filamentaires
• Susceptibilité accrue à l’arthrite expérimentale et à l’EAE
Yun Kyung Lee, et al. Science 2010 330, 1768
Treg
Th17
Microbiome normal
Dysbiose excès de bactéries pro-inflam.
Dysbiose déficit de bactéries anti-inflam. Yun Kyung Lee, et al. Science 2010 330, 1768
Réduction du microbiote = cause ou conséquence de l’inflammation ? Génétique
↘ biodiversité
Apparition d’un pathogène
Environnement
Dysbiose
Inflammation
Inflammation réduction de l’effet barrière vis à vis d’autres bactéries
réduction du microbiote
↘ biodiversité
Les spondylarthropathies
Rats transgéniques B27 • Rats Lewis, lignées 21-4H ou 33-3 : – Maladie inflammatoire spontanée : – Arthrites – Colite – Epididymite, balanite – Uvéite – Hyperkératose cutanée
– Seuls ceux ayant incorporé un nombre important de copies des transgènes B27/b2m (Taurog 1993) – Fond génétique protecteur : toutes les lignées transfectées ne développent pas la maladie
Hammer RE. Cell. 1990 Nov 30;63(5):1099-112
Rôle de la flore intestinale dans le modèle des rats transgéniques B27 • Les rats transgéniques axéniques (= germ-free) : – ne développent pas la maladie – sauf dermatite et épididymite
• L’ajout de bactéries dans l’alimentation : – Restauration de l’ensemble du phénotype pathologique – Une flore commensale suffit…
• Rats B27 gnotoxéniques (= réintroduction d’une flore sélectionnée) : – Seuls certains cocktails bactériens aboutissent à l’induction d’une colite – Rôle des Bacteroides
Taurog JD. J Exp Med. 1994 Dec 1;180(6):2359-64 Rath HC. J Clin Invest. 1996 Aug 15;98(4):945-53
Rôle du microbiote intestinal dans les modèles de SpA • Objectif • Méthode – Purification et amplification de l’ADN caecal – Séquençage de l’ADN (BRiSK) microbien
Résultats – Confirmation par PCR quantitative ̶ 900 espèces bactériennes identifiées
̶ Différences quantitatives concernant 4 espèces confirmées par PCR pour 2 d’entre elles :
̶ Akkermansia muciniphila (diminution) ̶ Bacteroides vulgatus (augmentation)
B. vulgatus (BRiSK)
30 Séquençage quantitatif
IV – Spondyloarthrites - Pathogénie
– Comparer le microbiote caecal du rat HLA B27/hβ2m à celui du type sauvage (WT)
20 10 0 TG seuls
TG + WT
WT
Mise en évidence de 2 germes caractérisant le microbiote intestinal des rats HLA B27/hβ2m Rôle possible de la « cohabitation » avec modification de la flore des rats WT s’ils sont au contact des rats HLA B27/hβ2m ACR 2012 - D’après Bach (2493)
Chez l’homme ? • Pas de véritable étude métagénomique à ce jour… • Des travaux en cours
La polyarthrite rhumatoïde • Le microbiote oral • Le microbiote digestif • Le microbiote respiratoire
Le microbiote oral
Les parodontites • Porphyromonas gingivalis = premier agent infectieux responsable des parodontites – P. gingivalis possède une PAD capable de citrulliner des protéines humaines – Association entre parodontite et HLA-DR4, ACPA, tabac
• Liens entre parodontite et PR : – Fréquence accrue de la parodontite au cours de la PR – Assocation entre : – sévérité de la parodontite – portage de P. gingivalis – sévérité de la PR
Mikuls T.R. Intern Immunopharmacol 2009;9(1):38-4 Marotte H. Ann Rheum Dis 2006;65:905–9 Stein J. J Periondotal Res 2003;38:508–17 Berthelot JM. Joint Bone Spine. 2010 Dec;77(6):537-41
Étude du microbiote oral de la PR • Étude du microbiote gingival de : – 31 PR récente (NORA) – > 6s < 6m, pas de DMARD – 88% ACPA+ – 16% fumeurs
– 34 PR chr (CRA) > 6 mois – 18 témoins sains
• Score de parodontopathie
• Modification de la flore gingivale chez les sujets PR récente / T• Similaire à la PR chronique et aux sujets sains avec parodontopathie sévère • Indépendamment du tabagisme
Scher JU. Arthritis Rheum (on line)
Le microbiote intestinal
Influence des facteurs génétiques liés à la PR sur le microbiote intestinal • analyse de la flore fécale de souris transgéniques exprimant : – HLA-DRB1*0401 : associé à la susceptibilité à la PR – HLA-DRB1*0402 : associé à la résistance à la PR
DRB1*0402
DRB1*0401
• Pyroséquençage 16S : – *0401 : – Dominance d’espèces Clostridium-like – Peu de variation selon le sexe et l’âge des animaux
– *0402 : – Dominance de Porphyromonadaceae et Bifidobacteria – Variabilité importante en fonction du sexe et de l’âge
Gomez A. PLoS ONE. 2012;7(4):e36095.
Influence des facteurs génétiques liés à la PR sur le microbiote intestinal • Augmentation de la perméabilité intestinale chez les femelles *0401 • Expression des cytokines (transcrits) pro-inflammatoires dans le jejunum : – *0401 femelles : surexpresssion (x3) des cytokines Th17 (IL-17, IL-23, IL-6) et Th1 cytokines (IFNg, Stat 4 et TBX21) – *0402 femelles : surexpression des cytokines Th2 et régulatrices ICOS, GATA3 et IL-4
Gomez A. PLoS ONE. 2012;7(4):e36095.
Prevotella copri associé à la PR débutante • Séquençage 16S sur selles : PR débutantes (n=44) / PR chroniques (n=26) / Rhum Pso (n=16) / Sujets sains (n=28) • Séquençage global (shotgun) sur 44 specimens
• Surabondance de prévotelles dans les PR débutantes • Bacteroides dominantes dans les autres groupes
Scher JU. eLife. 2013 ;2(0):e01202–2.
Prevotella copri associé à la PR débutante Prévalence de Prevotella copri (abondance>5%) / groupe de patients
Phylogénie des espèces de prévotelles associées aux PR débutantes : • 2 OTU spécifiquement retrouvés chez les PR • Liées phylogénétiquement à P. copri
Scher JU. eLife. 2013 ;2(0):e01202–2.
Prevotella copri associé à la PR débutante Association inverse entre l’abondance de P. copri et l’épitope partagé
Scher JU. eLife. 2013 ;2(0):e01202–2.
Prevotella copri associé à la PR débutante Évaluation de la capacité de P. copri à induire une réponse inflammatoire par gavage oral de souris C57BL/6 : induction d’une colite
Scher JU. eLife. 2013 ;2(0):e01202–2.
Le microbiote respiratoire
Le poumon candidat dans la physiopathologie de la PR • Facteurs d’environnement : – Tabac – Silice – Polluants
• Fréquence des pathologies respiratoires dans la PR : – 30% de bronchectasies – 35% des patients PR + bronchectasies sont hétérozygotes pour la mutation ∆F508 du gène CFTR
Schreiber J. Eur J Intern Med. 2010;21(3):168-72 Hart JE. Environ Health Perspect. 2009;117(7):1065-9
Cortet B. Ann rheum dis. 1997;56(10):596-600 Puechal X. Ann rheum dis. 2011;70(4):653-9
Réduction de la biodiversité du microbiote respiratoire en situation pathologique OTUs exclusivement retrouvées chez des sujets sains = noyau phylogénique sain
Noyau dur d’OTUs retrouvées chez tous les sujets
• BPCO Huang YJ. Omics. 2010;14(1):9-59
• Mucoviscidose
Cox MJ. PLoS One. 2010;5(6):e11044 Sibley CD. PLoS One. 2011;6(7):e22702 Willner D. PLoS One. 2009;4(10):e7370 Zemanick ET. PLoS One. 2010;5(11):e15101
OTU = Operational Taxinomic Unit
OTUs retrouvées aussi bien chez les sujets sains que chez les patients malades
Le poumon dans la PR préclinique et la PR récente Microbiote respiratoire PR précliniques (ACPA+ sans arthrite) et témoins sains ACPA-
Présence d’anti-CCP dans le liquide d’expectoration bronchique
Anti-CCP + 0 arthrite
T– Anti-CCP-
p
Prévalence
85 %
100 %
0,63
Abondance
2,0
0,6
0,01
Prévalence
100 %
100 %
1,0
Abondance
30,4
18,0
0,07
Prévalence
100 %
100 %
1,0
Abondance
12,4
25
0,07
85 %
100 %
0,63
Haemophilus
PR récente (12) Parent 1er degré (29) Témoins sains (17)
Streptococcus
Prevotella
Anti-CCP3 (IgA/IgG)
Porphyromonas Prévalence
Willis VC, ACR 2012, #423
Demoruelle MK. Am Thorac1,1Soc. 2014;11 Abondance 1,5Suppl 1:S74. 0,43
Étude bordelaise en cours • 30 patients PR < 2 ans, sans biothérapie • Bilan respiratoire : – Clinique – EFR – TDM thorax coupes fines
• Prélèvements respiratoires : – Aérosol hypertonique x 30 mn – Expectoration après clapping
• Pyroséquençage 16S et comparaison à 8 T- sains • Résultats préliminaires : – Restriction de la diversité de la flore chez les PR vs T– Restriction plus franche chez les PR avec manifestations respiratoires cliniques ou TDM – Surreprésentation de certaines espèces : – Pseudomonas – burkholderia
Phase préclinique extra-articulaire
Phase clinique articulaire
Environnement
citrulline
Immunisation anti-citrulline ACPA
Destructions articulaires
Élargissement du répertoire reconnu par les ACPA
Extension des synovites
Complications extraarticulaires
Temps
Épitope partagé
Microbiote
Génétique
Synovite Inflammation infra-clinique
Critères diagnostiques de PR
Le chainon manquant…
comment la maladie est transférée à l’articulation ?
Pilotage à distance d’une réaction dysimmunitaire ?
Translocation bactérienne ?
Détection d’ADN bactérien dans le liquide synovial ou la membrane synoviale • Mollicutes
Schaeverbeke T. Lancet. 1996 May 18;347(9012):1418 Schaeverbeke T. J Clin Pathol. 1996;49(10):824-8 Johnson SM. J Clin Microbiol. 2007 Mar;45(3):953-7
• Divers bactéries • P. gingivalis
van der Heijden IM. Rheumatology 1999;38(6):547-53 van der Heijden IM. Arthritis rheum. 2000;43(3):593-8 Kempsell KE. Infect Immun. 2000;68(10):6012-26
Martinez-Martinez RE. J Clin Periodontol. 2009;36(12):1004-10
La dysbiose muqueuse pourrait favoriser la translocation bactérienne
Hypothèse : translocation articulaire d’antigènes bactériens ou de bactéries entières (viables ?) dans l’articulation • Recherche d’ADN bactérien par pyroséquençage 16S sur liquide synovial (18 PR vs 6 arthroses) • Caractérisation des bactéries correspondantes, par patient et par groupe pathologique
• Certaines familles de germes exclusivement retrouvées dans les prélèvements de PR : – Mycoplasma, Clostridia, Pseudomonas and Burkholderiae – Germes majoritairement d’origine respiratoire ou digestive
Phase préclinique extra-articulaire Génétique
genre
Évènements stockastiques Tabac Toxines Microparticules
Statut hormonal
Microbiote
Pathogène
Microbiote modifié
Inflammation muqueuse Brochopneumopathie Parodontitie
Conflit immunologique Immunisation anti-citrulline ACPA
Élargissement du répertoire reconnu par les ACPA
Épigénétique
Microbiote pathogène
Translocation microbienne arthrite
3 L’immunité des muqueuses Comment notre système immunitaire compose avec une interface aussi riche en bactéries…
Immunité innée TLR
MyD88
IRAK
endotoxine
récepteur TNF
reconnaissance des LPS bactériens par les récepteurs TOLL
Réaction inflammatoire = première ligne de défense contre les infections D’après Elson C. N Eng J Med 2002
IKK
NOD2
IKB
TRAF NFKB
TNFα
Médiateurs de l’inflammation : cytokines, PGE2, NOsynthase...
Chaque TLR est adapté à un type de PAMP lipopolyligands ARN sb saccharides uropathogéniques ARN db flagelline ADN CpG
TLR = Toll Like Receptor PAMP = Pathogene Associated Molecular Patterns
TLR 11
TLR 9
TLR 7 TLR 8
TLR 5
TLR 4
TLR 3
TLR 1 TLR 2 TLR 6
lipoprotéines
Le pilotage de l’immunité adaptative
barrière peau, muqueuse antigène signal danger
PAMP
TLR
inflammation
LT NK
régulation LB T reg
immunité innée
immunité acquise
Comment différencier : • Les espèces symbiotiques (commerce) • Les espèces commensales (badauds) • Les espèces parasites/pathogènes (ennemis) • En sachant que, dans certaines conditions, une même espèce peut passer de commensale à pathogène… = pathogènes opportunistes !
La simple détection de particules étrangères ne suffit pas à activer la CPA : Rôle de l’inflammasome TLR = veille extracellulaire
Antigène vaccinal
PRR (TLR) TNF
PAMP Signal 1 : Identification de motifs “étrangers” : • portion hydrophobe des LPS • acides nucléiques… Signal 2 : Identification de perturbations intracellulaires
adjuvant
Pro-IL-1ß NLRP3
Pro-IL-1ß DAMP
Armement de la cellule dendritique « sentinelle »
Inflammasomme = gardien de l’intégrité intracellulaire IL-1ß
IL-1ß inflammasome
Récepteurs cytokines pro-inflammatoires Molécules costimulation Différenciation Th17
Polarisation M1
Polarisation M2
PAMPs TLR
Défensines
MDP
Phagocytose +
NOD 2
TNFSF15 TNF-α IL-12
-
Th1
NFkB
Cytotoxicité Granulome
CARD9 Autophagie
DAMPs
Atg16L1
proIL-1ß
IRGM
Th0
IL-1ß
MHC II
Th2
IL-23
Inflammasome
ORMDL3 IgA
Th0
Clairance bactérienne Immunité humorale
Th0
Th17 Persistance bactérienne Niche inflammatoire
Génétique des MICI • Nod2 (nucleotide-binding oligomerization domain containing 2) • CARD9 (caspase recruitment domain 9) • Atg16L1 (autophagy-related gene 16-like 1) • IRGM (immunity-related GTPase M) • ORMDL3 (réponse UPR : unfold protein response) • IL-23R (IL-23 receptor) • TNFSF15 (récepteur de la superfamille du TNF, inhibiteur de l’angiogenèse)
Barrett, J.C. Nat Genet 40: 955–962
Clairance bactérienne Immunité humorale
Polarisation M2
TLR
Défensines
Polarisation M1
PAMPs
TNFSF15 TNFα IL-12
-
MDP
Nod2 Nod2 Autophagie +
Th1
NFkB
Cytotoxicité Granulome
card9
Atg16L1 IRGM Th0
CARD9DAMPs proIL-1ß Inflammasome IL-1ß
MHC II
Th0
IL-23
IL-23R Th0
ORMDL3 Th17
IgA
Th2
Treg
Persistance bactérienne Niche inflammatoire
Facteurs génétiques associés à la SA Cytotoxicité NK
TCD8+
Inhibition de l’apoptose
• • • • •
TAP ERAP1 KIR IL-23R IL-17
KIR HLA-B27
ERAP TAP Proteasome
Th1
TCD4+
Th17 IL-1 HLA-B27 misfolding
C cible Th17
UPR
Th17
Mφ
IL-17
IL-6
TNF-α IL-1
IFN-γ IL-23R IL-23 Adapté de : Colbert RA. Immunological Reviews 2010 Vol. 233: 181–202
Inflammation
Communautés et singularités de la génétique du Crohn et de la SA Crohn
SA
Hyperperméabilité et inflammation intestinale Défaut de clairance bactérienne
Autophagie NOD2
IL-17 IL-12 TNF-α IL-23
Stress RE
Infiltrat macrophages CD163+
B27
4 Comment les bactéries ont-elles appris à « parler » humain ?
La vie sociale des bactéries Pseudomonas aeruginosa isolé ou organisé en colonie
Quelles sont les informations nécessaire à la survie d’une bactérie ou d’une levure ? • Est-ce qu’il y a à manger ? – Des « palpeurs » renseignent la bactéries sur la présence de nutriments dans son environnement
• Est-ce qu’il y a risques imminents ? – D’autres « palpeurs » permettent de détecter des substance témoignant de la mort de bactéries : – fraction liposoluble des lipoprotéines membranaires – acides nucléiques
• Ça ne vous rappelle rien ??? • Que fait une bactérie quand elle perçoit ces signaux ? – Sporulation – Synthèse de bulles de gaz qui lui permettent de changer de strate dans un milieu acqueux
LUCA : ancêtre de tous les êtres vivants (Last Universal Common Ancestor)
4,5 milliards d’années
3,5 milliards d’années 2,4 milliards d’années
Homo habilis 2,4 millions d’années Eucaryotes pluricellulaires : 500 millions d’années
Des briques fondamentales communes
Un code ADN commun : ATGC Une transcription en ARN remplacement T / U Une même façon de traduire en protéines Ribosomes ARN de transfert Un code de 20 acides aminés
Un fond commun de gènes et de protéines homologues Notamment celles qui concernent la conversation…
Un langage universel ? Non, mais des universaux dans les langages… • la fonction primitive d’adaptation d’une cellule vivante ou d’un organisme vivant à son milieu est une nécessité absolue pour survivre ●
fonction primitive
●
hautement conservée
●
les mécanismes sont très voisins pour les procaryotes et les eucaryotes
• notre système immunitaire est totalement empreint de ces fonctions primordiales • l’étude parallèle des mécanismes de la réponse immune à un agent infectieux et dans un processus «auto-immun» montrent qu’ils sont intimement liés • l’étude du dialogue bactérie-système immunitaire est susceptible de fournir des explications à la pérennisation des phénomènes auto-immuns
Ce langage universel permet aux bactéries filamentaires d’utiliser notre système immunitaire pour se protéger d’autres micro-organismes
Quorum sensing : système de communication des procaryotes • Dialogue procaryote-procaryote intra-espèce – Contrôle de la taille de la colonie – Spécialisation fonctionnelle
• Dialogue procaryote-procaryote inter-espèces – Organisation du microbiote intestinal – Biofilms
• Dialogue procaryote-eucaryote – Bactéries sensibles à nos secrétions hormonales, neuromédiateurs… – Certaines bactéries pilotent le système immunitaire à leur avantage… – Exemple : la différenciation Th17 promue par les bactéries filamentaires les protège des champignons
5 L’étude des microbiotes peut-elle avoir des débouchés thérapeutiques ?
Clostridium difficile • Bacille Gram + anaérobie strict – Appartient à la flore intestinale normale – Normalement présent en faible abondance
• Agent des colites pseudomembraneuses : – Infection digestive sévère – Surtout chez le sujet âgé – Après antibiothérapie
• Répond au traitement antibiotique • Mais risque de récidive +++ – 25% après 1er épisode – 35 à 45% après 2e épisode – > 50% au delà
Kelly CP. N Engl J Med. 2013;368(5):474–5.
Un « nouveau » traitement, déjà utilisé au 4e siècle en Chine dans le traitement des diarrhées… • Essai randomisé en ouvert chez des patients ayant présenté ≥ 1 rechute d’infection à C. difficile après antibiothérapie • 3 bras thérapeutiques : – Transplantation fécale /donneurs sains après lavement et vancomycine cure courte – Vancomycine – Vancomycine + lavement
• Sélection des donneurs : – Volontaires sains < 60 ans – Questionnaire pour évaluer les risques d’infections transmissibles – Multiples sérologies : HIV, HTLV 1 et 2, hépatites A, B et C, CMV, EBV, syphilis, strongyloides, entamoeba histolytica
• Transplantation fécale : – Selles collectées le jour de l’administration – Dilution dans 500 ml sérum physio – Administration par sonde nasoduodénale 50 ml/ 2 à 3 min
Taux de rémission sans rechute
van Nood E. N Engl J Med. 2013 Jan 31;368(5):407–15.
Diversité du microbiote intestinal avant et après transplantation fécale
Index de Simpson = score de diversité biologique
van Nood E. N Engl J Med. 2013 Jan 31;368(5):407–15.
Dans la maladie de Crohn • Plusieurs essais de probiotiques méthodologiquement ± bien conduits • Le plus souvent un effet significatif vs placebo • Mais : – Absence de stabilité dans le temps – Restauration plus ou moins rapide d’une flore pathologique
Et dans la PR ?
Mandel DR. BMC Compl Alt Med. 2010;10(1):2-7
Conclusion • Le microbiote intestinal peut être assimilé à un véritable organe : – Alimentation – Apports énergétiques, vitamines, acides aminés et lipides essentiels – Éducation du système immunitaire – Participation à la défense vis-à-vis des entéropathogènes
• Un dialogue permanent existe entre la flore muqueuse et le système immunitaire de l’hôte
Conclusion :
lien entre génétique, infections et rhumatismes • Les populations humaines ont subi pendant des millénaires une pression de sélection du fait de l’environnement infectieux • Notre génome est imprégné de cette sélection • Les facteurs de résistance aux infections ancestrales peuvent constituer des éléments déterminants dans la physiopathologie des maladies inflammatoires • La modification de l’environnement infectieux et la diminution de la pression infectieuse sont susceptibles de révéler de nombreuses pathologies : – allergies – auto-immunité…
Perpectives thérapeutiques Restaurer la biodiversité (microbiome sain) ? Flore intestinale
Barrière intestinale Immunité innée
Immunité adaptative
Un véritable organe microbien Diminue les capacités invasives des pathogènes
Compétition alimentaire avec les pathogènes
Participe à la barrière épithéliale
occupe les récepteurs cellulaires aux molécules d’adhésion
Secrète de l’acide lactique
Microbiote intestinal Signaux de stimulation pour le recrutement de lympho T et B
IgA
Th17
Produit des ligands qui activent les TLR
Peptides antimicrobiens