ANTIBIOGRAMA
LAURA MILENA REYES DUQUE
UNIVERSIDAD DEL QUINDIO FACULTAD DE CIENCIAS BASICAS Y TECNOLOGIAS PROGRAMA DE QUIMICA MICROBIOLOGIA ARMENIA 2013 ANTIBIOGRAMA El antibiograma es la prueba microbiológica que se realiza para determinar la susceptibilidad (sensibilidad o resistencia) de una bacteria a un grupo de antibióticos. Las técnicas de antibiograma son las utilizadas en el laboratorio de microbiología para estudiar la actividad de los antimicrobianos frente a los microorganismos responsables de las infecciones. Se considera como antimicrobiano cualquier sustancia con capacidad de matar o al menos de inhibir el crecimiento de los microorganismos y que sea susceptible de utilización como tratamiento en los pacientes. Pueden ser naturales, sintéticos o semisintéticos. La historia moderna de los antibióticos comienza con el
descubrimiento de sustancias presentes en unos microorganismos capaces de matar a otros microorganismos. La utilización de antibióticos supuso un avance enorme en la esperanza de vida de las personas que padecían procesos infecciosos, aunque desgraciadamente también supuso un aumento en los niveles de resistencia antibiótica. OBJETIVOS El primer objetivo del antibiograma es el de medir la sensibilidad de una cepa bacteriana que se sospecha es la responsable de una infección a uno o varios antibióticos. En efecto, la sensibilidad in vitro es uno de los requisitos previos para la eficacia in vivo de un tratamiento antibiótico. El antibiograma sirve, en primer lugar, para orientar las decisiones terapéuticas individuales. la epidemiología. Es necesario detectar el aumento de los niveles de resistencia en los aislamientos clínicos para tomar medidas correctoras. El segundo objetivo del antibiograma es el de seguir la evolución de las resistencias bacterianas. Gracias a este seguimiento epidemiológico, a escala de un servicio, un centro de atención médica, una región o un país, es como puede adaptarse la antibioterapia empírica, revisarse regularmente los espectros clínicos de los antibióticos y adoptarse ciertas decisiones sanitarias, como el establecimiento de programas de prevención en los hospitales. Sensibilidad bacteriana a los antibióticos La determinación de la Concentración Inhibidora Mínima (CIM) es la base de la medida de la sensibìlidad de una bacteria a un determinado antibiótico. La CIM se define como la menor concentración de una gama de diluciones de antibiótico que provoca una inhibición de cualquier crecimiento bacteriano visible. Es el valor fundamental de referencia que permite establecer una escala de actividad del antibiótico frente a diferentes especies bacterianas. Hay diferentes técnicas de laboratorio que permiten medir o calcular de rutina, y de manera semicuantitativa, las CIM (métodos manuales y métodos automatizados o semiautomatizados). Estos diferentes métodos de rutina permiten categorizar una cierta cepa bacteriana en función de su sensibilidad frente al antibiótico probado. Esta cepa se denomina Sensible (S), Intermedia (I) o Resistente (R) al antibiótìco. Para un determinado antibiótico, una cepa bacteriana es, según la NCCLS: Sensible, si existe una buena probabilidad de éxito terapéutico en el caso de un tratamiento a la dosìs habitual. Resistente, si la probabilidad de éxito terapéutico es nula o muy reducida. No es de esperar ningún efecto terapéutico sea cual fuere el tipo de tratamiento. Intermedia, cuando el éxito terapéutico es imprevisible. Se puede conseguir efecto terapéutico en ciertas condiciones (fuertes concentraciones locales o aumento de la posología).
Dilusion • Técnica de referencia en la mayoría de los estudios clínicos de susceptibilidad a antimicrobianos. • Entrega un resultado cuantitativo, ya que permite determinar la concentración inhibitoria mínima (CIM). • Se puede realizar en medio líquido (dilución en caldo) o en medio sólido (dilución en agar). • Método complejo y de alto costo.
Metodo de difusión en disco (Baeur-kirby) Es el mas utilizado Prueba la inhibición o resistencia de los microorganismos, enfrentándolos con los medicamentos que se encuentran impregnados en pequeños discos Consiste en sembrar las bacterias aisladas del paciente infectado sobre una placa de agar con un sensidisco Cantidad: 12 unidades en placas de 150 mm y 5 unidades en placas de 100mm Se incuba por 24 horas, si se observan halos, se prosigue con la medición En esta fotografía se muestra un ejemplo de antibiograma realizado por el método de difusión en agar por medio de discos. En la imagen de la izquierda se muestra una vista general de una placa con crecimiento bacteriano y con seis discos de antibióticos. La zona de color claro que ocupa la mayor parte de la placa es el crecimiento bacteriano en las zonas no
inhibidas. Los círculos negros que rodean a cinco de los seis discos marcan las zonas en que los respectivos antibióticos han inhibido, con mayor o menor eficacia, el crecimiento del microorganismo a estudio. El sexto disco (AM-10) no tiene a su alrededor halo de inhibición lo que indica la resistencia del microorganismo a ese antibiótico. La foto de la derecha, un plano más cercano de la mitad superior de la placa, permite observar con más detalle lo señalado en el párrafo anterior. Puede verse además, con gran claridad, la especial disminución de la intensidad de crecimiento del microorganismo en la zona interior del halo de inhibición del disco de CTX-30, debido probablemente a la aparición de mutantes resistentes de dicho microorganismo capaces de soportar en mayor medida que el resto el efecto inhibitorio del antibiótico.
Metodo de E-test Se trata de una técnica cuantitativa en placa que permite obtener una lectura directa de CMI en µg/ml, ya que se emplean tiras plásticas impregnadas en concentraciones crecientes de antibiótico indicadas en una escala graduada sobre la propia tira. Una de sus grandes ventajas, dadas sus características, es que resulta un método ideal para estudiar cualquier tipo de microorganismo, aerobio o anaerobio, incluyendo aquellos llamados "fastidiosos" o los que tengan requerimientos especiales para crecer. El microorganismo a investigar se inocula en una placa y sobre ella se deposita la tira del antibiótico (o antibióticos) a ensayar. Tras la incubación de 16-24 horas a 35ºC se observan las placas y se valora la zona de inhibición, de forma elíptica, alrededor de cada tira. La CMI se lee directamente observando el punto más bajo de la elipse que presente crecimiento. Antibiograma realizado por el método de E-test
En esta fotografía se muestra un ejemplo de antibiograma realizado por el método de E-test. En la fotografía de la izquierda se muestra una vista general de una placa con crecimiento bacteriano y con dos tiras de E-test. La zona de color más claro que ocupa la mayor parte de la placa es el crecimiento bacteriano en las zonas no inhibidas. Las elipses más oscuras que rodean la parte superior de las tiras E-test marcan las zonas en que los respectivos antibióticos han inhibido, con mayor o menor eficacia, el crecimiento del microorganismo a estudio. La foto de la derecha, un plano más cercano de la mitad inferior de la placa, permite observar con más detalle lo señalado en el párrafo anterior. Se aprecia perfectamente como el pico de la zona más estrecha de la elipse en la tira de MZ coincide, en la escala graduada, con la franja entre las marcas de 1.5 y 2, lo que nos indicaría que la CMI de este antibiótico (MZ) para este microorganismo sería de 2 µg/ml.
Métodos automatizados La mayoría de estos novedosos métodos utilizan sistemas de microdilución en medio líquido sobre microplacas con pocillos en "U" e interpretan el crecimiento bacteriano en los diferentes pocillos por medio de un autoanalizador (mediciones por turbidez o fluorescencia) o, en el caso de los sistemas más sencillos, por simple lectura óptica del técnico a través de un visor invertido de espejo. Su manipulación suele ser fácil y rápida, generalmente automatizada o semiautomatizada, lo que los convierte en métodos ideales para grandes volúmenes de trabajo. Una de sus grandes limitaciones es que sólo ofrecen garantía para investigar microorganismos de crecimiento rápido y que no tengan requerimientos especiales. Antibiograma realizado por método automático En esta fotografía se muestra un ejemplo de antibiograma realizado por un método automatizado. En la imagen de la izquierda se muestra una vista general de una microplaca para autoanalizador que incluye fase de identificación y fase de antibiograma (panel microScan). Las tres filas superiores de la microplaca son la zona de "identificación" del microorganismo, las cinco filas inferiores son el apartado "antibiograma".
La foto de la derecha, un plano más cercano de la mitad inferior izquierda de la microplaca, permite observar con más detalle algunas filas de pocillos con diluciones seriadas de algunos antibióticos. La dosificación de cada antibiótico aumenta, en cada fila, de izquierda a derecha (obsérvese los rótulos bajo cada pocillo: 8-16 ... 1-2-8-16 ... 2-8-32). Los pocillos que en la imagen muestran un color verde intenso tienen crecimiento bacteriano, o sea, el antibiótico en cuestión no impide el desarrollo del microorganismo a estudio. Los pocillos transparentes marcarían los puntos de inhibición de cada antibiótico.
Como hacerlo Para conocer la sensibilidad de una bacteria a distintos antibióticos se siembra una muestra del cultivo puro en un medio en el que conocemos la capacidad de difusión de cada una de las sustancias a testar. Este es el medio de Mueller Hinton. Para la realización de la prueba en primer lugar hay que sembrar el medio con una gran carga bacteriana que nos permita obtener un crecimiento en tapiz o césped. La siembra se realiza mediante un hisopo estéril que se empapa con el cultivo líquido o se impregna en un cultivo sólido. Se descarga el hisopo realizando una estrella en el centro de la placa y extendiéndola posteriormente por toda la superficie procurando que no queden espacios sin cubrir. Una vez sembrada la placa se eligen los antibióticos a testar. Los antibióticos vienen en impregnados en discos de papel absorbente que se sacan con pinzas metálicas esterilizadas mediante su flameo tras inmersión en alcohol. Los discos se depositan en la superficie del medio de cultivo inoculado, realizando una ligera presión para que queden adheridos al mismo. Hay que procurar que queden suficientemente separados unos de otros para que la lectura de resultados sea clara y no hayan interferencias entre la acción de unas sustancias y otras.
La placa preparada con el inóculo y los antibióticos se invierte y se lleva a incubar durante 24 horas a 37ºC. Tras este tiempo, se leen los resultados midiendo el diámetro de los halos de inhibición del crecimiento que aparecen alrededor de los discos de papel. Se valora la efectividad de los mismos consultando la tabla correspondiente en la que, según el antibiótico, tenemos la capacidad de difusión en el medio y por tanto, la medida de halo que corresponderá a una bacteria sensible, moderadamente sensible/de sensibilidad intermedia, o resistente.
Medicion de los halos Se usa una regla y se mide el diámetro del halo de inhibición partiendo desde donde esta el disco de antibiótico hasta donde se inhibio el crecimiento. La longitud obtenida después se compararan son estándares que nos diran si el medicamento será efectivo o no en el tratamiento