專題期中報告手冊 by Ting-Yu

國立中山大學生物科學系 104 級 102 學年度生物科學實務專題期中報告專輯 April 26, 2014

目錄謝政樺

…………………………………………002

黃冠庭

…………………………………………014

林大惟

…………………………………………024

潘桂香

…………………………………………040

張樂翔

…………………………………………052

洪珮瑜

…………………………………………060

白育齊

…………………………………………072

賴亭羽

…………………………………………080

李紫昀

…………………………………………086

謝承翰

…………………………………………094

楊伊雯

…………………………………………104

張淨涵

…………………………………………114

黃齡誼

…………………………………………124

賴思蓉

…………………………………………138

邵鈺涵

…………………………………………148

林冠宏

…………………………………………158 主辦單位: 中山大學生物科學系 104 級

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Tumor Susceptibility Gene 101(TSG101) 在胚胎發育時期神經-肌突觸訊息傳遞過程所扮演的角色 Tumor Susceptibility Gene 101(TSG101) functions at developing Xenopus neuromuscular synapse

學生：謝政樺指導老師：劉昭成教授學號：B002010028

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一. 摘要 TSG101 (Tumor Susceptibility Gene 101)，已有研究指出參與許多生理功能，其中一生理功能為參與囊泡運輸途徑中蛋白質分選及內含體成熟，因其蛋白產物參與 ESCRT-I （The endosomal sorting complexe required transport I）複合體形成。目前對於 TSG101 在參與囊泡運輸後的相關神經生理功能研究甚少，這是本次專題研究的方向，實驗以非洲爪蟾作為模式生物，探討 TSG101 在神經-肌突觸細胞發育過程中是否造成神經細胞的活性改變。首先將具 TSG101/pEGFP 重組基因的載體利用電穿孔的方式導入至非洲爪蟾脊神經-肌細胞進行混和培養(Xenopus nerve-muscle co-culture)。而接下來進行以下探討:一為觀察神經細胞和肌細胞形態是否在 TSG101 overexpression 的情況下造成改變或會影響神經細胞與肌肉細胞建立突觸的數量；再利用 whole-cell patch clamp 的電生理模式紀錄 TSG101 在過度表現下肌細胞的電流大小和頻率是否改變，反映出支配的運動神經活性，觀察是否 TSG101 過度表現會使得囊泡釋放神經傳遞物質頻率上升。由於已有有論文指出 TSG101 會和 Snapin 蛋白交互作用共同參與內溶酶體運輸路徑，影響內含體成熟及其內含物的降解或再循環。若本次實驗初步結果與預測研究相符合，則可進一步探討是否 TSG101 及 Snapin 的交互作用會影響神經-肌突觸細胞神經活性突觸形成及功能改變。

二. 研究動機與目的實驗室中目前的研究方向是探討物質在神經-肌突觸細胞發育過程中調控神經傳導物質釋放。而我們已知 TSG101 被證實可與 VPS37 交互作用，影響 ESCRT (The endosomal sorting complexe required transport)協助 multivesicular body (MVB) 的形成與成熟。本實驗將以電生理方式紀錄探討 TSG101 對於神經細胞的相關生理功能之角色。

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三. 文獻回顧與探討 (1) TSG101(Tumor Susceptibility Gene 101)相關背景 TSG101 的發現在 1996 年被 Stanley Cohen 發表在 cell 期刊上，其將隨機的 Antisense RNA 抑制小鼠 NIH3T3 纖維母細胞的 TSG101 表現使導致細胞轉形。隨後注射至裸鼠體內，發現其中的 coiled-coil domain 會與 stathmin 作用形成腫瘤；若回復 TSG101 的表現腫瘤則會消失，但過度表現 TSG101 亦會使細胞轉形，顯示 TSG101 是具產出抑制腫瘤特性蛋白的基因，但必須在細胞中維持一定的量，過多仍會造成腫瘤形成[1]。

TSG101 蛋白質由 390 個胺基酸所組成，可分為四個功能區，由 N 端至 C 端分別為: ubiquitin E2 variant (UEV)、Proline rich domain (PRD)、Coiled-coli domain (CC)、Steadiness box (SB) [2]。UEV 功能區其胺基酸序列與泛素連接酵素(E2)相似，因缺乏胺基酸 Cysteine 為不活化型的 E2 蛋白，在 ESCRT-I 充當泛素化的輔因子，對於囊泡運輸中受體降解及再循環扮演重要角色[3][4]。而 Coiled-coli domain (CC)在會與 ESCRT-I 其他蛋白交互作用影響 MVB 形成。

(2) 內含體運輸內含體運輸具有接受器再循環、傳遞分子至細胞和內容物降解之功能。內含體包含分選內含體(sorting endosome)和 ERC (endocytic recycling compartment) [5]。sorting endosome 為受體媒介(receptor-mediated)的內吞作用第一個分歧點，當 sorting endosome 進入細胞質運輸時，部分會形成 recycling tubule 循環回細胞膜上，另一部分則會成熟形成晚期內含體(late endosome)或進入 ERC[6]。ERC 可將 cargo 送至細胞膜上或 tran-Golgi network (TGN)。而晚期內含體會另外接受來自 tran-Golgi network (TGN)的囊泡，其包含許多與 lysosome 功能相關的蛋白質，兩者結合形成 lysosome 將 4

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內容物水解[7][8]。結合 lysosome 蛋白階段需要 ESCRT 的參與進行 MVB pathway，促使蛋白降解 [9]。藉由 ESCRT-0 為起始，ESCRT-I、ESCRT- II、ESCRTⅢ等複合物依序結合至晚期內含體限制膜(limiting membrane)上，使限制膜產生凹陷與囊泡分離，得以與 lysosome 融合並將內容物降解[10]。

(3) 晚期內含體與 TSG101 TSG101 在內涵體運輸途徑中扮演協助晚期內含體成熟的角色。TSG101 蛋白會與 ESCRT 複合物作用，提供 UEV 功能區作為辨識受器蛋白 [11]，並藉 CC 功能區與 VPS 交互作用連結 ESCRTⅢ，為形成 MVB 過程的重要蛋白質。[12] 若 TSG101 缺失，會在囊泡運輸的過程中造成許多嚴重影響。MVB 的生成會因為 ESCRT 的功能缺失而受阻，進而影響 lysosome 的成熟[13]；另會影響 recycling vesicule 送回至細胞膜的功能，使得 receptor 無法循環影響囊泡運輸 [14]。也有研究顯示 TSG101 的突變使得囊泡內吞的途徑改變活化 Notch signaling 將 Upd (secreted mitogen Unpaired)過度表現影響轉錄，大量釋放生長因子造成細胞不正常增生形成腫瘤[15]。

(4) TSG101 與 Snapin 交互作用在陳錦翠教授實驗室學長吳昱樂 2013 年碩士論文分析了 TSG101 與 Snapin 間交互作用之特性，先利用 GST Pull-down 及免疫沉澱分析驗證兩蛋白脂之交互作用，後續利用共轉染方式將 TSG101 及 Snapin 導入類運動神經元 NSC-34 作為實驗模式，觀察到其交互作用發生在細胞本體及神經突觸，顯示兩蛋白交互作用可能具備相關生理功能，而仍未有深入的研究[16]。

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四. 研究策略 TSG101/pEGFP 之重組質體製備材料: LB:1% NaCl, 0.5% Yeast extract ,1% Trptone LB agar plate: 1% NaCl, 0.5% Yeast extract ,1% Trptone,1.5% agar TFB I :30 mM KoAc,100 mM RbCl , 10 Mm CaCl2 ,50 mM MnCl2 , 15%glycerol , 以醋酸滴定至 pH 值 5.8 並以 0.45 mm 濾膜過濾。 TFB II: 10 mM KOAc，10 mM RbCl，75 mM CaCl2，15％ glycerol，以 KOH 滴定至 pH 為 6.5，並以 0.45 mm 濾膜過濾。

方法: 1. 勝任細胞之備製取 E.coli DH5a 菌株，接種至 3ml LB 培養液中，在 37℃下以 160rpm 振盪培養 16 小時。隔日從培養之菌液中取 1 ml，接種至 50 mL 內含 20 mM MgSO4 的 LB 中繼續培約 2 到 3 小時，使 OD 600 達到 0.5 左右，再將菌液於 4℃下以 3,000 rpm 離心 5 分鐘，去除上清液，加入 20 ml TFB1 後將菌體沉澱物打散，於冰上放置 5 分鐘，接著於 4℃下以 3,000 rpm 轉速離心 5 分鐘，去除上清液，加入 2 ml TFB2，同樣輕輕的將菌體沉澱物打散，放置冰上作用 1 小時後，即可用來進行轉形作用。 2. 熱休克轉形作用取質體 DNA 約 50 ng 加到 50 μl 的勝任細胞輕輕混勻，置冰上 30 分鐘後，以 42℃水浴進行熱休克作用 90 秒，接著再放置冰上 3 分鐘，於無菌操作加入 450 μl 之 LB 培養液，並輕輕混合均勻，置於振盪培養箱中以轉速 250 rpm 進行振盪培養 1 小時後，將菌液均勻塗在含適當濃度之合適抗生素的 LB agar 培養盤 6

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上，置於 37℃培養箱內培養 16-18 小時。

抽取中量質體 DNA 材料: Buffer P1 (RNaseA solution) Buffer P2 (for SDS precipitation) Buffer P3 to 4℃

方法: 取少量已植入質體 E.coli 於 3 mL LB 溶液中在 37℃下以 160rpm 振盪培養 1 小時，隨後移至 250 mL LB 溶液振盪培養 12-16 小時。隔夜將增量後的細菌在 4℃下以 10,000 rpm 轉速離心 10 分鐘取上清液。備製 QIAGEN-tip 以 4 mL Buffer QBT 潤洗，將上清液倒入 QIAGEN-tip 以重力滴定去除溶液；再加入 10 mL Buffer QC 重複兩次滴定；最後加入 Buffer QA 並準備一 15 mL 試管承接滴定溶液。接著在試管中加入 3.5 mL isopropanol，均勻混和後以 10000rpm 轉速離心 30 分鐘。離心後以 2 mL 70% 酒精 wash，重複離心 10 mins，並去除上清液。最後加入 TE Buffer 將質體 DNA 混和後即可在 4℃冰箱保存。

非洲爪蟾的神經、肌細胞共同培養

材料: Riger:NaCl 115 mM，CaCl 2 mM，KCl 2.5 mM，HEPES 10 mM， pH7.6 +

Ca2 、Mg2 free Ringer solution: 115 mM，KCl 2.5 mM ，HEPES 10 mM， EDTA 0.5mM 培養液: 50% Leibovitz-15，1% fetal bovine serum

方法: 7

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以非洲爪蟾（ Xenopus laevis ）運動神經、肌細胞混合培養。取成熟的雌、雄爪蟾在泄殖腔部位注射性腺激素（HCG ）1 ml，促進交配及排卵，第二天撿取受精發育而成的胚胎至 stage 20-23，先以 75% 酒精消毒，再置於 10% Ringer 溶液，之後以鑷子除去包覆胚胎透明莢膜（capsule），將其置於無鈣鎂的的 Ringer 溶液，切下背部神經管及附近胚層組織約 30 分鐘，待脊隨解離成單細胞之後，以拉巴斯德玻璃管吸取並將其鋪在 3 ml 含有抗生素及血清素培養液的培養皿上，於室溫（ 20 -25 ℃）下培養 1 天，此時即可得神經、肌細胞混合的培養。以電轉將 TSG101 導入爪蟾神經、肌肉細胞同於非洲爪蟾神經、肌肉細胞共同培養方法，剪爪蟾之 spinal cord，置於 CMF 溶液中，讓組織分離成單細胞，將欲導入質體與 spinal cord 共同加入 PBS 溶液的 eppendorf 後均勻混和，另外將電轉管加入 3 ml 的 R buffer 使其導電。以 Neon TM pipette 將細胞與溶液吸入 Neon TM tip 中並放置於電轉儀，設定適當電極強度和頻率等條件開啟程序。電轉結束後將細胞劃在直徑 3cm dish 上，於室溫 (約 25 ℃) 中靜置 24 小時培養。

電生理記錄模式測試細胞電流的的模式主要是用 voltage-clamped whole-cell recording 紀錄。在前一天進行電轉完後，隔天將含有神經-肌突觸細胞的培養皿放在倒立顯微鏡上，先利用兩段式拉針器將玻璃毛細管拉成電極，再注入細胞內溶液。將針碰觸培養皿中的溶液形成迴路，配合電流放大器 Axoscope 9.0 開啟刺激器持續給予負 200 毫安培、長 200 毫秒、1 Hz 形成方波；接著使電極靠近肌細胞的細胞膜。當方波高度變小時，根據 V(電壓)=I(電流)R(電阻)，表示電極已與細胞膜相當接近導致電阻上升電流下降。再給予一點吸力將電極與細胞膜形成 gigaseal， 8

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隨後吸破細胞膜即形成 whole cell。因細胞膜電位為-70mV，須立即關閉刺激器將電極電位調與細胞相同以免損害細胞。以 patch clamp 紀錄導入 TSG101 神經元所支配的肌肉細胞。此時電極與肌細胞相通，因此當期支配的神經細胞利用囊泡釋放神經傳導物質時，會開始肌細胞膜上的 ACh 離子通道，便可由電極記錄到微量的自發性終版電流(SSCs)。當記錄到 SSCs 後，於十分鐘後在肌細胞周圍加入 K+ 溶液刺激神經細胞活性，觀察 TSG101 overexpression 與對照組的比較。總紀錄時間約為 50 分鐘。

五. 目前研究進度目前仍處於訓練技術純熟階段，須把幾項前置技術性步驟不斷重複練習完善。 1.在非洲爪蟾 co-culture 步驟，在顯微鏡下將卵背部的 spinal cord 依適當大小剪下，如下圖中顯示。進一步地，在電轉步驟中必須在一定時間內剪約 100 隻 spinal cord，若細胞在 CMF 溶液過長時間則會導致細胞解離過於完全，影響後續實驗。現在已能一定時間內穩定的進行 culture

2.基本的技術 culture 穩定後，需要在倒立顯微鏡下紀錄細胞電生理。在接近細胞時，玻璃電擊極為容易碰觸到細胞而導致破裂，需練習到從下針到細胞膜吸破的穩定性。隨後加入 H2O2 等刺激神經細胞溶液。如下圖

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圖二、(正常基因表現)可從此圖觀察，細胞電流產生的頻率在第十分鐘加入 H2O2 後有明顯的上升

2.接著在電轉的技術上，現階段質體導入細胞的成功率仍不高，需要探討及改善，因電轉設備成本高，必須保證在穩定的情況下才能執行後續實驗。下圖為以螢光蛋白測試電轉，在螢光顯微鏡下的結果。

圖三.左圖為在光學顯微鏡下的肌細胞，右圖為在螢光顯微鏡下肌細胞

六. 預期結果鑒於之前提出的研究，TSG101 在囊泡運輸系統中會協助內涵體的成熟，因此我們預期以下結果: 1. 在 TSG101 overexpression 情形下，形態上神經元支配肌細胞的數量或肌細胞外觀可能會改變 2. 在 TSG101 overexpression 情形下，神經細胞活性方面，可能會使神經活性上升 10

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七. 執行上的困難與解決之道目前執行上的困難有二項: 1. 由於電轉的技術不純熟，因此在質體導入的方面進度就停滯；需要不斷的練習並檢討改進技術層面，以增加成功導入 TSG101 質體的機率。 2. 若好不容易 TS101 蛋白有表現在支配肌細胞的神經元，並肌細胞具有活性，但因為目前我在 patch-clamp 的階段雖有穩定性，但仍會不小心戳破細胞，倘若成功導入 TSG101 的肌細胞已很少量，在記錄活性時的失誤就會導致整個實驗失敗，這方面還是需要不斷做練習。

八. 文獻參考 [1]Li,L. and Cohen,S.N., Tsg101: a novel tumor susceptibility gene isolated by controlled homozygous functional knockout of allelic loci in mammalian cells. [2] Pornillos, O. , Structure and functional interactions of the Tsg101 UEV domain. [3] TSG101 interaction with HRS mediates endosomal trafficking and receptor down-regulation [4] Carlton,2007, Parallels Between Cytokinesis and Retroviral Budding: A Role for the ESCRT Machinery [5] Maxfield FR,2004, Endocytic recycling. [6] Sharron X. Lin, William G. Mallet, Endocytosed Cation-Independent Mannose 6-Phosphate Receptor Traffics via the Endocytic Recycling Compartment en Route to the trans-Golgi Network and a Subpopulation of Late Endosomes 11

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[7] Doyotte ,Depletion of TSG101 forms a mammalian "Class E" compartment: a multicisternal early endosome with multiple sorting defects. [8] Babst M1, Odorizzi G, Estepa EJ, Emr SD. ,Mammalian tumor susceptibility gene 101 (TSG101) and the yeast homologue, Vps23p, both function in late endosomal trafficking. [9] M. Razi and C. E. Futter, Distinct Roles for Tsg101 and Hrs in Multivesicular Body Formation and Inward Vesiculation [10] TSG101 interaction with HRS mediates endosomal trafficking and receptor down-regulation [11] Mammalian Tumor Susceptibility Gene 101 (TSG101) and the Yeast Homologue, Vps23p, Both Function in Late Endosomal Trafficking [12] ESCRT-I core and ESCRT-II GLUE domain structures reveal role for GLUE in linking to ESCRT-I and membranes. [13] Tsg101 and the Vacuolar Protein Sorting Pathway Are Essential for HIV-1 Budding [14] Ishidoh K, Kominami E. ,Processing and activation of lysosomal proteinases.

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Snapin 在胚胎發育時期神經-肌突觸訊息傳遞過程所扮演角色之研究 Studies on the effects of Snapin at developing Xenopusneuromuscular synapse

學生：黃冠庭指導老師：劉昭成教授學號：B002010038

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（一）摘要在神經-肌肉細胞突觸間的訊息傳遞過程中，內含神經傳遞物質的突觸泡需有 SNARE complex 參與才可與細胞膜融合並進而釋放出神經傳導物質，而 SNARE （soluble N-ethylmaleimide-sensitive fusion protein attachment protein receptor）complex 是由 synaptobrevin/VAMP、syntaxin 以及 SNAP-25 所組成， Snapin 為一種位於突觸泡膜上可藉由與 SNAP-25 結合而影響神經傳導物質的釋放。Snapin 其產物為一含有 136 個胺基酸，分子量為 15kDa 的蛋白質，分析其 cDNA 序列可發現可發現其 N 端為一疏水區域，C 端為一 coiled-coiled domain，可能扮演突觸蛋白間交互作用的角色。為了瞭解胚胎發育早期對神經肌突觸形成過程的影響，故以 Snapin/pDsRed 重組質體，以電穿孔（electroporation）的方式導入非洲爪蟾（Xenopus laevis）神經-肌肉細胞，再將電轉後的爪蟾神經-肌肉細胞製作成 culture，使爪蟾神經細胞上 Snapin overexpression，隨後觀察 Snapin overexpression 的情況下有無造成神經細胞型態的改變或影響神經與肌肉細胞建立突觸，再利用電生理模式進行測試。由於已有論文指出 Snapin 與 TSG101 （tumor susceptibility gene 101）參與內溶體運輸途徑時會產生交互作用，若 Snapin 的 overexpression 對突觸後肌肉細胞活性有顯著影響，我們將進一步將 Snapin/pDsRed 與 TSG101/pEGFP 以電穿孔的方式一起導入爪蟾的神經細胞中，再測試 TSG101 在突觸泡的釋放過程中與 Snapin 是否會產生交互作用，實驗的結果將使我們對 Snpain 與 TSG101 的交互作用及神經激突觸發育過程所扮演的角色有更進一步的了解。關鍵詞：SNARE complex、syntaxin、SNAP-25、synaptobrevin/VAMP、TSG101

（二）研究動機與研究問題在實驗室中的討論及實驗進行中了解到Snapin廣泛表達於各類組織中，在神經與非神經系統中，參與各種膜運輸過程。TSG101蛋白參與了細胞週期的調控、蛋白質分選及囊泡運輸，對細胞之生長、增殖與存活，以及個體之發育與生存非常重要。本實驗的主要目的在於以Snapin及TSG101 overexpression 的方式進一步探討Snapin在胚胎發育早期神經肌突觸形成過程中所扮演的角色，同時我們也將探討TSG101在此過程中與Snapin的交互作用。

（三）文獻回顧與探討 Snapin 調控許多通道蛋白至細胞膜上之運輸，主要被認為與其能和 SNAP25 或其同源蛋白 SNAP23 的交互作用有關。近期研究發現，Snapin 與溶酶體關聯之 SNARE 複合體成員 syntaxin 8 有直接的交互作用[1]。而晚期內含體 15

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與溶酶體間之融合，必須依靠溶酶體關聯之 SNARE 複合體才能達成[2]。 Snapin 除與溶酶體關聯之 SNARE 蛋白直接交互作用外，其基因剃除亦導致了 Lamp-1、syntaxin 8 與 Vti1b 的堆積，顯示 Snapin 除了與調控突觸泡的調控也扮演調節晚期內含體與溶酶體融合之角色[1]。另外，Snapin 直接參與了神經元之晚期內含體的回送運輸，並影響細胞自噬體泡傳輸至溶酶體的功能[3, 4]。這些研究顯示 Snapin 在晚期內含體功能調控上扮演重要角色，但目前仍無文獻有直接的證據顯示 TSG101 與 Snapin 之間的關聯性，在之前的研究中學者發現 TSG101 會與 Snapin 有交互作用，顯示可能在內含體路徑之調節共同參與。 Snapin 分布於細胞膜上，並與 SNAP23 或 SNAP25 交互作用，促進胞吐作用。雖然目前並不清楚 TSG101 及 Snapin 在細胞膜上之分布，但 TSG101 已被報導與 exosome 外釋作用有關，可做為 exosome 之標誌[5]。Exosome 為一類細胞釋放到外界環境中的囊泡，直徑為 30 至 100 nm，不同類型細胞包含如樹突細胞（dendritic cell）及 HeLa 細胞株皆有釋放 exosome 的現象。在許多不同類型的體液中皆發現 exosome 的存在，參與細胞間的訊息傳遞[6-10]。 TSG101與Snapin皆被報導與神經退化有關。或許是因為TSG101之基因剃除為致死突變，導致小鼠在胚胎發育早期即死亡[11, 12]，難以觀察其對神經系統的影響，目前甚少有文獻探討TSG101對神經功能的直接影響。目前文獻顯示TSG101與Mahogunin泛素連接酶E3的基因缺失，導致的小鼠發生海綿狀腦神經性退化有關聯[13, 14]。而Snapin基因剃除會導致小鼠胚胎產生神經退化 [15]，可能與Snapin參與BDNF-TrkB 訊息內含體（signaling endosome）的回送運輸有關[16]。兩蛋白各自參與神經相關生理功能，再加上許多神經退化性疾病被報導與內溶酶體路徑異常有關。兩者交互作用對於神經發育是否有影響？將是值得探討的方向。

（四）研究方法及步驟非洲爪蟾的神經、肌細胞共同培養本實驗主要以爪蟾（Xenopus laevis）之運動神經、肌細胞混合培養（nerve muscle co-culture）來進行，其製備方法如下：取成熟的雌、雄爪蟾分別在其泄殖腔部位注射性腺激素（Human Chorionic Gonadotropin，HCG）0.5-1 ml （1000 U/ml），放置同一籠內以促進其交配及排卵，第二天撿取其受精卵發育而成的胚胎，待其發育至 stage 20-23 （約一天左右），先以 75% 酒精消毒 10 秒，再置於 10% Ringer 溶液，之後以鑷子除去包覆胚胎之透明莢膜（capsule）後，將其置於無鈣，無鎂的 Ringer 溶液中，切下其背部神經管及其附近中胚層組織，靜置約 30 分鐘，待胚胎解離成單細胞之後，再以拉細之巴斯德玻璃管吸 16

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取並將其鋪在事先消毒好的蓋玻片上，於室溫（20-25℃）下培養 1 天，此時即可得神經、肌細胞混合的細胞培養。培養液的組成如下：50％ Leibovitz L-15 （Sigma），1％ fetal bovine serum （Gibco）及 49％ Ringer 溶液（115 mM NaCl, 2 mM CaCl2; 2.5 mM KCl；10 mM HEPES, pH 7.6）。以電轉方式將重組質體導入爪蟾神經、肌肉細胞中依非洲爪蟾神經、肌肉細胞共同培養方法，剪50條爪蟾之spinal cord，置於無鈣、無鎂的Ringer中，讓組織分離成單細胞，將細胞及溶液吸到 eppendorf後spin down，去除上層溶液，之後加入100 μl的R buffer使細胞呈懸浮狀態。以NeonTM pipette將細胞與溶液吸入NeonTM tip中並放置於電轉儀中，開啟電轉程序。電轉結束後將細胞劃在直徑 3 cm 之 dish 上，在室溫（約 25ｏC）中靜置 24 小時，以螢光顯微鏡檢察是否成功將質體導入細胞，之後以電生理方式進行測試。 Snapin/DsRED重組質體製備 1. 勝任細胞之備製取E.coli DH5a菌株，接種至3ml LB 培養液中，在37℃下以160 rpm振盪培養16小時。次日，從隔夜培養之菌液中取1 ml，接種至50 mL內含20 mM MgSO4的LB中繼續培養約2到3小時，使OD600達到0.5左右，再將菌液於4℃下以3,000 rpm 離心5分鐘，去除上清液，加入20 ml預冷的TFB1後，輕輕的將菌體沉澱物打散，於冰上放置5分鐘，接著再次於4℃下以3,000 rpm轉速離心5分鐘，去除上清液，加入2 ml預冷的TFB2，同樣輕輕的將菌體沉澱物打散，放置冰上作用1小時後，即可用來進行轉形作用。剩餘分裝於微量離心管中，凍於70℃下保存備用。 2. 轉型作用取適量質體 DNA （約 50 ng）加到 50 μl 的勝任細胞中輕輕混勻，置冰上 30 分鐘後，以 42℃水浴進行熱休克作用 90 秒，接著再放置冰上 3 分鐘，於無菌操作台中加入 450 μl 之 LB 培養液，並輕輕混合均勻，置於振盪培養箱中以轉速 250 rpm 進行振盪培養 1 小時後，依菌株所帶之質體 DNA 的抗生素抗性，將菌液均勻塗在含適當濃度之合適抗生素的 LB agar 培養盤上，置於 37℃ 培養箱內培養 16 至 18 小時。 3. 質體DNA小量備製與限制酶酵素切割反應將帶有質體之細菌接種於 3 ml 含有抗生素的 LB 中，於 37℃震盪培養 16 至 18 個小時。次日，於 4℃下以 3,000rpm 轉速離心 10 分鐘後，去除上清 17

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液。以 300 µl 之 STET buffer 將沈澱均勻打散後，移入微量離心管中。加入 25 µl lysozyme（10 mg/ml）混合均勻後，置於沸水中 90 秒，接著於冰上靜置 10 分鐘後，以 4℃，12,000rpm 轉速離心 20 分鐘，再以牙籤剔除管底之沉澱。加入 300 µl 之-20℃冰存的 5 M LiCl 混合均勻後，於冰上靜置 10 分鐘。再以 4 ℃，12,000 rpm 離心 5 分鐘，將上清液移至新離心管，並加入 600 μl 之-20℃冰存的 isopropanol 混合均勻後，於-20℃靜置 1 小時或隔夜。接著在 4℃下以 12,000 rpm 轉速離心 20 分鐘後去除上清液，再以 70％酒精清洗沉澱。接著於 4 ℃下以 12,000 rpm 轉速離心 5 分鐘後，去除上清液，將微量離心管上蓋打開，倒置於 15 ml 離心管鐵架上，使 DNA 沉澱風乾。以適量 ddH2O 回溶質體 DNA。接著以分光光度計測定 DNA 溶液濃度及純度，冰存於-20℃備用。為確認質體之正確性，在微量離心管依序加入 ddH2O、1 μl 質體 DNA 溶液、1 μl 10X carlos buffer、1 μl 25mM DTT 與相應限制酶，置於 37℃下水浴 2 小時，再將反應完成之上述混和液以 0.8 至 1.5%洋菜膠進行電泳分析。

4. 質體DNA大量製備將帶有已確認之質體 DNA 的細菌接種於 400 ml 含適當抗生素的 LB 中，於 37℃震盪培養 16 至 18 個小時。隔日以 High Speed Plasmid Maxi kit 進行大量質體 DNA 抽取純化。首先將菌液移至離心管中，於 4℃下以 5,000g 高速離心 10 分鐘後，去掉上清液，加入 10 ml PM1 buffer，以滴管將離心管底的菌體均勻打散懸浮，再移到另一離心管中。接著加入 10 ml PM2 buffer，溫和翻轉混勻後，於室溫靜置數分鐘直至溶液變為澄清，再加入 10 ml PM3 buffer，再次溫和翻轉混勻，再以 17,000g 於 4℃下高速離心 30 分鐘。離心完成後，將其上清液緩緩倒入已預先用 PEQ buffer 活化過之純化管柱中，待菌液自行流盡，再加入 30 ml PW buffer 清洗管柱。待 PW buffer 流盡後，取一新 50 ml 離心管，其中先加入 9 ml 預冰之 isopropanol，並把清洗完成的管柱移至上述 50 ml 離心管上，加入 12 ml PEL buffer 使其自然流盡，將管柱上結合之質體 DNA 沖提下來。接著將 50 ml 離心管內溶液混勻後，置-20℃下隔夜使 DNA 脫水析出。次日在 4℃下以 13,800 g 高速離心 30 分鐘。去除上清液後，以 500 µl 之 70%酒精清洗 DNA 沉澱，吸取 DNA 轉移至新的微量離心管中，再於 4℃下以 12,000rpm 轉速離心 5 分鐘，於無菌操作台中小心地去除酒精後，將微量離心管上蓋打開，倒置於 15 ml 離心管鐵架上，使 DNA 沉澱風乾。取 300 µl 之無菌 ddH2O 將質體 DNA 回溶，並以分光光度計測定其純度及濃度後，將 DNA 分裝保存於-20℃中備用。 Snapin/pDsRed 之載體與 TSG101/pEGFP 共同表現之分析將 Snapin/pDsRed 與 TSG101/PEGFP 兩重組載體已電穿孔方式導入爪 18

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蟾神經-肌肉細胞中，利用螢光顯微鏡觀察之，若兩重組質體有成功的導入細胞中，且被細胞表現則 Snapin 所表現的紅光，與 TSG101 所表的綠光理論上會有重疊的現象，且主要會分布在細胞核的外圍及細胞質中。神經釋放神經傳遞物質活性之記錄由於運動神經釋放出神經傳遞物質Ach （acetylcholine）之後，ACh會打開肌細胞上的ACh離子通道而引起肌細胞上電流的流動，因此只要記錄這些出現在肌細胞上電流的大小或頻率即可反映出支配他的運動神經的活性。將含有運動神經與肌細胞混合培養之培養皿置放於倒立顯微鏡（IX-70, Olympus）的置物台上，於室溫下以patch clamp來進行以下實驗。實驗用玻璃電極之製備，乃以外徑1.5 mm之薄壁玻璃毛細管以兩段式垂直拉針器（PP-830, Narishige）拉成內徑約為1~1.5 mm的patch clamp電極（stage 1: 71.3 oC，stage 2: 55.8 oC），再經鍛造器（MF-830, Narishige）以熱線圈鍛造電極尖端使之平滑。當此電極注入細胞內溶液（internal solution: KCl 150, NaCl 1, MgCl21, HEPES 10, in mM; pH=7.2）時其阻抗約為1-5 Megaohm。利用此電極配合電流放大器WPC-100 （E.S.F.）我們進行以下實驗：當電極進入培養液之後，我們持續給負200毫安培、長200毫秒、1Hz的電流來形成方波，當方波高度變小時即顯示電極尖端已與細胞膜表面接觸、阻抗增加，此時再給予一點吸力即可將電極與神經細胞形成緊密的gigaseal，吸破細胞膜形成whole-cell recordings，將靜止膜電位嵌在-70 mV，由於此時玻璃電極已與肌細胞相通，當神經自發性釋放之ACh打開肌細胞上的ACh離子通道時便可由玻璃電極記錄此微終板電流（Spontaneous synaptic currents, SSCs），此電流不受鈉離子通道抑制劑如河豚毒素的影響，可見SSCs與動作電位無關，但是微終板電流會被ACh受體阻斷劑 D-tubocurarine （D-Tc）所抑制，由此可證明SSCs的確是神經自發性釋放ACh 作用到肌細胞ACh離子通道的結果。為了模擬正常生理情況下神經經由動作電位傳導而造成的神經傳遞物質釋放現象，我們另取一根已經磨光處理之玻璃電極充填 Ringer 溶液後，將電極接觸神經細胞體（soma），給予 0.3 ms 波寬、2-4 μA 之電刺激，如此便可誘使神經產生動作電位，此時即可在該突觸後肌細胞記錄到誘發型終板突觸電流（evoked synaptic currents，ESCs）。統計方法將儲存於電腦中的電流數值，利用 PClamp（Axon Instrument）、 Minianalysis（Synaptosoft）及 Sigmaplot（Jandel Scientific Co.）等電腦軟體來分析來計算 SSCs 及 ESCs 振幅及頻率，每單一實驗所記得的 SSCs events 需大於 180 才列入統計以求取其振幅及頻率，否則就捨棄不用。實驗數據以平均 19

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值±平均標準偏差（mean ± S.E.M）表示，單一平均值之求取係將所記錄時間內所有 events 的振幅總和除以 events 數目而求得。而實驗組相互間或與對照組間差異之評估可根據 Student’s t-test 來進行統計分析，以 p＜0.05 表示

（五）目前進度目前已將重組質體 Snapin/pDsRed 製備完成，並導入 E.coli DH5a 菌株中，製造出內含有 Snapin/pDsRed 重組質體的 DH5a 並設計以下幾組實驗來進行電生理的測量： 1.正常爪蟾神經-肌細胞，不加藥 2.正常爪蟾神經-肌細胞，patch 上去 10 分鐘後加入 0.05M K+ 3.Snapin overexpression 爪蟾神經-肌細胞，不加藥 4.Snapin overexpression 爪蟾神經-肌細胞，patch 上去 10 分鐘後加入 0.05M K+ 5.Snapin & TSG101 overexpression 爪蟾神經-肌細胞，不加藥 6. Snapin & TSG101 overexpression，patch 上去 10 分鐘後加入 0.05M K+ 而在電轉的部份，目前有試著將 pEGFP 導入爪蟾神經-肌細胞中（圖一），並在螢光顯微鏡下觀察（圖二），只有少數肌肉細胞上激發出螢光，有些細胞雖有成功將基因導入但細胞已死亡無法進行進一步的測試（圖三）。

圖一：紡錘狀肌肉細胞。

圖二：螢光顯微鏡視野下的肌肉細胞，發出綠色螢光，代表成功將 pEGFP 導入。

圖三：螢光顯微鏡視野下出現發綠色螢光的死細胞，代表該細胞生前有表現 pEGFP，但已死亡。

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（六）討論 Snapin 在功能上的研究已有一段時間，參與內含體的形成以及突觸泡的釋放，本實驗由兩個方向進行，分別將 Snapin 及 TSG101 於爪蟾神經-肌細胞 overexpression，探討兩蛋白對突觸後肌細胞活性的影響，分析其對突觸釋放的影響，之後進一步將 Snapin & TSG101 overexpression 來證明兩蛋白是否有交互作用，在先前的研究中學者發現 Snapin 與 TSG101 能有交互作用，然而證據並不直接，無法直接顯示出在突觸泡釋放或其他傳遞路徑上 Snapin 與 TSG101 有參與反應，因此本實驗室想以電生理模式來測試突觸後肌細胞的活性，就可了解 Snapin 及 TSG101 對神經細胞突觸泡釋放的影響。本實驗的困難在於必須將兩重組質體一起導入神經細胞並被神經細胞表現，然後觀察在 protein overexpression 的情況下是否會影響神經與肌肉細胞建立突觸(圖四)，才能以 patch clamp 對此肌肉細胞進行測試(圖五)，目前已嘗試過幾次的電穿孔，神經細胞全數死亡，只有少數的肌肉細胞存活，可見技術及條件的拿捏還需更加的精進。

圖四：正常情況下，胚胎發育時期神經與肌肉細胞形成的突觸（上方為神經細胞，下方為神經細胞）。

圖五：以 patch clamp 模式對突觸後細胞進行測試。

（七）參考資料 1. Lu, L., Cai, Q., Tian, J.H., and Sheng, Z.H., Snapin associates with late endocytic compartments and interacts withlate endosomal SNAREs.Biosci. Rep., 2009. 29(4): p. 261-9. 2. Pryor, P.R., Mullock, B.M., Bright, N.A., Lindsay, M.R., Gray, S.R., Richardson, S.C., Stewart, A., James, D.E., Piper, R.C., and Luzio, J.P., Combinatorial SNARE complexes with VAMP7 or VAMP8 define different late endocytic fusion 21

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以蛋白酶體活性報導細胞株進行 CA-4 烯雙炔衍生藥物之篩選 Screening of Combretastatin-A4 Derivatives Drugs in Proteasome Activity Reporter Cell Line

學生：林大惟指導老師：陳錦翠教授學號：B002010029

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(一)摘要蛋白質泛素化修飾為介導真核細胞蛋白降解的重要訊息路徑之一，可將無用的、摺疊錯誤的或有害的蛋白標記泛素後，送到蛋白酶體(proteasome)分解。在真核生物中泛素化修飾系統具有高度保守性，其參與調節細胞生長週期及細胞分化、轉錄調控、核酸修復與細胞凋亡等重要生理功能，該系統的異常運作已知與許多人類疾病，如癌症、神經退化性疾病的衍生息息相關。而蛋白酶體在分解泛素修飾蛋白上扮演重要角色。目前，已有許多蛋白酶體抑制劑被研發出來，有些並已使用在如多發性骨髓瘤、慢性淋巴性白血病等癌症治療上，其利用抑制蛋白酶體的活性，達到抑制癌細胞生長的療效。本研究計畫的目標藥物為新型 Combretastatin A-4 (CA-4)烯雙炔衍生物，目前已知其具有抗微管聚合、限制細胞週期與影響細胞自噬作用之效應，但其對蛋白酶體活性的影響仍不明確。本計畫擬以 Ub-X-GFP 融合蛋白表現報導細胞株，做為篩選這些新型 CA-4 烯雙炔衍生物是否具有影響細胞蛋白酶體活性之效應，提供未來抗癌與神經退化相關疾病藥物研發之參考。關鍵詞: 蛋白質泛素修飾(protein ubiqitination)、蛋白酶體抑制劑(proteasome inhibitor)、CA-4 烯雙炔衍生物(Combretastatin-A4 derivatives)、報導細胞株(UbX-GFP reporter cell line)

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(二)文獻回顧與探討蛋白酶體(proteasome)之結構及功能蛋白酶體是普遍存在於真核生物的細胞質與細胞核中的一種大型蛋白複合體，又稱為26S蛋白酶體(26S proteasome)，其主要作用在分解多餘的、受損的或摺疊錯誤的蛋白，對細胞生長週期與細胞生理功能調節非常重要[1]。蛋白酶體由20S大小的蛋白水解中心(core particle)和兩個19S大小之調節複合體 (regulatory particle)所組成(圖一)， 19S調節複合體會辨識多泛素鏈 (polyubiquitin)，並將之從泛素修飾蛋白上移除，其並具有ATP水解酶活性使該蛋白去摺疊後，送入20S的蛋白水解中心分解[2]。20S複合體是由兩個α環及兩個 β環所組成的桶狀結構，前者與19S共同形成通道[3]，後者具有chymotrypsinlike、trypsin-like及post-glutamyl peptide hydrolase-like (PGPH)等三個蛋白水解活性位[4]。蛋白由蛋白酶體分解後，會產生短多肽鏈，並被回收分解成單一胺基酸再用於合成其他蛋白質[5]。

圖一、26S 蛋白酶體的組成與結構[3]。 (Millennium Pharmaceuticals, Inc., Cambridge, Massachusetts.) 泛素-蛋白酶體水解系統(ubiquitin/proteasome-dependent proteolysis) 泛素-蛋白酶體水解系統是真核生物中高度保守的蛋白水解機制，此系統的目標不只在折疊錯誤、不必要或異常的蛋白質，甚至有些新合成的蛋白也需經此系統的輔助[6]。蛋白泛素修飾過程需由三種酵素負責完成。首先，是利用 ATP活化泛素蛋白使與E1泛素活化酶( ubiquitin-activating enzyme)形成thiolester 鍵結，在人類至少有兩種E1，分別是UBA1和UBA6[7]，接著E2泛素複合酶 (ubiquitin-conjugating enzyme)會和E1上結合的泛素連接，並催化將該泛素轉移 26

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到E2蛋白自己的cysteine上[8]，接著，而E3泛素接合酶(ubiquitin ligase)會辨認受質上降解訊號(degradation signal, DEG)，並將E2上已活化的泛素轉而移至標的蛋白的lysine胺基酸位點，泛素再與其它泛素分子間形成isopeptide bond而形成多泛素鏈[9]，有些例子可能需要E4泛素延長因子(ubiquitin elongation factor4)的協助以有效率地延長其多泛素鏈[10]，標的蛋白被泛素標記後會被蛋白酶體辨認，將其上泛素去除、並打開其摺疊送到水解中心降解成多肽，泛素被DUB切除後可再進入下一個泛素修飾循環再利用[9]。泛素化蛋白酶體水解系統和細胞中處理構形異常蛋白的能力有關，在許多神經退化性疾病病理成因上極為重要。細胞中蛋白水解特性之研究顯示當蛋白質N端具有特定胺基酸如arginine、 lysine…等易降解之胺基酸時即不穩定而壽命短，此稱為N端規則(N-end rule) [11]。瑞典科學家Nico P. Dantuma實驗室設計了一序列結合N端規則及泛素修飾蛋白水解系統之綠螢光GFP蛋白報導Ub-X-GFP融合蛋白表現質體(圖二)，其所表現的Ub-M-GFP融合蛋白N端胺基酸為Methionine，因此蛋白質半生期長且較穩定，而Ub-R-GFP則是因為其蛋白質N端胺基酸為Arginine，蛋白質半生期較短而不穩定，另外，UbG76V-GFP雖具有泛素融合降解訊號 (ubiquitin fusion degradation signals)，但將其泛素蛋白C端的glycine胺基酸突變成Valine，導致無法被deubiquitinating enzymes(DUB)辨識以致其N端泛素無法被切除，因此會迅速經由多泛素化修飾後，再被送至蛋白酶體路徑降解，但如在有蛋白酶體抑制劑如MG132藥劑存在下，此UbG76V-GFP融合蛋白會在細胞中累積，因此可做為蛋白酶體活性抑制藥物之報導蛋白[12, 13]。

圖二、Ub-X-GFP 報導質體的結構示意圖[12] Combretastatin A-4 與其新型烯雙炔衍生物 Combretastatin A-4 (CA-4)是由一種南非矮柳樹 Combretum caffrum 樹皮中所分離得的天然成份，在哺乳類體中具有抗血管新生與抗微管聚合等效用，主要是透過與微管結合達到抑制微管系統形成以阻止腫瘤細胞生長，而可做為抗癌 27

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藥物。因為 CA-4 的水溶性不佳，臨床上的治療效果不如預期，因此針對 CA-4 的這項缺點，找出具 CA-4 的生物活性與水溶性俱佳的 CA-4 衍生物可增進其醫療應用性[14]。目前已研發出水溶性較 CA-4 為佳之衍生物 Combretastatin A-4 phosphate (CA-4P)，且 CA-4P 不但具有克制癌細胞的細胞毒性，亦能選擇性抑制腫瘤血管新生作用，在臨床上針對甲狀腺未分化癌(anaplastic thyroid cancer, ATC)的試驗中，不論在活體腫瘤移植老鼠研究或是第一期臨床試驗皆獲致不錯的結果[15, 16]。烯雙炔類化合物具有可以使細胞週期停滯、產生自由基切斷 DNA 等生物活性與癌細胞毒殺特性[17]，國立中山大學化學系吳明忠教授，藉由模仿 CA-4 之結構，搭配烯雙炔類開發出一系列 CA-4 新型烯雙炔衍生物 [18]，其結構及活性相關位置參見圖三。實驗室學長針對此類化合物分析其生物活性，其結果指出這些化合物有些能抑制肝癌及神經母細胞瘤的微管系統之形成，阻斷細胞週期，並影響細胞自噬標幟蛋白如 LC3-II 及 p62 之表現[19]。是否這系列藥物亦具有影響細胞蛋白質降解系統之運作值得進一步加以探討。

圖三、CA-4 衍生物結構與活性相關位置[20]

(三)研究動機與實驗設計真核細胞之蛋白經泛素修飾及蛋白酶體作用之路徑之運作可調控許多生理機能，其異常狀態常導致組織及器官之退行性病變，進而衍生如癌症、神經性退化疾病。目前已經有許多抑制該系統路徑之藥物被研發出來，並被使用在骨髓癌症臨床治療上、抗發炎、抗血管新生及免疫調節等作用上。本研擬計畫將使用由 Nico P. Dantuma 實驗室所提供之 Ub-X-GFP 融合蛋白表現質體建立泛素修飾蛋白酶體活性報導細胞株，用於一系列具腫瘤細胞毒殺作用之新型 CA-4 烯雙炔衍生物之篩選。實驗首先將進行表現質體轉染及 G418 藥物篩選，以建立永久轉染之 Ub-X-GFP 融合蛋白表現報導細胞株，並將利用已知蛋白酶體抑 28

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制劑 MG132 處理各報導細胞株以確認其作用。最後，將利用這些報導細胞株做為篩選平台，進行新型 CA-4 烯雙炔衍生物之篩選 (參見實驗流程圖)。實驗流程圖

圖四、實驗流程圖

(四)研究方法及步驟 1. 建立 Ub-X-GFP 融合蛋白表現報導細胞株 a. 萃取大量 pUb-X-GFP 質體 DNA 以接種環將帶有 pUb-X-GFP 質體的菌落分別接種至含有 1717 mM kanamycin 的 200 ml LB 培養液中，置於 37℃中以 300 rpm 震盪培養隔夜 (16-18 hr)，隔日收集菌液置於 500 ml 的 SORVALL 離心管中，以 4℃、 6000 x g 離心 15 分鐘，菌體離心完後後去除上清液，加入 VP1 buffer 後將菌體沉澱物打散，再加入 10 ml VP2 buffer 緩慢倒轉 6 次混合均勻，靜置 5 分鐘後，加入 10 ml 的 VP3 buffer 緩和倒轉 6 次混合至白色沉澱生成，接著在 4℃下以 20000x g 離心 15 分鐘，並同時以 20 ml VP4 buffer 潤洗 Maxi-V500 管柱。將上清液取出加到潤洗過的管柱中，利用重力過濾，將濾液丟棄，並用 30 ml VP5 buffer 清洗管柱，將濾液丟棄。最後，以 10 ml VP6 buffer 將管柱中的 DNA 回溶，再加入濾液體積 0.75 倍的常溫異丙醇將 DNA 析出，並在 4℃下以 15000x g 離心 30 分鐘，去除上清液。再加入 29

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5 ml 70%酒精清洗 DNA 沉澱物，離心去除酒精上清液後，置室溫使 DNA 沉澱乾燥後。以 ddH2O 將沉澱質體 DNA 回溶，並以分光光度計測量 DNA 濃度後，置於冰箱中冷凍保存備用。 b. 細胞株之培養從液態氮桶中取拿出 HeLa 細胞冷凍管，置於常溫水浴使快速解凍，隨後將細胞取出加入含 10 ml MEM 細胞培養液的離心管中潤洗，以 1250 x g 低速離心去除上清液後，將細胞以 10 ml MEM 細胞培養液小心懸浮後，放到 75T 培養瓶中以 37℃、5% CO2 培養箱中培養，待長到八分滿後，進行繼代分盤，吸除原先 MEM 後，以 GKNP 潤洗細胞，將 GKNP 移除，接著加入 1 ml 0.25% Trpsin 和 4 ml 的 GKNP，待細胞漂起不再貼附瓶底後，加入 MEM 細胞培養液以終止 Trypsin 作用，並以 1250 g 離心 1 分鐘，去除上清液，再加入 5 ml 的 MEM 細胞培養液將細胞懸浮，並取一小部份細胞進行計數，最後分盤(1 x 106 的細胞/6 cm 培養盤)，在 37℃的 CO2 培養箱中培養。 c. 細胞轉染及以 G418 篩選永久轉染細胞在實驗前 3 個小時，將已經培養到細胞八分滿的細胞中的培養液更新。隨後準備 A 與 B 兩個微量離心管，在 A 管中置入 18 μl 的 2 M CaCl2 和 10 µg 的質體 DNA (分別有 pUb-M-GFP、pUb-R-GFP 及 UbG76V-GFP)，並用 ddH2O 補體積至 150 μl；而在 B 管中則加入 150 μl 的 2X HBS，並置入微量玻離吸管以打氣方式製造氣泡，同時邊用微量吸管將 A 管中已混合完全之 DNA 溶液取出，再以小量且非常緩慢速度滴入 B 管中，待 DNA 溶液完全加入完畢後，在室溫下靜置半小時後，取出緩慢滴入到已培養至八分滿的細胞中(6 cm 培養盤)，並將細胞置入培養箱中培養。次日，去除細胞培養液，用 1X PBS 潤洗細胞兩次，再加入 2 ml 10% DMSO 溶液，進行 DMSO shock 約 2.5 分鐘後，將 DMSO 溶液移除，換上新的 MEM 細胞培養液後，再放回在 37℃的 CO2 培養箱中培養，隔天在培養液中加入 G418 藥劑進行永轉細胞之篩選。以可使未轉染細胞在二週內完全死亡之 G418 劑量進行質體轉染細胞之篩選，使沒有質體轉染的細胞死亡。將剩下的表現 GFP 綠螢光之細胞群落分離分別增殖後，即可進行後續 MG132 處理，再以共軛焦螢光顯微鏡影像及西方墨點分析。 d. 以西方墨點法確認報導細胞株之成功建立永轉篩選成功的細胞株，分別以 50 μM MG132 處理 7 小時或不處理，隨後進行蛋白質萃取與西方墨點法分析，實驗預計分為 7 組，所有組別分別加入 50 μM 之 MG132 或等量之用以溶解 MG132 的 DMSO 溶液。各處理組別分述如下: 30

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第一組為空白對照組，使用未轉染之 HeLa 細胞第二組為 pUb-M-GFP 質體永轉細胞，但不加入 MG132 第三組為 pUb-M-GFP 質體永轉細胞，並以 50 μM MG132 處理 7 個小時 (第二與第三組蛋白質 N 端胺基酸為 Methionine，穩定不易被分解，設計用做對照組)第四組為 pUb-R-GFP 質體永轉細胞，但不加入 MG132 第五組為 pUb-R-GFP 質體永轉細胞，並以 50 μM MG132 處理 7 個小時第六組為 pUbG76V-GFP 質體永轉細胞，但不加入 MG132 第七組為 pUbG76V-GFP 質體永轉細胞，並經 50 μM MG132 處理 7 個小時各處理組別細胞經萃取其蛋白質後，進行 SDS-PAGE 電泳後，進行轉漬後以 GFP 抗體進行西方墨點分析，各組別蛋白之配置如下表一所示: 表一、在進行 SDS-PAGE 膠體電泳時各組別之配置組別

pUb-M-GFP

pUb-R-GFP

pUbG76VGFP

MG132

e. 永轉細胞之蛋白質萃取及定量將處理完成之細胞以 PBS 清洗兩次，加入 1 ml 含有 5 mM EDTA 的 PBS，接著用細胞刮杓小心將細胞刮至溶液中，以 3000 rpm 離心 10 分鐘，再將上清液小心去除，加入含蛋白酶抑制劑之細胞裂解液(lysis buffer)，混勻後置冰上 20 分鐘，再進行超音波震盪，將未完全破的細胞打破，並將 genomic DNA 震碎，再置於 4 ℃下，以 12,000 rpm 離心 30 分鐘，收取上清液進行蛋白質定量分析。將 25 μl 已知濃度之 BSA 蛋白質標準液，以 ddH2O 調成 0 μg/ml, 200 μg/ml, 400 μg/ml, 600 μg/ml, 800 μg/ml, 1000μg/ml 等標準濃度溶液。取 1 μl 永轉細胞蛋白萃取液，加入 24 μl 的 ddH2O 稀釋，並分別將之加到 96 孔的 ELISA 分析盤中，每個待測樣品中再加入 200 μl 的蛋白分析試劑(BCA:CuSO4 = 50:1)，置於 37 ℃下反應 20 分鐘，最後使用 ELISA reader 測定 570 nm 吸光值，並記錄計算出各樣品之濃度。 f. SDS-PAGE 電泳與蛋白質轉漬及 GFP 抗體西方墨點分析 SDS 膠體電泳 (SDS-PAGE):取適量蛋白質萃取液加入 5X sample buffer 調成 1X sample buffer，並加入 β-ME，在沸水中煮沸 5 分鐘，本實驗使用的是 15%的 running gel 和 5%的 stacking gel，並以 95 伏特之電壓進行電泳。蛋白轉漬與訊號影像紀錄: 將電泳完後的膠體與甲醇活化過的 PVDF 膜三明治置 31

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入轉漬槽中，並加入轉漬緩衝液，以電壓 100 伏特轉漬 2 小時。轉漬完成後，取出 PVDF 膜，先以 TBST 潤洗，再置於含 10% 脫脂奶粉的 TBST 溶液中進行抗原阻斷作用 30 分鐘，再以 GFP 抗體(已用含 10% 脫脂奶粉的 TBST 溶液稀釋)作用 3 小時，接著置於轉台上，以 TBST 進行清洗三次，每次 10 分鐘，再進行二級抗體之作用 1 小時，同樣再以 TBST 清洗 6 次，每次 10 分鐘。將清洗乾淨的 PVDF 膜，置於透明塑膠片上，滴上 ECL 冷光感應劑，使覆蓋所有 PVDF 面積，再以 LAS3000 影像分析儀進行訊號影像擷取。 g. 以雷射共軛焦顯微鏡影像觀察確認報導細胞株之成功建立將各永轉報導細胞培養在蓋玻片上，並以 50 μM MG132 或等量之用來溶解 MG132 的 DMSO 溶液分別處理各永轉細胞株組別 7 小時，細胞經以 4% paraformaldehyde 固定後進行封片，再用共軛焦螢光顯微鏡觀察記錄 GFP 螢光，比較 MG132 處理及未處理組別間的螢光強度差異，以評估其效用。 2. 新型 CA-4 烯雙炔藥物篩選 a. 新型 CA-4 烯雙炔衍生藥物由國立中山大學化學系吳明忠教授實驗室提供 CA-4, LO-OMe、LONH2、LO-py、CPC14c、CPC20a、CPC15a、CPC19a、HYH10a、HYH10f。 b. 以細胞存活率測試 (MTT assay)測定 CA-4 烯雙炔衍生物對 HeLa 細胞之 IC50 濃度使用 96 孔細胞培養盤，培養 HeLa 細胞至貼附後，以完全細胞培養液為稀釋溶劑，以各衍生物已知對 Hep3B 的 IC50 濃度之 1/10, 1/5, 1/1, 5 倍,10 倍劑量之不同稀釋濃度處理 HeLa 細胞後繼續培養，並分別在 12、24、36、48 小時時間收取處理細胞樣品，移除原先培養液，換上新的培養液後，加入 121 mM MTT (3- (4,5-cimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl tetrazolium bromide)，繼續在 37℃下培養 4 小時後，移除培養液與 MTT，加入 200 μl 的 DMSO 溶液，並以 570 nm 波長量測吸光值，並以只含有 DMSO 樣品作為背景值進行儀器歸零校正，並計算出各 CA-4 烯雙炔衍生物對 HeLa 細胞之 IC50 濃度值。 c. 新型 CA-4 烯雙炔衍生藥物篩選使用 96 孔細胞培養盤，分別培養各永轉 Ub-X-GFP 報導細胞至貼附後，以各 CA-4 新型烯雙炔衍生藥物對 HeLa 細胞之 IC50 濃度之 1 倍，0.1 倍， 0.01 倍濃度處理 7 小時後，最後利用微盤式偏極螢光儀 (POLARstar OPTIMA) 以 480 nm 激發光波長，並記錄在 510 nm 吸收波長之吸光值，比較未經藥物處理與經 CA-4 烯雙炔衍生藥物處理組別之吸光值以評估其效用。經篩選 32

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到可能具有有效抑制蛋白酶體的活性之 CA-4 烯雙炔衍生藥物，再以前述之雷射共軛焦顯微鏡影像觀察與西方墨點法進一步加以確認。

(五)預期結果報導細胞株是否建立成功之確認細胞經質體轉染與 G418 藥物篩選後，以 MG132 處理或不處理，將以下列方式確認報導細胞株是否建立成功: 在螢光顯微鏡的觀察中對照組 Ub-M-GFP 融合蛋白表現報導細胞應可以觀察到綠色螢光，因其不含 N 端降解訊號而不會被分解，而其 N 端泛素會被 DUB 切除，因此在西方墨點分析中可檢測得 26 kd X-GFP 蛋白；而 Ub-R-GFP 與 UbG76V-GFP 融合蛋白表現報導細胞在 MG132 處理後能觀察到綠色螢光增強，不經 MG132 處理的兩種細胞因為融合蛋白被蛋白酶體分解，皆只能觀察到微弱綠色螢光或觀察不到綠色螢光，而前者泛素會被 DUB 辨識切除，後者則因為其泛素蛋白 C 端的 glycine 胺基酸突變成 Valine 而不會被切除，因此在西方墨點分析在前者僅檢測到 X-GFP，後者則可檢測到完整的到全長蛋白 UbG76VX-GFP。新型烯雙炔藥物篩選之判讀在新型烯雙炔藥物篩選實驗中，將以螢光儀篩選候選化合物，預期有效藥物將在 GFP 螢光吸收波長(510 nm)之吸光值在藥物處理組有顯著提升，本實驗初步將設定吸光值提升 3 倍以上藥物為候選藥物有進行進一步西方墨點分析確認之必要。並在確認後進一步與已知 MG132 或 Z-L3-VS 等抑制劑進行藥物有效濃渡比較之評估。本研究計畫預計進度請參見表二所列: 表二、實驗進度甘梯圖月份工作項目

7月

8月

9月

10 月

11 月

12 月

1月

2月

細胞解凍與培養細胞繼代操作建立報導細胞株螢光顯微鏡觀察西方墨點法分析藥物細胞存活率測試螢光儀藥物篩選數據檔案整理 33

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成果報告撰寫預計完成進度百分比

100

(六)目前進度永久轉染細胞株報導能力確認將實驗室已經分別轉染 Ub-M-GFP 或 UbG76V-GFP 質體並且篩選後的 HeLa 細胞解凍，培養數代至細胞貼附在培養盤八分滿後，以 50 μM MG132 分別處理或不處理 7 個小時，再以螢光顯微鏡以藍光激發 GFP 螢光觀察其表現情形。觀察具有 Ub-M-GFP 質體的 HeLa 細胞，加入 MG132 處理後的組別能在螢光顯微鏡下清楚看到綠色螢光，然而未處理的組別因為不具 N 端降解訊號仍然能夠觀察到綠色螢光；而觀察具有 UbG76V-GFP 質體的 HeLa 細胞，在使用 MG132 處理後阻止蛋白酶體作用，因此同樣能夠在顯微鏡視野下看到綠色螢光，但未處理的組別則如預期無法觀察到綠色螢光(表三)，因此判斷永久轉染細胞可能具有報導能力，並目前正在以此兩株永久轉染細胞，在 96 孔細胞培養盤中進行單一細胞培養(single cell cloning)，並期望以此方式篩選建立出三種不同 GFP 表現強度之細胞株，以便於使用在藥物篩選階段。表三、HeLa 永久轉染細胞加入蛋白酶體抑制劑 MG132 處理 7 小時後在螢光顯微鏡下觀察之結果

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細胞轉染與永久轉染細胞之篩選在進行轉染前一天繼代並且回種 2.5×106 個 HeLa 細胞，使其在第二天會長到八分滿，並在進行轉染前 3 小時更換培養液，最後使用氯化鈣沉澱法轉染。轉染完成後的隔天，置於螢光顯微鏡下觀察確認轉染結果。在轉染 GFP 質體的細胞為對照組，在螢光顯微鏡下可觀察到明顯的 GFP 綠螢光；而轉染 Ub-MGFP 與 Ub-R-GFP 質體的細胞在螢光顯微鏡的視野下的螢光亮度與對照組差異不大 (表四)，判斷轉染完成，並且目前以 G418 藥物進行轉染成功細胞篩選，預計完成後開始在螢光顯微鏡下標記與進行永久轉染細胞之篩選。表四、HeLa 暫時轉染細胞 24 小時後在螢光顯微鏡下觀察之結果

(七) 執行上的困難與解決之道本計劃所使用的實驗技術中，我先前在實驗室已經學會的有西方墨點法、細胞解凍培養、細胞繼代與質體 DNA 萃取，而在永轉細胞的挑選、細胞存活率測試、雷射共軛焦顯微鏡與微盤式偏極螢光儀的使用，則需要老師的指導；在實驗結果的分析上，需要老師指導分析數據的方向與恰當性；而目前遇到 HeLa 細胞在繼代等實驗中使用胰蛋白酶(Trypsin)將細胞從培養盤上切下時，較其他細胞困難，但這項問題在使用較多胰蛋白酶與拉長作用時間後獲得改善， 35

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另一項問題則是判斷細胞是否遭受汙染，最後在資料查詢與老師教導下解答。

(八)參考文獻 1. Kisselev AF, Goldberg AL. 2001. Proteasome inhibitors: from research tools to drug candidates. Chem Biol 8, 739–758. 2. Zwickl P, Voges D, Baumeister W. The proteasome: a macromolecular assembly designed for controlled proteolysis. 1999. Philos Trans R Soc Lond B: Biol 354, 1501–1511. 3. Julian Adams, The proteasome: structure, function, and role in the cell. 2003. CANCER TREATMENT REVIEWS 29, 3–9. 4. Groll M, Koguchi Y, Huber R, Kohno J. Crystal structure of the 20S Proteasome: TMC-95A complex: a non-covalent proteasome inhibitor. 2001. J Mol Biol 311, 543– 548. 5. Nussbaum AK, Dick TP, Keilholz W, et al. Cleavage motifs of the yeast 20S proteasome b subunits deduced from digests of Enolase 1. 1998. Proc Natl Acad Sci USA 95, 12504–12509. 6. Reits, E.A., Vos, J.C., Gromme, M., Neefjes, J., 2000. The major substrates for TAP in vivo are derived from newly synthesised proteins. Nature (London) 404, 774– 778. 7. Groettrup M, Pelzer C, Schmidtke G, Hofmann K, 2008. Activating the ubiquitin family: UBA6 challenges the field. Trends Biochem. Sci. 33, 230–237. 8. van Wijk SJ, Timmers HT, 2010. The family of ubiquitin-conjugating enzymes (E2s): deciding between life and death of proteins. FASEB J. 24, 981–993. 9. Kristina Lindsten, Nico P. Dantuma, 2003. Monitoring the ubiquitin/proteasome system in conformational diseases. Ageing Research Reviews 2, 433–449.

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10. Imai, Y., Soda, M., Hatakeyama, S., Akagi, T., Hashikawa, T., Nakayama, K.I., Takahashi, R., 2002. CHIP isassociated with Parkin, a gene responsible for familial Parkinson’s disease, and enhances its ubiquitin ligase activity. Mol. Cell 10, 55–67. 11. Bachmair, A., Finley, D., Varshavsky, A., 1986. In vivo half-life of a protein is a function of its amino-terminal residue. Science 234, 179–186. 12. Nico P. Dantuma, Kristina Lindsten, Rickard Glas, Marianne Jellne, and Maria G. Masucci, 2000. Short-lived green fluorescent proteins for quantifying ubiquitin/proteasomedependent proteolysis in living cells. Nature (America) 18, 538543 13. 陳昭惠，TSG101蛋白質磷酸化之分析及蛋白質泛素化作用報導細胞株之建立，2006。國立中山大學生物科學系。 14. Tron GC, Pirali T, Sorba G, Pagliai F, Busacca S, Genazzani AA. 2006. Medicinal chemistry of combretastatin A4: present and future directions. J Med Chem 49, 30333044. 15. Nagaiah G, Remick SC. 2010. Combretastatin A4 phosphate: a novel vascular disrupting agent. Future Oncol 6, 1219-1228. 16. Dowlati, Robertson K, Cooney M, et al. 2002. A Phase I Pharmacokinetic and Translational Study of the Novel Vascular Targeting Agent Combretastatin A-4 Phosphate on a Single-Dose Intravenous Schedule in Patients with Advanced Cancer. Cancer Res 62, 3408-3416. 17. K C Nicolaou, A L Smith, and E W Yue. 1993. Chemistry and biology of natural and designed enediynes. Proc Natl Acad Sci U S A. 90, 5881–5888. 18. Yu-Hsiang Lo, Ying-Ting Lin, Yu-Peng Liu, Tsai-Hui Duh, Pei-Jung Lu, MingJung Wu. 2013. Design, synthesis, biological evaluation and molecular modeling studies of 1-aryl-6-(3,4,5-trimethoxyphenyl)-3(Z)-hexen-1,5-diynes as a new class of potent antitumor agents. Eur J Med Chemistry 62, 526-533 19. 鍾秀昌，能誘發神經母細胞瘤SHSY5Y細胞自噬之抗有絲分裂藥物 Combretastatin A-4衍生物之篩選，2013。國立中山大學生物科學系。

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20. Qiang Zhang, Youyi Peng, Xin I. Wang, Susan M. Keenan, Sonia Arora, and William J. Welsh. 2007. Highly Potent Triazole-Based Tubulin Polymerization Inhibitors. J. Med. Chem. 50, 749–754.

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TSG101 蛋白對 UbG76V-GFP 報導蛋白分解之影響 The effect of TSG101 on UbG76V-GFP reporter protein degradation

學生：潘桂香指導老師：陳錦翠教授學號：B002010006

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一、摘要腫瘤易感基因 101(TSG101)其生理功能含括廣泛，參與囊泡運輸及調控細胞生長週期及分化。TSG101 表現過多或過少皆會導致細胞死亡或癌化。在文獻中提到腫瘤易感基因 101(TSG101)的蛋白結構中 UEV domain 與泛素連接酵素 (Ubiquitin-conjugated enzyme，E2)極為相似，但缺乏其酵素活性之胺基酸 Cysteine。推測 TSG101 為不活化型之 E2 蛋白質，可能在蛋白質泛素化作用中扮演調控之角色。蛋白質泛素化修飾介導細胞蛋白質的降解與回收，對於細胞中蛋白質含量扮演重要調控之角色。蛋白質泛素化修飾缺失會導致細胞生理功能缺失，導致如癌症或神經退化性疾病。本研究擬探討 TSG101 與蛋白質泛素化作用間的關係，釐清 TSG101 對細胞中蛋白質降解與回收的關係。實驗中將以實驗室學姊所建立的 pUbG76V-GFP 質體永久轉染細胞株，該細胞中表現之突變型 UbG76V-GFP 融合蛋白可反應細胞內蛋白酶體(Proteasome)活性，因此可作為活性報導細胞株。而本計畫中，將在此報導細胞中過度表現 TSG101，或以 siRNA 抑制 TSG101 表現方式評估 TSG101 對細胞中蛋白酶體活性報導 UbG76VGFP 融合蛋白之影響，以釐清 TSG101 蛋白之角色。關鍵詞: 腫瘤易感基因 101(TSG101)、UbG76V-GFP、蛋白酶體(proteasome)、蛋白質泛素化、細胞生長週期(cell cycle)

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二、文獻回顧與探討 1. TSG101 相關背景腫瘤易感基因 101(TSG101)於 1996 年 Stanley Cohen 實驗室中發現，以 antisense RNA 技術抑制小鼠 NIH3T3 纖維母細胞 Tsg101 會導致細胞轉形 (transformation)。將此細胞注射到裸鼠體內，會造成轉移性腫瘤；反之，回復 Tsg101 表現則會逆轉腫瘤的生成，顯示 Tsg101 具有抑制腫瘤的特性。有研究顯示 Tsg101 過度表現亦會促進細胞癌化[1]。利用基因剔除技術剔除 Tsg101 會導致細胞生長週期延滯及細胞死亡，但並不會促進細胞增殖及轉型[2]。後續有很多文獻顯示 TSG101 於調控細胞生長週期中扮演重要角色。人類的 TSG101 蛋白由 390 個胺基酸組成，分子量約為 46 kDa，和小鼠 tsg101 胺基酸序列比對有 94%相似度[3]。TSG101 蛋白可分為四個功能區，分別是由 N 端至 C 端分別為：ubiquitin E2 variant （UEV）、Proline rich domain （PRD）、Coiled-coil domain（CC）及 Steadiness box （SB）（如圖一） [4、5]。UEV 功能區與泛素連接酵素(Ubiquitin-conjugated enzyme，E2)極為相似，但缺乏酵素活性必要的胺基酸半胱氨酸 cysteine，推測 TSG101 為不活化型 E2 蛋白[6]；Coiled-coil 功能區在先前研究指出此功能區會與內含體運輸中 MVB12 有交互作用[7]。推測在內含體運輸中 TSG101 扮演一定重要的角色。

圖一、TSG101 蛋白質結構功能區是示意圖縮寫：UEV，ubiquitin E2 variant；PRD，Proline-rich domain；CC，coiled-coil domain；SB，steadiness box。參考文獻[5]所繪製。 2. 蛋白酶體(proteasome)結構及功能真核細胞都會在細胞核及細胞質表現蛋白酶體(proteasome)。蛋白酶體之生物功能主要為降解錯誤折疊的蛋白質及平衡細胞中的蛋白質含量，對於細胞生長週期及細胞存活甚重要[8]。26S 蛋白酶體(26S proteasome)由一個 20S 核心蛋白及二個 19S 次單元蛋白組成(如圖二)，19S 次單元蛋白主司調控的角色； 20S 核心蛋白司酵素活性部位。19S 次單元蛋白可以從受質上切除多泛素鏈 (polyubiquitin)，使蛋白質經 20S 核心蛋白及 19S 次單元蛋白構成的小孔道進入 20S 核心蛋白降解[8]。

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圖二、26S 蛋白酶體的組成與結構[9]。 3. 泛素-蛋白酶體水解系統(ubiquitin/proteasome-dependent proteolysis) 泛素-蛋白酶體水解系統是從酵母菌到哺乳類動物高度保留的水解系統，負責水解錯誤摺疊或多餘的蛋白質。在免疫反應中，抗原需要經過處理才能被輔助型 T 細胞辨識，引發後續的免疫反應，其處理過程中需利用泛素標記蛋白質，將其送入蛋白酶體中分解成小胜肽，以利細胞之 MHC 辨識誘導免疫反應 [10]。泛素-蛋白酶體水解系統有四個主要的蛋白質參與，分別為 E1 泛素活化酶 ( ubiquitin-activating enzyme)、E2 泛素複合酶(ubiquitin-conjugating enzyme)、E3 泛素接合酶(ubiquitin ligase)及 E4 泛素延長因子(ubiquitin elongation factor4)。泛素化修飾可分為兩種蛋白質，一為泛素(ubiquitin)另一為與泛素相似的蛋白質 (UBL, ubiquitin-like protein)，此兩種蛋白質具有高度保留性，對於調控蛋白質分解及分子功能很重要[11]。在泛素與目標蛋白連接前，首先，利用 ATP 活化泛素蛋白(ubiquitin)與 E1 泛素活化酶( ubiquitin-activating enzyme) 形成 thiolester 鍵結，E1 蛋白會將泛素蛋白(ubiquitin)轉移到 E2 蛋白上的半胱氨酸 cysteine；E2 泛素複合酶(ubiquitin-conjugating enzyme)會辨認特定的受質，將其半胱氨酸 cysteine 的泛素蛋白轉移到受質的離胺酸 lysine 上，最後把含有泛素標記的蛋白送到蛋白酶體分解。有些蛋白質會利用 E4 泛素延長因子(ubiquitin elongation factor4)延長受質的泛素蛋白形成多泛素鏈[12]。(反應機制參考圖二)

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圖二、泛素-蛋白酶體水解系統(ubiquitin/proteasome-dependent proteolysis)示意圖[12] 利用瑞典科學家 Nico P. Dantuma 實驗室所設計的 UbG76V-GFP 質體建立蛋白酶體報導細胞株[13]。Deubiquitinating enzymes(DUB)會辨識泛素蛋白 (ubiquitin)，將欲送入蛋白酶體或需回收的蛋白上的泛素蛋白(ubiquitin)切除。 UbG76V-GFP 因泛素蛋白 C 端的甘氨酸 glycine 突變成纈氨酸 Valine，導致無法被 deubiquitinating enzymes(DUB)辨識以致其 N 端泛素無法被切除，因此被送至蛋白酶體路徑降解。實驗過程中添加已知蛋白酶體抑制劑 MG132 藥劑，可抑制蛋白酶體的活性，因此 UbG76V-GFP 融合蛋白不會被降解，在細胞中累積，可作為報導細胞株[14]。

圖三、Ub-X-GFP 報導質體的結構示意圖[13]

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三、研究動機及實驗設計腫瘤易感基因 101(TSG101)參與細胞許多生理功能，含括囊泡運輸及細胞週期的調控等，對於細胞的生長分化扮演一定的角色。TSG101 蛋白在細胞中的含量需恆定，表現過多或過少對細胞生長發育皆有不良影響。細胞生長週期 G1 到 S 期及細胞分裂時都需要蛋白酶體的活化代謝不必要之蛋白質，由此可推測蛋白酶體活化機制對於真核細胞的發育有密切關係。蛋白酶體作用機制為辨識受質蛋白上的多泛素鏈後，才送進蛋白酶體分解。受質蛋白之多泛素鏈形成與 E1、E2 及 E3 蛋白所調控之蛋白泛素化有關。在先前研究顯示 TSG101 蛋白缺失會使細胞週期停滯在 G1 期；亦有研究顯示 TSG101 為一不活化型之 E2 蛋白，推測其可能參與蛋白質泛素化作用之調控。TSG101 蛋白參與調控機制尚不明瞭，希望本實驗可以更進一步提供 TSG101 蛋白對於細胞週期調控關係。細胞中很多蛋白質都會經由蛋白泛素化後送到蛋白酶體(proteasome)降解，我們以突變型 UbG76V-GFP 融合蛋白模擬細胞中蛋白酶體(proteasome)的受質，作為蛋白酶體(proteasome)活性的報導蛋白。我們假設 TSG101 蛋白會利用其 N 端之 UEV 功能區與 UbG76V-GFP 上的 Ub 作結合，使 Ub 被遮蔽而無法形成多泛素鏈以至於無法被蛋白酶體辨識，融合蛋白因此不會被降解，堆積於細胞中。實驗中擬以 UbG76V-GFP 融合蛋白表現之蛋白酶體活性報導細胞株印證上述假說。實驗將以 siRNA 抑制細胞中內源性 TSG101 之表現或以外送 HA- TSG101 表現質體方式，使細胞過度表現 TSG101 蛋白。藉由共軛焦顯微鏡及綠螢光光度計評估細胞中螢光含量，並以 GFP 抗體進行西方墨點法，分析 UbG76V-GFP 融合蛋白之含量以評估 TSG101 在蛋白酶體受質蛋白分解作用之影響。實驗設計參考圖四。

圖四、實驗流程設計圖 45

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四、研究方法與步驟 I. UbG76V-GFP 細胞株培養及繼代材料: MEM 培養液: MEM Medium(Invitrogen, USA)，10 %Fetal bovine serum(FBS), 2 mM L-glutamin(Sigma, USA),100μg/ml penicillin G potassium salt(Sigma, USA)，100μg/ml streptomycin sulfate salt(Sigma, USA), 1 mM sodium pyruvate(Hyclone, USA)，0.1 mM non-essential amino acids(Hyclone, USA)。 0.25 % Trypsin/EDTA: 0.25 % trypsin and 1 mM EDTA in 1X GKNP，在無菌操作下使用 0.22 μm filter 過濾，保存於 4℃。 10 X GKNP: 8 % NaCl，0.4 % KCl，0.058 % Na2HPO4，0.06 % KH2PO4，0.01 % Phenol red，1 % glucose，pH 7.4。實驗使用藥物之濃度: G-418

200 μg/ml

MG132

50 μM

方法: 首先將細胞培養液去除，加入 1x 的 GKNP 清洗細胞，去除 GKNP 後再加入 0.25 %的 Trypsin/EDTA 於培養相作用五分鐘使細胞從容器中脫落。加入與 Trypsin 等量的培養液終止反應，將液體移至 15 ml 離心管中，使用離心機(1200 rpm)離心一分鐘，去除上清液並加入 2 c.c.培養液於離心管中。取出適當的量至容器中進行培養，並在容器中加入 G418 抗生素(濃度為 200 μg/ml)。 II. siRNA 之轉染材料: TSG101-202206 RNAi: 5’-UGAGAAGGGUACUGAGAACUG-3’(由 Dharmacon 合成) siRNA-control (Dharmacon) HiPerFect transfection reagent (Qiagen,Germany) 方法: 取適量的細胞分至培養盤中(含 5 ml 細胞培養液)，培養過夜。次日，取 1 ml 不含血清之培養液加入 0.75 μg siRNA 混合均勻，再加入 30 μl HiPerFect 轉染試劑混合後靜置 10 分鐘，接著以一滴一滴方式滴入細胞培養盤中，培養過夜。第三天將細胞分為兩盤，再進行一次 siRNA 轉染，並放置於培養箱培養 24 小時，即可取出進行分析。 III. 真核細胞轉染(transfection) 46

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材料: 2 M CaCl2，plasmid，ddH2O，2 X HBS 實驗所使用的質體: pCMV-HA-TSG101 方法: 將1.3 × 106 的 pUbG76V-GFP 永轉細胞接種到 6 cm 培養皿中培養。隔夜，在轉染實驗操作前三個小時將培養液去除，加入 5 ml 新鮮的細胞培養液，放回培養箱培養。進行轉染時在微量離心管加入 18 μl 2 M CaCl2，5μl DNA 質體，再使用 ddH2O 把體積補至 150μl。同時在圓形試管(Falcon tube)中加入 150 μl 2 X HBS。以安裝玻璃滴管電動吸管輔助器在圓形試管(Falcon tube) 液體中製造氣泡，同時緩慢滴入 CaCl2 與 DNA 質體之混合液，滴完後靜置 15 分鐘再加至培養的細胞盤中，置於培養箱培養 24 小時，收集細胞進行後續實驗。 IV. 西方墨點法分析(Western blotting Analysis) i.

ii.

iii.

蛋白質萃取將細胞以適當的量 PBS 潤洗三次，加入 1 c.c. 含有 PMSF 的 PBS，以細胞刮杓收取細胞，將細胞置於微量離心管中，使用桌上型冷凍離心機，在 4 ℃下，以 1000 rpm 離心 5 分鐘。去除上清液，加入適當含有 PMSF、Proteinase Inhibitor, Phosphorylase Inhibitor, NEM, IAA 抑制劑的 SDS lysis buffer，將細胞打散後，冰上靜置 20 分鐘，接著以超音波將細胞完全震碎。最後，以 12,000 rpm 轉速離心 30 分鐘，收集上清液並進行蛋白質定量。蛋白質定量將 25 μl 已知濃度之 BSA 蛋白質標準液用 ddH2O 調成 0 μg/ml, 200 μg/ml, 400 μg/ml, 600 μg/ml, 800 μg/ml, 1000μg/ml，而目標蛋白萃取液則取 1 μl，再加入 24 μl 的 ddH2O 稀釋，分別將標準及目標蛋白萃取液分別置於 96 孔盤中，每個待測定樣品中再分別加入 200 μl 的蛋白濃度分析試劑(BCA:CuSO4=50:1)，置於 37 ℃培養箱中反應 20 分鐘，最後以 ELISA 判讀儀測定 570 nm 吸光值，並記錄及計算各樣品的濃度。 SDS-PAGE 電泳與蛋白質轉漬及 GFP 抗體西方墨點分析: 已知濃度蛋白萃取液取適量加入 5X sample buffer 使稀釋成 1 X sample buffer，並加入適量的β-ME，在沸水中煮沸 5 分鐘。實驗使用的是 8 %的蛋白分離膠體和 5 %的蛋白聚集膠體，並以 100 伏特之電壓進行電泳，待樣品染劑移到膠體底部時，取出膠體，接著進行蛋白轉漬 (Transfer)。先將 PVDF 膜以甲醇活化，接著與電泳完的膠體一起夾 47

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入三明治中，將其間氣泡完全趕出後放置於轉漬槽中，並加入轉漬液，以電壓 100 伏特轉漬 45 分鐘。轉漬完成後取出 PVDF 膜，先以 TBS-T 潤洗，再使用 10% 阻斷液(non-fat milk in TBST)進行抗原阻斷作用約 30 分鐘，之後加入以 5% non-fat milk in TBST 稀釋之一級抗體，放置於 4℃ 作用隔夜。一級抗體結合完畢後，將轉漬膜以 TBS-T 容液浸洗，置於震盪器上作用，每 10 分鐘換 1 次 TBS-T 容液，清洗共 6~9 次。接下來用 5% non-fat milk in TBS-T 稀釋二級抗體與轉漬膜作用 1 小時，最後同樣以 TBS-T 清洗 3~6 次，每次 10 分鐘。最後，進行訊號影像紀錄，將 PVDF 膜置於透明塑膠片上，使用 ECL 冷光感應劑滴在轉漬膜上，並使其完全覆蓋所有面積，再置於 LAS 3000 影像分析儀中進行訊號偵測與影像擷取。

五、預期結果如果符合假設情況，細胞中 UbG76V-GFP 蛋白在 tsg101 knock down 中， TSG101 無法遮蔽 UbG76V-GFP 上的 Ub，此蛋白質會經由蛋白酶體降解，因此利用顯微鏡不會觀察到綠色螢光且使用 GFP 抗體西方墨點分析亦不會偵測到 UbG76V-GFP 融合蛋白。反之，過度表現 TSG101 會使 UbG76V-GFP 蛋白上的 Ub 被遮蔽，蛋白酶體無法辨識此蛋白質，我們可以觀察到綠色螢光和利用西方墨點法分析偵測到此蛋白質。

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六、目前進度目前完成實驗第一階段的確認 UbG76V-GFP 細胞株，以濃度 50 μM 蛋白酶體抑制劑 MG132 處理 UbG76V-GFP 細胞株 7.5 小時，蛋白酶體抑制劑會抑制蛋白酶體之活性，使蛋白酶體無法辨認多泛素鏈，導致 UbG76V-GFP 融合蛋白不會被分解，在細胞中堆積。使用 SDS lysis buffer 萃取 UbG76V-GFP 融合蛋白，並取融合蛋白萃取液以 GFP 抗體進行西方墨點法分析。在轉漬膜上以 MG132 處理的細胞萃取液可偵測到 UbG76V-GFP 蛋白，此蛋白約為 35.5 kDa。結果表示此 UbG76V-GFP 細胞株可以穩定表現 UbG76V-GFP 融合蛋白。測試結果如圖五。圖五、確認 UbG76V-GFP 細胞株

IB: GFP

以濃度 50 μM 蛋白酶體抑制劑 MG132 處理 UbG76V-GFP 細胞株 7.5 小時，並收取細胞以 SDS lysis buffer 萃取蛋白質。每一個 well loading 100 μg 的蛋白萃取液進行 SDS-PAGE 電泳。在以 MG132 處理的細胞樣品中可偵測到 35.5 kDa 的 band 為 UbG76VGFP。

UbG76V-GFP

七、執行上的困難與解決之道先前已在實驗室學習相關技術，操作及設計實驗過程需要更加嚴謹。實驗設計及實驗結果分析之恰當性、報告撰寫的邏輯性需要請老師提供更加一步意見，協助引導思考。此外，也會藉由閱讀文獻資料及多選修系上相關課程增加自己的知識。

八、參考文獻 1.

Li, L. and Cohen, S.N., tsg101: A Novel Tumor Susceptibility Gene Isolated by Controlled Homozygous Functional Knockout of Allelic Loci in Mammalian Cells. Cell, 1996. 85(3): p. 319-329. Krempler, A., Henry, M.D., Triplett, A.A., and Wagner, K.U., Targeted deletion 49

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of the Tsg101 gene results in cell cycle arrest at G1/S and p53-independent 3.

8. 9.

10.

11. 12.

13.

14.

cell death. J. Biol. Chem., 2002. 277(45): p. 43216-23. Li, L., Li, X., Francke, U., and Cohen, S.N., The TSG101 Tumor Susceptibility Gene Is Located in Chromosome 11 Band p15 and Is Mutated in Human Breast Cancer. Cell, 1997. 88(1): p. 143-154. Pornillos, O., Alam, S.L., Rich, R.L., Myszka, D.G., Davis, D.R., and Sundquist, W.I.Structure and functional interactions of the Tsg101 UEV domain. EMBO J., 2002.21(10): p. 2397-2406. Feng, G.H., Lih, C.-J., and Cohen, S.N., TSG101 Protein Steady-State Level Is Regulated Posttranslationally by an Evolutionarily Conserved COOH-Terminal Sequence. Cancer Res., 2000. 60(6): p. 1736-1741. VerPlank, L., Bouamr, F., LaGrassa, T.J., Agresta, B., Kikonyogo, A., Leis, J., and Carter, C.A., Tsg101, a homologue of ubiquitin-conjugating (E2) enzymes, binds the L domain in HIV type 1 Pr55Gag. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2001. 98(14): p. 7724-7729. Babst, M., Odorizzi, G., Estepa, E.J., and Emr, S.D., Mammalian Tumor Susceptibility Gene 101 (TSG101) and the Yeast Homologue, Vps23p, Both Function in Late Endosomal Trafficking. Traffic, 2000. 1(3): p. 248-258. Julian Adams, The proteasome: structure, function, and role in the cell. 2003. CANCER TREATMENT REVIEWS 29, 3–9. Zwickl P, Voges D, Baumeister W. The proteasome: a macromolecular assembly designed for controlled proteolysis. 1999. Philos Trans R Soc Lond B: Biol 354, 1501–1511. Reits, E.A., Vos, J.C., Gromme, M., Neefjes, J., 2000. The major substrates for TAP in vivo are derived from newly synthesised proteins. Nature (London) 404, 774–778. van Wijk SJ, Timmers HT, 2010. The family of ubiquitin-conjugating enzymes (E2s): deciding between life and death of proteins. FASEB J. 24, 981–993. Kristina Lindsten, Nico P. Dantuma, 2003. Monitoring the ubiquitin/proteasome system in conformational diseases. Ageing Research Reviews 2, 433–449. Nico P. Dantuma, Kristina Lindsten, Rickard Glas, Marianne Jellne, and Maria G. Masucci, 2000. Short-lived green fluorescent proteins for quantifying ubiquitin/proteasomedependent proteolysis in living cells. Nature (America) 18, 538-543. 陳昭惠，TSG101 蛋白質磷酸化之分析及蛋白質泛素化作用報導細胞株之建立，2006。國立中山大學生物科學系。

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天然物 Euphol 選擇性促進人類胃癌細胞死亡之機轉探討：胃癌細胞中脂筏與膽固醇的角色 Study on the Mechanism of Natural Compound, Euphol, Selectively Induces Human Gastric Cancer Death: The Role of Lipid Raft and Cholesterol in Gastric Cancer Cell

學生：張樂翔指導老師：陳俊霖教授學號：B002010009

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一、摘要 (Abstract) 目前對於癌症的用藥趨勢逐漸傾向減少化學藥物的用量，以及使用具有專一或選擇性強的藥物，藉以降低對人的副作用，而由天然物質萃取且能達到專一性療效的藥物更是令一個嶄新的追求目標。近幾年於國立中山大學與高雄醫學大學合作研究計劃中的主要研究目標，就是從某一種大戟科的植物中萃取的天然物”euphol”來促使胃癌細胞走向細胞凋亡 (apoptosis)。而研究的對象是從人類胃黏膜組織分離出來，且具有幹細胞特質的細胞株，之後發現其部分產生自發性轉型，而命名為 CSN 細胞，再經數代 (cpdl=132)培養後，發現其第十二對染色體有變異的現象，而將其命名為 CS12。在裸鼠的實驗中發現此轉型後的胃幹細胞株可讓裸鼠產生腫瘤組織。從化學結構來看，天然物”euphol”與膽固醇極為相似，膽固醇又是細胞膜組成成份中重要的物質之一，在細胞膜上的脂筏 (Lipid raft)中，膽固醇會與 caveolin 相結合、聚集，此微域和 G 蛋白結合接受器 (G protein coupled receptor; GPCR)、TGF-接受器 (TGF-receptor)、PI3K 與 PKA (cAMP-dependent protein kinase)、PKC (Protein kinase C)與 ERK1/2 (extracellular signal-regulated protein kinase 1/2)等訊息傳遞路徑以及細胞凋亡有關。其中，caveolin-1 的表現量在近幾年的研究中被視為偵測癌症惡化的指標。這次的研究假設天然物”euphol”可以促使癌細胞凋亡的原因是透過取代其細胞膜上的膽固醇，進而使脂筏 (Lipid rafts)的組成發生改變，最後讓細胞下游的訊息傳遞路徑產生問題而走向凋亡。

二、動機 (Motivation) 在細胞膜雙層磷脂質中，有些特定的區域是由神經鞘脂類(sphingolipid)與蛋白質所組成的微域(microdomain)，此組成排列使微域的結構更加穩固，微域可分為 lipid raft 和 caveolae 兩種，差別在於 caveolae 在細胞膜上呈現凹陷的形狀，而 lipid raft 則為平面，兩者相似之處在於均含有接受器蛋白(receptors)、通道蛋白(channels)、離子幫浦(ion pumps)、活化子(transducers) 等等具有特殊功能的蛋白質，能引發下游的訊息傳遞路徑影響細胞生理，另一個特點在於，微域富含膽固醇與 caveolin 蛋白，以相結合的形式維持著微域的結構。在微域中的其中一類蛋白質接受器 TGF-接受器調控著細胞有關生長、死亡、分化等等生理機能，而在癌症的發展過程中，關於 TGF-beta receptor 的訊息傳遞路徑亦具有相當大的關連，但並非絕對會使癌細胞生長或是絕對使癌細胞走向凋亡，而是在癌症的前期和後期具有完全不一樣的影響力；在癌症發展的前期，TGF-因為有誘導細胞週期停滯以及促進細胞凋亡的能力，而扮演著抑癌因子的角色，但是到了癌症後期，因為 TGF-會使血管增生，並且能經過訊息傳遞路徑使細胞製造與附著能力相關的蛋白質或是細胞外間質，而使癌細胞得以獲得轉移或入侵的能力，在此則扮演使癌症惡化的元兇之一。因為罹患胃癌而死亡的病例在全世界居高不下，而在臺灣亦佔居所有癌症 53

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類型的排名第四，但現今對於胃癌的治療方法依舊是相當令人困擾，使用的化學藥物不僅沒法相當專一的治療，其所造成的副作用更是影響病友的生活品質甚大，故本次研究目標是放在天然物對胃癌的療效，亦或是可望降低化學藥物的使用量，而在指導教授對胃癌細胞的研究中指出，從 Euphorbia tirucalli 這種大戟科的植物中萃取出的天然物”euphol”，對胃癌細胞的毒殺能力是相當明顯的，而微域中因為含有上述提及的蛋白質接受器，跟細胞的生長、死亡等生理現象有很大的關聯，微域中有著富含膽固醇的特點，且癌細胞對於膽固醇有相當大的依賴程度，再加上 euphol 的化學結構與膽固醇十分相近這點，推論 euphol 可能是以取代胃癌細胞上的膽固醇的方式來使癌細胞的生理沒法正常運作，最終導致死亡。Euphol 會使 TGF-beta receptor 聚集到微域的 lipid raft 中，由此可說明 euphol 對 TGF‐/SMAD signaling pathway 是有活化的作用，但僅因這個點還不足以說明胃癌細胞的凋亡現象，以 euphol 加藥處理後的胃癌細胞，其對於 ERK signaling pathway 在正常細胞與癌細胞所造成不同程度的活化，才是 euphol 透過 TGF-beta receptor 並且影響 ERK signaling pathway 使胃癌細胞走向凋亡更佳的佐證。具有毒殺癌細胞的天然物”euphol”被發現與抗發炎及抑制老鼠皮膚腫瘤的效果(Yasukawa et al. 2000)，再加上 euphol 的結構與膽固醇相似，又膽固醇在細胞膜上能與 caveolin 結合形成微域，進而調控下游的生理機制，故推測 euphol 可能是以取代癌細胞細胞膜上膽固醇的方式，來影響訊息傳遞路徑。我們會先從分離細胞膜下手做相關的研究，用以下的幾個問題推論或反證 euphol 確實有辦法利用改變細胞膜上微域的組成，進而影響癌細胞的生理，最終使癌細胞走向細胞凋亡(apoptosis)。三、議題背景 (Research background) Lipid rafts 是位於細胞膜富含膽固醇和神經鞘脂質(sphingolipid)的地方，在 Lipid rafts 上面有一些與細胞生長、死亡、分化等生理現象相關的蛋白質，包含 GPCR、TGF-receptor 等，並可調節細胞內的訊息傳遞路徑及磷酸化級聯效應 (phosphorylation cascade) 。微域上有許多接受器蛋白，其中影響細胞生長、死亡與分化的 TGF-beta receptor 也是本次研究的重點之一。TGF-beta receptor 簡稱 TR，可分為 Type I(TR-I)&Type II(TR-II)，共通特點是兩接受器蛋白均穿越細胞膜一次，且兩者都具有磷酸化 serine/threonine 的能力(serine/threonine protein kinase)，差異在於 TR-II 在正常生理狀況下即具有活性，而 TR-I 則須要經過活化的動作才具有活性。TGF-beta receptor 的配體(ligand)是型轉化生長因子(TGF‐,transforming growth favtor beta)，是約有 30 種的蛋白質大家族，可借由與 TR-II 相結合來對 TR-I 造成活化的效應。首先，配體 TGF‐與 TR-II 結合，之後 TR-II 將 TR-I 其中的 GS domain 磷酸化，使原本與 TR-I 相結合的 FKBP12 脫離，且兩個 TR-I 與兩個 TR-II 會形成異四聚體(heterotetrameric complex)，進而啟動下游的訊息 54

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傳遞路徑。在 TR 參與的訊息傳遞路徑中，最被普遍探討的是有關 SMADs 的訊息傳遞路徑(TGF‐/SMAD signaling pathway，見圖一)，大致上的步驟可細分為 1. 配體與接受器蛋白的結合 2.接受器蛋白的聚集和交互磷酸化 3.R-SMAD 蛋白的磷酸化與活化 4.coSMAD 蛋白與 R-SMAD 蛋白的結合 5.進入細胞核促進轉錄作用。上述中已提及 TR-I & TR-II 會形成異四聚體且交互磷酸化啟動下游訊息傳遞路徑，其中”R-SMAD”是一個大家族的總稱，有之 SMAD1、SMAD2、SMAD3、 SMAD5 等等，被磷酸化的 R-SMAD 會與 coSMAD(通常是 SMAD4)結合，並且將轉錄因子(transcription factors)以相結合的方式帶進細胞核中，促進轉錄作用。

圖一、TGF‐/SMAD signaling pathway (來源：http://www.indianjcancer.com/article.asp?issn=0019509X;year=2011;volume=48;issue=3;spage=351;epage=360;aulast=Singh) 另一個訊息傳遞路徑是有關 ERK1/2 形成二聚體(Dimer)進入細胞核，藉由將轉錄因子(transcription factor , TF)磷酸化而活化，進而影響基因表現的路徑。這個路徑的最上游是牽涉到 G 蛋白接受器(G protein coupled receptor , GPCR)的活化而導致，又稱做 ERK signaling pathway(見圖二)，此訊息傳遞路徑的步驟大致上可細分為 1.具有 Tyrosine kinase 功能的 GPCR 接受到配體後形成二聚體 (Dimerization)交互磷酸化形成”Docking site”2.結合上 docking site 的 docking protein –GRB2 與 Sos 蛋白結合，Sos 蛋白再與原本就附著在細胞膜上的 Ras 蛋白結合，造成 Ras 蛋白產生結構改變(conformational change)並被活化 3.被活化的的 Ras 蛋白同樣以結構改變的方式活化 Raf 蛋白 4.Raf 蛋白以磷酸化 MEK 蛋白的方式將其活化，而 MEK 蛋白再磷酸化 ERK 蛋白而使其活化 5.被磷酸化的 ERK 蛋白會形成二聚體進入細胞核，並且將轉錄因子磷酸化而使其活化，經過一連串的磷酸化促成轉錄的進行。其中關於 ERK signaling pathway 的整條訊息傳遞路 55

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徑，可能因為各研究學者所研究的對象不同，中間的 kinase 命名會有所差異，不過大體而言可用 MAP3K、MAP2K、MAPK 來做為各階段造成磷酸化的蛋白質釐清，就上述所提及的各種蛋白質而言，扮演 MAP3K 的是 Raf 蛋白，扮演 MAP2K 的是 MEK 蛋白，而最後會形成二聚體並且進入細胞核的 MAPK 就是 ERK 蛋白。

圖二、ERK signaling pathway (來源：http://www.di.uq.edu.au/proj9background)

四、問題與假說 (Question(s) and hypothesis) 1.人類胃癌細胞 CS12 其細胞膜上的膽固醇含量是否跟人類胃細胞 CSN 有差異? 2.經過 euphol 加藥處理後的人類胃癌細胞，其細胞膜上微域(lipid raft)中的蛋白質(如蛋白質接受器 receptor)和磷脂質等等組成成份是否有改變? 3.承第 2 問，細胞膜上原本在微域中的蛋白質接受器 receptor，有哪些種類重新排列在非微域的位置 4.承第 2 問，這些經過加藥處理的胃癌細胞轉移與否，跟膽固醇及 caveolin 在細胞膜上的含量有無關聯? 5.若外加膽固醇至 euphol 加藥處理後的人類胃癌細胞，會不會使 euphol 所引起的細胞凋亡效用降低? 6. 若外加膽固醇至 euphol 加藥處理後的人類胃癌細胞，會不會使微域中組成重新分部的狀況減少? 56

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五、研究策略 (Strategy) 細胞膜膽固醇含量偵測：以蔗糖─超高速離心法分離細胞膜並且將細胞膜溶解在Tris-Triton x-100 溶液中，並轉送至高雄醫學大學附設醫院檢驗科，進行總膽固醇偵測。偵測胃癌細胞凋亡相關蛋白表現量：讓細胞在37℃、CO2的環境下，以euphol分別加藥處理4、24、48、72小時，之後萃取細胞蛋白如-actin、caspase-3 、TGF‐/ Smad、Bcl-2等，並以西方墨點法觀察其訊號表現量。在影響細胞生長週期調控蛋白上，以cyclin A，cyclin B1， cyclin D，cyclin E，及p27kip1抗體偵測。偵測lipid raft各區段上caveolin-1蛋白含量的變化：將細胞以euphol處理1~24小時，之後以PBS清洗，再將细胞刮在0.85 mL 的 500 mM 碳酸鈉（pH 11.0）溶液中。用 Dounce 均質器將细胞打破（10 次上下），然後用超音波粉碎儀處理 3 次，每次 20 秒。均質液加入 0.85 mL 90%的蔗糖溶液（配置在 25mM 2-(Nmorpholino)ethanesulfonic acid, 0.15 M NaCl, pH 6.5），然後移至離心管底部，從下至上依次加入 1.7 mL 35%蔗糖溶液和 1.7 mL 5%蔗糖溶液，再以 200,000g 離心 16-20 小時。最後從離心管頂部以每次 0.5 ml 抽取蔗糖溶液，約抽取 10 次，將所收集樣品以免疫墨點法分别分析 TβRI、 caveolin-1 和 TfR-1。五、預期結果 (Expected results) 1.胃癌細胞 CS12 其細胞膜上的膽固醇含量高於正常的胃細胞 CSN 2.以 euphol 加藥處理後的胃癌細胞，其蛋白質接受器會在脂筏(lipid raft)產生聚集的現象 3.若在經過 euphol 加藥處理的胃癌細胞中加入膽固醇，則會減緩細胞凋亡路徑六、目前進度 (Current progress) 已習得在分析蛋白質中常使用的方法—西方墨點法(western blot)，並且正在學習樣本的前置處理技術，如將細胞中的蛋白質以不同濃度的蔗糖溶液分離開來的 Fraction 技術，其中用超高速離心機做為分離的工具。以及不同的細胞培養技術並使用不同的藥物處理。大體上目前正在進行的是能夠使自己的樣本增加可信度的階段。七、執行上的困難與解決之道 (Difficulties & solutions) 之前在做西方墨點法分析老師提供的樣本時一直無法有可以觀察的條帶，也不停的思索問題是出在實驗步驟的哪個環節，後來經過老師一次次分階段的 57

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把實驗交給我執行，才找出問題並改善，目前西方墨點法的技術層面應該算是成熟許多了。而至於在西方墨點法結果的條帶上的分析是還要經過學習和思考的，畢竟目前的樣本都是取自老師或學長姐，故沒辦法以一系列的思維來分析最後的結果。所以才需要加緊練習製做自己的樣本來分析。而在培養細胞中，許多藥品所加的量及作用時間還需再拿捏，這部分只能依靠多請教老師或學長姐，以及自己的練習了。八、參考資料 (References) 1.Inhibitory Effect of Euphol, a Triterpene Alcohol from the Roots of Euphorbia kansui, on Tumour Promotion by 12-O-Tetradecanoylphorbol-13-acetate in Twostage Carcinogenesis in Mouse Skin KEN YASUKAWA1,*, TOSHIHIRO AKIHISA2, ZEN-YA YOSHIDA2, MICHIO TAKIDO1 Article first published online: 18 FEB 2010 DOI: 10.1211/0022357001773607 2. Inhibition of Proinflammatory Cytokines and Mediators by Euphol Pandey Anjali and Bani Sarang* Department of Pharmacology, Indian Institute of Integrative Medicine, Canal Road, Jammu Tawi-180001, Jammu and Kashmir State, India. Journal of Applied Pharmaceutical Science Vol. 3 (04), pp. 020-025, April, 2013 DOI: 10.7324/JAPS.2013.3403 3. Differential Expression and Function of Caveolin-1 in Human Gastric Cancer Progression Elke Burgermeister1, Xiangbin Xing1,2, Christoph Röcken3, Mark Juhasz4, Jie Chen2, Michaela Hiber1, Katrin Mair1, Maria Shatz5, Moti Liscovitch5, Roland M. Schmid1 and Matthias P.A. Ebert1 Cancer Research 67 8519, September 15, 2007. DIO: 10.1158/0008-5472.CAN-07-1125

4. Cholesterol targeting alters lipid raft composition and cell survival in prostate cancer cells and xenografts Liyan Zhuang1,2, Jayoung Kim1,2, Rosalyn M. Adam1,2, Keith R. Solomon1,3,4 and Michael R. Freeman1,2 Published in Volume 115, Issue 4 (April 1, 2005) J Clin Invest. 2005;115(4):959–968.DIO:10.1172/JCI19935. 58

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5. Cholesterol modulates cellular TGF-beta responsiveness by altering TGF-beta binding to TGF-beta receptors. Chen CL, Huang SS, Huang JS J Cell Physiol. 2008 Apr;215(1):223-33. 6. Euphol from Euphorbia tirucalli selectively inhibits human gastric cancer cell growth through the induction of ERK1/2-mediated apoptosis. Lin MW, Lin AS, Wu DC, Wang SS, Chang FR, Wu YC, Huang YB. 2012 Dec;50(12):4333-9. doi: 10.1016/j.fct.2012.05.029. Epub 2012 May 23. 7. TGF‐in cancer Joan Massagué1,* Cell. 2008 July 25; 134(2): 215–230. doi: 10.1016/j.cell.2008.07.001 8. (Review)Smad-dependent and Smad-independent pathways in TGF-β family signaling Rik Derynck1 & Ying E. Zhang2 Nature 425, 577-584 (9 October 2003) | doi:10.1038/nature02006 9.Lipid raft/caveolae asmicrodomauins of calcium signaling Biswaranjan Pani and Brij B Singh Cell Calcium. 2009 June; 45(6): 625–633. Published online 2009 March 25. doi: 10.1016/j.ceca.2009.02.009 10.TGF-beta in CAF-mediated tumor growth and metastasis Calon A1, Tauriello DV2, Batlle E3. 2014 Jan 7. pii: S1044-579X(14)00005-4. doi: 10.1016/j.semcancer.2013.12.008. 11.TGF-beta signaling in cancer—a double-edged sword Akhurst RJ, Derynck R. 2001 Nov;11(11):S44-51. 12. Studies on the Interaction of Hepatitis C Virus Proteins and TGF-β Signaling Pathway Pei-Lin Cheng , Yan-Hwa Wu Lee National Yang-Ming University School of Life Science Institute of Biochemistry Ph.D. Dissertation September, 2004

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GTP-binding protein 1-like (GTPBP1l) 對斑馬魚血管發育的影響 The effects of GTP-binding protein 1-like (GTPBP1l) in vascular development in zebrafish

學生：洪珮瑜指導老師：吳長益教授學號：B002010005

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一、

摘要

在脊椎動物胚胎的發育過程中，血管脈絡的生成極為相似且具有高度的演化保守性。目前利用斑馬魚為模式生物，以轉殖螢光的技術標定血管及血球，研究許多早期血管發育及相關的重要基因。斑馬魚胚胎在血管發育的過程中，經脈管生成作用 (vasculogenesis) ，從血管血球前驅幹細胞 (hemangioblast)在斑馬魚兩邊側中胚層往中間遷移、融合形成初級動靜脈血管迴路，接著透過血管新生成作用(angiogenesis)，從初級動靜脈出芽形成新血管。當斑馬魚胚胎發育約 20 小時的時候，軀間部份開始由初級動靜脈向上出芽形成區間血管(intersegmental vessel , ISV)，再經 5 小時後，後主靜脈尾端(posterior cardinal vein , PCV)出芽形成蜂巢狀的尾部靜脈血管叢(cardinal vein plexus , CVP)，整個脈絡形成受不同的訊號調控。先前研究指出 GP-1 家族成員 gtpbp1 為哺乳類動物高度保留的基因，參與蛋白的合成機制並與 GTPase 訊號傳遞相關，調控了許多生理機制。但是對於 gtpbp1 在斑馬魚中的相關序列目前未知。然而我們利用微陣列分析，篩選受 coupTF1b 促進或是抑制的下游基因，卻在斑馬魚中發現了 gtpbp1l 基因。其中 coupTF1b 表現的轉錄因子 coupTF1b 會受到 Notch 訊息的負向調控，而影響靜脈及區間血管的生成。因此我們將針對 gtpbp1l 基因做細部探討，利用斑馬魚為模式生物，探討 gtpbp1l 於心血管生成的過程中扮演的角色。首先須先設定幾項目標， 1. 利用血管螢光之基因轉殖斑馬魚探討 gtpbp1l 對血管脈絡的生成以及對心血管循環系統的影響。 2. 探討 gtpbp1l 影響血管脈絡生成的分子機轉。關鍵詞：斑馬魚(zebrafish)、血管新生(angiogenesis)、區間血管(intersegmental vessel , ISV)、GTP-binding protein 1、CoupTFIb

二、

研究動機與研究問題

心血管系統的正常運作主要與心臟延伸出的血管是否發育完整相關，目前很多研究利用斑馬魚為模式生物，探討發育過程中的血管生成及形成血管脈絡的分子機制。之前研究指出 coupTFIb 調節靜脈及區間血管 (intersegmental vessel , ISV)的生長，然而其調控的下游基因以及其對心血管發育分子機制的探討仍不清楚。因此，我們將針對下游基因作進一步研究。利用 DNA 微陣列(DNA microarray)的方式，我們團隊篩選可能受 coupTFIb 促進或是抑制的下游基因，我將針對其中之一基因 gtpbp1l 作細部探討。在哺乳類動物中 gtpbp1 為一段與 GTPase 訊號傳遞相關的高度保留的基因，調控了許多生理機制，但是在斑馬魚中尚未發現與 gtpbp1 相關的序列及功能。 61

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而將目前僅發現的 gtpbp1l 利用專一性探針與細胞內的 mRNA 在原位址雜交結合，發現此特定 mRNA 可以在血管細胞表現，推測此基因可能對於血管發育有一定的影響。因此，設計此假說而去做更進一步實驗，利用斑馬魚為模式生物，探討 gtpbp1l 於心血管生成的過程中扮演的角色，進一步了解整個心血管生長的機制，主要焦點在於血管發育。

三、

文獻回顧與探討

(1) 斑馬魚模式生物斑馬魚為體外授精，產卵數量多(每週大至可產 200-300 顆卵)，且相較其他脊椎動物下，斑馬魚的胚胎生長迅速、卵徑大且透明，便於我們於顯微鏡下觀察早期的胚胎發育與血管生成，使研究可以有效進行。另外，在脊椎動物的演化過程中，斑馬魚血管生長的分子細胞機制是具有保守性的，因此，斑馬魚已成為研究脊椎動物發育與人類遺傳疾病的新興模式動物。在斑馬魚系統中可利用嗎啉反義寡核苷酸（Morpholino）讓目標基因表現下降。Morpholino 為一段反義核苷酸片段，可與正常 mRNA 結合，阻止聚合酶辨識與結合，抑制正常 mRNA 轉譯，使結合的基因功能喪失。依此逆向遺傳學方法可驗證基因的功能，推導可能與人類血管生長和內皮組織相關的調節及功能[1]。目前實驗室使用的魚種中，野生型的魚種為 TL 和 AB，而利用螢光蛋白質在血管專一表現的基因轉殖魚分為三類：標記紅血球細胞呈現紅螢光的 Tg(gata1:dsRed)、標記血管內皮細胞呈現綠螢光的 Tg(fli1:egfp)及標記血管內皮細胞呈現綠螢光的 Tg(flk1:EGFP) [2-4]。 (2) 斑馬魚血管脈絡形成斑馬魚胚胎心血管系統的組成，首先由側中胚層開始分化，經由遷移往中間凝聚形成初級主動靜脈血管，即為脈管生成作用(vasculogenesis)，接著由原有的脈管出芽而使其他血管生成，此過程則被稱為血管新生成 (angiogenesis) [5-7]。斑馬魚胚胎約發育 20 小時後，當軀幹部分的背側動脈 (dorsal aorta , DA)和後主靜脈(posterior cardinal vein , PCV)兩個初級主要動靜脈血管迴路構造形成時，即開始向上出芽生長區間血管(intersegmental vessel , ISV)。而斑馬魚體節間大約有 30 條區間血管，可用以明確定量血管的缺陷[8-12] (圖一)。區間血管形成的過程中會分化成帶領細胞移動的尖細胞(tip cell)和後端穩固血管結構的柄細胞(stalk cell)。血管尖細胞從背側動脈出芽生長，藉由移動以及細胞增生的方式往上形成背部縱向血管 (Dorsal Longitudinal Anastomotic Vessel , DLAV) [13-14] (圖二)。在胚胎發育約 25 小時後，後主靜脈尾端的部分開始出芽形成蜂巢狀的尾部靜脈血管叢(Caudal vein plexus , 62

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CVP)[15] (圖三)。

圖一、斑馬魚血管生成由血管血球前驅幹細胞(Hemangioblast) 形成初級動靜脈血管迴路，再向上出芽形成區間血管 (intersegmental vessel, ISV)。

圖二、(A) 軀幹剖面圖觀察 ISV 血管生成情形可以發現尖端細胞(Tip cell) 藉由絲狀偽足伸出而移動，柄細胞(Stalk cell)負責穩固血管已生成的部分。(B) 根尖細胞和柄細胞的相對位置以及特定的基因調控。(C) 使用轉殖基因魚 Tg(fli:nGFP)觀察 ISV 的生成。

圖三、斑馬魚胚胎在 26、32、38 小時，開始由尾部靜脈(posterior vein , PV)向下出芽，並隨著胚胎的發育形成腹側血管(ventral vein , VV)及背側靜脈(dorsal vein , DV)，組成類似蜂巢狀的構造[15]。 63

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(3) 斑馬魚血管的特化及調控機制區間血管生長的過程中，Notch 訊號透過促進或是抑制的方式調控血管血球前軀幹細胞(Hemangioblast)而導致不同的分化。Notch 的訊號途徑亦可調控轉錄因子，影響下游基因的表現。其中，在吳長益博士的實驗室中利用斑馬魚為模式生物，研究 couTF 家族成員的 coupTF1b 轉錄因子， coupTF1b 涉及靜脈細胞之分化及區間血管尖端細胞之增生及遷移，而其作用是受到 Notch 訊息的負向調控。同時發現了另一個轉錄因子 islet2，islet2 對於靜脈以及區間血管的生成也扮演著不可或缺的腳色。因此，吳長益博士的實驗室利用 DNA 微陣列，篩選出同時受 coupTFIb＆islet2 促進或抑制的下游基因，再將這些基因列出，而 gtpbp1l 則為這些下游基因之一。 (4) GTPase 超家族 GTPase 亞型中的 GP-1 家族成員 gtpbp1 為哺乳類動物高度保留的基因，與延長因子 1a (elongation factor 1a , eEF1a)和延長因子 Tu (elongation factor Tu , EF-Tu)相關，參與蛋白的合成機制。雖然對於 gtpbp1 在斑馬魚中的相關序列目前未知[16]，但目前在斑馬魚中卻可以發現與 gtpbp1 類似的序列，稱為 GTP-binding protein 1-like (gtpbp1l)。

四、

研究方法及步驟

圖四、實驗流程簡易圖 64

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五、

初步實驗結果

(1) gtpbp1l 基因的篩選由之前的研究得知 coupTFIb＆islet2 調節靜脈及區間血管生長，利用 Microarray 的方式可以看到，下游基因受到 islet2 所促進的基因數量有 108 個；而受到 coupTFIb 所促進的基因數量有 89 個，同時篩選共同受 coupTFIb ＆islet2 所促進的基因有 23 個。另一方面下游基因受到 islet2 所抑制的基因數量有 308 個；而受到 coupTFIb 所抑制的基因數量有 168 個，共同受 coupTFIb ＆islet2 所抑制的基因有 121 個。將這些基因列出，針對 gtpbp1l 深入研究，推測這基因可能對於血管發育也有一定的影響，設計此假說而去做更進一步實驗(圖五)。

圖五、微陣列分析圖顯示受 coupTFIb＆islet2 促進或是抑制的下游基因，紅色為抑制，綠色為促進，再將這些下游基因列出。 (2) gtpbp1l 在斑馬魚中表現的位子利用原位組織染色，使用專一性的 gtpbp1l 探針去標記基因表現的位置，藉以推測他可能擁有的功能。觀察 18 小時、24 小時、30 小時的原位組織染色，可以看出表現的位置約略在血管組織的部分，18 小時主要表現在頭部神經管以及一些血管前驅細胞，24 小時主要表現在初級血管環路的尾部部分，而 30 小時表現在初級血管環路、體節以及尾部靜脈血管叢。由此初步的原位組織染色的結果與之前的微陣列分析得知，gtpbp1l 的表現受 65

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coupTFIb＆islet2 所調控，且從之前的研究也得到 coupTFIb＆islet2 對於區間血管生長有所影響。從原位組織染色的結果中可以發現到 gtpbp1l 在斑馬魚表現中除了頭部血管及初級血管環路外，在體節和尾部靜脈血管叢也有所表現，因此我們將觀察目標設立在區間血管以及尾部靜脈血管叢上(圖六)。

圖六、以 gtpbp1l 探針進行原位組織染色，觀察斑馬魚胚胎在 18、24、30 小時 gtpbp1l 所表現的位子。 (3) 利用 gtpbp1l morpholino 注射斑馬魚胚胎，觀察胚胎血管生成的變化觀察注射 gtpbp1l morpholino 後，斑馬魚在 30 小時的外觀型態，正常魚體的區間血管在 28 小時的時候就會生長到頂端，然而，gtpbp1l MO 胚胎的區間血管在 30 小時，仍有部份無法正常向上生長而形成背部縱向血管的構造(籃色箭頭所指)，推測 gtpbp1l 在血管出芽的時候可能具相當的影響力。而尾部靜脈血管叢的部分，可以看到控制組的魚體已形成類似蜂巢狀的構造，而 gtpbp1l MO 則有不正常的出芽現象，導致血管沒有產生正確的偽足數量 (圖七)。觀察注射 gtpbp1l morpholino 後，斑馬魚在 48 小時的外觀型態，在尾部靜脈血管叢的部分，正常的血管在此時已經由出芽連結形成類似環狀的結構，並停止生長，以維持大小及穩定，但是 gtpbp1l MO 卻持續在出芽，導致血管過多的不必要連結。在 48 小時區間血管的部份，正常區間血管已經完全生長完成，呈現一個類似 7 字形的形狀，而 gtpbp1l MO 雖然可以看到血管生長已經到達頂端，卻尚未形成完整的背部縱向血管，且區間血管不像 7 字形，部份甚至還有不正常的分岔(籃色箭頭所指) (圖八)。觀察注射 gtpbp1l morpholino 後，斑馬魚在 72 小時的外觀型態，由於上述血管的不正常發育，使 gtpbp1l MO 的魚體在血液循環方面可能有所缺失，而導致心包膜、腦膜及卵黃皆產生水腫的現象(籃色箭頭所指)。將控制組與注射組做量化分析，在注射組中有將近 85% 的魚體具有水腫的現象 (圖九) 66

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圖七、30 小時控制組與 gtpbp1l MO 在區間血管與尾部靜脈血管叢的比較。

圖八、48 小時控制組與 gtpbp1l MO 在區間血管與尾部靜脈血管叢的比較。

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圖九、72 小時控制組與 gtpbp1l MO 心膜腫大的比較及量化圖

六、

未來實驗計畫以及預期實驗結果

(1) gtpbp1l 與血管發育的關係：總結以上實驗結果發現 gtpbp1l 的剔除會導致區間血管的生長緩慢，出芽的不正常現象，且尾部靜脈血管叢會異常持續出芽導致血管結構不正常集結。已知血管的出芽是從動靜脈開始，現在出芽出現問題，我們推測是不是連動靜脈都會產生問題，所以我們將使用動靜脈標記物去做原位組織染色，去測試表現量是否有減少，未來也會做 Q-PCR 的部位更進一步定量。 (2) 測試血液循環是否也會有缺陷：由目前已知的結果斷定，gtpbp1l 的剔除會造成血管出芽的缺陷，且在心包膜、腦膜及卵黃皆有明顯的水腫的現象，因此推斷這些血管的缺陷是否因影響到斑馬魚的血液循環，而導致水腫的現象。後續的實驗主要使 tg(gata1:dsRed)-標記血球的螢光魚來測試。 (3) gtpbp1l 的過量表現：要證實一個基因的功能除了剔除基因觀察其表型的影響，再來就是剔除基因後重新注入此基因看其表型會不會被挽救回來。目前已知 gtpbp1l 剃除會造成血管異常，推測重新注入 gtpbp1l 或許可以挽救異常的血管表型，而實驗室在這方面主要是要使用 tol2 的技術。

七、

執行上的困難與解決之道

本計劃所使用的實驗技術中，最基本的即為斑馬魚的飼養及配魚收卵，且需建立良好的生物模式才得以觀察。在這方面，若斑馬魚不正常排卵或排卵量不夠就無法取樣，即使收到魚卵，受精的魚卵亦可能在早期就停止 68

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發育，這些皆會影響生物模式的建立而使往後實驗無法進行。這些問題可能與斑馬魚的飼養方式及環境相關，魚房需維持在適當的溫度，且養殖水系統的 pH 值與鹽份亦應保持恆定。在儀器使用方面，部份儀器的原理及操作方式尚未十分了解，且在實驗結果的分析上，還需要多與老師討論數據的方向與恰當性。

八、

參考文獻

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肌球蛋白抑制劑 pentabromopseudilin 和 pentachloropseudilin 對斑馬魚血管發育的影響

The vacular development of pentabromopseudilin and pentachloropseudilin inhibition of myosin in zebrafish embryos

學生：白育齊指導老師：吳長益教授學號：B002010023

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摘要肌球蛋白對於細胞的附著、移動、運動、胞吞及細胞分裂等扮演著重要的角色。 Pentabromopseudilin （ PBP ）為具有肌球蛋白抑制能力的藥物，而 pentachloropseudilin（PCLP）為其鹵基替代後的相似物，同樣具有肌球蛋白的抑制能力。關於肌球蛋白的大多為細胞運輸、附著與細胞訊息傳遞等。有文獻指出， MyH9（一種 myosin II）與血管內皮細胞運輸血管生成相關蛋白（nucleolin）有關，而 myo1c（一種 myosin I）在血管內皮細胞生長因子受器（vascular endothelial growth factor receptor 2）VEGFR2 運輸至細胞表面上扮演重要角色。而 PBP 與 PCLP 分別對於 myosin II 和 myosin I 有較佳的抑制能力。以上文獻為細胞層次的研究，對於個體發育上的研究則很少。因此以斑馬魚為模式生物，探討在個體層次，PBP、PCLP 抑制肌球蛋白對血管發育的影響。分別以基因轉殖魚以螢光顯微鏡拍攝血管螢光觀察血管是否異常，原位組織雜交（in situ hybridization）比較不同的血管相關基因表現位置，而使用即時定量聚合酶鏈鎖反應（real time PCR）分析血管生成相關基因表現量。研究結果將有助於了解 PBP、PCLP 作為細胞層次肌球蛋白抑制劑對於個體層次血管發育的影響，與發展應用在阻斷癌細胞周遭血管系的形成上。

文獻回顧與探討

一、斑馬魚簡介斑馬魚（zebrafish，Danio rerio）為一個研究脊椎動物早期血管生長理想的模型，在循環系統、解剖學上的發育、血管組成的方式以及血管形成的機制都與人類及其他高等脊椎動物具有高度的相似性（1）。斑馬魚具有體積小（成魚約3 公分），具有短生殖期，從幼魚到可以配種的成魚的過程中只要3~4 個月，普遍一周可產200~300 顆卵。有利於遺傳學上進行大規模的突變株篩選。此外斑馬魚胚胎透明，整個胚胎發育及器官形成可直接在顯微鏡下觀察，且斑馬魚以整個個體做為測試，可同時測驗毒性與藥效，其所需的劑量少，發育快，在時間及花費上具有相當大優勢。在目前使用的魚種中，野生型有兩種，分別是TL，和AB，而基因轉殖魚主要有三個種類，分別是tg（kdrl）-標記血管細胞呈現紅螢光；tg（y7）-標記血管內皮細胞核呈現綠螢光；tg（flk1）-標記血管內皮細胞呈現綠螢光。

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圖一、斑馬魚研究血管發育為一良好模型。(A)白光。(B)標記血管內皮細胞呈現綠螢光。(C)標記紅血球的細胞核呈現紅螢光。

圖二、斑馬魚主要觀察的血管示意圖研究觀察主要在節間血管（ISV）在24~30 hpf時期，是否長至頂端背側血管(DLAV)，以及尾部靜脈叢（CVP）在24~30 hpf 其蜂窩叢狀的血管發育情形。此外，可以利用原位雜交技術（in situ hybridization）以不同基因的探針，去結合在不同的基因表現位，藉此觀察基因表現的位置及強度，在本實驗中利用不同血管標記的探針去看血管表現有無缺失。

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二、肌球蛋白簡介肌球蛋白為真核生物中的一類分子馬達，已知有十八種類型，分子量在 51kD左右，肌球蛋白結構由重鏈(Myosin heavy chain) 和輕鏈(myosin light chain) 組成。輕鏈會與剩餘重鏈形成功能性的結構，包含具有ATPase功能的ATP結合和肌絲蛋白(actin)結合位。其在細胞運動和運輸上扮演重要的角色。目前研究多集中在myosin-I、myosin- II、myosin-V上。Myosin I 與囊泡運輸相關，而 myosin II則是與肌肉細胞的收縮相關外，還與細胞分裂有關（2）。有研究指出 PBP較偏好抑制myosin-II，而PCLP偏好抑制myosin-I（3,4）。

圖二、myosin-I、II、V結構示意圖三、Pentabromopseudilin和pentachloropseudilin藥物簡介 Pentabromopseudilin(PBP)在1966年首次從Pseudomonas bromoutilis分離出來， Pentachloropseudilin(PCLP)則在1978年首次被合成。展現出各式的藥物活性，如：抗菌、抗腫瘤、植物毒性等、抑制肌球蛋白活性等。PBP、PCLP會藉由異位性抑制作用使肌球蛋白上的ATP結合位構型改變，使ATP無法附著，進而抑制肌球蛋白的活性。（5）

圖三、Pentabromopseudilin和pentachloropseudilin的化學結構 75

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研究動機與實驗假設近年研究指出 Pentabromopseudilin（PBP）和 pentachloropseudilin（PCLP）對於細胞層次的肌球蛋白的具有抑制能力，如：人類腫瘤細胞、Gallus gallus 和 Oryctolagus cuniculus 的肌肉細胞、D. discoideum。肌球蛋白在細胞附著、移動、運動、胞吞及細胞分裂等扮演著重要的角色。在細胞層次上，有研究指出，MyH9 與血管內皮細胞運輸血管生成相關蛋白（nucleolin）有關（6），而 myo1c 在 VEGFR2 運輸至細胞表面上扮演重要角色（7）。表示 Myosin I、II 都與血管內皮細胞，血管生成因子相關。另外有研究指出，myosin 在血管萌發階段，與調控內皮細胞的凝聚相關（8）。表示 myosin 的抑制可能會對血管內皮細胞的凝聚造成影響。因此想以斑馬魚為模式生物，探討在個體層次，以 PBP、PCLP 抑制兩類肌球蛋白對血管發育的影響與是否會造成血管相關基因的表現被抑制。第一部分實驗假設 PBP、PCLP 會抑制 myosin 使血管的發育上出現缺陷，第二部分假設 PBP、PCLP 對於血管內皮細胞的 myosin 抑制，可能與血管生成相關基因有關。此研究成果將有助於了解肌球蛋白對斑馬魚胚胎血管發育的影響，與發展應用在阻斷癌細胞周遭血管系的形成上。

研究方法及步驟一、實驗流程圖

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目前結果

圖五、以 5 um 濃度的 PBP 處理六小時時期的胚胎後，30hpf 時期。以 5 um PBP 濃度處理的斑馬魚，其節間血管（ISV），長度只有對照組的一半左右，而尾部靜脈叢（CVP）無形成如對照組明顯的蜂窩狀血管叢。

圖六、以0.3以及0.4 um濃度的PCLP處理六小時時期的胚胎後，24hpf時期。 PCLP處理的斑馬魚，其節間血管（ISV），與對照組相比無明顯的缺陷，而尾部靜脈叢（CVP）無形成如對照組明顯的蜂窩狀血管叢。對於 PCLP是否會影響節間血管的缺陷，仍待測量。

預期結果實驗預期PBP、PCLP會對血管發育造成缺陷，且會影響到內皮細胞的遷移和分裂。而PBP的缺陷已經確認，接下來會以能標記內皮細胞核的基因轉殖魚（y7），觀察內皮細胞的生長情形。若內皮細胞生長的分裂與遷移有異常。則以血管生成相關基因做qPCR，檢測是否有非正常量的血管生成相關基因表達。另外PCLP則做進一步的濃度測試，預期會產生節間血管缺陷。

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執行上的困難與解決之道 PCLP目前在藥物測試上不穩定，0.2~0.5um的濃度間，耐受性不一，暫時沒有結果。會在換以新藥物配置stock後再做測試，並與老師進行討論排除變因。其他實驗假設與數據分析則請老師協助引導，並加強報告的邏輯、合理性。

參考文獻 1. Aniket V. Gore, Kathryn Monzo, Young R. Cha, Weijun Pan, and Brant M. Weinstein. （2012） Vascular Development in the Zebrafish. Cold Spring Harb Perspect Med. V.2(5) 2. Ji-Hong Zang, Guy Cavet, James H. Sabry, Peter Wagner, Sheri L. Moores, and James A. Spudich*. （1997） On the Role of Myosin-II in Cytokinesis: Division ofDictyostelium Cells under Adhesive and Nonadhesive Conditions. Mol. Biol. Cell v.8(12) 3. Fedorov R, Böhl M, Tsiavaliaris G, Hartmann FK, Taft MH, Baruch P, Brenner B, Martin R, Knölker HJ, Gutzeit HO, Manstein DJ.（2009） The mechanism of pentabromopseudilin inhibitionof myosin motor activity. Nat Struct Mol Biol. 16(1):80-8. 4. Chinthalapudi K1, Taft MH, Martin R, Heissler SM, Preller M, Hartmann FK, Brandstaetter H, Kendrick-Jones J, Tsiavaliaris G, Gutzeit HO, Fedorov R, Buss F, Knölker HJ, Coluccio LM, Manstein DJ.（2011）. Mechanism and specificity of pentachloropseudilin-mediated inhibition of myosin motor activity. J Biol Chem. 286(34) 5. René Martin Dr.1, Anne Jäger1, Markus Böhl Dr.2, Sabine Richter Dr.2, Roman Fedorov Dr.3, Dietmar J. Manstein Prof. Dr.3, Herwig O. Gutzeit Prof. Dr.2 andHans-Joachim Knölker Prof. Dr.（2009）Total Synthesis of Pentabromo- and Pentachloropseudilin, and Synthetic Analogues—Allosteric Inhibitors of Myosin ATPase. ANGEW CHEM INT ED. V.48(43) 8042–8046 6. Yujie Huang, Hubing Shi, Hao Zhou, Xiaomin Song, Shaopeng Yuan and Yongzhang Luo. （ 2006 ）. The angiogenic function of nucleolin is mediated by vascular endothelial. Blood. 107(9):3564-71. 7. Tiwari A, Jung JJ, Inamdar SM, Nihalani D, Choudhury A. (2013) The myosin motor Myo1c is required for VEGFR2 delivery to the cell surface and for angiogenic signaling. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 304(5) 8. Reiner Wimmer, Botond Cseh, Barbara Maier, Karina Scherrer, Manuela Baccarini .（2012）Angiogenic Sprouting Requires the Fine Tuning of Endothelial Cell Cohesion by the Raf-1/Rok-α Complex. Developmental Cell. 78

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V.22(1) 158-171

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篩選 Dehalococcoides 屬菌並檢測降解三氯乙烯的能力 Filter Dehalococcoides spp and detect the ability to degrade trichloroethylene

學生：賴亭羽指導老師：劉仲康教授學號：B002010033

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一、動機台灣有很多尚未處裡的污染地，其中含氯化合物的汙染，雖然沒有像重金屬汙染等那麼嚴重，但這類汙染卻十分常見。含氯化合物的汙染檢測包含多氯乙烯類的過氯乙烯、四氯乙烯及三氯乙烯，多氯乙烯類常做為工業上之有機物溶劑，可用於乾洗劑、脫脂劑或油漆等塗料。因為揮發性強，容易散布到空氣中，但在地下水中不易降解，長期暴露在高氯乙烯類化合物的環境下，會造成肝功能損害，以及抑制神經系統的功能，對健康產生危害。目前處理含氯化合物汙染的方法中，生物復育是較容易而且環保的方法，想利用篩選菌種檢驗的方式，尋找更多能降解三氯乙烯的微生物。二、議題背景已有實例證實，自然界中之脫氯球菌屬（Dehalococcoides sp.）可降解含氯化合物，其特性為兼性厭氧細菌，當進行無氧呼吸時，會利用含氯化合物接受電子傳遞鏈的電子取代氧氣的功能，並釋出 HCl，而達到我們所需降解含氯化合物的目的。降解的過程並不一定由單一菌種完成，有時是多種細菌以接力的方式，逐步將多氯乙烯降解成低毒性的乙烯。

圖一： Dehalococcoides ethenogenes strain 195 (Steve Zinder, 1997)

表一：目前 Dehalococcoides sp.的來源與能分解的含氯化合物 ( Löffler et al., 2012)

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以本國內的案例，目前關於去除多氯乙烯類汙染有多種方法，包含添加化學氧化物、循環地下水井再處理以及生物復育法等等。添加化學氧化物花費大而且易造成二次汙染；循環抽取地下水是利用地下水井的方式將水抽取上來，處理後再注回，耗費時間長：而生物復育法可以透過添加肥料或是限制物質，促使微生物生長，加強微生物分解多氯乙烯類汙染的能力，花費較低，處理時間中等，對環境影響較小（表一）。而下表這些整治評估方法之後都有在現地實施，結果顯示生物復育法成效優秀[1]。

表一：環保署土污基管會

高雄縣大寮鄉義仁村整治計劃評估

三、問題與假說因為各地氣候、汙染及土壤微生物環境有所差異，推測本地菌種與國外的菌種有一定程度的差別。這些有助於該類菌種適應環境，因此能有效應用於該汙染地生物復育，透過篩選菌種測試並比較相關文獻內容驗證假說。四、研究策略實驗內容是使用含多氯乙烯汙染場地的土壤，使用培養液添加三氯乙烯，在密封試管中培養，模擬厭氧環境使其進行無氧呼吸。而選擇添加三氯乙烯的原因是，其毒性較過氯乙烯或四氯乙烯低，且更容易溶於水，有助於實驗進行，且大多數的 Dehalococcoides sp.都有降解三氯乙烯的能力。之後每隔 7 天再培養一次，每次取 1 ml 加至下一管培養液，三氯乙烯濃度提升 3 ppm，逐次培養後，可得到對三氯乙烯耐受度高的菌種。培養到無法長菌時，將前一管菌液取出，塗盤後培養在厭氧缸中，最後取單一菌落放入試管中培養放大菌量，進行後續檢驗。

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檢驗方法：1.利用文獻上給予降解含氯化合物的功能片段引子 ( tceA、 bvcA、vcrA )進行 PCR 檢驗。 2.利用 HPLC 檢驗是否添加的含氯化合物的降解效率。 3.用之前篩出可以代表 Dehalococcoides sp.的 16s rRNA 作為標準進行 DGGE 比對，使用格蘭氏染色及直接染色法觀察菌的外型，序列相同、菌型相同且其他染色特性也相同，則僅選其中之一進行步驟 4。 4.做藍白篩、送定序，比對可能菌種。比對是否為已知的 Dehalococcoides sp.。若是，則進行文獻考察及功能差異分析；若不是，則檢驗其降解含氯化合物的能力是否有優勢，或其喜好的生長條件。若比對出可能菌種，查詢相關文獻資料，測試篩出的菌與資料中該菌種特性是否相同；若未比對出則測試其生化特性及降解力。五、預期結果 (expected results) 預期能得到有降解三氯乙烯的單一菌種，且其對三氯乙烯的耐受度極高，能適應高汙染場所。

六、目前進度 (current progress) 1.準備好代表 Dehalococcoides sp.的 16s rRNA 片段 2.目前在利用試管培養的階段，使用三種培養基測試，分別為 LB、

圖二：

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七、執行上的困難與解決之道 (difficulties & solutions) 1.三氯乙烯容易揮發造成實驗誤差，目前解決方法是：試管培養利用密封的方式防止三氯乙烯釋出，造成濃度下降，塗盤則是在厭氧缸中另放一管原液，使其蒸氣壓飽和。 2.厭氧環境的控制 3.濃度

八、引用 [1]土壤及地下水污染整治技術與實場應用案例介紹

環保署土污基管會

[2] Maymó-Gatell (1997). Isolation of a Bacterium That Reductively Dechlorinates Tetrachloroethene to Ethene Science.276.5318.1568 [3] Edwin R. Hendrickson (2002). Molecular Analysis of Dehalococcoides 16S Ribosomal DNA from Chloroethene-Contaminated Sites throughout North America and Europe Tetrachloroethene to Ethene APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY DOI: 10.1128 [4] Jon K. Magnuson (2000). Trichloroethene Reductive Dehalogenase from Dehalococcoides ethenogenes: Sequence of tceA and Substrate Range APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, Dec. 2000, p. 5141–514 84

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[5] Stephen H. Zinder and J. M. Gossett (1995). Reductive Dechlorination of Tetrachioroethene by a High Rate Anaerobic Microbial Consortium Tetrachloroethene to Ethene Environ Health Perspect 1 03(Suppl 5):5-7 (1995)

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臺灣鐵杉族群分析 The Analysis of Tsuga chinensis var. formosana Population

學生：李紫昀指導老師：江友中教授學號：B002010010

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摘要鐵杉屬（Tsuga）的台灣鐵杉（Tsuga chinensis (Franch.) Pritz. ex Diels var. formosana (Hayata) H. L. Li & H. Keng）為台灣的特有變種植物，主要分布於海拔 2100 至 3100 公尺，介於台灣冷杉及檜木帶之間，屬於亞高山分布物種。地球的氣候變遷隨著人類的活動頻繁而加劇，劇烈的全球氣候變遷會快速且大規模的影響生物遷徙以及地理分布，若物種遷徙至不同的環境條件，可能會因適應輻射演化（Adaptive Radiation）而演化出不同特徵的族群；為探討全球暖化對台灣鐵杉族群分布的影響，採集台灣境內之合歡山、鳶峰、太平山、觀霧、塔塔加、南湖大山、大禹嶺、大武山和清水山等地的台灣鐵杉族群葉片樣本，利用微衛星體基因座（microsatellite）分析族群遺傳多樣性，並使用聚合酶連鎖反應（Polymerase Chain Reaction, PCR）和 DNA 選殖（TA cloning）等技術將微衛星體 DNA 擴增且選殖出來，最後使用 GenAlEx 6.5、Arlequin ver 3.5.1.3、SAMOVA 1.0、 STRUCTURE 2.3.4 和 MaxEnt 3.3.3k 等軟體分析資料，探討台灣鐵杉不同海拔族群的族群遺傳多樣性差異，推估族群過去、現在及未來的族群動態情形，以及未來台灣鐵杉遺傳多樣性喪失的可能性。關鍵詞：族群遺傳學（population genetics）、氣候變遷（climate change）、適應輻射演化（Adaptive Radiation）、微衛星體基因座（microsatellite）

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一、動機 (motivation)：地球的氣候變遷隨著人類的活動頻繁而加劇，劇烈的全球氣候變遷會快速且大規模的影響生物遷徙以及地理分布，也可能造成許多物種的滅絕，全球暖化正影響著許多生物的生存 (Hewitt, 2000)。研究動機為探討全球暖化對台灣高山木本植物的影響，以台灣鐵杉作為主要對象，利用族群遺傳學 (population genetics) 和生態棲位模型 (ecological niche modeling) 等方法來評估族群動態及可能的適應方式。透過微衛星體 DNA 基因座進行族群遺傳變異分析，結合生態棲位模型來探討以下的問題與假設： 1. 篩選出適用於台灣鐵杉之多型性微衛星體基因座。 2. 台灣鐵杉不同海拔族群的族群遺傳多樣性差異。 3. 台灣鐵杉在過去、現在及未來的族群動態評估。 4. 台灣鐵杉在未來的遺傳多樣性喪失推估。二、議題背景 (research background)：全球暖化是指全球平均氣溫隨著時間逐漸升高的現象，而此現象從二十世紀中期開始趨於明顯，聯合國政府間氣候變遷小組 (Intergovernmental Panel on Climate Change, IPCC) ，在 2007 年出版的第四次氣候變遷評估報告中指出，愈靠近現在的年代，年平均上升溫度愈高，尤近 25 年的氣溫上升最為明顯 (IPCC, 2007)。溫室效應所造成的氣溫上升會使海面平上升、陸地面積減少，若加上氣候帶位移，可能引發動物大遷徙甚至是疾病的蔓延，最後有可能導致物種瀕臨滅絕、棲地減少及洋流的改變等問題，也進而影響人類的經濟和生活 (王碧玲, 2007)。族群的演化事件可藉由族群遺傳變異的探測及統計，並與歷史地質相關事件一同分析得到相關訊息，如生物棲地的破碎可以將大種群分割成互相隔離的小種群，且會因近親繁殖、基因庫縮小和基因喪失致使基因多樣性枯竭 (謝佳燕等人, 2006)。年齡結構和遺傳結構的資料結合，能為族群的演化事件提供時間上的訊息，並進一步做族群未來的演化趨勢預測 (Chung et al., 2003; Dubreuil et al., 2010; Kittelson et al., 2009)。適應輻射演化 (Adaptive Radiation)，是指一個族群在不同的環境條件下適應，而演化出不同特徵的族群，例如加拉巴哥雀鳥 (Galapagos fiches) 之適應輻射現象。適應輻射是由基因型變異和天擇所推動的，可形成物種多樣性，為生態和演化間重要的連結 (黃皓陽, 2010)。台灣鐵杉屬於適應台灣環境氣候的特有變種，可以透過分子遺傳技術並結合生態棲位模型，對台灣鐵杉族群進行相關分析研究，使用相關分析軟體 (如 MaxEnt 軟體等) 探究台灣鐵杉現在及未來的族群分布變動的可能性。三、問題與假說 (question(s) and hypothesis)：微衛星體基因座 (microsatellite) 又稱簡單重複序列 (simple sequence repeat, SSR) ，普遍隨機散佈於真核生物體內，具有高度的變異性，此類型 DNA 片段通常以 2-6 個鹼基對為單位，且連續重覆 5-100 次 (Tautz and Renz, 1984)，不同的物種和族群的微衛星體基因座出現頻率不同，因此可由此分辨族群。一般來說，植物的基因組中以二重複為主，三重複的部分以 (AAG)n 及 (AAT)n 最常見 (Gupta et al., 1996)。衛星體序列分析技術主要是針對微衛星體基因座中重覆序列的兩側序列設計具有高度專一性的引子對，並以基因組 DNA 為模板來進行 PCR 反應 (Cipriani et al., 1999)。從遺傳學的角度來看，微衛星體 DNA 不會被轉錄轉譯成具有功能性的蛋白質，進而不會受到天擇的影響，因此，微衛星體基因座的 88

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變異可以在個體中高度的被保留，其遺傳特性依循孟德爾遺傳定律之分離率 (Tambarussi et al., 2013)，可以透過分析同源染色體為同型合子 (homozygosity) 或異型合子 (heterozygosity)，得到微衛星體 DNA 在分析族群之間遺傳差異的完善資料，故也是現今分子鑑定技術中最有效率的分子標記方法 (Andersen and Lubberstedt, 2003)。四、研究策略 (strategy)： 1. 植物樣本採集於台灣境內之合歡山、鳶峰、太平山、觀霧、塔塔加、南湖大山、大禹嶺、大武山和清水山等地採集台灣鐵杉的新鮮葉片樣本，記錄採集座標等相關調查資料，並將葉片低溫保存迅速帶回實驗室做處理。現有之台灣鐵杉樣本資料如下表一，共 238 樣本。表一、現有之台灣鐵杉樣本資料採集地

採集地最高海拔(m)

分布範圍(m)

樣本數(株)

湖南大山

3740

2600-3000

合歡山

3422

2900-3000

武嶺

3275

2550-2800

大武山

3100

2400-2800

中央金礦山屋

2850

2550-2850

鳶峰

2756

2500-2750

塔塔加

2610

2450-2600

大禹嶺

2565

2450-2550

清水山

2408

2200-2400

觀霧

2000

1850-2000

太平山

1950

1850-1950

Total genomic DNA 萃取以及定量將處理過的葉子低溫冷凍後以機器將葉片打碎，再用 Genomic DNA Extraction Kit (Plant)： YGP100 (RBC Real Genomics, Taiwan) 萃取葉片的 Total genomic DNA，最後將抽取的 DNA 定量並儲存於-80℃冰箱備用。 3. 聚合酶連鎖反應 (Polymerase Chain Reaction, PCR) 用限制酶 Mse I 將基因體 DNA 切割成小片段序列 DNA，再以 T4 連接酶將設計好的 adapter 連接至 DNA 上，加入水、10x TE buffer、dNTP 和 Taq DNA 聚合酶，以最合適的溫度進行 PCR。 4. 雜合反應以及磁珠吸附分離將含有微衛星體的 DNA 與帶有生物素 (biotin) 的短片段重複序列探針 DNA 進行雜合反應，再利用帶有抗生物素的磁珠將 DNA 分離出來。 5. DNA 選殖 (TA cloning) 將微衛星體 DNA 以 PCR 擴增後，以 1% agarose 電泳分離不同大小之微行星序列，選出目標片段並純化。接著再加入 5X ligation buffer、T4 ligase 和 T vector 將 DNA 接合至 pGEM-T Easy (Promega, USA) 載體上，並轉入至至大腸桿菌勝 2.

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任細胞 (E. coli, DH5α) 中於 37℃下培養 16 小時。挑選出擁有正確選殖片段質體的菌株大量增殖，利用 Miniprep purification kit (Gene-SpinTM-V2, Protech Technology) 純化質體 DNA 並送定序。 6. 引子設計以及 PCR 擴增根據定序的結果設計 DNA 引子，對微衛星體序列進行擴增，篩選出專一性較高的引子對後，對單一族群測試是否為多型性微衛星體基因座，再進行全樣本族群遺傳多樣性分析。 7. 膠體電泳與基因型判讀將全樣本 PCR 產物以聚丙烯醯胺膠體電泳分析，再將所得的圖譜進行人工判讀及電腦分析，以 Quantity One version 4.62 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, California, USA) 計算電泳膠圖上條帶影像的片段大小並推算出各樣本的 SSR 重複套數。 8. 資料分析所得之判讀資料，可依序利用下列軟體得到所需資料： I. 遺傳多樣性資料：使用 GenAlEx 6.5 (Peakall and Smouse, 2012) 軟體計算等位基因頻率 (Pi)、等位基因數 (Na)、有效等位基因 (Ne)、異型合子觀測值 (observed heterozygosity, Ho) 和異型合子期望值 (expected heterozygosity, He) 等數據，得到遺傳多樣性的資料。 II. 遺傳結構資料：使用 Arlequin ver 3.5.1.3 (Excoffier and Lischer, 2010) 軟體進行 Fstatistics 以及 AMOVA (Analysis of Molecular Variance) 分析，得到的遺傳結構相關資料可觀察遺傳分化程度。 III. 族群分群資料：使用 SAMOVA 1.0 (Dupanloup et al, 2002) 軟體計算族群變異度 (FCT)，以變異程度高者為佳，評估資料並找出最適合的分群值。 IV. 分配分析 (assignment test)：使用 STRUCTURE 2.3.4 (Hubisz et al., 2009) 軟體，應用 MCMC 演算法進行運算，計算族群等位基因頻率等資料，進行分群分析，尋找最佳的分群情形。 V. 生態棲位模型：使用 MaxEnt 3.3.3k (Jane et al , 2011) 軟體抓取環境因子數據做為預測因子，可由 WorldClim- Global Climate Data (Hijmans et al., 2005) (http://www.worldclim.org/) 以及 CCAFS GCM Data Portal (http://www.ccafsclimate.org/) 兩個氣候因子資料庫中抓取過去、現在及未來之氣候因子，以最大熵值法 (maximum entropy) (Phillips et al., 2006)進行台灣鐵杉分布分析，預測台灣鐵杉族群分布變動的可能性。五、預期結果 (expected results)： 1. 台灣鐵杉微衛星體基因座之篩選。 2. 得知台灣鐵杉在不同海拔的族群基因體與遺傳差異。 3. 統計族群結構與族群遺傳變異的相關性，探討族群變動情形。 4. 推測台灣鐵杉在未來喪失遺傳多樣性的可能性推估。六、目前進度 (current progress)：目前以下進度已完成： 90

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1. 植物樣本採集 2. Total genomic DNA 萃取以及定量 3. 聚合酶連鎖反應 (Polymerase Chain Reaction, PCR) 4. 雜合反應以及磁珠吸附分離 5. DNA 選殖 (TA cloning) 現在正在進行之步驟為「引子設計以及 PCR 擴增」。七、執行上的困難與解決之道 (difficulties & solutions)： 1. 植物葉片基因體萃取以及定量的操作方法。 2. PCR 反應內容物的比例以及反應條件的設定。 3. 微衛星體基因座篩選法之原理操作以及設計引子的方法。 4. 電泳所需的 agarose 膠片配製以及電泳分離 PCR 產物的方法。 5. 聚丙烯醯胺 (acrylamide) 膠體電泳法之操作。 6. 分子序列資料之分析程式的操作。 7. 分子序列的資料整理排列與分析。八、參考資料：黃啟俊、林其永、王國雄、許再文、蔣鎮宇 (2007)。玉山國家公園境內紅檜之微衛星 DNA 研究。國家公園學報，17 (1): 17-32。王昭月、宋家瑋、劉明穗、歐錫坤 (2007)。微衛星 DNA 分子標誌應用於桃栽培種與雜交後代之遺傳相似性分析。台灣農業研究所，56: 108。王碧玲 (2007)。全球暖化與溫室效應的影響。科技發展政策報導，No.4: 7579。郭昱嵩、顏程鍾、張宇嵐、鄭近楠、許遠民、杜濤、王中鐸、劉楚吾 (2013)。多鱗 (Sillago sihama) 4 個野生地理群體的微衛星標記分析。海洋與湖沼 (OCEANOLOGIA ET LIMNOLOGIA SINICA) Vol.44, No.2: 267-276。黃皓陽 (2010)。生命自會找到出路-談適應輻射 (Adaptive Radiation)。國科會高瞻自然科學教學資源平台。楊國禎、林笈克、黃江綸、何政賢 (2012)。合歡山台灣冷杉林永久樣區地被植物組成與長期動態變化之研究。國科會 GRB 計畫編號: 100301020400G1001。 Andersen, J. R. and Lubberstedt T. (2003) Functional markers in plants. Trends in Plant Science. 8: 554-560. Breshears, D. D., Cobb, N.S., Rich, P. M., Price, K. P., Allen, C. D., Balice, R. G., Romme, W. H., Kastens, J. H., Belnap, J., Anderson, J. J., Myers, O. B. and Meyer, C. W. (2005) Regional vegetation die off in response to global change. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 102: 15144-15148. Chung, M. Y., Epperson, B. K. and Chung, M. G. (2003) Genetic structure of age classes in Camellia japonica (Theaceae). Evolution. 57: 62-73. Cipriani, G., Lot G., Huang W. G., Marrazzo, M. T., Peterlunger, E. and Testolin R. (1999) AC/GT and AG/CT microsatellite repeats in peach [Prunus persica (L) Batsch]: isolation, characterization and cross-species amplification in Prunus. Theoretical and Applied Genetics. 99: 65-72. Dupanloup, I., Schneider, S. and Excoffier, L. (2002) A simulated annealing approach to define the genetic structure of populations. Molecular Ecology. 11 (12): 2571-81. Excoffier, L. and Lischer, H. E. L. (2010) Arlequin suite ver 3.5: A new series of programs to perform population genetics analyses under Linux and Windows. Molecular Ecology Resources. 10: 564-567. 91

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臺灣刺柏的族群分析 The Analysis of Juniperus formosana Population

學生：謝承翰指導老師：江友中教授學號：B002010007

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一、動機全球暖化的議題日益受到重視，其對族群遺傳變動與遺傳多樣性影響的相關研究越來越多，例如：美國加州的橡樹種(Benjamin E. C. et al., 2008)和西澳洲的班庫山龍眼(Banksia prionotes)(Matthew C. F. et al., 2008)等物種均有相關研究。全球暖化對植物影響，除了造成植物種向高海拔遷移外，也使得族群分布面積大幅縮減。本研究物種台灣刺柏，擁有分別生長於高海拔及低海拔的族群，推測其間已產生遺傳變異，故本研究將分析其遺傳上的差異性，並使用生態棲位模型進行相關分析，分析在全球暖化影響下，族群遺傳變動與多樣性的喪失。台灣刺柏生長於海拔高度 2400 至 3400 公尺，依據蘇鴻傑(1978) 之植群分類，台灣刺柏主要跨越高山植群-亞寒帶-針闊葉灌木叢、森林-冷溫帶亞高山針葉樹林-冷杉林和森林-涼溫帶山地針葉樹林群系高山松林型等植群類型。然僅位於 200 至 1300 公尺的清水斷崖，也有台灣刺柏族群的分布，相對於高山分布的台灣刺柏族群，推測兩者間具有因適應性演化所產生的分歧存在。

二、議題背景全球暖化所導致的氣候變遷，影響了許多生物的永續生存。政府間氣候變化專門委員會（Intergovernmental Panel on Climate Change， 95

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IPCC）在 2007 年對全球氣候變遷的未來趨勢提出了幾點報告：2100 年全球平均氣溫將上升攝氏 1.1-6.4℃、海平面上升 18-59 公分；乾旱等天災強度增強，北極冰層在夏天可能全部溶解；北半球高緯度地區氣溫增加最多；冰雪覆蓋區縮小，熱浪頻傳(IPCC，2007)。全球暖化也可能影響降雨、氣壓等環境因子的變化，環境因子的改變都可能直接或間接影響物種的生長發育、生存數量及空間分布，甚至影響整個生態系組成跟功能，繼而使生物多樣性的維護與保存受到威脅(李玲玲，2005)。台灣海拔高度差異大，使得台灣的植物相呈現垂直分布。不同海拔高度所受到的風、坡向、雨量及濕度等環境因子影響不同，植物相也不同。物種為了適應不同環境而產生了差異，為適應輻射演化 (adaptive evolution)，形成物種多樣性。全球暖化將使得不同植物相生態系的環境因子產生改變，高海拔地區的溫度上升，可能迫使某些高山植物族群向更高海拔的地區遷移或是瀕臨滅絕。

三、問題與假說本研究為利用台灣刺柏族群的分布特性，使用多型性微衛星體基因座分子技術，評估族群動態並結合生態棲位模型(ecological niche 96

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modeling)，推測於全球氣候變遷下對於此高山植物之影響為何，故本研究之探討方向為： (一) 篩選出台灣刺柏之多型性微衛星體基因座。 (二) 高山樹木物種台灣刺柏族群與在低海拔族群的差異。 (三) 台灣刺柏在過往、現在與未來的族群動態推估。 (四) 台灣刺柏在未來的遺傳多樣性喪失推估。

四、研究策略 (一) 樣本採集本研究計畫採取南湖大山(3141 m)、合歡山(2965 m)、雪山(3170 m, 2877 m)以及清水斷崖(400 m)等不同海柏高度下的台灣刺柏族群共計 112 個植株進行分析。採集的樣本迅速帶回實驗室乾燥後進行後續步驟。 (二) DNA 萃取將乾燥後冷凍的樣本經由 CTAB 的步驟(Murray and Thompson, 1980)萃取出基因組 DNA。予以定量後放於-80 ℃冰箱保存以便後續實驗使用。 (三) 限制酶切割利用限制酶 Mse I 把基因組 DNA 切成小片段的序列 DNA，再使用 T4 連接酶將序列 DNA 連接至設計好的接合子(adapter)。 97

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(四) 聚合酶連鎖反應(PCR) 利用已接上接合子的 DNA 作為模版，加入固定比例的 H2O、10x buffer、dNTP 和 Taq DNA 聚合酶，並針對接合子設計的引子，利用所需反應條件進行聚合酶連鎖反應。 (五) 雜合反應及磁珠吸附將帶有生物素(biotin)的短片段重複序列探針與含有微衛星體序列的 DNA 進行雜合，使其能與磁珠結合。帶有生物素的探針 DNA 會與帶有抗生物素磁珠產生引力，之後再利用磁鐵吸附住有與 DNA 結合的磁珠，移除上清液，以便取得微衛星體 DNA。 (六) 微衛星體 DNA 擴增將取得的微衛星體 DNA 進行聚合酶連鎖反應擴增，再利用 1% agarose 經電泳分離後，選出目標片段後使用 Gene-SpinTM DNA Purification Kit-V2 (Protech Technology,Taiwan )純化取得高濃度的微衛星體 DNA。 (七) TA cloning 將純化後的 DNA 接合至 RBC TA Cloning (RBC Bioscience,Taiwan) 載體上進行選殖，轉入至大腸桿菌勝任細胞(E. coli, DH5α) 中培養於 37℃，16 小時。挑選具有正確轉殖片段質體的菌株進行大量增殖。利用 RBC Real Genomics HiYieldTM Plasmid Mini Kit (RBC Bioscience,Taiwan)純化質體 DNA，保存於-20℃冰箱中，作為之後定 98

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序使用。 (八) 引子設計及 PCR 擴增根據定序出來的結果，設計出多組的引子，對部分樣本進行擴增，篩選出具有較高專一性之引子，針對所有樣本利用此引子再次進行 PCR 擴增。 (九) 膠體電泳及分析利用聚丙烯醯胺膠體電泳分析，以 EtBr 進行染色，於 UV 光下拍照紀錄，並以 Quantity One version 4.62(Bio-Rad Laboratories, Hercules, California, USA)，計算出所出現的條帶的片段大小，並進行人工判讀。 (十) 資料判讀與分析利用 GenAlEx v6.5 (Peakall and Smouse, 2012)進行族群遺傳多樣性分析，計算等位基因數(N)、有效等位基因(Ne)和等位基因頻率(Pi)，並計算異型合子觀測值(observed heterozygosity, Ho) 和異型合子期望值(expected heterozygosity, He)等數據，進行哈溫檢測；遺傳結構方面，利用 Arlequin v3.5.1.3 (Excoffier and Lischer, 2010)進行 F-statistics 與 Analysis of Molecular Variance (AMOVA)分析，檢測不同生長地區的族群遺傳分化；分派檢驗(assignment test)方面，以 SAMOVA v.1.0 (Dupanloup et al., 2002)試算出族群遺傳變異程度，推估出適合的分群 99

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分析，及利用 STRUCTURE 2.3.4(Hubisz et al., 2009)，藉由 Markov chain Monte Carlo (MCMC)運算等為基因頻率，再次進行分群分析；以 MaxEnt 進行台灣刺柏族群分布預測，MaxEnt v3.3.2 (Phillips et al., 2010)是以最大熵值法(maximum entrop)( Phillips et al., 2006)進行物種棲位預測。輸入 WorldClim – Global Climate Data 跟 CCAFS GCM Data Portal 中的 19 種氣候環境因子資訊，結合物種生長地理資訊，以 AUC 值於 0.7-0.9 間有較高的判別率(Swets, 1988)。

五、預期結果 (一) 篩選出台灣刺柏之多型性微衛星體基因座。 (二) 高山樹木物種台灣刺柏族群與在低海拔族群的差異。 (三) 台灣刺柏在過往、現在與未來的族群動態推估。 (四) 台灣刺柏在未來的遺傳多樣性喪失推估。

六、目前進度執行上的困難與解決之道問題與困難： 1. 植物葉片 DNA 定量操作方法。 2. PCR 反應物比例以及反應的條件設定。 3. 電泳所需的聚丙烯醯胺膠體的配製。 4. DNA 接合載體及轉入至勝任細胞的操作方法。 100

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5. 分子序列資料整理、排列與分析。 6. 分子序列分析所使用的程式之操作。 7. 計畫內文撰寫。解決方法：接觸新實驗前先了解其原理及目的，請學長姐帶一次實驗步驟，遇到問題先自行思考解決，不確定就馬上詢問。資料分析、成果撰寫可以先參考學長姐的研究記錄，分析遇到問題時請學長姐指教。

七、參考文獻王之仰等人 (2013) 第十二章微衛星體 DNA 分子檢測技術。分子檢測技術實習。77 頁。 Benjamin E. C., Katharine H., Sean M., Richard M., Charles A. K. and David D. A. (2008) Climate Change and the Future of California's Endemic Flora, PLoS ONE 3(6): e2502. Bennett, P. (2000) Demystified : microsatellites, Molecular Pathology, 53: 177-183. Bruce A., Alexander J., Julian L., Martin R., Keith R., and Peter W. (1998) Molecular Biology of the Cell (4th ed.), Garland Science, New York. Core W. T., Pachauri R. K. and Reisinger A. (editors) (2007) Climate Change 2007: Synthesis Report (AR4), IPCC, Geneva, Switzerland. Cozzolino S., Caffasso D., Pellegrino G., Musacchio A. and Widmer A. (2003) Molecularevolution of a plastid tandem repeat locus in an Orchid lineage. J., Molecular Evolution, 57: 41-49. Graur D. and Wen-Hsiung L. (2000) Fundamentals of Molecular Evolution, Sinauer Associates, 392-394. Dohms K. M. and Burg T. M. (2013) Molecular Markers Reveal Limited 101

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Population Genetic Structure in a North American Corvid, Clark’s Nutcracker (Nucifraga columbiana), PLoS ONE 8(11): e79621. Doyle K. (editor) (1996) The Source for Discovery : protocols and application guide (3rd ed.), Progema Corporation, Madison. Goldstein D. B. and Schlotterer C., (editors) (1999) Microsatellites : Evolution and Applications, Oxford University Press, USA. Gupta P. K., Balyan H. S., Sharma P. C. and Ramesh B. (1996) Microsatellitesin plants, a new class of molecular marker, Current Science, 70: 45-54. Matthew C. F., Aaron D. G., Nathan J. S. and Robert R. D. (2008) Climate change, plant migration, and range collapse in a global biodiversity hotspot: the Banksia (Proteaceae) of Western Australia, Global Change Biology (6th ed.), 14: 1337-1352. Neil J., Helen O., Howard T. and zolda Pašakinskienë (2009) Markers and mapping revisited: finding your gene, New Phytologist(4th ed.), 183: 935-966. Sambrook J. and Russell D. W. (2006) Condensed Protocols from Molecular Cloning: A Laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.

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Tryptophan 對水稻汞逆境 ROS 生成之影響 The effect of tryptophan to generate ROS of mercury in rice

學生：楊伊雯指導老師：陳韻安教授學號：B002010044

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一、動機現代社會工業高度發展及土地的過度開發，使大部分的土地都受到重金屬的污染，而重金屬無法在自然界中自然分解，反而會經由食物鏈的傳遞及生物放大作用而累積於生物體中，對生物體造成危害。例如，1956 年日本九州熊本縣南端的水俁灣附近，因上游工廠排放含汞的工業廢水至海灣中，而造成對人體中樞神經系統有害的水俁病。對植物而言，汞污染屬於非生物因子的逆境，汞會造成植物體內產生大量的自由基，而自由基會引發脂質過氧化（Lipid peroxidation）造成蛋白質、脂質、DNA 的降解，而影響到植物的生理調節，而在植物的次級代謝物中，色胺酸及其衍生物在植物的抗氧化防禦機制佔有十分重要的地位，故希望能探討色胺酸對於汞逆境使水稻產生之 ROS 的影響。

二、議題背景汞會在植物體內累積，使植物生理調節發生異常並產生顯著傷害（Patra and Sharma，2000；Wang and Greger，2004；Ortega-Villasante et al.，2005； Israr and Sahi，2006；Zhou et al.，2007）。自然界中以遊離態（Hg0）、氧化態（Hg2+）或是甲基汞（methyl-Hg）等有機化合物形態存在，而主要以硫化汞（HgS）的形式蘊藏在礦物中；土壤中則多以 Hg2+形態存在也是植物汞逆境的主要形態（Han et al.，2006）。汞對植物造成毒害的原因第一為汞與蛋白質上的硫氫基（sulfhydryl groups, -SH）具高度親和力，使得 Hg2+與水通道的蛋白質結合而抑制其功能，造成植物氣孔關閉，阻礙水分輸導與蒸散作用（Preston et al.，1993；Zhang and Tyerman，1999），而 Hg2+還會抑制穀胱甘還原酶（glutathione reductase）的活性使穀胱甘（glutathione，GSH）過度消耗而引發自由基增加（Schutzendubel and Polle，2002），第二個原因與哈伯-衛斯反應（Haber–Weiss reaction）所產生的活性氧分子有關（Ernst，1996），經由非酵素途徑引發之自由基增加而造成細胞膜脂質過氧化（Ali et al.，2000；Cho and Park，2000)。因為汞逆境會造成植物細胞中自由基增加且引發傷害，故自由基的產生可作為汞毒害的指標（Shiyab et al.，2009）。植物面對汞逆境造成傷害之緩解方式分為兩類，一類為藉由蛋白質或化合物與汞直接結合以降低其毒害程度；如植物螯合素（phytochelatin）及其前驅物利用汞離子與硫氫基的高度親和特性將其與外界隔絕，而達到緩解汞毒性的作用（Zenk，1996）。另一類則是以植物自身的抗氧化防禦系統（antioxidative defense system）來降低汞逆境所誘導的自由基所造成的傷害；而這種由自由基所引發的生理負面影響亦稱為氧化逆境（oxidative stress）。在植物抗氧化防禦機制中，色胺酸路徑會合成五羥色胺 ( serotonin )、生長素 ( auxin )、褪黑色素（melatonin）等，生長素作為細胞中的訊息傳遞者或是基因的調節者（Muller，2000）；而血清素則是植物細胞利用光合作用產生之 NADPH 以及色胺酸而合成的；褪黑激素具有清除 reactive oxygen species （ROS）和 reactive nitrogen species（RNS），包含 hydroxyl radical （OH-）、 hydrogen peroxide（H2O2）、nitric oxide（NO-）和 peroxynitrite anion（ONOO-） 105

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等（Reiter，2003）。推測加入汞會對水稻產生氧化壓力，故預期水稻生長會受抑制，除了反映在生長情形之外，汞也會誘導更多 ROS 及抗氧化相關酵素 superoxide dismutase（SOD）、peroxidase （POD）、lipoxygenases（LOX）的生成，而脯胺酸（Proline）的含量也會跟著增加；而 Tryptophan 的加入會減緩汞對水稻的氧化壓力，故在 ROS、抗氧化相關酵素的表現及脯胺酸的累積量應該會有較只經汞處理的水稻下降的趨勢。

三、研究方法  水稻處理取出 15 g 水稻種子，置於 2.5 %消毒水中消毒，再利用 Shaker 以 50 rpm 搖 15 分鐘，最後以蒸餾水清洗 5 次。

 根莖長測量將水稻種子處理過後再將之放在 37℃培養 2 天，後移至內置直徑 9 cm 濾紙之培養皿（每盆 15 株已萌芽水稻幼苗），加入 10 ml 蒸餾水培養 2 天後，將蒸餾水倒吊後，再加入 10 ml 分別含 Trp（ 0、25、50、100（mM））及 Trp （ 0、25、50、100（μm）） m 於 25（μm）Hg 之濃度溶液，培育 24 hr 後測量根莖長度。

 蛋白質萃取植株移出以水漂洗，再以剪刀分離其根部與莖部，拭去多餘水分後秤重，以液態氮分別研磨；加入 500 μL 之萃取液（50 mM potassium phosphate buffer, pH 6.0）均質化後，以 13,000 g 於 4℃離心 20 分鐘，取其上清液以測量蛋白質濃度後置於 -20℃下保存。

 蛋白質定量 Bio-Rad DC Protein Assay 取已處理完成之蛋白質樣品 2 μl 至 1.5 ml 微量離心管，加入 100 μl A 試劑（Alkaline copper tartrate solution)，劇烈震盪，再加入 800 μl B 試劑，快速劇烈的震盪後，移入 1 ml 比色管，15 分鐘後，以 750 nm 波長測吸光值

 SDS-PAGE 蛋白質電泳蛋白質電泳將測定濃度之蛋白質樣本分別以（Shoot：25μg、Root：25μg）進行 SDS-PAGE（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis），在以（50μg）進行 native-PAGE，集焦膠體濃度為 5%，分離膠體為 10%。在 4℃ 106

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下集焦段以 10 mA，分離段以 15 mA 進行電泳；完成後以下列方法分別對總蛋白質、 SOD、 POD 及 LOX 進行染色及活性檢測（Abramoff et al., 2004）。

SDS-PAGE 染色改良 Reisner et al.（1975）之方法，以 0.25%（W/V）Coomassie brilliant blue G-250 染膠 20 分鐘，再以退染劑退染 6 小時後攝影記錄結果（Chang, 1996）。

Total SOD 酵素活性染以 Beauchamp & Fridovich（1971）之方法，使用 0.1% Nitro blue tetrazolium chloride（NBT）浸泡膠片且避光振盪 15 分鐘，再以 30 mL potassium phosphate buffer (pH 6.0)加入 100 μL N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine （TEMED）及 168 μL riboflavin 預先混合後避光振盪反應 15 分鐘，再以光照反應顯影並攝影記錄結果。

H202 處理（MnSOD 活性表現）以 Beauchamp & Fridovich（1971）之方法，以 8 μm H2O2 浸泡膠片避光震盪 15 分鐘後，使用 0.1% Nitro blue tetrazolium chloride（NBT）浸泡膠片且避光振盪 15 分鐘，再以 30 mL potassium phosphate buffer（pH 6.0）加入 100 μL N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine（TEMED）及 168 μL riboflavin 預先混合後避光振盪反應 15 分鐘，再以光照反應顯影並攝影記錄結果。

KCN 處理（抑制 CuZnSOD 活性）以 Beauchamp & Fridovich（1971）之方法，使用 0.1% Nitro blue tetrazolium chloride（NBT）浸泡膠片且避光振盪 15 分鐘後，再以 30 mL potassium phosphate buffer（pH 6.0）加入 100 μL N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine （TEMED）及 168 μL riboflavin 和 120 μL 8 mM KCN 預先混合後避光振盪反應 15 分鐘，再以光照反應顯影並攝影記錄結果。

POD 酵素活性染改良 Wayne & Diaz（1986）之方法，將膠片以含 0.09%（W/V）之 3',3'diaminobenzendine（DAB）及 0.035% H2O2 之 50 mL potassium phosphate buffer （pH 6.0）避光振盪 20 分鐘後攝影記錄結果。

四、結果 1. 水稻跟莖長測量：經過重金屬及 Trp 的處理後進行莖及根長的測量(圖一、二)，而 Trp 及 hg 對根的影響較對莖來的大。表中數字表示加入的 Trp 濃度，分別為 0、25、50、100 μm，而加入汞的濃度皆是 25 μm。 107

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圖一、水稻莖長度

圖二、水稻根長度

2.5

長度（cm）

5 1.5 trp

hg 0.5 0

4 3

trp

1 0

100

Trp濃度（μm）

100

Trp濃度（μm）

SDS-PAGE 電泳結果

0 0 M

25 0 Shoot

25 100

0 100

0 0

25 0

25 100

0 100

Hg(μm) Trp(μm)

Root

10 15 20 25 37 50

100 150 250kd

108

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3. SOD 酵素活性染水稻莖部部分 0 100

25 100

25 0

0 0

25 0

25 100

0 100

25 0

25 100

0 100

Hg(μm) Trp(μm)

H202 處理

水稻莖部部分 0 100

25 100

25 0

0 0

Hg(μm) Trp(μm)

109

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KCN 處理水稻莖部部分 0 100

25 100

25 0

0 0

25 0

25 100

0 100

Hg(μm) Trp(μm)

6. POD 酵素活性染 7. 水稻莖部部分 0 100

25 100

25 0

0 0

25 0

25 100

0 100

Hg(μm) Trp(μm)

五、預期困難與未來展望在電泳結果中，並無明顯觀察到汞逆境造成之抗氧化酵素表現的提升，推測可能為放置於汞逆境中時間較長，故使植物產生適應性而無法明顯觀察到抗氧化酵素表現的上升，之後將會縮短水稻至於汞逆境中的時間，藉此觀察短時間內汞逆境是否會造成水稻抗氧化酵素表現的上升，並與加入 Tryptophan 後型情加以比較，未來也會測定汞逆境下誘導的脯胺酸含量之累積、觀察組織上超 110

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氧陰離子跟過氧化氫自由基分布情形、細胞膜受損及脂質過氧化現象以及 ROS 產生情形，以便確認汞逆境所誘導之氧化壓力在 Tryptophan 的加入後是否有減緩的情形。

六、參考文獻 1. Han, F. X., Su, Y., Monts, D. L., Waggoner, C. A. & Plodinec, M. J. 2006. Binding, distribution, and plant uptake of mercury in a soil from Oak Ridge, Tennessee, USA. Sci Total Environ, 368, 753-768. 2. Patra, M. & Sharma, A. 2000. Mercury toxicity in plants. THE BOTANICAL REVIEW, 66, 379-422. 3. Ortega-Villasante, C., Rellan-Alvarez, R., Del Campo, F. F., Carpena-Ruiz, R. O. & Hernandez, L. E. 2005. Cellular damage induced by cadmium and mercury in Medicago sativa. J Exp Bot, 56, 2239-2251. 4. Wang, Y. & Greger, M. 2004. Clonal differences in mercury tolerance, accumulation, and distribution in willow. J Environ Qual, 33, 1779-1785. 5. Zhou, Z. S., Huang, S. Q., Guo, K., Mehta, S. K., Zhang, P. C. & Yang, Z. M. 2007. Metabolic adaptations to mercury-induced oxidative stress in roots of Medicago sativa L. J Inorg Biochem, 101, 1-9. 6. Israr, M. & Sahi, S. V. 2006. Antioxidative responses to mercury in the cell cultures of Sesbania drummondii. Plant Physiol Biochem, 44, 590-595. 7. Shiyab, S., Chen, J., Han, F. X., Monts, D. L., Matta, F. B., Gu, M., Su, Y. & Masad, M. A. 2009. Mercury-induced oxidative stress in Indian mustard (Brassica juncea L.). Environ Toxicol, 24, 462-471. 8. Godbold, D. L. & Huttermann, A. 1986. The uptake and toxicity of mercury and lead to spruce seedlings. Water Air Soil Pollut, 31. 9. Zhang, W. H. & Tyerman, S. D. 1999. Inhibition of water channels by HgCl2 in intact wheat root cells. Plant Physiol, 120, 849-858. 10. Cho, U. & Park, J. 2000. Mercury-induced oxidative stress in tomato seedlings. Plant Sci, 156, 1-9. 11. Preston, G. M., Jung, J. S., Guggino, W. B. & Agre, P. 1993. The mercurysensitive residue at cysteine 189 in the CHIP28 water channel. J Biol Chem, 268, 17-20. 12. Schutzendubel, A. & Polle, A. 2002. Plant responses to abiotic stresses: heavy metal-induced oxidative stress and protection by mycorrhization. J Exp Bot, 53, 1351-1365. 13. Ali, M. B., Vajpayee, P., Tripathi, R. D., Rai, U. N., Kumar, A., Singh, N., Behl, H. M. & Singh, S. P. 2000. Mercury bioaccumulation induces oxidative stress and toxicity to submerged macrophyte Potamogeton crispus L. Bull Environ Contam Toxicol, 65, 573-582. 14. Zenk, M. H. 1996. Heavy metal detoxification in higher plants--a review. Gene, 179, 21-30. 15. Yun-An Chena, Wen-Chang Chi, Tsai-Lien Huang, Chung-Yi Lin, Thi Thuy Quynh Nguyeh, Yu-Chywan Hsiung, Li-Chiao Chia, Hao-Jen Huang . 2012. Mercury-induced biochemical and proteomic changes in rice roots. Plant physiology and biochemistry, 55, 23-32. 16. Reiter RJ, Tan DX, Manchester LC, Lopez-Burillo S, Sainz RM, Mayo JC (2003) Melatonin: detoxification of oxygen and nitrogen-based toxic reactants. Adv Exp 111

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Med Biol ,527:539-548 17. Muller A, Weiler EW (2000) Indolic constituents and indole-3-acetic acid biosynthesis in the wild-type and a tryptophan auxotroph mutant of Arabidopsis thaliana. Planta, 211:855-863

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Tryptophan 對水稻汞逆境之影響 The effect of tryptophan to mercury stress in rice

學生：張淨涵指導老師：陳韻安教授學號：B002010037

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 動機 (motivation) 在現今的日常生活中，汞 ( mercury，Hg )的運用已相當普遍，如日光燈、含汞電池、溫度計等，然對於含汞物品的回收及工廠對排放汞的處理則可能因為處理不當使其排放到自然環境中造成汙染，被植物根部吸收後經由生態鏈累積於生物體中。汞無法在生物體中被代謝或分解排出，並且會累積在生物體中造成生理運作的損壞，如甲基汞 ( methyl mercury ) 經由人類對於食物的攝取而進入體內，並且被腸胃道吸收，使神經系統損傷，造成神經性病變( Crump, 2000 )。本研究比較經同濃度的汞 ( 25 ( μM ) )及不同濃度的色胺酸 ( tryptophan ) ( 0、25、50、100 ( μM ) )處理後 24 小時的水稻生長情形及水稻經汞處理後的超氧化物歧化酶 ( superoxide dismutase， SOD )、過氧化酶 (guaiacol peroxidase，POD )等抗氧化酵素在蛋白質電泳下的活性表現，藉以了解色胺酸路徑與汞逆境之間在水稻生理的防禦與修復機制的關聯性。

 議題背景近年來重金屬汞已成為重要的土地污染源之一 ( Pilon-Smits and Pilon, 2000 )，對於植物而言，汞屬於毒害元素，累積在植物體中

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( Bo Meng, 2010 )並干擾植物生理功能的運作而對植株產生損害 ( Manomita Patra, 2000; Patra and Sharma, 2000;Zhou et al., 2007; Weng and Greger, 2004 )。對於植物根莖生長的賀爾蒙調節而言， 3-吲哚乙酸 ( indole-3acetic acid，IAA )及吉貝素 ( gibberellin，GA )均可在一定濃度增加下有效提高莖的生長，兩者相較下，IAA 在根部的濃度對於其生長的調節佔有較主導的地位 ( Eiichi Tanimoto, 2005 )，IAA 僅在特定濃度下會增加根部的生長，而在特定低濃度下則對於根的生長有抑制效果，此現象在阿拉伯芥 ( Arabidopsis ) (Kim et al., 2001 )、萵苣 ( Lactuca sativa ) ( Tanimoto and Watanabe, 1986 )均有發現。在植物體中 IAA 濃度的調節機制主要有三種：前驅物 Tryptophan 的含量、運輸時進出細胞的效率、IAA 活化與否( Eiichi Tanimoto, 2005 )。當水稻植株受病原感染時，鄰氨基苯甲酸合酶 ( anthranilate synthase，AS )的表現會增加，而使植株體中的鄰胺基苯甲酸 ( anthranilate )、吲哚 ( indole )、Tryptophan 濃度提高，血清素 ( serotonin )會在受感染的葉片累積 (Atsushi Ishihara et al., 2008 )，以進行物理上的防禦，藉由此現象當水稻受到物理或化學性損傷時， Tryptophan pathway 亦會受到活化以對植株本身進行修復及防禦。

 問題與假說 116

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1. 汞累積在植株體中會引發產生活性氧自由基 ( reactive oxygen species，ROS ) ( Cao et al., 2004 )，使脂質、蛋白質、DNA 等降解 ( Hendry, 1993 )，故而植物體會合成抗氧化酵素以因應活性氧自由基造成的傷害，而色胺酸參與可能合成抗氧化酵素。 2. 汞逆境對植物體造成的傷害可能引響到植物生長相關激素的合成，並且色胺酸為此類激素的合成前驅物之一。

 研究策略 1. 根莖長測量：將水稻種子處理過後再將之放在 37℃培養 2 天，後移至內置直徑 9 cm 濾紙之培養皿( 每盆 15 株已萌芽水稻幼苗 )，加入 10 ml 蒸餾水並至於暗室以 37℃培養兩天後，將培養皿內的水吸乾，再加入 10 ml 分別含 Trp ( 0、25、50、100 (μM) ) 及 Trp ( 0、25、50、 100 (μM ) ) 於 25 (μM ) Hg 之濃度溶液，培養 24 hr 後測量根莖長度。 2. SDS-PAGE 蛋白質電泳：將膠片以蒸餾水沖洗三次後泡在 Coomassie brilliant blue R-250 stain solution，以 shaker 搖 30 分鐘泡在 destain 中退染 4-6 h(或置於冰箱隔日觀察結果)

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3. SOD 活性電泳處理：以蒸餾水將膠片沖洗三次後，以 15 mL 0.1 % Nitro blue tetrazolium chloride ( NBT )浸泡膠片且於 4℃環境中避光振盪 15 分鐘，以蒸餾水將膠片沖洗三次，再以 30 mL potassium phosphate buffer ( pH 6.0 ) 加入 100 μL N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine ( TEMED )及 168 μL riboflavin 混合後避光振盪反應 15 分鐘後，置於光照下使其顯影。另，抑制 Cu/Zn-SOD 活性處理為先以 SOD 染色法處理後再加入 120μL KCN，混合後避光震盪反應 15 分鐘再置於光照下使其顯影；抑制 Cu/Zn-SOD 與 Fe-SOD 活性處理則預先將膠片浸泡於 8 mM H2O2 中 30 分鐘再以 SOD 方法染色。 4. POD 活性電泳處理：將膠面浸泡於 10 ml 0.005 % DAB、50μL H2O2 及 40 ml potassium phosphate buffer ( pH 5.8 )，預先混合均勻後避光震盪 20 分鐘後，置於光照下顯影。

 預期結果經汞處理的水稻會產生活性氧化物質而影響到水稻的生理調節運作，使其活化抗逆境酵素的合成路徑，故而受汞處理的水稻蛋白質表現相對較高，且可發現抗氧化酵素 SOD 及 POD 的含量增加。並

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且植物受汞逆境時加入色胺酸可減緩汞抑制水稻生長的狀況，使抗氧化酵素及其它相關蛋白質的表現量下降。

 目前進度根莖長測量實驗：下圖一及圖二為水稻經 Trp ( 0、25、50、100 (μM) ) 及 Trp ( 0、 25、50、100 ( μM ) ) 於 25 ( μM ) Hg 之濃度溶液處理後所觀察到的結果，可發現於經汞處理的水稻根部依照色胺酸濃度增加而增長，而莖部則無此趨勢，然可觀察到色胺酸減緩汞抑制的現象。

圖一、水稻根長度

圖二、水稻莖長度

8 6 4 2

trp hg

2.5 2 1.5 1 0.5 0

trp hg

蛋白質電泳： 1. SDS-PAGE 蛋白質電泳：下圖三為 SDS-PAGE 蛋白質電泳結果，根部處理 25 μm Hg 相較其他處理方法的水稻被誘導出更多的水溶性蛋白，莖部則無明顯差 119

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異。

0 0 M

25 0

25 100

0 100

0 0

25 0

Shoot

25 100

0 100

Hg(μm) Trp(μm)

Root

10 15 20 25 37 50

100 150 250kd

圖三、SDS-PAGE 蛋白質電泳結果 2. SOD 活性電泳：圖四為水稻莖部經汞處理 24 小時後的 SOD 活性電泳結果，無法觀察到明顯差異。 Hg(μm)

Hg(μm)

Trp(μm)

100

Trp(μm)

SOD-a

120

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SOD-b SOD-c

圖四、SOD 活性電泳結果

3. 抑制 Cu/Zn-SOD 活性處理：圖五為水稻莖部經汞處理 24 小時後的抑制 Cu/Zn-SOD 活性電泳結果，無觀察到明顯差異。

Hg(μm)

Trp(μm)

100

Trp(μm)

SOD-a

圖五、抑制 Cu/Zn-SOD 活性處理結果 4. 抑制 Cu/Zn-SOD 與 Fe-SOD 活性處理：圖六為水稻莖部經汞處理 24 小時後的抑制 Cu/Zn-SOD 活性與 FeSOD 活性電泳結果，無觀察到明顯差異。 Hg(μm)

Hg(μm)

Trp(μm)

100

Trp(μm)

SOD-a

SOD-b

121

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圖六、抑制 Cu/Zn-SOD 與 Fe-SOD 活性處理結果 5. POD 活性電泳：圖七為水稻莖部經汞處理 24 小時後的 POD 電泳結果，可從 PODa 中看到以 100 μm 色胺酸處理後的條帶較不明顯，顯示 POD 較不活躍。

Hg(μm)

Trp(μm)

100

Trp(μm)

POD-a

POD-b POD-c

-a POD-d

圖七、POD 活性電泳結果

 執行上的困難與解決之道水稻根莖長測量實驗中，於莖部色胺酸對汞抑制減緩的效果並不明顯，可縮短汞處理的時間再做觀察，並視比較後的結果對於實驗方法及材料做修改。 SDS-PAGE 蛋白質電泳由於萃取的根部蛋白質濃度太低，需要準備的材料與萃取蛋白質的操作技術須更多、更加熟練才能達成，故而在未來的實驗會以水稻莖部為觀察對象。 122

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SOD 及 POD 活性電泳結果與預期中不符，可能為水稻對汞逆境產生適應性( Manomita Patra, 2000 )，可於下次實驗將汞處理的時間所逐漸縮短，觀察不同時間處理後的電泳活性變化是否與預期中的結果吻合。  參考文獻 1. Kenny S. Crump, Cynthia Van Landingham, Conrad Shamlaye, Christopher Cox, Phillip W. Davidson, Gary J. Myers, and Thomas W Clarkson (2000). Benchmark Concentrations for Methylmercury Obtained from the Seychelles Child Development Study. Environmental Health Perspectives. 108:257-262. 2. Eiichi Tanimoto (2005). Regulation of Root Growth by Plant Hormones—Roles for Auxin and Gibberellin. Critical Reviews in Plant Sciences. 24:249–265. 3. Hiroshi Maeda and Natalia Dudareva (2012). The Shikimate Pathway and Aromatic Amino Acid Biosynthesis in Plants. Annual Review of Plant Biology. 63:73–105. Atsushi Ishihara1, Yumi Hashimoto1, Chihiro Tanaka, Joseph G. Dubouzet, Takahito Nakao1, Fumio Matsuda, Takaaki Nishioka1, Hisashi Miyagawa1, and Kyo Wakasa (2008). The tryptophan pathway is involved in the defense responses of rice against pathogenic infection via serotonin production. The Plant Journal. 54: 481–495.國立中山大

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具離體抗發炎活性之珊瑚化合物在異位性皮膚炎上的治療作用

The therapeutic effects of in vitro antiinflammatory marine-derived compound on atopic dermatitis

學生：黃齡誼指導老師：溫志宏教授學號：B002010003

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摘要: 異位性皮膚炎(atopic dermatitis; AD)又稱為異位性溼疹(atopic eczema)，是一種慢性、反覆發作的發炎性皮膚疾病，臨床症狀為皮膚搔癢(pruritus)，同時經常伴隨紅腫(erythema)、水泡、結痂及皮膚乾燥。目前仍不清楚異位性皮膚炎的詳細發病原因。據生技中心調查統計，全球異位性皮膚炎的市場商機達 33 至 55 億美元。現今，治療異位性皮膚炎的方法，通常是給予止癢的抗組織胺藥口服藥，若有感染問題則併用抗生素。而急性嚴重發作的病狀則可以口服類固醇以減緩病徵，但長期服用會產生依賴性，且副作用大。由於現在用於治異位性皮膚炎的藥物尚未確定，因此迫切需要有效且安全的治療藥物開發。國立中山大學海洋生物科技暨資源學系的研究團隊，近年來發現了許多具有抗發炎活性的海洋天然物，包括治療發炎性疾病、脊隨損傷、神經退化性疾病、美白活性等，成果相當豐碩。因此，在本次專題研究計畫中，我們將 1% DNCB 及 0.2% DNCB 定期敷於老鼠背上，以建立異位性皮膚炎的動物模式，嘗試利用具離體抗發炎活性之珊瑚化合物對異位型皮膚炎動物模式進行測試，以組織切片觀察其病理型態及治療效果，也利用免疫螢光染色觀察其治療機轉，並檢測體內 IgE 的含量，期望能尋找更安全的新藥來治療異位性皮膚炎，並同時釐清可能之治療機轉。關鍵字:藥物開發（Drugs discovery）、發炎（Inflammation）、皮膚學（Dermatology）、組織病理學（histopathology）、動物疾病模式（Animal disease model）（一）研究動機與研究問題：１、建立異位性皮膚炎動物模式。２、利用異位性皮膚炎動物模式評估抗發炎活性之珊瑚化合物治療作用。３、評估可能之治療機轉及尋找疾病標的。（二）文獻回顧與探討：異位性皮膚炎概況異位性皮膚炎(atopic dermatitis; AD)是一種慢性且具復發性、搔癢和發炎的皮膚疾病(Leung, et al., 2004)。導致此疾病有多種因素，如皮膚屏障被破壞(Elias & Schmuth, 2009)、過敏性反應(Maintz & Novak, 2011)和感覺神經異常(Ikoma, 2009)。患者會表現出嚴重的皮疹、水腫、出血和脫屑等皮膚損傷(Leung & Bieber, 2003)。許多研究指出AD是系統性疾病的皮膚表現，也會引起過敏性鼻炎、食物過敏以及氣喘(Leung & Bieber, 2003; Leung, Nicklas et al., 2004)。根據統計，在工業國家約有15-20 %的兒童和1-3%的成人會有異位性皮膚炎的困擾，且發生率還在逐年升高(Flohr & Mann, 2013)。與AD有關的病理變化包括表皮增厚以及肥大細胞和嗜酸性細胞等炎症細胞的滲入(Imokawa et al., 1991)。儘管沒有生命威脅， AD仍需要早期的治療及管理以防止其復發(Cho and Cho, 2013)。現今治療AD方法為給予抗組織胺藥物或塗抹類固醇類藥物。類固醇藥膏具有消炎、止癢及血管收縮作用，即係俗稱「美國仙丹」的藥物，為治療異位性皮膚炎的主要外用藥， 125

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急性發作時可以先用強效的類固醇藥膏7-10天，再換成弱效的類固醇藥膏繼續使用數週，直至病情穩定，但會造成皮膚萎縮、皮膚色素脫落、青春痘等副作用。目前市面上已有多項針對異位性皮膚炎的產品，其中由美國FDA核准針對治療異位性皮膚炎藥物之免疫調節劑 pimecrolimus (Novartis AG) 與 tacrolimus (AstellasPharma)，雖然是非類固醇藥物，但在2005年已被列於black box清單上；需要在包裝盒上註明長期使用有致癌的風險。因此極需開發出具有抗發炎且兼具安全性的改善異位性皮膚炎疾病的藥物。發炎反應與異位性皮膚之關係發炎可能經由很多種刺激包括物理傷害所引起，像是紫外線的照射、微生物入侵，以及免疫反應等，而典型的發炎反應有紅、熱、腫、痛等主要症狀 (Gautam & Jachak, 2009)。有過敏性皮膚病患者會因為搔抓造成機械性傷害，同時加劇發炎反應時期刺激巨嗜細胞或組織單核球釋放更多前驅發炎相關的細胞激素(proinflammatory cytokine)如介白素 1 (interleukin 1, IL-1)與腫瘤壞死因子 (tumor necrosis factor, TNF)等，造成嚴重的傷害(Klein & Brailly, 1995)。異位性皮膚炎的重要症狀，如皮膚搔癢的原因尚不清楚，肥大細胞釋放出組織胺 (histamine)並非唯一因素，且抗組織胺對異位性皮膚炎的抑制效果並不好；外用類固醇及外用免疫製劑(calcineurin inhibitors)則有較好的止癢效果，由此可顯示出與發炎相關的細胞或免疫細胞在異位性皮膚炎上扮演重要之角色。巨噬細胞在異位性皮膚上之角色針對發炎反應相關研究中，實驗細胞株多以巨噬細胞(macrophage)為主，其中 RAW264.7 為一老鼠巨噬細胞株,它常被用來評估藥物或天然物之抗發炎效果 (Wang et al., 2006; Jean et al., 2008)。此外，巨噬細胞是重要的免疫細胞，參與發炎反應和傷口癒合。在皮膚上表現各種免疫功能，包括吞噬作用 (phagocytosis)和抗原傳遞(antigen presentation)(Valledor et al., 2010)。此外，巨噬細胞可產生許多細胞因子(cytokines)和趨化因子(chemokines)以促進微血管的新生、膠原蛋白合成和纖維化反應(Mirza et al., 2009)。巨嗜細胞亦會產生大量誘發型一氧化氮合成酶(inducible nirtric oxide synthase,iNOS)，會大量製造 NO，會造成組織的損傷，因此可作為嚴重發炎相關指標(Murad et al., 2007)。目前最常見的細胞株為 RAW264.7，來自 BABL/c 品系小鼠腹部抽取之巨噬細胞，可產生 IL-1、IL-6、TNF-α、TNF-γ、NO、CP-10、PGE2 等細胞激素與化學激素 (chemokines)，並具有吞噬能力(phagocytosis)(Yagnik et al., 2000)。海洋天然物在藥物開發上之重要性海洋占全球地表近 70％的面積，體積佔可容納生物棲息空間的 98％，具有高度的生物歧異度(Saludes et al., 2009)，截至目前可能有三分之一到三分之二的海洋物種是未被記載的，物種越多表示能被利用的活性物質相對可觀，可見海 126

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洋資源之開發潛能。而海洋和陸地一樣有許多種生態系，如在深海這種嚴苛的生存環境之下，無脊椎生物無殼或刺等物理防禦，因此演化出具有生物活性之二次代謝物，利用化學機制達到增強攻擊裂物、抵禦天敵等適應環境的能力。海洋的眾多生態系中，如珊瑚礁、海床等生物的歧異度都遠比熱帶雨林來的高；對珊瑚來說，牠需要利用一些化學機制來保衛自己，因此牠們演化出可以合成或從海洋微生物中獲取毒性化合物，但這些化合物一旦釋放至海洋將很快就被稀釋，而且變成沒有效用。現今已有許多化合物開發自海洋，如加勒比地區的軟珊瑚 Pseudopterogorgiaelisabethae 中得到 pseudopterosins 具有抗發炎活性(Blunt et al., 2012a, 2012b)。而迄今，許多海洋天然物被報導具有多種生物活性，其中像是抗發炎、治療神經痛及多發性硬化症等作用(Jean et al., 2008; Correa et al., 2009)。基於海洋的生物多樣性，海洋天然物儼然成為新藥開發來源之寶庫(Haefner, 2003；Mayer et al., 2000；Proksch et al., 2002)。近年來，全球對生產海洋藥物倍加重視，台灣四面環海，海岸線綿延一千五百多公里，是為絕佳的地理優勢。本計畫我們將利用給予脂多醣 LPS(lipopolysaccharide)刺激巨噬細胞 (RAW264.7)大量表現前驅發炎性蛋白包含誘發型一氧化氮合成酶及環氧化酶第二型(COX-2; cyclooxygenase-2)去評估珊瑚化合物之抗發炎活性。初步結果發現本研究所使用的珊瑚化合物 X、Y 及 Z 可以顯著抑制 LPS 所誘發的前驅發炎性蛋白的表現。但有關這三個化合物在異位性皮膚炎上的影響並不清楚。因此，本研究我們試圖建立一個活體的異位性皮膚炎模式，來探討 X、Y 及 Z 對於異位性皮膚炎之治療效果並評估其可能的作用機轉。（三）研究方法及步驟：  in vitro 抗發炎測試１、細胞培養與離體抗發炎模式的建立將小鼠巨噬細胞(RAW 264.7)培養於含 DMEM 培養液的 10 cm 培養皿中，放置於 37℃、5％CO2 的細胞培養箱 16 小時，再加入脂多醣(Lipopolysaccharide, LPS )於培養液中 16 小時，誘發小鼠巨噬細胞發炎，培養液中含 LPS(0.01 μg/ml)且還未加入化合物。而在抗發炎的模式中，預先加入珊瑚化合物 X、Y 及 Z(10μM)作用十分鐘，再加入 LPS 誘發發炎反應，在培養箱放置 16 小時。(方法仿自 Jean et al., 2008) ２、樣品保存將 10cm 培養盤中的培養液吸取乾淨後，加入 1X 冰冷的磷酸鹽緩衝液(phosphate-buffered saline,PBS)沖洗兩次，再加入 1ml 的 PBS 於 10cm 培養盤中，使用細胞刮刀將細胞刮下於 PBS 中，用 pipet 吸取 1ml 含細胞的 PBS 液體置於 1.5ml 的微量離心管中，以 4℃，3000rpm 離心 8 分鐘，離心後抽除上清液並將樣品保存在-80℃。實驗分組第一組：控制組。 127

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第二組：給予 LPS 誘發發炎。第三組：同時給予 LPS 及珊瑚化合物 x。第四組：同時給予 LPS 及珊瑚化合物 y。第五組：同時給予 LPS 及珊瑚化合物 z。３、發炎性蛋白質之西方點墨法分析將小鼠巨噬細胞株以冰冷的 lysis buffer 溶於冰冷的 lysis buffer 中並使其均質化，靜置五分鐘，以 4℃，20,000g 離心 30 分鐘，取上清液做西方點墨法之分析。蛋白質定量則使用 DC protein assay kit (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)作定量。樣品稀釋成相同蛋白質濃度後加入等體積的 sample buffer(2％ sodium dodecyl sulfate (SDS), 10％ glycerol, 0.1％ bromophenol blue, 2％ 2mercaptoethanol 和 50 mM Tris–HCl, pH 7.2)以 3：1 的比例混合均勻，配置好的樣品以 150V 之電壓在 SDS 膠體上進行電泳 90 分鐘，電泳結束後把蛋白質以 125 mA，4℃含有 transfer buffer(50 mM Tris–HCl, 380 mM glycine, 1%SDS, and 20% methanol) 的條件下轉移至 PVDF(Immobilon-P, Millipore, 0.45-M pore size)膜上。把 PVDF 膜以新鮮的 TTBS 液 (Trisbuffered saline，pH7.4，20mM Tris，137mM NaCl，0.1％Tween20) 沖洗三次 (每次 10 分鐘)，然後置於含 5％脫脂牛奶的 TTBS 液中，在室溫下持續震盪 30 分鐘，接者加入針對目標蛋白質作用的一級抗體混合震盪 1 小時，撈出 PVDF 膜，置入新鮮的 TTBS 液沖洗三次 (每次 10 分鐘)，接著使用含 5％脫脂牛奶的 TTBS 混合液浸泡，震盪 30 分鐘。再加入針對一級抗體作用的二級抗體，予以震盪 1 小時。撈出 PVDF 膜置入新鮮的 TTBS 液中震盪三次 (每次 10 分鐘)，鍵結上之抗體則利用化學螢光呈色劑(Millipore Corp)進行呈色，而影像使用 UVP 影像系統進行擷取，LabWorks 4.0 則用來作影像定量計算(Jean et al, 2008; Wu et al., 2011)。  in vivo 抗發炎測試１、本批實驗動物為 BALB/c 品系小鼠，飼養在中山大學海洋資源館動物室中。光週期維持 12 小時光照 12 小時黑暗，大白鼠可以自由取用飲水及食物。有專人照顧和維持飼養環境的清潔，並以空調系統控制飼養環境的溫度和溼度，使環境溫度保持在 23℃。建立異位性皮膚炎隻動物模式的方法步驟為:將小白鼠以 2.5% isofurane 麻醉(麻醉機：Isotec 4, Ohmeda)，使用動物電動剃毛刀及除毛膏將小鼠背部的毛剃除，在小鼠背部畫出 1 平方公分大小的記號，定期加入滴有 100 l 之 1% DNCB(1-Chloro-2,4dinitrochlorobenzene)或 0.2% DNCB 的吸水性良好的紗布於剃除毛的小鼠背上，以誘導似異位性皮膚炎的病變產生，此紗布的面積大小為 1 平方公分，最後貼附膠帶或繃帶使紗布可固定於小鼠背上。

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圖一、加藥時間流程圖

２、建立好異位性皮膚炎的模式後，每日相同時間取相同劑量之藥膏均勻敷於傷口上，或者以腹腔注射的方式給予 0.2 ml 的藥物治療。將小白鼠以 2.5%isofurane 麻醉，每次治療前先將傷口用滅菌生理鹽水清洗把前日剩餘之藥膏清潔，同時除去異物，再用無菌棉棒將生理食鹽水拭乾後，拍照紀錄傷口復原情形，再均勻塗敷藥膏於小鼠背部 1 平方公分大小的傷口上，以膠帶固定吸水貼布於塗藥的位置，帶小鼠清醒將其放回飼養箱裡。３、樣品收集及處理將小白鼠予以人道犧牲，以 2.5% isofurane 麻醉小鼠，再用手術刀將患有異位性皮膚炎紅腫的區域取下，將取下的皮膚樣本於 PBS、PMSF 和 Aportinin 的混合溶液中清洗皮膚層上的血，再將皮膚樣本以擦手紙吸乾水分後放入包埋盒裡，最後將包埋盒浸泡於 10%福馬林固定液存放在 4℃環境下固定 4 小時，再以清水福馬林沖洗掉。利用組織自動處理系統(Tissue-Tek, Sakura Finetek Japan Co., Ltd, Japan)將皮膚組織進行脫水及滲蠟，接著以石蠟組織包埋機將組織包埋成石蠟塊 (Paraffin block)。再以石蠟切片機進行組織切片後，使用蘇木紫-伊紅染色法（Hematoxylin-Eosin stain, HE stain）染色方法進行組織切片染色。完成後以封片膠封片，再將完成的樣品玻片置於 Leica DM-6000B 光學顯微鏡(Leica, Wetzlar, Germany)觀察，用 SPOT Idea 5 MP CMOS 數位影像擷取系統(Diagnostic Instruments, Inc., Sterling Heights, MI, USA)拍攝和紀錄切片結果。

４、組織免疫染色將冷凍切片取出風乾後，浸泡於 4%甲醛(paraformaldehyde)10 分鐘後，使用新鮮的 TTBS 液(20 mM. Tris-Hcl, pH 7.4, 0.5M NaCl, 0.05% Tween-20)沖洗 2 次，再以 Dako pen 畫繞於冷凍切片樣本周圍成框，使用 ABC kit (Vector, Vectastain ABC kit)的 blocking buffer 覆蓋樣本，於室溫下震盪 60 分鐘。移除 blocking buffer 後加入能針對目標蛋白作用的一級抗體，使其在 4℃下震盪過夜。隨即使用新鮮的 TTBS 液沖洗 2 次，以 ABC kit 的 blocking buffer 覆蓋樣本，在室溫下震盪 60 分鐘，移除 blocking buffer 後在 ABC kit 的二級抗體覆蓋下於室溫震盪 40 分鐘後，將樣本覆蓋於新鮮 TTBS 液中震盪兩次 129

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(每次 7 分鐘)，再用新鮮的磷酸鹽緩衝溶液(PBS; phosphate buffered saline)沖洗 2 次(每次 7 分鐘)。最後將冷凍切片依序浸泡於、70%酒精 60 秒、95%酒精 30 秒、100%酒精 45 秒，以封片膠封片，再將完成的樣品玻片置於 Leica DM-6000B 光學顯微鏡下，並用 SPOT Idea 5 MP CMOS 數位影像擷取系統紀錄切片結果。

（四）預期結果成功建立異位性皮膚炎的動物模式，探討 X、Y 或 Z 等三種具離體抗發炎活性之珊瑚化合物可能在異位性皮膚炎上具有治療作用，經由蘇木紫-伊紅(H&E)染色法可以提供這些化合物在動物模式上之治療作用，並且經由免疫螢光染色找出於分子機轉的層面上，這些具離體抗發炎活性之珊瑚化合物各是經由何種訊息途徑來達到抗發炎的功效。

（五）目前進度以 400-450 克的 Wistar 大白鼠公鼠為實驗動物成功建立異位性皮膚炎動物模式。也將 BALB/c 品系小鼠為實驗動物成功建立異位性皮膚炎動物模式。實驗一、以 Wistar 為實驗動物建立異位性皮膚炎的動物模式，並給予治療 

異位性皮膚炎模式建立後，控制組給予生理食鹽水，病變組則給予 0.5ml DNCB，治療組傷口每日持續給予 0.5mlDNCB 及 0.5 ml 的藥物治療，並每日拍照記錄各組改善發炎的效果。如圖二，為治療 9 天後各組大鼠背部發炎的情形。

圖二、A and B: Control groups ； C:不加藥治療 groups； D: X 藥；E:Y 藥； F:Z 藥 groups 討論: 圖 C 為純受傷的老鼠，觀察到皮膚有紅腫結痂現象，以及老鼠會因發癢而去咬其皮膚，使流出液體、傷口更嚴重。而加藥治療組則發現 X、Y、Z 等三種藥物均有改善老鼠皮膚紅腫、乾燥之效果，由於每隻老鼠誘發異位性皮膚炎的嚴重程度不太一樣，且每組都各只有一隻老鼠做測試，因此實驗結果並 130

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不能明確下定論，只可以初步得知 X、Y、Z 此三種珊瑚化合物對性皮膚炎的表皮外觀皆有改善效果，使紅腫現象減少、皮膚較不乾燥且皮屑較少。



取下老鼠表皮經石蠟包埋、切片及 HE 染色後的實驗結果，如圖三。再將相片以 spot 影像分析軟體算皮層厚度，每個測試組拍 3 張 10 倍的相片，每張相片再取 3 個等分線測量表皮的厚度，所以每組共有 9 個表皮層厚度的數值，在求平均及標準差，如表一。 350

300

表皮層厚(M)

250

200

150

100

0 control

DNCB

組別

圖三、control(x10) 圖

表一、表皮層厚度的統計

DNCB(x10)

討論: control 組的表皮層較薄，平均約 42.3 m；DNCB 為純受傷組，表皮層較厚，平均約 283.8 m。將 H-E 染色好的玻片，以 40 倍的物鏡觀察並拍照，再以 imagine J 軟體來標記各種免疫細胞。表二為用 sigmaplot 所做的免疫球細胞數量統計的圖表。 20 80

control DNCB

Control DNCB

cell numbers

Cell numbers



0 中性球

淋巴球

單核球

表二、表皮免疫細胞數量

中性球

淋巴球

單核球

真皮免疫細胞數量 131

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討論: 由於所染出的細胞核不明顯，難以判斷其為何種免疫細胞，所以各種免疫球的數量統計可能有誤差，但可發現病變組的免疫細胞數量遠高於控制組。實驗二、以 BALB/c 品系小鼠為實驗動物建立異位性皮膚炎的動物模式實驗小鼠共六隻，將其分為兩組，兩隻為 vehicle 組，vehicle 的成分為 acetone-olive oil 以 4:1 的比例混合而成；另外四隻為受傷組，依加藥流程時間表定期加入 1% DNCB 和 0.2% DNCB 以誘發小鼠得異位性皮膚炎。圖四為 day6-day11 小鼠的皮膚發病紀錄情形。此次實驗於 day11 將小鼠做犧牲，取下皮膚做切片染色觀察，如圖五。

圖四、A and B:control groups；C and F:DNCB groups

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圖五、BALB/c 品系小鼠的皮膚經石蠟包埋、切片後的 HE 染色圖討論: 受傷組的四隻小鼠因健康狀況不佳不幸死了兩隻。DNCB groups 的小鼠在 day6 之後觀察到皮膚有紅腫結痂現象，以及老鼠會因發癢而去咬其結痂處及傷口旁的皮膚，使流出液體、傷口更嚴重等情形。control groups 的小鼠則加了 vehicle，其皮膚有些許輕微的凸起。其皮膚外觀看 DNCB groups 明顯比 control groups 嚴重，從病理組織切片圖則可以看到 DNCB groups 的表皮比 control groups 厚許多，且有很多白色空洞聚集成一堆，推測為水腫現象。實驗三、以 BALB/c 品系小鼠為實驗動物建立異位性皮膚炎的動物模式，並給予藥物作抗發炎測試實驗小鼠共十隻，將其分為三組，一隻為 vehicle 組，vehicle 的成分為 acetone-olive oil 以 4:1 的比例混合而成；其餘九隻依加藥流程時間表定期加入 1% DNCB 和 0.2% DNCB 以誘發小鼠得異位性皮膚炎。其中三為受傷組，不加藥治療；三隻為塗藥治療組，另外三隻則為腹腔注射藥物的治療組。這九隻小鼠皆於 day0、day3 時加 1% DNCB，day7、day10 時加 1% DNCB；兩組治療組則於 day3 至 day10 期間，每天塗抹或施打治療藥物。塗藥治療組 133

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因人為的疏失，在 day4、day5 兩天相繼死亡。圖七為 vehicle groups、 DNCB groups 和腹腔注射藥物治療組的小鼠於 day6 至 day10 的傷口變化情形。

圖六、加藥及治療時間流程圖

圖七、各組小鼠背部傷口變化情形討論: 此批實驗小鼠尚未作犧牲，等治療實驗測試完成之後才會做組織切片染色，從病理層面去探討肉眼看不見的變化，包括免疫球細胞的數量、表皮腫脹的程度 134

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等。從外觀可以看到純受傷的組別其傷口旁邊有一些破皮，可能是小鼠因癢而去抓咬造成的，以腹腔注射藥物的治療組其傷口周圍沒有破皮，與純受傷組相比，其病徵比較不嚴重，稍微可以看出此藥物對發炎有些許的治療效果。（六）執行上的困難與解決之道建立異位性皮膚炎時首先要選適合的動物來實驗，目前常用的動物模式分為兩類，一類是基因改造的突變種，如 NC/Nga mice 和 IL-4/18-overexpressing mice; 另一類是sensitizer-induced 的模式，使用卵白蛋白(ovalbumin)、微生物抗原(如蟎、金黃色葡萄球菌)，或化學藥劑(如半抗原、硝基氯苯、oxazolone、 2,4dinitrochlorobenzene)，剛開始我選用OVA誘發Wistar大白鼠公鼠，可是發炎現象遲遲未明顯出現，後來改以1% DNCB誘發Wistar大白鼠公鼠，異位性皮膚炎的病徵大鼠背上有明顯的表現出來。由於多數論文的研究者都以小鼠來做實驗，且小鼠在經濟層面的花費較大鼠少，花費相同的錢可以有較多隻小鼠來實驗，實驗風險較小，其皮膚構造也和人類近似，有表皮真皮與肌肉分層。基於以上幾點考量，覺得用小鼠來建立異位性皮膚炎的模式有很大的發展潛力，因此改以BALB/c品系小鼠為實驗動物建立異位性皮膚炎的動物模式，初始的幾批小鼠實驗都失敗，小鼠皆變得很虛弱、活動力差、食慾不好以及體重驟減而死亡，推測是加的1% DNCB量太多、傷口誘發面積較大或者是加1% DNCB的時間點太密集，所以我不斷參考論文，並尋求教授的協助，找出最適合的流程，現在我已經可以以標準化的流程，成功在BALB/c品系小鼠上建立異位性皮膚炎的動物模式。接下來就要思考如給予具離體抗發炎活性之珊瑚化合物的藥物，來治療已經有異位性皮膚炎症狀的小鼠，給藥的方式很重要，要思考塗抹得比較好，或者腹腔注射給予藥物的方式比較好，因此我最近這批小鼠實驗設計兩組治療組，是同一種具離體抗發炎活性之珊瑚化合物，只是一組是塗抹在其傷口上，另一組是腹腔注射給予 0.2 ml 的藥物治療。但塗藥的治療組別三隻老鼠皆死亡，因為人為的疏失，沒有檢查到其飲用水的瓶蓋是故障的，鋼珠將水流出的出口堵住，因此同一籠的小鼠皆渴死了，下次我會多注意飲水器的問題，之後絕不會發生這種意外。在誘發異位性皮膚炎之前，要先將老鼠背部的毛剃除乾淨，以電動刮毛機並不能達到我們想要的效果，剛開始嘗試用人工的剃毛刀，將老鼠背部的毛慢慢仔細刮除乾淨，此過程花費時間耗大，且有時會傷到老鼠，在其背部會留下小傷口。小鼠的毛較細比大鼠更難替除乾淨，須想更好、有效率的方式將其毛剃除乾淨，後來實驗室採購一般人在用的除毛膏，因此我把電動替毛機與除毛膏並用，發現小鼠的背部毛剃除的極為乾淨，且不會造成傷口而影響後續實驗的結果判斷，除毛花費的時間也減少不少。另外，傷口位置的記號標記或選用敷在傷口上的貼布材質、大小、層數也要考量，像選用紗布或是吸水貼布，若用 135

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紗布則其紗布的絲線可能會殘留在傷口上造成影響，小鼠在抓其背部時，紗布的面積可能會變形，變成不規則形，而無法達到我們實驗所設計一平方公分大小的結果。由於剛開始記錄老鼠傷口發病的變化情形時是直接拿相機拍攝，無法比較各隻老鼠傷口面積復原的大小，後來利用翻拍架，將相機固定於同一高度拍攝，且放一隻尺於拍攝的畫面中，最後將相片利用spot軟體計算每一張照片之每公分為幾個像素，軟體可以提供所圈選之傷口面積，再利用上面之比例推算出實際傷口面積。（七）參考文獻： Blunt, J. W., Copp, B. R., Keyzers, R. A., Munro, M. H., & Prinsep, M. R. (2012a). Marine natural products. Natural product reports, 29(2), 144-222. doi: 10.1039/c2np00090c Blunt, J. W., Copp, B. R., Keyzers, R. A., Munro, M. H., & Prinsep, M. R. (2012b). Marine natural products. Nat Prod Rep, 29(2), 144-222. doi: 10.1039/c2np00090c Elias, P. M., & Schmuth, M. (2009). Abnormal skin barrier in the etiopathogenesis of atopic dermatitis. Curr Allergy Asthma Rep, 9(4), 265-272. Flohr, C., & Mann, J. (2013). New insights into the epidemiology of childhood atopic dermatitis. Allergy. doi: 10.1111/all.12270 Gautam, R., & Jachak, S. M. (2009). Recent developments in anti-inflammatory natural products. Med Res Rev, 29(5), 767-820. doi: 10.1002/med.20156 Ikoma, A. (2009). Analysis of the mechanism for the development of allergic skin inflammation and the application for its treatment: mechanisms and management of itch in atopic dermatitis. J Pharmacol Sci, 110(3), 265-269. Klein, B., & Brailly, H. (1995). Cytokine-binding proteins: stimulating antagonists. Immunol Today, 16(5), 216-220. doi: 10.1016/0167-5699(95)80161-8 Leung, D. Y., & Bieber, T. (2003). Atopic dermatitis. Lancet, 361(9352), 151-160. doi: 10.1016/S0140-6736(03)12193-9 Leung, D. Y., Boguniewicz, M., Howell, M. D., Nomura, I., & Hamid, Q. A. (2004). New insights into atopic dermatitis. J Clin Invest, 113(5), 651-657. doi: 10.1172/JCI21060 Leung, D. Y., Nicklas, R. A., Li, J. T., Bernstein, I. L., Blessing-Moore, J., Boguniewicz, M., . . . Tilles, S. A. (2004). Disease management of atopic dermatitis: an updated practice parameter. Joint Task Force on Practice Parameters. Ann Allergy Asthma Immunol, 93(3 Suppl 2), S1-21. Maintz, L., & Novak, N. (2011). Modifications of the innate immune system in atopic dermatitis. J Innate Immun, 3(2), 131-141. doi: 10.1159/000323963 Mirza, R., DiPietro, L. A., & Koh, T. J. (2009). Selective and specific macrophage 136

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胚胎脊髓組織移植入頸部脊髓損傷區域後之神經細胞特性研究 Characteristics of the neural cell derived from the fetal spinal cord tissue after transplantation into the cervical spinal cord lesion cavity

學生：賴思蓉指導老師：李昆澤教授學號：B002010052

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一、摘要中樞神經系統受損後，神經細胞的生長特性及損傷後產生的抑制性環境不利於軸突生長及神經元再生，目前臨床藥物治療的效用有限，採用細胞移植可能具有潛力取代損傷處細胞並且恢復神經元之間的迴路。脊髓損傷最常見的受傷位置為頸椎，但由於頸部脊髓損傷通常伴隨著呼吸衰竭，容易導致模式動物死亡，因此大部分研究都著重於胸部或腰部的脊髓損傷，為進一步了解細胞移植療法於頸部脊髓損傷的修復作用，本實驗將以第四節頸部脊髓半切手術（C4 hemisection, C4Hx）製造損傷模式大鼠，並於損傷後 7 天將大鼠胚胎頸部脊髓組織移植入脊髓損傷區域。動物接受細胞移植 2 週、4 週及 8 週後，灌流固定組織並進行冷凍切片，利用免疫組織染色及神經追蹤劑的方法研究移植細胞的神經化學及神經連結特性。初步實驗結果顯示，移植組織能在損傷處存活並與宿主組織融合，未來將繼續追蹤宿主與移植細胞間的神經迴路。此實驗的研究結果將可了解移植細胞於宿主體內的生長、分化以及神經連結狀況，藉此提供未來研發治療脊髓損傷的細胞移植療法。

二、研究動機與研究問題脊髓和大腦構成了人體的中樞神經系統，能夠協調並整合來自身體各個部位的運動及感覺訊息，其中包含的神經迴路是相當重要且複雜的。當中樞神經系統受到傷害時，情況往往比周圍神經系統嚴重且棘手，不僅因為中樞神經系統涉及維生（例如呼吸功能）、意識及全體幹的神經迴路，中樞神經系統的神經元再生能力受到相當的限制。而中樞神經系統具有獨特的血腦屏障（blood-brain barrier, BBB）及血脊髓屏障（blood-spinal cord barrier, BSCB），此屏障能阻礙有害物質的進入，但同時也限制了藥物的作用位置。中樞神經系統一旦受傷，如何協助神經系統的復原成了很重要的課題。中樞神經系統損傷分為腦部損傷及脊髓損傷兩個層面，兩者對於人體生理功能有不同影響，本實驗選擇脊髓損傷為研究主題，脊髓分為頸部（C1-C8）、胸部（T1-T12）、腰部（L1-L5）及骶部（S1-S5），脊髓損傷最常見的受傷位置為頸椎，但由於頸部脊髓損傷通常伴隨著呼吸衰竭，容易導致模式動物死亡，因此大部分研究都著重於胸部或腰部的脊髓損傷，為進一步了解細胞移植療法於頸部脊髓損傷的修復作用，本實驗將以頸部脊髓損傷作為研究模式。 139

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目前對於脊髓損傷仍無有效的治療方法，現今發展出以藥物控制損傷惡化、脊髓減壓手術、提供生長因子或抑制神經細胞不可再生的特性等，相較於以小分子物質誘導神經再生，直接將具分化潛力的細胞移植進入損傷處，可能可提供較為專一且有效率的治療，同時減少對非損傷處神經細胞的副作用。本計畫將於損傷後 7 天將外源未分化的胚胎神經前驅細胞（neural progenitor cell, NPC）移植入頸部脊髓損傷區域，藉此模擬臨床治療的可能性，並探討胚胎細胞移植入脊髓損傷處後，於不同時間點增生或分化的細胞形態、種類，及其與宿主神經細胞間是否會產生聯繫。

三、文獻回顧與探討脊髓損傷會造成神經細胞的死亡，並破壞神經細胞之間的連結性而造成身體部分功能的喪失。中樞神經系統受損後，神經細胞的生長特性及損傷後產生的抑制環境並不利於軸突生長及神經元再生(Cafferty et al., 2008)。此外，損傷後的免疫反應更可能導致神經細胞的二次傷害。由於血脊髓屏障的存在，藥物治療對於修復脊髓損傷的效用有限，而採用細胞移植療法可能可藉由神經保護作用──抑制發炎反應或者釋放生長因子來促進脊髓的修復(Madhavan et al., 2008; Yasuhara et al., 2006)。相較於藥物以分子機制影響損傷脊髓的微環境，細胞移植可能具有潛力取代損傷處細胞，恢復神經之間的迴路，並利用細胞分泌的化學物質同步影響脊髓的微環境(Eftekharpour et al., 2008)。細胞移植療法將可對於損傷脊髓進行多面向的修復；當成功建立起移植細胞與宿主細胞之間的聯繫，移植細胞將是有利且長效的療法。在脊髓損傷中，移植細胞的選擇相當多樣，大致分為兩種特性：一是移植細胞同時具有分化成神經細胞及神經膠細胞的能力，如臍帶血(Cho et al., 2008)及胚胎幹細胞移植(Parr et al., 2008)；另一則是移植細胞僅著重於分化成單一種神經膠細胞，輔助舊有神經跨越抑制環境而再生軸突，如建立許旺細胞(Paino et al., 1994) 及星狀膠細胞(Noble et al., 2011)。本次研究選擇前者，中樞神經膠細胞不只一種，而各自輔助神經細胞的情形大相逕庭，單一種細胞的移植效果有限，我們以擁有分化多種細胞潛能的神經前驅細胞為對象，取源於胚胎脊髓組織(Fischer et al., 2006)。White 等人發現，利用胚胎脊髓組織移植可以於損傷處的脊髓建立起新的神經迴路(White et al., 2010)。此外，神經前驅細胞移植的研究也發現不管在體外或體內都顯示神經前驅細胞具有神經保護的效果(Mothe et al., 2013)。神經前驅細 140

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胞在不同的區域環境中受到不同影響，分化出的細胞不盡相同，過去的細胞移植研究主要著重於腰部的脊髓損傷，由於脊髓損傷案例中有超過一半都屬於頸部脊髓損傷，且頸部脊髓損傷通常會引起呼吸衰竭病導致死亡。因此，本實驗將探討神經前驅細胞在頸部脊髓損傷處所衍生出的細胞類型特徵與功用，分成三個時間點（2 週、4 週及 8 週）追蹤細胞移植後的生長與分化情形，並利用神經追蹤劑觀察移植細胞是否可與宿主的神經組織產生連結。

四、研究方法及步驟以第四節頸部脊髓半切手術製造模式動物，模擬頸部脊髓損傷，模式動物選擇 Sprague-Dawley 大白鼠。實驗設計兩組實驗動物：細胞移植組，脊髓損傷 7 天後移植入胚胎脊髓組織；偽細胞移植組，脊髓損傷 7 天後注入 Hank’s balanced salt solution（HBSS）而非移植細胞，作為細胞移植組的對照組。細胞移植後，安排三個不同時間點觀察脊髓細胞的生長差異，分別為細胞移植 2 週、4 週及 8 週後。以下為實驗步驟： 1.

頸部脊髓損傷──脊髓半切手術實驗所使用的動物為飼養八週的雄性 Sprague-Dawley 大鼠，手術前先秤取

大鼠體重，以體重為標準，皮下注射適量的肌肉鬆弛劑（xylazine, 10 mg/kg）， 10 分鐘後，以腹腔注射麻醉劑（ketamine, 140 mg/kg），再等待 10 分鐘藥效作用，以手指捏夾大鼠的手與腳掌，確認其是否仍有反射的抽回動作，大鼠沒有立即反應則代表麻醉完全；若麻醉不完全則繼續補足麻醉劑。麻醉完全後，剃除大鼠背側頸部的毛，利用碘酒及酒精反覆各三次擦拭裸露皮膚以消毒，接著在大鼠的眼睛塗抹保濕藥膏，防止在手術中過於乾燥；最後，排空大鼠膀胱的尿液，即可置於手術檯。將事先浸泡過酒精的手術器械擦乾，大鼠以趴臥姿勢置於手術檯，並架高其胸部，以 11 號手術刀劃開大鼠後頸部的皮肉，手術剪輔助將結締組織撐開並剪大開口，將肌肉一層層分離直至接近頸椎，以撐開器撐開上層肌肉，利用手術刀劃開頸椎上的肌肉，以刮匙去除肌肉，待頸椎骨裸露，藉頸椎骨形狀特徵判別第三節頸椎骨位置，以骨剪將第三節及第四節頸椎骨交界的骨頭拔除，使脊髓裸露。接著以手術刀平行大鼠軀幹，垂直向下劃開大鼠左側脊髓的硬腦膜，將尖鑷及彎鑷伸入開口破壞脊髓組織，利用連接幫浦的微量吸管將脊髓組織吸出，使該處左側脊髓完全清空。然後用微縫線（10-0）將硬腦膜縫合，移除撐開器，以鉻腸線 141

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（4-0）縫合肌肉，尼龍線（4-0）縫合皮膚，縫合完成後立即以皮下注射 yohimbine （1.2 mg/kg）及 5 毫升的林格氏液，前者能紓解肌肉鬆弛劑的效用，後者能補充大鼠體內的水分及電解質。等到大鼠清醒能自發動作時，皮下注射止痛劑（buprenorphine, 0.03 mg/kg）。

胚胎脊髓組織移植胚胎脊髓組織來自於懷孕 14 天的母鼠，秤量母鼠體重並以腹腔注射足量麻

醉劑（ketamine, 140 mg/kg），麻醉後將母鼠腹部的毛剃除，以酒精及碘酒消毒後，以仰躺姿勢置於手術檯，利用手術剪將母鼠腹部皮肉延著劍突軟骨剪開，腹腔內可見串珠形態的子宮，而一個圓珠即是一個胚胎（圖一 A），將胚胎一一剪下取出。以手術剪剪開並去除取胚胎外層，接著剪破羊膜，將胚胎與羊膜分離，利用細針將胚胎背側向上固定（圖一 B），以尖鑷及彎鑷破壞胚胎後頸部肌肉，取出頸部脊髓（圖一 C）。取出的胚胎頸部脊髓置於 0℃的 HBSS 溶液中保存，以確保脊髓組織的活性。

圖一、胚胎脊髓組織的取得流程 A：懷孕 14 天之大鼠胚胎。B：胚胎背側向上固定。C：胚胎頸部脊髓。

脊髓損傷後的大鼠在飼養一週後進行細胞移植，和損傷手術的前置作業相同，麻醉後的大鼠置於手術檯上，以手術剪剪開皮和肉的縫線，用撐開器打開肌肉，找到頸椎骨後小心清除其上新生的組織，直到損傷處的脊髓裸露，將左側脊髓上的微縫線剪開，取一塊胚胎脊髓組織置入，再重新縫起硬腦膜及皮肉。術後同樣注射 yohimbine、林格氏液及止痛劑。

動物灌流與組織切片將實驗大鼠飼養到固定時間點後，以腹腔注射長效麻醉劑 urethane（1.2 g/kg），

確認麻醉完全後，大鼠以仰躺姿勢置於灌流台上，手術剪延劍突軟骨剪開皮肉， 142

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打開腹腔後，剪破上方的橫膈膜，以大剪剪碎肋骨將胸腔打開，心臟裸露後將灌流針由左心室避開冠狀動脈插入，直到灌流針抵達主動脈後以止血鉗固定，接著剪開右心房並打開灌流幫浦。首先以 20 rpm 灌入 200 毫升含有抗凝血劑（heparin）的生理食鹽水（saline），將大鼠體內的血液在凝固前置換出來；接著以 15 rpm 灌入 250 毫升的 4 %多聚甲醛（paraformaldehyde），最後以 15 rpm 灌入 250 毫升的含 10 %蔗糖的多聚甲醛溶液（10% sucrose in paraformaldehyde）以固定組織。灌流完成後將大鼠放入冰箱，在一週之內取出其頸部脊髓，取出的脊髓損傷形態在解剖顯微鏡下拍照紀錄後，放置於含有 30 %蔗糖的磷酸緩衝生理食鹽水（30% sucrose in phosphate buffer saline）中脫水，待脊髓組織沉降到微管底部，取出脊髓組織利用冷凍包埋劑包埋成圓柱狀，以 40 μm 的厚度進行橫向的冷凍切片，切片貼於玻片上後以加熱板烘乾 30-60 分鐘。

組織切片染色此部分實驗流程分成三個部份。第一部份將利用甲苯酚紫（crystal violet）對

切片進行細胞核染色，以鑑定移植細胞是否可存活。第二部份將使用 NeuN 與 Glial fibrillary acidic protein（GFAP）的抗體進行免疫組織染色，以確認移植細胞分化成神經元或是神經膠細胞。第三部分實驗則會將逆向神經追蹤劑（Cholera toxin B subunit）注入胸腔，讓追蹤劑接觸橫膈肌再經由神經軸突運送回脊髓 (Mantilla et al., 2009)，此技術將可確認移植細胞是否會與橫膈運動系統進行突觸連結。

五、預期結果細胞移植在原先已成空洞的損傷處提供了額外的神經前驅細胞，而該細胞具有分化潛力，對於損傷處而言，等同於獲得了更多幫手以應付損傷環境，若該細胞不造成排斥作用，移植細胞能與宿主細胞彼此融合，甚至替換原先損傷脊髓的細胞；而沒有細胞移植的脊髓，空洞將會一直保持。此外，我預測細胞移植入損傷脊髓後可能可與原本宿主細胞產生部分新的神經迴路，藉此調控損傷的脊髓。本研究已經做出一些初期成果，從損傷處脊髓的背側相片中比較，未進行細胞移植的脊髓呈現空洞；2 週後的細胞移植，填入的神經前驅細胞向外張揚，並未完全填滿脊髓損傷的空洞（圖二 A）；而細胞移植 4 週及 8 週後，移植細胞與未損傷處緊密結合，而將損傷的空洞完全掩蓋（圖二 B 及 C）。4 週和 8 週不同 143

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的是，8 週的細胞看似結合的更加穩固，且移植細胞有向外凸出的現象。移植細胞在空洞處自成一塊，在移除硬腦膜步驟中，移植細胞容易與膜一同被翻起而脫離脊髓，不管是 2 週、4 週還是 8 週的移植細胞都同樣如此，代表移植細胞與宿主細胞之間在 8 週之內建立的連結仍是相當脆弱的。

圖二、不同時間點下脊髓移植處背側結果比較（解剖顯微鏡 4X） A：細胞移植 2 週。B：細胞移植 4 週。C：細胞移植 8 週。

在偽細胞移植組的染色成果中，脊髓損傷的邊緣呈現較深的顏色（圖三 A 及 B），空洞在 8 週後沒有明顯填補。而在細胞移植組的染色成果中，左側具有移植組織的脊髓往往比非損傷側（右側）的脊髓染色深，顯示可能有大量的移植細胞於損傷處存活。2 週後移植組織與宿主組織之間仍有很大的空隙，移植組織趨向從外側包圍空洞後向內填滿，邊緣的染色較深，細胞核數量較多，且邊緣與宿主組織已經產生連結，內側卻是空洞的。4 週與 8 週後移植組織都有填充內外側的現象，並且使損傷空洞消失，移植細胞與宿主細胞相互融合，沒有明顯邊界；而移植組織外圍的細胞核含量還是較內側密集且多（圖三 C 及 D）。比較 4 週及 8 週的內側生長細胞，相同面積下，8 週的細胞核數量相較 4 週少，4 週的細胞生長密度較高，但細胞分布較雜亂，8 週則較均勻（圖三 E 及 F）。另外，4 週時左側移植組織與右側宿主脊髓組織的染色情形差異較大且明顯，而 8 週時兩者染色情形幾乎相同，左側移植組織只比右側宿主脊髓組織略深一些，可能代表 8 週後移植細胞已被宿主接納並產生相較 4 週更強烈的連結，使移植細胞受到宿主調控生長而接近正常脊髓的形態。除了移植細胞外，宿主自身的神經膠細胞同樣會在損傷處聚集，而初期只以甲苯酚紫染色，只能辨別細胞數量多寡，無法區別宿主細胞與移植細胞之間的不同，後期實驗將朝確立細胞生長來源及細胞生長種類為目標發展，預期在切片中能找到移植細胞與中間神經元產生新的神經連結，並擴大移植細胞在不同時間點的差異與特徵。 144

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圖三、4 週及 8 週脊髓組織切片染色結果比較 A：4 週偽細胞移植組（4 X） B：8 週偽細胞移植組（4 X） C：4 週細胞移植組（4 X） E：4 週細胞移植組（20 X）

D：8 週細胞移植組（4 X） F：8 週細胞移植組（20 X）

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神經前驅細胞移植對於大鼠頸椎損傷後呼吸與四肢運動功能恢復之療效 Therapeutic effectiveness of neural progenitor transplantation on the respiratory and locomotor functional recovery following cervical spinal cord injury

學生：邵鈺涵指導老師：李昆澤教授學號：B002010001

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一、摘要頸椎損傷在脊髓損傷案例中占多數比例，此部位的損傷不但可能造成四肢運動功能的癱瘓更容易導致呼吸衰竭引發死亡。近年來以細胞療法修復損傷脊髓的研究日益發展，為頸部脊髓損傷患者帶來了一線曙光。本研究的目的在於探討細胞移植是否可促進頸部脊髓損傷大鼠的呼吸與四肢運動功能恢復。實驗中先將大鼠頸部第四節左半邊脊髓進行切除造成損傷，於損傷一週後將胚胎脊髓組織移植入脊髓損傷區域，分別在移植手術前一天與手術後一週、兩週、四週及八週利用全體腔呼吸測量系統（whole body barometric plethysmography）測量動物的呼吸型態（呼吸頻率、潮氣容積與分鐘換氣量），觀察動物呼吸功能的恢復狀況。此外，本實驗還會利用影片拍攝，記錄大鼠四肢運動行為並依其關節移動的狀況評分。初步結果發現，接受胚胎組織移植的脊髓損傷大鼠比未接受細胞療法的脊髓損傷大鼠有較佳的呼吸功能，但兩組動物的四肢運動功能恢復狀況則類似。未來將累積樣本數據並且比較呼吸功能與四肢運動恢復是否有關聯性，藉此評估細胞移植的可行性以及療效。關鍵詞：頸部脊髓損傷（cervical spinal cord injury）、細胞療法（cell therapy）、胚胎脊髓組織（embryonic spinal cord）、全體腔呼吸測量系統（whole body barometric plethysmography）、呼吸型態（respiratory pattern）

二、動機隨著新時代的進步，人類活動與交通科技日新月異，但在此發展下卻也使意外事故逐年增加，造成脊髓損傷患者數目年年攀升。脊髓為人體主要的中樞神經系統之一，控制著呼吸、四肢與頸部等部位的主要運動功能。個體會因脊髓受到傷害造成四肢運動及反射能力受損，嚴重者會有肢體癱瘓的現象導致無法過著與一般人相同的生活。此外，當脊髓損傷的部位靠近頸部時，往往會造成呼吸機能的障礙，甚至會導致患者因呼吸衰竭而死亡。過去觀念認為受損傷的脊髓因受到環境因子影響與本身內生性神經細胞再生能力的受限而會導致永久性傷害。近年來的基礎與臨床實驗研究結果發現細胞移植可能可以改變脊髓的微環境，進而增加脊髓修復的可能性，這項發現對於脊髓損傷患者將是一項極大的生機。目前對於脊髓損傷患者最有成效的復健方法莫過於物理與職能的治療，透過運動方式與醫療器材來協助病患改善運動功能，但這些治療的效果有限且對於非四肢運動的功能（例如:呼吸）較無實質幫助。由於細胞移植是否真的可以修復損傷的脊髓並促進呼吸、運動功能改善的結果目前並不清楚，故本實驗目的即在探討胚胎脊髓組織的移植是否可促進頸部脊髓損傷後的呼吸及四肢運動功能恢復，並且分析呼吸與四肢運動功能的恢復是否有關聯性。本實 149

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驗的執行可了解細胞移植是否可直接促進脊髓損傷後的功能恢復，實驗結果將可提供未來基礎與臨床研究的參考，有助於未來替脊髓患者找到更有效的治療方法。

三、文獻回顧與探討脊髓損傷通常會導致運動和感覺功能的喪失（Bareyre, 2008），而頸部脊髓受到損傷則容易導致橫膈肌的麻痺（Lane, Fuller, White, & Reier, 2008），造成呼吸衰竭。以往的研究都較著重在脊髓損傷所造成的四肢運動傷害，但是近來關於脊髓損傷引起呼吸衰竭的研究逐漸增加。目前統計發現，大約有一半的脊髓損傷都發生在頸部（National Spinal Cord Injury Statistical, 2010），頸部脊髓損傷易造成腦幹投射到脊髓的呼吸神經路徑受到破壞，進而引發呼吸功能受損，使得此類脊髓損傷患者的發病率和死亡率提高（Jackson & Groomes, 1994）。由此可見，脊髓損傷不僅會對四肢運動造成極大的損傷，若損傷處發生於頸部更會導致呼吸功能的障礙，因此如何改善脊髓損傷所造成的運動與呼吸功能具有必要研究性。目前研究結果顯示，在脊髓損傷處進行細胞移植的治療對於功能性修復有極大的潛力（White et al., 2010），這些報告顯示單一或多種細胞組合而成的神經前驅細胞移植有助於脊髓損傷後功能之改善（Bonner, Blesch, Neuhuber, & Fischer, 2010; Hooshmand et al., 2009; Kim, Dai, Lynskey, McAtee, & Bregman, 2006）。迄今許多實驗研究發現移植入脊髓的細胞能夠與宿主細胞進行整合，並修復脊髓損傷處的細胞（Cummings et al., 2005）。此外，將小鼠胚胎幹細胞移植進入受過夾壓損傷的成年大鼠胸椎脊髓中，可誘發星形膠質細胞、寡突膠質細胞和神經元的存活、遷移與分化，並使運動功能受到改善（McDonald et al., 1999）。CaO 等人指出移植的細胞能夠存活並分化成寡突膠細胞，並造成一定程度的運動功能改善（Cao, Howard, Dennison, & Whittemore, 2002）。有鑑於脊髓損傷修復對運動及呼吸功能改善之重要性以及上述先前的實驗研究發展，本實驗將對頸部第四節脊髓損傷的大鼠進行胚胎脊髓組織的移植，同時觀察此移植對呼吸與四肢運動功能恢復的療效。

四、研究方法與步驟頸部脊髓損傷手術手術前，先秤老鼠的體重，根據其體重於皮下注入適量的肌肉鬆弛劑（xylazine, 10 mg/kg, s.c.），經過 10 分鐘後再於腹腔注射麻醉劑（ketamine, 140 mg/kg, i.p.），5-10 分鐘之後，以夾其前後四肢末梢的方式觀察有無抽動現象以確認老鼠是否完全麻醉。若無抽動反應則可將其頸部背側的毛剃除，以碘酒與 73 %的酒精擦拭三次消毒，將老鼠眼睛塗上保濕藥膏避免其乾燥並擠出老鼠膀 1.

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胱中的尿液，接著移至手術台上進行手術。手術中所使用的器具均先泡至 73 %酒精消毒。利用手術刀和手術剪將大鼠頸椎處的皮肉剪開，以撐開器將頸部的皮肉撐開，用手術刀將目標頸椎處附近的肉劃爛並用刮匙將肉刮除以找到目標頸椎骨，再用骨剪和手術剪將其去除。接著利用手術刀垂直切開頸部第四節脊髓左側的硬腦膜之後，用尖鑷和彎鑷撐開硬腦膜破壞目標處脊髓組織，將連接幫浦接上的微量吸管尖端伸入破壞的脊髓處吸除組織，腳踩控制幫浦間歇式吸出組織，直到損傷處的組織清除到中線處，才可停止吸出組織。損傷完成後，先以尼龍製的微縫線（10-0）將硬腦膜縫合，再用鉻長線（4-0）將肉縫合，最後以尼龍線（4-0）將皮縫合，以紗布為其擦拭血跡。手術結束後，為其施打 yohimbine（1.2 mg/kg, s.c.）中和肌肉鬆弛劑的效用，再注入 5 mL 的乳酸林格氏液來補充大鼠體內的水分。將其移至乾淨的籠子中，等大鼠清醒後為其施打止痛劑（buprenorphine, 0.03 mg/kg, s.q.），以降低手術後的疼痛不適。手術後一個星期之內會清理大鼠眼眶與鼻子周圍所滲出的血跡，依照動物狀況餵食 1-3 mL 的營養膏與皮下注射 5 mL 的乳酸林格氏液來維持大鼠的體力直到大鼠可自行進食與飲水。胚胎脊髓組織移植將懷孕 14 天的母鼠秤重後，施打適量的適量的肌肉鬆弛劑（xylazine, 10 mg/kg, s.c.），經過 10 分鐘後再於腹腔注射麻醉劑（ketamine, 140 mg/kg, i.p.）， 5-10 分鐘之後，夾其前後四肢末梢的方式觀察有無抽動現象以確認老鼠是否完全麻醉。麻醉完成後將其腹部的毛剃除以碘酒與 73%的酒精擦拭三次消毒，移 2.

至手術台後以手術剪剪開其皮肉，將腹部胚胎取出。以尖鑷和彎鑷去除其胎盤及胎衣，以細針固定其頭尾，將其前肢以上的脊髓組織（圖一紅圈處）挑出並置入冰浴的緩衝液體（Hanks' Balanced Salt Solution)。

圖一、懷孕母鼠體內胚胎中取出之脊髓組織將經過脊髓損傷手術一個星期後的大鼠，依先前相同的手術準備方式進行手術，將皮肉切開撐開後，利用刮匙將肌肉與結締組織刮乾淨，找出之前損傷處，將先前取出的胚胎脊髓組織（實驗組）或者注入 1 µl 的緩衝液體（對照組）移入損傷處並將損傷處填滿，接著依先前方式將脊髓硬腦膜、肌肉及皮縫合，並施打 yohimbine （1.2 mg/kg, s.q.）及注入 5 mL 的乳酸林格氏液。接著 151

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將其移至乾淨的籠子中，待大鼠清醒後為其施打止痛劑（buprenorphine, 0.03 mg/kg, s.q.）。呼吸運動測量方法本實驗利用全體腔呼吸測量系統（whole body barometric plethysmography， WBP）測量清醒大鼠的呼吸運動，測量項目包括呼吸頻率、潮氣容積與分鐘換氣量。測量時間點為胚胎脊髓組織移植手術前一天、手術後一週、兩週、四週及八週的大鼠。將全體腔呼吸測量系統的氣流、溫度與濕度進行校正後，將欲觀察的大鼠量完肛溫後放入壓克力測量箱中，並持續給予壓縮的空氣（2.5 L/min）一小時，之後灌入低氧氣體（10 % O2 , 4 % CO2 , balance N2）維持十分鐘，接著再恢復輸入壓縮的空氣維持十分鐘。低氧氣體處理可以了解在高呼吸 3.

驅動力的狀況下動物呼吸功能的恢復狀況。 4.

四肢運動測量方法

利用相機拍攝約四分鐘的大鼠行為影片，拍攝時間點為胚胎脊髓組織或緩衝液體移植前一天、移植後一週、兩週、四週及八週。根據拍攝影片中的大鼠前肢和後肢的運動行為進行評分。圖二為評分項目，主要觀察左半邊前後肢的運動情形，各關節的擺動幅度、四肢協調度、手腳掌攤平與否、轉彎流暢度等項目評比給分，總分最低為 0 分，最高為 20 分，分數均為整數，分數越高代表大鼠的恢復情形越好。

圖二、大鼠四肢運動功能評分項目表(Martinez, Brezun, Bonnier, & Xerri, 2009)。

五、目前初步結果 152

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圖三顯示兩組動物在不同時間下呼吸頻率與潮氣容積的變化。由圖三可得知兩組動物的呼吸頻率在各個時間點並沒有顯著差異，但是有接受細胞移植的組別在接受移植後八週有較高的潮氣容積。這個結果顯示細胞移植可能可以些微促進潮氣容積的恢復。

圖三、動物呼吸型態於各時間點的變化。圖 A 表示呼吸頻率。圖 B 顯示潮氣容積。C4Hx + Sham: 接受緩衝液移植的組別。C4Hx + FSC: 接受細胞移植的組別。X 軸的 Before 代表接受移植前的時間點（損傷後 6-7 天）。1-8 wk 代表接受移植後的時間點。

由於損傷處為左半邊的脊髓，大鼠左半邊前後肢受到的影響較大（傷害），右半邊前後肢較無影響（正常），主要觀察左右半邊四肢運動的情況並進行比較，藉此評分以判斷恢復情況。圖四為緩衝液移植後一週大鼠的動作圖片。動物的前肢手掌無法攤平（紅圈處），肩膀、手臂與手腕動作不流暢，手臂和手腕動作幅度小，轉彎會以前肢脫地，四肢運動極不協調，跑步時尤其明顯。圖五為移植胚胎組織幹細胞一週後的大鼠。前肢擺動時手腕、肩膀和手臂不協調，左右肢運動不協調；轉彎不順會卡住。圖四、緩衝液移植後一週大鼠的動作圖片。

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圖五、接受細胞移植後一週大鼠的動作圖片。

圖六為緩衝液移植後八週大鼠大鼠恢復情形。大鼠的四肢均能同時完整平放在平面上，90%以上的運動時間中其四肢彼此均協調，大鼠也能夠順利轉彎，左後肢與身體軸呈平行，但左前肢的肩膀、手臂與手腕在運動時的擺動仍無法像右前肢般流暢。圖七顯示移植胚胎幹細胞八週後的大鼠恢復情形。大鼠的四肢在 90%以上的運動時間內均活動自如、協調，擺動幅度接近正常，左前肢的肩膀、手臂與手腕擺動流暢。圖六、緩衝液移植後八週大鼠的動作圖片。

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圖七、接受細胞移植後八週大鼠的動作圖片。

綜合上述目前運動功能的評分，結果發現無論是否有進行幹細胞移植，大鼠的後肢行為恢復所需的時間都較前肢少，且前幾週恢復情況都較良好。兩組動物的運動功能於移植後的一星期內都較差（圖八），但移植後的兩星期後後行為能力明顯上升，恢復良好。此結果顯示動物於頸部脊髓損傷後的前肢運動可能會產生自發性的恢復，在損傷處進行細胞移植沒有顯著促進功能恢復的作用。

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圖八、動物四肢運動功能評分於各時間點的變化。圖 A 表示前肢運動。圖 B 顯示後肢運動。C4Hx + Sham: 接受緩衝液移植的組別。C4Hx + FSC: 接受細胞移植的組別。X 軸代表接受移植後的時間點。

六、目前困難 1.大鼠脊髓損傷手術過程，需要老師幫忙手術操作過程與確認損傷程度。 2.實驗樣本數不足，需要增加手術過後的大鼠存活率。

七、參考文獻 1. Bareyre, F. M. (2008). "Neuronal repair and replacement in spinal cord injury." J 2. 3. 4. 5.

6. 7.

Neurol Sci 265(1-2): 63-72. Lane, M. A., et al. (2008). "Respiratory neuroplasticity and cervical spinal cord injury: translational perspectives." Trends Neurosci 31(10): 538-547. National Spinal Cord Injury Statistical, C. (2010). "Spinal cord injury facts and figures at a glance." J Spinal Cord Med 33(4): 439-440. Jackson,A.B. and T. E. Groomes (1994). "Incidence of respiratory complications following spinal cord injury." Arch Phys Med Rehabil 75(3): 270-275. White, T. E., et al. (2010). "Neuronal progenitor transplantation and respiratory outcomes following upper cervical spinal cord injury in adult rats." Exp Neurol 225(1): 231-236. Bonner, J. F., et al. (2010). "Promoting directional axon growth from neural progenitors grafted into the injured spinal cord." J Neurosci Res 88(6): 1182-1192. Hooshmand, M. J., et al. (2009). "Analysis of host-mediated repair mechanisms after human CNS-stem cell transplantation for spinal cord injury: correlation of engraftment with recovery." PLoS One 4(6): e5871. Kim, B. G., et al. (2006). "Degradation of chondroitin sulfate proteoglycans potentiates transplant-mediated axonal remodeling and functional recovery after 156

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spinal cord injury in adult rats." J Comp Neurol 497(2): 182-198. 9.

Cummings, B. J., et al. (2005). "Human neural stem cells differentiate and promote locomotor recovery in spinal cord-injured mice." Proc Natl Acad Sci U S A 102(39): 14069-14074. 10. McDonald, J. W., et al. (1999). "Transplanted embryonic stem cells survive, differentiate and promote recovery in injured rat spinal cord." Nat Med 5(12): 1410-1412. 11. Cao, Q. L., et al. (2002). "Differentiation of engrafted neuronal-restricted precursor cells is inhibited in the traumatically injured spinal cord." Exp Neurol 177(2): 349-359. 12. Martinez, M., et al. (2009). "A new rating scale for open-field evaluation of behavioral recovery after cervical spinal cord injury in rats." J Neurotrauma 26(7): 1043-1053.

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第四型腎心症候群----慢性腎衰竭和心臟疾病關係之研究 Therapeutic effectiveness of neural progenitor transplantation on the respiratory and locomotor functional recovery following cervical spinal cord injury

學生：林冠宏指導老師：曾清俊教授學號：B002010056

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一、

動機：慢性腎衰竭（chronic kidney failure，CKD）是台灣較常見的慢性疾病之一，伴隨著疾病的演進，除了引發腎絲球及腎小管損傷、腎炎、尿毒症等腎臟疾病外，亦會發生血壓升高、左心室肥大、心衰竭等心臟疾病。由近期的臨床觀察發現因慢性腎衰竭末期的病人死因通常不是腎臟功能本身的喪失，而是致死於心血管相關的疾病之中，即使接受了血液透析的治療，病患死亡的主要原因仍然是心血管相關的疾病。在此臨床現象之下，觀察並了解腎臟與心臟的交互作用便顯得相當重要。因此，於本學期將經 5/6 腎臟切除術處理之 WKY 大鼠作為慢性腎衰竭模型，觀察慢性腎衰竭對於心血管所造成的基本生理現象，探討腎臟的損傷是否會影響到心血管的作用。二、議題背景：腎臟與心臟在生理架構中雖然分屬不同的系統，但兩者的關係卻相當密切。在臨床病例上，有心臟或腎臟任一方面的疾病時，往往會併發另一方的相關疾病，然而心臟與腎臟的相互影響機制至目前為止並未完全的了解。「心腎症候群（cardiorenal syndrome，CRS）」是一較為近代的醫學名詞，定義為因心臟或腎臟疾病而交互影響彼此而產生的疾病及其併發症，依照原發器官及原發器官病情屬性分為以下五個類型1：

1. 第一型心腎症候群（CRS type I）：又稱為急性心腎症候群（Acute cardiorenal syndrome），定義為急性心力衰竭综合症（acute heart failure syndrome，AHFS）併發腎臟損傷或病 1

資料來源（含下表）：內科學誌 2011:22:392~400 心腎症候群之病態生理，林孟德等人 159

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變，與流行病學統計中，在急性心臟衰竭的病患中約有 27 ％～40％的機率發生 CRS type I。 2. 第二型心腎症候群（CRS type II）：又稱為慢性心腎症候群（Chronic cardiorenal syndrome），定義為慢性心臟疾病併發腎臟損傷或病變，因慢性心衰竭而併發 CRS type II 的盛行率約為 25％。2 3. 第三型心腎症候群（CRS type III）：又稱為急性腎心症候群（Acute renocardiac syndrome），定義為急性腎臟疾病併發心血管功能異常或病變。 4. 第四型心腎症候群（CRS type IV）：又稱為慢性腎心症候群（Chronic renocardiac syndrome），定義為慢性腎損傷併發心血管功能異常或病變。 5. 的五型心腎症候群（CRS type V）：又稱為繼發性心腎症候群（Secondary cardiorenal syndrome），CRS type V 的發病原因並非直接的腎臟或心臟疾病造成，而是其他疾病或器官功能異常而影響到腎臟或心臟其中一方，並使其產生交互作用而併發另一方疾病，臨床上常見 CRS type V 現象者為糖尿病患者。在台灣，慢性腎衰竭為極為常見的慢性疾病，亦與 CRS type IV 的發生有高度關係。慢性腎衰竭依照腎絲球過濾率及腎臟損壞的程度可分為五個時期，如表所示：

其中腎臟的損傷程度在第一期時即有 50%的腎元失去功能，至第四期腎元大約有 70%以上皆失去功能，直至第五期已有 95%以上腎元無法作用，並產生尿毒症現象，必須進行血液透析（洗腎）方可存活，此時期即稱為末期腎衰竭（ESRD）。由流行病學的觀點來說，台灣的 ESRD 罹患機率並不低，由 USRDS 於 2011 年針對全世界罹患 ESRD 的發生率及盛行 2

資料來源： Journal of the American College of Cardiology， Cardiorenal Syndrome， Claudio Ronco et al. 160

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率做出的統計中，台灣 ESRD 的發生率為世界第三，僅次於墨西哥的哈利斯科州和美國；而盛行率則位居世界第一，因此，針對 ESRD 及其併發疾病的預防及治療在台灣醫學中，有其研究的必要性。3’4’5

盛行率（ prevalence ）：於流行病學中指在某一段時間內，該疾病的所有病例占人口的比率，單位為人/百萬人口。發生率（ incidence ）：於流行病學中指在某一段時間內，該疾病的新進病例占總人口數的比率，又稱為發病率，單位為人/百萬人口。 4 圖片：左圖為世界 ESRD 之發生率比較，右圖為世界 ESRD 之盛行率比較，單位皆為人/百萬人口。 5 資料來源：USRDS v2_ch12_13 161

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由臨床觀察中發現，重度腎衰竭及 ESRD 患者容易引起心血管相關疾病如左心室肥大、高血壓、心衰竭等等。在血液透析的患者中，其死亡的最重要原因往往非腎臟功能喪失，而是心臟相關疾病，即符合 CRS type IV 的要素。臨床上除了透析並配合心血管藥物的治療外，近幾年歐美等大型臨床試驗中亦有使用手術的方式將腎交感神經破壞（腎神經燒灼術， Renal denervation， RD）而達到防止心血管疾病惡化的目的。 CRS type IV 中，影響心血管的病理狀況取決於慢性腎衰竭的嚴重程度，簡圖如下6：

在第一～二期慢性腎衰竭中，造成心臟的損傷並不明顯，通常取決於外在因素、基因型態、腎臟發炎程度等等；與第三期開始出現較嚴重的心血管疾病，如貧血、血壓升高、左心室肥大等等，並因心臟損傷及血紅素量不足等因素而腎交感神經過度活化及 RAAS 系統活性上升；於第五期時，腎臟已經幾乎喪失其功能，必須以透析治療維持病人代謝，此時對於心臟血管的負擔將會增加（血液動力學逆境），而導致心衰竭。7 CRS type IV 的病理機轉中，為慢性的腎疾病導致心血管疾 6 7

圖片來源：Cardiorenal Syndrome Type 4:A Review， Anna Clementi et al. 參考資料：內科學誌 2011:22:392~400 心腎症候群之病態生理，林孟德等人 162

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病的併發症，因此，藉由觀察腎臟與心臟的損傷，有助於更了解 CRS type IV。研究上常以經 5/6 腎臟切除術（5/6 nephrectomy， 5/6 Nx）之 WKY 大鼠做為第四期慢性腎衰竭的模型。在本次實驗中藉由沿用此模型，模擬第四期慢性腎衰竭之病患，進行 CRS type IV 之研究。三、問題與假說： 1. 藉由 5/6 Nx 之 WKY 大鼠之模型模擬第四期慢性腎衰竭，再以臨床研究背景推測，在大鼠進行完手術一段時間後，會因血液動力學障礙及腎臟過濾率下降而使得水分排出體外困難，造成體液過多，而使血壓升高。 2. 將 5/6 Nx 之 WKY 大鼠在血壓升高後的一段時間，除了有腎臟的損傷外，亦會有心臟相關的損傷，因血液量增加而造成心臟負擔，導致左心室肥大。四、研究策略：分為血壓量測及組織切片兩大觀察要點 1. 血壓量測： i. 將 WKY 大鼠標記後以 NIBP 進行血壓量測，紀錄收縮壓（Systolic blood pressure， SBP），以每兩分鐘一次連續四十分鐘的方式進行記錄並平均即為一筆資料，同隻大鼠每筆資料間隔一週量測，共測量四週。 ii. 第五週時將大鼠分為對照組與實驗組，實驗組將進行第一次手術，將一邊的腎臟完全移除，對照組同樣進行手術，但為空白實驗（開刀但不移除腎臟），並使其術後恢復一週。 iii. 第七週時進行第二次手術，實驗組將另一邊的腎臟移去 2/3，完成 5/6 Nx 手術，而對照組仍然進行空白實驗，並令其術後恢復。 iv. 第八週回復血壓量測，以 ii.之方式進行量測記錄四週。 2. 組織切片： i. 將對照組及實驗組之大鼠犧牲，取其心臟及腎臟進行組織切片前處理。 ii. 以冷凍切片或石蠟切片的方式製成病理切片並進行 PAS staining。 iii. 觀察腎臟中腎絲球及腎小管的損傷情形，腎絲球的部分依照病理學統計處理，每個玻片中尋找二十顆腎絲球並依照損傷程度計分（0～4，數字越大，損傷率越大。）並平均成一筆資料，再將所有實驗組的資料平均，計算 163

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出腎小球損傷程度。 iv. 觀察心臟的損傷程度並與對照組進行比較，觀察著重於左心室的肌肉層的增生及纖維化狀況。五、預期結果： 1. 血壓量測：實驗組大鼠未動 5/6 Nx 手術之前的收縮壓應會穩定維持在一定的範圍中，而手術後血壓應會在一段時間後上升。而進行空白手術的對照組大鼠收縮壓應維持與術前相同，並且穩定維持在一定範圍內。 2. 腎臟組織切片：實驗組的組織切片中應可觀察到腎絲球纖維化、萎縮等損傷現象。 3. 心臟組織切片：實驗組的組織切片中應可觀察到左心室的肌肉必有肥大的現象，因心臟衰竭而造成心臟組織的破壞，可能可以觀察到纖維化的現象。六、目前進度： 1. 血壓量測8：量測結果如下（第 5~7 周圍手術期，無資料）： 200 5/6 Nx ( WKY ) control ( WKY )

SBP ( mmHg )

180 160 140 120 100 80 0

week

由圖中可以獲得資訊為： i. 觀察並比較對照組前四週與後四週的收縮壓關係可獲得下圖：

量測：中山大學生物科學系林冠宏 5/6 Nx 手術操作：高雄榮總教研部中樞調控心臟血管研究室陳信宏 164

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control 手術前 control 手術後

160 140

SBP ( mmHg )

120 100 80 60 40 20 0 0

週數

ii.

由圖可以觀察到，手術前後的收縮壓值大致平穩，手術後收所壓略微上升，但不多。觀察並比較實驗組前四週與後四週的收縮壓關係可獲得下圖： 5/6 Nx 手術前 SBP 值 5/6 Nx 手術後 SBP 值

200

SBP ( mmHg )

150

100

0 0

週數

iii.

由圖中可以觀察到手術前收縮壓數值大致平穩，而手術後一週的收縮壓值略低於手術前，而之後收縮壓值隨著週齡增加而上升。觀察並比較實驗組與對照組手術後後四週的收縮壓關係可獲得下圖： 165

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5/6Nx ( WKY ) control ( WKY )

200

SBP ( mmHg )

150

100

0 0

週數

由圖中可知，除了手術後第一週以外，實驗組的收縮壓皆高於對照組，並依週齡的增加而上升。 2. 腎臟組織切片9： i. 40 X 下低倍觀察結果：

左圖為對照組之腎臟低倍結構，右圖為實驗組腎臟之低倍結構，均為石蠟切片以 PAS staining 觀察，由圖中可以觀察到，實驗組之腎臟結構較為鬆散，除了可看見鮑氏囊腔擴張之外，亦可發現腎絲球血管萎縮及腎小管的擴張。 9

切片製作：高雄榮總教研部中樞調控心臟血管研究室陳信宏染片：國立中山大學生物科學系林冠宏 166

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ii.

200X 下高倍觀察結果

左圖為對照組之腎絲球型態，右邊為實驗組之腎絲球型態，均為石蠟切片以 PAS staining 觀察，由圖中可明顯觀察到鮑氏囊及周圍的腎小管發生擴張及內皮細胞脫落，腎絲球微血管萎縮並有透明變性的現象產生。觀察腎小管亦可發現管腔內絨毛有脫落的情形。 iii. 腎絲球損傷統計結果：進度尚未到達。 3. 心臟組織切片觀察結果：進度尚未到達。七、執行困難與解決之道： 1. 冷凍切片製作失敗：在製作冷凍切片時會有組織破裂、碎開的狀況。正在調查原因所在，後處理的部分經過多次嘗試仍然失敗，目前朝向樣本前處理的步驟找尋解決辦法，但仍然於實驗之中。 2. 病理組織損傷程度判斷障礙：於腎絲球病理計數中常有第二、三級搞混的狀況。半定量病理計數除了需要有足夠的病理知識外，亦要有豐富的觀察經驗支持，方可較為正確的辨認，解決方法為多觀察各級數損傷的腎絲球染色外觀及變化，建立足夠判定經驗及奠定組織學觀察基礎，並比較其他學長姐的判斷進行修正，以利日後可進行較精準之獨立判斷。

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