B. Lomonte
26
Procedimiento: respuesta mitogénica a la PHA 1.Todo el proceso se debe realizar en condiciones de esterilidad. Obtener una muestra de sangre y aislar los mononucleares por el método del ficoll-diatrizoato (Capítulo 1). Después de los lavados, ajustar la suspensión de linfocitos a 5x106 células/ml en medio RPMI-1640 3 suplementado con 10% de suero fetal bovino. En cada corrida de pacientes en estudio, debe incluirse linfocitos de un individuo sano como control. Algunos laboratorios utilizan alícuotas de linfocitos "normales", almacenadas por criopreservación en nitrógeno líquido. 2.Por triplicado (Fig.4.6), sembrar en los hoyos: (a) 100 μl de suspensión de linfocitos + 100 μl de medio sin mitógeno, como control (b) 100 μl de suspensión de linfocitos + 100 μl de medio con una concentración óptima4 (estimulatoria máxima) de la PHA; (c) 100 μl de suspensión de linfocitos + 100 μl de medio con una concentración subóptima5 (submáxima) de la PHA. 3.Incubar a 37°C con 5-7% CO2 durante 68 hr y luego agregar 0,5 μCi/hoyo de timidina tritiada (en 25 μl) durante 4-6 hr. 4.Filtrar los cultivos utilizando un cosechador conectado a una bomba de vacío. Realizar dos lavados de los hoyos, aspirando todo el material, para asegurarse de recoger el máximo de células. Secar los filtros en una estufa y transferirlos a viales de plástico con 10 ml de líquido de centelleo para contar las emisiones β (si el contador es de fase líquida), o pasar directamente el filtro al contador β (si este es de fase gaseosa). 5.Para expresar los resultados, calcular el índice de estimulación de cada muestra:
IE = promedio de cpm de los cultivos estimulados (con mitógeno) promedio de cpm de los cultivos no estimulados (control)
Es importante también proporcionar los datos absolutos de las lecturas (promedio y desviación estándar de cada conjunto de triplicados), para evitar errores de interpretación por resultados relativos. Un índice de estimulación de 3 o mayor es generalmente considerado como normal.
3
también pueden utilizarse otros medios de cultivo como base, tales como Dulbecco, MEM, etc. la dosificación de la PHA se estandariza probando unos 3-5 individuos normales con diferentes concentraciones de la lectina. 5 es recomendable utilizar dos concentraciones de PHA, una óptima (máxima estimulación) y una subóptima, por ejemplo, una dilución 1:3 de la anterior; esto permite detectar mejor defectos en la respuesta que podrían pasar desapercibidos si se utiliza solo la dosis óptima. 4