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Interpretación de las diferentes pruebas para el diagnóstico microbiológico de la infección por SARS-CoV-2 y su enfermedad el COVID-19: RT-PCR y anticuerpos La propagación continua de la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19), ha provocado una preocupación generalizada sobre cómo diagnosticar e interpretar las pruebas de laboratorio de manera más efectiva. Actualmente están disponibles diferentes pruebas comerciales para el diagnóstico de la infección por SARS-CoV-2, que pueden resumirse de la siguiente manera: un primer grupo permite la detección del ARN del virus por métodos moleculares (RTPCR en tiempo real) y más recientemente, la detección de antígenos virales (Ag) por técnicas inmunológicas. Un segundo grupo que permite la detección de la respuesta al virus por medio de anticuerpos totales y específicos de tipo IgM, IgA e IgG. Sin embargo, como se observa en la siguiente figura (1), dada la variación de las pruebas en el curso de la infección se requiere de una evaluación cuidadosa de los resultados y una estimación de la mejor interpretación, dados los cambios que pueden suscitarse a la luz de nuevas publicaciones. Además, todas las pruebas deben tener un grado de sensibilidad y especificidad cercanos al 100%.
Tomado de: Sethraman, N., Stanleyraj, S. y Ryo, A. Interpreting diagnostic tests for SARS-Co V2. Viewpoint. JAMA. 6 de mayo de 2020 Disponible en: https://jamanetwork.com/journals/jama/fullarticle/2765837
Detección de ARN mediante RT-PCR en tiempo real La detección del ARN del virus se hace actualmente por medio del RT- PCR (reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa). Esta pruebas permite detectar la presencia del ARN viral, en muestras nasofaríngeas, orofaríngeas, esputo, aunque en algunos sistemas de prueba puede utilizarse saliva, orina o heces (4,5,6,7). Alternativamente se puede utilizar la detección de antígenos virales (proteínas del virus) por medio de pruebas inmunológicas. La prueba más utilizada y confiable para el diagnóstico de COVID-19 ha sido la prueba de RT-PCR. La mayoría de los sistemas de prueba o kits comerciales utilizan 1 o más genes, generalmente 3, que pueden incluir el gen de la cubierta (Env), la nucleocápside (N), la espiga (S), el de la polimerasa (RdRp) y los genes ORF1a y ORF1b. Las sensibilidades de las pruebas a genes individuales son comparables entre las diferentes casas fabricantes (12). La RT-PCR es la técnica de elección para diagnosticar infección aguda y un resultado positivo prácticamente confirma infección. Su sensibilidad está alrededor del 85%, por esto si hay elevada sospecha clínica y resultado negativo de la PCR, se debe repetir. La especificidad es casi del 100%. Es muy importante anotar dos aspectos para evitar resultados falsos negativos, una buena toma de muestra y el tiempo esperado después del contacto. Un resultado positivo refleja la detección del ARN viral, pero no necesariamente indica la presencia de virus viables (7). La detección del SARS COV-2 en muestras nasofaríngeas y orofaríngeas puede ocurrir desde entre 2 a 3 días antes del inicio de los síntomas y es más probable en los primeros 5 días luego del inicio de estos. La presencia en esputo es mayor conforme avanza el virus al tracto respiratorio inferior (1,7). El día en que se toma la muestra es de gran importancia para obtener resultados confiables. Resultados sobre la presencia de falsos positivos fue reportando en un estudio de Kucirka et al (16). Estos autores encontraron que la posibilidad de tener un falso negativo por PCR durante los 4 días de infección antes del inicio de los síntomas (día 5), en una persona infectada disminuye del 100% en el día 1 al 67% en el día 4. El día del inicio de los síntomas, la tasa media de falsos negativos fue del 38%. Esto disminuyó al 20% en el día 8 (3 días después del inicio de los síntomas) y luego comenzó a aumentar nuevamente, del 21% en el día 9 al 66% en el día 21. De ahí que los autores sugieren tener cuidado al interpretar las pruebas de PCR para la infección por SARS-CoV-2, particularmente si la toma de la muestra ocurrió muy temprano en el curso de la infección. Si la sospecha clínica es alta, la infección no debe descartarse basándose solo en el PCR y la situación clínica y epidemiológica debe considerarse cuidadosamente. En personas con un curso clínico más grave, la carga viral es de hasta 60 veces mayor que las que tienen un curso más leve y además, la excreción viral puede ser más duradera (7). La duración mediana de excreción viral fue de 20 días y hasta un máximo de 37 días en los curados y fue detectable hasta el final en los que fallecieron (7). Algunos pacientes continúan por más de 70 días con PCR positiva (10), aunque no se ha demostrado que puedan transmitir la enfermedad, por lo que se trataría de residuos del material viral. En pacientes con infección leve, la PCR es positiva dentro de los primeros 10 días después del contacto, aunque en algunos casos puede haber una persistencia más allá de este momento (8). En general, se puede concluir que, de acuerdo con la evidencia existente, en los casos leves, la transmisión de la infección ocurriría fundamentalmente en la primera semana de la presentación de los síntomas, desde 1-2 días antes hasta 5-6 días después. En los casos más graves esta transmisión sería más intensa y duradera (14). Las personas asintomáticas que dan positivo pueden transmitir el virus durante mientras permanecen libres de síntomas (3,8,13). Varios informes han documentado la existencia de individuos verdaderamente asintomáticos infectados con SARSCoV-2, y la evidencia emergente sugiere que estos individuos pueden ser contagiosos en los primeros 8 días (13).
Detección de anticuerpos Diversas técnicas serológicas han demostrado su utilidad en series de casos, en las que detectan anticuerpos totales, IgM, IgA e IgG, con una sensibilidad creciente en el curso de la infección, que es mayor del 90% en la segunda semana tras el inicio de los síntomas (1,4,9,12,15). Las pruebas serológicas más utilizadas detectan IgM e IgG contra antígenos virales como la
nucleoproteína, la proteína S, o el dominio de unión al receptor de la proteína (9). La presencia y cuantificación de anticuerpos IgM, IgG e IgA se realiza por medio pruebas inmunológicas (ELISA o CLIA). Los ensayos rápidos de inmuno-cromatografía tipo prueba de embarazo, no tienen la sensibilidad ni la especificidad requerida para el diagnóstico, pero si pueden utilizarse en estudios epidemiológicos (12). La detección por ELISA de anticuerpos IgM e IgG tiene más de un 95% de especificidad y la sensibilidad puede ser de hasta el 100% (9,12). La sensibilidad detecta a los verdaderos positivos, una alta sensibilidad tiene pocos falsos negativos. La especificidad detecta a los verdaderos negativo y una alta especificidad tiene pocos falsos positivos. Se ha observado que durante los primeros 7 días tras inicio de síntomas la PCR es positiva en un alto porcentaje de los pacientes y se va negativizando según pasan los días (3,5,6,7,10). Por otro lado, la presencia de la IgM y IgA puede ocurrir tan temprano como a los 4 días y el 96.8% los pacientes hacen la seroconversión por IgG antes de los 20 días del inicio de los síntomas (1,4). Los niveles de IgM e IgA declinan entre la 5 y la 7 semana y los de IgG persisten más allá de la 7 semana (Figura 1). No hay evidencia respecto a la duración de los anticuerpos frente a SARS-CoV-2 a largo plazo, aunque se observa variación en los títulos y una disminución importante alrededor de los 3 meses, de ahí que la prueba de anticuerpos no debe usarse como prueba diagnóstica, ni tiene utilidad para saber si la persona es inmune (18), a no ser que forme parte del análisis en conjunto con la prueba de PCR. Las pruebas de PCR y serológicas para anticuerpos son complementarias y aumentan la sensibilidad. En un estudio (4), el uso combinado de PCR y la detección de IgM por ELISA, fue de 98.5% comparado con 51.9% por PCR. Durante los primeros 5.5 días, el PCR tiene una mayor tasa de positividad, mientras que la IgM e IgG por ELISA, la tasa de positividad fue mayor luego de los 5.5 días del inicio de los síntomas. El Ministerio de Sanidad de España en colaboración con la Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica (12), considerando que las técnicas existentes en el mercado tienen una especificidad mayor del 95%, dan una interpretación de los resultados de las pruebas para el diagnóstico del COVID-19 que se presenta a continuación: Tabla 1. Resumen General de interpretación
El diagnóstico serológico es especialmente importante en pacientes asintomáticos, con enfermedad leve a moderada y en los que tienen más de 2 semanas de alguna sintomatología (1,13,14). Igualmente, el diagnostico serológico nos permite comprender la extensión del COVID 19 en la comunidad e identificar individuos que han producido algún tipo de inmunidad en los primeros 3 meses (9,11). Igualmente, el uso combinado de las pruebas moleculares y serológicas permiten determinar los periodos de transmisibilidad (12) según el avance de la enfermedad (Figura 2) Figura 2. Periodos medios de transmisibilidad según la gravedad de los casos de COVID-19 y periodos de detección de RNA de SARS-CoV-2 mediante PCR y de anticuerpos mediante técnicas serológicas. Tomado de: Interpretación de las pruebas diagnósticas frente a SARS-CoV-2) 24 de abril de 2020.Versión 2. Ministerio de Sanidad, Gobierno de España en colaboración con la Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica.
Referencias: 1. Sethraman, N., S. Stanleyraj y A. Ryo. Interpreting diagnostic tests for SARS-Co V2. Viewpoint. JAMA. 6 de mayo de 2020. Disponible en: https://jamanetwork.com/journals/jama/fullarticle/2765837 2. Li Q, Guan X, Wu P, Wang X, Zhou L, Tong Y, et al. Early Transmission Dynamics in Wuhan, China, of Novel Coronavirus–Infected Pneumonia. N Engl J Med [Internet]. 29 de enero de 2020 [citado 6 de febrero de 2020]; Disponible en: https://doi.org/10.1056/NEJMoa2001316 3. Pan, J. et al. Epidemiological and clinical characteristics of 26 asymptomatic severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 carriers. Journal of Infectious Diseases, online April 22, 2020 Disponible en https://bit.ly/2KMTjzd 4. Guo L, Ren L, Yang S, et al. Profiling early humoral response to diagnose novel coronavirus disease (COVID-19). Clin Infect Dis. 2020; Published online March 21, 2020. doi:10.1093/cid/ciaa310 5. Pan Y, Zhang D, Yang P, Poon LLM, Wang Q. Viral load of SARS-CoV-2 in clinical samples. Lancet Infect Dis. 24 de febrero de 2020 6. To KK-W, Tsang OT-Y, Leung W-S, Tam AR, Wu T-C, Lung DC, et al. Temporal profiles of viral load in posterior oropharyngeal saliva samples and serum antibody responses during infection by SARS-CoV-2: an observational cohort study. Lancet Infect Dis. 23 de marzo de 2020; 7. Wölfel R, Corman VM, Guggemos W, Seilmaier M, Zange S, Müller MA, et al. Virological assessment of hospitalized patients with COVID-2019. Nature. 1 de abril de 2020; Disponible en: https://www.nature.com/articles/s41586-020-2196-x 8. Liu Y, Yan L-M, Wan L, Xiang T-X, Le A, Liu J-M, et al. Viral dynamics in mild and severe cases of COVID-19. Lancet Infect Dis. 19 de marzo de 2020; 9. Quan-Xin, Long. et.al., Antibody responses to Sars-CoV-2 in patients with COVID-19. Nature Medicine. Publicado on line 29 de abril de 2020. Disponible en https://doi.org/10.1038/s41591020-0897-1 10. Wang D, Hu B, Hu C, Zhu F, Liu X, Zhang J, et al. Clinical Characteristics of 138 Hospitalized Patients With 2019 Novel Coronavirus-Infected Pneumonia in Wuhan, China. JAMA. 7 de febrero de 2020; 11. Wu F, Wang A, Liu M, Wang Q, Chen J, Xia S, et al. Neutralizing antibody responses to SARS-CoV-2 in a COVID-19 recovered patient cohort and their implications. medRxiv [Internet]. 6 de abril de 2020 [citado 14 de abril de 2020];2020.03.30.20047365. Disponible en: https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2020.03.30.20047365v1 12. Interpretación de las pruebas diagnosticas frente a SARS-CoV-2. Versión2. 24 de abril de 2020. Ministerio de Sanidad, Instituto de Salud Carlos III y SEIMC. https://www.mscbs.gob.es/en/ profesionales/saludPublica/ccayes/alertasActual/nCov-China/ documentos/INTERPRETACION_DE_LAS_PRUEBAS.pdf 13. Gandhi, M., D.S. Yokoe y D.V. Havlir. Asymptomatic transmission the Achilles ‘Heel of current strategies to control Covid-19. NEJM (editorial) 2020. Disponible en: https://www.nejm.org/ doi/pdf/10.1056/NEJMe2009758?articleTools=true 14. Li Q, Guan X, Wu P, Wang X, Zhou L, Tong Y, et al. Early Transmission Dynamics in Wuhan, China, of Novel Coronavirus–Infected Pneumonia. N Engl J Med [Internet]. 29 de enero de 2020 [citado 6 de febrero de 2020]; Disponible en: https://doi.org/10.1056/NEJMoa2001316 15. Patel, R. et. al. Report from the American Society for Microbiology COVID-19 International Summit, 23 March 2020: Value of diagnostic testing for Sars-CoV-2/COVID-19. mBio 11 (2) 1-4. Guest editorial. 16 Kucirka, L. M.m Ann Intern Med. doi:10.7326/M20-1495. El artículo fue publicado en Annals.org el 13 de Mayo 2020. 17. https://www.fda.gov/medical-devices/emergency-situations-medical-devices/eua-authorized-serology-test-performance. Acceso 15 de junio de 2020. 18. Seow, J., et al., Longitudinal evaluation and decline of antibody responses in SARS-CoV-2 infection. https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2020.07.09.20148429v1 Acceso 16 de julio de 2020.