Issuu

Organismes modificats genèticament TREB. SOC. CAT. BIOL., VOL. 61, 2010 Sobrecob biologia 61.indd 1

Organismes modificats genèticament Josep M. Casacuberta editor

Il·lustració de la sobrecoberta Panotxa de blat de moro transgènic resistent al barrinador.

treballs de la societat catalana de biologia VOLUM 61, 2010

El blat de moro resistent al barrinador MON810 era fins a començaments del 2010 l’únic organisme modificat genèticament autoritzat per ser cultivat a Europa. La presència d’aquest blat de moro a Catalunya és important, i molts anys arriba al 50 % del blat de moro sembrat.

13/12/2010 16:47:31

Organismes modificats genèticament TREB. SOC. CAT. BIOL., VOL. 61, 2010 Sobrecob biologia 61.indd 1

Organismes modificats genèticament Josep M. Casacuberta editor

Il·lustració de la sobrecoberta Panotxa de blat de moro transgènic resistent al barrinador.

treballs de la societat catalana de biologia VOLUM 61, 2010

13/12/2010 16:47:31

VOLUM 61, 2010

ÍNDEX

Organismes modificats genèticament Presentació . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . J. M. Casacuberta Eines moleculars en agricultura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A. Monfort Plantes transgèniques en recerca . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . J. F. Martínez-García i J. Bou-Torrent Plantes transgèniques i agricultura: present i futur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A. Boronat Coexistència de cultius transgènics i convencionals . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . J. Messeguer i E. Melé Biofactories: producció de proteïnes recombinants en plantes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . M. D. Ludevid i M. Torrent Animals transgènics en recerca i models animals de malalties . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . L. Montoliu Peixos transgènics . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . R. M. Ceinos i J. Rotllant La transgènesi en els animals de producció i el seu efecte sobre l’alimentació i la salut . . . . . . M. T. Paramio i D. Izquierdo L’avaluació científica dels riscos associats als organismes modificats genèticament a Europa . . . J. M. Casacuberta Qüestions ètiques plantejades per la modificació genètica de les plantes . . . . . . . . . . . . . . . . . . P. Puigdomènech

7 15 31

Organismes modificats genèticament

TREBALLS DE LA SOCIETAT CATALANA DE BIOLOGIA

TREBALLS DE LA SOCIETAT CATALANA DE BIOLOGIA Organismes modificats genèticament

47 57

VOLUM 61, 2010

73 93 105 121 135 151

TREB. SOC. CAT. BIOL., VOL. 61, 2010

Filial de l’Institut d’Estudis Catalans

Cob biologia 61.indd 1

BARCELONA 2010

13/12/2010 16:48:56

Interior 59 Soc Cat Bio

2/3/2009

14:19

Página 1

NORMES DE PUBLICACIÓ DE TREBALLS DE LA SOCIETAT CATALANA DE BIOLOGIA Abast. Treballs de la Societat Catalana de Biologia (Treb. Soc. Cat. Biol.) publica: a) monografies i revisions sobre temes de ciències de la vida encarregades per la Societat, i b) comunicacions presentades a les sessions ordinàries i extraordinàries organitzades per la Societat o les seves seccions especialitzades. Els temes poden ser proposats pels membres del Consell Directiu o per socis que desitgin ocupar-se de la preparació d’un volum de la revista fent d’editors. El Consell Directiu decideix si un tema és apropiat per dedicar-hi un volum de Treb. Soc. Cat. Biol. Idioma. Els originals seran redactats en català, excepte en casos justificats per als quals el Consell Directiu pugui acceptar una altra llengua. Lliurament dels originals. La submissió implicarà que el material és original i que no ha estat enviat, acceptat o publicat en cap altre lloc. Els originals els lliurarà l’editor del volum per correu electrònic (scb@iecat.net), adreçat al president del Consell de Redacció. Cal enviar els següents arxius, preferentment empaquetats amb ZIP: — Un arxiu únic en format RTF o MS Word anomenat Text_TSCB_[cognom de l’editor], amb tot el text del volum, incloent-hi, en aquest ordre: coberta, índex, presentació, els capítols en l’ordre desitjat i les seves taules, si n’hi ha. Les pàgines hauran d’anar numerades consecutivament començant per la núm. 1, que serà la de la coberta. Tot el text serà escrit íntegrament amb Times New Roman de cos 12 amb interlineat d’1,5. L’arxiu amb el text no podrà contenir figures ni objectes incrustats. — Un arxiu per cada figura anomenat Figura_[número de figura]_[cognom del primer autor]. Les figures, si no contenen text (a part del peu), es poden remetre en qualsevol dels formats gràfics habituals (PNG, JPEG, TIFF); si contenen text, s’han d’enviar en un format que permeti editar-lo (EPS, PDF, Powerpoint). — Cal enviar també una còpia impresa electrònica en format PDF de tot el volum, anomenada TSCB_[cognom de l’editor], amb tot el contingut, incloent-hi les figures. Aquest arxiu es farà servir com a text imprès de referència durant el procés de tractament del text. Per aquest motiu, els autors i l’editor han de tenir cura personalment que en aquesta còpia hi hagi tot el contingut imprès correctament, incloent-hi sobretot els símbols o caràcters especials, equacions, etc. Cada article o, en un volum monogràfic, cada capítol, incloent-hi la bibliografia, taules i figures, hauria de tenir una extensió entre quinze i vint fulls DIN A4, escrits amb el tipus, mida i interlineat esmentats abans. Només es podrà ultrapassar aquest límit amb l’acord previ del Consell de Redacció de Treballs de la SCB. Els volums monogràfics haurien de contenir un mínim d’uns deu capítols. El Consell de Redacció consultarà especialistes, els quals recomanaran si un article pot publicar-se immediatament, necessita revisió, o bé és rebutjat. Els autors rebran notificació de la decisió. Si el treball requereix revisió, es facilitaran als autors els comentaris escrits dels especialistes que l’hagin revisat. Estructura dels originals. Els originals que no s’ajustin a aquestes instruccions seran retornats als autors perquè els modifiquin abans de la seva tramitació. Dintre de cada capítol o article se seguirà el següent ordre pel que fa als diferents components:

— Títol, escrit en majúscules i negreta. — Nom i primer cognom de l’autor. Si n’hi ha més d’un, els seus noms aniran separats amb una coma. L’autor per a la correspondència s’identificarà amb un asterisc posat al final del seu cognom. — Adreça postal completa de tots els autors. Telèfon, fax i correu electrònic de l’autor per a la correspondència — Resum en català, d’un màxim de dues-centes paraules. — Paraules clau en català, màxim de cinc. — Resum en anglès (que, òbviament, haurà d’ésser traducció fidel del resum en català i haurà d’anar precedit de la traducció del títol del manuscrit). — Paraules clau en anglès, màxim de cinc. — Text, que, si és una revisió, podrà estar dividit fins a dos nivells en els apartats (no numerats) que es creguin més oportuns. Si es tracta d’un article de recerca, el manuscrit haurà d’incloure Introducció, Materials i mètodes, Resultats i Discussió. No es podran fer servir notes a peu de pàgina ni text subratllat. — Agraïments, si escau. — Referències, segons el format indicat més endavant. — Taules. Portaran un títol descriptiu breu i aniran numerades correlativament amb números àrabs. Una taula per full. — Text de peus de figures. Il·lustracions. Les il·lustracions cal que siguin de bona qualitat i contrast, tenint en compte la possible reducció, ja que, a causa del format de la revista, un cop publicades poden ésser, com a màxim, de 14 cm d’ample per 19 cm d’alt. Totes les il·lustracions seran en blanc i negre, excepte en cas que el color sigui essencial per a comprendre’n el significat. Atès que la publicació de fotografies en color encareix molt el procés editorial, els autors que desitgin incloure alguna fotografia en color hauran de pagar les despeses extra. En cas que les taules o figures hagin estat publicades anteriorment, caldrà indicar-ne la procedència i, si escau, el copyright. Referències. Totes les referències, tant publicades com en premsa, citades al text, hauran d’ésser incloses a la llista de referències, ordenades alfabèticament. En el text s’indicaran els noms dels autors i l’any de publicació per ordre cronològic; en el cas que una referència tingui més de dos autors, se citarà el primer seguit d’et al. A continuació hi ha exemples de l’estil que s’ha de seguir per a citar articles, capítols o monografies. CODINA, C.; VILADOMAT, F.; BASTIDA, J.; LLABRÉS, J. M. (1989). «Potencial biotecnològic del cultiu de cèl·lules vegetals per a l’obtenció de productes farmacèutics». Treb. Soc. Cat. Biol., 40: 47-70. MELLADO, R. P. (1987). «Vectores utilizados para la manipulación y expresión de genes». A: VICENTE, M.; RENART, J. Ingeniería genética. Madrid: CSIC, 21-30. WOLFFE, A. (1995). Chromatin structure and function. Londres: Academic Press. Proves d’impremta i extrets. De tots els originals acceptats, l’autor de correspondència en rebrà unes proves d’impremta per a corregir-les, i aquestes proves hauran d’ésser retornades, per correu urgent, a: Secretaria de la Societat Catalana de Biologia, c/ Maria Aurèlia Capmany, 14-16, 08001 Barcelona (tel. 933 248 584; fax 932 701 180; a/e: scb@iec.cat) dins el termini màxim d’una setmana. En les proves no podran ésser introduïdes correccions d’estil, i només hi seran admeses les de caràcter ortogràfic i tècnic. Un cop publicat l’article, es lliuraran a l’autor vint extrets sense càrrec.

TREBALLS DE LA SOCIETAT CATALANA DE BIOLOGIA INSTRUCTIONS FOR AUTHORS Scope. Treballs de la Societat Catalana de Biologia (Treb. Soc. Cat. Biol.) publishes: a) monographs and reviews on life sciences topics commissioned by the Society; and b) lectures presented at both ordinary and extraordinary sessions organized by the Society or their specialized sections. Submission of originals. Submission implies that the material is original and that has not been submitted, accepted or published elsewhere. Originals will be submitted by the editor of the volume to the following e-mail address scb@iecat.net addressed to the President of the Publications Board. The following files will be provided, preferably ZIP-compressed: — A single file in format RTS or MS Word named Text_TSCB_ [editor’s last name], containing all the text of the volume, including, in this order, the following parts: cover page, table of contents, presentation, the chapters in the order that they should appear and their corresponding tables. Pages should be consecutively numbered, staring with page 1, which will be the cover page. All text should be written in Times New Roman, pt 12 with 1.5 spaces between lines. The text file cannot contain figures and incrustated objects. — One file for each figure named Figure_[figure number]_ [last name of the first author]. Figures that do not contain text characters can be submitted in standard graphic format (PNG, JPEG, and TIFF); figures that do contain text have to be submitted in an editable format (EPS, PDF, Powerpoint). — A single PDF file named TSCB_[editor’s last name] containing all text plus all figures. Authors and the editor are responsible that in this file, all contents appear correctly printed, in particular special symbols and equations. Each article or, in a monograph, each chapter, including text plus references, tables and figures, should be between fifteen and twenty DIN A4 sheets long, written with the font type and spaces between lines specified above. The maximum length can be surpassed only with prior approval from the Treballs de la SCB Publications Board. Monographs should have a minimum of 10 chapters. The Publications Board will contact specialists who will recommend immediate publication, acceptance after modifications or rejection of the submitted originals. Authors will be notified in due course. If revision is required, authors will receive the corresponding written comments for modifications. Structure of manuscripts. Manuscripts that do not conform to these instructions will be returned to the authors for modifications before their processing. Each chapter or manuscript should have the following structure: — Title, written in capitals and bold case. — Name and last name of author. If there is more than one author, their names will be separated with commas. The corresponding author will be identified with an asterisk placed after their last name.

— Full postal address of all authors. Phone, fax and e-mail address of the corresponding author. — Abstract, maximum two hundred words. — Keywords, maximum five — Text of manuscript. In the case of review articles, a maximum of two (not numbered) subheadings will be accepted. In the case of research articles, the manuscript will include the following sections: Introduction, Materials and Methods, Results, Discussion. Footnotes or underlined text will not be accepted. — Acknowledgments, if appropriate — References (see format below) — Tables. They will be preceded with a brief, descriptive title and will be numbered with Arabian numerals. One table per page — Figure legends Figure. Figures should be of good quality and contrast, taking into account that they can be reduced in size, and that once published they can be at most 14 cm width x 19 cm height. All figures will be in black and white, unless the use of color is essential to understand their meaning. The authors will pay extra costs of publishing color figures. If tables or figures have been previously published elsewhere, the original source must be indicated and it will be the responsibility of authors to deal with possible copyrights. References. All references published and in press cited within the text will have to be included in the reference list arranged in alphabetical order by the last name of the first author. In the text, the name of the authors and the publication year should be used in chronological order. If there are more than two authors, only the name of the first author followed by «et al.» will be used. The following examples represent the appropriate manner in which to cite articles, book chapters and books, respectively. CODINA, C.; VILADOMAT, F.; BASTIDA, J.; LLABRÉS, J. M. (1989). «Potencial biotecnològic del cultiu de cèl·lules vegetals per a l’obtenció de productes farmacèutics». Treb. Soc. Cat. Biol., 40: 47-70. MELLADO, R. P. (1987). «Vectores utilizados para la manipulación y expresión de genes». A: VICENTE, M.; RENART, J. Ingeniería genética. Madrid: CSIC, 21-30. WOLFFE, A. (1995). Chromatin structure and function. Londres: Academic Press. Galleyproofs and reprints. Once a manuscript has been accepted, the corresponding author will receive the galleyproofs. Galleyproofs will be returned by courier to: Secretaria de la Societat Catalana de Biologia, c/Maria Aurèlia Capmany, 1416, 08001 Barcelona (tel. +34-933 248 584; fax +34-932 701 180; e-mail: scb@iec.cat) within one week. Style corrections cannot be accepted in galleyproofs. Only typographic and technical corrections will be accepted. Once published, authors will receive 20 reprints free of charge.

TREBALLS DE LA SOCIETAT CATALANA DE BIOLOGIA FILIAL DE L’INSTITUT D’ESTUDIS CATALANS

VOLUM 61, 2010

BARCELONA 2010

Treballs de la SCB, revista anual de la SCB Direcció: Ricard Roca, Vocal de Publicacions

COMITÈ DE PUBLICACIONS RICARD ROCA, President, Vocal de Publicacions, SCB FRANCESC PIFERRER, Vocal, Institut de Ciències del Mar RAMON BARTRONS, Vocal, Universitat de Barcelona JOAN JOFRE, Vocal, Universitat de Barcelona CÈLIA MARRASÉ, Vocal, Institut de Ciències del Mar MERCÈ PIQUERAS, Vocal, Presidenta de l’ACCC

© dels autors dels articles Editat per la Societat Catalana de Biologia (filial de l’Institut d’Estudis Catalans) Carrer del Carme, 47. 08001 Barcelona Compost per Ricard Roca ricardroca@gmail.com Imprès a Limpergraf, SL Polígon industrial Can Salvatella, carrer de Mogoda, 29-31 Barberà del Vallès ISSN: 0212-3037 Dipòsit Legal: B.12164-1963

Organismes modificats genèticament Josep M. Casacuberta editor

TREBALLS DE LA SOCIETAT CATALANA DE BIOLOGIA VOLUM 61, 2010

ÍNDEX Organismes modificats genèticament Presentació . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . J. M. Casacuberta

Eines moleculars en agricultura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A. Monfort

Plantes transgèniques en recerca . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . J. F. Martínez-García i J. Bou-Torrent

Plantes transgèniques i agricultura: present i futur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A. Boronat

Coexistència de cultius transgènics i convencionals . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . J. Messeguer i E. Melé

Biofactories: producció de proteïnes recombinants en plantes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . M. D. Ludevid i M. Torrent

Animals transgènics en recerca i models animals de malalties . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . L. Montoliu

Peixos transgènics . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105 R. M. Ceinos i J. Rotllant La transgènesi en els animals de producció i el seu efecte sobre l’alimentació i la salut. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 121 M. T. Paramio i D. Izquierdo L’avaluació científica dels riscos associats als organismes modificats genèticament a Europa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 135 J. M. Casacuberta Qüestions ètiques plantejades per la modificació genètica de les plantes . . . . . . . . . . . . 151 P. Puigdomènech

PRESENTACIÓ Josep M. Casacuberta La transgènia és una de les últimes tècniques que s’han incorporat a la millora genètica. Des que l’ésser humà va descobrir l’agricultura, al Neolític, ha domesticat plantes i animals, i ha modificat els seus genomes de manera profunda. Aquest procés ha continuat fins avui, incorporant al llarg de la història les noves descobertes científiques i tecnificant-se com més va més. La producció d’animals de granja i l’obtenció de llavors han passat de ser una activitat desenvolupada pels agricultors i ramaders mateixos a ser un treball professional dut a terme per empreses especialitzades. En el cas de les plantes, des dels anys cinquanta del segle passat, la pràctica totalitat dels agricultors dels països desenvolupats compren les llavors a empreses que en certifiquen la qualitat. Aquest alt grau de tecnificació i de professionalització de la producció de llavors podria haver fet pensar que la incorporació de la transgènia a aquest procés es faria de manera suau i sense gaires polèmiques. Res més lluny de la realitat, si més no a casa nostra. Europa és una realitat diferent d’altres països o continents, i també ho ha estat en aquest cas. Mentre que a Europa la utilització d’organismes modificats genèticament (OMG) en agricultura és encara molt limitada i és objecte d’una gran polèmica, a d’altres països el cultiu d’OGM es fa a gran escala i està transformant l’agricultura i l’economia de manera important. Els Estats Units d’Amèrica van apostar decididament per aquestes noves tècniques des del primer moment, tant des del punt de vista de les empreses de llavors com del finançament públic per a la recer-

ca bàsica en genètica molecular vegetal. Actualment la transgènia és una eina fonamental en la producció de llavors en aquest país; els Estats Units són un dels principals exportadors de productes OMG i les empreses nord-americanes controlen bona part del mercat mundial de llavors modificades genèticament. Val a dir que les plantes transgèniques que s’han comercialitzat fins ara han estat dissenyades per millorar caràcters agronòmics (resistència a plagues o tolerància a herbicides) que són especialment útils per a una agricultura intensiva, en grans extensions i fortament tecnificada, com la nord-americana. Tot i que les plantes transgèniques van néixer a Europa i als EUA, el seu desenvolupament i el seu cultiu s’ha estès a d’altres parts del món, i actualment es cultiven transgènics a gran escala a Amèrica del Sud i a l’Àsia. L’Argentina i el Brasil s’han convertit en els darrers anys en dos dels països productors i exportadors d’OMG (sobretot de soja) més importants del món. Tots dos països cultiven majoritàriament OMG desenvolupats per companyies multinacionals, i la seva recerca en el camp és encara limitada. Els països asiàtics, com la Xina, han seguit una estratègia diferent i, si bé cultiven alguns OGM desenvolupats per companyies multinacionals, l’extraordinària inversió que han fet en recerca en els darrers anys els ha permès col·locar-se a la primera línia de la recerca bàsica en plantes i desenvolupar els seus OGM propis. Els EUA, l’Argentina, el Brasil, l’Índia, el Canadà i la Xina són, per aquest ordre, els productors de plantes transgèniques més importants del món actualment.

8 J. M. CASACUBERTA

La situació a Europa és molt diferent. L’agricultura no es veu a les ciutats europees com una activitat industrial sinó com una activitat quasi artesanal, fortament lligada a la tradició i que, en l’imaginari collectiu, forma part de la natura a la qual les societats urbanes han hagut de renunciar. És significatiu que els europeus anem al camp a passejar, mentre que als EUA a poca gent se li acudiria d’anar a passar un dia entre els camps de blat de moro que ocupen la meitat de l’estat de Missouri. Aquesta és probablement una de les raons que han fet que els europeus miréssim amb recel aquestes noves plantes. Però hi ha d’altres raons, tant polítiques com culturals. Quan a mitjan anys noranta van arribar els primers productes obtinguts d’organismes modificats genèticament (OMG) als mercats europeus, es van trobar amb uns consumidors que sortien de diverses crisis alimentàries (dioxines, «vaques boges»...) i de salut pública (contaminacions de bosses de sang per a transfusions amb el virus VIH) i amb una societat en què l’ecologia anava guanyant pes com a opció política que es recolzava no solament sobre partits tradicionals sinó, i sobretot, en organitzacions no governamentals que han recollit els fruits d’un cert descontent amb la política tradicional. Aquesta situació sociopolítica, l’ús que alguns actors polítics i industrials han fet de la polèmica incipient i una actitud sovint prepotent per part de les empreses de llavors, va fer que en poc temps la modificació genètica passés de ser un argument comercial (el triturat de tomàquets transgènics de maduració retardada es va vendre al Regne Unit amb una etiqueta ben grossa que explicava el seu origen transgènic i que els diferenciava de la resta) a un problema seriós per a les companyies del sector alimentari. Una de les principals preocupacions que susciten els OGM és el seu possible risc per

a la salut o el medi ambient. Per això Europa va regular des del primer moment la comercialització dels productes derivats d’OMG i va establir una legislació que assegura una anàlisi prèvia i molt a fons dels possibles riscos per a la salut humana, la salut animal i el medi ambient. Malgrat això el recel amb què els consumidors veuen aquests productes no ha minvat i l’ús polític del tema dels transgènics a Europa ha continuat sent important. Aquesta situació ha fet que durant quasi deu anys hi hagi hagut a Europa una moratòria de facto per a l’aprovació de nous OMG. En aquest moment, tot i que s’ha aprovat la importació de diversos OMG, hi ha només dos OMG aprovats per al cultiu a Europa, i han passat més de dotze anys entre l’aprovació del primer, el blat de moro MON 810 resistent al barrinador, aprovat originalment l’any 1998, i la patata amb contingut de midó modificat per a ús industrial de l’empresa BASF, aprovada el març del 2010. Deixant de banda l’escassa aprovació de nous OMG, aquesta situació ha tingut també un impacte sobre el finançament europeu de la recerca bàsica en genètica molecular de plantes, que ha estat pràcticament inexistent durant aquests deu anys, i sobre les indústries de biotecnologia vegetal europees que, havent estat pioneres al final dels anys vuitanta, han anat tancant, venent-se a companyies multinacionals o traslladant la seva recerca fora d’Europa. Catalunya, juntament amb l’Aragó, és la regió on més èxit ha tingut el blat de moro transgènic a Europa, i s’ha mantingut relativament al marge de les polèmiques més dures fins fa poc. El MON 810, blat de moro resistent al barrinador, que és una plaga particularment estesa a casa nostra, ha coexistit als camps catalans i aragonesos amb blat de moro convencional sense que es produïssin problemes importants i sense que això preocupés gaire l’opinió pública.

PRESENTACIÓ 9

Això ha canviat una mica darrerament, atès que l’any 2009 es va presentar una iniciativa legislativa popular per prohibir els OMG (des de la recerca a la comercialització) a Catalunya. Aquesta proposta va estar acompanyada d’una campanya contra els transgènics molt activa al carrer i als mitjans de comunicació que va portar a la primera línia de l’actualitat el tema. Aquesta ILP va fer que els partits polítics i diferents entitats catalanes organitzessin jornades informatives amb participació de científics, OMG i associacions d’agricultors, tant productors d’agricultura ecològica, oposats als transgènics, com productors de blat de moro transgènic, que tenen un pes particularment important a Catalunya. Finalment, després d’un debat intens i de bona qualitat, la majoria del Parlament va decidir no admetre a tràmit la ILP. Aquest és, doncs, un tema polèmic amb implicacions tant en la recerca com en les indústries biotecnològiques, en l’agricultura i, finalment, en els consumidors. Per això quan em van proposar d’editar un volum de Treballs de la SCB sobre els transgènics em va semblar que podia ser un marc excel·lent per abordar els diferents aspectes d’aquest tema des del rigor científic que caracteritzen aquests volums. Tot i que fins ara les plantes transgèniques comercialitzades incorporen millores de caràcters agronòmics, el potencial de la transgènia per a la millora genètica de plantes és molt gran. Per això hem inclòs un capítol en què es descriuen les modificacions genètiques que estan en fase de desenvolupament i que podrien arribar als mercats ben aviat. De la mateixa manera, tot i que fins ara només s’han comercialitzat plantes modificades genèticament, hi ha ja animals transgènics en fases de desenvolupament molt avançades. És difícil de predir si veurem algun dia a Europa aliments derivats d’animals transgènics,

però al Canadà i als EUA ja hi ha peixos transgènics que es troben en fase molt avançada d’avaluació i podrien ser aprovats per al consum ben aviat. Per altra banda, el potencial dels animals transgènics com a biofactories per a la producció de fàrmacs és molt important, cosa que podria fer que la transgènia en animals s’apliqués sobretot a aquests objectius. Per tot això hem cregut oportú no limitar aquest recull a les plantes modificades genèticament i incloure també un capítol sobre animals de granja transgènics i un altre sobre peixos modificats genèticament. De la mateixa manera, sovint es comparen els productes transgènics amb els productes convencionals, els quals s’acostumen a qualificar com a naturals, i s’oblida l’alt grau de tecnificació i la sofisticació científica i tècnica que hi ha darrere l’agricultura que coneixem com a tradicional. Per això hem decidit incloure un capítol dedicat a les tècniques moleculars utilitzades en agricultura, que ajudarà a establir un marc de referència correcte per a la valoració del que pot aportar la transgènia. Un tema clau a l’hora de la comercialització dels transgènics és el marc regulador i el paper que té l’anàlisi de riscos. Aquest és un aspecte sovint desconegut, cosa que fa molt difícil la reflexió serena sobre l’ús dels OMG. Per aquest motiu hem inclòs un capítol en què s’explica la legislació europea en matèria d’OMG i es detallen les anàlisis que han de superar aquests productes abans de poder ser comercialitzats. Per altra banda, tot i que sovint pensem en els transgènics utilitzats en alimentació quan ens parlen d’OMG, no s’ha d’oblidar l’extraordinària importància de la transgènia animal i vegetal en recerca bàsica. Per això hem inclòs també dos capítols que tracten d’aquest tema. Finalment, hi ha molts aspectes ètics i socials que es barregen en les discussions

10 J. M. CASACUBERTA

sobre els OMG. El fet que aquestes tecnologies s’estiguin utilitzant per a la producció d’aliments ens obliga a preguntar-nos quin impacte poden tenir sobre la qualitat i la disponibilitat d’aliments al món i, d’altra banda, també ens obliga a preguntar-nos com veuen els consumidors aquests productes i com arriba al consumidor la informació sobre el que són i el que podrien ser en el futur els OMG. Per això no hem volgut restringir aquest volum de la SCB als aspectes més tècnics de la transgènia i hem incorporat un capítol que fa una anàlisi dels aspectes ètics del problema. Ens hauria agradat poder tenir més col·laboracions que tractessin aspectes ètics i socials del tema dels transgènics, com ara el paper que han tingut els mitjans de comunicació en la difusió i la discussió de la utilització de la transgènia en millora genètica de plantes i animals, però malgrat els nostres esforços al final no ha estat possible. En qualsevol cas, crec que el recull d’articles que presentem en aquest volum de Treballs de la SCB dóna una visió àmplia i científicament sòlida de la transgènia que pot ser d’utilitat per a tots aquells que volen estar al corrent dels últims avenços en aquest camp i volen formar-se una opinió ben fonamentada sobre la utilitat i la conveniència de les seves possibles aplicacions. ELS AUTORS Amparo Monfort («Eines moleculars en agricultura») és doctora en ciències per la Universitat de Neuchâtel (Suïssa). És investigadora de l’IRTA en el Centre de Recerca en Agrigenòmica, CRAG (CSICIRTA-UAB). Està especialitzada en genètica molecular de plantes, en particular en la genòmica i seqüenciació i en la millora genètica en plantes. Ha participat en projectes nacionals i internacionals com la se-

qüenciació del genoma d’Arabidopsis o la construcció del mapa genètic de la maduixa. Col·labora amb empreses per fer selecció i millora de noves varietats vegetals amb l’ajuda de marcadors genètics. Els doctors Jaume Martínez-García i Jordi Bou-Torrent («Plantes transgèniques en recerca») treballen al Departament de Genètica Molecular del CRAG. El doctor Martínez-García és professor de recerca de l’ICREA i el doctor Bou-Torrent és un investigador associat sènior. Durant la seva trajectòria han desenvolupat diferents projectes de recerca d’investigació bàsica. Actualment, la seva línia de recerca està centrada a entendre la regulació per la llum del desenvolupament vegetal utilitzant la planta Arabidopsis thaliana com a sistema model. El doctor Albert Boronat («Plantes transgèniques i agricultura: present i futur») és catedràtic en bioquímica i biologia molecular de la Universitat de Barcelona. La seva recerca està centrada principalment en l’estudi del metabolisme vegetal i en l’aplicació d’estratègies d’enginyeria metabòlica orientades a la millora de la qualitat nutricional i a la producció de compostos vegetals d’interès farmacèutic i de biocombustibles. La doctora Joaquima Messeguer i el doctor Enric Melé («Coexistència de cultius transgènics i convencionals») treballen al Centre de Cabrils de l’IRTA, al grup de cultiu in vitro del Departament de Genètica Vegetal, recentment anomenat Programa de Genòmica i Biotecnologia. Joaquima Messeguer és doctora en biologia per la Universitat de Barcelona. La seva carrera investigadora s’ha desenvolupat dins l’àmbit del cultiu in vitro dels vegetals, i ha abordat diversos aspectes com la micropropagació, l’obtenció de metabòlits secundaris i la transformació genètica. Des de l’any 1998, i dins l’àmbit de diversos pro-

PRESENTACIÓ 11

jectes nacionals i europeus, s’ha especialitzat en l’estudi de la coexistència entre OMG i cultius convencionals. Enric Melé és doctor en biologia per la Universitat de Barcelona. La seva carrera investigadora s’ha desenvolupat dins l’àmbit del cultiu in vitro dels vegetals, i ha abordat diversos aspectes com la micropropagació, l’obtenció de metabòlits secundaris i la transformació genètica. És el president de la Societat Espanyola de Cultiu in vitro (SECIVTV). Des de l’any 1998, i dins l’àmbit de diversos projectes nacionals i europeus, s’ha especialitzat en l’estudi de la coexistència entre OMG i cultius convencionals. Les doctores M. Dolors Ludevid i Margarita Torrent («Biofactories: producció de proteïnes recombinants en plantes») treballen al CRAG. M. Dolors Ludevid és doctora en ciències químiques, investigadora del CSIC i cap d’un grup de recerca al CRAG. Bioquímica i biòloga molecular de plantes de formació, és especialista en transport subcel·lular de proteïnes vegetals. Darrerament part dels seus treballs deriven a aplicacions biotecnològiques, concretament a la producció de proteïnes recombinants d’interès terapèutic i industrial en sistemes vegetals. L’any 2002 va fundar l’empresa de biotecnologia ERA Biotech, de la qual actualment és assessora científica i col·laboradora. Margarita Torrent és doctora en biologia. Com a investigadora del CSIC s’ha especialitzat en biologia cel·lular i molecular de plantes, concretament en estudis sobre l’expressió i modificació de les proteïnes de reserva del blat de moro. Des de l’any 2000 ha focalitzat els seus treballs en aplicacions biotecnològiques per a la producció de proteïnes recombinants en plantes. Va ser cofundadora de l’empresa ERA Biotech. Lluís Montoliu («Animals transgènics en recerca i models animals de malalties») és doctor en ciències biològiques per la Uni-

versitat de Barcelona, i interessat en la generació i l’ús dels organismes modificats genèticament en recerca. Va fer la seva tesi doctoral al CID-CSIC de Barcelona, sota la direcció del professor Pere Puigdomènech i el doctor Joan Rigau, caracteritzant segments de DNA de blat de moro que permetien dirigir l’expressió gènica en diversos òrgans de la planta. Va fer una estada postdoctoral al DKFZ de Heidelberg, Alemanya, entre el 1991 i el 1995, al laboratori del professor Günther Schütz, explorant la regulació del gen de la tirosinasa i contribuint a descriure noves tecnologies per a la generació de ratolins transgènics amb cromosomes artificials. Va fer un breu retorn a Barcelona (1995-1996), a la Universitat Autònoma de Barcelona, abans d’incorporar-se a Madrid, al Centro Nacional de Biotecnología (CNB-CSIC), on treballa actualment des del 1997. El seu grup continua interessat en la generació i l’ús de ratolins transgènics com a models animals per a l’estudi de malalties humanes, especialment aquelles que comporten una alteració de la pigmentació, com l’albinisme. Més informació: http://www.cnb.csic.es/~montoliu. Els doctors Josep Rotllant i Maria Ceinos («Peixos transgènics») treballen a l’Instituto de Investigaciones Marinas de Vigo. Josep Rotllant és llicenciat en bioquímica per la Universitat Autònoma de Barcelona i doctor en ciències biològiques per la mateixa universitat. Actualment és científic titular del Consell Superior d’Investigacions Científiques (IIM-CSIC), en l’àrea de recursos naturals (aqüicultura i biotecnologia). Ha treballat en l’estudi de l’homeòstasi del calci i el desenvolupament del sistema musculoesquelètic en peixos a la Universitat de Nijmegen (Holanda), al CCMAR (Portugal), al Center of Marine Biotechnology (COMB, Maryland, EUA) i a la Universitat d’Eugene (Oregon, EUA). La seva àrea d’investigació principal és l’estudi del

12 J. M. CASACUBERTA

desenvolupament del sistema musculoesquelètic i tegumentari en peixos mitjançant l’ús de tècniques d’expressió gènica diferencial. Rosa Maria Ceinos és llicenciada en biologia per la Universitat de Vigo i doctora en ciències biològiques per la mateixa universitat. Actualment és becària postdoctoral en el Consell Superior d’Investigacions Científiques (IIM-CSIC) sota la supervisió del doctor Rotllant. La seva àrea d’investigació se centra principalment en l’estudi del desenvolupament del sistema tegumentari en peixos. Les doctores Maria Teresa Paramio i Dolors Izquierdo («La transgènesi en els animals de producció i el seu efecte sobre l’alimentació i la salut») treballen a la Facultat de Veterinària de la UAB. Maria Teresa Paramio Nieto és catedràtica en producció animal de la Facultat de Veterinària de la UAB. Llicenciada en veterinària per la Universitat de Lleó, va fer el seu doctorat en l’Institut Nacional d’Investigacions Agràries de Saragossa. Va ingressar a la UAB com a professora titular el 1988. El seu treball de recerca s’ha desenvolupat en l’àrea de la fisiologia de la reproducció dels remugants, concretament en la producció in vitro d’embrions, amb una atenció especial a l’estudi de la competència dels oòcits per al desenvolupament embrionari normal. Dolors Izquierdo i Tugas és professora agregada de producció animal a la Facultat de Veterinària de la UAB. L’any 1992 va obtenir una beca FPI i l’any 1997 es doctorà en veterinària per la UAB, amb la tesi doctoral que portà per títol Cultiu d’embrions de cabrum produïts in vitro. Des de llavors ha continuat fent recerca en l’àrea de la fisiologia de la reproducció dels remugants, concretament en la producció in vitro d’embrions i l’estudi de la qualitat dels oòcits i dels embrions obtinguts in vitro. El doctor Josep M. Casacuberta («L’avaluació científica dels riscos associats als or-

ganismes modificats genèticament a Europa») és investigador científic del CSIC al CRAG. És doctor en bioquímica i biologia molecular per la UAB. Ha treballat a l’Institut Nacional de la Recerca Agronòmica (INRA) a França i ha estat professor de la Universitat París VII i sotsdirector de l’Institut de Biologia Molecular de Barcelona, del CSIC. Actualment és director del Departament de Genètica Molecular Vegetal del CRAG. Des de l’any 1986 treballa en projectes de recerca estudiant com són i com evolucionen els genomes de plantes, amb una atenció particular al DNA no codificant i als elements mòbils. A més d’una trentena d’articles en revistes científiques internacionals, ha publicat treballs de divulgació i articles d’opinió en diversos diaris i revistes. Des de l’any 2006 és membre del Panel Científic d’OGM de l’Agència Europea de Seguretat Alimentària (EFSA). Pere Puigdomènech i Rosell («Qüestions ètiques plantejades per la modificació genètica de les plantes») és llicenciat en ciències físiques per la Universitat de Barcelona, doctor (menció en química física) per la Universitat de Montpeller, i en ciències biològiques per la Universitat Autònoma de Barcelona. És professor d’investigació del CSIC i director del Centre de Recerca en Agrigenòmica (CSIC-IRTA-UAB). Autor d’uns cent noranta treballs de recerca, s’ha especialitzat en aspectes biofísics de l’estructura de les proteïnes, en la regulació del gens eucariotes i, més recentment, en biologia molecular de plantes. És autor també d’uns dos-cents articles de divulgació científica en diaris (El Periódico de Catalunya, El País, etc.) i revistes nacionals i internacionals (com la revista Nature). És membre de l’Institut d’Estudis Catalans, de l’Organització Europea de Biologia Molecular, de la Reial Acadèmia de Ciències i Arts de Barcelona i de l’Academia Europaea, membre estranger de l’Académie

PRESENTACIÓ 13

d’Agriculture de France, i ha estat president de la Societat Catalana de Biologia (2000-2003). Ha estat membre de comitès científics consultius europeus, com el Scientific Steering Committee de la Comissió Europea o el Panel d’Organismes Modificats Genèticament d’EFSA. És membre del

Grup Europeu d’Ètica de les Ciències i les Noves Tecnologies, membre de la Comisión Nacional de Bioseguridad i president del Comitè d’Ètica del CSIC. Rebé la Medalla Narcís Monturiol de la Generalitat de Catalunya (1992) i el Premi de la Fundació Catalana per la Recerca (2000).

DOI: 10.2436/20.1501.02.90

Organismes modificats genèticament (Josep M. Casacuberta, ed.) Treballs de la SCB. Vol. 61 (2010) 15-29

EINES MOLECULARS EN AGRICULTURA Amparo Monfort Institut de Recerca i Tecnologia Agroalimentària, Centre de Recerca en Agrigenòmica (CSIC-IRTA-UAB) Adreça per a la correspondència: Amparo Monfort Vives. Institut de Recerca i Tecnologia Agroalimentària, Centre de Recerca en Agrigenòmica (CSIC-IRTA-UAB). Ctra. de Cabrils, km 2. 08348 Cabrils. Tel.: 937 507 686. Adreça electrònica: amparo.monfort@irta.es. RESUM Els marcadors moleculars són les eines utilitzades per l’ésser humà com a suport per a l’agricultura, i han representat un gran avenç en la millora genètica vegetal. A mesura que s’han anat descobrint els diferents tipus de marcadors moleculars, i que s’han anat millorant les tècniques per utilitzar-los, s’ha obtingut la selecció de noves varietats vegetals amb un temps més curt que fent servir la millora clàssica. Els marcadors són usats en plantes per a l’estudi de la seva variabilitat genètica, la identificació de les diferents varietats que hi ha en el mercat o en la natura o la selecció de plantes heterozigotes. En projec tes de millora genètica els marcadors han servit per seleccionar noves varietats escollides perquè tenen característiques d’interès en la planta o en el fruit. Són utilitzats també per elaborar els mapes genètics de les diferents espècies vegetals. En tots els casos es poden utilitzar diferents tipus de marcadors moleculars basats en el DNA, com els RFLP, els AFLP, els microsatèl·lits i els SNP. Paraules clau: marcador molecular, mapa genètic, varietat vegetal, millora, germoplasma. MOLECULAR TOOLS IN AGRONOMY SUMMARY Molecular markers are the tools used by breeders in support of agriculture and that meant a breakthrough in plant breeding. As we have been exploring different types of molecular markers, and improved techniques to apply them, we select new plant varieties in a shorter time than using the classical breeding. These markers are used in plants to study their genetic variability, the identification of different varieties on cultivated or wild Rebut: 09/02/2010. Acceptat: 01/03/2010.

16 A. MONFORT

cultivars and the selection of heterozygous plants. In other projects of marker assisted selection they were used to select new varieties characterized to have some specific para meters of the plant or fruit. They are also used to produce the genetic maps of different plant species. In all cases you can use different types of DNA-based molecular markers such as RFLPs, AFLPs, SNPs and microsatellites. Key words: molecular marker, genetic map, cultivar, breeding, germoplasme. INTRODUCCIÓ La millora genètica vegetal (MGV) és l’evolució de les espècies vegetals forçada per l’acció humana, i adaptada als ambients modificats pels éssers humans. Això és un procés lent i continu que ha fet que el millorador vegetal estigui obert a les noves tecnologies i a la incorporació de noves eines que puguin ajudar-lo en aquest procés. La genòmica i el desenvolupament de marcadors moleculars ha estat un pas decisiu en l’avenç de la MGV, ha incorporat un salt qualitatiu i ha escurçat el període de selecció de noves varietats en el procés que s’anomena selecció assistida per marcadors (MAS). En les bases de l’agricultura la modificació dels cultius era inconscient. Per exemple, per selecció de les espigues més productives, l’agricultor sembrava la temporada següent una llavor de blat que no tenia fragilitat en la tija, ja que aquesta no es recol·lectava. En poques generacions l’agricultor havia modificat l’estructura genètica de la població silvestre original i havia millorat l’espècie. Com més va més aquesta selecció era menor, ja que havia desaparegut la variabilitat genètica a causa de la uniformitat del cultiu. Per modificar l’estructura genètica de les poblacions i aconseguir els objectius de maximitzar el rendiment i el valor comercial del cultiu, el millorador ha d’establir un programa de MGV separat en tres etapes: generació de variabilitat, selecció i fixació dels genotips seleccionats. El mètode clàs-

sic per generar variabilitat són els encreuaments, però la selecció dels pares per encreuar, l’anàlisi de les descendències i els retroencreuaments per fixar els caràcters són un procés llarg i laboriós que comporta diversos anys, depenent del tipus de planta. Els marcadors moleculars han aportat a la MGV un salt qualitatiu de gran envergadura. MARCADORS MOLECULARS Un marcador genètic és un polimorfisme o diferència heretable d’herència mendeliana senzilla, i l’anàlisi de la seva variabilitat ens permet fer estudis genètics. Els primers marcadors descrits foren marcadors morfològics, basats en l’observació de les diferències fenotípiques degudes a gens amb efecte major que presenten una herència simple i són estables enfront de diferents ambients (Immer i Henderson, 1943; Allard, 1953). Un bon marcador ha de ser independent de l’ambient i d’altres regions del genoma, ha de ser estable i reproduïble en diferents experiments, altament polimòrfic, codominant, i per tenir una alta aplicabilitat ha de ser econòmic. Els marcadors moleculars han representat un gran avenç en la millora genètica vegetal, a mesura que s’han anat descobrint els diferents tipus i s’han anat millorant les tècniques per utilitzar-los. Són usats en plantes per a l’estudi de la variabilitat genètica, la identificació de les diferents varietats que hi ha en el mercat i en projectes de millora genèTreb. Soc. Cat. Biol., 61: 15-29

EINES MOLECULARS EN AGRICULTURA 17

tica. Són utilitzats també per elaborar els mapes genètics de les diferents espècies vegetals. Un bon marcador ha de reunir un conjunt de característiques, com són: a) l’alt grau de polimorfisme per distingir el nombre més gran de mostres possible, b) la codominància, que permet distingir individus homozigots i heterozigots, c) s’ha de distribuir de manera homogènia al llarg de tot el genoma, d) ha de tenir un comportament neutre i no estar sotmès a selecció natural, e) senzill, f ) d’interpretació objectiva i g) de reproductibilitat fàcil. En tots els casos es poden utilitzar diferents tipus de marcadors moleculars com els isoenzims o els marcadors de DNA (RFLP, AFLP, microsatèl·lits i SNP). Depenent de les seves característiques es pot escollir un o altre tipus de marcador per a les diferents aplicacions (vegeu la taula 1). Els primers marcadors moleculars descrits, els isoenzims, eren marcadors bioquímics basats en dues varietats d’una proteïna (isoenzim) que poden presentar diferent càrrega i, per tant, diferent mobilitat electroforètica. Aquests marcadors, molt utilitzats en la dècada dels vuitanta (Bournival et al., 1989), són codominants, i permeten distingir els individus heterozigots, però els trobem en un nombre reduït i no cobreixen tot el genoma. En cereals tenen una aplicació directa sobre la qualitat de la llavor, i detecten la propietat de blat dur o farinós. Restriction fragment length polymorphism (RFLP) Els primers marcadors de DNA que es van desenvolupar al final dels anys setanta foren els RFLP. Aquests marcadors es basen a detectar diferències de longitud d’uns fragments, que es generen en digerir el DNA genòmic amb enzims de restricció Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 15-29

(detecta polimorfismes a escala de dianes de restricció). El producte de la digestió se separa mitjançant una electroforesi en un gel d’agarosa, i es transfereix a una membrana pel mètode del transferència Southern (Sambrook i Russell, 2001). A continuació s’afegeix una sonda marcada (radioactiva o de fluorimetria), que hibridarà amb els fragments homòlegs immobilitzats a la membrana. Les sondes que s’utilitzen procedeixen de genoteques de cDNA (normalment són gens coneguts) o de DNA genòmic (fragments amplificats de manera inespecífica). Els RFLP solen segregar com a marcadors codominants, i es poden trobar en qualsevol part del genoma, i en un nombre quasi il·limitat. Per aquest motiu són molt utilitzats per a la construcció de mapes genètics (Joobeur et al., 1998). A més, és possible comparar mapes genètics entre espècies pròximes, ja que l’ordre dels marcadors RFLP en el mapa detectat amb la mateixa sonda es conserva entre les espècies properes. Els principals inconvenients d’aquest tipus de marcador molecular és que es necessita molt de temps per desenvolupar-ne de nous, tenen un elevat cost econòmic (el cost de la infraestructura necessària és considerable), i a més és necessària la presència de personal qualificat (normalment s’utilitza radioactivitat). Però els avantatges són que els RFLP no necessiten conèixer la seqüència, i a més, és relativament fàcil passar-los a marcadors basats en la seqüència. Així es poden passar RFLP potencialment útils per a projectes de millora genètica a uns marcadors més senzills, partint de la seqüenciació de l’RFLP. Podríem dir que són uns marcadors de base.

18 A. MONFORT Taula 1.

Característiques dels diferents marcadors moleculars

Marcador

Detecció polimorfisme

Codominància

Transferible

Reproduïble

Seqüència

Cost

Temps

RFLP

Pol. mitjà

Codominant

Interespecífic

Molt rep.

Alt

Molt

AFLP

Molt alt pol.

Dominant

Poc rep.

Baix

Molt

RAPD

Baix

Dominant

Poc rep.

Baix

Poc

CAPS

Molt baix pol.

Codominant

Intraespecífic

Reproduïble

Sí

Alt

Mitjà

SSR

Alt pol.

Codominant

Interespecífic

Reproduïble

Sí

Alt

Poc

SNP

Alt pol.

Codominant

Interespecífic

Reproduïble

Sí

Alt

Molt

Marcadors de tipus PCR Amb el descobriment de la reacció en cadena de la polimerasa (PCR), que permet copiar i amplificar qualsevol fragment de DNA, es va obrir un nou camp per desenvolupar nous marcadors moleculars. Són marcadors basats en la seqüència del DNA més fàcils d’utilitzar, i que es poden obtenir a un ritme més elevat que els RFLP. Els principals marcadors moleculars d’aquest tipus que es van desenvolupar i que s’utilitzen actualment, són: ― AFLP: amplified fragment length polymorphism ― RAPD: random amplified polymorphic DNA ― SSR o microsatèl·lits: simple sequence repeats ― CAPS: cleaved amplified polymorphic sequence ― SNP: single nucleotide polymorphism Tots aquests marcadors es basen en una reacció d’amplificació de fragments de DNA, i es beneficien dels avantatges d’aquesta tècnica: es necessita molt poca quantitat de DNA per mostra, és ràpida de fer, i produeix una amplificació específica dels fragments. Els encebadors (petits fragments de DNA de cadena senzilla) que intervenen en la reacció reconeixen dues zones concretes de la seqüència, i s’amplifica la regió compresa entre totes dues.

AFLP (amplified fragment length polymorphism) Aquests marcadors es basen en una amplificació selectiva de fragments de DNA obtinguts mitjançant una digestió amb enzims de restricció (Vos et al., 1995). A aquests fragments s’uneixen uns oligonucleòtids o adaptadors compatibles amb els extrems cohesius dels enzims, i s’amplifica per PCR. Jugant amb la complementarietat de l’oligonucleòtid i el lloc de restricció, es pot disminuir o augmentar el nombre de bandes amplificades. Aquesta tècnica és capaç de generar molts marcadors moleculars, que posteriorment es poden adaptar a un mètode d’aplicació fàcil en la millora i, per tant, són importants per generar molta informació. RAPD (random amplified polymorphic DNA) Aquesta és una de les tècniques més versàtils des que es van desenvolupar al principi dels anys noranta (Welsh i McClelland, 1990; Williams et al., 1990). Es basa a utilitzar una col·lecció de decanucleòtids (deu parells de bases de seqüència aleatòria), que amplifiquen àrees a l’atzar del genoma (s’utilitza un únic encebador en la reacció de PCR). Com que l’encebador és Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 15-29

EINES MOLECULARS EN AGRICULTURA 19

molt curt i la temperatura que s’utilitza en la PCR és poc restrictiva (36 °C), s’assegura que l’encebador s’unirà a moltes regions del genoma. Si aquesta unió es produeix entre dues regions amb orientació oposada, i dins del rang de mides amplificades per la polimerasa (200-2.000 pb), es produirà l’amplificació del fragment. Com els marcadors AFLP, solen ser marcadors dominants que s’analitzen com a presència/ absència del producte amplificat. És una tècnica molt còmoda, ràpida i econòmica que requereix poc DNA per amplificar i poca infraestructura. No cal tenir coneixements previs de la seqüència, i permet distingir de manera molt ràpida els diferents individus. Microsatèl·lits o simple sequence repeats (SSR) Els microsatèl·lits es van descriure per primer cop cap als anys vuitanta (Hamada et al., 1982), i consisteixen en seqüències formades per repeticions en tàndem d’un a sis nucleòtids. Aquest tipus de seqüències es troben àmpliament distribuïdes per tot el genoma, i les repeticions més freqüents són les de dinucleòtids. El nombre de repeticions de cada microsatèl·lit és variable, i el grau de polimorfisme d’aquest tipus de marcador és molt elevat. L’elevat polimorfisme i l’àmplia distribució en el genoma serien els dos avantatges més importants d’aquest tipus de marcador. L’amplificació del microsatèl·lit es fa mitjançant una parella d’encebadors específics que el flanquegen. Aquest és un dels principals desavantatges del marcador, ja que necessitem conèixer prèviament la seqüència per dissenyar els encebadors, i es tracta d’un procés molt costós i laboriós. Però una vegada ja disposem dels encebadors dissenyats, són molt fàcils d’utilitzar, ja Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 15-29

que llavors només necessitem una reacció de PCR. Són marcadors codominants i altament reproduïbles, i s’han utilitzat satisfactòriament en la construcció de mapes genètics de diferents espècies vegetals. També es poden utilitzar per a la identificació varietal, i són molt útils en espècies amb baixos nivells de polimorfisme. Per tant, són molt útils en la millora, ja que permeten separar diferents individus de la mateixa espècie i d’alta consanguinitat. Cleaved amplified polymorphic sequence (CAPS) Els marcadors CAPS els van descriure per primer cop Konieczny i Ausubel, l’any 1993. Consisteixen en una PCR d’amplificació de DNA genòmic, seguida d’una digestió enzimàtica amb un enzim de restricció. Els encebadors que s’utilitzen per a la PCR són d’uns 20-25 pb, i permeten amplificar una regió específica del genoma. A continuació, les mostres es carreguen en un gel d’electroforesi per observar els polimorfismes de les bandes digerides. Els polimorfismes que es produeixen entre les seqüències es deuen a diferències en la seqüència de DNA amplificada (mutacions puntuals, insercions, delecions, etc.), que produeixen la presència/absència d’una diana de restricció. Aquests canvis provoquen que l’enzim digereixi de manera diferencial les seqüències, i el patró de bandes resultant és diferent. Per a aquest tipus de marcador es necessita molt poca quantitat de DNA i la infraestructura necessària al laboratori no és gaire elevada. Un altre avantatge és que són uns marcadors altament reproduïbles. Són, a més, marcadors codominants, i els patrons de bandes dels gels es poden interpretar en termes de locus i al·lels. La princi-

20 A. MONFORT

pal limitació d’aquest marcador però, és que es necessita conèixer la seqüència prèviament per tal de dissenyar els encebadors de la PCR (com el cas dels SSR), i aquest és un procés costós i laboriós. Un cop obtinguts aquests marcadors són molt utilitzats en selecció assistida per marcadors, per exemple per identificar en espècies hortícoles les línies resistents a un virus a partir d’un encreuament entre un pare susceptible i l’altre resistent (vegeu la figura 1). Single nucleotide polymorphism (SNP) Els SNP són una nova generació de marcadors derivats de la tecnologia de seqüenciació del DNA. Els SNP són diferències d’un sol nucleòtid, i representen el tipus de variació més freqüent del DNA (Brookes, 1999). Perquè un canvi de base sigui considerat com a SNP i, per tant, un possible marcador molecular, la seva freqüència allèlica ha de ser superior a l’1 % en una població. Les insercions o delecions (INDEL) d’una sola base poden ser considerades com a SNP, encara que el seu origen sigui diferent. A vegades els SNP tenen associats un fenotip, i aleshores parlem d’una muta-

ció, però en general la pressió evolutiva acostuma a eliminar els canvis en les regions codificants. El mètode més senzill per descobrir un SNP és obtenir la seqüència directament dels productes de PCR obtinguts dels pares de la població d’estudi (vegeu la figura 2). La comparació de seqüències obtingudes de grans projectes de seqüenciació amb eines informàtiques (bases de dades d’EST, reseqüenciació en diferents individus) són una font important de descobriment de SNP in silico. Per detectar i mapar un SNP en una població o en un gran nombre d’individus, a part de la reseqüenciació, hi ha altres mètodes de detecció de SNP, com la PCR específica d’al·lel (Newton et al., 1989), la dHPLC (separació per cromatografia d’alta resolució en condició desnaturalitzant), els SSCP (single strand confirmation polymorphism) i la piroseqüenciació, i també les sondes Taqman i diferents formes de la singlebase extension (SNaPshot i mass array) (Landegren et al., 1998). Aquesta tècnica, molt utilitzada en millora vegetal per l’aplicació fàcil que presenta, consisteix a amplificar un fragment que contingui l’SNP amb encebadors específics, i a continuació dissenyar un nou encebador per a la seqüència amplificada, que tingui la posició 3´ just

Figura 1. Marcador CAPS M132 de meló lligat al gen nsv que dóna resistència al virus del mosaic del meló (Morales et al., 2005). La presència del locus resistent es correspon amb la detecció de la banda de 400 pb. La planta A és el genotip resistent i la planta B el genotip sensible. H correspon al genotip heterozigot. En les dotze plantes analitzades de la descendència trobem el genotip sensible (S) i el genotip resistent (R), i també els heterozigots (H). M correspon al marcador de pes molecular de les bandes de DNA. Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 15-29

EINES MOLECULARS EN AGRICULTURA 21

abans de l’SNP. Amb aquest nou encebador es fa una nova reacció de PCR amb els quatre didesoxinucleòtids (que estan marcats amb quatre fluorocroms diferents). D’aquesta manera només s’incorpora un nucleòtid, i amb un aparell de seqüenciació automàtic es pot determinar de quin es tracta. Un cop es té a punt la tècnica, es poden manipular moltes mostres de manera ràpida i eficient, encara que és una tecnologia cara i el cost per mostra continua sent elevat.

Les substitucions nucleotídiques tenen lloc amb una freqüència relativament alta al llarg del genoma, i són molt útils per construir mapes físics. Molts dels polimorfismes detectats per altres tipus de marcadors (RFLP, AFLP, CAPS), el que detecten realment és un SNP (una mutació puntual o un polimorfisme en el genoma). El desenvolupament de nous marcadors SNP està evolucionant d’una manera molt ràpida en introduir-se en el mercat les noves tecnologies de seqüenciació massiva de genomes, que permeten obtenir la seqüència

Figura 2. SNP, cromatograma de la seqüència obtinguda amb l’encebador PP705 en set individus seleccionats, F1, 59, 46, 815, 32, 83 i 48, que inclou un de parental (815) homozigot i un d’híbrid (F1) heterozigot. Els individus amb l’al·lel A presenten un pic corresponent a la base citosina a la posició central del cromatograma, i els individus amb l’al·lel B presenten un pic corresponent a la timina. Els individus heterozigots mostren els dos pics superposats, encara que el detector n’identifiqui un (timina) de manera preferent. Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 15-29

22 A. MONFORT

d’un genoma d’una manera econòmica i en un sol experiment. Comparant la seqüència d’un conjunt d’individus seleccionats per la seva distància genètica podem descobrir una col·lecció de SNP repartits al llarg de tot el genoma i que es poden transformar en xips de DNA, per detecció de SNP de manera massiva, i llavors caracteritzar el genotip dels individus. APLICACIÓ DELS MARCADORS MOLECULARS A LA MILLORA GENÈTICA VEGETAL Identificació de varietats La identificació varietal ha estat un dels objectius constants de l’estudi del material vegetal. L’observació de les característiques morfològiques és el primer pas de la identificació, però quan volem observar diferències a escala intraespecífica, per identificar varietats de la mateixa espècie, els marcadors genètics adquireixen una importància rellevant per poder diferenciar varietats cultivades, i defensar els drets de l’obtentor de la varietat. Per a la identificació de varietats hem de tenir en compte la definició de varietat. Una varietat vegetal és aquella que reuneix tres característiques essencials: a) ser distinta de les altres en determinades observacions, b) ser uniforme, de manera que diferents individus de la mateixa varietat es puguin considerar iguals i c) ser estable, és a dir, que transmeti les seves característiques als descendents. Actualment els avenços en biotecnologia permeten obtenir noves plantes amb la incorporació d’un sol gen que li confereix una característica diferent. Aquestes noves línies obtingudes per metodologia es consideren com a varietats essencialment derivades, ja que mantenen l’es-

tructura genètica de la varietat de la qual deriven. Les eines moleculars per protegir la propietat d’una varietat i els drets de l’obtentor han de ser capaces de distingir una varietat de les més properes i fins i tot distingir si és una varietat essencialment derivada. Els marcadors moleculars són actualment molt fiables i tenen capacitat de discernir canvis en un sol nucleòtid per diferenciar les noves varietats. L’aplicació d’aquests marcadors als estudis filogenètics i de distància genètica entre les línies permet al millorador dissenyar els futurs encreuaments per a l’obtenció de noves línies que incorporaran potencialment les característiques de tots dos pares o les milloraran. Caracterització de bancs de germoplasma La uniformitat en els cultius de l’agricultura moderna ha portat a una reducció de la base genètica dels cultius, i a la pèrdua de capacitat de resposta enfront de l’atac d’un patogen o un fenomen meteorològic imprevist. Per això s’ha desenvolupat un moviment de salvaguarda dels recursos filogenètics. Aquest moviment es plasma en la creació dels bancs de germoplasma, en què l’objectiu és la recol·lecció, conservació, propagació i ús dels recursos genètics vegetals. El millorador reconeix que l’ús dels recursos genètics és un dels principals components dels programes de millora vegetal. L’estratègia clàssica de la conservació i utilització del germoplasma es basa en el fenotip i la disposició ecogeogràfica de les varietats vegetals conservades. El resultat directe de l’aplicació dels marcadors moleculars a l’avaluació del germoplasma ha estat, en primer lloc, l’ordenació de les entrades al banc i la identificació de duplicacions. En segon lloc, la classificació Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 15-29

EINES MOLECULARS EN AGRICULTURA 23

de les varietats ha permès calcular la distància genètica entre les entrades i identificar les zones geogràfiques d’origen de la variabilitat de l’espècie. Variabilitat i distància genètica són dades objectives per al millorador, que les pot utilitzar per escollir els nous pares dels seus encreuaments per introduir nous al·lels que suposadament aportaran nous caràcters. L’anàlisi amb marcadors de la descendència d’aquests encreuaments permetrà detectar el grau d’herència d’aquests al·lels, i l’anàlisi fenotípica aportarà la informació de la millora en caràcters d’interès agronòmic. Estudi de la variabilitat genètica intraespecífica i interespecífica Els estudis comparatius existents demostren que l’ús de marcadors genètics proporciona els paràmetres més ajustats per identificar al·lels diferents en els encreuaments intraespecífics (Lee, 1995), que poden aportar variabilitat genètica en aspectes molt concrets. Com més properes siguin les línies parentals de l’encreuament, més difícil resulta identificar nous genotips entre la descendència i, per tant, individus amb noves combinacions al·lèliques. Quan el millorador no troba la variabilitat necessària dintre de l’espècie recorre als encreuaments interespecífics. Aquest tipus d’encreuaments s’utilitzen per introgressar en una planta caràcters d’herència senzilla d’espècies molt properes. Ens referim, per exemple, a la resistència a malalties, amb la recuperació de l’estructura genètica de l’espècie original després de diverses etapes de retroencreuament amb l’espècie recurrent. Els marcadors faciliten la selecció de l’individu heterozigot sempre que tinguem un marcador lligat o molt proper a l’herència del caràcter. Seleccionant amb marcadors no cal tenir la introTreb. Soc. Cat. Biol., 61: 15-29

gressió en homozigosi per tornar a fer el retroencreuament, és a dir, no cal que seleccionem pel caràcter, sinó que podem detectar l’al·lel lligat al caràcter i retroencreuar l’individu, rastrejant en la descendència la presència de l’al·lel considerat. D’aquesta manera es redueix a la meitat el nombre d’encreuaments per fer. En el cas de tenir marcadors flanquejant el caràcter es pot reduir la regió introgressada. Aquests últims anys la generació de mapes genètics d’alta densitat de poblacions d’encreuament entre espècies de tomàquet conreat i espècies de tomàquet silvestre ha permès la localització de regions cromosòmiques introgressades que milloren el color i el rendiment del tomàquet. El procediment consisteix en la generació per retroencreuaments de línies del cultivar amb segments cromosòmics de la línia silvestre (Tanksley i McCouch, 1997). El rendiment ha estat avaluat en diverses regions del món. Aquesta tècnica ha estat aplicada a diferents espècies vegetals com la civada o el meló. Estudi d’heterosis Un dels mètodes de millora genètica vegetal que ha revolucionat la indústria de llavors ha estat la producció de varietats híbrides. El principal avantatge dels híbrids és, per sobre del rendiment, l’homogeneïtat de la producció i el valor comercial de la llavor. L’híbrid comercial és el producte de l’encreuament de dues línies pures seleccionades per produir heterosi. L’heterosi o «vigor de l’híbrid» és el fenomen segons el qual els individus descendents (F1) d’un encreuament de dues línies endogàmiques mostren unes característiques fenotípiques superiors a la mitjana de les línies parentals, o el valor del pare més gran.

24 A. MONFORT

L’heterosi, descrita ja al principi del segle xx (East, 1936), és un mecanisme àmpliament documentat en plantes per determinar un increment de la biomassa, el rendiment, la mida de la planta i del fruit, la fertilitat, la resistència a malalties o plagues d’insectes, etc. La base genètica del vigor de l’híbrid encara és objecte de discussió entre els genetistes. El fenomen ha estat aplicat amb gran èxit a la millora de plantes, inicialment en l’obtenció de línies hibrides de blat de moro d’alt rendiment procedents de l’encreuament de línies endogàmiques. Aquest fenomen és un dels principals responsables de la revolució verda dels anys setanta. Actualment el 95 % del blat de moro plantat als Estats Units i el 65 % del plantat arreu del món (Swanson Wagner et al., 2006) és híbrid (vegeu la figura 3). El coneixement genètic de dues línies pot permetre al millorador predir l’heterosi. L’aportació de l´ús de marcadors moleculars per conèixer la distància

genètica entre les línies ha demostrat que els encreuaments entre línies que pertanyen a diferents grups heteroics presenten més heterosis que els encreuaments entre línies del mateix grup (Hallauer et al., 1988). Però no ens permet predir l’heterosi en híbrids produïts entre grups molt distants i tampoc si apareix el fenomen de l’epístasi o regulació per altres gens. Detecció d’híbrids Així mateix, el control de la qualitat de la llavor híbrida mitjançant l’ús de marcadors moleculars ha permès comercialitzar un gran nombre d’espècies hibrides que actualment asseguren els nivells de producció agrícola i d’uniformitat de característiques de qualitat de la planta i del fruit (Meyer et al., 2007). Cal pensar que la majoria d’espècies hortícoles com el tomàquet, el meló, el cogombre, el pebrot, etc., són

Figura 3. Manifestació fenotípica de l’heterosi. a) L’heterosi es manifesta típicament en els caràcters de la planta adulta com el rendiment o la llargària de la panotxa de blat de moro. b) L’heterosi també es manifesta normalment en el desenvolupament de les llavors (Hochholdinger i Hoecker, 2007). Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 15-29

EINES MOLECULARS EN AGRICULTURA 25

conreades a partir de la llavor híbrida que assegura al productor un rendiment homogeni. El control de la pol·linització creuada entre les línies escollides mitjançant marcadors codominants assegura la producció de llavor híbrida. Construcció de mapes genètics Els marcadors moleculars es poden fer servir tant per a la identificació varietal o l’estudi de la variabilitat genètica com per elaborar mapes genètics. Els mapes genètics són representacions gràfiques de l’ordre dels marcadors genètics en un cromosoma o grup de lligament. El concepte de lligament entre marcadors genètics en l’herència va ser proposat fa quasi un segle per Morgan (1911), i el primer mapa genètic lineal, del cromosoma X de Drosophila melanogaster, el va publicar Sturtevant el 1913. La descoberta dels marcadors moleculars en nombre il·limitat per tot el genoma ha fet possible la construcció de mapes de lligament detallats en tots els organismes de reproducció sexual (vegeu la figura 4). El mapatge de marcadors moleculars es basa en el principi que els gens i els marcadors segreguen per la via de la recombinació cromosòmica durant la meiosi, fet que en permet l’anàlisi en la descendència (Paterson, 1996). Els gens o marcadors que estan pròxims en el cromosoma es transmeten junts a la descendència amb una freqüència molt més elevada que els gens o marcadors que estan a una distància més gran. En una població segregant hi ha una barreja de genotips en què podem observar cada un dels parentals o recombinants. El nombre de genotips recombinants entre dos locus es pot fer servir per calcular la freqüència de recombinació i convertir-la en una mesura de distància genètica entre els locus. Com més genotips recombinants Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 15-29

apareixen entre dos locus, major és la distància genètica mesurada en centimorgans (cM). És a dir, la freqüència de recombinació és directament proporcional a la distància genètica entre els marcadors. Anàlisi de caràcters quantitatius La diversitat present a les poblacions segregants, tant a escala morfològica com molecular, és una valuosa eina per estudiar les bases genètiques de l’herència de caràcters qualitatius i quantitatius. L’anàlisi dels caràcters quantitatius (quantitative trait loci, QTL) és una manera de descriure la variació de les distribucions fenotípiques contínues i determinar el nombre de locus que controlen un caràcter fenotípic i, per tant, la seva segregació en la població (Tanksley, 1993). Una de les estratègies per identificar els gens implicats en un fenotip és l’aproximació per gens candidats o GC (Pflieger et al., 2001). Es consideren GC els gens amb funció coneguda o suposada, relacionats amb caràcters d’interès i que poden correspondre a locus majors o QTL. Els gens aïllats en espècies model poden ser considerats com a GC per a altres espècies. Quan es coneixen a fons les vies metabòliques o fisiològiques d’un caràcter d’interès els GC s’escullen entre els gens implicats en la via. Quan no es coneix la seqüència del gen en l’organisme, podem recórrer a la informació d’altres espècies properes que ens permet dissenyar encebadors degenerats de regions conservades per tractar d’amplificar el gen. Per trobar seqüències en espècies properes hem de cercar en les col·leccions d’EST provinents de genoteques de cDNA. Per localitzar els gens candidats en genètica de plantes s’utilitzen dues estratègies: comparar la posició en el mapa genètic del gen candidat amb els locus associats al caràcter d’interès, i analitzar i comparar

26 A. MONFORT

la segregació d’un caràcter fenotípic en una població i el polimorfisme del gen candidat. La posició dels QTL pot ser bastant aproximada; un QTL pot cobrir regions amb centenars de gens, i són necessaris experiments de mapatge de precisió mitjançant encreuaments que confirmin la segregació del gen candidat o el marcador amb un QTL, amb càlculs estadístics d’associació. Aquesta anàlisi serà més complexa si el caràcter està controlat per més d’un gen (poligènic). Caldran experiments de transformació gènica o silenciament per demostrar l’associació del QTL amb el gen candidat. Aquest mètode ha estat validat amb espècies com el tomàquet o l’arròs per a caràcters d’interès agronòmic, com la forma,

o aspectes relatius a la resposta a l’estrès hídric en arrels (Causse et al., 1999; Zheng et al., 2006). Els caràcters d’interès agronòmic tenen en general una herència quantitativa. Molts estan relacionats amb la maduració del fruit, definida com un conjunt de canvis que tenen lloc en el fruit en les darreres etapes de creixement. Aquest període està controlat genèticament i implica un ampli ventall de canvis bioquímics i fisiològics que comporten l’adquisició de qualitats organolèptiques i nutricionals que fan el fruit apte per al consum humà. Entre les modificacions més significatives destaquen canvis en el color, la textura, la mida, la forma, el contingut en sucres i àcids orgànics (res-

Figura 4. Mapa genètic de Fragaria construït amb el genotipatge dels 76 individus F2 de l’encreuament interespecífic entre Fragaria vesca × Fragaria nubicola. Distribució en set grups de lligament de 228 locus que cobreixen una distància de 569 cM. En negre els SSR i els gens, i en vermell els RFLP (Vilanova et al., 2008). Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 15-29

EINES MOLECULARS EN AGRICULTURA 27

ponsables del gust) i el contingut en substancies volàtils (responsables de l’aroma).

precoç de la forma del fruit o el color de la polpa.

Selecció assistida per marcadors

CONCLUSIONS

El procés d’aplicar els marcadors moleculars per identificar QTL i utilitzar-los per seleccionar les plantes que presenten l’al·lel específic del marcador associat al caràcter és el que es denomina selecció assistida per marcadors (MAS, marker assisted selection). Aquest procés és diferent dels processos de modificació genètica perquè en aquest cas se selecciona l’individu que conté el gen, però no es modifica el seu material genètic. El marcador molecular utilitzat en selecció no sempre és el gen responsable de la variació del caràcter, sinó que pot ser un marcador o fragment de DNA proper al QTL i localitzat en el mapa perquè segrega igual que la variació del caràcter. Aquests marcadors són senzills i de baix cost, per utilitzar en grans poblacions. Una recombinació ens pot separar el marcador del QTL, però com més petita és la distància entre el marcador i el QTL més baixa és la possibilitat que se separin per recombinació. Com més polimòrfic és un marcador més efectiu serà en la selecció assistida. La MAS ha estat utilitzada de manera àmplia en el cultiu de cereals, per exemple en el blat de moro, en què grans empreses com Monsanto o Syngenta han invertit grans capitals per utilitzar-lo de manera rutinària en la seva producció de llavors. La principal aplicació de la MAS es desenvolupa en el camp de la resistència a malalties en cereals, o en QTL associats a la fixació de nitrogen en plantes farratgeres. Els arbres fruiters, com la pomera, el presseguer o la perera (Dirlewanguer et al., 2004) tenen grans programes de selecció assistida basats en SSR i SNP per augmentar la resistència a malalties o la selecció

L’ús de marcadors moleculars en la millora d’espècies vegetals es va generalitzar en la dècada dels noranta, en què apareixen una gran nombre de referències en espècies llenyoses, hortícoles i cereals. Els marcadors són usats en plantes per a l’estudi de la variabilitat genètica, la identificació de les diferents varietats o la selecció de plantes heterozigotes. En projectes de millora genètica els marcadors han servit per seleccionar noves varietats escollides perquè tenen unes determinades característiques d’interès en la planta o en el fruit. L’efectivitat de la selecció assistida per marcadors en la millora genètica vegetal dependrà en primer lloc de l’existència d’un mapa d’alta densitat fet amb marcadors transferibles entre encreuaments. Molts dels caràcters agronòmics es comporten com a gens majors, incloent-hi resistència a patògens o característiques de fruit, fet que permet una aplicació millor de la MAS. Els QTL han d’estar flanquejats per gens estretament lligats a la variació del caràcter, ja que en cas contrari això implica recombinació entre el marcador i el QTL, i es reduirà la resposta a la selecció. Des del punt de vista genètic el coneixement dels genomes d’espècies properes permet l’ús de marcadors lligats a QTL en diferents espècies a causa de la conservació del DNA i la transferibilitat dels marcadors entre genomes de la mateixa família.

Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 15-29

28 A. MONFORT

BIBLIOGRAFIA Allard, R. W. (1953). «Inheritance of some seed coat colours and patterns in lima beans». Hilgardia, 22: 167-177. Bournival, B. L.; Scott, S. W.; Vallejos, C. E. (1989). «An isozyme marker for resistance to race 3 of Fusarium oxysporum f. sp. Lycopersici in tomato». Theor. Appl. Genet., 78: 489-494. Causse, M.; Duffe, P.; Gomez, M. C.; Buret, M.; Za mir, D.; Gur, A.; Lemaire-Chamley, M. C.; Rothan, C. (2004). «A genetic map of candidate genes and QTLs involved in tomato fruit size and composition». J. Exp. Bot., 55 (403): 1671-1685. Dirlewanger, E.; Graziano, E.; Joobeur, T.; Garriga-Calderé, F.; Cosson, P.; Howad, W.; Arús, P. (2004). «Comparative mapping and marker-assisted selection in Rosaceae fruit crops». Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 101: 9891-9896. East, E. M. (1936). «Heterosis». Genetics, 21: 375-397. Hallauer, A. R.; Russell, W. A.; Lamkey, K. R. (1988). «Corn breeding» A: Sprague, G. F.; Dubley, J. W. [ed.]. Corn and Corn Improvement. Vol. 18. 3a ed. Madison: ASA, CSSA i SSSA, p. 463564. Hamada, H.; Petrino, M. G.; Kakunaga, T. (1982). «A novel repeated element with Z-DNA-forming potential is widely found in evolutionarily diverse eukaryotic genomes». Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79: 6465-6469. Hochholdinger, F.; Hoecker, N. (2007) «Towards the molecular basis of heterosis». Trends in Plant Science, 12: 427-432. Immer, F. R.; Henderson, M. T. (1943) «Linkage studies in Barley». Genetics, 28: 419-440. Joobeur, T.; Viruel, M. A.; Vicente, M. C. de; Jàuregui, B.; Ballester, J.; Dettori, M. T.; Verde, I.; Truco, M. J.; Messeguer, R.; Batlle, I.; Quarta, R.; Dirlewanger, E.; Arús, P. (1998). «Construction of a saturated linkage map for Prunus using an almond × peach F2 progeny». Theoretical and Applied Genetics, 97: 1034-1041. Konieczny, A.; Ausubel, F. M. (1993). «A procedure for mapping Arabidopsis mutations using co-dominant ecotype-specific PCR-based markers». The Plant Journal, 4: 403-410. Landegren, U.; Nilsson, M.; Kwok, P. Y. (1998). «Reading bits of genetic information: methods for single-nucleotide polymorphism analysis». Genome Res., 8: 769-776. Lee, M. (1995) «DNA markers and plant breeding programs». Advan. in Agron., 55: 265-344.

Meyer, S.; Pospisil, H.; Scholten, S. (2007). «Heterosis associated gene expression in maize embryos 6 days after fertilization exhibits additive, dominant and overdominant pattern». Plant Mol. Biol., 63: 381-391. Morales, M.; Orjeda, G.; Nieto, C.; Leeuwen, H. van; Monfort, A.; Charpentier, M.; Caboche, M.; Arús, P.; Puigdomènech, P.; Aranda, M. A.; Dogimont, C.; Bendahmane, A.; Garcia-Mas, J. (2005). «A physical map covering the nsv locus that confers resistance to Melon necrotic spot virus in melon (Cucumis melo L.)». Theor. Appl. Genet., 111: 914-922. Morgan, T. H. (1911). «Random segregation versus coupling in Mendelian inheritance». Science, 36: 718-719. Newton, C. R.; Graham, A.; Heptinstall, L. E.; Powell, S. J.; Summers, C.; Kalsheker, N.; Smith, J. C.; Markham, A. F. (1989). «Analysis of any point mutation in DNA. The amplification refractory mutation system (ARMS)». Nucleic Acids Res., 17: 2503-2516. Paterson, A. H.; Lan, T. H.; Reischmann, K. P.; Chang, C.; Lin, Y. R.; Liu, S. C.; Burow, M. D.; Kowalski, S. P.; Katsar, C. S.; DelMonte, T. A.; Feldmann, K. A.; Schertz, K. F.; Wendel, J. F. (1996). «Toward a unified genetic map of higher plants, transcending the monocot-dicot divergence». Nat. Genet., 14 (4): 380-382. Pflieger, S.; Lefebvre, V.; Causse, M. (2001). «The candidate gene approach in plant genetics: a review» Mol. Breed. 7: 275-291. Sambrook, J.; Fritsch, E. F.; Maniatis, T. (1989). Molecular cloning, a laboratory manual. Cold Spring: Harbour Laboratory Press. Sturtevant, A. H. (1913). «The linear arrangement of six sex-linked factors in Drosophila, as shown by their mode of association». Journal of Experimental Zoology, 14: 43-59. Swanson Wagner, R. A. Y.; Jia, R.; DeCook, L. A.; Borsuk, D. (2006). «All possible modes of gene action are observed in a global comparison of gene expression in a maize F1 hybrid and its inbred parents». Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103: 6805-6810. Tanksley, S. D.; McCouch, S. R. (1997). «Seed banks and molecular maps: unlocking genetic potential from the wild». Science, 277: 1063-1066. Tanskley, S. D. (1993). «Mapping polygenes». Annu. Rev. Genet., 27: 205-233. Vilanova, S.; Sargent, D. J.; Arús, P.; Monfort, A. (2008). «Synteny conservation between two distantly-related rosaceae genomes: Prunus (the

Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 15-29

EINES MOLECULARS EN AGRICULTURA 29 stone fruits) and Fragaria (the strawberry)». BMC Plant Biology, 8 (67): 1-12. Vos, P.; Hogers, R.; Sleeker, M.; Reijans, M.; Lee, T.; Homes, M.; Freiters, A.; Pot. J.; Peleman, J.; Kuiper, M.; Zabeau, M. (1995). «AFLP: a new concept for DNA fingerprinting». Nucleic Acids Res., 23: 4407-4414. Welsh, J.; McClellan, M. (1990). «Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers». Nucleic Acids Res., 18: 7213-7218.

Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 15-29

Williams, J. G. K.; Kubelic, A. R.; Livak, K. J.; Rafalski, J. A.; Tingey, S. V. (1990). «DNA polymorphism amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers». Nucleic Acid. Res., 18: 6531-6535. Zheng, B. S.; Yang, L.; Mao, C. Z.; Zhang, W. P.; Wu, P. (2006). «Mapping QTLs and candidate genes for rice root traits under different watersupply conditions and comparative analysis across three populations». Theor. Appl. Genet., 107 (8): 1505-1515.

DOI: 10.2436/20.1501.02.91

Organismes modificats genèticament (Josep M. Casacuberta, ed.) Treballs de la SCB. Vol. 61 (2010) 31-45

PLANTES TRANSGÈNIQUES EN RECERCA Jaume F. Martínez-García 1, 2 i Jordi Bou-Torrent 2 1 2

Institució Catalana de Recerca i Estudis Avançats Departament de Genètica Molecular, Centre de Recerca en Agrigenòmica

Adreça per a la correspondència: Jaume F. Martínez-García. Departament de Genètica Molecular, Centre de Recerca en Agrigenòmica (CSIC-IRTA-UAB). C. De Jordi Girona, 18-26. 08034 Barcelona. Tel.: 934 006 189. Adreça electrònica: jmggmg@cid.csic.es. RESUM El conjunt d’aproximacions presentades en aquest article il·lustra alguns dels usos més habituals de les plantes transgèniques en la recerca, que han permès, i encara permeten, respondre moltes preguntes genuïnes de gran interès biològic difícilment resolubles per altres aproximacions. Per això es pot afirmar que les plantes transgèniques han revolucionat la recerca bàsica i aplicada en el camp de la biologia vegetal. La seua utilització ens està ajudant a entendre millor com uns organismes tan fascinants i plàstics com les plantes es formen i, en interaccionar amb el medi, responen alterant la seua forma o fisiologia. Encara ens queda molt per conèixer, i l’ús de plantes transgèniques en la nostra recerca encara té molt a dir. Esbrinar més o menys depèn, en gran mesura, de la imaginació dels investigadors. Paraules clau: col·lecció de mutants, genètica inversa, mutant d’inserció T-DNA. TRANSGENICS IN PLANT RESEARCH SUMMARY The different strategies summarized in the manuscript illustrate some of the most common uses of transgenic plants in research. They have allowed answering several questions of great biological importance that cannot be easily addressed by other approaches. For that reason it is probably correct to state that transgenic plants have revolutionized basic and applied research in plant biology. Its utilization is helping us to better under stand how these fascinating and plastic organisms are formed and, when interacting with the environment, responding by changing their form and/or physiology. We still have a

Rebut: 09/02/2010. Acceptat: 01/03/2010.

32 J. F. MARTÍNEZ-GARCÍA I J. BOU-TORRENT

lot to learn, and usage of transgenic plants in our research still has a lot to give. To discover more or less depends, partially, on the imagination of researchers. Key words: mutant collection, reverse genetics, T-DNA insertional mutant. LA FUNCIÓ GÈNICA EN PLANTES: UN REPTE EN LA RECERCA Igual com en altres camps de la biologia, una pregunta bàsica de gran interès per a molts dels laboratoris que treballen en biologia vegetal és adreçar la base genètica de la forma i el funcionament de les plantes. La genètica proporciona l’estratègia adequada, ja que permet comparar el fenotip d’individus genèticament quasi idèntics, en els quals l’única diferència es troba en l’existència d’un o pocs gens desregulats. Per adreçar aquesta qüestió fonamental, la genètica ofereix dues aproximacions alternatives: a) establir quins són els gens clau en la regulació d’un procés determinat i b) esbrinar quina és la funció d’un gen o grup de gens en el funcionament en general d’una planta o en un procés determinat d’interès. Aquestes dues estratègies genètiques es coneixen com a genètica directa (en anglès, forward genetics) i genètica inversa (en anglès, reverse genetics). En el cas de la biologia vegetal, totes dues estratègies impliquen l’ús habitual de plantes transgèniques. Arabidopsis thaliana és, sense dubte, l’espècie model més i millor desenvolupada, i per tant aquesta planta capdavantera en la recerca bàsica en plantes serà l’objecte principal d’anàlisi en aquest article. Des de ja fa uns quants anys, Arabidopsis l’estan utilitzant molts laboratoris del món com a organisme model per a l’estudi d’un rang ampli de problemes d’interès bàsic o aplicat en biologia vegetal. Això es deu principalment a la facilitat de créixer d’aquesta planta, al bon coneixement a escala fisiològica i morfològica, a l’abundància i dispo-

nibilitat de mutants, a la facilitat de transformació genètica i a la gran disponibilitat d’eines genètiques i genòmiques desenvolupades arran de la consecució de la seqüència del seu genoma l’any 2000 (Arabidopsis Genome Initiative, 2000). Hi ha una pàgina web (The Arabidopsis Information Resource, TAIR; www.arabidopsis.org) que manté actualitzada una base de dades genètiques i moleculars per a aquesta planta, que inclou la seqüència completa del genoma i l’estructura dels gens que el conformen, informació sobre els productes gènics, metabolisme, expressió gènica, mapes genètics, estocs de llavors de diverses colleccions, publicacions, enllaços a altres pàgines web d’interès i informació sobre la comunitat científica que treballa amb Arabidopsis. Altres espècies vegetals, de les quals s’ha seqüenciat tot el genoma o una bona part, s’estan establint com a espècies model complementàries a Arabidopsis, com és el cas de l’arròs com a model de plantes monocotiledònies, i Medicago truncatula com a espècie model de lleguminoses. En el cas de l’arròs, espècie amb el genoma totalment seqüenciat i uns protocols de transformació gènica ben establits, s’estan desenvolupant molt ràpidament moltes eines de genètica inversa paregudes a les que descriurem més avant per a Arabidopsis (http://orygenesdb.cirad.fr) (Krishnan et al., 2009). En el cas de M. truncatula, amb només un 60 % del genoma seqüenciat (http://www.medicago.org) però amb protocols de transformació gènica eficients, s’han començat a iniciar programes per establir eines de genètica funcional com colleccions de mutants per inserció de T-DNA Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 31-45

PLANTES TRANSGÈNIQUES EN RECERCA 33

o transposons (Benedito et al., 2008; Young i Udvardi, 2009). Amb aquesta massiva quantitat d’informació, el repte és adreçar i assignar la funció biològica a tots els gens d’un organisme. En alguns casos, la funció es pot definir amb molta seguretat basant-se en la similitud de la seua seqüència i expressió amb la de gens d’altres espècies de funció coneguda. Quan es tracta de gens dels quals no hi ha dades funcionals, com ara veurem, la generació i utilització de plantes transgèniques és bàsica per adreçar-ne la funció. GENÈTICA CLÀSSICA: DE LA FUNCIÓ AL GEN La genètica directa és una eina molt poderosa per identificar gens implicats en un procés biològic concret. Per exemple, gens que controlen el desenvolupament floral es poden identificar buscant plantes mutants que presenten flors amb una morfologia alterada (Simpson i Dean, 2002); gens implicats en la biosíntesi de les hormones vegetals giberel·lines es poden identificar buscant mutants nans que requereixen per créixer normalment l’aplicació exògena en el medi de la GA3, una giberel·lina bioactiva (Yamaguchi, 2008); i plantes deficients en els fotoreceptors de llum roja i roja llunyana, anomenats fitocroms, es poden identificar buscant mutants que siguen cecs a llum monocromàtica d’aquestes longituds d’ona (Fankhauser i Casal, 2004). Una vegada que la mutació que confereix el fenotip s’ha identificat, les anàlisis genètiques permeten establir si el defecte responsable del fenotip s’hereta, si depèn d’un sol gen (és a dir, si és monogènic), si el caràcter mutant és recessiu (cosa que suggereix que probablement es tracta d’una mutació de pèrdua de funció en el gen responsable) i Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 31-45

finalment, amb l’ús d’estratègies de genètica molecular, aïllar el gen mutat responsable del fenotip observat. Així, la genètica directa inicia l’estudi des de la funció per arribar a conèixer el gen que la regula. Cronològicament, la genètica directa va ser la primera a desenvolupar-se, i per això, després de l’aparició de les estratègies de genètica inversa (vegeu l’apartat següent) també s’anomenà genètica clàssica. L’ús de la genètica clàssica per estudiar la funció de gens es basa en l’establiment d’un cribratge per a la cerca i identificació senzilla de plantes mutants. Els cribratges genètics requereixen: a) l’establiment del fenotip mutant, sustentat en un bon coneixement previ de la fisiologia i morfologia de la planta utilitzada (Fankhauser i Casal, 2004) i b) la mutagènesi de plantes que introduïsca canvis a l’atzar en el genoma, base de la variabilitat fenotípica. Inicialment, les poblacions mutagenitzades es van generar mitjançant tractaments de les llavors amb agents químics, com l’etilmetanosulfonat (EMS), que introdueixen canvis o mutacions puntuals en la seqüència de DNA, i físics, com les radiacions amb neutrons, que normalment provoquen eliminacions de petites seqüències del genoma. Amb la posada a punt de les tècniques de transformació genètica, la generació de poblacions de plantes transgèniques mutagenitzades per la inserció de seqüències de T-DNA ha guanyat terreny en espècies susceptibles de ser transformades amb eficiència i facilitat relativa, com és el cas d’Arabidopsis. Un desavantatge de la mutagènesi per inserció de T-DNA respecte a la induïda per tractament amb agents químics i físics és la gran inversió inicial en temps i mà d’obra requerida per a la generació de les poblacions mutagenitzades, ja que el procés d’obtenció de les plantes transgèniques implica l’aïllament de milers de línies inde-

34 J. F. MARTÍNEZ-GARCÍA I J. BOU-TORRENT

pendents. Així, per a les insercions de T-DNA les plantes s’han de transformar amb el T-DNA (generació M0), seleccionar les plantes transgèniques (generació M1), fer-les créixer i deixar-les autopol·linitzar per produir la generació M2, en la qual els individus mutants es poden identificar. S’ha estimat que el nombre mitjà d’insercions de T-DNA per planta M1 és d’1,5, per la qual cosa s’han de cribrar poblacions mutagenitzades molt grans per poder identificar un nombre raonable de possibles mutants. No obstant això, la raó principal de l’estesa d’aquesta estratègia és l’avantatge que proporciona l’ús del T-DNA com a agent inductor de la mutació per a la identificació posterior del gen afectat gràcies a la facilitat per aïllar les seqüències flanquejants al lloc d’inserció. El gen que causa el fenotip mutant s’espera que siga el gen localitzat al voltant del lloc d’inserció del T-DNA, i que aquest siga la causa del fenotip mutant. Afortunadament, algunes poblacions de mutants per inserció del T-DNA estan disponibles públicament i poden ser utilitzades per diferents laboratoris en cribratges genètics diversos. Tal com ja s’ha comentat, les plantes utilitzades en un cribratge gènic, independentment del mutagen emprat, provenen normalment de llavors en la generació M2 (prenent com a M0 la generació mutagenitzada per l’agent emprat), perquè la majoria dels fenotips mutants resulten de mutacions recessives. Així, la primera generació de plantes mutagenitzades (M1), en ser heterozigotes per a totes les mutacions, no mostrarien cap fenotip si aquest és provocat per gens recessius. Si, al contrari, alguns dels fenotips seleccionats a partir de les poblacions mutagenitzades són dominants, podrien ser detectades en un cribratge de la generació M1, ens estalviaríem una generació i es reduiria la inversió en temps (vegeu més avall les col·leccions

d’activation tagging, enhancer-trap i genetrap). No obstant això, la majoria dels cribratges es duen a terme en poblacions M2, ja que permetrien l’aïllament de mutants recessius i dominants al mateix temps. GENÈTICA INVERSA: DEL GEN A LA FUNCIÓ Amb la disponibilitat de tota la seqüència del genoma d’Arabidopsis i la informació sobre els patrons d’expressió dels gens presents en els microxips, que permeten observar l’expressió de quasi tots els gens del genoma d’un organisme, tant en diferents genotips com en resposta a canvis en les condicions ambientals o estressos, diferents grups de recerca van mostrar interès en l’estudi de la funció de gens concrets, la seqüència o l’expressió dels quals suggeria un paper en un procés biològic particular. De nou la genètica va proporcionar l’estratègia per respondre aquestes qüestions, en permetre analitzar si plantes mutants que mancaven del gen d’estudi es comportaven de manera diferent que les plantes silvestres (no mutants). En aquest cas, l’ús de mutants com a eina per investigar la funció d’un gen rep el nom de genètica inversa, perquè l’origen de l’estudi és un gen del qual es vol esbrinar la funció en la planta (estudi iniciat des del gen per arribar a conèixer la funció). Per tant, identificar amb facilitat plantes mutants en gens concrets és bàsic en la utilització de la genètica inversa com a estratègia d’anàlisi en la recerca. La popularització de la genètica inversa va ocórrer en dos passos consecutius. En primer lloc, la generació de plantes transgèniques amb relativa facilitat en Arabidopsis va permetre la generació de col·leccions de milers de plantes mutants. Aquestes línies estaven inicialment disponibles per fer-ne ús en Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 31-45

PLANTES TRANSGÈNIQUES EN RECERCA 35

cribratges moleculars encaminats a identificar línies individuals a partir de bateries de línies d’inserció (Parinov et al., 1999). Posteriorment, es van iniciar les anàlisis massives de les regions flanquejants del lloc d’inserció del T-DNA, que van proporcionar col·leccions catalogades de mutants de T-DNA. LES COL·LECCIONS CATALOGADES DE MUTANTS DE T-DNA COM A BASE DE LA GENÈTICA INVERSA El Laboratori d’Anàlisi del Genoma de l’Institut Salk (Salk Institute Genomic Analysis Laboratory, SIGnAL), a San Diego (Califòrnia, Estats Units) va iniciar un programa per a l’obtenció d’una biblioteca catalogada (sequence-index) de mutacions en el genoma d’Arabidopsis. El SIGnAL va utilitzar mètodes de seqüenciació del genoma per identificar els llocs d’inserció del T-DNA en el genoma d’Arabidopsis en totes les línies disponibles. S’analitzaren les plantes transformades amb el T-DNA de les col·leccions d’Alonso/Crosby/Ecker, compostes per centenars de milers de línies transgèniques independents, i les seqüències de les regions frontereres al T-DNA obtingudes s’alinearen amb la seqüència del genoma d’Arabidopsis combinada amb la seua anotació (l’anotació del genoma, amb l’ús de tècniques bioinformàtiques combinades amb dades experimentals disponibles, permet indicar la posició de gens, introns i exons i regions intergèniques en la seqüència del genoma d’Arabidopsis) (Alonso et al., 2003). Aquestes dades es van fer disponibles al públic en general via una pàgina web (http://signal.salk.edu/ cgi-bin/tdnaexpress) que proveeix mètodes per a la cerca de les línies concretes disponibles a la base de dades que posseeixen Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 31-45

una inserció de T-DNA al voltant del gen d’interès. A més, les llavors de les línies d’inserció per T-DNA es dipositaren en bancs de germoplasma internacionals, com ara l’Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC; http://abrc.osu.edu) a la Universitat Estatal d’Ohio, als EUA, o el European Arabidopsis Stock Centre a la Universitat de Nottingham (NASC; http://arabidopsis.info) al Regne Unit. Més o menys al mateix temps, altres consorcis públics o privats van incrementar el nombre de línies disponibles per inserció de T-DNA, com ara les col·leccions SAIL (Syngenta Arabidopsis Insertion Library, generada per l’empresa de llavors Syngenta), Wisconsin (generada per la Universitat de Wisconsin) i GABI-KAT (generada al Max Planck Institute for Plant Breeding Research, Colònia, Alemanya). S’ha estimat que les 379.674 línies catalogades a la pàgina web del SIGnAL, que també inclou la informació de les altres col·leccions esmentades, etiqueten 30.280 gens del 33.003 gens predits en el genoma d’Arabidopsis (Krishnan et al., 2009). Aquesta facilitat en l’accés i distribució de les llavors dels mutants a tota la comunitat científica internacional ha permès l’anàlisi d’hipòtesis sobre la funció de gens concrets a un ritme sense precedents. LES COL·LECCIONS DE MUTANTS DE T-DNA AL SERVEI DE LA GENÈTICA CLÀSSICA A partir d’un cribratge genètic clàssic es poden trobar diversos mutants amb fenotips semblants. Després de les anàlisis genètiques es comú trobar que els diferents mutants corresponen a diferents al·lels o versions mutades del mateix gen. No obstant això, de vegades només es troba un sol al·lel mutant, fet que redueix la certesa que el fenotip mutat és causat per la pèrdua de

36 J. F. MARTÍNEZ-GARCÍA I J. BOU-TORRENT

la funció en el gen identificat (és a dir, que es tracta d’un al·lel KO, de l’anglès knock out). A partir del gen identificat, una cerca en les col·leccions de mutants per T-DNA ofereix la possibilitat de trobar nous al·lels mutants en el gen d’interès i reanalitzar el fenotip d’aquestes noves línies. Si el fenotip mostrat pels diferents al·lels identificats coincideix, es pot afirmar amb certesa que el gen identificat per mitjà de la genètica clàssica és el responsable de la funció estudiada. Com a exemple es mostra el fenotip adult de plantes mutants en el gen RIF1. L’al·lel rif1-1 va ser l’únic mutant identificat en un cribratge en què es buscaven plàntules amb fenotip «resistent a la inhibició per fosmidomicina» (rif, de l’anglès resistant to inhibition by fosmidomycin), un inhibidor específic de la biosíntesi d’isoprenoides plastídics. A més del fenotip rif, detectat en estadi de plàntula, les plantes adultes mostren unes rosetes més petites i pal·lidesa en les fulles més joves. La identificació de dues línies addicionals en altres colleccions de plantes mutades per inserció de T-DNA, indicades a la figura com els al·lels rif1-2 i rif1-3, va mostrar un fenotip en estadi de plàntula (Flores-Perez et al., 2008) i adult igual que el de l’al·lel mutant original rif1-1 (vegeu la figura 1), fet que va permetre confirmar que tots els fenotips descrits per als mutants rif1 són deguts a la pèrdua de funció del gen anomenat com a RIF1. LA SOBREEXPRESSIÓ GÈNICA: UNA ESTRATÈGIA COMPLEMENTÀRIA PER ALS ESTUDIS DE LA FUNCIÓ GÈNICA L’obtenció de línies de plantes amb nivells reduïts o nuls (mutants KO) en l’expressió d’un sol gen com una eina per entendre la funció gènica del gen afectat

també s’ha complementat normalment amb la generació de plantes transgèniques amb nivells incrementats del gen d’estudi (sobreexpressió constitutiva) o expressantlo en teixits o cèl·lules en què normalment no s’expressa (expressió ectòpica). Aquesta aproximació pot respondre a preguntes com ara si els nivells d’expressió del gen són limitants per a certs processos, si la regulació de l’expressió temporal o espacial es requereix per a la funció normal, o si els canvis en l’abundància d’una proteïna són deguts a canvis en l’expressió del gen que la codifica, indicatius de la seua regulació transcripcional, o de l’estabilitat de l’mRNA o de la proteïna, indicadors de la seua regulació a escala posttranscripcional o posttraduccional. La manera més senzilla de sobreexpressar un gen és fusionar el cDNA del gen d’interès a un promotor constitutiu, el més conegut dels quals és el promotor 35S del virus del mosaic de la coliflor (anomenat CaMV 35S, o simplement 35S). Si les plantes transgèniques resultants presenten un fenotip diferenciat, se solen referir com a mutants de guany de funció, ja que el seu fenotip és la conseqüència de l’increment en els nivells d’expressió del gen d’interès, i molt probablement per l’augment en la funció exercida per la proteïna transgènica

planta silvestre

rif1-1

rif1-2

rif1-3

plantes transgèniques

Figura 1. Fenotip de plantes adultes mutants rif1. El mutant rif1-1 es va identificar en el cribratge genètic directe. Després de la identificació del gen RIF1, els al·lels mutants rif1-2 i rif1-3 es van identificar en la col·lecció de mutants SALK i la del Cold Spring Harbor Laboratory Ds-GeneTrap, respectivament. Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 31-45

PLANTES TRANSGÈNIQUES EN RECERCA 37

codificada. La sobreexpressió d’un gen sota el control del promotor 35S té, no obstant això, algunes limitacions. Per un costat, el promotor 35S no és vertaderament constitutiu en el sentit que la seua expressió, sent ubiqua, no és igual en tots els teixits o estadis de desenvolupament. A més, l’expressió constitutiva d’un gen pot ser perjudicial per a la planta, i per tant pot ser difícil (si no impossible) obtenir línies transformades estables. A la figura 2 es mostra l’efecte en el desenvolupament d’Arabidopsis de la sobreexpressió d’un gen, anomenat ATHB2, que codifica un factor de transcripció que s’ha implicat en la rea

(35S:ATHB2) promotor

cDNA

35S

ATHB2

terminador

Plantes silvestres

35S:ATHB2

2 cm Figura 2. Plantes transgèniques d’Arabidopsis que sobrexpressen el gen ATHB2 sota el control del promotor 35S. a) Esquema de la construcció introduïda en Arabidopsis, indicada com a 35S:ATHB2. b) Aspecte de plantes no transgèniques (plantes silvestres) i el de plantes que sobreexpressen ATHB2 (35S:ATHB2) crescudes durant tres setmanes a l’hivernacle. Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 31-45

gulació de la síndrome de fugida de l’ombra (Steindler et al., 1999; Roig-Villanova et al., 2006). Les plantes transgèniques adultes presenten un nanisme accentuat en comparació de les plantes silvestres (no transgèniques). L’efecte de la sobreexpressió del gen ATHB2 també redueix la fertilitat (vegeu la figura 2b), fet que dificulta el manteniment d’aquesta línia. La sobreexpressió constitutiva d’altres gens que codifiquen factors de transcripció estructuralment relacionats amb ATHB2, com HAT2 i ATHB4, també provoca efectes dràstics en el desenvolupament de la planta i fertilitat baixa o nul·la (Sawa et al., 2002; Sorin et al., 2009). En aquests casos, l’ús de promotors específic de teixits o de sistemes per a l’expressió induïble del gen d’interès són alternatives viables. LA REDUCCIÓ DE L’EXPRESSIÓ GÈNICA AMB PLANTES TRANSGÈNIQUES: QUAN LES COL·LECCIONS DE MUTANTS DE T-DNA NO SÓN SUFICIENTS Tal com s’ha esmentat, les col·leccions de mutants per inserció de T-DNA d’Arabidopsis disponibles no cobreixen tots els possibles gens predits en Arabidopsis. A més, depenent del lloc d’inserció del T-DNA en l’estructura d’un gen ―regió promotora o terminadora, regió codificant (ORF), introns, exons o regions transcrites però no traduïdes, també conegudes com a UTR, de l’anglès untranslated regions―, aquesta no provoca necessàriament una pèrdua o reducció en la funció del gen etiquetat (vegeu la figura 3). Aquest fet provoca que la quantitat de línies KO siga molt inferior als més de 30.000 gens etiquetats, i rebaixa el nombre de línies útils en les col·leccions de mutants catalogades dis-

38 J. F. MARTÍNEZ-GARCÍA I J. BOU-TORRENT

ponibles. Com a conseqüència, si no es disposa de mutants de pèrdua o reducció de funció del gen d’estudi, s’ha de procedir a obtenir línies de reducció de funció en un gen concret mitjançant la generació de plantes transgèniques que sobreexpressen RNA antisentit, RNA interferent (RNAi) o un microRNA artificial (amiRNA) contra el gen que es vol suprimir. L’expressió d’un RNA antisentit d’un gen d’interès permet que, en hibridar amb l’RNA sentit producte del gen endogen, es

genere un RNA dúplex, el qual és degradat per mecanismes de seguretat cel·lulars. Com a conseqüència, l’expressió d’un RNA antisentit pot reduir amb certa eficàcia els nivells del gen endogen corresponent. El procediment clàssic és clonar un fragment o tot el cDNA del gen d’estudi en orientació contrària davant d’un promotor fort, transformar plantes transgèniques amb aquesta construcció i, mitjançant anàlisis moleculars, analitzar el fenotip d’aquelles línies que mostren una reducció en els ni-

Inici de traducció

Final de traducció

Inici de transcripció

Final de transcripció

Regió promotora

exó

5´ UTR

intró

Regió terminadora

ORF

3´ UTR

Línia

Figura 3. El lloc d’inserció del T-DNA pot afectar l’expressió del gen alterat. a) Estructura general d’un gen. b) Quan el T-DNA s’insereix fora de la regió codificant (ORF, de l’anglès open reading frame) és difícil predir si l’expressió del gen està afectada. c) Quan el T-DNA s’insereix dins de l’ORF, l’expressió del gen pot estar més o menys alterada, però el producte gènic pot ser afuncional. Les insercions dins de l’ORF és més probable que resulten en mutants KO. Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 31-45

PLANTES TRANSGÈNIQUES EN RECERCA 39

vells de l’RNA endogen. Idealment, almenys unes poques línies transgèniques independents obtingudes haurien de mostrar un fenotip nou. Si el gen d’interès forma part d’una família de gens estructuralment relacionats, l’elecció d’una part d’una seqüència del cDNA única o compartida entre els membres de la família pot silenciar un o diversos membres de la família, respectivament, tot i que és difícil predir el comportament de l’RNA antisentit en aquest aspecte. De vegades, la sobreexpressió d’un gen d’interès, és a dir, de l’RNA sentit del gen A, pot provocar l’efecte contrari al desitjat, i pot silenciar l’expressió del gen endogen i provocar fenotips de pèrdua o reducció de funció. S’ha postulat que aquest procés de silenciament d’un gen, conegut com a cosupressió, es pot aconseguir pel bloqueig de la transcripció del gen endogen o per la inducció de la degradació dels transcrits produïts pel gen endogen. Aquest últim procés, conegut com a silenciament gènic posttranscripcional (PTGS, de l’anglès posttranscriptional gene silencing) es creu que té lloc per la presència de RNA de doble cadena que resultaria de la presència de transcrits antisentit generats per promotors críptics, bé en les seqüències del T-DNA o en les regions genòmiques adjacents (Waterhouse et al., 1998). Quan el PTGS es descobrí en animals es va anomenar RNA interferent (RNAi, de l’anglés double stranded RNA interference). Actualment en plantes aquest terme també s’utilitza per referir-se al PTGS (Chuang i Meyerowitz, 2000). A més de les dues formes indicades, l’RNA de doble cadena també es pot produir transformant plantes amb una construcció per expressar un sol transcrit que conté seqüències autocomplementàries. La formació de l’RNA de doble cadena s’afavoreix si les seqüències autocomplementàries estan separades per una petita regió Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 31-45

no complementària d’almenys quatre bases. Com que pareix important que els nivells de l’RNA sentit i antisentit siguen similars, la sobreexpressió d’un RNA de doble cadena és la millor opció per silenciar un gen o grup de gens utilitzant plantes transgèniques. Aquest RNA de doble cadena formaria una estructura semblant a una forquilla i resulta més eficient que la sobreexpressió d’un RNA antisentit en la reducció de l’expressió del gen endogen d’interès (Wesley et al., 2001). Més recentment, s’ha desenvolupat la sobreexpressió de microRNA artificials (artificial microRNA, amiRNA) com una estratègia per suprimir l’expressió gènica de manera més específica i controlada (Ossowski et al., 2008). Els microRNA (miRNA) constitueixen un grup nombrós de RNA de cadena simple endògens i de mida petita (19-24 nucleòtids) que tenen una funció reguladora negativa en l’expressió gènica. Els miRNA de plantes reprimeixen la funció dels seus gens diana (normalment transcrits que codifiquen proteïnes) i n’indueixen la degradació. Per tant, la sobreexpressió de miRNA produeix una reducció dels nivells de l’mRNA dels gens diana. Els amiRNA són RNA de vinti-un nucleòtids que es poden manipular genèticament per silenciar específicament un gen o una família gènica d’interès. Hi ha pàgines web que ajuden al disseny dels oligonucleòtids més adients per al silenciament d’un gen o gens d’interès mitjançant aquesta estratègia (http://wmd3.weigelworld. org). Un avantatge d’aquesta tecnologia és l’aplicació en espècies d’estudi o interès aplicat transformables genèticament però per a les quals no es disposa de col·leccions de mutants per inserció de T-DNA ben desenvolupades. A més, el disseny dels amiRNA permet controlar els gens diana, de manera que aquest sistema permet silenciar un gen sol o un grup de gens es-

40 J. F. MARTÍNEZ-GARCÍA I J. BOU-TORRENT

tructuralment relacionats utilitzant plantes transgèniques. Això pot ser especialment important quan es treballa amb gens relacionats adjacents (probablement redundants) o molt a prop en el mateix cromosoma (repeticions en tàndem). ALTRES USOS DE LES PLANTES TRANSGÈNIQUES: FUSIONS A GENS MARCADORS PER INDICAR O CONTROLAR LA LOCALITZACIÓ SUBCEL·LULAR D’UNA PROTEÏNA D’INTERÈS Fusions a GUS i GFP Una part fonamental per entendre la funció gènica és establir la localització subcel·lular de la proteïna que codifica. La seqüència primària de la proteïna pot indicar o suggerir una localització subcel·lular, bé perquè mostra homologia amb proteïnes de funció i localització subcel·lular coneguda, bé perquè les seues anàlisis bioinformàtiques suggereixen l’existència de dominis responsables d’una certa localització subcel·lular, com per exemple pèptids de localització plastídica o mitocondrial en 35S:PAR1-GUS-GFP

l’extrem aminoterminal de la proteïna, seqüències de localització nuclear (NLS, de l’anglès nuclear localization signal) o dominis de localització transmembrana o en la paret cel·lular. No obstant aquestes anàlisis, només mitjançant la demostració experimental es pot concloure aquest aspecte de la funció gènica. La manera més directa d’esbrinar aquest aspecte és la utilització de mètodes bioquímics de fraccionament subcel·lular combinats amb la detecció immunoespecífica de la proteïna d’estudi. Quan no es disposa d’anticossos específics contra el producte del gen analitzat, una alternativa complementària és l’expressió en plantes de la fusió del cDNA del gen d’interès a gens reporters, com el que codifica la β–glucuronidasa (activitat GUS) o la proteïna fluorescent verda (GFP). Aquests dos gens reporters produeixen activitats fàcilment detectables amb equipaments disponibles en la majoria dels centres de recerca del nostre entorn. Tal com es mostra a la figura 4, plantes transgèniques que sobreexpressen constitutivament el gen PAR1 fusionat al doble gen reporter GUSGFP mostren activitat GUS immunohistoquímica en el nucli cel·lular. Com que la proteïna GUS-GFP sola es localitza en el citoplasma, la distribució observada s’explica com que la proteïna PAR1 conté seqüències de tipus NLS que en determinen la localització nuclear. Aquests resultats coincideixen amb els obtinguts de l’anàlisi de l’activitat GFP (Roig-Villanova et al., 2007). S’han fet experiments semblants amb proteïnes plastídiques (Flores-Perez et al., 2008), de membrana (Speth et al., 2009) o de paret (Rodriguez-Concepcion et al., 2001).

Figura 4. Localització subcel·lular de la proteïna PAR1 fusionada a les proteïnes reporteres GUS i GFP visualitzada mitjançant una tinció histoquímica de l’activitat GUS en arrels de plantes transgèniques. Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 31-45

PLANTES TRANSGÈNIQUES EN RECERCA 41

Fusions al receptor de glucocorticoides (GR) Quan es treballa amb factors reguladors de la transcripció s’assumeix que aquestes proteïnes actuen al nucli de les cèl·lules vegetals. En aquest camp està relativament estesa la sobreexpressió en plantes de fusions del factor de transcripció estudiat (FT) amb el receptor de glucocorticoides (GR) de mamífers (FT-GR). Aquesta estratègia es basa en el fet que, igual que en animals i llevats, els productes gènics dels gens HSP90 (del grup de les heat shock proteins) endògens de plantes s’uneixen al domini GR de la proteïna de fusió FT-GR en absència de les hormones glucocorticoides, i aquesta unió reté la proteïna transgènica al citoplasma cel·lular. El tractament amb glucocorticoides provoca que la proteïna de fusió FT-GR se separe de les proteïnes producte dels gens HSP90 i entre al nucli de la cèl·lula. Com que els tractaments amb glucocorticoides normalment tenen poc o cap efecte secundari en plantes, aquest sistema s’utilitza amb èxit per controlar la translocació nuclear de proteïnes nuclears, especialment factors reguladors de la transcripció (Sablowski i Meyerowitz, 1998; Wagner et al., 1999; Sawa et al., 2002; Roig-Villanova et al., 2007; Sorin et al., 2009). COL·LECCIONS ESPECIALS PER ENTENDRE LA FUNCIÓ GÈNICA: ACTIVATION TAGGING, ENHANCER-TRAPS I GENE-TRAPS La relativa rapidesa i simplicitat assolides pels protocols de transformació d’Arabidopsis ha estimulat la imaginació de molts investigadors, que han posat en marxa versions especialitzades de T-DNA per a la generació de poblacions mutagenitzades amb característiques noves d’interès. Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 31-45

És el cas de les col·leccions de mutants enhancer-trap, gene-trap i activation tagging. Col·leccions enhancer- i gene-trap En les anàlisis de la funció gènica, un altre aspecte molt important és el coneixement del patró d’expressió del gen d’interès. Les anàlisis transcriptòmiques mitjançant microxips han ajudat a disposar d’informació global i pública sobre els patrons d’expressió en diferents teixits o tipus cel·lulars (per exemple, The Bio-Array Resource for Arabidopsis Functional Genomics, accessible a http://bbc.botany.utoronto. ca; Genevestigator, accessible a https:// www.genevestigator.com). Aquests resultats també es poden complementar amb tècniques d’hibridació in situ específiques per al gen d’estudi. No obstant això, si la resolució o sensibilitat d’aquestes tècniques no és suficient i no proveeixen suficient informació, el cribratge de línies de gene-trap i enhancer-trap és una opció que cal considerar. El principi general en aquestes aproximacions és generar una col·lecció de mutants per inserció de T-DNA utilitzant un vector perquè s’integre en els diferents llocs del genoma de la planta un gen reporter al qual li manca un promotor (genetrap) o només du un promotor mínim (enhancer-trap). Com a reporters s’utilitzen normalment el gen GUS i el de la GFP, ja que produeixen activitats fàcilment visibles. En aquestes línies, com en la resta de mutants per inserció, el T-DNA s’insereix en el genoma a l’atzar. Quan la inserció té lloc dins o a prop d’un gen o d’una regió reguladora de tipus estimulador (en anglès, enhancer), el gen reporter s’expressa sota el control del promotor natiu (genetrap) o dels elements estimuladors (enhancer-trap) dels gens que han «atrapat». Per tant, l’expressió del gen reporter represen-

42 J. F. MARTÍNEZ-GARCÍA I J. BOU-TORRENT

ta i reflecteix l’expressió d’un gen endogen. Òbviament, en molts casos les insercions poden no tenir cap efecte en l’expressió dels gens reporters, ja que la detecció d’activitat és fortament dependent del lloc d’inserció (vegeu la figura 3). En conseqüència, aquestes estratègies en general produeixen una baixa freqüència de línies útils. Com les constriccions d’inserció pel sistema d’enhancer-trap són menors, aquestes insercions produeixen una freqüència més alta de patrons d’expressió que les derivades de les línies del gene-trap. En les col·leccions d’enhancer- i gene-trap generades s’han observat diferents patrons d’expressió dels gens reporters (Sundaresan et al., 1995; Campisi et al., 1999; Springer, 2000). Si bé s’han detectat línies en les quals el patró d’expressió del reporter és ubic, és a dir, l’expressió es mostrava en la majoria de les cèl·lules i teixits vegetals, i era més comú detectar l’expressió limitada a uns pocs teixits o tipus cel·lulars. S’ha descrit una col·lecció enhancer-trap d’unes trenta línies seleccionades perquè mostren patrons d’expressió del gen reporter GUS que són útils en l’ensenyament d’anatomia vegetal. Aquestes línies poden ajudar als estudiants a identificar tipus cellulars, teixits, sistemes de teixits i l’evolució dels patrons d’expressió durant el desenvolupament. Tot i que aquestes línies no estan caracteritzades molecularment, ja que es desconeixen els gens afectats per l’inserit, són útils com a marcadores i ja s’han convertit en una nova eina en l’ensenyament (Geisler et al., 2002). Col·leccions d’activation tagging En els cribratges genètics, la utilització exclusiva de col·leccions de mutants produïts per pèrdua de funció pot limitar la identificació de gens si el procés estudiat

està controlat per un grup de gens que actuen redundantment. El «problema» de la redundància gènica és molt més habitual del que inicialment s’havia considerat i, amb la seqüenciació del genoma d’Arabidopsis (i d’altres espècies vegetals), s’ha posat de manifest la duplicació de moltes regions del genoma i també l’existència de famílies de gens estructuralment pareguts i amb patrons d’expressió superposats. De fet, la popularització de les estratègies de genètica inversa i la disponibilitat de colleccions de mutants per inserció de T-DNA ha provat que, almenys, és tan habitual com excepcional que la pèrdua de funció de només un dels membres d’una família gènica no provoque canvis fenotípics. Un segon problema quan s’analitzen mutants de pèrdua de funció és l’anàlisi de mutants requerits per a la viabilitat de la planta, com ara els que resulten en embrions o gametòfits (pol·len o òvuls) letals. En el cas de gens de funció redundant en una determinada ruta genètica també es poden identificar si un excés en l’expressió d’aquests gens és suficient per alterar la ruta analitzada. En el cas de gens essencials per a la supervivència de la planta, la identificació serà possible sempre que l’expressió ectòpica o incrementada del gen siga compatible amb la supervivència de l’individu. Un exemple del primer cas són alguns mutants en components implicats en la regulació de la síndrome de fugida de l’ombra en Arabidopsis. Mentre que la sobreexpressió d’ATHB4 resulta en una forta alteració en la resposta de la planta a la proximitat vegetal, la pèrdua de funció no té cap efecte ni en la morfologia de la planta ni en les seues respostes a la proximitat vegetal. Tampoc no té cap efecte la pèrdua de funció en HAT3, el gen més paregut a ATHB4 de tot el genoma d’Arabidopsis. La combinació de mutacions de pèrdua de funció en ATHB4 i en el seu homòleg Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 31-45

PLANTES TRANSGÈNIQUES EN RECERCA 43

HAT3 provoca, al contrari, una alteració clara tant en la morfologia de la planta com en la seua resposta a la proximitat vegetal, i confirma la participació d’aquests gens estructuralment relacionats en la regulació de la síndrome de fugida de l’ombra (Sorin et al., 2009). A més, confirma que ATHB4 i HAT3 són redundants en la regulació del procés analitzat. Els fenotips de guany de funció es poden causar per mutacions en la regió codificant d’un gen que resulten en una proteïna amb una activitat augmentada, o per mutacions que incrementen els nivells d’expressió del gen. La manera més directa d’induir aquestes mutacions en poblacions mutagenitzades per la inserció d’un T-DNA va ser desenvolupada ja fa alguns anys en Arabidopsis per mitjà de la construcció d’un vector de T-DNA que contenia quatre còpies d’un element estimulador del promotor constitutiu 35S. Aquests estimuladors poden provocar l’activació transcripcional de gens localitzats en la proximitat del lloc d’inserció del T-DNA. Per tant, com que els gens activats estan etiquetats (de l’anglès tagged) per la inserció del T-DNA, aquesta aproximació s’anomenà activation tagging. Utilitzant aquesta estratègia, diferents grups han generat milers de plantes transgèniques que configuren diverses col·leccions d’activation tagging, algunes de les quals estan dipositades en les bases de llavors i poden ser utilitzades pels grup de recerca per dur a terme el seu cribratge genètic favorit. Les anàlisis d’aquestes línies per part de diferents laboratoris han mostrat dos fets importants que cal considerar: a) com que la inserció del T-DNA és a l’atzar, moltes de les línies de les col·leccions d’activation tagging no són mutants de guany de funció, sinó de pèrdua de funció (RodriguezConcepcion et al., 2004; Sauret-Gueto et al., 2006; Flores-Perez et al., 2008), i b) quan la Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 31-45

inserció cau fora de regions transcrites, la majoria dels gens adjacents al lloc d’inserció del T-DNA estan sobreexpressats, fet que facilita la identificació dels gens responsables de la mutació pel guany de funció (Weigel et al., 2000). Una vegada identificat un mutant de guany de funció (i per tant, genèticament dominant) en el procés d’interès, si la caracterització molecular mostra que en la línia que presenta el fenotip mutant hi ha un gen sobreexpressat, s’ha de demostrar inequívocament que aquest és el gen responsable (i per tant la causa) del fenotip identificat en el cribratge genètic. Com a complement de les anàlisis genètiques que permeten correlacionar el fenotip mutant amb la presència del T-DNA, l’estratègia més neta i elegant és l’aïllament d’una regió genòmica del mutant que continga el gen afectat sota el control dels estimuladors del 35S i la transformació posterior de plantes silvestres amb aquesta regió genòmica. Alternativament, si es disposa del cDNA del gen afectat, es pot inserir en un vector per sobreexpressar-lo sota el control del promotor constitutiu 35S. Les plantes transgèniques resultants haurien de recapitular el fenotip presentat pel mutant original. Aquests estudis, quan siga possible, s’haurien de complementar amb les anàlisis de mutants de pèrdua de funció en els gens afectats, tot i que, com ja s’ha comentat, la redundància gènica pot impedir la visualització fàcil de fenotips relacionats. AGRAÏMENTS Als membres del laboratori, al doctor Manuel Rodríguez-Concepción per les imatges dels mutants rif; i al Ministeri de Ciència i Innovació (BIO2008-00169, CSD2007-00036, programes FPU i FPI), al CSIC (programes JAEdoc i JAEpre) i a la

44 J. F. MARTÍNEZ-GARCÍA I J. BOU-TORRENT

Generalitat de Catalunya (Xarxa de Referència en Biotecnologia, 2009 SGR697) pel finançament. BIBLIOGRAFIA Alonso, J. M.; Stepanova, A. N.; Leisse, T. J.; Kim, C. J.; Chen, H.; Shinn, P.; Stevenson, D. K.; Zimmerman, J.; Barajas, P.; Cheuk, R.; Gadrinab, C.; Heller, C.; Jeske, A.; Koesema, E.; Meyers, C. C.; Parker, H.; Prednis, L.; Ansari, Y.; Choy, N.; Deen, H.; Geralt, M.; Hazari, N.; Hom, E.; Karnes, M.; Mulholland, C.; Ndubaku, R.; Schmidt, I.; Guzman, P.; Aguilar-Henonin, L.; Schmid, M.; Weigel, D.; Carter, D. E.; Marchand, T.; Risseeuw, E.; Brogden, D.; Zeko, A.; Crosby, W. L.; Berry, C. C.; Ecker, J. R. (2003). «Genome-wide insertional mutagenesis of Arabidopsis thaliana». Science, 301: 653-657. Arabidopsis Genome Initiative (2000). «Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana». Nature, 408: 796-815. Benedito, V. A.; Torres-Jerez, I.; Murray, J. D.; Andriankaja, A.; Allen, S.; Kakar, K.; Wandrey, M.; Verdier, J.; Zuber, H.; Ott, T.; Moreau, S.; Niebel, A.; Frickey, T.; Weiller, G.; He, J.; Dai, X.; Zhao, P. X.; Tang, Y.; Udvardi, M. K. (2008). «A gene expression atlas of the model legume Medicago truncatula». Plant J., 55: 504-513. Campisi, L.; Yang, Y.; Yi, Y.; Heilig, E.; Herman, B.; Cassista, A. J.; Allen, D. W.; Xiang, H.; Jack, T. (1999). «Generation of enhancer trap lines in Arabidopsis; characterization of expression patterns in the inflorescence». Plant J., 17: 699-707. Chuang, C. F.; Meyerowitz, E. M. (2000). «Specific and heritable genetic interference by doublestranded RNA in Arabidopsis thaliana». Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97: 4985-4990. Fankhauser, C.; Casal, J. J. (2004). «Phenotypic characterization of a photomorphogenic mutant». Plant J., 39: 747-760. Flores-Perez, U.; Sauret-Gueto, S.; Gas, E.; Jarvis, P.; Rodriguez-Concepcion, M. (2008). «A mutant impaired in the production of plastome-encoded proteins uncovers a mechanism for the homeostasis of isoprenoid biosynthetic enzymes in Arabidopsis plastids». Plant Cell, 20: 1303-1315. Geisler, M.; Jablonska, B.; Springer, P. S. (2002). «Enhancer trap expression patterns provide a novel teaching resource». Plant Physiol., 130: 17471753.

Krishnan, A.; Guiderdoni, E.; An, G.; Hsing, Y. I.; Han, C. D.; Lee, M. C.; Yu, S. M.; Upadhyaya, N.; Ramachandran, S.; Zhang, Q.; Sundaresan, V.; Hirochika, H.; Leung, H.; Pereira, A. (2009). «Mutant resources in rice for functional genomics of the grasses». Plant Physiol., 149: 165-170. Ossowski, S.; Schwab, R.; Weigel, D. (2008). «Gene silencing in plants using artificial microRNAs and other small RNAs». Plant J., 53: 674-690. Parinov, S.; Sevugan, M.; Ye, D.; Yang, W. C.; Kumaran, M.; Sundaresan, V. (1999). «Analysis of flanking sequences from dissociation insertion lines: a database for reverse genetics in Arabidopsis». Plant Cell, 11: 2263-2270. Rodriguez-Concepcion, M.; Fores, O.; MartinezGarcia, J. F.; Gonzalez, V.; Phillips, M. A.; Ferrer, A.; Boronat, A. (2004). «Distinct light-mediated pathways regulate the biosynthesis and exchange of isoprenoid precursors during Arabidopsis seedling development». Plant Cell, 16: 144-156. Rodriguez-Concepcion, M.; Perez-Garcia, A.; Beltran, J. P. (2001). «Up-regulation of genes encoding novel extracellular proteins during fruit set in pea». Plant Mol. Biol., 46: 373-382. Roig-Villanova, I.; Bou-Torrent, J.; Galstyan, A.; Carretero-Paulet, L.; Portoles, S.; RodriguezConcepcion, M.; Martinez-Garcia, J. F. (2007). «Interaction of shade avoidance and auxin responses: a role for two novel atypical bHLH proteins». Embo J., 26: 4756-4767. Roig-Villanova, I.; Bou, J.; Sorin, C.; Devlin, P. F.; Martinez-Garcia, J. F. (2006). «Identification of primary target genes of phytochrome signaling. Early transcriptional control during shade avoidance responses in Arabidopsis». Plant Physiol., 141: 85-96. Sablowski, R. W.; Meyerowitz, E. M. (1998). «A homolog of NO APICAL MERISTEM is an immediate target of the floral homeotic genes APETALA3/PISTILLATA». Cell, 92: 93-103. Sauret-Gueto, S.; Botella-Pavia, P.; Flores-Perez, U.; Martinez-Garcia, J. F.; San Roman, C.; Leon, P.; Boronat, A.; Rodriguez-Concepcion, M. (2006). «Plastid cues posttranscriptionally regulate the accumulation of key enzymes of the methylerythritol phosphate pathway in Arabidopsis». Plant Physiol., 141: 75-84. Sawa, S.; Ohgishi, M.; Goda, H.; Higuchi, K.; Shimada, Y.; Yoshida, S.; Koshiba, T. (2002). «The HAT2 gene, a member of the HD-Zip gene family, isolated as an auxin inducible gene by DNA microarray screening, affects auxin response in Arabidopsis». Plant J., 32: 1011-1022. Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 31-45

PLANTES TRANSGÈNIQUES EN RECERCA 45 Simpson, G. G.; Dean, C. (2002). «Arabidopsis, the Rosetta stone of flowering time?» Science, 296: 285-289. Sorin, C.; Salla-Martret, M.; Bou-Torrent, J.; Roig-Villanova, I.; Martinez-Garcia, J. F. (2009). «ATHB4, a regulator of shade avoidance, modulates hormone response in Arabidopsis seedlings». Plant J., 59: 266-277. Speth, E. B.; Imboden, L.; Hauck, P.; He, S. Y. (2009). «Subcellular localization; functional analysis of the Arabidopsis GTPase RabE». Plant Physiol., 149: 1824-1837. Springer, P. S. (2000). «Gene traps: tools for plant development and genomics». Plant Cell, 12: 10071020. Steindler, C.; Matteucci, A.; Sessa, G.; Weimar, T.; Ohgishi, M.; Aoyama, T.; Morelli, G.; Ruberti, I. (1999). «Shade avoidance responses are mediated by the ATHB-2 HD-zip protein, a negative regulator of gene expression». Development, 126: 4235-4245. Sundaresan, V.; Springer, P.; Volpe, T.; Haward, S.; Jones, J. D.; Dean, C.; Ma, H.; Martienssen, R. (1995). «Patterns of gene action in plant development revealed by enhancer trap and gene trap transposable elements». Genes Dev., 9: 1797-1810. Wagner, D.; Sablowski, R. W.; Meyerowitz, E. M. (1999). «Transcriptional activation of APETALA1 by LEAFY». Science, 285: 582-584.

Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 31-45

Waterhouse, P. M.; Graham, M. W.; Wang, M. B. (1998). «Virus resistance and gene silencing in plants can be induced by simultaneous expression of sense and antisense RNA». Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 13959-13964. Weigel, D.; Ahn, J. H.; Blazquez, M. A.; Borevitz, J. O.; Christensen, S. K.; Fankhauser, C.; Ferrandiz, C.; Kardailsky, I.; Malancharuvil, E. J.; Neff, M. M.; Nguyen, J. T.; Sato, S.; Wang, Z. Y.; Xia, Y.; Dixon, R. A.; Harrison, M. J.; Lamb, C. J.; Yanofsky, M. F.; Chory, J. (2000). «Activation tagging in Arabidopsis». Plant Physiol., 122: 1003-1013. Wesley, S. V.; Helliwell, C. A.; Smith, N. A.; Wang, M. B.; Rouse, D. T.; Liu, Q.; Gooding, P. S.; Singh, S. P.; Abbott, D.; Stoutjesdijk, P. A.; Robinson, S. P.; Gleave, A. P.; Green, A. G.; Waterhouse, P. M. (2001). «Construct design for efficient, effective and high-throughput gene silencing in plants». Plant J., 27: 581-590. Yamaguchi, S. (2008). «Gibberellin metabolism and its regulation». Annu. Rev. Plant Biol., 59: 225-251. Young, N. D.; Udvardi, M. (2009). «Translating Medicago truncatula genomics to crop legumes». Curr. Opin. Plant Biol., 12: 193-201.

DOI: 10.2436/20.1501.02.92

Organismes modificats genèticament (Josep M. Casacuberta, ed.) Treballs de la SCB. Vol. 61 (2010) 47-55

PLANTES TRANSGÈNIQUES I AGRICULTURA: PRESENT I FUTUR Albert Boronat Departament de Bioquímica i Biologia Molecular, Facultat de Biologia, Universitat de Barcelona Adreça per a la correspondència: Albert Boronat. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular, Facultat de Biologia, Universitat de Barcelona. Av. Diagonal, 645. 08028 Barcelona. Adreça electrònica: aboronat@ub.edu. RESUM Des de la seva comercialització a mitjan anys noranta, el cultiu de varietats transgèniques ha crescut de manera continuada fins avui dia. Cal destacar, però, que aquests conreus corresponen majoritàriament a varietats transgèniques de soja, blat de moro, cotó i colza resistents a insectes o herbicides. El cultiu de plantes transgèniques modificades en altres característiques representa encara una proporció molt petita en relació amb les indicades anteriorment. Els avenços en les tècniques de transformació genètica i en els coneixements adquirits en diversos aspectes de la biologia de les plantes ha possibilitat la generació d’un gran nombre de plantes transgèniques modificades no solament en noves característiques d’interès agronòmic, sinó també en altres aspectes, com ara propietats nutricionals millorades o la producció de compostos d’interès industrial o farmacèutic. Malgrat que aquestes varietats transgèniques no s’han comercialitzat, algunes podrien arribar a tenir un impacte important en l’agricultura del futur. Paraules clau: planta transgènica, resistència a plagues, tolerància a estrès, resistència a herbicides, plantes com a biofactories, millora nutricional. TRANSGENIC PLANTS AND AGRICULTURE: PRESENT AND FUTURE SUMMARY Since their introduction in the mid 90’s the cultivation of transgenic crops have been increasing until now. It must be stressed however that most of these crops correspond to transgenic varieties of soybean, maize, cotton and rapeseed resistant to insects and/or herbicides. The cultivation of transgenic plants modified in other traits is relatively low as compared to those indicated above. The advances in plant gene transformation technoloRebut: 09/02/2010. Acceptat: 01/03/2010.

48 A. BORONAT

gies and on the knowledge of new aspects related with plant biology have set the basis for the generation of transgenic plants modified not only in new agronomic traits but also in aspects like nutritional quality or the production of compounds with pharmaceutical and industrial interest. In spite that these transgenic plants have not been commercialized some of them could have a relevant impact in agriculture. Key words: transgenic plant, pest resistance, herbicide tolerance, stress tolerance, plants as factories, nutritional improvement. INTRODUCCIÓ Des de la seva comercialització a mitjan anys noranta, el cultiu de varietats transgèniques ha anat creixent de manera continuada fins avui dia. Les darreres dades fetes públiques per l’International Service for the Acquisition of Agri-Biotech Applications (ISAAA; http://www.isaaa.org) referides a l’any 2009 estimen una àrea global de cultius transgènics d’aproximadament 130 milions d’hectàrees. Aquests conreus corresponen majoritàriament a varietats transgèniques de soja, blat de moro, cotó i colza resistents a insectes o herbicides. Amb uns 70 milions d’hectàrees, la soja és el cultiu transgènic més important, seguit del blat de moro, el cotó i la colza (ISAAA). Contrasta el fet que el cultiu de plantes transgèniques modificades en altres característiques representi actualment una proporció molt petita en relació amb el de les varietats indicades anteriorment. Cal destacar també que l’augment continuat dels cultius transgènics fa que aquests estiguin desplaçant progressivament els de les varietats convencionals no transgèniques. El cas més il·lustratiu és el de la soja, en què el cultiu de les varietats transgèniques ja representa prop del 80 % del total cultivat. Els nous coneixements adquirits en múltiples aspectes de la biologia de les plantes han possibilitat la generació d’un gran nombre de plantes transgèniques modificades no solament en noves característi-

ques agronòmiques sinó també pel que fa a les propietats nutricionals o bé per a la producció de compostos d’interès industrial o farmacèutic. Malgrat que la majoria d’aquestes varietats transgèniques no s’han comercialitzat, resulta evident que algunes presenten un gran interès potencial i, en conseqüència, és possible que puguin arribar a tenir un impacte important en l’agricultura del futur. A continuació es consideren diferents àmbits en els quals s’han generat plantes modificades genèticament (algunes ja comercialitzades) i es valora el seu interès en l’agricultura. D’acord amb el context social, polític i econòmic actual és difícil, però, valorar el nivell d’acceptació que poden tenir aquestes varietats transgèniques. RESISTÈNCIA A PLAGUES Les plagues d’insectes i les malalties causades per fongs, bacteris i virus són responsables de grans pèrdues en les collites a escala mundial. Malgrat que al llarg de l’evolució les plantes han desenvolupat sistemes naturals de defensa per protegir-se contra insectes i patògens, les varietats utilitzades en l’agricultura moderna sovint han perdut aquests mecanismes de resistència. Si bé en alguns casos la resistència a certes plagues s’ha incrementat de manera efectiva per mitjà de programes de millora tradicional, la gran majoria de varietats cultivades no disposen de mecanismes Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 47-55

PLANTES TRANSGÈNIQUES I AGRICULTURA: PRESENT I FUTUR 49

efectius de resistència. És degut a aquest fet que l’agricultura intensiva actual requereix l’ús de grans quantitats de plaguicides, amb les repercussions econòmiques, ambientals i sanitàries consegüents. És per això que el desenvolupament de varietats transgèniques resistents a diferents tipus de plagues ha estat un dels primers objectius de l’agricultura transgènica. Les varietats transgèniques resistents a insectes que es cultiven actualment expressen les anomenades proteïnes Bt derivades del bacteri Bacillus thuringiensis. Les propietats insecticides de les proteïnes Bt són conegudes des dels anys trenta i han estat utilitzades com a bioinsecticida en forma d’espores o cristalls durant diverses dècades. Hi ha moltes soques de B. thuringiensis que produeixen proteïnes Bt amb diferents especificitats d’acció envers els insectes diana. Les proteïnes Bt formen cossos cristal·lins proteics dins del bacteri (per això el nom de proteïnes Cry, com també s’anomenen) i són inactives fins que són ingerides per les larves dels insectes diana i processades enzimàticament en l’aparell digestiu. Els pèptids derivats s’uneixen a receptors de l’epiteli intestinal, on generen forats que causen la pèrdua del seu contingut i la mort de la larva. L’especificitat de les diferents proteïnes Bt està relacionada amb els receptors amb els quals són capaços d’interaccionar. Malgrat el ràpid desenvolupament tecnològic i comercial de les plantes Bt, també s’han dirigit esforços a generar plantes resistents a insectes amb la utilització d’estratègies alternatives. En aquest sentit s’ha abordat l’ús de proteïnes insecticides d’origen vegetal, com ara les lectines, els inhibidors d’amilasa o els inhibidors de proteases. Si bé s’han obtingut resultats prometedors, aquestes estratègies no han mostrat l’efectivitat obtinguda amb les proteïnes Bt (Schuler et al., 1998; Christou et al., 2006). Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 47-55

La generació de plantes transgèniques resistents a patògens ha estat també una àrea molt activa en el camp de la biotecnologia vegetal. Així, cal destacar que entre les varietats transgèniques comercials cultivades actualment algunes són resistents a virus específics. Aquest és el cas de les papaies i d’algunes varietats de carbassons que expressen la proteïna de la coberta del virus infecciós corresponent. Malgrat que l’expressió de proteïnes de la coberta ha estat la manera primera i més efectiva de conferir resistència a diferents tipus de virus en les plantes, s’han descrit també estratègies alternatives basades en l’expressió d’altres proteïnes víriques, tant estructurals com no estructurals (Shah et al., 1995; Prins et al., 2008). Més recentment s’han utilitzat també amb èxit estratègies de silenciament gènic basades en l’expressió de seqüències de RNA víric no codificants i en la producció d’anticossos específics contra el virus per part de la planta mateixa (Prins et al., 2008). El desenvolupament de plantes transgèniques resistents a bacteris i fongs patògens ha estat també un camp de recerca molt actiu, malgrat que encara no se n’ha comercialitzat cap varietat. En aquests casos les estratègies utilitzades han estat també molt diverses i han implicat principalment la generació de plantes transgèniques que expressen components de les vies de senyalització de mecanismes de defensa i tecnologies de silenciament gènic (Campbell et al., 2002). TOLERÀNCIA ALS HERBICIDES La tolerància als herbicides és una característica de gran interès en la millora de les varietats comercials, ja que possibilita el tractament dels camps de cultiu amb un herbicida no selectiu que afecti exclusivament les males herbes. Tradicionalment, la

50 A. BORONAT

tolerància a alguns herbicides s’ha pogut generar per mètodes de millora genètica convencionals o mitjançant tècniques de cultiu in vitro. Més recentment, la disponibilitat de les tècniques d’enginyeria genètica ha ampliat la possibilitat de conferir tolerància als herbicides, principalment, d’acord amb la sobreexpressió de les proteïnes diana o l’expressió de versions de la proteïna diana insensibles a l’herbicida. Així, per exemple, les varietats resistents al glifosat (el principi actiu de l’herbicida Roundup Ready, comercialitzat per Monsanto) expressen una forma bacteriana de l’enzim EPSP-sintasa (la diana d’acció d’aquest l’herbicida) insensible a aquest compost (Dill, 2005). Les varietats tolerants als herbicides representen la superfície més gran de cultius transgènics a escala mundial (ISAAA). TOLERÀNCIA A L’ESTRÈS ABIÒTIC La productivitat agrícola es veu fortament afectada per diferents tipus d’estrès abiòtic, com ara la sequera, les temperatures extremes o l’elevada salinitat. En particular, es preveu que la sequera i la salinització progressiva dels sòls pot arribar a afectar fins al 50 % de la superfície cultivable en els propers quaranta anys. L’estrès abiòtic indueix en les plantes una gran diversitat de respostes morfològiques, fisiològiques, bioquímiques i moleculars que estan controlades per una complexa xarxa de cascades de senyalització. Els avenços en la comprensió d’aquests mecanismes de resposta han possibilitat el disseny d’estratègies per incrementar la tolerància a l’estrès abiòtic tant en plantes model com en plantes d’interès agronòmic. Aquestes estratègies s’han basat tant en l’expressió de gens implicats en les vies de senyalització com de gens que codifiquen proteïnes que

confereixen tolerància a l’estrès o bé enzims que participen en la síntesi de determinats metabòlits protectors (Vinocur i Altman, 2005; Yamaguchi i Blumwald, 2005; Bhatnagar-Mathur et al., 2008). Cal esmentar, però, que actualment no hi ha varietats transgèniques comercials amb tolerància a cap tipus d’estrès abiòtic. MANIPULACIÓ DE LA MADURACIÓ DELS FRUITS Les fruites, juntament amb les hortalisses, són components importants de la dieta per la seva aportació de fibra, vitamines i components minerals. La maduració dels fruits és un procés molt actiu que, en els fruits climatèrics com el tomàquet, comporta un pic de respiració relacionat amb la síntesi d’etilè i els canvis posteriors en el color, el sabor i la textura del fruit. A causa del seu elevat valor nutricional i comercial el fruit del tomàquet ha estat un dels sistemes model més utilitzats per a l’estudi dels diferents processos relacionats amb la maduració. Un dels aspectes que més condiciona la recol·lecció, el transport i la comercialització del tomàquet és l’estovament ràpid del fruit en les etapes finals del procés de maduració a causa de la síntesi d’enzims que degraden la paret cel·lular. Entre aquests enzims destaquen la poligalacturonasa i la pectina-metilesterasa (Alexander i Grierson, 2002). Els fruits de tomàquet transgènics FlavrSavr, amb baixos nivells d’activitat poligalacturonasa obtinguts mitjançant la inhibició selectiva d’aquest enzim utilitzant una estratègia de RNA antisentit, va ser el primer producte vegetal transgènic comercialitzat l’any 1994. En el tomàquet el procés de maduració està regulat per l’etilè. Aquesta hormona se sintetitza a partir de S-adenosilmetionina per l’acció seqüencial dels enzims ACCTreb. Soc. Cat. Biol., 61: 47-55

PLANTES TRANSGÈNIQUES I AGRICULTURA: PRESENT I FUTUR 51

sintasa i ACC-oxidasa. La inhibició selectiva de qualsevol d’aquests dos enzims resulta en un alentiment molt acusat del procés de maduració del fruit. Així, plantes transgèniques de tomàquet en les quals l’expressió del gens que codifiquen l’AACsintasa o l’ACC-oxidasa s’ha bloquejat mitjançant RNA antisentit, mostren fruits que maduren molt lentament en la planta, i el procés pot allargar-se durant setmanes o fins i tot mesos (Gray et al., 1992). Cal indicar, però, que el tractament d’aquests fruits amb etilè restableix el procés de maduració. Malgrat el seu interès potencial, aquestes varietats transgèniques de tomàquet no han estat comercialitzades. PRODUCCIÓ DE COMPOSTOS D’INTERÈS INDUSTRIAL Si bé una part important de l’activitat agrícola està destinada a l’alimentació humana i ramadera, el conreu de varietats destinades a la producció de matèries primeres d’interès industrial representa també una activitat important. Un exemple d’aquest tipus de compostos el tenim en els olis vegetals que, en funció dels àcids grassos que els componen, tenen aplicacions en àmbits tan diferents com la producció de detergents, pintures o niló. Cal destacar també l’interès més recent del cultiu de plantes oleaginoses destinades a la producció de biodièsel. A tot el món les plantes oleaginoses cultivades a més gran escala són la soja, la palma, el gira-sol i la colza. Malgrat que hi ha altres plantes que produeixen olis que contenen àcids grassos amb propietats molt interessants per a certs usos industrials, la seva producció a gran escala no és factible a causa del seu baix rendiment d’oli o pel fet que no són adequades per cultivar-les a gran escala. La identificació dels gens que codifiquen Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 47-55

enzims relacionats amb la síntesi d’àcids grassos en diferents espècies vegetals ha possibilitat la modificació d’espècies oleaginoses amb l’objectiu de modificar el perfil d’àcids grassos del seus olis per a usos alimentaris i industrials (Thelen i Ohlrogge, 2002; Jaworski i Cahoon, 2003). Algunes varietats de soja i de colza transgèniques amb perfils d’olis modificats es cultiven des de fa ja alguns anys. El midó és un altre compost vegetal de gran interès industrial. En aquest sentit cal fer ressaltar que aproximadament el 70 % del midó produït a Europa i als EUA es destina a usos industrials. El blat de moro és l’espècie més cultivada per a l’obtenció de midó, seguida del blat, la patata i la tapioca. El midó és una mescla de dos polímers de glucosa: l’amilosa (lineal) i l’amilopectina (ramificat). Les característiques fisicoquímiques del midó, i en conseqüència els seus usos industrials, estan determinades tant per les diferents propietats de l’amilosa i de l’amilopectina com per la seva proporció relativa. Les propietats del midó estan també condicionades per la distribució i la mida dels grànuls, i també per la presència addicional de lípids, proteïnes i fosfat. Totes aquestes característiques, que estan determinades genèticament, fan que el midó produït per una determinada planta pugui tenir propietats molt diferents del d’una altra planta. De manera semblant al que s’ha descrit anteriorment, la disponibilitat de gens que codifiquen enzims implicats en la síntesi de midó ha possibilitat la generació de varietats transgèniques que produeixen tipus de midó diferents dels que sintetitzen normalment i, per tant, adequats a nous usos industrials (Jobling, 2004). Un tema de gran interès en el camp de la biotecnologia vegetal és el de la manipulació genètica orientada a la producció de compostos que no se sintetitzen normal-

52 A. BORONAT

ment en les plantes. Un exemple d’aquest tipus de compostos és el dels polihidroxialcanoats, polímers produïts per alguns bacteris que tenen propietats equivalents a les dels plàstics convencionals obtinguts del petroli. En funció del monòmer que constitueix el polímer aquests plàstics mostren una consistència i un grau d’elasticitat diferents. Cal fer ressaltar que un dels aspectes més rellevants d’aquests materials plàstics és que són biodegradables. Alguns d’aquests polímers s’han produït per fermentació microbiana i s’han utilitzat en la fabricació de diferents tipus d’utensilis. Malauradament, l’elevat cost de producció ha fet que la comercialització no hagi tingut l’èxit esperat. Com que el nombre d’etapes enzimàtiques necessàries per produir els polihidroxialcanoats és relativament baix, s’ha avaluat la possibilitat de sintetitzar aquests polímers en plantes transgèniques. Així, l’expressió del gens que codifiquen els enzims bacterians requerits per a la síntesi de polihidroxibutirat ha mostrat l’acumulació d’aquest polímer en quantitats elevades en plantes transgèniques (Beilen i Poirier, 2008). Tanmateix, s’ha demostrat la possibilitat de produir el copolímer polihidroxibutirat-polihidroxivalerat (amb més interès comercial que el polihidroxibutirat) en plantes transgèniques d’Arabidopsis, si bé en aquest cas els nivells d’acumulació del polímer són significativament menors (Slater et al., 1999). MILLORA DE LA QUALITAT NUTRICIONAL Les plantes constitueixen la base de la nutrició humana. Així, mentre que alguns vegetals aporten els components calòrics bàsics de la dieta (blat, arròs, patates, llegums, etc.) altres representen un complement essencial en forma de vitamines o

sals minerals (fruites i hortalisses). Alguns productes agrícoles (principalment cereals i lleguminoses) són també importants en l’alimentació dels animals de granja. És ben conegut que una dieta estrictament vegetariana pot comportar una sèrie de dèficits nutricionals. Així, per exemple, mentre que els cereals són deficitaris en certs aminoàcids essencials com la lisina o el triptòfan, les lleguminoses tenen un contingut molt baix en metionina, aminoàcid també essencial. A part del seva importància en la salut humana, el fet que certs cereals i lleguminoses siguin la base per a la preparació de pinsos fa que aquests hagin de ser suplementats amb els aminoàcids deficitaris corresponents per equilibrar-ne el contingut. En aquest sentit s’han generat plantes transgèniques amb l’objectiu d’incrementar el contingut d’aminoàcids essencials tant en cereals com en lleguminoses. Algunes estratègies utilitzades s’han basat en l’increment del nivells d’aminoàcids essencials concrets mitjançant tècniques d’enginyeria metabòlica. Així, per exemple, s’han generat plantes transgèniques de blat de moro amb nivells elevats de lisina en el gra (Galili i Höfgen, 2002; Tang i Galili, 2004). Alternativament, l’increment de determinats aminoàcids essencials en les llavors s’ha obtingut per mitjà de l’expressió de proteïnes heteròlogues especialment riques en els aminoàcids d’interès (Tabe i Higgins, 1998; Mandal i Mandal, 2000). Mitjançant la dieta s’ingereixen una gran varietat de substàncies que són beneficioses per a la salut. Està ben documentat que, a causa de les seves característiques particulars, algunes d’aquestes substancies poden prevenir diferents malalties, com ara les cardiovasculars, certs tipus de càncer o malalties degeneratives. Malgrat les recomanacions de l’Organització Mundial de la Salut de consumir diàriament cinc peces de fruita o hortalisses, els hàbits aliTreb. Soc. Cat. Biol., 61: 47-55

PLANTES TRANSGÈNIQUES I AGRICULTURA: PRESENT I FUTUR 53

mentaris de la gran majoria de la població dels països industrialitzats no segueix aquestes indicacions. Per tant, l’increment del contingut d’aquests compostos en productes vegetals de consum quotidià representa una estratègia per proporcionar més aport per mitjà de la dieta. A continuació es descriuen alguns exemples dels compostos diana més destacats i dels resultats més rellevants obtinguts. Els carotenoides són pigments àmpliament distribuïts en la naturalesa i proporcionen coloració a molts fruits i altres parts comestibles de les plantes. A part de l’interès d’alguns carotenoides com a font de provitamina A (principalment el β-carotè), altres carotenoides de la dieta s’han relacionat amb una incidència menor de malalties cardiovasculars, certs tipus de càncer i malalties degeneratives. Entre aquests cal destacar el licopè, carotenoide que confereix el típic color vermell al fruit del tomàquet, que s’ha relacionat amb una incidència menor de malalties cardiovasculars i de càncer de pròstata. Com que el tomàquet és la font més habitual de licopè en la dieta, l’augment del nivell d’aquest carotenoide en el fruit mitjançant estratègies d’enginyeria metabòlica ha estat un objectiu important durant els darrers anys (Fraser et al., 2009). Si bé hi ha diferents exemples d’enginyeria metabòlica per incrementar o modificar el perfil de carotenoides en diferents plantes, el cas més paradigmàtic és el del golden rice. Aquest arròs ha estat modificat genèticament per acumular β-carotè en el gra i, d’aquesta manera, poder pal·liar els dèficits de vitamina A que es presenten en diverses zones del planeta on l’arròs representa el component bàsic de la dieta (Beyer et al., 2002). Aquest dèficit nutricional causa símptomes que van des de la ceguera nocturna a la ceguera total, i s’estima que aproximadament 500.000 nens es tornen cecs cada any com a conseqüència d’aTreb. Soc. Cat. Biol., 61: 47-55

quest dèficit vitamínic. A més, la deficiència en vitamina A genera problemes de salut addicionals com ara diarrea o malalties respiratòries, que repercuteixen en un increment de la mortalitat infantil en aquestes zones i que s’estima en 1-2 milions de casos per any. La generació del golden rice ha passat per diferents etapes que han comportat des de la demostració de la capacitat de sintetitzar i acumular β-carotè en el gra expressant gens heteròlegs fins a l’obtenció de noves variants en les quals s’ha incrementat el contingut de β-carotè fins a uns nivells propers als recomanables per a l’aport necessari de provitamina A mitjançant la dieta (Paine et al., 2005). Els flavonoides constitueixen un grup de compostos fenòlics que, entre altres funcions, actuen com a pigments en flors i fruits i com a precursors de compostos de defensa en les plantes. Els flavonoides també tenen un paper important en la salut humana per les seves propietats antioxidants, que actuen prevenint el càncer, malalties cardiovasculars i malalties relacionades amb l’edat, com la demència. Com que gran part de la població consumeix habitualment aquest fruit, el tomàquet s’ha utilitzat com un sistema model per incrementar el contingut de flavonoides mitjançant transgènia. En el fruit del tomàquet els nivells de flavonoides són baixos i es troben únicament a la pell. Mitjançant manipulació genètica s’han obtingut tomàquets amb un alt contingut de flavonoides tant a la pell com a la polpa (Verhoeyen et al., 2002). Recentment, i mitjançant l’expressió de factors de transcripció heteròlegs, s’han aconseguit fruits de tomàquet amb un elevat contingut d’antocianines (un tipus de flavonoide pigmentat), fet pel qual mostren un característic color morat. És interessant remarcar que quan els fruits d’aquests tomàquets transgènics s’han incorporat a la dieta de ratolins mutants Trp53+/+, alta-

54 A. BORONAT

ment susceptibles a desenvolupar càncer, s’ha pogut observar un clar augment de la seva supervivència (Butelli et al., 2008). Aquest fet és especialment rellevant, ja que mostra com el consum d’aquest productes modificats genèticament pot tenir un efecte beneficiós per a la salut. Els tocoferols, també coneguts col·lectivament com a vitamina E, constitueixen un grup de compostos lipofílics antioxidants presents en les plantes. Els tocoferols són components essencials de la dieta i tenen un paper molt important en el funcionament del sistema immunitari i en la prevenció de certs tipus de càncer, disfuncions neurològiques i malalties cardiovasculars. Hi ha quatre formes de tocoferols (α, β, γ i δ), que difereixen únicament en la posició i el nombre de grups metil en l’anell de cromanol present en la molècula. Si bé tots els tocoferols presenten una intensa activitat antioxidant, el α-tocoferol és el que presenta una absorció i distribució més gran en l’organisme, i per això representa la forma més potent de vitamina E. La quantitat i composició dels tocoferols en les plantes varia considerablement entre diferents teixits i espècies. Els olis vegetals constitueixen una rica font de tocoferols en la qual predomina, però, el γ-tocoferol, que té una activitat de vitamina E molt menor que la del α-tocoferol. És interessant indicar que malgrat que les parts verdes de les plantes tenen baixos nivells de tocoferols, la forma predominant és el α-tocoferol. Hi ha, per tant, dos objectius diferenciats, si bé complementaris, per incrementar els nivells de vitamina E en les plantes. Un seria l’augment dels nivells de tocoferols totals i l’altre l’increment de la proporció relativa del α-tocoferol respecte de les altres formes. Malgrat la complexitat dels processos metabòlics implicats en la síntesi de tocoferols, ha estat possible generar plantes transgèniques en les quals s’han incremen-

tat tant la proporció de α-tocoferol en els olis com el contingut total de tocoferols en els teixits verds (Ajjavi i Shintani, 2004; DellaPenna 2005). Tal com s’ha indicat anteriorment, la modificació de la composició dels olis vegetals ha constituït un dels objectius clàssics en el camp de la biotecnologia vegetal. Si bé algunes d’aquestes modificacions poden tenir certs beneficis nutricionals (per exemple, la producció d’olis amb un contingut major d’àcids grassos poliinsaturats), tal com s’ha indicat anteriorment moltes han estat enfocades a la producció d’olis destinats a usos industrials. Més recentment, un tema que ha despertat un gran interès és la producció d’olis que continguin àcids grassos poliinsaturats de cadena llarga del tipus ω-3 i ω-6. Aquests àcids grassos, que són essencials per al desenvolupament de l’organisme, posseeixen també efectes beneficiosos per a la salut, com ara la prevenció de malalties cardiovasculars. Malgrat que els olis vegetals contenen els precursors per a la síntesi dels àcids grassos ω-3 i ω-6, la seva metabolització en l’organisme és ineficient i l’aport depèn fonamentalment de la dieta, en particular del peix i de productes derivats. La identificació dels gens que codifiquen enzims implicats en la síntesi d’àcids grassos ω-3 i ω-6 a partir d’organismes marins n’ha possibilitat l’expressió en plantes transgèniques. Aprofitant que les plantes produeixen àcid linoleic i àcid α-linolènic, els precursors dels àcids grassos ω-3 i ω-6, ha estat possible produir aquest tipus de compostos en olis vegetals (Napier, 2007). BIBLIOGRAFIA Ajjawi, I.; Shintani, D. (2004). «Engineered plants with elevated vitamin E: a nutraceutical success story». Trends Biotechnol., 22: 104-107.

Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 47-55

PLANTES TRANSGÈNIQUES I AGRICULTURA: PRESENT I FUTUR 55 Alexander, L.; Grierson, D. (2002). «Ethylene biosynthesis and action in tomato: a model for climacteric fruit ripening». J. Exp. Bot., 53: 20392055. Beilen, J. B. van; Poirier, Y. (2008). «Production of renewable polymers from crop plants». Plant J., 54: 684-701. Beyer, P.; Al-Babili, S.; Ye, X.; Lucca, P.; Schaub, P.; Welsch, R.; Potrykus, I. (2002). «Golden Rice: introducing the beta-carotene biosynthesis pathway into rice endosperm by genetic engineering to defeat vitamin A deficiency». J. Nutr., 132: 506S510S. Bhatnagar-Mathur, P.; Vadez, V.; Sharma, K. K. (2008). «Transgenic approaches for abiotic stress tolerance in plants: retrospect and prospects». Plant Cell Rep., 27: 411-424. Butelli, E.; Titta, L.; Giorgio, M.; Mock, H. P.; Matros, A.; Peterek, S.; Schijlen, E. G.; Hall, R. D.; Bovy, A. G.; Luo, J.; Martin, C. (2008). «Enrichment of tomato fruit with health-promoting anthocyanins by expression of select transcription factors». Nat. Biotechnol., 26: 1301-1308. Campbell, M. A.; Fitzgerald, H. A.; Ronald, P. C. (2002). «Engineering pathogen resistance in crop plants». Transgenic Res., 11: 599-613. Christou, P.; Capell, T.; Kohli, A.; Gatehouse, J. A.; Gatehouse, A. M. (2006). «Recent developments and future prospects in insect pest control in transgenic crops». Trends Plant Sci., 11: 302-308. Dellapenna, D. (2005). «Progress in the dissection and manipulation of vitamin E synthesis». Trends Plant Sci., 10: 574-579. Dill, G. M. (2005). «Glyphosate-resistant crops: history, status and future». Pest Manag. Sci., 61: 219224. Fraser, P. D.; Enfissi, E. M.; Bramley, P. M. (2009). «Genetic engineering of carotenoid formation in tomato fruit and the potential application of systems and synthetic biology approaches». Arch. Biochem. Biophys., 483: 196-204. Galili, G.; Höfgen, R. (2002). «Metabolic engineering of amino acids and storage proteins in plants». Metab. Eng., 4: 3-11. Gray, J.; Picton, S.; Shabbeer, J.; Schuch, W.; Grierson, D. (1992). «Molecular biology of fruit ripening and its manipulation with antisense genes». Plant Mol. Biol., 19: 69-87. Jaworski, J.; Cahoon, E. B. (2003). «Industrial oils from transgenic plants». Curr. Opin. Plant Biol., 6: 178-184. Jobling, S. (2004). «Improving starch for food and industrial applications». Curr. Opin. Plant Biol., 7: 210-218. Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 47-55

Mandal, S.; Mandal, R. K. (2000). «Seed storage proteins and approaches to improvement of their nutritional quality by genetic engineering». Current Sci., 79: 576-589. Napier, J. A. (2007). «The production of unusual fatty acids in transgenic plants». Annu. Rev. Plant Biol., 58: 295-319. Paine, J. A.; Shipton, C. A.; Chaggar, S.; Howells, R. M.; Kennedy, M. J.; Vernon, G.; Wright, S. Y.; Hinchliffe, E.; Adams, J. L.; Silverstone, A. L.; Drake, R. (2005). «Improving the nutritional value of Golden Rice through increased pro-vitamin A content». Nat. Biotechnol., 23: 482-487. Prins, M.; Laimer, M.; Noris, E,.; Schubert, J.; Wassenegger, M.; Tepfer, M. (2008). «Strategies for antiviral resistance in transgenic plants». Mol. Plant. Pathol., 9: 73-83. Schuler, T. H.; Poppy, G. M.; Kerry, B. R.; Denholm, I. (1998). «Insect-resistant transgenic plants». Trends Biotechnol., 16: 168-175. Shah, D. M.; Rommens, C. M. T.; Beachy, R. N. (1995). «Resistance to diseases and insects in trangenic plants: progress and applications to agriculture». Trends Biotechnol., 13: 362-368. Slater, S.; Mitsky, T. A.; Houmiel, K. L.; Hao, M.; Reiser, S. E.; Taylor, N. B.; Tran, M.; Valentin, H. E.; Rodriguez, D. J.; Stone, D. A.; Padgette, S. R.; Kishore, G.; Gruys, K. J. (1999). «Metabolic engineering of Arabidopsis and Brassica for poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) copolymer production». Nat. Biotechnol., 17: 10111016. Tabe, L.; Higgins, T. J. V. (1998). «Engineering plant protein composition for improved nutrition». Trends Plant Sci., 3: 282-286. Tang, G.; Galili, G. (2004). «Using RNAi to improve plant nutritional value: from mechanism to application». Trends Biotechnol., 22: 463-469. Thelen, J. J.; Ohlrogge, J. B. (2002). «Metabolic engineering of fatty acid biosynthesis in plants». Metab. Eng., 4: 12-21. Verhoeyen, M. E.; Bovy, A.; Collins, G.; Muir, S.; Robinson, S.; Vos, C. H. de; Colliver, S. (2002). «Increasing antioxidant levels in tomatoes through modification of the flavonoid biosynthetic pathway». J. Exp. Bot., 53: 2099-2106. Vinocur, B.; Altman, A. (2005). «Recent advances in engineering plant tolerance to abiotic stress: achievements and limitations». Curr. Opin. Biotechnol., 16: 123-132. Yamaguchi, T.; Blumwald, E. (2005). «Developing salt-tolerant crop plants: challenges and opportunities». Trends Plant Sci., 10: 615-620.

DOI: 10.2436/20.1501.02.93

Organismes modificats genèticament (Josep M. Casacuberta, ed.) Treballs de la SCB. Vol. 61 (2010) 57-71

COEXISTÈNCIA DE CULTIUS TRANSGÈNICS I CONVENCIONALS Joaquima Messeguer i Enric Melé Institut de Recerca i Tecnologia Agroalimentària, Genètica Vegetal, Centre de Cabrils Adreça per a la correspondència: Joaquima Messeguer. Institut de Recerca i Tecnologia Agroalimentària, Centre de Cabrils. Ctra. de Cabrils, km 2. 08348 Cabrils. Tel.: 937 507 511, ext. 1232. Adreça electrònica: joaquima.messeguer@irta.cat. RESUM La comercialització de cultius transgènics ha determinat que la Unió Europea doni les directrius per a l’elaboració d’estratègies i millores pràctiques per tal de garantir la coexis tència dels cultius modificats genèticament (MG) amb els altres sistemes de producció, i ha establert el llindar del 0,9 % de contingut accidental de transgènic perquè la producció s’hagi d’etiquetar com a tal. Cada país ha de fer la seva normativa, basada en dades científiques fiables i adaptada a les pràctiques culturals de cada cultiu. Entre tots els factors que poden incidir en la presència accidental de transgènic en un camp convencional destaca el flux de gens, produït per la pol·linització creuada, ja que és el més difícil de controlar. Es descriuen dos exemples, l’arròs i el blat de moro, en què la investigació portada a terme demostra que la coexistència és possible. En el cas de l’arròs, atès que s’autofecunda, el risc de pol·linització creuada és molt baix, per la qual cosa pràcticament no caldria cap mesura de contenció, encara que caldria establir mesures per controlar l’arròs salvatge. En canvi, en el cas del blat de moro, que es pol·linitza amb el vent, cal establir estratègies de contenció com serien distàncies de seguretat (entorn dels 20 m) o separació de les dates de floració. Paraules clau: coexistència, cultiu transgènic, flux de gens, arròs, blat de moro. COEXISTENCE BETWEEN TRANSGENIC AND CONVENTIONAL CROPS SUMMARY The marketing of GM crops has determined the European Union to set guidelines for the development of strategies and best practices to ensure coexistence from genetically modified crop with other production systems, and so has established the 0.9% threshold Rebut: 09/02/2010. Acceptat: 01/03/2010.

58 J. MESSEGUER I E. MELÉ

for adventitious GM content for production to be labeled as GM. Each country must make its rules based on reliable scientific data and adapted to the cultural practices of each crop. Among the factors that can determine the adventitious presence of GM in a conventional field, gene flow produced by cross pollination is one of the most important, because it is quite difficult to control. We describe here two examples, rice and maize, in which scientific results show that coexistence is possible. In case of rice, because is a selfpollinating plant, the risk of gene flow is extremely low in practice and so, containment strategies might not be necessary, but wild rice should be controlled. On the other hand, for a wind-pollinated plant such as maize, containment strategies should be set up (separation distances about 20 m or/and flowering delay) to ensure coexistence. Key words: coexistence, transgenic crop, gene flow, rice, maize. INTRODUCCIÓ Els cultius anomenats transgènics o modificats genèticament (MG) es van començar a comercialitzar l’any 1996 i l’any 2008 ja ocupaven 125 milions d’hectàrees (ISAAA, 2009), que correspon al 8 % de la superfície mundial cultivada. La soja és el principal cultiu transgènic, seguida del blat de moro, el cotó i la colza. Dels vint-i-cinc països que en van cultivar al 2008, quinze estan en vies de desenvolupament i deu són industrialitzats. De fet, els principals països productors de transgènics són els Estats Units, l’Argentina, el Brasil, el Canadà i la Xina. Europa continua sent el continent on menys transgènics es cultiven. L’única espècie MG autoritzada per al cultiu a la Unió Europea (UE) és el blat de moro Bt (Bacillus thuringensis). Aquest blat de moro és resistent als barrinadors Ostrinia nubilalis Lef. i Sesamia nonagrioides Hbn. i, per tant, es cultiva principalment en aquelles zones on aquesta plaga és present. El 2008 el blat de moro Bt es va cultivar a set països de la UE i va ocupar un total de 100.000 ha, de les quals 79.000 es van cultivar a Espanya i, d’aquestes, 20.000 a Catalunya (DAR, 2009; ISAAA, 2009; MARM, 2009). La normativa europea que controla o minimitza els riscos que es podrien relacionar

amb el cultiu de plantes transgèniques és una de les més completes del món. Així, la Directiva 2001/18/CE (Comunitat Europea, 2001) regula la comercialització i l’alliberament controlat dels cultius transgènics i els reglaments 1229/2003 (Comissió Europea, 2003a) i 1830/2003 (Comissió Europea, 2003b) regulen els aliments i pinsos MG i també la traçabilitat i l’etiquetatge. La normativa 1829/2003 estableix el llindar del 0,9 % de contingut d’organisme modificat genèticament (OMG), per sobre del qual els cultius o productes derivats hauran de ser etiquetats com a transgènics. Eventualment, es podria donar el cas que, per una presència accidental de transgènic, la producció d’un cultiu convencional o ecològic s’hagués d’etiquetar com a transgènica, sense que l’agricultor hagi pogut decidir si optava per aquesta opció o no. Davant d’aquesta situació, la UE va publicar el 2003 la Recomanació de la Comissió 2003/556/CE (Comunitat Europea, 2003), en la qual es donaven les directrius per a l’elaboració d’estratègies i millores pràctiques per tal de garantir la coexistència dels cultius MG amb els altres sistemes de producció. Cada país europeu ha d’elaborar les seves normatives de coexistència, adaptades a la seva situació i d’acord amb la recomanació de la Comissió. Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 57-71

COEXISTÈNCIA DE CULTIUS TRANSGÈNICS I CONVENCIONALS 59

CONCEPTE DE COEXISTÈNCIA La coexistència es refereix a la capacitat dels agricultors de poder escollir entre la producció convencional, l’ecològica o la de cultius MG, i les implicacions econòmiques que es deriven del cultiu conjunt en una zona determinada. Així, per exemple, el fet que un cultiu que no estava destinat a ser MG s’hagi d’etiquetar indicant que en conté, podria donar lloc a una pèrdua d’ingressos, en el cas que es vengués a un preu inferior en el mercat, o s’haguessin d’establir mesures de seguiment i de contenció per reduir al mínim la barreja entre cultius MG i no-MG. Per tant, la coexistència fa referència a les mesures de gestió viables per reduir al mínim aquestes barreges i també fa referència al cost econòmic d’aquestes mesures. A la legislació europea queda molt clar que la coexistència es refereix solament a aspectes econòmics i no mediambientals ni sanitaris. Abans de la comercialització, els cultius MG passen per una exhaustiva avaluació mediambiental i sanitària que està regulada per la Directiva 2001/18/CE (Comunitat Europea, 2001). El concepte de coexistència no és nou en agricultura. Durant diversos anys s’han cultivat a les mateixes zones i fins i tot a la mateixa explotació varietats en què la producció estava destinada a finalitats diferents, i de les quals es requeria una gran puresa. Per exemple, diversos tipus de blat de moro (varietats per a consum humà, producció de midó o crispetes) o de blat (varietats de blat dur o varietats per a pinso). Mitjançant l’aplicació de tècniques senzilles de contenció és possible obtenir un bon rendiment i amb alta puresa de la collita. En tots aquests casos de l’agricultura convencional, ja està assumit que sempre hi pot haver una barreja involuntària a causa de la impuresa de la llavor, la pol·liTreb. Soc. Cat. Biol., 61: 57-71

nització creuada, el maneig de la maquinària o durant el transport i l’emmagatzemament. Per això, per a cada cas en particular hi ha llindars determinats i al llarg dels anys s’han anat establint les estratègies agronòmiques i de postcollita per poder complir-los. En el cas dels cultius MG la situació no és exactament igual que en el cas dels cultius convencionals. Si bé en la normativa europea es considera el dret de tots els agricultors a cultivar el que més els convingui, es recalca el dret que tenen els agricultors convencionals o ecològics de no haver d’etiquetar les seves collites com a transgèniques, és a dir, de tenir la garantia que les seves collites tindran un contingut de material transgènic inferior al 0,9 %. En aquest sentit les mesures de coexistència que s’hagin d’aplicar i el seu cost les haurà d’assumir «l’últim sistema de cultiu incorporat a la zona», és a dir, que aquells agricultors que vulguin cultivar plantes MG seran els que hauran d’aplicar les mesures de contenció i assumir les despeses derivades i les que es puguin ocasionar eventualment a causa d’una barreja accidental de les collites. Davant d’aquests condicionants, és important que la normativa de coexistència que s’estableixi a cada país i per a cada cultiu estigui molt ajustada a la realitat agrícola de les zones. És important tenir en compte que la Recomanació 2003/556/CE (Comunitat Europea, 2003) estableix que les mesures de gestió de la coexistència s’han de basar en dades científiques fiables sobre la probabilitat i les fonts de les barreges de cultius MG i no-MG. Això ha potenciat el desenvolupament de diversos projectes d’investigació, tant a escala nacional com a escala europea. Aquestes investigacions s’han portat a terme principalment en blat de moro ―ja que és l’únic cultiu autoritzat a la UE― i en menor escala en colza, remo-

60 J. MESSEGUER I E. MELÉ

latxa, cotó i arròs, perquè són els cultius que probablement podrien ser autoritzats en els propers anys. La presència accidental d’OGM en la collita d’un camp pot estar determinada per la puresa de les llavors, el flux de gens produït per la pol·linització creuada, ja sigui cap als camps veïns o cap a males herbes o altres espècies compatibles, la presència de renadius de l’any anterior i les barreges produïdes pel fet de compartir la maquinària (sembradores, collidores, etc.) i l’emmagatzemament a les sitges. De tots aquests factors, el que més preocupa als pagesos és la pol·linització creuada, ja que és el més difícil de controlar. La taxa de pol·linització creuada depèn fonamentalment del tipus de cultiu. Hi ha plantes que es pol·linitzen amb el vent, els insectes o que s’autofecunden. En tots els casos, el pol·len produït per un camp veí competeix amb el pol·len que es produeix a dins del camp. Altres factors que poden influir en la taxa de pol·linització creuada són les característiques del pol·len, com la viabilitat, la mida, etc. També tenen influència la compatibilitat entre les diferents varietats, les condicions meteorològiques i l’existència de barreres físiques que puguin dificultar el transport del pol·len. És evident que per poder elaborar una bona normativa de coexistència, s’han de fer estudis en cadascun dels conreus que tinguin en compte tots aquests factors que influencien la pol·linització creuada. A tall d’exemple, presentem a continuació els estudis en què es podria basar la normativa de coexistència de dos cultius molt diferents. D’una banda tenim l’arròs, un cultiu que s’autopol·linitza i que, per tant, té un risc de flux de gens molt baix. El cas oposat seria el blat de moro, ja que, com que es pol·linitza amb el vent, el risc de flux de gens a través del pol·len és relativament elevat.

COEXISTÈNCIA EN L’ARRÒS L’arròs és una de les espècies cultivades en què més s’ha aplicat la biotecnologia moderna per tal d’obtenir plantes millorades genèticament. Així, s’han incorporat amb èxit gens que confereixen resistència a plagues, malalties víriques o fúngiques, resistència a herbicides, a condicions de salinitat o sequera, o que tenen altres qualitats nutritives. Alguns exemples serien els descrits per Yahiro et al. (1993), Huang et al. (2002), Potrykus (2002), Breitler et al. (2004), Song et al. (2004) i Quilis et al. (2008). Malgrat aquesta gran tasca de recerca, encara no hi ha al mercat cap tipus d’arròs transgènic per a producció comercial, però està previst començar a comercialitzar-ne ben aviat. Les plantes d’arròs que produeixen pollen viable tenen unes taxes d’encreuament gairebé inexistents, encara que poden ser compatibles entre si quan els encreuaments es fan manualment. Això és degut al fet que l’arròs és una planta autògama que es propaga per llavors, produïdes per autopol·linització. L’òvul i el pol·len maduren simultàniament i l’estigma de la flor rep majoritàriament el pol·len de la mateixa flor. A més, el període en què la flor està receptiva és força curt, entre 50 i 90 min (Khush, 1993) i quan els grans de pol·len es desprenen de l’antera, perden la viabilitat en 5 min, encara que excepcionalment poden romandre viables fins a uns 15 min. Tradicionalment, els milloradors de l’arròs consideren que una distància d’aïllament de 10 m és suficient per evitar obtenir llavors híbrides produïdes pel pol·len dels camps adjacents (Khush, 1993). De tota manera, la probable comercialització d’arròs transgènic ha determinat la realització de tota una sèrie d’estudis per quantificar la pol·linització creuada. A Europa, amb l’excepció d’un petit assaig fet a Itàlia l’any Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 57-71

COEXISTÈNCIA DE CULTIUS TRANSGÈNICS I CONVENCIONALS 61

1999, tots els assajos de quantificació de flux de gens els ha fet al delta de l’Ebre el nostre grup investigador. El primer assaig (Messeguer et al., 2001) es va fer amb plantes transgèniques de la varietat Thaibonnet resistents a l’herbicida glufosinat d’amoni. Se’n van plantar dos nuclis, al voltant dels quals es van plantar plantes no transgèniques de la mateixa varietat a 1 m de distància al primer nucli i a 5 m al segon nucli (vegeu la figura 1). Al moment de la collita, es van recollir les llavors planta per planta, anotant la posició que ocupaven en relació amb la rosa dels vents. L’anàlisi de més de 200.000 llavors va permetre detectar un flux de gens menor que el 0,1 % en les plantes situades a 1 m i que el 0,01 % en les situades a 5 m de

distància. El disseny circular de l’assaig va permetre determinar la influència del vent en la pol·linització creuada. En un segon assaig fet amb la varietat Senia resistent al glufosinat d’amoni i utilitzant també un assaig circular (Messeguer et al., 2004), es va poder confirmar que el flux de gens decreix molt ràpidament amb la distància però a 10 m encara es va detectar una taxa de pol·linització creuada del 0,001 % en la direcció del vent dominant (vegeu la figura 2). Aquests resultats coincideixen amb els que han trobat altres autors (Noldin et al., 2002; Chen et al., 2004; Song et al., 2004; Rong et al., 2005, 2007; Yao et al., 2008). Per tal d’establir una normativa de coexistència, calia comprovar aquests resultats

Figura 1. Vista general de l’assaig circular d’arròs. El nucli central transgènic està envoltat de plantes convencionals sembrades a cinc metres de distància. Al fons es veu l’altre nucli amb les plantes convencionals plantades només a un metre de distància. Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 57-71

62 J. MESSEGUER I E. MELÉ

en camps de dimensions comercials. Per això, es va fer un assaig de camp que tenia com a objectiu avaluar la distància de seguretat per contenir el flux de gens entre dos camps adjacents de dimensions comercials. En aquest mateix assaig, també es va plantejar avaluar l’eficàcia de barreres de contenció física en el control del flux genètic de plantes transgèniques a no transgèniques de la mateixa varietat. Els resultats obtinguts en aquest assaig (dades no publicades) confirmen els resultats dels assajos anteriors i demostren que el pol·len produït a l’interior del camp pràcticament no arriba a l’exterior, i si ho fa, ja no és viable. Això significa que en el cas de l’arròs, en què el flux de gens és extremadament baix, no seria necessari establir ni una barrera de protecció ni unes distàncies de seguretat per garantir que el contingut d’arròs MG en un camp convencional a causa de la pollinització creuada sigui inferior al 0,9 % establert a la normativa europea. Pel que fa a la compatibilitat amb altres espècies o plantes, a Europa hi ha una única mala herba compatible amb l’arròs, que és l’arròs salvatge o arròs roig. En general, les plantes són més altes i de maduració tardana; tenen les llavors amb el pericarpi vermellós, són dehiscents (cauen quan estan madures) i presenten dormància (poden quedar «adormides» al camp i germinar al cap d’uns quants anys). Es considera una mala herba perquè els grans són de menor qualitat i són difícils de separar dels de les varietats comercials, fet que es tradueix en una pèrdua de qualitat i rendibilitat del cultiu. L’any 2000 ja es va fer una primera avaluació de la taxa de flux genètic de plantes transgèniques cap a l’arròs salvatge (Messeguer et al., 2004). El flux detectat va ser de 0,13 % quan la distància era zero (plantes a tocar). És evident que en el cas de l’arròs salvatge, que creix entremig de les

plantes d’arròs, el vent dominant no té cap influència, ja que pot ser pol·linitzat per totes les plantes que té al seu voltant. A la distància de 10 m ja no es detecta flux. Encara que la taxa de flux genètic cap a l’arròs salvatge és força baixa, la importància ecològica dependrà de fins a quin punt els híbrids resultants romanen al camp durant cultius posteriors, malgrat que s’apliquin estratègies agronòmiques que en els cultius comercials s’han mostrat molt eficaces contra aquesta mala herba. En aquest sentit, s’ha fet un assaig durant tres anys orientat a determinar la taxa d’introgressió de transgens cap a l’arròs salvatge en funció de les tècniques agronòmiques més usuals per controlar aquesta mala herba. Els resultats preliminars que tenim demostren que tant la tècnica del fangueig com la de la inducció de germinació i el tractament posterior amb herbicida controlen molt bé l’arròs salvatge, i no es va detectar introgressió al cap de tres anys, mentre que a la parcel·la control on no es va fer cap tractament sí que se’n va detectar. Això implica que, en el moment que s’aprovi el cultiu comercial d’arròs transgènic i s’hagi d’establir una normativa de coexistència, haurà d’incloure l’aplicació d’alguna estratègia agronòmica per controlar l’arròs salvatge. EL BLAT DE MORO El blat de moro pot estar afectat pels barrinadors, que són larves de lepidòpters (Ostrinia nubilalis Lef. i Sesamia nonagrioides Hbn.). Aquestes larves penetren a la tija i també a la panotxa i fan grans galeries, fet que debilita la planta, disminueix la producció i afavoreix el creixement de fongs productors de micotoxines. Actualment es disposa de varietats comercials de blat de moro MG que tenen incorporat un gen Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 57-71

COEXISTÈNCIA DE CULTIUS TRANSGÈNICS I CONVENCIONALS 63

de Bacillus thuringiensis, correntment anomenat Bt, que les fa resistents als barrinadors perquè produeixen una δ-endotoxina que és específica per als lepidòpters (Castañera i Ortego, 2000). Les primeres varietats de blat de moro Bt es van comercialitzar als Estats Units al 1996 i a Europa el 1998. A partir d’aquell moment es va començar a parlar de coexistència i de com calia regular-la. A l’inici d’aquest article s’ha esmentat que entre els factors que determinen la presència accidental de blat de moro MG en la producció d’un camp convencional hi ha la puresa de les llavors. Mitjançant models de simulació s’ha comprovat que la contribució de la puresa de les llavors al

Figura 2.

contingut de blat de moro MG és aproximadament additiva (Messéan et al., 2006). Això vol dir que, per exemple, si la llavor de sembra té un 0,3 % de llavors MG, la producció del camp tindrà la mateixa proporció de blat de moro MG, que se sumaria a la que fos deguda a altres factors. Per això, les empreses productores han de garantir la puresa de les llavors. Malauradament, encara no s’ha arribat a un acord amb la UE respecte al grau de puresa que han de tenir les llavors per garantir la coexistència. A diferència de l’arròs, el blat de moro és una espècie anemòfila, és a dir, que es pollinitza amb el vent. Els factors que més influeixen en la pol·linització creuada són els

Variació del flux genètic entre varietats transgèniques i convencionals en funció de la distància.

Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 57-71

64 J. MESSEGUER I E. MELÉ

que afecten la viabilitat i la dispersió del pol·len, la compatibilitat entre varietats, l’existència de barreres físiques, la coincidència de la floració i la distància entre camps. Una altra diferència remarcable amb l’arròs és que no hi ha a Europa cap mala herba ni cap espècie propera amb la qual es pugui encreuar, i per això la dispersió dels transgens cap a altres espècies compatibles no és possible. La viabilitat i la dispersió del pol·len han estat força estudiades per poder portar a terme els programes de millora genètica clàssica i la producció de llavors comercials (vegeu les revisions d’Emberlin et al., 1999; Treu i Emberlin, 2000; Brookes i Barfoot, 2004; Devos et al., 2005). De fet, ja l’any 1950 Jones i Brooks van determinar que el percentatge d’encreuament que es pot trobar dins d’un camp està correlacionat amb la seva mida i la dels camps adjacents, i que els cinc primers solcs de la vora actuen com a barrera per a la dispersió del pol·len. L’any 2000 Ingram ja va determinar que una distància de separació de 200 m entre camps de 2 ha era suficient per poder garantir una puresa del 99,9 % de les llavors híbrides obtingudes. La comercialització del blat de moro transgènic i la necessitat d’establir una normativa de coexistència han potenciat la realització de nombrosos estudis experimentals per quantificar el flux de gens i establir les mesures necessàries per poder garantir que el contingut accidental de blat de moro MG estigui per sota del llindar establert per la llei, que en el cas de la UE és del 0,9 %. Recentment Devos et al. (2009) han publicat una revisió en què se sintetitzen i comparen els estudis més rellevants. En tots es comprova la influència del vent dominant i que el flux de gens s’acumula a les vores del camp i decreix ràpidament cap a l’interior, a causa de la competència amb el pol·len produït pel camp mateix. Pel que fa

a les mesures de contenció, la distància de separació entre camps transgènics i convencionals per assolir una taxa de pol·linització creuada menor que el 0,9 % es troba entre els 17,5 m (Della Porta et al., 2006, 2008) i els 20-30 m (Weber et al., 2007), encara que alguns autors consideren que en camps molt petits o estrets la distància potser s’hauria d’ampliar fins als 50 m o més (Devos, 2008). Així però, és evident que el flux de gens pot estar influenciat per la climatologia i les pràctiques agrícoles de cada zona, i per això la normativa de coexistència s’haurà de basar en dades experimentals fiables obtingudes en les zones on s’aplicarà aquesta normativa. Tal com s’ha comentat anteriorment, Espanya és l’únic país de la Unió Europea on des de l’any 1998 es cultiva una superfície significativa de blat de moro Bt. Aquell any es van aprovar dues varietats, Compa CB i Jordi CB, ambdues amb el Bt 176, però solament es va comercialitzar la varietat Compa CB, que és l’única que es va cultivar fins al 2003. Aquell any es van comercialitzar cinc varietats noves de blat de moro Bt produïdes per diferents companyies, però totes amb l’event Bt MON810 patentat per Monsanto. A partir d’aquell moment, el nombre de varietats comercialitzades s’ha anat incrementant fins arribar a les 123 varietats comercialitzades per 112 companyies l’any 2009 (MARM, 2009), totes amb el MON810, ja que la varietat amb el Bt 176 s’ha deixat de cultivar. Durant tots aquests anys en què s’ha cultivat el blat de moro Bt, no hi ha hagut problemes remarcables de coexistència malgrat que no hi hagi una normativa que ho reguli. Això ha estat degut al fet que inicialment la comercialització d’aquestes varietats la van regular les companyies mateixes, i també perquè les cooperatives o grups d’agricultors s’han organitzat per Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 57-71

COEXISTÈNCIA DE CULTIUS TRANSGÈNICS I CONVENCIONALS 65

programar les sembres de cultius Bt o convencionals i el blat de moro Bt que es comercialitza és per a la producció de pinsos o per ensitjar. El fet que als pinsos s’afegeixen proteïnes vegetals que provenen de la soja, majoritàriament transgènica, ha afavorit que en la pràctica no es facin diferències entre el blat de moro Bt i el convencional, de tal manera que els productors que han optat pel blat de moro Bt han pogut vendre la seva producció al mateix preu que el del blat de moro convencional (Alcalde i Pelaez, 2004). Així però, la percepció pública dels cultius transgènics i la recomanació de la UE (Comunitat Europea, 2003) fan que ben aviat s’hagi d’establir una normativa que reguli el cultiu del blat de moro transgènic al nostre país i que estableixi les normes de coexistència, etiquetatge i traçabilitat. Per tal de disposar de dades experimentals fiables, ja l’any 2003 es van començar a fer tota una sèrie d’assajos de camp, coordinats pel Ministeri d’Agricultura, Pesca i Alimentació, l’associació de productors de llavors d’Espanya o l’IRTA (Institut de Recerca i Tecnologia Agroalimentàries), en col·laboració amb el Departament d’Agricultura i Acció Rural (DAR) (vegeu Messeguer i Melé, 2006). Aquests assajos estaven orientats a estudiar el flux de gens degut a la pol·linització creuada i a l’establiment de distàncies de seguretat com a mesura per garantir la coexistència. Les conclusions de tots aquests assajos van ser prou clares i coincidents amb els assajos fets en altres països: el flux de gens s’acumula a les vores i decreix exponencialment a mesura que ens internem en el camp. Per a camps menors de 5 ha, una distància de 20-25 m seria suficient per tenir un contingut de blat de moro MG inferior al 0,9 %; si en comptes de distància parlem de zona tampó, en aquest cas una barrera de blat de moro de 16-20 regues seria suficient. En Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 57-71

camps de mides més grans (>5 ha) no seria necessari establir cap distància de seguretat, ja que el total de la producció estaria per sota del 0,9 % (Ortega Molina, 2006). Un altre factor que ha estat menys estudiat és l’efecte de la coincidència de la floració entre camps. És evident que si els camps no floreixen alhora no hi podrà haver pol·linització creuada, però calia establir quin grau de no-coincidència en la floració és suficient per garantir la coexistència, i també quina relació es podia establir entre les dates de sembra i les de floració. Així, a la zona de Foixà (Girona) es va fer un assaig de camp combinant tres dates de sembra i dues varietats, una transgènica, i l’altra, la convencional isogènica (Palaudelmàs et al., 2008b) (vegeu la figura 3). Els resultats obtinguts demostren que deu dies de decalatge en la floració són una bona estratègia per controlar la pol·linització creuada, ja que el contingut de blat de moro MG al camp convencional és quasi inexistent. S’ha de tenir en compte que en les sembres primerenques cal una diferència de sembra de més d’un mes per obtenir deu dies de separació en la floració, mentre que en sembres tardanes vint dies de separació són suficients. Atès que a les zones mediterrànies hi ha una finestra molt àmplia per fer les sembres (des del començament de març fins al final de maig), el decalatge en les dates de floració és una bona estratègia per garantir la coexistència. Molts estudis fets sobre aquest tema es basen en assajos molt controlats i concrets, i això fa que s’hagi plantejat la necessitat d’estudiar el flux de gens en condicions reals de coexistència per veure fins a quin punt els resultats dels assajos de camp es poden extrapolar. Dins d’aquesta línia de treball vam fer tota una sèrie d’estudis centrats en el flux de gens, en una situació real en què coexis-

66 J. MESSEGUER I E. MELÉ

teixen camps de blat de moro Bt i convencionals, juntament amb altres cultius. L’estudi, finançat pel projecte europeu SIGMEA i per l’IRTA i el DAR, es va iniciar l’any 2004 i ha durat cinc anys. El primer any es van escollir dues zones de treball, una a Lleida i l’altra a Girona, mentre que els quatre anys restants solament es va fer el seguiment de la zona de Girona. Ambdues zones tenen una mida dels camps d’unes 2 ha de mitjana. Cada any es va identificar el tipus de cultiu (cereals, fruiters, blat de moro, guaret, etc.) i, més concretament, les varietats, dates de sembra i floració del panís (vegeu la figura 4). A partir d’aquestes dades es van seleccionar

uns quants camps convencionals, que es van mostrejar per analitzar-los per PCR quantitativa per determinar el contingut de blat de moro Bt (Messeguer et al., 2006, 2008; Palaudelmàs et al., 2008a). L’anàlisi de les dades obtingudes demostra clarament que en la majoria de camps analitzats el contingut de blat de moro MG degut a la pol·linització creuada era inferior al 0,9 %, malgrat que no s’havia aplicat cap estratègia de contenció. De tots els factors que determinen la presència accidental de blat de moro MG en un camp convencional es va veure que els més importants són la distància entre els camps i la coincidència de la floració. En funció d’aquests paràmetres

Figura 3. Vista parcial de l’assaig per determinar la influència de les dates de sembra sobre la po l·linització creuada entre plantes de blat de moro transgèniques i convencionals. Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 57-71

COEXISTÈNCIA DE CULTIUS TRANSGÈNICS I CONVENCIONALS 67

vam establir un índex empíric anomenat GI (global index), que ens permet predir, abans de la collita, el contingut de blat de moro MG que es trobaria en un camp convencional. A més, l’aplicació d’aquest índex permet deduir que una distància de separació d’uns 20 m és suficient per evitar que la presència accidental de blat de moro MG en un camp convencional superi el 0,9 % en les zones estudiades. Per tant, es confirma que les dades obtingudes en els assajos de camp són totalment aplicables en condicions reals de coexistència.

Com ja s’ha descrit abans, la pol·linització creuada s’acumula a les vores i decreix a mesura que ens endinsem en el camp. Això vol dir que els camps de dimensions petites representen el pitjor escenari pel que fa a la proporció del contingut d’OMG, ja que la contribució de les vores al total de la producció del camp és molt més elevada que en el cas de camps grans en què, encara que el perímetre augmenta, també augmenta molt més la proporció de pol·len produït pel camp mateix, que competeix amb el que ve de fora.

Figura 4. Mapes de la zona de Foixà (400 ha) amb el seguiment fet de la coexistència entre cultius de blat de moro transgènics i convencionals. Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 57-71

68 J. MESSEGUER I E. MELÉ

Per tal d’esbrinar si les estratègies de contenció establertes per als camps petits són també necessàries per a camps grans, durant la campanya de 2008 es va ampliar l’estudi a una zona de Lleida on hi ha camps de grans dimensions (<20 ha). En les dues zones estudiades hi havia pivots de 20-30 ha tant transgènics com convencionals, que havien florit en dates clarament diferents, o altres en què la coincidència de la floració era bastant significativa. Els resultats obtinguts (dades no publicades) demostren clarament que, encara que hi hagi coincidència de floració, el total de la producció d’aquests camps tan grans estarà clarament molt per sota del 0,9 % i, per tant, no caldria etiquetar-la com a transgènica. És més, si se separés la producció de les vuit regues del voltant (que és equivalent a una passada de la màquina de collir) la producció restant del camp tindria un nivell de blat de moro Bt, degut a la pol·linització creuada, per sota del nivell de detecció de la PCR quantitativa. Aquests resultats ―coincidents amb els obtinguts per Ortega (Ortega Molina, 2006)― demostren que en el cas de camps grans no seria necessari establir les mesures de contenció, necessàries per a camps petits. En aquests estudis en condicions reals portats a terme a les zones on els camps tenen una mida mitjana de 1,5 ha s’han pres com a mínim vint-i-vuit mostres de cada camp per poder avaluar el contingut d’OMG. El preu de l’anàlisi d’aquestes mostres supera amb escreix el preu de la producció d’aquests camps, fet que fa inviable aquest sistema de mostreig per utilitzar-lo l’agricultor o l’Administració per preveure o avaluar què és el que hi ha al camp. Per altra banda, en el moment en què s’estableixi una normativa caldrà, simultàniament, establir un sistema de detecció de responsabilitats. És a dir, si un camp convencional té un contingut de blat

de moro MG superior al 0,9 % degut a la pol·linització creuada, caldrà establir quins camps veïns són els responsables d’aquests fets. Establir aquestes responsabilitats mitjançant l’anàlisi de mostres és molt complicat, a causa de la gran variabilitat en la distribució del flux genètic en el camp i la indeterminació inherent als sistemes d’anàlisi actuals. Aquestes dificultats fan preveure que les normes de coexistència haurien d’estar basades en estratègies de prevenció més que no pas en anàlisis posteriors. Les dades científiques obtingudes tant en el cas de l’arròs com en el del blat de moro demostren que la coexistència és possible en aquests cultius, sempre que la normativa que s’estableixi tingui en compte les característiques inherents al tipus de cultiu i les pràctiques agronòmiques de les zones on es conreen. Així, en el cas de l’arròs les mesures de contenció haurien de ser mínimes o inexistents i haurien de tenir en compte la presència de l’arròs salvatge, mentre que en el cas del blat de moro, depenent de l’estructura parcel·lària, s’haurien d’establir normes referents a les distàncies de seguretat o establir pautes en les dates de sembra per coordinar la coincidència en la floració. A mesura que es vagin aprovant altres cultius a Europa, s’hauran de fer els estudis necessaris per dissenyar la normativa de coexistència adequada. També cal tenir en compte que les normatives de coexistència s’hauran d’anar adequant a la comercialització de noves varietats amb característiques diferents. En altres països del món ja es comercialitzen plantes transgèniques de blat de moro portadores de més d’un transgen, i les estratègies de control i contenció s’hauran de dissenyar tenint en compte també el contingut gènic de les plantes comercialitzades.

Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 57-71

COEXISTÈNCIA DE CULTIUS TRANSGÈNICS I CONVENCIONALS 69

AGRAÏMENTS La investigació descrita en aquest article ha estat finançada pels projectes europeus ERRI, EURICE i SIGMEA, els projectes nacionals INIA RTA2007-00006-00 i MCYT BIO2003-04936, el projecte INRA ANR-06POGM005-GCOMPAP i per l’IRTA i el DAR. BIBLIOGRAFIA Alcalde, E.; Pelaez, P. (2004). «Coexistencia del maíz Bt modificado genéticamente en España». A: V Congreso de la Asociación Española de Economía Agraria, Santiago de Compostel·la. Breitler, J. C.; Vassal, J. M.; Català, M. D.; Meynard, D.; Marfà, V.; Melé, E.; Royer, M.; Murillo, I.; San Segundo, B.; Guiderdoni, E.; Messeguer, J. (2004). «Bt rice harbouring cry genes controlled by a constitutive or wound-inducible promoter: protection and transgene expression under Mediterranean field conditions». Plant Biotechnology Journal, 2: 417-430. Brookes, G.; Barfoot, P. (2004). «Coexistence of GM and Non GM Crops: Case Study of Maize Grown in Spain» [en línia]. Dorchester: P. E. L. <http:// www.pgeconomics.co.uk>. Castañera, P.; Ortego, F. (2000). «El maíz transgénico en España». Mundo Científico, 210: 43-47. Comissió Europea (2003a). «Regulation no. 1829/ 2003 of the European Parliament and of the Council of 22 September 2003 on genetically modified food and feed». Official Journal of the European Communities, 1829/2003: 1-23. Comissió Europea (2003b). «Regulation no. 1830/ 2003 of the European Parliament and of the Council of 22 September 2003 concerning the traceability and labelling of genetically modified organisms and the traceability of food and feed products produced from genetically modified organisms and amending directive 2001/18/EC». Official Journal of the European Union, L 268: 24-28. Comunitat Europea (2001). «Directive (2001/18/CE) European Parliament and of the Council of 12 March 2001 on the deliberate release into the environment of genetically modified organisms». Official Journal of the European Communities, L106: 1-39.

Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 57-71

Comunitat Europea (2003). «Commission Recommendation. Guidelines for the development of national strategies and best practices to ensure the coexistence of genetically modified crops with conventional and organic farming». Official Journal of the European Communities, L189: 36-47. Chen, L. J.; Lee, D. S.; Song, Z. P.; Suh, H. S.; Lu, B. R. (2004). «Gene flow from cultivated rice (Oryza sativa) to its weedy and wild relatives». Annals of Botany, 93: 67-73. Della Porta, G.; Ederle, D.; Bucchini, L.; Prandi, M.; Pozzi, C.; Verderio, A. (2006). Gene flow between neighbouring maize fields in the Po Valley. Milà: C. D. Agrobiotecnologico. Della Porta, G.; Ederle, D.; Bucchini, L.; Prandi, M.; Verderio, A.; Pozzi, C. (2008). «Maize pollen mediated gene flow in the Po valley (Italy): Source-recipient distance and effect of flowering time». European Journal of Agronomy, 28: 255-265. Departament d’Agricultura, Alimentació i Acció Rural (2009). «Estadístiques i observatoris. Estructura i producció» [en línia]. <http://www20. gencat.cat/portal/site/DAR/>. Devos, Y.; Dillen, K.; Reheul, D.; Kaiser, M.; Sanvido, O. (2009). «Coexistence of genetically modified (GM) and non-GM crops in the European Union. A review». Agronomy for Sustainable Development, 29 (1): 11-30. Devos, Y.; Reheul, D.; Schrijver, A. de (2005). «The co-existence between transgenic and non-transgenic maize in the European Union: a focus on pollen flow and cross-fertilization». Environmental Biosafety Research, 4: 71-87. Devos, Y.; Thas, O.; Cougnon, M.; Clercq, E. M. de; Cordemans, K.; Reheul, D. (2008). «Feasibility of isolation perimeters for genetically modified maize». Agronomy for Sustainable Development, 28: 195-206. Emberlin, J.; Adams-Groom, B.; Tidmarsh, J. (1999). A report on the dispersal of maize pollen. Worcester: Soil Association, National Pollen Research Unit, Univ. College Worcester. Huang, J. K.; Rozelle, S.; Pray, C.; Wang, Q. F. (2002). «Plant biotechnology in China». Science, 295: 674-677. Ingram, J. (2000). «The separation distances required to ensure crosspollination is below specified limits in non-seed crops of sugar beet, maize and oilseed rape». Plant Var. Seeds, 13: 181199. ISAAA (2009). «Summary report on the current global status of GM crops» [en línia]. <http:// www.isaaa.org/kc>.

70 J. MESSEGUER I E. MELÉ Jones, M.; Brooks, J. (1950). «Effectiveness of distance and border rows in preventing outcrossing in corn». Tech. Bull., T-38. Khush, G. S. (1993). Floral structure, pollination biology, breeding behaviour, transfer distance and isolation considerations. World bank technical paper. Biotechnology Series, 1 (Rice Biosafety). EUA: The Rockefeller Foundation. Messéan, A.; Angevin, F.; Gómez-Barbero, M.; Menrad, K.; Rodríguez-Cerezo, E. (2006). «New case studies on the coexistence of GM and nonGM crops in European agriculture». Tech. Rep. EUR 22102 EN, p. 116. Sevilla: Institute for Prospective Technological Studies, Joint Research Centre, Comissió Europea. Messeguer, J.; Fogher, C.; Guiderdoni, E.; Marfà, V.; Català, M. M.; Baldi, G.; Melé, E. (2001). «Field assessments of gene flow from transgenic to cultivated rice (Oryza sativa L.) using a herbicide resistance gene as tracer marker». Theoretical and Applied Genetics, 103: 1151-1159. Messeguer, J.; Marfa, V.; Catala, M. M.; Guiderdoni, E.; Mele, E. (2004). «A field study of pollen-mediated gene flow from Mediterranean GM rice to conventional rice and the red rice weed». Molecular Breeding, 13: 103-112. Messeguer, J.; Melé, E. (2006). «Coexistencia de cultivos tradicionales y genéticamente modificados». A: Muñoz, E. [ed.]. Organismos modificados genéticamente. Madrid: Ephemera, p. 267-278. Messeguer, J.; Palaudelmas, M.; Penas, G.; Serra, J.; Salvia, J.; Ballester, J.; Bas, M.; Pla, M.; Nadal, A.; Mele, E. (2008). «Three year study of a real situation on coexistence in maize». Third International Conference on coexistence between Genetically Modified (GM) and non-GM based agricultural supply chains, Sevilla, 20-21 Novembre 2007, p. 9396. Messeguer, J.; Peñas, G.; Ballester, J.; Bas, M.; Serra, J.; Salvia, J.; Palaudelmàs, M.; Melé, E. (2006). «Pollen-mediated gene flow in maize in real situations of coexistence». Plant Biotechnology Journal, 4: 633-645. Noldin, J. A.; Yokoyama, S.; Antunes, P.; Luzzardi, R. (2002). «Potencial de cruzamento natural entre o arroz transgênico resistente ao herbicida glufosinato de amônio e o arroz daninho». Planta Daninha, 2: 243-251. Ortega Molina, J. (2006). «The Spanish experience with co-existence after 8 years of cultivation of GM maize». Co-existence of GM, Conventional, and Organic Crops, Freedom of Choice Conference, Viena.

Palaudelmàs, M.; Melé, E.; Peñas, G.; Pla, M.; Nadal, A.; Serra, J.; Salvia, J.; Messeguer, J. (2008b). «Sowing and flowering delays can be an efficient strategy to improve coexistence of genetically modified and conventional maize». Crop Science, 48: 2404-2413. Palaudelmàs, M.; Peñas, G.; Messeguer, J.; Melé, E.; Serra, J.; Salvia, J.; Pla, M.; Nadal, A. (2008a). «Coexistència en situació real entre blat de moro transgènic i convencional. Resultats del seguiment realitzat els anys 2004, 2005 i 2006 en la zona de conreu de Foixà (Baix Empordà)» [en línia]. RuralCat, dossier tècnic núm. 27. <http:// www.ruralcat.net>. Potrykus, I. (2002). «Golden rice: concept, development, and its availability in developing countries». International Rice Congress, Pequín, 46. Quilis, J.; Peñas, G.; Messeguer, J.; Brugidou, C.; Segundo, B. S. (2008). «The Arabidopsis AtNPR1 inversely modulates defense responses against fungal, bacterial, or viral pathogens while conferring hypersensitivity to abiotic stresses in transgenic rice». Molecular Plant-Microbe Interactions, 21: 1215-1231. Rong, J.; Lu, B. R.; Song, Z. P.; Su, J.; Snow, A. A.; Zhang, X. S.; Sun, S. G.; Chen, R.; Wang, F. (2007). «Dramatic reduction of crop-to-crop gene flow within a short distance from transgenic rice fields». New Phytologist, 173: 346-353. Rong, J.; Song, Z. P.; Su, J.; Xia, H.; Lu, B. R.; Wang, F. (2005). «Low frequency of transgene flow from Bt/CpTI rice to its nontransgenic counterparts planted at close spacing». New Phytologist, 168: 559-566. Song, Z. P.; Lu, B. R.; Chen, J. K. (2004). «Pollen flow of cultivated rice measured under experimental conditions». Biodiversity and Conservation, 13: 579590. Treu, R.; Emberlin, J. (2000). Pollen dispersal in the crops maize (Zea mays), oilseed rape (Brassica napus ssp. oleifera), potatoes (Solanum tuberosum), sugar beet (Beta vulgaris ssp. vulgaris), and wheat (Triticum aestivum). Worcester: Soil Association, National Pollen Research Unit, Univ. College Worcester. Weber, W. E.; Bringezu, T.; Broer, I.; Eder, J.; Holz, F. (2007). «Coexistence between GM and Non-GM maize crops - Tested in 2004 at the field scale level (Erprobungsanbau 2004)». Journal of Agronomy and Crop Science, 193: 79-92. Yahiro, Y.; Kimura, Y.; Hayakawa, T. (1993). «Biosafety results of transgenic rice plants expressing rice stripe virus coat protein gene». Third interna-

Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 57-71

COEXISTÈNCIA DE CULTIUS TRANSGÈNICS I CONVENCIONALS 71 tional symposium on the biosafety results of field tests of genetically modified plants and microorganisms. Oakland: University of California, p. 23-36.

Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 57-71

Yao, K. M.; Hu, N.; Chen, W. L.; Li, R. Z.; Yuan, Q. H.; Wang, F.; Qian, Q.; Jia, S. R. (2008). «Establishment of a rice transgene flow model for predicting maximum distances of gene flow in Southern China». New Phytologist, 180: 217-228.

DOI: 10.2436/20.1501.02.94

Organismes modificats genèticament (Josep M. Casacuberta, ed.) Treballs de la SCB. Vol. 61 (2010) 73-91

BIOFACTORIES: PRODUCCIÓ DE PROTEÏNES RECOMBINANTS EN PLANTES M. Dolors Ludevid i Margarita Torrent Centre de Recerca en Agrigenòmica Adreça per a la correspondència: M. Dolors Ludevid. Centre de Recerca en Agrigenòmica. C. de Jordi Girona, 18-26. 08034 Barcelona. Adreça electrònica: dlmgmd@cid.csic.es. RESUM Fins al començament del segle xxi, les plantes havien estat la font de remeis per a malalties en humans. Després, els extractes vegetals van ser substituïts per productes produïts a escala industrial per síntesi química. Durant les darreres dècades del segle xx, va aparèixer una alternativa a la síntesi química gràcies al desenvolupament de l’enginyeria genètica en bacteris, llevats i cèl·lules animals per a la producció de proteïnes recombinants. Amb el desenvolupament recent de les metodologies de transformació vegetal, les plantes ofereixen un sistema alternatiu al bacterià o al de cultiu de cèl·lules animals, per a la producció de proteïnes recombinants a baix cost i segur per a la salut humana. En aquest article il·lustrem els avantatges i desavantatges de diferents sistemes vegetals (transformació estable i transitòria), les seves limitacions i reptes. També exposem les millores que actualment s’estan duent a terme, emprant espècies diferents de plantes i sistemes diferents d’expressió per tal de consolidar aquestes factories per a la producció de proteïnes terapèutiques senzilles o molt complexes. Paraules clau: biofactoria vegetal, proteïna recombinant, planta transgènica, proteïna terapèutica. MOLECULAR FARMING: PLANT MADE BIOPHARMACEUTICALS SUMMARY Plants were the main source for human drugs until the beginning of the nineteenth century when plant-made pharmaceuticals were partly supplanted by drugs produced by the industrial methods of chemical synthesis. During the last decades of twentieth century, genetic engineering has offered an alternative to chemical synthesis using bacteria, Rebut: 09/02/2010. Acceptat: 01/03/2010.

74 M. D. LUDEVID I M. TORRENT

yeast and animal cells as a factories for the production of recombinant proteins. With the recent development of plant-based recombinant protein production systems, plants offer a safe and extremely cost effective alternative to microbial and mammalian cell cultures. Here, we evaluate the advantages and disadvantages of different plant expression systems (stable nuclear, or transient transformations) and their current limitations or challenges. We also illustrate that current improvements in plant expression systems and plant hosts are making them suitable as alternative factories for the production of either simple or highly complex recombinant proteins. Key words: molecular pharming, plant-made pharmaceuticals, recombinant protein, transgenic plant, therapeutic protein. En els darrers trenta anys s’ha dedicat un gran esforç al desenvolupament de tecnologies per a la producció de proteïnes recombinants en sistemes in vitro i in vivo. Cada sistema té els seus avantatges i inconvenients a l’hora d’expressar proteïnes heteròlogues. Encara que la demanda de proteïnes terapèutiques i enzims industrials creix dia a dia, actualment la capacitat de producció per a la majoria de proteïnes recombinants és limitada. És per això que cal avaluar els diferents sistemes biològics d’expressió i escollir aquell que garanteixi la producció d’un producte funcional i amb un cost efectiu. De fet, cap sistema és ideal per a qualsevol proteïna recombinant, i normalment caldrà utilitzar un sistema biològic o un altre, depenent d’un gran nombre de factors, com la toxicitat del producte, el rendiment, les característiques específiques de la proteïna, les estratègies de purificació, els costos de producció, el confinament, els problemes ambientals, la percepció pública, etc. LES PLANTES COM A BIOFACTORIES Durant milers d’anys les plantes s’han utilitzat com a font d’alimentació i de productes terapèutics. El primer text conegut sobre plantes medicinals va ser escrit fa

més de 4.500 anys a la Xina sota la direcció de l’emperador Shen-Nung, i s’hi descriuen 365 plantes medicinals. Més a prop, 1.500 anys aC, els egipcis ja empraven extractes vegetals com a medicines. Els papirs d’Ebers descriuen set-cents remeis provinents de plantes, com la Mandragora officinarum, el Ricinus communis i el Cannabis. El gran gir en la història dels medicaments es va produir des del principi del segle xx fins als anys setanta, quan els productes farmacèutics van ser dominats per la indústria química amb el desenvolupament de processos com més va més sofisticats per a l’extracció, purificació i síntesi de compostos actius. Com a complement als processos de síntesi i extracció, l’enginyeria genètica va entrar a la indústria farmacèutica al començament dels setanta i va obrir la possibilitat de biosintetitzar, en bacteris, llevats o cèl·lules animals, molècules complexes que no es podien sintetitzar químicament o en les quals el procés d’extracció de les plantes es feia inaccessible. Recentment la transformació gènica de vegetals ha forçat la introducció de les plantes dins el món de la indústria farmacèutica a causa de la recerca de nous sistemes de producció de proteïnes recombinants. És evident que les plantes són una alternativa per expressar de manera eficient i barata proteïnes recombinants, i ofereixen avantatges sobre altres sistemes Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 73-91

BIOFACTORIES: PRODUCCIÓ DE PROTEÏNES RECOMBINANTS EN PLANTES 75

d’expressió, com per exemple a) baix cost de producció, productes lliures de virus i prions que infectin humans, b) la producció a gran escala de proteïnes terapèutiques d’acord amb la demanda global i c) a diferència de la fermentació microbiana, les plantes són capaces de dur a terme modificacions posttraduccionals generalment necessàries per a l’activitat de moltes proteïnes terapèutiques (Walsh i Jefferis, 2006; Gomord i Faye, 2004; Twyman et al., 2003). La seroalbúmina humana va ser la primera proteïna recombinant produïda en plantes transgèniques de patata i tabac (Sijmons et al., 1990), i a partir d’aleshores la utilització de les plantes com a sistema d’expressió es va ampliar a altres proteïnes com citocines, col·lagen, enzims industrials, anticossos i vacunes humanes i animals (Ma et al., 2005; Gomord et al., 2004). Les propietats d’utilitzar les plantes com a bioreactors en lloc de microorganismes, cultius cel·lulars d’animals o animals transgènics les han documentades científicament aquests darrers anys molts investigadors (Ma et al., 2003; Fisher et al., 2004; Menkhaus et al., 2004; Ma et al., 2005; Gomord et al., 2005). Tot i la preocupació social per aquesta tecnologia, s’han fet moltes millores en els sistemes de transformació que han portat a la creació de plataformes de producció de proteïnes recombinants en plantes. Així, el Departament d’Agricultura dels Estats Units va aprovar per primera vegada una proteïna produïda en plantes, una vacuna contra la paramixovirosi aviària (malaltia de Newcastle) desenvolupada per Dow AgroSciences en cultius de cèl·lules vegetals modificades genèticament. Un altre exemple és la utilització de plantes modificades genèticament en casos en què es fa necessari un increment ràpid de producció d’anticossos (Ma et al., 1995). De fet, la producció d’immunoglobulines en plantes ens diu que les cèl·lules vegetals són capaces de Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 73-91

sintetitzar, acoblar via ponts disulfur i processar correctament les cadenes lleugeres i pesades dels anticossos. Les estratègies emprades per a l’expressió de proteïnes en plantes han evolucionat ràpidament, s’han emprat moltes espècies vegetals i s’han desenvolupat nous procediments de transformacions estables i procediments per a transformacions transitòries. PLANTES TRANSGÈNIQUES Els primers assajos per expressar proteïnes recombinants en plantes es van fer als anys vuitanta coincidint amb el desenvolupament de les tècniques de transformació del genoma nuclear de plantes (Horsch et al., 1895). En els primers assajos per aconseguir plantes transgèniques que expressessin un producte terapèutic es va utilitzar el mètode clàssic d’inserció d’un DNA exogen en el genoma nuclear de la planta emprant un bacteri intermediari, Agrobacterium, i el tabac com a planta hoste (McCormick et al., 1999). La introducció d’una seqüència promotora a l’inici de la construcció de DNA és essencial per a la transcripció del transgèn. El promotor del virus del mosaic de la col-i-flor (CaMV) (Fang et al., 1989) ha estat el més utilitzat. És un promotor constitutiu, és a dir, que permet l’expressió del transgèn en qualsevol teixit de la planta, encara que no amb la mateixa intensitat d’expressió. És necessari, a més, que el plasmidi (DNA) contingui un gen que confereixi resistència a un herbicida (per exemple, kanamicina) per poder separar després de la transformació aquelles plantes que són transgèniques de les que no ho són. Si la proteïna recombinant es vol expressar en un teixit concret caldrà utilitzar un promotor que tan sols permeti la transcripció en aquell teixit. Un

76 M. D. LUDEVID I M. TORRENT

bon exemple en són els promotors dels gens de proteïnes de reserva de la llavor, que, introduïts en el transgèn, expressaran la proteïna recombinant únicament a la llavor de la planta. Cal tenir en compte, però, que la transformació estable nuclear té inconvenients, entre d’altres: a) silenciament de l’RNA del transgèn, del qual parlarem més endavant, b) fenòmens epigenètics (metilacions produïdes en el transgèn) i c) efecte de posició (depenent d’on s’insereixi el transgèn en el genoma pot anul·lar la seva transcripció i, per tant, l’expressió de la proteïna). EXPRESSIÓ TRANSITÒRIA L’expressió transitòria és l’expressió de proteïnes en un sistema biològic sense integrar el transgèn en el seu genoma nuclear. Aquest és el mètode més ràpid conegut per a la producció de proteïnes en plantes. És un sistema que no requereix fer créixer les plantes transgèniques al camp, ja que poden créixer en medis confinats (hivernacles), permet estandarditzar els processos de producció i, el més important, resoldre el problema del silenciament gènic, cotransformant el transgèn emprat amb una proteïna vírica supressora del silenciament. Hi ha tres vies diferents per aconseguir una expressió transitòria de la proteïna recombinant: a) la transformació directa (bombardeig de partícules cobertes del DNA, transformació de protoplasts amb polietilenglicol, i microinjecció), b) infecció vírica de la planta ―el virus estarà modificat genèticament, de manera que s’introdueix el transgèn corresponent a la proteïna que volem expressar (Alamillo et al., 2006)― i c) infecció bacteriana ―el plasmidi que conté el transgèn s’introdueix en Agrobacterium tumefaciens, que, alhora, s’introduirà dins les cèl·lules vegetals per siste-

mes de buit o a pressió emprant una xeringa (Kapila et al., 1997). Avui dia el més utilitzat és aquest darrer mètode, amb el qual s’han produït anticossos, vacunes i altres productes farmacèutics. PLANTES HOSTES Les espècies vegetals més freqüentment utilitzades per a la producció de proteïnes terapèutiques són aquelles de les quals aprofitem la llavor, com l’arròs, el blat de moro i el gira-sol, o bé aquelles que tinguin molta biomassa foliar, com el tabac i l’alfals. Llavors de cereals com a bioreactors En el context dels sistemes de plantes utilitzades com a bioreactors cal assenyalar el paper de les llavors. Les llavors són òrgans que acumulen naturalment una gran quantitat de proteïna, que es manté estable en un entorn petit i compacte amb baix contingut en aigua. Així doncs, a les qualitats pròpies que tenen les plantes en general per produir proteïnes recombinants (absència de patògens animals, facilitat d’escalat i producció barata de biomassa) cal afegir la facilitat de transport i d’emmagatzematge estable que permeten les llavors. S’ha demostrat que diverses proteïnes recombinants, incloent-hi anticossos i vacunes, s’acumulen en bona quantitat a les llavors, on es mantenen funcionals al llarg dels anys en condicions ambientals. Les llavors més utilitzades es corresponen amb els cultius de gra més estesos arreu del món, els cereals en primer lloc i a bona distància els llegums. Cal destacar que aquestes llavors són objecte de consum directe i, per tant, presenten bones perspectives d’aplicació en vacunacions, aporTreb. Soc. Cat. Biol., 61: 73-91

BIOFACTORIES: PRODUCCIÓ DE PROTEÏNES RECOMBINANTS EN PLANTES 77

tació de nutracèutics i tractament de malalties per via oral (Nochi et al., 2007). En aquests casos no cal purificar el producte i, en conseqüència, s’abarateix extraordinàriament la producció. El blat de moro i l’arròs són els cereals més utilitzats en les plataformes industrials de producció de proteïnes en llavors. Ambdós tenen avantatges, com són un gran rendiment anual de gra, la disponibilitat de sistemes de transformació eficients que inclouen l’ús de promotors ben caracteritzats, i l’existència de pràctiques agrícoles de cultiu, recol·lecció i emmagatzemament molt ben establertes. El principal inconvenient que té el blat de moro és que és una planta de pol·linització creuada i, per tant, un cop transformat està sotmès a importants restriccions normatives que en regulen el conreu. L’arròs, per contra, és una planta que s’autopol·linitza i que, per tant, presenta baix risc de flux genètic amb espècies relacionades. A la taula 1 es mostren algunes de les proteïnes recombinants obtingudes utilitzant les llavors transgèniques de blat de moro i d’arròs com a biofactories, i s’assenyalen les seves aplicacions i les empreses o grups acadèmics implicats en l’estudi i la producció. La primera proteïna recombinant comercialitzada produïda en plantes, l’avidina, es va obtenir de blat de moro transformat amb el gen corresponent del pollastre (Hood et al., 1997). Des de llavors s’han llençat al mercat diverses proteïnes d’aplicació industrial produïdes en cereals, com la tripsina, la laccasa o la cel·lulasa (vegeu la taula 1). També s’han dut a terme diferents plataformes tecnològiques empresarials per produir proteïnes d’aplicació terapèutica, algunes en fases molt avançades de les proves clíniques requerides pels organismes sanitaris pertinents (com la vacuna Lt-B, la lactoferrina i el lisozim, vegeu la taula 1). Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 73-91

El tercer cereal utilitzat com a bioreactor és l’ordi. Encara que el seu rendiment en gra és menor que el del blat de moro i l’arròs, la seva producció és també més barata i s’autopol·linitza. Algunes empreses l’han inclòs en les seves plataformes tecnològiques (com Ventria Bioscience), i dues empreses d’Islàndia, ORF Genetics i Maltagen, l’han adoptat com a sistema de producció aprofitant l’avinentesa que la flora local no permet pol·linització creuada amb l’ordi (Sparrow et al., 2007). L’entorn islandès, doncs, és un bon sistema natural de confinament per a l’ordi transgènic. Els llegums es troben a gran distància dels cereals pel que fa al seu ús per a la producció i comercialització de proteïnes recombinants. Els casos més estudiats són el pèsol i la soja, tots dos autopol·linitzants i amb un gran contingut de proteïnes a les seves llavors (30-40 % del pes). Entre els resultats més prometedors trobem uns bons nivells d’acumulació d’anticossos expressats en el pèsol (Saalbach et al., 2001), la vacuna Lt-B i un pèptid hipotensor a les llavors de soja transformada (Moravec et al., 2007; Yamada et al., 2008). El desenvolupament dels llegums com a biofactories està encara retardat i, en particular, manca un bon mètode de transformació de la soja (Lau i Sun, 2009). Finalment, cal esmentar el paper que tenen les llavors de plantes oleaginoses en les plataformes tecnològiques de producció de proteïnes recombinants. Les llavors oleaginoses, com les de la colza, el gira-sol o el càrtam (o safrà bord), tenen una característica que les fa útils com a bioreactors. Aquestes llavors emmagatzemen els olis en uns orgànuls anomenats cossos oleics (oil bodies), que tenen una proteïna de membrana, l’oleosina, ben caracteritzada. L’empresa SemBioSys disposa d’una tecnologia basada en la fusió de l’oleosina a la proteïna d’interès que facilita l’extracció dels

78 M. D. LUDEVID I M. TORRENT

Taula 1. Exemples significatius de proteïnes industrials i terapèutiques produïdes en llavors Llavor

Producte

Aplicació

Empresa o grup acadèmic

Blat de moro

Avidina

Diagnòstic

Prodigene i Sigma

Tripsina

Enzim industrial

Prodigene i Sigma

Peroxidasa

Enzim industrial

Applied Biotech Institute

Laccasa

Enzim industrial

Applied Biotech Institute

Cel·lulasa

Enzim industrial

Applied Biotech Institute

Avicidina (anticòs)

Càncer colorectal

NeoRx/Monsanto

Vacuna Lt-B

Diarrea

Prodigene

Vacuna HN

Virus Newcastle

Guerrero-Andrade et al., 2006

Seroalbúmina humana

Cirrosi, cirurgia

Ventria Biosciences

Lactoferrina

Nutrició infantil i diarrea

Ventria Biosciences

Lisozim

Nutrició infantil i diarrea

Ventria Biosciences

Toxina B del còlera

Còlera

Nochi et al., 2007

Vacuna proteïna SS1

Hepatitis B

Qian et al., 2008

Insulina

Diabetis

SemBioSys

Somatotropina de carpa

Additiu piscifactoria

SemBioSys

Arròs

Càrtam

Dades tretes de Lau i Sun, 2009; Spök et al., 2008; Ramessar et al., 2008; Basaran i Rodríguez-Cerezo, 2008, i de les webs de les empreses.

productes i n’abarateix la purificació. La planta més utilitzada és el càrtam, i cal destacar l’entrada en el mercat de la somatotropina de la carpa i la producció d’insulina (vegeu la taula 1). Aquesta proteïna terapèutica es troba en fase molt avançada de les proves clíniques i podria ser comercialitzada vora el 2011 (vegeu la taula 1). Aquestes espècies vegetals no són exclusives; n’hi ha d’altres emergents que s’investiguen actualment en diverses companyies, com les algues, les molses i els cultius de cèl·lules vegetals, perquè ofereixen dos avantatges importants: a) d’acord amb la demanda social, permeten confinar els organismes modificats genèticament i b) d’acord amb la regulació vigent per a la producció de proteïnes terapèutiques,

aquests sistemes poden créixer en un entorn que protegeix el medi ambient. MOLSES Són organismes pluricel·lulars eucariotes i, per tant, amb capacitat per processar posttraduccionalment proteïnes, com per exemple, formar ponts disulfur, glicosilacions, etc. Physcomitrella patens és una de les molses més emprades per la seva facilitat de transformació via transfecció de protoplasts. És una planta fotòtrofa fàcil de fer créixer en suspensions cel·lulars i en condicions estrictament controlades (Shaefer et al., 1997). Una de les característiques interessants de P. patens és que és possible Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 73-91

BIOFACTORIES: PRODUCCIÓ DE PROTEÏNES RECOMBINANTS EN PLANTES 79

mantenir aquesta molsa en l’estat haploide tant en cultiu líquid com en cultiu sòlid. Així, després de la transformació s’aconseguiran cultius cel·lulars estables que mantinguin el nivell de proteïna recombinant requerit durant llargs períodes de temps. La producció de proteïnes recombinants es pot incrementar afegint a les construccions gèniques un pèptid senyal, que farà que la proteïna se secreti fora de les cèl·lules. En aquest cas, la purificació de la proteïna recombinant es farà molt més efectiva i menys costosa. Fins ara, han estat produïdes amb aquest sistema diverses proteïnes terapèutiques, com per exemple, factors de creixement humans, seroalbúmina humana i anticossos (Baur et al., 2005; Weise et al., 2007). L’avantatge fonamental d’aquesta molsa és que és l’únic cas, dels analitzats fins ara en plantes pluricel·lulars, que admet la recombinació homòloga en el seu DNA nuclear, i alhora és un procés eficient. Això representa una eina molt valuosa per dirigir la introducció de gens exògens i per a l’eliminació de gens no desitjats (genoanul·lació). Aquesta eina ha fet que la producció de proteïnes recombinants en P. patens estigui molt desenvolupada, especialment per la possibilitat de modificar els processos de glicosilació de proteïnes introduint o eliminant gens d’enzims de glicosilació. Així, una soca de P. patens ha estat modificada genèticament, de manera que no pot afegir els sucres 1,2-xilosa ni 1,3-fucosa a les proteïnes recombinants (perjudicials per a humans), però sí que pot afegir sucres idèntics als que afegeixen a les proteïnes els humans. Altres avantatges són que es poden produir proteïnes en suspensions cel·lulars (confinament) i una optimització quantitativa dels nivells de producció (Shuster et al., 2007).

Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 73-91

ALGUES Les algues, eucariotes unicel·lulars, esdevenen hostes emergents per a la producció de proteïnes recombinants. Chlamydomonas reinhardtii, Phaeodactylum tricornutum, Tetraselmis suecica i Odontella aurita poden produir quantitats considerables de proteïnes recombinants (Franklin i Mayfield, 2004). De fet, C. reinhardtii es pot fer créixer a gran escala, per exemple en contenidors de 500.000 l, a cost molt baix. Comparantles amb les plantes de terra, les algues tenen un creixement molt més ràpid, dupliquen el nombre de cèl·lules cada 4-8 h i, a més, la purificació de les proteïnes recombinants es fa més fàcil i el tipus i la mida de les cèl·lules és uniforme; per tant, no hi ha un gradient d’expressió de les proteïnes degut a diferències d’expressió en teixits diferents de la planta. Tot això facilita la purificació de proteïna i redueix la pèrdua de biomassa. C. reinhardii pot produir proteïnes recombinants i secretar-les al medi, de manera que redueix els costos de producció. S’ha produït en aquest organisme un anticòs humà; les dues cadenes es van acoblar correctament i l’anticòs era capaç de reconèixer les proteïnes del virus de l’herpes (Mayfield et al., 2003; Mayfield i Franklin, 2005). Una altra possibilitat per utilitzar Clamydomonas com a hoste és la producció de proteïnes recombinants en el seu cloroplast. La introducció d’un gen exogen dins el genoma propi dels cloroplasts, com veurem més endavant, permet expressar proteïnes dins aquest orgànul. C. reinhardii té un únic cloroplast enorme (ocupa el 40 % del volum de la cèl·lula). La transformació del genoma d’aquest orgànul d’algues es va fer al final dels anys vuitanta (Boynton et al., 1988). Aquesta estratègia de transformació de plastidis té l’inconvenient que les proteïnes codificades en el genoma dels cloroplasts no estan

80 M. D. LUDEVID I M. TORRENT

glicosilades i, per tant, impedeix produir proteïnes recombinants que requereixen l’addició de sucres. També, s’ha de considerar que l’ús de codons de les algues està esbiaixat respecte al de moltes plantes, i per tant cal modificar la seqüència del DNA que introduïm perquè es tradueixi eficaçment en aquest organisme. Lemna Lemna gibba i Lemna minor, anomenades llenties d’aigua, són plantes que floten i es desenvolupen a l’aigua a molts indrets del món. A causa de les seves condicions senzilles de creixement, aquestes plantes s’adapten perfectament al cultiu intensiu i, per tant, ofereixen la possibilitat de produir grans quantitats de biomassa per unitat de temps. De fet, Lemna duplica la seva mida cada 24-48 hores. Es poden transformar genèticament emprant mètodes de bombardeig de partícules o via Agrobacterium. Les proteïnes recombinants produïdes en Lemna es poden purificar directament de la planta o bé, si es vol, utilitzar la planta directament fresca o assecada. Com en el cas d’altres hostes, Lemna permet la secreció de la proteïna al medi sempre que la construcció de DNA introduïda contingui un pèptid senyal (Gasdaska et al., 2003). Lemna té la capacitat de modificar posttraduccionalment les proteïnes heteròlogues expressades, i també és capaç d’expressar i processar proteïnes terapèutiques complexes, com anticossos monoclonals humans. L’activitat d’aquest anticòs és semblant en el mateix anticòs produït en cultius cel·lulars animals (cèl·lules CHO) (Cox et al., 2006).

SUSPENSIONS CEL·LULARS DE PLANTES SUPERIORS Fins als anys vuitanta, els cultius cel·lulars es van utilitzar fonamentalment per a la producció de metabòlits secundaris amb valor terapèutic, com el taxol, l’ajmalicina i la shikonina (Honda et al., 1988). Els cultius cel·lulars de plantes superiors ens ofereixen avantatges respecte de les plantes cultivades al terra o fins i tot de les crescudes en hivernacles, ja que poden créixer en condicions controlades i estèrils per evitar la contaminació de patògens animals, plaguicides i fertilitzants. A diferència de les plantes transgèniques, que triguen mesos a créixer, els cultius cel·lulars poden créixer molt ràpidament; per exemple, les cèl·lules BY-2 de tabac dupliquen el seu nombre cada 12 h en condicions òptimes de creixement. De fet, una gran quantitat de proteïnes terapèutiques han estat produïdes amb aquest sistema. El seu potencial ha estat recentment demostrat amb l’expressió d'allèrgens d’àcars, altament immunoreactius i correctament modificats posttraduccionalment. Un altre exemple, en aquest cas amb cultius de cèl·lules de pastanaga, és la producció d’un enzim, la glucocerebrosidasa, producte terapèutic aplicat a pacients amb la malaltia de Gaucher (Shaaltiel et al., 2007). L’empresa d’Islàndia Protalix està produint aquest enzim, amb el nom de taliglucerasa alfa, en cultius cel·lulars de pastanaga. Actualment el producte està en les darreres fases d’assajos clínics per ser aprovat per la FDA. Per a la producció de proteïnes recombinants en cultius cel·lulars es requereixen instal·lacions costoses, fermentadors, sales de cultiu estèrils, etc. La inversió econòmica pot encarir tot el procés i finalment el producte, si ho comparem amb proteïnes produïdes en plantes al terra. De totes maneres, cal considerar que el procés de puriTreb. Soc. Cat. Biol., 61: 73-91

BIOFACTORIES: PRODUCCIÓ DE PROTEÏNES RECOMBINANTS EN PLANTES 81

ficació de les proteïnes és molt més eficient si la biomassa prové de cultius cel·lulars que si prové de plantes senceres o de gra. De fet, el procés de purificació d’una proteïna recombinant a partir de biomassa vegetal representa un 80 o un 90 % del cost final del producte (Kusnadi et al., 1997). Tenint en compte aquest aspecte i el valor afegit del producte caldria analitzar molt bé quina estratègia és la menys costosa. Com en el cas de les algues, els cultius cellulars de plantes superiors són uniformes en tipus i mida, i aquest fet és molt important per al processament posterior de la biomassa. La proteïna produïda en aquestes cèl·lules tindrà característiques moleculars homogènies. Així, a diferència de les plantes transgèniques crescudes a terra, en què una modificació posttraduccional, com la glicosilació, pot ser diferent en plantes joves i en plantes velles, en cultius cel·lulars probablement la proteïna produïda tindrà una glicosilació homogènia. Estratègies per incrementar els rendiments i la purificació de les proteïnes recombinants Una de les limitacions del sistema d’expressió en plantes són els baixos rendiments detectats per algunes proteïnes terapèutiques. S’han desenvolupat diferents estratègies per millorar els rendiments: des de l’optimització de l’ús de codons fins a la manipulació del transport subcel·lular de les proteïnes. Optimització de l’ús de codons. Per millorar la fidelitat de la traducció de la proteïna recombinant en plantes pot ser important adaptar la seqüència codificant de la proteïna que volem expressar a la utilitzada normalment per la planta hoste (Hamada et al., 2005). Per exemple, l’expressió en tabac i tomàquet d’un gen bacterià (el Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 73-91

cryIA) modificat parcialment (un 3 % de la seva seqüència) o totalment (un 21 % modificat) s’expressava entre deu i cent vegades més en plantes sense modificar (Perlak et al., 1991). Supressors del silenciament gènic posttranscripcional. El silenciament de l’RNA, també anomenat silenciament gènic posttranscripcional en plantes (PTGS), té un paper molt important en la defensa de molts organismes eucariotes contra les infeccions víriques. Els virus produeixen proteïnes que tenen l’habilitat de suprimir el silenciament de l’RNA de la cèl·lula hoste (Voinnet, 2005). Per exemple, cada virus específic de plantes sembla que produeix el seu supressor del silenciament propi i, actualment, se n’estan caracteritzant un gran nombre (les proteïnes HC-Pro, p19, p25, etc.). Avui dia la més ben caracteritzada és la p19, codificada pel virus del nanisme ramificat del tomàquet (TBMV) (Sholthof et al., 1995). El silenciament no tan sols pot tenir lloc per la presència del virus, sinó que també es pot iniciar per la presència de gens exògens. Per tant, en plantes transgèniques el silenciament està dirigit als transcrits del transgèn, i això provoca una davallada de l’expressió del producte. Aquest fenomen es pot evitar expressant simultàniament un supressor del silenciament i el gen exogen. El rendiment d’expressió del producte pot augmentar fins a cinquanta vegades (Voinnet et al., 2003). Expressió de proteïnes recombinants dirigida a orgànuls o compartiments subcel·lulars. Representa una estratègia per incrementar els nivells d’expressió i simplificar els primers passos de purificació de la proteïna. En aquest context, ha estat molt eficient l’expressió de proteïnes recombinants dirigides al reticle endoplasmàtic (RE), al cloroplast, al vacúol i als cossos oleics (oil bodies). Generalment, les proteïnes s’han expressat en teixits vegetals que

82 M. D. LUDEVID I M. TORRENT

permeten una gran producció de biomassa; per exemple, en fulles de tabac, alfals o altres llegums. En patata, blat de moro, soja, blat o arròs, la proteïna s’expressa específicament a la llavor o als tubercles. Cada estratègia té els seus avantatges i els seus inconvenients. Les empreses productores han escollit sistemes diferents; així, Dow AgroSciences i Protalix produeixen les proteïnes en cultius cel·lulars per transformació nuclear, Bayer en tabac per transformació vírica i cloroplàstica, Medicago en tabac per transformació nuclear, SemBioSys en gira-sol per transformació nuclear i Ventia en arròs i ordi per transformació nuclear. Secreció. La secreció a l’espai intracel·lular o apoplast ha estat i és actualment una de les estratègies emprades per a la producció de moltes proteïnes recombinants. Només cal afegir a la seqüència dels gens exògens un pèptid senyal a l’N-terminal que li permetrà l’entrada a l’RE i la secreció posteriorment. Els cultius de cèl·lules vegetals són el sistema idoni per a la producció per secreció, eviten el processament complicat de biomassa i faciliten el procés de purificació de la proteïna. Reticle endoplasmàtic. Mentre que la secreció per defecte d’una proteïna dins el sistema d’endomembranes tan sols depèn del pèptid senyal, l’expressió i el transport a altres compartiments de la via de secreció (RE, vacúols) requereixen pèptids senyal addicionals. L’RE vegetal és molt plàstic i tolera grans acumulacions de proteïna sense que quedi malmès el desenvolupament o la reproducció de la planta. L’expressió de proteïnes recombinants a l’RE ha estat àmpliament utilitzada, incrementa l’estabilitat proteica i, en conseqüència, incrementa els nivells d’expressió comparats amb els nivells que s’obtenen per secreció (Wandelt et al., 1992). De fet, l’únic senyal per retenir una proteïna exògena a l’RE és,

a part del pèptid senyal, un tetrapèptid (H/KDEL) que s’afegirà al C-terminal de la seqüència. Aquesta estratègia ha estat eficaç per a l’expressió d’immunoglobulines, vacunes i altres proteïnes terapèutiques (Ko et al., 2003). Cossos lipídics: proteïnes de fusió. Els cossos lipídics són uns orgànuls que s’originen a l’RE i que acumulen lípids en les llavors de les plantes. Estan envoltats d’una monocapa de fosfolípids en contacte directe amb els lípids acumulats a dintre. Aquesta membrana de fosfolípids conté una proteïna transmembrana molt abundant, l’oleosina. Les parts N-terminal i Cterminal estan localitzades al citoplasma i la part central dins la membrana lipídica. Les fusions proteiques N-terminals o C-terminals d’oleosina a proteïnes d’interès s’expressaran en els cossos lipídics de la llavor mirant cap al citoplasma. L’avantatge d’aquest sistema és que les proteïnes recombinants es poden aïllar fàcilment d’altres proteïnes de la llavor per flotació (els cossos lipídics són menys densos que l’aigua). Un inconvenient d’aquest sistema és que la proteïna, en estar expressada mirant al citoplasma, no es pot aprofitar de les modificacions posttraduccionals que li podria oferir l’RE ―formació de ponts disulfur, glicosilacions i la interacció amb proteïnes de tipus xaperones per a l’estructuració correcta (Parmenter et al., 1995). Cossos proteics: proteïnes de fusió. Les llavors emmagatzemen una quantitat enorme de proteïnes en uns orgànuls envoltats de membrana anomenats cossos proteics (PB). Aquests orgànuls poder tenir un origen vacuolar (PSV) o bé de l’RE. Les prolamines, una de les famílies de proteïnes de reserva de la llavor dels cereals, s’acumulen a l’RE, on s’agregen i formen PB. L’activitat proteolítica d’aquests orgànuls és molt baixa perquè evita que les proteïnes entrin en el cicle de control de qualitat de l’RE (ER-asTreb. Soc. Cat. Biol., 61: 73-91

BIOFACTORIES: PRODUCCIÓ DE PROTEÏNES RECOMBINANTS EN PLANTES 83

sociate degradation, ERAD) (Tsai et al., 2002); per tant, és una diana molt eficaç per acumular proteïnes recombinants. Recentment s’han desenvolupat diferents tecnologies que permeten expressar i acumular proteïnes terapèutiques en cossos proteics induïts en cèl·lules diferents de les cèl·lules de la llavor, com per exemple en teixits vegetatius. Sorprenentment, plantes transgèniques d’Arabidopsis thaliana transformades amb el domini N-terminal ric en prolina de g-zeïna, una proteïna de reserva de blat de moro, expressaven de manera estable aquest domini i l’acumulaven en cossos proteics. Els cossos proteics «induïts» eren semblants als originals de la llavor de blat de moro, però en aquest cas presents en cèl·lules de la fulla (Geli et al., 1994). Aquest fenomen va estimular el desenvolupament d’una tecnologia, Zera, per a la producció de proteïnes recombinants basada en la fusió del pèptid Zera a l’N-terminal de la proteïna d’interès i l’expressió en plantes. Zera és una seqüència polipeptídica de noranta-tres aminoàcids que conté: a) el pèptid senyal de g-zeïna, b) un domini repetitiu de vuit unitats de Pro-Pro-Pro-Val-HisLeu, c) un altre domini ric en prolina amb seqüència Pro-X (X és qualsevol aminoàcid) i d) sis cisteïnes distribuïdes al llarg de la seqüència. El més interessant és que l’expressió i acumulació de les proteïnes fusionades a Zera no tan sols indueixen la formació de PB en sistemes vegetals, sinó que també ho fan en cèl·lules d’insectes, fongs i cultius cel·lulars animals (Torrent et al., 2009b). Aquesta estratègia presenta tres avantatges importants per a la producció de proteïnes recombinants: a) les proteïnes fusionades a Zera romanen estables en els cossos proteics (Alvarez et al., 2010), b) els PB formats de novo són orgànuls densos que es poden aïllar fàcilment per densitat, fet que facilita enormement la recuperació de la proteïna (Torrent et al., 2009a) i c) la Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 73-91

presència d’aquests PB no afecta el creixement normal de la planta. La introducció d’una seqüència de consens d’un lloc de tall per a una proteasa específica entre Zera i la proteïna d’interès permet, després de l’aïllament dels PB, alliberar Zera i purificar la proteïna recombinant per mètodes clàssics de purificació de proteïnes. L’empresa ERA Biotech actualment desenvolupa i comercialitza la tecnologia Zera per a la producció de proteïnes terapèutiques, enzims i proteïnes industrials (vegeu les figures 1 i 2). Darrerament s’han descrit altres tecnologies basades en proteïnes de fusió. Un exemple en són els biopolímers sintètics derivats de l’elastina de mamífers (ELP), que contenen una repetició del pentapèptid VPGXG i que, fusionats a una proteïna d’interès, es transporten a l’RE del tabac. La proteïna de fusió expressada s’acumula en cossos proteics (Conley et al., 2009b), que es poden aïllar per inverse transition cycling (ITC) (Conley et al., 2009a). El procés de recuperació de la proteïna i la purificació són, però, cars i difícils. Un altre exemple recent són les fusions gèniques d’hidrofobines a proteïnes d’interès i la seva expressió en plantes de tabac. Les hidrofobines són unes proteïnes petites secretades en fongs. L’estabilitat de la proteïna està determinada per les vuit cisteïnes presents a la seva seqüència que formen ponts disulfur intramoleculars. En la natura les hidrofobines tenen tendència a autoacoblar-se i confereixen un cert grau d’hidrofobicitat a les hifes dels fongs, fet que els permet créixer (Wang et al., 2005). Aquestes proteïnes, un cop fusionades a les proteïnes d’interès, poden modificar la hidrofobicitat de la proteïna d’interès quan s’expressen en plantes. Això permet que, un cop expressada la proteïna quimèrica, es pugui purificar de la biomassa vegetal amb un sistema de partició en dues fases

84 M. D. LUDEVID I M. TORRENT

de sulfactants i medi aquós (ATPS). El sistema concentra d’una manera fàcil i barata les fusions d’hidrofobina dins les micel·les formades, i es recupera en la fase del sulfactant (Linder et al., 2002). TRANSFORMACIÓ DE CLOROPLASTS En les plantes superiors els plastidis tenen el seu genoma propi (plastoma), que oscil·la entre 120 i 180 quilobases, i és poliploide, és a dir, una cèl·lula pot tenir entre

1.000 i 10.000 còpies idèntiques del plastoma. Aquestes peculiaritats han motivat l’interès per desenvolupar tècniques de transformació de cloroplasts per a la producció de proteïnes recombinants. La transformació es basa fonamentalment en la inserció del gen escollit mitjançant el bombardeig de partícules sobre el teixit verd, la recombinació homòloga posterior que tindrà lloc entre seqüències frontereres al gen d’interès i les seqüències diana del genoma dels cloroplasts, i finalment l’eliminació de les còpies del plastoma no transformades en medis selectius (Maliga Zera-ECFP + HC-Pro

- HC-Pro

Figura 1. Cossos proteics induïts en cèl·lules epidèrmiques de fulles de tabac (N. benthamiana). Transformació transitòria per agroinfiltració amb una xeringa (A i B) amb el gen de fusió: Zera-proteïna fluorescent (ECFP) i un supressor de silencia ment (HcPro). Es pot observar la diferència del nivell d’expressió cotransformant o no amb el gen víric HcPro. L’expressió del gen està dirigida pel promotor constitutiu CaMV 35S. Imatge al microscopi confocal dels cossos proteics plens de proteïna fluorescent formats a les fulles de tabac (D) (vegeu l’ampliació). Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 73-91

BIOFACTORIES: PRODUCCIÓ DE PROTEÏNES RECOMBINANTS EN PLANTES 85

et al., 2004; Bock et al., 2007; Koop et al., 2007). La inserció d’un gen exogen (transgèn) en el genoma dels cloroplasts permet normalment una acumulació de la proteïna recombinant molt elevada, que podria fluctuar entre el 2 i el 70 % de la proteïna total soluble (TSP) (Oey et al., 2008; FernandezSanchezMillan et al., 2008; Zhou et al., 2008) i d’altres avantatges com la integració precisa dels transgens per recombinació homòloga, l’absència d’efectes epigenètics (silenciament gènic i efectes posicionals). A més, a causa de l’herència materna dels plastidis, evita la transmissió del transgèn pel pol·len de les plantes modificades genèticament a altres plantes, i garanteix així la contenció del transgèn (Svab i Maliga, 2007; Ruf et al., 2007), aspecte especialment important quan parlem de producció de proteïnes terapèutiques. Encara que els cloroplasts tinguin un origen eucariota, recentment s’ha observat que tenen la capacitat de dur a terme la formació de ponts

Figura 2. Immunocitoquímica al microscopi electrònic d’un cos proteic. Talls ultrafins de cèl·lules epidèrmiques de fulla de tabac transformades amb Zera-proteïna fluorescent incubades amb un anticòs anti-Zera i marcatge amb proteïna A conjugada amb or de 10 nm. S’observa un cos proteic ple de la proteïna recombinant. Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 73-91

disulfur i d’altres modificacions posttraduccionals (Bally et al., 2008). La glicosilació, però, és una modificació que no es dóna en cloroplasts i, per tant, no és possible la producció de glicoproteïnes. GLICOSILACIÓ Més d’un terç de les proteïnes terapèutiques estan glicosilades. Com en altres sistemes de producció de proteïnes recombinants com cultius cel·lulars de mamífer, cèl·lules d’insecte o llevats, les plantes no són capaces d’efectuar el mateix tipus de glicosilació que fan les cèl·lules humanes. Hi ha dos tipus de glicosilació en proteïnes: la N-glicosilació i l’O-glicosilació. La N-glicosilació la pateixen només aquelles proteïnes que entren en l’RE (o dit d’una altra manera, en la ruta de secreció) i que tenen en la seva seqüència d’aminoàcids la seqüència de consens asparagina-X-serina o treonina (X és qualsevol aminoàcid excepte prolina i àcid aspàrtic). Les glicosidases i glicosiltransferases de l’RE afegeixen un complex de sucres en l’asparagina d’alt contingut en manosa (Man9-5GlcNAc2). Aquesta glicosilació és comuna en totes les cèl·lules eucariotes, incloent-hi les cèl·lules animals i vegetals. Però, en cèl·lules vegetals, els complexos de Man9-5GlcNAc2 es modificaran fora de l’RE, a l’aparell de Golgi, on s’afegeix α-1,3-fucosa o β-1,2-xilosa. Aquestes modificacions no ocorren en les cèl·lules humanes, en què hi ha α-1,6-fucosa i β-1,4-galactosa i àcid siàlic. La xilosa i la fucosa afegides en les proteïnes recombinants produïdes en plantes poden provocar al·lèrgies i, per tant, poden ser insegures si s’injecten en humans (Gomord et al., 2005). S’estan utilitzant diferents tècniques per resoldre aquest problema. Una és expressar la proteïna a l’RE afegint-li, com hem comentat abans, la seqüència KDEL

86 M. D. LUDEVID I M. TORRENT

(Saint-Jore-Dupas et al., 2007). Una via més econòmica és eliminar les glicosiltransferases que afegeixen fucosa i xilosa per tècniques de genoanul·lació. Aquest sistema s’ha emprat en la producció d’anticossos monoclonals en Lemna (Cox et al., 2006) i d’un factor de creixement en molses (Kaprivova et al., 2004). BIOSEGURETAT, RISCOS I REGULACIONS Encara ara, en el món industrialitzat s’utilitzen les fórmules més bàsiques de medicines que provenen de plantes, i que consisteixen fonamentalment en extractes o infusions de plantes senceres (remeis etnobotànics). Amb el pas dels anys, però, s’han estès els productes farmacèutics convencionals sintetitzats químicament i a hores d’ara també productes complexos produïts en bacteris o cèl·lules animals a partir de DNA recombinant (GMO). Actualment ja hi ha plataformes de producció de productes recombinants en plantes i, per tant, s’han creat regulacions específiques per a aquests productes. Desafortunadament, a causa de la percepció negativa del públic en general a les plantes modificades genèticament, és possible que s’alenteixen les necessitats reals de determinats productes terapèutics. El Servei Internacional per a l’Adquisició d’Aplicacions Agrobiotecnològiques (ISAAA, 2006, http://www.isaaa. org) preveu que cap al 2015 més de vint milions de pagesos plantaran, en quaranta països, dos-cents milions d’hectàrees de llavors modificades genèticament. Per això s’ha desenvolupat un sistema rigorós de bioseguretat per cobrir aquestes plantacions i poder donar unes bases serioses a la regulació que dirigirà la producció de productes en plantes modificades genèticament. La diferència fonamental entre la

primera generació de plantes transgèniques és que aquestes produïen millores econòmicament rentables (per exemple, resistència a herbicides) en plantes emprades normalment per a consum alimentari, tant humà com animal. La nova regulació permetrà produir a alts rendiments productes que no siguin per a consum humà i animal. Les proteïnes recombinants produïdes entraran dins la regulació de productes farmacèutics i es formularan com qualsevol producte final, seguint estrictament les bones pràctiques de manufactura (GMP) associades a la indústria farmacèutica i les seves regulacions a Europa ―23/93/EU per a productes farmacèutics produïts per DNA recombinant: CPMP (2006), Draft Guideline on the Quality of Biological Active Substances produced by stable transgene expression in higher plants. European Agency for the evaluation of Medicinal products, EMEA―, equivalents a la Food and Drug Administration (FDA) dels Estats Units d’Amèrica. El fet que la regulació europea encara s’estigui elaborant és per la dificultat d’estandarditzar la terminologia emprada en dues àrees ben diferents: l’agricultura biotecnològica i la farmacèutica. Directives de la Comunitat Europea Regulacions ambientals: 98/81/EC (aïllament en l’us d’OMG); 2001/18/EC (alliberament al camp); 1829/2003/EC (comercialització). Regulació de productes farmacèutics: 2001/ 10/EC (assajos clínics); 23/93/726/2004 (productes biotecnològics); 2001/82/2004/28/EC (medicines per a veterinària); 2001/83/2004/ 27/EC (medicines per a humans); 2004/24/ EC (herbolaris). Molts dels problemes que envolten la bioseguretat en plantes modificades genètiTreb. Soc. Cat. Biol., 61: 73-91

BIOFACTORIES: PRODUCCIÓ DE PROTEÏNES RECOMBINANTS EN PLANTES 87

cament es deuen al fet que la societat vol que es garanteixi que no hi hagi barreja de plantes transgèniques amb no transgèniques, és a dir, preservar la identitat i un seguiment rigorós. Es necessita que la biologia de la producció en hostes vegetals tingui en compte l’impacte ambiental, la seguretat dels aliments i la salut humana. En el context de la bioseguretat s’ha d’escollir la millor opció, i això no vol dir la més econòmica ni la més rentable. Les plantes idònies per a bioseguretat inclouen aquelles que tenen esterilitat masculina (com algunes varietats de patata), les que no permeten encreuar-se amb les seves homòlogues no transgèniques (com la soja en alguns països) i plantes que no entren en la cadena alimentària (tabac). Com hem comentat abans, les plantes que no es cultiven normalment com per exemple, Lemna, podrien tenir molts avantatges. El teixit vegetal on s’expressi la proteïna també té la seva importància. Així, les llavors redueixen la possibilitat que els herbívors i altres organismes que s’aprofiten de les fulles s’exposin al producte. De totes maneres, l’expressió en fulles permet recollir la biomassa abans que la planta floreixi, i així s’evita la dispersió del pol·len i la dispersió de llavors. Als Estats Units i el Canadà ha estat prohibit l’us de colza i alfals transgènic perquè són espècies pol·linitzades per abelles, es poden encreuar amb espècies locals no transgèniques i tenen dormància plurianual. La localització de les plantes transgèniques també té la seva importància. Reduirem el risc de contaminació ambiental si les plantes creixen confinades. Aquelles proteïnes terapèutiques que han estat produïdes en plantes en un medi confinat tenen més probabilitats de ser aprovades per les regulacions que hi ha actualment. Normalment les plantes productores de productes farmacèutics no són l’objectiu dels Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 73-91

pagesos: són productes d’alt valor afegit, que no necessiten grans extensions de cultiu i que normalment es produeixen amb condicions de confinament rigorós. Cal considerar que la transparència és un requisit important en qualsevol procés regulador. En la majoria de països cal demanar permisos o l’aprovació de les autoritats competents tant en el cas d’alliberament al camp com en el moment de la comercialització. Podeu trobar informació sobre això a Europa a http://gmoinfo.jrc.it. Els països on no hi ha regulació però que formen part del Protocol de Bioseguretat de Cartagena (http://biodiv.org/biosafety) han de notificar qualsevol moviment o transport de plantes modificades genèticament. Les mesures que disminueixen el risc de producció per a un producte farmacèutic determinat depenen de diferents factors, com per exemple les propietats de la molècula, la biologia de l’hoste vegetal i el medi ambient on creix. Alguns mètodes per reduir els riscos (Sparrow et al., 2007; Commandeur et al., 2003) són: ― Preservació de la identitat, és a dir, l’ús de varietats particulars que siguin visualment diferents dels no transgènics, com tomàquets blancs, blat de moro de color porpra o llavors amb una proteïna marcador fluorescent. ― Aconseguir l’expressió de la proteïna després de la collita. ― Aïllament físic amb l’establiment de distàncies de cultiu amb espècies no transgèniques sexualment compatibles. ― Aïllament temporal, és a dir, cultiu de les plantes en períodes diferents per evitar el risc que s’encreuin. ― Eliminació física de les flors (s’utilitza actualment en blat de moro). El control d’aquestes pràctiques l’està duent a terme als Estats Units l’agència APHIS. El control inclou el pla de conten-

88 M. D. LUDEVID I M. TORRENT

ció per a la producció del producte, la manipulació i el transport de les plantes. Si són llavors, el temps de pol·linització, la collita, la destrucció de la part vegetativa de la planta, el transport, el confinament, i l’ús de les instal·lacions per a l’emmagatzematge. Finalment és important considerar que les proteïnes terapèutiques tenen un potencial intrínsec d’induir reaccions immunoal·lèrgiques no desitjades. Això és especialment rellevant si es tracta d’una administració via venosa d’aquests productes, tant els produïts en bacteris com els produïts en cultius animals o en plantes. El fet que hi hagi al·lèrgies alimentàries suggereix que els productes produïts en plantes poden provocar seriosos problemes d’hipersensibilitat, encara que restringits a pocs pacients. Per tant, cal utilitzar els mateixos mètodes emprats per controlar el risc associat a l’expressió de proteïnes recombinants en bacteris i cèl·lules animals per a proteïnes terapèutiques derivades de plantes. BIBLIOGRAFIA Alamillo, J. M.; Monguer, W.; Sola, I.; García, B.; Perrin, Y.; Bestango, M.; Burrone, O. R.; Sabella, P.; Plana-Durán, J.; Enjuanes, L.; Lomonossoff, G.; García, J. A. (2006). «Use of virus vector for the expression in plants of active full length and single chain anti-coronavirus antibodies». Biotechnol. J., 1: 1103-1111. Alvarez, M. L.; Topal, E.; Martín, F.; Cardineau, G. A. (2010). «Higher accumulation of F1-V fusion recombinant protein in plants after induction of protein body formation». Plant Mol. Biol., 72: 75-89. Bally, J.; Paget, E.; Droux, M.; Job, C.; Dubald, M. (2008). «Both the stroma and thylakoid lumen of tobacco chloroplasts are competent for the formation of disulfide bonds in recombinant proteins». Plant Biotechnol. J., 6: 46-61.

Basaran, P.; Rodríguez-Cerezo, E. (2008). «Plant molecular farming: opportunities and challenges». Crit. Rev. Biotech., 28: 153-172. Baur, A.; Reski, R.; Gorr, G. (2005). «Enhanced recovery of a secreted recombinant human growth factor using stabilizing additives and by coexpression of human serum albumin in the moss Physcomitrella patens». Plant Biotechnol. J., 3: 331340. Bock, R. (2007). «Plastid biotechnology: prospects for herbicide and insect resistance, metabolic engineering and molecular farming». Curr. Opin. Biotechnol., 18: 100-106. Boynton, J. E.; Gillham, N. W.; Harris, E. H.; Hosler, J. P.; Johnson, A. M.; Jones, A. R.; Randolph-Anderson, B. L.; Robertson, D.; Klein, T. M.; Shark, K. B. (1988). «Chloroplast transformation in Clamydomonas with high velocity microprojectiles». Science, 240: 1534-1538. Commandeur, U.; Twyman, R. M.; Fisher, R. (2003). «The biosafety of molecular farming in plants». AgBiotechNet, 5: 1-9. Conley, A. J.; Joensuu, J. J.; Jevnikar, A.; Menassa, R, Brandle, J. E. (2009a). «Optimization of elastin-like polypeptide fusions for expression and purification of recombinant proteins in plants». Biotechnol. Bioeng., 103: 562-573. Conley, A. J.; Joensuu, J. J.; Menassa, R.; Brandle, J. E. (2009b). «Induction of protein body formation in plant leaves by elastin-like polypeptide fusions». BMC Biol., 7: 48. Cox, K. M.; Sterling, J. D.; Regan, J. T.; Gasdaska, J. R.; Frantz, K. K.; Peele, C. G.; Black, A.; Pass more, D.; Moldovan-Loomis, C.; Srinivasan, M.; Cuison, S.; Cardarelli, P. M.; Dickey, L. F. (2006). «Glycan optimization of a human monoclonal antibody in the aquatic plant Lemna minor». Nat. Biotechnology, 24: 1591-1597. Fang, R. X.; Nagy, F.; Sivasubrammaniam, S.; Chua, A. H. (1989). «Multiple cis regulatory elements for maximal espression of the cauliflower mvirus 35S promoter in transgenic plants». Plant Cell, 1: 141-150. Fernandez-Sanchez Millan, A.; Ortigosa, S. M.; Hervas-Stubbs, S.; Corral-Martinez, P.; SeguiSimarro, J. M.; Gaetan, J.; Coursaget, P.; Veramendi, J. (2008). «Human papilloma virus L1 protein expressed in tobacco chloroplasts self-assambles into virus-like particles that are highly immunogenic». Plant Biotechnol. J., 6: 427-441. Fisher, R.; Stoger, E.; Sshillberg, S.; Christou, P.; Twyman, R. M. (2004). «Plant-based production of biopharmaceuticals». Curr. Opin. Plant. Biol., 7: 152-158. Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 73-91

BIOFACTORIES: PRODUCCIÓ DE PROTEÏNES RECOMBINANTS EN PLANTES 89 Franklin, S. E.; Mayfield, S. P. (2004). «Prospects for molecular farming in the green alga Chlamydomonas». Curr. Opin. Plant Biol., 7: 159-165. Gasdaska, J. R.; Spencer, D.; Dickey, L. F. (2003). «Advantatges of therapeutic protein production in the aquatic plant Lemna». Bioprocessing J., 3: 50-56. Geli, M. I., Torrent, M.; Ludevid, D. (1994). «Two structural domains mediate two sequential events in γ-zein targeting: protein endoplasmic retention and protein body formation». Plant Cell, 6: 19111922. Gomord, V.; Chamberlain, P.; Jefferis, R.; Faye, L. (2005). «Biopharmaceutical production in plants: problems, solutions and opportunities». Trends Biotechnol., 23: 559-565. Gomord, V.; Faye, L. (2004). «Post-translational modification of therapeutic proteins in plants». Curr. Opin. Plant Biol., 7: 171-181. Gomord, V.; Sourrouille, C.; Fitchette, A. C.; Bardor, M.; Pagny, S.; Lerouge, P.; Faye, L. (2004). «Production and glycosilation of plant made pharmaceuticals: the antibodies as a challenge». Plant Biotechnol. J., 2: 83-100. Guerrero-Andrade, O.; Loza-Rubio, E.; Olivera-Flores, T.; Fehervari-Bone, T.; Gomez-Lim, M. A. (2006). «Expresión of the newcastle disease virus fusion protein in transgenic maize and immunological studies». Transgenic Res., 15: 455-463. Hamada, A.; Yamaguchi, K. I.; Ohnishi, N.; Harada, M.; Nikumaru, S.; Honda, H. (2005). «High level production of yeast (Schwanniomyces occidentalis) phytase in transgenic rice plants by a combination of signal sequence and codon modification of the phytase gene». Plant Biotechnol. J., 3: 43-55. Honda, G.; Sakakibara, F.; Yazaki, K.; Tabata, M. (1988). «Isolation of deoxyshikonine, an antidermatophytic principle from Lithospermum erythrorhizon cell cultures». J. Nat. Prod., 51: 152-154. Hood, E. E.; Witcher, D. R.; Maddock, S.; Meyer, T.; Baszczynski, C.; Bailey, M.; Flynn, P.; Register, J.; Marshall, L.; Bond, D. (1997). «Commertial production of avidin from transgenic maize: characterization of transformant, production, processing, extraction and purification». Mol. Breed., 3: 291-306. Horsch, R.; Fry, J. E.; Hoffman, N.; Eicholtz, D.; Rogers, S.; Fraley, R. (1985). «A simple and general method for transferring genes into plants». Science, 227: 1229-1231. Kapila, J.; Rycke, R. de; Montagu, M. van; Angenon, G. (1997). «An Agrobacterium mediated transi-

Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 73-91

ent gene expression system for intact leaves». Plant Sci., 122: 101-108. Kaprivova, A.; Stremmer, C.; Altman, F.; Hoffmann, A.; Kopriva, S.; Gorr, G.; Reski, R.; Deker, F. L. (2004). «Targeted knock-outs of Physcomitrella lacking plant specific immunogenic Nglycans». Plant Biotechnol. J., 2: 517-523. Ko, K.; Tekoah, Y.; Rudd, P. M.; Koprowski, H. (2003). «Function and glycosilation of plant derived antiviral monoclonal antibody». Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100: 8013-8018. Koop, H. U.; Herz, S. Golds, T. J.; Nickelsen, J. (2007). «The genetic transformation of plastids». Top. Curr. Genet., 19: 457-510. Kusnadi, A. R.; Nikolov, Z. L.; Howard, J. A. (1997). «Production of recombinant proteins in transgenic plants: practical considerations». Biotechnol. Bioeng., 56: 473-484. Lau, O. S.; Sun, S. S. M. (2009). «Plant seeds as bioreactors for recombinant protein production». Biotechnol. Adv., DOI 10.1016/j.biotechadv.2009.05. 005. Linder, M. B.; Szilvay, G. R.; Nakari-Setälä, T.; Söderlund, H.; Penttilä, M. (2002). «Surface adhesion of fusion proteins containing the hydrophobins HFBI and HFBII from Trichoderma reesei». Protein Sci., 11: 2257-2266. Ma, J. K.-C.; Drake, P. M.; Christou, P. (2003). «The production of recombinant pharmaceutical proteins in plants». Nat. Rev. Genet., 4: 794-805. Ma, J. K.; Barros, E.; Bock, R.; Christou, P.; Dale, P. J.; Dix, P. J.; Fischer, R.; Irwin, J.; Mahoney, R.; Pezzotti, M.; Schillberg, S.; Sparrow, P.; Stoger, E.; Twyman, R. M. (2005). «Molecular farming for new drugs and vaccines. Current perspectives on the production of pharmaceuticals in transgenic plants». EMBO Reports, 6: 593-599. Ma, J. K.; Chickwamba, R.; Sparrow, P.; Fisher, R.; Mahoney, R.; Twyman, R. M. (2005). «Plant-derived pharmaceuticals–the road forward». Trends Plant Sci., 10: 580-585. Ma, J. K.; Hiatt, A.; Hein, M.; Vine, N. D.; Wang, F.; Stabila, P.; Dolleweerd, C. van; Mostov, K.; Lerner, T. (1995). «Generation and assembly of secretory antibodies in plants». Science, 268: 716719. Maliga, P. (2004). «Plastid transformation in higher plants». Annu. Rev. Plant Biol., 55: 289-313. Mayfield, S. P; Franklin, S. E. (2005). «Expression of human antibodies in eukariotic micro-algae». Vaccine, 23: 1828-1832. Mayfield, S. P.; Franklin, S. E.; Lerner, R. A. (2003). «Expression and assembly of a fully active

90 M. D. LUDEVID I M. TORRENT antibody in algae». Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100: 438-442. McCormick, A. A. [et al.] (1999). «Rapid production of specific vaccines for lymphoma by expression of the tumor-derived single-chain Fv epitopes in tobacco plants». Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96: 703-708. Menkhaus, T. J.; Bai, Y.; Zhang, C.; Nikolov, Z. L.; Glatz, C. E. (2004). «Considerations for the recovery of recombinant proteins from plants». Biotechnol. Prog., 20: 1001-1014. Moravec, T.; Schmidt, M. A.; Herman, E. M.; Woodford-Thomas, T. (2007). «Production of Escherichia coli heat labile toxin (LT) B subunit in soybean seed and analysis of its immunogenicity as an oral vaccine». Vaccine, 25: 1647-1657. Nochi, T.; Takagi, H.; Yuki, Y.; Yang, L.; Masumura, T.; Mejina, M. (2007). «Rice-based mucosal vaccine as a global strategy for cold-chain- and needle free vaccination». Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 104: 10986-10991. Oey, M.; Lohse, M.; Kreikemeyer, B.; Bock, R (2008). «Exhaustion of the chloroplast protein synthesis capacity by massive expression of a highly stable protein antibiotic». Plant J., 57: 436-445. Parmenter, D. L.; Boothe, J. G.; Rooijen, G. J. van; Yeung, E. C.; Moloney, M. M. (1955). «Production of biologically active hirudin in plant seeds using oleosin partition». Plant Mol. Biol., 29: 11671180. Perlak, F. I.; Fuchs, R. I.; Dean, D. A.; McPerson, S. L.; Fischhoff, D. A. (1991). «Modification of the coding sequence enhances plant expression of insect control protein genes». Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 3324-3328. Qian, B.; Shen, H.; Liang, W.; Guo, X.; Zhang, C.; Wang, Y. (2008). «Immunogenicity of recombinant hepatitis B virus surface antigen fused with preS1 epitopes expressed in rice seeds». Transgenic Res., 17: 621-631. Ramessar, K.; Capell, T.; Christou, P. (2008). «Molecular farming in cereal crops». Phytochem. Rev., 7: 579-592. Ruf, S.; Karcher, D.; Bock, R. (2007). «Determining the transgene containment level provided by chloroplast transformation». Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 104: 6998-7002. Saalbach, I.; Giersberg, M.; Conrad, U. (2001). «High level expression of a single-chain Fv fragment (scFv) antibody in transgenic pea seeds». J. Plant Physiol., 158: 529-533. Saint-Jore-Dupas, C.; Faye, L.; Gomord, V. (2007). «From planta to pharma with glycosilation in the toolbox». Trends Biotechnol., 25: 317-323.

Shaaltiel, Y.; Bartfeld, D.; Hashmueli, S.; Baum, G.; Brill-Almon, E.; Galili, G.; Dym, O.; Boldin-Adamsky, S. A.; Silman, I.; Sussman, J. L.; Futerman, A. H.; Aviezer, D. (2007). «Production of glucocerebrosidase with terminal mannose glycans for enzyme replacement therapy of Gaucher’s disease using a plant system». Plant Biotechnol. J., 5: 579-590. Shaefer, D. G.; Zryd, J. P. (1997). «Efficient gene targeting in the moss Physcomitrella patens». Plant J., 11: 1195-1206. Sholthof, H. B.; Sholth, K. B.; Jackson, A. O. (1995). «Identification of tomato bushy stunt virus host-specific symptom determinants by expression of individual genes from potato virus X vector». Plant Cell, 7: 1157-1172. Shuster, M.; Jost, W.; Mudde, G. C.; Wiederkum, S.; Schwager, C.; Janzek, E.; Altmann, F.; Stadlmann, J.; Stemmer, C.; Gorr, G. (2007). «In vivo glyco-engineered antibody with improved lytic potential produced by an innovative non-mammalian expression system». Biotechnol. J., 2: 700708. Sijmons, P. C.; Dekker, B. M.; Schrammeijer, B.; Verwoerd, T. C.; Elzen, P. J. van der; Hoekema, A. (1990). «Production of correctly processed serum albumin in transgenic plants». Bio/Technology, 8: 217-221. Sparrow, P. A. C.; Irwin, J. A.; Dale, P. J.; Twyman, R. M.; Ma, J. K. C. (2007). «Pharma-planta: Road testing the developing regulatory guidelines for plant-made pharmaceuticals». Transgenic Res., 16: 147-161. Spök, A.; Twyman, R. M.; Fischer, R.; Ma, J. K. C.; Sparrow, P. A. C. (2008). «Evolution of a regulatory framework for pharmaceuticals derived from genetically modified plants». Trends Biotechnol., 26: 506-517. Svab, Z.; Maliga, P. (2007). «Exceptional transmission of plastids and mitochondria from the transplastomic pollen parent and its impact on transgene containment» Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 104: 7003-7008. Torrent, M.; Llompart, B.; Ramassamy, S. L.; Tous, I. L.; Bastida, M.; Marzabal, P.; Parvinen, A. W.; Saloheimo, M.; Heifetz, P. B.; Ludevid, M. D. (2009a). «Eukaryotic protein production in designed storage organelles». BMC Biol., 7: 5. Torrent, M.; Llop-Tous, I.; Ludevid, D. (2009b). «Protein body induction: a new tool to produce and recover recombinant proteins in plants». A: Faye, L.; Gomord, V. [ed.]. 32 recombinant proteins from plants, methods in molecular biology, 1a ed. Heidelberg: Humana Press, p. 193-208. Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 73-91

BIOFACTORIES: PRODUCCIÓ DE PROTEÏNES RECOMBINANTS EN PLANTES 91 Tsai, B.; Ye, Y.; Rapoport, T. A. (2002). «Retro-translocation of proteins from the endoplasmic reticulum into the cytosol». Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 3: 246-255. Twyman, R. M.; Stoger, E.; Schillberg, S.; Christou, P.; Fisher, R. (2003). «Molecular farming in plants: host systems and expression technology». Trends Biotechnol., 21: 570-578. Voinnet, O. (2005). «Induction and suppression of RNA: insights from viral infections». Nat. Rev. Genet., 6: 206-220. Voinnet, O.; Rivas, S.; Mestre, P.; Baulcombe, D. (2003). «An enhanced transient expression system in plants based on suppression of gene silencing by the p19 protein of tomato bushy stunt virus». Plant J., 33: 949-956. Walsh, G.; Jefferis, R. (2006). «Post-translational modifications in the context of therapeutic proteins». Nat. Biotechnol., 24: 1241-1252. Wandelt, C. I.; Khan, M. R.; Craig, S.; Schoeder, H. E.; Spencer, D.; Higgins, T. J. (1992). «Vicilin with carboxy-terminal KDEL is retained in the endoplasmic reticulum and accumulates to high levels in the leaves of transgenic plants». Plant J., 2: 181-192.

Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 73-91

Wang, X.; Shi, F.; Wosten, H. A.; Hektor, H.; Poolman, B.; Robillard, G. T. (2005). «The SC3 hydrophobin self-assembles into a membrane with distinct mass transfer properties». Biophys. J., 88: 3434-3443. Weise, A.; Altman, F.; Rodriguez-Franco, M.; Sjoberg, E.; Baumenr, W.; Launhardt, H.; Kiertzmann, M.; Gorr, G. (2007). «High-level expression of secreted complex glycosilated recombinant human erythropoietin in the Physcomitrella delta-fuc-t and delta-xyl-t mutant». Plant Biotechnol. J., 5: 389-401. Yamada, Y.; Nishizawa, K.; Yokoo, M.; Zhao, H.; Onishi, K.; Teraishi, M. (2008). «Anti-hypertensive activity of genetically modified soybean seeds accumulating novokinin». Peptides, 29: 331-337. Zhou, F.; Badillo-Corona, J. A.; Karcher, D.; Gonzalez-Rabade, N.; Piepenburg, K.; Borchers, A. M.; Maloney, A. P.; Kavanagh, T. A.; Gray, J. C.; Bock, R. (2008). «High-level expression of human immunodeficiency virus antigens from the tobacco and tomato plastid genomes». Plant Biotechnol. J., 6: 897-913.

DOI: 10.2436/20.1501.02.95

Organismes modificats genèticament (Josep M. Casacuberta, ed.) Treballs de la SCB. Vol. 61 (2010) 93-104

ANIMALS TRANSGÈNICS EN RECERCA I MODELS ANIMALS DE MALALTIES Lluís Montoliu Centro Nacional de Biotecnología (CNB-CSIC), Madrid Centro de Investigación Biomédica en Red de Enfermedades Raras (CIBERER), Instituto de Salud Carlos III, Madrid Adreça per a la correspondència: Lluís Montoliu. Centro Nacional de Biotecnología (CNB-CSIC), Campus de Cantoblanco. C. de Darwin, 3. 28049 Madrid. Tel.: 915 854 844. Adreça electrònica: montoliu@cnb.csic.es. RESUM L’experimentació animal és essencial per poder interpretar adequadament el genoma humà i per reproduir les malalties que afecten les persones en altres organismes semblants a nosaltres. Entre aquests organismes destaquen els ratolins, un mamífer de petita mida però molt adequat per a la recerca en biomedicina. El genoma del ratolí també ha estat seqüenciat i, majoritàriament, comparteix el nombre de gens existents en el genoma humà, entre 20.000 i 25.000 gens. Addicionalment, tots aquests gens estan molt conservats evolutivament, i són similars als corresponents humans en un 95 %. Per tot això, la recerca sobre els gens del genoma del ratolí, indirectament, és una recerca sobre la funció dels gens humans. Tot allò que aprenem investigant la funció de determinats gens en el ratolí ho podem aplicar al coneixement dels gens homòlegs en humans. Finalment, els ratolins permeten la manipulació del seu genoma mitjançant tècniques de modificació genètica. Són els ratolins que anomenem ratolins transgènics o mutants, que porten nous gens o alteracions específiques en algun dels seus gens. Amb ells podem preparar models animals de moltes malalties que afecten els humans, per augmentar el nostre coneixement d’aquestes malalties i poder desenvolupar noves estratègies terapèutiques. Paraules clau: ratolí transgènic, genoma, modificació genètica, cèl·lula troncal, biomedicina.

Rebut: 11/05/2010. Acceptat: 01/06/2010.

94 L. MONTOLIU

TRANSGENIC ANIMALS IN RESEARCH AND ANIMAL MODELS OF HUMAN DISEASES SUMMARY Animal experimentation is essential to allow the adequate interpretation of the human genome and to reproduce the pathologies that affect us, as human beings, in other similar organisms. Among them, mice stand up as a small size mammal that is very suitable for research in biomedicine. The mouse genome has also been sequenced and, mostly, shares with the human genome the number of existing gens, situated between 20.000 and 25.000 genes. Additionally, all these genes have been highly conserved through evolution, thus being 95% similar to the corresponding human versions. For all this, research on genes from the mouse genome, indirectly, is also research on the function of human genes. Everything that we can learn by investigating the function of specific genes in the mouse can be applied to our knowledge on the corresponding homologous genes in humans. Finally, mice also allow the manipulation of their genome through genetic modification techniques. These are known as transgenic or mutant mice, carrying new genes or specif ic alterations in some of their genes. With them, it is possible to generate animal models of many diseases affecting humans, to increase our knowledge on them and to eventually be able to develop new therapeutic strategies. Key words: transgenic mice, genome, genetic modification, stem cells, biomedicine. ELS RATOLINS: EXEMPLE D’ANIMAL D’EXPERIMENTACIÓ Els animals d’experimentació són fonamentals en biomedicina. Especialment en aquesta època de recerca postgenòmica en què ens trobem. En efecte, després d’obtenir les seqüències dels genomes de molts animals, entre les quals les del genoma humà i d’altres mamífers, calia progressar en el nostre coneixement dels gens que els conformen. Saber llegir els genomes de molts mamífers ha servit per descobrir la majoria dels gens que hi són representats. Ara bé, poca o nul·la informació s’obté de la funció de tots aquests gens amb la consulta directa dels genomes. Per esbrinar la funció cal fer experiments i, òbviament, no es poden fer amb persones. Per això poder disposar de mamífers similars a nosaltres, els humans, ha estat i és un pas fona-

mental en el nostre coneixement dels genomes. Entre tots els animals que es poden fer servir en experimentació destaca el ratolí. Malgrat que, en aparença, els ratolins siguin molt diferents dels humans, per exemple pel que fa a la mida, la realitat ens demostra que són dos animals mamífers que comparteixen molt en comú. En particular, el desenvolupament embrionari dels ratolins és molt similar al dels humans. Si comparem com es formen els òrgans, com es desenvolupen les extremitats, com funcionen els diferents sistemes fisiològics dels ratolins i dels humans arribarem a la conclusió que comparteixen molts aspectes. Aquesta versemblança general té un fonament genètic. En realitat els genomes de ratolins i humans comparteixen gairebé el mateix nombre de gens, entre 20.000 i 25.000 i, el que és més important, aquests Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 93-104

ANIMALS TRANSGÈNICS EN RECERCA I MODELS ANIMALS DE MALALTIES 95

gens s’assemblen (són homòlegs) en un 95 %. Aquesta similitud no és només estructural, de seqüència de DNA, sinó funcional. És a dir, coneixent la funció d’algun gen en el ratolí podem esbrinar quina pot ser la funció del gen corresponent (del gen homòleg) del genoma humà i, per exemple, entendre com una funció anòmala del gen o de la proteïna que codifica pot acabar tenint conseqüències patològiques i esdevenir una malaltia. Addicionalment, els ratolins són uns animals especialment adequats per a l’experimentació científica. La seva mida petita permet estabular-los en condicions òptimes, respectuoses amb el benestar animal, en espais reduïts. Per tant, en animalaris de dimensions limitades es poden estabular milers de ratolins, cosa que no seria possible amb mamífers de mida més gran (com per exemple els porcs, que també s’utilitzen en alguns aspectes de la recerca en biomedicina). Els ratolins tenen un temps de gestació relativament curt, d’unes tres setmanes, i un temps de generació igualment curt, entorn de tres mesos, ja que arriben a la seva maduresa sexual a les 6-8 setmanes de vida. Una altra característica que els fa especialment interessants és que les seves ventrades són nombroses, sovint de sis a dotze cries en cada part i, a diferència d’altres animals, permeten la cria contínua, és a dir, una femella que ha acabat de parir pot ser fertilitzada pel mascle l’endemà, i s’aconsegueixen molts animals d’unes determinades característiques genètiques en poc temps. Si lliguem tot això amb el fet que són animals que s’adapten molt bé a la cria en captivitat, és fàcil comprendre el seu èxit en la recerca biomèdica. D’igual rellevància és el fet que coneixem moltes variants mutants de ratolins, producte dels esforços inicials, al final del segle xix i al principi del xx, dels cuidadors de mascotes, que, inconscientment, però Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 93-104

sistemàticament, en la seva tasca de seleccionar encreuaments que produïssin ratolins amb un pelatge o pigmentació singulars, van acabar establint les bases de moltes de les soques consanguínies actuals de ratolins, variants genètiques específiques que han estat indispensables en l’ús d’aquests animals en experimentació biomèdica (vegeu la figura 1). La utilització de ratolins en recerca biomèdica per esbrinar tot allò que no entenem de les malalties que afecten les persones no solament està fonamentada en la gran similitud genètica existent entre els genomes, sinó que ha estat propiciada per l’existència d’un conjunt de tecnologies que permeten manipular, a voluntat de l’investigador, el genoma del ratolí. Es tracta dels mètodes de modificació genètica, amb els quals es poden introduir nous gens, i també inactivar-ne alguns, específicament, amb la generació dels ratolins que globalment coneixem com a transgènics i que també inclouen els mutants (o genoanul·lats, els ratolins knockout, com es coneixen en la terminologia anglesa). Actualment, al laboratori, es poden generar ratolins transgènics «a la carta», mitjançant la introducció de nous gens o l’alteració d’alguns ja existents. Amb aquests nous models animals, generats ad hoc al laboratori, i investigant quin efecte té sobre el ratolí, sobre el seu desenvolupament, el seu comportament, la seva fisiologia, podem anticipar (o, segons els casos, reproduir) quin podria ser l’efecte d’alteracions genètiques similars quan s’esdevenen en els humans. RATOLINS TRANSGÈNICS I MUTANTS (GENOANUL·LATS) Des del principi dels anys vuitanta del segle passat sabem com podem generar ra-

96 L. MONTOLIU

tolins transgènics. És a dir, coneixem la tècnica necessària per introduir nous gens (per exemple d’origen humà) en el genoma del ratolí. Els nous fragments de DNA, que es preparen al laboratori, es poden microinjectar en embrions de ratolí, acabats de fecundar, en l’estadi d’una sola cèl·lula. Aquestes molècules de DNA foranes s’anomenen transgens i els animals finalment portadors s’anomenen, lògicament, transgènics (Montoliu, 1997). Els embrions microinjectats es poden retornar a una femella, preparada per acollir-los, i que serà responsable de gestar-los i de dur-los a terme, generant les cries, entre les quals en trobarem algunes que hauran incorporat el DNA microinjectat, el transgèn, en totes o en algunes de les seves cèl·lules. Si finalment es confirma, es pot validar, la inserció del nou gen, del transgèn, en el genoma del ratolí, direm que l’animal resultant és un fundador d’una nova soca de ratolins modificats genèticament que, si tot va bé, transmetrà a la seva descendència, per sempre més, aquest nou gen i ens permetrà obtenir una colònia de ratolins portadors de la mateixa modificació genètica per fer experiments. La tecnologia inherent a la generació de ratolins transgènics no ha evolucionat gaire en els darrers trenta anys. Essencialment, malgrat l’aparició d’algunes petites variacions i millores metodològiques, continuem obtenint aproximadament ratolins transgènics amb un 5 % d’eficiència. Això vol dir que, normalment, és possible obtenir vora cinc ratolins modificats genèticament, transgènics, a partir de la microinjecció d’un centenar d’embrions de ratolí. Actualment s’han generat ja milers de soques de ratolins transgènics, portadors de moltes modificacions genètiques. Potser un dels més coneguts (i dels més útils en biomedicina) són els ratolins transgènics verds fluorescents (vegeu la figura 2).

Aquests són uns ratolins que han estat obtinguts mitjançant la microinjecció d’un gen (GFP) que codifica una proteïna fluorescent, aïllada d’una medusa del pacífic. La seva singularitat i bellesa, incontestables, està associada a la seva gran utilitat en biomedicina, ja que totes les cèl·lules d’aquest ratolí transgènic són fluorescents i, així doncs, es poden fer servir per a trasplantaments, per a recerca de trasplantaments cel·lulars (per exemple, de moll de l’os) o d’òrgans, aprofitant el fet que les cèl·lules trasplantades seran sempre fàcilment reconegudes una vegada introduïdes en un nou organisme, trasplantades a un nou ratolí, vista la seva fluorescència òbvia. La importància d’aquest gen marcador, GFP, fluorescent, en biomedicina, i de totes les variants fluorescents multicolors que han vingut al darrere, queda perfectament il·lustrada amb el Premi Nobel de Química que van rebre l’any 2008 Osamu Shimomura, Martin Chalfie i Roger Y. Tsien, els descobridors de la proteïna fluorescent GFP i de les seves aplicacions (http://nobelprize. org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2008). Una altra categoria de ratolins modificats genèticament és la formada pels ratolins mutants, (genoanul·lats, knockout en anglès) (Montoliu, 2000). Però per descriure els ratolins mutants cal que em refereixi primer a les cèl·lules troncals pluripotents embrionàries (cèl·lules ES, de embryonic stem, en anglès). Aquestes cèl·lules ES són conegudes popularment com les «cèl·lules mare» embrionàries, malgrat que mare no és un terme científicament correcte i és més apropiat anomenar-les troncals, que és una traducció més fidedigna de l’anglès. Les cèl·lules ES van saltar a la premsa i van ser conegudes per la societat quan, l’any 1998, dos equips d’investigadors nord-americans, liderats per Thomson i Gearhart, van donar a conèixer que havien obtingut les primeres cèl·lules ES humanes, a partir Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 93-104

ANIMALS TRANSGÈNICS EN RECERCA I MODELS ANIMALS DE MALALTIES 97

d’embrions humans (Thomson et al., 1998; Shamblott et al., 1998). En realitat, més enllà de la novetat que representava haver descrit aquestes cèl·lules en l’espècie humana, aquells investigadors no van fer més que reproduir el que ja s’havia obtingut disset anys abans, l’any 1981, quan els laboratoris de Martin Evans i de Gail Martin van descriure, per primera vegada, aquestes cèl·lules en un mamífer, en el ratolí (Evans i Kaufmann, 1981; Martin, 1981). Per què són tan importants les cèl·lules ES? Per respondre aquesta pregunta cal primer referir-nos, breument, al seu origen. Les cèl·lules ES apareixen molt aviat

en el desenvolupament embrionari preimplantacional, abans que l’embrió s’implanti a la matriu, en una fase que coneixem com a blastocist, que apareix als 3-4 dies del desenvolupament embrionari del ratolí (a la setmana en el desenvolupament embrionari humà). Després d’un seguit de divisions inicials que converteixen l’embrió original unicel·lular en una pilota de 32-64 cèl·lules, aparentment idèntiques, té lloc la primera gran diferenciació cel·lular i les cèllules es distribueixen asimètricament, en un costat de l’embrió, formant un botó, deixant una cavitat, tot plegat envoltat per una capa de cèl·lules. Doncs bé, les cèl·lules

Figura 1. Diferents ratolins mutants portadors de variants genètiques que alteren la pigmentació, origen de moltes de les actuals soques establertes de ratolins que es fan servir en biomedicina. La figura és un compendi de fotografies de di versos autors extretes de la web Color genes, http://www.espcr.org/micemut, que coordina l’autor d’aquest capítol. Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 93-104

98 L. MONTOLIU

del botó s’anomenen massa interna cel·lular, que està formada fonamentalment per cèllules troncals pluripotents embrionàries, les cèl·lules ES. A partir d’aquestes cèl·lules ES es generaran tots i cadascun dels tipus cel·lulars existents en l’organisme, fet que demostra la seva pluripotència i la seva singularitat. Martin Evans, entre altres, es va adonar que era possible extreure aquestes cèl·lules ES dels embrions de ratolí i mantenir-les indefinidament en cultiu al laboratori, on, per exemple, era possible modificar-les genèticament. Juntament amb experiments liderats pels laboratoris de Mario Capecchi i Oliver Smithies, al final dels anys vuitanta, entorn de l’any 1987, va ser possible dissenyar un protocol que permet modificar genèticament, i específicament, un gen en concret de la totalitat de gens existents en el genoma del ratolí, fent servir homologia de seqüències de DNA i aprofitant un procés existent en les

Figura 2. Ratolí transgènic fluorescent. Ratolí generat mitjançant la introducció d’un gen, anomenat GFP (de l’anglès green fluorescent protein), que prové d’una medusa del pacífic, Aquorea victoria, i que codifica una proteïna que és fluorescent si s’il·lumina amb una llum d’una longitud d’ona característica. Fotografia proporcionada pel professor Andras Nagy (Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, Toronto, Canadà) (http:// www.mshri.on.ca/nagy).

cèl·lules, anomenat recombinació homòloga. Les cèl·lules resultants, modificades, es poden reintroduir en altres embrions de ratolí per contribuir a la formació de nous individus, els quals formaran els seus òrgans també a partir d’aquestes cèl·lules ES modificades. Els animals resultants d’aquesta modificació genètica són quimèrics, ja que provenen de dos tipus cel·lulars diferents, les cèl·lules ES en cultiu, i l’embrió que actua de receptor. Si el quimerisme arriba a colonitzar els òrgans interiors, en particular les gònades, els testicles i els ovaris, quan aquest ratolí hagi de generar nous gàmetes (per exemple, nous espermatozoides) també els farà a partir de cèl·lules derivades de les ES en cultiu, i per tant portadores de la modificació genètica específica. Així doncs, es transmetrà aquesta modificació genètica, inicialment obtinguda en cèl·lules ES en cultiu, a la descendència d’aquestes quimeres i, mitjançant els encreuaments adients, es pot arribar a obtenir una soca de ratolins portadora d’una mutació, d’una alteració genètica precisa en un gen, que constitueix una nova soca de ratolins mutants, genoanul·lats, un nou model animal. Novament, la rellevància de l’ús de les cèl·lules ES de ratolí i el seu paper preponderant en la generació de molts models animals nous, com a soques de ratolins portadores, cadascuna, de mutacions específiques en gens concrets del genoma, que contribueix al coneixement de la seva funció, va ser reconegut amb el Premi Nobel 2007 de Fisiologia o Medicina, que va recaure, merescudament, en Capecchi, Evans i Smithies (http://nobelprize.org/nobel_prizes/ medicine/laureates/2007) (Montoliu, 2008). Mitjançant la generació i l’anàlisi posterior de molts ratolins genoanul·lats, cadascun amb una inactivació específica, s’ha pogut investigar el paper de molts gens en molts processos biològics i la seva rellevància en Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 93-104

ANIMALS TRANSGÈNICS EN RECERCA I MODELS ANIMALS DE MALALTIES 99

malalties, malformacions i alteracions diverses en el desenvolupament i funcionament normal de l’organisme. MODELS ANIMALS GENERATS I PER GENERAR Des de fa més de vint anys s’han generat centenars de nous models animals, ja sigui amb ratolins transgènics o amb ratolins mutants (Montoliu, 2002). Sovint es pot tenir la sensació que ja s’ha pogut estudiar i esbrinar la funció de tots i cadascun dels gens, que gairebé no queden gens per investigar. Ans al contrari, aquesta sensació és errònia. Només ens cal mirar periòdicament les estadístiques del (poc) que coneixem del genoma i del (molt) que encara ignorem, aprofitant la base de dades del laboratori Jackson (JAX; http://www.jax.org), referència mundial en genètica del ratolí (vegeu la taula 1). Dels més de 25.000 gens que coneixem, incloent-hi els que codifiquen proteïnes, només coneixem la funció d’un 36 %. La resta, el 64 % restant, encara avui ens és desconegut. I malgrat l’enorme quantitat de gens modificats genèticament, d’al·lels alterats que s’han obtingut, novament només representen poc més del 35 % dels gens existents. Finalment, la figura més esclaridora de l’estat actual de la qüestió es pot obtenir repassant el nombre de malalties humanes conegudes de base genètica (entorn de vint mil) i el nombre de models animals que s’han produït i analitzat per estudiar-les (entorn de tres mil). No obstant això, aquests més de tres mil ratolins modificats genèticament produïts corresponen en realitat a poc més de mil malalties estudiades, amb un o més models animals murins, és a dir, poc més d’un 5 % del total de malalties possibles! Totes aquestes xifres, que es poden revisar periòdicament Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 93-104

en les bases de dades d’anotacions en genòmica funcional del ratolí, ens diuen que hi ha un llarg camí encara per recórrer, molts models animals encara hauran de ser generats i molts gens dels quals ho ignorem gairebé tot, menys la seqüència de DNA, els haurem d’estudiar fent servir models animals, i generar més ratolins modificats genèticament. Aquesta és la realitat i aquesta és la raó per la qual s’han posat en marxa diverses iniciatives internacionals, unint forces i recursos de diversos països, encaminades a l’obtenció sistemàtica de ratolins mutants per a tots i cadascun dels gens presents en el genoma, per tal de poder estudiar totes les funcions. Atès que la immensa majoria de gens humans estan presents en el genoma del ratolí, aquesta proposta pretén analitzar funcionalment els nostres genomes, fent servir els ratolins com a animals d’experimentació i aprofitant les eines de què disposem per a la manipulació controlada del seu genoma, mitjançant modificació genètica. Aquest projecte global s’anomena, en anglès, International Knockout Mouse Consortium (IKMC; http://www.knockoutmouse.org), i té per objectiu produir, fent servir cèl·lules ES, ratolins genoanul·lats de tots i cadascun dels gens del genoma del ratolí. El projecte és una unió de diverses iniciatives de caire continental, en què trobem projectes europeus (EUCOMM; http:// www.eucomm.org), estatunidencs (KOMP, http://www.komp.org; i TIGM; http://www. tigm.org) i canadencs (NorCOMM; http:// www.norcomm.org). Una ràpida consulta a qualsevol d’aquestes pàgines web permet saber, en qualsevol moment, quin nombre de gens ja ha estat inactivat, en cèl·lules ES, quin percentatge del genoma representa i quants gens queden encara per estudiar. Obtenir les cèl·lules ES portadores de mutacions en cada gen és només el primer

100 L. MONTOLIU

pas. Posteriorment cal fer servir aquestes cèl·lules ES genèticament modificades per obtenir els ratolins quimèrics i, mitjançant encreuaments específics, poder finalment derivar-ne els ratolins mutants, primer com a heterozigots i després com a veritables homozigots mutants, sobre els quals podrem aplicar una bateria d’experiments per estudiar-ne el fenotip, les característiques diferencials que pot tenir aquest ratolí mutant en relació amb el ratolí salvatge, no modificat genèticament. Aquest és un procés complex i car, que requereix una inversió en infraestructures i molts diners per poder dur a terme totes les tasques previstes. Es calcula que el cost necessari, mínim, per fenotipar un d’aquests nous models animals generats així (incloent-hi totes les etapes: a) obtenció de cèl·lules ES modificades genèticament, b) obtenció de quimeres, c) obtenció d’heterozigots i d’homozigots mutants, d) ampliació de la colònia de ratolins mutants i e) fenotipatge dels ratolins mutants) és de 50.000 $USA. Tenint en compte que són uns vint mil el nombre de gens que cal investigar, és relativament senzill fer la multiplicació, que ens donarà com a resultat que la inversió necessària és de 1.000.000.000 $USA, mil milions de dòlars. Aquesta inversió ha d’estar focalitzada en dos dels aspectes més importants del procés, els que tenen a veure amb les anàlisis del fenotip i els aspectes logístics de distribució i arxiu. Atès que és impossible generar i estudiar els vint mil nous models animals en un sol centre de recerca, cal establir un protocol normalitzat que permeti poder comparar els resultats analítics obtinguts per diferents centres. Així sorgeix el concepte de la clínica del ratolí (mouse clinic, en anglès) com a centre que disposa dels equips i la tecnologia necessària per analitzar els ratolins, per fenotipar-los, de manera sistemà-

tica, aplicant protocols de treball normalitzats arreu, els mateixos. Aquesta és una proposta essencialment europea i, per això a Europa és on funcionen les clíniques de ratolins més importants, a Estrasburg (Clinique de la Souris, http://www-mci.ustrasbg.fr) i a Munic (German Mouse Clinic, http://www.mouseclinic.de). Esbrinant què funciona bé i què no funciona bé de l’organisme es pot arribar a deduir l’efecte que ha tingut, sobre el ratolí, la inactivació d’aquest gen en particular i, alhora, inferir quina pot ser la funció específica del gen i de la proteïna que codifica en el conjunt de l’organisme. Un segon aspecte per a l’estudi sistematitzat de models animals, de ratolins modificats genèticament de nova generació, igualment important, és l’aspecte logístic. És evident que tots aquests vint mil tipus de ratolins mutants no poden estar generats en un sol centre, i és igualment lògic admetre que no és possible mantenir tots aquests ratolins vius, simultàniament, en tots els centres de recerca. S’imposa, doncs, una estratègia que permeti l’arxivament i la distribució eficaç de les soques de ratolins mutants a qualsevol laboratori del món. Per això, a més de construir centres de fenotipatge, com les clíniques de ratolí, cal construir centres d’arxivament i distribució, repositoris. En ratolins aquest tema s’aborda mitjançant la criopreservació d’embrions o d’esperma de ratolí a temperatures molt baixes, de –196 °C, fent servir nitrogen líquid, que garanteix el manteniment indefinit de les soques de ratolins i la seva revitalització, quan és necessari, aplicant protocols de descongelació molt específics. Els embrions o l’esperma congelat es poden enviar als laboratoris que necessitin revitalitzar aquest determinat model animal. El centre receptor, en rebre aquests embrions o esperma congelat, procedirà a la descongelació controlada i transferirà els Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 93-104

ANIMALS TRANSGÈNICS EN RECERCA I MODELS ANIMALS DE MALALTIES 101

embrions resultants a altres femelles perquè els gesti, per tal de reconstituir la soca de ratolins mutants criopreservada. Hi ha diverses iniciatives d’arxius arreu del món. A Europa, la iniciativa líder, finançada per la Comissió Europea, és el projecte EMMA (European Mouse Mutant Archive, http:// www.emmanet.org), del qual Espanya forma part per mitjà del CNB-CSIC, a Madrid, com a nus espanyol d’aquesta plataforma tecnològica. Actualment, la majoria dels models animals generats en ratolins transgènics i mutants corresponen a diversos intents per reproduir diferents tipus de càncer, que afecta una extensa varietat de tipus cel·lulars. Mitjançant diverses estratègies s’intenta posar de manifest el possible efecte de determinats oncogens i s’investiga el seu paper en l’origen dels càncers. Però també hi ha molts ratolins generats per a l’estudi de les malalties cardiovasculars, musculars, metabòliques, d’alteracions de la reproducció i, en particular, com més va més, com a model d’alguna de les milers de malalties rares (de baixa prevalença), que afecten menys d’una de cada dues mil persones; sovint, gràcies a aquests models animals, únics, és una de les poques maneres que té la medicina actual per aprendre quelcom de nou sobre aquestes malalties. Al nostre laboratori, per exemple, hem caracteritzat, mitjançant models animals, les alteracions visuals que afecten les persones amb albinisme, una condició genètica rara, que afecta una de cada disset mil persones, i que resulta de la mutació en algun dels gens, com per exemple el que codifica l’enzim tirosinasa, implicats en la biosíntesi de pigment, de la melanina. L’absència de pigmentació està associada a una pèrdua notable de les capacitats visuals (menys agudesa visual, poca o nul·la visió nocturna, pèrdua de visió tridimensioTreb. Soc. Cat. Biol., 61: 93-104

nal, etc.); fins fa poc, no s’entenia quina podia ser la relació amb la generació de pigment. L’ús de models animals, en concret de ratolins transgènics, ha permès descobrir que el dèficit enzimàtic no solament implica una hipopigmentació evident, sinó que comporta una disminució local, a la retina, de la producció d’un dels components intermediaris en la síntesi del pigment, la L-DOPA. Mitjançant una estratègia bioquímica i genètica, en ratolins transgènics, es va aconseguir produir L-DOPA sense produir pigment i els ratolins transgènics resultants continuaven sent, aparentment, albins, però tenien la seva capacitat visual restaurada (Lavado et al., 2006). Igualment, com més va hi ha més ratolins que serveixen per investigar les alteracions del sistema nerviós. Alteracions psíquiques associades a l’angoixa, l’estrès, la por, trastorns de la sociabilitat, trastorns d’addicció a les drogues, alcoholisme, tabaquisme, etc., es poden estudiar amb models animals que porten alteracions en determinats gens, candidats a futurs medicaments que permetin regular o controlar alguna d’aquestes respostes de l’organisme al seu entorn. Sovint, però, la recerca sobre algun d’aquests nous models de ratolí pot donar sorpreses i l’efecte esperat pot servir per investigar nous aspectes no previstos inicialment. Per exemple, al nostre laboratori es va generar un nou model animal per a l’estudi de l’esquizofrènia, mitjançant la producció d’un ratolí genoanul·lat amb la inactivació del gen que codifica un receptor, Sigma-1, de funció poc coneguda a escala de les neurones (Langa et al., 2003). No obstant això, poc després, es va descobrir que aquest ratolí modificat genèticament era molt útil per a la recerca sobre nous mecanismes de percepció del dolor i, per tant, per a la recerca sobre nous medicaments analgèsics possibles (Cendan et al., 2005).

102 L. MONTOLIU

Dues de les millors bases de dades per esbrinar quins models animals s’han generat, i sobre quina malaltia o gen determinat, es troben a l’OMIM i la MPD: (OMIM, Online Mendelian Inheritance in Man, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim; MPD, Mouse Phenome Database, http://phenome. jax.org). TIPUS DE MODELS ANIMALS Hi ha molts tipus de models animals; en concret, molts tipus de ratolins modificats genèticament (Montoliu, 2003, 2006). Els ratolins transgènics, els que incorporen un nou gen (o gens) portadors de nova informació genètica a l’individu, es poden obtenir, com ja he comentat, per microinjecció directa de DNA al nucli d’embrions unicellulars. Aquesta és la tecnologia bàsica. Però es pot potenciar amb l’ús de vectors lentivírics, un tipus de retrovirus que poden inserir al genoma fragments de DNA molt eficaçment, malgrat que sovint les integracions múltiples que produeixen fan molt difícil l’anàlisi del fenotip resultant. Igualment, es pot augmentar la taxa d’inserció del transgèn al genoma fent servir transposases, unes proteïnes que poden tallar un fragment de DNA situat entre unes seqüències invertides determinades, i transferir tot el que hi hagi enmig a posicions relativament a l’atzar en el genoma. En aquest cas, el problema sol ser l’alteració inesperada del genoma en els llocs d’inserció del transposó. També es poden fer microinjeccions de RNA d’interferència (iRNA), per minvar o inactivar l’expressió d’algun gen. Els ratolins modificats genèticament resultants són els genominvats, en els quals s’aconsegueix reduir l’expressió d’un gen sense fer-la desaparèixer completament, com en una soca de ratolins mutants o genoanul·lats.

També es pot regular l’expressió del transgèn a voluntat de l’investigador, mitjançant les estratègies de producció de ratolins transgènics induïbles, en els quals l’expressió del DNA forà introduït es regula per la presència, o no, de determinades molècules efectores del sistema. Sovint aquests sistemes d’expressió induïble fan servir mecanismes heteròlegs, importats d’altres organismes, com per exemple els bacteris, per evitar possibles interferències amb altres processos fisiològics interns de l’organisme mateix que volem regular. Pel que fa als ratolins mutants, obtinguts a partir de cèl·lules ES genèticament modificades, n’hi ha també de molts tipus. Els mutants clàssics (genoanul·lats) són els que acostumen a inactivar el gen en qüestió a totes les cèl·lules de l’organisme, de manera irreversible. Per altra banda, algunes d’aquestes mutacions són més subtils, i sovint corresponen a una substitució d’un o pocs nucleòtids, de manera similar a com s’estableixen moltes malalties humanes de base genètica. Aquests són els ratolins genomodificats. Molts dels gens que conformen els nostres genomes són pleotròpics, és a dir, codifiquen funcions que són necessàries en diferents moments del desenvolupament de l’organisme, potser inicialment durant fases embrionàries i després també en algun òrgan adult. La inactivació d’algun d’aquests gens, si és realment indispensable per al desenvolupament embrionari correcte, no produirà ratolins vius, ja que els ratolins mutants, deficients en la funció d’aquest gen, no podran néixer ni mantenir-se, ni tampoc seria possible esbrinar la funció del gen en una fase adulta. Per això es va desenvolupar la tecnologia dels ratolins mutants condicionals. En aquests ratolins, el gen que es vol inactivar es «marca» amb unes seqüències especifiques de DNA, que normalment no són reconeguTreb. Soc. Cat. Biol., 61: 93-104

ANIMALS TRANSGÈNICS EN RECERCA I MODELS ANIMALS DE MALALTIES 103

Taula 1.

Genòmica funcional (genomes humà i del ratolí) Nombre

Percentatge

Gens coneguts amb seqüència de nucleòtids (a)

29.665

Gens coneguts que codifiquen proteïnes

26.957 90,87 % (de a)

―

Gens amb anotació funcional

10.698 36,06 % (de a)

Gens representats en trampes gèniques

12.569 42,37 % (de a)

Nombre total d’al·lels genèticament modificats

25.392

Nombre total de gens amb al·lels genèticament modificats

10.505 35,41 % (de a)

Nombre total de malalties humanes conegudes amb una base genètica (b)

20.014

Nombre total de models animals generats per a l’estudi de malalties humanes

3.043

Nombre total de malalties humanes conegudes amb base genètica que han estat estudiades en models animals (ratolins modificats genèticament)

1.009 5,04 % (de b)

―

Fonts consultades: Mouse Genome Informatics Statistics (http://www.informatics.jax.org/mgihome/homepages/ stats/all_stats.shtml), i base de dades de l’Online Mendelian Inheritance in Man Statistics (http://www.ncbi. nlm.nih.gov/Omim/mimstats.html) [data de consulta: maig del 2010].

des per cap proteïna endògena, però sí que poden ser reconegudes per una recombinasa específica. En presència d’aquesta recombinasa, i només en la seva presència, és quan es produeix la inactivació específica del gen. L’expressió del gen que codifica aquesta recombinasa pot constituir un ratolí transgènic normal, i es pot restringir a un òrgan, un tipus cel·lular, o un moment del desenvolupament o una fase adulta determinada, aprofitant els senyals de control de la transcripció propis d’algun gen. Per altra banda, es pot fer servir una estratègia d’expressió induïble en què, mitjançant l’acció d’un efector, s’encengui o apagui la funció de la recombinasa. Naturalment, es poden combinar diferents estratègies i preparar un transgèn que activi la inactivació d’un gen només en la fase adulta, i només, per exemple, en cèl·lules musculars, a voluntat de l’investigador. Els ratolins mutants condicionals han permès superar les limitacions inherents a la tècnica i l’existència de gens d’expressió indispensable per Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 93-104

al desenvolupament embrionari de l’organisme que, sense aquesta variació, no haurien pogut ser estudiats en models animals. Hi ha diversos sistemes que s’utilitzen avui dia per generar ratolins mutants condicionals, com per exemple el sistema CRE recombinasa/lox o el sistema FLP recombinasa/flp. A més dels animals transgènics, per adició de nous gens, i genoanul·lats, per supressió o inactivació de gens, també es poden obtenir ratolins modificats genèticament mitjançant tècniques de transferència nuclear, de clonatge. En efecte, es pot transferir una construcció gènica, una nova molècula de DNA a cèl·lules en cultiu, per fer servir després el seu nucli per reconstruir un nou embrió de ratolí, que donaria lloc a un animal «clonat» i transgènic (Montoliu, 2004). Finalment, els ratolins transgènics també han servit, de manera molt important, per investigar el potencial terapèutic de les diferents propostes de cèl·lules troncals («ma-

104 L. MONTOLIU

re»), pluripotents, en medicina regenerativa, en terapèutica cel·lular. Des de les propostes inicials de cèl·lules troncals embrionàries, amb tot els avantatges i problemes que comporten (Montoliu, 2003b), fins a les darreres propostes de cèl·lules pluripotents induïbles (iPS). Les cèl·lules iPS són una de les propostes més innovadores que s’han donat a conèixer recentment (Montoliu, 2009). Mitjançant la reintroducció d’un petit grup de gens específics, tres o quatre, és possible reconvertir una cèl·lula somàtica, en principi de qualsevol òrgan del cos, en una cèl·lula que, des de tots els punts de vista, és indistingible d’una cèl·lula troncal pluripotent embrionària, amb la gran diferència que no és necessari fer servir cap embrió per obtenir-la. L’ús final i el possible impacte de totes aquestes propostes i aplicacions en biomedicina continuarà sent investigat mitjançant la generació i l’estudi de nous models animals, de nous ratolins modificats genèticament. BIBLIOGRAFIA Cendán, C. M.; Pujalte, J. M.; Portillo-Salido, E.; Montoliu, L.; Baeyens, J. M. (2005). «Formalin-induced pain is reduced in sigma(1) receptor knockout mice». Eur. J. Pharmacol., 511 (1): 73-74. Evans, M. J.; Kaufman, M. H. (1981). «Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos». Nature, 292: 154-156. Langa, F.; Codony, X.; Tovar, V.; Lavado, A.; Giménez, E.; Cozar, P.; Cantero, M.; Dordal, A.; Hernández, E.; Pérez, R.; Monroy, X.; Zamanillo, D.; Guitart, X.; Montoliu, L. (2003). «Generation and phenotypic analysis of sigma receptor type I (sigma 1) knockout mice». Eur. J. Neurosci., 18 (8): 2188-2196. Lavado, A.; Jeffery, G.; Tovar, V.; Villa, P. de la; Montoliu, L. (2006). «Ectopic expression of tyrosine hydroxylase in the pigmented epithelium rescues the retinal abnormalities and visual function common in albinos in the absence of melanin». J. Neurochem., 96 (4): 1201-1211.

Martin, G. R. (1981). «Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells». Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 7634-7638. Montoliu, L. (1997). «Transgénesis por microinyección». Revista de la Real Academia de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales, 91(2): 63-70. ― (2000). «Modificació genètica d’animals». Treballs de la Societat Catalana de Biologia, 50: 133-140. ― (2002). «Medicina genómica: la utilización de animales transgénicos en modelos de enfermedades genéticas humanas». A: Reol Tejada, J. M. [ed.]. Genómica y Farmacogenómica. Madrid: Publicaciones de la Real Academia de Farmacia, p. 55-74. ― (2003a). «Trasiego de genes (animales transgénicos, mutantes y clónicos)». A: García Barreno, P. [ed.]. 50 años de ADN. Madrid: Espasa-Fórum, p. 183-227. ― (2003b). «Células troncales: aspectos científicos». A: Lacadena, J. R. [ed.]. Células troncales humanas: aspectos científicos, éticos y jurídicos. Bilbao: Publicaciones de la Universidad Pontificia Comillas / Desclée de Brouwer, p. 23-62. ― (2004). «Clonación en mamíferos: aspectos científicos e implicaciones terapéuticas». A: Fernández Piqueras, J. [ed.]. Últimas investigaciones en biología: células madre y células embrionarias, p. 55-88. Madrid: Publicaciones de la Universidad Internacional Menéndez y Pelayo: Ministerio de Educación y Ciencia. ― (2006). «Animals modificats genèticament: ratolins transgènics i mutants. Definició, obtenció i aplicacions en Biologia, Biomedicina i Biotecnologia». Treb. Soc. Cat. Biol., 57: 109-111. ― (2008). «La modificación genética dirigida en ratones es premiada con el Nobel de Fisiología o Medicina de 2007». Anales de la Real Academia Nacional de Farmacia, 74: 81-99. ― (2009). «Células pluripotentes inducidas». A: Cascales y Flora de Pablo, M. [ed.]. Células madre y terapia regenerativa. Madrid: Real Academia Nacional de Farmacia / Instituto de España, p. 8399. Shamblott, M. J.; Axelman, J.; Wang, S.; Bugg, E. M.; Littlefield, J. W.; Donovan, P. J.; Blumenthal, P. D.; Huggins, G. R.; Gearhart, J. D. (1998). «Derivation of pluripotent stem cells from cultured human primordial germ cells». Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 13726-13731. Thomson, J. A.; Itskovitz-Eldor, J.; Shapiro, S. S.; Waknitz, M. A.; Swiergiel, J. J.; Marshall, V. S.; Jones, J. M. (1998). «Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts». Science, 282: 11451147. Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 93-104

DOI: 10.2436/20.1501.02.96

Organismes modificats genèticament (Josep M. Casacuberta, ed.) Treballs de la SCB. Vol. 61 (2010) 105-119

PEIXOS TRANSGÈNICS Rosa María Ceinos i Josep Rotllant Instituto de Investigaciones Marinas, Consell Superior d’Investigacions Científiques, Vigo Adreça per a la correspondència: Josep Rotllant. Departamento de Acuicultura y Biotecnología, Instituto de Investigaciones Marinas (IIM-CSIC). C. d’Eduardo Cabello, 6. 36208 Vigo. Adreça electrònica: rotllant@iim.csic.es. RESUM La generació d’organismes modificats genèticament (OMG) ha representat un avanç tecnològic molt important en totes les àrees de recerca biològica. Així, la producció d’animals transgènics ha estat una eina molt valuosa per a l’establiment d’organismes model en recerca biomèdica, la producció massiva de macromolècules biològicament actives i el desenvolupament de cultius d’aliments, entre d’altres. Malgrat que tradicionalment els mamífers han estat els vertebrats més emprats per a la generació d’animals transgènics, els peixos constitueixen una alternativa excel·lent. Comparats amb els mamífers, els peixos presenten tot un conjunt de característiques, tant evolutives com fisiològiques, i també una sèrie d’interessos comercials i tecnològics, que estan fent d’aquests organismes els animals amb més potencial en els diferents camps d’aplicació de la tecnologia de manipulació genètica. En aquesta revisió, a més de presentar els darrers avenços tecnològics disponibles per a la generació de peixos transgènics, es repassen les diferents aplicacions de la transferència gènica en peixos, i també els beneficis i els possibles riscos derivats d’aquest ús. Paraules clau: peix, transgènesi, vector, tècniques de transferència gènica, aqüicultura, biofactoria, riscos, salut humana, ecosistemes naturals. TRANSGENIC FISH SUMMARY The generation of genetically modified organisms (GMOs) has provided an important technological advance to many areas of biological research. The production of these GMOs has been a valuable tool for the establishment of model organisms for biomedical research and the commercial production of biologically active macromolecules and food, Rebut: 09/02/2010. Acceptat: 01/03/2010.

106 R. M. CEINOS I J. ROTLLANT

amongst others. Traditionally, mammals have been used as the model organisms however in recent years the production of transgenic fish has provided an excellent alternative. Compared with mammals, fish presents some ideal physiological characteristics and evolutionary features, which together with recent technological advances and commercial interests, make fish an ideal candidate for genetic manipulation. This paper provides a brief summary of the most recent relevant data in this field. Key words: fish, transgenesis, vector, gene transfer technology, aquaculture, biofactory, risks, human health, natural ecosystems. INTRODUCCIÓ Pocs avanços tecnològics en ciències biològiques han obert tantes qüestions i possibilitats com les que ha obert l’aplicació de les tècniques de transgènesi. La capacitat de canviar selectivament la composició genètica d’un organisme multicel·lular té implicació en totes les àrees de recerca biològica. La producció d’animals transgènics ha representat una eina important per poder entendre la funció i regulació gènica durant el desenvolupament embrionari de moltes espècies, per a la producció massiva de productes gènics d’interès divers i per a la millora o la producció de noves varietats d’organismes amb unes determinades característiques desitjades. Els primers experiments d’aplicació de tècniques de transferència gènica en animals es van iniciar els anys vuitanta, amb la creació del primer animal transgènic, un ratolí (Gordon et al., 1980). A partir d’aquest primer model, s’han aconseguit generar altres animals transgènics com rates, porcs, vaques, ovelles, cabres, conills i peixos, entre d’altres. Hi ha tres raons que fan dels peixos uns excel·lents candidats per crear organismes transgènics o organismes modificats genèticament (OMG). La primera és que els peixos són el grup de vertebrats més nombrós i amb més diversitat, i per tant constitueixen un sistema molt valuós per a l’estudi in vivo de diferents processos biològics en

vertebrats. La segona raó és que els processos clàssics de selecció genètica en peixos per optimitzar i millorar diferents factors d’interès en aqüicultura, com per exemple el creixement, són processos molt lents. En contraposició, l’aplicació de la transgènesi en peixos té el potencial de millorar i optimitzar aquests diferents factors genètics en tan sols una generació. I finalment, la tercera raó són les característiques fisiològiques mateixes del peixos: són animals molt prolífics, la fecundació és externa i els embrions són fàcilment manejables, cosa que fa que l’aplicació de tècniques de manipulació genètica sigui molt més senzilla de fer que en vertebrats terrestres. Addicionalment, en aquests darrers anys s’han desenvolupat tot un conjunt d’eines biotecnològiques que ens faciliten enormement la generació de peixos modificats genèticament. Els primers experiments de transgènesi en peixos es van iniciar a mitjan dècada dels vuitanta (Zhu et al., 1985). D’ençà d’aquells primers experiments, la creació i utilització de peixos transgènics ha augmentat significativament tant pel que fa a la recerca bàsica com aplicada, i han passat a ser en alguns casos organismes model d’ampli ús en investigació. En aquesta revisió es presenten els darrers avenços tecnològics disponibles per a la generació de peixos transgènics, i també els beneficis, aplicacions i dubtes que representen. Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 105-119

PEIXOS TRANSGÈNICS 107

GENERACIÓ DE PEIXOS TRANSGÈNICS Igual que en altres espècies, en els peixos la modificació genètica inclou principalment dos tipus d’experiments: la sobreexpressió gènica i la inhibició gènica. En el primer cas s’introdueix una informació genètica addicional de manera estable al genoma de l’animal. Aquesta nova informació o DNA forà pot ser de la mateixa espècie que l’organisme receptor o d’altres espècies. En el segon cas s’elimina de manera específica i estable una informació genètica del genoma de l’animal. La modificació genètica presenta tres components indissociables i necessaris: el primer, un gen d’interès del qual s’espera que la modificació l’acompanyi un efecte fenotípic en l’individu; el segon el constitueix l’organisme diana, sobre el qual es farà la modificació, i el tercer, el vector i les tècniques de transferència. Entenem com a vector el vehicle que transporta el material genètic i que en permet la introducció i integració en l’organisme diana en el cas d’experiments de sobreexpressió gènica. També s’anomenen vectors els vehicles que transporten les eines necessàries per a l’alteració d’una zona específica del genoma de l’animal en el cas d’experiments d’inhibició gènica. I s’anomenen tècniques d’expressió gènica els sistemes utilitzats per a la introducció del vector d’expressió gènica a l’interior de la cèl·lula. DISSENY DE VECTORS D’EXPRESSIÓ TRANSGÈNICA Els vectors, com hem mencionat anteriorment, són els sistemes de construcció gènica que s’utilitzen en el procés d’integració d’un gen exogen en el genoma de l’organisme diana. El disseny de vectors Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 105-119

gènics és molt variat, i dependrà bàsicament del tipus de gen que cal introduir i de la finalitat d’aquesta integració. En termes generals aquests vectors es divideixen en dos grans grups, els anomenats vectors vírics i el no vírics. Per a la generació de peixos transgènics els sistemes d’expressió més emprats han estat els vectors no vírics, i en destaquen els vectors plasmídics com els d’ús més habitual. Entre aquests cal destacar els següents: Sistema transposó-transposasa Els transposons són seqüències de DNA que es poden moure lliurement dins el genoma d’un organisme. Aquests fragments de DNA es mouen gràcies a un mecanisme de tallar i enganxar. Les eines d’integració dels elements de DNA transposable consisteixen en un element que codifica una transposasa que facilita l’escissió i reinserció de DNA a partir d’interaccions amb elements terminals cis del transposó i les seqüències en el lloc d’integració. Així, basant-se en aquestes característiques, els transposons tenen molta utilitat per a la generació de transgènesi i mutagènesi insercional. El sistema necessita un plasmidi amb el gen de la transposasa, el qual s’utilitzarà per a la síntesi in vitro de mRNA de transposasa i un plasmidi amb el gen que cal inserir envoltat per dues repeticions terminals invertides (tir) del transposó. Cada una de les tir presenta diferents llocs d’interacció amb la transposasa. L’mRNA de la transposasa i el plasmidi amb l’insert escollit es coinjecten a embrions en un estadi d’una a dues cèl·lules. La transposasa tallarà enzimàticament les regions tir del plasmidi i a continuació integrarà les regions tir més l’insert que volem en els nous llocs del genoma. Posteriorment, en aca-

108 R. M. CEINOS I J. ROTLLANT

bar-se la transposasa, la integració de l’insert escollit entre les seqüències tir serà estable. En peixos els sistemes de transposició més usats són el TOL2 (Kawakami, 2007) i l’Sleeping Beauty SB (Ivics et al., 1997). Dels diferents sistemes usats actualment per generar peixos transgènics, aquest és el que presenta el grau d’eficiència més alt, amb un 50 %. Sistema meganucleasa I-SceI El sistema meganucleasa I-SceI és un altre tipus de tecnologia recentment desenvolupada per generar transgènesi en peixos. Es basa en la utilització d’un enzim meganucleasa, la I-SceI, que talla la seqüència de DNA en llocs específics (Monteilhet et al., 1999). Semblant al sistema transposó-transposasa, el sistema meganucleasa I-SceI necessita un plasmidi amb el gen de la meganucleasa I-SceI, el qual s’utilitzarà per a la síntesi in vitro de mRNA de meganucleasa I-SceI i un plasmidi amb el gen que cal inserir flanquejat per dues seqüències específiques de reconeixement per a la meganucleasa I-SceI. L’mRNA de la meganucleasa I-SceI i el plasmidi amb l’insert escollit es coinjecten a embrions en un estadi d’una a dues cèl·lules. El mecanisme de funcionament d’aquesta nova tècnica de transgènesi encara no és del tot clar. Una hipòtesi és que la unió continuada de la meganucleasa I-SceI a les seqüències específiques de reconeixement que hi ha per a aquest enzim en els extrems de l’insert escollit impedeix la formació de concatàmers o la degradació de monòmers lineals, els quals normalment inhibeixen la integració del DNA forà (Thermes et al., 2002; Ogino et al., 2006). El grau d’eficiència d’integració del DNA forà

en el genoma diana de diferents espècies de peixos amb aquest sistema és aproximadament del 30 % (Thermes et al, 2002). TÈCNIQUES DE TRANSFERÈNCIA GÈNICA EN PEIXOS Les tècniques de transferència gènica són els sistemes utilitzats per a la introducció dels vectors d’expressió gènica a l’interior de la cèl·lula. Els mètodes més usats en peixos són la microinjecció d’embrions i l’electroporació i lipofecció de gàmetes i testicles. Microinjecció d’embrions La microinjecció va ser la primera tècnica de transferència gènica utilitzada en peixos (Zhu et al., 1985) i actualment encara continua sent el mètode més emprat en la generació de peixos transgènics. La microinjecció és un simple procés mecànic en el qual una agulla molt fina penetra la membrana cel·lular per alliberar el seu contingut. Aquest procés es fa utilitzant un microscopi òptic i mitjançant un micromanipulador. En peixos, la microinjecció de vectors d’expressió gènica per a l’obtenció d’animals transgènics es fa a l’espai perivitel·lí d’embrions fertilitzats d’una a dues cèllules (Westerfiled et al., 2007). La tècnica de microinjecció és una tècnica laboriosa i lenta i pot produir importants mortalitats als embrions injectats, i per això ha calgut el desenvolupament de tècniques alternatives com l’electroporació (Powers et al., 1990) i la lipofecció (Chen et al., 1990), encara que aquestes tècniques en peixos s’han usat majoritàriament per a l’expressió transitòria de gens exògens i no per generar animals transgènics estables. Una aplicació alternativa interessant de les tècniques Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 105-119

PEIXOS TRANSGÈNICS 109

d’electroporació i lipofecció en peixos ha estat la transferència gènica en gàmetes i testicles (Lu et al., 2002), en què s’intenta minimitzar la manipulació d’embrions i incrementar la producció del nombre d’animals transgènics. Transferència gènica en gàmetes (spermmediated gene transfer, SMGT) i testicles (testis-mediated gene transfer, TMGT) Aquestes tècniques de transferència es basen en la introducció del DNA transgènic als espermatozoides, els quals seran usats posteriorment per fertilitzar artificialment els òvuls. D’aquesta manera, s’obtenen embrions que són portadors del DNA forà inicialment introduït als espermatozoides. La introducció de la construcció d’expressió als espermatozoides es fa mitjançant l’aplicació de dues tècniques, que són l’electroporació o electropermeabilització, la qual utilitza l’aplicació d’un camp elèctric extern per incrementar la permeabilització de la membrana cel·lular, i la lipofecció o encapsulació del DNA transgènic en una membrana fosfolipídica que es fusionarà amb la membrana cel·lular. El gran avantatge d’aquests mètodes sobre el mètode de microinjecció és que no cal manipular els embrions, i la independència pel que fa a l’equipament de cost econòmic elevat, com la utilització dels microscopis i dels micromanipuladors necessaris en la microinjecció. Aquestes tècniques s’han aplicat amb èxit en la generació de transgènesi en espècies de peixos d’interès en aqüicultura com el sard daurat (Sparus sarba) (Lu et al., 2002).

Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 105-119

INHIBICIÓ GÈNICA ESPECÍFICA EN PEIXOS La generació d’OMG mitjançant la inhibició gènica específica és una eina molt útil per a l’estudi de la funció gènica, la caracterització de malalties i la producció d’organismes d’alt interès econòmic. Fins fa relativament poc temps, la generació d’OMG mitjançant la inhibició gènica específica s’havia aconseguit per tècniques de recombinació homòloga en cèl·lules mare embrionàries o clonatge mitjançant transferència nuclear, i només s’havia pogut dur a terme en un nombre limitat d’espècies en què l’obtenció de cèl·lules mare embrionàries i l’ús de determinades tècniques de clonatge ja estaven disponibles. Recentment, gràcies al desenvolupament de noves tecnologies, com el disseny d’oligonucleòtids morpholino antisentit, l’ús de dits de zinc-nucleases (ZFN) i la caracterització i disseny de RNA d’interferència, s’ha aconseguit la generació d’organismes amb delecions gèniques específiques en espècies en què no hi havia aïllades cèl·lules mare embrionàries i en què no estaven disponibles determinades tècniques de clonatge. Aquest és el cas de diferents espècies de peixos. Tècniques d’inhibició transitòria o reversible (genominvament) Oligonucleòtids morpholino antisentit (MOS). L’ús de morpholinos és un mecanisme d’inhibició posttranscripcional de gens específics (Heasman, 2002). Els morpholino phosphorodiamidate oligonucleotides antisentit, coneguts com a morpholinos, són molècules sintètiques resultants del redisseny de molècules de RNA natural, en les quals s’ha substituït la ribosa per una morpholina. La seva longitud sol ser de 21-25 nucleò-

110 R. M. CEINOS I J. ROTLLANT

tids. Els morpholinos inhibeixen l’expressió dels gens diana unint-se a l’RNA missatger (mRNA) complementari. La formació del complex morpholino-mRNA inhibeix la traducció a proteïna (Summerton, 1990) o la reacció de maduració de la molècula de mRNA mateixa, també anomenada reacció de tall i unió (Draper et al., 2001). La inhibició especifica d’un procés o l’altre dependrà exclusivament del disseny de l’oligonucleòtid. A diferència de l’ús de RNA d’interferència, els morpholinos no degraden la molècula de mRNA, sinó que en bloquegen estèricament el processament. En peixos, són àmpliament utilitzats per inhibir transitòriament l’expressió d’un gen determinat (Bill et al., 2009). RNA d’interferència. La ribointerferència o RNA d’interferència és un altre mecanisme d’inhibició posttranscripcional (Hamilton et al., 1999). Aquesta inhibició específica és portada a terme per molècules de RNA que, sent complementàries a un determinat RNA missatger (mRNA), condueixen a la degradació o alteració del seu processament. Els RNA d’interferència poden ser principalment de dos tipus diferents, siRNA i miRNA (Ghildiyal et al., 2009). Els siRNA (small interfering RNA) són molècules de RNA de cadena doble (dsRNA) de 20-21 nucleòtids que s’originen a partir d’un RNA més llarg. L’enzim responsable de la formació de molècules de siRNA a partir d’un dsRNA més gran és l’enzim Dicer. Dicer és un enzim citoplasmàtic de la família RNAasa III, que processa el dsRNA en fragments de RNA de doble cadena amb extrems 5´ fosfat i dos nucleòtids lliures amb un extrem hidroxil (–OH) en 3´. Els siRNA inhibeixen l’expressió dels gens diana tallant RNA missatger (mRNA) complementari, per mitjà de la interacció de la cadena antisentit del siRNA amb el complex RISC (RNA-induced silencing complex). Els dos trossos de

l’mRNA són degradats posteriorment, i això finalment es tradueix en la inhibició de l’expressió del gen diana. Addicionalment els siRNA també poden provocar la modificació conformacional del DNA. Els miRNA (microRNA) són molècules de RNA de cadena única (ssRNA) d’una longitud de 21-25 nucleòtids. Els miRNA d’animals no presenten una complementarietat exacta amb la regió 3´ UTR, i generalment inhibeixen la traducció de l’mRNA diana. El sistema de gènesi és similar al dels siRNA, en què intervenen l’enzim Dicer i el complex RISC. Addicionalment cal comentar que hi ha un tercer grup de RNA d’interferència, els anomenats piRNA (Piwi-interacting RNA) (Seto et al., 2007). Igual que els microRNA, són molècules de RNA de cadena única (ssRNA), i se sintetitzen a partir de precursors de cadena única mitjançant un procés diferent de l’usat per als miRNA i els siRNA. S’han identificat desenes de milers de piRNA, i avui dia se sap que la seva interacció amb unes proteïnes anomenades Piwi té un paper clau en el desenvolupament de les cèl·lules germinals (Klattenhoff, et al., 2008). Tècniques d’inhibició permanent o irreversible (genoanul·lació) Dits de zinc-nucleases (zinc-finger nucleases, ZFN). Els dits de zinc-nucleases són enzims de restricció artificials creats mitjançant la unió d’una proteïna de dit de zinc, que són proteïnes que uneixen DNA amb una proteïna nucleasa, que tenen la capacitat de tallar el DNA. El resultat és una proteïna artificial que té la capacitat d’unir-se específicament a una seqüència de DNA i tallar-la. El principal avantatge d’aquest mètode és la possibilitat d’introduir delecions gèniques a la línia germinal, fet que es tradueix en la creació d’animals genoaTreb. Soc. Cat. Biol., 61: 105-119

PEIXOS TRANSGÈNICS 111

nul·lats per a un gen específic (Rémy et al., 2009). L’etapa limitant de l’ús de dits de zinc-nucleases és el disseny de dominis de dits de zinc específics d’unió a seqüències concretes de DNA del gen diana. Actualment hi ha disponibles dues plataformes per dissenyar dits de zinc específics per a una determinada seqüència: una plataforma privada creada per Sangamo Biosciences (http://www.compozrzfn.com), i una plataforma publica, i per tant d’accés obert, creada pel Zinc Finger Consortium (http:// addgene.org/zfc, http://www.zincfingers.org/ software.tools.htm). El sistema funciona de la manera següent: injectem l’mRNA de la ZFN especifica a l’embrió de peix en un estadi de desenvolupament d’una o dues cèllules, l’mRNA es traduirà a proteïna i aquesta s’unirà al DNA del gen diana i hi provocarà un tall. La inducció d’aquest tall a la doble cadena de DNA activarà el sistema de reparació cel·lular, que repararà aquest tall d’una manera imprecisa, de manera que introduirà mutacions en el gen diana o seleccionat. D’aquesta manera obtindrem peixos mosaic per a una determinada mutació en un gen específic (Ekker, 2008). APLICABILITAT DE LA TRANSFERÈNCIA GÈNICA EN PEIXOS La utilització de peixos transgènics té un ampli ventall d’aplicacions, entre les quals cal destacar la seva importància en el camp de la investigació bàsica, concretament en disciplines com la biologia del desenvolupament, en què els organismes model, com el peix zebra (Danio rerio) (Westerfield et al., 2007) o el medaka o peix d’arrosar japonès (Oryzias latipes) (Wittbrodt et al., 2002) tenen un paper rellevant. Els processos de transferència d’eines biotecnològiques han Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 105-119

permès que els peixos transgènics s’utilitzin com a biofactories per a la síntesi de substàncies d’aplicació farmacèutica, o en aqüicultura, per modificar o introduir diferents característiques en una determinada espècie amb la finalitat d’optimitzar-ne el cultiu intensiu. Així, malgrat que la producció de peixos transgènics no és un procés complicat, la seva transferència a escala industrial planteja nombroses incògnites. La majoria són degudes principalment al desconeixement que tenim de la possible interacció entre aquest tipus d’animals, el medi natural i la salut humana. Investigació La transgènesi és una de les eines biotecnològiques més utilitzades per a la caracterització funcional d’un gen. Modulant l’expressió gènica mitjançant tècniques de sobreexpressió o inhibició es pot caracteritzar la funció, la regulació, l’estructura gènica i la implicació d’un gen en determinats processos fisiològics. Dels diferents organismes model utilitzats en investigació bàsica, un dels més prometedors i com més va més utilitzat és el peix zebra (Danio rerio) (Westerfield et al., 2007). El peix zebra és un excel·lent organisme model en l’estudi del desenvolupament embrionari dels vertebrats, en estudis genètics i en fisiologia. Actualment està substituint altres organismes model de vertebrats, com els ratolins i les rates, a causa del rebuig social que comporta usar-los en experimentació. Avui dia hi ha una base de dades disponible amb informació genètica, genòmica i del desenvolupament del peix zebra anomenada ZFIN (Zebrafish Information Network). Recentment, a Espanya s’ha creat una plataforma tecnològica per a la difusió de l’ús d’aquesta espècie com a organisme model anomenada DARENET

112 R. M. CEINOS I J. ROTLLANT

(www.darenet.es). L’estudi del desenvolupament del peix zebra proporciona diversos avantatges enfront d’altres organismes model. Tot i que el temps de generació del peix zebra és comparable al del ratolí, els embrions de peix zebra es desenvolupen ràpidament, i passen d’ous a larves en menys de tres dies. Addicionalment, els embrions són grans, robustos i transparents i es desenvolupen externament a la mare, característiques que en faciliten la manipulació experimental i l’observació. Un dels grans avantatges d’aquest organisme és la seva alta homologia genètica amb altres espècies de vertebrats com l’espècie humana, cosa que n’ha propiciat l’ús com a model per a l’estudi de malalties humanes d’origen genètic. Cal destacar també les grans possibilitats que ofereix aquest model per a l’aplicació de noves tecnologies «òmiques» com la genòmica, la proteòmica o la metabolòmica. Biofactories La síntesi química de proteïnes amb activitat biològica per part de la indústria farmacèutica és una activitat costosa i amb limitacions tecnològiques importants a l’hora d’obtenir grans quantitats. Una alternativa viable és l’ús d’animals, per la producció controlada. Així, generalment la síntesi d’aquestes macromolècules es fa en determinat teixits de l’animal hoste, que finalment allibera el producte en determinats líquids biològics com la llet, la sang o el líquid seminal. Aquest sistema facilita la recollida del producte sintetitzat (Ebert et al., 1991; Paleyanda et al., 1997; Cott et al., 2001). Malgrat que aquest sistema funciona molt bé en la majoria de casos, planteja algunes limitacions o problemes. La majoria de líquids biològics contenen enzims lítics que poden hidrolitzar les proteïnes heterò-

logues de nova producció, tret que siguin altament resistents a la degradació. Addicionalment, els animals utilitzats són normalment grans mamífers, com vaques, ovelles o cabres, que requereixen grans instal·lacions i que, per tant, tenen un cost molt elevat de manteniment. També cal tenir en compte que algunes malalties priòniques i víriques són transferibles des d’espècies de mamífers no humans a l’espècie humana i que, per tant, pot ser possible que la producció d’una proteïna recombinant en mamífers pugui actuar com a vector de transmissió d’aquest tipus de malalties. Per tant, l’ús de peixos transgènics per a la producció d’aquest tipus de macromolècules amb interès terapèutic o industrial és una bona alternativa. Actualment, la utilització de peixos transgènics com a biofactories està en fase experimental. Els treballs que s’han fet fins ara han estat experiments a petita escala per assajar la viabilitat de certes aplicacions. Així, s’ha descrit la producció del factor vii de coagulació humà (hFVII) en el peix zebra, el peix gat i la tilàpia (Hwang et al., 2004). Aquesta proteïna s’usa per al tractament de l’hemofília. Una altra proteïna en estudi per produir-la mitjançant peixos transgènics és la insulina humana. S’ha descrit la generació de tilàpies transgèniques que produeixen insulina humana en els seus corpuscles de Brockman per al tractament de diabetis en mamífers (Alexander et al., 2006). Aqüicultura En l’àmbit de l’aqüicultura, les aportacions que ofereix la transgènesi estan relacionades amb la millora de diferents caràcters d’interès econòmic i productiu, objectius que no varien dels buscats mitjançant la millora genètica tradicional. La Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 105-119

PEIXOS TRANSGÈNICS 113

majoria de treballs en aquest camp s’han centrat a millorar les taxes de creixement de diferents espècies, majoritàriament de salmònids. Això s’ha aconseguit mitjançant la integració de còpies addicionals del gen que codifica l’hormona de creixement o GH. Així, els primers peixos transgènics per a l’hormona del creixement van ser generats mitjançant la utilització de construccions gèniques constituïdes per promotors vírics i el gen de l’hormona de creixement procedent de mamífers. Els resultats obtinguts en aquests primers experiments no van ser gaire prometedors (Zang et al., 1990), i no va ser fins més tard, amb la introducció de seqüències pròpies de peixos, quan es va observar que els peixos transgènics per a l’hormona del creixement presentaven taxes de creixement de dues a onze vegades superiors a les registrades en els seus homòlegs no transgènics (Du et al., 1992; Devlin et al., 1994). Però a més dels salmònids, també s’han generat peixos transgènics per a l’hormona del creixement en altres espècies. Així, s’han creat tilàpies (Orochromis niloticus) transgèniques per a aquesta hormona que creixen tres vegades més que els seus homòlegs respectius no transgènics (Rahman et al., 1998), o el moll japonès (Misgurnus mizolepis), en què s’ha observat que els animals transgènics creixien vora cinc vegades més (Kwon-Nam et al., 2001). Altres esforços s’han centrat a millorar l’eficiència de conversió energètica, la resistència a malalties o bé a suportar condicions ambiental adverses com les baixes temperatures. Com és ben sabut, tota activitat industrial destinada al cultiu intensiu d’animals ha de fer front a malalties i a condicions ambientals adverses que poden posar en perill la producció. Per tant, per a la indústria piscícola és tan important optimitzar el creixement com assegurar la supervivència Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 105-119

dels animals cultivats. En aquest camp, hem de fer ressaltar el desenvolupament de vacunes de DNA. Encara que el fet de vacunar un individu no constitueix un procés de transgènia, sí que ho és el procés de síntesi de la vacuna. Les vacunes de DNA víric són plasmidis bacterians constituïts bàsicament per un promotor víric i el gen d’interès. Aquests plasmidis sintetitzats en bacteris són purificats i injectats intramuscularment en els peixos per activar la producció específica d’una proteïna (gen d’interès) in vivo i induir posteriorment la producció específica d’anticossos per part de l’animal. Un exemple d’aquesta aplicació és la immunització del salmó de l’atlàntic (Salmo salar) contra el virus causant de la necrosi hematopoètica infecciosa (IHN) (Traxlet et al., 1999). Exemples directes de l’aplicació de transgènesi a la millora de la resistència a patògens bacterians són la sobreexpressió de certes proteïnes antibacterianes d’ampli espectre com el lisozim i les cecropines (Hew et al., 2001; Sarmasik et al., 2002). En el primer cas, es van crear salmons transgènics que sobreexpressaven el lisozim de truita (Hew et al., 2001). Sorprenentment, avui dia els resultats d’aquests experiments encara no han estat publicats. Tanmateix, s’ha demostrat que peixos zebra (Danio rerio) que sobreexpressaven aquest mateix gen sí que presentaven més resistència enfront a diferents malalties bacterianes (Yazawa et al., 2006). El segon exemple és el de les cecropines. Les cecropines són pèptids que tenen activitat bactericida enfront un gran nombre de bacteris (Hultmark et al., 1980; Lee et al., 1989). Així, es van generar peixos gat (Ictalurus punctatus) transgènics mitjançant la introducció de la cecropina del cuc de seda, i es va demostrar que aquests peixos tenien més resistència enfront de diferents malalties bacterianes (Dunham et al., 2002).

114 R. M. CEINOS I J. ROTLLANT

Com ha estat mencionat anteriorment, una altra aplicació de la transferència gènica d’interès per a l’aqüicultura ha estat la de generar individus que puguin suportar condicions ambientals adverses com les baixes temperatures, amb l’objectiu d’incrementar geogràficament la seves àrees de cultiu, com en el cas del salmó i de la carpa vermella. Així, s’han creat animals transgènics que sobreexpressen proteïnes anticongelants (Hew et al., 1992; Wang et al., 1995). Les proteïnes anticongelants o AFP són glicoproteïnes presents en el plasma de diferents espècies de peixos capaços de viure a temperatures per sota dels 0 °C. Aquestes proteïnes s’uneixen als cristalls de gel i n’impedeixen el creixement en els líquids de l’animal (Davies i Sykes, 1997). Els resultats d’aquestes experiències han estat la generació d’animals de diferents espècies (salmó i carpa vermella) tolerants a aigües més fredes. Finalment, cal mencionar la millora de l’eficiència de conversió energètica com una altra àrea de gran importància en l’aplicació de la transferència gènica d’interès per a l’aqüicultura. En aquest camp, els avenços s’han centrat en la introducció de canvis en el metabolisme de determinades substàncies per poder millorar-ne la capacitat d’assimilació per part de l’organisme. Així, s’ha introduït el gen del transportador de glucosa-1 humana juntament amb el gen de l’hexocinasa de tipus 2 de rata en la truita, i s’ha observat que aquesta introducció es traduïa en una millora en la utilització de carbohidrats per part de l’animal (Krasnow et al., 1999). Un altre exemple és la creació de peixos zebra transgènics per a l’enzim D6-dessaturasa, un enzim de la ruta de biosíntesi de l’àcid eicosapentanoic (EPA) i l’àcid docosahexanoic (DHA), àcids grassos molt beneficiosos per a la salut humana. Els resultat d’aquests experiments van permetre la cre-

ació d’animals amb una capacitat de síntesi d’EPA i DHA significativament més elevada que la dels seus homòlegs no transgènics (Alimuddin et al., 2007). Com ha quedat palès, la utilització de tècniques de modificació genètica encara és incipient en alguns camps de possible aplicació d’aquesta tecnologia, com és el cas de la producció massiva de macromolècules biològicament actives o el desenvolupament del cultiu d’aliments. Això és degut principalment a dues raons: la primera és la falta d’informació gènica en moltes espècies, i la segona, i possiblement la més determinant, el desconeixement generalitzat de la possible interacció entre aquest tipus d’animals, el medi natural i la salut humana. Tot i això, ja hi ha al mercat peixos transgènics. L’any 2002 l’empresa Taikong va començar a comercialitzar a la Xina un petit peix ornamental transgènic amb una estranya coloració groga i verdosa amb propietats fluorescents. El peix va ser batejat amb el nom comercial de TK-1. Actualment, l’empresa Yorktown Technologies comercialitza l’anomenat GloFish, un peix zebra transgènic que conté diferents variants d’una proteïna fluorescent, i que s’ha convertit en el primer organisme modificat genèticament (OMG) que ha estat comercialitzat als Estats Units com a mascota. Un altre exemple, és l’anomenat salmó AquAdvantage, un salmó transgènic per a l’hormona del creixement dissenyat per l’empresa nord-americana AquaBounty Technologies. La comercialització del salmó AquAdvantage està en procés d’aprovació per part de la FDA i s’espera la resolució al començament de l’any 2010.

Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 105-119

PEIXOS TRANSGÈNICS 115

RISCOS DERIVATS DE L’ÚS DE PEIXOS TRANSGÈNICS Com ha estat mencionat anteriorment, tots els treballs de transgènia en peixos han generat grans expectatives i interès, però paral·lelament han generat recel i desconfiança sobre les possibles conseqüències del seu ús. Això inclouria efectes sobre el medi natural, efectes en el consumidor i problemes ètics relacionats amb el seu ús. Peixos transgènics i seguretat mediambiental El principal risc mediambiental derivat de l’ús de peixos transgènics és la possibilitat d’escapament dels animals transgènics dels seus llocs de cria i les conseqüències corresponents en la disseminació del transgèn, és a dir, el seu pas incontrolat a altres individus i, per tant, a la biodiversitat ictiològica. Aquestes i altres consideracions han fet necessari el desenvolupament d’estratègies per avaluar els riscos potencials que comporta l’ús de peixos transgènics en el medi natural. Per això s’han proposat una sèrie de paràmetres que cal tenir en compte, com són la capacitat de supervivència, de reproducció i d’adaptació d’una espècie transgènica en un ecosistema natural. En la figura 1 es mostra un quadre que esquematitza aquest tipus d’estratègia d’avaluació proposada per Devlin et al. (2006). A més de les consideracions generals plantejades en l’esquema anterior, l’avaluació correcta d’aquests possibles riscos ecològics requereix dur a terme estudis empírics per a cada espècie seleccionada, cada tipus de gen manipulat i cada sistema de cultiu intensiu escollit. Així, els estudis amb animals transgènics per a l’hormona del creixement, concretament en salmó i Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 105-119

carpa (Hu et al., 2007), han demostrat que en ecosistemes naturals rics en nutrients els peixos transgènics per a l’hormona del creixement constitueixen una clara amenaça per als organismes salvatges de la mateixa espècie o espècies similars, principalment a causa de la seva capacitat major per competir per l’aliment. Però, quan aquests animals es troben en ecosistemes pobres en nutrients, passen a ser els organismes salvatges els dominants i els transgènics els que passen a tenir una taxa de supervivència menor, bàsicament a causa de la incapacitat d’adaptació dels organismes transgènics a aquest tipus de condicions (Devlin et al., 1999; Fu et al., 2007). Així mateix, quan s’analitzava la capacitat natatòria dels animals, característica que determina la seva capacitat de trobar aliment, de reproduir-se i de fugir de possibles depredadors, i que, per tant, garanteix la capacitat de supervivència i de reproducció de l’animal, s’observava que els salmons adults i juvenils transgènics per a l’hormona del creixement presentaven una disminució significativa de la capacitat natatòria respecte als organismes salvatges (Farell et al., 1997; Lee et al., 2003). Tanmateix, aquests i altres estudis que consideren altres variables fenotípiques han estat fets en petits sistemes experimentals, espais artificials externs que intenten simular el medi natural però que difícilment inclouen tots els factors i interaccions que es donen a la natura. Per tant, és clar que els organismes genèticament modificats poden comportar riscos per al medi ambient i que és justificable la necessitat d’una avaluació objectiva completa.

116 R. M. CEINOS I J. ROTLLANT

Peixos transgènics i salut humana Un dels principals objectius de l’aplicació de la transgènesi és la millora en l’obtenció de productes alimentaris. L’any 1994 va arribar al mercat dels EUA el primer producte modificat genèticament (un tomàquet). De llavors ençà n’hi ha hagut molts més (soja, blat de moro i patates, entre d’altres), i menjar aliments modificats genèticament ha esdevingut una cosa bastant normal, encara que molta gent no n’és conscient. L’Organització de les Nacions Unides per l’Agricultura i l’Alimentació (FAO), l’Organització Mundial de la Salut (OMS) i l’Organització per a la Cooperació i el Desenvolupament Econòmic (OCDE) han constatat que els aliments obtinguts

mitjançant eines biotecnològiques són igual de saludables que els mateixos aliments obtinguts mitjançant tècniques tradicionals (OECD Symposium, 1992; Berkowitz i Sorensen, 1994). Encara que actualment no està aprovat l’ús de peixos transgènics com a aliment apte per al consum humà, hi ha algunes qüestions importants per tal d’avaluar-ne la seguretat. Així, la innocuïtat del DNA forà introduït, el producte d’aquest DNA i la seguretat que aquest DNA forà no s’integri en l’organisme que s’alimenta del producte transgènic són algunes de les consideracions que s’han d’analitzar. Quan mengem estem ingerint DNA d’espècies animals o vegetals, el qual és hidrolitzat per nucleases durant la digestió; per tant,

Figura 1. Esquema general simplificat del principals paràmetres que cal tenir en compte per a una avaluació de possibles riscos originats per l’escapament de peixos transgènics en un ecosistema natural. Els punts d’intersecció avaluen la conseqüència o probabilitat que una acció tingui lloc: S (l’acció es produeix), N (l’acció no es produeix). Adaptat de Devlin et al., 2006. Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 105-119

PEIXOS TRANSGÈNICS 117

el DNA forà present en els aliments transgènics sofreix el mateix procés. Una altra qüestió seria si el DNA forà fos de tipus infecciós, amb capacitat de replicar-se i afectar l’organisme hoste o altres organismes. Actualment, la majoria dels DNA forans emprats en processos de generació de transgènesi no tenen segments infecciosos. Quan es té en compte la seguretat del producte que s’origina en expressar-se el DNA forà inserit, s’apliquen els mateixos principis que per al consum de qualsevol tipus de proteïna, sempre que s’ingereixi per via oral. Però a més, la proteïna que expressa l’animal transgènic no ha d’afectar el seu estat de salut. Potser seria a escala al·lergènica on podria sorgir un possible problema amb la proteïna obtinguda per transgènesi. En el cas de peixos transgènics per a l’hormona del creixement (GH), hi ha un estudi fet en primats no humans en què els van injectar hormona obtinguda a partir de tilàpies (Oreochromis mossambicus) transgèniques. Després de l’anàlisi d’un ampli rang de paràmetres fisiològics, bioquímics i de conducta, no es van detectar anomalies de cap tipus (Guillen et al., 1999). Aquests mateixos autors van fer un segon estudi, però en aquest cas amb vint i dues persones voluntàries, que es van alimentar durant cinc dies amb tilàpies transgèniques. Cap paràmetre clínic no es va veure afectat en finalitzar l’experiment. Una altra possibilitat que cal tenir en compte a l’hora de valorar la seguretat d’un aliment d’origen transgènic és la capacitat mateixa de l’insert de DNA forà d’activar algun gen de l’organisme hoste que codifiqui alguna toxina. Tanmateix, aquesta possibilitat és ínfima. Cal dir que dins la Unió Europea no es poden comercialitzar organismes modificats genèticament sense que hagin rebut prèviament una autorització que es concedeix després que s’hagi fet una avaluació Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 105-119

científica dels riscos potencials per a la salut o el medi ambient. AGRAÏMENTS Volia agrair la col·laboració del doctor Lluís Tort en la revisió d’aquest manuscrit. BIBLIOGRAFIA Alexander, E. L. R.; Dooley, K. C.; Pohajdak, B.; Xu, B. Y.; Wright, J. R. (2006). «Things we have learned from tilapia islet xenotransplantation». Gen. Comp. Endocrinol., 148: 125-131. Alimuddin; Yoshizaki, G.; Viswanath, K.; Shuichi, S.; Toshio, T. (2007). «Expression of Masu salmon delta 5-desaturase-like gene elevated EPA and DHA biosynthesis in Zebrafish». Mar. Biotechnol., 9: 92-100. Berkowitz, D. B.; Kryspin-Sorensen, I. (1994). «Transgenic fish: Safe to eat?». Bio/Technology, 12: 247-252. Bill, B. R.; Petzold, A. M.; Clark, K. J.; Schimmenti, L. A.; Ekker, S. C. (2009). «A primer for morpholino use in zebrafish». Zebrafish, 6 (1): 69-77. Cott, K. E. van; Lubon, H.; Gwazdauskas, F. C.; Knight, J.; Drohan, W. N.; Velander, W. H. (2001). «Recombinant human protein C expression in the milk of transgenic pigs and the effect on endogenous milk immunoglobulin and transferring levels». Transgenic Res., 10: 43-51. Chen, T. T.; Powers, D. A. (1990). «Transgenic fish». Trends in Biotechnology, 8: 209-214. Davies, P. L.; Sykes B. D. (1997). «Antifreeze proteins». Curr. Opin. Structural Biol., 7: 828-834. Devlin, R. H.; Johnsson, J. I.; Smailus, D. E.; Biagi, C. A.; Jönsson, E.; Björnsson, B. T. (1999). «Increased ability to compete for food by growth hormone-transgenic coho salmon Oncorhynchus kisutch (Walbaum)». Aquac. Res., 30: 479-482. Devlin, R. H.; Sundström, L. F.; Muir, W. M. (2006). «Interface of biotechnology and ecology for environmental risk assessments of transgenic fish». Trends in Biotechnology, 24: 89-97. Devlin, R. H.; Yesaki, T. Y.; Biagi, C. A.; Donaldson, E. M.; Swanson, P.; Chan, W. K. (1994). «Extraordinary salmon growth». Nature, 371: 209-210. Draper, B. W.; Morcos, P. A.; Kimmel, C. B. (2001). «Inhibition of zebrafish fgf8 pre-mRNA splic-

118 R. M. CEINOS I J. ROTLLANT ing with morpholino oligos: A quantifiable method for gene knockdown». Genesis, 30b (3): 154156. Du, S. J.; Gong, Z. Y.; Fletcher, G. L.; Shears, M. A.; King, M. J.; Idler, D. R.; Hew, C. L. (1992). «Growth enhancement in transgenic Atlantic salmon by the use of an ‘all fish’ chimeric growth hormone gen construct». Biotechnology (NY), 10: 176-181. Dunham, R. A.; Warr, G.; Nichols, A.; Duncan, P. L.; Angue, B.; Middleton, D.; Liu, Z. (2002). «Enhanced bacterial disease resistance of transgenic channel catfish, Ictalurus punctatus,possessing cecropin genes». Mar. Biotechnol., 4: 338-344. Ebert, K. M.; Selgrath, J. P.; DiTullio, P.; Denman, J.; Smith, T. E.; Memon, M. A.; Schindler, J. E.; Monastersky, G. M.; Vitale, J. A.; Gordon, K. (1991). «Transgenic production of human tissue-type plasminogen activator in goat milk: generation of transgenic goat and analysis of expression». Biotechnology, 9: 835-838. Ekker, S. C. (2008). «Zinc finger-based knockout punches for zebrafish genes». Zebrafish, 5 (2): 121123. Farrell, A. P.; Bennett, W.; Devlin, R. H. (1997). «Growth-enhanced transgenic salmon can be inferior swimmers». Can. J. Zool., 75: 335-337. Fu, C.; Li, D.; Hu, W.; Wang, Y.; Zhu, Z. (2007). «Growth and energy budget of F2 ‘all-fish’ growth hormone gene transgenic common carp». J. Fish Biol., 70: 347-361. Ghildiyal, M.; Zamore, P. D. (2009). «Small silencing RNAs: an expanding universe». Nat. Rev. Genet., 10 (2): 94-108. Gordon, J. W.; Scangos, G. A.; Plotkin, D. J.; Barbosa, J. A.; Ruddle F. H. (1980). «Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA». Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77 (12): 7380-7384. Guillén, I.; Berlanga, J.; Valenzuela, C. M.; Morales, A.; Toledo, J.; Estrada, M. P.; Puentes, P.; Hayes, O.; Fuente, J. de la (1999). «Safety evaluation of transgenic tilapia with accelerated growth». Mar. Biotechnol., 1: 2-14. Hamilton, A.; Baulcombe, D. (1999). «A species of small antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants». Science, 286 (5441): 950-952. Heasman, J. (2002). «Morpholino oligos: making sense of antisense?». Dev. Biol., 243 (2): 209-214. Hew, C. L.; Fletcher, G. L. (2001). «The role of aquatic biotechnology in aquaculture». Aquaculture, 197: 191-204. Hew, C.; Poon, R.; Xiong, F.; Gauthier, S.; Shears, M.; King, M.; Davies, P.; Fletcher, G. (1999).

«Liver-specific and seasonal expression on transgenic Atlantic salmon harbouring the winter flounder antifreeze protein gene». Transgenic Research, 8: 405-414. Hu, W.; Wang, Y.; Zhu, Z. Y. (2007). «Progress in the evaluation of transgenic fish for possible ecological risk and its containment strategies». Sci. China Ser C-Life Sci., 50: 573-579. Hultmark, D.; Steioner, H.; Rasmusan, T.; Boman, H. G. (1980). «Insect immunity purification and properties of three inducible bactericidal proteins from haemolymph of immunized pupal of Hylophora cecropia». Eur. J. Biochem., 106: 7-16. Hwang, G.; Müller, F.; Rahman, M. A.; Williams, D. W.; Murdock, P. J.; Pasi, K. J., Goldspink, G.; Farahmand, H.; Maclean, N. (2004). «Fish as bioreactors: transgene expression of human coagulation factor VII in fish embryos». Mar. Biotechnol. (NY), 6 (5): 485-492. Ivics, Z.; Hackett, P. B.; Plasterk, R. H.; Izsvák, Z. (1997). «Molecular reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like transposon from fish, and its transposition in human cells». Cell, 91 (4): 501510. Kawakami, K. (2007). «Tol2: a versatil gene transfer vector in vertebrates». Genome Biology, 8 (supl. 1): S7. Klattenhoff, C.; Theurkauf, W. (2008). «Biogenesis and germline functions of piRNAs». Development, 135 (1): 3-9. Krasnov, A.; Pitkänen, T.; Mölsä, H. (1999). «Gene transfer for targeted modification of salmonid fish metabolism». Genetic Analysis: Biomolecular Engineering, 15: 115-119. Kwon Nam, Y.; Koo Noh, J.; Sun Cho, Y.; Jong Cho, H.; Cho K. N.; Geun Kim, C.; Soo Kim, D. (2001). «Dramatically accelerated growth and extraordinary gigantism of transgenic mud loach Misgurnus mizolepis». Transgenic Research, 10: 353362. Lee, C. G.; Devlin, R. H.; Farrell, A. P. (2003). «Swimming performance, oxygen consumption and excess post-exercise oxygen consumption in adult transgenic and ocean-ranched coho salmon». J. Fish Biol., 62: 753-766. Lee, J. Y.; Boman, A.; Sun, C. X.; Andersson, M.; Jörnvall, H.; Mutt, V.; Boman, H. G. (1989). «Antibacterial peptides from pig intestine: Isolation of a mammalian cecropin». Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 86: 9159-9162. Lu, J. K.; Fu, B. H.; Wu, J. L.; Chen, T. T. (2002). «Production of transgenic silver sea bream (Sparus sarba) by different gene transfer methods». Mar. Biotechnol., 4: 328-337. Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 105-119

PEIXOS TRANSGÈNICS 119 Monteilhet, C.; Perrin, A.; Thierry, A.; Colleaux, L.; Dujon, B. (1990). «Purification and characterization of the in vitro activity of I-Sce I, a novel and highly specific endonuclease encoded by a group 1 intron». Nucl. Acids Res., 18 (6): 14071413. Ogino, H.; McConnell, W. B.; Grainger, R. M. (2006). «Highly efficient transgenesis in Xenopus tropicalis using I-SceI meganuclease». Mechanisms of Development, 123: 103-113. Organization for Economic Cooperation and Development (1992). The proceedings of the OECD Symposium on Aquatic Biotechnology and Food Safety. París. Paleyanda, R. K.; Velander, W. H.; Lee, T. K.; Scandella, D. H.; Gwazdauskas, F. C.; Knight, J. W.; Hoyer, L. W.; Drohan, W. N.; Lubon, H. (1997). «Transgenic pigs produce functional human factor VIII in milk». Nat. Biotechnol., 15: 971975. Powers, D. A.; Cole, T.; Creech, K.; Chen,T. T.; Lin, C. M.; Kight, K.; Dunham, R. (1992). «Electroporation: a method for transferring genes into the gametes of zebrafish, Brachydanio rerio, channel catfish, Ictalurus punctatus, and common carp, Cyprinus carpio». Mol. Mar. Biol. Biotechnol., 1: 301309. Rahman, M. A.; Mak, R.; Ayad, H.; Smith, A.; Maclean, N. (1998). «Expression of a novel piscine growth hormone gen results in growth enhancement in transgenic tilapia Orochromis niloticus (L.) following heat-shock-induced triploidy». Mar. Biotechnol., 1: 533-544. Rémy, S.; Tesson, L.; Ménoret, S.; Usal, C.; Scharenberg, A. M.; Anegon, I. (2009). «Zinc-finger nucleases: a powerful tool for genetic engineering of animals». Transgenic Res., 19 (3): 363-371. Sarmasik, A.; Warr, G.; Chen, T. T. (2002). «Production of transgenic medaka with increased resistance to bacterial pathogens». Mar. Biotechnol., 4: 310-322.

Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 105-119

Seto, A. G.; Kingston, R. E.; Lau, N. C. (2007). «The coming of age for Piwi proteins». Molecular Cell, 26 (5): 603-609. Summerton, J. (1999). «Morpholino antisense oligomers: the case for an RNase-H independent structural type». Biochimica et Biophysica Acta, 1489: 141-158. Thermes, V.; Grabher, C.; Ristoratore, F.; Bourrat, F.; Choulika, A.; Wittbrodt, J.; Joly, J. S. (2002). «I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish». Mechanisms of Development, 118 (1-2): 91-98. Traxler, G. S.; Anderson, E.; LaPatra, S. E.; Richard, J.; Shewmaker, B.; Kurath, G. (1999). «Naked DNA vaccination of Atlantic salmon, Salmon salar against IHNV». Dis. Aquat. Org., 38: 183-190. Wang, R.; Zhang, P.; Gong, Z.; Hew, C. L. (1995). «Expression of the antifreeze protein gene in transgenicgoldfish (Carassius auratus) and its implication in cold adaptation». Mol. Mar. Biol. Biotechnol., 4: 20-26. Westerfield, M. (2007). The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of Zebrafish (Danio rerio), 5a ed. Eugene: Univ. of Oregon Press. Wittbrodt, J.; Shima, A.; Schartl, M. (2002). «Medaka, a model organism from the far East». Nat. Rev. Genet., 3: 53-64. Yazawa, R.; Hirono, I.; Aoki, T. (2006). «Transgenic zebrafish expressing chicken lysozyme show resistance against bacterial diseases». Transgenic Res., 15: 385-391. Zhang, P. J.; Hayat, M.; Joyce, C.; Gonzalez-Villaseñor, L. I.; Lin, C. M.; Dunham, R. A.; Chen, T. T.; Powers, D. A. (1990). «Gene transfer, expresión and inheritance of pRSV-rainbow trout-GH cDNA in the common carp, Cyprinus Carpio (Linnaeus)». Mol. Reprod. Dev., 25: 3-13. Zhu, Z.; Li, G.; He, L.; Chen, S. (1985). «Novel gene transfer into the fertilized eggs of goldfish (Carassius auratus 1758)». Journal of Applied Ichthyology, 1: 31-33.

DOI: 10.2436/20.1501.02.97

Organismes modificats genèticament (Josep M. Casacuberta, ed.) Treballs de la SCB. Vol. 61 (2010) 121-133

LA TRANSGÈNESI EN ELS ANIMALS DE PRODUCCIÓ I EL SEU EFECTE SOBRE L’ALIMENTACIÓ I LA SALUT Maria Teresa Paramio i Dolors Izquierdo Departament de Ciència Animal i dels Aliments, Universitat Autònoma de Barcelona Adreça per a la correspondència: Maria Teresa Paramio Nieto. Departament de Ciència Animal i dels Aliments, Universitat Autònoma de Barcelona, Edifici 5. 08193 Cerdanyola del Vallès. Tel.: 935 811 456. Adreça electrònica: teresa.paramio@uab.cat. RESUM Amb l’ús de la transgènesi, la ramaderia ha canviat i ha augmentat els seus objectius productius. A la producció de carn, llet i ous per al consum alimentari ara s’afegeix la producció de proteïnes d’interès terapèutic i comercial, obtingudes en la llet, la clara de l’ou i el sèrum dels animals. Les metodologies utilitzades per produir remugants, conills, porcs i ocells transgènics són encara poc eficients i econòmicament costoses. Les principals metodologies són: a) microinjecció del transgèn en el pronucli del zigot, b) utilització dels espermatozoides com a vectors del transgèn, c) utilització de virus, especialment de lentivirus, com a portadors del nou gen i c) transferència nuclear. Els principals objectius buscats amb la transgènesi són produir: a) animals més productius, b) aliments d’origen animals més saludables, c) animals menys contaminants i d) animals usats com a biofactories perquè produeixin proteïnes d’interès terapèutic. Fins avui dia no s’ha permès la co mercialització de cap producte de la ramaderia transgènica. La falta d’una normativa clara sobre la regulació i comercialització d’aquests productes més una opinió pública escèptica a aquestes metodologies ha produït una baixada important en l’activitat d’aquesta investigació. Paraules clau: ramaderia, transgènic, biofactoria, nous aliments. TRANSGENIC LIVESTOCK AND ITS EFFECT ON ANIMAL FOOD PRODUCTION AND HUMAN HEALTH SUMMARY Transgenic allows increasing and changing the conventional roles of farm animals. To the meat, the milk and the eggs is added the production of biopharmaceutical goods obRebut: 09/02/2010. Acceptat: 01/03/2010.

122 M. T. PARAMIO I D. IZQUIERDO

tained in milk, egg white and serum. The first transgenic sheep, goat, pig and rabbit were described at 1985. Nowadays, the methodologies used are inefficiently and costly. These are: a) pronuclear microinjection, b) sperm mediated DNA transfer, c) DNA transfer using viral vectors and d) transgenic somatic nuclear transfer. The main objectives search by transgenic livestock are: a) improve animal production, b) novel foods with additional benefits for human health, c) reduction of farm animal contamination, d) farm animals as bioreactors of pharmacological proteins. At present, marketing of transgenic animal products has not been allowed. As regulatory guidelines are not completely developed and because of the weak acceptance of transgenic products by population, these researches subjects has been reduced. Key words: livestock, transgenic, biopharmaceutical, novel foods. INTRODUCCIÓ Des de l’inici de la domesticació dels animals, els humans han estat modificant contínuament els seus genotips per adaptar-los a les necessitats humanes. Fins als anys vuitanta del segle passat, la selecció genètica dels animals d’interès ramader tenia per objectiu incrementar i optimitzar la seva capacitat per produir principalment llet, carn i ous, i secundàriament, llana, pell, pèl, energia i adob. Els avanços de la genètica molecular i de la biotecnologia de la reproducció han permès que les espècies ramaderes, a més dels seus productes tradicionals, puguin ser utilitzats per produir proteïnes d’interès terapèutic i industrial. Així, del terme farming, entès com l’activitat tradicional ramadera, s’ha passat a pharming, que indica la utilització dels animals com a biofactories per produir proteïnes terapèutiques d’alt interès comercial per mitjà de la llet, el sèrum, la clara d’ou i d’altres teixits i productes. La investigació sobre organismes transgènics s’inicia al començament dels anys setanta amb el desenvolupament de les tecnologies del DNA recombinant. La possibilitat de seleccionar, copiar i alterar gens d’interès identificat i poder transferir-los a altres animals, plantes o qualsevol altre organisme viu, va obrir una enorme perspectiva per a

modificacions genètiques dels organismes vius fins aquest moment desconegudes. En la ramaderia, la transgènesi també ha permès obrir horitzons totalment nous. Actualment, les principals línies d’investigació sobre transgènesi en els animals productius són: a) Incrementar la productivitat dels animals mitjançant extracòpies de l’hormona del creixement (GH, IGF, etc.) i produir animals amb velocitats de creixement més grans, índexs millors de conversió dels aliments i menys greix a la canal. b) Modificar les propietats nutritives dels aliments d’origen animal: per exemple, canviar la composició dels àcids grassos en la carn de porc, canviar la composició d’aminoàcids de certes proteïnes animals, l’enriquiment de la llet amb ferro i vitamines, etc. c) Produir aliments funcionals: llet sense lactosa, llets maternitzades amb proteïnes humanes, llet amb propietats antimicrobianes, etc. d) Produir animals resistents a malalties: principalment vaques d’alta producció lletera resistents a la mastitis i remugants que no puguin expressar el prió de la BSE o malaltia de les «vaques boges». e) Animals que permetin una producció menys contaminant: porcs que excretin menys fòsfor en la seva femta. Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 121-133

LA TRANSGÈNESI EN ELS ANIMALS DE PRODUCCIÓ I L’EFECTE SOBRE L’ALIMENTACIÓ I LA SALUT 123

f ) Utilitzar als animals com a productors d’òrgans per a trasplantaments humans, xenotrasplantaments; en aquesta línia d’investigació el porc és l’animal model, ja que la seva fisiologia i els seus òrgans tenen moltes similituds amb els òrgans humans. g) La utilització d’animals com a biofactories de proteïnes d’interès farmacològic. L’expressió d’aquestes proteïnes es produeix sobretot en la llet de remugants i conills, en la clara de l’ou i en el sèrum. Aquesta línia d’investigació és la que actualment està més desenvolupada, entre d’altres coses, a causa de l’alt valor econòmic que presenten aquestes proteïnes terapèutiques en el mercat en relació amb el valor dels aliments. Els primers conills, porcs i ovelles transgènics es van aconseguir el 1985 utilitzant la microinjecció de gens en el zigot (Hammer et al., 1985). A partir d’aquesta data s’han produït animals transgènics com a models de malalties humanes (ratolins i porcs, principalment) i animals amb resistència a malalties letals o molt incidents en la ramaderia. D’altres animals transgènics, especialment cabres, ovelles, gallines, conills, vaques i porcs, s’han utilitzat per produir proteïnes d’interès terapèutic. A mesura que aquestes investigacions es van desenvolupant es trobaran nous objectius en aquests animals. Actualment els organismes reguladors nord-americans i europeus, la FDA (Food and Drug Administration) i l’EMEA (European Medicines Agency) no han permès la comercialització de cap producte procedent d’animals transgènics. Aquest fet posa en risc la continuïtat d’aquestes línies de treball després de més de vint anys d’investigació (Miller, 2008).

Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 121-133

METODOLOGIES PER A LA PRODUCCIÓ D’ANIMALS TRANSGÈNICS Un animal és considerat transgènic quan una còpia d’un o diversos gens exògens, sintetitzats al laboratori, és introduït en el genoma de l’animal d’una manera estable; a més, s’ha de poder transmetre a la descendència. El gen forà (anomenat transgèn) generalment està format per dues parts: una part que és pròpiament el gen, i que és la que té la capacitat de produir la proteïna, i l’altra part formada per diverses seqüències genètiques reguladores que milloren o protegeixen l’expressió del gen. La proteïna codificada pel transgèn es denomina proteïna recombinant perquè és el resultat de la recombinació entre el gen seleccionat i els seus elements de control. El primer pas per produir un animal transgènic és seleccionar un gen que ens interessi i determinar on (llet, sèrum, cèl·lules epitelials, etc.) i quan (durant la lactació, abans de la pubertat, etc.) s’expressarà el gen. Les metodologies utilitzades per produir remugants, conills, porcs i ocells transgènics són diverses, econòmicament costoses i encara poc eficients en comparació de la producció de plantes transgèniques, animals de laboratori o peixos transgènics. Les metodologies utilitzades són les que esmentem tot seguit. Microinjecció del gen al pronucli del zigot La microinjecció consisteix a injectar en un dels pronuclis de l’òvul fecundat (zigot) moltes còpies del transgèn seleccionat, mitjançant un micromanipulador. Si el transgèn és incorporat amb èxit en el genoma del zigot, totes les cèl·lules de l’animal tin-

124 M. T. PARAMIO I D. IZQUIERDO

dran incorporat el nou gen. Aproximadament unes cinc mil còpies del gen, contingudes en 1-2 picolitres de medi, són injectades en un dels dos pronuclis, generalment en el format per l’espermatozoide. Aquesta tècnica és laboriosa i poc eficient a causa de l’alt nombre de zigots microinjectats que no podran seguir el seu desenvolupament embrionari per l’efecte advers de la injecció. D’altra banda, el DNA forà és altament mutagènic i letal per a molts embrions, de manera que solament el 10-20 % dels zigots microinjectats integren el nou gen en el seu genoma. En la pràctica, amb molta freqüència el transgèn no és incorporat en totes les cèl·lules embrionàries produïdes a partir del zigot i s’obtenen animals mosaic. A més, molts dels transgènics produïts per microinjecció no incorporen el transgèn a les seves cèl·lules germinals i, per tant, no el poden transmetre a la seva descendència. Així, en animals experimentals, com el ratolí, solament l’1-5 % dels zigots microinjectats produiran un ratolí transgènic. Aquesta xifra d’èxit és molt menor en animals domèstics com vaques, ovelles, porcs i cabres, en què no s’acostuma a arribar ni a l’1 %. La dificultat d’obtenir un nombre elevat de zigots en aquestes espècies de taxa d’ovulació més baixa, la sensibilitat més alta dels zigots a la microinjecció, les baixes taxes de desenvolupament embrionari dels zigots microinjectats en les femelles receptores i la freqüència menor d’integració del gen forà, fan d’aquesta tècnica d’obtenció de transgènics una metodologia molt costosa econòmicament i molt poc eficient científicament. A pesar de totes aquestes dificultats, la microinjecció ha estat utilitzada de manera reeixida en cabres i ovelles per produir proteïnes d’interès farmacèutic. Així, el primer producte biofarmacèutic presentat a l’EMEA perquè l’aprovessin va ser

l’ATryn, una forma recombinant de l’antitrombina humana, produïda en la llet de cabra (Zhou et al., 2005) utilitzant la microinjecció. En animals de laboratori, com els ratolins, aquesta metodologia és la que més s’utilitza. Utilització de virus com a vectors del nou gen Aquesta metodologia es basa en la capacitat que tenen els virus d’incorporar el seu material genètic a la cèl·lula infectada. Aquesta metodologia va ser la primera que es va utilitzar per aconseguir la transgènesi. L’avantatge que presenta és l’alta integració del transgèn tant en les cèl·lules germinals com en el zigot o en les cèl·lules de l’embrió, a més del trauma mínim que es produeix en les seves membranes i estructures. En gallines, en què l’embrió, que es troba present en l’ou fecundat, conté més de cinquanta mil cèl·lules, normalment la introducció del transgèn en l’embrió es fa mitjançant infecció amb virus. Fins ara s’han utilitzat dos tipus de virus, els retrovirus i els lentivirus. Actualment, els lentivirus són els més utilitzats i eficients en la producció d’animals transgènics pel fet que són capaços d’incorporar el transgèn a més varietat de cèl·lules i en cèl·lules en diferents estadis del cicle cel·lular. En porcs, el percentatge d’animals transgènics obtinguts en relació amb els embrions infectats és del 13 al 31 % amb un 90 % dels animals transgènics que expressen un alt nivell de proteïna (Whitelaw et al., 2004). En bovins, els lentivirus han produït vaques transgèniques mitjançant infecció de l’òvul però no mitjançant la infecció de l’embrió (Hofmann et al., 2004). Utilitzant aquests virus s’han obtingut pollastres, porcs, conills, ovelles, vaques i cabres transgèniques; no obstant això, hi ha espècies, com els micos, Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 121-133

LA TRANSGÈNESI EN ELS ANIMALS DE PRODUCCIÓ I L’EFECTE SOBRE L’ALIMENTACIÓ I LA SALUT 125

en què no s’han pogut produir. Una de les grans limitacions que presenta aquesta metodologia és que els virus solament poden transferir gens de mida petita (fins a 10 kb) per les limitacions físiques de la càpsula vírica. Un altre desavantatge important és el llarg i complicat procés que representa afegir el gen a la dotació genètica del virus i l’empaquetament posterior en la càpsula vírica (revisat per Robl et al., 2007). Utilització dels espermatozoides com a transmissors del nou gen El 1971 es va comprovar que l’espermatozoide tenia capacitat per incorporar nou DNA i integrar-lo al genoma de l’òvul (Brackett et al., 1971). Posteriorment, el 1989 unes investigadores italianes van demostrar que els espermatozoides eren capaços d’incorporar nou material genètic en el seu nucli i que inseminant amb aquests espermatozoides un òvul es podien aconseguir animals transgènics d’una manera fàcil i eficient. La investigació documentava que simplement afegint el material genètic a una solució d’espermatozoides, eren capaços d’integrar-lo al seu nucli i transferir-lo al zigot i, d’aquesta manera, s’aconseguia un ratolí transgènic (Lavitrano et al., 1989). Nombrosos laboratoris van intentar repetir aquesta metodologia tan prometedora i barata, però la baixa repetibilitat dels resultats va desanimar els investigadors a seguir en aquesta línia de recerca. En els darrers anys s’ha tornat a obrir aquesta investigació i s’ha aconseguit un 80 % de porcs transgènics amb gran estabilitat del transgèn (Lavitrano et al., 2002). Per millorar l’eficàcia d’aquest mètode s’han introduït tècniques d’electroporació i liposomes per millorar la incorporació del DNA a l’espermatozoide (Smith i Spadafora, 2005) i la utilització d’anticossos Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 121-133

monoclonals que reconeixen la superfície de l’espermatozoide (Chang et al., 2002). També l’ús de l’ICSI (intracytoplasmic sperm injection) ha millorat els resultats d’obtenció de porcs transgènics (Perry et al., 1999) en permetre seleccionar l’espermatozoide transgènic per injectar-lo directament a l’oòcit. En remugants, els resultats amb aquesta metodologia han estat més escassos (Shemesh et al., 2000), i s’ha aconseguit descendència transgènica, però amb mosaïcisme (revisat per Wall, 2002). Transferència nuclear de cèl·lules somàtiques El naixement de l’ovella Dolly, el primer animal clònic produït mitjançant transferència nuclear d’una cèl·lula somàtica (Wilmut et al., 1997), va donar pas a una nova tecnologia per produir animals transgènics. En comparació de la microinjecció, aquesta tècnica té com a avantatge la utilització d’un nombre menor d’animals experimentals i, com a conseqüència, la reducció significativa del cost de la investigació. La metodologia de la transferència nuclear té dues etapes: a) introduir el transgèn en el nucli de la cèl·lula somàtica i identificar correctament la cèl·lula transgènica i b) introduir la cèl·lula somàtica, i ja transgènica, dins del citoplast de l’òvul enucleat i fusionar i activar ambdues cèl·lules fins a produir un embrió transferible a una femella receptora. Aquesta segona etapa és específicament la metodologia del clonatge. Més concretament, per a la producció de les cèl·lules transgèniques, les cèl·lules somàtiques utilitzades preferentment en la producció d’animals transgènics són els fibroblasts. Els fibroblasts són cèl·lules fàcils de cultivar in vitro i es troben presents en molts teixits, des d’on és fàcil aïllar-les. Els fibroblasts poden ser obtinguts

126 M. T. PARAMIO I D. IZQUIERDO

de teixits d’animals vius i de teixits de fetus. El ritme de reproducció dels fibroblasts és molt ràpid i se’n poden aconseguir milions en poc temps. De totes maneres, amb cadascuna de les divisions, les cèl·lules van envellint i perdent capacitat per poder ser clonades. També, la vida in vitro de les cèl·lules depèn de l’edat de l’animal donant. Així, els fibroblasts fetals són els que permeten més divisions cel·lulars. Per exemple, cultivant durant quaranta-vuit hores teixit d’un fetus boví (2 a 4 cm) es poden obtenir cinquanta milions de cèl·lules en cultiu, fet que amplia les possibilitats que n’hi hagi de modificades genèticament, que un nombre adequat tinguin incorporat correctament el transgèn i que es trobin prou robustes per poder ser transferides al citoplast i produir embrions viables. Hi ha diferents mètodes per incorporar el transgèn a la cèl·lula; aquest procés s’anomena transfecció. Una de les tècniques per fer-la és mitjançant l’electroporació, que consisteix a produir descàrregues elèctriques a la cèl·lula de manera que es produeixin porus en la membrana perquè penetri el transgèn. De cinc milions de cèl·lules, solament incorporen el transgèn aproximadament 500 (revisat per Keefer, 2007). Per a la selecció d’aquestes cèl·lules, el transgèn incorpora una construcció marcadora que permet seleccionar les cèl·lules transgèniques i cultivar-les durant diversos dies per poder identificar el transgèn per PCR i poder augmentar el nombre de cèl·lules transgèniques en els diversos passos dels cultius cel·lulars. Durant aquests cultius les cèl·lules van envellint i finalment cal seleccionar les que semblin més viables. La transferència de nuclis En aquesta tecnologia el primer pas és l’enucleació de l’òvul, és a dir, l’extracció

de tot el seu material genètic. Aquest procés es fa aspirant amb una micropipeta tot el nucli i el corpuscle polar de l’òvul tenint cura de deixar intacta la major part del citoplasma. Aquesta nova cèl·lula enucleada és denominada citoplast. Una vegada preparat el citoplast, el fibroblast transgènic és introduït entre la zona pel·lúcida i la membrana plasmàtica del citoplast. La fusió d’ambdues cèl·lules es fa per electrofusió o descàrregues elèctriques. Aquestes descàrregues modifiquen les càrregues elèctriques d’ambdues membranes plasmàtiques i provoquen l’aparició d’una sèrie de porus per on es produeix la fusió dels citoplasmes, i això dóna com a resultat una única cèl·lula amb un sol nucli. El pas següent és el procés d’activació cel·lular, que consisteix a activar la nova cèl·lula fusionada perquè iniciï les divisions cel·lulars i es desenvolupi un embrió. Aquesta activació normalment es fa químicament utilitzant compostos que estimulen l’entrada massiva de calci a la cèl·lula i compostos que inhibeixen els enzims presents al citoplast encarregats de mantenir l’òvul sense dividir abans de ser estimulat per l’espermatozoide. Després de la fusió i l’activació, el nou embrió es manté en medis de cultiu embrionari in vitro fins a arribar a la fase de mòrula o blastocist, moment en el qual és transferit a una femella receptora perquè mantingui la gestació fins al naixement. Aquest mètode assegura que l’embrió és transgènic, ja que el nucli introduït provenia d’una cèl·lula transgènica. L’eficàcia d’aquestes tecnologies ha estat millorada gràcies a les investigacions en gens diana (gene targeting) (Kuroiwa et al., 2004) i la tecnologia transcromosòmica (Kuroiwa et al., 2002). Els gens diana es basen en el procés de recombinació homòloga; consisteix a col·locar en el transgèn seqüències de gens endògens que els permetin reconèixer el lloc específic del Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 121-133

LA TRANSGÈNESI EN ELS ANIMALS DE PRODUCCIÓ I L’EFECTE SOBRE L’ALIMENTACIÓ I LA SALUT 127

cromosoma on s’ha d’integrar el transgèn, de manera que s’eviti que s’integri a l’atzar, amb les conseqüències negatives que comporta això. La tecnologia transcromosòmica consisteix a transferir microcromosomes en lloc de gens. Els microcromosomes són grans trossos de DNA que contenen tots els elements d’un cromosoma, incloent-hi telòmers, centròmers i múltiples llocs de replicació del DNA. Els microcromosomes no s’integren en el DNA de l’amfitrió, sinó que afegeixen un nou cromosoma a la seva dotació genètica. A més, els microcromosomes duen més quantitat de DNA, ja que no necessiten ser integrats en cap cromosoma endogen. Normalment la quantitat que es pot integrar en un cromosoma és de 10.000 a 30.000 nucleòtids, i els microcromosomes poden tenir deu milions o més bases de DNA. Conseqüentment, aquesta tecnologia permet transferir gens de gran longitud o molts gens alhora. Actualment ja s’han produït vedelles transgèniques per produir immunoglobulina humana, que s’han obtingut mitjançant microcromosomes artificials, també denominats HAC (human artificial chromosome), i utilitzant la tècnica de transferència nuclear amb fibroblasts (Kuroiwa et al., 2002). OBJECTIUS DE LA TRANSGÈNESI EN ELS ANIMALS RAMADERS La transgènesi és una línia d’investigació tan potent que no solament afectarà la producció animal convencional, sinó que permetrà als animals tenir utilitats noves i diferents. Actualment les línies d’investigació més importants que es desenvolupen sobre els animals d’interès productiu són els que enumerem tot seguit.

Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 121-133

Millores en la salut animal Amb la genètica quantitativa s’ha pogut millorar poc la resistència dels animals a certes malalties. Amb l’enginyeria genètica s’han obert noves estratègies per poder millorar la salut dels animals. La millora de la salut dels animals implica, entre d’altres coses, més benestar per als animals, una reducció important de la medicació que necessiten ara, un increment en la productivitat i una millora en els paràmetres reproductius, a més de produir aliments de millor qualitat i més sans. Una de les estratègies per millorar la resistència a les malalties és fer animals transgènics que expressin en el seu organisme els anticossos necessaris per lluitar contra la malaltia seleccionada. S’han produït construccions per expressar anticossos en conills, porcs i ovelles; no obstant això, els anticossos formats eren d’una grandària aberrant i d’una capacitat molt feble d’afinitat amb l’antigen. Una altra línia d’estudi per millorar la salut animal és fer femelles transgèniques que expressin en la llet els anticossos que volem, de manera que el nounat s’immunitzi durant la lactació (revisat per Laible, 2009). Pel seu impacte social, una important línia d’investigació ha estat eradicar dels animals transmissors el prió que produïa la BSE (encefalitis bovina espongiforme) o malaltia de les «vaques boges». En ovelles, cabres i vaques els animals portadors de l’al·lel PrP són els animals que pateixen i transmeten aquesta malaltia. L’estratègia contra aquesta malaltia ha estat produir animals transgènics amb un transgèn desactivador del PrP. Els animals en els quals la transgènia els ha desactivat un gen endogen es coneixen amb el nom d’animals genoanul·lats. Fins al moment, s’han obtingut vaques (Kuroiwa et al., 2004), ovelles (Denning et al., 2001) i cabres (Yu et al., 2009) genoanul·lades en homozigosi.

128 M. T. PARAMIO I D. IZQUIERDO

Una de les grans infeccions que afecten el boví d’alta producció lletera són les mastitis. Aquesta infecció de la glàndula mamària comporta grans pèrdues econòmiques a les explotacions lleteres. Freqüentment la mastitis és provocada per Staphylococcus aureus, un patogen difícil de controlar amb els antibiòtics actuals. Per aturar aquest problema s’han produït vaques transgèniques que expressen en la llet l’enzim lisostafina (Wall et al., 2005). La lisostafina és un antimicrobià molt eficaç que provoca la ruptura de la paret cel·lular del bacteri. Segons els nivells d’expressió de l’enzim, el grau de protecció contra la mastitis serà major. Producció de nous aliments més saludables La composició química i nutritiva dels aliments pot ser modificada significativament per la transgènesi. Mitjançant l’enginyeria genètica els aliments poden augmentar el nombre de compostos nutritius que tenen, com per exemple en el cas de l’arròs daurat, o arròs al qual s’ha afegit provitamina A en la seva composició. També es poden eliminar o reduir nutrients que poden ser perillosos per a algunes persones, com és el cas de la lactosa de la llet de vaca. Un grup d’investigadors de la Universitat de Davis, a Califòrnia, ja ha aconseguit una cabra que expressa en la llet la proteïna lisozim (Maga et al., 2006). El lisozim és un antimicrobià natural de la llet dels mamífers. La llet humana conté molta més quantitat d’aquesta proteïna que les llets de vaca i cabra. L’enriquiment de la llet de vaca o de cabra amb lisozim humà milloraria la qualitat nutritiva i donaria a la llet propietats antimicrobianes i antiinflamatòries. També s’està estudiant d’afegir a la llet dels remugants la proteïna

humana lactoferrina, de manera que s’incrementin les propietats nutritives de la llet i es millori la protecció intestinal. Un altre problema que s’està estudiant fa referència a les intoleràncies a certs sucres. Moltes persones al món són intolerants a la llet de vaca a causa de la lactosa. Aquesta intolerància és deguda a la manca de lactasa, l’enzim que hidrolitza la lactosa en glucosa i galactosa. La lactosa és un sucre i no una proteïna, per la qual cosa no té un gen que la codifiqui específicament. Per eliminar la lactosa de la llet s’estan utilitzant diverses estratègies. Una és canviar els enzims que produeixen la lactosa en el cicle dels sucres perquè el producte final sigui la glucosa i la galactosa. D’altres estudis intenten produir en la llet la lactasa que hidrolitza la lactosa per aconseguir que aquest sucre s’hidrolitzi prèviament a la ingestió. Una de les primeres estratègies que es va seguir va ser la d’inhibir la producció d’aquest sucre, però no va tenir èxit. Una altra línia d’estudi va ser intentar expressar enzims que hidrolitzin la lactosa en la llet mateixa, i una altra via ha estat inhibir la producció de lactoalbúmina, una proteïna imprescindible per formar la lactosa en la glàndula mamària (Whitelaw, 1999). La transgènesi permetrà modificacions en la llet que produiran un canvi important en les seves característiques nutritives. Així, si s’aconsegueix que la glàndula mamària de la vaca produeixi proteïnes làcties provinents del genoma de les dones es podria obtenir una llet de vaca completament maternitzada. Potser, l’animal que ha superat tots els assajos productius i està a l’espera de la comercialització és el porc, al qual s’ha afegit el gen FAD2, que codifica l’enzim A12 àcid gras-dessaturasa provinent dels espinacs. Aquests porcs transgènics expressen aquest enzim en els seus adipòcits, i increTreb. Soc. Cat. Biol., 61: 121-133

LA TRANSGÈNESI EN ELS ANIMALS DE PRODUCCIÓ I L’EFECTE SOBRE L’ALIMENTACIÓ I LA SALUT 129

menten en un 20 % la quantitat d’àcid linoleic en el seu greix (Saeki et al., 2004). També s’han produït porcs amb capacitat per produir àcids grassos ω-3 (Lai et al., 2006). En ambdós tipus de transgènics, l’objectiu era produir carn amb menys greix saturat i, conseqüentment, amb menys risc de produir malalties cardiovasculars. Actualment en les revistes científiques es discuteix perquè no es poden comercialitzar (Kang i Leaf, 2007). Augment de la productivitat animal Uns dels primers objectius dels treballs amb transgènics van ser incrementar la velocitat de creixement, el pes i la composició de la canal dels animals. Des que el 1982 la revista Nature publiqués per primera vegada la fotografia d’un ratolí transgènic amb una grandària considerablement major que els seus congèneres perquè tenia moltes còpies de l’hormona del creixement (Palmiter et al., 1982), molts investigadors van iniciar aquesta línia de treball per produir una ramaderia d’animals més grans. No obstant això, els resultats van ser frustrants, ja que els animals nascuts presentaven tantes aberracions que eren inviables. En els darrers anys, utilitzant l’hormona de creixement humana s’han aconseguit porcs i vaques amb més creixement i menys greix a la canal; no obstant això, els resultats són encara poc consistents (Draghia-Akli et al., 1999). Millorar la sostenibilitat de la ramaderia Un dels grans problemes de la ramaderia intensiva de porcí és la contaminació que produeix la seva femta, anomenada purí, en el sòl. Una manera de reduir aquesta contaminació ha estat produir un Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 121-133

porc transgènic amb el gen de la fitasa obtingut d’un bacteri. El porc expressa la fitasa en les glàndules salivals i es produeix una millora en la digestibilitat dels fitats de la dieta, amb la qual cosa es redueix el 75 % la quantitat de fosfats produïts en la femta dels porcs (Golovan et al., 2001). Producció de proteïnes d’interès farmacèutic Potser un dels grans canvis que ha produït la transgènesi és la possibilitat de produir proteïnes d’interès terapèutic utilitzant animals amb una alta producció de llet, d’ous o carn. Els animals domèstics sempre han estat una font de medicaments humans, i han produït anticossos i antídots en el seu sèrum. Altres proteïnes farmacològiques s’obtenien de teixits animals, com per exemple la insulina i l’hormona del creixement, obtingudes del porc. Aquests medicaments obtinguts de teixits animals poden presentar problemes de contaminació amb proteïnes animals no desitjades (Houdebine, 2000). L’enginyeria genètica permet obtenir proteïnes humanes en teixits animals amb una alta taxa de síntesi proteica, com és la glàndula mamària, l’oviducte de la gallina o la sang. A més, certs compostos com els anticossos policlonals no podrien ser obtinguts d’altra manera. Les proteïnes recombinants procedents de gens humans també presentarien menys risc d’al·lèrgia en relació amb les obtingudes de teixits animals. Actualment la majoria de proteïnes recombinants humanes són produïdes per bacteris, llevats i cultius cel·lulars. L’avantatge d’utilitzar els animals com a biofactories és la seva capacitat per produir proteïnes estables i actives en comparació de les proteïnes recombinants procedents de bacteris, llevats, cèl·lules de mamífer i plantes. A més, els animals

130 M. T. PARAMIO I D. IZQUIERDO Taula 1.

Bioproductes elaborats per empreses europees i nord-americanes

Sistema

Empresa o grup, país Pàgina web

Productes o models

Estat

Cabres

GTC Biotherapeutics, EUA

www.transgenics.com

Antitrombina III (ATryn) Anticossos monoclonals Vacuna de la malària

L’ATryn és aprovada a la UE i es troba en proves clíniques als EUA. En els altres productes és preclínic

Pharmathene, EUA/Canadà

www.pharmathene.com

Butitilcolinesterasa

Recerca

Hematech, EUA

www.hematech.com

Anticossos policlonals

Recerca

GTC Biotherapeutics, EUA

www.transgenics.com

Albúmina sèrica humana Recerca

Revivicor, EUA

www.revivicor.com

Xenotrasplantaments (implants de cartílag) Anticossos policlonals

Recerca

Progenetics

www.progtx.com

Factor IX

Recerca

Foulum Research Center, Dinamarca

www.agrsci.org/ny_navi gation/forskning/centre/f orskningscenter_ foulum

Model d’Alzheimer

Recerca

Universitat Estatal de Carolina del Nord (R. M. Petters), EUA

www.ncse.edu

Model de retinitis pigmentosa

Recerca

Universitat de Missoury (R. Prather), EUA

www.missouri.edu

Xenotrasplantaments

Recerca

Pharming, Països Baixos

www.pharming.com

Inhibidor de C1

Assajos clínics de fase II

BioProtein Technologies, França

www.bioprotein.com

Proteïnes recombinants

Recerca

Therapeutic Human Proteins, EUA

www.polyclonals.com

Anticossos humans policlonals

Recerca

www.avigenics.com

Interferó

Assajos clínics

Origin Therapeutics, EUA

www.origentherapeutics. com

Proteïnes recombinants

Recerca

Viragen, EUA

www.viragen.com

Interferó α i anticossos de cadena simple

Recerca

Vivalis, França

www.vivalis.com

Proteïnes recombinants amb un sistema basat en cèl·lules

Recerca

Ovelles

Porcs

Conills

Pollastres Avigenics, EUA

Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 121-133

LA TRANSGÈNESI EN ELS ANIMALS DE PRODUCCIÓ I L’EFECTE SOBRE L’ALIMENTACIÓ I LA SALUT 131

produirien quantitats molt més grans de proteïnes, i això faria que el sistema fos més rendible econòmicament (Cott et al., 2004). Ja s’han obtingut quantitats acceptables de proteïnes recombinants en ovelles, cabres i vaques, amb una alta activitat biològica. En la clara d’ou, els resultats obtinguts d’expressió i activitat de la proteïna recombinant han estat menys importants que en la llet, encara que es van millorant. Actualment, cap de les proteïnes recombinants produïdes per animals ha estat comercialitzada, encara que des de 2006 l’antitrombina ATryn (anticoagulant) està aprovada per l’EMEA (Agència Europea del Medicament). Una altra proteïna recombinant produïda en la llet de cabra i que està en procés d’aprovació és Protexia, una proteïna amb activitat butiril-colinesterasa que és utilitzada contra els agents tòxics del sistema nerviós. Un dels problemes que preveuen les agències reguladores per a l’aprovació d’aquests medicaments és la seva possible immunogeneïtat alterada. Encara que les proteïnes provenen de gens humans, les modificacions posttraducionals possibles produïdes en l’organisme de l’animal en poden haver modificat l’al·lergeneïtat, a més d’haver alterat la capacitat de persistència o la vida útil de la proteïna. En el quadre de la pàgina anterior s’observen les empreses europees i americanes que produeixen bioproductes ―quadre elaborat per Keefer et al. (2007), Council for Agriculture Sicence and Technology, 35. No hi ha productes procedents d’animals transgènics que hagin estat comercialitzats, ni proteïnes farmacèutiques, ni aliments enriquits, ni animals més productius. Un dels principals motius d’aquesta falta de comercialització és que la legislació reguladora de nous fàrmacs i aliments no ha decidit definitivament quins tipus de regulacions haurien de superar aquests productes obtinguts mitjançant enginyeria Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 121-133

genètica (Keefer, 2004). En aquest moment avança amb més rapidesa la ciència que les noves regles produïdes pels organismes reguladors, i, per tant, no s’atreveixen a comercialitzar-los solament utilitzant les proves que es fan als aliments o fàrmacs convencionals. A més, l’opinió publica dels països desenvolupats, escèptica amb aquestes metodologies, impedeix una política més activa sobre aquesta investigació. Ja fa vint anys que es va produir la primera proteïna recombinant en ovelles i encara no s’ha donat una resposta concloent a la petició de comercialització. Aquesta situació tan poc definida, tant legalment com políticament, ha resultat en una disminució important en les inversions en aquestes línies de treball, malgrat el gran potencial que tenen (Miller, 2008). BIBLIOGRAFIA Brackett, B. G.; Baranska, W.; Sawicki, W.; Koprowski, H. (1971). «Uptake of heterologous genome by mammalian spermatozoa and its transfer to ova through fertilization». Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 68: 353-357. Chang, K.; Qian, J.; Jiang, M.; Liu, Y. H.; Wu, M. C.; Chen, C. D.; Lai, C. K.; Lo, H. L.; Hsiao, C. T.; Brown, L.; Bolen, J.; Huang, H. I.; Ho, P. Y.; Shih, P. Y.; Yao, C.-W.; Lin, W. J.; Chen, C. H.; Wu, F. Y.; Lin, Y. J.; Xu, J.; Wang, K. (2002). «Effective generation of transgenic pigs and mice by linker based sperm-mediated gene transfer». BMC Biotechnology, 2: 5. Denning, C.; Burl, S.; Ainslie, A.; Bracken, J.; Dinnyes, A.; Fletcher, J.; King, T.; Ritchie, M.; Ritchie, W. A.; Rollo, M.; Sousa, P. de; Travers, A.; Wilmut, I.; Clark, A. J. (2001). «Deletion of the α-(1,3)galactosyl transferase (GGTA1) gene and the prion protein (PrP) gene in sheep». Nat. Biotech., 19: 559-562. Draghia-Akli, R.; Fiorotto, M. L.; Hill, L. A.; Malone, P. B.; Deaver, D. R.; Schwartz, R. J. (1999). «Myogenic expression of an injectable protease-resistant growth hormone-releasing hormone augments long-term growth in pigs». Nat. Biotech., 17: 1179-1183.

132 M. T. PARAMIO I D. IZQUIERDO Golovan, S. P.; Meidinger, R. G.; Ajakaiye, A.; Cottrill, M.; Wiederkehr, M. Z.; Barney, D. J.; Plante, C.; Pollard, J. W.; Fan, M. Z.; Hayes, M. A.; Laursen, J.; Hjorth, J. P.; Hacker, R. R.; Phillips, J. P.; Forsberg, C. W. (2001). «Pigs expressing salivary phytase produce low-phosphorus manure». Nat. Biotech., 19: 741-745. Hammer, R. E.; Pursel, V. G.; Rexroad, C. E.; Wall, R. J.; Bolt, D. J.; Ebert, K. M.; Palmiter, R. D.; Brinster, R. L. (1985). «Production of transgenic rabbits, sheep and pigs by microinjection». Nature, 315: 680-683. Hofmann, A.; Zakhartchenko, V.; Weppert, M.; Sebald, H.; Wenigerkind, H.; Brem, G.; Wolf, E.; Pfeifer, A. (2004). «Generation of transgenic cattle by lentiviral gene transfer into oocytes». Biol. Reprod., 71: 405-409. Houdebine, L. M. (2000). «Transgenic animal bioreactors». Transgenic Res., 9: 305-320. Kang, J. X.; Leaf, A. (2007). «Why the omega-3 piggy should go to market». Nat. Biotech., 25: 505506. Keefer, C. (2007) «The role of the transgenic livestock in the treatment of the human disease». Council for Agricultural Science and Technology (CAST), 35: 12. Keefer, C. L. (2004). «Production of bioproducts through the use of transgenic animal models». Anim. Reprod. Sci., 82: 5-12. Kuroiwa, Y.; Kasinathan, P.; Choi, Y. J.; Naeem, R.; Tomizuka, K.; Sullivan, E. J.; Knott, J. G.; Duteau, A.; Goldsby, R. A.; Osborne, B. A.; Ishida, I.; Robl, J. M. (2002). «Cloned transchromosomic calves producing human immunoglobulin». Nat. Biotech., 20: 889-894. Kuroiwa, Y.; Kasinathan, P.; Matsushita, H.; Sathiyaselan, J.; Sullivan, E. J.; Kakitani, M.; Tomizuka, K.; Ishida, I.; Robl, J. M. (2004). «Sequential targeting of the genes encoding immunoglobulin-µ and prion protein in cattle». Nat. Genet., 36: 775-780. Lai, L.; Kang, J. X.; Li, R.; Wang, J.; Witt, W. T.; Yong, H. Y.; Hao, Y.; Wax, D. M.; Murphy, C. N.; Rieke, A.; Samuel, M.; Linville, M. L.; Korte, S. W.; Evans, R. W.; Starzl, T. E.; Prather, R. S.; Dai, Y. (2006). «Generation of cloned transgenic pigs rich in omega-3 fatty acids». Nat. Biotech., 24: 435-436. Laible, G. (2009). «Enhancing livestock through genetic engineering–recent advances and future prospects». Comp. Immunol. Microbiol. Infect. Dis., 32: 123-137. Lavitrano, M.; Bacci, M. L.; Forni, M.; Lazzereschi, D.; Di Stefano, C.; Fioretti, D.; Giancotti,

P.; Marf, G.; Pucci, L.; Renzi, L.; Wang, H.; Stoppacciaro, A.; Stassi, G.; Sargiacomo, M.; Sinibaldi, P.; Turchi, V.; Giovannoni, R.; Casa, G. della; Seren, E.; Rossi, G. (2002). «Efficient production by sperm-mediated gene transfer of human decay accelerating factor (hDAF) transgenic pigs for xenotransplantation». Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 99: 14230-14235. Lavitrano, M.; Camaioni, A.; Fazio, V. M.; Dolci, S.; Farace, M. G.; Spadafora, C. (1989). «Sperm cells as vectors for introducing foreign DNA into eggs: Genetic transformation of mice». Cell, 57: 717-723. Maga, E. A.; Shoemaker, C. F.; Rowe, J. D.; Bondurant, R. H.; Anderson, G. B.; Murray, J. D. (2006). «Production and processing of milk from transgenic goats expressing human lysozyme in the mammary gland». J. Dairy Sci., 89: 518-524. Miller, H. I. (2008). «FDA on transgenic animals―dog’s breakfast?». Nat. Biotech., 26: 159160. Palmiter, R. D.; Brinster, R. L.; Hammer, R. E.; Trumbauer, M. E.; Rosenfeld, M. G.; Birnberg, N. C.; Evans, R. M. (1982). «Dramatic growth of mice that develop from eggs microinjected with metallothionein-growth hormone fusion genes». Nature, 300: 611-615. Perry, A. C.; Nbsp, F.; Wakayama, T.; Kishikawa, H.; Kasai, T.; Okabe, M.; Toyoda, Y.; Yanagimachi, R. (1999). «Mammalian transgenesis by intracytoplasmic sperm injection». Science, 284: 1180-1183. Robl, J. M.; Wang, Z.; Kasinathan, P.; Kuroiwa, Y. (2007). «Transgenic animal production and animal biotechnology». Theriogenology, 67: 127-133. Saeki, K.; Matsumoto, K.; Kinoshita, M.; Suzuki, I.; Tasaka, Y.; Kano, K.; Taguchi, Y.; Mikami, K.; Hirabayashi, M.; Kashiwazaki, N.; Hosoi, Y.; Murata, N.; Iritani, A. (2004). «Functional expression of a δ-12 fatty acid desaturase gene from spinach in transgenic pigs». Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 101: 6361-6366. Shemesh, M.; Gurevich, M.; Harel-Markowitz, E.; Benvenisti, L.; Shore, L. S.; Stram, Y. (2000). «Gene integration into bovine sperm genome and its expression in transgenic offspring». Mol. Reprod. Dev., 56: 306-308. Smith, K.; Spadafora, C. (2005). «Sperm-mediated gene transfer: Applications and implications». BioEssays, 27: 551-562. Wall, R. J. (2002). «New gene transfer methods». Theriogenology, 57: 189-201. Wall, R. J.; Powell, A. M.; Paape, M. J.; Kerr, D. E.; Bannerman, D. D.; Pursel, V. G.; Wells, K. D.; Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 121-133

LA TRANSGÈNESI EN ELS ANIMALS DE PRODUCCIÓ I L’EFECTE SOBRE L’ALIMENTACIÓ I LA SALUT 133 Talbot, N.; Hawk, H. W. (2005). «Genetically enhanced cows resist intramammary Staphylococcus aureus infection». Nat. Biotech., 23: 445-451. Whitelaw, B. (1999). «Toward designer milk». Nat. Biotech., 17: 135-136. Whitelaw, C. B. A.; Radcliffe, P. A.; Ritchie, W. A.; Carlisle, A.; Ellard, F. M.; Pena, R. N.; Rowe, J.; Clark, A. J.; King, T. J.; Mitrophanous, K. A. (2004). «Efficient generation of transgenic pigs using equine infectious anaemia virus (EIAV) derived vector». FEBS Letters, 571: 233236. Wilmut, I.; Schnieke, A. E.; Mcwhir, J.; Kind, A. J.; Campbell, K. H. (1997). «Viable offspring de-

Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 121-133

rived from fetal and adult mammalian cells». Nature, 385: 810-813. Yu, G.; Chen, J.; Xu, Y.; Zhu, C.; Yu, H.; Liu, S.; Sha, H.; Chen, J.; Xu, X.; Wu, Y.; Zhang, A.; Ma, J.; Cheng, G. (2009). «Generation of goats lacking prion protein». Molecular Reproduction and Development, 76: 3. Zhou, Q.; Kyazike, J.; Echelard, Y.; Meade, H. M.; Higgins, E.; Cole, E. S.; Edmunds, T. (2005). «Effect of genetic background on glycosylation heterogeneity in human antithrombin produced in the mammary gland of transgenic goats». Journal of Biotechnology, 117: 57-72.

DOI: 10.2436/20.1501.02.98

Organismes modificats genèticament (Josep M. Casacuberta, ed.) Treballs de la SCB. Vol. 61 (2010) 135-150

L’AVALUACIÓ CIENTÍFICA DELS RISCOS ASSOCIATS ALS ORGANISMES MODIFICATS GENÈTICAMENT A EUROPA Josep M. Casacuberta Departament de Genètica Molecular de Plantes, Centre de Recerca en Agrigenòmica Adreça per a la correspondència: Josep M. Casacuberta. Departament de Genètica Molecular de Plantes, Centre de Recerca en Agrigenòmica. Jordi Girona, 18. 08034 Barcelona. Adreça electrònica: josep.casacuberta@cid.csic.es. RESUM L’obtenció de les primeres plantes transgèniques l’any 1983 va obrir la porta a la utilit zació de la genètica molecular per a la millora genètica. L’enorme potencial d’aquesta tècnica va aconsellar desenvolupar una legislació que assegurés que només s’aprovarien OMG després d’haver-los sotmès a una anàlisi de risc en profunditat. La legislació europea sobre la comercialització d’OMG es basa en la precaució i exigeix una anàlisi de risc molt exhaustiva, a la qual no estan sotmesos els organismes modificats per altres tècniques. Aquesta anàlisi es refereix molt particularment al potencial tòxic o a l·lergènic i a la capacitat nutricional per als humans o el bestiar d’aquests productes, i també als possibles riscos ambientals del seu cultiu. L’anàlisi de risc l’efectua l’Autoritat Europea de Seguretat Alimentària (EFSA), però la decisió d’aprovar o no la comercialització d’un nou transgènic recau en els estats membre de la UE i la Comissió Europea. Tot i que la legislació actual ha funcionat correctament, la seva feixuguesa i les implicacions polítiques de la gestió de les aprovacions de nous OMG fa que s’estiguin plantejant possibles modificacions. En aquest article s’analitza la legislació actual, el procés de l’anàlisi de risc, els problemes de la legislació actual i les possibles modificacions que s’estan discutint en aquests moments. Paraules clau: OMG, legislació, anàlisi de risc, EFSA. SCIENTIFIC ASSESSMENT OF GENETICALLY MODIFIED ORGANISMS RISKS IN EUROPE SUMMARY The first transgenic plants obtained in 1983 opened up the possibility of using transgenics in plant and animal breeding. The nature of these powerful techniques made neRebut: 09/02/2010. Acceptat: 01/03/2010.

136 J. M. CASACUBERTA

cessary a specific legislation ensuring that only GMOs that had undergone risk analysis could be eligible for commercialization. European GMO legislation is based on the precautionary principle and requires the safety of these products to be analyzed to an unprecedented level of detail. These analyses refer in particular to their toxic or allergenic po tential, their nutritional capacity as food and feed products, as well as their potential risk for the environment. The European Food Safety Authority (EFSA) performs the risk assessment, but the decision for commercialization approval belongs to the Member States and the European Commission. Although the European GMO legislation has been shown to work adequately, its complexity, long time frames, and the political implications of new GMO approvals has prompted some stakeholders to propose possible modifications. In this paper we review the European GMO legislation, the risk assessment process, the weak points of the GMO approval process, and the modifications that are being dis cussed at this time. Key words: GMO, legislation, risk analysis, EFSA. UNA MICA D’HISTÒRIA Les primeres plantes transgèniques es van obtenir pràcticament al mateix temps en dos laboratoris dels EUA i d’Europa (Herrera-Estrella et al., 1993; Barton et al., 1993). Aquests articles descrivien la introducció de construccions gèniques en cèl·lules de tabac valent-se del bacteri Agrobacterium tumefaciens, i la regeneració posterior de plantes que contenien el transgèn a partir de les cèl·lules transformades. El potencial d’aquest bacteri del sòl per a la biotecnologia vegetal ja s’havia previst uns anys abans, quan es va comprovar que transferia un fragment de DNA (el T-DNA) a les cèl·lules vegetals que infectava. L’estratègia per aconseguir plantes transgèniques va consistir a substituir alguns dels gens que el bacteri integrava de manera natural en les cèl·lules infectades per les construccions gèniques que es volien introduir, i es deixava al bacteri la feina de fer la transformació. Les aplicacions van trigar poc més de deu anys a arribar al mercat i l’any 1994 ja es podia comprar al Regne Unit, etiquetat clarament com a producte transgènic, un triturat de tomàquets modificats genèticament per retardar-ne la ma-

duració. Tot i que la transferència del laboratori al mercat va ser extremadament ràpida, quatre anys abans que el primer producte transgènic arribés als mercats europeus la UE ja s’havia dotat d’una legislació que regulava aquests productes i va establir uns procediments d’anàlisi de risc detallats i exhaustius. La Directiva 90/220/EEC (CEE, 1990), que es va publicar l’abril de 1990, i que s’ha modificat diverses vegades des d’aleshores, defineix els termes legals, estableix les responsabilitats dels estats membre i del Consell i regula per primer cop tant l’alliberament voluntari d’OMG com la comercialització. La Directiva 90/220/EEC defineix per primera vegada què s’entén per OMG en la legislació europea, i ho restringeix a aquell organisme al qual s’ha modificat la informació genètica per mitjà de tècniques de DNA recombinant. La directiva especifica en un annex quines són les tècniques que, des d’un punt de vista legal, donen lloc a un OMG i quines no. Per exemple, la utilització de vectors de transformació o la introducció directa de DNA per microinjecció es consideren tècniques que donen lloc a OMG, mentre que les tècniques de fertilització in vitro o la inducció de poliploiTreb. Soc. Cat. Biol., 61: 135-150

L’AVALUACIÓ CIENTÍFICA DELS RISCOS ASSOCIATS ALS OMG A EUROPA 137

des, no. Per altra banda, la directiva, en el seu article tercer, també exclou explícitament tècniques àmpliament utilitzades per modificar els genomes en programes de millora genètica com ara la mutagènesi o la fusió de protoplasts. Per tant, des de la primera regulació, la UE va definir els OMG no tant per la seva natura com per la tècnica utilitzada per obtenir-los. Aquesta decisió, probablement raonable des del punt de vista legislatiu, fa que no sempre siguin fàcils de justificar des d’un punt de vista científic algunes anàlisis que són obligatòries en el cas dels OMG i que ni tan sols no es plantegen quan els nous organismes s’obtenen, per exemple, per mutagènesi química o amb rajos X. També, la Directiva 90/220/EEC obliga els estats membre a designar una autoritat competent responsable del compliment de la normativa, i a garantir que aquesta autoritat organitzi les inspeccions i mesures de control necessàries. Aquestes autoritats competents tenen també un paper rellevant en l’anàlisi de risc prevista en la legislació actual, com es veurà en l’apartat següent. LA LEGISLACIÓ EUROPEA SOBRE ELS PRODUCTES DERIVATS D’OMG El marc regulador actual consisteix essencialment en la Directiva 2001/18/EC (CE, 2001) i el Reglament (EC) 1829/2003 (CE, 2003a), que regulen l’alliberament voluntari d’OMG al medi ambient i els productes per a alimentació humana o animal obtinguts d’OMG, respectivament. La primera, la Directiva 2001/18/EC, recull, amplia i substitueix l’anterior Directiva 90/220/EEC. En aquesta directiva, a més de mantenir les definicions esmentades en l’apartat anterior, s’assenten les bases de Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 135-150

l’estratègia d’aprovació i d’anàlisi de riscos. Es diu, per exemple, que l’avaluació dels riscos es basarà en informes científics independents, i també que la introducció d’un OMG al medi ambient s’ha de fer «pas per pas», és a dir, reduint progressivament el seu nivell de confinament i avaluant el possible risc a cada etapa. També diu que un estat membre no podrà prohibir, restringir o impedir la comercialització d’un OMG autoritzat, tot i que estableix en el seu article 23 un procediment, la clàusula de salvaguarda, per fer-ho de manera provisional en alguns casos concrets. La clàusula de salvaguarda és una eina que permet aturar cautelarment la comercialització d’un OMG en el territori d’un estat en cas que noves dades científiques, aparegudes amb posterioritat a l’aprovació, suggereixin que pot representar un risc per a la salut humana, la salut animal o el medi ambient. Quan un estat membre decideix aplicar aquesta clàusula ha d’informar immediatament la Comissió Europea i els altres estats membre, explicant clarament les raons i aportant les noves dades científiques que justifiquen la mesura. La Comissió, després de demanar un informe científic a l’Autoritat Europea de Seguretat Alimentària (EFSA), haurà de decidir si la prohibició és justificada o si, en cas contrari, obliga l’estat membre a aixecar la prohibició cautelar. La Directiva 2001/18/EC també estableix que els OMG o els seus productes derivats hauran de portar una etiqueta que especifiqui que «conté OMG». Atès que els únics OMG que es poden comercialitzar a UE són els que, després d’haver superat una anàlisi detallada de riscos, han estat aprovats per les autoritats competents, l’obligatorietat de l’etiquetatge no es justifica en un possible problema sanitari (com podria ser el cas de l’etiquetatge dels productes que porten gluten, per exemple, en cas que

138 J. M. CASACUBERTA

fos obligatori l’etiquetatge). L’obligatorietat de l’etiquetatge es basa en la voluntat del legislador de permetre la lliure elecció entre productes que, tot i ser equivalents des del punt de vista científic, són vistos com si fossin diferents pels consumidors. La directiva mateixa preveu també que per causes involuntàries i tècnicament inevitables es puguin trobar traces d’OMG en un producte no-OMG. Per això especifica que caldrà definir un llindar a partir del qual no sigui obligatori etiquetar. Aquest llindar es defineix en un reglament posterior, el Reglament (EC) 1830/2003 sobre la traçabilitat i etiquetatge (CE, 2003b), que estableix un límit del 0,9 % per a cada un dels components d’un determinat producte, per sota dels quals no cal etiquetar com a OMG el producte final. Com ja ha estat dit, aquest llindar només s’aplica a OMG aprovats a la UE i no hi ha cap llindar de tolerància per als OMG no aprovats a la CE. El Reglament (EC) 1829/2003 regula els aliments i pinsos obtinguts d’OMG i defineix a quines anàlisis s’han de sotmetre per assegurar que no representen un risc a la salut humana o animal. Aquest reglament s’aplica a tot producte obtingut d’un OMG destinat a l’alimentació humana o animal, però no s’aplica al que s’anomenen auxiliars tecnològics utilitzats durant el procés de producció. Així, per exemple, els productes obtinguts d’animals no transgènics tractats amb productes veterinaris modificats genèticament no són considerats OMG i, per tant, no estan subjectes a aquesta regulació, com no ho estan tampoc els animals no transgènics alimentats amb pinso que contingui OMG. La raó subjacent és que el producte comercialitzat no conté l’OMG utilitzat com a «auxiliar tecnològic» o com a aliment, ni és possible detectar-hi productes derivats. Tot i que un OMG pot ser destinat exclusivament a la producció de pinsos, i pot te-

nir l’autorització per ser utilitzat únicament per a l’alimentació animal, el reglament estableix que, atès que és molt difícil impedir la contaminació accidental de la cadena alimentària, l’anàlisi de riscos no es pot restringir als riscos per a la salut animal i ha d’incloure necessàriament l’anàlisi de riscos per a la salut humana. Tant en el cas de la Directiva 2001/18/EC com del Reglament (EC) 1829/2003, l’avaluació dels possibles riscos per a la salut humana, la salut animal o el medi ambient constitueix el nucli de la normativa. Aquesta avaluació de risc es fa en dos nivells: les autoritats competents dels estats membre i l’EFSA, l’agència creada l’any 2002 per informar la Comissió Europea o el Parlament sobre qüestions relacionades amb la seguretat alimentària. En el cas de la directiva, l’avaluació és responsabilitat en primer terme d’un estat membre, però en cas que altres estats membre tinguin objeccions a l’informe, és l’EFSA qui ha d’emetre l’informe científic final (vegeu la figura 1). Atès que en tots els casos hi ha objeccions d’alguns estats, la intervenció de l’EFSA és quasi sistemàtica. En el cas del reglament, el paper de l’EFSA és central, i aquesta agència és l’encarregada de fer l’avaluació de riscos (vegeu la figura 2). De tota manera, en cas que es demani l’autorització de cultiu de l’OMG, un dels estats membre es farà càrrec de l’anàlisi del risc ambiental. Així doncs, l’anàlisi de risc és en tots els casos una responsabilitat compartida entre l’EFSA, que tindrà l’última paraula, i les autoritats competents dels estats membre de la UE que, a més, tenen accés a tots els dossiers durant tot el procés i tenen la possibilitat de fer comentaris i preguntes a l’EFSA per aclarir aspectes que puguin despertar dubtes pel que fa a la seguretat de l’OMG.

Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 135-150

L’AVALUACIÓ CIENTÍFICA DELS RISCOS ASSOCIATS ALS OMG A EUROPA 139

EL PROCÉS D’AVALUACIÓ Atès que la majoria de les sol·licituds per posar al mercat un producte modificat genèticament inclouen, ni que sigui indirectament, la possible utilització per a l’alimentació humana o animal, el Reglament (EC) 1829/2003 és el marc legal que se segueix gairebé sempre per tramitar-les. Només en casos molt concrets en els quals l’OMG es destinarà a usos industrials i es pot excloure totalment la possibilitat que acabi entrant a la cadena alimentària humana o animal, se segueixen els tràmits

descrits en la Directiva 2001/18/EC. Per altra banda, com ja s’ha dit, els dos processos són, en la pràctica, molt semblants, per la qual cosa només descriurem el procés previst en el Reglament (EC) 1829/2003 (vegeu la figura 2). Qualsevol persona jurídica que vulgui demanar l’autorització per comercialitzar un OMG o un producte obtingut d’un OMG a Europa ha de fer una anàlisi de riscos per a la salut humana, la salut animal i el medi ambient, i presentar-lo a les autoritats competents d’un dels estats membre de la UE que, immediatament, el transme-

Sol·licitud OMG

Estat membre (EM): informe d’anàlisi de risc

Comissió Europea (CE)

Objeccions resoltes

Comentaris i objeccions de tots els EM

Objeccions no resoltes

Informe d’anàlisi de risc

Anàlisi de risc Gestió del risc EM: Autorització (o no)

Comissió Europea

CE/EM: Autorització (o no) Figura 1.

Directiva 2001/18/EC. Alliberament voluntari.

Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 135-150

140 J. M. CASACUBERTA

trà a l’EFSA perquè l’avaluï. Després de comprovar que el dossier conté totes les dades que es consideren necessàries per a l’anàlisi de risc (vegeu més endavant), l’EFSA declara vàlida l’aplicació. A partir d’aquell moment, el panel d’OMG de l’EFSA disposa d’un termini de sis mesos per emetre una opinió científica sobre els riscos potencial d’aquell OMG pel que fa a les aplicacions per a les quals es demana l’autorització. El procés que segueix l’EFSA per analitzar els dossiers està esquematitzat a la figura 3. En el mateix moment en el qual l’EFSA declara vàlida una aplicació, fa accessible el dossier a les autoritats competents dels estats membre de la UE, i les involucra des del primer moment en l’avaluació. Cada una de les autoritats competents estudia el dossier i envia preguntes i comentaris a l’EFSA, que les tindrà en compte i les podrà retransmetre al sol·licitant. Al mateix moment, els diferents grups de treball del panel d’OMG de

l’EFSA comencen a treballar en els diferents apartats del dossier. Els tres grups de treball estables del panel (caracterització molecular, alimentació humana i animal, i impacte ambiental) analitzen les diferents parts del dossier i plantegen preguntes o demanen aclariments al sol·licitant sobre tots aquells punts en els quals consideren que l’anàlisi de riscos és incompleta. Durant el temps en què el panel espera la resposta a cada una de les preguntes, el rellotge que mesura el termini en el qual l’EFSA ha d’emetre la seva opinió s’atura. Atès que molt sovint es demanen anàlisis complementàries que poden requerir un temps d’experimentació força llarg, com és el cas, per exemple, dels assajos de camp, el temps que triga el panel a emetre la seva opinió acostuma ser molt més llarg que els sis mesos que legalment té l’EFSA per donar una resposta, i es pot retardar uns quants anys. Un cop resoltes totes les qüestions dubtoses en els grups de treball, el

Sol·licitud OMG

Un EM fa l’anàlisi de risc ambiental (si es demana autorització per cultivar)

Informe d’anàlisi de risc

Consulta amb els estats membre

Anàlisi de risc Gestió de risc

Consulta pública

Comissió Europea / Estats membre

Comissió Europea / Estats membre Autorització (o no) Figura 2.

Reglament (EC) 1829/2003. Aliments i pinsos MG. Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 135-150

L’AVALUACIÓ CIENTÍFICA DELS RISCOS ASSOCIATS ALS OMG A EUROPA 141

dossier analitza el panel en ple, i s’emet una opinió científica sobre els riscos potencials associats a aquell OMG, en particular tenint en compte les utilitzacions per a les quals es demana l’autorització. A aquesta opinió científica s’afegeix l’informe del Laboratori de Referència Europeu (Community Reference Laboratory, CRL, que és part del Joint Research Center, JRC, situat a Ispra, Itàlia), que és qui valida els mètodes de detecció per poder identificar cada un dels OMG aprovats i permetre les anàlisis necessàries per assegurar la traçabilitat de qualsevol OMG en el mercat. El conjunt de l’opinió i l’informe sobre els mètodes de detecció s’envia a la Comissió Europea, que prepara una proposta de concedir o denegar el permís de comercialització a la UE, que haurà de ser discutida i votada pel Comitè Permanent de la Cadena Alimentària i Salut Animal (SCFCAH), en què són representats (i amb un nombre de vots ponderat en funció de la població) els diferents estats de la UE. En cas que no hi hagi majoria suficient ni a favor ni en contra de la proposta, és la Comissió qui ha de prenSol·licitud OMG

dre una decisió final. Tots els OMG aprovats en aquests últims anys ho han estat per decisions de la Comissió, ja que en cap cas no s’ha donat una majoria suficient al si de l’SCFCAH perquè els estats membre prenguessin la decisió d’autoritzar o denegar l’autorització. L’autorització per a la comercialització d’un producte OMG és vàlida per un termini de deu anys, després dels quals s’haurà de fer una sol·licitud per renovar l’autorització. Els dossiers de renovació segueixen el mateix procés que els de les sollicituds d’aprovació d’un nou OMG, i l’anàlisi de risc que s’ha de fer és molt semblant, tot i que en aquest cas, s’ha d’adjuntar la informació que permeti valorar els possibles riscos que es puguin haver detectat durant els deu anys en els quals s’ha comercialitzat l’OMG en qüestió. L’ANÀLISI DE RISC L’anàlisi de risc s’ha de basar en el que preveu el reglament i en les guies orientati-

Rapporteur / EFSA staff científic

Comprovació de continguts Grups de treball

Sol·licitud vàlida Panel científic GMO Consulta als EM Informe de validació del CRL Figura 3.

Esquema del proces d’avaluació dels dossiers de nous OMG.

Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 135-150

•Sol·licitud i avaluació d’informacions addicionals •Adopció de l’opinió científica •Adopció de l’opinió científica global d’EFSA

142 J. M. CASACUBERTA

Taula 1. Sol·licituds d’aprovació en el marc del Reglament 1829/2003 que inclouen el cultiu (l’anàlisi ambiental és feta per un estat membre) Sol·licitud

OMG

EMS; estat

EFSA

UK-2005-17

Blat de moro 1507 × NK603

Espanya; 

En curs

NL-2005-22

Blat de moro NK603

Espanya; 

Publicat

NL-2005-23

Blat de moro 59122

NL; 

En curs

NL-2005-24

Soia 40-3-2

DE; 

En curs

NL-2005-26

Blat de moro MON810 × NK603

Espanya; en curs

En curs

NL-2005-28

Blat de moro 1507 × 59122

NL; 

En curs

UK-2006-30

Blat de moro 59122 x1507 × NK603

BE; en curs

En curs

NL-2007-46 & RX

Blat de moro T25

UK; en curs

En curs

CZ-2008-54

Blat de moro MON88017

BE; en curs

En curs

UK-2008-60

Blat de moro GA21

CZ; en curs

En curs

DE-2008-63*

Remolatxa H7-1

DE;

NL-2009-69*

Patata AV43-6-GT

SE;

BE-2009-71*

Blat de moro MON89034 × MON88017

BE;

NL-2009-72*

Blat de moro MON89034 × Nk603

NL;

RX-MON810

Blat de moro MON810

Espanya; 

ves que ha preparat per a això l’EFSA. Actualment hi ha una guia orientativa per a l’anàlisi de riscos de plantes (EFSA, 2004) o microorganismes (EFSA, 2006a) modificats genèticament, i se n’està preparant una per a l’anàlisi dels animals transgènics. També hi ha una guia orientativa per a l’anàlisi de plantes en les quals s’ha combinat més d’un transgèn (EFSA, 2007) i una guia que dóna les directrius per preparar els dossiers de sol·licitud de renovació del permís de comercialització un cop passats deu anys de l’aprovació (EFSA 2006b). L’estratègia de l’anàlisi de risc es basa en la comparació de l’OMG amb un organisme no transgènic, el més proper possible, per al qual hi hagi una llarga història de cultiu i consum que permeti considerar-lo com a segur. Aquesta estratègia es fona-

Publicat

menta, doncs, en la premissa que les plantes (o els animals) que els éssers humans estem acostumats a consumir són segures o, com a mínim, tenen un risc acceptable. En realitat, moltes de les plantes que consumim representen un risc relativament elevat per a grups importants de la població. Per exemple, el consum de molts cereals que continguin gluten representa un risc elevat per als celíacs, o el consum de productes derivats de la soja pot produir reaccions al·lèrgiques importants en certes persones. El que es pretén determinar en l’anàlisi de risc dels OMG és si el fet que es tracti d’un OMG representa un risc addicional. La comparació de l’OMG amb un organisme no transgènic relacionat permet detectar les possibles diferències. Però l’anàlisi no s’acaba aquí. Tan important com Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 135-150

L’AVALUACIÓ CIENTÍFICA DELS RISCOS ASSOCIATS ALS OMG A EUROPA 143

detectar les possibles diferències és determinar si aquestes són biològicament significatives i si tenen un impacte en la seguretat alimentària o en el potencial nutricional de l’OMG. De fet, tot i que és difícil trobar diferències biològicament rellevants, l’alt nombre de paràmetres analitzats i la variabilitat natural d’aquests paràmetres fa que sempre es detectin diferències entre l’OMG i el seu comparador. Atès que el risc associat a un OMG depèn en gran mesura tant del tipus de modificació genètica introduïda com de l’organisme modificat, l’anàlisi s’adapta a cada cas, sense que es pugui establir un protocol d’anàlisi de risc general per a qualsevol OMG. En qualsevol cas, hi ha unes línies directrius generals que inclouen algunes anàlisis que són obligatòries sempre i d’altres que només seran necessàries en alguns casos particulars. L’anàlisi es pot dividir en tres parts: la caracterització molecular de l’OMG, l’anàlisi del risc associat a l’alimentació humana i animal, i l’anàlisi del risc per al medi ambient. La caracterització molecular ha d’incloure necessàriament informació sobre els mètodes de transformació i el DNA utilitzat per generar l’OMG, informació sobre les seqüències inserides (eliminades o modificades) en el genoma receptor, i informació sobre l’expressió espacial i temporal de l’insert o sobre la seva estabilitat genètica i l’estabilitat fenotípica de l’OMG. L’anàlisi dels riscos per a l’alimentació humana o animal ha d’incloure una anàlisi comparativa de la composició de l’OMG i la d’un organisme no transgènic proper. L’elecció del comparador adequat és clau perquè l’anàlisi tingui valor, i aquesta elecció s’haurà de justificar adequadament en el dossier. També, una anàlisi estadística adequada és també un prerequisit perquè es puguin treure conclusions de la comparació. L’anàlisi comparativa ha d’incloure la determiTreb. Soc. Cat. Biol., 61: 135-150

nació de les concentracions de diferents nutrients considerats clau (proteïnes, lípids, carbohidrats, etc.), i també de toxines endògenes o antinutrients (com ara inhibidors d’enzims digestius) o al·lèrgens importants. També, en funció del caràcter introduït i de l’espècie receptora, pot ser necessari analitzar altres components particulars. A més, s’ha de fer en tots els casos una anàlisi de la toxicitat i al·lergeneïtat potencial dels productes derivats de l’OMG, i també del seu poder nutricional. Aquestes anàlisis impliquen diferents tipus d’assajos d’alimentació en animals de laboratori. Finalment, l’anàlisi d’impacte ambiental inclou l’anàlisi de les interaccions de l’OMG amb les altres espècies vegetals o animals. Aquest estudi ha de tenir en compte tant la possibilitat de disseminació del transgèn a espècies interfèrtils amb l’OMG, com la interacció de l’OMG amb espècies no diana. Això és particularment important en els OMG que expressen proteïnes tòxiques per a organismes plaga i que poden tenir un impacte sobre altres organismes evolutivament relacionats amb els organismes que es volen combatre. Totes aquestes anàlisis són molt més importants quan la sol·licitud inclou el permís de cultivar l’OMG a Europa. En aquests casos l’EFSA delega en l’autoritat competent d’un dels estats membre l’anàlisi ambiental (vegeu la figura 2). Tot i que fins ara només hi ha un OMG autoritzat per a cultiu a la UE, el MON 810, el nombre de sol·licituds que inclouen el cultiu ha augmentat en els darrers anys de manera significativa. A hores d’ara (tardor de 2009) hi ha quinze dossiers que inclouen cultiu tramitant-se, i és important fer constar que en quatre és l’autoritat competent espanyola la que assumeix la responsabilitat de l’anàlisi ambiental (vegeu la taula 1). L’anàlisi representa un volum de dades molt important (vegeu la figura 4), que des

144 J. M. CASACUBERTA

del primer moment es posa a disposició de les autoritats competents de tots els estats membre de la UE, i que la Comissió Europea fa accessible també, de manera resumida, al conjunt dels ciutadans de la UE. En resum, l’anàlisi de riscos es fa cas per cas i progressa per etapes successives, en un procés en el qual les dades obtingudes de les anàlisis individuals es valoren en funció d’una visió global, tenint en compte el seu pes relatiu, i mai de manera aïllada. Tot i que l’EFSA té, com ja s’ha explicat, un paper central, en l’anàlisi de risc participen de manera directa els estats membre de la UE, que són, a més, els que tenen la decisió política final de l’aprovació dels OMG.

Figura 4.

ESTRUCTURA I FUNCIONAMENT DE L’EFSA L’Autoritat Europea de Seguretat Alimentària, EFSA, es va crear l’any 2002 en un context de crisis alimentàries i de desconfiança creixent dels consumidors en la cadena alimentària europea. En aquesta situació la necessitat de tenir una agència científica independent que donés assessorament en tots els temes relacionats amb el risc alimentari es va anar imposant en els mitjans polítics. La funció de l’EFSA és la d’unificar en una sola agència l’assessorament científic en temes que tenen a veure amb la cadena alimentària, amb el doble objectiu de millorar l’anàlisi de risc i de protecció dels consumidors europeus i de restablir la confiança en la cadena alimentària a Europa. A diferència del que passa als EUA, on la Food and Drug Administration (FDA) fa l’avaluació de risc i,

Un exemple de dossier. Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 135-150

L’AVALUACIÓ CIENTÍFICA DELS RISCOS ASSOCIATS ALS OMG A EUROPA 145

al mateix temps, té capacitat normativa en temes relacionats amb els productes alimentaris, a Europa es va separar clarament l’avaluació de risc, competència de l’EFSA, de la gestió del risc, que és competència de la Comissió i els estats membre. L’EFSA és una agència independent dirigida per un comitè de direcció (management board) format per catorze membres designats pel Consell de la Unió Europea, a proposta del Parlament, escollits per la seva competència i experiència professionals (experiència en associacions de consumidors, governs, agricultura, indústria, ciència, etc.) i que, en qualsevol cas, no representen els estats membre. La veu dels estats membre o de la Comissió Europea es troba representada al consell assessor (advisory forum), que inclou també representants d’altres organismes amb funcions similars a l’EFSA o representants de països, com ara Noruega o Suïssa, que no formen part de la UE. Aquesta estructura pretén assegurar la independència de l’agència, al mateix temps que mostra la voluntat de treballar en col·laboració estreta amb els estats membre i la Comissió. Per altra banda, l’EFSA funciona d’una manera oberta i transparent, i publica a la seva pàgina web tant els currículums i l’experiència prèvia dels seus treballadors i experts externs (amb una cura especial a explicar qualsevol conflicte d’interès que hi pugui haver), com les agendes i resums de totes les reunions de treball. A part de l’administració i la divisió de comunicació, que compleix una de les tasques essencials de l’EFSA, que és la d’assegurar una bona comunicació en temes relacionats amb la cadena alimentària, l’EFSA té una secció científica que està dividida en onze panels i unitats científiques. Aquestes unitats tenen un equip de científics de plantilla i un panel d’experts, que són els que fan les anàlisis i produeixen les opinions científiques Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 135-150

sobre els temes de la seva competència. En el cas dels OMG, la unitat científica consta de disset científics de plantilla amb experiència en camps tan variats com la biologia molecular, la bioquímica, la medicina veterinària, la virologia, l’ecologia, la genètica o la biologia cel·lular. Els científics de la unitat d’OMG tenen diferents tasques de suport en el panel però no són els encarregats de debatre i produir les opinions. Aquesta és la tasca dels vint-i-un experts científics externs escollits, per a un termini de tres anys, en funció de la seva experiència professional. A més dels membres del panel científic, l’EFSA demana la col·laboració d’altres experts que participen d’una manera més o menys continuada en les diferents tasques del panel. En el cas del panel d’OMG hi ha uns quaranta científics que col·laboren regularment en les discussions dels diferents temes que cal tractar. La funció del panel científic d’OMG de l’EFSA és la de produir informes científics (coneguts com a opinions científiques o declaracions científiques) sobre qüestions relacionades amb els riscos associats als OMG, ja siguin plantes, animals o microorganismes. Això inclou, a més dels informes sobre el risc associat a noves sol·licituds de comercialització d’OMG ja comentats o de les guies per orientar els sol·licitants en l’anàlisi de riscos requerida per a l’aprovació, les respostes a qualsevol pregunta sobre riscos associats als OMG per part de la Comissió Europea o del Parlament Europeu. Aquests estaments poden demanar a l’EFSA d’avaluar la importància per a la seguretat alimentària de noves dades aparegudes en la literatura científica o d’avaluar el possible risc derivat de l’aparició en la cadena alimentària d’OMG no aprovats a la UE. Com comentarem en l’apartat 7, l’asincronia de les aprovacions d’OMG entre la UE i els països que exporten productes agrícoles a la UE fa que la contaminació ac-

146 J. M. CASACUBERTA

cidental per OMG aprovats a països tercers però que no estan aprovats a la UE sigui com més va més freqüent. Per altra banda, en aquests darrers anys alguns estats membre de la UE han aplicat la clàusula de salvaguarda, i en tots els casos el panel d’OMG de l’EFSA ha hagut d’avaluar, a instàncies de la Comissió Europea, si les dades científiques aportades justificaven la prohibició de comercialització. En l’apartat següent intentarem analitzar aquests processos en què la política es barreja estretament amb l’anàlisi científica. EL DIFÍCIL EQUILIBRI ENTRE LA CIÈNCIA I LA POLÍTICA Com ja hem comentat en apartats anteriors, l’estructura de l’EFSA pretén assegurar la independència de l’anàlisi científica dels riscos associats a la cadena alimentària de les decisions polítiques. Aquesta és també la base de la legislació europea en matèria d’OMG, que separa d’una manera clara i neta l’anàlisi del risc, essencialment científica i independent, de la gestió del risc, que es reparteix entre les instàncies polítiques europees i dels estats. Això no vol dir que els dos mons, científic i polític, es mantinguin totalment aïllats. Hem vist que la Comissió té representants en el Consell Assessor de l’EFSA, i que és la Comissió la que, amb les seves preguntes, dirigeix en certa manera part del treball de l’EFSA. La Comissió, a més, pot tenir observadors en les discussions dels panels científics, cosa que permet sovint aclarir aspectes legals que poden ser importants per establir el marc de les discussions científiques. També, la Comissió demana sovint assessorament a l’EFSA sobre aspectes científics que es troben sovint en la base de molts aspectes legislatius. Malgrat tot, tant l’estructura de l’EFSA com la legislació eu-

ropea pretenen assegurar una alta qualitat científica en l’anàlisi del risc i mantenir-la el més separada possible de la política. Per això els panels científics són escollits únicament sobre la base de l’excel·lència científica, i els membres dels panels ho són a títol personal i no representen ni les seves organitzacions ni els seus estats. Tot i que tots els temes que tenen a veure amb la cadena alimentària són en general delicats políticament, a Europa els OMG són un cas particularment complex. L’opinió pública europea és crítica amb els OMG i aquesta oposició és clarament majoritària en alguns països. Això explica la moratòria de facto que va afectar l’aprovació d’OMG a Europa durant diversos anys i podria també explicar el gran nombre de clàusules de salvaguarda invocades darrerament per diferents estats (set entre el juny de 2008 i el juny de 2009). Com hem explicat, la clàusula de salvaguarda és una mesura que permet als estats membre de la UE de prohibir temporalment la comercialització d’un OMG aprovat si hi ha noves dades científiques que apunten a un risc possible per a la salut humana o animal o el medi ambient al seu territori. La legislació és molt clara en la necessitat de justificar aquesta mesura aportant les noves dades científiques que apunten a un nou risc, i l’organisme responsable d’analitzar aquestes dades i emetre un informe que indiqui si, efectivament, suggereixen un nou risc, és l’EFSA. Fins ara, l’anàlisi que ha fet l’EFSA de les dades científiques aportades pels diferents estats sempre ha conclòs que en les referències aportades, o en la literatura científica disponible, no hi havia dades científiques suficients que suggerissin un possible risc associat a la comercialització de l’OMG en qüestió. En alguns casos, com ara el cas de la clàusula de salvaguarda invocada per França l’any 2008 per prohibir el cultiu del blat de moro MON 810, Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 135-150

L’AVALUACIÓ CIENTÍFICA DELS RISCOS ASSOCIATS ALS OMG A EUROPA 147

fins i tot al si de l’estat mateix, la comunitat científica i diferents estaments oficials han donat suport públicament a l’EFSA i s’han adherit a la conclusió de la falta de base científica d’aquesta mesura política. Això no obstant, moltes d’aquestes clàusules segueixen en vigor i actualment hi ha sis estats, Àustria, França, Grècia, Hongria, Alemanya i Luxemburg, que mantenen la prohibició de comercialitzar algun dels OMG aprovats a Europa. Això és així perquè els estats membre, que són els que, en el Comitè Permanent de la Cadena Alimentària i Salut Animal (SCFCAH), haurien d’obligar cada un dels estats a aixecar la prohibició de comercialitzar els OMG al seu territori, sempre han votat majoritàriament en contra de la proposta de la Comissió en aquest sentit. Així doncs, la clàusula de salvaguarda, que hauria de ser un recurs d’urgència per suspendre de manera cautelar i transitòria la comercialització d’un OMG quan noves dades científiques apunten a un possible risc sanitari o ecològic, s’ha convertit en una eina política en mans dels estats per oposar-se a les decisions de la Comissió. ELS PROBLEMES DEL SISTEMA EUROPEU I PERSPECTIVES FUTURES El problema de les clàusules de salvaguarda és, en primer lloc, un reflex de les reticències de l’opinió pública sobre aquest tema i de l’ús polític que es fa de la gestió d’un tema delicat com aquest. Però pot ser també un reflex d’un moviment més general de recuperació del poder cedit a les instàncies comunitàries per part dels estats membre de la UE. En qualsevol cas, hi ha un moviment per part d’alguns estats membre per introduir modificacions en el sistema d’avaluació i augmentar el seu poTreb. Soc. Cat. Biol., 61: 135-150

der de decisió. Aquestes modificacions poden ser des d’augmentar la implicació de les autoritats competents dels estats en l’avaluació del risc en detriment de l’EFSA, fins a deslligar les autoritzacions de cultiu de les autoritzacions d’importació, i fer que en les primeres el paper dels estats sigui més important. De fet, l’anàlisi del risc ambiental en les sol·licituds de cultiu és ja responsabilitat d’un dels estats membre i, per tant, la implicació dels estats membre en l’aprovació és ja més important. Una possibilitat seria tractar la regulació del cultiu des de la perspectiva de la gestió del risc (que és eminentment política), i no pas l’anàlisi del risc. Segons aquesta proposta, tot i haver superat una anàlisi de risc única, els estats membre podrien, basant-se en criteris socioeconòmics o polítics, gestionar l’aprovació del cultiu al seu territori. Alguns analistes pensen que una gestió més directa dels estats de les autoritzacions de cultiu podria permetre alleugerir la pressió que alguns estats imposen sobre les autoritzacions en general, i que podria agilitzar les autoritzacions d’importació d’OMG que no es cultiven (que són la immensa majoria). La lentitud del sistema d’aprovació europeu va camí de convertirse en un problema econòmic de primer ordre i és com més va més urgent trobar mesures per alleugerir el procés. Europa és fortament deficitària en proteïna vegetal per a la fabricació de pinsos i importa de països com els EUA, Argentina o el Brasil grans quantitats de soja i, en menys mesura, blat de moro, per cobrir aquestes necessitats. Aquests països han incorporat ràpidament els OMG a la seva producció i a hores d’ara la pràctica totalitat de la soja que produeixen i una bona part del blat de moro són transgènics. Mentre han estat cultivant majoritàriament OMG aprovats a Europa, no hi ha hagut problemes en la

148 J. M. CASACUBERTA

importació. Però les diferències entre els ritmes d’aprovació de noves varietats transgèniques entre la UE i els països que exporten productes agrícoles estan generant ja problemes seriosos. La UE exigeix l’etiquetatge de qualsevol producte que contingui més d’un 0,9 % de transgènic en qualsevol dels seus components, i considera com a accidental, tolerable i exempta de l’obligatorietat d’etiquetar la presència de transgènic per sota d’aquest llindar. Però això es refereix només als OMG autoritzats a la UE. No hi ha cap llindar de tolerància per a la presència accidental d’OMG no aprovats a la UE. Això implica que qualsevol importació de productes agrícoles que poguessin contenir traces d’un producte no aprovat a la UE seria il·legal, independentment de si aquest producte ha estat aprovat en el país d’origen o no. Això fa que els exportadors hagin d’extremar les precaucions per evitar la contaminació accidental dels productes que exporten a la UE amb altres OMG cultivats legalment als seus països. Com més gran sigui el nombre dels OMG només autoritzats als països exportadors, més gran serà el risc per als exportadors. Atès que la diferència entre les velocitats d’aprovació de nous OMG als dos costats de l’Atlàntic no sembla que es redueixi, aquest problema pot acabar fent que alguns productors deixin d’exportar a la UE perquè ho considerin massa arriscat. La meitat del blat de moro importat a la UE i la pràctica totalitat de la soja són transgènics. En el cas del blat de moro, la producció europea és important, però no és així en el cas de la soja, en què Europa depèn totalment de les importacions. Una possible solució a aquest problema podria ser que els països que exporten a la UE no autoritzessin cap OMG que no hagi estat aprovat a la UE. Aquesta és la política que han estat portant a terme l’Argentina i el

Brasil fins ara. El fet que la UE sigui un dels destinataris principals de la producció d’OMG d’aquests països ha fet que, en una política realista, hagin optat per aprovar només aquells OMG aprovats a la UE. En canvi, el ritme d’aprovacions als EUA no s’ha vist condicionat per les polítiques europees, probablement perquè l’exportació a la UE no té un pes gaire important en la seva política agrària. La política de restringir les aprovacions als OMG aprovats a Europa que han seguit l’Argentina i el Brasil ha permès, com dèiem, minimitzar el problema. Però l’existència de nous OMG de segona generació i amb més potencial agronòmic que esperen l’aprovació, i la irrupció de la Xina com a importador de soja com més va més important a escala mundial, podria fer canviar la política d’aquests països, amb l’aprovació de nous transgènics i la modificació de les seves prioritats d’exportació cap al país asiàtic en detriment d’Europa. El Director General d’Agricultura de la Comissió Europea va publicar un informe l’any 2007 (DG AGRI, 2007) en el qual advertia el cost econòmic per a la ramaderia europea que representaria si l’Argentina i el Brasil deixaven d’exportar a la UE soja i blat de moro. En aquest cas, l’augment de la producció pròpia de gira-sol i colza no podria compensar la pèrdua de les importacions i els efectes sobre el sector del porcí i de l’aviram seria sever, amb pèrdues de producció del 30 % i del 40 %, respectivament. També, la producció de carn de boví es veuria afectada i la UE es podria veure obligada a importar fins a tres quartes parts de la carn que es consumeix a Europa. Davant d’aquesta situació, diferents veus, que inclouen les organitzacions de la indústria agrícola europea (Europabio, 2007), han proposat que es reguli la presència adventícia d’OMG autoritzats en Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 135-150

L’AVALUACIÓ CIENTÍFICA DELS RISCOS ASSOCIATS ALS OMG A EUROPA 149

països tercers i que s’estableixi un llindar de tolerància que permeti mantenir les importacions en el futur. CONSIDERACIONS FINALS: LA IMPORTÀNCIA DE L’AVALUACIÓ CIENTÍFICA INDEPENDENT La transgènia és l’última tècnica que s’ha incorporat a la millora genètica de plantes, i ben aviat podria ser també una realitat per a la millora genètica dels animals de granja. Tot i que la millora genètica aplicada a l’agricultura té més de 10.000 anys d’història, la incorporació de la transgènia ofereix unes possibilitats d’un abast particularment important. Aquest potencial justifica que els OMG siguin objecte d’una legislació específica i que, des del primer moment, la seva comercialització estigui subjecta a anàlisis de risc prèvies. Europa s’ha dotat des de l’any 1990 d’una legislació basada en la precaució i el rigor científic en l’anàlisi del risc, una legislació que ha anat evolucionant condicionada per la particular sensibilitat dels consumidors europeus envers els OMG i la utilització política que s’ha fet d’aquestes reticències. La legislació actual assegura un alt grau de protecció de la salut humana i animal i del medi ambient, però la lentitud del procés d’aprovació d’OMG que ja estan aprovats en altres països pot acabar afectant les importacions de gra i pot generar problemes en un sector d’importància cabdal a Europa com és la ramaderia. Per altra banda, la utilització política d’aquest tema pot portar a alguns països a voler recuperar el control de les aprovacions i a posar en qüestió el sistema actual d’avaluació de riscos. Si això fos així es perdria la separació estricta entre anàlisi i gestió del risc, que és la base de la legislació actual. Lligar l’anàlisi del risc Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 135-150

al poder polític equival a reduir la independència que necessita qualsevol anàlisi científica rigorosa, i pot comportar una pèrdua de qualitat d’aquesta anàlisi. Qualsevol decisió política en temes que poden comportar riscos s’ha de basar en una anàlisi de risc fiable. Confiem que les modificacions que s’hauran d’introduir en la legislació europea no acabin afectant la qualitat de l’anàlisi de risc, que fins ara ha estat sempre incontestada per tots els estaments científics. WEBS D’INTERÈS Pàgina sobre OMG de la Direcció General de Salut i Consumidors de la UE (DG SANCO): http://ec.europa.eu/food/food/ biotechnology/index_en.htm. Pàgina d’EFSA: http://www.efsa.europa.eu. GMO-Compass: http://www.gmo-compass. org. BIBLIOGRAFIA Barton K. A.; Binns, A. B.; Matzke, A. J. M.; Chilton, M.-D. (1983). «Regeneration of intact tobacco plants containing full length copies of genetically engineered T-DNA, and transmission of T-DNA to R1 progeny». Cell, 32: 1033-1043. CE (2001). Directiva 2001/18/CE del Parlamento Europeo y del Consejo [en línia]. <http://eur-<lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=OJ:L:2001: 106:0001:0038:ES:PDF>. CE (2003a). Reglamento (CE) nº 1829/2003 del Parlamento Europeo y del Consejo [en línia]. <http:// eur-lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do? uri=OJ:L:2003:268:0001:0023:ES:PDF>. CE (2003b). Reglamento (CE) nº 1830/2003 del Parlamento Europeo y del Consejo [en línia]. <http:// eur-lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do? uri=OJ:L:2003:268:0024:0028:ES:PDF>. CEE (1990). Directiva 90/220/CEE del Consejo de 23 de abril de 1990 sobre la liberación intencional en el medio ambiente de organismos modificados genéticamente [en línia]. <http://www.belt.es/legislacion/

150 J. M. CASACUBERTA vigente/alimentaria/prot_biotecn/comunitaria/pdf /dir_90_220.pdf>. DG AGRI (2007). Economic impact of unapproved GMOs on EU feed imports and livestock production [en línia]. <http://ec.europa.eu/agriculture/envir/ gmo/economic_impactGMOs_en.pdf>. EFSA (2004). Guidance document for the risk assessment of genetically modified plants and derived food and feed by the Scientific Panel on Genetically Modified Organisms (GMO) ― including draft document updated in 2008 [en línia]. <http://www. efsa.europa.eu/EFSA/efsa_locale-1178620753812_ 1211902599947.htm>. EFSA (2006a). Guidance document for the risk assessment of genetically modified microorganisms and their derived products intended for food and feed use by the Scientific Panel on Genetically Modified Organisms (GMO) [en línia]. <http://www.efsa.europa.eu/ EFSA/efsa_locale-1178620753812_1211902600026. htm>.

EFSA (2006b). Guidance document for the renewal of authorisations of existing GMO products by the Scientific Panel on Genetically Modified Organisms (GMO) [en línia]. <http://www.efsa.europa.eu/ EFSA/efsa_locale-1178620753812_1211902599871. htm>. EFSA (2007). Guidance Document for the risk assessment of genetically modified plants containing stacked transformation events by the Scientific Panel on Genetically Modified Organisms (GMO) [en línia]. <http://www.efsa.europa.eu/EFSA/efsa_locale1178620753812_1211902599859.htm>. Europabio (2007). Economic impact of EU unapproved GMOs on Europe’s feed and livestock production – Joint Industry reference document and Questions and Answers – EuropaBio [en línia]. <http://www. eubusiness.com/Agri/europabio.07-07-19>. Herrera-Estrella, L.; Depicker, A.; Montagu, M. van; Schell, J. (1983). «Expression of chimaeric genes transferred into plant cells using a Ti-plasmid-derived vector» Nature, 303: 209-213.

Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 135-150

DOI: 10.2436/20.1501.02.99

Organismes modificats genèticament (Josep M. Casacuberta, ed.) Treballs de la SCB. Vol. 61 (2010) 151-163

QÜESTIONS ÈTIQUES PLANTEJADES PER LA MODIFICACIÓ GENÈTICA DE LES PLANTES Pere Puigdomènech Centre de Recerca en Agrigenòmica Adreça per a la correspondència: Pere Puigdomènech. Centre de Recerca en Agrigenòmica, CSIC-IRTA-UAB. C. de Jordi Girona, 18. 08034 Barcelona. Adreça electrònica: pprgmp@cid.csic.es. RESUM La modificació genètica de plantes ha estat una tecnologia desenvolupada des de 1983. Ha obert possibilitats per a una nova aproximació per a la millora de les plantes en les quals basem la nostra agricultura, però també és una polèmica complexa, sobretot a Europa. La polèmica té moltes facetes. Quan es planteja la qüestió en termes dels conflictes de valors que apareixen es poden examinar quins estan en joc. Hi ha posicions que plantegen la impossibilitat de la modificació genètica en termes de dignitat de les plantes o de la sacralitat dels genomes. Si no acceptem aquestes posicions podem considerar que cal assegurar l’accés de les poblacions a una alimentació suficient, segura i saludable, i també que les pràctiques que es desenvolupin no comprometin l’accés a uns productes de l’agricultura a les generacions futures. Les decisions semblen, per tant, difícilment generalitzables i cal, com s’ha fet arreu, analitzar cas per cas les modificacions que es presenten en termes de beneficis i riscos que presenten. I cal tractar que les regulacions que es dictin o les regles de propietat intel·lectual no acabin donant lloc a posicions monopolístiques que poden impedir que els productes derivats de les noves tecnologies arribin a la majoria de qui més els necessita. Paraules clau: modificació genètica, ètica, plantes. ETHICAL QUESTIONS IN RELATION TO THE GENETIC MODIFICATION OF PLANTS SUMMARY Genetic modification of plants is a technology that has been developed since 1983. It has opened a new possibility for plant breeding but also a complex debate, particularly in Rebut: 09/02/2010. Acceptat: 01/03/2010.

152 P. PUIGDOMÈNECH

Europe. The debate has different aspects. When the conflict is examined in terms of value conflicts it is possible to examine which ones enter into play. There are positions that propose the impossibility of genetic modification in terms of the dignity of plants of the sacrality of genomes. If we do not accept these positions we must consider that we must assure the secure access of human populations to safe and healthy food and also that the practices that are being developed do not compromise the access to food for future generations. The decisions appear difficult to be generalized and we should, as it has been done, consider case-by-case the modifications that can be proposed in terms of the risks and benefits that they may present. And we should try that the regulations that are ap proved and the rules of intellectual property do not favour monopolies that might interfere with the access to the products derived from these new technologies to the people who need them the most. Key words: genetic modification, ethics, plants. INTRODUCCIÓ La modificació genètica de les plantes ha alterat de manera sensible molts aspectes de la recerca que es fa en els sistemes vegetals, des de la biologia molecular fins a la millora genètica de plantes, però ha tingut efectes importants també sobre la indústria de llavors, sobre algunes pràctiques agrícoles i fins i tot sobre l’estructura social d’alguns països. I ha introduït consideracions que fins ara no apareixien tant en la recerca sobre els sistemes vegetals com en la pràctica de l’agricultura. Per exemple, qüestions com la seguretat alimentària del producte agrícola, la coexistència de conreus o les patents de plantes són temes nous per a la majoria dels actors en els sectors de la producció agrícola, i l’aparició de la modificació genètica els ha posat sobre la taula o n’ha accelerat el procés. Si volem complicar encara més la situació podem parlar de qüestions ètiques. I hi ha gent que es pregunta què té a veure la reflexió ètica en una de les activitats més tradicionals de les societats humanes com és l’agricultura, que s’ha anat desenvolupant durant segles sense necessitat de grans reflexions filosòfiques. Però en el món complex dels inicis del segle xxi en què ens

plantegem els aspectes ètics de la medicina però també dels negocis, de la política o de l’esport, l’agricultura no podia escapar d’aquestes reflexions, i hi ha diferents raons per explicar aquesta situació. L’any 1983 es van publicar els primers articles (Barton et al., 1983; Herrera-Estrella et al., 1983) en dues de les revistes científiques de més impacte que demostraven que es podrien introduir en cèl·lules vegetals gens, que prèviament havien estat aïllats de dos tipus de bacteris, mitjançant els mètodes del DNA recombinant. Per aconseguir-ho havien desenvolupat tècniques que permetien fer servir les propietats de bacteris patògens de plantes del gènere Agrobacterium. Aquests bacteris, durant el procés d’infecció de plantes ferides, introdueixen fragments de DNA en les plantes per aprofitar els metabòlits que es produeixen per l’alteració del metabolisme i el desenvolupament de la planta. S’aplicaven també tècniques que permeten regenerar les plantes a partir de cultius in vitro que havien estat desenvolupades durant els trenta anys anteriors, i les metodologies del DNA recombinant, que permeten aïllar els gens que introduïm i modificar-los en el laboratori amb elements de control propis de plantes. D’aquesta manera la planta Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 151-163

QÜESTIONS ÈTIQUES PLANTEJADES PER LA MODIFICACIÓ GENÈTICA DE LES PLANTES 153

adquiria en el seu genoma una nova seqüència de DNA que els mecanismes d’expressió gènica de la planta reconeixien com un gen propi. Un cop incorporat el nou gen, es transmet a la descendència seguint les lleis de Mendel, com qualsevol altre gen. La importància de la descoberta no va escapar a ningú. L’any següent l’Acadèmia Nacional de Ciències dels Estats Units va publicar un informe (National Research Council, 1984) en el qual s’analitzaven les oportunitats obertes per aquesta nova tecnologia per a l’agricultura. Per a aquells que buscaven plantes amb característiques importants per conrear-les, com resistències a malalties, s’obria una via nova per aconseguir-ho i la imaginació de molts es desencadenava en projectes futuristes en els quals les plantes produïen tota mena de substàncies i s’adaptaven a nous entorns. Però en el mateix informe es cridava ja l’atenció sobre la necessitat de definir un marc de regulacions en el qual es desenvolupessin les aplicacions de la modificació genètica de plantes per aconseguir que la utilització es fes sense riscos innecessaris. Cal remarcar que aquest informe es publicava l’any 1984, deu anys abans que la primera planta transgènica fos comercialitzada. EL DNA RECOMBINANT. REGULACIONS DE LA BIOTECNOLOGIA No era el primer cop que aquest tipus de reflexió es feia en la biologia moderna. En els anys setanta l’aparició de les tècniques del DNA recombinant va obrir un nou món per a l’anàlisi de les bases moleculars dels éssers vius. Aquestes perspectives han estat àmpliament confirmades i potser superades pels resultats obtinguts. L’allau Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 151-163

d’informació que hem anat acumulant els darrers trenta anys sobre el funcionament de la cèl·lula biològica, sobre la fisiologia i el desenvolupament dels organismes i sobre la seva evolució, han donat lloc a una nova biologia d’una profunditat i riquesa de conceptes extraordinàries. Al mateix temps s’obrien unes possibilitats interessants d’aplicacions per al diagnòstic i per a la producció de substàncies d’interès terapèutic. Una conseqüència d’aquestes aplicacions va ser la formulació de patents de les tècniques que s’havien desenvolupat i la fundació d’un nou tipus de companyies biotecnològiques que havien de comercialitzar els productes derivats d’aquestes tècniques, algunes de les quals han tingut un èxit considerable. Però al mateix temps apareixia una nova preocupació sobre les condicions en les quals aquestes tecnologies es podrien desenvolupar de manera segura. La famosa Conferència d’Asilomar, un centre de reunions de la costa de Califòrnia, de l’any 1975, n’és la demostració més clara. En aquesta conferència es van debatre possibles conseqüències sobre la salut que es podrien produir per la proliferació d’activitats basades en el DNA recombinant. I es van proposar unes regles de conducta per minimitzar els possibles riscos. Als Estats Units es va considerar aprovar lleis que regulessin l’ús d’aquestes tècniques. Fins i tot algunes ciutats, com Cambridge, a Massachusetts, on hi ha la seu de la Universitat de Harvard i el Massachusetts Institute of Technology (MIT), van aprovar la prohibició que es fessin experiments amb DNA recombinant al seu territori. Finalment no va caldre cap legislació específica sobre el tema, es van retirar les prohibicions i es va demostrar que els possibles riscos d’aquestes tècniques eren baixos i podien ser controlats seguint regles senzilles de treball en el laboratori que s’han continuat seguint des d’aleshores.

154 P. PUIGDOMÈNECH

Actualment, i de manera progressiva, la recerca, sobretot en biologia, s’està fent en un marc molt regulat en diferents aspectes. El cas més clàssic és el de les normes per fer experiments amb mostres o individus humans. A partir de la Segona Guerra Mundial i després dels horrors d’aquells que van utilitzar els camps de concentració per dur a terme experiments amb presoners, diferents convencions internacionals han posats les bases dels criteris sense els quals és impossible fer experiments amb humans. Algunes d’aquestes convencions, com la de Hèlsinki de l’Associació Mèdica Internacional, són codis de conducta als quals s’adhereixen els metges i laboratoris, però en altres casos hi ha legislacions amb conseqüències penals, com passa a Europa. De manera semblant, s’han establert les condicions en què es poden dur a terme experimentacions amb animals, un tema que en certs països europeus, però també a l’Índia, provoca una sensibilitat especial. S’han dictat legislacions per reduir-ne l’ús, limitar el sofriment al màxim possible i tractar de trobar mètodes alternatius per a l’experimentació quan sigui possible. Això no vol pas dir que l’oposició a aquest tipus de recerca per part de certs grups d’activistes hagi disminuït. També s’han aprovat normatives europees que tracten d’evitar que l’ús d’organismes modificats genèticament, fins i tot en els laboratoris, pugui acabar produint algun problema a la salut humana o animal o al medi ambient. I sens dubte hi ha també regulacions de prevenció de riscos laborals en els laboratoris o de transport de productes de recerca, com patògens, per exemple, que podrien causar algun problema a la salut o al medi ambient. Aquestes consideracions estan ben establertes i han de ser seguides en els laboratoris dels països on es fa ciència de manera significativa. En el cas de la recerca en plantes són apli-

cables les regulacions entorn de les modificacions genètiques però també una diversitat de convencions internacionals que tracten d’evitar l’extensió de malalties, l’aparició d’espècies invasores o l’apropiació d’espècies, varietats o característiques genètiques pròpies d’un país determinat. Complir aquest conjunt de condicions legislatives és un primer requisit ètic per a la recerca i acaba tenint influència en la pràctica de l’agricultura. En el cas de les plantes modificades genèticament l’any 1986 es va dictar als Estats Units el que s’anomenava un marc regulatori coordinat per a l’ús de la biotecnologia, en el qual es tractava d’evitar que les aplicacions de la biotecnologia vegetal poguessin produir problemes a la salut o al medi ambient, i s’encarregava a diverses agències federals (Food and Drug Administration, Environmental Protection Agency i United States Department of Agriculture) que tinguessin una acció coordinada de control d’aquestes aplicacions. A Europa es va aprovar l’any 1990 una Directiva 90/220 (CEE, 1990) que tenia la mateixa finalitat. A Europa la directiva preveu que no es faci una alliberació al medi ambient ni es comercialitzi una planta (o qualsevol altre organisme) modificada genèticament que no hagi estat aprovada i amb una anàlisi científica cas per cas dels possibles riscos que es presentin, que permeti d’assegurar que no hi hagi indicis d’efectes negatius sobre la salut humana o animal o sobre el medi ambient. Aquestes regulacions han estat modificades en diferents períodes, i normes semblants han estat implantades en diferents països del món. A Europa hi ha actualment dues normatives (CE, 2001; CE, 2003a, 2003b) que regulen aquest tema. Per tant, és possible afirmar que als diferents països del món les aplicacions de les plantes modificades genèticament s’ha fet en el marc d’unes regles estrictes que han Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 151-163

QÜESTIONS ÈTIQUES PLANTEJADES PER LA MODIFICACIÓ GENÈTICA DE LES PLANTES 155

tractat d’aprofitar-ne els beneficis minimitzant els possibles efectes negatius que en pugui presentar l’ús. UN ENTORN COMPLEX A L’INICI DEL SEGLE XXI Però l’entorn en el qual es du a terme el conreu de les varietats i espècies utilitzades en l’agricultura planteja en aquest inici del segle xxi un conjunt de qüestions complexes que cal plantejar i que fan necessària una reflexió dels conflictes que es presenten. Nosaltres cultivem plantes per a un conjunt de finalitats que són essencials per a la nostra societat. És evident que practiquem l’agricultura per produir aliments i és aquesta la seva principal funció, com la de la ramaderia i la pesca, però no tan sols aquesta. La producció agrícola ens proporciona aliments, pinsos per alimentar els nostres animals que fem servir en la ramaderia, fibres diverses, i en el passat, però també de manera creixent actualment, combustibles per a la calefacció i per al transport. I a més produïm materials de construcció, medicaments o cosmètics, entre altres. Al principi del segle xxi la demanda de productes agrícoles, vista la diversitat de productes que obtenim, està en un pendent creixent des de fa temps. Un dels factors més importants és el creixement de la població humana, que continua augmentant i que potser arribarà als 9.000 milions d’habitants el 2050 i s’estabilitzarà després. Aquesta població és creixentment exigent en la qualitat dels aliments que demanda (per exemple, països emergents com la Xina tenen un consum de carn que s’ha multiplicat per tres en els darrers quinze anys en el cas del boví). I en tots els països hi ha una exigència de seguretat en els aliments que es comercialitzen. Al mateix temps Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 151-163

som com més va més conscients que la qualitat i la diversitat dels nostres aliments és un requisit essencial per a la nostra salut. La demanda per una alimentació suficient, segura i saludable és creixent al nostre món. En una reunió recent d’alt nivell de la FAO (Organització per a l’Alimentació i l’Agricultura, 2008) es preveia que la producció d’aliments ha de créixer un 70 % en els propers vint anys si es vol respondre aquesta demanda i resoldre els problemes de fam que hi ha al món. Mentrestant, els consumidors d’aliments anem allunyantnos com més va més dels llocs de producció, amb la conseqüència de la creació d’una llarga cadena de transport, conservació, distribució i transformació dels aliments. I cal recordar que, per a una enorme minoria dels habitants del planeta, accedir als mínims d’aliments necessaris per a una vida digna no és encara possible. Per tant, assegurar un nivell suficient de producció agrícola és un requisit fonamental en el nostre món que podem plantejar en termes d’exigència ètica per a la nostra societat en termes globals. També, sabem que les pràctiques agrícoles actuals utilitzades arreu del món estan tenint en conjunt un gran impacte sobre el medi ambient per raons diferents. I aquest impacte ens fa preguntar si podrem mantenir l’actual nivell de producció agrícola durant molt de temps. Si això no fos possible podria tenir la conseqüència que les generacions que vénen després de nosaltres no puguin assolir els nivells de producció que necessitaran per tenir un accés als aliments que els permeti desenvolupar una vida semblant a la nostra. Sabem que l’agricultura en si mateixa, pel fet de substituir sistemes complexos de plantes i animals per sistemes molt més simples d’espècies cultivades, és una de les causes importants del canvi climàtic. Posar en conreu terres salvatges ha estat la pràctica usual durant se-

156 P. PUIGDOMÈNECH

gles quan hi havia una demanda de productes agrícoles, i això ha estat passant també els darrers anys, sobretot a les zones tropicals del nostre planeta. I per tenir conreus productius hem de fer servir diversos productes que permeten el bon creixement de les plantes, com els adobs, o que les protegeixen de malalties, com insecticides o fungicides, o de competidors, com els herbicides. Segons quins d’aquests productes fem servir i com els fem servir l’impacte en el medi ambient, en la terra i les aigües pot ser important i en alguns casos irreversible. I si fos així les possibilitats que en el futur es donin nivells de producció semblants disminuirien. En aquest cas estaríem donant lloc a un cas d’injustícia envers els nostres descendents que planteja també un conflicte de base ètica. VALORS EN JOC Quan intentem reflexionar sobre quines són les bases per poder prendre decisions en temes que tenen a veure amb criteris ètics podem començar considerant si hi ha valors que estan en joc i que poden estar en conflicte. És clar que en l’origen de l’agricultura hi ha la necessitat de produir aliments d’una manera continuada. La transició d’una societat de caçadors i recollectors a una societat d’agricultors va ser complexa i conflictiva. El canvi es va estendre durant mil·lennis, però ara podem dir que ha acabat triomfant arreu del món de manera gairebé absoluta. Actualment la producció d’aliments als països desenvolupats és una activitat industrialitzada que pot fer que un 2 % de la població produeixi aliments suficients per al 98 % restant. Per tant, la societat ha de prendre decisions sobre com s’organitza amb vista a assegurar uns nivells suficients de producció perquè l’accés a aliments suficients ha estat recone-

gut com un dels drets fonamentals dels humans en diferents documents i convencions internacionals. Per tant, en les accions que es duguin a terme per actuar sobre l’agricultura, la priorització de la producció d’aliments suficients per a tota la humanitat hauria de ser el valor principal. I sabem que aquest és un objectiu que no hem assolit fins ara. L’any 1999 es van definir uns objectius a escala internacional per disminuir la fam al món, els anomenats Objectius del Mil·lenni (Assemblea General de les Nacions Unides, 2000). Durant uns anys, en termes absoluts el nombre de persones sense un accés adequat al menjar havia anat disminuint, però l’any 2009, amb la crisi econòmica global en marxa, aquests objectius s’allunyen i, per tant, la necessitat de recordar aquesta prioritat és encara més urgent. En aquest sentit una producció d’aliments suficients és un requisit de justícia distributiva en la nostra societat en la qual els desequilibris són tan acusats i ho són també en la producció d’aliments. Però els nostres aliments han de tenir a més una característica important: han de ser segurs. Pel mateix fet que els aliments s’incorporen a la nostra fisiologia, poden contenir components nocius que de vegades són difícils d’identificar. Per a l’espècie humana, que és omnívora, pot ser difícil identificar els aliments que són convenients per a la seva alimentació. Aquesta dificultat pot haver estat augmentada per la distància creixent entre el productor i el consumidor d’aliments, fet que pot permetre que s’introdueixin substàncies indesitjades en els aliments de manera accidental o fraudulenta. La seguretat alimentària s’ha convertit durant el segle xx en una de les funcions dels estats moderns i un altre dels requisits ètics a l’hora de prendre decisions en agricultura, perquè no cal tan sols un accés suficient als aliments sinó també que siguin segurs. Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 151-163

QÜESTIONS ÈTIQUES PLANTEJADES PER LA MODIFICACIÓ GENÈTICA DE LES PLANTES 157

En aquests moments sabem també que una alimentació adequada és un requisit indispensable per a una salut correcta. I també anem tenint de manera progressiva un coneixement sobre què és allò que individualment necessitem per a una salut correcta. Tenim en aquests moments informacions parcials sobre condicions individuals de les nostres reaccions enfront dels aliments, com és el cas de la condició celíaca o de les al·lèrgies alimentàries, però de manera generalitzada no tenim encara la informació, essencialment de base genètica, que ens haurà de permetre que l’alimentació sigui un factor de salut que permeti una vida més perllongada i saludable. Per tant, la producció d’aliments suficients, segurs i saludables és un dels requisits ètics a l’hora de protegir un dels valors essencials humans com és el dret a una vida digna. En aquest sentit els principis de no produir perjudicis als altres juntament amb els de justícia ens porten a creure que en les discussions a escala social, i fins i tot a escala internacional, calgui insistir que hagin de prevaldre els principis sobre els quals diem que fonamentem la nostra societat. Actualment, les discussions internacionals sobre comerç tenen en l’agricultura el seu punt més difícil. Els països desenvolupats tenen polítiques pròpies de protecció de la seva producció agrícola i això implica unes subvencions que impedeixen l’entrada a productes d’altres països i augmenten els preus internacionals. Al mateix temps els productes primaris per a l’alimentació són objecte de moviments de mercat que en modifiquen el preu i que poden donar lloc a grans moviments especulatius. Aquests fets poden acabar tenint un efecte important en els preus i, per tant, en l’accés als aliments per part de poblacions de baix nivell adquisitiu. La introducció d’elements de justícia en aquestes discussions ha estat reclamada des de diferents veus. Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 151-163

I ja hem dit que l’impacte que té l’agricultura sobre el medi ambient pot acabar impedint que la producció d’aliments es mantingui en el futur. La demanda de pràctiques sostenibles és també un requisit ètic. I això inclou la protecció dels sòls i les aigües, limitar la desforestació, reduir totes aquelles pràctiques agrícoles que tenen impacte en els factors de canvi climàtic, però també de conservació de la diversitat biològica. Aquesta diversitat té importància en diferents aspectes. D’una banda, la conversió de sòl silvestre en sòl agrícola redueix per definició la diversitat de les espècies que viuen en un entorn determinat, i això, portat a un nivell ampli, implica la desaparició d’espècies, un efecte que empobreix la variabilitat existent al nostre planeta. Però d’altra banda hi ha una tendència, amplificada per l’aparició de grans indústries de llavors, a proposar al pagès un nombre reduït de varietats de les grans espècies agrícoles, que són aquelles més reclamades pel mercat i més productives. Aquesta tendència pot estar donant lloc a una reducció de la variabilitat genètica disponible per a les espècies vegetals en les quals basem la nostra alimentació. I sense variabilitat genètica no hi ha possibilitat de millora, que és essencial per afrontar reptes de malalties o canvis climàtics. Per aquesta raó s’han donat en el món diferents tipus d’iniciatives de creació de bancs de llavors de les principals espècies, amb una xarxa de centres a escala mundial com el Centro Internacional del Maíz y el Trigo (CIMMYT) a Mèxic, el Centro Internacional de la Papa (CIP) a Lima, o l’International Rice Institute (IRI) a les Filipines, entre altres, on es conserven, es propaguen i distribueixen milers de llavors. El cas més extrem és l’obertura del que es coneix com «la Volta de la Fi del Món» a les illes Svalbald, on s’ha construït una gran cova subterrània a baixa temperatura en la qual es

158 P. PUIGDOMÈNECH

guarden les llavors amb propietats més interessants de les principals espècies que utilitzem en agricultura, perquè sobrevisquin fins i tot a una possible guerra nuclear. En aquest mateix context es presenta la qüestió de la propietat intel·lectual de les varietats que es desenvolupen. Ja al final del segle xix la consciència de la importància d’obtenir varietats vegetals més productives va fer que, sobretot als Estats Units, es dictessin normes de protecció en favor d’aquell qui fa l’esforç d’obtenir una nova varietat vegetal. Aquest moviment va dur a l’adopció d’una convenció internacional, l’anomenada Convenció UPOV, que protegeix els drets de l’obtentor de varietats vegetals però deixa una gran llibertat al pagès i al futur obtentor per utilitzar les varietats protegides. Aquesta convenció ha tingut diferents versions que els diferents països han anat ratificant de manera irregular. Sobre la protecció definida pel sistema UPOV s’afegeix des de fa poc temps l’aprovació de patents de varietats i de gens vegetals seguint l’evolució de les patents biotecnològiques. Aquest tipus de protecció és molt més estricta i limita les possibilitats de millores posteriors basades en les varietats patentades per altres investigadors. Actualment assistim a una forta discussió sobre els límits que pot tenir el dret de patents, sobretot en una matèria de la qual depèn l’alimentació humana. Les patents es poden fer servir per estimular la innovació i la publicitat dels avenços tecnològics però de vegades també de manera defensiva per evitar que un altre inverteixi en alguna nova tecnologia. La manera com equilibrem els drets dels diferents actors que intervenen en la recerca de noves varietats i en la seva comercialització i ús hauria de tenir en compte els seus efectes sobre els drets d’accés a l’alimentació que hem estat discutint.

Però hi ha també persones que han posat la qüestió de la legitimitat mateixa de la modificació de plantes. Hi ha hagut posicions (Federal Ethics Comittee on Non-Human Biotechnology, 2008) en les quals es proposa que es defineixi per a les plantes un estatus de dignitat que implicaria considerar si tenim dret a utilitzar-les de certes maneres en les quals podríem tenir en compte que aquesta dignitat es vulnera. Certament, hi ha modificacions genètiques fetes amb els sistemes tradicionals o els basats en tècniques moleculars en les quals alguns dels símptomes de la producció d’estrès en plantes estan activats de manera permanent. O hi ha posicions per a les quals les espècies són objectes de la creació divina o resultats de l’evolució, i l’espècie humana no hauria de tenir dret a violar el seu genoma. Aquestes posicions són minoritàries, però no ho són tant posicions, sobretot expressades per grups activistes de caràcter ecologista, per als quals l’única alternativa per a la producció agrícola és el conjunt de pràctiques que s’acullen entorn de l’agricultura ecològica i els estils de vida diferents d’aquells als quals ens ha portat la societat industrial. El conflicte creat per aquestes posicions és sense dubte el que ha donat lloc a una literatura més extensa. LA MODIFICACIÓ GENÈTICA DE LES PLANTES EN L’ENTORN ACTUAL En l’entorn que hem descrit l’aparició de les plantes transgèniques cultivades de manera massiva arreu del món ha donat lloc a un dels casos més discutits d’introducció d’una nova tecnologia. El nivell de conflicte que s’ha produït ha estat una sorpresa per a molts. La modificació genètica de les plantes amb les tècniques de la biologia molecular es troba en la línia dels esTreb. Soc. Cat. Biol., 61: 151-163

QÜESTIONS ÈTIQUES PLANTEJADES PER LA MODIFICACIÓ GENÈTICA DE LES PLANTES 159

forços per tenir les millors característiques genètiques possibles en les plantes que cultivem. La millora genètica ha estat una disciplina desenvolupada durant el segle xx i que, al costat de moltes pràctiques agronòmiques diferents, ha aconseguit uns nivells de producció d’aliments que han contrarestat el ràpid augment de la població humana total. Per això la introducció de caràcters d’interès agronòmic com resistències a malalties, a insectes o toleràncies a herbicides, semblaven ben clarament en la línia dels esforços fets en el passat. I a això cal afegir les regulacions establertes als Estats Units, Europa i altres països, molt abans que aquestes plantes fossin utilitzades al camp, que havien de permetre evitar que es desenvolupessin varietats que poguessin ser problemàtiques per a la salut o el medi ambient. Però per diferents circumstàncies socials, polítiques i fins i tot comercials, l’oposició a aquestes plantes ha aparegut i s’ha mantingut amb gran intensitat, sobretot a Europa. Aquest conflicte ha donat lloc a múltiples reflexions sobre el tema des de diferents angles, incloent el de l’ètica (Nuffield Council of Bioethics, 1999; Organització per a l’Alimentació i l’Agricultura, 2001). D’una banda podem considerar les plantes OMG com una tecnologia més de les que es fan servir en agricultura, i des d’aquest punt de vista caldria aplicar les reflexions fetes en els paràgrafs anteriors. En aquest sentit caldria preguntar-nos si introduir-les afavoreix una producció més eficient de les plantes que cultivem, si són segures i permeten tenir aliments saludables. I després caldria que ens preguntem si introduir-les dóna lloc a una agricultura amb menys impacte per al medi ambient. La resposta d’entrada és que no es pot generalitzar perquè per a cada espècie i per a cada modificació genètica el tipus de resposta pot ser diferent. Aquesta conclusió ja Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 151-163

apareix en les regulacions existents, en les quals es preveu que l’anàlisi dels efectes dels OMG es faci cas per cas. I es preveu una anàlisi del risc per prendre una decisió, i aquest tipus d’aproximació ja ens dóna elements de decisió, que han estat discutits a bastament. Les regulacions existents per al control dels OMG preveuen una anàlisi del risc però no un estudi de risc enfront de benefici. I des del punt de vista ètic ens podem preguntar si es té en compte el risc que es planteja per actuar i també el risc de no actuar. En termes generals ja hi ha veus que prevenen del risc que podem estar corrent si no ens posem a invertir en millora de plantes en general (European Plant Science Organization, 2005; The Royal Society, 2009) per enfrontar-nos als reptes que podem preveure que tindrem en el futur proper; la introducció dels OMG podria ser un cas particular. Per dir-ho de manera resumida, és possible que la modificació genètica de plantes no doni la resposta a tots els problemes que planteja la producció d’aliments i altres productes en el futur proper, però també és possible que no aprofitar les possibilitats que ofereix sigui un error, sobretot si tenim un marc regulador que ens pot permetre minimitzar els riscos. Un altre aspecte que ha donat lloc a discussions té a veure amb l’aparició de monocultius. Algunes de les modificacions genètiques desenvolupades han donat resposta a la demanda d’un producte determinat, per exemple blat de moro o soja per a pinsos o producció d’oli. Això ha fet que s’hagin plantat grans extensions d’alguns d’aquests conreus. És el cas, per exemple, de la soja resistent a herbicides a l’Argentina o al Brasil. El seu èxit ha donat lloc a un gran monocultiu que ha estat certament un factor de creixement econòmic d’aquests països, però que planteja preguntes de tipus ecològic i social. Per exemple, l’ús

160 P. PUIGDOMÈNECH

massiu d’herbicides o de plantes resistents a insectes pot donar lloc a l’aparició de plantes resistents als herbicides més utilitzats o d’insectes resistents a les proteïnes insecticides. Si això es dóna podria impedir l’ús d’aquests herbicides o insecticides en el futur. L’aparició de grans superfícies de monocultius, d’altra banda, pot acabar creant problemes a les poblacions que estaven vivint d’un altre tipus d’agricultura. Es pot dir que aquests no són problemes específics de les plantes modificades genèticament, i que són efectivament els mateixos problemes que es produeixen en altres tipus de conreus, però la soja, el blat de moro o el cotó OMG ha donat lloc a aquest tipus de conflictes en algun lloc del món i han posat sobre la taula la legitimitat d’alguns dels seus usos. Es tracta, com es pot veure, d’un conflicte de tipus social i de base ètica que cal considerar. Però també hi ha altres aspectes socials que cal tenir en compte. Per exemple, és un fet que la percepció social a Europa és negativa pel que fa a les plantes modificades genèticament. Per raons diferents que poden anar des del concepte de la sacralitat de la vida fins a temors de seguretat, del temor enfront d’un control de l’alimentació per part de les empreses multinacionals a preocupacions per la biodiversitat, el cert és que una majoria d’europeus és reticent al conreu i consum d’OMG. Hi ha, sens dubte, grans diferències entre països, i sembla que aquesta percepció negativa va canviant. Els més oposats a aquests cultius han estat fins ara Grècia i Àustria, mentre que els països nòrdics, Holanda, Anglaterra o Espanya no tenen una majoria de la població oposada a utilitzar-los. Però a tots els països europeus hi ha grans majories a favor que els productes d’alimentació continguin en la informació que es transmet al consumidor la presència de derivats d’OMG. Per aquesta raó hi ha a Europa

una normativa d’etiquetatge de tots els productes alimentaris en què hi hagi un component que contingui més d’un 0,9 % procedent d’un OMG. Es considera la resposta de la Unió Europea a l’expressió del dret a escollir el que es vol menjar reconegut al consumidor europeu. Una altra qüestió que està present en les discussions sobre OMG és el paper de les indústries. L’existència d’empreses que proporcionen llavors als pagesos és un fet des del segle xviii. Amb la introducció de llavors híbrides i certificades al segle passat el paper de les empreses de llavors i dels planters s’ha incrementat notablement. En particular, les llavors híbrides no permeten al pagès produir ell mateix una llavor idèntica a la que va comprar. De fet, al final del segle xx han entrat amb força en el negoci de les llavors empreses que procedeixen del sector químic i han acabat format un petit grup de multinacionals amb gran presència en la producció de llavors de gran conreu. Aquest fet ha tingut diversos efectes. Un és que la millora de plantes per a les espècies més importants ha passat en la seva majoria de ser una activitat pública a esdevenir una activitat industrial. Això ha donat lloc fins i tot en alguns països a la desaparició dels grups universitaris de recerca en aquest camp. Aquesta evolució, que s’ha donat ja fa temps en altres camps, s’ha accelerat amb l’aparició dels OMG. L’empobriment de la recerca universitària en millora de plantes pot impedir atacar problemes diferents dels que interessen a les grans companyies i donar lloc a una manca de criteri públic a l’hora de prendre decisions en un tema cabdal. Les plantes modificades genèticament han acabat necessitant grans inversions per al seu desenvolupament, sobretot a causa del cost necessari per a l’aprovació. Es tracta de xifres de vora quinze o vint milions d’euros per cada modificació genètica. I Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 151-163

QÜESTIONS ÈTIQUES PLANTEJADES PER LA MODIFICACIÓ GENÈTICA DE LES PLANTES 161

també calen experiments de camp que s’estenen durant anys. Per tant, aquestes inversions només tenen sentit en plantes de gran conreu en les quals es poden obtenir beneficis que compensin les inversions, i només les poden fer les grans companyies. Però al mateix temps aquestes plantes donen a les companyies que les produeixen un valor afegit de gran importància que els dóna un avantatge competitiu sobre la resta. Aquests fets han donat lloc a una gran concentració de les empreses de llavors en un grapat de noms. I la concentració en poques mans d’un producte essencial per a l’alimentació com són les llavors planteja per a alguns el risc que el desenvolupament de les llavors només afavoreixi aquelles que tenen interès en termes econòmics i, per tant, per a les agricultures més poderoses dels països desenvolupats. CONCLUSIONS Sovint la introducció de noves idees científiques i de noves tecnologies ha donat lloc històricament a conflictes de diferent tipus, que poden tenir bases ideològiques, filosòfiques o religioses molt diverses i que poden expressar un malestar social més o menys profund. Les noves idees de la ciència sovint han fet trontollar creences que estaven ben establertes i han provocat conflictes de vegades sagnants. Les noves tecnologies sacsegen interessos creats que poden afectar les estructures socials i impliquen canviar costums sovint arrelats i prendre decisions sobre com es fan servir sovint en un entorn d’incertesa. Des que hi ha història sabem que hi havia autors que defensaven que qualsevol temps passat era millor quan hi havia innovacions que arribaven per destorbar la vida tranquil·la en la qual vivíem. El que passa més sovint és que les novetats s’acaben integrant en la Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 151-163

societat i passat el temps esdevenen tradicions, o que les idees fan part de la base comuna de coneixements de la societat. Avui ningú no s’oposa a l’augment de la velocitat dels trens en termes de perillositat per a la vida de la gent i la majoria està convençuda que la Terra fa voltes al voltant del Sol, encara que, sorprenentment, una minoria significativa resisteix. També passa que la societat mantingui de manera indefinida una forta reacció contra alguna aplicació tecnològica. Potser l’exemple més evident i comprensible és el rebuig de l’armament nuclear. De tot això hi ha hagut en els conflictes plantejats entorn de la introducció de les plantes modificades genèticament. Les plantes transgèniques van començar a ser introduïdes en el mercat l’any 1994 sense una oposició destacable. Per diferents circumstàncies, que la història s’encarregarà d’analitzar en detall, entorn de l’any 2000 el conflicte entre els seus partidaris i els seus detractors estava encès i, amb daltabaixos, ha estat viu des d’aleshores. L’aparició d’aquestes plantes ha tingut efectes profunds en algunes agricultures com les d’Amèrica Llatina i, probablement, en tindran a l’Àsia. També han provocat canvis importants en l’estructura de les grans empreses de llavors del món i han posat sobre la taula un tipus de debat al qual no estàvem acostumats ni els que treballem en biologia molecular ni els pagesos acostumats a fer servir els materials més eficaços possibles als seus camps. I el debat ha estimulat que es posin sobre la taula consideracions de tipus ètic per tractar d’analitzar el conflicte. Ja hem vist que es poden posar sobre la taula diferents criteris de tipus filosòfic per abordar la qüestió, que van des de considerar la dignitat de les plantes fins al nostre dret d’actuar sobre la natura. Un darrer informe del Grup Europeu d’Ètica de les

162 P. PUIGDOMÈNECH

Ciències i les Noves Tecnologies de la Comissió Europea (European Group of Ethics on Sciences and New Technologies, 2008) s’ocupava d’aquest tema. En l’informe no es considerava que el debat purament filosòfic ajudés a arribar a les conclusions pràctiques que serien desitjables, perquè les arrels filosòfiques d’una anàlisi no han de ser necessàriament decisives a l’hora de prendre una decisió de tipus pragmàtic. En una anàlisi dels valors que cal defensar s’arribava a la conclusió descrita abans que qualsevol nova tecnologia que es vulgui fer servir en agricultura hauria d’estar dirigida a aconseguir una producció d’aliments suficients per a tothom, segurs i saludables, i a fer que aquesta producció sigui sostenible. Hi ha hagut estudis (Organització Mundial de la Salut, 2000; Brooks i Barfoot, 2006) per tractar de concloure si els procediments actuals eren adequats per assegurar la manca d’efectes dels OMG per a la salut i el medi ambient, i han conclòs que són àmpliament suficients. Caldria potser veure si el seu caràcter exhaustiu no està, de fet, impedint que les noves tecnologies es puguin fer servir en algunes aplicacions en les quals podrien ser emprades i solucionar problemes amb què es troben els pagesos. En aquest sentit una anàlisi de la balança entre risc i benefici seria sovint apropiada i podria ser èticament reprovable que certes aplicacions de la modificació genètica de plantes hagin estat retardades per raons essencialment ideològiques, quan podrien estar resolent problemes de salut. També recorda l’opinió de l’EGE que hem de prioritzar tot allò que permeti reduir la divisió escandalosa entre un món que malbarata una part important dels seus aliments i l’altra part, que no hi té accés suficient. I cal analitzar les tendències actuals de concentració industrial, reducció de la despesa en recerca pública i un ús probablement excessiu del dret de patents

per tractar que es prenguin mesures que impedeixin que un element essencial de la nostra cadena de producció de llavors estigui controlat per un nombre reduït d’empreses. L’ús de tecnologies potents i complexes necessita una reflexió profunda per tractar de copsar-ne la complexitat i prendre aquelles decisions que ens permetin de treure’n el màxim de beneficis. El fet és, però, que en un món globalitzat en el qual la complexitat és la regla, sovint molts escoltem només les receptes més senzilles proclamades amb els mitjans més potents. En una societat democràtica estem convençuts que la reflexió del conjunt de les qüestions en joc i l’examen de les millors dades disponibles ha d’acabar prevalent. En aquest cas l’anàlisi cas per cas dels beneficis i dels riscos que plantegen aquestes noves tecnologies sembla que és la via necessària per utilitzar-les. L’agricultura és la base de l’alimentació de les nostres poblacions i un factor essencial per a l’equilibri ecològic i social del planeta. Les tecnologies que desenvolupem en el present i el futur han de ser utilitzades per aprofitar els beneficis que produeixen, per minimitzar els riscos, i perquè serveixin per a la majoria dels habitants del planeta actualment i en el futur. BIBLIOGRAFIA Assemblea General de les Nacions Unides (2000). United Nations Millenium Declaration [en línia]. <http://www.un.org/millennium/declaration/ares552e.pdf> Barton, K. A.; Binns, A. N.; Matzke, A. J.; Chilton, M. D. (1983). «Regeneration of intect tobacco plants containing full length copies of genetically engineered T-DNA and transmission of T-DNA to R1 progeny». Cell, 32: 1033-1043. Brooks, G.; Barfoot, P. (2006). GM-Crops, the first ten years. Global Socio-Economic and Environmental impact. Nova York: ISAA. Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 151-163

QÜESTIONS ÈTIQUES PLANTEJADES PER LA MODIFICACIÓ GENÈTICA DE LES PLANTES 163 CE (2001). Directiva 2001/18/CE del Parlamento Europeo y del Consejo [en línia]. <http://eur-lex. europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=OJ:L: 2001:106:0001:0038:ES:PDF>. CE (2003a). Reglamento (CE) nº 1829/2003 del Parlamento Europeo y del Consejo [en línia]. <http:// eur-lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do? uri=OJ:L:2003:268:0001:0023:ES:PDF>. CE (2003b). Reglamento (CE) nº 1830/2003 del Parlamento Europeo y del Consejo [en línia]. <http:// eur-lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do? uri=OJ:L:2003:268:0024:0028:ES:PDF>. CEE (1990). Directiva 90/220/CEE del Consejo de 23 de abril de 1990 sobre la liberación intencional en el medio ambiente de organismos modificados genéticamente [en línia]. <http://www.belt.es/legislacion/ vigente/alimentaria/prot_biotecn/comunitaria/ pdf/dir_90_220.pdf>. European Food Safety Authority. GMO Panel. (2006). Guidance document for the risk assessment of genetically modified plants and derived food and feed by the Scientific Panel on Genetically Modified Organisms (GMO) - including draft document updated in 2008 [en línia]. <http://www.efsa.europa.eu/cs/ BlobServer/Scientific_Document/gmo_guidance_ gm_plants_en,0.pdf?ssbinary=true>. European Group of Ethics in Science and Modern Technologies (2009). Ethics of modern developments in agriculture [en línia]. <http://ec.europa. eu/european_group_ethics/docs/opinion24_en. pdf>. European Plant Science Organisation (2005). «European plant sciences: a field of opportunities. Journal of Experimental». Botany, 56: 16991709. Federal Ethics Comittee on Non-Human Biotechnology (2008). The dignity of living beings

Treb. Soc. Cat. Biol., 61: 151-163

with regard to plants [en línia]. <http://www.ekah. admin.ch/uploads/media/e-Broschure-WurdePflanze-2008.pdf>. Herrera-Estrella, L.; Depicker, A.; Montagu, M. Van; Schell, J. (1983). «Expression of chimaeric genes transferred into plant cells using a Ti-plasmid-derived vector». Nature, 303: 209-213. Klein, T. M.; Wolf, E. D.; Wu, R.; Sanford, J. C. (1987). «High velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells». Nature, 327: 70-73. National Research Council (1984). Genetic engineering of plants: agricultural research opportunities and policy concerns. Washington: National Academy Press. Nuffield Council of Bioethics (1999). Genetically modified crops: the ethical and social issues. Londres: Nuffield Council of Bioethics. Organització per a l’Alimentació i l’Agricultura (2001). «Genetically modified organisms, consumers, food safety and the environment». FAO Ethics Series, 2. Organització per a l’Alimentació i l’Agricultura (2008). Declaration of the High-Level Conference on World Food Security: The Challenges of Climate Change and Bioenergy [en línia]. <http://www. fao.org/fileadmin/user_upload/foodclimate/ HLCdocs/declaration-E.pdf>. Organització Mundial de la Salut (2000). Aspectos relativos a la incocuidad de los alimentos de origen vegetal genéticamente modificados. Informe de una Consulta Mixta FAO/OMS. Ginebra: Organització Mundial de la Salut. The Royal Society (2009). Reaping the benefits. Londres: The Royal Society.

ÍNDEX D’AUTORS Boronat, A. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47 Bou-Torrent, J. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31 Casacuberta, J. M. . . . . . . . . . . . . . . . . 7, 135 Ceinos, R. M.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105 Izquierdo, D.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 121 Ludevid, M. D.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73 Martínez-García, J. F.. . . . . . . . . . . . . . . . 31 Melé, E.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57

Messeguer, J.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57 Monfort, A.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 Montoliu, L.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93 Paramio, M. T.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 121 Puigdomènech, P.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 151 Rotllant, J.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105 Torrent, M.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73

SOCIETAT CATALANA DE BIOLOGIA Consell Directiu President Vicepresidenta 1a Vicepresident 2n Secretari General Vicesecretari Tresorera Vocal de Publicacions Vocal de Sessions Vocal d’Acció Territorial Vocal de Comunicació Vocal d’Ensenyament Vocal d’Estudiants Delegat de l’IEC

Lluís Tort Àurea Navarro Jordi Barquinero Josep Clotet Arcadi Navarro Carme Segarra Ricard Roca Ramon Roca Jordi Bermúdez Joan Duran Rosa Pérez Marta Llauradó Ricard Guerrero

Secretàries administratives

Maite Sánchez Mariàngels Gallego

SOCIETAT CATALANA DE BIOLOGIA Seccions especialitzades Aqüicultura Biofísica Biologia del desenvolupament Biologia evolutiva Biologia i indústria Biologia molecular Biologia molecular del càncer Biologia de la reproducció Biologia i societat Ecologia aquàtica Ecologia terrestre Ensenyament Genòmica i proteòmica Microbiologia Neurobiologia experimental Senyalització cel·lular i metabolisme Virologia Estudiants SCB a Alacant SCB a les Balears SCB a Lleida SCB al Pallars SCB a València SCB a Vic

Josep Planas Pere Garriga Jordi Garcia-Fernández Montserrat Papaceit Ramon Roca Albert Jordan Gabriel Capellà Enric Ribes Cristina Junyent Ramon Masana Josep Maria Espelta Rosa Pérez Francesc Xavier Avilés Mercè Berlanga Josep Saura Francesc Vinyals Miguel À. Martínez i Ana Angulo Marta Llauradó Sergi Soriano Balbina Nogales M. Ángeles de la Torre Xavier Castells Helena Mira Jordi Planas

ACTIVITATS DEL CURS 2009-2010

SESSIÓ INAUGURAL

23 de novembre Sala Pere i Joan Coromines, IEC «Els virus de la grip. Patògens en constant evolució» Tomàs Pumarola, Hospital Clínic de Barcelona, UB «Epidèmies i pandèmies gripals: realitats o especulacions?» Antoni Trilla, Hospital Clínic de Barcelona, UB II.

CONGRESSOS I SIMPOSIS

17 d’octubre II Congrés d’Aqüicultura Mediterrània Sant Carles de la Ràpita Organitza: Secció d’Aqüicultura 19-20 d’octubre Reunió Científica Anual de Microbiologia 2009 (RECAM2009) «Unitat i diversitat en microbiologia-6» Sala Nicolau d’Olwer, IEC Organitza: Secció de Microbiologia III.

CURSOS I SEMINARIS

30 de novembre Seminari: «Genetic consequences of seed dispersal for tree populations» Facultat de Ciències, UAB Organitza: Secció d’Ecologia terrestre 30 de novembre - 2 de desembre Introducció a les good laboratory practices: sistema de qualitat en desenvolupament no clínic Sala Nicolau d’Olwer, IEC Organitza: Secció de Biologia i indústria

170

11 de desembre 6th Workshop on Biomedical Genomics and Proteomics Hospital General Vall d’Hebron Organitza: Secció de Genòmica i proteòmica 8 de gener «Nous avenços en ecologia microbiana» ICM-CMIMA Organitza: Secció de Microbiologia D’octubre a març Curs d’actualització en coneixements de biologia IEC Organitza: Secció d’Ensenyament 21 de maig Seminari de recerca: «Caracterització histopatològica i molecular del glioblastoma multiforme» Sala d’Actes, Institut de Bioenginyeria, Elx Organitza: Secció d’Alacant 2-3 de juliol Taller: «Fitfish: workshop on the swimming physiology of fish» IEC Organitza: Secció d’Aqüicultura IV. JORNADES 16 de setembre III Jornada de Biofísica Sala Pere i Joan Coromines, IEC Organitza: Secció de Biofísica 22 de setembre I Jornada de Biologia de Sistemes IEC Organitza: Secció de Biologia de sistemes 02 d’octubre VI Jornada d’Avenços en Ecologia Centre d’Estudis Avançats de Blanes Organitza: Secció d’Ecologia aquàtica

171

23 d’octubre Jornada anual d’hipòxia i angiogènesi Sala Prat de la Riba, IEC Organitza: Secció de Senyalització cel·lular 06 de novembre VII Jornada de Fisiologia Vegetal Sala Pere i Joan Coromines, IEC Organitza: Secció de Fisiologia vegetal 10 de novembre IX Jornada de Virologia Sala Prat de la Riba, IEC Organitza: Secció de Virologia 8-20 de novembre ESCMID Conference on enterococci: «From animals to man» Sala Prat de la Riba, IEC Organitza: Secció de Microbiologia 3 de desembre VI Jornada CREAF-SCB-ICHN: «Aturem la pèrdua de biodiversitat» Sala Prat de la Riba, IEC 11 de desembre Jornada sobre diabetis i obesitat Universitat Miguel Hernández Organitza: Secció d’Alacant 17 de desembre Jornada de Santa Llúcia 2009 «Gaps en la comunicació científica: quan es creen conxorxes» Sala Puig i Cadafalch, IEC Organitza: Secció de Ciència en societat 5 de març I Jornada de Cromatina i Epigenètica Sala Pere i Joan Coromines, IEC Organitza: Secció de Biologia molecular Febrer-abril VII Jornades de Biologia Cel·lular i Molecular UIC, PCB i IEC Organitza: Secció d’Ensenyament

172

29 d’abril Jornada: «Immunòlegs i societat: la relació entre ciència i salut» Sala Pere i Joan Coromines, IEC Organitza: SCB i Societat Catalana d’Immunologia 18 de juny Jornada anual: «Senyals implicats en mort cel·lular» Sala Prat de la Riba, IEC Organitza: Secció de Senyalització cel·lular 29-30 de juny XVIII Jornades de Biologia Molecular Sala Prat de la Riba, IEC Organitza: Secció de Biologia molecular 05 de juliol X Jornada de Biologia Evolutiva Sala Prat de la Riba, IEC Organitza: Secció de Biologia evolutiva V.

ALTRES ACTIVITATS / SESSIONS EXTRAORDINÀRIES

Octubre Cicle de conferències en commemoració del 200 aniversari de Darwin i els 150 anys de la teoria de l’evolució Organitza: Secció de la SCB a Lleida 10 de novembre Tertúlies a la Virreina: «Mitosi» Palau de la Virreina Organitza: Joan Duran, Consell Directiu de la SCB 17 de novembre Més enllà de Darwin Aula Magna, Facultat de Biologia, UB Organitza: Secció de Biologia del desenvolupament 9-20 de novembre «La cultura a l’Espanya del segle xx: Junta per a l’Ampliació d’Estudis i l’origen del CSIC» Activitat inclosa dins els actes de la Setmana de la Ciència Organitza: Secció d’Alacant

173

26 d’octubre - 27 de novembre Lleida, ciutat de ciència Visites guiades als laboratoris de la ciutat de Lleida i rodalies 15-26 de febrer Exposició: «La cultura a l’Espanya del segle xx: l’origen del CSIC» Organització conjunta de la Secció d’Alacant amb ANEI Siglo xxi 22-25 de febrer Exposició: «La cultura a l’Espanya del segle xx: l’origen del CSIC» Escola Oficial d’Idiomes, Elx Organització conjunta de la Secció d’Alacant amb ANEI Siglo xxi 18-23 d’abril Exposició itinerant: «Darwin: el viatge del Beagle» Institut de Bioenginyeria, UMH Organització conjunta de la Secció d’Alacant amb ANEI Siglo xxi 10-31 de maig Exposició: «La cultura a l’Espanya del segle xx: l’origen del CSIC» Centre d’Investigacions Biològiques, Universitat Complutense de Madrid Organització conjunta de la Secció d’Alacant amb ANEI Siglo xxi 13 de maig Conta contes Institut de Bioenginyeria, UMH Organitza: Secció d’Alacant 15 de maig VII Matinal d’Evolució Auditori Joan Plaça, Jardí Botànic de la UV Organitza: Secció de València Fins al 31 de juliol I Concurs de fotografia científica Organitza: Secció d’Alacant

Interior 59 Soc Cat Bio

2/3/2009

14:19

Página 1

VOLUM 61, 2010

ÍNDEX

7 15 31

Organismes modificats genèticament

TREBALLS DE LA SOCIETAT CATALANA DE BIOLOGIA

TREBALLS DE LA SOCIETAT CATALANA DE BIOLOGIA Organismes modificats genèticament

47 57

VOLUM 61, 2010

73 93 105 121 135 151

TREB. SOC. CAT. BIOL., VOL. 61, 2010

Filial de l’Institut d’Estudis Catalans

Cob biologia 61.indd 1

BARCELONA 2010

13/12/2010 16:48:56

Organismes modificats genèticament TREB. SOC. CAT. BIOL., VOL. 61, 2010 Sobrecob biologia 61.indd 1

Organismes modificats genèticament Josep M. Casacuberta editor

Il·lustració de la sobrecoberta Panotxa de blat de moro transgènic resistent al barrinador.

treballs de la societat catalana de biologia VOLUM 61, 2010

13/12/2010 16:47:31

Organismes modificats genèticament TREB. SOC. CAT. BIOL., VOL. 61, 2010 Sobrecob biologia 61.indd 1

Organismes modificats genèticament Josep M. Casacuberta editor

Il·lustració de la sobrecoberta Panotxa de blat de moro transgènic resistent al barrinador.

treballs de la societat catalana de biologia VOLUM 61, 2010

13/12/2010 16:47:31