Issuu

10:31

Página 1

LES BIOTECNOLOGIES

28/1/09

TREB. SOC. CAT. BIOL., VOL. 58, 2007

Sobrecob 58 Soc Cat Bio

LES BIOTECNOLOGIES PERE PUIGDOMÈNECH I FRANCESC GÒDIA EDITORS Il·lustració de la sobrecoberta

TREBALLS DE LA SOCIETAT CATALANA DE BIOLOGIA VOLUM 58, 2007

Nature morte a la brioche. Jean-Baptiste Chardin (1699-1779). Museu del Louvre, París. En el quadre es mostren dues precioses mostres de biotecnologies clàssiques, la preparació de pa i la de vi. En el cas del pa és, de fet, un gustós brioix. Tant de bo aprofitem en el futur el coneixement en biotecnologia de manera tan eficaç i prudent com hem fet en el passat.

10:31

Página 1

LES BIOTECNOLOGIES

28/1/09

TREB. SOC. CAT. BIOL., VOL. 58, 2007

Sobrecob 58 Soc Cat Bio

LES BIOTECNOLOGIES PERE PUIGDOMÈNECH I FRANCESC GÒDIA EDITORS Il·lustració de la sobrecoberta

TREBALLS DE LA SOCIETAT CATALANA DE BIOLOGIA VOLUM 58, 2007

10:15

Página 1

TREBALLS DE LA SOCIETAT CATALANA DE BIOLOGIA

VOLUM 58, 2007

ÍNDEX

LES BIOTECNOLOGIES Presentació . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . F. GÒDIA I P. PUIGDOMÈNECH TECNOLOGIES FACILITADORES I NOVES APLICACIONS Bioinformàtica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . R. GUIGÓ Biologia estructural . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . M. COLL Noves perspectives de la bioenginyeria a l’inici del segle XXI . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . J. SAMITIER Nanobiotecnologia: Alliberament de fàrmacs, obtenció d’imatges i disseny de nanobiosensors amb nanomaterials . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A. MERKOÇI LES APLICACIONS: SALUT, ALIMENTACIÓ, INDÚSTRIA I MEDI AMBIENT Nous fàrmacs. Medicina personalitzada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . J. M. PALACIOS I S. MUSOLES La biotecnologia vegetal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . P. PUIGDOMÈNECH Millora genètica de plantes assistida amb marcadors . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . P. ARÚS Aplicació de la biotecnologia a l’aqüicultura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . F. PIFERRER, L. TORT, A. GÓMEZ I A. FIGUERAS Bases ecològiques per a la recerca de nous fàrmacs en els organismes marins . . . . . . . . . . . . . M. J. URIZ Fármacos de origen marino . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . F. DE LA CALLE Bioprocessos industrials. Biocombustibles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . F. GÒDIA I C. SOLÀ Biotecnologia i medi ambient . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A. R. BLANCH La bioremediació . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A. M. SOLANAS

LES BIOTECNOLOGIES

28/1/09

TREBALLS DE LA SOCIETAT CATALANA DE BIOLOGIA LES BIOTECNOLOGIES

11 25 39

VOLUM 58, 2007

65 79 87 105 125

FILIAL DE L’INSTITUT D’ESTUDIS CATALANS

141 157 175 187

TREB. SOC. CAT. BIOL., VOL. 58, 2007

Cub. 58 Soc Cat Bio

BARCELONA 2009

Interior 58 Soc Cat Bio

27/01/09

09:01

Página 1

NORMES DE PUBLICACIÓ DE TREBALLS DE LA SOCIETAT CATALANA DE BIOLOGIA Abast. Treballs de la Societat Catalana de Biologia (Treb. Soc. Cat. Biol.) publica: a) monografies i revisions sobre temes de ciències de la vida encarregades per la Societat, i b) comunicacions presentades a les sessions ordinàries i extraordinàries organitzades per la Societat o les seves seccions especialitzades. Els temes poden ser proposats pels membres del Consell Directiu o per socis que desitgin ocupar-se de la preparació d’un volum de la revista fent d’editors. El Consell Directiu decideix si un tema és apropiat per dedicar-hi un volum de Treb. Soc. Cat. Biol. Idioma. Els originals seran redactats en català, excepte en casos justificats per als quals el Consell Directiu pugui acceptar una altra llengua. Lliurament dels originals. La submissió implicarà que el material és original i que no ha estat enviat, acceptat o publicat en cap altre lloc. Els originals els lliurarà l’editor del volum per correu electrònic (scb@iecat.net), adreçat al president del Consell de Redacció. Cal enviar els següents arxius, preferentment empaquetats amb ZIP: — Un arxiu únic en format RTF o MS Word anomenat Text_TSCB_[cognom de l’editor], amb tot el text del volum, incloent-hi, en aquest ordre: coberta, índex, presentació, els capítols en l’ordre desitjat i les seves taules, si n’hi ha. Les pàgines hauran d’anar numerades consecutivament començant per la núm. 1, que serà la de la coberta. Tot el text serà escrit íntegrament amb Times New Roman de cos 12 amb interlineat d’1,5. L’arxiu amb el text no podrà contenir figures ni objectes incrustats. — Un arxiu per cada figura anomenat Figura_[número de figura]_[cognom del primer autor]. Les figures, si no contenen text (a part del peu), es poden remetre en qualsevol dels formats gràfics habituals (PNG, JPEG, TIFF); si contenen text, s’han d’enviar en un format que permeti editar-lo (EPS, PDF, Powerpoint). — Cal enviar també una còpia impresa electrònica en format PDF de tot el volum, anomenada TSCB_[cognom de l’editor], amb tot el contingut, incloent-hi les figures. Aquest arxiu es farà servir com a text imprès de referència durant el procés de tractament del text. Per aquest motiu, els autors i l’editor han de tenir cura personalment que en aquesta còpia hi hagi tot el contingut imprès correctament, incloent-hi sobretot els símbols o caràcters especials, equacions, etc. Cada article o, en un volum monogràfic, cada capítol, incloent-hi la bibliografia, taules i figures, hauria de tenir una extensió entre quinze i vint fulls DIN A4, escrits amb el tipus, mida i interlineat esmentats abans. Només es podrà ultrapassar aquest límit amb l’acord previ del Consell de Redacció de Treballs de la SCB. Els volums monogràfics haurien de contenir un mínim d’uns deu capítols. El Consell de Redacció consultarà especialistes, els quals recomanaran si un article pot publicar-se immediatament, necessita revisió, o bé és rebutjat. Els autors rebran notificació de la decisió. Si el treball requereix revisió, es facilitaran als autors els comentaris escrits dels especialistes que l’hagin revisat. Estructura dels originals. Els originals que no s’ajustin a aquestes instruccions seran retornats als autors perquè els modifiquin abans de la seva tramitació. Dintre de cada capítol o article se seguirà el següent ordre pel que fa als diferents components:

— Títol, escrit en majúscules i negreta. — Nom i primer cognom de l’autor. Si n’hi ha més d’un, els seus noms aniran separats amb una coma. L’autor per a la correspondència s’identificarà amb un asterisc posat al final del seu cognom. — Adreça postal completa de tots els autors. Telèfon, fax i correu electrònic de l’autor per a la correspondència — Resum en català, d’un màxim de dues-centes paraules. — Paraules clau en català, màxim de cinc. — Resum en anglès (que, òbviament, haurà d’ésser traducció fidel del resum en català i haurà d’anar precedit de la traducció del títol del manuscrit). — Paraules clau en anglès, màxim de cinc. — Text, que, si és una revisió, podrà estar dividit fins a dos nivells en els apartats (no numerats) que es creguin més oportuns. Si es tracta d’un article de recerca, el manuscrit haurà d’incloure Introducció, Materials i mètodes, Resultats i Discussió. No es podran fer servir notes a peu de pàgina ni text subratllat. — Agraïments, si escau. — Referències, segons el format indicat més endavant. — Taules. Portaran un títol descriptiu breu i aniran numerades correlativament amb números àrabs. Una taula per full. — Text de peus de figures. Il·lustracions. Les il·lustracions cal que siguin de bona qualitat i contrast, tenint en compte la possible reducció, ja que, a causa del format de la revista, un cop publicades poden ésser, com a màxim, de 14 cm d’ample per 19 cm d’alt. Totes les il·lustracions seran en blanc i negre, excepte en cas que el color sigui essencial per a comprendre’n el significat. Atès que la publicació de fotografies en color encareix molt el procés editorial, els autors que desitgin incloure alguna fotografia en color hauran de pagar les despeses extra. En cas que les taules o figures hagin estat publicades anteriorment, caldrà indicar-ne la procedència i, si escau, el copyright. Referències. Totes les referències, tant publicades com en premsa, citades al text, hauran d’ésser incloses a la llista de referències, ordenades alfabèticament. En el text s’indicaran els noms dels autors i l’any de publicació per ordre cronològic; en el cas que una referència tingui més de dos autors, se citarà el primer seguit d’et al. A continuació hi ha exemples de l’estil que s’ha de seguir per a citar articles, capítols o monografies. CODINA, C.; VILADOMAT, F.; BASTIDA, J.; LLABRÉS, J. M. (1989). «Potencial biotecnològic del cultiu de cèl·lules vegetals per a l’obtenció de productes farmacèutics». Treb. Soc. Cat. Biol., 40: 47-70. MELLADO, R. P. (1987). «Vectores utilizados para la manipulación y expresión de genes». A: VICENTE, M.; RENART, J. Ingeniería genética. Madrid: CSIC, 21-30. WOLFFE, A. (1995). Chromatin structure and function. Londres: Academic Press. Proves d’impremta i extrets. De tots els originals acceptats, l’autor de correspondència en rebrà unes proves d’impremta per a corregir-les, i aquestes proves hauran d’ésser retornades, per correu urgent, a: Secretaria de la Societat Catalana de Biologia, c/ Maria Aurèlia Capmany, 14-16, 08001 Barcelona (tel. 933 248 584; fax 932 701 180; a/e: scb@iec.cat) dins el termini màxim d’una setmana. En les proves no podran ésser introduïdes correccions d’estil, i només hi seran admeses les de caràcter ortogràfic i tècnic. Un cop publicat l’article, es lliuraran a l’autor vint extrets sense càrrec.

TREBALLS DE LA SOCIETAT CATALANA DE BIOLOGIA INSTRUCTIONS FOR AUTHORS Scope. Treballs de la Societat Catalana de Biologia (Treb. Soc. Cat. Biol.) publishes: a) monographs and reviews on life sciences topics commissioned by the Society; and b) lectures presented at both ordinary and extraordinary sessions organized by the Society or their specialized sections. Submission of originals. Submission implies that the material is original and that has not been submitted, accepted or published elsewhere. Originals will be submitted by the editor of the volume to the following e-mail address scb@iecat.net addressed to the President of the Publications Board. The following files will be provided, preferably ZIP-compressed: — A single file in format RTS or MS Word named Text_TSCB_ [editor’s last name], containing all the text of the volume, including, in this order, the following parts: cover page, table of contents, presentation, the chapters in the order that they should appear and their corresponding tables. Pages should be consecutively numbered, staring with page 1, which will be the cover page. All text should be written in Times New Roman, pt 12 with 1.5 spaces between lines. The text file cannot contain figures and incrustated objects. — One file for each figure named Figure_[figure number]_ [last name of the first author]. Figures that do not contain text characters can be submitted in standard graphic format (PNG, JPEG, and TIFF); figures that do contain text have to be submitted in an editable format (EPS, PDF, Powerpoint). — A single PDF file named TSCB_[editor’s last name] containing all text plus all figures. Authors and the editor are responsible that in this file, all contents appear correctly printed, in particular special symbols and equations. Each article or, in a monograph, each chapter, including text plus references, tables and figures, should be between fifteen and twenty DIN A4 sheets long, written with the font type and spaces between lines specified above. The maximum length can be surpassed only with prior approval from the Treballs de la SCB Publications Board. Monographs should have a minimum of 10 chapters. The Publications Board will contact specialists who will recommend immediate publication, acceptance after modifications or rejection of the submitted originals. Authors will be notified in due course. If revision is required, authors will receive the corresponding written comments for modifications. Structure of manuscripts. Manuscripts that do not conform to these instructions will be returned to the authors for modifications before their processing. Each chapter or manuscript should have the following structure: — Title, written in capitals and bold case. — Name and last name of author. If there is more than one author, their names will be separated with commas. The corresponding author will be identified with an asterisk placed after their last name.

— Full postal address of all authors. Phone, fax and e-mail address of the corresponding author. — Abstract, maximum two hundred words. — Keywords, maximum five — Text of manuscript. In the case of review articles, a maximum of two (not numbered) subheadings will be accepted. In the case of research articles, the manuscript will include the following sections: Introduction, Materials and Methods, Results, Discussion. Footnotes or underlined text will not be accepted. — Acknowledgments, if appropriate — References (see format below) — Tables. They will be preceded with a brief, descriptive title and will be numbered with Arabian numerals. One table per page — Figure legends Figure. Figures should be of good quality and contrast, taking into account that they can be reduced in size, and that once published they can be at most 14 cm width x 19 cm height. All figures will be in black and white, unless the use of color is essential to understand their meaning. The authors will pay extra costs of publishing color figures. If tables or figures have been previously published elsewhere, the original source must be indicated and it will be the responsibility of authors to deal with possible copyrights. References. All references published and in press cited within the text will have to be included in the reference list arranged in alphabetical order by the last name of the first author. In the text, the name of the authors and the publication year should be used in chronological order. If there are more than two authors, only the name of the first author followed by «et al.» will be used. The following examples represent the appropriate manner in which to cite articles, book chapters and books, respectively. CODINA, C.; VILADOMAT, F.; BASTIDA, J.; LLABRÉS, J. M. (1989). «Potencial biotecnològic del cultiu de cèl·lules vegetals per a l’obtenció de productes farmacèutics». Treb. Soc. Cat. Biol., 40: 47-70. MELLADO, R. P. (1987). «Vectores utilizados para la manipulación y expresión de genes». A: VICENTE, M.; RENART, J. Ingeniería genética. Madrid: CSIC, 21-30. WOLFFE, A. (1995). Chromatin structure and function. Londres: Academic Press. Galleyproofs and reprints. Once a manuscript has been accepted, the corresponding author will receive the galleyproofs. Galleyproofs will be returned by courier to: Secretaria de la Societat Catalana de Biologia, c/Maria Aurèlia Capmany, 1416, 08001 Barcelona (tel. +34-933 248 584; fax +34-932 701 180; e-mail: scb@iec.cat) within one week. Style corrections cannot be accepted in galleyproofs. Only typographic and technical corrections will be accepted. Once published, authors will receive 20 reprints free of charge.

TREBALLS DE LA SOCIETAT CATALANA DE BIOLOGIA FILIAL DE L’INSTITUT D’ESTUDIS CATALANS

VOLUM 58, 2007

BARCELONA 2009

CONSELL DEPUBLICACIONS REDACCIÓ COMITÈ DE FRANCESC PIFERRER, president, Institut de Ciències del Mar, CSIC, Barcelona RICARD ROCA, secretari, vocal de lexicografia, SCB MERCÈ PIQUERAS, vocal, presidenta de l’ACCC JOAN JOFRE, Vocal, Universitat de Barcelona RAMON BARTRONS, Vocal, Universitat de Barcelona LLUÍS SERRA, Vocal, Universitat de Barcelona CÈLIA MARRASÉ, Vocal, Institut de Ciències del Mar

© dels autors dels articles Editat per la Societat Catalana de Biologia (filial de l’Institut d’Estudis Catalans) Carrer del Carme, 47. 08001 Barcelona Compost per Ricard Roca ricardroca@gmail.com Imprès a Limpergraf, SL Polígon industrial Can Salvatella, carrer de Mogoda, 29-31 Barberà del Vallès ISSN: 0212-3037 Dipòsit Legal: B. 12164-1963

Les biotecnologies Pere Puigdomènech i Francesc Gòdia editors

TREBALLS DE LA SOCIETAT CATALANA DE BIOLOGIA VOLUM 58, 2007

ÍNDEX Les biotecnologies Presentació . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . F. Gòdia i P. Puigdomènech

Tecnologies facilitadores i noves aplicacions Bioinformàtica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . R. Guigó

Biologia estructural . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . M. Coll

Noves perspectives de la bioenginyeria a l’inici del segle xxi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . J. Samitier

Nanobiotecnologia: Alliberament de fàrmacs, obtenció d’imatges i disseny de nanobiosensors amb nanomaterials . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A. Merkoçi

Les aplicacions: salut, alimentació, indústria i medi ambient Nous fàrmacs. Medicina personalitzada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . J. M. Palacios i S. Musoles

La biotecnologia vegetal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . P. Puigdomènech

Millora genètica de plantes assistida amb marcadors . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . P. Arús

Aplicació de la biotecnologia a l’aqüicultura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105 F. Piferrer, L. Tort, A. Gómez i A. Figueras Bases ecològiques per a la recerca de nous fàrmacs en els organismes marins . . . . . . . 125 M. J. Uriz

Fármacos de origen marino . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141 F. de la Calle Bioprocessos industrials. Biocombustibles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 157 F. Gòdia i C. Solà Biotecnologia i medi ambient . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 175 A. R. Blanch La bioremediació . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 187 A. M. Solanas

Les biotecnologies (Pere Puigdomènech i Francesc Gòdia, ed.) Treballs de la SCB. Vol. 58 (2007) 7

PRESENTACIÓ Francesc Gòdia i Pere Puigdomènech

L’interès per la biotecnologia ha anat en augment des que en els anys setanta es van desenvolupar les tècniques del DNA recombinant. Això no vol dir que no existissin biotecnologies abans, quan aquest nom ja s’utilitzava. Però les possibilitats obertes per les noves aproximacions moleculars van obrir un nou món. Això ens ho demostra el fet que els mateixos que van guanyar el Premi Nobel per haver assolit els avenços que van donar lloc al que es coneixia també com a enginyeria genètica van patentar els seus descobriments i van fundar companyies que en alguns casos han acabat donant lloc a veritables empreses multinacionals. Però també hem de recordar que les tècniques del DNA recombinant van generar un debat complex sobre els riscs que s’obrien i que van donar lloc a la famosa conferència d’Asilomar l’any 1975. Per a alguns les biotecnologies han estat un somni i per a altres un malson. Ben probablement les biotecnologies hauran de viure amb el debat de manera permanent. A casa nostra la recerca amb les tècniques del DNA ha crescut de manera exponencial i els grups que poden identificar-se amb les biotecnologies també. La Societat Catalana de Biologia va organitzar l’any 1982 un curs sobre enginyeria genètica, en què les noves tecnologies es van fer servir pel primer cop a Catalunya. Poc després es posava en marxa una Agència de Biotecnologia de Catalunya que tractava de coordinar els grups que treballaven en el tema. Un resultat va ser el Pla Estimulador de

la Biotecnologia a Catalunya (PEBEC) que va possibilitar l’organització de diferents reunions entre investigadors i empresaris. Fruit d’aquestes iniciatives va ser també el Centre de Referència de Biotecnologia, que encara manté una activitat en xarxa. El fet és que les aproximacions biotecnològiques són ben vives a casa nostra. N’és testimoni l’èxit de la llicenciatura de biotecnologia i també ho és el fet que hagin estat creades diverses companyies catalanes de biotecnologia i que sobrevisquin en una àrea d’activitat molt competitiva per definició. També és mostra de la vitalitat de les biotecnologies a Catalunya el fet que en moltes empreses, per exemple farmacèutiques, de diagnòstic, de millora genètica, etc., s’estiguin fent servir aproximacions biotecnològiques. I no es pot oblidar la qualitat dels grups de recerca, que ha anat creixent de manera molt significativa. Finalment, hem viscut en els darrers anys la creació de centres de recerca específics en biotecnologia i biomedicina, i hem pogut observar un notable increment de la recerca biomèdica als nostres hospitals. És en aquest context que la Societat Catalana de Biologia va decidir dedicar aquest volum de treballs de la scb a recollir revisions sobre diferents aspectes de la biotecnologia escrites per persones que hi treballen i que han acceptat participar-hi. Són visions de primera mà que haurien de permetre posar-se al dia sobre algunes de les principals temàtiques que componen aquest món complex, dinàmic i ple de futur.

Tecnologies facilitadores i noves aplicacions

DOI: 10.2436/20.1501.02.41

Les biotecnologies (Pere Puigdomènech i Francesc Gòdia, ed.) Treballs de la SCB. Vol. 58 (2007) 11-24

BIOINFORMÀTICA Roderic Guigó Centre de Regulació Genòmica i Institut Municipal d’Investigació Mèdica, Universitat Pompeu Fabra. Adreça per a la correspondència: Roderic Guigó. Centre de Regulació Genòmica i Institut Municipal d’Investigació Mèdica, Universitat Pompeu Fabra. Dr. Aiguader, 88. 08003 Barcelona. Adreça electrònica: roderic.guigo@crg.es. RESUM La recerca en biologia no es pot entendre avui sense la computació. A causa, sobretot, del desenvolupament de les tecnologies genòmiques, la biologia ha passat en molt poc temps, de ser una ciència en la qual l’esforç humà s’orientava principalment envers l’obtenció d’unes poques dades, a ser una ciència que genera un volum enorme de dades sense pràcticament intervenció humana. L’esforç de l’investigador s’ha desplaçat, en conseqüència, de la producció a l’anàlisi de les dades. I és en aquest desplaçament en què els mètodes informàtics tenen un paper essencial, tant en la planificació dels experiments com en la seva execució i, sobretot, en l’emmagatzematge i anàlisi dels resultats. Aquests mètodes configuren una nova disciplina científica, que anomenem bioinformàtica. En aquest article repassarem, des d’una perspectiva històrica, els fonaments d’aquesta disciplina, que s’articulen al voltant del concepte, entès de manera molt genèrica, de alineament i similitud entre seqüències. Paraules clau: bioinformàtica, computació, seqüències, alineament, similitud. BIOINFORMATICS SUMMARY Nowadays, research in biology can not be understood without computation. Due to the development of the genomic technologies, biology has been transformed in a very short period of time, from being a science in which the human effort was mainly oriented towards data gathering to being a science that generates a huge volume of data with little (or no) human intervention. The effort of researchers has, consequently, moved away from data production towards data analysis. Computational methods play an essential role to cope with this transformation: in the planning of the experiments, as well as in their execution, and, especially, in the storage and analysis of their results. These methods configure

12 R. GUIGÓ

a new scientific discipline named bioinformatics. In this article we review from a historical perspective the foundations of this discipline, which articulate around the generic concept of sequence alignment and similarity. Key words: bioinformatics, computation, sequences, alignments, similarity.

INTRODUCCIÓ La bioinformàtica és una disciplina en la intersecció entre la biologia i les ciències de la computació que tracta del desenvolupament i aplicació de mètodes computacionals per a l’obtenció, l’emmagatzematge, l’anàlisi i la interpretació de dades biològiques. Tot i que es tracta d’una disciplina recent, (Medline, la base de dades que compila la literatura científica en biologia i medicina, no inclou cap article en el qual aparegui el terme bioinformatics abans de l’any 1990), s’ha introduït en un període de temps curtíssim en moltes de les àrees tradicionals de la biologia. A finals de l’any 2007, el nombre d’articles de Medline que inclouen el terme bioinformatics s’apropa a vint mil, i això testimonia l’explosió insòlita d’una disciplina científica, possiblement sense precedents en la història de la ciència. Es tracta, en qualsevol cas, d’una disciplina jove i, per tant, encara sense sistematitzar. En un sentit molt ampli qualsevol aplicació de la computació en la biologia (i de la biologia en la computació) pot ser inclosa dins la bioinformàtica. En aquest article, però, entendrem la bioinformàtica, en un sentit més restringit, com la disciplina que tracta de l’anàlisi computacional de seqüències biològiques (DNA o proteïnes). De fet, s’atribueix normalment al desenvolupament de les tecnologies de la genòmica el paper clau que la bioinformàtica té avui dia en la investigació en biologia. En efecte, les tecnologies de la genòmica generen un volum de dades sobre els fenòmens de la vida d’una magnitud sense precedents

en biologia. Aquestes dades són majoritàriament, però no únicament, seqüències de DNA dels genomes (cel·lulars, individuals, específics o poblacionals) i seqüències de RNA cel·lulars, l’abundància relativa de les quals, mesurada directament a partir del nombre de molècules seqüenciades o a partir dels senyals d’hibridació obtinguts mitjançant experiments amb matrius de DNA (els microxips de DNA), reflecteix l’activitat del genoma en una determinada condició cel·lular. Els experiments amb microxips són particularment il·lustratius de l’enorme volum de dades que produeix la recerca en biologia. Mitjançant els microxips, el suport físic dels quals tot just supera uns pocs centímetres quadrats, és possible obtenir en poques hores dades sobre el comportament simultani de milers de gens sota unes condicions determinades. Milers d’experiments amb matrius de DNA es porten a terme diàriament en tot el món, molts de manera gairebé automàtica. Fa només una dècada, tanmateix, l’obtenció d’aquestes mateixes dades sobre un únic gen era el resultat del treball continuat d’un investigador (o d’un equip d’investigadors) durant mesos, sovint durant anys. La biologia ha passat, doncs, en molt poc temps, de ser una ciència en la qual l’esforç humà s’orientava principalment envers l’obtenció de (poques) dades, a ser una ciència que genera un volum literalment vertiginós de dades sense pràcticament intervenció humana. L’esforç de l’investigador s’ha desplaçat, en conseqüència, des de la producció cap a l’anàlisi de les dades. I és en aquest desplaçament en què els mètodes informàtics tenen un

BIOINFORMÀTICA 13

paper essencial, tant en la planificació dels experiments com en la seva execució, i, sobretot, en l’emmagatzematge i anàlisi dels resultats. L’eclosió recent de la bioinformàtica, amb el desenvolupament de la genòmica, no sorgeix, però, del no-res. La història de la biologia molecular i de la informàtica, després de la Segona Guerra Mundial és, de fet, la història d’una interdependència creixent. Sempre és difícil posar una data exacta al naixement d’una determinada disciplina científica, però en el cas de la informàtica i la biologia molecular podríem dir que s’originen gairebé al mateix temps. Si, per posar alguna data, la biologia molecular neix l’any 1953, amb el desxiframent de l’estructura del DNA per part de Watson i Crick, i amb la determinació per primer cop, el mateix any, de la seqüència d’aminoàcids d’una proteïna per part de Sanger, la informàtica podríem dir que neix pocs anys abans, amb el desenvolupament dels primers ordinadors digitals programables en memòria, és a dir, els ordinadors tal com els entenem avui dia.

LES PRIMERES COĿLECCIONS DE SEQÜÈNCIES. LA MODELITZACIÓ DE L’EVOLUCIÓ MOLECULAR Haurien de passar gairebé vint anys, però, perquè, gràcies a la progressiva miniaturització dels seus components, els ordinadors esdevinguessin suficientment petits, ràpids i econòmics perquè el seu ús pogués generalitzar-se i estendre’s a les universitats i centres de recerca. Uns anys durant els quals, d’altra banda, va augmentar de manera considerable el nombre de proteïnes de les quals, seguint l’exemple de Sanger, s’havia aconseguit desxifrar la seqüència d’aminoàcids. A mitjan dècada dels seixanta, Margaret Dayhoff i els seus col·laboradors van començar a compilar aquestes seqüències d’aminoàcids. Aquestes compilacions van ser donades a conèixer als altres investigadors mitjançant els anomenats Atlas of protein sequence and structure. En la seva quarta edició, a finals dels seixanta, l’Atlas contenia prop de tres-centes seqüències de proteïnes. Aquests atles, encara llibres impresos

65 149 63 138

AEEVEVQDGPNEDGEMFMRPGKLSDYFPKPYPNPEAARAANNGALPPDLS AAEVEVQDGPNEDGEMFMRPGKLFDYFPKPYPNSEAARAANNGALPPDLS AASFEVDDDPDEKGEARKRPGKRFDTVVQPYKNEQEARYANNGALPPDLS AEENEYDTEPNDQGEIEKRPGKLSDYLPDPYKNDEAARFANNGALPPDLS * ..*. ..*...**.. ****. *....**.*...**.***********

CY1_BOVIN CY1_HUMAN CY1_EUGGR CY1_NEUCR consensus

115 199 113 188

YIVRARHGGEDYVFSLLTGY.CEPPTGVSLREGLYFNPYFPGQAIGMAPP YIVRARHGGEDYVFSLLTGY.CEPPTGVSLREGLYFNPYFPGQAIAMAPP VITNARHGGVDYIYALLTGYGRPVPGGVQLSTTQWYNPYFHGGIIGMPPP LIVKARHGGCDYIFSLLTGYPDEPPAGASVGAGLNFNPYFPGTGIAMARV .*..*****.**...***** ...*.*.........****.*..*.*...

CY1_BOVIN CY1_HUMAN CY1_EUGGR CY1_NEUCR consensus

164 248 163 238

IYNEVLEFDDGTPATMSQVAKDVCTFLRWAAEPEHDHRKRMGLKMLLMMG IYTDVLEFDDGTPATMSQIAKDVCTFLRWASEPEHDHRKRMGLKMLMMMA LTDDMIEYEDGTPASVPQMAKDVTCFLEWCSNPWWDERKLLGYKTIATLA LYDGLVDYEDGTPASTSQMAKDVVEFLNWAAEPEMDDRKRMGMKVLVVTS .........*****...*.****..**.*. .*..*.**..*.*......

CY1_BOVIN CY1_HUMAN CY1_EUGGR CY1_NEUCR consensus

Figura 1. Alineament de les seqüències del citocrom C1 en diferents organismes: Homo sapiens, Bos taurus (vaca), Euglena gracilis (una alga unicel·lular) i Neurospora crassa (un fong). Alguns residus estan completament conservats (identificats amb un asterisc), en uns altres observem substitucions relacionades (identificades amb un punt), mentre que altres posicions són completament variables. En general, les posicions conservades en un alineament corresponen als aminoàcids més importants per al manteniment de la funció comuna en les proteïnes alineades. Per altra banda, la seqüència del citocrom C1 és molt més semblant entre els dos organismes mamífers, que entre aquests i les algues o els fongs. La similitud de seqüència constitueix, de fet, una bona indicació de proximitat filogenètica.

14 R. GUIGÓ

en paper, constitueixen possiblement les primeres bases de dades biomoleculars. Dayhoff i els seus col·laboradors, però, no es van limitar a col·leccionar les seqüències, sinó que les van organitzar en famílies i superfamílies relacionades funcionalment, i d’acord amb el grau de semblança que presentaven. Per a cada família construïren el que s’anomena un alineament múltiple (vegeu la figura 1). Un alineament múltiple és una organització matricial d’una col·lecció de seqüències, en la qual cada fila es correspon amb una seqüència diferent (per exemple, la seqüència de la mateixa proteïna en espècies diferents) i cada columna correspon a una posició «equivalent» en les seqüències. Si les seqüències que es comparen són força similars, l’alineament múltiple es pot

construir a mà sense gaire dificultat. De fet, Dayhoff va construir alineaments per a grups de proteïnes que compartien almenys el 85 % de la seva seqüència (Dayhoff et al., 1978). A partir d’aquests alineaments és possible investigar fins a quin punt determinades substitucions d’aminoàcids són tolerades per l’evolució. En efecte, Dayhoff assumia que els aminoàcids en una mateixa columna d’un alineament tenien el mateix origen evolutiu, és a dir, provenien d’un aminoàcid en una proteïna ancestral que havia mutat eventualment de manera diferent en les diferents proteïnes alineades. Sota aquesta assumpció, intercanvis entre aminoàcids que són observats sovint en la mateixa columna dels alineaments serien

Figura 2. Matriu de substitució PAM 250 construïda per Dayhoff. Vegeu el text per a una explicació del significat.

25 de setembre de 2008

BIOINFORMÀTICA 15

tolerats (acceptats, en la terminologia utilitzada per Dayhoff) per l’evolució, mentre que l’intercanvi entre aminoàcids que s’observen rarament en una mateixa columna dels alineaments serien penalitzats per l’evolució. Dayhoff va anar més lluny, i va quantificar aquesta tolerància a l’intercanvi d’aminoàcids durant l’evolució. A partir dels alineaments múltiples va construir les anomenades matrius de substitució. El valor dels coeficients d’aquestes matrius està relacionat amb la probabilitat d’observar durant un determinat període evolutiu la substitució d’un determinat aminoàcid per un altre. A la figura 2 hi ha representada una d’aquestes matrius. El valor zero és el valor neutral, és a dir, el valor que indica que la substitució d’un aminoàcid per l’altre en els alineaments múltiples ocorre amb la freqüència que esperaríem a l’atzar. Els valors positius (com ara, per exemple, el valor +2 entre arginina (Arg) i histidina (His)) indiquen que l’intercanvi entre aquests dos aminoàcids és observat amb una freqüència més elevada que l’esperada (i que, per tant, és un intercanvi favorable des del punt de vista evolutiu), mentre que els valors negatius (com, per exemple, el valor –7 entre glicina (Gly) i triptòfan (Trp)) indiquen que l’intercanvi entre els dos aminoàcids es produeix amb menys freqüència que l’esperada (i que es tracta, en conseqüència, d’un intercanvi penalitzat per l’evolució). La matriu de la figura 2 és la matriu anomenada PAM250, perquè les freqüències esperades de canvi es calculen durant un període evolutiu en el qual s’han produït una mitjana de 2,5 canvis en cada posició de la seqüència de les proteïnes comparades. Les matrius de substitució han estat calculades per a diferents distàncies evolutives amb mètodes diferents, i es troben al nucli dels programes de recerca de semblança de seqüència més usats avui dia.

L’ALINEAMENT DE SEQÜÈNCIES A mesura que el nombre de seqüències de proteïnes augmentava, augmentava també l’interès per obtenir alineaments de seqüències cada cop més allunyades filogenèticament. Però, mentre que alinear dues seqüències molt similars és relativament simple, alinear dues seqüències allunyades és més complicat. Per exemple, suposem que volem alinear les seqüències ARNDCQ i ARDCK. Sembla que existiria consens en el fet que l’alineament ARNDCQ AR-DCK és aquell que reflecteix millor la relació evolutiva entre els aminoàcids de les dues seqüències. (En aquest alineament, el caràcter «–», que es llegeix com a gap, indica la inserció d’un aminoàcid en una de les seqüències o la seva deleció en l’altra.) Però què ocorre si les dues seqüències que volem alinear són ARNDCQ i SKEAE? En aquest cas no és tan senzill fer una hipòtesi sobre l’alineament que reflecteix millor la seva història evolutiva comuna. Quin d’aquests tres alineaments, per exemple, és aquell que la reflecteix millor? Quin és el més versemblant des del punt de vista evolutiu? ARNDCQ SK–EAE

ARNDCQ -SKEAE

--ARNDCQSKEA---E

O, més concretament, i fixant-nos només en els dos primers alineaments, quins esdeveniments són més probables durant el procés evolutiu, la substitució de A per S, de R per K i la inserció/deleció de N, com en l’alineament primer, o la inserció/deleció d’A, la substitució de R per S i la de N per K, com en el segon alineament? (la segona part de l’alineament és idèntica en els dos casos). Per respondre aquesta qüestió podem utilitzar les matrius de substitució construïdes

16 R. GUIGÓ

per Dayhoff, les quals quantifiquen precisament la tolerància de l’evolució als intercanvis entre aminoàcids. Així l’intercanvi entre una A i una S rep, d’acord amb la matriu PAM250 (vegeu la figura 2), una puntuació s(A, S) = 1. De la mateixa manera tenim, s(R, K) = 3, mentre que s(R, S) = 0 i s(N, K) = 1. Si suposem que la probabilitat d’una inserció/deleció és independent de l’aminoàcid inserit/delecionat, comprovem que les substitucions implícites en el primer alineament (A ↔ S i R ↔ K) són més probables que les substitucions implícites en el segon alineament (R ↔ S i N ↔ K), ja que tenen globalment valors positius més grans en la matriu de Dayhoff. Per tant, el primer alineament és més versemblant des del punt de vista evolutiu que no pas el segon. De fet, podem atorgar a cada alineament una puntuació, la qual és simplement la suma de les puntuacions, d’acord amb la matriu de Dayhoff, de les substitucions entre aminoàcids observades en cada posició. Així, la puntuació dels dos alineaments anteriors (suposant que l’alineament amb un gap tingui una puntuació de –1) seria: A R N D C Q S K – E A E +1+3-1+3-2+2=6

A R N D C Q - S K E A E -1+0+1+3-2+2=3

El primer alineament té, efectivament, una puntuació superior al segon. La matriu de substitució de Dayhoff ens proporciona, en conseqüència, un criteri objectiu d’optimització per construir l’alineament entre dues seqüències: ateses dues seqüències, l’alineament òptim, és a dir, el més versemblant des del punt de vista evolutiu, és l’alineament que té la puntuació màxima de tots els alineaments possibles entre les dues seqüències. Aquest criteri objectiu d’optimització ens proporciona un procediment simple per computar l’alineament òptim entre dues seqüències. Es tracta simplement de calcular

la puntuació de tots els alineaments possibles entre les dues seqüències i escollir-ne un dels que tingui la puntuació màxima. El problema és que el nombre d’alineaments possibles entre dues seqüències és molt gran. Per exemple, el nombre d’alineaments possibles entre dues seqüències de cent aminoàcids cadascuna és aproximadament 10200, un nombre impossible de calcular en un període raonable de temps amb cap ordinador (dels que existeixen avui dia o, fins i tot, dels que podrien arribar a existir). Per fer front a aquest problema, Nedleman i Wunsch (1970) van inventar un algoritme que permetia trobar l’alineament òptim entre dues seqüències, i requeria un nombre d’operacions «infinitament» més petit. Aquest algoritme es basa en una tècnica informàtica coneguda com a programació dinàmica, d’acord amb la qual, determinats problemes poden ser resolts molt més eficientment si són descompostos recursivament en subproblemes, a partir de la solució dels quals s’obté la solució del problema original. En el cas de l’alineament de dues seqüències, l’algoritme de Nedleman i Wuncsh es basa en el fet que l’alineament òptim entre dues seqüències X i Y (de longituds n i m) que acaben amb els residus xn i ym és l’alineament millor entre aquest tres alineaments possibles: a) L’alineament òptim entre Xn – 1 i Ym – 1, seguit de l’alineament de xn amb ym (on Xj és la subseqüència de X que comença en la posició 1 i acaba en la posició j). b) L’alineament òptim entre Xn – 1 i Ym, seguit de l’alineament de xn amb un gap. c) L’alineament òptim entre Xn i Ym – 1, seguit de l’alineament de ym amb un gap. Els alineaments òptims entre Xn – 1 i Ym – 1 , Xn – 1 i Ym, i Xn i Ym – 1 es troben, de la mateixa manera, descomponent-ne cadascun en tres (sub)possibilitats, i així successivament. Aquest procés recursiu de descomposició acaba quan un gap en una seqüència (és a dir, la seqüència buida X0 s’alinea amb cada

BIOINFORMÀTICA 17

una de les subseqüències de l’altra seqüència (Y1, …, Yn) i viceversa (Y0 amb X1, …, Xn). Les puntuacions d’aquests alineaments inicials són trivials de calcular, atesa la puntuació d’alineament amb un gap en la matriu de substitucions sota la qual es construeix l’alineament, i a partir d’aquestes es calculen recursivament els alineaments entre tots els parells de subseqüències de X i de Y. Tot i que inicialment aquest procediment pot semblar contraintuïtiu, és fàcil veure que dóna lloc, amb un nombre reduït de càlculs, a l’alineament òptim entre dues seqüències. De fet, el nombre d’operacions necessàries per obtenir l’alineament òptim entre dues seqüències utilitzant l’algoritme de Needleman-Wunsch és simplement proporcional al producte de la longitud de dues seqüències (és a dir, en el cas de dues seqüències de cent aminoàcids, un nombre d’operacions proporcional a 1002; un nombre que és, en la pràctica, «infinitament» més petit que 10200). Mitjançant l’algoritme de Needleman i Wunsch es pot obtenir el que s’anomena alineament global entre dues seqüències, és a dir, l’alineament que inclou la totalitat dels residus de cada una de les dues seqüències comparades. Sovint, però, quan es comparen dues seqüències, només determinades regions exhibeixen una similitud de seqüència indicativa d’un origen evolutiu o d’una funcionalitat similar. Per exemple, quan es comparen dues seqüències ortòlogues entre genomes evolutivament allunyats, només les regions codificants exhibeixen una similitud de seqüència suficient perquè tingui sentit, des del punt de vista biològic, construir-ne l’alineament. L’any 1981 Smith i Waterman van desenvolupar una modificació de l’algoritme de programació dinàmica per obtenir el millor (o millors) alineament local entre dues seqüències (Smith i Waterman, 1981). La construcció d’alineaments locals entre una determinada seqüència i totes les seqüències emmagat-

zemades en una base de dades per identificar seqüències conegudes que puguin estar eventualment relacionades evolutivament o funcional amb la seqüència problema ha estat una de les tècniques més utilitzades en tota la biologia molecular en la darrera dècada del segle xx (vegeu més avall). D’alguna manera, podríem dir que amb les matrius de substitució de Dayhoff i els algoritmes de Needleman-Wunsch i SmithWaterman d’alineament de seqüències s’i naugura la disciplina de la bioinformàtica: per primer cop, es desenvolupen tècniques computacionals específiques per fer front a problemes d’origen biològic. LES BASES DE DADES DE SEQÜÈNCIES Malgrat que a finals dels anys seixanta s’havia compilat ja la seqüència d’aminoàcids d’alguns centenars de proteïnes, la seqüenciació d’àcids nucleics romania elusiva. A principis dels setanta, però, la situació canvia i gràcies als treballs de Maxam i Gilbert, d’una banda, i de Sanger, d’una altra, es posen a punt mètodes que permeten finalment la seqüenciació d’àcids nucleics. Curiosament, això ocorre pràcticament al mateix temps que el Departament de Defensa dels Estats Units desenvolupava ARPANET, una xarxa experimental d’ordinadors, que esdevindria més tard Internet, l’omnipresent xarxa d’ordinadors que tant ha modificat les nostres vides. Dos esdeveniments que es produeixen de manera totalment independent i dels quals només ara podem veure la relació: la seqüència del genoma seria impossible sense Internet. Què difícil és anticipar cap a on anirà la ciència! A principis dels vuitanta, el nombre de seqüències d’àcids nucleics havia crescut de manera espectacular. Era evident que la distribució de les col·leccions de seqüències en format imprès, com ara els atles

18 R. GUIGÓ

compilats per Dayhoff, no podia continuar per molt més temps. Així, l’any 1982 es creava a Los Alamos National Laboratory a Nou Mèxic la base de dades americana de seqüències d’àcids nucleics en format electrònic, GenBank, i al Laboratori Europeu de Biologia Molecular (EMBL) a Heidelberg l’equivalent europea. Alguns anys més tard, al Japó, es crearia el DNA Data Bank of Japan (DDBJ). La primera versió de la base de dades d’EMBL, el juny de 1982, contenia 582 seqüències que sumaven poc menys de 600.000 nucleòtids. L’octubre de l’any 2007 conté més de cent milions de seqüències i prop de dos-cents mil milions de nucleòtids. El seu creixement continua sent exponencial (vegeu la figura 3). A més, multitud d’altres bases de dades (de seqüència

i estructura de proteïnes, de regions promotores del gens, de processos bioquímics, d’experiments amb microxips, etc.) han estat creades des d’aleshores (vegeu, per exemple, l’edició especial de la revista Nucleic Acid Research dedicada a les bases de dades en biologia, que es publica el mes de gener de cada any (http://nar.oxfordjournals.org/content/vol35/suppl_1/index.dtl). RECONEIXEMENT DE PATRONS EN SEQÜÈNCIES Aviat la seqüenciació d’àcids nucleics reemplaçaria la seqüenciació de proteïnes; fins i tot per obtenir la seqüència d’una proteïna era més senzill obtenir primer la se-

Figura 3. Creixement de la base de dades EMBL, que conté informació sobre les seqüències d’àcids nucleics conegudes. En el moment de la seva fundació, el 1982, les seqüències d’àcids nucleics dipositades a dins sumaven al voltant de 500.000 nucleòtids. L’octubre de 2007 sumaven al voltant de 200.000 milions.

BIOINFORMÀTICA 19

qüència de DNA del gen que la codifica i a partir d’aquesta deduir la seqüència d’aminoàcids de la proteïna, que no pas seqüenciar la proteïna directament. Però mentre que la seqüència de les proteïnes és funcional en la seva totalitat, no ocorre el mateix amb la seqüència del DNA. En realitat, una gran part del genoma dels organismes eucariotes superiors sembla buit de funció. En particular, els gens eucariotes no es codifiquen de manera contínua en la seqüència de DNA, sinó que les regions que codifiquen, els exons estan separades per regions de longitud usualment molt major, els introns, de funció majoritàriament desconeguda. Senyals (motius, patrons) de seqüència delimiten les regions funcionals en la seqüència dels àcids nucleics i fan possible el seu reconeixement per part de la maquinària

A C G T

-3 35.1 34.8 18.5 11.6 C/A

cel·lular. El problema del reconeixement de patrons en seqüències d’àcids nucleics (i també de proteïnes) comença a adquirir rellevància. L’any 1982, per exemple, Fickett (1982) desenvolupa un dels primers mètodes per identificar dominis funcionals en seqüències de DNA (regions codificants, en aquest cas concret). Aquests mètodes es basen en la definició d’un patró de seqüència (no sempre explícit), i en la implementació d’un algoritme per a la localització en seqüències problema. Un patró de seqüència és un objecte que denota un conjunt de seqüències en un alfabet determinat (l’alfabet dels quatre nucleòtids en el cas del DNA, o l’alfabet dels vint aminoàcids en el cas de les proteïnes). Les expressions regulars constitueixen un dels mètodes més estesos per definir patrons

-2 -1 +1 +2 +3 +4 +5 +6 59.6 8.7 0.0 0.0 50.7 72.1 7.0 15.8 13.3 2.7 0.0 0.0 2.8 7.6 4.7 17.2 13.2 80.9 100.0 0.0 43.9 12.2 83.1 18.8 13.9 7.7 0.0 100.0 2.5 8.1 5.2 48.3 A G G T A A G T

Figura 4. Part superior. Matriu de puntuacions específica de posició (position specific scoring matrix, PSSM) corresponent als llocs donadors d’empalmament en gens humans. Els llocs donadors d’empalmament són els senyals que defineixen les fronteres entre les regions codificants (exons) i les no codificants (introns). L’intró comença en la posició +1. Com és possible observar, els dos primers nucleòtids de l’intró són sempre GT. Qualsevol nucleòtid pot apareixer en les altres posicions del senyal; no obstant això, alguns nucleòtids apareixen amb probabilitats molt distintes en algunes posicions. Així, per exemple, la probabilitat del nucleòtid G en la posició +4 és 0,83, mentre que la del nucleòtid C en aquesta posició és només 0,05. Part inferior. Representació gràfica en forma de logotip de la matriu de puntuacions. En cada posició, els nucleòtids apareixen en una grandària proporcional a la seva probabilitat. La grandària total de cada posició és proporcional al seu contingut informatiu. Com més allunyada de la distribució a l’atzar és la distribució de probabilitats dels nucleòtids en una posició, més informativa és aquesta posició.

20 R. GUIGÓ

de seqüència en aquests alfabets. En una expressió regular, l’alfabet original s’estén amb símbols addicionals que denoten, per exemple, la possibilitat de símbols alternatius en una determinada posició o el fet que una determinada posició pot no estar necessàriament present. Així el patró C.[STA]..C[STA][^P]C denota les seqüències d’aminoàcids constituïdes per la seqüència: cisteïna (C), qualsevol aminoàcid (.), serina, treonina o alanina ([STA]), qualsevol aminoàcid (.), cisteïna (C), serina, treonina o alanina ([STA]), qualsevol aminoàcid, llevat de prolina ([^P]) i cisteïna (C). Aquest patró constitueix la signatura específica de la regió d’unió al ferro de les proteïnes que pertanyen a la família

de les ferredoxines. El patró prové, en aquest cas, de la base de dades PROSITE, una base de dades de patrons de seqüència d’aminoàcids molt usada en biologia molecular. En ocasions és important especificar la probabilitat amb la qual els diferents símbols apareixen en cada posició, ja que probabilitats distintes en una determinada posició poden reflectir fenòmens biològics subjacents; per exemple, diferent afinitat en la interacció entre la seqüència que conté el patró i una altra bioseqüència distinta, depenent del nucleòtid o aminoàcid que ocupa aquesta posició. Aquestes probabilitats configuren les anomenades matrius de puntuació específiques de posició (position specific scoring matrices, PSSM) (vegeu la figura 4). Mitjançant aquestes matrius és possible calcular la probabilitat que una determinada

>sp|P01128|TSIS_SMSAV TRANSFORMING PROTEIN P28-SIS

Length = 226 Score = 140 bits (350), Expect = 2e-33 Identities = 75/161 (46%), Positives = 100/161 (61%), Gaps = 11/161 (6%) Query: 25 Sbjct: 10 Query: 85 Sbjct: 65

IPREVIERLARSQIHSIRDLQRLLEIDSVGSEDSLDTSLRAHGVHATKHVPEKRPLPIRR 84 IP E+ + L+ I S DLQRLL+ DS G ED + L H+ + R IPEELYKMLSGHSIRSFDDLQRLLQGDS-GKEDGAELDLNMTRSHSGGELESLA----RG 64 KRSI------EEAVPAVCKTRTVIYEIPRSQVDPTSANFLIWPPCVEVKRCTGCCNTSSV 138 KRS+ E A+ A CKTRT ++EI R +D T+ANFL+WPPCVEV+RC+GCCN +V KRSLGSLSVAEPAMIAECKTRTEVFEISRRLIDRTNANFLVWPPCVEVQRCSGCCNNRNV 124

Query: 139 KCQPSRVHHRSVKVAKVEYVRKKPKLKEVQVRLEEHLECAC 179 +C+P++V R V+V K+E VRKKP K+ V LE+HL C C Sbjct: 125 QCRPTQVQLRPVQVRKIEIVRKKPIFKKATVTLEDHLACKC 165 Figura 5. Resultat de la comparació de la seqüència del platelet derived growth factor amb totes les seqüències d’aminoàcids en la base de dades amb el programa BLAST. El programa identifica totes les seqüències amb les quals la seqüència problema exhibeix alguna similitud i mostra el seu alineament local. En la figura es mostra, en concret, l’alineament entre la seqüència del platelet derived growth factor (query) i la transforming protein P28-SIS (subject), un oncogen. La seqüència intermèdia indica el grau de conservació dels residus alineats. Quan aquests estan conservats, l’aminoàcid conservat apareix en la seqüència intermèdia; quan ocorre una substitució conservada el signe «+» apareix en aquesta seqüència. Si no hi ha conservació, no apareix cap símbol. Els guions (–) indiquen gaps en una de les seqüències alineades. El score és la puntuació global de l’alineament (d’acord amb la matriu de substitució anomenada BLOSUM62, similar a la PAM250). Expect és el nombre d’ocasions en les quals esperem trobar per atzar alineaments amb una puntuació igual o superior a la puntuació en score. En aquest cas, la probabilitat de trobar per atzar un alineament com el de la figura és extraordinàriament baixa. Això ens indueix a pensar que les dues seqüències estan relacionades funcionalment. El descobriment per part de Doolittle d’aquesta semblança el 1983 va contribuir a millorar la nostra comprensió dels mecanismes moleculars involucrats en el càncer.

BIOINFORMÀTICA 21

subseqüència pertanyi a un determinat patró. Poden utilitzar-se mètodes més sofisticats quan les posicions al llarg del patró no són independents. Una tècnica molt potent per representar patrons la constitueixen els anomenats models de Markov ocults (hidden Markov models, HMM). En aquests models s’assumeix que una determinada seqüència està constituïda per dominis funcionals diferents (per exemple, una seqüència gènica està constituïda per la successió d’exons i introns). El nombre i localització exactes d’aquests dominis o estats, però, són a priori desconeguts i el problema consisteix a identificar-los a partir només de la seqüència observada (de nucleòtids en aquest cas). Es coneixen, però, les probabilitats de cada residu característiques de cada domini particular, les anomenades probabilitats d’emissió (per exemple, els introns són en general més rics en nucleòtids A i T que els exons), així com les probabilitats de transició entre els diferents estats. Per tant, es pot calcular la probabilitat d’una seqüència observada, donada una determinada partició de la seqüència en estats. Existeixen algoritmes molt eficients per determinar quina és la partició de la seqüència en estats, que fan que la probabilitat de la seqüència observada sigui màxima. Aquesta partició és la que es considera la solució del problema. Seqüència problema 1

Taula hash K = 1 A

2 6

9 12

5 7

Figura 6. Taula hash k = 1 d’una seqüència d’aminoàcids. En aquest cas, la taula hash simplement indica en quines posicions de la seqüència apareixen els diferents nucleòtids.

RECERQUES DE SEMBLANÇA EN BASES DE DADES L’existència de compilacions electròniques de seqüències va facilitar-ne extraordinàriament l’anàlisi computacional. Va ser precisament mentre realitzava comparances entre les seqüències emmagatzemades en les recentment creades bases de dades electròniques que Doolittle va descobrir el 1983 la semblança entre la seqüència d’un oncogen i la seqüència d’un factor de creixement (vegeu la figura 5). Una relació que havia passat desapercebuda als investigadors de Harvard i de Caltech que havien estudiat aquest gen, i que contribuïa a la comprensió dels mecanismes moleculars involucrats en el càncer. Aquest i altres resultats semblants, en els quals la funció d’un gen era (almenys parcialment) inferida a partir de la semblança de la seva seqüència amb seqüències de funció coneguda, van demostrar la importància de les recerques de semblança en les bases de dades. A mesura que augmentava la grandària de les bases de dades de seqüències, però, els algoritmes de programació dinàmica desenvolupats per Need leman i Wunsch, i Smith i Waterman, van esdevenir massa lents per portar a terme, de manera eficient, recerques de semblança entre una seqüència nova i les seqüències prèviament emmagatzemades en les bases de dades. Programes com FASTA (Lipman i Person, 1988) i BLAST (Altschul et al., 1990) van resoldre aquest problema mitjançant la utilització d’algoritmes heurístics que proporcionaven alineaments generalment molt aproximats a l’alineament òptim, encara que no necessàriament l’alineament òptim, i que eren molt més ràpids. Aquests algoritmes utilitzen una tècnica informàtica coneguda com a taules hash per accelerar la comparació i l’alineament de seqüències. Una taula hash de dimensió 1 d’una seqüència és una taula en la qual es registra la posició en què apareix cada un

22 R. GUIGÓ

dels vint aminoàcids (o dels quatre nucleòtids) en la seqüència (vegeu la figura 6). En una taula hash de dimensió 2 es registra l’aparició de cada diaminoàcid (o dinucleòtid), i així successivament. Aleshores, donades dues seqüències, es construeix la taula hash d’una d’aquestes. La segona seqüència, es compara aleshores amb aquesta taula. L’avantatge és que els ordinadors poden indexar les taules hash pels caràcters, en lloc de fer-ho per les posicions. És a dir, quan en la segona seqüència trobem el símbol «A» , un programa d’ordinador pot accedir directament (en una sola operació) el registre de la taula que conté les posicions en les quals el símbol «A» apareix en la primera seqüència. D’aquesta manera és possible identificar ràpidament regions d’alta semblança entre les dues seqüències, les quals s’utilitzen d’ancoratge per construir l’alineament, sense necessitat d’explorar totes les possibilitats que s’exploren implícitament en els algoritmes de programació dinàmica. El risc, però, és que l’ancoratge inicial porti a la construcció d’un alineament subòptim (és a dir, amb una puntuació inferior, d’acord amb la matriu de substitució emprada, que la puntuació màxima). Com més gran és la dimensió de la taula hash, més gran és el guany d’eficiència comparat amb l’algoritme de programació dinàmica, però més gran és també el risc d’obtenir un alineament subòptim. L’enorme importància dels algoritmes de recerca de semblança en bases de dades en la investigació en biologia molecular queda reflectida en el fet que l’article que descriu el programa BLAST (Altschul et al., 1990) ha estat el més citat en biologia durant la dècada dels noranta. EL PROJECTE GENOMA HUMÀ: BIOLOGIA I COMPUTACIÓ Atesos els avenços en la dècada anterior,

quan l’any 1990 començava «oficialment» el Projecte Genoma Humà, ja es considerava indispensable el concurs de la computació. Com pot llegir-se en un dels documents que a principis dels noranta va elaborar el Departament d’Energia (DOE), l’organisme que al costat dels Instituts Nacionals de Salut (NIH), ha estat responsable als Estats Units del desenvolupament del Projecte Genoma Humà: «Els sistemes computacionals tenen un paper essencial en tots els aspectes de la investigació genòmica, des de l’adquisició de les dades fins a l’anàlisi i manipulació. Sense ordinadors potents i sistemes apropiats per al tractament de les dades, la investigació genòmica és impossible.» Tanmateix, el creixement exponencial de les bases de dades de seqüències durant la dècada dels vuitanta plantejava cada vegada problemes més greus de manteniment i actualització. El model original sobre el qual es van estructurar aquestes bases de dades requeria una considerable intervenció humana, un tipus de recurs que, òbviament, no podia créixer al mateix ritme. També, el nombre de bases de dades especialitzades creixia sense parar. No es tracta només de bases de dades de seqüències, sinó també de dades de molts altres tipus: mapes físics i genètics, estructures de proteïnes, xarxes metabòliques, dades funcionals a escales distintes, etc. Els investigadors necessiten accedir de manera immediata i transparent a aquesta informació. Per exemple, aquells investigadors interessats en un gen determinat volen conèixer la seqüència, la localització cromosòmica, la funció i l’estructura de gens similars, els teixits o estadis del desenvolupament en els quals s’expressa el gen, gens homòlegs en altres organismes, etc. A principis dels anys noranta aquesta informació es trobava dispersa en dotzenes de bases de dades especialitzades distintes, cadascuna amb la seva estructura pròpia i la seva manera peculiar d’accés. Va ser precisament en aquells anys que

BIOINFORMÀTICA 23

els científics del CERN (Organització Europea per a l’Energia Nuclear) van inventar la tecnologia world wide web (WWW) sobre Internet (la xarxa d’ordinadors desenvolupada als Estats Units gairebé dues dècades abans). WWW era la plataforma adequada que permetia resoldre molts dels problemes de manteniment, actualització, accés i integració de les bases de dades en biologia molecular. En certa manera, sense Internet i la tecnologia WWW el Projecte Genoma Humà no hauria estat possible, almenys, de la manera com els coneixem avui. De fet, Internet ha estat, i continua sent, el la-

boratori virtual en el qual té lloc la recerca genòmica. Tres sistemes, en particular, que utilitzen la tecnologia WWW, faciliten l’accés de tota la comunitat (i no solament de la comunitat científica) a la informació genòmica distribuïda en múltiples bases de dades: el sistema ENSEMBL (http://www.ensembl.org, vegeu la figura 7) a Europa, i el servidor de NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih. gov/Genomes/index.html) i el Genome Browser (http://genome.ucsc.edu/) als Estats Units. Certament, la quantitat de dades que genera la recerca genòmica fa que no puguem pensar, avui dia, la biologia sense la infor-

Figura 7. Visualització d’una regió del genoma humà a traves del navegador genòmic ENSEMBL (www.ensembl.org). Aquesta representació diagramàtica ens mostra els gens que han estat anotats o predits en una regió de cent mil nucleotids del cromosoma 6 humà.

24 R. GUIGÓ

màtica. Pot argumentar-se, tanmateix, que la generació massiva de dades no és patrimoni de la investigació en biologia, i que el mateix fenomen té lloc en àrees tan diverses de la ciència com l’astronomia, l’economia, la física d’altes energies, la meteorologia, etc. I que, en totes, els mètodes computacionals tenen un paper essencial en el tractament i interpretació de les dades. És cert. Però per què, doncs, com podem comprovar de nou a Google, existeixen tan pocs documents a Internet en els quals apareguin termes com astroinformatics, meteoinformatics, econoinformatics, o semblants, en contrast amb les desenes de milions de documents en els quals apareix el terme bioinformatics? En la meva opinió, això és en part així perquè la relació entre biologia i computació s’estableix a un nivell més íntim que no pas simplement el de la quantitat de les dades, i té a veure amb la «qualitat» (entesa com la naturalesa) d’aquestes dades. La vida comença quan els nucleòtids s’organitzen en la seqüència del genoma. Per sota de la seqüència del genoma hi ha la química i la física. I és l’ordre particular dels nucleòtids d’aquesta seqüència, més que no pas les seves característiques fisicoquímiques (el codi, com tan bé va anticipar Shröedinger

als anys quaranta, que dicta les característiques biològiques dels éssers vius). I la vida, el desplegament en el món d’un ésser viu, és aleshores una computació, gairebé en un sentit paradigmàtic, sobre la seqüència del genoma. Un dels grans reptes de la biologia del segle xxi és, precisament, desxifrar els múltiples codis mitjançant els quals es produeix aquesta computació. BIBLIOGRAFIA Altschul, S. F.; Gish, W.; Miller, W.; Myers, E. W.; Lipman, D. J. (1990). «Basic local alignment search tool». Journal of Molecular Biology, 215: 403-410. Dayhoff, M.; Schwartz, R.; Orcutt, B. (1978). «A model of evolutionary change in protein». Atlas of Protein Sequences and Structure, 5: 345-352. Fickett, J. W. (1982). «Recognition of protein coding regions in DNA sequences». Nucleic Acids Research, 105: 303-318. Lipman, D. J.; Pearson, W. R. (1985). «Rapid and sensitive protein similarity searches». Science, 2271: 435-441. Needleman, S. B.; Wunsch, C. D. (1970). «A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequence of two proteins». Journal of Molecular Biology, 484: 43-53. Smith, T. F.; Waterman, M. S. (1981). «Identification of common molecular subsequences». Journal of Molecular Biology, 1471: 95-97.

DOI: 10.2436/20.1501.02.42

Les biotecnologies (Pere Puigdomènech i Francesc Gòdia, ed.) Treballs de la SCB. Vol. 58 (2007) 25-38

BIOLOGIA ESTRUCTURAL Miquel Coll Institut de Recerca Biomèdica i Institut de Biologia Molecular de Barcelona, CSIC, Parc Científic de Barcelona. Adreça per a la correspondència: Miquel Coll. Institut de Recerca Biomèdica i Institut de Biologia Molecular de Barcelona, CSIC, Parc Científic de Barcelona. Josep Samitier, 1-5. 08028 Barcelona. Adreça electrònica: mcoll@ibmb.csic.es. RESUM La biologia estructural ha arribat a la seva maduresa. Avenços tecnològics sense precedents han ajudat, en el últims anys, a assolir resultats espectaculars, tant pel que fa al nombre d’estructures de macromolècules resoltes com a la complexitat d’algunes d’aquestes. L’aplicació biotecnològica està ben establerta, per exemple, en el procés de desenvolupament de fàrmacs. Tot i així, la biologia estructural i, en particular, la cristal·lografia de macromolècules, es troba en un moment de reflexió. Podem seguir endavant com fins ara i esperar nous descobriments importants per a la biologia o cal buscar nous camins? Paraules clau: biologia estructural, complex de proteïnes, genòmica estructural, difracció de raigs X, cristal·lografia. STRUCTURAL BIOLOGY SUMMARY Structural biology has reached maturity. During recent years unprecedented technological advances have contributed to spectacular results both in the number of macromolecular structures solved and in the complexity of some of these. The biotechnological application of this branch of biology is well established, for example, in drug development. However, structural biology, in particular macromolecular crystallography, is now being reconsidered. Can we expect further discoveries with great impact in biology or should we look for new avenues? Key words: structural biology, protein complex, structural genomics, X-ray diffraction, crystallography.

26 M. COLL

Francis Crick deia que si vols conèixer la funció t’has de mirar l’estructura (Crick, 1988). I és veritat: el fet de conèixer l’estructura molecular dels àcids nucleics i les proteïnes ha obert moltes portes per entendre com funcionen aquestes macromolècules, que es troben en la base de la vida. Però com s’ha de mirar l’estructura? Les tres tècniques més importants per determinar estructures moleculars en 3D són la difracció de raigs X (RX), la ressonància magnètica nuclear (RMN) i la microscòpia electrònica (ME). Cadascuna té els seus avantatges i inconvenients i cadascuna pot donar una visió diferent i complementària (vegeu la figura 1).

LA MICROSCÒPIA ELECTRÒNICA Comencem per la darrera. La microscòpia electrònica (ME) i, concretament, la reconstrucció tridimensional de partícules a partir d’imatges de les mateixes amb orientacions diverses, proporciona un model fiable en 3D. Això es pot fer de dues maneres: mitjançant tinció negativa o criomicroscòpia. En la primera de les tècniques la mostra es tracta amb una sal d’un metall pesant que dispersarà molt més els electrons que no pas els àtoms de la proteïna, i proporcionarà així un contrast fort entre aquest i la mostra. La imatge que s’obté serà, per tant, el «negatiu» de l’espècimen en qüestió i tindrà un cert grau de distorsió. La resolució, atès el granulat mateix de la sal pesada, no passarà dels 15 o 20 Å. La reconstrucció final serà, doncs, una visió de la forma global,

Figura 1. La microscòpia electrònica, la ressonància magnètica nuclear i la cristal·lografia de raigs X permeten analitzar l’estructura en 3D de les macromolècules. Les fletxes indiquen quina tècnica és adient segons la mida de la molècula o partícula. Les fletxes petites de la RMN indiquen que aquest mètode es pot emprar per determinar fragments o dominis de les proteïnes o acoblaments grans. D’esquerra a dreta: cofactor A de plegament de la tubulina (Guasch et al., 2002), complex relaxasa/DNA (Guasch et al., 2003), proteïna acobladora de la conjugació TrwB (Gomis-Rüth et al., 2001), RNA-polimerasa ii (Cramer et al., 2001), virus de la llengua blava (Grimes et al., 1998).

BIOLOGIA ESTRUCTURAL 27

no gaire definida, de la partícula (vegeu la figura 2). Aquesta tècnica clàssica és relativament senzilla, ja que costa poc preparar les mostres, i encara es fa servir molt. L’altra tècnica, la criomicroscòpia, és més moderna; proporciona imatges sense distorsió i una resolució major (vegeu la figura 13). La congelació de la mostra a la temperatura del nitrogen líquid o encara més baixa permet augmentar considerablement la radiació que pot suportar l’espècimen sense que es destrueixi i, per tant, es poden fer servir microscopis electrònics més potents, com els de canó d’emissió de camp (FEG), de 200 o 300 kV. La mostra, però, no es pot congelar de manera ordinària, ja que els cristalls de gel que es formarien amb l’aigua de la solució en què es troba la farien malbé. Aquesta aigua s’ha de vitrificar, congelant-la a gran velocitat. Les imatges amb mostres tractades d’aquesta manera tenen poc contrast, però estan més protegides i proporcionen reconstruccions fidedignes, sense distorsions. La mitjana de moltes imatges per compensar el poc contrast de la criomicroscòpia i assolir la reconstrucció 3D de les partícules es fa amb ordinadors potents. Es necessiten moltes projeccions diferents de la mateixa partícula, bé aprofitant que les partícules es troben diposi-

tades a la reixeta portamostres en diverses orientacions o bé inclinant la reixeta mateixa en diversos angles. No totes les mostres es deixen tractar bé criogènicament, i això és un factor limitant. També la mida de la partícula ho és, ja que el poc contrast fa encara més difícil o impossible treballar amb partícules petites. Però si tenen la mida apropiada i es comporten adequadament en vitrificar-les, els resultats són espectaculars: ens podem apropar als 4 o 5 Å de resolució, una resolució que permet començar a localitzar elements d’estructura secundària, com ara les hèlixs alfa (Henderson, 2004). Tot i així, aquests són casos favorables i encara estem lluny dels detalls que, de vegades, ens interessen: els àtoms. És clar, però, que la criomicroscòpia electrònica és una tècnica molt potent que ha revolucionat el camp i que, per exemple, complementada amb la difracció de raigs X permet obtenir estructures quasiatòmiques, com veurem més endavant. Un altre desenvolupament prometedor en la microscòpia electrònica és la tomografia. També en aquest cas es fa una reconstrucció 3D amb ordinadors (un tomograma), però a partir d’imatges d’una sola partícula, en diversos angles. El problema és que la resolució és proporcional al rang

Figura 2. Proteïna iniciadora de la replicació RepB (Boer et al., 2007). Esquerra: Reconstrucció en 3D a partir d’imatges de ME de tinció negativa. Dreta: Estructura de RX.

28 M. COLL

angular de rotació cobert, és a dir, que per tenir resolucions acceptables s’han de prendre imatges en molts angles. I, com més imatges es prenguin, més patirà la mostra. L’automatització recent dels microscopis ha permès fer aquest procés ràpidament, minimitzant-ne el dany electrònic. Grans orgànuls i cèl·lules senceres que no poden ser estudiats amb les tècniques microscòpiques abans esmentades poden ser, sorprenentment, visualitzats en 3D amb la tomografia electrònica (Nickell et al., 2006). LA RESSONÀNCIA MAGNÈTICA NUCLEAR La ressonància magnètica nuclear (RMN), a diferència de la microscòpia electrònica, permet determinar la posició de gairebé cadascun dels àtoms que formen part d’una proteïna o àcid nucleic (Ferentz i Wagner, 2000). En aquest sentit els resultats són semblants a la cristal·lografia, però, a diferència d’aquesta, no necessita que la macromolècula formi part d’un cristall. L’experiment es fa en solució aquosa i, per tant, ens estalviem un coll d’ampolla important com és la cristal·lització, sempre dificultosa i impredictible. Un altre avantatge de la RMN és que podem estudiar amb més facilitat les

Figura 3. Estructura de l’α-sarcina determinada per NMR (Perez-Canadillas et al., 2002). La major o menor flexibilitat, segons la zona, està representada pel gruix variable de la cadena polipeptídica.

propietats dinàmiques de les macromolècules (vegeu la figura 3). A més, amb aquesta tècnica es pot obtenir informació estructural de macromolècules que no tenen una única estructura sinó diverses en equilibri. Una aplicació clara d’aquesta capacitat és l’estudi del plegament de les proteïnes en què poden ser caracteritzats estats de plegament parcial. La limitació més gran de la RMN —i que no ho és pas en ME ni en RX— és la mida de la proteïna, que sol estar al voltant dels 20 o 30 kDa, encara que hi ha algun estudi que ha arribat fins als 80 kDa. Per adquirir un espectre de RMN s’ha de posar la mostra dins d’un camp magnètic proporcionat per una bobina superconductora refredada amb heli líquid i s’ha d’irradiar amb polsos de radiofreqüència. La utilització de camps magnètics elevats representa un avenç molt important per a l’estudi de biomolècules, ja que dóna lloc a un augment de la sensibilitat i de la dispersió i a una disminució de l’amplada dels senyals que permet abordar proteïnes més grans. En la RMN la magnitud del camp magnètic s’expressa com la freqüència de ressonància del 1H i els aparells comercials actuals arriben fins a 900 MHz, tot i que la instal·lació dels primers aparells d’1 GHz és imminent. A Catalunya hi ha un instrument de 800 MHz al Parc Científic de Barcelona. A banda dels estudis dinàmics, una altra aplicació molt avantatjosa de la RMN és la caracterització de les interaccions de les proteïnes amb diferents lligands, ja siguin altres macromolècules o molècules petites com ara inhibidors o fàrmacs. Segons la tècnica que es faci servir (p. ex., STD), es pot caracteritzar aquesta interacció sense haver de determinar l’estructura completa de la proteïna. Això pot ser molt ràpid i, per tant, factible per fer cribratges de petites molècules respecte a la seva capacitat d’unir-se a una proteïna determinada, que pot ser una diana farmacològica. L’aplicació d’aquesta tècnica a la indústria farmacèutica és,

BIOLOGIA ESTRUCTURAL 29

doncs, evident. La RMN es pot fer servir també per caracteritzar les interaccions febles entre proteïnes, útils, per exemple, per entendre fenòmens de regulació. Malgrat que la RMN no requereix la formació de cristalls, la determinació de les estructures 3D de proteïnes no sol ser més ràpida que mitjançant RX, ja que, a més del marcatge de la proteïna amb 15N i 13C, es necessiten assignar els senyals de ressonància als nuclis atòmics individuals, en definitiva, a cada un dels aminoàcids de la proteïna. Aquest procés és certament laboriós, malgrat els recents desenvolupaments de programari d’assignació automàtica. LA DIFRACCIÓ DE RAIGS X Si accedim al Protein Data Bank (PDB), la base de dades en què es troben totes les estructures 3D de les macromolècules, veurem que hi ha arxivades, actualment, 48.181 estructures atòmiques. D’aquestes, el 85 %, han estat determinades per RX. Aquesta és, doncs, la tècnica d’anàlisi estructural que

Figura 4. Densitat electrònica corresponent a una part de l’estructura de RX de l’activador transcripcional PhoB (Blanco et al., 2002). L’alta resolució permet localitzar tots els àtoms de la proteïna i, fins i tot, la primera capa d’hidratació.

ha proporcionat un major nombre d’estructures i segurament, si les coses no canvien molt, ho continuarà sent en el futur. Aquesta és, a més, la tècnica que proporciona major resolució, que en els casos més favorables s’apropa a l’àngstrom, la unitat de distancia d’enllaç entre dos àtoms. El detall i, per tant, la informació que pot proporcionar una estructura 3D de RX, no admet comparacions (vegeu la figura 4). Tampoc no hi ha limitació en la mida de la proteïna, complex o partícula a estudiar... sempre que cristal· litzi. El boom de la cristal·lografia de proteïnes, en el qual s’ha passat de les quatre-centes estructures de RX que hi havia dipositades al PDB a finals dels noranta a les quaranta mil que hi ha ara, s’ha degut a diversos factors (Dauter, 2006). En primer lloc, a la possibilitat d’obtenir proteïnes amb tècniques de DNA recombinant, sense haver de dependre de mètodes d’extracció a partir de teixits i fent accessibles, per clonatge i expressió en bacteris o en altres sistemes, quantitats suficients de proteïna per emprendre estudis estructurals. I això es pot fer amb tot tipus de proteïnes, per minoritàries que siguin a la cèl·lula. La cristal·lització mateixa, tot s’ha de dir, no ha avançat gaire conceptualment (encara que els automatismes hagin facilitat les coses, com veurem més endavant). La coneguda tècnica de difusió de vapor, en la qual es concentra, a poc a poc, una solució de proteïna fins a fer-la precipitar ordenadament —el que és un cristall— segueix sent el sistema emprat majoritàriament. La cristal·lització, curiosament, no depèn de la mida de la macromolècula: hi ha enormes bacteriòfags que s’han cristal·litzat (Abrescia et al., 2004) i petites proteïnes d’un centenar d’aminoàcids amb les quals resulta impossible. Es tracta d’un procés difícil de controlar, en el qual pot arribar a ser determinant la presència d’un sol aminoàcid a la superfí-

30 M. COLL

cie de la proteïna que faciliti o dificulti la interacció amb les molècules veïnes que formaran el cristall. Per descomptat, influeixen també la temperatura, el pH, les sals, el tampó, els additius, els detergents, el precipitant, el volum de les gotes de cristal· lització, la proporció entre proteïna i precipitant... Massa variables. I quan passa això no hi ha més remei que fer cribratges, en aquest cas de centenars o milers de condicions de cristal·lització. Si això tampoc no funciona cal provar proteïnes una mica diferents: homòlegs d’altres espècies o construccions una mica més llargues, o una mica més curtes, o amb alguns aminoàcids de la superfície mutats o modificats. Un cop obtinguts els cristalls, que no passen d’uns centenars de micròmetres, s’han

d’irradiar amb un feix de raigs X. El cristall, més concretament els electrons dels àtoms continguts en aquest, dispersaran els raigs X incidents i, a causa del seu ordre en una xarxa, donaran lloc al fenomen de la difracció. Doncs bé, la construcció de sincrotrons dedicats, de tercera generació, on es generen raigs X d’altíssima intensitat, ha estat un dels factors determinants per a l’augment exponencial d’estructures resoltes. Però no ha estat només la brillantor del feix, que en un sincrotró és d’ordres de magnitud superior al d’un generador de raigs X convencional, el que ha estat determinant per poder resoldre milers d’estructures en pocs anys: també ho ha estat el fet que la radiació de sincrotró és sintonitzable. És a dir, podem variar l’energia o longitud d’ona dels raigs

Figura 5. Vista de les obres del sincrotró Alba l’octubre de 2007. Es poden veure les parets protectores de formigó entre les quals passarà l’anell, amb les sortides tangencials, una per a cada línia de llum.

BIOLOGIA ESTRUCTURAL 31

X. Aquesta característica permet aprofitar l’anomenada difracció anòmala que tenen certs àtoms pesants i, així, amb un sol derivat pesant es pot resoldre l’estructura tridimensional. Aquest derivat es pot preparar directament quan expressem la proteïna si fem servir un medi en què l’aminoàcid metionina ha estat substituït per selenometionina. Aquesta s’incorpora a les proteïnes en lloc de l’aminoàcid natural i el seleni, un àtom que dispersarà els fotons anòmalament, serà útil per resoldre l’estructura. Un altre factor clau per a l’acceleració de tot el procés de determinació d’estructures ha estat el desenvolupament de detectors bidimensionals —CCD als sincrotrons—, que permeten la recollida de dades de difracció, de milers de reflexions, en uns pocs minuts. A Cerdanyola del Vallès s’està construint un sincrotró, anomenat ALBA, que inclou una línia de llum per a cristal·lografia de ma- cromolècules i altres —microscòpia de raigs X, difracció de baix angle— també per a aplicacions biològiques (vegeu la figura 5). Amb un pressupost de 200 milions d’euros, serà la instal·lació científica més gran de la península i un instrument extraordinari per a la biologia estructural al nostre país. És clar, que si se sap aprofitar, també serà

Figura 6. Resultats dels projectes de genòmica estructural segons el registre del Protein Data Bank l’octubre de 2007 (http://www.rcsb.org/pdb).

una eina molt valuosa per a la indústria biotecnològica i farmacèutica. Finalment, com en altres camps de la ciència, el desenvolupament d’ordinadors molt ràpids i de sistemes gràfics molt potents ha facilitat les coses als cristal·lògrafs, com així ha estat també per als biòlegs estructurals que fan servir ME i RMN. LA GENÒMICA ESTRUCTURAL I LES TÈCNIQUES D’ALT RENDIMENT Els avenços en la seqüenciació del genoma humà i la seqüenciació completa del genoma de diversos organismes, units a les tècniques de DNA recombinant, van obrir les portes a la determinació massiva d’estructures 3D de proteïnes (Grabowski et al., 2007). Si s’han pogut seqüenciar tots els gens d’un organisme, per què no s’han de poder resoldre les estructures de totes les proteïnes que codifiquen aquests gens? A finals dels noranta es van començar a organitzar iniciatives i consorcis, inicialment als EUA i al Japó, per implementar tecnologies automatitzades que fessin possible aquest objectiu ambiciós. La tasca ha estat més difícil del que pensaven alguns i, certament, no s’ha pogut resoldre cap «genoma estructural» complet. La figura 6 mostra que de les més de cent mil dianes (proteïnes o dominis) dipositades públicament pels diferents consorcis de genòmica estructural arreu del món, menys d’un 10 % s’han aconseguit cristal·litzar. Aquest percentatge anirà augmentant, ja que les dianes es dipositen des del bon començament dels projectes, però ara ja és clar que, ni de bon tros, ens aproparem mai al 100 %. És cert però, que moltes proteïnes han estat resoltes per part d’aquests consorcis, concretament 5.608, però ja s’indica també que per a 27.393 proteïnes s’ha aturat la feina. Sobretot, el que s’ha resolt és el que algú ha anomenat, amb prou encert, els fruits de les branques més bai-

32 M. COLL

xes, és a dir, les proteïnes menys difícils, per exemple aquelles expressables fàcilment en forma soluble. Un dels grans èxits de la genòmica estructural ha estat, però, el desenvolupament de tecnologies automatitzades o d’alt rendiment que s’han anat incorporat a la vida normal dels laboratoris estructuralistes encara que no sigui per a la determinació massiva d’estructures, sinó més aviat per a projectes molt focalitzats. El primer punt d’automatització ha estat en el clonatge i expressió. Passar del tub Eppendorf i de les pipetes d’un sol canal a la placa de 96 i les pipetes multicanals o robots de dispensació de líquids requereix un esforç de reconversió organitzativa i també de diners. Però pot pagar la pena. De vegades, per resoldre amb èxit una sola proteïna. Hem dit que un coll d’ampolla del treball estructural és la cristal·lització. Un altre, abans que aquest, és l’expressió de la proteïna soluble. Moltes proteïnes s’expressen molt malament o s’agregen formant cossos d’inclusió d’on difícilment es poden recuperar. Els mètodes automàtics i paral·lelitzats permeten provar l’expressió de moltes construccions diferents de la mateixa proteïna, per dominis, truncant progressivament els extrems, etc. Aquesta metodologia portada

a l’extrem és el que es coneix com a rendiment ultraalt (Hart i Tarendeau, 2006), en el qual es fan cribratges d’expressió de biblioteques de milers de construccions del gen en qüestió, truncats d’aminoàcid en aminoàcid pels dos extrems. Un altre punt clau d’automatització ha estat la cristal·lització. Aquí també s’ha passat de les plaques de cristal·lització de vint-iquatre pous, fetes a mà, a les de noranta-sis, fetes amb robots capaços de dispensar acuradament volums d’un centenar de nanolitres (vegeu la figura 7). Les gotes de cristal· lització s’han fet, doncs, més petites —p. ex., de 200 nl—, de manera que ara és possible fer cribratges amb un ordre de magnitud menys de mostra proteica. Un aspecte negatiu d’aquesta automatització és que els cristalls són també més petits i molts cops s’han d’escalar amb mètodes més manuals. La comprovació de les plaques també és un problema i fa necessari un altre robot per a l’emmagatzematge i la visualització de les gotes de cristal·lització. També a la recollida de dades ha arribat l’automatització, amb robots per al muntatge dels cristalls al feix de les línies de llum de macromolècules, als sincrotrons. També, cal esmentar el programari que s’ha anat desenvolupant recentment, més amigable i automàtic en alguns aspectes, com és el traçat inicial de la cadena polipeptídica. AIXÒ JA NO ÉS CIÈNCIA!

Figura 7. Placa de cristal·lització de noranta-sis pous en un robot dispensador de nanogotes.

Amb tota aquesta automatització, consorcis milionaris de genòmica estructural i determinació massiva d’estructures, un cristal·lògraf, que actualment és a la Universitat d’Upsala, va exclamar: «Si es pot fer de manera industrial, això ja no és ciència!» Semblaria, doncs, que des d’un punt de vista metodològic el problema ja està resolt i que no caldria més que posar força bruta per acabar resolent totes les estructures. Si

BIOLOGIA ESTRUCTURAL 33

tot són només millores tecnològiques i està perfectament establerta la metodologia per resoldre estructures, on es troba el repte científic? Bé, vist els resultats, fins ara més aviat minsos, dels projectes de genòmica estructural, és clar que moltes proteïnes que, aparentment, per la mida, haurien de ser fàcils de resoldre amb tota la tecnologia disponible, no acaben de poder-se expressar, purificar o cristal·litzar. Només per això ja és evident que la tasca que queda per fer és ingent. Tot i així, es podria argumentar que és un problema purament de temps i que s’acabarà superant, només afinant la tecnologia d’alt rendiment. Sigui això cert o no, el fet és que hi ha àrees de la biologia estructural en les quals la genòmica estructural gairebé (encara) no ha entrat; àrees que es pot dir que estem només començant a explorar. A un parell d’aquestes ens referim a continuació. EL MALSON DE LES PROTEÏNES DE MEMBRANA Entre les proteïnes que certament no són fruits de les branques baixes de l’arbre es troben les proteïnes de membrana. Aquestes proteïnes són de gran interès, ja que fan moltes funcions essencials a la cèl·lula: controlen el tràfic d’ions i altres substàncies a través de la membrana, generen l’energia que necessita la cèl·lula en forma d’ATP, actuen com a antenes captadores de l’energia lumínica en la fotosíntesi, són receptors hormonals, constitueixen sensors de tot tipus que permeten a la cèl·lula relacionarse amb el seu entorn, són part crucial de vies de transducció de senyals, etc. Precisament amb motiu d’algunes d’aquestes funcions hi ha moltes proteïnes de membrana que són dianes farmacològiques rellevants. Conèixer la seva estructura, a més d’ajudar a entendre com funcionen,

ajudaria molt al desenvolupament de fàrmacs nous. Si tornem a mirar el PDB i les 48.181 proteïnes dipositades, resulta que només 280 són transmembranoses (133 úniques o no redundants). És evident que els progressos en aquest camp estan lluny del boom de les proteïnes solubles. Per què són tan difícils d’estudiar? El problema és que les proteïnes de membrana tenen dues cares i no se sap per on mirar-les; tenen parts hidrofòbiques i parts hidrofíliques. Per això són difícils de mantenir en solució: en dissolvents orgànics es desnaturalitzen, en aigua precipiten. Requereixen, doncs, un medi en el qual concorrin les dues característiques: polaritat i apolaritat. Això s’aconsegueix amb detergents que s’han d’afegir, en petites quantitats, a les solucions tamponadores, tant en la purificació com en la cristal·lització. Els avenços tecnològics, incloent-hi la robotització i la miniaturització dels cribratges que hem mencionat abans, també han estat de gran ajut per a les proteïnes de membrana, però els bons resultats s’obtenen aquí molt més a poc a poc. També, una tècnica alternativa a l’ús de detergents, com és la de cristal·litzar en una fase lipídica cúbica, tractant d’imitar la bicapa cel·lular, ha servit en alguns casos, però certament no ha revolucionat el camp. Aquí queda molt per fer. NO ESTAN SOLES Moltes, si no la majoria, de les proteïnes, fan la seva funció interaccionant amb altres proteïnes o altres components cel·lulars, com ara els àcids nucleics. D’aquí ve l’enorme interès a conèixer com són aquests acoblaments o complexos macromoleculars. Els complexos poden anar des d’un parell de proteïnes a dotzenes d’aquestes, barrejades o no amb àcids nucleics. El ribosoma, una partícula o orgànul ben caracteritzat, està format, en els bacteris, per cinquanta-cinc

34 M. COLL

proteïnes i tres molècules de RNA. Malgrat la seva complexitat, la seva estructura 3D ha estat resolta, tant per ME com per RX (vegeu la figura 8), i ha donat lloc a una allau

Figura 8. Estructura 3D de la subunitat gran del ribosoma, determinada per RX (Ban et al., 2000).

Figura 9. L’estructura del transportador transmembranós FepA, determinada per RX; mostra un plegament de tipus barril-β, amb les cadenes β inclinades travessant amunt i avall la membrana cel·lular (Buchanan et al., 1999).

d’informació estructural i funcional sense precedents (Ban et al., 2000; Korostelev et al., 2006; Wimberly et al., 2000). Semblaria, doncs, que tot complex fóra abordable. Com en el cas de les proteïnes de membrana, ja la preparació d’aquests complexos és un problema. En principi es podrien preparar les parts per separat, expressant els components en algun dels sistemes coneguts, i després ajuntar-los. Això pot arribar a ser impossible, ja que aquests components tot sols ben sovint no són solubles perquè presenten grans zones d’interacció proteïna-proteïna més aviat hidrofòbiques, o simplement perquè no es pleguen apropiadament sense els seus partners. Hi ha estratègies per superar això. Una és la de produir subcomplexos, és a dir, complexos formats només per algunes parts o dominis que es puguin expressar solubles i ajuntarlos apropiadament. Algunes d’aquestes estratègies poden ser molt sofisticades (vegeu la figura 10) i requereixen un coneixement exhaustiu de la diana. El treball es torna de nou artesà, cas per cas, i fuig dels mètodes automàtics o d’alt rendiment. Fins i tot si aquestes parts es poden arribar a expressar,

Figura 10. Estructura del subcomplex d’activació transcripcional PhoB/σ4/β-flap/DNA determinat per RX. σ4 i β-flap són parts de les subunitats σ70 i β, respectivament, de la RNA-polimerasa, i es van expressar com una quimera (en una mateixa cadena polipeptídica) per poder obtenir-les solubles i cristal·litzar el complex (Blanco et al., 2007).

BIOLOGIA ESTRUCTURAL 35

reconstruir el complex i arribar a l’estequiometria correcta pot ser molt difícil. Una altra alternativa per preparar complexos és expressar els diversos components a l’hora. Això es pot fer clonant-los cadascun en vectors diferents —p. ex., infectant cèl·lules d’insecte amb diversos baculovirus—, o tots junts en un mateix vector policistrònic. Si els complexos o acoblaments són grans i prou estables es poden purificar directament de la cèl·lula. Òbviament, això requereix cultius molt grans i protocols de purificació prou sofisticats i específics per a aquell complex concret per tal que se’n mantingui la integritat. Un cas espectacular, premiat amb el Nobel de Química de 2006 (Coll, 2006), ha estat l’estructura de la RNA-polimerasa ii de llevat, resolta per RX a alta resolució (vegeu la figura 11; Cramer et al., 2001). La purificació d’aquest enzim amb dotze subunitats requereix cultius de llevat de centenars de litres i l’ús de grans fermentadors. Per a complexos làbils, recentment s’ha desenvolupat un nou mètode per preparar-

los, conegut com a purificació d’afinitat en tàndem (TAP). En aquest mètode es posen dues etiquetes d’afinitat en tàndem en un dels components del complex i es fa passar primer per una primera columna d’afinitat i, després de tallar la primera etiqueta, per una segona columna (vegeu la figura 11). Les condicions d’elució, tall, etc., són suaus, per no desfer el complex. Hi ha complexos o orgànuls molt coneguts, com ara el ribosoma, el proteosoma, el centrosoma, etc., però la cèl·lula n’està farcida de molts altres. Un estudi fet per investigadors de l’EMBL i la Biotech Cellsome en va trobar 491 fent servir la tècnica TAP i espectrometria de masses (Gavin et al., 2006). Caracteritzar estructuralment, ni que fos una part petita, d’aquest «complexosoma», serà un esforç científic considerable que necessitarà el desenvolupament de noves tècniques preparatives, que espero que veurem florir en el propers anys. Si caracteritzar aquests complexos més o menys estables és i serà difícil, encara ho serà més caracteritzar estructuralment tot tipus de complexos transitoris que es donen en les vies o xarxes de senyalització o regulació. Aquestes interaccions múltiples i transitòries són, de fet, les que fan que la cèl·lula funcioni com a tal, com el sistema sofisticadament regulat que és. Abordar-les des d’un punt de vista estructural és un caPurificació d’afinitat en tàndem (TAP) CBP Proteïna A

Etiqueta TAP: Contaminants

Lloc TEV

Granets d’IgG

Tall amb TEV

Ca2+

1) Proteïna A, s’uneix fortament a la immunoglobulina G (IgG) 2) Lloc de tall de la proteasa del virus del gravat del tabac (TEV) 3) Pèptid d’unió a la calmodulina (CBP)

Granets de calmodulina

Elució amb EGTA

Figura 11. Estructura de la RNA-polimerasa ii de llevat, resolta per RX (Cramer et al., 2001).

Figura 12. Esquema de la purificació d’afinitat en tàndem d’un complex de tres proteïnes.

36 M. COLL

mí que pot semblar adient per a visionaris sense els peus a terra però que ja s’està reclamant fa un temps (Harrison, 2004; Beltrao et al., 2007; Abad-Zapatero, 2007). I ja té nom: biologia estructural de sistemes. BARREIG DE TÈCNIQUES Els grans complexos, siguin perdurables o transitoris, estables o làbils, requeriran per al seu estudi estructural l’ús de diverses tècniques alhora. Per exemple la barreja de ME i RX, que ja ha donat tan bons resultats en l’estudi dels virus, s’haurà de generalitzar a altres partícules i complexos. En aquesta barreja els components (més petits) d’una partícula són resolts per RX a molt alta resolució i després s’encaixen dins dels volums de ME de més baixa resolució però abastant la partícula sencera (vegeu la figura 13). Amb aquest encaix acabem tenint un bon model del tot amb les parts a alta resolució, un model quasiatòmic.

En els propers anys veurem com aquesta idea va uns passos més enllà, i s’intentaran encaixar també els complexos i partícules dins d’imatges de tota la cèl·lula, imatges globals que podran provenir de la tomografia, de la microscòpia confocal o d’altres tècniques. Ja es veu que la biologia estructural i la biologia cel·lular s’hauran d’aproximar (Harrison, 2004) encara que la distància tecnològica i conceptual entre aquestes disciplines sembla avui encara molt gran. Al final del camí hi ha la foto detallada, a resolució atòmica, de tota la cèl·lula. Hem parlat de foto, però en realitat el que necessitem és una pel·lícula. Per entendre realment com funcionen els components de la cèl·lula, haurem d’esbrinar inexorablement el moviment de les proteïnes, dels complexos, de les màquines i motors moleculars i el desplaçament de tots dins de la cèl·lula. L’espai d’aquest article no ens permet ara de perdre’ns en els avenços de les diverses tècniques per analitzar aquesta dinàmica —per exemple, tècniques d’anàlisi de partícula única, o mètodes computacionals. Ara només em cal mencionar que aquestes metodologies s’hauran d’integrar, d’una manera o altra, en l’anàlisi estructural del futur. Un futur que no serà pas avorrit per als biòlegs estructurals. AGRAÏMENTS

Figura 13. Estructura d’una càpsida del virus aviar IBDV, determinada per criomicroscòpia electrònica (Coulibaly et al., 2006). En el requadre inferior es mostren tres proteïnes de la càpsida, determinades a alta resolució per RX, encaixades en una de les torretes del volum de ME, que resulta en una estructura quasiatòmica.

Vull expressar el meu agraïment a Miquel Pons per haver revisat la part de RMN d’aquest article, a Oscar Llorca i Roeland Boer per la figura 2, a Marta Bruix per la figura 3, a Alex G. Blanco per les figures 4 i 9, a Johann Deisenhofer per la figura 8, a Joan Pons per la figura 12 i a Albert Canals per corregir el text.

BIOLOGIA ESTRUCTURAL 37

BIBLIOGRAFIA Abad-Zapatero, C. (2007). «Notes of a protein crystallographer: quo vadis structural biology». Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr., 63: 660-664. Abrescia, N. G.; Cockburn, J. J.; Grimes, J. M.; Sutton, G. C.; Diprose, J. M.; Butcher, S. J.; Fuller, S. D.; San Martin, C.; Burnett, R. M.; Stuart, D. I.; Bamford, D. H.; Bamford, J. K. (2004). «Insights into assembly from structural analysis of bacteriophage PRD1». Nature, 432: 68-74. Ban, N.; Nissen, P.; Hansen, J.; Moore, P. B.; Steitz, T. A. (2000). «The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 Å resolution». Science, 289: 905-920. Beltrao, P.; Kiel, C.; Serrano, L. (2007). «Structures in systems biology». Curr. Opin. Struct. Biol., 17: 378-384. Blanco, A. G.; Sola, M.; Bernúes, J.; Coll, M. (2007). «Structural basis for RNA polymerase recruitment and transcription activation by response regulator PhoB: the σ4 / β-flap / PhoBE / Pho Box DNA Complex». [En premsa] Blanco, A. G.; Sola, M.; Gomis-Rüth, F. X.; Coll, M. (2002). «Tandem DNA recognition by PhoB, a twocomponent signal transduction transcriptional activator». Structure, 1: 1-20. Boer, R.; Ruiz-Masó, J. A.; Gómez-Blanco, A.; LopezBlanco, J. R.; Chacón, P.; Usón, I.; Gomis-Rüth, F. X.; Espinosa, M.; Llorca, O.; Solar, G. del; Coll, M. (2007). «The structure of streptococcal plasmid replication initiation protein RepB is a hexameric ring with mobile DNA recognition and catalytic domains». [En premsa] Buchanan, S. K.; Smith, B. S.; Venkatramani, L.; Xia, D.; Esse, L.; Palnitkar, M.; Chakraborty, R.; Helm, D. van der; Deisenhofer, J. (1999). «Crystal structure of the outer membrane active transporter FepA from Escherichia coli». Nat. Struct. Biol., 6: 5663. Coll, M. (2006). «El transcriptor de ADN». El País (11 d’octubre): 41. Coulibaly, F.; Chevalier, C.; Gutsche, I.; Pous, J.; Navaza, J.; Bressanelli, S.; Delmas, B.; Rey, F. A. (2006). «The birnavirus crystal structure reveals structural relationships among icosahedral viruses». Cell, 120: 761-772. Crack, F. H. C. (1988). What mad pursuit. Londres: Weindelfeld and Nicolson. Cramer, P.; Bushnell, D. A.; Kornberg, R. D. (2001). «Structural basis of transcription: RNA polymerase II at 2.8 ångstrom resolution». Science, 292: 8631876. Dauter, Z. (2006). «Current state and prospects of

macromolecular crystallography». Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr., 62: 1-11. Ferentz, A. N.; Wagner, G. (2000). «NMR spectroscopy: a multifaceted approach to macromolecular structure». Quarterly Reviews of Biophysics, 33: 2965. Gavin, A. C.; Aloy, P.; Grandi, P.; Krause, R.; Boesche, M.; Marzioch, M.; Rau, C.; Jensen, L. J.; Bastuck, S.; Dümpelfeld, B.; Edelmann, A.; Heurtier, M. A.; Hoffman, V.; Hoefert, C.; Klein, K.; Hudak, M.; Michon, A. M.; Schelder, M.; Schirle, M.; Remor, M.; Rudi, T.; Hooper, S.; Bauer, A.; Bouwmeester, T.; Casari, G.; Drewes, G.; Neubauer, G.; Rick, J. M.; Kuster, B.; Bork, P.; Russell, R. B.; Superti-Furga, G. (2006). «Proteome survey reveals modularity of the yeast cell machinery». Nature, 440: 631-636. Gomis-Rüth, F. X.; Moncalián, G.; Pérez-Luque, R.; González, A.; Cabezón, E.; Cruz, F. de la; Coll, M. (2001). «The bacterial conjugation protein TrwB resembles ring helicases and F1-ATPase». Nature, 409: 637-641. Grabowski, M. K.; Joachimiak, A.; Otwinowski, Z.; Minor, W. (2007). «Structural genomics: keeping up with expanding knowledge of the protein universe». Curr. Opin. Struct. Biol., 17: 347-353. Grimes, J. M.; Burroughs, J. N.; Gouet, P.; Diprose, J. M.; Malby, R.; Zientara, S.; Mertens, P. P.; Stuart, D. I. (1998). «The atomic structure of the bluetongue virus core». Nature, 395: 470-478. Guasch, A.; Aloria, K.; Pérez, R.; Campo, R.; Avila, J.; Zabala, J. C.; Coll, M. (2002). «Three-dimensional structure of human tubulin chaperone cofactor A/ p14». J. Mol. Biol., 318: 1139-1149. Guasch, A.; Lucas, M.; Moncalián, G.; Cabezas, M.; Pérez-Luque, R.; Gomis-Rüth, F. X.; Cruz, F. de la; Coll, M. (2003). «Recognition and processing of the origin of transfer DNA by conjugative relaxase TrwC». Nat. Struct. Biol., 10: 1002-1010. Harrison, S. (2004). «Whither structural biology». Nat. Struct. & Mol. Biol., 11: 12-15. Hart, D. J.; Tarendeau, F. (2006). «Combinatorial library approaches for improving soluble protein expression in Escherichia coli». Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr., 62: 19-26. Henderson, R. (2004). «Realizing the potential of electron cryo-microscopy». Q. Rev. Biophys., 37: 3-13. Korostelev, A.; Trakhanov, S.; Laurberg, M.; Noller, H. F. (2006). «Crystal structure of a 70S ribosometRNA complex reveals functional interactions and rearrangements». Cell, 126: 1065-1077. Nickell, S.; Kofler, C.; Leis, A. P.; Baumeister, W. (2006). «A visual approach to proteomics». Nat. Rev. Mol. Cell. Biol., 7: 225-230. Perez-Canadillas, J. M.; Guenneugues, M.; Campos-Olivas, R.; Santoro J.; Martínez del Pozo,

38 M. COLL

A.; Gavilanes, J. G.; Rico, M.; Bruix, M. (2002). «Backbone dynamics of the cytotoxic ribonuclease alpha-sarcin by 15N NMR relaxation methods». J. Biomol. NMR, 24: 301-316.

Wimberly, B. T.; Brodersen, D. E.; Clemons, W. M. Jr; Morgan-Warren, R. J.; Carter, A. P.; Vonrhein, C.; Hartsch, T.; Ramakrishnan, V. (2000). «Structure of the 30S ribosomal subunit». Nature, 407: 327339.

DOI: 10.2436/20.1501.02.43

Les biotecnologies (Pere Puigdomènech i Francesc Gòdia, ed.) Treballs de la SCB. Vol. 58 (2007) 39-49

NOVES PERSPECTIVES DE LA BIOENGINYERIA A L’INICI DEL SEGLE XXI Josep Samitier Laboratori de Nanobioenginyeria, Departament d’Electrònica. Universitat de Barcelona. Institut de Bioenginyeria de Catalunya. Centre de Recerca Biomèdica en Xarxa de Bioenginyeria, Biomaterials i Nanomedicina. Adreça per a la correspondència: Josep Samitier. Departament d’Electrònica, Facultat de Física, Universitat de Barcelona. Martí Franqués, 1. 08028 Barcelona. Adreça electrònica: jsamitier@ub.edu. RESUM La bioenginyeria o enginyeria biomèdica és una disciplina que cerca la millora de la salut, mitjançant la integració de coneixements de les enginyeries, de les ciències biomèdiques i la pràctica clínica. La bioenginyeria combina les capacitats de l’enginyeria amb els requeriments mèdics per millorar la salut. És una branca de l’enginyeria en què el coneixement i les habilitats es desenvolupen i s’apliquen a definir i solucionar qüestions de la biologia i la medicina. El segle xxi ha estat denominat el segle biològic, atès que s’esperen avenços profunds en els àmbits mèdics i dels sectors industrials relacionats, que marquin canvis rellevants. La bioenginyeria esdevé essencial per comprendre la ingent quantitat d’informació que està sent generada per la recerca bàsica, per entendre la complexitat dels éssers vius i per proveir solucions innovadores que es puguin convertir en productes comercials. En aquest sentit l’aplicació de la nanotecnologia a la millora de la salut, àmbit que es coneix com a nanomedicina, ofereix opcions nombroses i prometedores per millorar de manera significativa el diagnòstic i la terapèutica, i permeten assolir una millor qualitat de vida per a tothom. Nous sistemes de diagnòstic que fan ús de la nanotecnologia per quantificar biomarcadors indicatius de malalties permetran una millor valoració dels riscs abans que els símptomes apareguin completament. Paraules clau: enginyeria biomèdica, bioenginyeria, biomaterials, nanomedicina, tecnologia mèdica, instrumentació.

40 J. SAMITIER

NEW PERSPECTIVES ON BIOENGINEERING AT THE BEGINNING OF 21ST CENTURY SUMMARY Bioengineering or biomedical engineering is a discipline that improves human health through cross-disciplinary activities that integrate the engineering sciences with the biomedical sciences and clinical practice. Bioengineering combines engineering expertise with medical needs for the enhancement of health care. It is a branch of engineering in which knowledge and skills are developed and applied to define and solve problems in biology and medicine. The 21st century has been labeled as the “Biological Century” with the expectation of profound implications to future technological breakthroughs both in the medical and other industrial sectors. The bioengineering is becoming essential to understanding the enormous amount of information that is being generated by basic research, to using quantitative approaches, to integrating disparate components in order to understand complex living systems, to providing truly innovative solutions and to translating these to commercial products. In this sense, the application of nanotechnology in healthcare, also know as nano medicine, offers numerous very promising possibilities to significantly improve medical diagnosis and therapy, leading to an affordable higher quality of life for everyone. New diagnostic tests making use of nanotechnology to quantify disease-related biomarkers could offer an earlier and more personalised risk assessment before symptoms show up. Key words: biomedical engineering, bioengineering, biomaterials, nanomedicine, medical technology, instrumentation.

INTRODUCCIÓ Gran nombre dels descobriments decisius en biologia i medicina realitzats durant el segles xix i xx han estat possibles gràcies a la recerca de nous principis i tècniques de les ciències físiques i de l’enginyeria. Des de la utilització dels raigs X i la ressonància magnètica nuclear (RMN) per a la determinació de l’estructura molecular i l’obtenció d’imatges mèdiques, fins a la utilització del marcapassos, les noves aplicacions de les nanotecnologies en la manipulació molecular i cel·lular i el desenvolupament dels bioxips, són innombrables els exemples en què la física i l’enginyeria han estat invo-

lucrades en la innovació biomèdica i en la pràctica clínica. És un fet que el sector sanitari demanda incorporar i aplicar els coneixements científics i tecnològics desenvolupats per les ciències bàsiques i les enginyeries. Només cal analitzar actualment com s’han introduït les noves tecnologies en els processos de diagnosi, terapèutica i rehabilitació d’un pacient. Aquest camp científic i tecnològic vast i pluridisciplinari és el que denominem habitualment bioenginyeria o enginyeria biomèdica (Enderle et al., 2000; Bronzino, 1995). Malgrat que moltes vegades ambdues paraules es fan servir com a sinònims, és rellevant fer una matisació sobre els conceptes i les

NOVES PERSPECTIVES DE LA BIOENGINYERIA A L’INICI DEL SEGLE XXI 41

definicions que abasten la bioenginyeria i l’enginyeria biomèdica. Així, seguint la definició que dóna Paceva dins el Bioengineering education directory, bioenginyeria seria el terme general que aglutinaria totes les activitats de desenvolupament tecnològic, des de les aplicacions a la salut humana fins a les activitats de recerca orientada en què l’enginyeria s’aplica a l’estudi i modificació cel·lular i, per tant, amb interacció amb la biotecnologia i l’enginyeria genètica. Per a Bronzino, en la segona edició de The biomedical engineering handbook, el concepte enginyeria biomèdica apareix com l’aplicació de principis, com l’electricitat, la química, l’òptica i la mecànica, entre altres, per entendre, modificar o controlar sistemes biològics (humans o animals). El NIH Bioengineering Consortium dels EUA (Varmus, 1998) va acordar el 1997 la següent definició per a la recerca en bioenginyeria, tot reconeixent que cap definició no pot eliminar la intersecció amb altres disciplines: «La bioenginyeria integra les ciències físiques, químiques i matemàtiques amb els principis de l’enginyeria per a l’estudi de la biologia, la medicina i les ciències del comportament o la salut. Proporciona els conceptes fonamentals, crea coneixement tant en l’escala molecular com en la dels sistemes fisiològics i desenvolupa nous components, materials, processos, implants, dispositius i aproximacions informàtiques per a la prevenció, el diagnòstic i el tractament de malalties, així com per a la rehabilitació de pacients i la millora de la salut». Dins la primera edició de la Gran enciclopèdia catalana, apareix bioenginyeria com un terme que inclou l’enginyeria bioquímica i l’enginyeria biomèdica com a branques de l’enginyeria que, pel seu caràcter interdisciplinari, són difícils d’encasellar, i que participen de les tècniques de la biologia, la química i l’enginyeria. En el segon suple-

ment de l’enciclopèdia es defineix bioenginyer com ‘enginyer especialitzat en biotecnologia’. No és l’objectiu d’aquest article fer un estudi rigorós de la definició d’aquests termes i, per tant, centrarem la nostra anàlisi en les perspectives d’evolució que presenten aquests camps a partir de l’aparició de noves tecnologies com els microsistemes derivats de la microelectrònica, les nanotecnologies i la seva aplicació a l’enginyeria de materials i les capacitats de processament que ens donen les millores en les tecnologies de la informació i les comunicacions. Sense intentar ser exhaustius, podem considerar que la bioenginyeria abasta el desenvolupament de coneixements en els àmbits següents: — Anàlisi i modelització de sistemes biològics. — Nanotecnologia cel·lular i molecular. — Processos i tècniques per a la creació, manipulació o modificació de material biològic amb finalitats terapèutiques o de millora de processos per a la producció d’aliments. Dispositius, sistemes i instrumentació per detectar, mesurar i visualitzar magnituds i paràmetres biològics amb aplicacions al medi ambient, l’agricultura, l’alimentació i la medicina. — Processament de senyal per detectar, classificar i analitzar senyals biomèdics. — Disseny i desenvolupament de dispositius i tècniques de rehabilitació i de processos terapèutics basats en principis físics (radiació, làser, corrents elèctrics, pròtesis externes...). — Disseny i desenvolupament de pròtesis i dispositius per reemplaçar o incrementar les prestacions de subsistemes orgà- nics. — Obtenció d’imatges mèdiques per obtenir informació gràfica de detalls anatòmics i funcions fisiològiques. — Anàlisi informàtica de dades de paci-

42 J. SAMITIER

ents i sistemes de suport a la presa de decisions. — Disseny i desenvolupament de dispositius, sistemes i processos en instal·lacions hospitalàries. La bioenginyeria és un camp de recerca i desenvolupament interdisciplinari i dinàmic (Endy, 2005) amb gran vitalitat, vinculat a sectors industrials amb productes d’elevat valor afegit i de gran importància econòmica, política i social en qualsevol societat avançada. Tot sembla indicar que en els propers anys s’ha de produir un fort increment de la demanda de dispositius i sistemes que incloguin els nous avenços tecnològics, per millorar tant els processos en la indústria alimentària com per a la prevenció, tractament i millora dels processos sanitaris. BREU EVOLUCIÓ HISTÒRICA L’aparició de la bioenginyeria, com a aplicació dels avenços tecnològics a la biologia i a la medicina, està lligada als descobriments mateixos de la fisiologia dels éssers vius. Així, l’hemodinàmica va començar amb el plantejament de Wiliam Harvey el 1616 que el cor bombeja la sang dins d’un circuit fluídic tancat. Posteriorment, l’any 1840, un metge francès, J. L. M. Poiseuille, demostrà que la caiguda de pressió més forta en el sistema cardiovascular succeeix en els capil·lars i va analitzar i determinar les relacions entre la caiguda de pressió, el flux, i el diàmetre. Un fet cabdal en el desenvolupament de la bioenginyeria fou la determinació de la relació entre el sistema nerviós i l’electricitat. Malgrat que abans de 1790 s’havien referenciat un nombre considerable de fets relacionats amb l’electricitat en general i la bioelectricitat en particular, entre els quals destaquen els treballs sobre electrostàtica de Charles Dufay (1698-1739) a França i

Otto von Guericke (1602-1685) a Alemanya, els experiments i hipòtesis de Benjamin Franklin (1706-1790) sobre l’electricitat com un fluid o la determinació de la força entre dues partícules carregades per Charles A. Coulomb (1726-1806), abans dels treballs de Galvani (1737-1798) i Volta (1745-1827) no s’havia estudiat de manera sistemàtica el «fluid nerviós», fet que va ser motiu de l’anomenada controvèrsia Galvani-Volta. Galvani, metge i físic, va publicar l’any 1791 un article titulat «De viribus elettricitatis in motu musculari commentarius», en què exposava la seva teoria sobre l’electricitat animal a partir d’una sèrie d’experiments basats en la contracció muscular de les cuixes de granota. En aquesta publicació, Galvani insistia que el cervell era l’òrgan més rellevant per a la secreció del fluid elèctric, i que els nervis conduïen l’electricitat. La polèmica entre els que creien que els moviments de les granotes eren deguts a un «fluid galvànic» d’origen animal igual o diferent de l’electricitat ordinària (electrostàtica) i els que rebutjaven tot tipus de fluid elèctric contingut dins el sistema nerviós, va perdurar durant anys. El principal defensor d’aquest rebuig va ser Alessandro Volta, professor de filosofia natural a la Universitat de Pavia. Volta va descobrir la primera pila com a generador de corrent elèctric continu, que va detallar en una carta datada a Como, Itàlia, el 20 de març de 1800 i dirigida al president de la Royal Society of London, que la va publicar posteriorment en els seus annals. Avui sabem que tant Volta com Galvani tenien part de raó. Volta va negar correctament l’existència de l’electricitat animal, però es va equivocar en admetre que el corrent elèctric en els experiments de Galvani procedia només del contacte simple entre dos metalls. Posteriorment, es va determinar que el flux d’electrons és degut a les reaccions químiques de tipus redox que tenen lloc entre aquests metalls i les solucions sa-

NOVES PERSPECTIVES DE LA BIOENGINYERIA A L’INICI DEL SEGLE XXI 43

lines que els envolten. Tampoc no era certa la seva afirmació que tot efecte electrofisiològic exigeix dos metalls diferents com a font de corrent. Galvani estava convençut que el cervell, els nervis i els músculs dels animals funcionen mitjançant l’acció de forces elèctriques, però no va saber interpretar correctament les seves experiències. El físic Hermann von Helmholtz (18211894), que podem considerar com el primer enginyer biomèdic, ja que va inventar diversos equips com l’oftalmoscopi (1851), va determinar la velocitat de transmissió de l’impuls nerviós, i va impulsar l’electrofisiologia, a més a més de les seves contribucions a la formulació del principi de conservació de l’energia. Però va ser gràcies a la instrumentació que l’enginyeria va començar a influir de manera decidida sobre la biomedicina. L’any 1888, Augustus Desiré Waller va mostrar amb un electròmetre els canvis de potencial cardíac sobre el cos. L’any 1895, Wilhem Röntgen va descobrir els raigs X i la capacitat de generar imatges, i això va fer que l’any 1896 Siemens i General Electric construïssin el primer equip. L’any 1920 es va desenvolupar el primer electrocardiògraf i l’any 1930 el primer electroencefalograma. Finalment, podem citar que fa cinquanta anys, el 8 d’octubre de 1958, un equip de metges suec va realitzar el primer implant d’un marcapassos en un cos humà. A Catalunya, com a precursor dels principis de la bioenginyeria entesa com l’aplicació de la física experimental a la medicina i com a defensor de la necessitat de desenvolupar la recerca interdisciplinària, cal reivindicar la figura d’Antoni Cibat i Arnautó (1770-1812). Aquest cirurgià, professor de física del Reial Col·legi de Cirurgia de Barcelona, que va estudiar física, química, medicina i cirurgia a Aberdeen (Escòcia), va introduir les idees de Galvani i Volta al nostre país. Com s’ha publicat recentment en una tesi doctoral (Pérez, 2007), mitjan-

çant l‘estudi de l’arxiu de les memòries llegides en les juntes literàries del Col·legi de Barcelona, la introducció sobre el nou fenomen del galvanisme s’inicia l’any 1796 per part d’Antoni Cibat, que havia estat escollit l’any anterior acadèmic d’aquesta institució. Ja l’any 1794, en el seu Ensayo sobre el trismus traumático: o sea la ineficacia de los antiespasmódicos comúnmente usados para la curación, Cibat es planteja la problemàtica d’una malaltia que cursava amb convulsions i per a la qual no coneixia cura. Antoni Cibat va publicar l’any 1804 un llibre de text, Elementos de física experimental, per a estudiants de l’acadèmia de cirurgia, en el qual dedicava més de cent cinquanta pàgines a explicar l’electricitat, i en destaquen els apartats sobre el galvanisme, l’opinió de Galvani, la teoria de Volta, les analogies entre el fluid elèctric i el galvànic i la influència del fluid galvànic en la vitalitat física dels animals i el seu moviment muscular. Cibat va desenvolupar experiments relacionats amb el galvanisme i l’electricitat a partir dels instruments de física experimental que va reunir o va fer construir. La voluntat d’entendre el funcionament del cos humà i les causes de la malaltia l’expressa en tota claredat en un article esplèndid que publicà a la Gaceta de Madrid l’any 1810, que recull l’evolució del coneixement científic i on afirma: «Las ciencias naturales, que son la base del saber, se excluyeron de los estudios de la cirurgía médica, a pesar de que su conocimiento es tan indispensable, que sin la física, la química y la botánica ningun facultativo puede preciarse de ser consumado ni en cirurgía ni en medicina [...]»; i en el pròleg del primer volum de Física experimental destaca: «La Física experimental no es una ciencia auxiliar de la medicina, la una sigue los pasos de la otra y reciprocamente cual es la Física, tal es la Medicina [...]». La seva mort prematura i la seva consideració d’afrancesat pel seu suport a Joseph Bonaparte no han permès fins fa poc estu-

44 J. SAMITIER

diar i retre la consideració deguda a qui va ser l’introductor de l’estudi del fenòmens de l’electrofisiologia, precursora de la bioenginyeria, al nostre país. ÀREES RELLEVANTS D’APLICACIÓ DE LA BIOENGINYERIA A LA MEDICINA L’ampli ventall de conceptes i tecnologies que inclou la bioenginyeria fa que en el seu si coexisteixin diverses àrees d’especialització amb continguts i metodologies que estan determinades per les tecnologies emprades. Així, podem parlar de la bioinstrumentació o instrumentació biomèdica, la biomecànica, els biomaterials, la fisiologia de sistemes, l’enginyeria clínica i l’enginyeria de rehabilitació. Totes aquestes àrees estan molt relacionades entre si, tot i que presenten trets diferencials (Bronzino, 1995). Així, la bioinstrumentació és l’aplicació de l’electrònica i els principis i tècniques de la mesura per desenvolupar dispositius emprats en el diagnòstic i tractament de malalties. Els ordinadors tenen cada vegada més rellevància en bioinstrumentació, des del microprocessador emprat per gestionar i controlar els dispositius fins a l’ús intensiu de sistemes informàtics en el cas de sistemes de diagnòstic amb imatge o en telemedicina. La biomecànica és l’aplicació de les lleis de la mecànica de sòlids i fluids per resoldre problemes mèdics o biològics. Això inclou l’estudi del moviment, la deformació de materials, el flux dins el cos i el transport de substàncies químiques a través de membranes i medis. La recerca en biomaterials inclou tant la descripció del comportament i de les característiques de teixits vius i de materials emprats per a pròtesis. Conèixer les propietats dels materials vius és de vital importància per al disseny correcte dels materials que

seran implantats. Els biomaterials emprats cal que no siguin tòxics ni cancerígens, químicament inerts, estables i amb les propietats mecàniques adequades per suportar tensions durant el seu període de funcionament. La fisiologia de sistemes és el terme que descriu el conjunt de mètodes, tècniques i eines per entendre el funcionament dels organismes vius, des dels bacteris fins als humans. La simulació i l’elaboració de models són emprades per a l’anàlisi de dades experimentals i, mitjançant formulacions i descripcions matemàtiques, tracten de descriure els comportaments fisiològics. Els éssers vius tenen sofisticats sistemes de realimentació i control que es poden estudiar emprant les eines que ens aporten aquestes disciplines de l’enginyeria. L’enginyeria clínica és l’aplicació de la tecnologia a l’atenció sanitària en els hospitals. Comprèn el desenvolupament i manteniment de les bases de dades clíniques, instrumentació mèdica i l’adquisició d’equipaments nous. Moltes vegades requereix l’adaptació dels equipaments a les necessitats específiques. Finalment, l’enginyeria de rehabilitació és una especialitat nova, sorgida de la necessitat de millorar la qualitat de vida amb pacients que pateixen limitacions físiques. Són múltiples els avenços notables que ha portat la bioenginyeria a la millora de l’atenció sanitària, en la qual com més va més les noves tecnologies són més necessàries per a un millor diagnòstic i terapèutica. Exemples reeixits són el desenvolupament d’òrgans artificials, les pròtesis, els sistemes d’instrumentació de les unitats de vigilància intensiva, els sistemes de suport com els aparells de diàlisi i els pulmons o cors artificials, els sistemes d’informació mèdica i els sistemes de gestió de salut que actualment s’empren en la pràctica mèdica. Si ens fixem en qualsevol d’aquests exemples, veurem que tots inclouen més d’una de les

NOVES PERSPECTIVES DE LA BIOENGINYERIA A L’INICI DEL SEGLE XXI 45

diferents especialitats en què hem subdividit la bioenginyeria. A través de la història de la medicina, la cerca de sistemes que permetessin observar a l’interior del cos humà de manera no invasiva ha estat una constant (Passariello, 2002). Des del primer Premi Nobel de Física l’any 1901, atorgat a Wilhelm Conrad Roentgen per la descoberta d’un nou tipus de radiació, els raigs X, que va permetre el naixement d’una nova especialitat en medicina, la radiologia, i un desenvolupament industrial d’equips d’imatge per al diagnòstic, el segle xx ha aportat diverses innovacions remarcables. Ara bé, és a partir de 1970, amb la utilització dels ordinadors, que va aparèixer una revolució en l’obtenció i tractament de les imatges mèdiques. En particular, cal esmentar els treballs d’Allan Macleod Cormark i Godfrey Newbold, premis Nobel de Fisiologia o Medicina l’any 1979, que van determinar les bases de la tomografia computada. Dins el diagnòstic per imatge, la ressonància magnètica ha permès el diagnòstic precís de múltiples malalties, en les seves etapes inicials. Aquesta tecnologia està constituïda per un complex conjunt d’aparells emissors d’electromagnetisme, antenes receptores de radiofreqüència i ordinadors que analitzen les dades per produir imatges detallades, de dues o tres dimensions amb un nivell de precisió que permet detectar, o descartar, alteracions en els òrgans i els teixits del cos humà. Les imatges s’obtenen en sotmetre el pacient a un camp electromagnètic, equivalent a quinze mil vegades el camp magnètic del nostre planeta. Aquest camp interacciona amb els protons que estan continguts en els àtoms d’hidrogen que conformen els teixits humans. Quan l’estímul se suspèn, s’allibera energia que es transforma en un senyal de radiofreqüència que és captat per una sèrie de detectors. La descoberta de la ressonància magnètica va fer merèixer el Premi Nobel

de Física l’any 1952 a Fèlix Bloch i Edward Mills Purcell, però no va ser fins l’any 1970 que Raymond Damadian va demostrar la capacitat d’emprar la ressonància magnètica com una eina de diagnòstic de tumors cancerígens. Malgrat aquest fet, l’any 2003 no va ser inclòs entre els premiats al Nobel de Fisiologia o Medicina concedit a Paul Lauterbur, químic americà, i a Peter Mansfield, físic britànic, per l’aplicació de la ressonància magnètica a l’obtenció d’imatges mèdiques. L’avenç de la recerca biomèdica fa que es vagin plantejant problemes més complexos sobre els processos bioquímics que succeeixen en els éssers vius. Les tècniques d’imatge molecular són el gran repte de futur de les tècniques de diagnòstic amb imatge. En aquest sentit, la tomografia per emissió de positrons (PET) és una de les més destacades, ja que permet observar l’activitat metabòlica de diferents teixits en el cos humà. Fent servir un radiofàrmac que s’injecta al pacient s’obté que en el nucli amb major nombre de protons que neutrons es produeix la conversió d’un protó en neutró i l’emissió d’un positró. Aquests interaccionen amb els electrons de l’àtom i té lloc l’aniquilació de les dues partícules i l’aparició de dos fotons d’energia gamma que s’emeten en un angle de 180°. La detecció síncrona dels fotons mitjançant detectors permet localitzar i quantificar l’emissió a la zona estudiada. La tècnica PET té múltiples aplicacions en recerca, que abasten tant el desenvolupament de nous fàrmacs, l’estudi de models de malalties humanes en animals o la caracterització de l’expressió gènica i les modificacions en el fenotip. Cada cop és més freqüent la combinació de tècniques de diagnòstic amb imatge que ofereixen informació complementària. En aquest sentit, s’investiga àmpliament en sistemes que permetin la combinació d’imatges obtingudes per ressonància magnètica, tomografia computada i tècniques nuclears,

46 J. SAMITIER

així com la seva aplicació a la telemedicina (Englemann et al., 2007). Finalment, en aquest àmbit del diagnòstic amb imatge, cal esmentar els avenços produïts amb el diagnòstic per ultrasons, que s’ha convertit en la segona modalitat de diagnòstic amb imatge més emprada actualment. L’origen ve de les aplicacions de la tecnologia del sonar desenvolupada durant la Segona Guerra Mundial. Entre els diferents investigadors que han contribuït al desenvolupament d’aquesta tècnica destaquen el metge anglès John Julian Wild i l’enginyer John M. Reid, que van publicar l’any 1952 a Science l’article «Application of echo-ranging techniques to the determination of structure of biological tissues». Entres les tècniques de visualització mínimament invasives, basades en tècniques endoscòpiques, només mencionarem l’artroscòpia, emprada pels cirurgians ortopèdics com a procediment quirúrgic per visualitzar, diagnosticar i tractar problemes dins d’una articulació. L’artroscòpia, paraula derivada del grec άρθρον (‘unió, articulació’) i σκοπέω (‘observar, mirar’), significa literalment ‘mirar dins de l’articulació’. Totes les tècniques mínimament invasives, que combinen robòtica i observació òptica, són objecte actualment d’una gran recerca tecnològica. Aquesta necessitat de manipulació a l’interior de l’organisme, que en certs casos requereix la substitució de parts del mateix o la utilització puntual d’estris o dispositius, ha requerit el desenvolupament de materials amb propietats que siguin compatibles amb els òrgans i teixits biològics. Així, es defineix un biomaterial com aquell material, natural o artificial, que inclou de manera completa o parcial una estructura o un dispositiu biomèdic que permet substituir o augmentar una funció natural (Stevens i George, 2005). Les exigències d’utilització dels implants imposen severes restriccions sobre les propietats físiques, químiques,

mecàniques i biològiques dels biomaterials candidats. També, la recerca de la millora del comportament amb el temps dels implants o de la seva integració en els teixits que l’envolten, ha portat a desenvolupat materials o recobriments superficials amb característiques específiques que estimulin una determinada activitat fisiològica. La millora de les característiques superficials dels implants, ja sigui per assolir la bioactivitat o per evitar la degradació mitjançant determinats processos de funcionalització química, són objecte d’una gran activitat de recerca (Morato et al., 2004). L’evolució mateixa dels biomaterials ha portat a plantejar la possibilitat de regeneració de teixits i òrgans, en lloc de plantejar la seva substitució, i és l’origen de l’enginyeria tissular (Yaszemski, 2004). Com a exemple d’aplicació de biomaterials, tenim les pròtesis de maluc, que és una de les intervencions quirúrgiques amb més èxit actualment en la substitució de parts de l’organisme. Només als Estats Units se’n fan prop de dues-centes mil intervencions cada any, i podem considerar sense dubte el desenvolupament de la pròtesi total de maluc com un dels majors avenços de la cirurgia ortopèdica. El pioner en el seu disseny i utilització fou Sir John Charnley (1911-1982), un cirurgià ortopèdic anglès que, amb la col·laboració d’un equip d’enginyers, va desenvolupar-ne la tècnica i els materials. EVOLUCIÓ I NOVES PERSPECTIVES DE LA RECERCA EN BIOENGINYERIA: LA NANOMEDICINA Uns dels àmbits més prometedors de la bioenginyeria és l’aportació que fan les micro i les nanotecnologies al desenvolupament de materials i dispositius nous (Morrow et al., 2007; Ferrari, 2005). L’aplicació de la nanotecnologia a la medicina es coneix

NOVES PERSPECTIVES DE LA BIOENGINYERIA A L’INICI DEL SEGLE XXI 47

com a nanomedicina, i comprèn un àmbit d’investigació científic i tecnològic interdisciplinari que pretén millorar el diagnòstic, el tractament i la prevenció de malalties i lesions traumàtiques, així com preservar i millorar la salut i qualitat de vida. Això requereix millorar el coneixement i la comprensió del cos humà a escala molecular a fi de poder analitzar, supervisar, controlar, reparar, reconstruir i millorar qualsevol sistema biològic humà. La nanomedicina estudia les interaccions a la nanoescala (1 a 100 nm), i per a això desenvolupa i utilitza dispositius, sistemes i tecnologies que inclouen nanoestructures capaces d’interaccionar a escala molecular i que s’interconnecten amb microsistemes per interaccionar a escala molecular o cel·lular. Des del punt de vista de les seves aplicacions, la nanomedicina incideix en tres grans àmbits: la millora del diagnòstic tant in vivo com in vitro, el desenvolupament de nous sistemes més efectius de subministrament i dosificació de fàrmacs i el desenvolupament de tecnologies per a l’enginyeria tissular i la medicina regenerativa. La nanomedicina constitueix un paradigma d’investigació translacional, ja que requereix tant la investigació fonamental que prové de la química, física o biologia, com la investigació aplicada de la ciència i tecnologia dels materials, la farmacologia, la bioelectrònica i la investigació mèdica clínica. Així mateix, la nanomedicina requereix el desenvolupament d’un sector industrial que permeti que els avenços cientificotecnològics es transformin en tecnologies per a la salut que puguin millorar la qualitat de vida i disminuir el cost sanitari. Es tracta d’un àmbit econòmic que inclou sectors com el farmacèutic, les tecnologies mèdiques o la biotecnologia. És obvi que la nanomedicina està encara en una fase embrionària en què preval la tasca d’investigació bàsica i orientada. Però és en els pròxims 10-15 anys quan els resul-

tats d’aquesta recerca han de transferir-se a aplicacions que siguin plenament operatives dins del sistema sanitari, tant en la prevenció i diagnòstic com en la terapèutica. Breument, comentarem els àmbits de recerca més destacats en els quals es preveuen innovacions notables en els propers anys. Tenim, en primer lloc, el nanodiagnòstic, que possibilitarà la identificació de malalties o de la predisposició a aquestes a escala cel·lular o molecular mitjançant la utilització de nanodispositius. Sota aquest concepte s’unifica la necessitat social i clínica, juntament amb la capacitat tecnològica per detectar malalties en l’estat més primerenc possible, així com la necessitat de detectar efectes indesitjables potencials dels fàrmacs abans de la seva prescripció. Per assolir aquest objectiu, totes les activitats han d’estar encaminades a augmentar l’eficàcia del diagnòstic. I en aquest sentit, la nanotecnologia ofereix eines per millorar la sensibilitat, l’especificitat i la fiabilitat. També ofereix la possibilitat de realitzar mesures de diferents paràmetres en paral·lel o d’integrar diverses etapes del procés d’anàlisi, des de la preparació de la mostra fins a la seva detecció en un simple dispositiu miniaturitzat. Gràcies a la nanotecnologia, els dispositius futurs seran prou intel·ligents, a causa tant del seu caràcter informatitzat com del seu caire robust, per ser utilitzats pel pacient mateix i subministrar una multitud de dades al metge (EMRC, 2007). El diagnòstic in vitro pot ser realitzat mitjançant biosensors o dispositius integrats que contenen molts sensors (laboratoris en un xip). Un biosensor conté un determinat receptor biològic, com pot ser un enzim o un anticòs, capaç de detectar la presència o concentració d’una substància de manera específica i traduir aquesta interacció a través d’un transductor que transforma el senyal bioquímic en un senyal quantificable. L’aportació més rellevant de la nanotecnologia al diagnòstic per imatge se centra

48 J. SAMITIER

en el desenvolupament d’agents moleculars de contrast nous que permetin millorar la resolució de les tècniques d’imatge mèdica existents. Per visualitzar molècules específiques in vivo és necessari que es compleixin una sèrie de requisits: disponibilitat de nanodispositius d’alta afinitat per a la molècula a detectar amb una farmacodinàmica adequada, capacitat d’arribar a l’objectiu en una concentració i durant un temps suficient, utilització d’estratègies químiques o biològiques d’amplificació i disponibilitat de tècniques d’imatge amb suficient sensibilitat, resolució i velocitat. La nanotecnologia també permet incidir en les terapèutiques farmacològiques, ja que avui dia, per aconseguir terapèutiques efectives, no solament és necessari disposar de molècules amb activitat farmacològica, sinó que el vehicle, suport o sistema en el qual aquestes molècules estan incorporades desenvolupa un paper fonamental en l’èxit final del medicament. En aquest sentit, els sistemes nous d’alliberament de fàrmacs (Yaszenski, 2004) han permès de disposar de tractaments més selectius i potents, i han millorat la relació eficàcia/toxicitat. Aquesta idea va ser conseqüència del reconeixement de les possibilitats de millora de les propietats terapèutiques dels fàrmacs en virtut de la incorporació en un sistema que en permeti l’alliberament a la velocitat adequada i en l’entorn adequat. Per tant, la idea de sistema d’alliberament es va desvincular des dels seus inicis del concepte tradicional de forma farmacèutica, forma de dosificació o forma d’administració, que fan referència a la forma o condicionament final del fàrmac (comprimit, càpsula, injectable, supositori, etc.). Amb el pas del temps, els importants avenços en el disseny de nous sistemes d’alliberament han donat lloc a una ampliació d’aquest concepte, com és la generació de nanosistemes terapèutics. Aquesta àrea de la nanomedicina es defineix com la ciència i tecnologia de sistemes comple-

xos de grandària 1-1.000 nm formats per almenys dos components, un dels quals és un principi actiu. El sistema desenvolupat així està especialment dissenyat per tractar, prevenir o diagnosticar malalties. La nanotecnologia està íntimament vinculada amb la tecnologia de materials. Per tant, la seva contribució a les millores en les característiques dels biomaterials implantats és òbvia. La medicina regenerativa és una àrea emergent que cerca la reparació o reemplaçament de teixits i òrgans mitjançant l’aplicació de mètodes procedents de terapèutica genètica, terapèutica cel·lular i enginyeria tissular. L’enginyeria tissular combina la utilització de cèl·lules vives i biomaterials, que actuen com estructures de suport en la reconstrucció del teixit i realitzen les funcions de la matriu extracel·lular. Els biomaterials utilitzats en enginyeria tissular han sofert una clara evolució. Van començar sent materials inerts per a l’organisme (biomaterials de primera generació, període 1960-1970), i després van passar a ser materials bioactius o biodegradables, (biomaterials de segona generació, període 1980-1990). Actualment, els materials que s’utilitzen són els denominats de tercera generació, aquells capaços de mimetitzar respostes cel·lulars específiques d’escala molecular. Gràcies al desenvolupament de tecnologies d’escala nanomètrica, aquesta nova generació de materials millora la capacitat d’interaccionar amb els components cel·lulars, amb la finalitat de poder dirigir la proliferació i diferenciació cel·lular i la producció i organització de la matriu extracel· lular en un futur proper. EPÍLEG Podem concloure que la bioenginyeria, com a disciplina que cerca i desenvolupa tecnologies aplicades a la pràctica de la medicina, es troba en aquests moments

NOVES PERSPECTIVES DE LA BIOENGINYERIA A L’INICI DEL SEGLE XXI 49

en un procés de forta renovació, amb un ampli ventall de línies de recerca, tant pel que fa a les millores en les tecnologies com a la comprensió de problemes bàsics a escala cel·lular i molecular. De ben segur, en els propers anys veurem com la recerca i desenvolupament en bioenginyeria ens aportarà tant millores com aplicacions noves, que tindran una forta repercussió tant econòmica com social en l’àmbit de la sanitat i la biomedicina. En aquest sentit la convergència de tecnologies «nano-bio-info-cogno», també conegudes amb l’acrònim NBIC (Bainbridge, 2005) pot esdevenir una gran font d’innovacions tecnològiques per a la bioenginyeria. BIBLIOGRAFIA Bainbridge, W. S.; Roco, M. C. [ed.]. (2005). Managing nano-bio-info-cogno innovations: converging technologies in society. Berlín: Springer. Bronzino, J. (1995). Biomedical Engineering Handbook. Boca Raton: CRC Press. Cibat, A. (1794). Ensayo sobre el trismos traumatico: o sea la ineficacia de los antiespasmódicos comúnmente usados para la curación. [Lligall 3, Ms. 914, Archivo histórico de Valdecilla, Madrid] — (1804). Elementos de Fisica Experimental. [Biblioteca de la Universitat de Barcelona] — (1810). «Memoria sobre la necesidad de establecer la policía de sanidad en unas bases sólidas y estables, capaces de contener las epidemias y contagios desoladores...». Gaceta de Madrid (12 d’octubre): 1267-1268. Converging technologies iniciative [en línia]. <http:// www.nbic.org.es> EMRC (2007). White paper «Present status and future strategy for medical research in Europe». European Science Foundation.

Enderle, J.; Blanchard, S.; Bronzino, J. (2000). Introduction to biomedical engineering. Londres: Academic Press. Endy, D. (2005). «Foundations for engineering biology» Nature, 438: 449-453. Engelmann, U.; Munch, H.; Schoroter, A.; Meinzer, H. P. (2007). «The last 10 years of evolution in teleradiology: An overview of concepts and approaches of CHILI» Int. J. Cars, S315-S316. Ferrari, M. (2005). «Cancer nanotechnology: opportunities and challenges». Nature Reviews, 5: 161171. Galvani, L. (1791). «De viribus elettricitatis in motu musculari commentarius». Commentarii Bononiensi, 7: 363. Morato, A.; Narvaez, I.; Toribio, C. (2004). El futuro de los biomateriales. Madrid: Fundación OPTI. Morrow, J.; Bawa, R.; Wei, C. (2007). «Recent advances in basic and clinical nanomedicine». Med. Clin. N. Am., 91: 805-843. Pacela, A. (1990). Bioengineering education directory. Brea: Quest. Passariello, R. (2002). «Diagnostic imaging and intervencional radiology». Businness Briefing: Global Healthcare, 3: 90. Pérez, N. (2007). Anatomia, química i física experimental al Reial Col·legi de Cirurgia de Barcelona (1760-1808). Barcelona: UAB. [Tesi doctoral] Stevens, M. M.; George, J. H. (2005). «Exploring and egineering the cell surface interface». Science, 310: 1135-1138. Varmus, H. (1998). «Bioengineering: building the future of biology and medicine». Natcher Conference Center (National Institutes of Health) (27-28 de febrer). Visión estratégica de la nanomedicina en España [en línia]. (2006). <http://www.nanomedspain.net> Volta, A. (1800). «On the electricity excited by the mere contact of conducting substances of different kinds». Phil. Trans., 1: 403. Wild, J. J.; Reid, J. M. (1952). «Application of echoranging techniques to the determination of structure of biological tissues». Science, 115: 226-230. Yaszemski, M. J. [ed.]. (2004). Tissue Engineering and novel delivery systems. Nova York: Marcel Dekker.

DOI: 10.2436/20.1501.02.44

Les biotecnologies (Pere Puigdomènech i Francesc Gòdia, ed.) Treballs de la SCB. Vol. 58 (2007) 51-62

NANOBIOTECNOLOGIA: ALLIBERAMENT DE FÀRMACS, OBTENCIÓ D’IMATGES I DISSENY DE NANOBIOSENSORS AMB NANOMATERIALS Arben Merkoçi Institució Catalana de Recerca i Estudis Avançats, Grup de Nanobioelectrònica i Biosensors, Institut Català de Nanotecnologia, Departament de Química, Universitat Autònoma de Barcelona. Adreça per a la correspondència: Arben Merkoçi. ICREA i Grup de Nanobioelectrònica i Biosensors, Institut Català de Nanotecnologia, Departament de Química, UAB. 08193 Bellaterra. Adreça electrònica: arben.merkoci.icn@uab.es. RESUM Es presenta una introducció sobre la nanobiotecnologia com una dels parts principals de la nanotecnologia. Tres són els camps més importants de la nanobiotecnologia actual: a) alliberament controlat de fàrmacs, b) l’ús de nanopartícules per a l’obtenció d’imatges de cèl·lules i c) els nanobiosensors. Es descriu breument cadascun d’aquests camps i es fa una revisió d’algunes publicacions rellevants, incloent-hi, en el cas dels nanobiosensors, exemples del nostre grup d’investigació. Tals aplicacions, resultat de la difusió entre nanotecnologia i biotecnologia, demostren la importància de la nanobiotecnologia en el camp de la salut humana, entre altres camps d’interès. Paraules clau: nanobiotecnologia, nanopartícula, alliberament controlat de fàrmacs, imatges de cèl·lules, nanobiosensors. NANOBIOTECHNOLOGY: DRUG DELIVERY, IMAGING AND DESIGN OF NANOBIOSENSORS USING NANOMATERIALS SUMMARY An introduction of the nanobiotechnology as one of the principles parts of the nanotechnology. Three are the most important fields of the current nanobiotechnology: i) controlled delivery of drugs, ii) use of nanoparticles for the obtaining of images and iii) nanobiosensors. Each of these fields is described and a revision of some relevant publications, including examples of the group of research itself, in the case of the nanobiosensors, is done.

52 A. MERKOÇI

Such applications, results of the diffusion among nanotechnology and biotechnology, demonstrate the importance of nanobiotechnology in the field of the human health among other fields. Key words: nanobiotechnology, nanoparticles, drug delivery, cell imaging, nanobiosensors.

INTRODUCCIÓ La nanotecnologia i la nanobiotecnologia: què representen? La nanotecnologia és la ciència i al mateix temps l’enginyeria i la tecnologia de fabricació de sistemes dimensionats d’escala nanomètrica (1 nm = 10 –9 m). La nanotecnologia du a terme diverses tasques específiques, que poden ser de caràcter elèctric, mecànic, biològic, químic o fins i tot de computació. La nanotecnologia se centra en la manipulació de la matèria a una escala molecular i atòmica. Les nanoestructures, els nanoaparells i els nanosistemes exhibeixen propietats i funcions noves com a resultat de la seva mida reduïda, normalment en el rang d’1 a 100 nm. Aquest és un fenomen nou que estudia la nanociència fent servir la nanotecnologia. D’una banda, la nanotecnologia es considera la tecnologia de construcció de na-

noestructures des de baix a dalt amb una precisió d’escala molecular i atòmica. D’altra banda, representa també la creació, utilització o manipulació (de dalt a baix) de materials, aparells i sistemes mitjançant el control dels materials a escala nanomètrica amb diverses tècniques de nanocaracterització i fabricació. Ateses les funcions inherents a escala nanomètrica dels components biològics de les cèl·lules, era inevitable que la nanotecnologia s’apliqués a les ciències de vida. Tals aplicacions, resultat de la difusió entre nanotecnologia i biotecnologia, han creat una nova tecnologia: la nanobiotecnologia. La nanobiotecnologia és l’aplicació de la nanotecnologia a les ciències de vida o, amb altres paraules, l’aplicació d’eines de dimensions reduïdes (d’escala nanomètrica) als sistemes biològics. Addicionalment, la nanobiotecnologia utilitza els sistemes biològics com a plantilles per al desenvolupament de productes nous a escala nanomètrica.

Figura 1. Presentació esquemàtica dels segments principals de la nanobiotecnologia incloent-hi els aspectes més importants per a cada segment.

NANOBIOTECNOLOGIA 53

Quins són els objectius de la nanobiotecnologia? La demanda de més tecnologies avançades i innovacions en nanomaterials ha creat tres segments essencials dins de la nanobiotecnologia actual: l’alliberament de fàrmacs, l’obtenció d’imatges, i els nanobiosensors. A continuació s’expliquen breument aquests tres segments (vegeu la figura 1) que representen els camps més importants on s’està enfocant recentment la nanobiotecnologia: l’alliberament controlat de fàrmacs, l’ús de nanopartícules per a obtenció d’imatges de cèl·lules i els nanobiosensors. ALLIBERAMENT DE FÀRMACS La nanobiotecnologia està tenint un impacte no solament en el camp de la diagnosi, sinó també en el d’alliberament dels fàrmacs. L’anàlisi de les transduccions de senyals (canvis de senyals durant els processos biològics) amb tècniques nanobiotecnològiques podria proporcionar idees noves sobre els processos d’una malaltia, i permetria identificar biomarcadors nous, més eficaços, i entendre els mecanismes d’acció dels fàrmacs; a més, ajudaria a dissenyar-ne de nous. L’objectiu essencial en l’alliberament del fàrmac és repartir-lo eficaçment en el seu objectiu biològic (diana) sense provocar efectes secundaris nocius. Aquest alliberament controlat dels fàrmacs, en principi, minimitzaria la toxicitat causada per l’excés dels fàrmacs, i repartiria una dosi eficaç del fàrmac cap al lloc on cal. L’alliberament controlat exigeix la conjugació química de fàrmacs o dels transportadors del fàrmac amb la diana (o amb una part seva) que ho necessita. Els sistemes d’alliberament de fàrmacs (DDS, de l’anglès drug delivery systems) poden millorar les propietats far-

macològiques dels fàrmacs convencionals canviant-ne la farmacocinètica i la biodistribució, i també funcionen com a reservoris dels fàrmacs. Els DDS actuals són eficaços per dur a terme l’alliberament dels fàrmacs d’una manera controlada, però al mateix temps produeixen una concentració local del fàrmac relativament alta, que està dirigida a tot el teixit i no solament a les cèl·lules que ho necessiten. En canvi, les nanopartícules, per tal com són més petites, tindrien una càrrega de fàrmac més baixa i, a més, a causa de la seva mida, podrien travessar la membrana cel·lular i portar el fàrmac al destí. Aquests nous DDS basats en la nanotecnologia (nanoDDS) tenen diàmetres de ~100 nm o menys. Els nanoDDS inclouen liposomes, dendrímers, micel·les i nanopartícules polimèriques i ceràmiques, i s’estan estudiant àmpliament per a l’alliberament de diversos fàrmacs en objectius cel·lulars. A part de la capacitat de ser utilitzats com a portadors de fàrmacs, els DDS han de tenir la capacitat de poder dirigir-se a l’objectiu (diana) que ho necessita. És per això que a aquests materials s’ha d’afegir una «marca» especifica que farà de guia per fer-los arribar al destí. La figura 2a descriu el trànsit intracel·lular típic per a les nanopartícules i altres sistemes de transport de medicaments basats en col·loides (Vasir et al., 2007), mentre que la 2b esquematitza l’alliberament dirigit d’un fàrmac dins de les cèl·lules de melanoma metastatitzades (Rezler et al., 2007). Un altre exemple és l’ús de nanopartícules per a l’alliberament de fàrmacs en el camp d’aplicacions oftàlmiques. Les nanopartícules, en forma de solució col·loïdal, es poden subministrar o aplicar a l’ull en forma de gota, igual com es fa amb altres medicaments. La biodisponibilitat ocular de molts fàrmacs augmenta significativament quan aquest està connectat amb les nanopartícules en comparació de l’ús del mateix

54 A. MERKOÇI

fàrmac en forma de solució aquosa normal de gotes (Reshetnikov et al., 2007). La figura 3 demostra el cas d’un vehicle d’alliberament del fàrmac que és sensitiu

a l’acidesa. Es tracta de les nanopartícules de policetal, que estan dissenyades per ser alliberades just quan arriben al medi àcid al voltant d’un tumor (Heffernan et al., 2005).

Figura 2. a) Representació esquemàtica d’alliberament de fàrmacs (escala no real) amb nanopartícules. 1) associació cel·lular dels NP, 2) internacionalització de NP dins les cèl·lules mitjançant l’endocitosi, 3) escapada endosòmica de NP, 4) alliberament del fàrmac dins el citoplasma, 5) transport citosòlic de l’agent terapèutic, 6) degradació del fàrmac a lisosoma o citoplasma, 7) exocitosi de NP. PE: endosoma primari; RE: endosoma reciclant; Endo-lys: endolisosomes; Lys: lisosoma. b) Representació esquemàtica del cas d’alliberament dirigit dins les cèl·lules de melanoma metastatitzades: 1) degradació i escapada endosòmica, 2) alliberament del fàrmac. En els dos casos es mostra com les nanopartícules (carregades amb un fàrmac adequat) penetren dins de la cèl·lula i es dirigeixen cap a la diana, on alliberen el fàrmac (Vasir et al., 2007; Rezler et al., 2007).

NANOBIOTECNOLOGIA 55

Aquest sistema d’alliberament en principi podria tenir aplicacions nombroses, ja que la síntesi d’aquests productes és relativament fàcil i, a més, presenten propietats de degradació excel·lents. Un altre sistema alternatiu d’alliberament que ha emergit com a alternativa a les nanopartícules són els nanotubs de carboni d’una sola paret (SWCNT, de l’anglès single walled carbon nanotubes). Els SWCNT representen un nou nanovehicle altament eficaç per a l’alliberament d’espècies de mides i propietats diverses a la membrana cel·lular. Els SWCNT poden ser utilitzats per alliberar molècules més petites a les cèl·lules que en necessiten (Bottini et al., 2006; Nakayama-Ratchford et al., 2007). OBTENCIÓ D’IMATGES MITJANÇANT NANOPARTÍCULES Es preveu que la nanobiotecnologia proporcioni recursos nous per a la millora de la diagnosi i el tractament de les malalties. Els avenços en les tècniques de síntesi d’una varietat de nanomaterials ha fet que augmenti l’interès per l’ús de nanopartícu-

les com a eines noves d’obtenció d’imatges per a una sèrie d’aplicacions biomèdiques in vivo (Rosi et al., 2005; Gao et al., 2005). Els exemples típics inclouen nanopartícules magnètiques com a agents de contrast de la ressonància magnètica (Kim et al., 2003; Martina et al., 2005), punts quàntics (QD, de l’anglès quantum dots) (Gao et al., 2004) i nanopartícules d’or (AuNP) (Loo et al., 2002; Huang et al., 2006) com a sondes per a l’obtenció d’imatges òptiques. Les propietats físiques noves dels nanomaterials, com el superparamagnetisme, la fluorescència altament intensa, i la ressonància de plasmons de superfície, els donen avantatges sobre els materials convencionals moleculars utilitzats fins ara. Els punts quàntics semiconductors (QD) estan reemplaçant lentament els fluoròfors moleculars com a agents de contrast òptic gràcies a la seva intensitat i estabilitat espectral significativament millorades (Bruchez et al., 1998). La investigació duta a terme fins ara en el camp de les aplicacions biològiques ha mostrat que una gran part de les tècniques, incloent-hi les que utilitzen l’emissió en la gamma de l’infraroig proper (NIR), es poden fer servir amb nanopartí-

Figura 3. Síntesi del policetal (poli(1,4-fenileneacetona dimetilè), PPADK), mitjançant la reacció d’intercanvi d’acetal. a) polimerització per etapes basada en la reacció d’intercanvi d’acetal entre 1,4-benzendimetanol i 2,2-dimetoxipropà per produir PPADK; b) formació de nanopartícules carregades amb el fàrmac amb el mètode d’evaporació del solvent. Les partícules exhibeixen una degradació que depèn del pH i es degraden a altres espècies de pes molecular baix (Heffernan et al., 2005).

56 A. MERKOÇI

cules. Les aplicacions biològiques dels QD inclouen el marcatge dels tumors in vitro i in vivo, l’observació in vivo de la circulació de les cèl·lules a llarg termini i l’estudi dels fenòmens intracel·lulars amb una resolució molecular. La raó principal de la versatilitat dels QD es basa en la seva química de superfície en la fase aquosa rica, que fa possible la incorporació d’un ampli espectre de biomolècules (proteïnes, pèptids, DNA, etc.) dissenyades per dur a terme una funció específica dins d’una cèl·lula. Últimament s’ha informat per primera vegada de l’obtenció d’imatges simultànies in vivo de cinc fluxos limfàtics diferents i la

seva circulació cap a nòduls limfàtics determinats (Kobayashi et al., 2007). S’utilitzen cinc QD compostos de seleniür de cadmi (CdSe) de mides diverses (amb pics d’emissió de 565, 605 i 655 nm) o tel·lurur de cadmi (CdTe, amb emissió de llum a 705 i 800 nm). Es fa una injecció intercutània simultània dels cinc QD (tres de CdSe i dos de CdTe) en cinc llocs diferents en les falangines, l’extremitat superior, les orelles i la barbeta, per controlar els drenatges limfàtics al coll i al tronc superior, on hi ha les xarxes limfàtiques més complexes del cos (vegeu la figura 4).

Nodes cervicals interiors N o Nodes d cervicals superficials

Nodes toràcics laterals Conducte toràcic

Imatges en blanc i negre

Nodes auxiliars

Imatges en cinc colors Figura 4. a) Anatomia del sistema limfàtic de la part alta del cos del ratolí amb una il·lustració esquemàtica de les imatges de fluorescència amb cinc colors diferents i un gràfic dels espectres d’emissió de cada un dels cinc QD utilitzats (QD 565, blau; QD 605, verd; QD 655, groc; QD 705, magenta; QD 800, vermell). Els nòduls limfàtics pintats són els nòduls limfàtics que drenen i que es visualitzen en aquest estudi. b) Imatge in vivo amb cinc colors del drenatge limfàtic (Kobayashi et al., 2007).

NANOBIOTECNOLOGIA 57

NANOBIOSENSORS Actualment hi ha un ús creixent dels nanomaterials per a aplicacions en biosensors. Malgrat l’esforç, no hi ha encara cap biosensor que sigui produït totalment en l’escala nanomètrica. Un objectiu principal de la nanobiotecnologia a llarg termini és la creació d’aparells que es puguin utilitzar dins del cos d’un pacient per realitzar tasques de diagnosi. El punt crucial d’aquest objectiu és la integració en nanoescala de l’esdeveniment de detecció —dit també reconeixement (bio)químic— amb l’element responsable de la transducció de senyal electrònic. El procés d’integració, que inclou també la transmissió del senyal i la font d’energia necessària per al funcionament del biosensor, serà costós i arriscat, ja que no es poden garantir totalment ni la funció ni l’adaptació de la tecnologia. A continuació es mostren alguns casos d’aplicació de nanopartícules per dur a terme l’analisi de DNA com a exemples d’una integració parcial: detecció-senyal. Anàlisi de DNA i els genosensors L’evolució ràpida del Projecte Genoma Humà ha fomentat el desenvolupament de

Nanobiosensor

Energia

Figura 5

Senyal

Detecció

Informació

diversos mètodes analítics per a la detecció de mutacions i per entendre altres problemes complexos de la biologia molecular. Les tecnologies relacionades amb el DNA s’estan convertint en plataformes capdavanteres per descobrir i desenvolupar nous assaigs diagnòstics. Aquests assaigs estan emergint com a eines d’una importància especial per determinar els tipus de tractament que han de prescriure els metges als pacients. L’anàlisi de DNA o, en altres paraules, detectar la seqüència de les bases que el constitueixen, és el fonament de la investigació genètica. Aquesta classe d’anàlisi normalment exigeix temps i esforços considerables per part dels especialistes. Fins i tot la quantitat més petita de DNA extreta de cèl·lules està formada per uns quants milions de bases, que no es poden llegir directament. Primer el DNA s’ha de dividir en fragments d’uns quants centenars de parells de bases. Després, s’ha de produir un nombre de còpies d’aquests fragments mitjançant la PCR i, finalment, la informació de l’anàlisi s’ha de processar i descodificar amb un ordinador per completar l’anàlisi. El procés complet exigeix l’ús d’equips relativament sofisticats i cal que es porti a terme en un laboratori especialitzat. Què es pot fer en el cas en què és necessari un control ràpid (screening) per detectar si hi ha present només una seqüència de DNA relativament curta? És possible evitar la PCR

Figura 5. Els components principals d’un nanobiosensor totalment integrat en nanoescala. La part de detecció i els reactius relacionats estan totalment integrats a escala nanomètrica. La detecció d’un esdeveniment químic o biològic es converteix en un senyal que es pot propagar cap a l’usuari. La font d’energia que s’ha d’utilitzar per fer nanobiosensors capaços de ser autònoms durant la seva vida en un medi biològic hauria d’estar basada en la bioelectrònica. Les dades de diagnosi s’han de transmetre al pacient o l’especialista per a la interpretació i presa de mesures adequades. Un cop construïts tots els elements d’un nanobiosensor en l’escala nanomètrica, s’han d’integrar en un mateix sistema .

58 A. MERKOÇI

per reduir el temps d’anàlisi i el cost? La resposta la tenim en uns aparells simples anomenats sensors de DNA o genosensors. L’acoblament de l’esdeveniment d’identificació de l’àcid nucleic amb un transductor òptic o electroquímic condueix a una detecció ràpida de les seqüències de DNA, que és el principi d’un genosensor (vegeu la figura 6, part esquerra). Aquests aparells tindrien un gran interès per ser utilitzats en la detecció ràpida de seqüències de DNA relacionades, per exemple, amb una malaltia infecciosa, un contaminant específic o un ingredient especial d’un aliment, incloent-hi la identificació d’un aliment en particular. Els sensors electroquímics, entre altres,

estan mostrant un paper creixent en diversos camps en què cal un sistema de mesurament ràpid, acurat i de baix cost. La millora dels sistemes existents i el disseny conceptual de nous sistemes requereixen la millora contínua de tots els components dels sistemes de detecció electroquímica de DNA. Detecció de DNA basada en nanopartícules El desenvolupament de sistemes de detecció no isotòpics sensibles ha causat un impacte significatiu en el camp dels sensors de DNA. Els biosensors electroquímics

Figura 6. Esquerra: Representació esquemàtica d’un sensor de DNA. Una sonda de DNA (P1) s’immobilitza a la superfície d’un transductor (S). El DNA objectiu (diana T) que necessita ser analitzat s’hibrida amb la seqüència de DNA P1, complementària al T, i que està immobilitzada sobre la superfície d’un sensor S. En una segona etapa tindria lloc la segona hibridació d’una altra part de T amb una altra sonda complementària P2, que està connectada amb una marca (label) detectable. Un senyal electroquímic o òptic perceptible (relacionat amb la marca utilitzada) es produeix quan la seqüència per analitzar (T) queda «atrapada» en l’anomenat sandwich. Dreta. Estratègies utilitzades per a la detecció de DNA mitjançant l’ús de nanopartícules metàl·liques. Normalment una sonda de DNA està immobilitzada sobre una plataforma de transducció, s’hibrida amb el DNA diana (objectiu) i més endavant aquesta diana s’hibrida amb un altre DNA complementari modificat amb una nanopartícula. a) Assaig basat en mesures de conductivitat: la deposició de plata sobre les nanopartícules d’or (amb hidroquinona com a agent reductor) amb un increment notable del corrent, apareix només quant hi ha present el DNA diana, b) assaig basat en la redissolució electroquímica anòdica de les nanopartícules d’or (utilitzades com a marques de DNA) després de la redissolució química amb la mescla Hbr/Br2, c) igual com b), però les nanopartícules d’or es cobreixen primer amb plata, que és el metall que es detecta després (Wang et al., 2001) i d) multietiquetatge mitjançant l’ús de tres nanopartícules diferents (punts quàntics, QD) i la detecció simultània de tres sondes de DNA diana.

NANOBIOTECNOLOGIA 59

d’afinitat, basats en marcatge amb enzims, han resolt els problemes de detecció radioactiva (p. ex., perills per a la salut i temps de vida curts) i han obert noves possibilitats per a la detecció ultrasensible i automatitzada de DNA (Pividori et al., 2000). No obstant això, els biòlegs investiguen com uns altres camps d’aplicació necessiten una gamma més àmplia i fiable de sistemes de marcatge, més robustos, que permetin una bioanàlisi d’alt rendiment i la possibilitat de determinació simultània de diverses biomolècules presents en una mostra. Les tècniques de marcatge existents tenen uns quants desavantatges: els marcadors utilitzats tenen temps de vida curts i un nombre limitat de combinacions, que es poden utilitzar per a l’anàlisi simultània de diversos analits. El marcatge de materials biològics amb colorants orgànics fluorescents també s’ha emprat àmpliament i s’ha utilitzat en una varietat de sistemes de detecció òptica de DNA. Els fluoròfors orgànics, tanmateix, tenen característiques que limiten la seva eficàcia per a tals aplicacions. Aquestes limitacions inclouen bandes d’excitació estretes i bandes d’emissió amples amb cues espectrals vermelles, que poden ser problemàtiques en l’avaluació simultània d’unes quantes sondes a causa de la superposició espectral. Altres desavantatges de molts colorants orgànics són que no són estables i es degraden sota la llum. Millorar la sensibilitat d’assaig i arribar a una millora i fiabilitat d’anàlisi significa cercar altres alternatives de marcatge. Les propietats electroquímiques de les nanopartícules (NP) fan que siguin extremadament fàcils de ser detectades utilitzant a més a més una instrumentació simple com l’anomenada anàlisi de redissolució electroquímica, que permet el disseny d’assaigs ultrasensibles i detecció simultània. La detecció d’hibridació de DNA amb mesures conductomètriques després del marcatge amb nanopartícules ha estat de-

mostrada per Park et al. (2002). Els autors fan servir la tècnica de deposició de plata i mesuren l’augment de la conductivitat quan es produeix l’amplificació de les nanopartícules d’or (vegeu la figura 6a). Altres estratègies per a la detecció de DNA es basen en l’ús de NP d’or (AuNP) o en els QD. S’han utilitzat extensament diverses tècniques de redissolució voltamètrica o potenciomètrica basades en elèctrodes de screen-printed (Wang et al., 2001) o fins i tot amb elèctrodes construïts amb portamines de carboni (Ozsoz et al., 2003). El senyal electroquímic intrínsec de les AuNP, observat després de dissoldre-les amb HBr/Br2, es relaciona llavors amb DNA. La mesura s’aconsegueix mitjançant la preconcentració d’ions d’or (+3) després de la reducció electroquímica i la subsegüent determinació amb voltametria de redissolució anòdica (vegeu la figura 6b) (Wang et al., 2001). Amb l’objectiu de disminuir els límits de detecció, s’ha utilitzat també l’amplificació mitjançant deposició de plata. Això representa una alternativa interessant per a l’obtenció de més sensibilitat en la detecció de DNA (Thaxton et al., 2005; Wang et al., 2001) (vegeu la figura 6c). El marcatge amb NP fa possible la detecció simultània de més d’una sonda de DNA en una mostra. El nombre de sondes (dianes) que es poden detectar simultàniament és controlat pel nombre de marcadors NP distingibles amb la tècnica voltamètrica. A continuació es descriu un assaig d’hibridació basat en l’ús de tres QD (ZnS, CdS i PbS) (Wang et al., 2003). Les sondes de DNA connectades amb QD representen pics de redissolució ben definits en els potencials: –1,12 V (Zn), –0,68 V (Cd) i –0,53 V (Pb) amb un elèctrode de carboni vitrificat cobert d’una capa de mercuri (amb l’elèctrode de referència d’Ag/AgCl) després de dissoldre les nanopartícules de metall esmentades. (vegeu la figura 6d).

60 A. MERKOÇI

Integració dels components del genosensors L’ús de NP com a marques electroquímiques per a la detecció de DNA té uns quants avantatges. La tècnica relacionada (voltametria de redissolució) és més barata comparada amb l’òptica, i més ràpida i fàcil de fer servir en l’anàlisi de camp. A més, ofereix la possibilitat de la detecció simultània d’unes quantes molècules biològiques en la mateixa mostra amb un sensor únic, tot això a causa de l’obtenció d’una corba voltamètrica específica produïda per marques electroquímiques diferents. Els avantatges oferts, juntament amb la possibilitat de ser utilitzada en l’anàlisi d’un conjunt de biomolècules, exigeixen el desenvolupament de noves estratègies de detecció de nanopartícules. Últimament s’ha desenvolupat una tècnica nova de detecció de DNA basada en un genosensor integrat (Pumera et al., 2005). Es basa en la detecció electroquímica directa

de DNA mitjançant la detecció de AuNP utilitzades com a marques. El sistema desenvolupat evita la redissolució acídica prèvia (és a dir, HBr/Br2). Per aconseguir aquest objectiu es fan servir micropartícules paramagnètiques (MP) modificades amb estreptavidina, que es modifiquen amb sondes de DNA amb biotina. Aquesta sonda de DNA (sonda de captura) s’hibrida després amb el DNA marcat amb AuNP (Au67) en una proporció 1:1. El conjugat resultant, MP-DNAAuNP, és recollit magnèticament mitjançant un magnetosensor (un sensor amb un imant petit integrat al seu interior) (vegeu la figura 7). Els avantatges més destacats d’aquest nou sensor són: a) la detecció directa de les AuNP evita l’ús de la redissolució química prèvia i b) la connexió 1:1 entre el DNA i les AuNP evita la formació de les xarxes entre les MP i les AuNP, i augmenta així la sensibilitat d’anàlisi. La integració de la nanotecnologia amb la biologia i l’electroquímica, l’anomenada nanobioelectrònica, pot produir avenços importants en el camp dels sensors electroquímics de DNA i dels immunosensors. La recerca sobre l’aplicació dels sistemes citats en mostres reals està en procés de desenvolupament i s’espera que pugui portar noves alternatives i avenços en l’anàlisi del DNA. CONCLUSIONS

Figura 7. Representació esquemàtica del principi d’un nou genosensor basat en l’ús de AuNP. Es fa servir un material electròdic nou que inclou un imant al seu interior. Aquest magnetosensor captura les partícules paramagnètiques amb l’híbrid de DNA connectat amb les AuNP. Després de la captura del conjugat es du a terme la voltametria de polsos diferencial de les AuNP i el senyal obtingut es relaciona amb la quantitat del DNA diana present en la mostra.

La nanobiotecnologia, com a part de la nanotecnologia, ha augmentat la seva importància durant els darrers deu anys, en particular en medicina i farmacologia. Aquesta àrea d’investigació obre perspectives noves en relació amb la terapèutica i la diagnosi. En el camp dels fàrmacs, les nanopartícules, un producte d’especial interès per a la nanobiotecnologia, estan esdevenint una eina nova per assegurar un alliberament

NANOBIOTECNOLOGIA 61

controlat dels fàrmacs. Per dur a terme aquestes funcions la preparació adequada de les nanopartícules té una importància especial, per assegurar la càrrega amb el fàrmac i la modificació adequada de la nanocàpsula formada per poder dirigir-la cap al lloc que ho necessita. A més, la nanocàpsula s’ha d’obrir fàcilment (per alliberar el fàrmac) i les restes (l’excés de nanocàpsules) s’han d’evacuar per evitar possibles efectes secundaris. La utilització de les nanopartícules per obtenir imatges de cèl·lules és ja un camp consolidat amb una sèrie d’avantatges en relació amb altres tècniques. Cal destacar no solament la qualitat d’imatge (ja que hi ha més intensitat de fluorescència), sinó també la possibilitat d’obtenir imatges multicolor amb una qualitat millor de diagnosi. Un altre camp d’interès per a l’ús de nanopartícules és el dels nanobiosensors. Encara que la preparació d’un nanobiosensor ideal, que integra en un únic sistema totes les parts necessàries per al seu funcionament, encara no ha tingut lloc, s’està fent un gran esforç per al desenvolupament d’una nova generació de biosensors que aprofita una sèrie d’avantatges que ofereixen els nanomaterials. El camp de l’ús de les nanopartícules, com a marcadors de DNA o anticossos, és només una part d’aquestes aplicacions. La nanobiotecnologia és un camp d’investigació interdisciplinari i es basa en un treball cooperatiu de farmacèutics, químics, físics, biòlegs, metges i enginyers. Els tres camps de la nanobiotecnologia mostrats en aquest article són només part dels esforços que s’estan duent a terme últimament. La nanobiotecnologia investiga també, en la interfase entre la biotecnologia i la nanotecnologia, els fenòmens d’autoacoblament o autoorganització de biomolècules, com les membranes cel·lulars o els virus, per adaptar aquests principis a la producció de noves nanoestructures. Hi ha altres casos més que no són descrits en aquesta revisió i

que poden ser objecte d’altres articles interessants en el futur. AGRAÏMENTS L’autor d’aquesta revisió agraeix les ajudes de la Fundació Ramón Areces (projecte Bionanosensores), el MEC (Madrid) (projectes MAT2008-03079/NAN) i Consolider-Ingenio 2010 (projecte CSD2006-00012) per a la investigació duta a terme en el camp dels nanobiosensors. Resta agraït també a tots els seus col·laboradors, professors i doctorands, que han contribuït a dur a terme els treballs mencionats. BIBLIOGRAFIA Bottini, M.; Cerignoli, F.; Dawson, M. I.; Magrini, A.; Rosato, N.; Mustelin, T. (2006). «Full-length single-walled carbon nanotubes decorated with streptavidin-conjugated quantum dots as multivalent intracellular fluorescent nanoprobes». Biomacromolecules, 7: 2259-2263. Bruchez, J. M.; Moronne, M.; Gin, P.; Weiss, S.; Alivisatos, A. P. (1998). «Semiconductor nanocrystals as fluorescent biological labels». Science, 281: 20132016. Gao, X.; Cui, Y.; Levenson, R. M.; Chung, L. W.; Nie, S. (2004). «In vivo cancer targeting and imaging with semiconductor quantum dots». Nat. Biotechnol., 22: 969-976. Gao, X.; Yang, L.; Petros, J. A.; Marshall, F. F.; Simons, J. W.; Nie, S. (2005), «In vivo molecular and cellular imaging with quantum dots». Curr. Opin. Biotechnol., 16: 63-72. Heffernan, M. J.; Murthy, N. (2005). «Polyketal nanoparticles: a new pH-sensitive biodegradable drug delivery vehicle». Bioconjugate Chem., 16: 13401342. Huang, X.; El-Sayed, I. H.; Qian, W.; El-Sayed, M. A. (2006). «Cancer cell imaging and photothermal therapy in the near-infrared region by using gold nanorods». J. Am. Chem. Soc., 128: 2115-2120. Kim, D. K.; Mikhaylova, M.; Wang, F. H.; Kehr, J.; Bjelke, B.; Zhang, Y.; Tsakalakos, T.; Muhammed, M. (2003). «Starch-coated superparamagnetic nanoparticles as MR contrast agents». Chem. Mater., 15: 4343-4351.

62 A. MERKOÇI

Kobayashi, H.; Hama, Y.; Koyama, Y.; Barrett, T.; Regino, C. A. S.; Urano, Y.; Choyke, P. L. (2007). «Simultaneous multicolor imaging of five different lymphatic basins using quantum dots». Nano Lett., 6: 1711-1716. Loo, C.; Lowery, A.; Halas, N.; West, J.; Drezek, R. (2002). «Immunotargeted nanoshells for integrated cancer imaging and therapy». Nano Lett., 5: 709711. Martina, M. S.; Fortin, J. P.; Menager, C.; Clement, O.; Barratt, G.; Grabielle-Madelmont, C.; Gazeau, F.; Cabuil, V.; Lesieur, S. (2005). «Generation of superparamagnetic liposomes revealed as highly efficient MRI contrast agents for in vivo imaging». J. Am. Chem. Soc., 127: 10676-10685. Nakayama-Ratchford, N.; Bangsaruntip, S.; Sun, X.; Welsher, K.; Dai, H. (2007). «Noncovalent functionalization of carbon nanotubes by fluoresceinpolyethylene glycol: supramolecular conjugates with pH-dependent absorbance and fluorescence». J. Am. Chem. Soc., 129: 2448-2449. Ozsoz, M.; Erdem, A.; Kerman, K.; Ozkan, D.; Tugrul, B.; Topcuoglu, B.; Ekren, H.; Taylan, M. (2003). «Electrochemical genosensor based on colloidal gold nanoparticles for the detection of factor v leiden mutation using disposable pencil graphite electrodes». Anal. Chem., 75: 2181-2187. Park, S. J.; Taton, T. A.; Mirkin, C. A. (2002). «Arraybased electrical detection of DNA with nanoparticle probes». Science, 295: 1503-1503. Pividori, M. I.; Merkoçi, A.; Alegret, S. (2000). «Electrochemical genosensor design. Immobilization of oligonucleotides onto transducer surfaces and detection». Biosensors & Bioelectronics, 15: 291-303.

Pumera, M.; Castañeda, M. T.; Pividori, M. I.; Eritja, R.; Merkoçi, A.; Alegret, S. (2005). «Magnetically trigged direct electrochemical detection of DNA hybridization using Au67 quantum dot as electrical tracer». Langmuir, 21:. 9625-9629. Reshetnikov, P. S.; Haldar, M. K.; Seal, S.; Mallik, S. (2007). «Surface-derivatized nanoceria with human carbonic anhydrase ii inhibitors and fluorophores: a potential drug delivery device». J. Phys. Chem. C., 111: 8437-8442. Rezler, E. M.; Khan, D. R.; Lauer-Fields, J.; Cudic, M.; Baronas-Lowell, D.; Fields, G. B. (2007). «Targeted drug delivery utilizing protein-like molecular architecture». J. Am. Chem. Soc., 129: 4961-4972. Rosi, N. L.; Mirkin, C. A. (2005). «Nanostructures in biodiagnostics». Chem. Rev., 105: 1547-1562. Thaxton, C. S.; Hill, H. D.; Georganopoulou, D. G.; Stoeva, S. I.; Mirkin, C. A. (2005). «A bio-bar-code assay based upon dithiothreitol-induced oligonucleotide release». Anal. Chem., 77: 8174-8178. Vasir, J. K; Labhasetwar, V. (2007). «Biodegradable nanoparticles for cytosolic delivery of therapeutics». Advanced Drug Delivery Reviews, 59: 718–728. Wang, J; Liu, G.; Merkoçi, A. (2003). «Electrochemical coding technology for simultaneous detection of multiple DNA targets» J. Am. Chem. Soc., 125: 3214-3217. Wang, J.; Polsky, R.; Xu, D. (2001). «Silver-enhanced colloidal gold electrochemical stripping detection of DNA hybridization». Langmuir, 17: 5739-5741. Wang, J.; Xu, D.; Kawde, A.-N.; Polsky, R. (2001). «Metal nanoparticle-based electrochemical stripping potentiometric detection of DNA hybridization». Anal. Chem., 73: 5576-5581.

Les aplicacions: salut, alimentació, indústria i medi ambient

DOI: 10.2436/20.1501.02.45

Les biotecnologies (Pere Puigdomènech i Francesc Gòdia, ed.) Treballs de la SCB. Vol. 58 (2007) 65-78

NOUS FÀRMACS. MEDICINA PERSONALITZADA José M. Palacios i Sonsoles Musoles Agència de Valorització i Comercialització dels Resultats de la Investigació, Universitat de Barcelona, Parc Científic de Barcelona. Adreça per a la correspondència: José M. Palacios. Agència de Valorització i Comercialització dels Resultats de la Investigació, UB, Parc Científic de Barcelona. Torre D, Baldiri Reixac, 4-6. 08028 Barcelona. Adreça electrònica: avcri@pcb.ub.es. RESUM El desenvolupament de metodologies que permeten la seqüenciació de genomes individuals d’una manera ràpida i amb costos acceptables fa pensar que en el futur serà possible parlar de medicina personalitzada, és a dir, la possibilitat d’administrar a un pacient específic el fàrmac apropiat per a la indicació apropiada amb la dosi adequada. Això hauria de permetre evitar la falta d’eficàcia i seguretat d’una bona part dels fàrmacs utilitzats actualment, que està lligada a la gran variació genètica en la població general en els llocs d’acció dels fàrmacs i als mecanismes que en determinen l’absorció, el metabolisme i l’excreció. La farmacogenètica i, més àmpliament, la farmacogenòmica, són les ciències en què es basa la medicina personalitzada. El canvi més important en el desenvolupament de nous fàrmacs en l’era postgenòmica està lligat a la necessitat de desenvolupament conjunt del binomi assaig diagnòstic i tractament dirigit. El compliment de les promeses de la farmacogenòmica té implicacions que van més enllà dels aspectes purament científics, ja que requereixen un canvi radical en la pràctica de la medicina amb implicacions ètiques, legals, reguladores i econòmiques. Aquest article revisa les diferències entre el desenvolupament tradicional de fàrmacs i els canvis introduïts per l’ús de la informació genòmica en el desenvolupament de noves terapèutiques. Paraules clau: farmacogenètica, farmacogenòmica, diagnòstic, desenvolupament de fàrmacs, medicina personalitzada. NEW DRUGS. PERSONALIZED MEDICINE SUMMARY The development of methodologies allowing for the sequencing of individual genomes in a rapid manner and with acceptable costs allows us to think that in the future it will be possible to speak of personalized medicine, i.e., the possibility to treat a particular patient

66 J. M. PALACIOS I S. MUSOLES

with the drug for the right indication at the right dose. This should help to avoid the lack of efficacy and safety of a good part of the drugs used currently that is linked to the great genetic variability in the general population with regard to the sites of actions of drugs as well as in the mechanisms determining their absorption, metabolism and excretion. Pharmacogenetics and more widely pharmacogenomics are the sciences in which personalized medicine is based. The most important change in the development of new medicines in the postgenomic era is linked to the necessity of developing, at the same time, both a diagnostic assay and a targeted treatment. The fulfilment of the promises of pharmacogenomics has implications far beyond the pure scientific aspects as it requires a radical change in the way medicine is currently practised with ethical, legal, regulatory and economic implications. This paper reviews the differences between the traditional drug development and the changes introduced by the use of genetic information in the development of new therapies. Key words: pharmacogenetics, pharmacogenomics, diagnostics, drug development, personalized medicine. EL GENOMA DE JAMES WATSON: L’ERA DE LA MEDICINA PERSONALITZADA El 31 de maig de 2007, en una cerimònia que va tenir lloc a Houston, Richard Gibbs, director del Centre per a la Seqüenciació del Genoma Humà del Baylor College of Medicine, i Jonathan Rothberg, fundador de la companyia 454 BioScience, lliuraven a James Watson dos DVD que contenien la seqüència completa del seu genoma. Aquesta era la primera vegada que es generava un genoma personalitzat i identificat d’una persona concreta. Sembla adequat que la primera persona que hagi rebut públicament una còpia de la seqüència completa del seu genoma sigui James Watson, atès que ell, juntament amb Francis Crick, va publicar l’any 1953 a la revista Nature un article capital en la història de la biologia molecular i de la biotecnologia titulat «Molecular structure of nucleic acids; a structure for deoxyribose nucleic acid» (Watson i Crick, 1953). Encara que aquest fet no ha passat sense controvèrsia (Check, 2007), pot ser considerat una fita més en la llarga carrera que ha dut des dels descobriments de les bases

de l’herència per part de Mendel (finals del segle xix) a la seqüenciació del genoma humà, publicada per dos consorcis en les revistes Nature i Science l’any 2001 (Lander et al., 2001; Venter et al., 2001), que van des del reconeixement que el DNA és el material hereditari, la determinació de la seva estructura, l’elucidació del codi genètic, el desenvolupament de la tecnologia del DNA recombinant i l’establiment de tot un seguit de mètodes automatitzats per a la reproducció i seqüenciació del DNA fins a la posada en marxa al començament dels anys noranta del segle passat del Projecte Genoma Humà, que es va coronar amb la publicació de la seqüència l’any 2001 (Collins et al., 2003). Tots aquests avenços signifiquen que, gràcies al desenvolupament de tecnologies que permeten l’automatització de l’establiment de la seqüència completa del genoma d’una persona amb un cost i una efectivitat acceptable (es parla de costos del voltant de mil dòlars per genoma en un futur no gaire llunyà), que es pugui pensar en una cosa que es va proposar ja a la fi dels noranta amb l’avenç en la genòmica i que va generar grans expectatives, que s’ha anomenat medicina personalitzada o medicina individualitzada.

NOUS FÀRMACS. MEDICINA PERSONALITZADA 67

Què vol dir medicina personalitzada? Vol dir que un pacient ha de rebre el fàrmac correcte per a la indicació correcta a la dosi correcta i en el moment correcte. Tot això ens ha de dur a aconseguir millorar d’una manera significativa i canviar radicalment la medicina en el segle xxi. El paradigma de la medicina personalitzada (vegeu la figura 1) va més allà del mer diagnòstic i tractament: inclou també la detecció primerenca mitjançant l’anàlisi de factors de risc, la prevenció i el monitoratge dirigit d’aquests factors, i continua després del tractament amb el monitoratge de la resposta. La medicina personalitzada és avui dia tema de debat des de molts punts de vista: polític, social, ètic i econòmic. Així ho testimonia l’important nombre d’informes generats des d’organitzacions científiques, com la Royal Society del Regne Unit (The Royal Society, 2005), consultories (Price Waterhouse Coopers, 2005) i organitzacions governamentals com el Departament de Salut dels EUA (vegeu Draft report of the secretary’s advisory committee on genetics, health, and society, 2007). El valor que pot tenir ara per a la salut d’un individu el coneixement de la seqüència completa del seu genoma és difícil d’estimar, però els fets esmentats subratllen simplement que és tècnicament possible fer-ho a un cost raonable. Encara que el genoma de Watson ha costat prop d’un milió de dòlars, es parla, com hem esmentat, de

Figura 1. El paradigma de la medicina personalitzada.

costos del voltant d’uns mil dòlars en un futur no gaire llunyà. En aquest article examinarem la influència que tenen i tindran els avenços en les biotecnologies aplicades al camp de la salut humana en el desenvolupament de terapèutiques noves. L’EFICÀCIA I SEGURETAT DELS FÀRMACS Els elements clau en l’acció d’un medicament són l’eficàcia i la seguretat. L’eficàcia és el valor terapèutic positiu que s’obté amb l’administració d’una dosi determinada d’un fàrmac a un pacient. La seguretat està determinada per l’absència d’efectes secundaris importants en aquesta dosi. Es busca que les dosis recomanades siguin fàcils d’usar tant per al metge com per al pacient. L’eficàcia d’un fàrmac depèn, d’una manera simplificada, de la seva farmacodinàmica: a) la diana terapèutica sobre la qual actua, b) la manera com hi interacciona i c) la seva farmacocinètica: 1) l’accés que té la substància activa del fàrmac per arribar a la seva diana i 2) el temps que la diana està exposada al fàrmac. La seguretat igualment depèn de a) la farmacocinètica i farmacodinàmica sobre la diana terapèutica sobre la qual s’intenta actuar (de l’acció fisiopatològica que aquesta dugui a terme) i b) l’acció sobre altres molècules que de manera no intencionada dugui

68 J. M. PALACIOS I S. MUSOLES

a terme, i l’impacte d’aquesta interacció en les accions fisiològiques que aquestes exerceixen. Per tant, el paradigma del fàrmac ideal seria: a) aquell que actués de manera exclusiva sobre una única diana, per evitar accions no buscades, b) que aquesta diana tingués un potent impacte en la causa de la malaltia o els seus símptomes i no tingués accions fisiològiques rellevants, per evitar efectes secundaris indissociables del mecanisme d’acció, c) que arribés amb facilitat al lloc d’acció un cop administrat (si pot ser per la via més fàcil, l’oral), d) que la unió a la seva diana fos forta i duradora, i e) que requerís poc temps i esforç a l’organisme per ser eliminat. Relació risc/benefici. Aquests aspectes d’eficàcia i seguretat es tradueixen en el que s’anomena relació risc-benefici en un pacient per a una medicina concreta. Aquesta relació risc-benefici és variable depenent del tipus de malaltia que s’està tractant, i de l’objectiu del fàrmac en qüestió: el risc acceptable és més gran a mesura que augmenta la gravetat o la capacitat d’amenaçar la vida d’aquesta malaltia, o la capacitat d’obtenir un benefici del fàrmac. És a dir, per a malalties amb menor risc de causar mort, el risc acceptable de produir efectes adversos greus és menor. Per a aquesta mateixa malaltia s’acceptaria un perfil d’efectes adversos pitjor en un producte que pogués guarir la malaltia que en un altre que només pogués guarir-ne els símptomes. Igual ocorre en fàrmacs d’acció preventiva, en els quals la seguretat ha de ser extrema. LLUMS I OMBRES DELS FÀRMACS ACTUALS La salut de la humanitat ha experimentat un progrés significatiu en les últimes dècades, com indica l’últim informe de l’Organització Mundial de la Salut sobre les

projeccions de mortalitat global i l’impacte de les malalties (Mathers i Loncar, 2006). En aquesta millora les medicines han tingut un paper important. Per exemple, es pot atribuir a l’ús de medicines un 40 % de l’augment de l’esperança de vida. En malalties concretes com la SIDA, el desenvolupament de tractaments permet que una malaltia que significava un risc de mort molt elevat s’hagi transformat en una infecció crònica controlable (vegeu PhRMA, 2006). Això no vol dir, ni de bon tros, que hagin deixat d’existir necessitats mèdiques sense satisfer. El fàrmac ideal no s’ha trobat, però sí que hi ha alguns fàrmacs que s’ha demostrat que s’acosten al compliment dels criteris abans mencionats i, no obstant això, davant un pacient individual, no funcionen o són mal tolerats. Per què? Des del punt de vista de la seguretat, se sap per la pràctica mèdica que hi ha individus que poden necessitar fins a deu vegades menys medicació que la que ha estat considerada adequada o estàndard i, per tant, aquests individus estan exposats a una sobredosificació i a l’aparició d’efectes secundaris no desitjats. Des del punt de vista de l’eficàcia, se sap que hi ha alguns pacients que poden necessitar fins a cinc vegades més medicació que l’aprovada com a dosi estàndard i que amb aquesta dosi estàndard no s’assoleixen els beneficis terapèutics esperats. Per què? A més, un aspecte important és que no tots els fàrmacs tenen un nivell de resposta semblant en la població general. El nivell més alt de resposta, un 80 %, es troba en els inhibidors de l’enzim ciclooxigenasa 2 (COX2) (antiinflamatoris no esteroïdals o AINE), i el més baix, d’un 25 %, en la quimioteràpia del càncer. La major part dels fàrmacs es troben en un rang del 50 al 75 %. Els tractaments més comuns per a la diabetis, depressió i asma són eficaços en un 60 % de pacients. De catorze classes importants

NOUS FÀRMACS. MEDICINA PERSONALITZADA 69

Taula 1. Resposta dels pacients als fàrmacs més importants en diferents àrees terapèutiques Àrea terapèutica

Eficàcia (%)

Alzheimer

Analgèsia (COX-2)

Asma

Arítmies cardíaques

Depressió (AINES)

Diabetis

Herpes

Incontinència

Migranya (aguda)

Migranya (profilaxi)

Oncologia

Osteoporosi

Artritis reumatoide

Esquizofrènia

Dades de Spears et al., 2001.

de fàrmacs, set mostren respostes de menys del 50 % (vegeu la taula 1). Molts fàrmacs presenten, a més, efectes no desitjats severs que s’estimen en més de tres milions de casos a l’any als EUA, dels quals 137.000 van acabar amb la mort del pacient (Spear et al., 2001). El que sabem és que hi ha grans variacions entre els individus en la manera com responen a aquestes dues variables. Un factor important és com metabolitzen els fàrmacs els diferents individus. Per exemple, un enzim de la família dels citocroms, el CYP2D6, metabolitza molts dels fàrmacs més utilitzats, incloent-hi antidepressius, antipsicòtics, antihipertensius i antiemètics. Amb el desenvolupament de metodologies per a l’aïllament, clonatge i seqüenciació de gens en la dècada dels setanta va ser possible identificar amb precisió les variants genètiques d’aquests enzims i descobrir l’enorme varietat de mutacions d’aquests

gens responsables de la variabilitat en la resposta terapèutica dels fàrmacs. Aquests estudis han permès posar de manifest que variants d’aquest gen, associats amb un metabolisme lent, estan presents en segments de població entre l’1 i el 10 %, segons l’origen ètnic. Aquest coneixement ha dut les agències reguladores a exigir la inclusió de poblacions amb una composició ètnica que representi la població del país, en el seu procés de revisió de fàrmacs (als EUA la FDA exigeix població caucàsica, però també un percentatge d’afroamericans, hispans, etc.,; i l’agència japonesa exigeix estudis especials en població asiàtica que confirmin els resultats generats en altres poblacions), i moltes companyies farmacèutiques han introduït criteris de selecció negativa de fàrmacs que rebutgen molècules que utilitzen com a via metabòlica principal un enzim amb un alt nivell de variació poblacional. EL DESENVOLUPAMENT PREGENÒMIC DE NOUS FÀRMACS El desenvolupament tradicional de fàrmacs implica l’establiment de l’eficàcia i seguretat d’una molècula que actua sobre un mecanisme concret, mitjançant l’estudi d’aquesta molècula en un gran nombre de pacients per determinar-ne la dosi adequada i el tipus de població al qual s’administrarà, d’una manera epidemiològica. El model predominant en els últims quaranta anys per al desenvolupament de fàrmacs presenta tres característiques: a) es basa en el mètode d’assaig prospectiu de poblacions, b) es busca que «serveixin» per a la major quantitat de pacients possible i c) es busca que la forma d’ús aprovada per les agències reguladores sigui única per a tota la població, un cop aprovada La seqüència clàssica del desenvolupament d’un nou fàrmac s’esquematitza a la figura 2 i consta tradicionalment de les

70 J. M. PALACIOS I S. MUSOLES

etapes següents: identificació de la diana terapèutica; identificació de caps de sèrie químics; optimització de la molècula candidata; estudis preclínics de seguretat i desenvolupament farmacèutic; estudis clínics dividits tradicionalment en tres fases: fase 1, fase 2 i fase 3; aprovació reguladora i inici de l’ús clínic. Durada dels estudis: la durada dels estudis ha de ser la que permet observar diferències clínicament rellevants fruit de la intervenció terapèutica duta a terme tant per a les variables d’eficàcia com per a les de seguretat. Això és aplicable tant als estudis preclínics de seguretat in vivo com als de toxicologia i, per descomptat, als assaigs clínics en humans. En humans, un criteri principal de valoració (clinical endpoint) es defineix com l’objectiu d’eficàcia o seguretat mínim que es pretén aconseguir en l’assaig (p. ex., reducció en la mortalitat per càncer en un any; o reducció d’un 20 % en la producció de sagnat gàstric per a un AINE), i que permetrà considerar el fàrmac com a producte potencial per ser aprovat. Grandària de la mostra: el nombre d’individus que s’han d’incloure en un estudi prospectiu controlat (grandària de la mostra) s’ha de calcular de manera que s’asseguri que serà capaç de discriminar estadísticament entre el comportament de les variables objectiu en el grup control i el grup d’estudi. Per als estudis preclínics i els de fase i en humans, la grandària de la mostra generalment s’acorda per consens (sense fer càlculs específics). Per als estudis en humans de fase ii i iii, aquests han de ser calculats, i obliguen a incloure un nombre molt impor-

tant de pacients per poder aconseguir els criteris principals de valoració clínica que permeten l’aprovació d’un fàrmac. LIMITACIONS DEL DESENVOLUPAMENT PREGENÒMIC DE FÀRMACS Aquesta manera de descobrir i desenvolupar fàrmacs ha permès generar informació molt robusta sobre aquests, incentivar la millora sobre els fàrmacs precedents i, en general, donar lloc a fàrmacs que han canviat el panorama sanitari de manera espectacular en els últims cinquanta anys. No obstant això, el grau d’innovació i de generació de nous fàrmacs ha sofert un important alentiment que causa preocupació en molts nivells (informe FDA Innovation or stagnation, 2004). La traducció o «translació» dels avenços en les ciències de la vida en resultats pràctics per a la salut no està tenint lloc a la velocitat que s’esperava. Algunes de les raons consisteixen en els mateixos tres principis en què es basa l’estratègia de desenvolupament (generalització poblacional) abans esmentats. Les diferències farmacodinàmiques i farmacocinètiques interespecífiques fan que el risc d’incompliment de les hipòtesis d’eficàcia i seguretat en passar d’animals a humans sigui molt alta, com es posa de manifest en les taxes de fracàs (attrition) mitjanes de la indústria, que són del voltant de nou de cada deu compostos que inicien el desenvolupament clínic (Kola i Landis, 2004).

Figura 2. Etapes del descobriment i desenvolupament «clàssic» d’un fàrmac.

NOUS FÀRMACS. MEDICINA PERSONALITZADA 71

En moltes ocasions, sobretot per a malalties cròniques i per avaluar certs perfils d’efectes adversos, la durada dels assaigs clínics per assolir els criteris principals de valoració ha de ser molt llarga: seguiments de fins a tres anys no són inusuals, amb el consegüent impacte en el cost i risc del desenvolupament actual de fàrmacs (i el seu consegüent impacte en les decisions de negoci de la indústria farmacèutica, que ha d’assegurar el retorn de la inversió). A pesar d’aquests intents d’aportar evidència que els fàrmacs són segurs abans de la seva sortida al mercat, això no s’aconsegueix sempre, i són coneguts els casos que han motivat retirades de productes del mercat (l’exemple recent de Vioxx de MSD) amb els consegüents efectes socioeconòmics que això genera (Giacomini et al., 2007). El càlcul de la grandària de la mostra per a un assaig clínic (fase ii-iii) es basa en l’efecte esperat i en la variabilitat de la resposta estimada, en funció d’informació prèvia amb el producte o amb altres de semblants. Atesa la variabilitat descrita en els apartats anteriors, és fàcil entendre per què es necessiten grandàries mostrals tan grans en assaigs clínics, amb el consegüent impacte en temps i cost en el desenvolupament. IMPACTE DE LA BIOTECNOLOGIA EN EL DESENVOLUPAMENT DE NOUS FÀRMACS I EL SEU ÚS: FARMACOGENÈTICA I FARMACOGENÒMICA La farmacogenètica s’ocupa de la influència de les diferències genètiques individuals en la resposta d’un pacient als fàrmacs i s’ha concentrat tradicionalment en aspectes relacionats amb el seu metabolisme. La farmacogenòmica, que sorgeix dels avenços més recents en el coneixement del genoma humà, estudia el paper de tot el genoma en tots els aspectes de la salut i de l’acció dels

fàrmacs: diagnòstic, identificació de dianes terapèutiques, biomarcadors, etc., implicats en l’acció i en el desenvolupament dels fàrmacs (Meyer, 2004; Hopkins et al., 2006). L’estudi de la influència de les diferències genètiques entre diferents grups de pacients, la farmacogenètica, va néixer als anys cinquanta del segle passat com a conseqüència d’una sèrie d’observacions independents: a) el desenvolupament d’anèmia severa en afroamericans que havien rebut l’antimalàric primaquina lligat a una deficiència de l’enzim glucosa-6-fosfat-deshidrogenasa, b) la identificació de metabolitzadors ràpids i lents de l’antituberculós isoniazida i c) l’acció prolongada de l’anestèsic succinilcolina en alguns pacients era causat per defectes en l’activitat d’enzims que eren heretats. Això va dur a l’establiment de les bases conceptuals de la farmacogenètica. Aquest terme el va utilitzar per primera vegada l’any 1959 el genètic alemany Vogel. En les dues dècades posteriors es van descobrir molts altres exemples de respostes inesperades a fàrmacs relacionades amb defectes enzimàtics hereditaris. En particular, els estudis amb l’antihipertensiu debrisiquina i l’antiarítmic esparteïna van dur a la identificació del paper del citocrom P450 monooxigenasa, posteriorment denominat CYP2D6, com un dels enzims del metabolisme de fàrmacs més importants implicat en el metabolisme de molts fàrmacs, tals com els antidepressius o els analgèsics opiacis (Meyer, 2004). És important tenir en compte que molts factors afecten la resposta als fàrmacs. En primer lloc, les variacions genètiques poden ser heretables (germinals), o somàtiques (no heretables). Les variacions somàtiques es produeixen al llarg de la vida de l’individu com a resultat de factors mediambientals o del comportament i són particularment significatives i identificables en tumors o altres teixits. A més, encara que òbviament l’herència i l’estructura genòmica són molt importants per entendre la resposta d’una

72 J. M. PALACIOS I S. MUSOLES

persona a un fàrmac, hi ha una altra sèrie d’elements que són també rellevants i que no estan determinats pel genoma, particularment l’entorn, l’edat, l’historial mèdic (les malalties que s’han sofert anteriorment), l’estil de vida, els costums, fer o no exercici, o fins i tot efectes que s’hagin pogut sofrir en l’úter. La forma més senzilla i abundant de variació entre individus a escala del DNA són els anomenats polimorfismes d’un únic nucleòtid (single nucleotide polymorphism, SNP). Cada individu té un gran nombre de SNP, que donen lloc a un perfil genètic únic que

el diferencia de la resta de la seva espècie. D’aquí la variabilitat en la resposta als fàrmacs, entre altres coses. A més, els SNP són el tipus de variació genètica més accessible amb les noves tecnologies. En els últims deu anys s’ha generat una gran quantitat d’informació sobre els SNP en el genoma humà (vegeu The Royal Society, 2005, i les referències d’aquest treball). Alteracions en una única base en la regió que codifica la proteïna o en regions de control de l’activitat del gen poden donar com a resultat modificacions importants en el producte del gen.

Figura 3. Efecte sobre l’eficàcia i la seguretat d’un fàrmac de dos polimorfismes genètics, un al lloc d’acció i un altre en un enzim del seu metabolisme (Evans i McLeod, 2003; Evans i Relling, 1999).

NOUS FÀRMACS. MEDICINA PERSONALITZADA 73

Per entendre la importància que tenen aquestes mutacions puntuals en els gens que codifiquen tant els llocs d’acció com els de metabolisme de fàrmacs, veurem un exemple teòric senzill. Imaginem una persona que expressa dues variants: una en el lloc d’acció, i una altra en l’enzim del metabolisme. Això es pot traduir en variacions en la manera com respon la persona al fàrmac quan li és administrat i, al seu torn, estan combinades amb variacions en la manera com l’elimina, és a dir, en la quantitat present en el cos del pacient al qual s’ha administrat el fàrmac i, per tant, en l’exposició o la interacció entre el fàrmac i el seu lloc d’acció. Això s’il·lustra a la figura 3, (Evans i Relling, 1999; Evans i McLeod, 2003), que mostra clarament com dos polimorfismes genètics poden afectar d’una manera molt diferent la resposta a un fàrmac, i que es pot traduir fins en nou fenotips distints, nou formes diverses de resposta a un fàrmac. La relació eficàcia/toxicitat variarà àmpliament entre valors de 65:1 i 10 a 80. Aquest exemple teòric senzill mostra la dificultat de trobar la «dosi que serveix per a tots». Això té implicacions molt importants per al descobriment, el desenvolupament, l’autorització i l’ús de fàrmacs. En què poden ajudar les metodologies biotecnològiques al desenvolupament de fàrmacs? El desenvolupament de metodologies, les «òmiques» (genòmica, proteòmica, metabonòmica, etc.), que permeten una anàlisi molecular refinada dels diferents elements que componen el binomi eficàcia i seguretat d’un fàrmac en les darreres dècades, ha generat l’expectativa ―raonable des d’un punt de vista estrictament científic― que molts d’aquests elements són identificables i predictibles i que, per tant, podria pensar-se en una nova generació de fàrmacs més indivi-

dualitzats o personalitzats que tindrien en compte les característiques específiques del pacient. Les principals àrees en què les «òmiques» poden contribuir al desenvolupament de nous fàrmacs són: — Identificació de biomarcadors diagnòstics o pronòstics. La identificació de RNA i marcadors de proteïnes per al cribratge, diagnòstic, pronòstic i monitoratge de malalties requereixen l’accés a teixits afectats (d’aquí la importància dels biobancs i col·leccions de mostres biològiques de pacients). Aquestes mostres se sotmeten a estudis d’expressió gènica, per identificar mitjançant tècniques estadístiques adequades diferències poblacionals, i correlacionar-les amb diferències en el comportament/evolució de la malaltia. — Identificació i validació de dianes terapèutiques. Si el biomarcador és una molècula sobre la qual som capaços d’interaccionar i que pot produir un canvi en el curs de la malaltia, es considera una diana terapèutica. La validació d’aquesta diana és el procés pel qual s’utilitzen molècules (de síntesi química o biològica, com anticossos) i es prova que la modificació de la diana produeix un efecte in vivo. — Desenvolupament de mètodes diagnòstics per a biomarcadors. Si el biomarcador és una molècula sobre la qual no podem actuar, però marca un pronòstic, també serà interessant desenvolupar un mètode senzill i econòmic que permeti detectar-lo i seguir-lo en poblacions àmplies de pacients, per ser utilitzats, bé en la pràctica clínica, bé en assaigs clínics, com una prova de l’efecte que produïm amb una intervenció terapèutica. — Selecció de poblacions d’estudi. Disposar d’aquests mètodes diagnòstics de manera assequible, permetria, en el context del desenvolupament de fàrmacs, identificar aquells pacients que tenen un potencial més gran de beneficiar-se del tractament o,

74 J. M. PALACIOS I S. MUSOLES

al contrari, aquells en els quals la toxicitat és superior, i prendre decisions en conseqüència. La possibilitat de dur a terme selecció de pacients té tant conseqüències econòmiques (la reducció de la variabilitat permet treballar amb grandàries mostrals més petites) com ètiques (no s’han de sotmetre al risc dels efectes secundaris d’un fàrmac les que tenen possibilitats molt petites de beneficiar-se’n) i reguladores (com s’aprova un fàrmac per al seu ús i comercialització). — Nous criteris principals de valoració (end point) per a assaigs clínics. Si els biomarcadors poden detectar-se d’una manera primerenca, abans que es manifesti un canvi en la clínica i siguin mesurables amb un alt grau de fiabilitat, es converteixen en variables robustes per ser amidades en els assaigs clínics i, per tant, poden convertir-se en criteris principals de valoració clínics acceptats per les agències reguladores, amb el consegüent estalvi en nombre de pacients que es necessiten (grandària de la mostra), temps (durada de l’assaig) i disminució del risc, temps i cost d’un desenvolupament. Exemples de realitats Hi ha ja un nombre important d’exemples en la pràctica mèdica en què l’ús de marcadors moleculars s’utilitza de guia en la prescripció i dosificació de fàrmacs d’una manera individualitzada o personalitzada (Lesko, 2007). Un exemple n’és l’ús de la warfarina. La warfarina és un anticoagulant oral àmpliament utilitzat per impedir la formació de coàguls, que evita trombosis i prevé l’infart de miocardi o l’ictus. Tot i que és un fàrmac eficaç, hi ha diferències entre pacients de fins a trenta vegades en la dosi requerida de manteniment. La dosificació no adequada comporta un risc elevat d’hemorràgies. Mentre que fins ara l’ajustament de la dosi es portava a terme mitjançant prova i error

examinant la resposta a dosis creixents del fàrmac, el descobriment de polimorfismes en els gens de dues proteïnes implicades en el mecanisme d’acció i en el metabolisme de la warfarina ha permès una aproximació més racional i més ràpida en l’establiment de la dosi adequada d’aquest fàrmac. L’FDA ha aprovat recentment un algorisme de dosificació de la warfarina basat en l’establiment del polimorfisme del gen del citocrom CYP2C9, implicat en el metabolisme del fàrmac, i del gen del complex de l’epoxireductasa de la vitamina K, VKORC1, que és el lloc d’acció de la warfarina. Es pot establir si els pacients són metabolitzadors «pobres» basant-nos en el polimorfisme del CYP2C9, i es pot saber quina dosi és l’adequada fent servir la informació de la variant del VKORC1. Aquesta informació, conjuntament amb paràmetres com l’edat, el pes, el sexe i altres medicacions concomitants, permeten, mitjançant l’algorisme, determinar la dosi de manteniment adequada d’una manera molt ràpida. Un exemple similar d’establiment de dosi eficaç i segura és el de l’agent de quimioteràpia 6-mercaptopurina, que s’usa per al tractament de la leucèmia limfoblàstica aguda. Aquesta molècula és metabolizada predominantment per l’enzim tiopurinametiltransferasa (TPMT). Es coneixen mutacions del gen de la TPMT, que impliquen una disminució important en el metabolisme d’aquesta molècula i que, fins en un 10 % dels pacients, pot conduir a la mort per acumulació excessiva del fàrmac en les cèl·lules de la sang. La possibilitat d’establir el genotip per al gen del TPMT permet l’ús d’aquest fàrmac amb un alt nivell de seguretat. Un exemple de producte farmacèutic és l’herceptina (Trastuzumab), per al tractament de tumors cancerosos de mama que eren produïts per la sobreexpressió del gen HER2. Es va descobrir que una subpoblació de pacients amb càncer de mama (aproxima-

NOUS FÀRMACS. MEDICINA PERSONALITZADA 75

dament el 20 %) sobreexpressaven l’HER2, un protooncogen (17q11.2-q12) membre de la família dels receptors del factor de creixement epidèrmic (EGFR), i aquesta sobreexpressió es correlacionava amb un pitjor pronòstic: una resposta pitjor al tractament habitual, un índex més gran de recidives i de metastatització (validació del biomarcador). Aquesta informació va donar lloc al desenvolupament d’un mètode diagnòstic senzill que permet seleccionar els pacients de càncer de mama en funció del pronòstic. A més, en tractar-se d’un receptor de membrana en la ruta de senyalització de càncer, es va considerar com a potencial diana terapèutica, i això finalment va donar lloc a la generació de productes que hi actuaven directament. L’herceptina és un anticòs monoclonal anti-HER2/NEU, que ha canviat radicalment el panorama pronòstic en aquesta subpoblació de pacients de càncer de mama. Recentment, la FDA (FDA, 2007) ha apro-

vat el que podria ser el segon fàrmac amb unes característiques d’aquest tipus. És un nou tractament per a la infecció del VIH-1, el maraviroc (Celsentri, de Pfizer), que seria indicat exclusivament per a pacients que estiguin infectats per un virus determinat que contingui a més el receptor de la quimiocina 5 (CCR5) en cèl·lules CD4. Això significa l’establiment d’un mètode diagnòstic que permeti determinar que el pacient està infectat amb una soca del VIH-1 que interacciona amb el CCR5. PERSPECTIVES DE FUTUR: EL DESENVOLUPAMENT DE FÀRMACS EN L’ERA DE LA GENÒMICA El desenvolupament de fàrmacs dirigits a pacients caracteritzats molecularment des del punt de vista de l’eficàcia (la diana terapèutica) i de la seguretat (especialment, metabolisme) requereix un canvi significa-

Figura 4. Etapes en el descobriment i desenvolupament de fàrmacs amb eines farmacogenètiques.

76 J. M. PALACIOS I S. MUSOLES

tiu en la manera com es descobreix, es desenvolupa, s’aprova i s’usa un fàrmac nou. Un esquema possible del descobriment i desenvolupament de fàrmacs, en un escenari d’ús extensiu de les eines farmacogenètiques, es presenta a la figura 4. El procés s’inicia amb un coneixement de la genètica de la malaltia que permet la selecció de dianes terapèutiques basades en la genètica humana subjacent a l’etiologia de la malaltia. Un cop seleccionada la diana, l’estudi de les variants més habituals de la diana permet predir quina influència tindran en l’eficàcia de la molècula seleccionada per al desenvolupament. Aquestes informacions, conjuntament amb el desenvolupament de biomarcadors, ajuden en les proves clíniques de concepte, és a dir, assaigs clínics amb un nombre reduït de pacients que mostrin si el mecanisme seleccionat té l’eficàcia terapèutica esperada i permetin la selecció o estratificació de pacients en els quals es pot esperar una resposta clínica. Finalment, el genotipatge de pacients hauria de proporcionar informació predictiva tant de l’eficàcia com d’efectes adversos. Un aspecte important és la introducció d’un nou concepte regulador: l’aprovació condicionada d’un fàrmac, és a dir, l’autorització de la venda i ús clínic d’un fàrmac, però condicionada a la recol·lecció de dades clíniques en una població extensa de pacients (es parla de dos-cents mil) que en permeti finalment l’ús més generalitzat (Roses, 2007). Aquest raonament, en aparença senzill, està farcit, com és habitual, d’una sèrie de complicacions, no solament tècniques, sinó també econòmiques i polítiques i, més específicament, de regulació. Aquestes últimes es refereixen essencialment al cost de desenvolupament i ús d’aquests nous fàrmacs i sobre quin tipus d’informació biològica, farmacèutica i clínica ha de ser autoritzat el seu ús en terapèutica. Com ja hem comentat, l’ús de dades ge-

nètiques en el descobriment i desenvolupament de nous fàrmacs és cada vegada més important però encara molt limitat, i això és així per tot un seguit de factors, molts derivats de l’absència d’experiència per part de la indústria i de les autoritats reguladores en l’ús d’aquests nous instruments, i també de criteris de qualitat ben establerts per a la generació de dades amb nous instruments com els microxips de DNA o els biomarcadors diagnòstics. SITUACIÓ A CATALUNYA Pel que fa a la situació de la medicina personalitzada i del desenvolupament de la farmacogenètica i les seves tecnologies a Catalunya, es poden fer les observacions següents. En primer lloc cal subratllar dos factors competitius: les dimensions de la població, uns set milions d’habitants, i la presència d’un sistema de salut pública avançat i que cobreix enterament la població representen un avantatge pel que fa a la possibilitat de generar informació de tipus epidemiològic o genètic amb valor diagnòstic i de tractament. Altres països europeus de grandària similar o més petita com Suècia, Islàndia o Estònia estan portant a terme projectes en aquesta direcció, incloent-hi el desenvolupament de biobancs i experiències d’utilització de dades genètiques amb objectius de desenvolupament de fàrmacs (DeCode a Islàndia) molt interessants. Des del punt de vista de la recerca bàsica i clínica, Catalunya presenta novament un nivell de productivitat competitiu internacionalment. En particular, els hospitals investigadors més importants (Clínic, Bellvitge, Vall d’Hebron, Can Ruti, Sant Pau) presenten nivells de productivitat científica d’excel· lència. Un nombre important d’aquestes investigacions entrarien dins del marc de les tecnologies de la farmacogenètica. Particularment en l’àrea de la investigació on-

NOUS FÀRMACS. MEDICINA PERSONALITZADA 77

cològica, on hi ha una iniciativa de la Generalitat de Catalunya de creació d’un institut de medicina personalitzada, és on potser aquest camp està més avançat. Pel que fa a la indústria, han sorgit a Catalunya una sèrie de companyies biotecnològiques que aposten clarament per la nova medicina, particularment des del desenvolupament de diagnòstics genètics i moleculars. A Catalunya es localitza un dels tres centres de genotipatge de l’Estat espanyol (López et al., 2005). Per tant, sembla que les bases per a una participació del país en el desenvolupament de la farmacogenètica estan establertes. CONCLUSIONS En resum, l’aplicació de la farmacogenòmica a la salut pública podria marcar el curs de la medicina en el segle xxi. Les promeses de la farmacogenòmica, no obstant això, semblen, en opinió d’alguns, encara llunyanes. Els reptes perquè les seves promeses es compleixin són molt importants i abasten molts aspectes no solament científics, sinó també socials i econòmics. En les societats més avançades aquests aspectes estan sent objecte d’estudis i debats molt amplis. L’esborrany de l’informe del secretari del Comitè Assessor en Genètica, Salut i Societat (del Departament de Salut dels EUA), publicat recentment, és un excel·lent resum d’alguns d’aquests reptes i conté recomanacions de valor general. Aquest informe assenyala com a consideracions clau les següents: a) adaptació del desenvolupament de fàrmacs i de la investigació clínica per permetre l’avaluació dels nous instruments farmacogenòmics en les diferents etapes de la descoberta, desenvolupament i ús de medicaments, b) regulació dels productes farmacogenòmics per assegurar la seguretat dels pacients i afavorir-ne el desenvolupament, c) garantir l’accés a aquests

instruments mitjançant el seu reemborsament o gratuïtat en els diferents sistemes de salut públics o privats, d) creació d’una infraestructura de gestió de la informació sobre la salut que permeti manejar la gran quantitat de dades interrelacionades que permetin donar suport a les decisions de diagnòstic, tractament i seguiment basades en dades farmacogenòmiques, e) educació i ensinistrament de metges i altres professionals clínics, amb la creació d’eines de suport, per a l’ús de les noves tecnologies i f) els aspectes ètics, legals i socials generats per l’enorme increment d’informació genètica i genòmica d’individus i subgrups de la població. El repte, com hem descrit en aquest article, és, malgrat tot, formidable, i té un horitzó temporal molt llarg. Es fa necessària una acció política de coordinació i aportació de recursos. La lectura d’alguns dels documents generats en altres països pot ajudar en l’elaboració de plans estructurats perquè les promeses de la medicina personalitzada i de la farmacogenòmica es puguin fer realitat a Catalunya sense demora respecte als països de l’entorn, i també perquè serveixin de base per a la generació de nova riquesa basada en el coneixement i la innovació. BIBLIOGRAFIA Approves novel antiretroviral drug [en línia]. Food and Drug Administration USA. <http://www.fda.gov/ bbs/topics/news/2007/NEW01677.html> Collins, F. S.; Green, E. D.; Guttmacher, A. E.; Guyer, M. S. (2003). «A vision for the future of genomics research». Nature, 422: 835-847. Check, E. (2007). «Celebrity genomes alarm researchers». Nature, 447: 358-359. Evans, W. E.; McLeod, H. L. (2003). «Pharmacogenomics: drug disposition, drug targets, and side effects». The New England Journal of Medicine, 348: 538-547. Evans, W. E.; Relling, M. V. (1999). «Pharmacogenomics: translating functional genomics into rational therapeutics». Science, 286: 487-491.

78 J. M. PALACIOS I S. MUSOLES

Giacomini, K. M. [et al.] (2007). «When good drugs go bad». Nature, 446: 975-977. Hopkins, M. M.; Ibarreta, D.; Gaisser, S.; Enzing, C. M.; Ryan, J.; Martin, P. A.; Lewis, G.; Detmar, S.; Akker-van Marle, M. E. van den; Hedgecoe, A. M.; Nightingale, P.; Dreiling, M.; Harting, K. J.; Vullings, W.; Forde, T. (2006). «Putting pharmacogenetics into practice». Nature Biotechnology, 24: 403-410. Innovation or stagnation [en línia]. Food and Drug Administration USA. <http://www.fda.gov/oc/initiatives/criticalpath/whitepaper.html> Kola, I.; Landis, J. (2004). «Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates?» Nature Reviews, 3: 711-715. Lander, E. S. [et al.] (2001). «Initial sequencing and analysis of the human genome». Nature, 409: 860921. Lesko, L. J. (2007). «Personalized medicine: elusive dream or imminent reality?» Clinical Pharmacology & Therapeutics, 81: 807-816. López, M.; Mallorquín, P.; Vega, M. (2005). «Genotipado en la salud humana» [en línia]. Genoma España. <http://www.gen-es.org/> Mathers, C. D.; Loncar, D. (2006). «Projections of global mortality and burden of disease from 2002 to 2030.» PLoS Medicine, 3: 2011-2030.

Meyer, U. A. (2004). «Pharmacogenetics: five decades of therapeutic lessons from genetic diversity». Nature, 5: 669-676. Personalised medicines: hopes and realities [en línia]. The Royal Society. <http://www.royalsoc.ac.uk/document.asp?id=3780> Personalized medicine: the emerging pharmacogenomics revolution [en línia]. PriceWaterhouseCoopers. <http:// w w w.pwc.com/ext web/pwc publicat ions.nsf/ docid/9FAD83BE2EAC935A852573290070CB22> Realizing the promise of pharmacogenomics [en línia]. Department of Health & Human Services USA. <http://www4.od.nih.gov/oba/sacghs/SACGHS_ PGx_PCdraft.pdf> Roses, A. (2007). «Personalized medicine: elusive dream or imminent reality?: a commentary». Clinical Pharmacology & Therapeutics, 81: 801-804. Spear, B. B.; Heath-Chiozzi, M.; Huff, J. (2001). «Clinical application of pharmacogenetics». Trends Mol. Med., 7: 201-204. Value of medicine [en línia]. PhRMA. <http://www.phrma.org/files/value%of%Medicine%,202006.pdf> Venter, J. C. [et al.] (2001). «The sequence of the human genome». Science, 291: 1304-1351. Watson, J. D.; Crick, F. H. (1953). «Molecular structure of nucleic acids; a structure for deoxyribose nucleic acid». Nature, 171: 737-738.

DOI: 10.2436/20.1501.02.46

Les biotecnologies (Pere Puigdomènech i Francesc Gòdia, ed.) Treballs de la SCB. Vol. 58 (2007) 79-86

LA BIOTECNOLOGIA VEGETAL Pere Puigdomènech Centre de Recerca en Agrigenòmica, CSIC-IRTA-UAB. Adreça per a la correspondència: Pere Puigdomènech. Centre de Recerca en Agrigenòmica, CID-CSIC. Jordi Girona, 18. 08034 Barcelona. Adreça electrònica: pprgmp@ibmb.csic.es. RESUM La biotecnologia vegetal en sentit estricte és una de les més antigues i utilitzades en temps històrics i en el temps actual. És una paradoxa que sigui una de les que s’enfronten a una pitjor percepció social. Les plantes que cultivem són el resultat d’una intensa pressió selectiva per part de les societats humanes. Actualment utilitzem eines biotecnològiques com els cultius in vitro per propagar d’una manera clonal varietats de propietats interessants en diferents espècies. Utilitzem els marcadors moleculars com a eina de suport de la millora i han estat desenvolupades les varietats modificades genèticament, que estan sent utilitzades de manera creixent en el món en un nombre reduït d’espècies. Els reptes de l’agricultura en les properes dècades ens indiquen que haurem de fer servir qualsevol possibilitat que tinguem a la nostra mà per mantenir un nivell acceptable en la producció d’aliments de la manera menys agressiva possible amb el medi ambient. Paraules clau: genòmica, plantes modificades genèticament, millora genètica. PLANT BIOTECHNOLOGY SUMMARY Plant biotechnology sensu stricto is one of the oldest and most used biotechnologies in history and at present. It is a paradox that is one that has to face one of the worst public perceptions. The plants that we use are the results of a strong selection pressure from human societies. At present we use biotechnological tools such as in vitro cultures to propagate in a clonal way varieties that have interesting properties of different species. We use molecular markers as an auxiliary tool for breeding and genetically modified varieties have been developed that are increasingly being used in a limited number of species. The challenges of agriculture in the next decades show that we will have to use any possibility that we

80 P. PUIGDOMÈNECH

may have to maintain an acceptable level of food production in the less aggressive form towards our environment. Key words: genomics, genetically modified plants, genetic improvement. INTRODUCCIÓ HISTÒRICA Si prenem la definició clàssica de biotecnologia en sentit estricte (l’ús d’organismes biològics o parts d’aquests per a la producció de béns o serveis) la biotecnologia vegetal és una de les biotecnologies més antigues i una de les més utilitzades en el curs de la història, sobretot durant el segle xx. Per a molts és una de les més prometedores i potser la més necessària de totes, perquè la nostra alimentació en depèn de manera directa. Malgrat això, és potser la més discutida de totes les biotecnologies. La biotecnologia d’aplicació mèdica no té problemes d’acceptació social, mentre que la vegetal, si prenem com a exemple els organismes modificats genèticament, es troba amb una gran oposició. Aquest article tractarà de reflexionar sobre aquesta paradoxa. La societat neolítica es va basar en el desenvolupament de l’agricultura i la ramaderia. Això vol dir que grups d’humans en diferents parts del món, en un procés simultani que està en la base de la civilització humana, van identificar un petit nombre d’espècies vegetals i animals sobre les quals basarien la seva economia. Un inventari aproximat de les plantes de les quals tenim notícia que han estat utilitzades per les societats humanes en algun moment conté unes quatre mil espècies (Sanchez-Monge, 1991). El procés de domesticació va portar a escollir un petit nombre (menys d’un centenar) d’espècies i, en aquestes, aquelles varietats que tenien les propietats adequades per ser cultivades. El fet és que la base genètica sobre la qual està construïda la nostra societat és molt feble, però ha estat eficaç durant tot aquest temps. De fet, ens ha permès arribar a uns nivells de producció que

fan que trobar aliments hagi deixat de ser un problema per a una gran part dels humans, malgrat l’existència de bosses de fam o desnutrició que no acabem d’eliminar. Les eines moleculars que hem desenvolupat des la dècada dels anys setanta ens permeten de comprendre en termes precisos quines van ser les propietats determinants a l’hora de convertir una espècie en un conreu. Per exemple, ha estat identificat el gen que controla el procés d’escissió dels grans en la planta d’arròs madura (Li et al., 2006). Aquest és un dels caràcters més importants a l’hora de permetre un conreu útil per al pagès. Efectivament, a la planta li interessa que la llavor, un cop madura, caigui per poder germinar la temporada següent, però a l’agricultor li interessa que quedi en la planta fins que arribi a la maduresa i la pugui collir. Que en una planta el control genètic d’aquest tipus de caràcters importants per a l’agricultura sigui senzill n’ha afavorit la domesticació. La comprensió del fenomen de la domesticació de les espècies vegetals i animals que són a la base de la nostra alimentació ens està permetent dissenyar noves estratègies per a la millora de les plantes, i en particular ens permet tractar de fer servir les noves eines ofertes per la genòmica per millorar espècies que tenen propietats interessants però que no eren accessibles fins al moment a causa de la complexitat de la seva genètica. LA BIOTECNOLOGIA VEGETAL MODERNA Abans del desenvolupament de les tècniques del DNA recombinant al començament de la dècada dels setanta, podem mencio-

LA BIOTECNOLOGIA VEGETAL 81

nar dos desenvolupaments importants que es van produir en diferents moments i que marquen els inicis de la biotecnologia vegetal. Es tracta dels cultius vegetals in vitro i els inicis dels marcadors genètics de base molecular, en particular els marcadors enzimàtics. En aquest mateix volum dediquem un capítol específic als marcadors moleculars. Els cultius in vitro parteixen de l’experiència comuna dels qui treballen amb els sistemes vegetals i sovint poden reproduir un individu vegetal plantant una part de la planta adulta. En termes tècnics podem dir que la població de cèl·lules totipotents, o cèl·lules mare totipotents (cèl·lules que poden donar lloc a una planta sencera en les condicions adequades), és molt abundant en plantes, molt més que en animals. Per tant, si volem tenir plantes iguals que alguna que té unes propietats especialment interessants, una de les maneres és produir-les per esqueixos. Els cultius in vitro porten aquesta idea al seu extrem. D’una planta podem cultivar de manera continuada en uns medis determinats cèl·lules en un estat indiferenciat, de les quals, quan ens interessa, podem regenerar plantes senceres i obtenir aquelles que ens interessen. En teoria podríem tenir d’aquesta manera una font inacabable de plantes idèntiques o, si volem, un clon, terme que avui ha passat al llenguatge comú. Això és el que es va anar fent de manera progressiva en moltes espècies. Es van anar establint protocols perquè en diferents espècies es poguessin establir cultius en medis artificials que permetessin mantenir teixits que anaven creixent per llarg temps, dels quals es podia extreure una part que, en les condicions adequades, podia regenerar plantes que són genèticament idèntiques entre si. Aquesta tècnica s’usa rutinàriament per obtenir plantes, per exemple en el cas de plantes forestals o ornamentals. Són també la base de l’obtenció de plantes modificades genèticament.

De totes maneres, es pot considerar que la biotecnologia moderna culmina quan vam començar a saber estudiar i modificar el DNA. Això ho podem datar al voltant de l’any 1970. En aquest període es va demostrar que era possible fragmentar i unir segments específics de DNA i transferir-los a bacteris per amplificar-los a voluntat. Això permet de conèixer-ne l’estructura i aconseguir els seus productes en quantitat, fet que permet de fer-los servir en medicina. No tan sols s’obrien possibilitats insospitades per a la recerca en biologia, sinó també possibilitats industrials que han donat lloc a noves possibilitats de negoci i a algunes empreses que han esdevingut actors importants en el camp farmacèutic, però també en el del diagnòstic i en el de les llavors. En biologia vegetal, ben aviat es van començar a aïllar gens d’importància en diferents espècies i a utilitzar les noves metodologies per estudiar qüestions de la fisiologia de les plantes, del seu desenvolupament, de la taxonomia i de la manera com es defensen de l’atac dels patògens, i això ha obligat a tornar a escriure els llibres de text bàsics de la biologia vegetal. Una eina decisiva en aquesta direcció va aparèixer quan es va publicar la possibilitat de modificar genèticament les plantes mitjançant mètodes moleculars. LES PLANTES MODIFICADES GENÈTICAMENT En plantes aquests avenços van culminar l’any 1983, amb la publicació dels primers exemples de plantes transgèniques. Dos treballs publicats de manera pràcticament simultània per grups europeus i americans (Herrera-Estrella et al., 1983; Barton et al., 1983) van demostrar que era possible introduir en plantes de tabac gens construïts en el laboratori a partir de fragments de procedència diferent i que en les plantes regenerades el seu genoma havia adquirit la nova

82 P. PUIGDOMÈNECH

propietat que havia estat prevista. Les dues primeres publicacions van fer servir la mateixa aproximació. Es tractava de construccions gèniques amb un promotor potent i un gen de resistència a un antibiòtic que permetia seleccionar fàcilment les plantes transformades i confirmar la presència d’un nou gen funcional en la planta transformada. La planta escollida era també el tabac, espècie en què la regeneració és coneguda per ser especialment eficaç. El mètode de transformació era també similar. Estava basat en les propietats dels bacteris del gènere Agrobacterium, sobretot Agrobacterium tumefaciens, els quals tenen la propietat d’infectar plantes i de produir en aquestes uns creixements indiferenciats de cèl·lules que produeixen substàncies de les quals s’alimenten els bacteris. Aquest procés es fa fent servir uns vectors plasmídics que tenen aquests bacteris, en els quals hi ha un fragment de DNA (el DNA T) que es transmet a la planta. De fet, és un mecanisme natural de transformació de plantes. Aquest mecanisme va ser l’utilitzat per introduir gens en les cèl·lules de tabac. Després s’han fet servir altres mètodes com la microinjecció, la transformació de protoplasts i el canó de gens. Aquest darrer ha estat el principal competidor d’Agrobacterium. Consisteix en un sistema (Klein et al., 1987) que permet introduir el DNA que es vol transformar vehiculat per petites partícules sobre les quals es precipita el DNA. Aquestes partícules es llencen a gran velocitat sobre cultius cel· lulars i deixen anar el DNA al seu pas per les cèl·lules. El sistema és senzill i ha permès de transformar espècies com els cereals, en què no semblava possible fer servir Agrobacterium. De totes maneres, el sistema d’Agrobacterium permet fer transformacions més controlades i ha acabat imposant-se en el casos en què es tractava de tenir una planta per a un ús agrícola. La demostració que era possible fer que les plantes adquirissin nous caràcters ge-

nètics fent servir les tècniques moleculars va produir una gran expectació arreu del món. Era una nova manera d’introduir en les plantes caràcters que no eren accessibles mitjançant les aproximacions de la genètica clàssica. En aquesta, si volem obtenir en una espècie una varietat que contingui un caràcter determinat hem de buscar entre les poblacions existents de l’espècie si existeix aquest caràcter i introduir-lo mitjançant encreuaments amb la varietat d’interès. Amb les noves tècniques esdevenia possible buscar aquest caràcter en qualsevol espècie, aïllar el fragment de DNA que el codifica, modificar-lo si és necessari perquè la planta el reconegui com a propi i obtenir la varietat amb el nou caràcter. El procediment semblava més ràpid, senzill, net i barat que la genètica clàssica. La realitat ha esdevingut molt diferent. La modificació genètica de les plantes ha esdevingut sens dubte una eina de poder extraordinari per a la biologia vegetal. Ha fet possible l’estudi de la funció d’una gran quantitat de gens de les plantes. Ha representat una revolució en molts aspectes de l’agricultura, i ha estat en l’origen d’un gran negoci i d’un gran conflicte que ha tingut conseqüències molt significatives en el món de les llavors arreu. L’any 2006 la superfície plantada amb plantes transgèniques al món sobrepassava probablement els cent milions d’hectàrees, especialment de blat de moro, cotó, soja i colza (Brooks i Barfoot, 2006). De fet, s’ha convertit probablement en la tecnologia que més ràpidament ha estat adoptada en tota la història de l’agricultura. Això ha representat per a un petit grup d’empreses l’oportunitat d’obtenir grans beneficis. L’adopció d’aquestes llavors per part dels pagesos, evidentment, respon al benefici que treuen en termes de reducció de pèrdues per l’atac d’insectes o en termes de facilitat en el conreu en el cas de les varietats tolerants a herbicides. El fet és que un nombre creixent d’agricultors de diferents paï-

LA BIOTECNOLOGIA VEGETAL 83

sos han utilitzat aquestes varietats. Des del començament de la introducció de les varietats modificades genèticament, ja es van dictar reglaments i directives que posaven en marxa un sistema regulador que tractava que no arribés al mercat cap planta que tingués efectes negatius sobre la salut i el medi ambient diferents dels de les varietats explotades fins al moment. Això es va fer primer als EUA, després a Europa i al Japó i progressivament a la majoria dels països del món en un procés que s’està completant actualment en els països menys desenvolupats. Aquestes regulacions van posar una barrera de cost important a la comercialització de varietats transgèniques, però malgrat tot no van impedir que es produís una reacció en contra en molts països, sobretot a Europa. El fet és que el conflicte ha anat perpetuant-se i els seus efectes han produït, sobretot a Europa, una situació contradictòria i difícil de gestionar. Actualment sembla tan difícil que aquells que estan utilitzant amb èxit aquesta tecnologia deixin d’aplicar-la com que aquesta pugui aplicar-se a moltes més espècies, per un simple problema de cost. Com en tantes altres qüestions, les decisions que es prenguin als països asiàtics, i especialment a la Xina respecte a l’ús d’aquesta tecnologia, per exemple en l’arròs, podrà acabar de ser decisiva sobre el seu futur. LA GENÒMICA APLICADA A LES PLANTES L’arribada de les aproximacions massives a la biologia està obrint unes perspectives completament noves en el nostre coneixement de les bases moleculars del funcionament dels organismes biològics. En les plantes aquest coneixement és particularment important. Quan les tècniques del DNA recombinant van ser desenvolupades al començament dels anys setanta es va tar-

dar poc perquè s’aïllessin els primers gens de plantes. El mateix ha passat amb la seqüenciació dels genomes. El primer genoma relativament complex a ser seqüenciat va ser el del llevat, en un treball fet per un consorci públic europeu (Goffeau et al., 1996). Ben aviat es va veure que si es volia portar aquest treball a un nivell de complexitat superior es podria pensar en els genomes relativament petits d’algunes plantes. L’exemple escollit de manera natural va ser el d’Arabidopsis thaliana. Aquesta espècie ja havia estat adoptada feia temps per grups que buscaven un sistema senzill per aplicarhi les aproximacions de la genètica molecular, de la mateixa manera que durant anys Drosophila melanogaster havia estat el sistema d’elecció per als estudis genètics en animals. Arabidopsis és una planta petita, amb un cicle vital ràpid, que es pot transformar fàcilment i que a més té un genoma entre els més petits coneguts en plantes. L’any 1992 es va formar un consorci europeu que es va federar amb grups americans i japonesos per seqüenciar el genoma d’Arabidopsis. Es pensava en uns terminis de quinze anys, que la realitat de l’acceleració de les tecnologies de seqüenciació van escurçar fins al punt que l’any 1998 ja se’n publicava un fragment del genoma (Bevan et al., 1998) i aquest es completava dos anys després (Arabidopsis Genomic Initiative, 2000). La seqüenciació del genoma d’Arabidopsis ha donat lloc a una allau de possibilitats i resultats que han donat una nova visió a la genètica molecular de les plantes. Entre les sorpreses que han aparegut de la seva anàlisi hi ha el nombre de gens, que actualment es troba al voltant dels 26.000, una xifra molt propera a la del genoma humà, o també que una gran proporció del genoma d’aquesta planta, malgrat la seva petita grandària, està duplicat. En qualsevol cas, el genoma ha estat anotat amb una bona precisió i ha esdevingut una eina important de recerca per a la genòmica de plantes. Al

84 P. PUIGDOMÈNECH

mateix temps han anat desenvolupant-se altres eines, com per exemple col·leccions de mutants produïts sobre pràcticament qualsevol gen de la planta, que estan permetent analitzar la funció dels gens de plantes amb gran detall. Després del genoma d’Arabidopsis han estat encetats altres projectes per seqüenciar genomes de plantes. El següent va ser el de l’arròs. En aquest cas va començar el projecte un consorci internacional liderat pel Japó, però amb participació de diversos països asiàtics, europeus i els EUA. Poc després de començar el projecte dues empreses de llavors (Monsanto i Syngenta) van emprendre el mateix treball. En aquell moment les possibilitats de generar prou propietat intel·lectual a partir de les dades de gens de cereals semblava compensar el cost d’aquests projectes. Ben aviat la problemàtica entorn de les plantes modificades genèticament va fer baixar les expectatives de les empreses i finalment els tres projectes es van fusionar. Mentrestant el Govern de la Xina va subvencionar un projecte propi que en sis mesos va produir un primer esborrany (Yu et al., 2002). El consorci internacional ha acabat produint la millor seqüència d’aquesta espècie (International Rice Genome Project, 2005). Després s’ha acabat el projecte del pollancre (Tuskan et al., 2006) i estan molt avançats els projectes del blat de moro, una lleguminosa model, Medicago truncatula, i hi ha en marxa dos projectes de vinya, que han donat lloc en un cas a una seqüència publicada (Jaillon et al., 2007); progressivament els genomes del conjunt de les espècies vegetals que tenen interès, ja sigui per la seva posició filogenètica, ja sigui pel seu interès agrícola, acabaran sent coneguts, fins i tot les més complexes com el blat, la seqüenciació de la qual ja ha començat també. Una de les aplicacions més clares de tenir un conjunt de genomes seqüenciats és la possibilitat de conèixer el que és comú als vegetals i el que és espe-

cífic d’alguna espècie. Una altra és la comparació de mapes genètics i la identificació de gens responsables de caràcters d’interès aprofitant la sintènia o colinearitat entre mapes genètics d’espècies properes. L’existència de la conservació, encara que només sigui parcial, de l’estructura dels genomes entre espècies properes ha estat ja utilitzada en molts casos per aprofitar-se del coneixement molecular d’una espècie propera. L’altre gran grup d’aproximacions que ha obert la disponibilitat de grans col·leccions de seqüències gèniques és el desenvolupament de tècniques d’anàlisi massiva. Aquestes tècniques es basen a disposar sobre una base sòlida sondes que corresponen a un gran nombre de gens de seqüència coneguda. En uns casos es tracta simplement de dipositar sobre una superfície de vidre un fragment clonat d’un gen o d’un cDNA. En altres casos el que es tracta és de fer créixer sobre una base de silici una seqüència que se sintetitza fent servir les tècniques que han estat desenvolupades per la microelectrònica. El fet és que sobre una petita superfície podem trobar centenars o milers de seqüències de DNA conegudes. Aquests xips poden ser hibridats amb l’mRNA que conté un teixit determinat. D’aquesta manera es pot tenir informació sobre la variació de l’expressió de milers de gens diferents i podem preveure que observem la totalitat dels gens que s’expressen en un teixit determinat. És obvi que la interpretació d’un nombre tan enorme de dades necessita l’ús d’eines bioinformàtiques molt poderoses. Aquestes aproximacions també es poden fer servir per mesurar la variabilitat genètica que es dóna en un organisme determinat si en lloc de RNA hibridem amb DNA. El que sí que és cert és que amb aquestes metodologies la biologia molecular ha fet un tomb decisiu. El programa molecular mateix era essencialment reduccionista. Tractava d’analitzar els fenòmens biològics en termes d’interaccions molecu-

LA BIOTECNOLOGIA VEGETAL 85

lars. Actualment l’enorme riquesa d’informació ens permet d’analitzar l’expressió del conjunt del genoma i com reacciona en diferents situacions fisiològiques. Arribem, per tant, a una visió holística dels organismes. La biologia de sistemes tracta d’integrar aquesta informació gènica amb una anàlisi completa de les proteïnes presents en un conjunt de cèl·lules o dels metabòlits produïts (aproximacions proteòmiques o metabolòmiques) i tracta de definir les xarxes de control que permeten el funcionament cel· lular i la seva patologia. UNA REFLEXIÓ DE FUTUR Les eines que hem estat acumulant els darrers trenta anys ens estan oferint una nova visió de les espècies vegetals sobre les quals es basa la nostra agricultura. Aquesta visió és, en primer lloc de la nostra comprensió sobre les bases de la fisiologia, la patologia o el desenvolupament de les plantes, que ha sofert una autèntica revolució els darrers anys. En segon lloc, incrementa les possibilitats d’oferir noves aproximacions per a la millora genètica. D’aquestes en podem destacar dues: els marcadors moleculars, que permeten d’accelerar el procés de millora, i les plantes transgèniques, que proporcionen un nou tipus de variabilitat genètica que pot ser utilitzat pel millorador. Aquestes dues aproximacions han tingut els darrers anys una expansió considerable, malgrat els problemes que han tingut en diferents països les plantes modificades genèticament, com és el cas dels europeus. El desenvolupament de la genòmica obre noves possibilitats. Una és l’anàlisi de caràcters complexos. De la mateixa manera que passa quan es tracta d’analitzar caràcters en la nostra espècie, que estan lligats de manera complexa a malalties o comportaments, en les plantes també ens interessa treballar sobre fenotips que estan lligats a

més d’un caràcter. De fet, la millora d’una de les plantes de més gran impacte econòmic, el blat de moro, s’ha fet pràcticament sense marcadors perquè els caràcters que interessen, com el rendiment, per exemple, són caràcters quantitatius que depenen d’un gran nombre de gens, més de cinc-cents en aquest cas, per exemple. El desenvolupament de mapes genètics saturats i de tècniques estadístiques apropiades han permès correlacionar els caràcters quantitatius en conjunts de gens que hi contribueixen, i en alguns casos han permès descobrir els gens individual que tenen l’efecte més gran. Aquestes aproximacions (Gur et al., 2004) obren les portes a l’anàlisi genètica de caràcters d’interès agronòmic d’espècies que fins ara no havien pogut ser objecte de millora. És ben possible que en el curs del procés de prova i error que va donar lloc a la domesticació només aquelles espècies que tenien un control senzill dels caràcters necessaris acabessin adoptant-se. Ara s’obren noves perspectives que cal utilitzar. La situació que tenim en aquest moment hauria de ser especialment favorable per a la utilització de les eines de la biotecnologia vegetal en l’entorn complex que s’està desenvolupant en el nostre planeta. Hi ha factors que ens indiquen que l’esforç per tenir plantes adaptades a les noves situacions és urgent. Només cal llegir el que expliquen els diaris entorn dels preus d’alguns aliments essencials. Només cal que algun país important per a la producció agrícola tingui una mala collita o que als EUA decideixin subvencionar la conversió de gra de blat de moro en biocombustibles, perquè els preus d’alguns dels nostres productes essencials es disparin. Això ens parla del fet que l’abundància d’aliments, que en països com el nostre sembla que s’hagi de donar com un fet, pugui estar en un equilibri inestable. Un recent informe europeu tracta de resumir en quins aspectes es pot esperar que les noves oportunitats obertes pel

86 P. PUIGDOMÈNECH

desenvolupament de les eines genòmiques puguin tenir incidència (European Plant Science Organisation, 2005). Els factors a tenir en compte actualment són, per començar, l’actual situació de la producció agrícola. Si bé durant el darrer segle l’augment de la producció d’aliments ha estat més ràpida que l’augment de la població, no hem d’oblidar que hi ha encara una enorme minoria de persones amb problemes d’alimentació. De totes maneres la demanda d’aliments segurs i de qualitat està creixent arreu del món i cal ser conscients que els efectes climàtics actuen de manera sistemàtica en la producció, i que aquests efectes estaran sotmesos a l’acció del canvi climàtic que actua de manera creixent sobre la major part del planeta. També hem de tenir en compte que hi ha una demanda creixent de productes que provenen de les plantes, ja sigui productes alimentaris, farmacèutics, cosmètics o d’ús industrial. Entre aquests trobem sense dubte els combustibles. Aquesta situació es dóna quan els efectes ambientals d’una agricultura intensiva estan qüestionats i quan ens preocupa que segueixi la pressió sobre les zones salvatges que encara existeixen al nostre planeta, sobretot als tròpics. Tot això ens porta envers una demanda per una agricultura més versàtil i productiva, i al mateix temps més respectuosa amb el medi ambient. De fet, ja veiem com polítiques com l’abandonament de terres de conreu, que estava estimulada a Europa, hagin estat posades en qüestió. Aquestes raons fan que les noves tecnologies hagin de ser aprofitades per tractar d’enfrontar-nos als reptes que tenim davant nostre i que caldrà que tractem de resoldre en els anys que vénen. Per aquestes raons la biotecnologia vegetal hauria de tenir al davant seu un gran futur, per tal com ha estat en el passat un factor essencial per al desenvolupament de les nostres societats. Potser s’han comès errors en la manera com algunes tècniques han estat

utilitzades i presentades a la societat. De tot això hem d’aprendre en els anys que vénen perquè els que ens hi juguem val la pena. BIBLIOGRAFIA Arabidopsis Genomic Initiative (2000). «Analysis of the flowering plant Arabidopsis thaliana». Nature, 408: 796-815. Barton K. A.; Binns A. N.; Matzke A. J.; Chilton M. D. (1983). «Regeneration of intect tobacco plants containing full length copies of genetically engineered T-DNA and transmission of T-DNA to R1 progeny». Cell, 32: 1033-1043. Bevan, M. [et al.] (1998). «Analysis of 1.9 Mb of contiguous sequence from chromosome 4 of Arabidopsis thaliana». Nature, 391: 485-488. Brooks, G.; Barfoot, P. (2006). GM-Crops, the first ten years. Global Socio-Economic and Environmental impact, ISAAA briefs, brief 36. Nova York: Ithaca. European Plant Science Organisation (2005). «European plant sciences: a field of opportunities». Journal of Experimental Botany, 56: 1699-1709. Goffeau, A. [et al.] (1996). «Life with 6000 genes». Science, 274: 563-567. Gur, A.; Semel, Y.; Cahaner, A.; Zamir, D. (2004). «Real time QTL of complex phenotypes in tomato interspecific introgression lines». Trends in Plant Science, 9: 107-109. Herrera-Estrella, L.; Depicker, A.; Montagu, M. van; Schell, J. (1983). «Expression of chimaeric genes transferred into plant cells using a Ti-plasmidderived vector». Nature, 303: 209-213. International Rice Genome Sequencing Project (2005). «The map-based sequence of rice genome». Nature, 436: 793-800. Jaillon, O. [et al.] (2007). «The grapevine genome sequence suggests ancestral hexaploidization in major angiosperm phyla». Nature, 449: 463-467. Klein, T. M.; Wolf, E. D.; Wu, R.; Sanford, J. C. (1987). «High velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells». Nature, 327: 70-73. Li, C.; Zhou, A.; Sang, T. (2006). «Rice domestication by reduced shattering». Science, 311: 1936-1939. Sanchez Monge, E. (1991). Flora agrícola. Taxonomía de magnoliofitas (angiospermas) de interés agrícola. Madrid: Ministeri d’Agricultura, Pesca i Alimentació. Tuskan, G. A. [et al.]. (2006). «The genome of black cottonwood, Populus trochocarpa (Torr and Gray)». Science, 313: 1596-1604. Yu. J. [et al.]. (2002). «A draft sequence of the rice genome». Science, 296: 79-92.

DOI: 10.2436/20.1501.02.47

Les biotecnologies (Pere Puigdomènech i Francesc Gòdia, ed.) Treballs de la SCB. Vol. 58 (2007) 87-104

MILLORA GENÈTICA DE PLANTES ASSISTIDA AMB MARCADORS Pere Arús Centre de Recerca en Agrogenòmica, CSIC-IRTA-UAB. Adreça per a la correspondència: Pere Arús. IRTA, Centre de Recerca en Agrogenòmica, CSIC-IRTA-UAB. Carretera de Cabrils, km 2. 08348 Cabrils. Adreça electrònica: pere.arus@irta.es. RESUM En els darrers trenta anys s’ha fet un gran progrés en el desenvolupament i ús dels marcadors moleculars en plantes. Els marcadors, que detecten la variació de la seqüència del DNA, permeten la predicció de molts caràcters, com ara la forma, mida, color, resistència a les malalties, productivitat, etc., d’una manera sovint més precoç, eficient i barata que la mesura del caràcter quan aquest es manifesta en la planta. La millora genètica ha anat integrant progressivament els marcadors en el procés de selecció i en el control de qualitat de llavors i planters, de manera que actualment s’han convertit en eines d’ús generalitzat i sovint imprescindible que ajuden i potencien els mètodes clàssics d’obtenció de noves varietats. En aquest article es resumeixen les característiques dels principals tipus de marcadors i es descriuen les seves principals aplicacions en la selecció de gens majors, de caràcters quantitatius i en la incorporació de gens d’interès a partir d’individus exòtics o d’espècies silvestres properes als conreus. Paraules clau: millora genètica, marcadors moleculars, caràcters quantitatius, introgressió. MARKER-ASSISTED SELECTION IN PLANT BREEDING SUMMARY The last three decades have witnessed an enormous progress in the development and use of molecular markers for plant breeding. Molecular markers are based on the DNA variation and allow the prediction of many characters related with form, color, size, disease resistance, yield, etc., often quicker, more efficiently and cheaper than field measurements when these characters are expressed on the plant. Markers have been progressively integrated in the process of selection and have become a useful and often necessary

88 P. ARÚS

tool for breeders to select the best individuals and for quality control of seed and nursery plants. This chapter summarizes the characteristics of the main marker types and their application for the selection of major genes, quantitative characters and for the exploitation of genes of interest from wild or exotic sources in cultivated species. Key words: plant breeding, molecular markers, quantitative characters, introgression. INTRODUCCIÓ La millora genètica de plantes, el procés que porta a l’obtenció de noves varietats d’un conreu, es compon de tres etapes ben diferenciades. En la primera, una vegada definits els caràcters a millorar, es tracta de trobar dins la variabilitat genètica de l’espècie conreada, o de les espècies que s’hi poden hibridar, individus que tinguin aquests caràcters. Aleshores comença la segona etapa, en la qual aquests individus s’hibriden entre si i amb plantes de bones característiques agronòmiques generals, per obtenir una població de base que segregarà per a un gran nombre de caràcters, de la qual se seleccionaran els individus que més s’acostin a la varietat que estem cercant, és a dir, els que tinguin un bon comportament general i incorporin els nous caràcters, a la qual sovint s’arriba després de diversos cicles d’hibridació-selecció. El mètode de millora, que consisteix en l’estratègia d’hibridacióselecció i el nombre de cicles necessaris, depèn de molts factors, els més rellevants dels quals són el sistema de reproducció de l’espècie, ja sigui sexual (autògama o al·lògama) o asexual, les característiques genètiques del caràcter (monogènic o poligènic, molt o poc heretable, dominant o recessiu, etc.) i el tipus de varietat que es vulgui obtenir al final (línia pura, híbrid F1, sintètic, clon, multilínia, etc.). Al final d’aquest procés s’arriba a una o més línies seleccionades, de les quals hem de comprovar, dins de la tercera etapa, que són millors en un o més aspectes que les varietats que hi ha al mercat, fet que normalment obliga a realitzar assaigs comparatius. Les línies que millo-

ren les anteriors són les noves varietats que, dins també d’aquesta tercera etapa, s’han de multiplicar, mantenir i comercialitzar per tal que arribin, habitualment com a llavors o plançons, als que les han de conrear. L’enorme progrés de la genètica molecular des del descobriment de l’estructura del DNA, fa poc més de mig segle, fins ara, ens ha portat a un coneixement cada vegada més detallat del genoma dels éssers vius i al desenvolupament d’un seguit d’eines per al seu estudi, que tenen aplicació en la millora genètica en qualsevol de les tres etapes descrites abans, és a dir, en la caracterització de la variabilitat genètica, en la selecció dels individus amb la composició genètica més interessant en poblacions segregants i, finalment, en el control de la qualitat de les noves varietats, tant en l’aspecte de la seva composició genètica (si cada individu o el conjunt dels que componen una varietat correspon a aquest tipus de varietat), com de la seva identitat (distinció individualitzada de cada varietat). En aquest capítol s’expliquen les característiques i aplicacions d’una d’aquestes eines, els marcadors moleculars i, per extensió, el coneixement del genoma que hem obtingut amb aquests, en la segona de les etapes de la millora, és a dir, en la selecció de noves varietats. MARCADORS GENÈTICS: DELS GENS MAJORS ALS MARCADORS MOLECULARS Els marcadors genètics són polimorfismes de qualsevol tipus, que es caracteritzen per tenir una herència mendeliana simple.

MILLORA GENÈTICA DE PLANTES ASSISTIDA AMB MARCADORS 89

Per polimorfisme s’entén qualsevol caràcter morfològic o molècula orgànica (incloenthi, evidentment, les proteïnes i àcids nucleics) que presenti variants al·lèliques que es puguin detectar d’alguna manera. Les propietats ideals dels marcadors són que: a) siguin de bona qualitat genètica, és a dir, codominants (que es puguin distingir els dos homozigots i l’heterozigot produïts per qualsevol parella d’al·lels) i polimòrfics (que cada marcador detecti dos o més al·lels), b) es puguin trobar en gran quantitat en el genoma i el cobreixin completament d’una manera aproximadament uniforme, c) no afectin el fenotip de la planta ni interaccionin entre si i d) s’obtinguin amb un mètode senzill, robust, barat i adequat pel seu ús a diferent escala. L’objectiu dels marcadors en millora genètica és que ens proporcionin unes fites en el genoma que serveixin per estudiar la seva variabilitat, localitzar gens que estiguin a prop dels marcadors o per poder seguir l’evolució de fragments de DNA, cromosomes o del genoma sencer a través de la seva evolució, en general, o dins d’un procés evolutiu a menor escala, com és la selecció dins d’un programa de millora genètica. Els primers marcadors genètics que es van usar foren els que determinen les característiques qualitatives que afecten qualsevol aspecte de la morfologia o fisiologia de la planta, com la forma, mida o color del vegetal o qualsevol dels seus òrgans, la seva resistència a malalties, les èpoques de floració o fructificació, etc. Aquests marcadors, alguns dels quals codifiquen caràcters de gran importància econòmica, i que s’anomenen també gens majors, són tan antics com el mateix naixement de la genètica, ja que van ser la base de la formulació de les lleis de l’herència de Mendel a mitjan segle xix. Tenen com a limitacions el seu baix nombre en la majoria d’espècies, la seva forta interacció amb altres gens (que fa difícil que se’n puguin estudiar molts en segrega-

ció en el mateix encreuament), el seu caràcter habitualment dominant, el poc nivell de polimorfisme (rarament més de dos al·lels) i la condició freqüentment deletèria d’alguns al·lels, normalment els recessius. L’estudi de molts d’aquests gens al mateix temps en descendències d’encreuaments controlats (de tipus F2, la descendència obtinguda de l’autofecundació de l’híbrid entre dues línies diferents, o retroencreuament (RC), la descendència que s’obté d’encreuar aquest híbrid amb un dels seus pares) va fer possible la construcció dels primers mapes genètics, que representen l’alineació ordenada d’aquests marcadors en els cromosomes basada en el grau de lligament entre marcadors. La construcció de mapes genètics amb aquests marcadors fou una empresa a llarg termini, plena de dificultats i reservada només a les espècies més estudiades des del punt de vista genètic com el blat, el blat de moro, el tomàquet o el pèsol (O’Brien, 1990), en les quals aquesta inversió podia justificar-se per la seva qualitat d’espècies model per als estudis genètics. Pels tres quarts del segle passat es va descobrir una nova classe de marcadors, els isoenzims, que havia de revolucionar la genètica clàssica i assentar les bases dels usos actuals dels marcadors (Lewontin, 1970; Tanksley i Orton, 1983). Els isoenzims són formes moleculars d’un mateix enzim amb diferències moleculars d’origen genètic (de la seqüència del gen que els codifica) que en permeten la separació per electroforesi (la substitució d’un sol aminoàcid pot produir una migració electroforètica suficientment diferent per ser detectada). Els isoenzims permeten identificar diferents formes al· lèliques d’un enzim determinat que sovint s’expressen de manera codominant. Els isoenzims polimòrfics solen detectar sèries al·lèliques i és possible comparar la variabilitat dels mateixos isoenzims en diferents espècies, cosa que els fa especialment útils per als estudis de variabilitat genètica

90 P. ARÚS

comparativa (Gottlieb, 1981). La metodologia és senzilla i barata, però el seu baix nombre (és infreqüent que s’hagin descrit més d’una o dues desenes d’isoenzims polimòrfics en les espècies en les quals s’han usat) és el seu factor limitant fonamental. Els isoenzims van permetre l’anàlisi de la variabilitat genètica des d’una perspectiva més acurada i profunda (Lewontin, 1970; Gottlieb 1981), van ser una tècnica que va expandir aquests estudis de variabilitat a moltes espècies silvestres i cultivades i van fer possible els primers assaigs de les aplicacions que després han estat profusament usades quan altres marcadors més potents han estat disponibles (Tanksley i Orton, 1983). Quan l’ús dels isoenzims s’havia expandit considerablement, va aparèixer un nou tipus de marcador, els RFLP (restriction fragment length polymorphisms) (Botstein et al., 1980), que foren els primers directament basats en la variació del DNA i els primers que s’anomenaren moleculars. Els RFLP es basen en les diferències de la mida de fragments homòlegs de DNA creats a partir de la digestió del DNA total amb un enzim de restricció. Aquests polimorfismes són deguts a la detecció o no-detecció d’una diana de l’enzim en un fragment determinat, o a l’existència de diferències de mida entre fragments al·lèlics delimitats per les mateixes dianes de restricció, a causa de l’existència d’una inserció (o deleció) dins d’un dels dos al·lels. Els RFLP es detecten amb el mètode de transferència Southern (Southern, 1975), consistent a separar els productes de la digestió per electroforesi, fixar-los en una membrana de niló i identificar-los allí amb sondes curtes de DNA marcades. Amb els RFLP es pot produir un nombre virtualment infinit de marcadors, i per això superen la principal limitació dels isoenzims i obren la porta als mapes saturats, és a dir, amb una cobertura completa del genoma amb marcadors. El primer ma-

pa en plantes va ser el del tomàquet (Bernadzky i Tanksley, 1986) al qual van seguir molts altres en espècies econòmicament importants. Els RFLP són de gran qualitat genètica (codominants, polimòrfics) i altament transferibles entre espècies (normalment una sonda d’una espècie és útil per produir RFLP en qualsevol membre de la seva família i freqüentment en la d’espècies d’altres famílies). Això els ha fet els més utilitzats per a la comparació de mapes, en què la posició de marcadors homòlegs de diferents espècies permet establir el nivell de semblança entre els seus genomes, de manera que s’identifica la seva sintènia, o localització dels mateixos marcadors als mateixos cromosomes, i la seva colinearitat, o manteniment de l’ordre entre marcadors sintènics. La comparació de genomes és un element important en la comprensió de la seva evolució (Ahn i Tanksley, 1993; Devos, 2005; Yogeeswaran et al., 2005) i en la predicció de l’existència de gens d’interès en espècies poc estudiades comparant el seu genoma amb el d’altres en les quals s’ha acumulat un major nivell de coneixement (Ku et al., 2001; Barnes, 2002). Tot i les seves indubtables virtuts, el principal defecte dels RFLP és que s’obtenen amb un mètode feixuc, lent i car, només a l’abast d’alguns laboratoris especialitzats, adequat per a estudis fonamentals, però lluny d’usos a gran escala com els necessaris per a la seva aplicació en millora genètica. El descobriment de l’amplificació (producció d’un elevat nombre de còpies) de fragments curts de DNA basada en el mètode de la reacció en cadena de la polimerasa (PCR) (Saiki et al., 1988), impulsà el desenvolupament d’una nova onada de marcadors. La PCR permet l’amplificació exponencial de qualsevol fragment de DNA petit (1002.000 pb) a partir d’una sèrie de cicles de síntesi (habitualment entre trenta i cinquanta) de noves cadenes de DNA, que es fa amb l’ajut d’un enzim termostable (la po-

MILLORA GENÈTICA DE PLANTES ASSISTIDA AMB MARCADORS 91

limerasa Taq) i dos encebadors (fragments de DNA, freqüentment de 18-24 bases, complementaris de la seqüència de cada extrem del fragment a amplificar). Aquest fragment amplificat es pot separar per electroforesi, i llavors es pot comparar la seva mida amb la d’altres fragments o es pot aïllar per a la seqüenciació posterior. Els primers marcadors basats en la PCR foren els RAPD (randomly amplified polymorphic DNA) (Williams et al., 1990), en què la PCR es fa amb un sol encebador molt curt (~10 bases) que amplifica per atzar els fragments que aquest encebador pot delimitar, i produeix normalment un nombre discret (~2-20) de fragments amplificats, que es poden separar per electroforesi. La presència o absència dels fragments amplificats en una descendència o col·lecció d’individus permet l’anàlisi genètica d’aquests polimorfismes i l’estudi de la seva variabilitat. Poc després dels RAPD es van proposar els AFLP (amplified fragment length polymorphisms) (Vos et al., 1995), en què la variabilitat es crea, tal com en els RFLP, amb la digestió del DNA total, en aquest cas amb dos enzims de restricció. Posteriorment s’afegeixen als extrems dels fragments obtinguts uns adaptadors (fragments curts de 14-20 pb de seqüència coneguda) i es redueix el nombre de fragments a força d’amplificar el DNA usant uns encebadors homòlegs a la seqüència dels adaptadors que incorporen un nombre petit de bases noves a l’atzar (entre una i tres) que, en proporció inversa a aquest nombre, amplifiquen més o menys fragments. Finalment els fragments són separats per electroforesi i la seva variabilitat és analitzada en un conjunt d’individus. RAPD i AFLP, així com altres marcadors que s’han desenvolupat al voltant de variacions sobre els mateixos mètodes (Garcia-Mas et al., 2000), tenen en comú la seva capacitat de produir una gran quantitat de fragments amplificats potencialment polimòrfics i, per tant, de marcadors que s’obtenen d’una ma-

nera inespecífica, és a dir, sense tenir cap informació prèvia sobre la seva seqüència. La propietat de generar molts polimorfismes a partir d’un mètode senzill va ser crucial en l’acceptació d’aquests marcadors, que s’usaren àmpliament en estudis de variabilitat, en la construcció de mapes i en la cerca de marcadors prop de gens d’interès, com comentarem més endavant. El seu ús va convertir el mapatge en una operació més senzilla, ràpida i barata del que havia estat amb els RFLP, i contribuí a l’extensió de l’ús dels marcadors a moltes més espècies. Malgrat tot, tant RAPD com AFLP tenen punts febles molt importants, ja que són marcadors generalment dominants i poc transferibles i, en el cas dels RAPD, són poc reproduïbles. Com a conseqüència, la informació que han proporcionat, tant en mapes com en variabilitat, es limita a la que s’ha obtingut en les descendències o col·leccions de genotips estudiats, sense que aquesta informació sigui gairebé mai acumulable o ampliable amb la que proporcionen altres marcadors, altres genotips o altres poblacions de mapatge. El seu ús per a aquests propòsits ha decaigut considerablement amb l’aparició de marcadors de millor qualitat, i és previsible que aquesta davallada continuï en el futur. Els problemes de transferibilitat, reproductibilitat i, de vegades, de qualitat (dominància) de RAPD i AFLP es poden resoldre si és possible aïllar el fragment de DNA polimòrfic i convertir-lo en un marcador de PCR específic, és a dir, basat en la seqüència d’aquest fragment, a partir de la qual es dissenyen un parell d’encebadors que permeten amplificar-lo. Aquesta és una operació d’una certa complexitat que sovint, encara que no sempre, es pot realitzar amb èxit, però que es limita a aquells marcadors que tenen un valor especial, normalment perquè estan lligats a gens d’interès. Aquests principis van portar al desenvolupament de marcadors de PCR elaborats a partir de la seqüència de qualsevol frag-

92 P. ARÚS

ment de DNA (com per exemple la sonda d’un RFLP), que s’anomenen d’una manera general STS, (sequence tagged sites) (Olsen et al., 1989), o SCAR (sequence characterized amplified regions), en el cas que s’obtinguin de RAPD (Paran i Michelmore, 1993). Una elaboració dels SCAR o STS són els marcadors CAPS (cleaved amplified polymorphic sequence) (Akopyanz et al., 1992), en què a partir del polimorfisme de seqüència de dos al·lels d’un RAPD, AFLP o qualsevol altre fragment de DNA, es pot elaborar un marcador de PCR i buscar un enzim de restricció que talli un dels al·lels però no l’altre, cosa que genera un polimorfisme, específic i habitualment codominant. El progrés en el coneixement de la seqüència del genoma dels éssers vius, degut en part al desenvolupament, al final del segle xx, de tecnologies eficients de seqüenciació de DNA, resultaren en el descobriment d’un dels marcadors més potents i versàtils dels que s’usen actualment. Es tracta dels marcadors basats en microsatèl·lits, anomenats també SSR (simple-sequence repeats). Un microsatèl·lit és una seqüència curta de DNA formada per un motiu d’una a sis bases repetit diverses vegades en tàndem. Els microsatèl·lits, que són molt freqüents i es troben dispersos per tot el genoma, tant en zones transcrites com no transcrites del DNA, tenen la particularitat de ser altament polimòrfics a causa de la deleció o inserció d’un o més dels motius dels quals es compon (Morgante i Olivieri, 1993). Aquestes propietats els fan adequats per convertir-los en marcadors de PCR quan es coneixen seqüències que els continguin i permetin dissenyar encebadors en les zones de seqüència única que flanquegen cada microsatèl·lit. El marcador (SSR) resultant detectarà habitualment un sol locus codominant i altament polimòrfic. El mètode d’anàlisi és senzill, escalable, requereix molt poc DNA, no necessàriament de bona qualitat, habitualment robust, i té el cost d’una simple

reacció de PCR i la separació posterior per electroforesi, és a dir, comparativament barat. Els SSR solen ser altament transferibles dins de l’espècie, mentre que un percentatge bastant elevat ho és entre espècies properes del mateix gènere, i molt més baix entre gèneres propers. Això permet acumular informació respecte a la variabilitat genètica entre dades de diferents laboratoris o col·leccions de genotips, o inferir la posició d’un marcador situat en un mapa respecte d’altres mapes de la mateixa espècie. En conjunt, les propietats dels SSR s’acosten molt a les del marcador ideal. No obstant això, la primera dificultat per al seu ús va ser la disponibilitat de seqüències de DNA per poder cercar-los, que només eren suficients en les espècies més estudiades. Aquesta limitació no és actualment un problema en la majoria d’espècies conreades, que, amb el desenvolupament, primer de genoteques enriquides en microsatèl·lits (Billotte et al., 1999), i després de les col·leccions de fragments de DNA transcrits (EST, expressed sequence tags), va quedar resolt en gran part (Morgante et al., 2002). Actualment s’han desenvolupat, o hi ha la informació per ferho, centenars o milers de SSR en molts conreus. Els SSR són actualment els marcadors més usats en l’àmbit aplicat i, per bé que tard o d’hora s’aniran substituint per altres marcadors, tot sembla indicar que seguiran sent útils durant bastant temps. En els darrers anys s’han començat a usar marcadors basats en un dels darrers nivells de la variabilitat genètica, la produïda per la substitució d’una base per una altra. Aquests marcadors, que s’anomenen SNP (single nucleotide polymorphisms), són també la conseqüència de la informació que es va acumulant sobre la seqüència del DNA en moltes espècies i del fet que el nombre de genomes de plantes complets o parcialment seqüenciats és cada vegada més gran. Molts dels marcadors que hem considerat abans, tots menys els SSR, ja tenien com una pos-

MILLORA GENÈTICA DE PLANTES ASSISTIDA AMB MARCADORS 93

sible base de variabilitat els SNP, que es poden detectar amb tecnologies molt diverses, com la reseqüenciació de fragments de DNA de polimorfisme conegut, els mètodes basats en la piroseqüenciació (Alderborn et al., 2000), l’espectrometria de masses (Rodi et al., 2002), l’HPLC desnaturalitzant (O’Donovan et al., 1998), la PCR Taq-man (Livak, 1999) i l’ús de microxips (Borevitz et al., 2003), entre d’altres. Cadascuna d’aquestes tecnologies s’adapta a diferents situacions considerant dos paràmetres bàsics: el nombre d’individus a analitzar amb el mateix SNP i el nombre de marcadors a analitzar per cada individu. D’una manera general, els SNP s’analitzen com a bial·lèlics, codominants o dominants i el seus avantatges són que, en ser els marcadors més ubics, és possible trobar-ne en qualsevol punt del genoma i, si s’analitzen a gran escala, el cost per dada individual pot ser molt inferior al de qualsevol altre marcador. La seva aplicació depèn del nivell del coneixement de la seqüència de DNA de l’espècie d’interès, fet que els limita a les poques espècies en les quals aquesta informació és molt gran. És previsible, doncs, que el seu ús s’estengui a mesura que la informació sobre la seqüència de DNA augmenti, tal com ha passat amb els SSR. Recentment s’han posat en el mercat uns aparells de seqüenciació massiva de DNA (www.roche.com, www.illumina.com, www. appliedbiosystems.com), que permeten seqüenciar un gran nombre de fragments de DNA més o menys grans (de 25 a 400 pb), amb una quantitat total entre un quart i una megabase per assaig, i amb perspectives que aquests nombres augmentin ràpidament. Aquests aparells, que ja estan facilitant la seqüenciació de genomes de novo, seran molt útils per a la seva reseqüenciació (obtenció de la seqüència d’un altre individu d’una espècie una vegada que ja n’hi ha una de completa, que és més senzill que l’obtenció de la primera seqüència, que re-

quereix un procediment d’obtenció i muntatge més lent i costós) i es poden convertir en eines eficients per a l’anàlisi de l’expressió gènica. També poden representar una millora substancial en el descobriment de SNP nous o altres tipus de polimorfismes (derivats de la inserció o deleció de petits fragments de DNA). L’anàlisi de genotips heterozigots o de barreges de DNA total o de fragments transcrits de diversos individus pot generar un gran nombre de SNP en poc temps i a preus competitius (Barbazuk et al., 2007), fet que expandirà l’ús d’aquests marcadors a moltes més espècies i previsiblement marcarà el futur immediat de les aplicacions dels marcadors en la millora genètica. SELECCIÓ ASSISTIDA AMB MARCADORS Dins d’aquesta secció s’inclouen diverses aplicacions dels marcadors com a ajut al procés de selecció de varietats noves. Aquestes aplicacions estan dirigides a l’augment de l’eficiència de la selecció de caràcters determinats en el sentit de fer-la més precoç, més acurada o més barata. Els marcadors permeten també la selecció d’individus amb un genotip interessant quan el fenotip seria difícil o impossible d’avaluar (heterozigots per a gens recessius, acumulació de gens de resistència a una mateixa malaltia), i faciliten la selecció del genoma d’un genotip o una espècie en programes d’introducció (introgressió) de gens d’espècies silvestres o genotips exòtics. Amb els marcadors també és possible conèixer a fons l’herència dels caràcters agronòmics, especialment aquells que són més difícils, com els d’herència quantitativa, i fa més eficaç, a partir d’aquesta comprensió, la selecció dels genitors que tinguin els al·lels adequats i dels descendents amb les combinacions de gens més interessants.

94 P. ARÚS

Etiquetatge de gens La meiosi produeix sobreencreuaments d’una manera discreta en el genoma de les plantes. El nombre de recombinacions de cada cromosoma després de la meiosi és petit. És freqüent que no n’hi hagi cap, o bé un o dos, i nombres majors són progressivament més rars, encara que això depèn de la mida del cromosoma, de l’espècie i de l’individu. Per tant, els fragments que es conserven de l’individu original en el seu descendent són habitualment grossos, cosa que vol dir que un al·lel d’un marcador que estigui a la vora d’un gen d’interès s’heretarà habitualment amb un al·lel d’aquest mateix gen. La freqüència amb la qual això passi dependrà de la distància genètica entre el marcador i el gen, un paràmetre que es calcula a partir de la freqüència de recombinació entre el gen i el marcador, que és la informació bàsica necessària per a la construcció de mapes de lligament. La distància genètica es pot determinar en les descendències típicament usades per al mapatge (de tipus F2 o retroencreuaments), sabent el fenotip del gen i del marcador per a cada individu. Es mesura en centimòrgans (cM) —per donar una idea del seu valor, per a distàncies curtes (1-10 cM), un cM és aproximadament igual al percentatge de recombinació (1-10 %). Quan un gen que ens interessa és a prop d’un marcador, podrem seleccionar el marcador en comptes del gen, com si tinguéssim el nostre gen etiquetat amb el marcador i el poguéssim reconèixer amb aquesta etiqueta. Com que els dos locus segreguen en la descendència, això vol dir que hi haurà un al·lel del marcador que estarà associat a l’al·lel del gen que ens interessa i un altre que ho estarà de l’al·lel del gen que volem eliminar. L’eficiència de la selecció amb el marcador dependrà de la proximitat entre els dos locus: si la distància és de 5 cM, ens equivocarem aproximadament el 5 % de les vegades, si és d’1 cM, l’u per cent, i si el gen

i el marcador cosegreguen ~0 cM (fet que passa quan el marcador està basat en la seqüència del mateix gen), no ens equivocarem gairebé mai. Un dels avantatges de l’etiquetatge de gens és que es pot fer la selecció tan aviat com sigui possible extreure el DNA de la planta, cosa que en general ocorre molt aviat (la llavor, el cotiledó, la primera fulla vertadera). Si el gen que ens interessa es manifesta molt més tard, com ara un caràcter de flor o fruit, requereix una tecnologia addicional per manifestar-se, com en el cas de la major part de resistències a malalties o plagues, o hi és però no pot manifestar-se (un al·lel recessiu en segons quin tipus d’encreuament); llavors la selecció amb el marcador pot ser avantatjosa i pot representar un estalvi de temps, diners o eficiència respecte a la selecció basada en el fenotipus. També, la selecció basada en el marcador només descarta les plantes que tenen un cert caràcter, però permet seleccionar d’una manera convencional la resta. La selecció es pot aplicar al mateix temps en tots els gens en què la població estigui segregant per als quals es disposi de marcadors, i es pot fer per a diversos gens que afectin el mateix caràcter, encara que una vegada que un s’hagi incorporat no es pugui notar cap canvi en el fenotip. Aquest és el cas de molts gens de resistència a malalties en què la seva acumulació (que s’anomena també piramidació) no canvia la resistència original de la planta, però pot representar un avantatge pel que fa a la seva durada (Castro et al., 2003; Tar’an et al., 2003; Barloy et al., 2007). La piramidació només es pot fer amb l’ajut dels marcadors, ja que sense aquests no es pot tenir cap garantia que el segon gen o els posteriors s’hagin incorporat al genoma de la planta seleccionada.

MILLORA GENÈTICA DE PLANTES ASSISTIDA AMB MARCADORS 95

Com es poden trobar marcadors a prop de gens d’interès? Per poder etiquetar gens cal trobar marcadors propers, idealment molt a prop, perquè d’això depèn l’eficiència de la selecció. Hi ha diverses maneres de fer-ho. Una consisteix a construir un mapa genètic amb una població que segregui per al caràcter d’interès, de manera que es pugui trobar així la posició del gen. Quan en l’espècie existeix ja un mapa saturat amb marcadors transferibles, una bona manera de procedir és seleccionar alguns marcadors d’aquest mapa, de manera que cobreixin la major part del genoma a distàncies més o menys grans (25-35 cM) i que segreguin la població usada per mapar el gen. Una vegada la posició del gen queda establerta amb aquest mapa mínim, s’assagen altres marcadors situats en la regió genòmica on hi ha el gen fins que se’n troba un que està suficientment a prop (< 2 cM) del gen. Si no hi ha marcadors suficientment propers es poden intentar cercar dos marcadors que flanquegin el gen, encara que estiguin a distàncies majors: seleccionant al mateix temps dos marcadors d’aquestes característiques separats entre si, per exemple, 10 cM, s’aconsegueix una eficiència igual o major que amb un marcador que estigués a 0,25 cM (Tanksley, 1983). El mètode més usat per a la localització de marcadors propers a un gen, anomenat bulked segregant analysis (BSA), no requereix la construcció de cap mapa (Michelmore et al., 1991). Es basa en la característica ja esmentada que en les descendències habitualment usades en els experiments de mapatge, el nombre de sobreencreuaments per cromosoma i meiosi és baix, i per tant, l’al· lel que cerquem del gen d’interès s’hereta juntament amb una gran fragment de DNA d’un dels genitors, mentre que l’al·lel alternatiu d’aquest gen inclou un fragment també gran, de DNA homòleg, però diferent, procedent de l’altre genitor. D’aquesta ma-

nera, si en un encreuament determinat (suposem una F2) barregem el DNA de plantes (normalment entre sis i dotze) amb un dels dos fenotips (per exemple, resistents a una malaltia) i el comparem amb una barreja semblant de DNA de plantes amb el fenotip alternatiu (susceptible) per a un gran nombre de marcadors, si trobem algun marcador que detecti un polimorfisme entre les dues barreges, molt probablement es trobarà en la regió on hi ha el gen que busquem. Això és degut al fet que en cada barreja només al voltant del gen seleccionat es mantindrà una finestra en la qual el DNA serà només d’un dels dos possibles haplotips (fragments al·lèlics). La mida d’aquesta finestra serà més petita com més gran sigui el nombre de plantes usat en cada barreja. Els marcadors més adequats per a aquests assaigs són els RAPD, AFLP i els marcadors inespecífics semblants, atesa la seva elevada capacitat de generar polimorfismes de DNA. El BSA és un mètode de gran eficiència que ha estat sovint utilitzat amb èxit. Com a punts febles, hi ha la seva gran sensibilitat als errors de fenotipatge que puguin implicar la inclusió d’alguna planta de fenotip erroni en alguna de les barreges de DNA, així com de plantes amb fenotip correcte no pertanyents a l’encreuament, que s’han de comprovar amb marcadors abans de ser usades. Un altra via possible de localització de marcadors es basa en la comparació de genomes, quan l’espècie d’interès és propera a una altra de la qual hi ha molta informació sobre la seqüència, o de la qual fins i tot es coneix la seqüència sencera del genoma. En aquests casos, una vegada localitzada la regió on es troba al gen a seleccionar, es poden cercar en la regió homòloga de l’espècie model fragments de DNA que puguin generar marcadors lligats al gen d’interès (Ku et al., 2001).

96 P. ARÚS

El millor marcador és el gen mateix A mesura que es va avançant en el coneixement dels gens, les seves característiques i funcions i la seva posició en els genomes, és possible dissenyar estratègies que permetin localitzar els gens d’interès i elaborar marcadors a partir de la seva seqüència, que reemplaçarien els marcadors propers al gen. Això té molts avantatges, i el primer és que la selecció amb un marcador basat en la seqüència del mateix gen és la més acurada de totes les possibles. Una estratègia per cercar un gen d’interès és el clonatge posicional, que es basa a trobar, per la via del BSA o d’altres semblants, marcadors que estiguin en la proximitat del gen d’interès i procedir després al mapatge d’alta resolució d’aquests marcadors amb un nombre molt elevat (generalment milers) de plantes (Tanksley et al., 1995). Una vegada hi ha dos marcadors que flanquegen el gen a una distància molt curta (< 1 cM), es poden usar per garbellar genoteques (col·leccions de grans quantitats de fragments de DNA) de mida gran (habitualment BAC, bacterial artificial chromosomes, que són fragments de ~100-250 kb) de l’espècie en què s’estudia el gen. Si els dos marcadors es troben en un mateix BAC, s’ha de seqüenciar aquest; si no, s’ha de construir un contig (conjunt de BAC parcialment sobreposats) usant marcadors obtinguts de la seqüència dels BAC (habitualment dels extrems) que contenen els marcadors, fins a localitzar un BAC que contingui el gen, és a dir, un BAC amb el qual es puguin obtenir dos marcadors, un a cada cantó d’aquest. Una vegada seqüenciat el BAC, s’identifiquen, entre els gens que conté, aquells que corresponen més probablement al gen cercat. Experiments de complementació per la via transgènica o altres aproximacions permetran al final validar quin d’aquests gens és el causant del fenotip estudiat. Aquest mètode ha permès clonar gens molt importants sobre els

quals no es tenia cap informació sobre la seva base molecular, com per exemple els primers que es van conèixer dels que confereixen resistència a malalties (Martin et al., 1993; Cai et al., 1997). Es tracta, però, d’una estratègia complexa, que implica freqüentment una inversió considerable de temps i mitjans i no està exempta de riscos: per exemple, que la regió estudiada estigui en una zona de baixa recombinació, on petites distàncies genètiques puguin correspondre a grans distàncies físiques, o que els dos al· lels alternatius es trobin en una regió poc variable, que faci difícil la localització de marcadors. La disponibilitat de mapes físics, és a dir, basats en la distància física (nombre de bases) i no en la distància genètica (freqüència de recombinació), com els mapes de lligament, simplifica molt el clonatge de gens (Zhang i Wing, 1997; Chang et al., 2001). Els mapes físics es fan sovint amb l’acoblament de grans fragments de DNA procedents de genoteques de BAC en contigs que cobreixin la major part o la totalitat del genoma. Quan es disposa d’un mapa físic, el clonatge de gens localitzats amb una precisió raonable al mapa genètic requereix essencialment la cerca de BAC que continguin marcadors a prop d’aquest gen i l’aproximació successiva al gen amb marcadors obtinguts de BAC adjacents a aquest fins trobarne un que contingui el gen que busquem. La seqüenciació d’aquest BAC ens durà a la identificació de candidats i finalment al gen. Quan el genoma està complet o parcialment seqüenciat, i una vegada situat el gen en una regió del genoma, serà suficient la cerca in silico de gens d’aquesta regió que puguin correspondre per la seva funció al gen que cerquem, la comprovació de la seva cosegregació amb el gen i la validació de la seva funció via complementació o altres aproximacions. Una aproximació funcional a la cerca de gens d’interès és l’anàlisi de gens candidats

MILLORA GENÈTICA DE PLANTES ASSISTIDA AMB MARCADORS 97

(GC). Un GC és un gen de seqüència coneguda, la funció hipotètica o demostrada del qual pot estar implicada en l’expressió d’un caràcter determinat. El mapatge de GC en el genoma d’una planta i la seva colocalització amb la de gens que afectin aquest caràcter ens pot permetre establir una relació de causa-efecte entre els GC i aquests gens. L’estratègia dels GC ha estat usada amb èxit en molts casos (Pflieger et al., 2001), per bé que en altres no ha donat resultat. Les causes dels fracassos són que per a alguns caràcters és difícil cartografiar tots els GC potencialment involucrats en el caràcter (no hi ha seqüències disponibles en l’espècie, no és possible trobar polimorfisme en tots els GC assajats, etc.) i que de vegades pot ser difícil identificar tots els possibles GC perquè corresponen a àmbits funcionals poc coneguts o a mecanismes de regulació gènica (factors de transcripció, mRNA, etc.). Una via envers el reconeixement del màxim possible de GC és l’ús de microxips, constituïts per milers de fragments de DNA transcrit immobilitzats en un xip, placa de vidre o altres materials, que s’hibriden amb DNA marcat procedent de la part transcrita d’un teixit tractat i un d’usat com a control per estudiar l’expressió diferencial de gens entre si. Els gens que s’expressen diferencialment en tractaments, teixits o moments del desenvolupament relacionats amb l’expressió del caràcter estudiat són també candidats a explicar la variació fenotípica estudiada, i representen generalment una mostra molt àmplia del genoma transcrit, difícil de detectar per altres mitjans, que augmenta l’amplitud i probabilitats d’èxit d’aquest tipus d’anàlisi. Caràcters d’herència quantitativa La major part dels trets agronòmics (relacionats amb la productivitat, la qualitat del producte, l’adaptació de la planta a di-

ferents medis, etc.) són de tipus quantitatiu, és a dir, estan codificats per diversos gens, l’expressió dels quals està influïda també per l’ambient i per la interacció entre els gens i l’ambient. Durant molts anys es van analitzar acceptant el que s’anomenà hipòtesi infinitesimal, que assumeix que la base genètica d’aquests caràcters està determinada per molts gens amb efectes individuals petits i semblants. El descobriment dels marcadors moleculars i la generació de mapes genètics amb aquests va permetre re examinar aquests caràcters, incloent-hi una dimensió addicional: la posició dels gens al genoma. L’anàlisi de la cosegregació entre marcadors que cobreixen tot el genoma i les dades dels caràcters quantitatius permeten establir punts del genoma on existeix una correlació entre les dades d’alguns marcadors i les dades fenotípiques. Es pot inferir que en aquests llocs es troben un o més gens que afecten l’expressió del caràcter quantitatiu, que s’anomenen QTL (quantitative trait loci). La diferent intensitat d’aquesta correlació i els efectes produïts per homozigots i heterozigots per als marcadors en la proximitat del QTL permeten també establir algunes de les característiques centrals d’aquests QTL, és a dir, la magnitud del seu efecte, el seu mode d’expressió (additivitat, dominància, sobredominància, etc.) i la seva posició aproximada en el mapa genètic. També és possible estimar la interacció entre diferents QTL (Ahmadi et al., 2001) i entre aquests i el medi ambient (MacMillan et al., 2006). La prova de concepte que aquesta aproximació era viable i generava informació útil va ser proposada per primera vegada en plantes per Tanksley et al. (1982), quan els marcadors que hi havia eren els isoenzims. Posteriorment, Paterson et al. (1988), ja amb un mapa del tomàquet saturat, i construït en la seva major part amb RFLP, van realitzar el primer estudi de QTL amb cobertura de tot el genoma i amb una anàlisi estadís-

98 P. ARÚS

tica específicament adequada als estudis de lligament. Els resultats desmentiren clarament la hipòtesi infinitesimal i demostraren (Tanksley, 1993) que una proporció, variable en funció de molts aspectes (espècie, caràcter, població analitzada i les seves característiques, etc.) de la variància fenotípica de cada caràcter està determinada per un nombre variable i finit de QTL, amb magnituds de l’efecte i accions gèniques molt diferents entre si. Aquests resultats obriren la porta a l’ús de marcadors propers a aquests QTL per a la selecció d’aquests caràcters, de la mateix manera que es fa amb els caràcters qualitatius. En alguns casos l’anàlisi de QTL porta al descobriment d’un o dos QTL de gran efecte que poden tractar-se d’una manera independent, tal com si fossin gens majors, i dels quals es poden buscar i trobar diferents al·lels. També és possible clonar QTL per la via dels gens candidats o amb aproximacions posicionals (Friedman et al., 2000). Els desenvolupaments genòmics en els àmbits de la transcriptòmica (anàlisi del DNA transcrit i de la seva expressió diferencial en teixits, ambients o genotips), la proteòmica (anàlisi de la composició, estructura i expressió de les proteïnes) i la metabolòmica (estudi bioquímic de metabòlits i polipèptids i les vies metabòliques que els produeixen), que impliquen en tots els casos l’anàlisi massiva i sovint quantitativa dels gens i els seus productes, obre una via nova a l’estudi del fenotip, molt més propera al missatge genètic que l’avaluació de caràcters morfològics i fisiològics, i complementària a aquesta. Els resultats de les anàlisis instrumentals en transcriptòmica, que sovint es fan amb l’ajut de microxips, consisteixen en dades quantitatives de presència relativa de milers de seqüències. Aquestes dades (i també les produïdes per assaigs semblants de proteòmica i metabolòmica) es poden tractar com qualsevol altre caràcter fenotípic en una població

segregant i detectar la seva correlació amb la segregació de marcadors que cobreixen tot el genoma. Aquesta aproximació, que s’anomena genòmica genètica (Jansen i Nap, 2001), permet la detecció de QTL (que en aquest cas s’anomenen eQTl o QTL d’expressió) que identifiquen regions del genoma on hi ha gens involucrats en resposta a perfils d’expressió determinats. Les posicions dels eQTL poden ser comparades amb les de gens majors o QTL que determinen diferències morfològiques o agronòmiques, fet que en alguns casos permet la identificació o validació de gens candidats. Tot i que aquestes noves aproximacions són molt útils i d’aplicació immediata en alguns casos, els caràcters quantitatius segueixen presentant dificultats per a l’anàlisi en molts d’altres, particularment en caràcters habitualment poc heretables, per als quals la majoria dels QTL detectats són de petit efecte, i la seva expressió és fortament afectada pel medi ambient, com els relacionats amb la productivitat en els cereals i altres espècies de conreu extensiu. Un dels elements que dificulta l’anàlisi genètica d’aquests caràcters és que les poblacions usades, habitualment del tipus F2, RC, RIL (línies recombinants consanguínies) o DHL (línies diplohaploides), són poc eficients per a aquest propòsit, ja que cada individu és una barreja d’al·lels de QTL de cadascun dels seus pares que interaccionen entre si i dificulten la individualització i avaluació de l’efecte de cada QTL i de la seva acció gènica. El nombre d’individus necessari per a una bona avaluació del caràcter hauria de ser elevat (diversos centenars) i cada individu s’hauria d’estudiar en diferents replicacions i sotmetre’s a medis diferents. Algunes d’aquestes poblacions són poc adequades per fer-ne replicacions, com les F2 o RC. Una via a la resolució d’aquests problemes és l’anàlisi de generacions avançades de retroencreuaments (Tanksley i Nelson, 1996) i la creació de col·leccions de línies

MILLORA GENÈTICA DE PLANTES ASSISTIDA AMB MARCADORS 99

quasiisogèniques (NIL) (Eshed i Zamir, 1995), cadascuna de les quals conté el genoma sencer d’un dels genitors de l’encreuament inicial (idealment una línia pura, la qual anomenarem genitor recurrent o R) a excepció d’un fragment d’un dels cromosomes, que pertany a l’altre (el genitor donant o D). La selecció de les NIL es fa usant marcadors situats per tot el genoma en diferents generacions de retroencreuament i autofecundació a partir d’un híbrid R × D. Si es disposa d’una col·lecció de NIL diferents que cobreixin la totalitat del genoma de D, qualsevol diferència entre un caràcter d’una de les NIL i R pot ser atribuïble a l’existència d’un gen o QTL localitzat en el fragment introgredit. Encreuant R amb qualsevol NIL es pot obtenir un heterozigot que ens permet avaluar l’efecte de diferents dosis del mateix al·lel sobre el mateix fons genètic, o encreuant diferents NIL podem estimar l’efecte conjunt de diversos QTL del mateix caràcter i les seves interaccions. Mapatge per associació El mapatge per associació o per desequilibri de lligament (DL) és una altra manera de localitzar gens d’interès o marcadors per a aquests (Flint-Garcia et al., 2003; Gupta et al., 2005). El DL és l’associació no a l’atzar d’al· lels de dos locus, de manera que un al·lel determinat del primer locus prediu la presència d’un altre al·lel del segon. Tal com s’ha explicat en la descripció del BSA, els fragments de DNA conservats en una població de mapatge són grans, cosa que vol dir que trobarem associació (o DL) entre marcadors que estiguin localitzats a distàncies grans del mateix cromosoma. Això vol dir que la nostra capacitat d’estimar distàncies petites serà limitada o ens obligarà a usar un nombre de plantes molt gran. Les col·leccions de genotips poc relacionats, en què el nombre de recombinacions que s’han produït en el

seu genoma des d’un ancestre comú és molt elevat, tenen un nivell de DL molt més baix, que pot reduir els fragments conservats fins a mides molt petites (centenars o milers de bases). Aquestes característiques fan que si trobem associació en una col·lecció de genotips amb DL baix entre un marcador i un gen, aquest marcador estarà molt a prop del gen, o serà part de la seqüència d’aquest. Això és útil per validar gens candidats, colocalitzats amb gens o QTL d’una manera aproximada amb el mapatge convencional, i per als quals el manteniment de l’associació amb el caràcter en col·leccions de genotips proporciona una prova important de la seva relació amb el gen/QTL d’interès, i en pot permetre fins i tot la identificació i la d’al·lels amb diferents efectes (Thornsberry et al., 2001). El manteniment del DL depèn de diversos factors relacionats amb la història de l’espècie estudiada (autogàmia o al·logàmia, mida de les poblacions, selecció, etc.). En funció d’aquests paràmetres es poden elaborar col·leccions de genotips amb diferents nivells de DL. Col·leccions amb DL més elevats poden permetre estudis d’associació del genoma sencer, quan es disposa d’un joc de marcadors que cobreixin el genoma a distàncies curtes, fet que pot permetre estudiar qualsevol caràcter que sigui variable en la col·lecció de plantes analitzada, sense la limitació del nombre d’al·lels (freqüentment només dos) de les poblacions de mapatge convencional. D’altra banda, el genotipatge de la col·lecció serveix per analitzar posteriorment qualsevol caràcter d’interès, qualitatiu o quantitatiu. Tot i els avantatges de les associacions marcador-caràcter, les anàlisis d’associació tenen algunes dificultats tècniques importants, la més destacable de les quals és l’existència d’estructures subpoblacionals dins de l’espècie, que generen associacions espúries. L’estructura s’ha de tenir en compte, però es pot estudiar coneixent la

100 P. ARÚS

variabilitat de cada col·lecció d’acord amb la variabilitat de marcadors analitzats prèviament, i se’n poden minimitzar els efectes. Un altre element important és que els jocs de marcadors necessaris (previsiblement SNP) ben distribuïts pels cromosomes (el que s’anomena mapa d’haplotips) per fer una exploració de tot el genoma són necessàriament molt grans (desenes o fins i tot centenars de milers), cosa que de moment queda fora de l’abast de la majoria d’espècies però que, com molts altres desenvolupaments, sembla possible per a molts conreus a mitjà o llarg termini. Ús dels marcadors moleculars en la introgressió de gens Un dels objectius més freqüents en la millora de plantes és la introgressió d’un gen d’un material exòtic o una espècie silvestre dins d’una línia d’alta qualitat o una varietat. Aquesta és la via més freqüent d’utilització de la variabilitat natural per introduir gens interessants dins del genoma d’una espècie cultivada. L’objectiu és complementar un genotip de bon comportament general comprovat amb algun gen que el millori d’una manera puntual com, per exemple, conferint-li resistència a una malaltia o allargant la vida postcollita del seu producte. La línia millorada és en essència una NIL de la primera, que incorpora un fragment de DNA, en aquest cas tan petit com sigui possible, on hi ha el gen que ens interessa. El mètode utilitzat, anomenat de retroencreuament, consisteix, d’una manera semblant al que s’ha explicat abans per construir una NIL, en el fet que la línia de bon comportament (R) és hibridada amb la línia exòtica donadora del gen (D) i la línia millorada s’obté després d’una sèrie de retroencreuaments amb R en cadascun dels quals se selecciona a favor del gen introgredit i, al mateix temps, es retorna a les característiques de la línia R, fet

que s’acostuma a completar després de 6-8 generacions de retroencreuament. La selecció del gen a introgredir es fa quan és possible amb un marcador que estigui a la vora del gen. Els marcadors es poden usar també al mateix temps per seleccionar a favor del genoma sencer dels individus segregants, de manera que sigui possible arribar més de pressa al genotip de la línia R. Tanksley et al. (1981), que foren els primers a usar aquesta aproximació, van estimar en un genoma com el del tomàquet que la selecció de només un marcador per cromosoma a favor del genotip del genitor recurrent duria a una fixació del 95 % del genoma en la primera generació de retroencreuament, quan aquesta proporció sense selecció assistida amb marcadors seria només del 75 %. L’ús de marcadors seleccionats de manera que cobreixin el genoma a distàncies de 20-30 cM millora substancialment aquestes previsions, de manera que el procés d’introgressió d’un gen nou es pot reduir amb aquesta aproximació, anomenada selecció de tot el genoma, de 6-8 generacions a només dues o tres (Tanksley et al., 1989). Un altre element important del procés d’introgressió és la mida del fragment introgredit. Stam i Zeven (1981) van estimar que després de vint generacions de retroencreuament encara podia quedar un fragment de D tan gran com 10 cM al voltant del gen seleccionat. Això vol dir que juntament amb el fragment introgredit s’incorpora una gran quantitat de DNA no desitjat que pot incloure centenars de gens de D. Aquesta és la causa de l’associació freqüent de determinats gens introgredits amb característiques indesitjables en altres aspectes del comportament de la línia seleccionada, que s’anomena linkage drag (que es podria traduir com ‘ròssec de lligament’). Aquest efecte augmenta amb la llunyania entre les línies donant i recurrent, i amb el nombre de gens a introgredir en un sol encreuament.

MILLORA GENÈTICA DE PLANTES ASSISTIDA AMB MARCADORS 101

Els marcadors són útils per a la reducció del ròssec de lligament. Si hi ha dos marcadors lligats i flanquejant el gen d’interès, es pot seleccionar en algun moment del programa de lligament en plantes que tinguin aquest gen però l’hagin recombinat amb un dels dos marcadors (un 1 % de les plantes analitzades si la distància fos d’1 cM), i per a l’altre en la generació següent. D’aquesta manera el fragment introgredit quedarà reduït a menys de la distància entre els dos marcadors flanquejants (Tanksley et al., 1989). CONCLUSIÓ La selecció assistida amb marcadors i altres aplicacions dels marcadors en diverses activitats del procés de millora han estat adoptats d’una manera general per part de les empreses que treballen en espècies que es reprodueixen per llavors, principalment els conreus extensius (cereals, oleaginoses, etc.) i hortalisses. En la major part dels casos s’usen per a activitats relacionades amb el control de la qualitat del material que comercialitzen (test de puresa híbrida en híbrids F1, control de la identitat de línies pures i híbrides, defensa de les patents de varietats vegetals), en la selecció de gens majors (freqüentment resistències a malalties) i en la selecció de tot el genoma en programes d’introgressió de gens. També en la selecció de caràcters quantitatius, encara que aquesta aplicació, més complexa i amb una inversió inicial en recerca, està limitada a algunes espècies més conegudes des del punt de vista genètic (blat de moro, blat, arròs, ordi, tomàquet o colza, entre altres), normalment en els programes de les empreses més grans. En el cas dels conreus que es reprodueixen vegetativament (fruiters, vinya, maduixa, ornamentals) les empremtes de DNA obtingudes amb marcadors (principalment SSR) s’usen a bastament per a la protecció dels drets d’obtentor, però

per ara molt poc per a la selecció, ja que es coneix poc sobre la genètica d’aquestes espècies, la metodologia de millora emprada habitualment és poc propícia per al seu ús i les empreses que es dediquen a aquestes espècies són habitualment petites i menys tecnificades. El coneixement del fenotip necessita una mesura acurada, fet que segueix sent un element clau perquè es pugui associar aquesta informació amb la que s’obtingui del genotip, és a dir, en la seqüència del DNA. Si bé el progrés del coneixement del genotip ha estat molt important en els darrers anys, una part molt gran del que puguem fer en el futur dependrà també d’un augment en quantitat i qualitat de les dades actuals sobre variabilitat fenotípica dins del germoplasma cultivat i silvestre pròxim de cada conreu, així com de la creació i caracterització de poblacions segregants de mapatge adequades per a la dissecció de caràcters quantitatius, el desenvolupament de col·leccions de mutants i el de poblacions adequades per a la genètica d’associació. La informació sobre el genotip ha estat útil per a una interpretació millor de les dades fenotípiques, tal com ha demostrat l’anàlisi de QTL, i l’avenç metodològic de les eines d’anàlisi de molècules ha de permetre una caracterització a fons del fenotip pel que fa al metaboloma complet. En l’àmbit genòmic el desplegament de les noves tècniques de seqüenciació massiva fa preveure que els propers anys es produirà la seqüenciació (i reseqüenciació) de molts dels genomes de les espècies conreades i augmentarà en gran mesura la comprensió de la funció de molts gens i de les seves interaccions. Tota aquesta informació generarà un major grau d’aplicació en la millora de les eines que ja existeixen, ja que simplificarà la cerca de gens i marcadors per a aquests gens i ampliarà el nombre de caràcters a seleccionar i el d’espècies en què aquests se seleccionaran. En conjunt, el progrés metodològic i

102 P. ARÚS

de coneixement del genoma, que ja ha estat enorme en els darrers vint anys, promet seguir a un ritme creixent en el futur immediat, cosa que ens ha de permetre afinar cada vegada més en la predicció del fenotip a partir del coneixement del genotip, amb uns criteris de rapidesa i baix cost, que es troben en la base de l’ús dels marcadors en la millora genètica. BIBLIOGRAFIA Ahmadi, N.; Albar, L.; Pressoir, G.; Pinel, A.; Fargette, D.; Ghesquiere, A. (2001). «Genetic basis and mapping of the resistance to Rice yellow mottle virus. III. Analysis of QTL efficiency in introgressed progenies confirmed the hypothesis of complementary epistasis between two resistance QTLs». Theor. Appl. Genet., 103: 1084-1092. Ahn, S.; Tanksley, S. D. (1993) «Comparative linkage maps of the rice and maize genomes». Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 90: 7980-7984. Akopyanz, N.; Bukanov, N. O.; Westblom, T. U.; Berg, D. E. (1992). «PCR-based RFLP analysis of DNA sequence diversity in the gastric pathogen Helicobacter pylori». Nucleic Acid Res., 20: 6221-6225. Alderborn, A.; Kristofferson, A.; Hammerling, U. (2000). «Determination of single-nucleotide polymorphisms by real-time pyrophosphate DNA sequencing». Genome Res., 10: 1249–1258. Barbazuk, W. B.; Emrich, S. J.; Chen, H. D.; Li, L.; Schnable, P. S. (2007). «SNP discovery via 454 transcriptome sequencing». Plant J., 51: 910-918. Barloy, D.; Lemoine, J.; Abelard, P.; Tanguy, A. M.; Rivoal, R.; Jahier, J. (2007). «Marker-assisted pyramiding of two cereal cyst nematode resistance genes from Aegilops variabilis in wheat». Molec. Breed., 20: 31-40. Barnes, S. (2002). «Comparing Arabidopsis to other flowering plants». Curr. Opinion Plant Biol., 5: 128133. Bernatzky, R.; Tanksley, S. D. (1986). «Toward a saturated linkage map in tomato based on isozymes and random cDNA sequences». Genetics, 112: 887898. Billote, N.; Lagoda, P. J. L.; Risterucci, A. M.; Baurens, F. C. (1999). «Microsatellite-enriched libraries: Applied methodology for the development of SSR markers in tropical crops». Fruits, 54: 277-288. Borevitz, J. O.; Liang, D.; Plouffe, D.; Chang, H. S.; Zhu, T.; Weigel, D.; Berry, C. C.; Winzeler, E.;

Chory, J. (2003). «Large-scale identification of Single-Feature Polymorphisms in complex genomes». Genome Res., 13: 513-523. Botstein, D.; White, R. L.; Skolnick, M.; Davis, R. W. (1980). «Construction of a genetic-linkage map in man using restriction fragment length polymor phisms». Am. J. Hum. Genet., 32: 314-331. Cai, D.; Kleine, M.; Kifle, S.; Harloff, H. J.; Sandal, N. N.; Marcker, K. A.; Klein-Lankhorst, R. M.; Salentijn, E. M. J.; Lange, W.; Stiekema, W. J.; Wyss, U.; Grundler, F. M. W.; Jung, C. (1997). «Positional cloning of a gene for nematode resistance in sugar beet». Science, 275: 832-834. Castro, A.; Chen, X.; Corey, A. E.; Filichkina, T.; Hayes, P. M.; Mundt, C.; Richardson, K.; Sandoval-Islas, S.; Vivar, H. (2003). «Pyramiding and validation of Quantitative Trait Locus (QTL) alleles determining resistance to barley stripe rust: effects on adult plant resistance». Crop Sci., 43: 2234-2239. Chang, Y. L.; Tao, Q.; Scheuring, C.; Ding, K.; Meksem, K.; Zhang, H. B. (2001). «An integrated map of Arabidopsis thaliana for functional analysis of its genome sequence». Genetics, 159: 1231-1242. Devos, K. M. (2005). «Updating the crop circle». Plant Biol., 8: 155-162. Eshed, Y.; Zamir, D. (1995). «An introgression line population of Lycopersicon pennellii in the cultivated tomato enables the identification and fine mapping of yield-associated QTL». Genetics, 141: 1147-1162. Flint-Garcia, S. A.; Thornsberry, J. M.; Buckler, E. S. (2003). «Structure of linkage disequilibrium in plants». Annu. Rev. Plant. Biol., 54: 357-374. Fridman, E.; Pleban, T.; Zamir, D. (2000). «A recombination hotspot delimits a wild-species quantitative trait locus for tomato sugar content to 484 bp within an invertase gene». Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97: 4718-4723. Garcia-Mas, J.; Graziano, E.; Aranzana, M. J.; Monforte, A.; Oliver, M.; Ballester, J.; Viruel, M. A.; Arús, P. (2000) «Marcadores de ADN: concepto, tipos, protocolos». A: Nuez, F.; Carrillo, J. M. [ed.]. Los marcadores genéticos en mejora vegetal. València: UPV: 93-151. Gottlieb, L. D. (1981). «Electrophoretic evidence and plant populations». Phytochemistry, 7: 1-45. Gupta, P. K.; Rustgi, S.; Kulwal, P. L. (2005). «Linkage disequilibrium and association studies in higher plants: present status and future prospects». Plant Molec. Biol., 57: 461-485. Jensen, R. C.; Nap, J. P. (2001). «Genetical genomics,: the added value from segregation». Trends Genet., 17: 388-391. Ku, H. M.; Liu, J. P.; Doganlar, S.; Tanksley, S. D. (2001). «Exploitation of Arabidopsis-tomato synteny

MILLORA GENÈTICA DE PLANTES ASSISTIDA AMB MARCADORS 103

to construct a high-resolution map of the ovatecontaining region in tomato chromosome 2». Genome, 44: 470-475. Lewontin, R. C. (1970). The Genetic Basis of Evolutionary Change. Nova York: Columbia University Press. Livak, K. J. (1999). «Allelic discrimination using fluorogenic probes and the 5′ nuclease assay». Genet. Anal. Tech. Appl., 14: 143–149. MacMillan, K.; Emrich, K.; Piepho, H. P.; Mullins, C. E.; Price, A. H. (2006). «Assessing the importance of genotype X environment interaction for root traits in rice using a mapping population II: conventional QTL analysis». Theor. Appl. Genet., 113: 953-964. Martin, G. B.; Brommonschenkel, S. H.; Chunwongse, J.; Frary, A.; Ganal, M. W.; Spivey, R.; Wu, T. Y.; Earle, E. D.; Tanksley, S. D. (1993). «Map-based cloning of a protein kinase gene conferring disease resistance in tomato». Science, 262: 14321436. Michelmore, R. W.; Paran, I.; Kesseli, R. V. (1991). «Identification of markers linked to disease-resistance genes by bulked segregant analysis: a rapid method to detect markers in specific genomic regions by using segregating populations». Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 1212-1217. Morgante, M.; Hanafey, M.; Powell, W. (2002). «Microsatellites are preferentially associated with nonrepetitive DNA in plant genomes». Nature Genet., 30: 194-200. Morgante, M.; Olivieri, A. M. (1993). «PCR-amplified microsatellites as markers in plant genetics». Plant J., 3: 175-182. O’Brien, S. J. (1990). Genetic maps: locus maps of complex genomes. Nova York: Cold Spring Harbor Laboratory Press. O’Donovan, M. C.; Oefner, P. J.; Roberts, S. C.; Austin, J.; Hoogendoorn, B.; Guy, C.; Speight, G.; Upadhyaya, M.; Sommer, S. S.; McGuffin, P. (1998). «Blind analysis of denaturing high-performance liquid chromatography as a tool for mutation detection». Genomics, 52: 44-49. Olsen, M.; Hood, L.; Cantor, C.; Botstein, D. (1989). «A common language for physical mapping of the human genome». Science, 245: 1434-1435. Paran, I.; Michelmore, R. W. (1993). «Development of reliable PCR-based markers linked to downy mildew resistance genes in lettuce». Theor. Appl. Genet., 85: 985-993. Paterson, A. H.; Lander, E. S.; Hewitt, J. D.; Peterson, S.; Lincoln ,S. E.; Tanksley, S. D. (1988). «Resolution of quantitative traits into Mendelian factors by using a complete linkage map of restriction fragment length polymorphisms». Nature, 335: 721-726.

Pflieger, S.; Lefebvre, V.; Causse, M. (2001). «The candidate gene approach in plant genetics: a review». Molec. Breed., 7: 275-291. Rodi, C. P.; Darnhofer-Patel, B.; Stanssens, P.; Za beau, M.; Boom, D. van der (2002). «A strategy for the rapid discovery of disease markers using the MassARRAY system». BioTechniques, 32: 62-69. Saiki, R. K.; Gelfand, D. H.; Stoffel, S.; Scharf, S. J.; Higuchi, R.; Horn, G. T.; Mullis, K. B.; Erlich, H. A. (1988). «Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA-polymerase». Science, 239: 487-491. Stam, P.; Zeven, C. (1981). «The theoretical proportion of the donor genome in near-isogenic lines of self-fertilizers bred by backcrossing». Euphytica, 30: 227-238. Southern, E. M. (1975). «Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel-electrophoresis». J. Molec. Biol., 98: 503. Tanksley, S. D. (1983) «Molecular markers in plant breeding». Plant. Molec. Biol. Rep., 1: 3-8. — (1993). «Mapping polygenes». Annu. Rev. Genet., 27: 205-233. Tanksley, S. D.; Ganal, M. W.; Martin, G. B. (1995). «Chromosome landing: a paradigm for map-based gene cloning in plants with large genomes». Trends Genet., 11: 63-68. Tanksley, S. D.; Medina-Filho, H.; Rick, C. M. (1981). «The effect of isozyme selection on metric characteris in an interspecific backcross of tomato - basis of an early screening procedure». Theor. Appl. Genet., 50: 291-296. — (1982). «Use of naturally-occurring enzyme variation to detect and map genes controlling quantitative traits in an interspecific backcross of tomato». Heredity, 49: 11-25. Tanksley, S. D.; Nelson, J. C. (1996). «Advanced backcross QTL analysis: a method for the simultaneous discovery and transfer of valuable QTLs from unadapted germplasm into elite breeding lines». Theor. Appl. Genet., 92: 59-87. Tanksley, S. D.; Orton, T. J. (1983). Isozymes in Plant Genetics and Breeding. Parts A and B. Nova York: Elsevier Science. Tanksley, S. D.; Young, N. D.; Paterson, A. H.; Bonierbale, M. W. (1989). «RFLP mapping in plant breeding: new tools for an old science». BioTechnology, 7: 257-263. Tar’an, B.; Buchwaldt, L.; Tullu, A.; Banniza, S.; Warkentin, T. D.; Vandenberg, A. (2003). «Using molecular markers to pyramid genes for resistance to ascochyta blight and anthracnose in lentil (Lens culinaris Medik)». Euphytica, 134: 223-230. Thornsberry, J. M.; Goodman, M. M.; Doebley, J.; Kresovich, S.; Nielsen, D.; Buckler, E. S. (2001).

104 P. ARÚS

«Dwarf8 polymorphisms associate with variation in flowering time». Nature Genet., 28: 286-289. Vos, P.; Hogers, R.; Bleeker, M.; Reijans, M.; Lee, T. V. D.; Hornes, M.; Frijters, A.; Pot, J.; Peleman, H.; Kuiper, M.; Zabeau, M. (1995). «AFLP: a new technique for DNA fingerprinting». Nucleic Acids Res., 2: 4407-4414. Williams, J. G. K.; Kubelik, A. R.; Livak, K. J.; Rafalski, J. A.; Tingey, W. V. (1990). «DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers». Nucleic Acids Res., 18: 6531-6535.

Yogeeswaran, K.; Frary, A.; York, T. L.; Amenta, A.; Lesser, A. H.; Nasrallah, J. B.; Tanksley, S. D.; Nasrallah, M. E. (2005). «Comparative genome analyses of Arabidopsis spp.: Inferring chromosomal rearrangement events in the evolutionary history of Arabidopsis thaliana». Genome Res., 15: 505-515. Zhang, H. B.; Wing, R. A. (1997). «Physical mapping of the rice genome with BACs». Plant Molec. Biol., 35: 115-127.

DOI: 10.2436/20.1501.02.48

Les biotecnologies (Pere Puigdomènech i Francesc Gòdia, ed.) Treballs de la SCB. Vol. 58 (2007) 105-123

APLICACIÓ DE LA BIOTECNOLOGIA A L’AQÜICULTURA Francesc Piferrer,1 Lluís Tort,2 Ana Gómez 3 i Antonio Figueras 4 Institut de Ciències del Mar, Consell Superior d’Investigacions Científiques, Barcelona. Departament de Biologia Cel·lular i de Fisiologia, Universitat Autònoma de Barcelona, Bellaterra. 3 Institut d’Aqüicultura Torre de la Sal, Consell Superior d’Investigacions Científiques, Ribera de Cabanes, Castelló. 4 Instituto de Investigaciones Marinas, Consell Superior d’Investigacions Científiques, Vigo.

Adreça per a la correspondència: Francesc Piferrer. Institut de Ciències del Mar, Consell Superior d’Investigacions Científiques. Passeig Marítim, 37-49. 08003 Barcelona. Adreça electrònica: piferrer@icm.csic.es. RESUM L’aqüicultura és cada cop més important en el proveïment de proteïna d’origen aquàtic en un món en què la pesca ha tocat sostre en el nombre de captures anuals a causa de la sobreexplotació dels oceans. A més, hi ha un augment continuat tant de la població humana com del requeriment d’aquesta proteïna d’aliments d’origen marí. En aquest context, l’aqüicultura esdevé un procés de producció d’aliments fortament tecnificat i industrialitzat. La contribució de la biotecnologia a aquest sector de l’alimentació és encara incipient però molt prometedora. Aquí es repassen les aplicacions de la biotecnologia a l’aqüicultura, algunes ja en explotació, altres encara en fase experimental. Aquestes aplicacions inclouen el control de la reproducció —selecció del sexe, producció de poliploides i línies clonals i xenotrasplantaments de la línia germinal—; el control del creixement —producció d’animals transgènics de ràpid creixement o adaptats a ambients extrems—; la prevenció de malalties —vacunes de DNA i detecció de la presència de patògens—; i el proveïment d’unes condicions de cria òptimes –monitorització de l’estat d’estrès i de les variables ambientals. Aquestes aplicacions han d’assegurar el benestar dels animals i la qualitat del producte que s’espera, tot en un context de producció sostenible i respectuosa amb el medi ambient. Paraules clau: biotecnologia, aqüicultura, control de la reproducció, transgènesi, patologia i benestar animal.

106 F. PIFERRER, L. TORT, A. GÓMEZ I A. FIGUERAS

APPLICATION OF BIOTECHNOLOGY TO AQUACULTURE SUMMARY Aquaculture is increasingly becoming more relevant for the supply of animal protein of aquatic origin in a world where capture fisheries has reached an all-time maximum in annual landings due to overfishing of the oceans. Furthermore, there is a sustained increase in both the human population and the requirement of this population for food supplies of aquatic origin. In this context, aquaculture is becoming a food sector increasingly technified and industrialized. The contribution of biotechnology to aquaculture is still incipient but it holds a great deal of promise. Here, several applications of biotechnology to aquaculture are reviewed, some of them already being applied commercially, others still in the development phase. These applications include the control of reproduction –sex control, production of polyploids and clonal lines, and xenotransplantation of the germinal line; growth control—production of transgenics for superior growth or adapted to extreme environments—; disease prevention—DNA vaccines and pathogen detection—; and the providing of optimal growth conditions—stress and environment monitoring. These applications must ensure the welfare of the farmed animals and the quality products that one expects from aquaculture, all in a context of sustainable production respectful with the environment. Key words: biotechnology, aquaculture, control of reproduction, trangenesis, pathologies and animal welfare.

INTRODUCCIÓ La continuada sobrepesca en els darrers decennis ha tingut com a conseqüència que actualment una bona part dels caladors estiguin esgotats o en vies d’esgotament. Això es tradueix en el fet que malgrat que cada cop l’esforç pesquer és més gran, el nombre de captures s’ha estancat en els darrers anys al voltant dels noranta-tres milions de tones, segons les darreres dades disponibles a través de la FAO (www.fao.org). Paral·lelament a aquest fenomen hi ha hagut, especialment en el darrer quart de segle, l’aparició d’una aqüicultura industrial i globalitzada, amb fortes inversions de capital, que ha permès fer front a la incessant demanda de productes aquàtics a tot el món. No es pot oblidar que aproximadament una sisena part de la població humana depèn de la producció

aquàtica com a principal font de proteïnes d’origen animal. En els darrers anys, l’aqüicultura ha estat i és el sector agroalimentari amb una taxa anual de creixement més elevada. Actualment subministra ja més d’un 30 % de tota la proteïna aquàtica consumida. Segons estimacions de la FAO la producció de l’aqüicultura igualarà a la de la pesca cap a l’any 2027. Beneficiant-se dels avenços en altres camps de la ciència i la tècnica, en els darrers anys s’ha començat a aplicar la biotecnologia a l’aqüicultura. Aquí és convenient esmentar que la FAO defineix la biotecnologia en dos sentits. En un sentit restringit, la defineix com ‘un ventall de diverses tecnologies moleculars, tals com la manipulació genètica, la transgènesi i el clonatge de plantes i animals’. En un sentit més ampli, i seguint les recomanacions proposades per

APLICACIÓ DE LA BIOTECNOLOGIA A L’AQÜICULTURA 107

la Convenció sobre la Diversitat Biològica (CBD, www.biodiv.org), del Programa de Medi Ambient de les Nacions Unides, la defineix com ‘qualsevol aplicació tecnològica que fa servir sistemes biològics, organismes vius o els seus derivats per fer o modificar processos per a usos específics’. En l’aqüicultura s’aplica el concepte de biotecnologia en aquest sentit més ampli. Tot i que en peixos s’han aplicat algunes modificacions per produir, per exemple, peixos ornamentals transgènics que poden emetre fluorescència segons amb la llum amb què s’il·luminen, aquí es repassen les aplicacions biotecnològiques fonamentalment encaminades a augmentar la producció d’animals aquàtics destinats al consum humà. Aquestes aplicacions biotecnològiques incideixen en diversos aspectes del cicle productiu com són, entre d’altres, el control de la reproducció, el creixement, la prevenció de malalties i el benestar animal. APLICACIONS BIOTECNOLÒGIQUES PER AL CONTROL DE LA REPRODUCCIÓ L’aqüicultura moderna intensiva implica poder tancar el cicle vital d’una espècie en captivitat per independitzar-se del medi natural com a font de cries o juvenils per a l’engreix. Això possibilita poder controlar els diferents aspectes relacionats amb la producció. Aquests inclouen la gestió dels reproductors, l’obtenció de postes i cria larvària, el subministrament d’una dieta que permeti un bon creixement, la prevenció i control de les malalties i proporcionar un ambient que minimitzi l’estrès i asseguri el millor benestar possible als animals de producció. És precisament durant la reproducció que hi ha la possibilitat d’aplicar tot un reguitzell de biotecnologies per controlar-ne diversos aspectes, que van des de la inducció hormonal a la maduració i posta

dels gàmetes mitjançant l’administració d’hormones barrejades en una matriu artificial que en permet l’alliberació lenta, la criopreservació dels gàmetes, així com la generació de línies d’un sol sexe, la inducció de poliploïdies i la selecció genètica ajudada per marcadors moleculars (Lee i Donaldson, 2001). De totes aquestes possibilitats, a continuació se n’escullen i comenten breument algunes, en funció del seu grau d’implantació i de les seves possibilitats futures. Selecció del sexe En moltes espècies de peixos, un sexe creix significativament més que l’altre i arriba a talles més grans. Encara que hi ha espècies molt importants en el context de l’aqüicultura mundial, com ara les tilàpies (Oreochromis sp.), en què els mascles creixen més, és cert que per a la majoria d’espècies cultivades, com ara el salmó de l’Atlàntic (Salmo salar), la truita irisada (Oncorhynchus mykiss), el llobarro (Dicentrarchus labrax), el turbot (Scophthalmus maximus) i el llenguado (Solea sp.), són les femelles el sexe de major creixement. Això ha propiciat que s’hagin desenvolupat protocols per a la feminització de més d’una cinquantena d’espècies d’interès comercial, en què es dóna el fenomen del creixement diferencial a favor de les femelles (Piferrer, 2001). Per a aquest fi es poden emprar tractaments amb esteroides sexuals administrats durant breus períodes a l’inici del desenvolupament, quan les gònades estan ja formades però encara sexualment indiferenciades. Amb això s’aconsegueixen peixos del sexe fenotípic que es desitja, independentment del sexe genotípic dels animals tractats. Si bé aquests tractaments directes estan perfectament regularitzats i se sap que qualsevol resta hormonal s’elimina en un termini aproximat d’unes tres setmanes després del tractament, cosa que succeeix típicament

108 F. PIFERRER, L. TORT, A. GÓMEZ I A. FIGUERAS

uns 20 mesos abans de que els peixos vagin a parar als consumidors, també és cert que per evitar qualsevol tipus de rebuig dels consumidors, les empreses, almenys en el context europeu, no fan servir aquest mètode directe de feminització. Per aquest motiu, es desenvolupà el que s’anomena mètode indirecte de feminització, el qual només es pot aplicar en espècies que presenten un sistema de determinació sexual del tipus XX (femelles) i XY (mascles) que, tot i que és bastant comú en els peixos, no és ni molt menys l’únic que presenten (Devlin i Nagahama, 2002). En aquest cas, es comença per tractar amb andrògens un grup d’animals sexualment indiferenciats durant les etapes inicials del desenvolupament, amb la qual cosa s’aconsegueix la masculinització de tota la població. Entre els mascles presents, n’hi ha que ho haguessin estat igualment a causa de la seva constitució cromosòmica (XY), però també n’hi ha, aproximadament, la meitat, que genotípicament són femelles (XX). A aquests darrers se’ls anomena neomascles. Mitjançant un test de progènie o, en alguns casos, mitjançant l’ús de sondes moleculars específiques per a regions del cromosoma Y, es poden identificar els neomascles entre tots els mascles produïts. Passat un temps, quan aquests neomascles creixen i maduren sexualment produeixen esperma que és portador exclusiu de cromosomes X, per la qual cosa, en fer-lo servir per fecundar ous produïts per femelles normals, la descendència és exclusivament formada per femelles, tant genotípicament com fenotípicament, mai tractades amb esteroides i destinades a la producció. Actualment aquest mètode s’empra, per exemple, en la producció de salmons del Pacífic (Oncorhynchus tsawytscha) al Canadà o bé de truites irisades a Escòcia i França.

Generació d’auto i al·lopoliploides Un altra tècnica interessant és la generació d’animals estèrils per millorar certs aspectes de la producció. Això s’aconsegueix amb la inducció de la poliploïdia, és a dir, la producció d’animals amb un cert nombre addicional de jocs sencers de cromosomes, en lloc del nombre habitual diploide (2n). La poliploïdia més comunament induïda és la triploïdia. Els triploides s’obtenen normalment mitjançant l’aplicació d’un xoc tèrmic o hidrostàtic administrat en els minuts immediatament posteriors a la fecundació dels ous, fet que impedeix l’extrusió del segon corpuscle polar de l’ou acabat de fecundar (Felip et al., 2001). Els animals triploides (3n) tenen tres jocs sencers de cromosomes homòlegs, cosa que no impedeix la divisió cel·lular per mitosi però sí que bloqueja la formació de gàmetes, ja que els tres jocs de cromosomes esmentats no poden aparellarse correctament durant la profase i de la meiosi, i això atura la progressió de la línia germinal durant la gametogènesi. Com que el creixement gonadal implica una certa sincronització entre el desenvolupament de la línia germinal i la somàtica, els animals triploides no solament tenen un desenvolupament gonadal molt minvat en comparació del dels diploides, sinó que també són estèrils. Això permet un millor aprofitament de l’energia obtinguda a través de l’alimentació, ja que no han d’emprar-la per a la formació de les gònades. Per tant, amb la inducció de la triploïdia s’eliminen els problemes associats a la maduració sexual, que en molts peixos cultivats acostumen a ser un menor creixement durant l’època de posta, una major susceptibilitat a les malalties i un empobriment de la qualitat de les parts comestibles. Tal com succeeix en l’agricultura moderna, la inducció de la poliploïdia s’empra com més va més en l’aqüicultura, ja sigui per augmentar la fracció comestible, tal i com es fa amb alguns mol·

APLICACIÓ DE LA BIOTECNOLOGIA A L’AQÜICULTURA 109

luscs com l’ostra japonesa (Crassostrea gigas), o bé per eliminar la maduració sexual en la truita irisada i altres peixos (Hulata, 2001). Així mateix, la inducció de la triploïdia serveix també per augmentar la viabilitat d’híbrids interespecífics que en la condició diploide presenten interessants propietats respecte a les línies parentals, però pateixen una baixa supervivència, com és el cas de l’encreuament entre el peix gat tailandès (Clarias macrocephalus) i el peix gat africà (Clarias gariepinus) (Na-Nakorn et al., 2004), i s’ha proposat com a mètode per evitar l’impacte genètic dels escapaments d’animals cultivats sobre les poblacions naturals (Piferrer et al., 2008). Producció de línies clòniques Els mateixos xocs tèrmics o hidrostàtics emprats per induir la triploïdia s’usen també per restablir la diploïdia si l’activació dels ous s’ha realitzat amb esperma prèviament irradiat amb llum ultraviolada. D’aquesta manera s’obtenen peixos ginogenètics diploides amb un cert grau d’homozigositat, depenent del grau de creuament entre cromàtides homòlogues durant la profase i (meioginogenètics). Si, per contra, el xoc tèrmic o hidrostàtic en ous prèviament fecundats amb esperma irradiat es dóna una mica més tard, el que s’aconsegueix és permetre la duplicació cromosòmica del zigot, alhora que s’impedeix la seva primera divisió cel·lular, amb la conseqüent producció d’individus ginogenètics diploides homozigots (mitoginogenètics). La inducció de la meioginogènesi en ous produïts per femelles mitoginogenètiques dóna com a resultat l’obtenció de línies clòniques. Això s’ha aconseguit en diverses espècies de peixos com ara la carpa comuna (Cyprinus carpio) amb l’objectiu de facilitar l’acceptació de trasplantaments (Komen et al., 1991), en la palaia japonesa (Paralichthys olivaceus), per

ajudar en programes de selecció genètica (Yamamoto, 1999), i en el pagre (Pagrus major) (Kato et al., 2002) i el llobarro (Bertotto et al., 2005), per estudiar la seva aplicabilitat en la selecció de caràcters d’interès per a la producció. Xenotrasplantaments de cèl·lules de la línia germinal El trasplantament de cèl·lules germinals és una eina potent principalment per a la recerca d’aspectes bàsics de la biologia reproductiva. En peixos s’han aconseguit darrerament trasplantaments tant singènics com xenogènics (Takeuchi et al., 2004). Així, s’ha aconseguit el trasplantament d’espermatogonis de tilàpia a tilàpia (gènere Oreochromis) i de truita a salmó. El xenotrasplantament pot ser útil per a la producció de cries d’espècies d’interès en aqüicultura o en perill d’extinció, fet que obre possibilitats interessants per al manteniment dels recursos genètics. Així, salmons del Pacífic (Oncorhynchus masou) prèviament esterilitzats per inducció de la triploïdia, i que actuaren de receptors, foren trasplantats mitjançant una microinjecció a la cavitat visceral d’una suspensió de cèl·lules germinals primordials obtingudes de truites (O. mykiss), que actuaren com a donants. Amb aquest procediment s’ha aconseguit recentment crear animals receptors xenogènics que produeixen cèl·lules germinals només de l’espècie donant (Okutsu i Yoshitaki, 2007). Això significa que les cèl·lules primordials germinals de truita van ser capaces de migrar a la cresta germinal del salmó, colonitzar-la, proliferar i diferenciar-se posteriorment en ous i esperma madurs. Això permeté l’obtenció de descendència viable pertanyent en exclusiva a l’espècie donant a partir de pares implantats, cosa que no s’havia aconseguit abans en cap altre vertebrat. Aquesta tècnica, amb les modificacions

110 F. PIFERRER, L. TORT, A. GÓMEZ I A. FIGUERAS

corresponents, pot tenir aplicacions molt interessants en peixos marins. Per exemple, podria contribuir significativament a la producció controlada de la tonyina (Thunnus thynnus). Actualment, la forta demanda d’aquest peix a tot al món en general i al Japó en particular, ha propiciat l’establiment de granges dedicades al seu engreix. Espanya és un dels principals llocs on es du a terme aquesta activitat nova que, per altra banda, té un impacte negatiu sobre l’ecosistema marí, ja que, a causa de la forta demanda, fomenta una sobrepesca de la tonyina a tot el Mediterrani i dels animals dels quals s’alimenta, amb el perill que això suposa per al manteniment sostenible d’un recurs tan important. Poder tancar el cicle de vida de la tonyina en captivitat facilitaria una vertadera aqüicultura, i això alleujaria la pressió sobre les poblacions naturals d’aquesta espècie. Per aconseguir això s’està treballant en el desenvolupament de tècniques per a l’obtenció controlada de gàmetes. El problema el tenim en el manteniment i maneig d’animals tan grans en instal·lacions en terra dedicades a la producció d’alevins, ja que les tonyines poden atènyer 3 m de llargada i 500 quilos de pes. Per aquest motiu ja s’està adaptant amb èxit la tècnica del trasplantament de cèl·lules germinals, originàriament desenvolupada en salmònids, en peixos marins amb ous pelàgics, concretament entre diferents gèneres de corballs (gèneres Nibea i Argyosomus). L’objectiu últim és aconseguir la producció d’ous i esperma de tonyina a partir de verats (Scomber scombrus). Aquests peixos, amb els quals es fan proves per trasplantarlos cèl·lules germinals de tonyina (Takeuchi et al., 2007), pertanyen a la mateixa família que les tonyines (escòmbrids) però només arriben als 30 cm de llargada i, per tant, són molt més fàcils de manipular. Les possibilitats que pot oferir el xenotrasplantament de cèl·lules de la línia germinal per a la pro-

ducció i conservació d’animals marins semblen, doncs, molt prometedores. BIOTECNOLOGIES D’APLICACIÓ A LA SALUT I BENESTAR DELS PEIXOS Una de les àrees relacionades amb l’aqüicultura en què s’ha incrementat de manera rellevant la demanda de biotecnologies és la de la salut i el benestar dels peixos. En els darrers anys, tant des dels organismes reguladors com dels responsables de la indústria alimentària i les cadenes de distribució, augmenta l’exigència de certificacions de procediments de benestar dels peixos, mètodes ètics de sacrifici i qualitat de les instal·lacions. Com a conseqüència, la indústria demanda als investigadors i tècnics aquelles tecnologies que permetin la monitorització dels estats d’estrès, tant pel que fa a les respostes gèniques o moleculars com en les respostes macroscòpiques immediates de comportament i rendiment. Indicadors de l’estat d’estrès, immunodepressió i vulnerabilitat als patògens En l’àmbit de la biologia molecular i la genètica la irrupció de les tecnologies «òmiques» com la genòmica, la transcriptòmica o la immunòmica, és molt recent en el camp de l’aqüicultura, però ha generat una entrada molt significativa de grups d’investigadors per intentar utilitzar la capacitat d’aquestes tecnologies per determinar patrons moleculars i genètics indicatius d’estats d’estrès, immunodepressió i vulnerabilitat als patògens. En aquesta direcció, el fet que espècies com el peix de l’arrossar japonès (Oryzias latipes), el fugu (Tetraodon sp.) o el peix zebra (Danio rerio) hagin estat adoptats com a model en els estudis biomèdics (Alestrom et al., 2006), ha significat un

APLICACIÓ DE LA BIOTECNOLOGIA A L’AQÜICULTURA 111

avantatge també per a l’estudi de la fisiologia dels peixos i les aplicacions en l’aqüicultura (Blázquez et al., 1998). Dues aproximacions biotecnològiques són les que s’han desenvolupat darrerament. En primer lloc, s’han desenvolupat diferents consorcis o projectes d’àmbit europeu i americà basats primerament en la generació de genoteques de teixits de diferents espècies d’interès aqüícola, amb la construcció posterior de microxips de DNA centrats en la determinació de patrons genètics d’estrès per poder-los aplicar a la detecció i predicció d’aquests estats en aqüicultura. Aquesta ha semblat també una de les apostes de la Unió Europea, ja que ha posat fons a disposició dels investigadors en aquesta direcció en el sisè programa marc en diferents projectes i xarxes (Aquafirst, Eurocarp, Stressgenes, Marine Genomics, Aquafunc, Aquagenome), també relacionats amb la determinació del rendiment i el benestar dels peixos; per tant, amb l’aplicació de biotecnologies per a aquesta finalitat (Wealth, Fastfish, Ethiqual, Welfish, Benefish). D’aquests projectes, els més aplicats a l’estudi de l’estrès encara no han aconseguit avenços aplicables en la indústria, encara que sí que s’han començat a publicar resultats científics a partir d’aquests consorcis (Sarropoulou et al., 2005; Douglas, 2006) o per part de grups independents (Mackenzie et al., 2006). Atès que la selecció dels gens que integren el microxip és complexa i que es necessitarien diferents xips adequats a les diferents espècies aqüícoles, el sector productiu de l’aqüicultura haurà d’esperar un temps abans de poder utilitzar aquests instruments com a diagnòstic, com a eina analítica o com a sistema de predicció d’alteracions en els cultius. La segona aproximació ha estat la de trobar gens específics que puguin ser indicadors de processos d’estrès, immunodepressió o de mal funcionament. De la mateixa manera que tenim alguns indicadors fisio-

lògics com el cortisol, pel que fa a les hormones, la glucosa o l’osmolalitat, pel que fa al metabolisme, o els valors de lisozim o complement, pel que fa al sistema immunitari, s’estan buscant indicadors genètics que podrien tenir aquest poder predictiu o marcador i que es correlacionarien significativament amb estats alterats com alta densitat, infecció, etc. En aquesta direcció de recerca/descobriment de gens específics els avenços són més tangibles i ja se n’han descrit alguns com l’enolasa, les proteïnes de xoc tèrmic (HsP90 i HsP70) o el citocrom P450, que són susceptibles de marcar alteracions sota condicions molt diverses d’estrès (Ribas et al., 2004; Gornati et al., 2005). Qualitat de l’aigua i control de patògens En altres àmbits la biotecnologia pot aportar solucions en la qualitat de l’aigua i control de patògens. Des de la biotecnologia ambiental i la toxicològica s’estan desenvolupant sensors capaços de detectar la presència de microorganismes específics especialment patogènics o virulents mitjançant microxips específics que es podrien col·locar en els punts crítics de control de l’aigua en instal·lacions d’aqüicultura, principalment de recirculació o de flux d’aigua, que permetrien una detecció incipient i una reacció ràpida (Cossins i Crawford, 2005). També respecte a la qualitat de l’aigua, s’estan desenvolupant microsensors capaços d’analitzar les característiques fisicoquímiques de l’aigua (oxigen, temperatura, CO2, salinitat, amoníac, nitrits, etc). Malgrat que aquestes són variables que es poden determinar habitualment, els sensors actuals no solen poder-les mesurar totes alhora i requereixen una mida considerable. Els nous sensors, basats en biotecnologies de membrana, permetran mesures simultànies i seran especialment útils en sistemes de recirculació i aquariologia. Addicionalment les

112 F. PIFERRER, L. TORT, A. GÓMEZ I A. FIGUERAS

tècniques de radiotransmissió o infraroigs permeten una monitorització integrada i remota d’aquestes variables. Monitoratge del medi Un dels reptes biotecnològics més demandat en la prevenció de l’estrès i el control del benestar dels peixos és el del monitoratge dels animals en el seu medi de cultiu (tancs, gàbies o estanys). En l’aqüicultura pràctica, totes aquelles tècniques que ens permetin aquest monitoratge d’una manera no invasiva seran les que més utilitat aportaran al sector. En aquest aspecte, les tecnologies de la imatge poden representar un gran avenç, perquè permeten un control no invasiu de paràmetres biològics indicadors, com poden ser l’alimentació o el comportament. La monitorització amb dispositius d’imatge submarins ja és utilitzada per al control de la ingesta dels peixos dins de les gàbies, de manera que el sistema d’administració de pinsos en les gàbies és controlat de manera retroactiva, i s’atura quan els dispositius d’imatge indiquen que els animals paren de menjar. En un futur proper es podran utilitzar per registrar comportaments alimentaris que es compararan automàticament amb patrons, siguin alterats o normals, per detectar-ne els canvis. Igualment, la presència de comportaments d’agressió i la seva comparació amb patrons normals o la monitorització eventual de presència de malformacions o ferides a través d’imatges dels peixos en el seu medi, representaran indicadors d’estrès i benestar que es podran obtenir a partir d’anàlisis informàtiques i sistemes experts provinents de registres d’imatges sense necessitat de mostreigs de sang o teixits, procediments invasius i fonts d’estrès puntual, que alteren inevitablement la població en l’extracció de les mostres, encara que sigui de manera transitòria.

Prevenció de malalties En el camp de la prevenció de les malalties i la promoció d’unes condicions de salut més robustes s’estan desenvolupant amb força les biotecnologies relacionades amb la utilització de prebiòtics i probiòtics. Els prebiòtics són substàncies, tals com certs glúcids, que s’introdueixen a través de la dieta i que estimulen el creixement de certs bacteris convenients per a l’animal, els probiòtics. També es poden utilitzar els mateixos probiòtics, que s’introdueixen tant en el medi com a través de la via digestiva, i que desplacen per competència organismes potencialment patògens. Fomentant, doncs, el creixement dels probiòtics, es pot impedir o controlar el creixement de patògens. L’ús de prebiòtics i probiòtics, que comencen a ser habituals en els suplements alimentaris per als humans, ja s’està utilitzant amb èxit amb alguns cultius de crustacis mitjançant la sembra de bacteris beneficiosos. L’avantatge està en el fet que amb la utilització d’aquesta biotecnologia en zones d’estanys on s’han cultivat gambes utilitzant aquest mètode (per exemple a Indonèsia), s’ha demostrat que disminueix significativament la mortalitat deguda a vibriosi, i al mateix temps, comparat amb estanys on s’utilitzen antibiòtics, la producció augmenta unes cinc vegades a causa d’estalviar-se l’efecte indiscriminat de l’antibiòtic. Els probiòtics poden ser de diferents gèneres bacterians amb capacitat antagonista als patògens, han de ser persistents en la microbiota intestinal i biològicament estables. Actualment s’estan provant microorganismes del tipus Lactobacillus, bacteris de l’àcid làctic, el grup del Bacillus subtilis, i els grups del Bacillus cereus i dels Vibrio, encara que aquests dos darrers presenten més dificultats perquè no són biològicament tan estables i poden intercanviar gens més fàcilment i esdevenir patògens (Carnevali et al., 2006; Balcazar et al., 2006).

APLICACIÓ DE LA BIOTECNOLOGIA A L’AQÜICULTURA 113

En aquest àmbit, un dels darrers desenvolupaments incorpora les nanotecnologies per produir nanopartícules en la fabricació de vacunes de nova generació per a peixos, i és probable que la incorporació de les nanotecnologies ajudi en processos com l’administració de molècules immunològicament actives a través de membranes biològiques, de manera que s’eviten processaments o degradacions prèvies. TRANSFERÈNCIA GÈNICA ALS PEIXOS La transferència gènica en eucariotes superiors és un dels màxims assoliments de l’aplicació de les tècniques de DNA recombinant en biotecnologia. Així, els animals transgènics són actualment una eina valuosa tant en estudis bàsics com aplicats. En els peixos els primers experiments de transferència gènica en embrions daten de mitjan anys vuitanta (Chourrout et al., 1986). Des de llavors aquesta tecnologia s’ha aplicat a diferents espècies, moltes importants en aqüicultura. La transferència gènica permet modificar les característiques hereditàries d’un animal, ja sigui introduint gens nous o reemplaçant un gen concret del genoma. Aquesta segona aproximació, coneguda com a genoanul·lació, no és factible de moment en peixos. Producció de peixos transgènics La tècnica més utilitzada per a la producció de peixos transgènics consisteix en la introducció directa del DNA exogen en l’ou fecundat (revisat a Sin, 1997). Aquest DNA ha de contenir la seqüència codificant completa del gen a expressar (transgèn), juntament amb les seqüències reguladores necessàries per a una expressió eficient. En el cas d’aplicacions biotecnològiques

és desitjable que totes aquestes seqüències provinguin també d’un peix. El procediment més utilitzat per introduir el DNA és la injecció d’aquest al citoplasma d’una cèl· lula de l’embrió, quan aquest està en estat d’una o dues cèl·lules. S’han assajat altres mètodes que permetin transferir el DNA a molts embrions alhora, com són l’electroporació o el bombardeig de micropartícules recobertes de DNA. Igualment, s’ha usat l’esperma com a portador del transgèn en el moment de la fecundació, ja sigui barrejant simplement el DNA exogen amb l’esperma, o electroporant prèviament l’esperma per introduir-hi el DNA, però en tots els casos els nivells d’integració i expressió del transgèn han estat molt més baixos que els assolits mitjançant microinjecció. Per millorar els nivells d’integració s’ha assajat amb èxit l’ús de retrovirus atenuats com a vectors per introduir el DNA, però aquest mètode no seria acceptable per desenvolupar peixos destinats al consum humà. També s’han emprat elements transponibles de peix com a vector en peix zebra i peix d’arrossar japonès. En qualsevol cas, el seu ús no està molt estès i, per tant, la injecció al citoplasma continua sent el mètode més utilitzat. Un cop introduït en una de les cèl·lules de l’embrió en desenvolupament, el DNA ha de dirigir-se al nucli i posteriorment integrar-se en el genoma de l’organisme hoste. La integració del DNA és un pas limitant en la producció d’un peix transgènic. Aquesta integració ocorre a l’atzar en qualsevol lloc del genoma; a més, no es produeix immediatament després de la injecció, sinó en etapes tardanes de l’embriogènesi, i només en algunes cèl·lules, de manera que dóna lloc a un organisme adult mosaic. Aquest mosaïcisme també s’observa en el patró d’expressió del gen introduït, ja que no totes les cèl·lules de l’organisme expressen el transgèn. A més, les molècules de DNA injectades formen concatèmers abans de la

114 F. PIFERRER, L. TORT, A. GÓMEZ I A. FIGUERAS

seva integració, i això dóna lloc a la inserció de múltiples còpies. Això afecta l’expressió del transgèn, ja que la maquinària cel·lular pot acabar desactivant aquest DNA estrany mitjançant metilació o formació d’heterocromatina. En moltes de les aplicacions dels peixos transgènics és desitjable el control temporal o espacial de l’expressió del transgèn, de manera que aquest només s’expressi en determinats teixits. Aquest control es pot aconseguir utilitzant promotors específics de teixit per dirigir l’expressió del gen exogen, tot i que en peixos hi ha encara pocs promotors caracteritzats. L’últim pas en la generació d’un peix transgènic és aconseguir la presència del gen exogen en les cèl·lules de la línia germinal, per assegurar que el transgèn passarà a la generació següent. La probabilitat que això passi és baixa, a causa de la integració tardana del DNA en el genoma, fet que resulta en una mitjana inferior al 15 % de la descendència que ha incorporat el transgèn. Aquest percentatge de transmissió pot ser fins i tot més baix (2-5 %) en animals amb cicles vitals més llargs. Tanmateix, en la segona generació transgènica ja s’obté una transmissió mendeliana. Tot i així, poden aparèixer fenòmens de silenciament de l’expressió fins i tot després de diverses generacions. Aplicacions La majoria dels estudis de transferència gènica en peixos s’han realitzat amb petits peixos d’aquari com ara el peix zebra o el peix d’arrossar japonès, i en treballs dedicats a la investigació bàsica. La facilitat de cultiu i l’elevada fecunditat d’aquests peixos model, combinat amb un temps curt de generació, els fan molt atractius per a aquest tipus d’estudis. D’altra banda, el fet que la fecundació dels ous i el desenvolu-

pament dels embrions siguin externs, junt amb la transparència dels mateixos, permet el monitoratge del desenvolupament embrionari i els ha convertit en models ideals per a estudis de biologia del desenvolupament (Wittbrodt et al., 2002; Dahm i Geisler, 2006). En l’àmbit de l’aqüicultura, les aportacions que pot oferir la transferència gènica estan relacionades amb la introducció de caràcters nous o la millora de caràcters d’interès productiu. Els esforços més importants fins al moment s’han destinat a la creació de peixos transgènics amb elevades taxes de creixement. Això s’ha aconseguit mitjançant la introducció de còpies addicionals del gen de l’hormona del creixement (GH) i l’expressió posterior d’alts nivells d’aquesta hormona. Aquesta estratègia s’ha assajat en un gran nombre d’espècies, majoritàriament salmònids. Inicialment es van usar sobretot gens de la GH de mamífers i promotors d’origen víric o de mamífers. Posteriorment, s’han utilitzat construccions de DNA amb seqüències d’origen piscícola, amb les quals s’han obtingut generalment millors resultats, a més de tenir una millor acceptació pública (Zbikowska, 2003; Fletcher et al., 2004; Hallerman et al., 2007). La resposta a l’acció de la GH ha estat molt dispar en les diferents línies desenvolupades, des d’animals que no han incrementat el seu creixement respecte als seus congèneres no transgènics, fins a augments en el creixement de més de vint vegades. Aquesta variabilitat de resposta és deguda a múltiples factors, com el tipus de construcció de DNA, al lloc d’integració i al nombre de còpies integrades. Així mateix, influeixen l’espècie receptora utilitzada i el seu patrimoni genètic (Devlin et al., 2001), ja que s’ha vist que generalment en els salmònids s’obtenen millors resultats. D’altra banda, amb un impacte tan gran sobre el creixement, cal esperar que l’expressió del gen exogen de la GH tingui altres manifestacions fisiolò-

APLICACIÓ DE LA BIOTECNOLOGIA A L’AQÜICULTURA 115

giques, a més d’influir en el comportament i benestar de l’animal. Aquesta informació és escassa o inexistent en la majoria dels casos, però aquestes qüestions han d’estudiarse si es pretén la comercialització d’alguna d’aquestes línies (Hallerman et al., 2007). També s’estan assajant altres aplicacions de la transferència gènica d’interès potencial per a l’aqüicultura, encara que aquestes es troben en un estat de desenvolupament menys avançat. Entre aquestes, la producció de salmons capaços de viure a temperatures per sota dels 0 °C, fet que ampliaria la seva àrea de cultiu a la costa atlàntica del Canadà. L’estratègia consisteix a introduir certs gens d’espècies de peixos que habiten a l’Àrtic i que codifiquen proteïnes anticongelants que protegeixen el peix dels efectes de la congelació. Els salmons transgènics produïts fins al moment no mostren resistència a la congelació, a causa dels baixos nivells de proteïna anticongelant que produeixen (Zbikowska, 2003; Fletcher et al., 2004). D’altra banda, l’ús d’aquests gens s’ha assajat amb èxit en la carpa vermella (Carassius auratus) per produir espècies tolerants a aigües fredes. Això beneficiaria el cultiu de carpa comuna a la Xina o de la tilàpia a Israel, països on les temperatures hivernals són properes als límits fisiològics d’aquestes espècies (Maclean, 2003). A causa de la dificultat de generar peixos transgènics en la majoria d’espècies comercials, la tendència actual és usar prèviament espècies model per assajar la viabilitat de certes aplicacions. En aquest sentit s’han fet assaigs per millorar la resistència a patògens bacterians en diferents espècies model, mitjançant l’expressió de certes proteïnes antibacterianes d’ampli espectre, com el lisozim o les cecropines (Yazawa et al., 2006). Igualment, s’ha usat la transferència gènica per modificar el metabolisme dels peixos. Així, s’han desenvolupat peixos d’arrossar japonès amb una fitasa fúngica que, a diferència de les no transgè-

niques, poden aprofitar el fòsfor en forma de fitat contingut als pinsos d’alimentació. En aquesta mateixa línia, s’han desenvolupat peixos zebra transgènics amb els gens codificants de diferents enzims de la ruta de biosíntesi d’àcid eicosapentanoic (EPA) i àcid docosahexanoic (DHA), àcids grassos beneficiosos per a la salut humana, per elevar el contingut d’aquests àcids grassos en aquests animals (Alimuddin et al., 2007). D’altra banda, la utilització de peixos transgènics com a biofactories per a la producció de proteïnes amb interès terapèutic o industrial ampliaria considerablement les aplicacions de l’aqüicultura. Actualment, Maclean et al. (2002) estan treballant amb tilàpies transgèniques per a la producció del factor vii de coagulació humà. Aquesta proteïna s’usa per al tractament de l’hemofília, i la seva obtenció tradicional a partir de plasma humà està en desús. La producció en tilàpies d’aquest factor tindria un menor cost i un major rendiment que el sistema actual in vitro (Hwang et al., 2004). A més, s’estan desenvolupant tilàpies transgèniques que expressen insulina humana per utilitzar els seus corpuscles de Brockman en trasplantaments per a diabètics. Els trasplantaments ja realitzats en ratolí han mostrat la viabilitat d’aquesta estratègia (Alexander et al., 2006). S’ha de destacar que no sempre s’intenta l’expressió elevada d’un gen; també s’ha intentat bloquejar l’expressió d’un gen endogen mitjançant tecnologia antisentit. Aquesta estratègia s’ha aplicat en la truita irisada per bloquejar l’acció de l’hormona alliberadora de la gonadotrofina (GnRH‑III), per obtenir animals estèrils. Encara que es va aconseguir disminuir la producció de GnRH-III endògena, aquesta estratègia no va tenir èxit, ja que els peixos igualment van assolir la maduració sexual. Aquesta mateixa aproximació s’està assajant en tilàpia i carpa, sense dades concloents encara (Maclean, 2003; Zbikowska, 2003).

116 F. PIFERRER, L. TORT, A. GÓMEZ I A. FIGUERAS

De l’esmentat anteriorment es desprèn que la majoria de les aplicacions de la transgènesi en peixos està en fase de desenvolupament, i continua relegada exclusivament a la investigació. Això es deu fonamentalment a dues raons: la necessitat de tenir un coneixement més profund de l’acció dels gens, i la falta d’una tècnica veritablement eficaç per a la producció de transgènics, especialment en espècies d’interès en aqüicultura. Tot i així, ja hi ha al mercat peixos transgènics. L’empresa GloFish comercialitza, com a peixos ornamentals per a aquariofília, peixos zebra transgènics que contenen diferents variants d’una proteïna fluorescent (http://www.glofish.com). D’altra banda, Aqua Bounty Technologies Inc. intenta comercialitzar sota el nom de salmó AquAdvantage un salmó atlàntic transgènic per a GH. Aquesta petició es troba en procés de revisió per part de la Food and Drug Administration dels EUA (Fletcher et al., 2004). Tots aquests treballs han suscitat molt interès, però també han alertat sobre l’aparició de riscs derivats del seu ús. Aquests inclouen riscs mediambientals per la possibilitat d’escapada d’animals transgènics, prevenció per part del consumidor, així com problemes ètics per la manipulació del genoma d’animals (Einsiedel, 2005; Kapuscinski, 2005). GENÒMICA, IMMUNOLOGIA I MALALTIES DE PEIXOS EN AQÜICULTURA Sistema immunitari de peixos teleostis La resposta immunitària implica el reconeixement del patogen o material estrany seguit del desenvolupament d’una resposta per eliminar-lo. Els peixos teleostis són, en termes evolutius, el grup animal més pri-

mitiu amb un sistema immunitari complet. Presenten mecanismes de defensa inespecífics i específics similars als dels mamífers. Malgrat que aquests animals estan en íntim contacte amb el seu ambient, el qual, generalment, té grans concentracions de microorganismes, en condicions normals el peix es manté en bon estat de salut, i es defensa contra aquests invasors potencials mitjançant un sistema complex de mecanismes de defensa. Aquests mecanismes poden dividir-se en inespecífics o innats i en específics o adaptatius. Encara que és habitual a l’hora de descriure el sistema immunitari fer aquesta divisió, cada vegada hi ha més evidències tant en peixos com en mamífers que ambdós mecanismes es combinen per mantenir un màxim nivell d’immunocompetència. La resposta innata generalment precedeix l’adaptativa, activa i determina la naturalesa d’aquesta última i coopera en el manteniment de l’homeòstasi. Els mecanismes de defensa inespecífics engloben aquells que es desencadenen sense necessitat d’un contacte previ o un reconeixement anterior de l’agent invasor, i donen una resposta ràpida davant una gran varietat d’estímuls. La immunitat innata es caracteritza per presentar una sèrie de receptors de reconeixement de patrons codificats en la línia germinal, els quals reconeixen dos tipus de patrons moleculars (Magnadóttir, 2006), els associats a patògens (PAMP) com les glicoproteïnes i lipopolisacàrids (LPS) de bacteris i fongs, DNA bacterià i RNA víric. Els mecanismes de defensa específics només es troben en els vertebrats i es desencadenen davant un estímul concret amb què l’operador ha tingut contacte anteriorment. Aquesta resposta, que millora amb la trobada successiva amb el mateix patogen, és altament específica per a un patogen particular, de tal manera que el reconeixement d’epítops antigènics és pràcticament il·limitat. Per tant, les dues característiques més importants de la res-

APLICACIÓ DE LA BIOTECNOLOGIA A L’AQÜICULTURA 117

posta immunitària adaptativa són l’especificitat i la memòria. Clonatge de gens relacionats amb la resposta immunitària en peixos La major part dels estudis de biologia molecular aplicada a l’estudi de la resposta immunitària de peixos se centren en el clonatge i caracterització de gens individuals, la seva seqüència completa, les relacions evolutives respecte a altres espècies, l’anàlisi de la seva expressió, etc., encara que recentment s’ha iniciat l’estudi de l’expressió simultània de gens (Goetz et al., 2004b; MacKenzie et al., 2006; Martin et al., 2006). Els salmònids, especialment la truita irisada, és el grup a què s’ha dedicat més atenció en l’estudi de les bases moleculars de la resposta immunitària. Entre altres gens, s’han seqüenciat i realitzat estudis d’expressió de l’IL-1, l’IL-6, l’IL-11, l’IL-18 i el TNF-α (Koussounadis et al., 2004; Zou et al., 2004; Roca et al., 2007). A causa de la importància de les malalties d’etiologia vírica també s’han estudiat l’interferó i gens relacionats com l’Mx, dos TLR (Rebl et al., 2007); factors reguladors d’IFN (IRF) (Collet et al., 2003); proteïnes Mx (Trobridge i Leong, 1995; Trobridge et al., 1997; Collet et al., 2007), un factor activador de macròfags del tipus IFN-γ (Graham i Secombes, 1988, 1990) i s’han realitzat clonatges, estudis d’expressió i d’organització gènica de la sintasa induïble de NO (iNOS) (Wang et al., 2001). A més, s’han seqüenciat i realitzat estudis d’expressió de diversos gens de pèptids antimicrobians (Zou et al., 2007), dels factors del complement C4 i molècules de tipus C1, de les anafilatoxines C3a (Boshra et al., 2004; Rotllant et al., 2004) i de diverses quimiocines tals com una CXC del tipus CXCL8 (Laing et al., 2002a) i una altra amb homologia del subgrup CXCL9, CXCL10, CXCL11, de la qual semblen existir

dues formes i que és induïda en infeccions víriques (Laing et al., 2002b; O’Farrell et al., 2002). També s’han caracteritzat dues quimiocines CC, CK1 (Dixon et al., 1998) i CK2 (Liu et al., 2002). També de diverses lectines i els seus receptors i una proteïna associada al receptor de l’IL-1 (Stansberg et al., 2005). S’han clonat dos isotips de la immunoglobulina IgM (Hordvik et al., 1992) i l’isotip IgD (Hordvik et al., 1999). No són gaires els gens amb possible funció immunitària caracteritzats en espècies comercials d’interès a Espanya, si ho comparem amb el que s’ha fet en salmònids, ja que el progrés en aquest camp és molt recent. Vacunes de DNA Les malalties d’origen víric són un dels problemes amb major impacte en el desenvolupament de l’aqüicultura, ja que generalment provoquen unes altes mortalitats i no existeixen tractaments eficaços ni vacunes. La vacunació seria el mètode més eficaç per controlar l’impacte d’aquestes malalties; tanmateix, per a molts dels virus més devastadors, les vacunes tradicionals (vacunes atenuades, mortes) o la vacunació amb antígens vírics han resultat ineficaces. Dins d’aquest context, la vacunació genètica representa en aquests moments l’opció més viable. Amb aquest tipus de vacunes, en lloc d’injectar l’antigen s’injecta la seqüència de DNA que el codifica, juntament amb regions reguladores i cofactors (per exemple, perquè la vacuna s’expressi en un determinat teixit). Des de fa uns anys, s’està experimentant amb les vacunes de DNA per a molts d’aquests patògens, amb resultats positius. La major part de les vacunes de DNA desenvolupades en l’àmbit de la piscicultura són per a rabdovirus, els virus de peixos amb major repercussió en l’aqüicultura continental, i entre els quals

118 F. PIFERRER, L. TORT, A. GÓMEZ I A. FIGUERAS

es troben el virus de la necrosi hematopoètica infecciosa (IHNV) i el virus de la septicèmia hemorràgica vírica (VHSV). Tanmateix, fins que no es resolguin alguns problemes associats amb aquestes vacunes de DNA, com són els aspectes relacionats amb la seguretat o rendibilitat econòmica, aquestes no estaran disponibles per al sector (Takano et al., 2004). Genoteques de marques de seqüència expressada. Hibridació substractiva supressora La producció de marques (o etiquetes) de seqüència expressada (EST, segons la sigla anglesa), ja sigui de manera directa a partir d’òrgans relacionats amb la funció que s’investiga, o mitjançant la hibridació substractiva supressora (SSH, també segons la sigla anglesa) (Bayne et al., 2001; Alonso i Leong, 2002; Blum et al., 2004; Tsoi et al., 2004), ha generat múltiples bases de dades amb centenars o milers de gens, que constitueixen al seu torn la plataforma necessària per a la construcció de xips de DNA. Els salmònids, com es va veure en l’apartat anterior, són els peixos en els quals s’ha avançat més en l’aplicació d’eines de genòmica. Un consorci de grups del Canadà, França, Noruega i els EUA van preparar més de cent setanta-cinc genoteques de cDNA a partir d’una àmplia varietat de teixits en diferents estats de desenvolupament, en les quals s’han obtingut més de tres-centes mil seqüències de cDNA de salmònids. Aquestes seqüències s’han organitzat en quaranta mil contigs únics (un contig és un conjunt de segments de DNA sobreposats derivats del mateix origen que, sumats, donen una seqüència contigua de consens). Es va construir un xip de 3.557 cDNA i s’està emprant per aconseguir noves dades en l’estudi de la resposta de cèl·lules i teixits a contaminants, malalties i estrès, així com per a reproduc-

ció i desenvolupament. Utilitzant aquests resultats com a base s’ha construït un xip de DNA de mida major que comprèn 16.006 gens i que s’ha emprat per detectar patrons d’expressió gènica davant infeccions experimentals i canvis ambientals i fisiològics a petita escala (Rise et al., 2004b; Schalburg et al., 2005). Xips de DNA Els xips de DNA (microxips) són plataformes físiques (normalment portaobjectes de vidre) amb gens o seqüències de gens impresos, que permeten l’anàlisi simultània de l’expressió de cents o milers de seqüències gèniques. L’estudi d’aquests perfils d’expressió en teixits o barreges de cèl·lules d’interès constitueix la base de la genòmica funcional. Una de les primeres utilitzacions publicades de xips de DNA per a l’estudi de les malalties de peixos, a fi d’entendre l’expressió de gens davant d’una infecció, es va basar en l’ús de xips de cDNA humans (Tsoi et al., 2003). En aquest experiment es va determinar l’expressió en fetges de salmó atlàntic infectats amb Aeromonas salmonicida, i comparant-los amb peixos sans, Rise et al. (2004a) van emprar els xips de DNA preparats a partir de les EST descrites anteriorment per determinar la modulació de la infecció de Piscirickettsia salmonis de gens de macròfags i del teixit hematopoètic del ronyó. Aquests resultats van ser validats posteriorment amb RT-PCR. Els patrons moleculars de la infecció amb P. salmonis podrien ajudar el desenvolupament de vacunes i de tractaments anti Piscirickettsia. MacKenzie et al. (2006) van emprar un altre xip de DNA de salmònids desenvolupat per Krasnov et al. (2005), amb el qual van estudiar la capacitat del cortisol per modular la resposta de transcripció dels macròfags de truita irisada davant l’LPS. Els resultats van indicar que el cortisol inhibeix

APLICACIÓ DE LA BIOTECNOLOGIA A L’AQÜICULTURA 119

significativament la inducció de l’expressió de TNF-α-2, una citocina proinflamatòria. Gerwick et al. (2007) van emprar un xip d’«oligos» per estudiar els perfils d’expressió gènica en el procés d’inflamació de fetges de truites irisades injectades amb bacterina de Listonella (Vibrio) anguillarum en adjuvant incomplet de Freund. Les anàlisis amb xips de DNA van determinar que la variabilitat individual era molt elevada, probablement com a conseqüència de la gran variabilitat en la resistència a malalties. La resposta antivírica va ser avaluada mitjançant l’ús de xips de DNA en la palaia japonesa per Byon et al. (2005). Aquests autors van comprovar que gens immunitaris no específics, tals com el receptor MIPI1-a de les cèl·lules NK i de Kupfer o la proteïna Mx1, se sobreexpressaven davant la vacunació amb una vacuna integrada per la proteïna G de VHSV els dies 1 i 3 postimmunització. Dios et al. (2007) van estudiar els perfils d’expressió gènics de la daurada (Sparus aurata) en resposta a infeccions de nodavirus. Per a això van emprar la tècnica de SSH per generar genoteques de cDNA sostretes expressades el dia 1 postinfecció. Alguns dels gens pertanyien a les categories funcionals d’estrès i de sistema immunitari. Per comprovar la modulació dels perfils d’expressió, es van prendre mostres els dies 1, 3 i 7 postinfecció, que es van hibridar en un macroxip amb 765 gens construït a partir de productes de PCR amb més de tres-cents parells de bases, procedents dels gens de la genoteca forward (385 gens) i reverse (380) de la SSH. Es van detectar canvis significatius en l’expressió de gens relacionats amb la resposta immunitària antivírica. CONCLUSIONS Algunes aplicacions biotecnològiques ja s’empren avui en l’aqüicultura com, per exemple, la generació de línies poliploides

en diversos llocs del món o les línies clonals de peixos plans al Japó. Fa poc l’empresa Novartis ha presentat una vacuna de DNA que funciona contra el virus IHN en el salmó atlàntic, anomenada Apex-IHN, l’ús de la qual potser no tardarà a estendre’s. Altres aplicacions biotecnològiques en l’aqüicultura són tècnicament possibles, però encara cal una avaluació més completa de les seves possibles implicacions. Aquest seria el cas de la producció de peixos transgènics per millorar diferents aspectes de la producció, com ara el creixement o la resistència a ambients adversos o a certs patògens. Altres aplicacions, com ara el trasplantament de la línia germinal, requereixen encara més recerca abans que el seu ús pugui ser compatible amb una viabilitat no solament tècnica sinó també econòmica. Un millor coneixement de la genètica i fisiologia de les espècies importants en aqüicultura és un requisit previ a l’aplicació de la biotecnologia en sentit ampli per a la millora de la producció. S’espera que en el futur això contribuirà a l’obtenció d’espècies o varietats amb les millors característiques de creixement, reproducció i resistència a malalties i estrès. Això facilitarà que l’aqüicultura compleixi el paper que li tocarà fer de manera cada cop més evident, és a dir, com a garant per al subministrament de proteïna animal d’origen aquàtic en un món cada cop més globalitzat i poblat. BIBLIOGRAFIA Aleström, P.; Holter, J. L.; Nourizadeh-Lillabadi, R. (2006). «Zebrafish in functional genomics and aquatic biomedicine». Trends Biotech., 24: 15-21. Alexander, E. L. R.; Dooley, K. C.; Pohajdak, B.; Xu, B. Y.; Wright, J. R. (2006). «Things we have learned from tilapia islet xenotransplantation». Gen. Comp. Endocrinol., 148: 125-131. Alimuddin; Yoshizaki, G.; Kiron, V.; Satoh, S.; Takeuchi, T. (2007). «Expression of masu salmon delta5-desaturase-like gene elevated EPA and DHA

120 F. PIFERRER, L. TORT, A. GÓMEZ I A. FIGUERAS

biosynthesis in zebrafish». Mar. Biotechnol., 9: 92100. Alonso, M.; Leong, J. A. (2002). «Suppressive subtraction libraries to identify interferon-inducible genes in fish. Mar. Biotechnol., 4: 74-80. Balcazar J. L.; Blas, I. D.; Ruiz-Zarzuela, I.; Cunningham, D.; Vendrell, D.; Muzquiz, J. L. (2006). «The role of probiotics in aquaculture». Vet. Microbiol., 114: 173-186. Bayne, C. J.; Gerwick, L.; Fujiki, K.; Nakao, M.; Yano, T. (2001). «Immune-relevant (including acute phase) genes identified in the livers of rainbow trout, Oncorhynchus mykiss, by means of suppression subtractive hybridization». Dev. Comp. Immunol., 25: 205-217. Bertotto, D.; Cepollaro, F.; Libertini, A.; Barbaro, A., Francescon, A.; Belvedere, P.; Barbaro, J.; Colombo, L. (2005). «Production of clonal founders in the European sea bass, Dicentrarchus labrax L., by mitotic gynogenesis». Aquaculture, 246: 115-124. Blázquez, M.; Bosma, P. T.; Fraser, E. J.; Look, K. J. W. van; Trudeau, V. L. (1998). «Fish as models for the neuroendocrine regulation of reproduction and growth». Comp. Biochem. Physiol., Part C, 119: 345-364. Blum, J. L.; Knoebl, I.; Larkin, P.; Kroll, K. J.; Denslow, N. D. (2004). «Use of suppressive subtractive hybridization and cDNA arrays to discover patterns of altered gene expression in the liver of dihydrotestosterone and 11-ketotestosterone exposed adult male largemouth bass (Micropterus salmoides)». Mar. Environ. Res., 58: 565-569. Boshra, H.; Gelman, A. E.; Sunyer, J. O. (2004). «Structural and functional characterization of complement C4 and C1s-like molecules in teleost fish: insights into the evolution of classical and alternative pathways». J. Immunol., 173: 349-359. Byon, J. Y.; Ohira, T.; Hirono, I,; Aoki, T. (2005). «Use of a cDNA microarray to study immunity against viral hemorrhagic septicemia (VHS) in Japanese flounder (Paralichthys olivaceus) following DNA vaccination». Fish Shellfish Immunol., 18: 135-147. Carnevali, O.; Vivo, L. de; Sulpizio, R.; Gioacchini, G.; Olivotto, I.; Silvi, S.; Cresci, A. (2006). «Growth improvement by probiotic in European sea bass juveniles (Dicentrarchus labrax L.), with particular attention to IGF-1, myostatin and cortisol gene expression». Aquaculture, 258: 430-438. Collet, B.; Hovens, G. C.; Mazzoni, D.; Hirono, I.; Aoki, T.; Secombes, C. J. (2003). «Cloning and expression analysis of rainbow trout Oncorhynchus mykiss interferon regulatory factor 1 and 2 (IRF-1 and IRF-2)». Dev. Comp. Immunol., 27: 111-126. Collet, B.; Munro, E. S.; Gahlawat, S.; Acosta, F.; Garcia, J.; Roemelt, C.; Zou, J.; Secombes, C. J.;

Ellis, A. E. (2007). «Infectious pancreatic necrosis virus suppresses type I interferon signalling in rainbow trout gonad cell line but not in Atlantic salmon macrophages». Fish Shellfish Immunol., 22: 44-56. Cossins, A. R.; Grawford, D. L. (2005). «Fish as models for environmental genomics». Nat. Rev. Gen., 6: 324-333. Chourrout, D.; Guyomard, R.; Houdebine, L. M. (1986). «High efficiency gene transfer in rainbow trout (Salmo gairdneri Rich.) by microinjection into egg cytoplasm». Aquaculture, 51: 143-150. Dahm, R.; Geisler, R. (2006). «Learning from small fry: The zebrafish as a genetic model organism for aquaculture fish species». Mar. Biotechnol., 8: 329345. Devlin, R. H.; Biagi, C. A.; Yesaki, T. Y.; Smailus, D. E.; Byatt, J. C. (2001). «Growth of domesticated transgenic fish». Nature, 409: 781-782. Devlin, R. H.; Nagahama, Y. (2002). «Sex determination and sex differentiation in fish: an overview of genetic, physiological, and environmental influences». Aquaculture, 208: 191-364. Dios, S.; Poisa-Beiro, L.; Figueras, A.; Novoa, B. (2007). «Suppression subtraction hybridization (SSH) and macroarray techniques reveal differential gene expression profiles in brain of sea bream infected with nodavirus». Mol. Immunol., 44: 2195-2204. Dixon, B.; Shum, B.; Adams, E. J.; Magor, K. E.; Hedrick, R. P.; Muir, D. G.; Parham, P. (1998). «CK-1, a putative chemokine of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss)». Immunol. Rev., 166: 341-348. Douglas, S. E. (2006). «Microarray studies of gene expression in fish». Omics, 10: 474-489 Einsiedel, E. F. (2005). «Public perceptions of transgenic animals». Rev. Sci. Tech. OIE, 24: 149-157. Felip, A.; Zanuy, S.; Carrillo, M.; Piferrer, F. (2001). «Induction of triploidy and gynogenesis in teleost fish with emphasis on marine species». Genetica, 111: 175-195. Fletcher, G. L.; Shears, M. A.; Yaskowiak, E. S.; King, M. J.; Goddard, S. V. (2004). «Gene transfer: potential to enhance the genome of Atlantic salmon for aquaculture». Aust. J. Exp. Agr., 44: 1095-1100. Gerwick, L.; Corley-Smith, G.; Bayne, C. J. (2007). «Gene transcript changes in individual rainbow trout livers following an inflammatory stimulus». Fish Shellfish Immunol., 22: 157-171. Goetz, F. W.; Iliev, D. B.; Mccauley, L. A.; Liarte, C. Q.; Tort, L. B.; Planas, J. V.; Mackenzie, S. (2004b). «Analysis of genes isolated from lipopolysaccharide-stimulated rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) macrophages». Mol. Immunol., 41: 1199-1210. Gornati, R.; Papis, E.; Rimoldi, S.; Chini, V.; Terova, G.; Prati, M.; Saroglia, M.; Bernardini, G. (2005).

APLICACIÓ DE LA BIOTECNOLOGIA A L’AQÜICULTURA 121

«Molecular markers for animal biotechnology: sea bass (Dicentrarchus labrax, L.) HMG-CoA reductase mRNA». Gene, 344: 299-305. Graham, S.; Secombes, C. J. (1988). «The production of a macrophage-activating factor from rainbow trout Salmo gairdneri leucocytes». Immunology, 65: 293-297. Graham, S.; Secombes, C. J. (1990). «Do fish lymphocytes secrete interferon-gamma?» J. Fish Biol., 36: 563-573. Hallerman, E. M.; Mclean, E.; Fleming, I. A. (2007). «Effects of growth hormone transgenes on the behaviour and welfare of aquacultured fishes: A review identifying research needs». Appl. Anim. Behav. Sci., 104: 265-294. Hordvik, I.; Thevarajan, J.; Samdal, I.; Bastani, N.; Krossoy, B. (1999). «Molecular cloning and phylogenetic analysis of the Atlantic salmon immunoglobulin D gene». Scand. J. Immunol., 50: 202-210. Hordvik, I.; Voie, A. M.; Glette, J.; Male, R.; Endresen, C. (1992). «Cloning and sequence analysis of two isotypic IgM heavy chain genes from Atlantic salmon, Salmo salar L.». Eur. J. Immunol., 22: 29572962. Hulata, G. (2001). «Genetic manipulations in aquaculture: a review of stock improvement by classical and modern technologies». Genetica, 111: 155173. Hwang, G. L.; Muller, F.; Rahman, M. A.; Williams, D. W.; Murdock, P. J.; Pasi, K. J.; Goldspink, G.; Farahmand, H.; Maclean, N. (2004). «Fish as bioreactors: Transgene expression of human coagulation factor VII in fish embryos». Mar. Biotechnol., 6: 485-492. Kapuscinski, A. (2005). «Current scientific understanding of the environmental biosafety of transgenic fish and shellfish». Rev. Sci. Tech. OIE, 24: 309-322. Kato, K.; Hayashi, R.; Yuasa, D.; Yamamoto, S.; Miya shita, S.; Murata, O.; Kumai, H. (2002). «Production of cloned red sea bream, Pagrus major, by chromosome manipulation». Aquaculture, 207: 19-27. Komen, J.; Bongers, A. B. J.; Richter, C. J. J.; Muiswinkel, W. B. van; Huisman, E. A. (1991). «Gynogenesis in common carp (Cyprinus carpio). 2. The production of homozygous gynogenetic clones and F1 hybrids». Aquaculture, 92: 127-142. Koussounadis, A. I.; Ritchie, D. W.; Kemp, G. J.; Secombes, C. J. (2004). «Analysis of fish IL-1beta and derived peptide sequences indicates conserved structures with species-specific IL-1 receptor binding: implications for pharmacological design». Curr. Pharm. Design, 10: 3857-3871. Krasnov, A.; Koskinen, H.; Rexroad, C.; Afanasyev, S.; Molsa, H.; Oikari, A. (2005). «Transcriptome responses to carbon tetrachloride and pyrene in

the kidney and liver of juvenile rainbow trout (Oncorhynchus mykiss)». Aquat. Toxicol., 74: 70-81. Laing, K. J.; Bols, N.; Secombes, C. J. (2002b). «A CXC chemokine sequence isolated from the rainbow trout Oncorhychus mykiss resembled the closely related interferon-g inducible chemokines CXCL9, CXCL10 and CXCL11». Eur. Cytokine Netw., 13: 462473. Laing, K. J.; Zou, J. J.; Wang, T. [et al.] (2002a). «Identification and analysis of an interleukin 8-like molecule in rainbow trout Oncorhynchus mykiss». Dev. Comp. Immunol., 26: 433-444. Lee, C. S.; Donaldson, E. M. (2001). Reproductive Biotechnology in Finfish Aquaculture. Amsterdam: Elsevier. Liu, L.; Fujiki, K.; Dixon, B.; Sundick, R. S. (2002). «Cloning of a novel rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) CC chemokine with a fractalkine-like stalk and a TNF decoy receptor using cDNA fragments containing Au-rich elements». Cytokine, 17: 71-81. Mackenzie, S.; Iliev, D.; Liarte, C.; Koskinnen, H.; Planas, J. V.; Goetz, F. W.; Molsa, H.; Krasnov, A.; Tort, L. (2006). «Transcriptional analysis of LPS-stimulated activation of trout (Oncorhynchus mykiss) monocyte/macrophage cells in primary culture treated with cortisol». Mol. Immunol., 43: 1340-1348. Maclean, N. (2003). «Genetically modified fish and their effects on food quality and human health and nutrition». Trends Food Sci. Tech., 14: 242-252. Maclean, N.; Rahman, M. A.; Sohm, F.; Hwang, G.; Iyengar, A.; Ayad, H.; Smith, A.; Farahmand H. (2002). «Transgenic tilapia and the tilapia genome». Gene, 295: 265-277. Magnadóttir, B. (2006). Innate immunity of fish (overview)». Fish Shellfish Immunol., 20: 137-151. Martin, S. A.; Blaney, S. C.; Houlihan, D. F.; Secombes, C. J. (2006). «Transcriptome response following administration of a live bacterial vaccine in Atlantic salmon (Salmo salar)». Mol. Immunol., 43: 1900-1911. Na-Nakorn, U.; Rangsin, W.; Boon-Ngam, J. (2004) «Allotriploidy increases sterility in the hybrid between Clarias macrocephalus and Clarias gariepinus». Aquaculture, 237: 73-88. O’farrell, C.; Vaghefi, N.; Cantonnet, M.; Buteau, B.; Boudinot, P.; Benmansour, A. (2002). «Survey of transcript expression in rainbow trout leukocytes reveals a major contribution of interferon-responsive genes in the early response to a rhabdovirus infection». J. Virol., 76: 8040-8049. Okutsu, T.; Yoshitaki., G. (2007). «Production of all donor-derived offspring from surrogate parents by interspecies transplantation of spermatogonia

122 F. PIFERRER, L. TORT, A. GÓMEZ I A. FIGUERAS

using sterile triploid recipient». A: Roudaut, G.; Labbé, C.; Bobe, J. [ed.]. 8th International Symposium on Reproductive Physiology of Fish. Univ. de Rennes: 58. Piferrer, F. (2001). «Endocrine sex control strategies for the feminization of teleost fish». Aquaculture, 197: 229-281. Piferrer, F.; Beaumont, A.; Falguère, J. C.; Flajshans, M.; Haffray, P.; Colombo, L. (2008). «The use of induced polyploidy in the aquaculture of bivalves and fish for performance improvement and genetic containment». Aquaculture. [En premsa] Rebl, A.; Siegl, E.; Kollner, B.; Fischer, U.; Seyfert, H. M. (2007). «Characterization of twin toll-like receptors from rainbow trout (Oncorhynchus mykiss): Evolutionary relationship and induced expression by Aeromonas salmonicida salmonicida». Dev. Comp. Immunol., 31: 499-510. Ribas, L.; Planas, J. V.; Barton, B.; Monetti, C.; Bernardini, G.; Saroglia, M.; Tort, L.; Mackenzie, S. (2004). «A differentially expressed gene isolated from the gilthead sea bream (Sparus aurata) under high-density conditions is up-regulated in brain after in vivo lipopolisaccharide challenge». Aquaculture, 241: 195-206. Rise, M. L.; Jones, S. R. M.; Brown, G. D.; Shalburg, K. R. von; Davidson; W. S.; Koop, B. F. (2004a). «Microarray analyses identify molecular biomarkers of Atlantic salmon macrophage and hematopoietic kidney response to Piscirickettsia salmonis infection». Physiol. Genomics, 20: 21-35. Rise, M. L.; Schalburg, K. R. von; Brown, G. D. [et al.] (2004b). «Development and application of a salmonid EST database and cDNA microarray: data mining and interspecific hybridization characteristics». Genome Res., 14: 478-490. Roca, F. J.; Cayuela, M. L.; Secombes, C. J.; Meseguer, J.; Mulero, V. (2007). «Post-transcriptional regulation of cytokine genes in fish: A role for conserved AU-rich elements located in the 3′-untranslated region of their mRNAs». Mol. Immunol., 44: 472-478. Rotllant, J.; Parra, D.; Peters, R.; Boshra, H.; Sunyer, J. O. (2004). «Generation, purification and functional characterization of three C3a anaphylatoxins in rainbow trout: role in leukocyte chemotaxis and respiratory burst». Dev. Comp. Immunol., 28: 815-828. Sarropoulou, E.; Kotoulas, G.; Power, D. M.; Geisler, R. (2005). «Gene expression profiling of gilthead sea bream during early development and detection of stress-related genes by the application of cDNA microarray technology». Physiol. Genomics, 23: 182-191. Schalburg, K. R. von; Rise, M. L.; Cooper, G. A.; Brown, G. D.; Gibbs, A. R.; Nelson, C. C.; Davidson,

K. W. S.; Koop, B. F. (2005). «Fish and chips: various methodologies demonstrate utility of a 16,006-gene salmonid microarray». BMC Genomics, 6: 126. Sin, F. Y. T. (1997) «Transgenic fish». Rev. Fish Biol. Fisher., 7: 417-441. Stansberg, C.; Subramaniam, S.; Collet, B.; Secombes, C. J.; Cunningham, C. (2005). «Cloning of the Atlantic salmon (Salmo salar) IL-1 receptor associated protein». Fish Shellfish Immunol., 19: 53-65. Takano, T.; Iwahori, A.; Hirono, I.; Aoki, T. (2004). «Development of a DNA vaccine against hirame rhabdovirus and analysis of the expression of immune-related genes after vaccination». Fish Shellfish Immunol., 17: 367-374. Takeuchi, Y.; Higuchi, K.; Nagasawa, K.; Yoshizaki, G. (2007). «Interspecies transplantation of spermatogonia in marine teleosts». A: Roudaut, G.; Labbé, C.; Bobe, J. [ed.]. 8th International Symposium on Reproductive Physiology of Fish. Univ. de Rennes: 188. Takeuchi, Y.; Yoshizaki, G.; Takeuchi, T. (2004). «Surrogate broodstock produces salmonids». Nature, 430, 629-630. Trobridge, G. D.; Chiou, P. P.; Leong, J. A. C. (1997). «Cloning of the rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) Mx2 and Mx3 cDNAs and characterization of trout Mx protein expression in salmon cells». J. Virol., 71: 5304-5311. Trobridge, G. D.; Leong, J. A. C. (1995). «Characterization of a rainbow trout Mx gene». J. Interf. Cytok. Res., 15: 691-702. Tsoi, S. C.; Cale, J. M.; Bird, I. M.; Ewart, V.; Brown, L. L.; Douglas, S. E. (2003). «Use of human cDNA microarrays for identification of differentially expressed genes in Atlantic salmon liver during Aeromonas salmonicida infection». Mar. Biotech., 5: 545-554. Tsoi, S. C.; Ewart, V.; Penny, S.; Melville, K.; Lieb scher, R. S.; Brown, L. L.; Douglas, S. E. (2004). «Identification of immune-relevant genes from Atlantic salmon using suppression subtractive hybridization». Mar. Biotech., 6: 199-214. Wang, T.; Ward, M.; Grabowski, P.; Secombes, C. J. (2001) «Molecular cloning, gene organization and expression of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) inducible nitric oxide synthase (iNOS) gene». Biochem. J., 358: 747-755. Wittbrodt, J.; Shima, A.; Schartl, M. (2002). «Medaka: A model organism from the far East». Nat. Rev. Genet., 3: 53-64. Yamamoto, E. (1999). «Studies on sex manipulation and production of cloned populations in hirame, Paralichthys olivaceus (Temminck et Schlegel)». Aquaculture, 173: 235-246. Yazawa, R.; Hirono, I.; Aoki, T. (2006). «Transgenic zebrafish expressing chicken lysozyme show resis-

APLICACIÓ DE LA BIOTECNOLOGIA A L’AQÜICULTURA 123

tance against bacterial diseases». Transgenic Res., 15: 385-391. Zbikowska, H. M. (2003). «Fish can be first-advances in fish transgenesis for commercial applications». Transgenic Res., 12: 379-389. Zou, J.; Bird, S.; Truckle, J.; Bols, N.; Horne, M.; Secombes, C. (2004). «Identification and expression analysis of an IL-18 homologue and its alternati-

vely spliced form in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss)». Eur. J. Biochem., 271: 1913-1923. Zou, J.; Mercier, C.; Koussounadis, A.; Secombes, C. (2007). «Discovery of multiple beta-defensin like homologues in teleost fish». Mol. Immunol., 44: 638-647.

DOI: 10.2436/20.1501.02.49

Les biotecnologies (Pere Puigdomènech i Francesc Gòdia, ed.) Treballs de la SCB. Vol. 58 (2007) 125-140

BASES ECOLÒGIQUES PER A LA RECERCA DE NOUS FÀRMACS EN ELS ORGANISMES MARINS Maria J. Uriz Centre d’Estudis Avançats de Blanes, CEAB-CSIC. Adreça per a la correspondència: Maria J. Uriz. Centre d’Estudis Avançats de Blanes, CEAB-CSIC. Accés a la Cala St. Francesc, 14. 17300 Blanes. Adreça electrònica: iosune@ceab.csic.es. RESUM Hi ha una diversitat extraordinària de molècules bioactives en els éssers vius, les quals han estat utilitzades com a font de medicaments des de l’antiguitat. De fet, la major part dels medicaments que existeixen actualment al mercat són productes naturals o en deriven. Durant els darrers cinquanta anys, la investigació per al desenvolupament de nous fàrmacs a partir de productes naturals s’ha centrat en el mar, un medi poc explorat i amb unes condicions físiques particulars, les quals suggereixen la presència d’estructures químiques noves en el seus habitants. Les interaccions mitjançant substàncies bioactives estan ben esteses entre els organismes marins, ja que el mar ofereix una visibilitat molt inferior a la del medi aeri (terrestre) i a dins seu, per tant, les pistes químiques adquireixen una major rellevància. D’altra banda, a més dels vegetals, al mar s’ha desenvolupat una estratègia de vida animal, absent del medi terrestre. Aquesta estratègia està representada pels invertebrats sedentaris (fixos al fons marí), els quals, per evitar ser recoberts per altres organismes de creixement més ràpid (epibionts) o depredats pels animals mòbils, han desenvolupat una capacitat especial per produir substàncies bioactives de defensa, les quals han resultat tenir un interès potencial en farmacologia. En aquest estudi es descriu com la investigació de nous fàrmacs d’origen marí ha viatjat de la mà de la química de productes naturals i de l’ecologia química, i com aquestes investigacions representen un model en el qual la ciència bàsica i l’aplicada caminen en paral·lel. També, es revisa l’estat actual del coneixement en aquests camps i es mencionen les línies d’investigació actuals i la seva evolució previsible en un futur pròxim. Paraules clau: ecologia química marina, metabòlits secundaris, fàrmacs d’origen marí, invertebrats marins, algues, aplicacions biotecnològiques.

126 M. J. URIZ

ECOLOGICAL BASES FOR THE PROSPECTING OF NEW DRUGS FROM MARINE ORGANISMS SUMMARY Natural beings contain an extraordinary diversity of bioactive molecules, which have been used as a source of medicines since the Antiquity. The majority of the available drugs in the market, are or derive from natural products. During the last 50 years, the research for the development of new drugs from natural substances has focused on the marine environment. Marine organisms have been comparatively less explored than terrestrial ones and are thought to produce unusual chemical structures because of the particular physical characteristics of marine waters. The interactions mediated by bioactive substances are widespread among marine beings, since they inhabit a low-visibility environment where the chemical cues become particularly relevant. Moreover, besides vegetables (algae), in the sea, there is an animal form of life that does not exist in the terrestrial environment. This form of life is represented by sessile invertebrates (attached to the sea bottom as adults), which are particularly prone to develop a set of mechanisms to avoid being covered by other fast-growing organisms (epibionts) or predated by mobile animals. Among these mechanisms, the production of defensive chemicals is preponderant, and these chemicals have been found applications in the pharmacological industry. In this study, I describe the way the investigation on new drugs of marine origin has developed in parallel to that on natural products and on chemical ecology and how this research field is a model in which basic and applied sciences go close together. Furthermore, I review the state of the art of the research in these fields and outline the current research topics and their foreseeable evolution in the forthcoming years. Key words: marine chemical ecology, secondary metabolites, marine drugs, marine invertebrates, seaweeds, biotechnological aplications.

INTRODUCCIÓ Els estudis de química de productes naturals han mostrat la presència d’una gran complexitat i diversitat de molècules bioactives en els éssers vius. Aquesta diversitat de substàncies ha fet que la natura hagi estat la font principal de medicines des de l’antiguitat. De fet, la major part dels medicaments actuals del mercat són productes naturals o en deriven, fet que és particularment cert en el camp de l’oncologia. Un cas paradigmàtic és el de l’aspirina (àcid acetilsalicílic), la qual es va obtenir de l’escorça del salze blanc (Salix alba). D’altra banda, la

química de productes naturals s’ha desenvolupat durant els darrers cinquanta anys de la mà de la farmacologia i de l’ecologia química, aquesta última, una ciència relativament moderna, la qual s’ocupa d’estudiar aquelles relacions entre els organismes vius en què estan implicades determinades substàncies químiques. INTERACCIONS MITJANÇANT SUBSTÀNCIES QUÍMIQUES Les substàncies químiques han demostrat ser un mecanisme de comunicació interes-

BASES ECOLÒGIQUES PER A LA RECERCA DE NOUS FÀRMACS EN ELS ORGANISMES MARINS 127

pecífic i intraespecífic extraordinàriament potent i àmpliament estès en els sistemes terrestres. Un exemple paradigmàtic és el de les complexes relacions entre les plantes i els insectes fitòfags, les quals han rebut una gran atenció dins de la investigació ecològica a causa de les seves implicacions en el control de les plagues del conreus. Malgrat que hi ha autors que, seguint el creador del terme al·leloquímics (Molich, 1937), consideren com substàncies al· leloquímiques totes aquelles implicades en qualsevol tipus d’interacció bioquímica entre organismes, les substàncies bioactives s’han dividit tradicionalment, segons la funció ecològica que desenvolupen, en feromones, substàncies involucrades en la comunicació intraespecífica, entre les quals destaquen les implicades en la reproducció sexual o en l’enviament de senyals d’alarma, i al·lomones o substàncies al·leloquímiques, les quals estan involucrades en les relacions interespecífiques i tenen funcions ecològiques vitals, com ara les relacionades amb la defensa de les espècies que les produeixen. Les primeres solen tenir el seu origen en proteïnes estructurals, pigments fotosintètics, exopolímers com els de la closca dels ous, o mucopolisacàrids, i el seu paper com a missatgers químics pot ser secundari, ja que la seva funció primària és estructural o metabòlica. En canvi, les molècules implicades en la defensa (antidepredació o repelència), competència entre espècies, antiparasitisme, etc, i que es coneixen com a metabòlits secundaris, poden ser de naturalesa química molt diversa (p. ex., terpens, esteroides, policètids, polifenols, àcids grassos, prostaglandines, flavonoides, alcaloides, quinones, hidroquinones, etc). En qualsevol cas, aquest segon tipus de molècules, les quals no participen directament en el metabolisme primari de les espècies, presenten propietats biològiques d’interès per al disseny i desenvolupament de nous medicaments.

EL MAR COM A FONT DE NOUS FÀRMACS Per què cal cercar al mar? El mar ocupa la major part de la superfície del planeta. A dins seu hi ha representats la major part dels grups taxonòmics animals, a més d’una dotzena de fílums que són exclusivament marins. En els anys seixanta, al començament de les prospeccions del mar com a font de medicaments, el mar es presentava com un medi potencialment ric en substàncies bioactives i, a diferència del medi terrestre, era pràcticament inexplorat. D’altra banda, les condicions físiques del mar (viscositat, pressió), molt diferents de les del medi terrestre, feien sospitar la presència d’estructures químiques inusuals en els organismes marins. No obstant això, la idea que el mar podia produir substàncies bioactives noves no es va basar en estudis científics contrastats, i així, les primeres campanyes de recol·lecció d’organismes es van realitzar sense cap criteri selectiu respecte als ambients o als organismes més idonis. La primera recerca extensiva basada en la hipòtesi general que aquestes substàncies tenen un paper en els ecosistemes bentònics i que, per tant, són previsiblement més abundants en uns organismes que en altres i en uns ambients que en d’altres, es va dur a terme al Mediterrani els anys 19891990, gràcies a la col·laboració entre l’empresa PharmaMar i el CSIC. Estudis posteriors dels resultats d’aquesta campanya (Uriz et al., 1991, 1992; Ballesteros et al., 1992) van mostrar una distribució i una abundància diferent dels metabòlits bioactius en funció de les característiques de l’ambient, la qual cosa suggeria un paper ecològic d’aquestes molècules en els sistemes marins. El percentatge més elevat d’espècies bioactives amb interès potencial en farmacologia es va trobar en comunitats d’am-

128 M. J. URIZ

bients foscos, densament poblats (vegeu la figura 1) i, com a conseqüència d’això, amb una forta pressió competitiva pel substrat (Uriz et al., 1991). Aquests ambients estaven dominats per invertebrats sedentaris de creixement lent, com per exemple, esponges, cnidaris, briozous i ascidis (vegeu la figura 2). Per tant, els invertebrats, i no les algues, van resultar els organismes del bentos més prometedors com a font potencial de nous fàrmacs. Això, que a primera vista podria resultar sorprenent per comparació amb el que es troba al medi terrestre, en realitat s’explica una vegada s’analitzen les funcions ecològiques d’aquest metabòlits al mar. Les substàncies bioactives d’origen terrestre que s’han utilitzat en farmacologia provenen principalment de microbis i d’organismes eucariotes que no poden desplaçar-se, com és el cas dels vegetals. En el medi marí, a més de microorganismes i vegetals (algues i fanerògames), hi ha una estratègia de vida animal que no existeix al medi terrestre per raons òbvies i que està representada per diversos grups d’inverte-

Figura 1. Percentatge d’espècies bioactives (amb interès potencial en farmacologia) en les principals comunitats mediterrànies. CC: comunitat coral·lígena; CSO: coves semifosques; PC: comunitat precoral·lígena; PP: praderia de Posidonia; AF: algues fotòfiles; FD: fons detrítics (Uriz et al., 1991).

brats. Es tracta d’animals fixats als substrat, els quals s’alimenten de la matèria orgànica particulada, suspesa en la columna d’aigua (Sarà i Vacelet, 1973). Aquests animals, filtradors o suspensívors, que, a diferència de la majoria de les algues solen créixer lentament, necessiten mantenir la seva superfície de filtració lliure (vegeu la figura 3) d’altres organismes (no cal recordar la rapidesa amb la qual qualsevol superfície inerta introduïda en el mar és colonitzada pels bacteris, les espores d’algues i diversos tipus de larves). D’altra banda, ja que es tracta d’organismes que no poden fugir dels possibles depredadors, han hagut de desenvolupar altres estratègies que evitin o redueixin la seva depredació (vegeu la figura 4). La conseqüència d’aquesta necessitat evolutiva d’establir sistemes de defensa alternatius als de la major part dels animals mòbils ha estat la producció d’un gran arsenal de substàncies bioactives, els mecanismes d’acció de les quals troben una aplicació en farmacologia. La «guerra química» al mar: perjudicis i beneficis per a l’home La primera familiarització de la societat amb les substàncies al·leloquímiques marines té lloc unida a circumstàncies tràgiques. Certes substàncies de defensa, especialment algunes produïdes pels organismes del plàncton, són conegudes a tot arreu pels terribles efectes ocasionats en l’home després de la seva ingestió accidental mitjançant els peixos (cigatera de les regions de l’Indopacífic), crustacis o mol·luscs (especialment musclos i ostres) que, al seu torn, n’havien ingerit. Es coneixen al voltant de vint mil tipus de toxines marines, les quals afecten l’home i ocasionen al voltant de cent cinquanta morts anuals (Rusell, 1984). Alguns dinoflagel·lats (principalment dels gèneres Gymnodinium i Protogonyaulax), la

BASES ECOLÒGIQUES PER A LA RECERCA DE NOUS FÀRMACS EN ELS ORGANISMES MARINS 129

brionàries de possibles competidors, objectius ambdós de l’ecologia química. D’altra banda, la recerca sistematitzada de bioactivitats d’interès aplicat ha permès descobrir aspectes de la distribució ecològica de les substàncies o activitats, així com detectar associacions entre espècies susceptibles d’estar produïdes per substàncies químiques, les quals han estat posteriorment objecte de les investigacions ecològiques. Variació natural en la producció de metabòlits bioactius Les defenses químiques es divideixen convencionalment en constitutives i induïbles. Es parla de defenses constitutives quan es produeixen en qualsevol circumstància, fins i tot en absència de competidors o predadors, i s’hipotetitza que la quantitat Tipus de bioactivitat antimitòtica

antifúngica

citotòxica

antivírica

antibacteriana �00 �0 �0

% d’espècies bioactves

proliferació dels quals es dóna circumstancialment (blooms), produeixen una potent toxina que mata els peixos i altres animals de l’àrea del bloom. Aquesta toxina pot acumular-se en esglaons tròfics superiors, i així arriba fins a l’home. Encara que els casos de producció de tòxics naturals, coneguts com a marees roges, són els més espectaculars per la seva repercussió en la població humana, no són els únics ni els més interessants, tant des del punt de vista ecològic com aplicat. Centenars d’altres substàncies, molt més críptiques, són investigades a diferents nivells o formen part de la cartera d’empreses d’I+D especialitzades, pel seu ús en aplicacions biotecnològiques i, molt especialment, en el desenvolupament de nous fàrmacs per al tractament de malalties de curació difícil, tant de l’home com dels seus animals domèstics (Faulkner, 1984-2002). Les substàncies bioactives d’origen marí s’han investigat tradicionalment des de tres perspectives: a) la recerca d’aplicacions (biotecnologia), b) l’estudi de la seva estructura química (química de productes naturals) i c) el seu paper ecològic en els ecosistemes marins (ecologia química marina). Els descobriments en cada un dels tres camps són necessaris per al progrés dels altres, per la qual cosa s’han desenvolupat noves aproximacions pluridisciplinàries amb resultats molt satisfactoris (vegeu la figura 5). Per exemple, les investigacions ecològiques de les condicions ambientals que indueixen o inhibeixen la producció d’un metabòlit bioactiu serveixen per optimitzar la recerca i recol·lecció de l’organisme productor, i permeten seleccionar els ambients i les èpoques més favorables. Igualment, el coneixement del mode d’acció d’un metabòlit bioactiu enfront els microbis patògens o les cèl·lules tumorals aporta informació sobre els processos bioquímics que li permeten controlar les poblacions de microbis simbionts o inhibir el creixement de formes em-

�0 �0 �0 �0 �0 �0 �0 0

�

��

� � � ��

Figura 2. Distribució per tàxons de les principals activitats farmacològiques de les molècules obtingudes a partir de macroorganismes mediterranis durant la campanya PHARMAMAR-CSIC-1989.

Fig. 2

130 M. J. URIZ

d’aquestes defenses estaria determinada genèticament. Pel contrari, les induïbles només es produirien en presència de factors adversos (p. ex., depredadors, competidors,

Figura 3. Com es pot evitar ser recobert quan es viu fix al substrat al mar? a) Plaques de Petri recobertes per algues i invertebrats després d’un mes d’immersió al mar; b) i c) superfície d’una esponja i d’un ascidi de més de dos anys de vida, totalment lliures de fouling gràcies a la producció de molècules bioactives (Uriz i Casamayor, 2007).

patògens) i són les que contribuirien, en major grau, a les variacions observades. Encara que no ha estat comprovat experimentalment en organismes marins, hi ha evidències indirectes que permeten suposar que la producció de metabòlits secundaris és costosa des del punt de vista metabòlic. Segons la teoria de la defensa òptima, formulada per a plantes terrestres (Rhoades i Cates, 1976; Rhoades, 1979), els organismes haurien de prioritzar la dedicació dels recursos disponibles a la producció d’aquestes substàncies o a altres funcions, com ara el creixement o la reproducció, depenent de les seves necessitats, de manera que, fins i tot les defenses constitutives podrien decréixer notablement en benefici d’altres processos metabòlics (p. ex., Uriz et al., 1995). Un estudi de la depressió de les defenses químiques en una esponja marina assenyala l’estrès cel·lular com a responsable, ja que l’augment de les proteïnes d’estrès (HSP) induïdes sota condicions adverses (p. ex., en presència de contaminants) es correlaciona negativament amb la producció de substàncies bioactives (Agell et al., 2001). Entendre la distribució geogràfica i ecològica dels metabòlits secundaris a diferents escales espacials i temporals, a més d’ajudar a comprendre els processos evolutius que han modelat les defenses químiques en el mar, contribueix a l’optimització de la recerca de molècules candidates per a diverses aplicacions biotecnològiques. S’ha avançat la hipòtesi que les defenses químiques han de ser més potents i estar més esteses en ambients on la pressió depredadora és més forta, com succeeix a les zones tropicals (Bakus i Green, 1974; Menge i Lubchenco, 1981; Bolser i Hay, 1996). Encara que hi ha estudis de grups taxonòmics concrets que mostren una bioactivitat major en espècies tropicals respecte als seus congèneres de zones temperades, la hipòtesi general ha estat falsejada en estudis d’altres grups, com ara les esponges, les quals han mostrat

BASES ECOLÒGIQUES PER A LA RECERCA DE NOUS FÀRMACS EN ELS ORGANISMES MARINS 131

una distribució similar de les defenses en mars tropicals i temperats (Becerro et al., 1997). Els estudis comparatius actuals són clarament insuficients per poder establir

generalitzacions consistents. D’altra banda, els metabòlits bioactius poden realitzar simultàniament diverses funcions (Schmitt et al., 1995; Becerro et al., 1997), i així doncs,

Figura 4. On es poden buscar medicaments al mar? L’ecologia ens en dóna les pistes. a) Zones d’alta competència pel substrat rocós, com ara l’entrada de les coves submarines dominades per esponges i cnidaris; b) quatre espècies diferents d’esponges coexistint en un àrea de 20 × 20 cm, gràcies a les interaccions mitjançant substàncies bioactives; c) l’alliberament de metabòlits bioactius permet a l’ascidi (vermell) evitar el creixement al seu voltant d’altres invertebrats, com el briozou de la fotografia; d ), e) i f ) dos dels principals depredadors del invertebrats sedentaris al mar: mol·luscs sense closca (opistobranquis) i peixos. Modificat de diverses fonts.

132 M. J. URIZ

les hipòtesis evolutives de les defenses químiques, formulades exclusivament d’acord amb la pressió depredadora, són clarament inadequades. L’abundància de substàncies bioactives no tan sols varia entre comunitats, regions geogràfiques o espècies d’un mateix gènere. Hi ha també una gran variació intraespecífica, tant en el medi marí (Martí, 2004) com en el terrestre, en què el seu coneixement és fonamental per gestionar el control de plagues dels conreus. La variabilitat intraespecífica en la producció d’una substància bioactiva és necessària perquè aquesta pugui desenvolupar una funció ecològica efectiva. La producció d’una quantitat constant d’una substància amb propietats defensives afavoriria la coevolució d’un nombre major de depredadors o de competidors amb mecanismes per adaptar-se al tòxic. Com a resultat, la producció d’aquesta substància deixaria de suposar un avantatge ecològic

per a l’espècie productora i, conseqüentment, seria eliminada en el curs de l’evolució. Alguns exemples poden il·lustrar la magnitud del rang de la variació intraespecífica. La briostatina, un potent anticancerigen procedent del briozou Bugula neritina, només es va trobar en alguns exemplars dels molts recol·lectats per als assaigs farmacològics preclínics. Aquesta variació es va atribuir, en un principi, a diferències genètiques entre poblacions, fins que es van aïllar els gens implicats en la seva producció en un bacteri simbiont del briozou, l’abundància del qual variava en les diferents poblacions de briozou. L’esponja Ircinia variabilis, la qual produeix palinurina (furanosesterterpè) en diverses quantitats en funció de l’ambient en el qual viu (Martí et al., 2003), és molt tòxica en primavera, a les zones mes confinades de les coves del sublitoral mediterrani, mentre que resulta

DE L’ECOLOGIA A LA FARMACOLOGIA

Estudi biològic i ecològic en el medi

Recol·lecció d’espècies ecològicament bioactives

BIOLOGIA/ ECOLOGIA

Tests d’activitat

Aïllament de substàncies

QUÍMICA FARMACOLOGIA/ BIOQUÍMICA

Identifi cació de substàncies Estudis preclínics Estudis clínics

Producció de medicaments

Figura 5. De l’ecologia a la farmacologia: principals passos en el descobriment d’un nou medicament a partir d’organismes marins. Taxonomia, ecologia, química orgànica, biologia, bioquímica i farmacologia (la majoria ciències bàsiques) es combinen durant el llarg procés de produir nous medicaments.

BASES ECOLÒGIQUES PER A LA RECERCA DE NOUS FÀRMACS EN ELS ORGANISMES MARINS 133

inofensiva a les zones exteriors. En aquest cas, la variació en la toxicitat sembla que és deguda exclusivament a factors ambientals, ja que les mateixes poblacions inverteixen la tendència a la tardor, quan els individus més tòxics són els de les zones exteriors de les coves (Martí, 2004). Diferenciar el component fenotípic del genotípic en les variacions observades seria de gran interès per a la selecció dels clons i de les condicions ambientals que afavoreixen la producció dels metabòlits bioactius quan es preveu la producció massiva d’un metabòlit per a l’aplicació en farmacologia. A part dels aspectes genètics, encara mal coneguts (objectiu d’alguns projectes d’investigació en curs al CSIC, Catalunya), s’han pogut identificar diversos factors que indueixen o inhibeixen la producció de defenses químiques. L’esporgada deguda a petits animals com els amfípodes, crustacis fitòfags que poden alimentar-se durant molt temps d’un mateix individu sense matar-lo, indueix la producció de les defenses químiques en les algues (Cronin i Hay, 1996). En altres casos, es produeix l’activació d’un metabòlit precursor, innocu a l’interior de l’organisme productor, en ser alliberat i exposat al medi extern (Ebel et al., 1997). El coneixement dels mecanismes que indueixen la transformació d’una molècula inactiva en una altra d’extraordinàriament bioactiva és d’interès especial en el disseny de fàrmacs a partir de molècules d’origen natural. Les defenses químiques també varien al llarg del cicle biològic d’una espècie. Hi ha espècies particularment ben defensades durant els períodes més vulnerables de la seva vida, com ara les fases juvenils (algues), embrionàries o larvàries, com postes de nudibranquis o poliquets (Martin et al., 2000). D’altres vegades, pel contrari, les defenses no existeixen en els estats larvaris, i augmenten a mesura que l’individu és més vell. Això s’ha comprovat en algunes

esponges (Uriz et al., 1996) i ascidis (Tarjuelo, 2001) i aquest coneixement resulta d’interès per a la recol·lecció selectiva de les fases més actives de les espècies diana, tant en poblacions naturals com en els cultius al laboratori. ESTAT ACTUAL I NOUS REPTES DE LA INVESTIGACIÓ DE LES MOLÈCULES BIOACTIVES MARINES Investigació bàsica: ecologia química La vista desenvolupa un paper preponderant en la nostra percepció de la natura. La major part dels estudis ecològics es basen en l’observació, tant d’aspectes naturals com dels resultats experimentals (Becerro, 1994). Així, descrivim espècies, associacions, creixement d’individus, taxes de mortalitat, depredació, processos i canvis, i comparem tots aquests descriptors en diverses condicions ambientals. Darrere moltes d’aquestes observacions, però, i fins i tot d’aspectes ecològics descrits fa centenars d’anys, s’amaguen mecanismes d’interacció química, en general encara mal coneguts. El desenvolupament de l’ecologia química en els darrers quinze anys (McClintock i Baker, 2001) ha estat impulsat per les inversions de les empreses farmacològiques, cada vegada més interessades a conèixer nous aspectes de la biologia i ecologia de les espècies productores dels metabòlits d’interès. L’ecologia química és pluridisciplinària en essència, perquè les interaccions mitjançant substàncies químiques són complexes i el seu estudi ha d’abordar-se des de l’escala molecular fins a la d’ecosistema. Taxònoms, zoòlegs, ecòlegs marins, bioquímics, biòlegs cel·lulars i químics de productes naturals s’han associat de manera espontània o induïts per les necessitats de les empreses

134 M. J. URIZ

farmacèutiques i, mitjançant aproximacions pluridisciplinàries, han produït avenços significatius en el coneixement de l’ecologia química marina. Molts estudis s’han inspirat en els coneixements ja adquirits de l’ecologia química terrestre, particularment en les paradigmàtiques relacions insecte-planta. Es troben, però, amb les dificultats inherents a un medi més advers que el terrestre, en el qual els experiments estan limitats per problemes logístics (curt temps i falta de perspectiva de les observacions, naturalesa física del medi, etc). Encara que la funció ecològica o biològica de la majoria dels metabòlit secundaris marins continua sent desconeguda, s’ha demostrat que algunes d’aquestes substàncies tenen un paper decisiu en la defensa dels organismes enfront dels depredadors, competidors, larves i espores que s’instal·len en les seves superfícies i els microorganismes patògens. D’altres molècules intervenen en aspectes relacionats amb la reproducció, o representen pistes químiques per a la selecció del substrat adequat per a l’assentament i reclutament de nous individus. Metabòlits bioactius en la defensa contra els depredadors La depredació és una de les fonts de mortalitat més important en les comunitats naturals, i n’influencia notablement l’estructura i la dinàmica. Entre les diferents funcions ecològiques atribuïdes als metabòlits secundaris, les defenses antidepredació són les més fàcils d’estudiar mitjançant aproximacions experimentals. Els metabòlits poden extreure’s de les espècies que els produeixen, incloure’s en aliments experimentals i ser oferts als consumidors potencials del mar (Becerro et al., 2003). La resposta és immediata, amb la qual cosa, en un curt període de temps es pot saber

si els productes inhibeixen o disminueixen el consum respecte al d’un aliment control. S’ha vist que les defenses produïdes per una espècie poden protegir indirectament altres espècies que viuen en relació estreta amb la productora dels metabòlits defensius. És el cas de petits invertebrats, com poliquets o amfípodes, que eviten ser depredats quan viuen entre algues o esponges protegides químicament, o altres (principalment nudibranquis) que han evolucionat per alimentar-se de l’organisme defensat químicament, segrestar el metabòlit actiu, concentrar-lo o fins i tot modificar-lo a fi d’augmentar-ne l’activitat. Metabòlits bioactius en la competència per l’espai Alguns organismes del bentos produeixen metabòlits que impedeixen la fixació de larves o espores al damunt de la seva superfície, o bé són tòxics o inhibeixen alguna funció biològica dels possibles competidors. El coneixement dels papers dels metabòlits secundaris en la competència per l’espai ha avançat poc a causa de la dificultat de realitzar experiments en condicions realistes (p. ex., és difícil trobar un substrat en el qual es puguin incloure els metabòlits sense que se n’alteri l’estructura química, no en variï l’activitat i s’alliberin en concentracions similars a les de les condicions naturals. Per tant, la majoria dels estudis existents són correlacionals o es basen en experiments de laboratori, els quals no permeten l’extrapolació dels resultats al medi natural. En algunes comunitats en les quals el substrat està saturat, com és el cas dels esculls de corall o la comunitat coral·lígena del Mediterrani, les interaccions mitjançant substàncies químiques es preveuen particularment importants en la seva estructuració i funcionament. La identificació de xarxes d’interacció

BASES ECOLÒGIQUES PER A LA RECERCA DE NOUS FÀRMACS EN ELS ORGANISMES MARINS 135

mitjançant substàncies químiques és complexa i, per tant, aquestes interaccions s’han tractat d’estudiar de manera indirecta. La localització dels metabòlits en la superfície de l’espècie «agressiva» és un indicador del seu alliberament a l’exterior, condició necessària perquè actuïn contra els competidors pròxims o en contacte directe. Són pocs els estudis que han localitzat els metabòlits secundaris en els invertebrats sèssils o les algues. Alguns d’aquests estudis, realitzats a Catalunya (Uriz et al., 1996; Turon et al., 2000), han estat pioners en la identificació de les cèl·lules responsables de la producció o emmagatzematge de substàncies bioactives, i han mostrat la seva concentració en la proximitat dels canals exhalants i de la superfície de les esponges, així com el seu alliberament progressiu al medi. Són necessaris més estudis d’aquest tipus, juntament amb una experimentació ben dissenyada per avançar en el coneixement dels papers antifouling i de competència pel substrat d’aquests metabòlits. Automedicació en els organismes marins? Els metabòlits amb activitat antimicrobiana són molt freqüents en els organismes marins, i produir els antibiòtics propis podria ser una bona estratègia per evitar infeccions. No obstant això, i encara que l’eficàcia contra bacteris, fongs i virus, tant marins com patògens, de molts metabòlits marins, ha estat repetidament provada (p. ex., Uriz et al., 1991; Ballesteros et al., 1992; Bece- rro et al., 1995), no existeixen proves incontestables que la seva funció natural en l’organisme sigui la de controlar les infeccions per part de microbis patògens. Al contrari, s’apunta com a paper més probable el control de l’abundant flora simbiont de molts invertebrats, ja que, sense un mecanisme de control, quan les condicions ambientals

canvien de manera inusual (p. ex., un augment de la temperatura), es podrien produir explosions microbianes amb un desenllaç fatal per a l’invertebrat. Les pistes químiques La transparència de l’aigua és considerablement menor que la de l’aire i, com a conseqüència, la visibilitat en el medi marí és notablement reduïda en relació a la del medi terrestre. A més, molts dels invertebrats marins no disposen d’un sistema de visió desenvolupat que els permeti processar estímuls lumínics. Tot això fa que les pistes químiques adquireixin una rellevància particular per a l’orientació dels animals al mar. La percepció sensorial dels senyals químics determina, en gran manera, processos vitals tan decisius per a la supervivència de les espècies com la recerca d’aliment, la reproducció, l’agregació i la selecció de l’hàbitat. Un dels papers ecològics de les substàncies bioactives marines menys conegut és el que tenen en la selecció, per part de les larves i juvenils, de l’hàbitat apropiat per al reclutament. Se sap que en alguns casos, aquestes substàncies són produïdes per conespecífics (com el cas de les ostres, Ostrea spp.) o per certes algues de l’ambient on viuen els adults (com el cas de l’orella de mar Haliotis spp.), però es desconeix com succeeix en la majoria d’invertebrats i peixos. Investigació aplicada: recerca de nous fàrmacs El 1967, el simposi «Medicines del mar», que va tenir lloc a la Universitat de Rhode Island, va emfatitzar la potencialitat del mar com a font de nous fàrmacs. Des de llavors, s’han aïllat més de deu mil molècules (vegeu la figura 6) a partir de micro-

136 M. J. URIZ

organismes (bacteris, fongs, cianobacteris, fitoplàncton), algues macroscòpiques i invertebrats marins (esponges, poliquets, equinoderms, briozous, ascidis), de les quals, un 0,1 % (cent molècules) són úniques des del punt de vista estructural i exhibeixen bioactivitats potencialment aplicables en la indústria farmacològica (McClintock i Baker, 2002). Com a exemple paradigmàtic de la gran diversitat de molècules en els organismes marins, podem citar el cas de les algues del gènere Laurencia, en les espècies del qual s’han descrit més de cinc-cents terpens diferents, pertanyents a almenys vinti-sis classes estructurals distintes.

No obstant això, cap de les deu mil molècules descobertes des de 1967 ha arribat a ser comercialitzada com a medicament. Possiblement, fruit de les dificultats trobades en aquest camp, la investigació de nous medicaments d’origen marí ha sofert una desacceleració en els últims anys del segle passat i primers d’aquest, seguint la tendència general en la investigació de nous medicaments (drug discovery) (Kennedy, 2004). No ha estat fins a aquests últims tres anys que el somni de la «farmàcia del mar» sembla començar a fer-se realitat, amb unes deu molècules d’origen marí en fase d’assaigs clínics (contra malalties com el càncer,

74,5 %

INVERTEBRATS

ALGUES

25,5 %

80 %

50 %

40 %

10 %

Algues vermelles Algues brunes Algues verdes

Esponges

Equinoderms

Cnidaris Ascidis

Mol·luscs Poliquets, crustacis

Figura 6. De les més de deu mil molècules bioactives identificades de macroorganismes del mar, la majoria (74,5 %) provenen dels invertebrats, i la resta de les algues. Entre els invertebrats, els sedentaris (esponges, cnidaris i ascidis), han donat el 80 % de les molècules conegudes, i la resta correspon als mol·luscs, equinoderms, crustacis i poliquets. Fig. 5 D’altra banda, el 50 % dels metabòlits obtinguts de plantes provenen de les algues vermelles (rodòfits) i el 40 % de les algues brunes (feòfits) (McClinkton i Baker, 2001).

BASES ECOLÒGIQUES PER A LA RECERCA DE NOUS FÀRMACS EN ELS ORGANISMES MARINS 137

l’Alzheimer, i l’esquizofrènia) i moltes altres en assaigs preclínics (vegeu l’article següent d’aquest volum). S’han obtingut metabòlits del mar a partir de microorganismes (bacteris heteròtrofs, cianobacteris, fitoplàncton), algues macroscòpiques i invertebrats, els quals han resultat actius en assaigs preclínics contra malalties com el càncer, la sida o l’osteoporosi, a més d’uns altres amb efectes calmants, antiinflamatoris, inhibidor enzimàtics, antibacterians o antivírics (Fusetani, 2000). Però encara que el nombre de substàncies candidates trobades és molt alt i s’aïllen noves estructures químiques, existeixen seriosos obstacles que frenen el desenvolupament de medicines a partir de productes naturals marins (Fusetani, 2000). En primer lloc, molts dels metabòlits bioactius més prometedors són altament tòxics, la qual cosa resulta problemàtica per utilitzar-los com a fàrmacs. Es podrien modificar els compostos originals per disminuir-ne la toxicitat o incrementar l’activitat desitjada, però el procés és costós i no sempre viable. A més, la majoria dels compostos d’interès presenten estructures complexes que fan econòmicament inviable la seva síntesi en el laboratori. Com a conseqüència, s’han d’obtenir a partir dels organismes productors, almenys durant les fases experimentals, preclíniques i clíniques. Finalment, aquestes substàncies es troben normalment a concentracions baixes (al voltant de 10 × 10 –6 en pes humit) en uns organismes generalment de creixement lent, l’abundància dels quals no permet una recol·lecció massiva sense esgotar les poblacions. Com a exemple representatiu de la problemàtica, podem esmentar el metabòlit halicondrina B, un potent antitumoral, fins i tot a concentracions de nanograms, produït per l’esponja Lissodendoryx spp. Es disposa de 300 mg d’aquesta substància, extrets a partir d’una tona d’esponja. Es necessitarien deu grams d’halicondrina per als assaigs

clínics, fet que representaria recol·lectar unes quinze tones de l’esponja, la qual és endèmica de Nova Zelanda. Una exploració dels fons va permetre estimar-ne l’abundància total en unes dues-centes noranta tones, cosa que fa inviable pensar en la comercialització del producte a partir de les poblacions naturals. D’altra banda, la síntesi de la molècula completa en el laboratori és impensable per la seva complexitat, per la qual cosa es va sintetitzar la part més activa per als assaigs clínics. Aquest és un de tants casos en el quals el desenvolupament com a medicament d’un metabòlit d’origen marí ha de buscar vies alternatives a la de la recol·lecció de l’organisme productor. Malgrat els avenços de la genòmica, proteòmica, metagenòmica i de la síntesi combinatòria, que semblen prometre vies més eficaces, el cultiu de les espècies productores dels metabòlits d’interès es presenta, ara com ara, com l’única alternativa a la recol·lecció de les poblacions naturals. No obstant això, les espècies que produeixen els metabòlits més interessants són generalment de creixement lent i estan evolutivament adaptades a un hàbitat particular, per la qual cosa viuen malament en condicions artificials. Molts invertebrats contenen en el seu interior microorganismes simbionts, els quals també produeixen metabòlits d’interès. El cultiu d’aquests microorganismes podria reduir el problema del creixement lent que presenten els invertebrats, però els intents realitzats fins ara han fracassat, tant en l’aïllament (per la inseguretat sobre si el microorganisme aïllat és realment el simbiont) com en el cultiu. Els aspectes d’identificació estan actualment solucionats gràcies al desenvolupament de les eines moleculars, però el cultiu de les espècies diana és encara un repte a causa dels requeriments específics d’aquests bacteris, difícil, si no impossibles de reproduir fora de l’organisme hoste. L’aqüicultura d’esponges i ascidis en el

138 M. J. URIZ

mar s’està assajant amb diferents resultats en estats com Espanya, Nova Zelanda i els EUA. En qualsevol cas, els riscos econòmics que comporta, a causa de les epidèmies i temporals, no permeten aconsellar l’aqüicultura com a base exclusiva de la producció, sinó en tot cas per al subministrament de biomassa durant els estudis preclínics i clínics. Els cultius cel·lulars en bioreactors serien més desitjables, però els intents realitzats fins ara en alguns grups com les esponges no semblen excessivament prometedors. En primer lloc, s’haurien d’aconseguir línies cel·lulars contínues, cosa que resulta molt difícil quan es tracta d’invertebrats marins. Per tant, en cap cas és realista preveure una escala de processos per cobrir les necessitats de la indústria farmacèutica, ja que s’han de millorar prèviament aspectes tecnològics i aprofundir en l’ecologia, biologia i genètica de les espècies les línies cel·lulars de les quals es pretenen cultivar. El futur proper L’ecologia química marina és una ciència relativament jove, amb un ampli camp de possibilitats en la investigació, tant de caràcter bàsic com aplicat. L’interès de les molècules bioactives del mar per a la indústria del medicament fa preveure la continuació de les inversions en aquest camp, fet que inevitablement seguirà impulsant les investigacions en ecologia química marina. Les investigacions actuals i les del futur pròxim estan obligades a preveure des d’aspectes moleculars (identificació de vies metabòliques, enzims i gens que regulen la producció de les substàncies bioactives) i d’enginyeria genètica (p. ex., transfecció de gens a cèl·lules procariotes o eucariotes), a aspectes ecològics (aproximacions experimentals holístiques), ja que l’expressió gènica i la consegüent producció dels metabò-

lits no és independent dels factors biòtics i abiòtics del medi. Noves aproximacions conceptuals i noves aportacions tecnològiques permetran una experimentació en condicions més realistes, cosa que produirà un avenç substancial en la comprensió de les interaccions mitjançant substàncies químiques en el medi marí. Els estudis sobre els efectes de l’ambient i de la fisiologia de les espècies en els processos de biosíntesi o les relacions entre els invertebrats i la seva nombrosa biota simbiont, ambdós temes amb implicacions evolutives, continuaran sent de la màxima actualitat. És esperable que les anàlisis químiques, gràcies a una major versatilitat i capacitat de resolució de la instrumentació analítica, puguin reduir la manipulació de les mostres, i això evitarà l’alteració de compostos inestables i assegurarà la detecció d’un major nombre de metabòlits d’interès, tant en l’ecologia de les espècies com en les seves aplicacions. Un esment particular mereixen les investigacions dirigides a l’estudi dels efectes dels metabòlits en el plàncton, molt poc coneguts, i que han resultat clau en el control de l’estructura de certs ecosistemes mitjançant efectes «cascada», com el que va produir la proliferació de dinoflagel·lats tòxics en les ostres i, com a conseqüència, la desaparició de les llúdrigues i la proliferació dels eriçons, els quals van acabar amb les algues d’una extensa zona de la costa del Pacífic nord-americà (Schmitt et al., 1995). Finalment, i com a primer objectiu de la investigació aplicada a l’obtenció de nous fàrmacs, és urgent trobar un sistema de producció que garanteixi el subministrament de la substància diana, bé a partir de suficient biomassa de les espècies d’interès, bé a partir de clonatge, transfecció o semisíntesi química, per tal d’assegurar la viabilitat de tot el procés de la investigació biomèdica i la comercialització del medicament. El cultiu de les espècies diana es presenta com

BASES ECOLÒGIQUES PER A LA RECERCA DE NOUS FÀRMACS EN ELS ORGANISMES MARINS 139

una alternativa a la recol·lecció i la síntesi dels metabòlits bioactius, però requereix un coneixement i control més grans de les condicions de cultiu apropiades, fet que comporta aprofundir en la biologia, ecologia i genètica de les espècies. Trobar un equilibri entre divisió i diferenciació en els cultius de línies cel·lulars d’invertebrats marins és encara un repte que la utilització de cèl·lules mare o embrionàries podria ajudar a solucionar (De Caralt et al., 2007). L’estudi de l’assignació dels recursos dels organismes a les seves diferents funcions biològiques (p. ex., Uriz et al., 1995) i la manipulació ambiental o genètica per al desviament dels recursos envers termes d’interès de l’equació metabòlica (p. ex., la producció de metabòlits bioactius) serà un tema important per optimitzar els cultius en els propers anys. La genètica, sens dubte, contribuirà decisivament al desenvolupament de les aplicacions biotecnològiques de les substàncies bioactives, gràcies a la possibilitat de seleccionar clons particularment productius. L’enginyeria genètica possibilitarà la transfecció dels gens implicats en les vies metabòliques dels metabòlits d’interès a cèl·lules procariotes amb alta capacitat de divisió. La metagenòmica, encara en la seva infantesa pel que fa a l’ús per a la recerca de noves molècules bioactives, sembla prometedora però, com ha succeït amb altres camps de les aplicacions genètiques, la seva utilització realista pot necessitar encara diversos anys d’investigació. BIBLIOGRAFIA Agell, G.; Uriz, M. J.; Cebrián, E.; Martí, R. (2001). «Does stress protein induction by copper modify natural toxicity in sponges?». Environ. Tox. Chem., 20: 2588-2593. Ballesteros, E.; Martin, D.; Uriz, M. J. (1992). «Biological activity of extracts from some Mediterranean macrophytes». Botanica Mar., 35: 481-485. Becerro, M. A. (1994). From cell to populations: ecolo-

gy of the Mediterranean sponge Crambe crambe. Barcelona: Universitat de Barcelona. [Tesi doctoral] Becerro, M. A.; Lopez, N. I.; Turon, X.; Uriz, M. J. (1994). «Antimicrobial activity and surface bacterial film in marine sponges». J. Exp. Mar. Biol. Ecol., 179: 195-205. Becerro, M. A.; Thacker, R. W.; Turon, X.; Uriz, M. J.; Paul, V. J. (2003). «Biogeography in chemical ecology: temperate vs. tropical sponge defenses». Oecologia, 135: 91-101. Becerro, M. A.; Turon, X.; Uriz, M. J. (1997). «Multiple functions for secondary metabolites in encrusting sponges». J. Chem Ecol., 23: 1527-1547. Bolser, R. C.; Hay, M. E. (1996). «Are tropical plants better defended? Palatability and defenses of temperate vs. tropical seaweeds». Ecology, 77: 22692286. Caralt, S. de; Uriz, M. J.; Wijffels, R. (2007). «Sponge cell culture for biomass supply: new approaches». Trends in Biotechnology, 26: 467-471. Cronin, G.; Hay, M. E. (1996). «Induction of seaweed chemical defenses by amphipod grazing». Ecology, 77: 2287-2301. Ebel, R.; Brenzinger, M.; Kunze, A.; Gross, H. J.; Proksch, P. (1997). «Wound activation of protoxins in marine sponge Aplysina aerophoba». J. Chem. Ecol., 23: 1451-1462. Faulkner, J. (1984-2002). «Marine natural products». Nat. Prod. Rep. Fusetani, N. (2000). Drugs from the Sea. Basilea: Karger. Kennedy, D. (2004). «Drug Discovery». Science, 303: 1717. Martí, R. (2002). Spatial and temporal variation of the natural toxicity in benthic communities of Mediterranean caves. Barcelona: Universitat de Barcelona. [Tesi doctoral] Marti, R.; Fontana, A.; Uriz, M. J. (2003). «Quantitative assessment of natural toxicity in sponges: toxicity bioassay versus compound quantification». J. Chem. Ecol., 29: 1307-1318. Martin, D.; Le Nourichel, C.; Uriz, M. J.; Bhaud, M.; Duchêne, J. C. (2000). «Ontogenic shifts in chemical defenses of the NW mediterranean sea Eupolymnia nebulosa (Polychaeta, Terebellidae)». Bull. Mar. Sci., 67: 287-298. McClintock, J. B.; Baker, B. J. (2001). Marine Chemical Ecology. Boca Raton: CRC Press. Rhoades, D. F. (1979). «Evolution of plant chemical defense against herbivores». A: Rosenthal, G. A.; Janzen, D. H. [ed.]. Herbivores: their interaction with secondary plant metabolites. Nova York: Academic Press: 4-54. Rhoades, D. F.; Cates, R. G. (1976). «Towards a general

140 M. J. URIZ

theory of plant antiherbivore chemistry». Recent Advances in Phytochemistry, 10: 168-213. Sarà M.; Vacelet, J. (1973). «Ecologie des éponges». A: Grassé, P. P. [ed.]. Traité de Zoologie. I Sponges. París: Masson. Schmitt, T. M.; Hay M. E.; Lindquist, N. (1995). «Constraints on chemically mediated coevolution: Multiple functions for seaweed secondary metabolites». Ecology, 76: 107-123. Sponge Culture Meeting. (2001). Program and Abstracts. Wageningen (1-20 de juny). Stachowicz, J. J.; Hay, M. E. (1999). «Reducing predation through chemically mediated camouflage: indirect effects of plant defenses on herbivores». The Ecological Society of America, 80: 495-509. Tarjuelo, I. (2001). Reproductive strategies in colonial ascidians: relationships with other life-history traits and genetic structure. Barcelona: Universitat de Barcelona. [Tesi doctoral] Turon, X.; Becerro, M. A.; Uriz, M. J. (2000). «Distribution of brominated compounds within the sponge Aplysina aerophoba: coupling of X-ray microanalysis with cryofixation techniques». Cell Tissue Res., 301: 311-322.

Uriz, M. J.; Becerro, M. A.; Tur, J. M.; Turon, X. (1996). «Location of toxicity within the Mediterranean sponge Crambe crambe (Demospongiae: Poecilosclerida)». Mar. Biol., 124: 583-590. Uriz, M. J.; Martin, D.; Turon, X.; Ballesteros, E.; Hughes, R. G.; Acebal, C. (1991). «An approach to the ecological significance of chemically mediated bioactivity in Mediterranean benthic communities». Mar. Ecol. Prog. Ser., 70: 175-188. Uriz, M. J.; Turon, M.; Becerro, M. A.; Galera, J. (1995). «Resource allocation to somatic and reproductive functions in the mediterranean encrusting sponge Crambe crambe (Porifera, Demospongiae)». Mar Ecol. Progr. Ser., 124: 159-170. Uriz, M. J.; Turon, X.; Becerro, M. A.; Galera, J. (1996). «Feeding deterrence in sponges. The role of toxicity, physical defenses, energetic contents, and life-history stage». J. Exp. Mar. Biol. Ecol., 205: 187-204. Zimmer, R. K.; Butman A. (2000). «Chemical signaling processes in the marine environment». Biol. Bull., 198: 168-187.

DOI: 10.2436/20.1501.02.50

Les biotecnologies (Pere Puigdomènech i Francesc Gòdia, ed.) Treballs de la SCB. Vol. 58 (2007) 141-155

FÁRMACOS DE ORIGEN MARINO Fernando de la Calle PharmaMar SAU. Dirección para la correspondencia: Fernando de la Calle. PharmaMar SAU. Avda. Los Reyes, 1. 28770 Colmenar (Madrid). Correo electrónico: fdelacalle@pharmamar.com. RESUM Els primers éssers vivents van aparèixer al mar fa més de 3.500 milions d’anys i el seu desenvolupament evolutiu ha proveït molts d’aquests organismes amb els mecanismes apropiats per sobreviure, alguns de gran complexitat per a la defensa, l’atac, la senyalització i altres propòsits encara desconeguts, que representen potents armes químiques amb modes d’acció nous per a nosaltres, i obren el potencial per a noves vies de tractament del càncer i altres malalties. Tant des del punt de vista científic i acadèmic, com des del de les indústries farmacèutiques biotecnològiques, ha estat reconeguda aquesta oportunitat i milers de compostos bioactius han estat descoberts, i alguns estan sent provats en assaigs clínics, principalment en oncologia. La visió clàssica de la biotecnologia marina ha canviat radicalment amb l’arribada de les eines moleculars. En aquests moments el concepte de diversitat biològica està basat en l’enorme univers de les seqüències de DNA, tenint en compte que la majoria de les formes de vida no poden ser cultivades en el laboratori. Això obre la possibilitat d’analitzar tot aquest contingut genòmic com a gens amb potencial per produir compostos farmacèutics innovadors i enzims. Paraules clau: biotecnologia marina, productes naturals, descobriment de drogues, PKS NRPS, metagenomes. SEA DRUGS SUMMARY The first living organisms appeared in the sea more than 3,500 million years ago and evolutionary development has equipped many marine organisms with the appropriate mechanisms to survive, developing exquisitely complex biological and chemical mechanisms for defence, attack, signalization and other still unknown purposes. These biologi-

142 F. DE LA CALLE

cal capabilities are clearly revealed by their ability to biosynthesize and release potent chemical weapons that are active per se. Such novel chemical structures often result in new modes of action and open up the potential of new ways to treat cancer and other diseases. The current scientific, academic and biotech-pharmaceutical industries have recognized this opportunity and thousands of bioactive compounds are being discovered and some of them are being testing in clinical trials, mainly in oncology. The classical view of marine biotechnology has been radically changed with the advent of molecular tools. Now, the concept of biological diversity is based on an enormous universe of DNA sequences, where the majority of the life forms cannot be cultivated in the laboratory. It opens up the possibility of analyzing all this genomic content as potential genes able to produce innovative pharmaceutical compounds and enzymes. Key words: marine biotechnology, natural products, drug discovery, PKS NRPS, metagenomes. INTRODUCCIÓN La historia de la humanidad está condicionada a la utilización de ciertos productos naturales como remedios para paliar enfermedades. Por citar algunos, la aspirina, la morfina o la penicilina han marcado un antes y un después en expectativas y calidad de vida. Incluso en el ámbito del cáncer, productos como la adriamicina o el paclitaxel (taxol) se emplean a diario como tratamiento de ciertos tumores. Estos compuestos, junto con otros miles, han sido fruto de la exploración de plantas y microorganismos obtenidos de muestras del suelo como fuentes de potenciales moléculas de aplicación en medicina. Las grandes compañías farmacéuticas han ido posicionándose en estas estrategias de descubrimiento de compuestos durante los últimos setenta años, y han llenado sus carteras de productos con nuevos medicamentos. El avance del conocimiento científico a escala molecular y celular ha ido variando esas estrategias hacia una búsqueda más competitiva, con el desarrollo de plataformas de alto rendimiento high throughput screening y sistemas in vitro que permiten cribar miles de compuestos sintéticos en cuestión de horas atendiendo a la baja pro-

babilidad de encontrar sustancias activas. Este cambio de actitud puso en entredicho la obsoleta disciplina de cribar organismos del suelo de forma empírica que tantos éxitos reportó en el pasado. Muchos autores calificaron de «casi exhausto» el arsenal de productos naturales. Sin embargo, pocas novedades se han reportado en los últimos años en cuanto a nuevos mecanismos de acción en antibióticos, por ejemplo. La combinatoria química, por sí sola, no ha sido capaz de suplir la extraordinaria versatilidad estructural que ofrecen los compuestos naturales. Esas enormes expectativas de modernidad han sucumbido a los hechos (Payne et al., 2007). Durante los últimos años, la revolución científica surgida de la genómica y la proteómica ha variado sustancialmente el escenario de búsqueda de nuevos medicamentos. Conociendo mejor el ciclo celular se pueden describir reacciones bioquímicas claves para ser modificadas, obteniendo dianas o targets específicos en que se reduce enormemente los efectos secundarios. Se diseñan métodos de cribado basados en células, en que se realizan construcciones genotípicas y fenotípicas que destacan los efectos sobre dianas celulares específicamente. Se utilizan modelos animales transgénicos de validación de tales dianas que

FÁRMACOS DE ORIGEN MARINO 143

incrementan las opciones de confirmación de que las moléculas bioactivas puedan llegar a convertirse en fármacos. Las técnicas analíticas de determinación estructural permiten la identificación de estructuras atendiendo a su estereoquímica. Los sistemas de simulación virtual entre estructura química y actividad biológica o de acople espacial entre la sustancia y el centro activo de la diana permiten el diseño de estructuras más optimizadas. Hemos pasado de la búsqueda de nuevos antibióticos que mermaban la población mundial a nuevas necesidades terapéuticas del siglo xxi: cáncer, enfermedades neurodegenerativas, diabetes, obesidad, enfermedades coronarias, antivirales y cáncer. Aunque los océanos contienen una biodiversidad muy superior a la de la tierra, su exploración desde el punto de vista de búsqueda de nuevos compuestos químicos apenas se ha iniciado, y se conocen en la actualidad «únicamente» unos quince mil productos naturales de origen marino, una décima parte de los terrestres. La revisión del grupo neozelandés liderado por M. Munro (Blunt et al., 2007) recopila las nuevas moléculas aisladas de organismos marinos. Este potencial se basa en que los océanos abarcan el 70 % de la extensión del globo y su diversidad biológica el 95 % de la biosfera. Un dato muy interesante aportado por el Nacional Cancer Institute es que el porcentaje de extractos activos de origen marino es muy superior al terrestre. A pesar de su reciente exploración, ya hay productos naturales marinos que han mostrado actividad en la mayoría de las dianas celulares y moleculares. La evolución ha definido y seleccionado diversas estrategias de supervivencia, defensa, ataque y comunicación entre organismos marinos que componen un verdadero arsenal de diversas moléculas (metabolitos) que podemos emplear en salud humana. Si observamos dos esponjas compitiendo

por un sustrato de fijación, o el empleo de defensas químicas en seres inmóviles para no ser depredados, nos daremos cuenta de que la estrategia evolutiva las ha dotado de sustancias capaces de detener el crecimiento de los rivales y ello puede aplicarse al cáncer, donde la división celular juega un papel determinante. Sin duda, es en el área del cáncer donde el arsenal metabólico marino juega el papel más determinante, pero no es el único. La supervivencia a grandes profundidades conlleva estructuras capaces de resistir más de cien atmósferas de presión conservando su capacidad vital, como el caso de ciertas esponjas y gorgonias, y podemos utilizar esos biomateriales en trasplantes óseos por su exquisita resistividad y flexibilidad. Las neurotoxinas de dinoflagelados y moluscos juegan un papel determinante como venenos paralizantes de vertebrados y hoy en día ya se han comercializados ciertos péptidos de origen marino para el tratamiento del dolor. Existe un extenso listado de medicamentos de origen marino en fases clínicas a punto de ser comercializados. Uno de los principales retos está en diseñar sistemas de producción a escala industrial de sustancias que se encuentran en partes por millón en las muestras biológicas estudiadas. La biotecnología marina tiene mucho que aportar al respecto cuando la síntesis química no es eficiente. Ya tenemos varios ejemplos con compuestos encontrados inicialmente en esponjas, tunicados o briozoos, incluso en bacterias marinas de difícil industrialización. El futuro de las medicinas marinas debe venir del empleo de técnicas moleculares o genómicas y celulares, de la robótica y de la bioinformática. Los avances en biología molecular de la última década han pulverizado el concepto clásico de biodiversidad marina, entendida hasta ahora como mera clasificación de especies atendiendo a morfología. Se calculan en 3 × 1028 el número

144 F. DE LA CALLE

de formas de vida microscópicas existentes globalmente en océanos; para que lo entendamos, ello supone que hay cien millones de veces más microorganismos que estrellas en el universo visible. Pero el reto está en como poder cultivarlos en el laboratorio, pues más del 99 % de ellos sólo se conocen por técnicas moleculares (Zengler et al., 2006). Además, estos organismos unicelulares son máquinas de expresar genes. Algunos de estos productos de expresión son los llamados metabolitos secundarios, que han sido seleccionados durante millones de años de evolución para ser útiles como defensa o ataque de depredadores. Por otro lado, la extremada promiscuidad (entendida como mezcla confusa o indiferente) de los microorganismos marinos para intercambiar genes está rompiendo el paradigma de relacionar taxonomía con diversidad metabólica. Además de lo anterior, los recientes progresos en el conocimiento de genes encargados de producir metabolitos secundarios como péptidos o poliquétidos (llamados clusters génicos NRPS y PKS) (Donadio et al., 2007) sólo han conseguido demostrar su funcionalidad en microorganismos. Si a esto le añadimos el gran contenido de simbiontes marinos (microorganismos que viven en estrecha relación con invertebrados marinos) se abren eficaces vías de estudio para identificar nuevas moléculas con actividad en salud humana, además de atribuir a estos «invisibles» habitantes marinos la propiedad de producción de biocompuestos,

Figura 1. Esponja Crytotethya cripta y estructura química de Ara-C (arabinosilcitosina).

que hasta ahora sólo se achacaban a invertebrados. A modo de ejemplo, una esponja marina puede contener más de un millón de genes bacterianos capaces de producir sustancias tóxicas. Finalmente, gracias a técnicas de microbiología molecular, sistemas de alta rapidez en secuenciación de DNA y con métodos de predicción secuencia nucleótido-enzimametabolito, es posible plantearse nuevos retos de cribado basados en la exploración de millones y millones de genes aunque no sea posible cultivar a sus dueños. Es la llamada era de los metagenomas. En conclusión, ese universo de moléculas pequeñas, pero de extremada sutileza estructural, encontradas en muestras marinas, forman un armamento tan fascinante que no es de extrañar que sean calificadas como las medicinas del futuro. Pero la mejor noticia es que la comunidad científica sólo ha explorado la punta del iceberg del potencial existente en la biodiversidad marina. Seguro que lo mejor está por llegar. FÁRMACOS DE ORIGEN MARINO Historia de la exploración de recursos marinos en salud humana No es muy frecuente encontrar referencias en etnofarmacología sobre medicamentos de origen marino, aunque desde hace miles de años se hayan empleado ungüentos, brebajes y cataplasmas de algas y lodos marinos para un sinfín de dolencias (desparasitación intestinal, regulaciones hormonales, efectos antiinflamatorios o antibióticos, tratamientos de estados anímicos, etc). Algunas fórmulas, como el Noni, bebida elaborada a partir de extractos de algas y fruta fermentada, empleada para afecciones varias en archipiélagos del Pacífico o

FÁRMACOS DE ORIGEN MARINO 145

las algas marinas limu, kelp y wakame, que la medicina tradicional china y nipona considera tónicos revitalizantes, aún se pueden encontrar en tiendas especializadas. Plinio el Viejo describió en su Naturalis Historia la utilización de una absenta marina (Seriphum) en el Antiguo Egipto para alteraciones gastrointestinales. En 1900 se comercializó el primer producto marino sensu stricto, el ácido kaínico, obtenido de extractos de algas pardas y empleado como insecticida y antihelmíntico. Pero no fue hasta cincuenta años más tarde cuando empezaron a identificarse los primeros fármacos encontrados en esponjas y microorganismos marinos. La AZT (zidovudina), que marcó un hito en la lucha contra el sida, fue inspirado a partir de los nucleósidos espongouridina, también conocida como Ara-C y espongotimidina o Ara-A, antivirales aislados de la esponja Crytotethya cripta (véase la figura 1). También sirvió como molde para desarrollar análogos para el tratamiento de leucemias (Scheuer, 1996). También a mediados de los años cincuenta, se descubrió la cefalosporina C a partir de un microorganismo marino, el hongo Cephalosporium, que actualmente sigue siendo muy utilizado como antibiótico. En 1966 se publicó otro antibiótico, la pentabromopseudilina, producido por una bacteria aislada del mar. Otro hecho significativo de aquella época fue el descubrimiento en grandes cantidades de prostaglandinas en el coral Plexauria homomalla. Estos compuestos son importantes mediadores en afecciones inflamatorias, fiebre y dolor, e incluso están descritos como anticonceptivos; se descubrieron en semen de carnero, y de ahí su nombre, al ser provenientes de líquidos prostáticos. Desde entonces hasta nuestros días, se han descrito más de quince mil compuestos marinos; aunque la mayoría tienen su aplicación en el área del cáncer, es de destacar

la reciente aprobación por parte de la FDA del Prialt (ziconotida), péptido neuroparalizante con aplicación en anestesia y que debe ser empleado a dosis mucho más bajas que la morfina. Fue aislado inicialmente del molusco Conus magnus (Olivera et al., 1985). De crustáceos planctónicos (neptune krill oil) una empresa canadiense está comprobando sus efectos en fase clínica ii como atenuantes del ciclo menstrual. Otros metabolitos obtenidos de esponjas y corales están siendo probados como antiinflamatorios. Incluso el fármaco GTS21 de un gusano nemertino está mostrando potencialidad en el tratamiento del Alzheimer y la esquizofrenia. En julio de 2007, la agencia europea de medicamentos EMEA emitió el visto bueno para la futura comercialización de Yondelis (trabectedina o ET-743), convirtiéndose así en el primer compuesto natural marino aprobado para el tratamiento del cáncer. Proceso de descubrimiento de fármacos (drug discovery) La mortalidad a causa de enfermedades infecciosas a principio del siglo xx, como gripe, neumonías, tuberculosis y gastroenteritis, ha dejado de ser el gran reto de la medicina actual; ahora las enfermedades cardiovasculares, el cáncer, las afecciones neurodegenerativas, los moduladores del sistema inmunitario y los nuevos tratamientos frente a cepas resistentes a antibióticos conllevan un nuevo mercado global farmacéutico que mueve quinientos mil millones de euros al año. Frente a tales enfermedades, se están seleccionando dianas moleculares específicas para basar los ensayos de búsqueda de actividades biológicas. Sin embargo, una vez encontradas moléculas que puedan interaccionar con ellas selectivamente, es necesario aplicar tecnologías de optimización quí-

146 F. DE LA CALLE

mica e innovadores formas de aplicación o drug delivery para hacer frente a los efectos tóxicos que conllevan. El objetivo de la I+D actual es doble: ser más eficaces y reducir los efectos colaterales que conllevan las terapias basadas en sustancias tóxicas. Las tres cuestiones que subyacen a la hora de diseñar este proceso son: a) ¿Qué queremos encontrar y cómo vamos a hacerlo? b) ¿De qué muestras partimos? c) ¿Qué tipo de información vamos a obtener del cribado?, ¿cómo podemos encontrar la sustancia responsable de la actividad y cómo la podemos convertir en fármaco? Esta aproximación tan simplista se complica atendiendo a varios factores, entre ellos la disponibilidad económica existente, el grado de automatización, la probabilidad de éxito que auguremos, el estado de la técnica existente, el tiempo empleado en el desarrollo, etc. El esquema general más simplificado queda reflejado en la figura 2. Este esquema se complica atendiendo al área antiinfectiva, antitumoral, antiviral o al empleo de la genómica en la búsqueda de actividades enzimáticas. Paul Ehrlich (Drews, 2000) postuló en 1957 que ciertos quimiorreceptores en bacterias, parásitos y células cancerosas podrían ser explotados terapéuticamente. El primer paso del diseño del cribado (screening) es la selección de la diana (target) adecuada. Puede ser a nivel de célula o de estructura molecular, normalmente proteica (receptor o enzima).

Una vez identificada dicha reacción, es necesario validarlo. Este concepto conlleva dos objetivos: que la diana sea lo más específica posible (máxima actividad en células tumorales y no en sanas, o actividad frente a microorganismos resistentes a determinados antibióticos e inocuos al resto de células) y que pueda ser indicio de éxito en las pruebas de eficacia que se realizarán en sistemas animales o tejidos como paso previo a su aplicación en el paciente final. El segundo paso es el diseño del proceso propiamente definido como cribado, que permita el procesado de muestras de forma rápida y certera. La evolución en sistemas de placa Microtiter ha pasado de las ancestrales placas de Petri a las actuales Microtiter de 96, 384 o 1.536 pocillos, y permite el desarrollo de plataformas de alto rendimiento (HTS) o sistemas automatizados. Los tipos de cribado los dividiremos en celulares, moleculares y virtuales (in silico). La función de dicho cribado puede ser triple: — Seleccionar muestras iniciales de interés. — Servir como referencia en el proceso de purificación del compuesto activo (bioensayo). Aportar datos suficientemente específicos y concisos que permitan aumentar el éxito en la conversión de la sustancia activa o hit al producto de uso industrial o lead. Normalmente, se definen cribados pri-

Figura 2. Proceso general de descubrimiento de fármacos (drug discovery).

FÁRMACOS DE ORIGEN MARINO 147

marios, como aquellos que se utilizan para seleccionar poblaciones de interés, que suelen estar basados en el empleo de células. En el cribado secundario, habitualmente mucho más específico, el objetivo básico es el estudio de la especificidad del modo de acción. Una vez seleccionadas las muestras activas por cribado primario, comenzará el aislamiento del compuesto responsable de actividad mediante el empleo de técnicas analíticas, hasta llegar a la elucidación estructural. Cada paso de purificación (fracciones) será guiado por la actividad, en lo que se conoce como bioensayo. Si la estructura responsable de la actividad permite su desarrollo al aportar estructura química novedosa, potencia (medida habitualmente como molar) interesante y específica y posibilidad real de suministro a escala industrial (por fermentación directa del productor o indirecta por clonaje y expresión heteróloga o síntesis química), comenzarán los estudios de síntesis química, dirigida o combinatorial, para encontrar la mejor variante atendiendo a su formulación, estabilidad, actividad o solubilidad. Es lo que se conoce como optimización del lead o de hit a lead. Respecto a la definición de muestras y en el caso concreto de organismos marinos, podemos agruparlas en tres grandes grupos:

— Invertebrados y algas marinas. — Microorganismos cultivables (bacterias, hongos, fotosintéticos unicelulares). — DNA medioambiental o metagenomas. Este proceso conlleva grandes inversiones de recursos económicos, humanos y tecnológicos. La figura 3 resume los tiempos medios empleados y las probabilidades de éxito del descubrimiento de fármacos. Moléculas bioactivas marinas frente a dianas actuales Como se ha comentado anteriormente, los avances en biología molecular y celular junto con plataformas robotizadas y perfeccionamiento en análisis estructural junto con modelos espaciales de unión entre moléculas y centros activos de enzimas claves, han revitalizado el descubrimiento de fármacos de productos naturales marinos (PNM). Existe un largo listado de PNM de novedosas estructuras activas sobre dianas específicas (Nagle et al., 2004). La mayoría de las aplicaciones tiene que ver con la oncología. Repasaremos las familias más relevantes en ensayos clínicos en el siguiente apartado. Fuera del área de cáncer destacan las siguientes familias de metabolitos con aplicación en salud humana: Conotoxinas (ziconotida, MVIIA o Prialt).

Figura 3. Tiempos de desarrollo medio desde el inicio del descubrimiento de fármacos hasta la comercialización.

148 F. DE LA CALLE

La ziconotida es un péptido de veinticinco aminoácidos que ha sido recientemente autorizado por las autoridades americanas de la FDA para su comercialización para el tratamiento del dolor. Esta conotoxina, junto a otras ω-conotoxinas, fue aislada del gasterópodo marino Conus magus (Olivera et al., 1985), conocido habitualmente por su capacidad de lanzar venenos paralizantes a peces. Está siendo desarrollado por Elan Corporation y se aplica para tratamientos analgésicos en casos de enfermedades terminales, ya que multiplica cientos de veces la eficacia de la morfina con mejor tolerancia. Manzaminas (manzamina A). Aunque la manzamina A (véase la figura 5) presenta efectos citotóxicos, insecticidas y antibacterianos, es conocido por su utilización en ensayos clínicos frente a la malaria. Se aislaron originalmente de esponjas marinas del genero Haliclona en Okinawa, aunque posteriormente se aisló un microorganismo marino, perteneciente a los actinomicetos (en concreto al género Micromonospora) por parte del grupo de Mark Hamann de la Universidad de Misisipí (Blunt et al., 2003). Por lo tanto, este compuesto puede ser desarrollado por fermentación a escala industrial. Pseudopterosinas. Se trata de diterpenos biclíclicos glicosilados, aislados de la gorgonia Pseudopterogorgonia elisabethae, con potentes efectos antiinflamatorios. La compañía OsteoArthritis Sciences Inc. ha presentado recientemente el investigational new

Figura 4. Gasterópodo Conus magus y estructura de la ω-conotoxina ziconotida.

drug (IND) para el comienzo de los ensayos en humanos como compuesto antiinflamatorio en dermatitis irritante de contacto. Sin embargo, dichos efectos beneficiosos ya se conocían en cosmética, ya que extractos de este coral son componentes de la crema Resilience (Rouhi, 1995). Principales compuestos marinos en fases clínicas en oncología En ensayos clínicos de oncología existen actualmente una veintena de compuestos, siendo PharmaMar, empresa ubicada en Madrid y Boston, pionera en la investigación y desarrollo de PNM, ya que cuenta actualmente con cinco productos derivados de fuentes marinas en distintas fases de desarrollo clínico en humanos en hospitales de todo el mundo. Ecteinascidinas (ET-743, trabectedina, Yondelis). Dentro de la familia de las ecteinascidinas, destaca en particular ET-743 (Yondelis) como potente antitumoral, aislado originalmente del tunicado (ascidia) Ectei-

Figura 5. Actinomiceto marino Micromonospora sp. y estructuras de manzamina A (1) e hidroximanzamina A (3).

Figura 6 . Tunicado Ecteinascidia turbinata y estructura de ET-743, principio activo de Yondelis.

FÁRMACOS DE ORIGEN MARINO 149

nascidia turbinata (véase la figura 6) y en la actualidad producido por semisíntesis a partir de un metabolito microbiano (Cuevas et al., 2000). La figura 7 muestra la similitud estructural entre el metabolito microbiano safracina B, producido por fermentación de la bacteria Pseudomonas fluorescens A2-2, y la ecteinascidina ET-743. Desarrollado por PharmaMar, recibió en julio de 2007 el visto bueno de la EMEA para su comercialización en Europa para sarcomas de tejido blando, y actualmente está llevándose a cabo un estudio en fase iii para su aplicación en cáncer de ovario junto con la compañía norteamericana Johnson & Johnson PRD. El tunicado marino productor puede localizarse muy extendido por aguas del Mediterráneo (Formentera, Mallorca, Túnez) y del Caribe. Durante los primeros años de exploración en fases clínicas, PharmaMar llevó a cabo cultivos marinos de la ascidia para la extracción y obtención del producto. (Carballo et al., 2000). Por otro lado, Yondelis está designado como medicamento huérfano (orphan drug) en sarcomas de tejido blando (STS) y ovario en la UE y los EEUU. Este compuesto se une al surco menor del DNA interfiriendo en los procesos de división celular, de transcripción genética y en los sistemas de reparación del ácido nucleico. Recientemente, científicos de PharmaMar han publicado la existencia de un simbionte, aunque no se ha conseguido todavía relacionarlo con la biosíntesis. Como se verá más adelante, la extraor-

dinaria similitud estructural de este compuesto con estructuras bacterianas como safracinas o saframicinas así lo sugieren. Didemninas (deshidrodidemnina B, aplidina o Aplidin). Familia de péptidos cíclicos aislados de tunicados. La didemnina B fue aislada de la ascidia Trididemnum solidum y fue el primer fármaco marino en entrar en fases clínicas, aunque fue paralizada su aplicación en fase ii debido a la alta toxicidad (Vries y Beart, 1995). Como en el caso anterior, fueron científicos de PharmaMar, junto con K. L. Rinehart, de la Universidad de Illinois, quienes aislaron la deshidrodidemnina B (aplidina o Aplidin) de otra ascidia, Aplidium albicans (véase la figura 8) en aguas del Mediterráneo. Esta ascidia vive a más de 50 m de profundidad. Aplidin se encuentra en fase ii frente a tumores sólidos y hematológicos, sólo y en combinación con otros agentes, y su mecanismo de acción está basado en la inducción rápida y persistente de la apoptosis, inhibe la secreción del factor 1 de crecimiento del endotelio vascular VEGF1 y bloquea el ciclo celular. Le fue concedido el estatus de medicamento huérfano frente a leucemia linfoblástica y mieloma múltiple por las autoridades regulatorias europeas en la UE y los EEUU en 2003 y 2004, respectivamente. Su producción se realiza por síntesis química total. Kahaladidos (kahaladido F o KF). El kahaladido F (KF) es la estructura más estudiada dentro de la familia de los kahaladidos. Como en los dos casos anteriores, PharmaMar posee la exclusividad de desarrollo. Su pro-

Figura 7. Similitud estructural ET-743 entre la safracina B y ETSafracina B 743. La primera se utiliza como material de partida de la actual ruta de fabricación de Yondelis.

Figura 8. Tunicado Aplidium albicans y estructura de Aplidin.

150 F. DE LA CALLE

ducción industrial está prevista realizarla por síntesis química. Este compuesto de naturaleza peptídica con cadenas de ácidos grasos fue descubierto por el profesor Scheuer, de la Universidad de Hawaii en la bahía de Kahala, de ahí su nombre. Los kahaladidos se aislaron del extracto de un molusco marino, Elysia rufescens (véase la figura 9), aunque años más tarde también se aisló KF del alga Bryopsis sp., que forma parte de la dieta del nudibranquio. En 2005, M. Hamman, de Universidad de Misisipí y R. Hill, de la Universidad de Maryland (WO2005/042720) patentaron la producción bacteriana de KF. Se trata de dos especies de Vibrio, bacteria muy habitual en los mares. KF se encuentra en ensayos clínicos de fase II para carcinoma hepatocelular, cáncer de pulmón no microcítico (CPNM) y melanoma. También se está evaluando para el tratamiento de psoriasis severa. Su mecanismo de acción apunta a la alteración de las membranas lisosomáticas e induce la muerte celular mediante oncosis. Se ha comprobado que la actividad antitumoral es independiente de la resistencia a múltiples fármacos (MDR) y del estado de la p53. Briostatinas (Briostatina 1). Las briostatinas son lactonas macrocíclicas aisladas originariamente del briozoo Bugula neritina (véase la figura 10). Este organismo es muy abundante en todos los océanos y, como veremos más adelante, se ha intentado su cultivo en

condiciones controladas. Sin embargo, es muy probable que el verdadero productor sea una bacteria simbionte y pueda en un futuro ser fermentada. La briostatina 1 está siendo desarrollada en ensayos clínicos en fase ii por el NCI en licencia con BristolMyers. Parece que no es efectiva sin combinación, lo que hace que se valore su efecto sinérgico con taxol para la aplicación en cáncer de pulmón, mama y ovario (Wang et al., 1998). Este compuesto se une con gran afinidad a la proteína C quinasa, lo que se traduce en efectos antitumorales e inmunoestimulantes. Dolastatinas (dolastatina 10). Péptidos aislados de la liebre marina o nudibranquio Dollabela auriculata, que producen una inhibición de la polimerización de los microtúbulos, lo que se traduce en la inhibición de la división celular y la apoptosis posterior. La dolastatina 10 está siendo probada en ensayos en fase ii en combinación con vinblastina, e incluso se ha probado con briostatina 1. Sus posibles aplicaciones futuras serían para tumores de mama, próstata y colon. Hay investigadores que atribuyen su biosíntesis a cianobacterias asociadas (Harrigan y Gotees, 2002). Discodermólidos. Macrólidos aislados de la esponja caribeña Discodermia disoluta (Gunasekera et al., 1990), con mecanismo de acción muy similar a las dolastatinas, presentan actividad incluso en células tumorales resistentes a taxol y epotilonas. Están

Figura 9. Nudibranquio Elysia rufescens y estructura del kahaladido F.

FÁRMACOS DE ORIGEN MARINO 151

siendo ensayados en combinación con taxol en fase i. Novartis ha conseguido publicar su síntesis química en treinta y nueve pasos. Aminoesteroles de tiburón (escualamina y Neovastat). Estas sustancias han sido extraídas del cartílago de tiburón (Moore et al., 1993), sobre todo de especies de Squalus acanthus, muy común en las costa este de los EEUU. Sus mecanismos de acción se basan en efectos antiangiogénicos o inhibidores de la formación de capilares sanguíneos que irrigan los tumores. Halicondrinas (halicondrina E7389). De varias esponjas del océano Indico y preferentemente de la esponja de grandes profundidades neocelandesa, Lyssodendorix sp. y de la más extendida Halichondria okadai, pueden obtenerse halicondrinas, siendo la más activas la isohomohalicondrina B (Litaudon et al., 1994) y la halicondrina B. Su enorme potencial radica en las actividades antitumorales inferiores al nanomolar. Debido a la escasa productividad de dichas esponjas y después de varios intentos fallidos de cultivo de Lyssodendoryx en condiciones controladas, se consiguió la síntesis química del fragmento más activo de la halicondrina B, y dicho compuesto, E7389, se encuentra actualmente en ensayos clínicos al demostrar producir arresto del ciclo celular en G2/M debido a su efecto sobre el citoesqueleto (microtúbulos). Salinosporamidas (salinosporamida A). Comenzó su desarrollo en ensayos clínicos en 2006 por la compañía norteamericana Nereus Pharmaceuticals, liderada científica-

Figura 10. Briozoo Bugula neritina y estructura de la briostatina 1.

mente por William Fenical. Este compuesto fue aislado de los caldos de fermentación de un nuevo grupo de actinomicetos marinos, conocido como Salinospora (Fenical y Jensen, 2006). Estos microorganismos se encuentran en grandes profundidades y están revolucionando el concepto de diversidad química asociada a nuevos géneros en bacterias. Las salinosporamidas, obtenidas de este nuevo grupo taxonómico, presentan inhibición específica sobre proteasoma (Groll et al., 2006) y presentaron prometedores resultados en preclínica frente a cáncer de colon, mama y pulmón no microcítico. Fármacos de grandes profundidades Actualmente, la necesidad de exploración a grandes profundidades supone un importante reto tecnológico, ya que es posible que la diversidad química que pueda encontrarse presente la ventaja de la adaptación bioquímica a grandes presiones. El cuadro 1 resume los productos marinos de aplicación en salud humana obtenido por medios diferentes al buceo clásico, cuya limitación fisiológica sitúa la bioprospección hasta 40-60 metros. Es de destacar la lección de bioingeniería y su posible aplicación en ingeniería ósea que obtenemos de las estructuras calcáreas de ciertos corales (Keratoisis e Isidella), en que científicos alemanes (Ehrlich et al., 2003) están examinando la enorme flexibilidad y, a la vez, dureza, que confieren una proteínas llamadas gorgoninas, que se sitúan en ángulos precisos de las estructuras calcáreas de

Figura 11. Estructura química de la salinosporamida A.

152 F. DE LA CALLE Cuadro 1. Productos marinos de aplicación en salud humana Compuesto Isohomo Halicondrina B Discodermólido

Aplicación Cáncer

Fuente Esponja Lyssodendoryx

Cáncer

Profundidad > 100m

Esponja D. dissoluta Dictiostatina 1 Cáncer Esponja no identificada Fam. Corallistadae Sarcodictina Cáncer Coral Sarcodic tyon roseum Salinosporamida A Cáncer Bacteria Salinospora tropica Topsentina Antiinflamatorio Esponja Spongosporites Alzheimer ruetzeri Gorgoninas Implantes óseos Corales, fam. Isididae

dichos corales que viven a más de 1.000 m de profundidad. Aplicación de la biotecnología en productos naturales marinos (PNM) Como se ha indicado anteriormente, el empleo de herramientas moleculares no sólo ha revolucionado el concepto de biodiversidad marina, sino que puede suponer un nuevo enfoque en la búsqueda de nuevas medicinas.

Figura 12. Caldo de fermentación de Micromonospora marina y tiocoralina, depsipéptido obtenido por expresión heteróloga en varias especies de Streptomyces industriales mediante ingeniería molecular del cluster NRPS responsable de la biosíntesis.

Comentario Véase 2.4

140 m

Localización Nueva Zelanda Bahamas

442 m

Jamaica

Toxicidad similar a taxol

100 m

Mediterráneo

> 1.000 m

Pacífico norte

Toxicidad similar a taxol Véase 2.4

300-600 m

Bahamas

Desarrollo preclínico iniciado

> 1.000 m

Pacífico norte

Bioingeniería

Véase 2.4

Los análisis de la riqueza cuantitativa y cualitativa microbiana asociados a muestras marinas (y terrestres) revelan que la ciencia sólo es capaz de cultivar en laboratorio menos del 1 % del total de formas vivas que se encuentran allí (Kellenberger, 2001). El conocimiento molecular de los genes responsables de la biosíntesis de metabolitos secundarios, especialmente relacionados con péptidos (non ribosomal peptide synthetases, o NRPS) y macrólidos policétidos (poliketide synthetases o PKS) y la posibilidad de silenciarlos o combinar distintos módulos para alterar estructuras definidas suponen un salto significativo en el actual descubrimiento de drogas a partir de productos marinos. Un ejemplo práctico del empleo de la biotecnología aplicada a solventar el problema que supone el diseño de la producción industrial de estos PNM ha sido publicado por investigadores de PharmaMar en colaboración con científicos de la Universidad de León (Lombó et al., 2006): la producción heteróloga del antitumoral marino tiocoralina (véase la figura 12). Este depsipéptido, perteneciente a la fa-

FÁRMACOS DE ORIGEN MARINO 153

milia de las equinomicinas y los antibióticos quinoxalínicos, fue aislado del actinomiceto marino Micromonospora marina que, a su vez, fue aislado de un molusco en costas mozambiqueñas. Debido a la necesidad de cultivo en agua de mar de la bacteria productora, su posible industrialización se llevará a cabo mediante la expresión de los genes responsables en otro actinomiceto de carácter más industrial, como son especies de Streptomyces. Este mismo grupo de investigadores de PharmaMar también publicó la caracterización, knock-out y expresión heteróloga de los genes relacionados con la biosíntesis de la safracina B que, como se indicó anteriormente, es la fuente de partida de la fabricación de Yondelis (Velasco et al., 2005). En los EEUU, y gracias al grupo de M. Haygood, se identificó un simbionte en Bugula neritina de cuyo extracto se aisla la briostanina 1, descrita anteriormente. Este interesante compuesto podrá ser igualmente obtenido en cantidades industriales gracias al descubrimiento del material genómico de Candidatus endobugula sertula, simbionte que lleva las secuencias nucleótidas del PKS responsable de la biosíntesis de tal compuesto (Davidson et al., 2001). Ello demuestra el gran potencial de las herramientas moleculares en las investigaciones sobre simbiontes marinos, cada vez con mayor relevancia como posibles productores de compuestos marinos que se creían producidos por esponjas, tunicados y otros invertebrados (Woyke et al., 2006). Hay una enorme biodiversidad microbiana asociada a muestras marinas, y las formas procariotas llegan a suponer hasta el 60 % del peso de algunas esponjas. Esta microflora, detectada por tecnologías moleculares, apenas puede ser estudiada empleando conceptos clásicos de microbiología, ya que la inmensa mayoría de microbios no pueden ser llevados en condiciones

de cultivos puros al laboratorio (Taylor et al., 2007). Ante estas enormes expectativas, surge el concepto de metagenomas, con multitud de aplicaciones y que, en un futuro cercano, será el centro de la investigación marina en productos naturales. Esta tecnología se basa en la exploración de genes del DNA sin necesidad de cultivar a sus «dueños». Básicamente, se trata de: a) Recolectar muestras medioambientales como unos pocos gramos de esponjas, sedimentos marinos o agua de mar. b) Concentrar y limpiar el DNA que allí se encuentre. c) Cortarlo mediante enzimas de restricción a tamaños adecuados. Los tamaños vendrán determinados por el vector, siendo desde 5 kb hasta más de 100 kb en el caso de los cromosomas bacterianos artificiales (BAC). d) Insertarlo en vectores de clonaje, como fósmidos, cósmidos, BAC, etc. e) Transformar bacterias (Escherichia coli, Pseudomonas, Streptomyces, etc.) o levaduras (Pischia pastoris) mediante la inclusión del vector con la porción de DNA medioambiental a explorar. Podemos estar hablando de miles o millones de clones, dependiendo de la cantidad de DNA que se encuentre en la muestra. f) Cribado o búsqueda de clones activos. Esto puede realizarse de varias formas atendiendo al fin que se persiga: — Cribado de secuencias de interés: Mediante hibridación con secuencias homólogas de búsqueda. — Cribado por actividades. Ello implica la expresión del gen o los genes en los microorganismos transformados. Utilizado en la búsqueda de actividades enzimáticas o antimicrobianas, al poder rastrear miles de clones a la vez sobre medios de cultivo con el sustrato o germen problema y detectar los productos producidos por las porciones del DNA clonado.

154 F. DE LA CALLE

— Cribado por trampa genética o sustrato inducido (Ferrer et al., 2005). Esta tecnología se basa en la detección de clones de interés por cambios del fenotipo (morfología) de los clones. Estos cambios (son las llamadas blue colonies) se producen cuando el gen externo clonado expresa algún producto que sirva como inducción de operones (tipo lacZ) que produzcan esas variaciones. g) Seleccionar el clon o clones de interés y secuenciar el fragmento que ha dado actividad para conocer la secuencia entera y poder utilizarla industrialmente. El desarrollo de la metagenómica marina ya está dando sus frutos en el descubrimiento de nuevas o mejoradas actividades enzimáticas y está comenzando a utilizarse en la búsqueda de metabolitos novedosos (DeLong, 2005). En conclusión, la bioprospección marina está reportando multitud de pequeñas moléculas que pueden ser aplicadas en la salud humana. Entre los quince mil metabolitos marinos conocidos, una treintena de ellos está siendo probado en fases clínicas, principalmente en oncología, y algunos ya han sido aprobados para su comercialización. Diversas estrategias biotecnológicas han resuelto el complicado reto de conseguir un suministro recurrente de algunos de estos metabolitos, que se encuentran en cantidades ínfimas en invertebrados marinos. Sin embargo, gracias a la aplicación de nuevas herramientas moleculares que nos están mostrando que la biodiversidad marina va más allá de lo imaginable, al conocimiento de rutas bioquímicas relacionadas con ciclos celulares y biosíntesis de metabolitos secundarios, y a innovadoras estrategias de exploración como la metagenómica, podemos esperar en el futuro cercano un incremento significativo de nuevas e innovadoras moléculas.

BIBLIOGRAFÍA Blunt, J. W.; Copp, B. R.; Hu, W.; Munro, M. G.; Northcote, P. T.; Prinsep, M. R. (2007). «Marine Natural Products». Nat. Prod. Rev., 24: 81-86. Carballo, J. L.; Naranjo, S.; Kukurtçu, B.; Calle, F. de la (2000). «Production of Ecteinascidia turbinata for obtaining antitumor compounds». Journal of the World Aquaculture Society., 31: 481-491. Cuevas, C.; Pérez, M.; Martín, M. J.; Chicharro, J. L.; Fernández-Rivas, C.; Flores, M.; Francesch, A.; Gallego, P.; Zarzuelo, M.; Calle, F. De la; García, J.; Polanco, C.; Rodríguez, I; Manzanares, I. (2000). «Synthesis of ecteinascidin ET-743 and phtalascidin Pt-650 from cyanosafracin B». Org. Lett., 2: 2545-2548. Davidson, S. K.; Allen, S. W.; Lim, G. E.; Anderson, C. M.; Haygood, M. G. (2001). «Evidence for the biosynthesis of bryostatins by the bacterial symbiont candidatus Endobugula sertula of the Bryozoan Bugula neritina». Applied and Environmental Microbiology (octubre): 4531-4537. Delong, E. (2005). «Microbial community genomics in the ocean». Nature Reviews (juny) 3: 459-469. Donadio, S.; Moncardini, P.; Sosio, M. (2007). «Polyketide synthetases and non ribosomal peptide synthetases: the emerging view from bacterial genomics». Nat. Prod. Rev., DOI: 10.1039/b514050c. Drews, J. (2000). «Drug discovery: a historical perspective». Science, 287: 1960-1964. Ehrlich, H.; Etnoyer, P.; Meissner, H.; Hanke, T.; Born, R.; Scharnweber, D.; Worch. (2003). «Nanoimage and biomimetic potential of same Isididae corals». Erlanger Geol. Abh., 4: 34. Fenical, W.; Jensen P. R. (2006). «Developing a new resource for drug discovery: marine actinomycete bacteria». Nature chemical biology, 2: 666-673. Ferrer, M.; Martínez-Abarca, F.; Golyshin, P. (2005). «Mining genomes and metagenomes for novel catalysts». Current Opinion in Biotechnology, 16: 588593. Groll, M.; Huber, R.; Potts, B. C. (2006). «Crystal structure of salinosporamide A (NPI-0052) and B (NPI-0047) in complex with the 20S proteasome reveal important consequences of beta-lactone ring opening and a mechanism for irreversible binding». J. Am. Chem. Soc., 128: 5136-5141. Gunasekera, S. P.; Gunasekera, M.; Longley, R. E.; Schulte, G. K. (1990). «Discodermolide: a new bioactive polyhydroxylated lactone from the marine sponge Discodermia dissolute». J. Org. Chem., 55: 4912-4915. Harrigan, G,; Goetz, G. (2002). «Symbiotic and dietary marine microalgae as source of bioactive mole-

FÁRMACOS DE ORIGEN MARINO 155

cules: experience from natural products research». Journal of Applied Phycology, 14: 103-108. Kellenberger, E. (2001). «Exploring the unknown: the silent revolution of microbiology». EMBO Rep., 2: 5-7. Litaudon, M.; Hart, J. B.; Blunt, J.; Lake, R. J.; Munro, M. H. G. (1994). «Alkaloids from the Antarctic sponge Kirkpatrickia varialosa. Part 2: Variolin A and N(3´)-methyl tetrahydrovariolin B». Tetrahedron letters, 35: 943. Lombó, F.; Velasco, A.; Castro, A.; Calle, F. de la; Braña, A. F.; Sanchez-Puelles, J. M.; Méndez, C.; Salas, J. A. (2006). «Deciphering the biosintesis pathway of the antitumor thiocoraline from a marine Actinomycete and Its expression in two Streptomyces species». ChemBioChem, 7: 366-378. Nagle, D. G.; Zhou, Y.; Mora, F.; Mohammed, K. A.; Kim, Y. (2004). «Mechanism targeted discovery of antitumor marine natural products». Current Medicinal Chemistry, 11: 1725-1756. Olivera, B. M.; Gray, W. R.; Zeikus, R.; Mcintosh, J. M.; Varga, J.; Rever, J.; De Santos, W.; Cruz, L. J.; (1985). «Peptide neurotoxins from fish-hunting cone snails». Science, 230: 1338-1343. Payne, D. J.; Gwynn, M. N.; Holmes, D. J.; Pompliano, D. (2007). «Antibacterial discovery. Drugs for bad bugs». Nature Reviews. DrugDiscovery, 16: 29-40. Rouhi, A. M. (1995). «Supply issues complicate trek of chemicals from the sea». C&EN (20 de novembre): 42-44. Scheuer, P. J. (1996). «Marine metabolites as drug

leads-retrospect and prospect: in biochemical aspects of marine pharmacology». A: Lazarovivi, P.; Spira, M. E.; Zlotkin, E. [ed.]. Fort Collins: Alaken: 1-12. Taylor, M. W.; Radax, R.; Steger, D.; Wagner, M. (2007). «Sponge-associated microorganisms: evolution, ecology and biotechnological potential». Microbiology and Molecular Biology Reviews (juny): 295-347. Velasco, A.; Acebo, P.; Gomez, A.; Schleissner, C.; Rodríguez, P.; Aparicio, T.; Conde, S.; Muñoz, R.; Calle, F. de la; García, J. L.; Sanchez-Puelles, J. M. (2005). «Molecular characterization of the safracin biosynthetic pathway from pseudomonas fluorescens A2-2: Designing new cytotoxic compounds». Mol. Microbiol., 56: 144-154. Vries, D. J. de; Beart, P. M. (1995). «Fishing for drugs from the sea: status and strategies». TiPS, 16: 275279. Wang, S.; Guo, C. Y.; Castillo, A.; Dent, P.; Grant, S. (1998). «Effect of bryostatin 1 on taxol-induced apoptosis and cytotoxicity in human leukemia cells». Biochem. Pharmacol., 56: 635. Woyke, T.; Teeling, H.; Ivanova, N. N.; Hunteman, M.; Richter, M.; Gloecker, F. O.; Boffelli, D.; Dubilier, N. (2006). «Symbiosis insights thrpugh metagenomic analysis of a microbial consortium». Nature, DOI: 10.10387nature05192. Zengler, K.; Toledo, G.; Rappé, M.; Elkins, J.; Mathur, E. J.; Short, J. M.; Keller M. (2002). «Culturing the uncultured». PNAS, 99: 15681-15689.

DOI: 10.2436/20.1501.02.51

Les biotecnologies (Pere Puigdomènech i Francesc Gòdia, ed.) Treballs de la SCB. Vol. 58 (2007) 157-173

BIOPROCESSOS INDUSTRIALS. BIOCOMBUSTIBLES Francesc Gòdia i Carles Solà Departament d’Enginyeria Química, ETSE, Universitat Autònoma de Barcelona. Adreça per a la correspondència: Francesc Gòdia. Departament d’Enginyeria Química, ETSE, Universitat Autònoma de Barcelona. 08193 Bellaterra. Adreça electrònica: francesc.godia@uab.cat. RESUM La biotecnologia ha tingut ja un important impacte en la millora o substitució de processos químics industrials. En aquest capítol es revisen els aspectes més importants de l’anomenada biotecnologia blanca, i les seves principals aplicacions en diferents sectors: enzims industrials, indústria quimicofarmacèutica, producció de biopolímers i biocombustibles. Paraules clau: biotecnologia blanca, enzims industrials, biocatàlisi, biopolímers, biocombustibles. INDUSTRIAL BIOPROCESSES. BIOFUELS SUMMARY Biotecnology has already made an important impact in the improvement or replacement of industrial chemical processes. In this chapter, the most important aspects of White Biotechnology are reviewed, as well as the main applications in different sectors: industrial enzymes, chemico-phamaceutical industry, biopolymer production, and biofuels. Key words: white biotechnology, industrial enzymes, biocatalysis, biopolymers, biofuels. INTRODUCCIÓ La utilització d’enzims, microorganismes o parts dels mateixos en l’obtenció de productes industrials és una de les aplicacions ja consolidades de la biotecnologia, i recentment se’n fa referència de manera global

amb el terme biotecnologia blanca. L’elevada especificitat dels catalitzadors biològics, la capacitat de dur a terme en condicions suaus les reaccions en les quals intervenen (per exemple, pel que fa a temperatura, pressió o pH) i la possibilitat d’emprar matèries primeres noves, han estat els elements deter-

158 F. GÒDIA I C. SOLÀ

minants en la concepció i consolidació de nous processos industrials biotecnològics (bioprocessos) o en la substitució de processos industrials químics convencionals, de manera total o parcial, per bioprocessos. A més, cal emmarcar aquesta tendència en una dinàmica global en la qual els processos industrials evolucionen, i hauran d’evolucionar encara més, no solament en termes d’eficiència econòmica, sinó també en termes de menor impacte ambiental i utilització de matèries primeres renovables. Només amb aquests criteris es podrà desenvolupar una indústria sostenible, a escala mundial, que contribueixi al progrés sense malmetre el futur. En el futur, l’impacte de la biotecnologia en la indústria química anirà augmentant (Sijbesma, 2003). El darrer informe publicat per Burrill et al. (Biotechnology 2007. Life sciences: a global transformation) fa la previsió que l’any 2010 la biotecnologia industrial representarà el 10 % de les vendes de la indústria química, uns 125.000 milions de dòlars, mentre que l’any 2005 el sector va representar un 7 % de les vendes (77.000 milions de dòlars). La despesa en energies netes es preveu que es multiplicarà per quatre en la pròxima dècada, i això suposarà un mercat global de 226.000 milions de dòlars. Els avantatges fonamentals que es deriven dels bioprocessos a escala industrial són diversos (Hatti-Kaul et al., 2007). — La generació de catalitzadors més eficients, que poden catalitzar reaccions amb una elevada selectivitat, incloent-hi també reaccions estereoselectives i enantioespecífiques, que donen com a resultat productes molt purs i, per tant, amb pocs subproductes i processos de purificació menys intensius. — La reducció en el consum d’energia, derivada de la utilització de condicions de treball suaus, com ara temperatures moderades. — També el descobriment de microor-

ganismes extremòfils, que estan adaptats a viure en condicions extremes (temperatures molt elevades o molt baixes, alcalinitat o acidesa elevades, etc.) ha permès ampliar el ventall d’aplicacions industrials dels catalitzadors biològics. — La generació de menys residus a causa de la utilització de microorganismes permet substituir en un sol pas diferents etapes d’un procés convencional. — La utilització de matèries primeres renovables (per exemple, permeten desenvolupar una indústria basada en els biocombustibles en substitució del hidrocarburs, en via d’exhauriment) i la disminució de les emissions (CO2, residus...). — La menor utilització de compostos tòxics, com ara dissolvents, ja que moltes reaccions es produeixen en medis aquosos. — Finalment, l’obtenció de productes amb característiques noves que els milloren, com ara la seva biodegradabilitat. Els avenços recents en els aspectes més bàsics de la biotecnologia han estat elements facilitadors vitals per desenvolupar moltes de les noves aplicacions industrials. D’una banda la identificació de nous microorganismes i enzims mitjançant tècniques modernes de cribratge, la selecció de soques productores, la modificació genètica i, en definitiva, la conversió dels microorganismes en factories cel·lulars mitjançant l’enginyeria metabòlica; d’altra banda, la millora en el disseny, construcció i operació de plantes biotecnològiques ha permès portar a la pràctica nous processos de manera eficient. En aquest capítol es farà una breu ullada a la situació actual de les principals aplicacions dels bioprocessos industrials, en sectors tan diversos com la indústria quimicofarmacèutica, els detergents, el processament de la pasta de paper o els biopolímers. En aquest context, la generació de nous biocombustibles té un paper molt important, a causa de l’elevada dependència que en té la

BIOPROCESSOS INDUSTRIALS. BIOCOMBUSTIBLES 159

societat actual. És important destacar aquí que el sector anomenat biotecnologia blanca pot incloure des d’un producte bàsic, d’elevada producció i baix preu, com ara el bioetanol (uns trenta milions de tones produïdes el 2005, amb un preu de 0,4 €/kg), fins a un producte de química fina, amb baixa producció i elevat preu, com ara la vitamina B12 (vint tones produïdes el 2005, amb un preu de 25.000 €/kg). De manera general, s’utilitzen enzims quan es busquen aplicacions en les quals intervé només una o, en tot cas, molt poques reaccions. En canvi, quan la transformació requerida implica diferents passos, ja no sol ser rendible aïllar i purificar els enzims corresponents a cada etapa, i és més avantatjós l’ús de microorganismes. BIOPROCESSOS A més de tots els avenços moleculars, que han permès el desenvolupament de nous biocatalitzadors amb activitats noves i més eficients, cal fer esment explícit que la seva producció a l’escala final requerida en cada cas necessita el desenvolupament del bioprocés corresponent (Doran, 1995; Bailey i Ollis, 1986). Aquest desenvolupament comença una vegada s’ha definit i posat a punt el sistema biològic amb el qual s’obtindrà el producte corresponent, per exemple un enzim o una cèl·lula recombinant, en el qual s’inclou la definició del medi i les condicions de cultiu, les característiques del seu creixement i qualsevol aspecte que n’optimitzi el creixement i la producció. Un dels aspectes concrets que es poden definir en aquesta etapa és si la utilització del biocatalitzador es farà en forma lliure (cas habitual en la majoria de fermentacions, per exemple, en què l’obtenció de producte sol estar associada al creixement cel·lular), o en forma immobilitzada, sobre una matriu (cas freqüent quan es treballa amb enzims,

en què la biotransformació no està associada a creixement) (Guisán, 2006). També caldrà definir la forma d’operació del sistema: discontinu, discontinu alimentat, continu, etc. (Doran, 1995). Abans d’arribar a l’escala final de producció se solen fer proves en bioreactors de mida petita (primer reactors a escala de laboratori i després a escala pilot). En sistemes amb cèl·lules que creixen en suspensió el bioreactor industrial més habitual és el tanc agitat, mentre que si es treballa amb enzims en forma immobilitzada se solen emprar els bioreactors de llit reblerts. En aquesta etapa de canvi d’escala cal estudiar com aporta el bioreactor totes les condicions necessàries perquè el biocatalitzador continuï operant de manera òptima a una escala de volum superior. Aquí intervenen de manera directa una sèrie de processos físics, com ara la transferència de matèria, essencial en el cas de la transferència d’oxigen del corrent d’aire que alimenta el reactor al líquid del mateix, la transferència de calor, o les característiques de mescla en el líquid, importants per assegurar-ne l’homogeneïtat. En definitiva, cal que a escala de producció també es pugui assegurar que es mantenen la temperatura, el pH, la concentració d’oxigen, etc., òptims per al biocatalitzador a utilitzar. A més, cal comprovar que aspectes intrínsecs als bioreactors i a la seva operació no afectin negativament les cèl·lules. Cal comprovar que els efectes d’estrès associats a l’agitació mecànica, el bombolleig, les possibles manques d’homogeneïtat en tancs de gran volum, la presència d’escumes o la pressió hidrostàtica no imposin limitacions en el creixement cel· lular. Moltes vegades els resultats que s’obtenen en aquest procés obliguen a introduir canvis de disseny en els bioreactors per evitar alguna de les limitacions observades. El volum definitiu del procés de producció es podrà fixar després d’aquestes etapes, en funció de la producció final requerida i la

160 F. GÒDIA I C. SOLÀ

productivitat volumètrica assolida als bioreactors pilot. El disseny del bioprocés a escala de producció inclou el bioreactor com a nucli, però també ha de considerar altres aspectes essencials per garantir la correcta operació. En concret, tots els serveis associats, com el subministrament d’aire, l’equip d’esterilització, els equips de preparació i esterilització del medi, l’aigua de refrigeració o calefacció i tot el sistema de monitorització i control del procés. En sistemes que operin en continu s’hauran de desenvolupar sistemes de retenció cel·lular. Si el procés treballa de manera asèptica cal fer una atenció especial, ja que la dificultat de mantenir l’esterilitat en un bioreactor augmenta sensiblement a volums elevats, en què, a més, el risc de pèrdues en cas de contaminacions és molt elevat. Finalment, caldrà també reflectir totes les necessitats des del punt de vista de la bioseguretat quan es treballa amb cèl· lules patògenes. La segona part, que és tan important o més que el nucli del bioreactor, consisteix en tot el procés de purificació del producte. Cal tenir en compte que els bioprocessos solen assolir concentracions finals de producte molt baixes quan es comparen amb els processos químics, normalment per sota del 10 %. Per tant, el procés de recuperació del producte, reutilització del medi sobrant i purificació final, té una importància molt elevada i sovint acaba dictant l’economia global del procés. De fet, en alguns casos la purificació pot representar el 80-90 % dels costos d’un bioprocés. Com en el cas anterior, els sistemes de purificació també s’han d’estudiar i adaptar, primer a escala de laboratori i després a escala pilot, fins arribar a poder-los dissenyar a escala de producció. Finalment, cal fer esment de la importància que té considerar tots aquests aspectes associats a la producció final a gran escala des del primer moment en què es comencen a desenvolupar els biocatalitzadors. Per

exemple, si es treballa amb un sistema d’expressió en una cèl·lula que en créixer augmenta molt la viscositat del medi de cultiu, es pot arribar a la situació contradictòria que una cèl·lula amb una activitat molt interessant en el laboratori no es pugui portar a la indústria per problemes insalvables en la mescla i transferència d’oxigen de reactors de gran volum. També, una cèl·lula modificada per exportar proteïnes a través de la membrana de manera eficient pot, en canvi, tenir una elevada fragilitat en ser cultivada en sistemes agitats. Un últim exemple pot ser el d’afegir components al medi de cultiu per millorar la productivitat en els bioreactors, que dificulten molt, però, el procés de purificació. En conclusió, cal tenir en compte tots els diferents components que formen part d’un bioprocés, i que es recullen de manera esquemàtica a la figura 1, de manera integrada, per assolir resultats que permetin portar a terme els bioprocessos a escala industrial de manera òptima i rentable. LES APLICACIONS INDUSTRIALS DELS ENZIMS. BIOCATÀLISI Segurament una de les principals aplicacions industrials de la biotecnologia es pot englobar dins d’aquest apartat. La producció d’enzims ha esdevingut, de fet, un subsector industrial en si mateix, ja que els enzims poden ser directament part d’un producte final, com un detergent, o un biocatalitzador que permeti fer una determinada transformació d’un substrat en un producte, com ara la isomerització de glucosa a fructosa. El ventall d’aplicacions industrials dels enzims ha anat augmentant de manera continuada en les darreres dècades (Buchholz et al., 2005; Aehle, 2007), de la mà de la identificació de nous enzims amb noves activitats i del desenvolupament de processos optimitzats de fermentació en

BIOPROCESSOS INDUSTRIALS. BIOCOMBUSTIBLES 161

els quals es poden produir grans quantitats d’enzims de manera eficient i rentable. A més, l’aplicació de la tecnologia del DNA recombinant ha permès obtenir soques microbianes amb una elevada capacitat de produir enzims com a proteïnes heteròlogues, i també enzims específicament dissenyats mitjançant evolució dirigida o modificació genètica, capaços de dur a terme reaccions altament específiques i en condicions ambientals més extremes (Liese et al., 2006). Tot això fa que actualment més del 50 % del enzims emprats en processos industrials provinguin de microorganismes modificats genèticament (Gravilescu i Chisti, 2005). Cal tenir en compte també que en les aplicacions destinades als sectors de la salut i l’alimentació cal emprar soques considerades segures (GRAS) o de tipus i. Els enzims es poden classificar de moltes maneres, normalment en funció de la seva activitat catalítica. Pel que fa als principals grups amb aplicacions industrials, són:

Tanc de substrat

a) Proteases. Enzims que hidrolitzen les proteïnes en fragments més curts (polipèptids) i en alguns casos a aminoàcids. S’apliquen a la formulació de detergents, processament d’aliments, i síntesi quimicofarmacèutica. b) Carbohidrases. Enzims que hidrolitzen els polisacàrids a sucres senzills. S’apliquen en el camp de l’alimentació, la indústria de la pasta de paper, la indústria tèxtil i els detergents. c) Lipases. Enzims que hidrolitzen els triglicèrids a àcids grassos i glicerol. S’apliquen en el camp de l’alimentació, els detergents, el tractament d’efluents i la indústria farmacèutica. d) Pectinases. Enzims que permeten la degradació de la pectina, un polisacàrid complex que es troba a la fruita. S’apliquen en el camp de l’alimentació i de les begudes. e) Cel·lulases. Enzims que degraden la cel·lulosa a sucres. S’apliquen en el camp de

Fermentador

Tanc de producte

Tren d’equips de separació i purificació: centrifugació, ultrafiltració, cromatografia, etc. Figura 1. Esquema de les principals etapes que conformen un bioprocés.

162 F. GÒDIA I C. SOLÀ

la pasta de paper, la indústria tèxtil, els aliments, detergents i en el sector energètic. f) Amilases. Enzims que degraden l’estructura ramificada del midó i alliberen cadenes lineals de polisacàrids. S’apliquen en el camp de l’alimentació i la indústria tèxtil. g) Invertases. Enzims que catalitzen reaccions d’isomerització. S’apliquen en el camp de l’alimentació i en la indústria quimicofarmacèutica. h) Ligninases. Degradació dels compostos de lignina. S’apliquen en la indústria de la pasta de paper. Per ordre d’importància, el sector de l’alimentació representa un 30-45 % de les aplicacions, el dels detergents està al voltant del 33 %, el de la indústria tèxtil i de la pasta de paper és el 10-18 %, i el de la indústria quimicofarmacèutica un 5 % del mercat mundial (Dechema, 2004). El mercat global de la indústria dels enzims és molt notable i se situava en 1.800.000 € durant el període 2004-2005. Està clarament dominat per empreses europees, entre les quals destaquen les daneses, com Novozymes, Chr. Hansen o Danisco, que en conjunt dominen més del 50 % del mercat mundial dels enzims. En el cas dels detergents, els enzims són directament part del producte mateix. La incorporació d’enzims als detergents es va iniciar en els anys seixanta, i actualment els enzims emprats inclouen un ampli ventall: proteases, amilases, cel·lulases i lipases. Els avantatges principals són la reducció de la temperatura i el temps de rentatge, cosa que afavoreix la qualitat del resultat, redueix el consum d’energia i també l’impacte ambiental a causa de la biodegradabilitat dels enzims. S’estima que una disminució de la temperatura de rentatge de 95 °C a 40 °C redueix el consum d’energia en un 70 %. Les aplicacions principals són en detergents per a rentadores de roba i de plats. Els enzims es processen en forma encapsulada per evitar reaccions al·lèrgiques per contacte direc-

te o per inhalació (fet que es va observar al principi en els treballadors de les plantes de preparació de detergents amb enzims): de fet, aquesta és també la raó per la qual encara no s’utilitzen en detergents d’aplicació en superfícies obertes. La utilització dels enzims en el camp de l’alimentació és molt notable, com s’ha comentat. Les indústries làcties, de panificació i begudes aglutinen un percentatge molt important de les aplicacions. Les proteases s’utilitzen en la coagulació de la llet i les lipases milloren l’aroma dels formatges en potenciar-ne la maduració. Les lactases permeten trencar la molècula de lactosa en glucosa i galactosa i, per tant, permeten preparar productes sense lactosa. En la panificació s’utilitzen amilases per millorar la textura del pa, per estabilitzar i condicionar la massa de panificació (xilanases, lipases i fosfolipases), i per enfortir-la (glucosa-oxidasa i lipooxigenasa). En la producció de la cervesa els enzims intervenen en diferents etapes, com ara en l’addició d’enzims als ja produïts en l’ordi per afavorir el procés de producció, la utilització d’amilases, glucanases i proteases per hidrolitzar els sucres de la malta, de betaglucanases i arabinoxilanases per millorar la filtrabilitat, i d’amiloglucosidases i pul·lulanases per a la preparació de cervesa baixa en calories, entre altres. En la producció de sucs de fruita, les pectinases s’utilitzen per a la clarificació. La papaïna, una proteasa, s’utilitza per entendrir la carn i afavorir-ne la cocció. Segurament els enzims que han tingut un major impacte, però, en el camp de la preparació d’aliments, pel seu gran volum, són els que s’utilitzen en l’obtenció de sucres a partir del midó. De fet, els avantatges que representa aquest procés han fet que hagi substituït de manera completa, i en pocs anys, el procés anterior, basat en la hidròlisi àcida a temperatura alta. El midó presenta en la seva estructura (vegeu la figura 2) cadenes d’amilosa, un polisacàrid

BIOPROCESSOS INDUSTRIALS. BIOCOMBUSTIBLES 163

lineal format per enllaços α-1,4 entre molècules d’α-D-glucosa, i d’amilopectina, d’estructura ramificada que es produeix a causa dels enllaços α-1,6 entre molècules d’α-D-glucosa situades en diferents cadenes d’amilosa. L’estructura ramificada del midó és més soluble que l’estructura lineal, que dóna molta viscositat a les solucions de midó. El procés d’hidròlisi enzimàtica del midó, normalment a partir dels grànuls obtinguts del blat de moro, necessita, doncs, combinar diferents activitats enzimàtiques i en condicions diferents. Dels dos components, el més difícil d’hidrolitzar és l’amilopectina, ja que la majoria d’enzims ataquen els enllaços α-1,4, però per arribar a una hidròlisi com més completa millor cal també hidrolitzar els enllaços α-1,6, que representen un 4-6 % de la glucosa present en el midó. El procés consta bàsicament de tres etapes: gelatinització, liqüefacció i sacarifi-

cació. Es parteix d’una suspensió aquosa de grànuls de midó, a una concentració del 30-40 % en pes, a pH 6-6,5, amb 20-80 ppm de Ca2+, que actua com a estabilitzant i activador dels enzims. El procés de gelatinització implica la dissolució del midó per formar una solució viscosa. En aquesta etapa ja s’afegeix un dels enzims, l’α-amilasa (1,4-α-D-glucan-glucanohidrolasa), que és capaç d’hidrolitzar enllaços α-1,4, però no els enllaços α-1,6. El procés es realitza en continu, durant cinc minuts, en reactors tubulars, i un dels principal avenços ha estat el desenvolupament d’α-amilases (a partir de Bacillus licheniformis) altament termostables, que permeten realitzar el procés a 105 °C mitjançant injecció directa de vapor. En el segon pas, la liqüefacció, que es realitza en tancs a 90-100 °C durant dues hores, es completa l’acció de les amilases i s’arriba a un grau de sacarificació d’un 8-12 %, i una

Amilosa

Amilopectina

Glucosa

Fructosa

Figura 2. Estructures dels principals compostos involucrats en el procés d’hidròlisi del midó per a l’obtenció de sucres.

164 F. GÒDIA I C. SOLÀ

viscositat sensiblement reduïda. A continuació es pot procedir a la tercera etapa del procés, la sacarificació, que normalment es realitza en tancs en discontinu (tot i que es pot mantenir l’alimentació en altres etapes contínues del procés mitjançant la utilització d’un nombre de tancs igual o superior a sis) durant 72 h, a pH 4,5 i 60 °C, i en la qual es combinen dos tipus d’enzims. D’una banda, les anomenades glucoamilases (1,4-α-D-glucan-glucohidrolasa), que alliberen β-D-glucosa tant dels enllaços α-1,4 com dels α-1,6, i també dels menys freqüents α-1,3. Aquests enzims se solen obtenir a partir del cultiu d’A. niger. I de l’altra, s’afegeixen enzims desramificadors, és a dir, pul·lulanases o isoamilases, que són capaços d’hidrolitzar els punts de ramificació de l’amilopectina d’una manera molt més ràpida que les glucoamilases. El desenvolupament de pul·lulanases que puguin ser estables i actives en les mateixes condicions que les glucoamilases (a partir de B. acidopullulyticus) ha estat un dels desenvolupaments més importants per optimitzar aquest procés i, d’aquesta manera, assolir rendiments de sacarificació al voltant del 99 %. Entre les diferents aplicacions de la glucosa obtinguda per hidròlisi del midó cal destacar l’obtenció de xarops rics en fructosa, que també es basa en un procés enzimàtic. En aquest cas, la utilització de l’enzim glucosa-isomerasa, que catalitza la transformació de la glucosa en fructosa, en forma immobilitzada sobre suports, permet operar processos en continu, a 60-70 °C i pH 6,8-7,2. El poder edulcorant major de la fructosa i el contingut menor en calories respecte a la sacarosa fa que aquest xarop tingui una utilització important en l’edulcoració de begudes, gelats, etc. El tercer gran grup d’aplicacions industrials dels enzims és el de la indústria del paper i la indústria tèxtil. La matèria primera per a la producció de paper és la cel·lulosa

obtinguda de la fusta. Hi ha diferents punts en els quals es poden utilitzar enzims, però la seva introducció encara no està generalitzada del tot. Els enzims més àmpliament emprats són les xilanases, que s’utilitzen per millorar l’extracció de lignines en el procés de blanquejament de la polpa de paper. Un dels principals avantatges de la seva utilització és la important reducció en l’ús de clor (fins a un 90 %) en aquest procés, amb la disminució conseqüent de compostos orgànics clorats en les aigües residuals de les plantes. Un dels punts d’aplicació addicionals és la introducció, relativament recent, de cel·lulases i hemicel·lulases, en el procés d’eliminació de la tinta, quan es processa polpa de paper provinent de reciclatge (a Europa un 55 % del paper produït el 2004 provenia de paper reciclat). Pel que fa a la indústria tèxtil, l’impacte més important de l’ús d’enzims ha estat en les fases finals del procés de producció dels teixits, l’anomenat acabat, i en particular per al cas de les fibres de cotó. Un dels processos més generalitzats és la utilització d’amilases per eliminar restes de midó després del procés de teixir. També s’han començat a introduir els enzims, encara que no de manera generalitzada, en les operacions d’eliminació de restes de components de les parets cel·lulars, com ara ceres i olis, mitjançant pectinases. També en bastants processos s’utilitzen catalases per eliminar el peròxid d’hidrogen sobrant en el procés de blanqueig, i s’evita així haver de fer diferents cicles d’esbandit dels teixits en aigua calenta, fet que implica una reducció del 80 % en l’ús de substàncies químiques, un 20 % de reducció en l’aigua emprada i un 10 % dels costos energètics. Les cel·lulases s’utilitzen per millorar la qualitat final dels teixits i, de fet, representen uns dos terços de les vendes d’enzims en aquest sector.

BIOPROCESSOS INDUSTRIALS. BIOCOMBUSTIBLES 165

LA BIOCATÀLISI EN LA INDÚSTRIA QUIMICOFARMACÈUTICA La biotecnologia ha entrat a formar part dels processos de la indústria química, bé mitjançant la utilització d’enzims o microorganismes. Normalment s’està produint la substitució d’un o més passos en processos químics ja establerts per un sol pas biocatalític, fet que comporta una reducció de matèries primeres, subproductes, residus o ús d’energia. Els principals sectors en què s’ha produït un major impacte, a banda dels dels biopolímers i els biocombustibles, que es tracten en apartats específics, són: a) La producció d’aminoàcids, com ara àcid L-glutàmic, L-lisina, L-trionina o Lmetionina. b) La producció d’àcids orgànics, com ara cítric, làctic, succínic i glucònic. c) La producció de vitamines, com ara la vitamina C, la B12 o la riboflavina. d) La producció d’antibiòtics i els seus derivats, com ara l’àcid 6-aminopenicil·lànic, la D-p-hidroxifenilglicina o l’àcid 7-aminocefalosporínic. La producció d’antibiòtics β-lactàmics és un molt bon exemple de la contribució i l’evolució de la biotecnologia en l’obtenció de productes de gran volum. Els antibiòtics β-lactàmics es poden diferenciar en dues grans famílies, les penicil·lines i les cefalosporines (Elander, 2003) i, tot i que es van començar a desenvolupar fa diverses dècades, els anys 1999-2000, encara representaven el 65 % del mercat mundial d’antibiòtics. En ambdós casos hi ha tota una família de molècules, derivades fonamentalment de la modificació de la penicil·lina i la cefalosporina, amb l’eliminació de la seva cadena lateral i amb l’alliberament de la part nuclear de la molècula, a la qual després s’afegeixen diferents radicals per obtenir els diferents antibiòtics (Queener i Neuss, 1982). En aquest procés es combinen etapes químiques i biotecnològiques, però de manera

cada vegada més marcada les primeres estan deixant lloc a les segones. S’anomenen en general antibiòtics semisintètics, ja que una part de la síntesi és biològica, mentre que l’addició dels radicals es fa habitualment per via de síntesi química. A la figura 3 es poden observar les estructures dels principals components implicats en aquests processos. El procés es comença en tots els casos mitjançant una fermentació, normalment en tancs de gran volum, que poden arribar als 250 m3, cosa que sense dubte és també un esforç notable d’enginyeria. Les soques habitualment emprades són Penicillium chrysogenum i Cephalosporium acremonium, i s’ha fet una gran evolució en l’obtenció de soques millorades, durant anys de recerca contínua de noves soques i de la millora per enginyeria genètica, que permeten

Nucli de les penicil·lines

Àcid 6-aminopenicil·lànic (6-APA)

Nucli de les cefalosporines

Àcid 7-aminocefalosporínic (7-ACA)

CH3 CH3

Àcid 7-aminodeacetoxicefalosporínic (7-ADCA)

Cefalexina

Figura 3. Estructures dels principals compostos involucrats en el procés d’obtenció d’antibiòtics semisintètics.

166 F. GÒDIA I C. SOLÀ

una producció major de l’antibiòtic buscat o establir noves rutes de biosíntesi en afegir activitats noves a un determinat microorganisme. A partir de la molècula bàsica d’antibiòtic es generen les molècules d’àcid 6-aminopenicil·lànic (6-APA), en el cas de la penicil·lina, o d’àcid 7-aminocefalosporànic (7-ACA) en el cas de la cefalosporina. L’obtenció de 6-APA mitjançant la via química implica la utilització de dimetilclorsilà, NN′-dimetilanilina, fosfopentaclorur i amoni, i es realitza a –40 °C. En canvi, la via enzimàtica mitjançant la penicil·lina-acilasa utilitza només amoni, i es realitza a una temperatura de 30 °C. Pel que fa als dissolvents emprats, per a una mateixa quantitat de producte, cinc-centes tones de 6-APA, cal emprar 10.000 m3 d’aigua per la via enzimàtica, mentre que per la via química calen 4.200 m3 de diclormetà i 4.200 m3 de n-butanol. Aquestes han estat raons de pes a l’hora d’adoptar la via enzimàtica en els processos d’obtenció d’antibiòtics derivats de la penicil·lina. D’altra banda, unes dues terceres parts dels antibiòtics comercials es deriven de la molècula de 7-ACA, de la qual es produeixen entre quatre mil i cinc mil tones a l’any. L’alliberament de la molècula de 7-ACA a partir de la cefalosporina es pot fer per via química, però també per via enzimàtica, en un procés en dues etapes, en què intervenen els enzims D-aminoàcid-oxidasa i glutaril-acilasa, o en un procés en una sola etapa, basat en l’enzim cefalosporinaC-acilasa. La producció d’enzims recombinants ha permès que més d’un 20 % dels processos químics ja hagin estat substituïts per processos biològics. Un dels exemples recents més singulars ha estat el desenvolupament, per part de l’empresa DSM, d’una via de producció completament biotecnològica per a l’obtenció de l’antibiòtic cefalexina, un antibiòtic de la família de les cefalosporines (Bruggink i Nossin, 2006). Aquest antibiòtic es produïa a partir d’una fermentació amb Penicillium chrysogenum seguida

d’un conjunt de passos de síntesi química, fins a tretze. La nova ruta biotecnològica té només tres etapes. La primera és una fermentació amb una soca recombinant de P. chrysogenum, en la qual s’ha clonat l’activitat del enzim expandasa (anomenat així perquè expandeix l’anell de cinc àtoms del nucli de les penicil·lines al de sis àtoms de les cefalosporines), que permet obtenir directament adipoil-7-ADCA en comptes de penicil·lina G. A continuació es fan dues transformacions enzimàtiques, catalitzades per la glutaril-acilasa i la penicil-acilasa, per arribar al producte final. Cal mencionar la important reducció en l’ús de dissolvents i reactius orgànics que ha representat la introducció d’aquest nou procés, fins a un 90 %, la reducció de la necessitat d’energia en un 40 % i dels residus generats en un 15 %. La combinació d’aquests factors ha permès reduir els costos en un 50 %. Aquest procés ha estat desenvolupat per DSM i industrialitzat el 2001. La nova soca permet arribar de manera més fàcil a l’intermediari 7-ADCA, a partir del qual s’han pogut obtenir tota una sèrie de nous antibiòtics. Un segon exemple, entre molts, el podem trobar en la producció de l’aminoàcid L-lisina. En general els aminoàcids s’han d’afegir en diferents quantitats als aliments, ja que les fonts naturals d’aminoàcids no permeten abastir la demanda. Tenint en compte que la forma biològicament activa dels aminoàcids és l’enantiòmer L i que la síntesi química convencional produeix mescles racèmiques que cal separar, la majoria d’aminoàcids s’obtenen per mètodes biotecnològics, bé mitjançant enzims o fermentació, i també de l’extracció a partir de fonts naturals (Aida et al., 1986). La lisina és un aminoàcid essencial, que s’ha d’incloure en l’alimentació per assolir els requeriments nutricionals, tant en humans com en animals. La seva producció fou d’un milió de tones el 2006, i representa un percentatge elevat de la producció global d’aminoàcids.

BIOPROCESSOS INDUSTRIALS. BIOCOMBUSTIBLES 167

La lisina es produeix actualment només per la via de la fermentació. S’utilitzen soques de Chorynebacterium glutamicum i Brevibacterium flavum, amb diferents tipus de modificacions genètiques per augmentar els rendiments en lisina i evitar la formació de subproductes (Anastassiadis, 2007). LA PRODUCCIÓ DE BIOPOLÍMERS Els plàstics i els polímers són els materials més emprats al món, amb una producció de 224 milions de tones l’any 2004. No obstant això, l’obtenció de plàstics està basada en els derivats del petroli i, per tant, en matèries primeres no renovables. A més, tant les matèries primeres com els productes no són biodegradables (amb algunes excepcions, ja que es poden produir plàstics biodegradables a partir de derivats del petroli), cosa que significa un desavantatge addicional des del punt de vista de l’impacte ambiental. La producció de polímers a partir de matèries primeres renovables, és a dir, glúcids, per biotecnologia, representa una alternativa vertadera a aquesta problemàtica (Gross i Kaira, 2002), que ja s’està començant a desenvolupar industrialment (Kaplan, 1998). Tot i que des de fa anys s’han desenvolupat polímers derivats del midó i de la cel·lulosa, el que actualment s’entén com a nous polímers basats en la biotecnologia, i que es plantegen com a substituts dels plàstics actuals, es poden agrupar en dos grans tipus: a) Els derivats de l’àcid làctic. En aquest cas es parteix com a matèria primera de sucre o de midó, i aquest darrer cal hidrolitzar-lo a glucosa seguint el procés descrit en l’apartat corresponent. A continuació es realitza una fermentació a àcid làctic, mitjançant diferents soques del bacteri Lactobacillus. Una manera habitual de millorar el rendiment de les fermentacions és l’eliminació de l’efecte inhibidor del producte

final mateix, l’àcid làctic, mitjançant neutralització amb hidròxid o carbonat càlcic i formació de lactat càlcic en solució. En finalitzar la fermentació es filtra la solució de lactat càlcic per eliminar-ne les impureses, com ara les mateixes cèl·lules responsables de la fermentació, s’evapora, es recristal· litza i finalment s’acidifica amb àcid sulfúric per obtenir l’àcid làctic. El procés produeix quantitats importants de sulfat de calci, i l’àcid obtingut requereix una purificació posterior per eliminar restes de proteïnes i glúcids. L’àcid làctic es pot assecar i extrudir per obtenir un material amb propietats termoplàstiques, o es pot polimeritzar químicament per a obtenir àcid polilàctic (PLA), que té propietats molt interessants com a polímer termoplàstic i biodegradable (Gupta et al., 2007), i que després es pot processar per obtenir diferents productes del camp dels embalatges, fibres tèxtils i, de manera molt notable, materials biocompatibles i biodegradables per a aplicacions mèdiques. També es poden produir tota una sèrie de copolímers basats en el PLA. La polimerització es fa a partir del ciclodímer de l’àcid làctic (lactida), mitjançant una reacció d’esterificació que es produeix amb l’obertura dels anells (a la figura 4 es poden observar les estructures d’aquests compostos). Una de les primeres instal·lacions industrials en què s’ha desenvolupat aquest procés és el resultat d’una aliança entre un dels principals productors de blat de moro als EUA, Cargill, i una empresa petroquímica, Dow Chemicals, fet que no deixa de ser significatiu, tot i que actualment Dow Chemicals s’ha retirat de l’explotació. Aquesta planta produeix el polímer NatureWorks, un dels primers plàstics biodegradables derivats de glúcids, i se’n produeixen 140.000 tones/any. Recentment l’empresa japonesa Tejin Ltd. Japan s’ha associat a Cargill en la producció de NatureWorks. També recentment, a finals de 2007, s’ha creat una nova associació entre dues empreses, Galactic i Total

168 F. GÒDIA I C. SOLÀ

Petrochemicals, per construir una nova planta de PLA a Bèlgica, amb capacitat de producció de 1.500 tones/any. A Holanda, l’empresa Rodenburg BioPolymers també produeix un polímer derivat de l’àcid làctic, Solanyl, amb una capacitat de producció de 40 000 tones/any. b) Els polihidroxialcanoats (PHA). Els PHA són bioèsters, formats per hidròxids grassos que, de fet, són una classe especial de polímers de reserva. Són sintetitzats per un ampli ventall de bacteris, en els quals es dipositen com a inclusions citoplasmàtiques insolubles. El factor clau en aquest procés és l’expansió (de manera natural o recombinant) de l’enzim polièster-sintetasa (Rehm, 2007). Es coneixen cinquanta-nou gens de polièster-sintetasa en quaranta-cinc microorganismes diferents. L’enzim permet el pas de conversió dels tioèsters (R)-hidroxiacil-CoA a polièster, amb alliberament de CoA (Reddy et al., 2003). En aquest cas també ja hi ha alguns processos industrials, com per exemple el cas de Metabolix, una empresa que produeix PHA amb un elevat grau de puresa per a aplicacions mèdiques, i que ja disposa d’una planta pilot per a la fabricació de 1.000 tones/any de l’anomenat Biopol. A més, cal destacar també en aquest apartat la utilització de materials basats en la fermentació o els enzims per modificar polímers ja existents, tot i que en aquests casos no són biodegradables. El procés més antic que utilitza la biocatàlisi en un procés de producció d’un polímer és la conversió

enzimàtica de l’acrilonitril (CH2CHCN) a acrilamida (CH2CHCONH2), per poder ser emprada després en l’obtenció de poliacrilamida. Aquest és un exemple de les aplicacions del grup de les nitril-hidratases (Nhases), normalment obtingudes de soques recombinants de Rhodococcus, que permeten convertir els grups nitrils a amides en condicions suaus (Yamada et al., 2001). El procés industrial pioner en aquesta transformació el va desenvolupar al Japó l’empresa Nitto Chemical Industry (actualment Mitsubishi Rayon Co.), i representa una reducció del 80 % dels costos d’energia i l’obtenció d’una acrilamida de puresa major que la que s’obtenia per la via química, en eliminar-ne quasi completament el principal subproducte, l’àcid acrílic. El procés es realitza amb enzims immobilitzats que, de fet, s’obtenen mitjançant enllaç creuat directe de les cèl·lules de Rhodococcus amb una matriu de poliacrilamida-dimetilaminoetilmetacrilat. En aquest procés s’arriben a obtenir concentracions finals de fins a 200 g/l d’acrilamida, i se’n produeixen unes quatre mil tones l’any. La producció mundial (sobretot localitzada al Japó) de polímers d’acrilamida basats en biotecnologia és d’unes 100.000 tones/any. Un altre exemple destacat en aquest camp és la utilització de 1,3-propandiol obtingut per fermentació a partir de sucres en la producció de polimetilenterftalat (PTT) que, de fet, ha donat lloc a un nou tipus de fibra de polièster que s’anomena Sorona. Aquest procés ha estat portat a la producció indusCatalitzador + Calor

Àcid làctic

Lactida

Polilactida

Figura 4. Estructures dels principals compostos involucrats en el procés de polimerització de PLA.

BIOPROCESSOS INDUSTRIALS. BIOCOMBUSTIBLES 169

trial mitjançant un acord entre Tate & Lyle i DuPont, que té capacitat de producció de 23.000-45.000 tones. El desenvolupament d’una soca d’Escherichia coli modificada genèticament ha estat la clau per a la industrialització del bioprocés. La soca productora té divuit gens modificats, i ha representat un important esforç d’enginyeria metabòlica (Nakamura i Whited, 2003), ja que s’han incorporat a E. coli gens fonamentals trobats en altres organismes per a les dues rutes metabòliques principals implicades, la transformació de glucosa a glicerol (en què intervenen la dihidroxiacetona-3fosfat-deshidrogenasa i la glicerol-3-fosfat fosfatasa), i la transformació del glicerol a 1,3-propandiol (on intervenen la gliceroldeshidratasa i trimetilenglicol-deshidrogenasa); a més ha calgut incorporar també una sèrie de gens reguladors. El resultat final és una soca capaç de produir 135 g/l de 1,3-propandiol, amb un 51 % de rendiment en pes a partir de glucosa. El Bio-PDO, com s’anomena comercialment, té tota una sèrie d’usos en l’elaboració de polímers i productes plàstics nous. La producció de polímers basats en biotecnologia suposa encara avui dia un percentatge petit de la producció total. De fet, en la majoria dels casos els preus de venda encara són superiors als dels polímers obtinguts per via petroquímica. No obstant això, aquesta situació molt probablement canviarà en el futur, a mesura que la disponibilitat de recursos derivats del petroli disminueixi. ELS BIOCOMBUSTIBLES L’augment dels preus del petroli, la disminució de les seves reserves i la preocupació sobre el canvi climàtic i els nivells creixents de CO2 a l’atmosfera han tornat a posar de relleu la utilització de matèries renovables com a font d’energia. La utilització de fonts

renovables d’energia (des de plantes riques en sucre i midó fins a materials lignocel· lulòsics, que poden incloure tant residus de l’agricultura i l’explotació forestal, com plantacions específiques per a aquesta finalitat) comporta de manera global una disminució de les emissions de gasos amb efecte d’hivernacle, ja que en la seva producció s’ha produït fixació de CO2, i suposa una font energètica molt més distribuïda des del punt de vista geogràfic, que pot generar treball en les àrees rurals. Dels diferents tipus de biocombustibles que s’estan desenvolupant, avui dia els únics que s’estan explotant a escala industrial són el biodièsel i el bioetanol. Si s’hi afegeix l’etilterbutilèter (ETBE), obtingut parcialment a partir de bioetanol, tindrem el 90 % del mercat actual dels biocombustibles (Antoni et al., 2007). L’obtenció de biocombustibles per biotecnologia ja és actualment rendible des del punt de vista econòmic, a causa de l’encariment del preu del cru de petroli. En aquest context, la producció d’etanol per fermentació, a partir de material provinent de biomassa de plantes, és el desenvolupament més rellevant i, de fet, el producte biotecnològic que es produeix en més quantitat al món (uns trenta milions de tones l’any 2005), ja que des de fa anys s’està utilitzant en molts països com a combustible, en especial al Brasil i als EUA. En el cas del Brasil representa un 14 % del total del combustible emprat. Es fan servir des de mescles amb gasolina fins a motors que operen amb etanol, passant pels nous motors flexibles o híbrids, que permeten combinacions de carburants. Les matèries primeres varien en funció dels països. Al Brasil s’utilitza la canya de sucre, als EUA, el blat de moro, i a Europa la remolatxa, el blat i el vi. Els processos anomenats de primera generació, els primers que es van instal·lar i que actualment funcionen a escala industrial, es basen en la fermentació de la glucosa a etanol mitjançant llevats com els del gènere

170 F. GÒDIA I C. SOLÀ

Saccharomyces. Hi ha moltes plantes ja instal· lades i en funcionament, i cal assenyalar en aquest apartat que la primera companyia europea productora de bioetanol és l’espanyola Abengoa, que té un percentatge molt elevat de la seva producció als EUA. Un procés a partir de blat de moro té les etapes següents (vegeu la figura 5): — Mòlta del blat de moro. — Liqüefacció mitjançant els enzims αamilases. — Sacarificació mitjançant glucoamilases. — Fermentació de la solució de sucres amb llevats. Normalment la majoria de plantes tenen instal·lats processos en continu, mitjançant tancs en sèrie, que permeten optimitzar la producció, en concret minimitzant els efectes de la inhibició per producte que es dóna en la fase final del procés fermentatiu.

— Rectificació. L’etanol, que al final de la fermentació es troba en una concentració al voltant del 10 % en pes, se separa de l’aigua mitjançant rectificació. S’obté en una concentració d’un 95 %, a causa de la formació d’un azeòtrop. Com a subproducte de la rectificació s’obté una mescla dels sòlids no fermentables i els llevats produïts al llarg de la fermentació. — Deshidratació. Mitjançant filtres moleculars se separa l’aigua restant, fins assolir etanol completament deshidratat i pur. — Desnaturalització. L’etanol es barreja amb un 2-3 % de gasolina per evitar que sigui utilitzat amb finalitats diferents que les de combustible. — Subproductes. Cal mencionar que la planta de bioetanol produeix principalment dos subproductes. D’una banda, els components pesants de la rectificació, que contenen sòlids no fermentables, els lle-

Blat de moro

Recepció del gra Massa

Hidròlisi enzimàtica

Amoni Enzims

Xarop de glucosa

Fermentació

CO2 Desnaturalitzant

Brou (10 % etanol)

Rectificació

Emmagatzematge

Deshidratació Etanol 95 %

Combustibles

Etanol 100 %

Residus

Centrifugació

Emmagatzematge

Assecatge DDG

Brou (10 % etanol)

Condensats

Evaporació Xarop

Figura 5. Esquema d’un procés industrial d’obtenció de bioetanol a partir de blat de moro.

Alimentació animal

BIOPROCESSOS INDUSTRIALS. BIOCOMBUSTIBLES 171

vats mateixos, restes de proteïnes i glúcids. Aquesta fracció es deshidrata i esdevé un subproducte valorat com a suplement per a l’alimentació animal (dried distilled grains, DDG). D’altra banda, el CO2 produït durant la fermentació se sol recuperar, filtrar i comprimir, per ser utilitzat en empreses de producció de begudes carbòniques. Aquests processos de producció de bioetanol de primera generació han permès un primer desenvolupament del mercat, lligat a la major facilitat d’utilització de les matèries primeres. No obstant això, aquestes matèries, que també són necessàries per a l’alimentació humana i animal, no seran suficients per assolir una producció de bioetanol realment significativa (per exemple, a la UE es vol assolir un 20 % de substitució dels combustibles fòssils per biocombustibles per al 2020). Per això, la utilització de materials lignocel·lulòsics es considera la vertadera alternativa per al desenvolupament dels processos de segona generació (Hahn-Hägerdal et al., 2006). Aquests materials són d’utilització més complexa, i el seu desenvolupament eficient haurà de considerar diferents aspectes. En primer lloc, la despolimerització de la cel·lulosa i l’hemicel· lulosa present en aquests materials a sucres solubles. Aquí hi ha dos factors importants: el pretractament (Galbe i Zacchi, 2007), que varia en funció del tipus de matèria primera (oxidació humida, tractament amb vapor, amb àcids, etc.), i la hidròlisi enzimàtica, amb els enzims cel·lulases i β-glucosidases. Un dels colls d’ampolla se situa actualment en l’absència d’enzims prou eficients a costos assequibles. Cal tenir en compte també que en aquesta etapa es poden produir components minoritaris (derivats de furà, àcids orgànics, compostos fenòlics i inorgànics, etc.) que poden ser inhibidors de l’etapa de fermentació. En segon lloc, el procés de fermentació és més complex, ja que el brou a fermentar conté una barreja d’hexoses i pentoses, a banda dels compostos amb potenci-

al d’inhibició ja esmentats. Això ha obligat a fer un esforç molt important en el desenvolupament de noves soques que permetin fermentar simultàniament els dos tipus de sucres. Així, per exemple, s’han desenvolupat soques del llevat Saccharomyces cerevisiae que, a més de la seva capacitat natural per fermentar hexoses, incorporen gens per als enzims responsables de la metabolització de xilosa en Picchia stipitis o d’altres que incorporen el gen de la xilosa-isomerasa del bacteri Thermus thermophilus (Hahn-Hägerdal, 2007). En tercer lloc, és fonamental avançar en nous conceptes d’integració de procés per minimitzar la demanda d’energia. Una alternativa clara en aquest sentit és la realització del procés simultani d’hidròlisi i fermentació (SSF). Un dels avantatges d’aquest procés és l’eliminació immediata de l’efecte inhibitori que tenen els sucres obtinguts en la hidròlisi enzimàtica mateixa, ja que són consumits contínuament en el procés de fermentació. En resum, serà la millora combinada en tots aquests aspectes el que podrà portar finalment la producció de bioetanol a partir de materials lignocel· lulòsics a l’explotació industrial de manera econòmica (Wyman, 2007; Stephanopoulos et al., 2007). L’interès creixent en aquests processos es reflecteix amb exemples com la decisió del Departament d’Energia dels EUA d’invertir 385 milions de dòlars en quatre anys en sis projectes de biorefineries per produir etanol a partir de diferents materials lignocel·lulòsics, la més gran de les quals serà construïda per Abengoa Bioenergy a Missouri i produirà unes 35.000 tones/any d’etanol a partir de palla de blat, pellofes de blat de moro i altres materials. Pel que fa al biodièsel, cal mencionar que, de fet, no és un procés que es pugui considerar biotecnològic com a tal (Antoni et al., 2007), tot i que la seva font sigui l’aprofitament de residus d’olis vegetals i presenti avantatges clars de tipus ambiental. El biodièsel és un monoalquil èster obtingut

172 F. GÒDIA I C. SOLÀ

dels àcids grassos dels olis vegetals, que actualment s’obté per transesterificació amb metanol, obtingut per via petroquímica. En el futur, la biotecnologia podria contribuir a aquest procés, en concret mitjançant la substitució del metanol per altres alcohols obtinguts per fermentació i en la utilització d’enzims o microorganismes recombinants per dur a terme la transesterificació, producte que s’ha anomenat microdièsel (Kalscheuer et al., 2006). També s’ha proposat la utilització de microalgues per a la producció de la matèria primera (oli) de manera intensiva (Yusuf, 2007). CONCLUSIONS La biotecnologia ha fet ja aportacions importants als processos industrials, i els ha fet més segurs, rendibles en termes econòmics i energètics, respectuosos amb el medi ambient, i eficients. Aquestes primeres aplicacions, algunes de les quals s’han tractat en aquest capítol, s’hauran d’anar ampliant i millorant, de manera que l’impacte augmenti en el futur proper. Per assolir-ho caldrà basar-se en una explotació intensiva del potencial de les tecnologies facilitadores, que permetin desenvolupar biocatalitzadors nous i més eficients, i en una aproximació més integrada i optimitzada dels processos biotecnològics. El desenvolupament d’una indústria sostenible, amb matèries primeres renovables i impacte menor en el medi ambient, passa en gran part per la biotecnologia com a vector de futur. BIBLIOGRAFIA Aehle, W. (2007). Enzymes in industry: production and applications. Berlín: Wiley-VCH. Aida, K.; Ichiba, I.; Nakayama, K.; Takinami, K.; Yamada, H. (1986). Biotechnology of amino acid production. Àmsterdam: Elsevier.

Anastassiadis, S. (2007). «L-lysine fermentation». Rec. Pat. on Biotechnol., 1:11-24. Antoni, D.; Zverlov, V. V.; Schwarz, W. H. (2007). «Biofuels from microbes». Appl. Microbiol. Biotechnol., 77: 23-35. Bailey, J. E.; Ollis, D. F. (1986). Biochemical Engineering Fundamentals, 2a ed., Nova York: McGraw-Hill. Bruggink, A.; Nossin, P. (2006). «Assessment of biobased pharmaceuticals: the cephalexin case». A: Dewulf, J. [ed.]. Renewables-Based Technology. Nova York: John Wiley & Sons: 315-329. Buchholz, K.; Kasche, V.; Bornscheuer, U. T. (2005). Biocatlyst and Enzyme Technology. Weinheim: Wiley-VCH. Doran, P. (1995). Bioprocess Engineering Principles. Londres: Academic Press. Elander, R. P. (2003). «Industrial production of betalactam antibiotics». Appl. Microbiol. Biotechnol., 61: 385-392. Galbe, M.; Zacchi, G. (2007). «Pretreatment of lignocellulosic materials for efficient bioethanol production». Adv. Biochem. Eng. Biotechnol., 108: 41-65. Gravilescu, M.; Chisti, Y. (2005). «Biotechnology: a sustainable alternative for chemical industry». Biotechnology Advances, 23: 471-499. Gross, R. A.; Kaira, B. (2002). «Biodegradable polymers for the environment». Science, 297: 803-807. Guisán, J. M. (2006). Immobilization of enzymes and cells. Totowa: Humana Press. Gupta, B.; Revagade, N.; Hilborn, J. (2007). «Poly(lactic acid) fiber: an overview». Polym. Sc., 32: 435-482. Hahn-Hägerdal, B.; Galbe, M.; Gorwa-Granslund, M. F.; Lidén, G.; Zacchi, G. (2006). «Bio-ethanolthe fuels of tomorrow from the residues of today». Trends in Biotechnol., 24: 549-556. Hahn-Hagerdal, B.; Karhumaa, K.; Fonseca, C.; Spencer-Martins, I.; Gorwa-Grauslund, M. F. (2007). «Towards industrial pentose-fermenting yeast strains». Appl. Microbiol. Biotechnol., 74: 937953. Hatti-Kaul, R.; Törnvall, U.; Gustafsson, L.; Börjesson, P. (2007). «Industrial biotechnology for the production of bio-based chemicals-a cradle-to-grave perspective». Trends in Biotechnol., 25: 119-124. Kalscheuer, R.; Stölting, T.; Steinbüchel, A. (2006). «Microdiesel: Escherichia coli engineered for fuel production». Microbiol., 152: 2529-2536. Kaplan, D. L. (1998). Biopolymers from renewable resources. Berlín: Springer. Liese, A.; Seelbach, K.; Wandrey, C. (2006). Industrial biotransformations. 2a ed. Weinheim: Wiley-VCH. Nakamura, C.; Whited, G. (2003). «Metabolic engineering for the mirobial production on 1,3-propanediol». Curr. Opin. Biotechnol., 14: 454-459. Queener, S. W.; Neuss, N. (1982). «The biosynthesis of

BIOPROCESSOS INDUSTRIALS. BIOCOMBUSTIBLES 173

the betalactam antibiotics», A: Morin, R. B.; Gorman, M. [ed.]. Chemistry and biology of beta-lactam antibiotics, vol. 3. Nova York: Academic Press: 1100. Reddy, C. S. K.; Ghaii, R.; Rashmi, K. C. (2003). «Polyhydroxyalkanoates: an overview». Bioresour. Technol., 87: 137-146. Rehm, B. H. A. (2003). «Polyester synthases: natural catalysts for plastics». Biochem. J., 376: 15-33. Sijbesma, F. (2003). «White biotechnology: gateway to more sustainable future» [en línia]. Europabio. <www.europabio.org> Stephanopoulos, G. (2007). «Challenges in engine-

ering microbes for biofuels production». Science, 315: 801-804. Wyman, C. E. (2007). «What is (and is not) vital to advancing cellulosic ethanol». Trends Biotechnol., 25: 153-157. Yamada, H.; Shimizu, S.; Kobayashi, M. (2001). «Hydratases involved in nitrile conversion: screening, characterization and application». Chem. Rec., 1: 152-161. Yusuf, C. (2007). «Biodiesel from microalgae». Biotechnol. Adv., 3: 294-306.

DOI: 10.2436/20.1501.02.52

Les biotecnologies (Pere Puigdomènech i Francesc Gòdia, ed.) Treballs de la SCB. Vol. 58 (2007) 175-186

BIOTECNOLOGIA I MEDI AMBIENT Anicet R. Blanch Departament de Microbiologia, Universitat de Barcelona. Adreça per a la correspondència: Anicet R. Blanch. Departament de Microbiologia, Universitat de Barcelona. Diagonal, 645. 08028 Barcelona. Adreça electrònica: ablanch@ub.edu. RESUM La biotecnologia ambiental comprèn el conjunt d’activitats tecnològiques que ens permeten comprendre i gestionar els sistemes biològics en el medi ambient, per tal de proveir productes i serveis. Actualment la gestió del medi ambient i dels seus recursos naturals no s’entén si no es realitza de manera sostenible. L’avenç del coneixement científic i tecnològic permet a la biotecnologia ambiental desenvolupar noves eines i aplicacions per respondre als principals reptes ambientals actuals. Entre aquests cal destacar la disponibilitat de recursos hídrics i energètics. El paper essencial que tenen els consorcis microbians, no solament en el cicle dels elements sinó també en el funcionament dels ecosistemes naturals, ha comportat una estreta relació entre la biotecnologia ambiental i l’ecologia microbiana. El desenvolupament de noves metodologies basades en la genòmica, proteòmica i metabolòmica, han permès a la biotecnologia ambiental plantejar noves perspectives a partir del coneixement estructural i funcional d’aquests consorcis microbians. Els principals àmbits d’interès actual de la biotecnologia ambiental són els aspectes mediambientals relacionats amb el canvi climàtic, la cerca de noves fonts energètiques renovables i alternatives, la millora dels processos de reciclatge, l’aprofitament i gestió dels recursos hídrics i la millora de les interaccions entre salut i medi ambient. Paraules clau: medi ambient, consorcis microbians, recursos naturals, sostenibilitat, mètodes moleculars. BIOTECHNOLOGY AND ENVIRONMENT SUMMARY Environmental biotechnology comprises technological activities to allow understanding and managing biological systems in the environment in order to provide goods and services. Sustainability is an essential request on the management of environment and

176 A. R. BLANCH

their natural resources. New technological and scientific knowledge supports environmental biotechnology on the development of new tools and applications by providing answers to environmental challenges, such as the availability of water and energy resources. The essential role of microbial consortia, not only on the cycling of elements but also in the functioning of natural ecosystems, confers an inherent relation between environmental biotechnology and microbial ecology. New methodologies—based on genomics, proteomics and metabolomics—allow environmental biotechnology to consider new perspectives supported by recent understanding of the structure and function of microbial consortia. At present, main fields of interest in environmental biotechnology are topics related to climatic change, renewable and alternative energy sources, improvement of recycling process, proper use and management of water resources, and upgrading health and environment interactions. Key words: environment, microbial consortia, natural resources, sustainability, molecular methods. INTRODUCCIÓ La gestió del medi ambient s’enfronta actualment amb una demanda social imperativa: la sostenibilitat. Diferents activitats biotecnològiques han esdevingut unes eines metodològiques determinants per mantenir i preservar els recursos naturals, i al mateix temps facilitar el desenvolupament de les activitats humanes en una societat pròspera. Habitualment, el conjunt d’aquestes activitats es reuneix sota la denominació de biotecnologia ambiental. El seu desenvolupament depèn en gran part dels avenços de diferents àrees científiques, així com del coneixement dels materials. La biotecnologia ambiental ha adquirit en els darrers anys un paper destacat entre les diferents activitats de la biotecnologia. Aquest fet resulta entenedor si tenim en compte que dins de les necessitats determinades per la sostenibilitat trobem dos recursos que han esdevingut els principals reptes del segle xxi: l’aigua i l’energia. El proveïment d’aigua presenta de manera inherent un compromís de qualitat, que comporta sovint diferents tractaments per eliminar o mitigar riscs sanitaris i millorar les característiques organolèptiques de l’aigua. A més, aquest proveïment s’ha

de realitzar de manera contínua i sostenible, assegurant el retorn de l’aigua usada a la natura amb uns nivells de qualitat, tant des del punt de vista del sanejament per a la protecció de la salut humana, com des de l’impacte de l’aigua contaminada en els ecosistemes naturals. S’estima que actualment hi ha al voltant d’un 20 % de la població humana que no disposa d’un proveïment d’aigua de qualitat, i quasi un 40 % que no disposa de sistemes de sanejament acceptables. Per tant, el subministrament i el sanejament de l’aigua tenen un protagonisme important dins de les aplicacions biotecnològiques en el medi ambient. La disponibilitat d’energia és una necessitat determinant per al funcionament de les societats desenvolupades. Els requeriments energètics són necessaris en els diferents àmbits de les activitats humanes, tant les domèstiques com les industrials, agrícoles i ramaderes, o també aquelles relacionades amb el lleure o els serveis. L’increment de la població humana i una positiva extensió d’una major qualitat de vida per a un major nombre d’humans en el darrer segle ens han situat davant d’un escenari de crisi energètica global. Aquests dos aspectes han fet que en les darreres dècades la utilització de fonts energètiques fòssils s’hagi accele-

BIOTECNOLOGIA I MEDI AMBIENT 177

rat i, atenent a la seva limitada disponibilitat i al plantejament de sostenibilitat abans indicat, ens enfrontem a un imminent repte tecnològic: la disponibilitat de fonts energètiques renovables i que veritablement resultin alternatives. La biotecnologia ambiental contribueix en gran part al desenvolupament de processos de conversió de fonts energètiques renovables (principalment biomassa i energia solar) a reserves energètiques útils. Aquestes bioenergies renovables poden esdevenir una aportació important per alleugerir una crisi energètica global. Els esforços més importants s’estan fent en el desenvolupament de mètodes alternatius de producció d’electricitat. Aquests mètodes pretenen produir energia a partir de recursos renovables sense una emissió neta de diòxid de carboni. Hi tenim com a exemple la bioelectricitat produïda pels generadors microbians d’electricitat (microbial fuel cell) (Du et al., 2007). D’altres potencials fonts energètiques alternatives cconsideren la utilització del metabolisme microbià per produir gas natural (metà), etanol o hidrogen. És evident que, tot i que l’aigua i l’energia resulten recursos molt importants en la societat actual, l’aportació de la biotecnologia ambiental en la gestió del medi ambient té implicacions científiques i tecnològiques més enllà d’aquests dos requeriments. En els propers apartats analitzarem el domini d’estudi de la biotecnologia ambiental i la seva estreta relació amb l’ecologia microbiana, les seves bases científiques conceptuals, els avantatges i limitacions de les metodologies tradicionals i les noves aproximacions moleculars i les activitats actuals de major interès. DOMINI DE LA BIOTECNOLOGIA AMBIENTAL Les aplicacions biotecnològiques que tra-

dicionalment s’han relacionat amb la gestió del medi ambient o amb l’aprofitament dels recursos naturals han estat aquelles que s’apliquen als sistemes biològics per prevenir, mitigar o eliminar la presència de compostos contaminants en el medi ambient (Watanabe i Baker, 2000). Tal i com s’ha comentat anteriorment, tradicionalment ens hem referit a aquestes activitats tecnològiques com a biotecnologia ambiental. L’avantatge d’utilitzar aquests tractaments biològics en lloc d’altres de tipus físic o químic ha estat que els processos biològics presenten un cost relativament més baix i comporten una menor alteració del medi ambient. Aquests mètodes biològics comporten una degradació dels compostos orgànics contaminants a compostos inorgànics que, en els casos ideals, resulten innocus (per exemple, CO2, H2O, Cl–, etc.). A més, els procediments de tractament dels contaminants en l’ambient per mètodes físics i químics sovint simplement transfereixen el contaminant a una ubicació diferent per mitigar o controlar-lo més adequadament. Durant molts anys, les activitats biotecnològiques relacionades amb el medi ambient han fet que la biotecnologia ambiental se centrés i fonamentés principalment en la capacitat degradadora dels compostos contaminants per part de l’activitat metabòlica que presenten els consorcis microbians presents en els ecosistemes naturals. Aquesta visió tradicional de la biotecnologia ambiental, basada en l’ús dels processos de biodegradació microbiana, ha fet que durant molt de temps l’esforç tecnològic i de recerca s’orientés a: a) aïllar bacteris del medi ambient, b) classificar-los i caracteritzar-los fisiològicament, c) analitzar les seves capacitats enzimàtiques degradadores i d) en alguns casos intentar realitzar amb aquests una millora genètica per obtenir soques altament eficients en la degradació de compostos orgànics contaminants (Watanabe, 1997).

178 A. R. BLANCH

Ara bé, sovint s’ha observat que hi ha discrepàncies fisiològiques entre la capacitat metabòlica del bacteri degradador aïllat i la capacitat de biodegradació natural que presenten els consorcis microbians en els ecosistemes. Això ha fet considerar en alguns casos els consorcis microbians naturals com a «caixes negres» amb capacitats degradadores (Bragg et al., 1994; Swannell et al., 1996). El desenvolupament de nous mètodes moleculars i la seva aplicació en els estudis d’ecologia microbiana ens ha permès constatar que les poblacions microbianes del medi ambient són molt més diverses que els microorganismes aïllats i estudiats en condicions de cultiu pur en el laboratori. Aquest darrer procediment d’estudi és el que s’ha utilitzat durant molt de temps per a les aplicacions tradicionals de la biotecnologia ambiental. Els avenços metodològics facilitats per l’aplicació dels nous mètodes moleculars en l’ecologia microbiana han permès noves aproximacions conceptuals a aquesta branca de la microbiologia. Així, tant les noves tecnologies moleculars com les noves aproximacions conceptuals de l’ecologia microbiana han estat la base per a un avenç diferencial en el coneixement dels consorcis microbians i la gestió de processos en la biotecnologia ambiental. La conseqüència ha estat un estret lligam del desenvolupament de l’ecologia microbiana amb el de la biotecnologia ambiental. Aquesta relació ha fet en els darrers anys estendre l’àmbit de les aplicacions biotecnològiques derivades de la comprensió dels consorcis microbians més enllà dels processos degradadors de compostos contaminants en el medi ambient. Com a conseqüència, l’ecologia microbiana proveeix els fonaments científics per al desenvolupament de processos aplicats, que són els objectius pràctics perseguits per la biotecnologia ambiental. Per altra banda, els processos derivats de la biotecnologia ambiental faciliten l’estudi d’ecosistemes

interessants per a l’ecologia microbiana, fet que li permet avançar conceptualment i desenvolupar noves metodologies (Rittman, 2006). Aquesta estreta relació, i sobretot la disponibilitat de noves metodologies moleculars i nous conceptes bàsics per entendre el funcionament dels sistemes microbians en el medi ambient, ha ampliat l’àmbit de les activitats previstes per la biotecnologia ambiental més enllà de la seva definició tradicional. Així, actualment cal definir la biotecnologia ambiental com el conjunt d’activitats tecnològiques que ens permeten comprendre i gestionar els sistemes biològics (principalment els sistemes microbians) en el medi ambient per proveir productes i serveis a la societat. Conseqüentment, la biotecnologia ambiental no pot només considerar la microbiota present en l’aigua, l’aire i el sòl que ens envolta per desenvolupar aplicacions biotecnològiques mediambientals, sinó que també ha de tenir en compte, per exemple, les poblacions microbianes presents en el tracte gastrointestinal. Aquestes poblacions són una part del món exterior en l’interior dels animals vius. Resta oberta la discussió sobre si hem de considerar aquestes comunitats microbianes com uns consorcis accidentals o com a unitats funcionals metagenòmiques (Tringe et al., 2005). Ara bé, el que és evident és que són un enorme recurs de gens i de funcions biològiques, fins i tot probablement més enllà del que s’estima actualment mitjançant tècniques metagenòmiques per a la caracterització molecular de poblacions microbianes. Un dels reptes per a les properes dècades de la microbiologia (i, més particularment, de la biotecnologia microbiana aplicada al medi ambient) és el coneixement i la gestió d’aquests recursos microbians. En els darrers anys, els estudis impartits en les escoles d’estudis empresarials i de negocis han

BIOTECNOLOGIA I MEDI AMBIENT 179

introduït i utilitzat el concepte de la gestió dels recursos humans com una eina essencial per poder dirigir empreses i establir plans estratègics. De la mateixa manera podem considerar que durant els propers anys serà essencial per a la biotecnologia ambiental comprendre i gestionar els recursos microbians en el medi ambient (concepte que s’anomena, en anglès, microbial resource management, MRM) per proveir productes i serveis biotecnològics a la nostra societat. Aquesta nova aproximació conceptual i metodològica ens pot permetre entendre, utilitzar i gestionar adequadament el nostre entorn (Verstraete, 2007). BASES CONCEPTUALS I NOVES APROXIMACIONS METODOLÒGIQUES PER A L’ESTUDI DE LA MICROBIOTA AMBIENTAL Normalment aquestes comunitats microbianes són sistemes biològics molt complexos que resulten de difícil estudi i, conseqüentment poden esdevenir d’utilització o aplicació biotecnològica gairebé impossibles. Per poder-les entendre i gestionar, la biotecnologia ambiental continua basant-se en una sèrie de conceptes científics bàsics (Verstraete, 2007): a) El concepte de Beijerinck: la majoria dels microorganismes hi són a tot arreu, però s’accepta que en hi ha casos en què el processos de bioaugment (increment condicionat d’una població microbiana que ens interessa en un procés determinat) resulten imprescindibles per millorar o recuperar un entorn natural alterat (Boon et al., 2002; Vaithiyanathan et al., 2005). b) El concepte d’associació nínxol-organisme de Darwin: ens proposa que existeix una adaptació d’un microorganisme a les tasques que presenta un nínxol en el medi ambient.

c) La teoria neutral de Hubbel: l’entrada de noves espècies en un ecosistema resulta determinant en la creació de nous nínxols ecològics, i el microorganisme és qui genera les seves pròpies tasques i nínxols (Hubbell i Borda-De-Agua, 2004). Aquesta teoria contrasta i ens condiciona el concepte anterior, en què el microorganisme no presenta un paper determinant. d) El principi de Pareto 80/20: ens planteja que la distribució d’espècies respon al principi 80/20 de Pareto, pel qual hem d’assumir que el 80 % de l’energia d’un ecosistema microbià (les activitats metabòliques en el cas dels consorcis microbians del nostre interès) està directament relacionada amb el 20 % de les poblacions microbianes presents (Dejonghe et al., 2001). e) La successió de poblacions microbianes en un consorci: ens planteja que hi ha un canvi continuat i una successió cooperativa en el consorci microbià d’un entorn en concret, més que una comunitat microbiana estable (Curtis i Sloan, 2004). Llavors resulta determinant poder conèixer quan i en quina freqüència es donen aquests canvis o successions cooperatives, i quina és la persistència de les comunitats microbianes a situacions d’estrès. Addicionalment a aquests conceptes científics bàsics, l’ecologia microbiana disposa actualment d’un conjunt de nous mètodes moleculars que permeten a la biotecnologia ambiental plantejar l’estudi de quatre aspectes fonamentals: — L’estructura i composició de les poblacions microbianes en els consorcis. — El potencial fenotípic de la comunitat entès com les capacitats dels microorganismes del consorci per realitzar les transformacions bioquímiques que ens interessin. — Les reaccions bioquímiques que cada membre del consorci realitza dins de l’activitat metabòlica global de la comunitat microbiana. — Les interaccions entre els membres

180 A. R. BLANCH

constituents del consorci i les seves interaccions amb el medi. Aquesta nova informació, conjuntament amb les bases conceptuals indicades anteriorment, proporciona a la biotecnologia ambiental un horitzó més ampli d’actuació basant-se en la gestió dels recursos microbians naturals (MRM). AVANTATGES I LIMITACIONS DELS MÈTODES TRADICIONALS I ELS NOUS MÈTODES MOLECULARS Hi ha hagut tradicionalment dues maneres metodològiques de realitzar els estudis en la biotecnologia ambiental: a) Les metodologies basades en l’aïllament del microorganisme d’interès i en la caracterització de les seves funcions metabòliques a partir del seu estudi en el laboratori mitjançant el cultiu pur. El coneixement que ens permet aquesta aproximació metodològica té la limitació que les situacions generades en el laboratori i la informació que en deriva sota condicions de cultiu pur sovint no resulten fàcils de transferir al que ocorre en el medi natural, o fins i tot no resulta possible d’interpretar quan s’analitzen aquestes funcions metabòliques com una part de tot l’ecosistema. Aquesta limitació es deu a la complexitat dels consorcis microbians i les seves interaccions amb l’entorn. b) Les metodologies basades en l’anàlisi del consorci microbià considerant-lo tot com una unitat funcional. Tot i que aquesta aproximació pot resultar més empírica, en algunes circumstàncies pot resultar més pràctica. No obstant això, presenta la limitació que no detectem les estructures o els grups rellevants fisiològicament en el consorci, i perdem possibilitats d’intervenció sobre aquests. La combinació de les dues aproximacions metodològiques s’ha vist facilitada des de

la dècada dels anys vuitanta pel desenvolupament de les noves tècniques moleculars. Aquestes noves tècniques de biologia molecular ens permeten encarar els estudis dels consorcis microbians in situ, avaluant la composició i estructura de poblacions presents, les funcions metabòliques que realitzen, la identificació dels microorganismes rellevants en el consorci (environmental relevant microorganisms), l’aïllament d’aquests microorganismes i la manipulació o gestió dels processos desenvolupats pel consorci. En un principi, l’observació microscòpica i les tècniques de cultiu foren pràcticament els únics mètodes utilitzats per identificar els microorganismes (principalment els bacteris) presents en el medi ambient. La simplicitat i l’elevada similitud morfològica de moltes espècies bacterianes resultava un factor limitant per als estudis amb microscòpia. Cal també afegir que algunes espècies bacterianes poden adoptar diferents morfologies sota condicions fisiològiques diferents (Roszak i Colwell, 1987; Edwards, 2000). Per altra banda, les tècniques de cultiu (enumeració de cèl·lules viables i cultivables sobre placa o la tècnica del nombre més probable) s’han utilitzat per a una quantificació de cèl·lules actives en mostres ambientals. Ara bé, els medis de cultiu comporten una selecció d’aquells microorganismes que estan en un estat metabòlicament viable i que, a més, resulten cultivables en les especificitats que determinen els components del medi. Els microorganismes que es troben en una situació no cultivable o no viable no seran capaços de multiplicar-se en aquests medis i, per tant, ens esbiaixaran qualsevol anàlisi estructural o funcional del consorci microbià (Colwell, 2000; Ramaiah et al., 2002; Mar Lleò et al., 2005). Aquest problema ha estat identificat quan s’han combinat tècniques d’enumeració en cultiu amb tècniques d’enumeració basades en microscòpia, veient que el nombre de microorganismes comptats amb aquestes dar-

BIOTECNOLOGIA I MEDI AMBIENT 181

reres tècniques superava en alguns ordres de magnitud els nombres detectats amb el cultiu (Torsvik et al., 1990; Hoefel et al., 2003; Kirk et al., 2004). En la majoria dels casos, els mètodes tradicionals basats en el cultiu només detecten una fracció molt petita dels microorganismes presents en un consorci. Contrastant amb els mètodes tradicionals ens trobem els nous mètodes moleculars que ens permeten descriure l’estructura i les activitats metabòliques de les poblacions presents en el consorci microbià. Un nombre important de les tècniques moleculars es fonamenta en les seqüències específiques que presenten els àcids nucleics en els éssers vius. Així, l’amplificació ràpida i selectiva del DNA amb una varietat de tècniques basades en la reacció en cadena de la polimerasa (PCR, polymerase chain reaction) i les tècniques d’hibridació d’àcids nucleics amb oligonucleòtids específics ens proveeixen informació genòmica tant dels microorganismes individualment com de les seves poblacions senceres (Olsen et al., 1986; Amann et al., 1995). Aquestes anàlisis poden realitzar-se mitjançant un ampli ventall de mètodes que ens faciliten diferent informació en un dels àmbits següents: — Identificació filogenètica dels microorganismes. Principalment, l’estudi de les seqüències de les unitats petites de l’RNA ribosòmic (16S en procariotes i 18S en eucariotes) ha proporcionat una nova eina per a la identificació microbiana i els estudis filogenètics. — Genotipatge i fenotipatge d’individus i poblacions. Disposem d’un ampli ventall de tècniques miniaturitzades per al fenotipatge, i mètodes per al genotipatge, com són l’amplificació selectiva de determinats gens diferencials i l’estudi posterior dels fragments amplificats (per exemple: DGGE, denaturing gradient gel electrophoresis; RT-PCR, reverse-transcription polymerase chain reaction), i l’anàlisi dels perfils dels fragments de digestió mitjançant enzims de restric-

ció (per exemple, la tècnica RFLP, restriction fragment length polymorphism). Aquestes metodologies estan facilitant analitzar la diversitat microbiana en els ecosistemes (Muyzer, 1999; Freeman, 1999). — Estructuració i organització del consorci. L’anàlisi dels RNA missatgers presents en un consorci microbià ens permet conèixer quins gens s’estan expressant en un moment concret i, per tant, quines funcions s’estan donant per part del consorci. Si addicionalment es realitza un estudi mitjançant microscòpia amb visualització de les dianes de l’RNA expressat amb tècniques d’hibridació in situ (FISH, fluorescence in situ hybridization), podem obtenir informació sobre l’estructura, organització i funcions del consorci microbià (Amann et al., 1990; Amman et al., 2001). Per tant, el desenvolupament de tècniques genòmiques més o menys sofisticades ha resultat de gran utilitat per descriure l’estadi en què es troben un nombre important de gens en un moment determinat en un entorn específic (Lajoi et al., 2002; Gentry et al., 2006). Tot i així, aquestes tècniques d’anàlisi genòmica o metagenòmica en poblacions microbianes ambientals no ens permeten encara comprendre com els sistemes naturals contenen desenes de milers de microorganismes diferents, tal i com ens els trobem en el tracte intestinal o en un llot actiu d’una planta depuradora d’aigües. Actualment es proposa el concepte de metaboloma, que ens ajudaria a comprendre quins microorganismes són essencials i com es beneficien selectivament de les seves accions metabòliques pròpies dins d’un ecosistema en concret. Sabem que els processos naturals de selecció microbiana desplacen fàcilment qualsevol metabolisme accidental que ens interessi a nosaltres i, per tant, l’èxit de processos d’intervenció ambiental necessita mecanismes actius per al manteniment d’un determinat metabolisme. També s’ha

182 A. R. BLANCH

plantejat la introducció de microorganismes manipulats genèticament per realitzar tasques especifiques en el medi, però aquests microorganismes seleccionats de manera artificial resulten sovint competidors molt dolents en entorns naturals. Sovint no poden superar els diferents condicionants ambientals per al creixement o fins i tot per a la supervivència. Per tant, podria ser que ens haguéssim de preocupar més de disposar de tècniques que ens permetin l’ús de soques microbianes naturals mantingudes adequadament dins d’una comunitat natural, que de generar sofisticats microorganismes manipulats genèticament per obtenir noves combinacions artificials de gens (Boon et al., 2002; Watanabe et al., 2002; Vaithiyanathan et al., 2005). Això permetria estabilitzar aquestes soques naturals de microorganismes o bé facilitar que els seus gens que codifiquen les propietats del nostre interès puguin ser transferits horitzontalment a altres poblacions microbianes presents en el mateix ecosistema (Taghavi et al., 2005). A més de poder establir un llistat d’espècies bacterianes i els seus gens que es troben específicament en un ecosistema concret mitjançant les noves tècniques moleculars, caldrà establir durant els propers anys les relacions entre la diversitat i el volum (quantitat de microorganismes en un ecosistema) (Gast et al., 2006) i les transformacions metabòliques que es realitzen per part dels microorganismes, així com valorar el balanç energètic (Ishii et al., 2005; Ishii et al., 2006). ÀMBITS ACTUALS D’INTERÈS EN LA BIOTECNOLOGIA AMBIENTAL Podem diferenciar cinc grans àmbits d’aplicació de la biotecnologia ambiental, en què probablement hi haurà contribucions destacables durant els propers anys:

a) El canvi climàtic. El control de les emissions de CO2 per part del sòl i la possibilitat de segrestar quantitats important de carboni en el sòl mitjançant canvis significatius en les pràctiques agrícoles rutinàries pot esdevenir una de les contribucions en la regulació del canvis climàtics que podrien afectar-nos en les properes dècades (Rosenberg i Izaurralde, 2001). També podem afegir-hi el control o la prevenció de les emissions de metà procedent dels residus, de pràctiques agrícoles i de sistemes naturals. Existeixen algunes aproximacions metodològiques que es basen en l’objectiu d’eliminar metà atmosfèric a través de bacteris metanotròfics del sòl (Boecks et al., 1997; Mohanty et al., 2006). b) Energies alternatives. Tal i com s’ha indicat anteriorment, la disponibilitat de noves fonts energètiques renovables està esdevenint un dels objectius tecnològics més destacables del segle xxi. Tot i que fins al moment les possibles contribucions per part de microorganismes són limitades i algunes de les propostes s’han quedat a escala experimental de laboratori o de planta pilot, cal no menystenir algunes aportacions potencials. Entre aquestes poden destacar la síntesi d’hidrogen per part de noves soques d’arqueus o la producció de l’anomenada bioelectricitat mitjançant els generadors microbians d’energia (microbial fuel cells). Aquestes unitats estan basades a generar electricitat directament a partir de l’oxidació de compostos orgànics per part del metabolisme bacterià (soques dels gèneres Geobacter o Rhodoferax) en transferir els electrons a un ànode en lloc de fer-ho a un acceptor tradicional d’electrons (Lovley, 2006; Rabaey et al., 2003; Rabaey i Verstraete, 2005; Du et al., 2007). També caldrà valorar en un futur els progressos que s’aconsegueixin en l’augment del rendiment energètic a gran escala de les diferents fonts de bioenergia (metà, etanol i hidrogen, principalment). Aquestes procedeixen de la degradació de la matèria

BIOTECNOLOGIA I MEDI AMBIENT 183

orgànica en diverses rutes del catabolisme microbià, i presenten diferents eficiències energètiques (Rittman, 2006). c) Processos de reciclatge. La sostenibilitat mediambiental de determinades activitats humanes està estretament relacionada amb un reciclatge efectiu de molts elements i compostos en els ecosistemes. La comprensió de l’estructura i de les funcions dels consorcis microbians ens pot proporcionar eines per a la descontaminació de sòls i sediments, l’eliminació de contaminats en l’aire i la degradació de compostos recalcitrants procedents de diferents activitats humanes. Tenim com a exemple la biodegradació de compostos aromàtics, que resulta essencial per mantenir el cicle del carboni al planeta. Aquesta degradació es pot aconseguir principalment amb diversos microorganismes (Harayama i Timmis, 1992). En els darrers anys hi ha hagut un especial interès per estudiar les capacitats de degradació dels compostos aromàtics derivats de les activitats industrials per part de diferents grups de microorganismes. Tot i que hi ha diferents gèneres que poden degradar els compostos aromàtics, el gènere Pseudomonas ha estat el més estudiat i utilitzat, però no es descarta l’ús d’altres grups bacterians (Díaz et al., 2001). d) Els recursos hídrics. Un bon exemple el tenim al nostre territori en l’aprofitament i la gestió optimitzada dels recursos hídrics (Jofre, 2007). La qualitat en el subministrament d’aigua potable (Mendez et al., 2004), el sanejament de les aigües residuals (Lucena et al., 2001) i la seva potencial regeneració està esdevenint un repte cabdal per poder garantir recursos hídrics amb la qualitat adient per satisfer les diferents activitats humanes en el nostre entorn geogràfic. La regeneració d’aigües és un factor ambiental estratègic en el nostre territori, com per exemple en els casos de recuperació d’aqüífers, la gestió integral de conques fluvials o zones costaneres, o el proveïment

de recursos hídrics alternatius a les aigües potables de subministrament per a diferents activitats industrials i de lleure (Jofre, 2007). En els darrers anys s’estan fent esforços importants en el desenvolupament de metodologies per detectar l’origen de la contaminació fecal en les aigües superficials (terme anomenat, en anglès, microbial source tracking). Els riscos sanitaris associats deguts a la presència d’aquesta contaminació fecal resulten diferents atenent al fet si és d’origen humà o animal. Això ha fet que darrerament s’hagin proposat diferents mètodes microbiològics o químics per a la determinació de l’origen de la contaminació fecal (Blanch et al., 2006). Addicionalment, hi ha hagut un major interès en la detecció de contaminants i patògens en l’aigua per determinar els riscos sanitaris i prendre mesures per al control o l’eliminació. Això ha fet potenciar el desenvolupament de noves tècniques per a la detecció de patògens en aigües (García-Aljaro et al., 2005), l’avaluació de la transferència horitzontal potencial de gens que codifiquen factors de virulència (García-Aljaro et al., 2004; Muniesa et al., 2004a) o la resistència a antibiòtics (Muniesa et al., 2004b; Kühn et al., 2005). e) Salut i medi ambient. Les expectatives que havien fet alguns analistes a partir de l’èxit en l’aplicació clínica dels antibiòtics que els van fer anunciar l’eradicació de les malalties infeccioses en unes poques dècades han quedat sense fonament. Ben al contrari, actualment ens trobem amb una nova situació sanitària a causa de l’aparició dels anomenats patògens emergents. L’increment de la mobilitat de les persones per tot el planeta, conjuntament amb una economia globalitzada, que permet la mobilitat de recursos materials i, conseqüentment de microorganismes, ha facilitat l’extensió de determinades malalties infeccioses que estaven limitades territorialment. D’altra banda, els antibiòtics s’han utilitzat rutinàriament en medicina humana i veterinària

184 A. R. BLANCH

per al tractament i la prevenció de malalties, però també com a promotors de creixement en la producció ramadera. L’ús excessiu d’aquestes pràctiques ha portat com a resultat la selecció de resistències a alguns antibiòtics en les poblacions bacterianes del tracte intestinal dels animals utilitzats en la cadena alimentària humana. Això ha comportat l’aparició de soques de patògens resistents als antibiòtics en la medicina humana. Actualment, estan adquirint un paper essencial el coneixement i la gestió de les poblacions bacterianes intestinals (tant dels humans com dels animals relacionats amb la cadena alimentària), i d’altres poblacions microbianes extraintestinals, ja siguin simbionts o comensals (principalment en mucoses i epidermis), que estan directament o indirectament relacionades amb l’estat sanitari. Aquests coneixements permetran establir nous processos actius i alternatius de prevenció i control dels agents causals de malalties. Entre aquests processos poden destacar la utilització dels autoinductors i inhibidors dels mecanismes de percepció de quòrum bacterians (Waters i Bassler, 2005). Aquests mecanismes permeten la coordinació poblacional de l’expressió gènica relacionada amb la concentració cel·lular d’una població bacteriana. També tenim la utilització dels bacteriòfags per al control de patògens emergents o com a alternatives a les resistències als antibiòtics. Tots dos mecanismes d’actuació estan adquirint un paper destacat per a la seva potencial aplicació en l’àmbit sanitari (Marks i Sharp, 2000; Petty et al., 2007; Verthe et al., 2004; O’Flaherty et al., 2005). CONCLUSIONS La biotecnologia ambiental ens està proporcionant d’una manera progressiva noves eines metodològiques per a una gestió sostenible dels recursos naturals i del medi

ambient, i ens facilita al mateix temps una millora global de la qualitat de vida dels humans. Aquests avenços esdevenen possibles gràcies als nous coneixements provinents de diferents camps científics, però molt especialment de l’ecologia microbiana. El desenvolupament de noves metodologies moleculars que ens permeten una nova aproximació a l’estudi de la composició i les funcions dels consorcis microbians presents en els ecosistemes naturals ens proporcionen en gran part aquests nous coneixements. La integració de la informació que es derivi dels futurs estudis de genòmica, proteòmica i metabolòmica de les poblacions microbianes, conjuntament amb altres àrees del coneixement, ens ha de permetre en un futur noves aplicacions metodològiques en el control dels contaminants, en la regulació del cicle dels elements, en la gestió dels recursos hídrics i energètics i en la millora de la situació sanitària. AGRAÏMENTS Vull agrair a Joan Jofre els comentaris que m’ha fet sobre el contingut d’aquest capítol, així com aquelles estones en les quals hem pogut dissertar sobre diferents temàtiques científiques relacionades principalment amb la microbiologia. BIBLIOGRAFIA Amann, R. I.; Krumholz, L.; Stahl, D. A. (1990). «Fluorescent-oligonucleotide probing of whole cells for determinative, phylogenetic, and environmental studies in microbiology». J. Bacteriol., 172: 762-770. Amann, R. I.; Ludwig, W.; Schleifer, K. H. (1995). «Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation». Microbiol. Rev., 59: 143-169. Amann, R.; Fuchs, B. M.; Behrens, S. (2001). «The identification of microorganisms by fluorescence in situ hybridisation». Curr. Opin. Biotechnol., 12: 231-236.

BIOTECNOLOGIA I MEDI AMBIENT 185

Blanch, A. R.; Belanche-Munoz, L.; Bonjoch, X.; Ebdon, J.; Gantzer, C.; Lucena, F.; Ottoson, J.; Kourtis, C.; Iversen, A.; Kühn, I.; Moce, L.; Muniesa, M.; Schwartzbrod, J.; Skraber, S.; Papageorgiou, G. T.; Taylor, H.; Wallis, J.; Jofre, J. (2006). «Integrated analysis of established and novel microbial and chemical methods for microbial source tracking». Appl. Environ. Microbiol., 72: 5915-5926. Boecks, P.; Cleemput, O. van; Villaralvo, I. (1997). «Methane oxidation in soils with different textures and land use». Nutr. Cycl. Agroecosys., 49: 91-95. Boon, N.; Gelder, L. de; Lievens, H.; Verstraete, W. (2002). «Bioaugmenting bioreactors for the continuous removal of 3-chloroaniline by slow release approach». Environ. Sci. Technol., 36: 4698-4704. Bragg, J. R.; Prince, R. C.; Harner, E. J.; Atlas, R. M. (1994). «Effectiveness of bioremediation for the Exxon Valdez oil spill». Nature, 368: 413 - 418. Colwell, R. R. (2000). «Viable but nonculturable bacteria: a survival strategy». J. Infect. Chemother., 6: 121-125. Curtis, T. P.; Sloan, W. T. (2004). «Prokaryotic diversity and its limits: microbial community structure in nature and implications for microbial ecology». Curr. Opin. Microbiol., 7: 221-226. Dejonghe, W.; Boon, N.; Seghers, D.; Top, E. M.; Verstraete, W. (2001). «Bioaugmentation of soils by increasing microbial richness: missing links». Environ. Microbiol., 3: 649-657. Díaz, E.; Fernández, A.; Prieto, M. A.; García, J. L. (2001). «Biodegradation of aromatic compounds by Escherichia coli». Microbiol. Mol. Biol. Rev., 65: 523569. Du, Z.; Li, H.; Gu, T. (2007). «A state of the art review on microbial fuel cells: A promising technology for wastewater treatment and bioenergy». Biotechnol. Advances, 25: 464-482. Edwards, C. (2000). «Problems posed by natural environments for monitoring microorganisms». Mol. Biotechnol., 15: 211-223. Garcia-Aljaro, C.; Bonjoch, X.; Blanch, A. R. (2005). «Combined use of an immunomagnetic separation method and immunoblotting for the enumeration and isolation of Escherichia coli O157 in wastewaters». J. Appl. Microbiol., 98: 589-597. Garcia-Aljaro, C.; Muniesa, M.; Jofre, J.; Blanch, A. R. (2004). «Prevalence of the stx2 gene in coliform populations from aquatic environments». Appl. Environ. Microbiol., 70: 3535-3540. Gast, C. J. van de; Jefferson, B.; Reid, E. (2006). «Bacterial diversity is determined by volume in membrane bioreactors». Environ. Microbiol., 8: 1048-1055. Gentry, T. J.; Wickham, G. S.; Schadt, C. W. (2006). «Microarray applications in microbial ecology research». Microb. Ecol., 52: 159-175.

Harayama, S.; Timmis, K. N. (1992). «Aerobic biodegradation of aromatic hydrocarbons by bacteria», A: Sigel, H.; Sigel, A. [ed.]. Metal ions in biological systems. Nova York: Marcel Dekker: 99-156. Hoefel, D.; Grooby, W. L.; Monis, P. T.; Andrews, S.; Saint, C. P. (2003). «Enumeration of water-borne bacteria using viability assays and flow cytometry: a comparison to culture-based techniques». J. Microbiol. Methods, 55: 585-597. Hubbell, S. P.; Borda-De-Agua, L. (2004). «The unified neutral theory of biodiversity and biogeography». Ecology, 85: 3175-3178. Ishii, S.; Kosaka, T.; Hori, K.; Hotta, Y.; Watanabe, K. (2005). «Coaggregation facilitates interspecies hydrogen transfer between Pelotomaculum thermopropionicum and Methanothermobacter thermautotrophicus». Appl. Environ. Microbiol., 71: 78387845. Ishii, S.; Kosaka, T.; Hotta, Y.; Watanabe, K. (2006). «Simulating the contribution of coaggregation to interspecies hydrogen fluxes in syntrophic me thanogenic consortia». Appl. Environ. Microbiol., 72: 5093-5096. Jofre, J. (2007). Oportunitats relacionades amb el cicle integral de l’aigua per a les empreses de l’Àrea Metropolitana de Barcelona. Barcelona: Pla Estratègic Metropolità de Barcelona. (Estratègica; 5). Kirk, J. L.; Beaudette, L. A.; Hart, M.; Moutoglis, P.; Klironomos, J. N.; Lee, H.; Trevors, J. T. (2004). «Methods of studying soil microbial diversity». J. Microbiol. Methods, 58: 169-188. Kühn, I.; Iversen, A.; Finn, M.; Greko, C.; Burman, L. G.; Blanch, A. R.; Vilanova, X.; Manero, A.; Taylor, H.; Caplin, J.; Dominguez, L.; Herrero, I. A.; Moreno, M. A.; Möllby, R. (2005). «Occurrence and relatedness of vancomycin-resistant Enterococci in animals, humans, and the environment in different European regions». Appl. Environ. Microbiol., 71: 5383-5390. Lajoie, C. A.; Sayler, G. S.; Kelly, C. J. (2002). «The activated sludge biomolecular database». Water Environ. Res., 74: 480-487. Logan, B. E. (2004). «Extracting hydrogen and electricity from renewable resources». Environ. Sci. Technol., 38: 160A-167A. Lovley, D. R. (2006). «Microbial energizers: fuel cells that keep on going». Microbe, 1: 323-329. Lucena, F.; Duran, A. E.; Moron, A.; Calderon, E.; Campos, C.; Gantzer, C.; Skraber, S.; Jofre, J. (2001). «Reduction of bacterial indicators and bacteriophages infecting faecal bacteria in primary and secondary wastewater treatments». J. Appl. Microbiol., 97: 1069-1076. Mar Lleò, M. del; Bonato, B.; Benedetti, D.; Canepari, P. (2005). «Survival of enterococcal species in

186 A. R. BLANCH

aquatic environments». FEMS Microbiol. Ecol., 54: 189-196. Marks, T.; Sharp, R. (2000). «Bacteriophages and biotechnology: a review». J. Chemical Technol. Biotechnol., 75: 6-17. Mendez, J.; Audicana, A.; Cancer, M.; Isern, A.; Llaneza, J.; Moreno, M., Navarro, M.; Tarancon, M. L.; Valero, F.; Ribas, F.; Jofre, J.; Lucena, F. (2004). «Assesment of drinking water quality using indicator bacteria and bacteriophages». J. Water Health, 2: 201-214. Mohanty, S. R.; Bodelier, P. L. E.; Floris, V.; Conrad, R. (2006). «Differential effects of nitrogenous fertilizers on methane-consuming microbes in rice field and forest soils». Appl. Environ. Microbiol., 72: 1346-1354. Muniesa, M.; Garcia, A.; Miró, E.; Minelis, B.; Prats, G.; Jofre, J.; Navarro, F. (2004a). «Bacteriophages and diffusion of β-lactamase gens». Emerg. Infect. Dis., 10: 1134-1137. Muniesa, M.; Serra-Moreno, R.; Jofre, J. (2004b). «Free Shiga-toxin bacteriophages isolated from sewage showed diversity although the stx genes appeared conserved». Environ. Microbiol., 6: 716-725. Muyzer, G. (1999). «DGGE/TGGE, a method for identifying genes from natural ecosystems». Curr. Opin. Microbiol., 2: 317-322. O’Flaherty, S.; Ross, R. P.; Meaney, W.; Fitzgerald, G. F.; Elbreki, M. F.; Coffey, A. (2005). «Potential of the polyvalent anti-Staphylococcus bacteriophage K for control of antibiotic-resistant Staphocci from hospitals». Appl. Environ. Microbiol., 71: 1836-1842. Olsen, G. J.; Lane, D. J.; Giovannoni, S. J.; Pace, N. R.; Stahl, D. A. (1986). «Microbial ecology and evolution: a ribosomal RNA approach». Annu. Rev. Microbiol., 40: 337-365. Petty, N. K.; Evans, T. J.; Fineran, P. C.; Salmond, G. P. (2007). «Biotechnological exploitation of bacteriophage research». Trends Biotechnol., 25: 7-15. Rabaey, K.; Lissens, G.; Siciliano, S.; Verstraete, W. (2003). «A microbial fuel cell capable of convering glucose to electricity at high rate and efficiency». Biotechnol. Lett., 25: 1531-1535. Rabaey, K.; Verstraete, W. (2005). «Microbial fuel cells: novel biotechnology for energy generation». Trends Biotechnol., 23: 291-298. Ramaiah, N.; Ravel, J.; Straube, W. L.; Hill, R. T.; Colwell, R. R. (2002). «Entry of Vibrio harveyi and Vibrio fischeri into the viable but nonculturable state». J. Appl. Microbiol., 93: 108-116.

Rittmann, B. E. (2006). «Microbial ecology to manage processes in environmental biotechnology». Trends Biotechnol., 24: 261-266. Rosenberg, N. J.; Izaurralde, R. C. (2001). Storing Carbon in Agricultural Soils: A Multi-Purpose Environmental Strategy. Àmsterdam: Kluwer Academic. Roszak, D. B.; Colwell, R. R. (1987). «Survival strategies of bacteria in the natural environment». Microbiol. Rev., 51: 365-379. Swannell, R. P. J.; Lee, K.; McDonagh, M. (1996). «Field evaluation of marine oil spill bioremediation». Trends Bitoechnol., 11: 344-352. Taghavi, S.; Barac, T.; Greenberg, B. (2005). «Horizontal gene transfer to endogenous endophytic bacteria from poplar improves phytoremediation of toluene». Appl. Environ. Microbiol., 71: 8500-8505. Torsvik, V.; Goksøyr, J.; Daae, F. L. (1990). «High diversity in DNA of soil bacteria». Appl. Environ. Microbiol., 56: 782-787. Tringe, S. G.; Mering, C. von; Kobayashi, A.; Salamov, A.; Chen, K.; Chang, H. W.; Podar, M.; Short, J. M.; Mathur, E. J.; Detter, J. C.; Bork, P.; Hugenholtz, P.; Rubin, E. M. (2005). «Comparative metagenomics of microbial communities». Science, 308: 554557. Vaithiyanathan, S.; Sheikh, Q.; Ku, R. (2005). «Effect of transinoculation of goat rumen liquor on degradation and metabolism of mimosine in sheep fed with Leucaena leucocephala leaves». Asian Austral. J. Anim., 18: 332-339. Verstraete, W. (2007). «Microbial ecology and environmental biotechnology». ISME J., 1: 4-8. Verthe, K.; Possemiers, S.; Boon, N.; Vaneechoutte, M.; Verstraete, W. (2004). «Stability and activity of an Enterobacter aerogenes-specific bacteriophage under simulated gastro-intestinal conditions». Appl. Microbiol. Biotechnol., 65: 465-472. Watanabe, K. (1997). «Identification of functionally important catabolic populations in microbial consortium». Recent Res. Develop. Microbiol., 1: 65-76. Watanabe, K.; Baker, P. W. (2000). «Environmentally relevant microorganisms». J. Biosci. Bioeng., 89: 111. Watanabe, K.; Teramoto, M.; Harayama, S. (2002). «Stable mentation of activated sludge with foreign catabolic genes harboured by an indigenous dominant bacterium». Environ. Microbiol., 4: 577-583. Waters, C. M.; Bassler, B. L. (2005). «Quorum Sensing: cell-to-cell communication in bacteria». Annu. Rev. Cell. Dev. Biol., 21: 319-346.

DOI: 10.2436/20.1501.02.53

Les biotecnologies (Pere Puigdomènech i Francesc Gòdia, ed.) Treballs de la SCB. Vol. 58 (2007) 187-202

LA BIOREMEDIACIÓ Anna Maria Solanas Departament de Microbiologia, Universitat de Barcelona. Adreça per a la correspondència: Anna Maria Solanas. Departament de Microbiologia, Universitat de Barcelona. Diagonal, 645. 08028 Barcelona. Adreça electrònica: asolanas@ub.edu. RESUM La biotecnologia de la bioremediació es basa a aprofitar les capacitats metabòliques dels microorganismes per degradar els contaminants químics presents en diferents matrius ambientals, majoritàriament sòls, incloent-hi les aigües subterrànies. Fins avui dia, la tipologia de contaminants amb la qual s’ha mostrat més eficaç són els hidrocarburs. En la majoria de casos es basa a estimular les poblacions microbianes presents a l’emplaçament mateix, atesa la seva adaptació a la presència dels contaminants. En altres ocasions s’afegeixen inòculs microbians obtinguts al laboratori amb les capacitats catabòliques adients. Abans de portar a terme una bioremediació s’han de conèixer les poblacions microbianes presents i els factors ambientals que les condicionen amb l’aplicació dels assaigs de tractabilitat. A diferència d’altres països europeus, el nostre país està tot just començant, a causa del retard en l’aparició de la legislació pertinent. No obstant això, atès que les estimacions efectuades a Catalunya xifren en unes trenta mil les activitats potencialment contaminants del sòl, l’aplicació de les normatives aparegudes recentment comportarà un impuls per a aquesta matèria. En el cas concret de Catalunya es descriuen tres casos desenvolupats a escala pilot. Finalment, s’apunten diferents aspectes necessitats d’investigació que haurien de permetre ampliar la tipologia de contaminants susceptibles de ser tractats i reduir el temps de procés. Paraules clau: bioremediació, sòls contaminats, bioestimulació, bioreforç. BIOREMEDIATION SUMMARY The biotechnology of the bioremediation is based on the metabolic capacities of the microorganisms to degrade the chemical pollutants in different environmental compartments, especially soil including underground waters. Until the present time, the type

188 A. M. SOLANAS

of pollutants more suitable to be treated by bioremediation are the hydrocarbons. In most of cases it is based on stimulating the microbial populations present in the location, given their high adaptation to the presence of the pollutants. In other cases microbial inócula, obtained in the laboratory with the appropriate metabolic capacities, are added. Before carrying out a bioremediation it is important to know the microbial populations present in the site and the environmental factors that they condition the biodegradation process by means of the application of feasibility assays. Contrary to other European countries, our country is in its beginnings due to the delay in the pertinent appearance of the normative ones. Nevertheless, keeping in mind that the estimates made in Catalonia calculate potentially in 30.000 the pollutants activities of the soil, the application of the normative recently appeared behaved an impulse in the matter. In the case of Catalonia, three scale pilot cases are described. Finally, different needy aspects of research are aimed that must allow to enlarge the typology of susceptible pollutants of being treated by bioremediation as well as reduce the time of the process. Key words: bioremediation, polluted soils, biostimulation, bioaugment. LA CONTAMINACIÓ QUÍMICA DELS SÒLS A partir de la segona meitat del segle xx, i d’una manera creixent, la humanitat s’ha trobat amb un important repte que amenaça tant la seva salut com la del planeta que habita: la contaminació química ambiental. El que durant molts anys hem qualificat com progrés en diferents àrees, com ara el transport, la higiene, la construcció, l’agricultura o la salut, ha implicat mobilitzar materials que estaven immobilitzats (com el cas del petroli o dels metalls pesants) o introduir nous productes de síntesi química (detergents, pintures, plàstics, materials aïllants, plaguicides, fàrmacs, etc.). Aquests productes s’originen en el que podríem anomenar la tecnosfera, on s’integren totes les activitats que porten envers el seu ús: extracció, producció, emmagatzematge, transport, distribució i consum. Malauradament, part d’aquests productes químics escapen accidentalment o intencionadament cap a l’ecosfera, i produeixen una contaminació química del medi, ja sigui de l’atmosfera, de les aigües dolces o marines, del sediments o del sòls, incloent-hi les aigües subterrànies.

Mentre la depuració d’aigües residuals constitueix una pràctica molt antiga i molt estesa en el món occidental, les tecnologies per descontaminar els sòls han aparegut de manera més recent. Tot just a la Cimera de Rio, l’any 1992 (ONU, 1992), es va reconèixer la importància de la protecció dels sòls i dels seus usos potencials en el context d’un desenvolupament sostenible i, en particular, contra la contaminació procedent d’accions o activitats d’origen antròpic. MARC LEGISLATIU L’any 1995 el Govern espanyol va aprovar el Pla Nacional de Recuperació de Sòls Contaminats. En aquest pla es van inventariar un total de 18.142 activitats industrials, a partir de les quals es van catalogar 4.532 emplaçaments com a potencialment contaminats. D’acord amb aquesta situació, es va veure la necessitat urgent d’implantar una legislació sobre la contaminació de sòls. A Catalunya, la Junta de Residus del Departament de Medi Ambient i, concretament, el Departament de Sòls, va realitzar un estudi (Busquet, 1997) que va servir per elaborar la Guia d’avaluació de la qualitat del

LA BIOREMEDIACIÓ 189

sòl: criteris provisionals de qualitat del sòl a Catalunya (CQS). L’any 1998 es va promulgar la Llei de residus (10/1998), que va incloure un capítol de sòls contaminats. En aquesta llei es requeria a les comunitats autònomes (CA) que fessin un inventari de sòls contaminats, i s’incloïa un mandat al Govern central mateix per publicar una llista d’activitats potencialment contaminants i per establir criteris i estàndards que permetessin avaluar el risc per a la salut humana i per al medi ambient. Malauradament, la normativa estatal en matèria de sòls contaminats no va arribar fins set anys després. L’any 2005 es va publicar el Reial Decret 9/2005 (RD), que estableix la relació d’activitats potencialment contaminants del sòl i els criteris i estàndards per a la declaració d’un sòl com a contaminat. Aquest retard en la disponibilitat d’instruments normatius s’ha traduït en un retràs, tant pel que fa al desenvolupament de tecnologies adequades per part de les empreses del sector, com pel que fa a la conscienciació de la societat sobre la problemàtica que presenten els sòls contaminats i la necessitat de protegir-los. Mentre països europeus com Alemanya, Dinamarca o els Països Baixos disposen d’una llarga experiència en aquest camp, el nostre país es troba tot just al començament. A aquesta situació hem d’afegir que el nostre país encapçala el rànquing de països europeus pel que fa a activitat constructora. Aquest fet ha portat a fer que molts ajuntaments hagin canviat els usos de moltes hectàrees de sòl industrial a sòl urbà. Malauradament, aquesta situació, juntament amb el buit legal esmentat, ha portat al que podríem anomenar la cultura de l’excavació i l’abocador, que suposa l’excavació dels sòls contaminats i el seu trasllat a abocadors controlats, estratègia molt poc sostenible. En aquest sentit, un punt important del RD, i que s’esmenta al preàmbul, és que per

a la descontaminació d’un sòl s’han de prioritzar les millors tècniques disponibles en funció de les característiques de cada cas, i han d’aportar solucions permanents, de manera que prevalguin aquelles tecnologies que evitin la generació de residus. En concret, l’article 7 diu que es prioritzen les tècniques de remediació in situ que evitin el trasllat de terres als dipòsits controlats. Actualment a Catalunya existeix un esborrany de decret per a la contaminació del sòl, que està en fase de consulta pública. Aquest decret és l’adaptació de la regulació estatal per donar compliment al que el RD estableix per a les CA. Cal fer ressaltar el fet que consolida la idea d’aplicar les millors tècniques disponibles, així com la priorització de les tecnologies de recuperació in situ i en segon lloc les on site/ex situ mitjançant tractaments de la terra excavada. És, per tant, previsible, que l’aplicació d’aquest Reial Decret comportarà un impuls en la matèria, atès que les estimacions efectuades a Catalunya xifren en unes trenta mil les activitats potencialment contaminants del sòl i, per tant, subjectes al compliment del RD. LA IMPORTÀNCIA DELS MICROORGANISMES EN L’ELIMINACIÓ DELS CONTAMINANTS QUÍMICS Quan un contaminant arriba a l’ecosfera comencen a actuar a sobre seu diferents processos físics, químics i biològics que dirigiran el que anomenem el seu destí ambiental. Imaginem el cas d’una marea negra. Malgrat que la primera imatge que hi associem és la d’una au bruta de petroli, és a dir, una imatge macroscòpica, existeix tot un món microscòpic que ens passa desapercebut. Així que es produeix un vessament de petroli al mar, els seus components, majo-

190 A. M. SOLANAS

ritàriament hidrocarburs, estan subjectes a processos físics, químics i biològics (vegeu la figura 1). Alguns només provoquen el canvi de compartiment ambiental, com l’evaporació o la sedimentació, ja que fan que els hidrocarburs passin de l’aigua a l’atmosfera o de la columna d’aigua al sediment. D’altres suposen un canvi d’estat físic o químic, com la dissolució o les reaccions químiques espontànies. De tots, destaquem dos processos, que són la fotooxidació i la degradació microbiana, els únics que suposen la transformació dels hidrocarburs en productes totalment innocus, com l’anhídrid carbònic i l’aigua, és a dir, que provoquen la mineralització del contaminant i, per tant, l’eliminació del problema. Ara bé, mentre la fotooxidació només actua sobre les superfícies irradiades pel Sol, la degradació microbiana pot actuar en tota la columna d’aigua, al sediment i a les zones costeres afectades, atesa la ubiqüitat dels microorganismes. Sens dubte, el principal procés d’eliminació dels contaminants químics de qualsevol emplaçament contaminat és la degradació

microbiana (Bordons i Constanti, 1999; Talley, 2006). Sense por d’equivocar-nos, podríem dir que si no fos pels microbis, en especial pels bacteris, els nostres mars estarien plens d’hidrocarburs. A títol d’exemple, els mars catalans reben aproximadament unes vint mil tones d’hidrocarburs a l’any, procedents de petits accidents o d’operacions rutinàries dels vaixells, malgrat que estan prohibides. Ens sorprèn que els bacteris tinguin la capacitat d’alimentar-se i créixer amb aquests compostos? Si recordem que aquests petits organismes són a la Terra des de fa més de tres mil cinc-cents milions d’anys, no ens costarà entendre que durant aquest llarg període de temps hagin pogut desenvolupar unes capacitats metabòliques increïblement variades i diversificades, que els permeten metabolitzar compostos químics que per a nosaltres i per a la majoria d’organismes molt més organitzats resulten molt estranys i no metabolitzables. Nosaltres, a aquesta escala evolutiva, fa només un instant que som a la Terra, i per això la nostra

Figura 1. Destí ambiental d’un vessament de petroli. Font: Núria Jimenez.

LA BIOREMEDIACIÓ 191

inventiva metabòlica és extraordinàriament simple. LA BIOREMEDIACIÓ Tenint en compte la capacitat innata que presenten els microorganismes per destruir els contaminants del nostre medi, aprofundir en el coneixement del procés per poderlo controlar, accelerar i millorar constitueix l’objectiu de molts microbiòlegs ambientals des de les últimes dècades del segle passat. La informació generada conjuntament amb la d’altres disciplines, com ara la hidrogeologia o l’enginyeria, ha configurat una nova biotecnologia anomenada bioremediació. La bioremediació es basa en l’aprofitament de les capacitats metabòliques dels microorganismes per a la destrucció dels contaminants dels sòls, sediments, platges i aigües subterrànies (Alexander, 1999). Com veiem, el tractament d’aigües residuals no queda inclòs en el terme bioremediació, atesa la seva antiguitat; en aquest cas, parlem de tractament biològic. La bioremediació ha aparegut en el moment en què ens hem hagut d’enfrontar amb sòls, platges i aigües subterrànies contaminats o amb aigües residuals industrials molt específiques, situació produïda en les darreres dècades. Val a dir que existeixen tecnologies alternatives a la bioremediació, però, com hem dit en el cas de les marees negres, la bioremediació suposa la veritable eliminació dels contaminants perquè els converteix en anhídrid carbònic i aigua. L’excavació i posterior gestió en abocador, els tractaments fisicoquímics o la incineració comporten el trasllat del problema o la generació de residus, i no l’eliminació. A més, la bioremediació és una tecnologia compatible amb el desenvolupament sostenible i de baix cost comparada amb d’altres tecnologies fisicoquímiques. Aquesta tecnologia ha estat majoritària en diferents països europeus com

Alemanya, Dinamarca i França. En el cas d’Alemanya, la bioremediació va ser majoritària en els anys noranta. A títol d’exemple, l’any 1998 el 98 % de les plantes de tractament fixes eren biològiques (Ulrici, 2001) . TIPOLOGIES DE BIOREMEDIACIÓ Existeixen diferents tipus de bioremediació en funció de l’estratègia microbiològica i del lloc on es porti a terme. Tenint en compte que el sòl està format per una zona insaturada i una part saturada o aigües subterrànies, segons sigui la zona afectada per la contaminació el tractament s’haurà d’adaptar a les característiques diferencials dels dos compartiments (Singh i Tripathi, 2007). En el cas de les marees negres és susceptible de tractar per bioremediació el litoral afectat, les roques i les sorres, i no pas el mar obert (Sabaté et al., 2003). Atenuació natural. Es parla de bioremediació intrínseca o atenuació natural quan no es porta a terme cap intervenció i ens limitem a portar un seguiment de la disminució de la contaminació que es produeix com a conseqüència de l’activitat metabòlica de les poblacions microbianes de l’emplaçament mateix. Aquesta situació es pot produir en algunes gasolineres que presentin una baixa contaminació (Álvarez Pedro, 2006). Bioestimulació. Si el que fem és afavorir el creixement de les poblacions que ja existeixen mitjançant l’addició de productes que millorin la seva activitat metabòlica, parlem de bioestimulació. Partint del coneixement dels factors que condicionen un procés de bioremediació, la bioestimulació suposarà ajustar les característiques de l’emplaçament contaminat a les necessitats dels microorganismes, mitjançant el subministrament d’agents bioestimulants, com ara oxigen o nutrients (Singh i Ward, 2004). Bioreforç. Finalment, si s’afegeixen microorganismes que tinguin les capacitats

192 A. M. SOLANAS

catabòliques adequades que no tenen els autòctons, parlem de bioreforç. En el cas que les poblacions microbianes de l’emplaçament contaminat no puguin degradar els contaminants presents, es pot portar a terme la inoculació de soques bacterianes o fúngiques amb les capacitats catabòliques específiques (Viñas et al., 2002). No obstant això, cal tenir present que aquests consorcis microbians es fan créixer en unes condicions controlades i constants en el laboratori i, per tant, es trobaran amb uns bacteris autòctons molt més competitius i més ben adaptats a la presència de depredadors, inhibidors i tòxics, així com a les condicions particulars de pH i temperatura de l’emplaçament (Alexander, 1999). Bioremediació in situ. Quan no es porta a terme l’excavació del sòl, els agents bioestimulants, com ara l’oxigen o els inòculs, s’han de proporcionar mitjançant pous d’injecció o galeries d’infiltració adequades a la part afectada, ja sigui la zona insaturada, les aigües subterrànies o ambdues. Aquest tipus d’intervenció, malgrat que és molt menys costosa que l’excavació i el tractament posterior, presenta l’inconvenient de l’heterogeneïtat del subsòl i la necessitat que els agents bioestimulants accedeixin als llocs on es troba el contaminant. És per això que s’obtindran millors resultats amb sòls més homogenis. No obstant això, en els darrers anys han aparegut una sèrie de productes nous que permeten optimitzar el subministrament d’aquests agents. Un exemple en són els alliberadors lents d’oxigen (Koenigsberg i Mahaffey, 2001). Bioremediació on site/ex situ. Si la contaminació afecta la zona insaturada, una vegada excavat el sòl es pot tractar amb diferents tecnologies. Una és dipositar el sòl damunt d’un altre sòl i llaurar-los: es tracta de l’anomenat landfarming. Aquesta tecnologia va ser la primera a utilitzar-se, per la seva simplicitat. Més recentment s’han introduït les biopiles. Es tracta de construir una pila de

sòl i subministrar-hi els activadors que es necessitin. Si es construeix amb xarxes de tubs de PVC que permetin el subministrament dels agents bioestimulants, parlem de biopiles estàtiques. Si el que fem és afegir l’aigua i els agents bioestimulants cada vegada que es remena la pila de sòl, es parla de biopila dinàmica. El tractament és on site quan la biopila es realitza en el mateix emplaçament, i ex situ quan es porta a una planta de tractament. En el cas de les aigües subterrànies el tractament on site suposa bombejar les aigües a reactors en superfície, on són tractades i posteriorment reinjectades a l’aqüífer. Fins avui dia, la tipologia de contaminació amb la qual la bioremediació s’ha mostrat més eficaç és la derivada del petroli i derivats; per tant, amb els contaminants que pertanyen a diferents tipologies d’hidrocarburs, com els alifàtics o els hidrocarburs aromàtics policíclics (HAP). FACTORS QUE CONDICIONEN LA BIOREMEDIACIÓ Tenint en compte que la bioremediació suposa una interacció entre els contaminants presents en un emplaçament, el lloc on es troben i els microorganismes autòctons, els factors que condicionaran el procés estaran relacionats amb aquests tres protagonistes (Atlas i Philip, 2005). Malgrat que ens hem referit al gran potencial catabòlic dels microorganismes, no serà difícil entendre que, atesa la gran variabilitat d’estructures químiques dels contaminants, no tots presentaran el mateix grau de biodegradabilitat. Si tornem a recordar que els microorganismes són a la Terra des de fa aproximadament tres mil cinc-cents milions d’anys, és a dir, des de l’aparició de la vida, és raonable pensar que la biodegradabilitat dels productes químics estarà relacionada amb el temps que fa que es troben a

LA BIOREMEDIACIÓ 193

la Terra i, per tant, amb el grau d’adaptació a la seva presència que han pogut desenvolupar els sistemes enzimàtics dels microorganismes. Feta aquesta consideració, els productes químics que es troben en el nostre entorn els podem classificar en tres categories: els compostos, com les proteïnes, que formen part dels organismes, que anomenem biogènics i que són a la Terra des de l’aparició de la vida; els hidrocarburs, que provenen de transformacions de compostos biogènics i que són presents a la Terra des de fa milions d’anys i, finalment, els compostos que són resultat d’una síntesi química feta per l’home, com els plaguicides, i que, tenint en compte l’escala geològica del temps, podem dir que fa només un instant que es troben al nostre entorn. Aquests últims els anomenem xenobiòtics, és a dir ‘estranys’, ja que estan molt allunyats de l’estructura química dels compostos biogènics. La biodegradabilitat d’aquestes tres categories de compostos és decreixent, des dels compostos biogènics, que són intrínsecament biodegradables, fins als xenobiòtics, amb els productes més recalcitrants, passant pels hidrocarburs, amb graus de biodegradabilitat variable depenent de l’estructura. De fet, un contaminant és més difícil de degradar en la mesura que presenti una estructura química amb substituents diferents dels dels compostos biogènics, que s’anomenen grups xenobiòtics. Per exemple, la presència del clor fa que un compost sigui més resistent a la biodegradació i a més, de manera proporcional al nombre d’àtoms d’aquest element. Així, el clorur de metilè és més biodegradable que els bifenilpoliclorats o PCB (Talley, 2006). La biodegradació d’un contaminant pot ser parcial i pot donar lloc a un intermediari més oxidat, o pot ser oxidat d’una manera terminal a anhídrid carbònic, aigua i compostos inorgànics (Alexander, 1999). En una bioremediació aquest últim succés és el

més desitjat, malgrat que quan hi ha la producció d’un intermediari, és força freqüent que un altre microorganisme present pugui acabar de mineralitzar-lo. Per mineralitzar un contaminant els microorganismes necessitaran les condicions adients per portar a terme el seu metabolisme. Si el metabolisme és aeròbic necessitaran oxigen, i si és anaeròbic necessitaran la presència de l’acceptor d’electrons específic, com ara el nitrat o el ferro. En el cas dels hidrocarburs, el metabolisme més eficaç és l’aeròbic. Així mateix, el contingut d’aigua o humitat serà un factor clau, com també ho són el pH i la salinitat. La majoria dels contaminants només estan formats per carboni (C), hidrogen (H) i halògens com el clor o el brom. Ara bé, les cèl·lules dels microorganismes, a més de C i H, tenen nitrogen (N) i fòsfor (P) en moltes macromolècules, com les proteïnes, els lípids o els àcids nucleics, per la qual cosa, si el contaminant és utilitzat pels microorganismes presents per créixer, és a dir, per formar noves cèl·lules, es necessitarà la presència de N i P en quantitats proporcionals. És per això que una pràctica bastant universal en la bioestimulació és la d’afegir nutrients, que poden ser hidròfils o lipòfils. Es considera que una cèl·lula bacteriana té unes proporcions de C:N:P de 50:10:4. Les quantitats a afegir en aplicar una bioremediació dependran del rendiment que els microorganismes extreguin del contaminant. Durant molt de temps s’ha tingut com a model Escherichia coli, que quan creix amb glucosa deriva el 50 % en noves cèl· lules i l’altre 50 % en CO2 i H2O. En aquest cas les proporcions de C:N:P que haurien d’estar presents a l’emplaçament contaminat sotmès a una bioremediació serien de 100:10:4. En els últims anys, l’aïllament de diferents soques bacterianes degradadores de diferents tipus de contaminants per part de diferents grups de recerca ha permès comprovar que els rendiments d’aques-

194 A. M. SOLANAS

tes soques bacterianes degradadores són normalment inferiors al descrit per a E. coli. Així, les soques bacterianes degradadores d’hidrocarburs presenten uns rendiments al voltant del 30 % (Casellas et al., 1997), i per això les proporcions haurien d’estar al voltant de 150:10:4. FASES EN UN PROJECTE DE BIOREMEDIACIÓ Per portar a terme una bioremediació s’han de seguir una sèrie d’etapes. En primer lloc es necessita caracteritzar l’emplaçament mitjançant sondeigs i presa de testimonis. En aquesta etapa s’ha de poder disposar d’un mapa hidrogeològic de l’emplaçament i de l’abast i el tipus de contaminació, i també s’ha de saber si existeix fase lliure en les aigües subterrànies. La fase lliure és freqüent en la contaminació amb hidrocarburs i suposa l’existència d’una capa flotant d’hidrocarburs. Aquesta informació servirà per portar a terme la fase següent, que consisteix a dur a terme els anomenats estudis de factibilitat o tractabilitat. Aquests estudis es realitzen al laboratori i pretenen poder respondre dues preguntes. En primer lloc, si és adequat aplicar una bioremediació en un determinat emplaçament contaminat, i en segon lloc, si la resposta anterior és afirmativa, en quines condicions es podran obtenir uns resultats òptims. Hem de partir de la base que cada emplaçament presenta unes característiques particulars i, per tant, dos sòls poden respondre de manera diferent enfront d’un determinat agent bioestimulant En aquest sentit, el Grup de Recerca de Biodegradació i Bioremediació de la Universitat de Barcelona, dirigit per Anna Maria Solanas, integrat en el Centre de Referència de Biotecnologia de la Generalitat de Catalunya, ja fa més de trenta anys que treballa en el camp de la biodegradació d’hidrocarburs, i

des de l’any 1998 realitza un paper destacat dins dels sectors implicats, ja siguin empreses o administracions, per convèncer de la necessitat de portar a terme aquests tipus d’estudis. De manera equivocada, alguna empresa pot voler repetir en un altre emplaçament un tipus d’estratègia de bioremediació que li ha funcionat en un sòl, i no necessàriament el nou sòl respondrà de la mateixa manera. La realització dels assaigs de factibilitat permeten conèixer la capacitat de resposta d’un emplaçament concret. Aquest tipus d’estudi pot abaratir el cost final del projecte i, el que és més important, augmentar les possibilitats d’èxit. En aquest sentit, el grup esmentat ha desenvolupat un protocol d’assaigs de tractabilitat (Sabaté et al., 2003) que ha aplicat a diferents tipologies de sòls contaminats (Martínez et al., 2003; Viñas et al., 2001, 2005; Sabaté et al., 2003). Una vegada demostrada la factibilitat de portar a terme una bioremediació i quines són les condicions més eficaces, és convenient portar a terme una prova pilot, en què es poden ajustar els diferents paràmetres. Finalment es porta a terme la implementació de la tecnologia escollida acompanyada d’un protocol de control del procés. EXPERIÈNCIES DE BIOREMEDIACIÓ A CATALUNYA Prova pilot de bioremediació d’un sòl contaminat per olis minerals a Lliçà de Vall amb la tecnologia de la bioventilació Atesa la contaminació del sòl de les antigues instal·lacions de Clipper Oil de Lliçà de Vall, la Junta de Residus de la Generalitat de Catalunya va actuar subsidiàriament per evitar la possible afectació de pous d’abastament d’aigua. La contaminació era

LA BIOREMEDIACIÓ 195

d’olis minerals. En primer lloc, es va portar a terme una tecnologia de confinament actiu per part de l’empresa ECOCAT SL (abans TQMA). A continuació es va demanar un estudi de factibilitat a la Universitat de Barcelona per aplicar una bioremediació. L’existència de poblacions microbianes degradadores d’hidrocarburs, metabòlicament actives, capaces de biodegradar els hidrocarburs presents en el sòl, van permetre establir que l’emplaçament era susceptible de ser sotmès a la tecnologia de la bioremediació. La segona fase dels assaigs de tractabilitat havia de permetre trobar les condicions més adequades per arribar a optimitzar el procés. Ja que la Junta de Residus volia portar a terme una bioremediació in situ, es van dissenyar uns lisímetres per avaluar el subministrament d’aire i el subministrament de nutrients inorgànics en forma de nitrat i fosfat, per tal d’acostar-se més a les condicions del camp (vegeu la figura 2). Un bon airejament i un grau d’humitat òptim van ser els paràmetres clau per assolir un bon descens de la concentració d’hidrocarburs. L’addicció de nutrients en forma de nitrat i fosfat accelerava el procés i permetia un descens lleugerament superior. No obstant això, atès el confinament, es va optar per portar a terme una bioventilació. Aquesta tecnologia va ser aplicada per TQMA (vegeu la figures 3a, b i c). Durant tot el procés es va realitzar un rigorós seguiment de les poblacions microbianes, de la concentració d’oxigen i CO2 i de la concentració dels hidrocarburs (Martinet et al., 2003). En aquesta prova pilot es van assolir unes eliminacions del 84-97 % dels hidrocarburs totals del petroli (TPH).

Prova pilot de bioremediació d’un sòl contaminat per creosota a Callús amb la tecnologia de la biopila dinàmica En unes instal·lacions de tractament per a la conservació de la fusta es va portar a terme una bioremediació mitjançant la tecnologia de la biopila dinàmica (vegeu la figura 4). La creosota està formada per hidrocarburs aromàtics policíclics (HAP), dels quals és ben coneguda la toxicitat. Després de portar a terme els estudis al laboratori per part del grup de la Universitat de Barcelona es va optar per aplicar una biopila dinàmica mantenint l’airejament i la humitat òptima mitjançant el volteig de la terra i el rec amb aigua (Viñas, 2005). Aquesta prova pilot va ser finançada per

Figura 2. Assaig de factibilitat amb lisímetres per avaluar el subministrament d’aire, humitat òptima i addició de nutrients en un sòl contaminat d’olis minerals (Clipper Oil, Lliçà de Vall).

196 A. M. SOLANAS

Figures 3a i 3b. A dalt, plànol de l’emplaçamernt amb els pous d’injecció d’aire i els pous de control; a baix, perfil de la situació dels pous d’injecció d’aire i dels pous de control.

LA BIOREMEDIACIÓ 197

la Junta de Residus de la Generalitat. En aquesta prova pilot, que va durar sis mesos, es van assolir unes degradacions entre el 96 i el 100 % per als HAP de tres anells. Per als HAP de quatre i cinc anells es van assolir disminucions entre el 46 i el 76 %. Hem de dir que alguns dels HAP no van assolir els valors NGR que es troben en la Llei de sòls. Aquest sòl està sent objecte d’estudi per part del grup de recerca de la Universitat de Barcelona. Prova pilot de bioremediació in situ d’aigües subterrànies contaminades per nitrats La contaminació per nitrats de les aigües subterrànies és un problema important per a Catalunya. En aquest sentit, l’empresa catalana D d’enginy Biorem SL, pionera en la recerca de tractaments anaerobis in situ d’aigües subterrànies, va rebre l’encàrrec de l’Agència Catalana de l’Aigua (ACA) per portar a terme una bioremediació d’unes aigües contaminades per nitrats. La proposta plantejada per l’empresa està basada en la desnitrificació bacteriana. Aquesta tecnologia aprofita la capacitat que té un grup important de microorganismes per utilitzar els nitrats per respirar. Aquest procés suposa convertir el nitrat en nitrogen gas. En aquest procés es necessita un substrat carbonatat fàcilment respirable per als microorganismes desnitrificants, que s’injecta mitjançant pous d’injecció (vegeu la figura 5).

típica cinètica de desaparició dels contaminants es pot observar a la figura 6. A una disminució inicial ràpida segueix un descens molt més lent. El procés suposa un enriquiment del sòl en compostos cada vegada més recalcitrants i menys biodisponibles. En aquest sentit, si s’han d’assolir uns valors concrets per a cada contaminant diana, reflectits en la Llei de sòls com a valors de referència o NGR, això pot comportar una durada excessivament llarga. És el cas d’alguns contaminants d’alt pes molecular i d’elevada hidrofobicitat i recalcitrància. Els equips de recerca hem de trobar la manera de disminuir el temps dels processos de bioremediació i tractar d’assolir valors més baixos d’alguns contaminants. Es tracta d’incidir en el punt d’inflexió de la cinètica en què es produeix un enriquiment dels contaminants més recalcitrants i menys biodisponibles. En aquests moments els esforços els estem realitzant en la millora del coneixement de les poblacions microbianes implicades, la millora de la biodisponibilitat dels

LIMITACIONS I ASPECTES NECESSITATS D’INVESTIGACIÓ Una de les limitacions més importants de la bioremediació és el temps necessari per assolir els objectius de descontaminació, que podria estar entre tres i deu mesos. La

Figura 3c. Control d’oxigen i CO2.

198 A. M. SOLANAS

contaminants i la biodegradació de contaminants recalcitrants. Les poblacions microbianes del sòl encara són poc conegudes, i s’estima que tan sols un 0,1-1 % dels microorganismes presents són cultivables (Amann et al., 1995). En aquest sentit, l’aparició de tècniques moleculars ha permès augmentar el coneixement dels microorganismes presents en un sòl a partir de l’extracció del DNA total, l’amplificació dels gens que codifiquen els

Figura 4. Construcció i manteniment de la biopila dinàmica.

rRNA 16S o 18S, la separació i la seqüenciació posterior. El coneixement de les poblacions microbianes presents en un sòl sotmès a una tecnologia de bioremediació ens pot permetre conèixer millor la resposta d’aquestes als diferents agents bioestimulants (vegeu la figura 7). En aquest sentit, els estudis amb sòls afectats per diferents tipologies de contaminants ens ha permès observar que la pràctica quasi universal d’addició de nutrients a l’inici d’un procés de bioremediació afavoreix les poblacions degradadores d’hidrocarburs alifàtics, però no les degradadores d’HAP. L’explicació estaria en el fet que els microorganismes que degraden els HAP són de creixement lent i els degradadors d’alifàtics, més fàcils de degradar, són de creixement ràpid. Per tant, l’addició de nutrients afavoriria les poblacions degradadores d’alifàtics en detriment de les degradadores d’HAP. Així doncs, en sòls contaminats per olis minerals o gasoil és adequat afegir nutrients, mentre que no ho és, almenys a l’inici del procés, en sòls contaminats per HAP, com per exemple els sòls contaminats per creosota (Viñas et al., 2005). Durant molts anys es pensava que la no-biodegradabilitat d’un contaminant era deguda al fet que els microorganismes presents no tenien la capacitat catabòlica per degradar-lo o els mancava algun dels factors necessaris per al seu metabolisme. En l’última dècada s’ha vist que molts contaminants no estan biodisponibles per als microorganismes (Mahro, 2000): per fenòmens de sorció, ja sigui adsorció a partícules d’argila o absorció dins la matèria orgànica, per segrest mitjançant l’establiment d’enllaços covalents dels contaminants amb els àcids húmics, o per interiorització dins de nanopors amb la pèrdua conseqüent d’accessibilitat per als bacteris. La possible addició de tensioactius o, encara millor, de biotensioactius, podria desadsorbir els contami-

LA BIOREMEDIACIÓ 199

nants i permetre’n la biodegradació. Ara bé, mentre que s’han obtingut resultats espectaculars de millora de la biodegradació dels contaminants hidrofòbics amb l’addició de biotensioactius en medi líquid (Abalos et al., 2004), el comportament d’aquests en medi sòlid és molt més complex i els resultats de què disposem són contradictoris (Ron i Rosenberg, 2002). En l’accident succeït a la costa gallega del petroler Prestige en el mes de novembre de 2002 es va produir una marea negra que va afectar la costa gallega i la càntabra. El producte vessat era un fuel molt pesant enriquit amb components d’elevat pes molecular, tan pel que fa la part alifàtica com pel que fa a l’aromàtica. Dels diferents agents bioestimulants i diferents consorcis comercials que es van assajar, el que va presentar millors resultats va ser un fertilitzant oleofílic que presentava un tensioactiu en la seva formulació (vegeu la figura 8). Precisament

l’efecte d’aquest tensioactiu va ser el de millorar la biodisponibilitat dels components més pesants (Jiménez et al., 2006). Un altre aspecte important és refereix al destí dels contaminants. Els contaminants del sòl poden ser mineralitzats pels microorganismes (convertits en anhídrid carbònic i aigua) o bé parcialment oxidats. En el cas dels hidrocarburs aromàtics policíclics (HAP) és molt coneguda la producció de metabòlits d’oxidació intermèdia, que solen ser més tòxics que els hidrocarburs originals. En aquest sentit es va descriure l’aïllament d’una soca bacteriana F101 d’Arthrobacter sp. que degradava el fluorè, un HAP de tres anells, mitjançant tres rutes catabòliques diferents: dues que portaven a la mineralització del fluorè i una tercera que suposava l’oxidació del fluorè a fluorenona, una cetona aromàtica molt més tòxica que el fluorè. Aquesta cetona s’acumulava per-

Figura 5. Prova pilot de descontaminació de nitrats segons el procediment de bioremediació in situ per desnitrificació bacteriana (Osona).

200 A. M. SOLANAS

què la soca F101 no tenia els enzims necessaris per mineralitzar-la. Aquest fenomen va portar els investigadors a intentar aïllar una soca bacteriana que fos capaç de degradar la fluorenona. Es va aïllar la soca MC2 de Pseudomonas mendocina, que degradava la fluorenona però no el fluorè, és a dir, presentava el sistema enzimàtic que no tenia la soca F101 (Casellas et al., 1998). En aquest moment es tenia, al laboratori, un model de cooperació catabòlica entre diferents microorganismes que permetia que amb el cocultiu de les dues soques s’eliminessin el fluorè i la fluorenona. Podia tractar-se d’un model de col·laboració metabòlica freqüent en els processos de bioremediació de sòls contaminats per HAP. Aquesta hipòtesi es va confirmar en la bioremediació del sòl contaminat per creosota esmentat anteriorment. Mentre que a l’inici de la bioremediació el sòl presentava un alt contingut d’HAP i de productes d’oxidació intermèdia com la fluorenona, aquests van anar disminuint fins pràcticament desaparèixer al llarg del procés de bioremediació (Sabaté et al., 2006). Per tant, els resultats podrien fer concloure que la col·laboració metabòlica entre diferents poblacions microbianes pot ser un dels principals mecanismes d’eliminació dels contaminants en el medi.

Figura 6. Cinètica de degradació dels contaminants en un procés de bioremediació.

Finalment, un altre punt crític que es presenta al final d’un procés de bioremediació és el relacionat amb els criteris de descontaminació. Considerar que un sòl no està descontaminat perquè la concentració residual d’algun hidrocarbur excedeix el valor estàndard establert en el RD (NGR) no és científicament correcte. S’hauria d’incloure un criteri de toxicitat i no considerar el valor de referència com a únic criteri. Per exemple, el NGR del benzo(a)antracè, que és un HAP de quatre anells, és de 2 ppm per a un sòl urbà i de 20 ppm per a un sòl industrial. Quan un contaminant es troba al sòl pot estar biodisponible per als microorganismes, és a dir, que aquests el poden captar com a substrat per al seu metabolisme, o pot no estar-ho (Mahro, 2000). Fenòmens de sorció a les argiles, d’absorció a la matèria orgànica o de segrest per entrar a formar part del humus del sòl suposen convertir els contaminants en no biodisponibles. Si un contaminant no està biodisponible la toxicitat se’n veurà modificada. Per tant, a més dels NGR s’hauria d’incloure una avaluació toxicològica, que permetria considerar un sòl com a descontaminat, malgrat No tractat

+ Nutrients

- Nutrients

M 21d

45d

90d

135d

200d

21d

45d

90d

135d

200d

Figura 7. Electroforesi en gels de gradient de densitat (DGGE). Cadascuna de les bandes correspon a un microorganisme diferent. Es pot veure la seva dinàmica al llarg del temps i en resposta a diferents tractaments, com ara afegir nutrients.

LA BIOREMEDIACIÓ 201

que no s’haguessin assolit els valors absoluts de NGR. Hem d’esmentar que aquestes concentracions s’obtenen a partir de metodologies químiques basades en extraccions fortes amb dissolvents orgànics, lluny dels lixiviats que es poden produir després de la pluja. En aquest sentit s’està generant informació al respecte mitjançant l’avaluació toxicològica dels sòls al llarg de processos de bioremediació amb assaigs de toxicitat, com ara la germinació de llavors i la toxicitat aguda en cucs (Eisenia foetida). Per concloure, del que s’ha exposat en l’apartat de normatives i de les proves pilot que s’han portat a terme a Catalunya fins ara es desprèn el fet que cal potenciar el desenvolupament i, per tant, la recerca de millores tècniques en la recuperació de sòls, especialment aquelles que permetin la

recuperació in situ o bé on site/ex situ, i que siguin viables des del punt de vista del cost. Així doncs, els tractaments biològics seran importants per a la recuperació d’aquells sòls contaminats en què aquest tipus de tècniques siguin aplicables. Actualment aquestes tecnologies s’estima que representen només un 2-3 % del total; indiscutiblement, aquest percentatge haurà de créixer en un futur. BIBLIOGRAFIA Abalos, A.; Viñas, M.; Sabaté, J.; Manresa, M. A.; Solanas, A. M. (2004). «Enhanced biodegradation of Casablanca crude oil by a microbial consortium in presence of a rhamnolipid produced by Pseudomonas aeruginosa AT10». Biodegradation, 15: 249-260.

Figura 8. Assaig de bioremediació a la costa afectada pel vessament del Prestige. A l’esquerra, vista de les dues parcel· les, una tractada per bioremediació amb un nutrient oleofílic i l’altra de control; a la dreta a dalt, roques tractades; a la dreta a baix, roques no tractades.

202 A. M. SOLANAS

Alexander, M. (1999). Biodegradation and Bioremediation. Londres: Academic Press. Alvarez, P. J. J. (2006). Bioremediation and natural attenuation: process fundamentals and matemathical models. Hoboken: Wiley. Amann, R. I.; Ludwig, W.; Schleifer, K. H. (1995). «Phylogenetic identification and situ detection of individual microbial cells without cultivation». Microb. Rev., 59: 143-169. Atlas, R.; Philip, J. (2005). Bioremediation: applied microbial solutions for real-world environmental cleanup. Washington: ASM Press. Bordons, A.; Constanti, M. (1999). Introducció a la biotecnologia ambiental: solucions als problemes ambientals mitjançant sistemes biològics. Tarragona: Universitat Rovira i Virgili. Busquet, E. (1997) Elaboració dels Criteris de Qualitat del Sòl a Catalunya. Barcelona: Generalitat de Catalunya. Casellas, M.; Grifoll, M. Bayona, J. M.; Solanas, A. M. (1997). «New metabolites in the degradation of fluorene by Arthrobacter sp. Strain F101». Appl. Environ. Microbiol., 63: 819-826. Casellas, M.; Grifoll, M.; Sabaté, J.; Solanas, A. M. (1998). «Isolation and characterization of a 9-fluorenone degrading bacterial strain and its role in a synergistic degradation of fluorene by a consortium». Can. J. of Microbiol., 44: 734-742. Generalitat de Catalunya. Departament de Medi Ambient. Junta de Residus (2007). Guia d’avaluació de la qualitat del sòl: criteris provisionals de qualitat del sòl a Catalunya. Barcelona. Generalitat de Catalunya. Jiménez, N.; Viñas, M.; Sabaté, J.; Diez, S.; Bayona, J. M.; Solanas, A. M.; Albaiges, J. (2006). «The Prestige oil spill. II. Enhanced biodegradation of a heavy fuel oil by the use of an oleophilic fertilizer under field conditions». Environmental Science and Technology, 40: 2578-2585. Koenigsberg, S.; Mahaffey, M. (2001). «The use of oxygen release compound for bioremediation of MTBE». Contaminated Soil Sediment and Water, núm. primavera: 42. Mahro, B. (2000). «Bioavalilability of contaminants. Environmental processes II». A: Klein, J. [ed.]. Biotechnology, vol. VII. Wenheim: Wiley-VCH: 61-88. Martinez, R.; Sabaté, J.; Viñas, M.; Romanya, J.; Simo neau, R.; Fons, J.; Vidal, G.; Viñolas C.; Solanas, A. M. (2003). «Determinación de las condiciones óptimas de biorremediación con bioventing en un suelo contaminado con aceites minerales». Residuos Revista Técnica, 74: 72-82. Mulligan, C. N.; Yong, R. N.; Gibbs, B. F. (2001). «Surfactant-enhanced remediation of contaminated soil: a review». Engineering Geology, 60: 371-380.

ONU (1992). Report of the United Nations Conference on Environment and Development. Annex I: Rio Declaration on Environment and Development [en línia]. <http://www.un.org/documents/ga/conf151/ aconf15126-1annex1.htm> Ron, E. Z.; Rosenberg, E. (2002). «Biosurfactants and oil bioremediation». Curr. Opin. Biotechnol., 13: 249-252. Sabaté, J.; Viñas, M.; Solanas, A. M. (2003). «Combatir el fuel del Prestige». Mundo Científico, 243: 32-39. — (2004). «Laboratory-scale bioremediation experiments on two hydrocarbon contaminated soils». International Biodeterioration and Biodegradation, 54: 19-25. — (2006). «Bioavailability assessment and environmental fate of PAHs in biostimulated creosote-contaminated soil». Chemosphere, 63: 1648-1659. Singh, A.; Ward, O. P. (2004). Biodegradation and bioremediation. Berlín: Springer. Singh, S. N.; Tripathi, R. D. (2007). Environmental bioremediation technologies. Berlín: Springer. Talley, J. W. (2006). Bioremediation of recalcitrant compounds. Boca Raton: CRC Taylor & Francis. Ulrici, W. (2000). «Contaminated soil areas, different countries and contaminants, monitoring of contaminants. Environmental processes II». A: Klein, J. [ed.]. Biotechnology, vol. VII. Wenheim: Wiley-VCH: 5-42. Viñas, M. (2005). Biorremediación de suelos contaminados por hidrocarburos: caracterización microbiológica, química y ecotoxicológica. Barcelona: Universitat de Barcelona. [Tesi doctoral] Viñas, M.; Grifoll, M.; Sabaté, J.; Solanas, A. M. (2002). «Biodegradation of a crude oil by three microbial consortia of different origins and metabolic capabilities». J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 28: 252-260. Viñas, M.; Sabaté, J.; Espuny, M. J.; Solanas, A. M. (2005). «Bacterial community dynamics and PAHs degradation during bioremediation of a heavily creosote-contaminated soil». Applied and Environmental Microbiology, 71: 7008-7018. Viñas, M.; Sabaté, J.; Grifoll, M.; Solanas, A. M. (2001). «Ensayos de tratabilidad en la recuperación de suelos contaminados por la tecnología de la biorremediación». Residuos Revista Técnica, 59: 78-82. Viñas, M.; Sabaté, J.; Solanas, A. M. (2005). «Culturedependent and independent approaches establish the complexity of a PAH-degrading microbial consortium». Canadian Journal of Microbiology, 51: 897909. Wilson, R.; Mackay, D.; Scow, K. (2002). «In-situ MTBE biodegradation supported by diffusive oxygen release». Environmental Science and Technology, 36: 190-199.

ÍNDEX D’AUTORS Arús, P. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87 Blanch, A. R. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 175 Calle, F. de la . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141 Coll, M. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25 Figueras, A. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105 Gòdia, F. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7, 157 Gómez, A. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105 Guigó, R. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 Merkoçi, A. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51

Musoles, S. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65 Palacios, J. M. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65 Piferrer, F. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105 Puigdomènech, P. . . . . . . . . . . . . . . . . 7, 79 Samitier, J. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39 Solà, C. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 157 Solanas, A. M. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 187 Tort, L. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105 Uriz, M. J. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 125

SOCIETAT CATALANA DE BIOLOGIA Consell Directiu President Vicepresident 1r Vicepresidenta 2a Secretària general Vicesecretari Tresorera Vocal 1r, lexicografia Vocal 2n, recerca Vocal 3r, sessions Vocal 4a, relacions exteriors Vocal 5è, publicacions Vocal 6è, estudiants Delegat de l’IEC

Jaume Reventós i Puigjaner Ferran Azorín i Marín Montserrat Vendrell i Rius Àurea Navarro i Sabaté Arcadi Navarro i Cuartiellas Carme Segarra i Robert Ricard Roca i Pascual Lluís Tort i Bardolet Josep Clotet i Erra Cristina Junyent i Rodríguez Francesc Piferrer i Circuns Hèctor Ruiz i Martín Ricard Guerrero i Moreno

SOCIETAT CATALANA DE BIOLOGIA Seccions especialitzades Biofísica Biologia del desenvolupament Biologia evolutiva Biologia i indústria Biologia molecular Biologia molecular del càncer Biologia de la reproducció Biologia i societat Ecologia Ensenyament Fisiologia vegetal Microbiologia Neurobiologia experimental Senyalització cel·lular i metabolisme Virologia Estudiants SCB a Alacant SCB a Balears SCB a Lleida SCB al Pallars SCB a València SCB a Vic

Esteve Padrós Jordi Garcia-Fernández Montserrat Papaceit Ramon Roca Maribel Geli Gabriel Capellà Francesca Vidal Cristina Junyent Josep Maria Espelta i Ramon Masana Rosa Pérez Josep M. Torné Mercè Berlanga Josep Saura Francesc Vinyals Miguel À. Martínez i Ana Angulo Hèctor Ruiz Ivan Quesada Balbina Nogales M. Ángeles de la Torre Xavier Castells Helena Mira Jordi Planas

ACTIVITATS DEL CURS 2006-2007

I. CONGRESSOS I SIMPOSIS 22 i 23 de novembre VI Simposi de neurobiologia experimental Sala Prat de la Riba, IEC. C. Carme, 47. Barcelona. Organitza: Secció de Neurobiologia experimental de la SCB 3 de maig Minisimposi: Cèl·lules mare i malaltia de Parkinson Sala d’actes, biblioteca, campus de Burjassot, Universitat de València. Del 9 a l’11 de maig RECAM 2007. Reunió Científica Anual de la Secció de Microbiologia de la SCB CERC. C. Montealegre, 7. Barcelona. Organitza: Secció de Microbiologia de la SCB II. CURSOS 20-22 de setembre V Curs de tècniques de fisiologia cel·lular Aulari i Departaments de Fisiologia, Genètica i Microbiologia, UA, i Institut de Bioenginyeria, UMH, Elx. Organitza: Secció de la SCB a Alacant 14 i 15 de desembre Models lineals generalitzats (GLM) en ecologia Aula d’informàtica del CREAF, Edifici C. UAB. Bellaterra. Organitza: Secció d’Ecologia Del 12 al 16 de març III Curs de comunicació científica Aula 2, Fac. de Biologia, UB. Av. Diagonal, 645. Barcelona Organitza: Secció de Biologia i societat de la SCB i Omnis Cellula 10, 11 i 12 de juliol Curs de ciència-ficció Aula 1, Fac. de Biologia, UB. Barcelona. Organitza: Secció d’Estudiants

208

III. JORNADES 14 i 15 de setembre XIV Jornada de biologia molecular Sala Prat de la Riba, IEC. C. Carme, 47. Barcelona. Organitza: Secció de Biologia molecular de la SCB 18 d’octubre I Jornada sobre la recerca i la gestió dels espais costaners i marins protegits als Països Catalans Sala Prat de la Riba, IEC. C. Carme, 47. Barcelona. Sessió conjunta ICHN-SCB 10 de novembre IV Jornada de fisiologia vegetal Sala Pere Coromines, IEC. C. Carme, 47. Barcelona. Organitza: Secció de Fisiologia vegetal de la SCB 13 de novembre VI Jornada de virologia Sala Prat de la Riba , IEC. C. Carme, 47. Barcelona. Organitza: Secció de Virologia de la SCB 20 de novembre III Jornada de biologia i filosofia Sala Pere Coromines. IEC. C. Carme, 47. Barcelona. 30 de novembre Jornada conjunta SCB-ICHN-CREAF sobre canvi global: efectes i estratègies de gestió Sala Prat de la Riba , IEC. C. Carme 47. Barcelona. 13 de desembre Jornada de la Secció de Biologia i societat: de la comunicació científica a Catalunya Sala Pere Coromines, IEC. C. Carme, 47. Barcelona. Organitza: Secció de Biologia i societat de la SCB 16 i 24 de febrer IV Jornades de biologia molecular i cel·lular per a professors de secundària Universitat de Barcelona i Hospital General Organitza: Secció d’Ensenyament de la SCB 22 i 23 de març Jornades sobre energia: crisis, riscos i solucions Aula 2, Fac. de Biologia, UB. Av. Diagonal, 645. Barcelona Organitza: Secció d’Estudiants

209

25 d’abril X Jornada de biologia de la reproducció Aula 2, CaixaForum. Av. Marquès de Comillas, 6-8. Barcelona Organitza: Secció de Biologia de la reproducció 12 de maig II Matinal de l’evolució Auditori Joan Plaça. Jardí botànic. UV. València. 28 i 29 de juny XV Jornades de biologia molecular Sala Prat de la Riba, IEC. C. Carme, 47. Barcelona. Organitza: Secció de Biologia molecular i Secció de Biologia i indústria de la SCB 2 de juliol VII Jornada de biologia evolutiva Sala Prat de la Riba, IEC. C. Carme, 47. Barcelona. Organitza: Secció de Biologia evolutiva de la SCB 5 i 6 de juliol Jornada divulgativa de biologia humana Aula 1, Fac. de Biologia, UB. Barcelona. Organitza: Secció d’Estudiants i Omnis cellula 16 de juliol Perspectives in genomics and proteomics 2007 Sala Prat de la Riba, IEC. C. Carme, 47. Barcelona. Organitza: Secció de Proteòmica i genòmica de la SCB IV. ALTRES / SESSIONS EXTRAORDINÀRIES 3, 4, 5 i 10 d’octubre Gimcana forestal «Boscos, incendis i canvi climàtic» Serra de Castelltallat, Bages Organitza: Consell Directiu, Secció de Biologia i societat de la SCB i CREAF 5, 11, 19 i 26 d’octubre III Cicle de cinema científic Aula magna, Fac. de Biologia, UB. Barcelona. Organitza: Secció d’Estudiants 19 de desembre Conferència sobre el Premi Nobel de Fisiologia o Medicina Sala Pi i Sunyer, IEC. C. Carme, 47. Barcelona. Silencing of the genome by small non-coding RNA Ramin Shikhattar, professor d’investigació d’ICREA

210

14 de febrer Dia de Darwin a la Universitat de València Sala de Seminaris, Institut Cavanilles de Biodiversitat i Biologia, Campus de Burjassot, València. Seminari de Recerca: Patrones biogeogràficos y evolución del gasterópodo marino venenoso Conus en el archipiélago de Cabo Verde Rafael Zardoya, MNCN-CSIC, Madrid Organitza: Secció de València de la SCB 27 de març Conferència de la guanyadora del Premi Sala-Trepat 2007 Sala Pere Coromines, IEC. C. Carme, 47. Barcelona Els brassinosteroides i la seva funció en el desenvolupament vascular en Arabidopsis thaliana Ana Caño-Delgado, Consorci CSIC-IRTA, Barcelona 12-14 d’abril VIII Exporecerca Jove Cosmocaixa. C. Teodor Roviralta, 47-51. Barcelona. 19 de juny Acte del centenari de l’IEC Sala Prat de la Riba, IEC. C. Carme, 47. Barcelona. Ciència i societat, grans reptes Federico Mayor Zaragoza

Interior 58 Soc Cat Bio

27/01/09

09:01

Página 1

10:15

Página 1

TREBALLS DE LA SOCIETAT CATALANA DE BIOLOGIA

VOLUM 58, 2007

ÍNDEX

LES BIOTECNOLOGIES

28/1/09

TREBALLS DE LA SOCIETAT CATALANA DE BIOLOGIA LES BIOTECNOLOGIES

11 25 39

VOLUM 58, 2007

65 79 87 105 125

FILIAL DE L’INSTITUT D’ESTUDIS CATALANS

141 157 175 187

TREB. SOC. CAT. BIOL., VOL. 58, 2007

Cub. 58 Soc Cat Bio

BARCELONA 2009

10:31

Página 1

LES BIOTECNOLOGIES

28/1/09

TREB. SOC. CAT. BIOL., VOL. 58, 2007

Sobrecob 58 Soc Cat Bio

LES BIOTECNOLOGIES PERE PUIGDOMÈNECH I FRANCESC GÒDIA EDITORS Il·lustració de la sobrecoberta

TREBALLS DE LA SOCIETAT CATALANA DE BIOLOGIA VOLUM 58, 2007

10:31

Página 1

LES BIOTECNOLOGIES

28/1/09

TREB. SOC. CAT. BIOL., VOL. 58, 2007

Sobrecob 58 Soc Cat Bio

LES BIOTECNOLOGIES PERE PUIGDOMÈNECH I FRANCESC GÒDIA EDITORS Il·lustració de la sobrecoberta

TREBALLS DE LA SOCIETAT CATALANA DE BIOLOGIA VOLUM 58, 2007