Issuu

13:37

PÆgina 1

ANTIMICROBIANS

21/12/2005

Il·lustració de la sobrecoberta Sífilis, de Ramon Casas Original per a cartell; llapis conté i pastel; 46 × 28 cm; Barcelona, 1900 Museu Nacional d’Art de Catalunya, Barcelona [MNAC/GDG 108770]

TREB. SOC. CAT. BIOL., VOL. 55, 2004

SobreCub. Volum 55.qxd

ANTIMICROBIANS JOAQUIM RUIZ EDITOR

TREBALLS DE LA SOCIETAT CATALANA DE BIOLOGIA VOLUM 55, 2004

Aquest dibuix és l’original per al cartell de Casas Sífilis, que anunciava el sanatori del doctor Abreu, que tenia la seu al carrer Major de la Bonanova de Barcelona, dedicat a la curació de malalties de transmissió sexual. El cartell, imprès per la Casa Thomas, incloïa les llegendes següents: «Sífilis», amb les esses en forma de serp, a la part superior, i «Curación absoluta y radical en el Sanatorio para sifilíticos» a la inferior, i, en lletres més petites, les dades de l’establiment. L’artista fa servir una figura d’una dona tapada amb un mantó de Manila, com en altres cartells d’anuncis seus, però aquí li dóna un sentit diferent en introduir-hi elements clarament simbòlics al·lusius a la malaltia i a la perillositat del contacte sexual. La dona ofereix un lliri blanc amb la mà esquerra, però amaga la malaltia, representada per la serp que té agafada amb la mà dreta i s’enfila pel mantó. Casas no podia saber que la sífilis està produïda per Treponema pallidum, una espiroqueta petitíssima que podria recordar una serp microscòpica. Atès que la sífilis era una malaltia que els homes contreien principalment a través del contacte amb prostitutes, Casas va triar la imatge colpidora d’una d’aquelles dones, que va representar demacrada i amb aspecte de malalta. A començament del segle XX, la sífilis era la malaltia de transmissió sexual més temuda, no únicament pels efectes i les complicacions que podia causar en les persones afectades, sinó perquè el reconeixement públic de la malaltia era un estigma social.

13:37

PÆgina 1

ANTIMICROBIANS

21/12/2005

TREB. SOC. CAT. BIOL., VOL. 55, 2004

SobreCub. Volum 55.qxd

ANTIMICROBIANS JOAQUIM RUIZ EDITOR

TREBALLS DE LA SOCIETAT CATALANA DE BIOLOGIA VOLUM 55, 2004

13:30

PÆgina 1

TREBALLS DE LA SOCIETAT CATALANA DE BIOLOGIA

VOLUM 55, 2004

ÍNDEX

ANTIMICROBIANS Presentació. Antimicrobians: des d’abans de 1929 fins ara . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . J. RUIZ ANTIMICROBIANS: GENERALITATS Resistència bacteriana. Aspectes generals . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . F. MARCO Utilització dels antimicrobians en veterinària i l’ús prudent dels antibiòtics . . . . . . . I. BADIOLA, A. PÉREZ, M. LLAGOSTERA I M. SACO Difusió de la resistència als antimicrobians. Diferents camins amb un mateix final . . . A. GARCÍA, M. REBOLLO I F. NAVARRO Sistemes d’expulsió activa i llur relació amb la resistència als agents antibacterians . . J. VILA, J. SÁNCHEZ-CÉSPEDES I A. RIBERA Antibioticoteràpia en la pràctica de la medicina tropical . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . M. CORACHAN Noves tecnologies en la recerca d’antimicrobians . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C. TARRAGÓ, C. ALEMANY, C. PALACÍN, J. TERENCIO I A. GUGLIETTA Resistència i virulència . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . S. M. SOTO PRINCIPALS GRUPS D’AGENTS ANTIBACTERIANS Els b-lactàmics . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . E. MIRÓ, A. RIVERA I R.-J. MESA Antibiòtics aminoglicòsids . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . M. P. GOÑI, M. C. AGUDO I R. GÓMEZ-LUS Tetraciclines . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A. RIBERA Quinolones: acció i resistència . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . J. RUIZ Glicopèptids: mecanismes d’acció i mecanismes de resistència . . . . . . . . . . . . . . . . . . . M. Á. DOMÍNGUEZ Macròlids: mecanismes d’acció i de resistència . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C. TORRES, Y. SÁENZ I A. PORTILLO Altres antibacterians . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C. VIDAL, M. SEGURA I C. SANTOS ALTRES ANTIMICROBIANS Agents antiretrovirals contra el VIH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C. GIL I J. M. GATELL Mecanismes d’acció dels antifúngics i resistència en llevats . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . J. M. TORRES-RODRÍGUEZ, Y. MORERA I E. ALVARADO Resistències als principals fàrmacs antituberculosos. Importància, detecció i alteracions genètiques associades . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . J. GONZÁLEZ I G. TUDÓ Terapèutica antiparasitària . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . I. M. OLIVEIRA

ANTIMICROBIANS

21/12/2005

TREBALLS DE LA SOCIETAT CATALANA DE BIOLOGIA

ANTIMICROBIANS

19 29

VOLUM 55, 2004

49 61 67 81

91 107

FILIAL DE L’INSTITUT D’ESTUDIS CATALANS

121 135 143 151 165

177 187 197 213

TREB. SOC. CAT. BIOL., VOL. 55, 2004

Cub. Volum 55.qxd

BARCELONA 2005

Interior cubierta.qxd

21/12/2005

13:35

PÆgina 1

NORMES DE PUBLICACIÓ DE TREBALLS DE LA SOCIETAT CATALANA DE BIOLOGIA Treballs de la Societat Catalana de Biologia (Treballs de la SCB) publica: a) revisions encarregades per la Societat, de ciències de la vida; b) comunicacions presentades a les sessions ordinàries i extraordinàries que organitza la Societat o les seves seccions especialitzades; c) monografies o conferències de científics convidats per la Societat; d) les ressenyes de les sessions científiques organitzades per la Societat. Presentació dels originals Els originals seran redactats en llengua catalana, excepte en casos justificats pels quals el Consell Directiu pugui acceptar una altra llengua. El Consell de Redacció consultarà especialistes, els quals, en qualsevol cas, determinaran si un article pot publicar-se immediatament, necessita revisió, o bé és rebutjat. Els autors rebran notificació de la decisió. Si el treball requereix revisió, es facilitaran als autors els comentaris escrits dels especialistes que l’hagin revisat. En el cas que no sigui acceptat, la còpia original i les il·lustracions seran retornades als autors. La submissió d’un manuscrit implicarà que el material és original i que no se’n considera la publicació en cap altra revista. Els originals es lliuraran en disquet d’ordinador de 3 ½” o per correu electrònic (scb@iec.es), junt amb una còpia en paper. El programa cal que sigui Microsoft Word (Macintosh o PC), pel que fa al text. Les figures, il·lustracions i taules també s’entregaran en suport informàtic. Feu servir el cognom de l’autor com a nom del document. Cal indicar en l’etiqueta del disquet: l’autor del treball, l’adreça i el sistema operatiu informàtic emprat. Els manuscrits mecanografiats seran acceptats tan sols en circumstàncies excepcionals. Les il·lustracions cal que siguin de bona qualitat i que les mides s’ajustin a les dimensions de la revista. L’original, incloent-hi les taules i les il·lustracions, no sobrepassarà l’extensió de vint fulls. Només podran ultrapassar aquest límit el text de les conferències o monografies extraordinàries, amb l’acord previ del Consell de Redacció de Treballs de la Societat Catalana de Biologia. Els treballs i la correspondència referent a la redacció hauran de dirigir-se al president del Consell de Redacció de Treballs de la Societat Catalana de Biologia, carrer del Carme, 47. 08001 Barcelona. Estructuració dels manuscrits Cada treball ha d’estar encapçalat pel títol, seguit pel nom i primer cognom del(s) autor(s) en majúscules i del lloc o llocs de treball respectius. S’evitarà la utilització de notes a peu de pàgina. Tots els fulls aniran numerats consecutivament començant pel full de la portada. Resum El resum, d’una extensió màxima de dues-centes paraules, serà redactat en català i anglès. El títol del treball també

haurà d’ésser traduït a l’anglès i s’acompanayarà d’un màxim de cinc paraules clau en anglès. Taules i il·lustracions Les fotografies en blanc i negre hauran d’ésser de bona qualitat i contrast. Les fotografies portaran al dors, en llapis tou, el cognom de l’autor i el número d’ordre i llur part superior haurà d’ésser indicada mitjançant una fletxa. Caldrà indicar quines són els originals i quines les còpies. Cada taula portarà un títol descriptiu breu i aniran numerades correlativament en caràcters romans. Bibliografia Els manuscrits inclouran les referències bibliogràfiques ordenades per ordre alfabètic. En el text s’indicarà per ordre cronològic els noms dels autors i la data de publicació; en el cas que una referència tingui més de dos autors, se citarà el primer seguit de et al. Cada referència inclourà, i en aquest ordre: cognoms dels autors (amb versaletes), any de publicació, títol de l’article, nom de la revista abreujat i en cursiva, número del volum i la primera i la darrera pàgines. Les referències a capítols i monografies indicaran el títol de la referència llibre seguit del nom del(s) editor(s), el títol del treball, la ciutat de publicació i l’editorial. Al final de la citació s’indicaran les planes que inclou el treball. Cal tenir en compte els exemples següents: CODINA, C.; VILADOMAT, F.; BASTIDA, J.; LLABRÉS, J. M. (1989). «Potencial biotecnològic del cultiu de cèl·lules vegetals per a l’obtenció de productes farmacèutics». Treb. Soc. Cat. Biol., vol. 40, pàg. 47-70. GLICK, T. F. (1989). «Biologia i context social: la nova historiografia del Darwinisme». Treb. Soc. Cat. Biol., vol. 40, pàg. 7-18. MELLADO, R. P. (1987). «Vectores utilizados para la manipulación y expresión de genes». A: Vicente, M.; Renart, J. Ingeniería genética. Madrid: CSIC, pàg. 21-30. YUNIS, J. J.; PRAKASH, O. (1982). «The origin of man: a chromosomal pictorial legacy». Science, núm. 215, pàg. 1525-1530. Proves d’impremta De tots els originals acceptats, l’autor (o bé el primer dels autors si són més d’un) en rebrà unes proves d’impremta per tal de corregir-les, i aquestes proves hauran d’ésser retornades, per correu urgent, a la secretaria de la Societat Catalana de Biologia, dins del termini màxim d’una setmana. En les proves no podran ésser introduïdes correccions d’estil, i només hi seran admeses les de caràcter ortogràfic i tècnic. Un cop publicat, se’n lliuraran a l’autor vint extrets sense càrrec.

TREBALLS DE LA SOCIETAT CATALANA DE BIOLOGIA

FILIAL DE L’INSTITUT D’ESTUDIS CATALANS

VOLUM 55, 2004

BARCELONA 2005

CONSELL DE REDACCIÓ FRANCESC PIFERRER, president RICARD ROCA, secretari MERCÈ PIQUERAS JOAN JOFRE RAMON BARTRONS LLUÍS SERRA RICARD GUERRERO

© dels autors dels articles Editat per la Societat Catalana de Biologia (filial de l’Institut d’Estudis Catalans) Carrer del Carme, 47. 08001 Barcelona Compost per Ricard Roca ricardroca@gmail.com Imprès a Limpergraf, SL Polígon industrial Can Salvatella, carrer de Mogoda, 29-31 Barberà del Vallès ISSN: 0212-3037 Dipòsit Legal: B. 12164-1963

Antimicrobians

Joaquim Ruiz editor

TREBALLS DE LA SOCIETAT CATALANA DE BIOLOGIA VOLUM 55, 2004

ÍNDEX Antimicrobians Presentació. Antimicrobians: des d’abans de 1929 fins ara . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . J. Ruiz

Antimicrobians: generalitats Resistència bacteriana. Aspectes generals . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 F. Marco Utilització dels antimicrobians en veterinària i l’ús prudent dels antibiòtics . . . . . . . . . . . . I. Badiola, A. Pérez, M. Llagostera i M. Saco

Difusió de la resistència als antimicrobians. Diferents camins amb un mateix final . . . . . . A. García, M. Rebollo i F. Navarro

Sistemes d’expulsió activa i llur relació amb la resistència als agents antibacterians . . . . . J. Vila, J. Sánchez-Céspedes i A. Ribera

Antibioticoteràpia en la pràctica de la medicina tropical M. Corachan

............................

Noves tecnologies en la recerca d’antimicrobians . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C. Tarragó, C. Alemany, C. Palacín, J. Terencio i A. Guglietta

Resistència i virulència . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . S. M. Soto

Principals grups d’agents antibacterians Els β-lactàmics . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . E. Miró, A. Rivera i R.-J. Mesa

Antibiòtics aminoglicòsids . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . M. P. Goñi, M. C. Agudo i R. Gómez-Lus

107

Tetraciclines . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A. Ribera

121

Quinolones: acció i resistència . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . J. Ruiz

135

Glicopèptids: mecanismes d’acció i mecanismes de resistència . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . M. Á. Domínguez

143

Macròlids: mecanismes d’acció i de resistència . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C. Torres, Y. Sáenz i A. Portillo

151

Altres antibacterians . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C. Vidal, M. Segura i C. Santos

165

Altres antimicrobians Agents antiretrovirals contra el VIH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C. Gil i J. M. Gatell

177

Mecanismes d’acció dels antifúngics i resistència en llevats . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . J. M. Torres-Rodríguez, Y. Morera i E. Alvarado

187

Resistències als principals fàrmacs antituberculosos. Importància, detecció i alteracions genètiques associades . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . J. González i G. Tudó Terapèutica antiparasitària . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . I. M. Oliveira

197

213

Antimicrobians (Joaquim Ruiz, ed.) Treballs de la SCB. Vol. 55 (2004) 7-8

. ANTIMICROBIANS. DES D’ABANS DE 1929 FINS ARA Joaquim Ruiz Centre de Salut Internacional, Hospital Clínic, IDIBAPS. Adreça per a la correspondència: Joaquim Ruiz. Centre de Salut Internacional, Hospital Clínic, IDIBAPS. Villarroel, 170. 08036 Barcelona. Adreça electrònica: joruiz@clinic.ub.es.

L’any 1929 Fleming va publicar el que és considerat arreu el treball que obrí l’era antibiòtica. En aquest treball va descriure la penicill. ina, que és considerat com l’antibiòtic per antonomàsia. Malgrat això, cal fer esment que les primeres observacions empíriques de caire científic que mostraven fenòmens deguts a la producció natural d’antibiòtics daten de mitjan segle xix. Aquestes observacions varen quallar en els primers treballs sobre antimicrobians, que es varen encetar a la segona meitat del mateix segle; així, per exemple, Lister, el 1871 va observar que en orines contaminades amb fongs no podien créixer bacteris. Per les mateixes dates Billroth va suggerir que Penicillium podia modificar els medis de cultiu i els feia inservibles per als bacteris. Garré, l’any 1877 ja parlava directament de la capacitat que presentaven alguns microorganismes d’inhibir la capacitat de creixement d’altres, i va dissenyar una metodologia per al desenvolupament d’aquesta mena d’estudis. Encara més, l’any 1899 ja es va introduir un producte antibiòtic en la pràctica clínica, la piocianasa, produïda per Pseudomonas aeruginosa, malgrat que l’experiència no va ésser gens positiva, atesa la toxicitat que presenta aquest producte. Fins i tot hi ha constància de dos treballs independents desenvolupats a la darreria del segle xix per Duchesne (1897) i Tiberio (1895), on

es descriu la penicill. ina i es demostra, no ja tan sols la seua capacitat bactericida in vitro, sinó que arriben molt més enllà que Fleming, ja que ambdós varen demostrar la seua capacitat per a curar infeccions experimentals en ratolins. Si aquests estudis haguessin estat continuats al seu moment, ara parlaríem de més de cent anys d’història dels antibiòtics. Deixant al darrere aquest període històric, del qual malauradament s’han perdut moltíssimes dades, el que és innegable és que des que la penicill. ina va ésser introduïda de manera estable en la clínica, cap als anys quaranta, un munt de substàncies varen ésser aïllades o sintetitzades, i varen permetre atacar els bacteris d’una manera directa. Fins i tot s’ha aconseguit disposar de substàncies capaces de fer front a infeccions de paràsits, fongs i, encara que d’una manera més limitada, de virus. Cal ressenyar que aquest avenç s’ha vist entelat per dues raons: a) El fet que els bacteris han desenvolupat mecanismes de resistència als agents antimicrobians. b) Les relacions «familiars» dels agents antimicrobians. Ambdós raonaments s’entrecreuen: els bacteris han estat capaços de desenvolupar mecanismes de resistència que abasten la totalitat de l’arsenal antibacterià del qual es disposa

J. RUIZ

actualment, i fins i tot hi ha patògens específics (com ara Acinetobacter baumannii) que presenten resistència a tots els antimicrobians emprats a hores d’ara, cosa que fa d’aquests bacteris autèntics paradigmes de la resistència. Alguns mecanismes de resistència són, de fet, «adaptacions» de mecanismes que en el seu origen tenien una altra funció, com podria ésser el cas de les bombes d’expulsió; d’altres són mutacions puntuals, o alteracions estructurals que no afecten la viabilitat bacteriana, malgrat que en alguns casos minvin la seua vitalitat, o afectin la seua capacitat infectiva. Tanmateix, hi ha d’altres mecanismes, com sistemes capaços de destruir o modificar els antibiòtics (potser heretats dels mateixos microorganismes productors d’antibiòtics). A més a més, els bacteris són prou promiscus per a intercanviar material genètic sense gaires entrebancs. Actualment es coneixen fins a tres mecanismes de transferència de material genètic: la conjugació, la transducció i la transformació. Aquestes vies de moviment de gens fan que els gens codificadors de mecanismes de resistència es puguin estendre de manera horitzontal, i no tan sols entre membres d’una mateixa espècie microbiana, sinó entre espècies llunyanes. El fet que el gran nombre d’antibacterians del cert es limiti a un petit nombre de famílies fa que comparteixin tant mecanismes d’acció com estructura general, fets, ambdós, que es resumeixen en el fet que la resistència a un membre d’una família sovint comporta la re-

sistència a la resta, o almenys un minvament en els seus nivells d’activitat. També cal tenir en compte que l’ús d’antimicrobians no es limita a la medicina humana: també es fan servir al món veterinari, la qual cosa fa que aquells patògens que tenen com a reservori determinats animals de granja presentin cada cop nivells de resistència més elevats a aquests agents. Per enllestir aquest panorama general, cal fer esment d’allò de què sempre ens oblidem: que l’ús dels antimicrobians té molt a veure amb el desenvolupament o selecció de soques resistents als mateixos. L’ús dels antimicrobians té una vessant econòmica, que fa que per a tractar una malaltia en diferents parts del món es facin servir diferents productes. Hi ha llocs on es disposa de recursos adients, que fan que els diagnòstics siguin acurats, i el ventall d’antimicrobians de què es disposa sigui ampli i variat, dins de les limitacions pròpies del nombre de famílies suara esmentades, cosa que fa que les resistències puguin ésser vorejades mitjançant un simple canvi de pauta terapèutica. Però als eufemísticament anomenats països en vies de desenvolupament, que són simplement països pobres, sense prou recursos econòmics per a garantir ni diagnòstic ni tractament, el ventall d’agents de què es disposa és limitat, antic, poc potent i sovint inadequat, cosa que fa que els problemes de resistència als antimicrobians en aquestes zones siguin especialment seriosos.

Antimicrobians: generalitats

Antimicrobians (Joaquim Ruiz, ed.) Treballs de la SCB. Vol. 55 (2004) 11-18

RESISTÈNCIA BACTERIANA. ASPECTES GENERALS Francesc Marco Servei de Microbiologia, Hospital Clínic, IDIBAPS, Facultat de Medicina, Universitat de Barcelona. Adreça per a la correspondència: Francesc Marco. Servei de Microbiologia, Hospital Clínic, IDIBAPS, Facultat de Medicina, Universitat de Barcelona. Villarroel, 170. 08036 Barcelona. Adreça electrònica: fmarco@clinic.ub.es. RESUM La resistència a antimicrobians va aparèixer alhora que els antibiòtics mateixos. Actualment abasta tots els antibacterians coneguts i és un dels principals problemes de salut mundials. Aquest capítol fa una repassada per sobre dels principals mecanismes de resistència. Paraules clau: resistència, antibiòtics, antimicrobians. SUMMARY Resistance to antibiotics was described at the same time that the first antimicrobial agents. It currently affects all known antibacterial agents, being one of the main health problems at worldwide. This chapter is devoted to explain the main mechanisms of antimicrobial resistance. Keywords: resistance, antibiotics, antimicrobial agents. INTRODUCCIÓ Tot i que la situació actual de resistència als antimicrobians que presenten molts bacteris ens podria fer pensar que estem davant d’un fenomen relativament recent, una visió històrica de l’evolució de la microbiologia ens indica que el problema de la resistència bacteriana va aparèixer quasi al mateix temps que es descobria que determinades substàncies podien destruir els microorganismes. De fet, a darrers del segle xix es va constatar que alguns microorganismes podien sobreviure en presència de dosis letals dels «compostos antimicrobi-

ans» que en aquells moments es coneixien. Els estudis inicials realitzats van concebre la resistència microbiana en termes d’adaptació als agents tòxics (Kossiakoff, 1887). Va ser Ehrlich qui va introduir l’any 1907 el concepte d’organismes resistents, en observar com Trypanosoma brucei desenvolupava resistència a la p-roseanilina (Ehrlich, 1907), i poc després, el 1911, Morgenroth i Kaufmann descrivien com el pneumococ adquiria resistència a l’etilhidrocupreïna (Morgenroth i Levy, 1911). Amb el descobriment dels antibiòtics i la seva aplicació en el tractament de les infeccions, l’estudi de la resistència a aquests compostos va

F. MARCO

adquirir major rellevància. Molt aviat es va detectar l’aparició de resistència a antimicrobians completament nous, com la sulfonamida el 1939 (Maclean et al., 1939), la penicill. ina el 1941 (Abraham et al., 1941) o l’estreptomicina el 1946 (Murray et al., 1946). Als anys cinquanta van aparèixer bacteris amb resistència a diversos antibiòtics, i aquesta resistència no es podia explicar simplement per l’existència de mutacions aleatòries; a més a més, els patrons de resistència eren complexos i no encaixaven dintre d’un model mutacional simple. Investigadors japonesos van suggerir que la resistència a diversos antibiòtics es podia transmetre entre els bacteris tant in vivo com in vitro (Akiba et al., 1960). Estudis posteriors van permetre conèixer l’existència d’un mecanisme de transferència de gens, el factor R, un element genètic extracromosòmic que actualment denominem plasmidi (Watanabe et al., 1963). Amb la millor comprensió de la genètica de la resistència als antibiòtics i la classificació dels tipus de resistència es van poder esbrinar les bases bioquímiques d’aquesta resistència. Així, el paper específic de la penicill. ina amb el bloqueig de la síntesi de la paret cell. ular, juntament amb el coneixement de les estructures que envolten els bacteris, pot explicar la sensibilitat dels bacteris grampositius i la resistència dels gramnegatius a aquest antibiòtic. De la mateixa manera, el coneixement del seu procés metabòlic ens va permetre esbrinar que la penicill. ina era freqüentment inactivada per degradació mitjançant uns enzims anomenats β-lactamases. Estudis bioquímics detallats dels diversos mecanismes d’acció dels antibiòtics han contribuït que coneguem les diverses maneres en què els microorganismes han evolucionat per convertir-se en resistents a aquests agents. Als anys setanta, les investigacions en resistència als antibiòtics van obrir-se a nous aspectes no previstos fins llavors. Es va estudiar com entraven els antibiòtics a l’interior dels bacteris i el paper que podien desenvo-

lupar les estructures de la paret cell. ular, les proteïnes de la membrana externa i l’estructura capsular. Mutacions als gens que codificaven les proteïnes de la membrana externa s’associaven amb una sensibilitat alterada a alguns antibiòtics. Aquestes proteïnes, denominades porines i codificades per gens Omp, estan involucrades en el transport de substàncies o compostos que necessita el bacteri, com aminoàcids, però també són utilitzades pels antibiòtics per penetrar al seu interior. Un fet remarcable dels anys vuitanta va ser l’estreta cooperació que es va establir entre el treball de laboratori i l’epidemiologia, gràcies als estudis que intentaven analitzar l’origen de la resistència als antibiòtics i el fenomen de la seva transferència entre microorganismes. Probablement, un dels temes més importants de la bacteriologia als anys noranta ha estat el reconeixement públic de la resistència als antibiòtics i les discussions que això ha generat. Actualment, el nombre d’antibiòtics als quals els bacteris no han desenvolupat resistència és més aviat escàs, però fins i tot en aquests casos, com passa amb la vancomicina, els bacteris han trobat la manera de ferhi front. Així, la resistència als antibiòtics s’ha convertit en un autèntic problema de salut pública en el qual intervenen nombrosos factors, tant en la seva aparició com en el posterior manteniment. Probablement, el més important d’aquests factors és la utilització dels antibiòtics. Només cal pensar en el fet que cada any es fan servir al món centenars de milers de tones d’antibiòtics. Tot i que no es disposa de xifres precises en molts països, aproximadament la meitat d’aquests antibiòtics es fan servir per tractar o prevenir infeccions humanes i l’altra meitat s’utilitza en l’agricultura. A aquest volum cal afegir una quantitat desconeguda d’antibiòtic actiu que arriba al medi ambient alliberat per les plantes de tractament d’aigües residuals. Tot això ha contribuït al fet que bacteris provinents del món animal, de plantes o fins i tot bacteris utilitzats en la generació de productes modificats genèticament

RESISTÈNCIA BACTERIANA. ASPECTES GENERALS

tinguin marcadors de resistència que poden ser adquirits per bacteris que poden infectar els humans (Salyers et al., 2002). TIPUS DE RESISTÈNCIA ALS ANTIBIÒTICS Els bacteris poden expressar bàsicament dos tipus de resistència als antibiòtics: a) Resistència natural o primària. b) Resistència adquirida. En el primer cas, els bacteris presenten una resistència intrínseca a un determinat antibiòtic, ja sigui per impermeabilitat, manca d’un sistema de transport o desactivació de l’antibiòtic. La resistència adquirida es pot produir per mutació d’algun gen propi del bacteri, per adquisició de gens de resistència exògens o per mutacions en gens adquirits. La interacció entre l’antibiòtic i la seva diana sol ser bastant específica; per tant, mutacions puntuals en un gen donen lloc a canvis en una base que pot alterar aquestes interaccions. Són exemples de resistències mutacionals la resistència a fluoroquinolones per mutació en gyrA i la topoisomerasa iv (Martínez et al., 1998), la mutació ribosòmica en la resistència a estreptomicina (Eliopoulos et al., 1984) o mutacions en ropB i resistència a rifampicina (Wehrli et al., 1983). Altres exemples que afecten processos cell. ulars són la disminució de l’expressió de la porina OMPD2 en P. aeruginosa i la resistència a imipenem (Livermore, 1992) o mutacions al gen ampD que regula l’expressió de la β-lactamasa cromosòmica d’Enterobacter sp. que dóna lloc a una sobreexpressió del gen ampC (Jacobs et al., 1997). Mitjançant l’adquisició de determinants genètics de resistència els bacteris recorren als clàssics mecanismes d’intercanvi genètic: transformació, conjugació i transducció. Amb la transformació, el bacteri adquireix el DNA directament del medi ambient, en circumstàncies favorables, a partir d’un altre bacteri que

ha alliberat el seu material genètic. Aquest nou material genètic es recombina amb el cromosoma del bacteri receptor en aquelles regions on hi ha suficient homologia i pot donar lloc a gens funcionals. Un exemple d’aquest tipus de resistència el trobem en Streptococcus pneumoniae i la resistència a penicill. ina i cefalosporines (Hakenbeck et al., 1998). La conjugació plasmídica és probablement el mecanisme més freqüent per intercanviar material genètic amb el qual adquireixen una gran varietat de gens, que un cop a l’interior del bacteri poden transferir-se a altres plasmidis o integrar-se al cromosoma. L’adquisició de material genètic per l’acció d’un bacteriòfag (virus) es coneix com a transducció i permet al bacteri adquirir una quantitat relativament petita de DNA (no més de 40 kb). Altres sistemes per adquirir gens de resistència són els transposons i els integrons. L’exemple més característic d’aparició de resistència als antibiòtics per mutacions en gens adquirits són probablement les β-lactamases d’espectre ampliat. Aquests enzims deriven, en una gran majoria dels casos, dels enzims de tipus TEM que es van començar a detectar poc després d’iniciar-se la comercialització de l’ampicill. ina. Són codificats per gens de localització plasmídica i apareixen en produir-se mutacions puntuals al gen que codifica la β-lactamasa. MECANISMES BIOQUÍMICS DE RESISTÈNCIA ALS ANTIBIÒTICS Els mecanismes bàsics pels quals un bacteri pot expressar resistència a un antibiòtic són: a) Modificació de la diana o molècula sobre la qual actua l’antibiòtic. b) Modificació, alteració o desactivació de l’antibiòtic. c) Disminució de la quantitat d’antibiòtic que pot accedir a la diana. Això pot produirse per una disminució en l’entrada de l’antibiòtic a l’interior del bacteri per problemes de

F. MARCO

permeabilitat, o bé perquè hi ha un augment de l’eliminació de l’antibiòtic des de l’interior del bacteri mitjançant un sistema d’expulsió activa. RESISTÈNCIA PER MODIFICACIÓ DE LA DIANA Antibiòtics β-lactàmics La resistència per modificació de la diana, sobre la qual actuen els antibiòtics β-lactàmics, es produeix per modificació de les proteïnes (PBP, penicillin binding proteins) sobre les quals actuen aquests compostos. Aquesta mena de resistència la trobem fonamentalment en bacteris grampositius i n’hi ha diverses maneres: adquisició d’una proteïna amb baixa afinitat, recombinació d’una PBP sensible amb varietats més resistents, major expressió d’una determinada PBP o mutacions puntuals que disminueixen l’afinitat d’una PBP pels antibiòtics β-lactàmics. Potser l’exemple més clar de resistència als antibiòtics per expressió d’una PBP de baixa afinitat és la resistència a l’oxacill. ina en Staphylococcus aureus. La PBP 2a és una proteïna codificada pel gen mecA de localització cromosòmica (regió mec) que confereix resistència a tots els antibiòtics β-lactàmics i que no trobem en els S. aureus sensibles a l’oxacill. ina. L’origen del gen mecA és desconegut, però s’ha suggerit que podria procedir d’algun estafilococ coagulasanegatiu. L’expressió del gen mecA és complexa, no és del tot coneguda i està controlada per l’activitat de diversos gens inductors (mecI, blaI) i repressors (mecR1, blaR1). A més a més, també està influïda per l’expressió d’altres gens: fem (factors essencials de la resistència a la meticill. ina) i aux (auxiliars). Streptococcus pneumoniae, estreptococs del grup viridans, Neisseria gonorrhoeae o Neisseria meningitidis són microorganismes amb capacitat d’experimentar fenòmens de trans-

formació natural o captació de DNA del medi ambient. Gràcies a aquesta capacitat es pot produir una recombinació dels gens de les seves PBP amb gens responsables de la síntesi de PBP d’altres microorganismes, tot adoptant un patró en mosaic. Les modificacions en diverses proteïnes (PBP 2X, PBP 2B i PBP 1A) són les responsables de resistència a la penicill. ina en S. pneumoniae; en canvi, només es requereixen modificacions a les PBP 2X i PBP 1A perquè aparegui resistència a les cefalosporines (Barcus et al., 1995). Els gens exògens en S. pneumoniae procedeixen d’estreptococs del grup viridans (Amoroso et al., 2001) i en l’expressió de la resistència que confereixen intervenen gens auxiliars ( ﬁbA, ﬁbB). En N. meningitidis i N. gonorrhoeae aquests gens s’han adquirit a partir d’espècies de Neisseria comensals amb major resistència a la penicill. ina (Spratt et al., 1989). La resistència als antibiòtics β-lactàmics per una major expressió d’una determinada PBP és un fet poc freqüent. L’exemple més clar és l’augment del nivell de resistència a la penicillina en Enterococcus faecium per sobreexpressió de PBP5 (Rice et al., 2001). En aquest microorganisme és més habitual l’existència de mutacions puntuals en els gens de les PBP (PBP5) que condicionen una menor afinitat pels β-lactàmics i unes CMI de la penicill. ina superiors als 1000 μg/ml.

Glicopèptids La vancomicina i la teicoplanina actuen sobretot unint-se a la terminació D-Ala-D-Ala del pentapèptid precursor del peptidoglicà. La resistència als glicopèptids es produeix quan se sintetitzen precursors alterats (terminació D-Ala-D-Lac) que no permeten la unió amb la vancomicina, ja que es redueix de manera notable l’afinitat per l’antibiòtic. És una resistència adquirida que trobem fonamentalment en enterococs. Hi ha descrits sis tipus de resistència als glicopèptids: VanA, VanB,

RESISTÈNCIA BACTERIANA. ASPECTES GENERALS

VanC, VanD, VanE i VanG. Les dues primeres són les més importants des d’un punt de vista clínic i la resistència VanC és intrínseca en les espècies E. casselifalvus i E. gallinarum (terminació D-Ala-D-Ser). En la codificació de la resistència VanA i VanB intervenen diversos gens per expressar la resistència (vanH i vanA, vanX o vanH B, vanB i vanX B), amplificar-la (vanY i vanZ o vanY B i vanW) o regular la transcripció dels tres gens essencials (vanS B i vanR B o vanS B i vanR B) (Arthur et al., 1996). El fenotipus de resistència VanA comporta resistència a vancomicina i teicoplanina, i el vanB només a la vancomicina, tot i que, almenys in vitro, la teicoplanina sembla activa, perquè no indueix l’expressió de la resistència, però si s’utilitza in vivo pot expressar-se durant el tractament. Els operons vanA i vanB són codificats per transposons (Tn1546 el vanA i Tn1549 o Tn5382 el vanB) i s’han descrit sobretot en E. faecium i E. faecalis (Arthur et al., 1993; Garnier et al., 2000).

Macròlids i lincosamines Un dels mecanismes de resistència més importants als macròlids i lincosamines és la metilació del ribosoma, que impedeix la unió d’eritromicina i clindamicina. Hi ha diversos gens que codifiquen aquesta resistència (gens erm), la qual pot ser constitutiva (resistència a macròlids, lincosamines i estreptogramines) o induïble (resistència a macròlids de catorze i quinze àtoms, però no a clindamicina i estreptogramines) (Roberts et al., 1999).

Fluoroquinolones El mecanisme de resistència a les fluoroquinolones més important es produeix per mutacions espontànies als gens que codifiquen els enzims topoisomerases (DNA-girasa i topoisomerasa iv). Tots dos enzims estan compostos per dues subunitats, GyrA i GyrB, i ParC

i ParE. Les mutacions en GyrA i ParC són les més freqüents i la combinació de diverses mutacions confereix un nivell de resistència més elevat (Piddock, 1999).

Rifampicina La resistència a la rifampicina es produeix per una mutació puntual en el gen rpoB que condiciona una alteració d’un aminoàcid en l’enzim RNA-polimerasa dependent del DNA (Wehrli, 1983). És una resistència de baix grau que se selecciona fàcilment durant un tractament si la rifampicina no es combina amb altres antibiòtics.

Trimetoprim/sulfametoxazole Trimetoprim i sulfametoxazole són inhibidors de dos enzims, dihidrofolat-reductasa (DHFR) i àcid dihidropteroic-sintasa (DHPS), respectivament, els quals actuen de manera seqüencial en la formació de tetrahidrofolat (THF). La resistència adquirida al trimetoprim més important és l’adquisició de gens dhfr que condicionen la secreció d’un enzim amb baixa afinitat pel fàrmac (Huovinen, 2001). Mutacions puntuals als gens cromosòmics dhps o adquisició de nous gens via transformació o recombinació incorporats en integrons que, al mateix temps, estan integrats en plasmidis, són el mecanisme de resistència habitual al sulfametoxazole (Huovinen, 2001). RESISTÈNCIA PER MODIFICACIÓ ALTERACIÓ O DESACTIVACIÓ DE L’ANTIBIÒTIC Antibiòtics β-lactàmics Les β-lactamases constitueixen un grup heterogeni de proteïnes que hidrolitzen l’anell β-lactàmic i formen un complex sense activi-

F. MARCO

tat antibacteriana. Actualment es classifiquen segons la similitud en la seqüència d’aminoàcids (sistema d’Ambler) o segons la similitud funcional, perfil de substrat i d’inhibició (sistema de Bush-Jacoby-Medeiros) (Livermore, 1995). Les β-lactamases són codificades per gens de localització cromosòmica, plasmídica o en transposons i es poden produir de manera constitutiva o induïble en presència del substrat. En els microorganismes grampositius les β-lactamases es comporten com exoenzims i són secretades a l’entorn del bacteri; en canvi, en els bacteris gramnegatius es troben localitzades a l’espai periplasmàtic. En la família Enterobacteriaceae, les dues β-lactamases més freqüents són la TEM-1 (plasmídica) i la SHV-1 (cromosòmica), i es comporten com penicill. inases amb escassa o null. a activitat per les cefalosporines (Livermore, 1995). En els darrers anys han aparegut un grup de β-lactamases, derivades de les TEM-1 i SHV-1, amb un espectre hidrolític molt superior, que desactiven les cefalosporines de tercera generació i els monobactams. Es coneixen amb el nom de β-lactamases d’espectre ampliat i apareixen com a conseqüència de mutacions seqüencials al gen que codifica l’enzim. Es troben amb més freqüència en E. coli i Klebsiella pneumoniae, els microorganismes on trobem els enzims originals, TEM-1 i SHV-1, respectivament (Livermore, 1995). En altres gèneres com Enterobacter, Citrobacter, Proteus, Providencia o Pseudomonas les β-lactamases habituals són generalment cefalosporinases d’origen cromosòmic. La seva producció pot ser constitutiva o induïble per β-lactàmics amb capacitat per hidrolitzar cefalosporines de tercera generació (Livermore, 1995).

Antibiòtics aminoglicòsids Els enzims modificadors d’aminoglicòsids són enzims específics que actuen sobre els grups amino o hidroxil de la molècula de l’antibiòtic i disminueixen d’aquesta manera

el grau d’unió a la fracció 30S del ribosoma. Es classifiquen en fosfotransferases, adeniltransferases i acetiltransferases, segons la seva capacitat per modificar aquests grups (fosforilació, adenilació o acetilació) (Azucena et al., 2001). La producció d’aquests enzims és la manera més freqüent de resistència als aminoglicòsids i els gens responsables estan localitzats en transposons, plasmidis o bé al cromosoma per inserció d’un transposó.

Cloramfenicol El mecanisme més freqüent de resistència a aquest antibiòtic és la producció d’una acetiltransferasa. És habitual que els gens responsables (cat) estiguin localitzats en plasmidis petits, amb múltiples còpies. L’enzim acetila els dos grups hidroxil de la molècula en una reacció en la qual també participa l’acetilcoenzim A. Els derivats formats no tenen capacitat per unir-se a la subunitat 50S del ribosoma i inhibir la peptidiltransferasa. Hi ha descrits diversos tipus d’acetiltransferasa (cinc tipus en S. aureus i tres en bacteris gramnegatius). RESISTÈNCIA PER DISMINUCIÓ DE LA PERMEABILITAT O PER AUGMENT DE L’EXPULSIÓ Diversos antibiòtics entren a l’espai periplasmàtic del bacteri a través d’unes proteïnes específiques o porines, situades a la membrana externa dels bacteris gramnegatius, generalment OmpC i OmpF. Una disminució o manca de síntesi d’aquestes porines comporta una menor sensibilitat als fàrmacs que els utilitzen. Diversos antibiòtics es poden veure afectats per aquest mecanisme de resistència: tetraciclines, fluoroquinolones o β-lactàmics. La resistència per augment de l’expulsió de l’antibiòtic de l’interior del bacteri amb disminució de la seva concentració és més important. Els sistemes d’expulsió en els bacteris

RESISTÈNCIA BACTERIANA. ASPECTES GENERALS

gramnegatius s’estenen des de la membrana citoplasmàtica fins a la membrana externa; en canvi, en els bacteris grampositius només necessiten travessar la membrana citoplasmàtica. Aquests sistemes actuarien de manera fisiològica en els bacteris eliminant substàncies tòxiques i les mutacions als gens reguladors incrementarien la seva expressió, amb la consegüent expulsió dels antibiòtics. Hi ha descrits diversos sistemes d’expulsió activa que afecten una àmplia varietat d’antibiòtics. Per exemple, NorA en S. aureus, que afecta entre altres compostos les fluoroquinolones (Neyfakh et al., 1993) o MexB, MexD o MexF en P. aeruginosa, que afectaria antibiòtics β-lactàmics, tetraciclines i fluoroquinolones (Li et al., 1994). En S. pneumoniae o S. pyogenes l’expressió del sistema d’expulsió Mef (gens mef E i mef A) condiciona resistència a l’eritromicina (macròlids de catorze i quinze àtoms) però no a la clindamicina, els macròlids de setze àtoms i les estreptogramines (fenotipus M) (Sutcliffe et al., 1996). BIBLIOGRAFIA Abraham, E. P.; Chain, E.; Fletcher, C. M.; Gardner, A. D.; Heatley, N. G.; Jennings, M. A.; Florey, H. W. (1941). «Further observations on penicillin». Lancet, vol. 2, pàg. 177-189. Akiba, T.; Koyama, K.; Ishiki, Y.; Kimura, S.; Fukushima, T. (1960). «On the mechanism of the development of multiple-drug-resistant clones of Shigella». Jap. J. Microbiol., vol. 4, pàg. 219-227. Amoroso, A.; Demares, D.; Mollerach, M.; Gutkind, G.; Coyette, J. (2001). «All detectable high-molecularmass penicillin-binding proteins are modified in a highlevel beta-lactam-resistant clinical isolate of Streptococcus mitis». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 45, pàg. 20752081. Arthur, M.; Molinas, C.; Depardieu, F.; Courvalin, P. (1993). «Characterization of Tn1546, a Tn3-related transposon conferring glycopeptide resistance by synthesis of depsipeptide peptidoglycan precursors in Enterococcus faecium BM4147». J. Bacteriol., vol. 175, pàg. 117-127. Arthur, M.; Reynolds, P.; Courvalin, P. (1996). «Glycopeptide resistance in enterococci». Trends Microbiol., vol. 4, pàg. 401-407. Azucena, E.; Mobashery, S. (2001). «Aminoglycoside-

modifying enzymes: mechanisms of catalytic processes and inhibition». Drug Resist. Update, vol. 4, pàg. 106-117. Barcus, V. A.; Ghanekar, K.; Yeo, M.; Coffey, T. J.; Dowson, C. G. (1995). «Genetics of high level penicillin resistance in clinical isolates of Streptococcus pneumoniae». FEMS Microbiol. Lett., vol. 126, pàg. 299-303. Chambers, H. F. (1997). «Methicillin resistance in staphylococci: molecular and biochemical basis and clinical implications». Clin. Microbiol. Rev., vol. 10, pàg. 781-791. Ehrlich, P. (1907). «Chemotherapie trypanosomen-studien». Berl. Klin. Wochenschr., vol. 44, pàg. 233-238. Eliopoulos, G. M.; Farber, B. F.; Murray, B. E.; Wennersten, C.; Moellering Jr., R. (1984). «Ribosomal resitance of clinical enterococcal isolates to streptomycin». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 25, pàg. 398-399. Garnier, F.; Taourit, S.; Glaser, P.; Courvalin, P.; Galimand, M. (2000). «Characterization of transposon Tn1549, conferring VanB-type resistance in Enterococcus sp.» Microbiology, vol. 146, pàg. 1481-1489. Hakenbeck, C. J.; Coyette, J. (1998). «Resistant penicillinbinding proteins». Cell. Mol. Life Sci., vol. 54, pàg. 332340. Houvinen, P. (2001). «Resistance to trimetoprim-sulfametoxazole». Clin. Infect. Dis., vol. 32, pàg. 1608-1614. Jacobs, C.; Frer, J. M.; Normarl, S. (1997). «Cytosolic intermediates for cell wall biosynthesis and degradation control inducible β-lactam resistance in gram-negative bacteria». Cell, vol. 88, pàg. 823-832. Kossiakoff, M. G. (1887). «De la propiété que possédent les microbes de s’accomoder aux les milieux antiseotiques». Ann. Inst. Pasteur, vol. 1, pàg. 465-476. Li, X. Z.; Ma, D.; Livermore, D. M.; Nikaido, H. (1994). «Role of efflux pump(s) in intrinsic resistance of Pseudomonas aeruginosa: active efflux as a contributing factor to β-lactam resistance». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 38, pàg. 1742-1752. Livermore, D. M. (1992). «Interplay of impermeability and chromosomal β-lactamase activity in imipenem-resistant Pseudomonas aeruginosa». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 36, pàg. 2046-2048. — (1995). «β-lactamases in laboratory and clinical resistance». Clin. Microbiol. Rev., vol. 8, pàg. 557-584. Maclean, I. H.; Rogers, K. B.; Fleming, A. M. (1939). «693 and pneumococci». Lancet, vol. 1, pàg. 562-568. Martínez, J. L.; Alonso, A.; Gómez-Gómez, J. M.; Baquero, F. (1998). «Quinolone resistance by mutations in chromosomal gyrase genes. Just the tip of the iceberg?» J. Antimicrob. Chemother., vol. 42, pàg. 683-688. Morgenroth, J.; Levy, R. (1911). «Chemotherapie der pneumokokkeninfektion». Berl. Klin. Wochenschr., vol. 48, pàg. 1560. Murray, R.; Kilham, L.; Wilcox, C.; Finland, M. (1946). «Development of streptomycin resistance of Gram-negative bacilli in vitro and during treatment». Pro. Soc. Exp. Biol. Med., vol. 63, pàg. 470-474. Neyfakh, A. A.; Borsch, C. M.; Kaatz, G. W. (1993).

F. MARCO

«Fluoroquinolone resistance protein NorA of Staphylococcus aureus is a multidrug efflux transporter». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 37, pàg. 128-129. Piddock, L. J. (1999). «Mechanisms of fluoroquinolone resistance: an update 1994-1998». Drugs, vol. 58 (supl. 2), pàg. 11-18. Rice, L. B.; Carias, L. L.; Hutton-Thomas, R.; Sifaoui, F.; Gutmann, L.; Rudin, S. D. (2001). «Penicillin-binding protein 5 and expression of ampicillin resistance in Enterococcus faecium». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 45, pàg. 1480-1486. Roberts, M. C.; Sutcliffe, J.; Courvalin, P.; Jensen, L. B.; Rood, J.; Seppala, H. (1999). «Nomenclature for macrolide and macrolide-lincosamide-streptogramin B resistance determinants». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 43, pàg. 2823-2830. Salyers, A. A.; Shoemaker, N. B.; Bonheyo, G. T. (2002). «The ecology of antibiotic resistance genes». A: Lewis, K.; Salyers, A. A.; Taber, H. W.; Wax, R. G. [ed.] Bacterial resistance to antimicrobials. Nova York: Marcel Dekker, pàg. 1-17.

Shaw, W. V. (1983). «Chloramphenicol acetyltransferase: enzymology and molecular biology». Crit. Rev. Biochem., vol. 14, pàg. 1-46. Spratt, B. G.; Zhang, Q. Y.; Jones, D. M.; Hutchinson, A.; Brannigan, J. A.; Dowson, C. G. (1989). «Recruitment of a penicillin-binding protein gene from Neisseria ﬂavescens during the emergence of penicillin resistance in Neisseria meningitidis». Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 86, pàg. 8988-8992. Sutcliffe, J.; Tait-Kamradt, A.; Wondrack, L. (1996). «Streptococcus pneumoniae and Streptococcus pyogenes resistant to macrolides but sensitive to clindamycin: a common resistance pattern mediated by an efflux system». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 40, pàg. 1817-1824. Watanabe, T. (1963). «Infective heredity of multiple drug resistance in bacteria». Bact. Rev., vol. 27, pàg. 87-115. Wehrli, W. (1983). «Rifampin: mechanisms of action and resistance». Rev. Infect. Dis., vol. 5 (supl. 3), pàg. S407S411.

Antimicrobians (Joaquim Ruiz, ed.) Treballs de la SCB. Vol. 55 (2004) 19-28

UTILITZACIÓ DELS ANTIMICROBIANS EN VETERINÀRIA I L’ÚS PRUDENT DELS ANTIBIÒTICS Ignacio Badiola, 1 Ana Pérez, 1 Montserrat Llagostera 2 i Montserrat Saco 3 1 Departament de Microbiologia, Centre de Recerca en Sanitat Animal, Universitat Autònoma

de Barcelona. 2 Departament de Microbiologia i Biologia Molecular, Universitat Autònoma de Barcelona. 3 Laboratori de Sanitat Ramadera de Barcelona.

Adreça per a la correspondència: Ignacio Badiola. Departament de Microbiologia, Centre de Recerca en Sanitat Animal, Universitat Autònoma de Barcelona. 08193 Bellaterra. Adreça electrònica: ignacio.badiola@irta.es. RESUM La utilització dels antimicrobians en producció animal ha suposat un gran avanç en la reducció dels problemes infecciosos dels animals que es fan servir com a font fonamental de proteïna d’origen animal. Aquesta reducció dels problemes infecciosos comporta a més una reducció del risc de transmissió d’infeccions als consumidors i, per tant, un augment en la seguretat de la cadena alimentària. L’ús dels antimicrobians porta implícita l’aparició de resistències. Per tal de minimitzar el risc d’aparició de resistències i controlar-ne la disseminació, cada vegada és més important implementar unes pautes de comportament que incloguin un ús prudent dels antimicrobians. Paraules clau: sanitat animal, antibiòtics, ús prudent. SUMMARY Antimicrobial use in animal production has lead to a great reduction of infectious diseases in animals used as protein source. Additionally to the reduction of infectious disorders, a reduction of transmission risks of infectious agents to consumers is also achieved and, also, an increase in food chain safety. Antimicrobial use is always related to resistance generation. In order to minimise the appearance risk of these resistances and to control their spread, it is very important to implement guidelines to force a prudent use of antimicrobials. Keywords: animal health, antibiotics, prudent use.

I. BADIOLA, A. PÉREZ, M. LLAGOSTERA I M. SACO

INTRODUCCIÓ Amb el descobriment i posterior desenvolupament dels antimicrobians, des de les primeres aplicacions de les sulfamides fins a la síntesi de les fluoroquinolones d’espectre ampliat, la sanitat animal i humana ha experimentat una veritable millora, fins al punt d’haver-se arribat a pensar que les malalties infeccioses podien considerar-se un tema del passat. Però la capacitat d’adaptació dels microorganismes a les noves condicions ha fet que en els darrers anys, i més pel lent desenvolupament de molècules realment noves, s’estigui considerant la necessitat d’un canvi d’actitud envers l’ús dels antimicrobians en el que es coneix com a ús prudent dels antibiòtics. En aquest escrit es pretén fer una petita revisió de la utilització dels antimicrobians en medicina veterinària, fent especial esment en la idiosincràsia de la quimioteràpia en producció animal, per acabar enumerant i desenvolupant alguns aspectes sobre l’ús prudent dels antibiòtics, filosofia de comportament que mira d’ésser força universal, sense la qual l’era preantibiòtica pot estar no molt llunyana. Abans de continuar vull aclarir al lector, que potser ja s’ha fet la pregunta en el decurs dels dos paràgrafs precedents, que en aquest escrit faré servir indistintament, a pesar d’ésser conscient que no són totalment equivalents, les paraules antibiòtic, quimioteràpic, antimicrobià i antibacterià. La utilització dels antibiòtics en medicina veterinària es va iniciar, pràcticament al mateix temps que en medicina humana, en la dècada dels cinquanta del segle xx. Encara que, prèviament, i especialment per via tòpica, les sulfamides es van fer servir des del seu descobriment en la dècada dels trenta. PAUTES TERAPÈUTIQUES EN MEDICINA VETERINÀRIA En medicina veterinària, i per les pautes

utilitzades clarament diferents, es poden distingir un ús dels antibiòtics en animals de companyia i un ús dels antibiòtics en animals de producció. Aquesta utilització diferent té, o pot tenir, una importància primordial en el possible nivell de risc de generació de resistències microbianes. En els animals de companyia —gossos, gats, cavalls...— la utilització dels diferents principis actius contra infeccions sistèmiques generalment es fa per via parenteral, en dosis ajustades al pes dels animals —en mg/kg p. v./dia— i freqüentment amb un únic antibiòtic d’un espectre més o menys ampli. Amb aquestes pautes terapèutiques, tret d’una excreció digestiva del principi actiu, els únics microorganismes que entrarien en contacte amb l’antimicrobià serien els que produeixen la malaltia, amb la qual cosa el risc de generació de soques resistents queda limitada als bacteris diana. Tan sols en el cas d’infeccions digestives, l’aplicació per via oral del principi actiu pot fer que el risc de generació de soques resistents s’ampliï a soques diferents de les diana. Així doncs, en el cas de la quimioteràpia dels animals de companyia, es tractaria d’una intervenció individual sobre l’animal malalt, generalment sota prescripció veterinària i amb ajustament de la dosi. Contràriament als animals de companyia, en els animals de producció —porcs, vedells, ovelles, pollastres o conills, entre d’altres— l’aplicació dels diferents principis actius es fa generalment per via oral, al pinso o a l’aigua de beguda, sobre tots els animals que es troben en una mateixa nau i procurant corregir la dosi a mg/kg p. v./dia. No obstant això, i a diferència de l’aplicació individual dels animals de companyia, en un moment determinat es mediquen animals sans, animals amb pròdroms, animals que presenten els primers signes de malaltia i animals amb signes clars de la malaltia, amb marcades diferències en el consum de pinso i aigua i, parall. elament, amb significatives diferències en la quantitat de principi actiu ingerit —els animals malalts ge-

UTILITZACIÓ DELS ANTIMICROBIANS EN VETERINÀRIA I L’ÚS PRUDENT DELS ANTIBIÒTICS

neralment disminueixen dràsticament el consum de pinso i, en menor quantitat, el consum d’aigua. Aquestes diferències en el consum de pinso o de l’aigua de beguda fan que, mentre uns animals s’estan submedicant, d’altres estan rebent una sobremedicació. Un canvi en aquest tipus de pauta terapèutica és del tot irreal, més quan parlem de cents o de milers d’animals que s’han de medicar amb l’aparició dels primers signes de malaltia, ja que, en cas de no fer-se així, els nivells de morbiditat o de mortalitat poden arribar a ésser netament improductius, en un dels mons amb més competitivitat i amb menys marge comercial. És per això que cada vegada tindrà més importància un ús adient, un ús prudent, dels diferents principis actius amb capacitat antimicrobiana per a maximitzar l’eficàcia dels antimicrobians, retardar la seva manca d’utilitat i minimitzar el risc de generació o selecció de soques resistents. Si l’ús dels antimicrobians en medicina dels animals de companyia té un cert parall. elisme amb l’ús dels antimicrobians en medicina humana, l’ús en animals de producció és clarament diferent. A més, i fins als últims anys, un altre fet diferencial distingia la medicina veterinària dels animals de producció de la medicina humana. Aquest fet diferencial era la utilització d’antimicrobians, a baixes dosis, com a promotors del creixement. L’ús d’antibiòtics com a promotors del creixement, és a dir, amb la capacitat de produir un augment de pes més gran amb un menor consum de pinso, va iniciar-se després de l’observació d’un efecte positiu en l’índex de creixement de porcs alimentats amb subproductes de la fermentació resultants de la producció de les tetraciclines. Aquesta utilització dels antibiòtics s’ha perllongat fins avui o, per ésser més exactes, fins a l’any 2006, any en el qual la prohibició d’antibiòtics com a promotors del creixement arribarà al màxim. No obstant això, i a causa de dos temes que estan força relacionats, l’augment continuat de la població mundial, amb l’augment continuat

dels residus animals generats pels animals necessaris per a l’alimentació d’aquesta població mundial, és possible que en el futur torni a replantejar-se l’ús d’alguns antimicrobians com a promotors del creixement. Això sí, l’elecció dels possibles antibiòtics s’haurà de fer d’una manera molt acurada i sempre dintre de l’espectre d’antimicrobians que no tinguin mecanismes de resistència creuats amb productes de primera o de segona elecció de l’arsenal terapèutic humà o animal. PRINCIPALS PRINCIPIS ACTIUS UTILITZATS EN PRODUCCIÓ ANIMAL Com pot observar-se a la figura 1, treta d’una de les publicacions de Veterindustria —l’Associació Empresarial Espanyola de la Indústria de la Sanitat i la Nutrició Animal—, el subsector de la producció animal que té un nivell de despesa més alt i, parall. elament, un major consum de productes farmacèutics, antibiòtics inclosos, és el dels porcs, seguit dels bovins, les aus i els animals de companyia. La resta d’espècies animals estan considerades per la indústria veterinària com a espècies menors, amb el problema afegit del registre de productes per a aquestes espècies animals. En la mateixa publicació de Veterindustria, el consum més alt de productes veterinaris animals es dóna a Catalunya, amb un 23,31 % del total de productes consumits a Espanya, seguida de Castella i Lleó, amb un consum del 13,34 % del total de productes. Creuant aquestes dades resulta que el sector porcí de Catalunya, un dels sectors agraris més importants del nostre país, concentra significativament l’ús dels productes farmacèutics, antibiòtics inclosos, produïts per la indústria veterinària ubicada a Espanya. Benbrook (2001) presenta els resultats del consum d’antimicrobians en medicina veterinària tenint en compte la importància dels

I. BADIOLA, A. PÉREZ, M. LLAGOSTERA I M. SACO

!"# $ #%%!&& $ #!% $ &'! ' $ '"!'( $ %! % $ &!#& $ (! ) $ * + ")!(( $ )!% $ # ! $ # !)' $ '!&% $ #!% $ #!## $ -! % $ "&!' $ !)' $ #"! $ ##!' $ & $ #!(' $ #!# $ #! ) $

, ! -- , ! --#

Figura 1. Despesa anual en medicaments per als principals grups d’animals, adaptat de Veterindustria.

productes en el tractament de les malalties humanes. Segons aquesta classificació, els principis actius de la categoria i —principis actius utilitzats en medicina humana, sense o amb poques alternatives, com l’eritromicina o la virginiamicina— representen el 2,44 % dels antimicrobians utilitzats en medicina veterinària. Els principis actius de la categoria ii —principis actius utilitzats en medicina humana, amb suficients alternatives terapèutiques, com la penicill. ina o la tetraciclina— representen el 52,61 % dels antimicrobians utilitzats en medicina veterinària. Mentre que els principis actius de la categoria iii —principis actius no utilitzats en medicina humana, com la monensina o la salinomicina— representen el 44,95 % dels antimicrobians utilitzats en medicina veterinària. En referència als principis actius utilitzats en medicina veterinària, i després de provar diferents possibles ordenacions, he optat per tenir en compte la relació, estreta o llunyana, amb principis actius utilitzats per la medicina

humana, i les infeccions que es pretenen controlar. A la taula 1 es poden trobar resumits alguns dels antimicrobians utilitzats en medicina veterinària, juntament amb el mecanisme d’acció i l’espectre d’activitat. Per al control de malalties respiratòries —freqüentment produïdes per micoplasmes i per bacteris gramnegatius— s’utilitzen antimicrobians fàcilment absorbibles després de la seva administració oral. Amoxicill. ina, tetraciclina, doxiciclina, tilosina, tilmicosina, lincomicina, generalment associada a espectinomicina, i enrofloxacina són els principis actius que més es fan servir per al tractament de problemes respiratoris. En general, aquest tipus de tractaments es fan servir en animals molt joves, quan fan el canvi de les unitats de maternitat a les unitats d’engreix, moment en el qual acostumen a posar-se en contacte animals de diferents orígens. Aquests tractaments acostumen a prolongar-se durant una o dues setmanes, amb la qual cosa la probabilitat de la presència de possibles residus

UTILITZACIÓ DELS ANTIMICROBIANS EN VETERINÀRIA I L’ÚS PRUDENT DELS ANTIBIÒTICS

Taula 1.

Antimicrobians utilitzats en medicina veterinària, mecanisme d’acció i espectre d’activitat

Grup

Antimicrobià

Penicill. ines

Penicill. ina G

Inhibició síntesi de paret

Bacteris G+

Ampicill. ina

Inhibició síntesi de paret

Bacteris G+ i G–

Cefalosporines

Ceftiofur

Inhibidors β-lactamasa Àcid clavulànic Aminoglucòsids

Mecanisme d’acció

Espectre

Inhibició síntesi de paret

Bacteris G+ i enterobacteris

Inhibició β-lactamasa

Bacteris productors de β-lactamasa

Estreptomicina

Inhibició síntesi proteica

Bacteris G–

Kanamicina

Inhibició síntesi proteica

Bacteris G–

Neomicina

Inhibició síntesi proteica

Bacteris G–

Gentamicina

Inhibició síntesi proteica

Bacteris G–

Aminociclitols

Espectinomicina Inhibició síntesi proteica

Bacteris G– i Mycoplasma sp.

Lincosamines

Lincomicina

Bacteris G+ anaerobis i Mycoplasma sp.

Inhibició síntesi proteica

Rifamicines

Rifampicina

Inhibició RNA-polimerasa

Bacteris G+, micobacteris

Pèptids cíclics

Colistina

Alteració de la membrana

Bacteris G–

Bacitracina

Alteració de la paret

Bacteris G+

Glicopèptids

Vancomicina

Inhibició síntesi de paret

Bacteris G+ aerobis

Avoparcina

Inhibició síntesi de paret

Bacteris G+ aerobis

Estreptogramines

Virginiamicina

Inhibició síntesi proteica

Bacteris G+

Macròlids

Eritromicina

Inhibició síntesi proteica

Bacteris G+ i G–

Tilosina

Inhibició síntesi proteica

Bacteris G+ i G–

Espiramicina

Inhibició síntesi proteica

Bacteris G+ i G–

Tilmicosina

Inhibició síntesi proteica

Bacteris G+ i G–

Anfenicoles

Florfenicol

Inhibició síntesi proteica

Bacteris G+ i G–, Rickettsia sp. i Chlamydia sp.

Tetraciclines

Oxitetraciclina

Inhibició síntesi proteica

Bacteris G+ i G–, Rickettsia sp. i Chlamydia sp.

Doxiciclina

Inhibició síntesi proteica

Bacteris G+ i G–, Rickettsia sp. i Chlamydia sp.

Sulfamides

Sulfanilamida

Inhibició síntesi d’àcid fòlic

Bacteris G+, G– i Eimeria sp.

Sulfadiazina

Inhibició síntesi d’àcid fòlic

Bacteris G+, G– i Eimeria sp.

Sulfatiazole

Inhibició síntesi d’àcid fòlic

Bacteris G+, G– i Eimeria sp.

Diaminopirimidines

Trimetoprim

Inhibició síntesi d’àcid folínic Bacteris G+ i G– aerobis

Fluoroquinolones

Enrofloxacina

Inhibició DNA-girasa

Bacteris G+ i G–

Ionòfors

Monensina

Alteració de la membrana

Eimeria sp.

Salinomicina

Alteració de la membrana

Eimeria sp.

Nitroimidazoles

Metronidazole

No establert amb claredat

Anaerobis, protozous

Dimetridazole

No establert amb claredat

Anaerobis, protozous

d’antibiòtics a la carn dels animals, una vegada arriben al consumidor, s’ha de considerar de pràcticament zero. Només en el cas d’animals de creixement ràpid, com podrien ésser els pollastres, en casos puntuals de complicacions respiratòries en la segona meitat del període d’engreix, podria fer-se necessari l’ús d’alguns dels antimicrobians molt a prop del moment de la sortida dels animals cap a l’escorxador. No obstant això, els períodes de retirada obligatoris, imposats per les agències

encarregades del registre de nous productes, es pot dir que sempre s’acompleixen amb escrupolositat. Per al control de les malalties digestives —sovint produïdes per diferents serovars d’Escherichia coli, per soques de Clostridium perfringens productores de diferents tipus de toxines, alguns serovars de Salmonella, o d’altres bacteris anaerobis estrictes de tipus espirill. ar— és freqüent que s’utilitzin antibiòtics que tenen una reduïda absorció per via diges-

I. BADIOLA, A. PÉREZ, M. LLAGOSTERA I M. SACO

tiva, com gentamicina, colistina, bacitracina o apramicina, encara que també és freqüent la utilització de tetraciclina, doxiciclina o enrofloxacina. Com hem comentat amb anterioritat, i encara que no s’han utilitzat per al tractament de cap malaltia infecciosa específica, en producció animal s’han fet servir alguns antimicrobians com a promotors del creixement. Molts dels productes utilitzats han estat antibiòtics, a dosis subterapèutiques, molt actius contra bacteris grampositius. Una part de l’efecte dels promotors del creixement ocorre pel control dels Clostridium perfringens, tal i com pot deduir-se de l’increment dels casos de clostridiosi amb la prohibició de la utilització dels promotors en producció animal. Alguns dels antibiòtics que s’han fet servir com a promotors del creixement han estat la penicill. ina, les tetraciclines, la bacitracina, l’avoparcina, la virginiamicina i alguns derivats de les quinolones. A causa de la previsible relació entre la utilització d’alguns antibiòtics com a promotors del creixement i l’aparició de soques de bacteris intestinals resistents a antibiòtics relacionats, com vancomicina, quinupristina-dalfopristina o norfloxacina, 2006 és la data límit per a la desaparició de la major part dels antimicrobians que s’han utilitzat com a promotors del creixement. Durant els últims anys, alguns dels antibiòtics que s’han fet servir com a promotors han estat reconvertits a terapèutics, a dosis més elevades i durant períodes de tractament més curts. Això ha succeït amb les tetraciclines o la bacitracina. Especial atenció en medicina veterinària ha tingut el control d’alguns paràsits intestinals, especialment Eimeria sp. Aquest tipus d’agents infecciosos són controlats mitjançant la inclusió al pinso dels productes coneguts genèricament com a coccidiostàtics, uns productes amb una potent activitat inhibidora del creixement d’Eimeria sp. Aquests coccidiostàtics s’inclouen durant tot el període d’engreix, amb l’excepció de l’última setmana abans del

trasllat dels animals a l’escorxador per tal d’evitar la presència de residus del coccidiostàtic a la carn a consumir. Dintre d’aquest tipus d’antimicrobians destaquen les sulfonamides, la monensina, la salinomicina, l’avilamicina o la nicarbacina. Alguns d’aquests antiparasitaris tenen també un efecte antibacterià, i redueixen, en alguns casos, el recompte de viables de Lactobacillus sp. RISCOS I BENEFICIS DE LA UTILITZACIÓ DELS ANTIMICROBIANS EN ANIMALS DE PRODUCCIÓ La utilització dels antimicrobians en producció animal comporta una sèrie de perills per al consumidor, perills que poden derivarse de la presència de quantitats més o menys grans de principis actius o de la selecció de soques bacterianes, algunes amb potencial zoonòtic, que poden transportar mecanismes de resistència antibacteriana. Sabedors d’aquests perills, des de fa temps els organismes encarregats de les regulacions per al registre, la producció i l’eficàcia dels principis actius han estat minimitzant el nivell de risc i han introduït els estudis necessaris per a l’avaluació dels riscos. En referència a la possible presència de restes de medicaments a la carn que arriba al consumidor, per a tots els productes veterinaris destinats a animals de producció s’ha de fixar l’anomenat límit màxim de residus (LMR). Aquest LMR és definit per la quantitat màxima de principi actiu que pot trobar-se als diferents òrgans i teixits animals. La cinètica d’eliminació de l’antimicrobià, una vegada s’ha suspès la medicació, juntament amb els valors de LMR per a cada òrgan, permeten determinar el que es coneix com a període de retirada, que fixa el temps mínim que es necessita que passi entre el final d’una medicació i la tramesa dels animals cap a l’escorxador.

UTILITZACIÓ DELS ANTIMICROBIANS EN VETERINÀRIA I L’ÚS PRUDENT DELS ANTIBIÒTICS

En determinades circumstàncies especials, i sempre sota la responsabilitat del veterinari de la granja, pot establir-se una medicació amb un producte no registrat per a una determinada espècie animal, o no registrat per a la via o la dosi aplicada. En aquests supòsits, el període de retirada queda establert en vinti-vuit dies, període més que suficient per a trobar quantitats insignificants de residus antibiòtics als teixits animals. Els estudis, l’estadística i els càlculs necessaris per a la fixació del període de retirada estan regulats per la Guia EMEA/CVMP/036/95 01 (CVMP, 1995) de l’Agència Europea del Medicament (EMEA). En l’avaluació dels LMR es té present el nivell de dosi sense efecte (NOEL) i el consum diari admissible (ADI), quantitat diària de productes derivats d’animals que no produeixen cap efecte negatiu en el consumidor. Entre els diferents ADI que són possibles d’utilitzar per al càlcul dels LMR, el valor més petit, és a dir, el que dóna un marge de seguretat més gran, acostuma a ésser l’ADI microbiològic. Aquest ADI microbiològic, per al càlcul del qual l’EMEA ha editat les guies EMEA/ CVMP/234/01 (CVMP, 2001a) i EMEA/CVMP/ 235/0101 (CVMP, 2001b), es basa en el grau de sensibilitat al principi actiu que s’estigui analitzant d’un mínim de deu soques de cadascuna de les espècies bacterianes més importants de la microbiota intestinal dels humans: Fusobacterium sp., Escherichia coli, Proteus sp., Salmonella enterica, Biﬁdobacterium sp., Eubacterium sp., Clostridium sp., Peptostreptococcus sp., Lactobacillus acidophilus, Enterococcus sp., Streptococcus sp. i Bacteroides fragilis. La fórmula utilitzada per al càlcul dels ADI microbiològics és: ADI =

MIC50 (CL 10 % de la MG) × CF2 × PBFD CF1 × FDD × PHM

On: CL 10 % de la MG (mitjana geomètrica): Límit

inferior al 10 % de la mitjana geomètrica dels bacteris intestinals sensibles al principi actiu. CF 1: Factor de correcció que pren el valor de 5 quan la resistència al principi actiu està codificada per plasmidis o per estructures mobilitzables, el valor d’1 quan els mecanismes de resistència són cromosòmics, o el valor de 3 quan els mecanismes de resistència no estan plenament identificats. CF 2: En general aquest factor és 1, però pot ésser superior quan es disposi de dades que permetin valorar el grau de desactivació oral del producte, durant el seu pas per l’estómac o per trams més distals del sistema digestiu, o el grau de segrest del principi actiu per unió a proteïnes o a alguns cations digestius. FDD (fracció disponible de la dosi) (al tracte digestiu): 1 – biodisponibilitat sistèmica. PBFD (pes del bol fecal diari): Estimat en 220 g d’acord amb les guies EMEA/CVMP. PHM (pes humà mitjà): Establert en 60 kg. L’exposició detallada del càlcul de l’ADI microbiològic l’hem considerada interessant per dues raons fonamentals: d’una banda, aquest valor no està previst en el registre de productes per a medicina humana, és a dir, és específic per al registre de productes veterinaris i, d’altra banda, és un exponent de la cura que es posa, per part dels organismes reguladors, per minimitzar el risc d’efectes negatius sobre els bacteris humans digestius dels antimicrobians que es fan servir en animals de producció. El segon bloc de riscos derivats de la utilització d’antibiòtics en medicina veterinària està constituït per la inducció, selecció i manteniment de soques de bacteris amb mecanismes de resistència, especialment amb mecanismes de resistència relacionats amb principis actius utilitzats en medicina humana. És de sobres conegut que la utilització d’antibiòtics implica, pràcticament en tots els casos coneguts, l’aparició de soques resistents al principi actiu. La velocitat d’aparició de soques resistents, depenent del principi actiu, pot ésser més o menys ràpida i els mecanismes

I. BADIOLA, A. PÉREZ, M. LLAGOSTERA I M. SACO

genètics implicats poden ésser alteracions en el grau de permeabilitat de les estructures superficials bacterianes, canvis en el lloc d’acció de l’antibiòtic, inducció de la síntesi d’enzims modificadors de la molècula d’antimicrobià o bombeig actiu de l’antibiòtic cap a l’exterior del protoplasma bacterià. Els mecanismes de resistència poden estar associats al DNA bacterià, en elements no mobilitzables o mobilitzables, o en plasmidis. Com s’ha pogut veure amb anterioritat, en el càlcul de l’ADI microbiològic es té en compte el risc de transmissió dels mecanismes de resistència segons estiguin o no associats a elements genètics mobilitzables. Un dels resultats més adversos de l’ús d’antimicrobians ha estat la selecció de soques multiresistents, i especialment soques d’Escherichia coli O157:H7 (Byrne et al., 2003) o soques de Salmonella enterica ser. Typhimurium fagotip DT 104 (Wall et al., 1994). Recentment el nostre grup va participar en la discussió i redacció d’una nova guia de l’EMEA dirigida a avaluar el risc d’aparició de resistències antibiòtiques, com a pas previ a l’aprovació de nous principis actius per a la producció animal. Segons aquesta guia (CVMP, 2001c) es proposen fer estudis sobre animals medicats, en els quals s’ha d’analitzar el grau de sensibilitat de diferents soques de bacteris intestinals (Escherichia coli, Enterococcus sp., Campylobacter sp. i Salmonella enterica, com a bacteris amb potencial zoonòtic, juntament amb els bacteris diana) abans de l’inici del tractament, en finalitzar el període de tractament, en finalitzar el període de retirada i a l’arribada dels animals al pes de comercialització. Amb aquesta guia es pretén que en el futur no solament es tingui present en la fixació d’una pauta terapèutica l’eficàcia del tractament, sinó que es triï també la pauta amb menors nivells de risc d’aparició de resistències. En referència als beneficis de la utilització d’antibiòtics en producció animal, el descobriment i l’ús dels diferents principis actius

en medicina veterinària ha produït, com ha succeït en patologia humana i en patologia vegetal, una reducció en la incidència de malalties infeccioses i un augment en la capacitat de producció de les granges, que ha permès abaratir i posar a l’abast de tothom proteïna animal de bona qualitat. Els beneficis que l’ús d’antimicrobians en medicina veterinària han produït poden resumir-se en els següents punts: a) Reducció de les taxes de morbiditat i de mortalitat, efecte que repercuteix en: 1. Homogeneïtzació dels lots d’animals. 2. Reducció del nombre d’animals petits i del temps de permanència en l’explotació. 3. Fa possible el buit sanitari de la nau entre cicle i cicle de producció. 4. Disminució dels residus generats per la granja. b) Augment del grau de benestar animal. c) Millora de la seguretat alimentaria, per: 1. Reducció de la càrrega microbiana de la canal. 2. Reducció de bacteris zoonòtics. Vigilant la correcta utilització del productes farmacèutics en el sector de la producció animal hi ha un departament del Ministeri de l’Interior, el SEPRONA (Servei de Protecció de la Natura). Aquest departament està encarregat del control, a les fàbriques de pinso i granges, d’un ús correcte dels antibiòtics i d’altres additius animals. Com a exemple dels seus controls, durant l’any 2002, de les 173.087 intervencions dels agents del SEPRONA, 30.112 (17,40 %) van correspondre a vulneracions de les lleis de sanitat. D’aquestes intervencions, 22.545 (74,87 %) corresponien a sanitat animal, 2.730 (9,07 %) a sanitat vegetal i 4.837 (16,06 %) a qualitat alimentària, la qual cosa pot ésser una indicació de l’estret marcatge que el SEPRONA fa sobre la producció animal. A pesar dels controls públics, tant per part de les agències espanyola i europea del medicament, com per part del Ministeri de l’In-

UTILITZACIÓ DELS ANTIMICROBIANS EN VETERINÀRIA I L’ÚS PRUDENT DELS ANTIBIÒTICS

terior i de les comunitats autònomes, durant els últims anys s’ha cregut interessant fer campanyes d’educació dels diferents estaments implicats en la producció animal. Aquestes campanyes estan englobades en una nova filosofia de comportament coneguda com a ús prudent dels antimicrobians. ÚS PRUDENT DELS ANTIMICROBIANS De les discussions que van tenir lloc en les reunions preparatòries de Brussell. es i París, i durant la Conferència Científica Europea sobre l’ús dels antibiòtics en animals (OIE, 1999) va acordar-se que el terme prudent, o responsable, ha d’ésser el principi que ha de regular la utilització dels antimicrobians en el futur. Aquest principi ha de tenir com a punt de partida que tota prescripció d’antibiòtics ha de fer-se sota la supervisió d’un professional, que tingui els coneixements necessaris i un criteri sòlid, que serà el responsable final de la correcta utilització del producte. En aquesta conferència va quedar clar que la responsabilitat ha d’ésser definida amb l’elaboració de guies i que el seguiment del seu acompliment ha d’estar obert a auditories externes i independents. En l’elaboració de guies sobre l’ús prudent d’antimicrobians es necessita que es tingui en compte que: a) Els sistemes de producció animal inclouen grups nombrosos d’animals, generalment de la mateixa edat i status immunitari, que comparteixen un espai aeri i que fàcilment es posen en contacte amb les excretes d’altres animals. b) És important comptar amb bones install. acions i amb un bon maneig per a poder implementar bones estratègies terapèutiques que permetin controlar malalties infeccioses. c) L’ús prudent no ha d’ésser tan restrictiu que comprometi el benestar animal. d) La utilització d’antimicrobians ha d’aportar beneficis clars i, per això, ha de basar-

se en una diagnosi el més exacta possible. És indispensable que el veterinari tingui un perfecte coneixement del perfil sanitari dels animals a tractar, i és interessant que pugui ferse una identificació de l’agent causal i del seu grau de sensibilitat in vitro. També és important que es puguin tenir coneixements sobre el perfil sanitari de l’àrea geogràfica on es troba localitzada la granja. e) Per minimitzar el risc de disseminació de possibles resistències han d’adoptar-se les mesures higienicosanitàries adients. En el cas d’animals de producció, tots els sectors de la indústria s’han de comprometre a complir el seu paper corresponent. f ) Hi ha importants diferències nacionals, regionals o entre granges en relació als perfils de malaltia. Aquestes diferències obeeixen a variacions en el serotip o el grau de virulència de les soques, a diferències en el maneig, en els programes de vacunació i en el tipus d’antimicrobians utilitzats. Per això, és difícil dissenyar guies universals, i s’han d’implementar guies nacionals o regionals per a cadascuna de les espècies animals. g) L’ús prudent no ha d’implicar una restricció molt forta, de manera que pugui afavorir-se l’aparició de un mercat negre d’antimicrobians o de productes no registrats. h) És important fomentar la formació continuada dels veterinaris amb assistència a cursos, congressos i conferències. L’ús prudent d’antimicrobians ha d’ésser un component essencial del manual de bones pràctiques clíniques en veterinària, marc en el qual s’ha de centrar l’actuació de tots els professionals. En aquest manual, en l’apartat corresponent a antimicrobians, s’haurien d’incloure els punts següents: a) Els antimicrobians s’han de fer servir per al tractament d’infeccions, primàries o secundàries, de bacteris, fongs o paràsits. b) La utilització dels antimicrobians s’ha de fer sota la direcció i supervisió d’un veterinari. c) S’han de fer els màxims esforços per ar-

I. BADIOLA, A. PÉREZ, M. LLAGOSTERA I M. SACO

ribar al diagnòstic correcte. És desitjable que per al diagnòstic s’incloguin estudis de laboratori i, especialment, l’aïllament del patogen i la valoració del grau de sensibilitat. d) S’ha de triar la ruta d’administració més apropiada, i cal posar especial atenció als animals malalts i la capacitat d’aquests per a menjar o beure. e) L’ús prolongat d’antimicrobians orals genera resistències en la microbiota intestinal amb una freqüència més gran que l’administració parenteral del mateix principi actiu. No obstant això, l’administració parenteral en la majoria de sistemes de producció és pràcticament impossible. f ) Quan un antimicrobià es faci servir, haurà de tenir l’espectre adient d’activitat, se n’haurà de calcular la dosi correcta i el seu ús s’haurà d’allargar solament durant el temps necessari. g) El tractament amb antimicrobians no ha de suplir els aspectes bàsics de maneig, higiene, alimentació i, quan siguin possibles, les mesures d’immunoprofilaxi més eficaces. h) La utilització d’antimicrobians s’ha de documentar adequadament i les quantitats utilitzades han de concordar amb les quantitats prescrites. i) Sempre que sigui possible, els antimicrobians s’han de fer servir dintre de les especificacions indicades en el registre. L’ús fora de les indicacions del registre s’ha de restringir a situacions extremes en les quals no es disposi de cap altre producte eficaç; en aquest cas el veterinari responsable ha d’exposar, per escrit, les raons per al seu ús. j) La utilització de promotors del creixement autoritzats ha de respondre a criteris estrictes de bon maneig i no han d’emmascarar una pràctica incorrecta. La utilització d’antimicrobians per al tractament d’infeccions ha de tenir present la presència de qualsevol promotor del creixement en la dieta. Tots els punts precedents han de servir

com a referència del modus operandi perquè es pugui continuar disposant, durant molt de temps, del potent arsenal d’antimicrobians indispensable per a mantenir els nivells de producció dintre d’uns marges econòmicament compatibles amb la capacitat de la majoria dels consumidors, i també perquè es pugui garantir el benestar dels animals i la seguretat dels consumidors. Per acabar, és important destacar la necessitat d’establir vies efectives de relació i comunicació entre veterinaris, metges, ramaders, administració, mitjans de comunicació i tots els operadors implicats en la cadena alimentària. BIBLIOGRAFIA Benbrook, C. M. (2001). «Quantity of antimicrobials used in food animals in the United States». A: Proc. 101st Annual Meeting American Society for Microbiology. Byrne, C. M.; Erol, I.; Call, J. E.; Kaspar, C. W.; Buege, D. R.; Hiemke, C. J.; Fedorka-Cray, P. J.; Benson, A. K.; Wallace, F. M.; Luchansky, J. B. (2003). «Characterization of Escherichia coli O157:H7 from downer and healthy dairy cattle in the upper Midwest region of the United States». Appl. Environ. Microbiol., vol. 69, pàg. 4683-4688. CVMP (1995). Note for guidance: Approach towards harmonisation of withdrawal periods. EMEA/CVMP/036/95. — (2001a). Revised guideline on safety evaluation on antimicrobial substances regarding the effects on human gut flora. EMEA/CVMP/234/01. — (2001b). Background paper to the revision of the CVMP guideline on safety evaluation of antimicrobial substances regarding the effects on human gut flora. EMEA/CVMP/235/01. — (2001c). Guideline on pre-authorisation studies to assess the potential for resistance resulting from the use of antimicrobial veterinary medicinal products. EMEA/CVMP/244/01. OIE (1999). «The use of antibiotics in animals: ensuring the protection of public health». A: Proc. of European Scientific Conference. París, 24-26 de març. Wall, P. G.; Morgan, D.; Lamden, K.; Ryan, M.; Griffin, M.; Threlfall, E. J.; Ward, L. R.; Rowe, B. (1994). «A case control study of infection with an epidemic strain of multiresistant Salmonella typhimurium DT104 in England and Wales». Commun. Dis. Rep. CDR Rev. 4, vol. 11, pàg. R130-R135.

Antimicrobians (Joaquim Ruiz, ed.) Treballs de la SCB. Vol. 55 (2004) 29-48

DIFUSIÓ DE LA RESISTÈNCIA ALS ANTIMICROBIANS. DIFERENTS CAMINS AMB UN MATEIX FINAL Aurora García, 1, 2 Montserrat Rebollo 1 i Ferran Navarro 1, 2 1 Servei de Microbiologia, Hospital de la Santa Creu i Sant Pau. 2 Departament de Genètica i Microbiologia, Universitat Autònoma de Barcelona.

Adreça per a la correspondència: Ferran Navarro. Servei de Microbiologia, Hospital de la Santa Creu i Sant Pau. Av. Sant Antoni M. Claret, 167. 08025 Barcelona. Adreça electrònica: fnavarror@santpau.es. RESUM Un dels aspectes més preocupants de l’adquisició de resistències és la seva difusió en el món microbià. L’adquisició dels diferents mecanismes de resistència pot ser originada pel microorganisme mateix, fruit d’errors en la seva replicació, o per l’adquisició de material genètic que codifiqui gens de resistència. En el primer cas parlaríem d’una difusió vertical, mentre que en el segon parlaríem de difusió horitzontal. La difusió horitzontal es pot donar per transformació, transducció i conjugació. Potser el més simple d’aquests mecanismes de transferència gènica és la transformació natural, on DNA lliure de l’ambient és adquirit per un bacteri receptor. Aquest DNA serà incorporat a la cèll. ula i, en expressar-se, podrà comportar un canvi fenotípic. En el cas de la transducció el DNA és transferit per bacteriòfags a les noves cèll. ules que infecten. El darrer mecanisme de difusió horitzontal de la resistència és la conjugació, procés de transferència de gens a través de plasmidis entre dues cèll. ules que estan en contacte. Finalment, trobem unes altres estructures gèniques, els elements mòbils, que tenen també un paper molt important en la difusió gènica, com són els gens cassette, integrons, seqüències d’inserció, transposons conjugatius i no conjugatius i les illes genòmiques. Paraules clau: transformació, transducció, conjugació, elements mòbils. SUMMARY One of the greatest concerns in acquiring drug resistance is dissemination of resistance genes in the microbial world. Acquisition of various resistance mechanisms could be generated either by the microorganism itself, as the result of replication errors, or by acquisition of genetic material that codes for resistance genes. In the former, we are talking about vertical diﬀusion, whereas the latter is known as horizontal diﬀusion.

A. GARCÍA, M. REBOLLO I F. NAVARRO

Transformation, transduction and conjugation could mediate horizontal dissemination. Perhaps the simplest of these genetic exchanges mechanisms is natural transformation, where free DNA will be acquired by a recipient bacterium. This DNA will be incorporated to the cell and could cause a phenotypic change if it is expressed. In transduction, DNA is transferred by bacteriophages to newly infected cells. The third mechanism is conjugation, where gene transfer is mediated by plasmids between two cells, which are in direct contact. Finally, other genetic structures, mobile elements, also play an important role in genetic diffusion. These mobile elements are cassette genes, integrons, insertion sequences, conjugative and non-conjugative transposons and genomic islands. Keywords: transformation, transduction, conjugation, mobile elements. BASES GENÈTIQUES DE LA RESISTÈNCIA Un dels aspectes més preocupants de l’adquisició de resistències és la seva difusió en el món microbià. L’adquisició dels diferents mecanismes de resistència pot ser originada pel microorganisme mateix, fruit d’errors en la seva replicació, o per l’adquisició de material genètic que codifiqui gens de resistència. En el primer cas estaríem parlant de mutacions, que només es difondran verticalment, és a dir, seran transmeses de cèll. ula mare a cèll. ula filla. L’adquisició de la resistència, en aquest cas, pot aparèixer bé en una sola generació, com és el cas de la resistència a rifampicina, o bé en el transcurs de diverses generacions, com en el cas de la resistència a fluoroquinolones. Les mutacions poden tenir lloc per substitució d’una base nucleotídica o per addició o pèrdua d’una o diverses bases. També poden tenir lloc per amplificació o còpia de múltiples segments de DNA, per inserció o escissió d’un segment mòbil de DNA que codifica o regula la seqüència d’un gen, o per inversió d’un segment. La interacció de l’antibiòtic amb la seva diana sol ser força específica, de manera que un simple canvi de base al gen, que provoqui un canvi d’aminoàcid a la proteïna, pot alterar aquesta interacció entre l’antibiòtic i la seva diana i donar lloc a un fenotipus de resistència a aquest antibiòtic. Aquesta mutació puntual presenta una freqüència relativament eleva-

da en moltes espècies bacterianes. Exemples de resistència «mutacional» són la resistència a estreptomicina per mutació ribosòmica (Eliopoulos et al., 1984), a rifampicina per mutacions a l’RNA-polimerasa (Wehrli, 1983), a fluoroquinolones a través de mutacions a les topoisomerases (Martínez et al., 1998) i la resistència al linezolid per mutacions a l’RNA ribosòmic (Prystowsky et al., 2001). Aquestes mutacions poden aparèixer també en gens reguladors de processos cell. ulars. Un dels exemples més clars és la «desrepressió» de la β-lactamasa cromosòmica d’Enterobacter sp. (Jacobs et al., 1997). Mutacions al gen ampD, codificador d’una amidasa cell. ular, donen lloc a l’acumulació d’un determinat producte que té com a efecte l’increment de l’expressió del gen cromosòmic ampC, que codifica una β-lactamasa. També, existeixen una sèrie de mecanismes d’adquisició de material genètic mitjançant els quals la resistència pot ser difosa d’una cèll. ula a una altra (de la mateixa espècie o no), cosa que contribueix a la difusió horitzontal de la resistència als antimicrobians. Aquests mecanismes són la transformació, la transducció i la conjugació. TRANSFORMACIÓ Potser el més simple d’aquests mecanismes de transferència de gens és la transformació natural, que es va definir originàriament

DIFUSIÓ DE LA RESISTÈNCIA ALS ANTIMICROBIANS

com l’habilitat d’algunes espècies bacterianes d’absorbir, sota determinades circumstàncies, molècules de DNA nu lliure de l’ambient, provinent d’un bacteri donant. Aquest DNA serà adquirit per un bacteri receptor, que rebrà el nom de transformant, serà incorporat a la cèllula i, en expressar-se, podrà comportar un canvi fenotípic. La transformació la va posar en evidència per primera vegada Fred Griffith el 1928, mitjançant experiments amb Streptococcus pneumoniae i l’adquisició de virulència, tot i desconèixer llavors quina era la partícula transformant. No va ser fins al 1944 quan Avery, McLeod i McCarty van provar que la partícula transformadora responsable d’aquesta adquisició de virulència en una soca no virulenta era un fragment de DNA (Avery et al., 1944). Perquè el material genètic s’incorpori al genoma bacterià, després de travessar la membrana citoplasmàtica, i pugui, per tant, comportar un canvi fenotípic, és necessari que existeixin regions de certa homologia entre el nou DNA incorporat per la cèll. ula i el del bacteri en qüestió. Si no existeix aquesta homologia, el DNA incorporat serà degradat; mentre que si existeix homologia, el nou DNA podrà ser incorporat mitjançant un procés de recombinació. De totes maneres, encara que el DNA exogen internalitzat ha d’integrar-se al cromosoma o en un plasmidi, també pot circularitzar-se (si conté un origen de replicació) i establir-se com un replicó autònom. Com a resultat dels fenòmens de recombinació, es poden obtenir gens la seqüència dels quals està formada per múltiples fragments de diferents orígens, i es forma el que es denomina un mosaic. Un exemple de gen mosaic és el que confereix resistència a penicill. ina i a cefalosporines en S. pneumoniae. S’ha descrit, en soques resistents, una gran varietat de gens mosaic codificadors de la penicillin-binding protein (PBP), amb el nivell i grau de resistència determinats pel nombre i la naturalesa de les re-

combinacions gèniques (Hakenbeck i Coyette, 1998). Els mecanismes pels quals tenen lloc els fenòmens de transformació són variats i encara no molt ben coneguts. Perquè la cèll. ula pugui captar el DNA nu ha de trobar-se en un estat de «competència». Aquest estat de «competència» pot ocórrer naturalment (competència fisiològica) en alguns microorganismes com, per exemple, Bacillus subtilis, Haemophilus inﬂuenzae, Neisseria gonorrhoeae, S. pneumoniae i diverses espècies de cianobacteris com el gènere Synochococcus (Snyder i Champness, 1997), o bé pot ser induït artificialment en altres (competència artificial) per diferents mecanismes (CaCl 2, polsos elèctrics, etc.). En qualsevol cas, perquè la transformació tingui lloc és necessari disposar de DNA lliure, principalment de doble cadena, que s’unirà a la cèll. ula mitjançant un receptor localitzat a la seva superfície (Averhoff i Friedrich, 2003). La transformació pot dividir-se en diferents etapes que són comunes a tots els bacteris (vegeu la figura 1): a) Desenvolupament de la competència. Requereix canvis fisiològics complexos que tenen lloc en determinades etapes del creixement bacterià i està associat a diversos fenòmens com són la producció de feromones o factors de competència en diferents espècies bacterianes. b) Unió del DNA. S’uneix DNA de doble cadena, encara que la cèll. ula receptora pot unir també limitades quantitats de DNA de cadena senzilla. Aquest DNA, provinent de la cèll. ula donant, s’uneix a través d’un receptor localitzat a la superfície cell. ular. L’especificitat del DNA que la cèll. ula pot unir varia segons l’espècie bacteriana. Bacteris grampositius, com per exemple B. subtilis i S. pneumoniae, poden unir tant DNA homòleg (de la mateixa espècie) com heteròleg (d’altres espècies). En canvi, els gramnegatius, com H. inﬂuenzae o N. gonorrhoeae, només poden unir DNA homòleg o d’espècies molt semblants. En aquests casos, es requereixen unes seqüèn-

A. GARCÍA, M. REBOLLO I F. NAVARRO

Figura 1. Mecanisme de transformació. a) Desenvolupament de la competència i unió del DNA transformador. b) Processament i presa del DNA exogen. c) Les proteïnes específiques (SSB) s’uneixen i protegeixen el DNA exogen monocatenari. d) El DNA exogen s’integra al cromosoma bacterià en regions homòlogues mitjançant la proteïna RecA.

cies de «captació» específiques, que solen ser curtes, entre deu i dotze parells de bases (pb), però suficientment llargues perquè gairebé mai puguin trobar-se per casualitat en un altre DNA. En H. inﬂuenzae, la internalització del DNA requereix una seqüència específica d’11 pb, que es troba repetida unes sis-centes vegades en el seu genoma, mentre que en N. gonorrhoeae aquesta seqüència és de tan sols 10 pb (Snyder i Champness, 1997). La unió del DNA transformador involucra una primera fixació reversible, que després es transforma en irreversible (Dubnau, 1999). c) Processament i captació del DNA. Una vegada fixat el DNA de doble cadena a la cèll. ula, tenen lloc diversos processos que porten a la captació de només una de les dues cadenes. Aquests passos són també diferents segons l’espècie bacteriana. En grampositius, una de les cadenes del DNA que s’ha unit és tallada per una endonucleasa en petits fragments. Es creu que aquest enzim forma part del receptor de DNA. Aquest receptor empeny la cadena complementària (no tallada) cap a l’interior de la cèll. ula, mentre que l’altra cadena és degradada a oligonucleòtids per una exonucleasa associada. Aquest DNA de cadena senzilla que s’ha captat s’associa a proteïnes SSB (single strand-binding proteins) específiques de la competència, que el protegeixen de l’acció de les endonucleases. En gramne-

gatius, el DNA de doble cadena específic unit és captat per unes vesícules, o compartiments subcell. ulars, que reben el nom de transformasomes. Dins d’aquestes vesícules es degrada una de les dues cadenes i l’altra s’interna mitjançant un procés semblant al del pneumococ (no obstant això, en bacteris com Haemophilus no s’han observat intermediaris de DNA de cadena senzilla al citoplasma). En aquest cas són els transformasomes i no les proteïnes SSB els que protegeixen el DNA de les DNAases externes i dels enzims de restricció cell. ulars (Dubnau, 1999). d) Integració del DNA per recombinació i expressió. Tant en grampositius com en gramnegatius el DNA transformant s’integra al DNA cell. ular en regions homòlogues mitjançant un procés anomenat desplaçament de la cadena: la nova cadena envaeix la doble hèlix i desplaça la cadena homòloga vella, i aquesta és degradada. Mitjançant reparació i subsegüent replicació, la seqüència del nou DNA incorporat pot reemplaçar la seqüència cromosòmica original en aquestes regions homòlogues. Si les seqüències de DNA donant i receptor difereixen lleugerament, en aquesta regió poden aparèixer recombinants (Snyder i Champness, 1997). Existeixen nombrosos exemples d’adquisició de resistències en microorganismes naturalment transformables d’interès clínic com

DIFUSIÓ DE LA RESISTÈNCIA ALS ANTIMICROBIANS

la resistència a β-lactàmics en S. pneumoniae (pbp), Helicobacter pylori (pbp1A) i neissèries (penA), la resistència a quinolones en S. pneumoniae (gyrA i parC), la resistència a tetraciclina en Gardnerella vaginalis, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum i altres (tetM), la resistència a sulfamides i trimetoprim (sul i dfr) i potser la resistència a carbapenems en Pseudomonas aeruginosa (oprD). TRANSDUCCIÓ Un altre dels mecanismes de difusió horitzontal de gens de resistència és la transducció. En aquest cas, la situació és semblant a l’anterior, però en lloc d’incorporar DNA lliure del medi, aquest DNA prové d’una cèll. ula prèviament infectada i serà transferit per partícules víriques o bacteriòfags a les noves cèll. ules que seran infectades. Els fags implicats en un procés de transducció reben el nom de fags transductors o partícules transductores. La soca bacteriana original en la qual aquests fags s’han multiplicat s’anomena cèll. ula donant, mentre que la soca bacteriana que serà infectada per aquestes partícules rep el nom de cèll. ula receptora. Finalment, les cèll. ules que han rebut el DNA per transducció s’anomenen transductants (Snyder i Champness, 1997). Existeixen dos tipus de transducció: a) Transducció generalitzada. Comença en el moment en què té lloc l’empaquetament accidental d’una porció de DNA bacterià en una partícula vírica normal (vegeu la figura 2). Encara que s’ha descrit que l’empaquetament del DNA víric comença per llocs específics del concatàmer víric, anomenats pac, i que aquests no es troben en el genoma bacterià, el fag pot, aparentment, reconèixer seqüències semblants, i es produeix així l’encapsidació errònia de DNA bacterià (Snyder i Champness, 1997). Quan s’indueix la lisi cell. ular, s’allibera aquesta partícula transductora que, tot i que té la totalitat del seu DNA bacterià, és capaç d’adherir-se a una nova cèll. ula i injectar

aquest DNA. Si existeixen regions homòlogues, aquest DNA transductor pot ser incorporat al genoma de la cèll. ula receptora. La quantitat de partícules de transducció generalitzada que poden produir-se a les cèll. ules infectades és molt variable; mentre que en algunes cèll. ules no se’n produeix cap, en altres es pot arribar a encapsidar el 20 % del genoma bacterià. Malgrat que, en un principi, totes les regions del DNA bacterià podrien ser encapsidades, en aquest tipus de transformació s’ha observat que alguns loci són transduïts amb major freqüència. S’ha observat que aquest tipus de transducció pot tenir lloc tant amb fags temperats com pseudotemperats, i també mitjançant fags virulents. Aquests últims són els que produeixen el major nombre de partícules transductores. Alguns bacteriòfags que presenten aquest tipus de transducció són el P1 d’Escherichia coli i el P22 de Salmonella enterica serovar Typhimurium. b) Transducció especialitzada. Es diferencia de la generalitzada en el fet que només poden transferir-se els gens que es troben flanquejant la regió on el fag temperat o lisogènic s’integra al cromosoma bacterià (vegeu la figura 3). Aquesta regió d’integració sovint es troba en punts concrets del genoma i, per tant, els gens transduïts solen ser uns determinats (Canchaya et al., 2003). Per exemple, el lloc d’inserció del fag λ es troba, en E. coli, entre els gens gal i bio (Snyder i Champness, 1997). No obstant això, la integració d’aquest fag en altres llocs secundaris pot comportar la transducció d’altres marcadors bacterians. L’escissió d’un fag no sempre és «perfecta»: en alguns casos pot tenir lloc una escissió anormal que provoca que part del genoma del fag arrossegui gens bacterians propers al punt on estava, i es formen fags defectius, anomenats fags o partícules de transducció especialitzada, que contindran tant DNA víric com bacterià. Aquestes s’obtenen amb una freqüència molt baixa, atès que els errors en l’escissió del fag són extremadament infreqüents, i és un milió de vegades més freqüent l’escissió normal

A. GARCÍA, M. REBOLLO I F. NAVARRO

Figura 2. Mecanisme de transducció generalitzada. a) Fixació del fag a la cèll. ula. b) Injecció del material genètic víric. c) Degradació del DNA bacterià i replicació del genoma víric. d) Síntesi de les càpsides i empaquetament del material genètic bacterià i víric. e) Lisi cell. ular i alliberació de les noves partícules víriques.

(Snyder i Champness, 1997). Una vegada el fag injecta el DNA transductant poden donarse diferents situacions. En tots els casos, però, després de la injecció es produeix la circularització i superenrotllament del DNA transductor. Després, el DNA víric pot produir la replicació vírica mitjançant un cicle lític, pot mantenir-se inactiu i eliminar-se per segregació, o bé pot recombinar-se, per diferents vies, amb el material genètic bacterià. Un dels primers exemples de transducció detectat en clínica va ser el de la transferència de gens de resistència a penicill. ina en Staphylococcus aureus. En aquest cas, però, el bacteriòfag contribueix a la difusió de plasmidis de mida petita, que són encapsidats i transferits a altres bacteris. Així, els plasmidis seran autoreplicats i mantinguts sense necessitat de recombinació. El fet que el responsable d’aquesta resistència sigui un gen codificador d’una β-lactamasa, que aquest s’hagi identificat freqüentment en plasmidis i que durant molt de temps s’hagin descrit amb detall diversos bacteriòfags en aquest grup de microorganismes, ha permès especular que l’elevada prevalença de producció de β-lactamases en estafilococs prové de la transferència d’aquests plasmidis a través de bacteriòfags (Lyon i Skurray, 1987).

Altres exemples són la detecció de gens que confereixen resistència a β-lactàmics, com són els gens bla OXA i bla PSE, en DNA fàgic obtingut a partir d’aigües residuals, tant humanes com animals, a la província de Barcelona (Muniesa et al., 2004) o la implicació d’aquests en la transferència de determinants de virulència (Cheetham i Katz, 1995; Ferretti et al., 2001). Els fags tenen un important paper en l’evolució, ja que promouen la transferència horitzontal de gens tant entre membres individuals de la mateixa espècie com entre bacteris força distanciats. El DNA dins les càpsides víriques és, normalment, més estable que el DNA nu lliure al medi, i això li permet poder persistir més temps a l’ambient. A més a més, molts fags són capaços d’infectar un ampli rang d’hostes, per la qual cosa aquest DNA pot disseminar-se en un gran nombre d’espècies diferents. Encara que el DNA d’una determinada espècie no sigui capaç de recombinar-se si no troba seqüències homòlogues al cromosoma d’una espècie diferent, quan el DNA transduït és un plasmidi amb un ampli rang d’hostes, capaç d’autoreplicar-se a la cèllula receptora, o bé conté un transposó que pot saltar dins el DNA d’aquesta cèll. ula receptora, sí que és possible la transducció estable de

DIFUSIÓ DE LA RESISTÈNCIA ALS ANTIMICROBIANS

Figura 3. Mecanisme de transducció especialitzada. a) Cèll. ula lisògena: el DNA del bacteriòfag es troba inserit dins el DNA bacterià. b) Circularització i escissió del DNA del fag. c) Escissió anormal que produeix la pèrdua d’alguns gens del fag, que es mantenen inserits al cromosoma bacterià. En canvi, alguns gens bacterians s’han circularitzat juntament amb el DNA del fag. d) Degradació del DNA bacterià i replicació del genoma víric. e) Síntesi de les càpsides i empaquetament del material genètic bacterià i víric. f ) Lisi cell. ular i alliberació de les noves partícules víriques.

gens entre bacteris poc relacionats (Snyder i Champness, 1997). CONJUGACIÓ El darrer mecanisme de difusió horitzontal de la resistència és la conjugació, procés de transferència de gens entre dues cèll. ules que estan en contacte (vegeu la figura 4). Aquest tipus de transferència de gens és possible gràcies al fet que els microorganismes poden ser portadors d’estructures genètiques, denominades plasmidis. Els plasmidis i el cromosoma bacterià constituirien el que es coneix amb el nom de genoma bacterià. Els plasmidis són molècules circulars de DNA de doble cadena, superenrotllades negativament (tot i que també se’n troben de lineals en Borrelia i alguns actinomicets) (Snyder i Champness, 1997). Són literalment material genètic accessori. No codifiquen funcions essencials per a la cèll. ula i la seva mida pot variar entre poques i centenars de quilobases. Poden transportar des d’únicament els gens necessaris per a la seva replicació fins a centenars de gens addicionals; llavors es

consideren com a «mini-cromosomes» (Cole i Saint-Girons, 1999). En alguns casos la dispensabilitat d’aquests és dubtosa, com en el cas de Borrelia burgdorferi, on diferents plasmidis contenen gens que codifiquen lipoproteïnes i altres funcions metabòliques, que en el cas de perdre’s serien molt perjudicials per a la cèll. ula (García-de los Santos et al., 1996). Els plasmidis es repliquen autònomament (replicons), independentment del cromosoma de la cèll. ula (Grinsted i Bennet, 1988). Presenten un origen de replicació (oriV) i algunes de les proteïnes necessàries per a iniciar la replicació, tot i que dependran de la cèll. ula hoste per a replicar-se, ja que necessitaran l’aport extern de DNA-polimerases, ligases, helicases, etc. S’han observat dos tipus de replicació plasmídica: la replicació en θ, freqüent en bacteris gramnegatius, i la replicació en σ o cercle rodant, freqüent en bacteris grampositius. Alguns plasmidis presenten un rang d’hostes força estret, mentre que altres són capaços de transferir-se i replicar-se dins una gran varietat d’espècies bacterianes diferents (Rice et al., 2003). Els plasmidis poden també integrarse dins el cromosoma de la soca receptora (cèllules Hfr), i incrementen així l’estabilitat de

A. GARCÍA, M. REBOLLO I F. NAVARRO

Figura 4. Mecanisme de conjugació. a) Cèll. ula conjugativa (F+), amb el seu pili sexual, i cèll. ula no conjugativa (F–), sense pili. b) Establiment del contacte entre les dues cèll. ules mitjançant el pili sexual. c) Contracció del pili sexual i contacte cèll. ula-cèll. ula. Formació d’un porus per on passa el DNA de cadena senzilla des de la cèll. ula donant a la receptora. d) Síntesi de les cadenes de DNA conjugatiu: contínua a la cèll. ula donant i discontínua a la receptora. e) Segellament dels porus i separació de les dues cèll. ules. Cadascuna conté una còpia del factor F i poden, per tant, sintetitzar el pili.

la informació genètica que transporten (Rice i Carias, 1998), replicant-se com qualsevol altre caràcter cromosòmic. Aquests plasmidis integrats s’anomenen episomes. Els plasmidis conjugatius són potser més freqüents o, com a mínim, més estudiats, en bacteris gramnegatius (gèneres Escherichia i Pseudomonas) (Snyder i Champness, 1997). El procés de la conjugació s’inicia quan el pili sexual de la cèll. ula donant, format per les proteïnes sintetitzades pels gens traA i traQ, entra en contacte amb la membrana d’una cèll. ula receptora. El contacte cèll. ula-cèll. ula s’aconsegueix, presumiblement, bé per la contracció o pel desacoblament del pili sexual. L’aparellament entre les dues cèll. ules és, en un principi, inestable, però després s’estabilitza específicament mitjançant les proteïnes TraG i TraN. Posteriorment, altres gens tra s’encarregaran de la transferència del plasmidi a través de les membranes, mitjançant la formació d’un relaxosoma (complex format per DNA i proteïnes) al voltant de l’origen de transferència (oriT) del plasmidi. Aquest com-

plex realitzarà un tall i és la cadena simple de DNA, creada pel tall, la que es transferirà. Un altre complex de proteïnes connectarà i estabilitzarà la cèll. ula receptora amb la donant, i el pili coll. aborarà en el manteniment de l’aparellament (Snyder i Champness, 1997; Waters, 1999). En bacteris grampositius (Enterococcus, Streptococcus, Bacillus, Staphylococcus i Streptomyces), l’agregació de cèll. ules donants i receptores no està mitjançada pel pili sinó per mitjà d’una sèrie de substàncies d’agregació i feromones, ja que aquests microorganismes no tenen l’elaborada membrana externa dels bacteris gramnegatius (Snyder i Champness, 1997). Es desconeix com es desestabilitza l’aparellament i com se separen les cèll. ules. La conjugació s’ha estudiat amb més detall en E. coli per mitjà del factor F, plasmidi conjugatiu i mobilitzable de 94,5 kb que presenta la capacitat d’integrar-se al cromosoma bacterià. Aquest factor codifica la síntesi i l’acoblament del pili sexual, i també les diferents funcions que porten a la transferència d’una còpia del factor F a la cèll. ula receptora

DIFUSIÓ DE LA RESISTÈNCIA ALS ANTIMICROBIANS

(Lawley et al., 2003). Els diferents gens que codifiquen les funcions de conjugació i transferència estan agrupats en una regió de 35 kb que rep el nom de reguló tra. Aquesta regió conté l’oriT, diferent de l’origen de replicació oriV, pel qual s’inicia la replicació normal del plasmidi (Snyder i Champness, 1997), que és el lloc on s’inicia la transferència del DNA i està contingut al locus bom (basis of mobility), conjuntament amb més de vint-i-vuit gens anomenats tra i trb. El factor F es transfereix des de la cèll. ula donant a la receptora en forma de DNA de cadena senzilla, passant en primer lloc l’extrem 5 . Es creu que en la síntesi del DNA donant conjugatiu estan involucrats els productes de quatre o cinc gens tra i que, abans que comenci la síntesi d’aquest DNA, tenen lloc diferents esdeveniments. Un és el trencament d’una de les dues cadenes del factor F a l’oriT per mitjà del producte del gen traI, que es manté unit a l’extrem 5 de la cadena tallada. La proteïna TraI posseeix també activitat helicasa i ATPasa, amb la que separa la cadena de DNA conjugatiu durant la translocació utilitzant ATP. Fins al moment, encara no es coneix del tot el paper que tenen determinades proteïnes en l’ancoratge i protecció del DNA i en la formació de porus a les membranes, si bé sí que es coneix el sentit en què és transferit el DNA durant la conjugació. Una de les propostes sobre això és que el DNA de cadena senzilla és protegit durant la transferència per les proteïnes SSB, tant a la cèll. ula donant com a la receptora. La transferència de l’extrem 5 s’acompanya de la síntesi contínua de la cadena de DNA complementària a la cèll. ula donant, mentre que a la receptora el DNA de cadena senzilla transferit serveix com a motlle per a la síntesi discontínua de la cadena complementària. Per tant, les dues cadenes senzilles serveixen com a motlle per a la replicació de molècules completes de DNA de doble cadena tant a la cèll. ula donant com a la receptora; després de la transferència, ambdues cèll. ules contenen

una còpia del plasmidi. La cèll. ula receptora que ha rebut DNA com a resultat d’una conjugació rep el nom de transconjugant (Snyder i Champness, 1997). Com ja s’ha comentat, s’han trobat també plasmidis autotransferibles en diversos tipus de bacteris grampositius. Malgrat això, la informació sobre els sistemes de transferència d’aquests bacteris és encara molt menor. Les regions de transferència dels plasmidis de grampositius són sovint molt més petites que les de gramnegatius. Per exemple, la regió de transferència del plasmidi pSN22 de Streptomyces nigrifaciens es creu que té menys de 7.000 pb i que deu necessitar només uns cinc gens per a la transferència. Aquestes regions tra poden ser més petites, ja que els bacteris grampositius no necessiten un pili sexual per a intercanviar plasmidis (Snyder i Champness, 1997). Els plasmidis bacterians poden classificarse segons diferents caràcters (Hardy, 1986): a) Segons siguin autotransferibles per conjugació o no: — Plasmidis autotransferibles (Tra+, Mob+) o conjugatius. Són plasmidis capaços per si mateixos de conjugar. — Plasmidis no conjugatius, dins els quals trobem els plasmidis no mobilitzables (Tra–, Mob–) i els plasmidis mobilitzables (Tra–, Mob+). Els darrers no tenen la regió tra però sí la regió mob, que pot ser reconeguda per proteïnes Tra de conjugació d’altres plasmidis que sí són conjugatius i poden conjugar. També trobem els plasmidis que són capaços de realitzar el contacte entre cèll. ules però no poden transferir el seu DNA (Tra+, Mob–). Però fins i tot els plasmidis no mobilitzables poden conjugar mitjançant un procés anomenat de conducció, a través del qual un plasmidi no mobilitzable i un de conjugatiu es recombinen i formen un cointegrat, el qual serà capaç de conjugar-se i, per tant, de transferir el plasmidi no mobilitzable a la cèll. ula receptora; un cop allà, el cointegrat pot resoldre’s i s’obtenen els dos plasmidis per separat.

A. GARCÍA, M. REBOLLO I F. NAVARRO

b) Segons el control de la replicació vegetativa (on el nombre de còpies es defineix com el nombre de còpies del plasmidi en una nova cèll. ula immediatament després de la divisió cell. ular): — Plasmidis de control estricte: mantenen un baix nombre de còpies a la cèll. ula. Normalment són plasmidis de mida mitjana (unes 30 kb) i gran (centenars de kb). Com a exemple tenim el factor F: una o dues còpies per cromosoma. — Plasmidis de control relaxat: alt nombre de còpies per cromosoma (més de deu). Són plasmidis petits (menys de 10 kb). c) Segons el tipus de fenotipus que codiﬁquen: — Plasmidis R, que codifiquen una o més resistències a antibiòtics o metalls pesants. Aquests plasmidis són mall. eables i evolucionen ràpidament davant la pressió selectiva. Gràcies a l’enginyeria genètica i a la seqüenciació s’ha vist com aquests gens de resistència s’han difós entre espècies i gèneres molt diferents mitjançant difusió horitzontal, ja que el mateix gen pot estar situat en espècies molt llunyanes en plasmidis de diferent tipus i de grups d’incompatibilitat diferents. Tot i que a la natura i independentment de l’acció humana ja existien plasmidis R, l’ús massiu dels antibiòtics ha provocat un augment espectacular de soques portadores de plasmidis R i que, en aquests, cada cop es trobin situats més gens de resistència. — Plasmidis bacteriocinogènics, que codifiquen una bacteriocina i immunitat davant aquesta. Com a exemple tenim els plasmidis Co1 E1 o Clo DF13 (Elzen et al., 1982). — Plasmidis de virulència que codifiquen funcions relacionades amb la virulència. Un exemple d’aquests seria la neurotoxina de Clostridium tetani (Finn et al., 1984) o la toxina de Bacillus anthracis (Koehler, 2002). — Plasmidis que codifiquen factors de colonització. — Plasmidis que confereixen la capacitat d’utilitzar rutes metabòliques alternatives, com la degradació de l’octà (plasmidis

OCT), la degradació del toluè i xilè (plasmidis TOL/XYL) o la degradació del naftalè (plasmidis NAF). — Plasmidis responsables de la fixació de nitrogen als nòduls radicals de les lleguminoses en les soques de Rhizobium (Rosenblueth i Martínez-Romero, 2004). — Plasmidis Ti i Ri d’Agrobacterium, responsables de la producció de tumors en moltes plantes dicotiledònies. d) Plasmidis segons el grup d’incompatibilitat: Molts bacteris contenen més d’un tipus de plasmidi, però no tots els plasmidis poden coexistir en una mateixa cèll. ula. Aquest fenomen s’anomena incompatibilitat plasmídica. Dos plasmidis són incompatibles quan no poden coexistir establement a la mateixa cèllula perquè comparteixen el mateix sistema de replicació o segregació de les còpies. S’han trobat diferents elements causants de la incompatibilitat plasmídica, tres elements típics dels replicons plasmídics: el cop (gen que codifica proteïnes que s’uneixen a l’origen de replicació i inhibeixen la replicació), el rep/ori (gen que codifica proteïnes necessàries per a la replicació/origen de replicació) i el par (gen que codifica proteïnes que intervenen en la divisió cell. ular) (Novick, 1987). La incompatibilitat pot ser simètrica o vectorial, depenent si els dos plasmidis del mateix grup d’incompatibilitat tenen la mateixa probabilitat de ser eliminats de la cèll. ula o un dels dos té més probabilitats de mantenir-se que l’altre. Hi ha més de trenta grups d’incompatibilitat (IncA, IncH, IncP10, IncQ-like, etc.) (Novick, 1987). ELEMENTS MÒBILS En una avaluació recent, utilitzant la seqüència genòmica de dinou espècies diferents, s’ha calculat que aproximadament un 6 % del genoma bacterià pot provenir d’esdeveniments de transferència horitzontal (Ochman et al., 2000). La variació és molt àmplia.

DIFUSIÓ DE LA RESISTÈNCIA ALS ANTIMICROBIANS

Tot i que alguns microorganismes, com Mycoplasma genitalium i Rickettsia prowazekii pràcticament no mostren seqüències exògenes, n’hi ha d’altres, com Synechocystis, que arriben fins a un 16,6 %. La transferència horitzontal de material genètic, com ja s’ha comentat prèviament, es dóna gràcies a tres mecanismes: la transformació, la transducció i la conjugació. En els dos últims casos intervenen elements mòbils com són els bacteriòfags, els plasmidis i els transposons conjugatius, respectivament. Però també existeixen uns altres elements mòbils que tenen un paper molt important en la mobilització intracell. ular del material genètic. El terme elements mòbils o elements genètics mòbils (mobile genetic elements, MGE) fa referència a seqüències de DNA que tenen la capacitat de moure’s entre cèll. ules o entre molècules de DNA. Poden ser petits (≈ 1 kb) o grans (centenars de kb). Tradicionalment, els elements genètics mòbils es classificaven en bacteriòfags, plasmidis (ambdós comentats prèviament), transposons, seqüències d’inserció i gens cassette. Aquesta classificació s’ha modificat a causa de la identificació d’uns elements quimèrics anomenats illes genòmiques. Fer una classificació sistemàtica dels elements mòbils resulta difícil, ja que molts cops és difícil trobar una relació filogenètica entre aquests. Són elements àmpliament distribuïts, extremadament diversos i en contínua evolució. Un subgrup dins els elements mòbils, anomenat elements transposables, el formarien les seqüències d’inserció (Mahillon i Chandler, 1998), els transposons i els bacteriòfags transposables (p. ex.: el bacteriòfag Mu) (Pato, 1989), ja que tenen la capacitat de moure’s d’un replicó a un altre mitjançant la transposició. La transposició és una reacció de recombinació de material genètic que es dóna com a resultat de la translocació d’un segment de DNA discret, anomenat element transposable o transposó, des d’un lloc del genoma a un altre. La transposició és una recombinació no homòloga però sí especialitzada, no necessita

una homologia entre l’element transposable o l’antic lloc d’inserció i el nou lloc d’inserció, però es dóna en llocs específics, dianes reconegudes per unes recombinases especialitzades, anomenades transposases (Craig, 1997). La transposasa és un enzim codificat normalment pel mateix element transposable que actua reconeixent específicament els extrems d’aquest i promovent-ne la mobilització cap a una altra diana. Normalment actua conjuntament amb altres proteïnes sintetitzades per l’element transposable i per l’hoste. El fenomen de transposició pot promoure també altres reorganitzacions del material genètic, com són delecions o inversions. És per aquest motiu que les seqüències d’inserció i els transposons són uns potents agents de canvis genètics i les seves accions poden contribuir substancialment a la diversitat gènica. Es poden donar dos tipus de transposició: la replicativa, com en el cas del transposó Tn3 i del fag Mu, i la no replicativa, com en la majoria de seqüències d’inserció i transposons compostos com el Tn5, Tn9 o Tn10 (Bennet, 2000). La transposició replicativa (vegeu la figura 5) dóna com a resultat una duplicació del transposó i, per tant, un increment del nombre de còpies d’aquest dins la cèll. ula. El resultat d’aquesta acció és una regeneració del replicó donador, amb una còpia del transposó, i l’aparició d’una nova còpia del transposó al replicó receptor, limitada per dues còpies en la mateixa orientació de la seqüència diana. Cada còpia del transposó mantindrà una cadena original i una de nova formació. En canvi, en la transposició no replicativa el transposó s’escindeix del DNA d’origen sense deixar cap còpia i s’insereix a la nova diana (vegeu la figura 6). No hi haurà un augment del nombre de còpies del transposó. En aquest tipus de transposició la replicació només es donarà per a unir el transposó al lloc diana. En aquest cas la cadena de DNA donadora pot ser reparada o degradada.

A. GARCÍA, M. REBOLLO I F. NAVARRO

Figura 5. Transposició replicativa. a) La transposasa talla les cadenes de DNA del transposó a l’alçada de cada IR i també fa dos talls a la seqüència diana. b) S’han format dos extrems 5 PO4 i dos extrems 3 OH lliures al transposó; aquests últims s’uniran amb els dos 5 PO 4 lliures de la seqüència diana. Els dos extrems 3 OH lliures de la seqüència diana actuaran d’iniciadors per a la replicació, que en aquest cas es donarà bidireccionalment, i replicarà la totalitat del transposó. Un cop finalitzada, els extrems 3 OH de la nova cadena sintetitzada s’uniran als extrems 5 PO 4 lliures del transposó i formaran un cointegrat. c) L’últim pas és la resolució del cointegrat; es dóna una recombinació específica conservativa a la regió res de les dues còpies del transposó gràcies a la resolvasa (TnpR) sintetitzada per aquest.

SEQÜÈNCIES D’INSERCIÓ Els transposons més petits són les seqüències d’inserció (IS). Oscill. en entre 760 i 2.500 pb. Tenen dues repeticions invertides (IR) curtes (9-41 pb) a cada extrem (amb l’excepció de les famílies IS91, IS110 i IS200/605) i un o diversos open reading frames (ORF) o pautes obertes de lectura, que codifiquen la transposasa (Chalmers i Kleckner, 1994) i, en alguns casos, també com a funció reguladora de la transcripció d’aquesta (Reznikoff, 1993). Dues IS poden formar un transposó compost i ser capaces de mobilitzar els gens situats entre aquestes. Normalment es troben múltiples còpies d’una mateixa IS al mateix genoma (Galas i Chandler, 1989). Una característica pròpia de les IS és la generació de seqüències repetides directes (DR) al lloc diana on s’insereixen (Craig, 1997). La llargada de les DR, entre 4 i 14 pb, és característica de cada IS, tot i que també existeixen excepcions com la IS91, que no forma repeticions directes en inserir-se a la nova diana (Mendiola et al., 1994) o com

les IS1549, IS1634 o IS1630, que formen llargues DR amb llargades variables (Plikaytis et al., 1998; Calcutt et al., 1999; Vilei et al., 1999). La transposició de les IS normalment és mantinguda en una baixa freqüència, per tal d’evitar un efecte letal per a la cèll. ula (Doolittle et al., 1984). En moltes ocasions s’ha vist com una IS pot actuar com a activadora de l’expressió del gen del costat. Alguns exemples serien la IS21 (Reimmann et al., 1989), la IS30 (Dalrymple, 1987) o la IS257 (Leelaporn et al., 1994). El 1998, més de cinc-centes IS van ser agrupades en diferents famílies segons quatre criteris (Mahillon i Chandler, 1998): l’organització genètica, la transposasa, les IR i les dianes d’inserció. Es van crear disset famílies: IS1, IS3, IS4, IS5, IS6, IS21, IS30, IS66, IS91, IS110, IS200/605, IS256, IS630, IS982, IS1380, ISAs1 i ISL3. Tot i això, encara resten elements per classificar. Una nova classificació dels elements mòbils proposada per Raphaël Leplae et al. (2004) pot trobar-se a la web http:// aclame.ulb.ac.be, on es vol intentar classificar

DIFUSIÓ DE LA RESISTÈNCIA ALS ANTIMICROBIANS

Figura 6. Transposició no replicativa. a) La transposasa talla ambdues cadenes de DNA als extrems del transposó (IR) i es creen dos extrems 3 OH lliures al transposó que s’uneixen als dos extrems 5 PO 4 lliures de la seqüència diana formats també per l’acció de la transposasa. b) Seguidament, els extrems 3 OH que romanen lliures a la seqüència diana faran d’iniciadors i començarà la replicació per a omplir els petits buits deixats a la seqüència diana fins arribar a l’extrem 5 PO 4 del transposó inserit. c) Formació de dues repeticions directes (DR) a banda i banda d’aquest. Aquestes DR seran una duplicació de la diana reconeguda per la transposasa i poden variar entre quatre i tretze bases. El lloc diana és característic de cada transposó, ja que reflecteix la geometria de tall de la transposasa.

tots els tipus d’elements mòbils descrits fins avui. TRANSPOSONS Els transposons (Tn) es caracteritzen per la seva capacitat de moure’s dins el genoma bacterià mitjançant recombinació no homòloga, i poden saltar d’un lloc a un altre del cromosoma o del plasmidi. Aquest moviment s’anomena transposició i es dóna gràcies a la transposasa. Aquesta activitat transposasa roman molt regulada, ja que, igual que passava amb la transposició de les seqüències d’inserció, un elevat índex de transposició seria letal per a la cèll. ula. Els transposons depenen de la replicació del seu hoste, ja que són incapaços de replicar-se autònomament. Poden deixar o no una còpia del seu DNA a la cadena d’origen, depenent si fan una transposició replicativa o no. Els transposons es classifiquen en transposons compostos o de classe 1 i transposons no compostos o de classe 2. Els transposons compostos són segments de

DNA flanquejats per dues seqüències d’inserció iguals o molt similars, que poden estar orientades en el mateix sentit o invertides (vegeu la taula 1). Perquè es pugui portar a terme la transposició només cal que una de les dues IS codifiqui una transposasa (TnpA). Entre les dues IS es troben diferents gens amb funcions molt variades. Els transposons de classe 1 poden tenir diverses IS a la seva estructura i diferents gens que normalment codifiquen resistència a antimicrobians o funcions metabòliques. La transposició dels transposons de classe 1 pot ser complexa, ja que la transposasa pot activar la transposició de les seqüències d’inserció independentment de l’estructura del transposó o bé la recombinació entre les IS pot donar lloc a reorganitzacions en l’estructura del transposó. Els transposons no compostos o de classe 2 no tenen seqüències d’inserció als extrems. Es caracteritzen per tenir a banda i banda repeticions invertides (inverted repeats, IR) que oscill. en entre 30 i 50 pb (vegeu la taula 1). Entre aquestes es troben una sèrie de gens que codifiquen una o més funcions necessàries per a la transposició (tnp), però, a més a més, igual

A. GARCÍA, M. REBOLLO I F. NAVARRO

Taula 1.

Exemples de transposons compostos i no compostos

Transposons compostos: Transposó

Mida (kb)

Elements terminals

Diana (pb)

Tn5

5,7

IS50 (RI)

Tn9

2,5

IS1 (RD)

Tn10

9,3

IS10 (RI)

Tn903

3,1

IS903 (RI)

Tn1525

4,4

IS15 (RD)

Tn1681

4,7

IS1 (RI)

Tn2350

10,4

IS1 (RD)

Mida (kb)

Repeticions invertides terminals

Diana (pb)

Transposons no compostos: Transposó Tn1

38/38

Tn3

4,957

38/38

Tn21

19,6

35/38

Tn501

8,2

35/38

Tn1000

5,8

36/37

Tn2501

6,3

45/48

Tn3926

7,8

36/38

Tn4651

32/38

RI: Repeticions invertides. RD: Repeticions directes.

que els transposons compostos, tenen també altres gens addicionals. També trobem un tipus de transposons capaços de conjugar. Són els anomenats transposons conjugatius, els quals poden transferirse per si mateixos d’una cèll. ula a una altra, ja que disposen dels gens necessaris per a dur a terme aquesta funció. Per a transferir-se d’una cèll. ula a una altra primer s’escindeixen i es circularitzen, una de les cadenes és transferida a l’altra cèll. ula des de l’oriT i un cop allà se sintetitza la cadena complementària i forma de nou una estructura circular capaç d’integrar-se al genoma del nou hoste. Sembla ser que aquesta classe de transposons conjugatius són els principals responsables de la disseminació de resistències a antibiòtics en soques d’estreptococs i en altres bacteris grampositius. Un exemple de transposons conjugatius molt ben estudiats són el Tn916 (Franke i Clewell, 1981) i el Tn1545 (Courvalin i Carlier, 1987).

INTEGRONS I GENS CASSETTE Formant part d’estructures mòbils o situats al cromosoma trobem unes altres estructures que tenen un paper molt important en la captació i mobilització gènica: els integrons (In). S’han trobat molt freqüentment formant part de transposons com el Tn21, el Tn1403, el Tn1404, el Tn1696, el Tn1412 i el Tn2000 (Fluit i Schmitz, 2004). Aquests transposons poden estar localitzats tant al cromosoma com en plasmidis. Aquests plasmidis normalment són grans (més de 100 kb) i conjugatius, i normalment pertanyen als grups d’incompatibilitat IncFI, IncFII o IncL/KM (Fluit i Schmitz, 2004). Els integrons foren descrits a començaments dels anys vuitanta, quan la seqüenciació de diferents gens de resistència va revelar una seqüència comuna a la regió 5 que contenia un promotor i un gen codificador d’una integrasa, similar a les descrites en els bacteriòfags. Els integrons s’han disseminat àmpliament entre moltes espècies de

DIFUSIÓ DE LA RESISTÈNCIA ALS ANTIMICROBIANS

microorganismes. Estan formats per tres elements necessaris per a la captura i expressió de gens exògens: un gen que codifica una integrasa (intI), un lloc de recombinació específic (attI) i un promotor (P ant) per a l’expressió dels gens cassette adjacents. A vegades contenen un segon promotor més fort (P 2), localitzat adjacentment al primer. Els gens que són incorporats als integrons tenen una estructura particular i han estat denominats gens cassette. La integració es produeix per un mecanisme de recombinació específica de lloc a l’attI (format per 65 pb i que inclou el lloc de recombinació i dues regions corresponents als llocs d’unió fort i dèbil de la integrasa), en el qual els gens capturats són integrats gràcies a l’acció de la integrasa IntI. Aquesta integrasa sembla que pertany a la família de les recombinases, ja que presenta les dues regions consensus trobades en la integrasa del fag λ i en altres recombinases (Stokes i Hall, 1989). Els gens cassette capturats pels integrons són molècules de DNA no replicatives que es troben com a DNA circular lliure, i són, per tant, un altre tipus d’element mòbil, però també es poden trobar integrats, formant part d’una molècula de DNA (plasmidi o cromosoma) com a seqüències lineals. En aquest darrer cas, majoritàriament estan inclosos en integrons. Aquests gens cassette, generalment, inclouen un únic gen i en posició posterior presenten una seqüència de recombinació específica, coneguda com a attC o element de cinquanta-nou bases (59-be), la qual permet el seu reconeixement i mobilització per part de la integrasa de l’integró (Stokes et al., 1997). Normalment no contenen promotors; per tant, un cop integrats, s’expressen utilitzant el promotor de l’integró. La transcripció dels gens cassette inserits a l’integró s’inicia a partir d’un mateix promotor i tots són transcrits en un mateix RNA missatger, i es dóna una relativa disminució de la transcripció als gens més distals (vegeu la figura 7). La inserció o escissió dels cassettes dins l’integró té un paper important en la disseminació i la

formació de noves combinacions de gens de resistència als antibiòtics. El fet que molts integrons posseeixin més d’un gen cassette de resistència, juntament amb el fet que molts estan localitzats en elements genètics, com per exemple transposons o plasmidis, que porten determinants de resistència, fa que la selecció a través d’un d’aquests determinants de resistència antimicrobiana seleccioni els altres (selecció en autostop) (Eliasson et al., 1986). La classificació dels integrons es basa en la seqüència codificadora de la integrasa. Actualment se’n coneixen deu classes (Correia et al., 2003), tot i que la denominació de les integrases a partir de la IntI4 és confusa (Fluit i Schmitz, 2004). Els integrons de classe 1 (vegeu la figura 7) són els que es troben amb major freqüència en soques clíniques. Es caracteritzen per tenir una seqüència 5 conservada (5 -CS) que conté el gen codificador de la integrasa. També tenen una seqüència 3 conservada (3 -CS) que inclou el gen que dóna resistència a components d’amoni quaternari (qacEΔ1) i el gen de resistència a sulfamida (sul1); aquests dos gens de resistència no són cassettes, sinó que es troben fixos a l’integró. La longitud d’aquesta regió anomenada 3 -CS és variable al seu extrem 3 , com s’ha descrit en In1, In5 i In10. També s’han caracteritzat integrons de la classe 1 que presenten delecions en aquesta regió 3 -CS, com per exemple els integrons localitzats al Tn5086 i al Tn5090. Així doncs, el contingut i l’extensió del segment 3 -CS pot diferir en cada integró (Hall et al., 1994). Mentre que la majoria dels integrons de la classe 1 tenen l’estructura descrita anteriorment, darrerament s’han descrit integrons inusuals: l’In6, l’In7 (Stokes et al., 1993), un integró descrit al plasmidi pSAL-1 de S. enterica serovar Enteritidis que conté el gen de resistència a β-lactàmics bla DHA-1 i el seu regulador ampR (Verdet et al., 2000), l’In60 portador de la β-lactamasa CTX-M-9 (Sabaté et al., 2002), l’In35 portador de la β-lactamasa CTX-M-2 (Arduino et al., 2002), l’In36 i l’In37 portadors

A. GARCÍA, M. REBOLLO I F. NAVARRO

Figura 7. Integró de classe 1. Format per dues zones conservades anomenades 5 CS i 3 CS i per una part variable on es localitzen els gens cassette. La integrasa codificada per l’integró reconeix l’attC del gen cassette i el lloc receptor attI de l’integró, on el gen cassette serà incorporat. Els gens cassette s’aniran incorporant d’esquerra a dreta; per tant, els primers a ser transcrits seran els últims que s’han incorporat.

del gen de resistència a quinolones qnr i el gen bla DHA-1 (Wang et al., 2003), etc. Aquests integrons són inusuals perquè contenen una segona còpia del segment 3 -CS (vegeu la figura 8). Tots aquests integrons tenen un segment comú de 2,1 kb localitzat entre les dues repeticions 3 -CS, que conté l’orf513, raó per la qual s’anomenen integrons compostos de classe 1 o integrons portadors de l’orf513. Les diverses classes d’integrons són capaces d’adquirir els mateixos gens cassette, la qual cosa indica que el pool d’aquests és compartit. Fins avui, en bacteris gramnegatius s’han descrit més de seixanta gens cassette de resistència (White et al., 2001). Clark et al. (1997) van descriure al cromosoma de Vibrio cholerae una regió de 126 kb amb característiques d’un integró, on s’havien donat més de cent setanta-nou captures de gens cassette, i es va anomenar superintegró (Rowe-Magnus et al., 1999). La importància dels integrons rau en la seva versatilitat, és a dir, en l’habilitat de reconèixer una alta varietat de seqüències de recombinació i en la seva aparentment ill. imitada capacitat d’intercanvi de gens cassette. Aques-

ta flexibilitat permet una ràpida adaptació al flux impredictible dels nínxols ecològics. S’ha observat que els gens cassette examinats sembla que codifiquen funcions adaptatives més que no pas funcions indispensables. Tot i que l’origen dels integrons i dels gens cassette no és clar, hi ha evidències que mostren que els integrons continuen evolucionant. ILLES GENÒMIQUES A més dels bacteriòfags, els plasmidis, els transposons, les seqüències d’inserció, els integrons i els gens cassette, trobem uns altres elements que tenen un paper molt important en el moviment del material genètic: són les illetes genòmiques (< 10 kb) o illes genòmiques (GEI) (> 10 kb). Tots aquests elements mòbils formen part d’un pool flexible de gens que es caracteritzen per codificar funcions no essencials per a la cèll. ula però que li confereixen avantatges enfront de condicions particulars. Normalment, tenen un contingut de G+C i una pauta de lectura diferents respecte

DIFUSIÓ DE LA RESISTÈNCIA ALS ANTIMICROBIANS

IntI1

dfrA16

aadA2

qacE'1

sul1

orf513

blaCTX-M-9

orf3-like

IntI1

aacA4

aadA2 qacE'1

sul1

orf513

catA2

sul1

IntI1

aadB

IntI1

aadA2

qacE'1

IntI1

dfrA16

aadA2 qacE'1

orf1005

qacE'1

sul1

qacE'1

orf5

qacE'1

sul1

orf513

dfrA10

qacE'1

sul1

orf5

sul1

orf513

ampC

ampR

qacE'1

sul1

orf5

ampR

qacE'1

sul1

orf513

qnr

orf5 orf6 IS6100

EcoRII

EcoRI1 Citosina metilasa

IntI1

aac(6')-1b blaOXA-2

orfD qacE'1

sul1

orf513

qnr

ampR qacE'1

sul1

orf5 orf6 IS6100

EcoRII

EcoRI1 Citosina metilasa

IntI1

aac(6')-1b

catB3 blaOXA-30

qacE'1 aar-3

sul1

orf513

blaCTX-M-2

orf3 qacE'1

sul1

Figura 8. Comparació de diferents integrons compostos de classe 1. a) In60 (AF174129) (Sabaté et al., 2002). b) i c) In6 i In7 (Stokes et al., 1993). d) pSAL-1 (Verdet et al., 2000). e) i f ) In36 i In37 (Wang et al., 2003). g) In35 (Arduino et al., 2002).

al cromosoma bacterià. Les illes genòmiques transporten clusters de gens amb funcions específiques que són incorporats al nou DNA en bloc. Aquests blocs de DNA tan particulars es troben molt sovint al costat o inserits dins gens tRNA o tmRNA (molècula que combina les funcions de l’mRNA i el tRNA) (Hacker et al., 1997) del cromosoma de l’hoste: per tant, serà molt freqüent trobar a banda i banda de les illes genòmiques els dos fragments de tRNA. Aquesta característica ha estat utilitzada per autors com Mantri per a detectar aquests tipus d’elements mòbils dins el genoma bacterià (Mantri i Williams, 2004). Les illes genòmiques poden subdividir-se en diferents grups segons els avantatges que confereixen al nou

hoste: illes ecològiques en els microorganismes ambientals, illes saprofítiques, illes de simbiosi o illes de patogenicitat (PAI) en microorganismes que interaccionen amb el seu hoste. S’han localitzat al cromosoma bacterià, tot i que també s’han descrit casos de localització plasmídica. Es creu que provenen de plasmidis o bacteriòfags que han perdut els gens necessaris per a la replicació autònoma i la transferència (Dobrindt et al., 2004), encara que també s’ha vist que en moltes ocasions transporten gens que els confereixen activitats de transferència, recombinació i restricció. La vida hipotètica d’una illa genòmica, descrita segons Dobrindt et al. (2004), podria iniciarse amb la integració d’un element mòbil, com

A. GARCÍA, M. REBOLLO I F. NAVARRO

pot ser un plasmidi o un bacteriòfag, al cromosoma bacterià, mitjançant una recombinació específica de lloc. Un cop allà, el plasmidi, per fenòmens de recombinació, delecions o insercions, perd o queda amb els gens necessaris per a la seva replicació autònoma, mobilització o transferència desactivades, i es crea una illa genòmica. Aquesta pot veure’s sotmesa a constants reorganitzacions, delecions i insercions, que faran que evolucioni. Però pot donarse la inserció d’un element mòbil que supleixi la mancança o desactivació d’aquells gens que s’havien perdut, cosa que provocaria l’escissió de l’illa genòmica del cromosoma i la inserció d’aquesta en una altra diana o, fins i tot, la seva transferència a una altra cèll. ula. Una illa genòmica típica està flanquejada per DR i normalment transporta diverses IS, ja siguin funcionals o fragmentades. Poden transportar també transposases (Hacker et al., 1997) o integrases que actuaran en la integració i escissió de l’illa genòmica (Dobrindt et al., 2004). S’ha vist però, que en algunes illes genòmiques el gen de la integrasa pot estar delecionat o no ser funcional, i per tant són illes genòmiques no mòbils (Osborn i Boltner, 2002). A part d’aquests gens que els confereixen la capacitat de mobilitzar-se, les illes genòmiques es caracteritzen per transportar gens que confereixen avantatges adaptatius o de patogenicitat a la cèll. ula on s’insereixen, com poden ser la producció de toxines, factors d’adherència, la degradació de fenols, la resistència a antibiòtics com la meticill. ina (SCCmec), la fixació de nitrogen, l’expressió d’adhesines, etc. Tot i que en la majoria de casos es desconeix el mètode exacte de transferència d’aquestes illes, una variant de particular interès és l’illa que conté el gens que codifiquen la toxina del xoc tèrmic en S. aureus, que pot ser transferida entre soques mitjançant un fag auxiliador (Lindsay et al., 1998). Altres exemples en què la transferència de l’illa genòmica encara és més clara és en el cas de l’element SXT de V. cholerae (que confereix la resistència a quatre antibiòtics diferents) (Hochhut

i Waldor, 1999) i l’anomenada illa simbiòtica de Mesorhizobium loti (que conté gens per a la simbiosi fixadora de nitrogen) (Sullivan i Ronson, 1998). Ambdós elements són integratius i autotransferibles per conjugació, raó per la qual s’ha suggerit anomenar-los CONSTIN (conjugal self-transmissible integrating element) (Hochhut i Waldor, 1999). BIBLIOGRAFIA Arduino, S. M.; Roy, P. H.; Jacoby, G. A.; Orman, B. E.; Pineiro, S. A.; Centron, D. (2002). «bla CTX-M-2 is located in an unusual class 1 integron (In35) which includes Orf513». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 46, pàg. 23032306. Averhoff, B.; Friedrich, A. (2003). «Type IV pili-related natural transformation systems: DNA transport in mesophilic and thermophilic bacteria». Arch. Microbiol., vol. 180, pàg. 385-393. Avery, O. T.; MacLeod, C. M.; McCarty, M. (1944). «Studies of the chemical nature of the substance inducing transformation of pneumococcal types. Induction of transformation by a desoxyribonucleic acid fraction isolated from Pneumococcus Type III». J. Exp. Med., vol. 79, pàg. 137-158. Bennet, P. (2000). «Transposable elements». A: Lederberg, J. [ed.] Encyclopaedia of Microbiology. San Diego, Ca: Academic Press, vol. 4, pàg. 704-724. Calcutt, M. J.; Lavrrar, J. L.; Wise, K. S. (1999). «IS1630 of Mycoplasma fermentans, a novel IS30-type insertion element that targets and duplicates inverted repeats of variable length and sequence during insertion». J. Bacteriol., vol. 181, pàg. 7597-7607. Canchaya, C.; Fournous, G.; Chibani-Chennoufi, S.; Dillmann, M. L.; Brussow, H. (2003). «Phage as agents of lateral gene transfer». Curr. Opin. Microbiol., vol. 6, pàg. 417-424. Chalmers, R. M.; Kleckner, N. (1994). «Tn10/IS10 transposase purification, activation, and in vitro reaction». J. Biol. Chem., vol. 269, pàg. 8029-8035. Cheetham, B. F.; Katz, M. E. (1995). «A role for bacteriophages in the evolution and transfer of bacterial virulence determinants». Mol. Microbiol., vol. 18, pàg. 201-208. Clark, C. A.; Purins, L.; Kaewrakon, P.; Manning, P. A. (1997). «VCR repetitive sequence elements in the Vibrio cholerae chromosome constitute a mega-integron». Mol. Microbiol., vol. 26, pàg. 1137-1138. Cole, S.; Saint-Girons, I. (1999). «Bacterial genomes: all shapes and sizes». A: Charlebois, R. L. [ed.] Organization of the Prokaryotic Genome. Washington, DC: ASM Press, pàg. 35-62.

DIFUSIÓ DE LA RESISTÈNCIA ALS ANTIMICROBIANS

Correia, M.; Boavida, F.; Grosso, F.; Salgado, M. J.; Lito, L. M.; Cristino, J. M.; Mendo, S.; Duarte, A. (2003). «Molecular characterization of a new class 3 integron in Klebsiella pneumoniae». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 47, pàg. 2838-2843. Courvalin, P.; Carlier, C. (1987). «Tn1545: a conjugative shuttle transposon». Mol. Gen. Genet., vol. 206, pàg. 259264. Craig, N. L. (1997). «Target site selection in transposition». Annu. Rev. Biochem., vol. 66, pàg. 437-474. Dalrymple, B. (1987). «Novel rearrangements of IS30 carrying plasmids leading to the reactivation of gene expression». Mol. Gen. Genet., vol. 207, pàg. 413-420. Dobrindt, U.; Hochhut, B.; Hentschel, U.; Hacker, J. (2004). «Genomic islands in pathogenic and environmental microorganisms». Nat. Rev. Microbiol., vol. 2, pàg. 414424. Doolittle, W. F.; Kirkwood, T. B.; Dempster, M. A. (1984). «Selfish DNAs with self-restraint». Nature, vol. 307, pàg. 501-502. Dubnau, D. (1999). «DNA uptake in bacteria». Annu. Rev. Microbiol., vol. 53, pàg. 217-244. Eliasson, I.; Kamme, C.; Prellner, K. (1986). «Beta-lactamase production in the upper respiratory tract flora». Eur. J. Clin. Microbiol., vol. 5, pàg. 507-512. Eliopoulos, G. M.; Farber, B. F.; Murray, B. E.; Wennersten, C.; Moellering Jr., R. C. (1984). «Ribosomal resistance of clinical enterococcal isolates to streptomycin». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 25, pàg. 398399. Elzen, P. J. van den; Maat, J.; Walters, H. H.; Veltkamp, E.; Nijkamp, H. J. (1982). «The nucleotide sequence of the bacteriocin promoters of plasmids Clo DF13 and Co1 E1: role of lexA repressor and cAMP in the regulation of promoter activity». Nucleic Acids Res., vol. 10, pàg. 1913-1928. Ferretti, J. J.; McShan, W. M.; Ajdic, D.; Savic, D. J.; Savic, G.; Lyon, K.; Primeaux, C.; Sezate, S.; Suvorov, A. N.; Kenton, S.; Lai, H. S.; Lin, S. P.; Qian, Y.; Jia, H. G.; Najar, F. Z.; Ren, Q.; Zhu, H.; Song, L.; White, J.; Yuan, X.; Clifton, S. W.; Roe, B. A.; McLaughlin, R. (2001). «Complete genome sequence of an M1 strain of Streptococcus pyogenes». Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 98, pàg. 4658-4663. Finn Jr., C. W.; Silver, R. P.; Habig, W. H.; Hardegree, M. C.; Zon, G.; Garon, C. F. (1984). «The structural gene for tetanus neurotoxin is on a plasmid». Science, vol. 224, pàg. 881-814. Fluit, A. C.; Schmitz, F. J. (2004). «Resistance integrons and super-integrons». Clin. Microbiol. Infect., vol. 10, pàg. 272-288. Franke, A. E.; Clewell, D. B. (1981). «Evidence for a chromosome-borne resistance transposon (Tn916) in Streptococcus faecalis that is capable of “conjugal” transfer in the absence of a conjugative plasmid». J. Bacteriol., vol. 145, pàg. 494-502. Galas, D. J.; Chandler, M. (1989). «Bacterial insertion

sequences». A: Berg, D.; Howe, M. M. [ed.] Mobile DNA. Washington, DC: American Society for Microbiology, pàg. 109-162. García-de los Santos, A.; Brom, S.; Romero, D. (1996). «Rhizobium plasmids in bacteria-legume interactions». World Journal of Microbiology and Biotechnology, vol. 12. Grinsted, J.; Bennet, P. M. (1988). Plasmid Technology. Londres: Academic Press. Hacker, J.; Blum-Oehler, G.; Muhldorfer, I.; Tschape, H. (1997). «Pathogenicity islands of virulent bacteria: structure, function and impact on microbial evolution». Mol. Microbiol., vol. 23, pàg. 1089-1097. Hakenbeck, R.; Coyette, J. (1998). «Resistant penicillinbinding proteins». Cell. Mol. Life Sci., vol. 54, pàg. 332-340. Hall, R. M.; Brown, H. J.; Brookes, D. E.; Stokes, H. W. (1994). «Integrons found in different locations have identical 5 ends but variable 3 ends». J. Bacteriol., vol. 176, pàg. 6286-6294. Hardy, K. (1986). Bacterial plasmids. Washington, DC: ASM Press. Hochhut, B.; Waldor, M. K. (1999). «Site-specific integration of the conjugal Vibrio cholerae SXT element into prfC». Mol. Microbiol., vol. 32, pàg. 99-110. Jacobs, C.; Frere, J. M.; Normark, S. (1997). «Cytosolic intermediates for cell wall biosynthesis and degradation control inducible beta-lactam resistance in gram-negative bacteria». Cell, vol. 88, pàg. 823-832. Koehler, T. M. (2002). «Bacillus anthracis genetics and virulence gene regulation». Curr. Top. Microbiol. Immunol., vol. 271, pàg. 143-164. Lawley, T. D.; Klimke, W. A.; Gubbins, M. J.; Frost, L. S. (2003). «F factor conjugation is a true type IV secretion system». FEMS Microbiol. Lett., vol. 224, pàg. 1-15. Leelaporn, A.; Firth, N.; Byrne, M. E.; Roper, E.; Skurray, R. A. (1994). «Possible role of insertion sequence IS257 in dissemination and expression of high- and lowlevel trimethoprim resistance in staphylococci». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 38, pàg. 2238-2344. Leplae, R.; Hebrant, A.; Wodak, S. J.; Toussaint, A. (2004). «ACLAME: a classification of mobile genetic elements». Nucleic Acids Res., vol. 32, pàg. D45-D49. Lindsay, J. A.; Ruzin, A.; Ross, H. F.; Kurepina, N.; Novick, R. P. (1998). «The gene for toxic shock toxin is carried by a family of mobile pathogenicity islands in Staphylococcus aureus». Mol. Microbiol., vol. 29, pàg. 527543. Lyon, B. R.; Skurray, R. (1987). «Antimicrobial resistance of Staphylococcus aureus: genetic basis». Microbiol. Rev., vol. 51, pàg. 88-134. Mahillon, J.; Chandler, M. (1998). «Insertion sequences». Microbiol. Mol. Biol. Rev., vol. 62, pàg. 725-774. Mantri, Y.; Williams, K. P. (2004). «Islander: a database of integrative islands in prokaryotic genomes, the associated integrases and their DNA site specificities». Nucleic Acids Res., vol. 32, pàg. D55-D58. Martínez, J. L.; Alonso, A.; Gomez-Gomez, J. M.; Baquero, F. (1998). «Quinolone resistance by mutations in

A. GARCÍA, M. REBOLLO I F. NAVARRO

chromosomal gyrase genes. Just the tip of the iceberg?» J. Antimicrob. Chemother., vol. 42, pàg. 683-688. Mendiola, M. V.; Bernales, I.; Cruz, F. de la (1994). «Differential roles of the transposon termini in IS91 transposition». Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 91, pàg. 19221926. Muniesa, M.; García, A.; Miró, E.; Mirelis, B.; Prats, G.; Jofre, J.; Navarro, F. (2004). «Bacteriophages and diffusion of beta-lactamase genes». Emerg. Infect. Dis., vol. 10, pàg. 1134-1137. Novick, R. P. (1987). «Plasmid incompatibility». Microbiol. Rev., vol. 51, pàg. 381-395. Ochman, H.; Lawrence, J. G.; Groisman, E. A. (2000). «Lateral gene transfer and the nature of bacterial innovation». Nature, vol. 405, pàg. 299-304. Osborn, A. M.; Boltner, D. (2002). «When phage, plasmids, and transposons collide: genomic islands, and conjugative and mobilizable-transposons as a mosaic continuum». Plasmid, vol. 48, pàg. 202-212. Pato, M. (1989). «Bacteriophage Mu». A: Berg, D.; Howe, M. M. [ed.] Mobile DNA. Washington, DC: ASM Press, pàg. 23-52. Plikaytis, B. B.; Crawford, J. T.; Shinnick, T. M. (1998). «IS1549 from Mycobacterium smegmatis forms long direct repeats upon insertion». J. Bacteriol., vol. 180, pàg. 10371043. Prystowsky, J.; Siddiqui, F.; Chosay, J.; Shinabarger, D. L.; Millichap, J.; Peterson, L. R.; Noskin, G. A. (2001). «Resistance to linezolid: characterization of mutations in rRNA and comparison of their occurrences in vancomycin-resistant enterococci». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 45, pàg. 2154-2156. Reimmann, C.; Moore, R.; Little, S.; Savioz, A.; Willetts, N. S.; Haas, D. (1989). «Genetic structure, function and regulation of the transposable element IS21». Mol. Gen. Genet., vol. 215, pàg. 416-424. Reznikoff, W. S. (1993). «The Tn5 transposon». Annu. Rev. Microbiol., vol. 47, pàg. 945-963. Rice, L. B.; Carias, L. L. (1998). «Transfer of Tn5385, a composite, multiresistance chromosomal element from Enterococcus faecalis». J. Bacteriol., vol. 180, pàg. 714-721. Rice, L. B.; Sahm, D.; Bonomo, R. A. (2003). «Mechanisms of resistance to antibacterial agents». A: Murray, P. R.; Baron, E. J.; Jorgensen, J. A.; Pfaller, M. A.; Yolken, R. H. [ed.] Manual of Clinical Microbiology. Washington, DC: ASM Press, vol. 1, pàg. 1074-1101. Rosenblueth, M.; Martínez-Romero, E. (2004). «Rhizobium etli maize populations and their competitiveness for root colonization». Arch. Microbiol., vol. 181, pàg. 337-344. Rowe-Magnus, D. A.; Guerout, A. M.; Mazel, D. (1999). «Super-integrons». Res. Microbiol., vol. 150, pàg. 641-651.

Sabaté, M.; Navarro, F.; Miró, E.; Campoy, S.; Mirelis, B.; Barbé, J.; Prats, G. (2002). «Novel complex sul1-type integron in Escherichia coli carrying bla CTX-M-9». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 46, pàg. 2656-2661. Snyder, L.; Champness, W. (1997). Molecular Genetics of Bacteria. Washington, DC: ASM Press. Stokes, H. W.; Hall, R. M. (1989). «A novel family of potentially mobile DNA elements encoding site-specific gene-integration functions: integrons». Mol. Microbiol., vol. 3, pàg. 1669-1683. Stokes, H. W.; O’Gorman, D. B.; Recchia, G. D.; Parsekhian, M.; Hall, R. M. (1997). «Structure and function of 59-base element recombination sites associated with mobile gene cassettes». Mol. Microbiol., vol. 26, pàg. 731-745. Stokes, H. W.; Tomaras, C.; Parsons, Y.; Hall, R. M. (1993). «The partial 3 -conserved segment duplications in the integrons In6 from pSa and In7 from pDGO100 have a common origin». Plasmid, vol. 30, pàg. 39-50. Sullivan, J. T.; Ronson, C. W. (1998). «Evolution of rhizobia by acquisition of a 500-kb symbiosis island that integrates into a phe-tRNA gene». Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 95, pàg. 5145-5149. Verdet, C.; Arlet, G.; Brnaaud, G.; Lagrange, P. H.; Philippon, A. (2000). «A novel integron in Salmonella enterica serovar Enteritidis, carrying the bla DHA-1 gene and its regulator gene ampR, originated from Morganella morganii». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 44, pàg. 222225. Vilei, E. M.; Nicolet, J.; Frey, J. (1999). «IS1634, a novel insertion element creating long, variable-length direct repeats which is specific for Mycoplasma mycoides subsp. mycoides small-colony type». J. Bacteriol., vol. 181, pàg. 1319-1323. Wang, M.; Tran, J. H.; Jacoby, G. A.; Zhang, Y.; Wang, F.; Hooper, D. C. (2003). «Plasmid-mediated quinolone resistance in clinical isolates of Escherichia coli from Shanghai, China». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 47, pàg. 2242-2248. Waters, V. L. (1999). «Conjugative transfer in the dissemination of beta-lactam and aminoglycoside resistance». Front. Biosci., vol. 4, pàg. D433-D456. Wehrli, W. (1983). «Rifampin: mechanisms of action and resistance». Rev. Infect. Dis., vol. 5 (supl. 3), pàg. S407S411. White, P. A.; McIver, C. J.; Rawlinson, W. D. (2001). «Integrons and gene cassettes in the Enterobacteriaceae». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 45, pàg. 2658-2661.

Antimicrobians (Joaquim Ruiz, ed.) Treballs de la SCB. Vol. 55 (2004) 49-60

SISTEMES D’EXPULSIÓ ACTIVA I LLUR RELACIÓ AMB LA RESISTÈNCIA ALS AGENTS ANTIBACTERIANS Jordi Vila, Javier Sánchez-Céspedes i Anna Ribera Servei de Microbiologia, Centre de Diagnòstic Biomèdic, Hospital Clínic, Facultat de Medicina, Universitat de Barcelona. Adreça per a la correspondència: Jordi Vila. Servei de Microbiologia, Hospital Clínic, Facultat de Medicina, Universitat de Barcelona. Villarroel, 170. 08036 Barcelona. Adreça electrònica: jvila@ub.edu. RESUM Els microorganismes han desenvolupat diversos mecanismes per resistir els efectes tòxics dels agents antibacterians. Entre aquests es troba la disminució de l’acumulació de l’agent antibacterià a l’interior del bacteri, la qual cosa pot ésser deguda a la disminució de la permeabilitat de la membrana externa en els bacteris gramnegatius i a la sobrexpressió de sistemes d’expulsió activa en ambdós tipus de bacteris, gramnegatius i positius. En bacteris gramnegatius la interacció entre aquests dos mecanismes és el que probablement es dóna amb més freqüència. Els sistemes d’expulsió activa s’han dividit en diferents famílies segons llur arquitectura molecular, mecanisme d’acció, requeriments energètics i especificitat de substrat. Aquests sistemes d’expulsió activa s’han de considerar com a potencials dianes terapèutiques, ja que llur inhibició restauraria l’activitat antibacteriana. Així doncs, una possible nova estratègia terapèutica seria el desenvolupament d’inhibidors d’aquests sistemes d’expulsió activa, que serien administrats conjuntament amb l’agent antibacterià que es veuria afectat pel sistema d’expulsió. Paraules clau: bombes d’expulsió, resistència, agents antibacterians. SUMMARY Microorganisms have developed several mechanisms to resist toxic effects from antibacterial agents; among them we found decrease in drug accumulation, which can be due to a decrease of permeability in Gram-negative bacteria or/and to an increased expression of one or more efflux pumps in both Gram-negative and Gram-positive bacteria. Among Gram-negative bacteria the interplay between both mechanisms is frequently found. Active efflux systems can be distributed in several families, depending on their molecular architecture, mechanism of action, energetic requirements and substrate specificity. Those active efflux systems have been considered as potential therapeutic targets, since their inhibition can restore antibacterial agent

J. VILA, J. SÁNCHEZ-CÉSPEDES I A. RIBERA

activity. Therefore, a possible new therapeutic strategy would be found in development of efflux pumps inhibitors, which would be administered together with the antibacterial agent. Keywords: Efflux pumps, resistance, antibacterial agents. INTRODUCCIÓ La coberta cell. ular bacteriana proporciona al bacteri la forma i rigidesa necessàries per resistir la pressió osmòtica generada per l’elevada concentració intracell. ular de ions, metabòlits i macromolècules. A més, constitueix una barrera enfront de certes substàncies tòxiques i biològiques. A les figures 1a i 1b s’observa l’estructura de la coberta cell. ular d’un bacteri grampositiu i d’un gramnegatiu. En un bacteri grampositiu la coberta cell. ular està constituïda fonamentalment pel peptidoglicà, mentre que la coberta d’un bacteri gramnegatiu es caracteritza per la presència d’una membrana externa i un espai periplasmàtic, que es troba delimitat per la membrana citoplasmàtica i la membrana externa. El peptidoglicà està immers en aquest espai. La membrana externa és una bicapa lipídica molt asimètrica. A la monocapa externa hi ha proteïnes i lipopolisacàrid, mentre que a la monocapa interna el lipopolisacàrid és substituït per fosfolípids i lipoproteïnes. El resultat és una membrana amb una fluïdesa menor que la membrana citoplasmàtica. Entre altres components de la membrana externa dels bacteris gramnegatius destaquen unes proteïnes anomenades porines. Es tracta de trímers que generen canals que permeten el pas de substàncies, regulades per un complex mecanisme genètic que respon a la concentració de soluts al medi. En bacteris grampositius, a part del peptidoglicà un altre component de la coberta cell. ular és l’àcid teïcoic, que és un polímer de glicerol fosfat o ribitol fosfat amb diversos sucres o aminoàcids com a substituents. Aquest sembla estar unit al peptidoglicà o bé a un glicolípid de la membrana citoplasmàtica. Finalment, la membrana citoplasmàtica dels bacteris és molt semblant a la típica bicapa li-

pídica d’altres cèll. ules. No obstant això, hi ha diferències importants: per exemple, la membrana citoplasmàtica bacteriana és excepcionalment rica en proteïnes, el cromosoma bacterià s’hi troba unit, i desenvolupa un paper important en la segregació de cromosomes naixents durant la divisió cell. ular. Conté, també, el sistema complet de transport d’electrons de la cèll. ula i proteïnes involucrades en el transport actiu i selectiu de soluts i en l’excreció de proteïnes i altres compostos a l’exterior. QUÈ ÉS UN SISTEMA D’EXPULSIÓ ACTIVA? Els microorganismes han desenvolupat diversos mecanismes per resistir els efectes tòxics dels antimicrobians (vegeu la figura 2), entre els quals es troba la disminució de l’acumulació de l’antibiòtic a l’interior bacterià, la qual cosa pot ésser deguda a diferents factors, tals com una disminució en la permeabilitat de la membrana externa a l’agent antibacterià en el cas dels bacteris gramnegatius i la sobrexpressió de sistemes d’expulsió activa en ambdós tipus de bacteris, gramnegatius i positius. No obstant això, sembla que per si sola la disminució de la permeabilitat no és suficient perquè l’agent antibacterià no assoleixi l’acumulació a l’interior del bacteri, sinó que només hi ha un retard en l’entrada d’aquest (Nikaido, 1994). Avui dia, la funció natural d’aquests sistemes d’expulsió activa encara és una incògnita, i entre altres hipòtesis s’ha especulat que podrien estar implicats en mecanismes de destoxicació i que l’expulsió de fàrmacs seria un efecte coll. ateral. Hom coneix que aquests sistemes eviten sobretot l’acció d’aquells antimicrobians que actuen al cito-

SISTEMES D’EXPULSIÓ ACTIVA I LLUR RELACIÓ AMB LA RESISTÈNCIA ALS AGENTS ANTIBACTERIANS

Figura 1.

a) Coberta cell. ular d’un bacteri gramnegatiu. b) Envolta cell. ular d’un bacteri grampositiu.

plasma bacterià, i ho fan expulsant l’antibiòtic fora de la cèll. ula abans que aquest pugui exercir la seva funció. El 1978 va sorgir una primera hipòtesi de l’existència d’aquests mecanismes amb la descripció de proteïnes de transport en bacteris gramnegatius als quals s’unien els antimicrobians (proteïnes descrites en E. coli capaces d’expulsar tetraciclina fora del citoplasma cell. ular). Des d’aquest descobriment el paper dels sistemes d’expulsió com a mecanisme de resistència als diversos antimicrobians ha estat explorat i caracteritzat, i s’ha arribat a la conclusió que aquests sistemes són comuns a la majoria de bacteris patògens i que són responsables de l’expulsió d’antibiòtics i altres toxines fora de les cèll. ules bacterianes, i asseguren així llur supervivència (Nelson, 2002). Mentre les propietats moleculars d’aquestes proteïnes d’expulsió i llur especificitat de substrat estan tot just començant a comprendre’s en la majoria de gèneres bacterians, incloent-hi E. coli i P. aeruginosa, podem assumir raonablement que la majoria d’antimicrobians i xenobiòtics poden veure’s afectats per aquests sistemes, i això els comporta certa inutilitat per al tractament de malalties infeccioses. Alternativament, podem considerar aquestes bombes d’expulsió com atractives dianes terapèutiques, ja que llur inhibició restauraria l’activitat antibacteriana als substrats expulsats.

En general, el sistema d’expulsió activa en bacteris grampositius consta d’una única proteïna situada a la membrana citoplasmàtica que es troba acoblada al potencial de membrana o obtenint l’energia mitjançant la hidròlisi de l’ATP. En bacteris gramnegatius la majoria de sistemes d’expulsió activa que afecten agents antibacterians estan acoblats al potencial de membrana i estan constituïts per tres proteïnes, tot i que hi ha excepcions, com hom veurà a la següent secció. Aquestes tres proteïnes són: una proteïna transportadora integrada a la membrana citoplasmàtica, una porina situada a la membrana externa i una altra proteïna que actua com a nexe d’unió entre les altres dues i que es troba situada a l’espai periplasmàtic. TIPUS DE SISTEMES D’EXPULSIÓ ACTIVA I LLUR RELACIÓ AMB LA RESISTÈNCIA A DIVERSOS AGENTS ANTIMICROBIANS Les proteïnes d’expulsió activa han estat subdividides en diferents famílies, segons llur arquitectura molecular, els mecanismes d’acció, els requeriments energètics i la constitució bioquímica. Aquestes proteïnes es troben en quasi tots els microorganismes i llur paper com a mecanisme de resistència a antimicrobians està tot just essent elucidat. Així, per

J. VILA, J. SÁNCHEZ-CÉSPEDES I A. RIBERA

! " !

Figura 2. 1) Impermeabilitat de membrana. 2) Hidròlisi de l’antibiòtic. 3) Sobreexpressió de sistemes d’expulsió activa. 4) Canvi conformacional a la proteïna diana.

exemple, s’espera que bacteris potencialment patògens puguin contenir combinacions de proteïnes d’expulsió pertanyents a les diferents famílies. Existeixen diferents tipus de bombes d’expulsió (Putman et al., 2000) (vegeu la figura 3): a) Bombes que són específiques de substrat i, per tant, confereixen resistència a un únic agent antimicrobià (p. ex.: les bombes que expulsen tetraciclina, que pertanyen a la família MFS). Normalment aquestes es troben codificades per gens que viatgen en transposons integrats en plasmidis conjugatius (Lomovskaya i Watkins, 2001). b) Bombes inespecífiques de substrat i que, per tant, s’anomenen transportadors de múltiples agents antimicrobians (MDR, de l’anglès multi-drug resistance), poden conferir resistència a diferents components antibacterians no relacionats estructuralment. Normalment es troben codificades per gens que

formen part del cromosoma bacterià (Lomovskaya i Watkins, 2001). A més, segons els criteris estructurals i bioenergètics aquests sistemes es divideixen en dos grups majoritaris (Putman et al., 2000): a) Transportadors de múltiples antimicrobians del tipus ABC, els quals utilitzen l’energia que prové de la hidròlisi de l’ATP per expulsar els antimicrobians fora de la cèll. ula. b) Transportadors secundaris de múltiples antimicrobians, els quals expulsen l’antibiòtic fora de la cèll. ula a través d’un intercanvi de protons o de ions sodi. De bombes d’aquests tipus tenim les de la família RND, SMR, MFS i MATE (aquesta subdivisió està feta segons la mida que presentin i segons llur estructura primària i secundària). Així, tenim diferents famílies relacionades amb l’expulsió activa i aquestes es divideixen en (Putman et al., 2000; Borges-Walmsley i Walmsley, 2001; Nelson, 2002):

SISTEMES D’EXPULSIÓ ACTIVA I LLUR RELACIÓ AMB LA RESISTÈNCIA ALS AGENTS ANTIBACTERIANS

Figura 3.

Classes de sistemes d’expulsió activa.

a) MFS (de l’anglès major facilitator superfamily): aquesta família de transportadors està formada per proteïnes que presenten dotze o catorze segments transmembranosos (a la membrana citoplasmàtica) i utilitzen el flux de protons com a font d’energia. Aquest tipus de transportadors són presents tant en bacteris grampositius com gramnegatius i també en cèll. ules eucariotes. En els bacteris gramnegatius aquests sistemes es poden associar a una proteïna de fusió de membrana (MFP, de l’anglès membrane fusion protein) i a una proteïna de membrana externa (OMP, de l’anglès outer membrane protein), que forma un canal, per tal de translocar els antimicrobians a través de la membrana interna i externa, i els expulsa fora de la cèll. ula. Cal esmentar, però, que el veritable paper de les MFP és encara desconegut, encara que podrien actuar com una proteïna de canal capaç de translocar els agents antimicrobians entre el transportador de membrana interna i la proteïna de membrana externa. Una altra hipòtesi alternativa seria que les MFP empenyen les dues proteïnes a la vegada, de manera que el transpor-

tador de membrana interna passaria directament l’antibacterià a la proteïna de membrana externa (Borges-Walmsley i Walmsley, 2001). Els principals substrats químics d’aquest tipus de bombes són principalment agents antimicrobians, colorants d’amoni quaternari i ions fòsfor. I els bacteris hoste són principalment (entre parèntesi trobem alguns dels transportadors d’aquesta família descrits en el gènere bacterià): Mycobacterium (Tet V, Tap, LfrA), Lactobacillus (LmrP), Staphylococcus (Tet K, NorA, Qac A i B), Bacillus (Blt, Bmr i Bmr 3), Escherichia (Tet A, B i E, Bcr, Emr B i D, MdfA), Streptococcus (PmrA), Vibrio (VceB) i Corynebacterium (Cmr). b) RND (de l’anglès resistance-nodulation cell division family). L’estructura d’aquests transportadors és més llarga que els que formen part de la família MFS, però només presenten dotze segments transmembranosos (encara que posseeixen uns dominis periplasmàtics i extracitoplasmàtics entre les hèlixs 12, 7 i 8 molt més llargs). Aquests transportadors, tal com els transportadors del tipus MFS, també es troben associats a les MFP i a les

J. VILA, J. SÁNCHEZ-CÉSPEDES I A. RIBERA

proteïnes de membrana externa i utilitzen el flux de protons com a font d’energia. Aquest tipus de transportadors només s’ha descrit en bacteris gramnegatius; no s’han trobat en bacteris grampositius ni en cèll. ules eucariotes. Els principals substrats químics d’aquest tipus de bombes són principalment agents antimicrobians, àcids grassos, detergents i colorants bàsics. I els bacteris hoste són principalment: Escherichia (AcrB, AcrF, YhiV), Pseudomonas (MexB, MexD, MexF, MexY), Neisseria (MtrD), Haemophilus (HI0895 ≈ AcrB), Burkholderia (Ceo B, AmrB), Stenotrophomonas (SmeB i SmeE) i Acinetobacter (AdeB). c) SMR (de l’anglès small multidrug resistance family). En aquesta família els transportadors són molt més petits que els de les famílies MFS i RND, ja que normalment estan formats per quatre fragments transmembranosos. També utilitzen el flux de protons com a font d’energia. Només presenten el transportador a la membrana citoplasmàtica, no es troben associats a cap MFP. S’han descrit tant en bacteris grampositius com gramnegatius, però no en cèll. ules eucariotes. Els principals substrats químics d’aquest tipus de bombes són principalment agents antimicrobians, antisèptics d’amoni quaternari, etidis i tetrafenilfosfats. I els bacteris hoste són principalment: Mycobacterium (Mmr), Staphylococcus (Qac G, H i Smr), Bacillus (EbrA i B, YkkC i D) i Escherichia (EmrE, TehA). d) MATE (de l’anglès multidrug and toxic compound extrusion family). En aquesta família els transportadors estan formats per dotze segments transmembranosos i utilitzen el flux de protons com a font d’energia. S’han trobat tant en bacteris grampositius com gramnegatius. Els principals substrats químics d’aquest tipus de bombes són principalment colorants, fluoroquinolones hidrofíliques i aminoglicòsids. I els bacteris hoste són principalment: Haemophilus, Vibrio (NorM), Bacillus (PmrA) i Escherichia (Ydhe). e) Transportadors del tipus ABC (de l’anglès ATP-binding cassette). Aquests són trans-

portadors que utilitzen com a font d’energia ATP i presenten múltiples segments transmembranosos. Es troben tant en cèll. ules eucariotes com procariotes (tant en bacteris grampositius com gramnegatius). Tenim com a membres: MDR1 humà, que és una P-glicoproteïna de resistència a múltiples antibiòtics, i els transportadors de resistència múltiple en humans associats a la proteïna MRP1 (MRP). Els principals substrats químics d’aquest tipus de bombes són principalment ionòfors, alcaloides d’etidi i fosfolípids. I els bacteris hoste són principalment: Mycobacterium, Staphylococcus (MsrA), Lactobacillus (LmrA) i Escherichia (MsbA, MdlA, MdlB, CydC, CydD). f ) PET (de l’anglès putative eﬄux transporter family). Aquests transportadors han estat trobats recentment en bacteris i en cèll. ules eucariotes, però llur paper en la resistència a agents antimicrobians no ha estat encara establert. REGULACIÓ DEL SISTEMES D’EXPULSIÓ ACTIVA La majoria d’aquests sistemes d’expulsió activa, a més d’estar sotmesos a una regulació local (repressora o activadora) per proteïnes codificades en gens adjacents als del mateix sistema, poden tenir l’expressió controlada a altres nivells. Seria lògic pensar que s’activen en presència de llur substrat natural; no obstant això, hom desconeix la funció real de la majoria d’aquests sistemes d’expulsió i, tot i que hom ha vist que són capaços d’expulsar una àmplia varietat de compostos, fins ara no s’han identificat els substrats naturals en la majoria del casos. Podríem dir que existeixen quatre sistemes de regulació: a) Regulació mitjançant un repressor local. El gen que codifica la proteïna que actua com a repressor està localitzat cap amunt del primer gen de l’operó. En algunes ocasions la repressió no és total, sinó que permet una ex-

SISTEMES D’EXPULSIÓ ACTIVA I LLUR RELACIÓ AMB LA RESISTÈNCIA ALS AGENTS ANTIBACTERIANS

pressió basal que pot estar relacionada amb la resistència intrínseca basal a alguns agents antibacterians. Entre els diferents operons que codifiquen sistemes d’expulsió activa que es troben regulats per un repressor local trobem els sistemes AcrAB en E. coli (Ma et al., 1996) i MexAB-OprM en P. aeruginosa (Evans et al., 2001) (vegeu la figura 4). Generalment, l’aparició de fenotipus de multiresistència està associada a la presència de mutacions als gens reguladors locals o en llurs regions promotores (Jellenritter i Kern, 2001; Ziha-Zarifi et al., 1999; Adewoye et al., 2002). b) Regulació mitjançant un activador local. Fins avui només s’ha identificat aquest tipus de regulació a l’operó mexEF-oprN de P. aeruginosa. L’activador local (mexT) està localitzat cap amunt dels gens de l’operó (Köhler et al., 1999) (vegeu la figura 4). c) Activació mitjançant un sistema de doble component. En general, aquests sistemes de doble component que vehiculen la transducció de senyals estan constituïts per una fosforilasa que rep els estímuls activadors i un regulador de la resposta que s’activa mitjançant fosforilació. Un d’aquests sistemes de doble component descrits en la bibliografia científica és l’EvgSA. EvgA és la proteïna reguladora de la resposta i activa els sistemes d’expulsió activa EmrKY i YhiUV en E. coli (Nishino i Yamaguchi, 2002). L’operó emrKY es localitza cap avall de l’operó regulador evgSA, mentre que, en el cas de l’operó yhiUV, l’activació s’exerceix a distància (vegeu la figura 4). d) Reguladors globals. Grkovic et al. (2001) han indicat que la majoria de sistemes suara esmentats podrien estar regulats globalment. Aquests reguladors globals s’activen en situacions d’estrès bacterià (estrès oxidatiu, estrès osmòtic, xoc tèrmic, etc.) i regulen positivament i negativament l’expressió d’un ampli nombre de gens, entre els quals n’hi ha alguns que codifiquen sistemes d’expulsió activa. En E. coli l’activador global MarA (codificat pel gen marA) regula l’expressió tant positiva com negativa d’almenys seixanta gens (Barbosa i

Levy, 2000) (vegeu la figura 4). Entre aquests gens es troba l’operó acrAB. A més de MarA, s’han identificat tres reguladors globals en E. coli implicats en l’activació d’acrAB. Aquests són SoxS, Rob (Ma et al., 1996) i SdiA (Rahmati et al., 2002) IMPORTÀNCIA CLÍNICA DE LA SOBREEXPRESSIÓ DE SISTEMES D’EXPULSIÓ ACTIVA Com ha estat esmentat anteriorment, aquests sistemes d’expulsió activa es troben normalment reprimits, però sota certes condicions d’estrès microbià llur síntesi pot activarse i generar fenotipus de resistència a agents antibacterians no detectats mitjançant tècniques habituals d’anàlisi al laboratori. Tenint en compte la infinitat de factors d’estrès que s’esdevenen al lloc de la infecció, aquests podrien contribuir a explicar la raó d’algun dels fracassos terapèutics per als quals no tenim actualment explicació. A més, durant la infecció es poden seleccionar mutants amb expressió constitutiva d’aquests sistemes d’expulsió, normalment per mutacions en llurs sistemes de regulació. Aquest fenomen es veu afavorit per dos factors, que són: a) si el bacteri presenta un fenotipus hipermutador, aquest afavoreix l’adquisició de mutacions que poden facilitar la pèrdua de la regulació dels sistemes d’expulsió activa i b) en aquells bacteris amb capacitat de produir bioﬁlm hom ha descrit que pot tenir lloc un increment de sistemes d’expulsió activa. Si bé els primers sistemes d’expulsió activa associats a resistència als agents antibacterians van ésser descrits en bacteris gramnegatius, com E. coli i P. aeruginosa, s’han reportat sistemes similars en la majoria de bacteris d’interès clínic, tant gramnegatius com grampositius. Fins avui, hom ha descrit cinc tipus diferents de sistemes d’expulsió activa en P. aeruginosa que poden afectar diversos agents antibacterians. A causa que

J. VILA, J. SÁNCHEZ-CÉSPEDES I A. RIBERA

! ! "

Figura 4. a) Regulació mitjançant un repressor local. b) Regulació mitjançant un activador local. c) Sistema de doble component. d) Regulador global.

aquest microorganisme ha estat àmpliament estudiat des d’aquest punt de vista, la majoria d’estudis en els quals hom ha intentat esbrinar el paper de la sobreexpressió d’aquests sistemes d’expulsió activa en el desenvolupament de multiresistència durant el tractament s’han realitzat amb aquest microorganisme. Ziha-Zarifi et al. (1999) van estudiar vint-iun malalts amb infeccions per P. aeruginosa en els quals s’havia aïllat una soca multiresistent durant el tractament, i hom va observar

que onze aïllaments multiresistents presentaven una sobreexpressió de MexAB-OprM. Un resultat similar va ésser obtingut per Le Thomas et al. (2001), els quals van aïllar una soca multiresistent de P. aeruginosa a partir d’un malalt tractat amb ciprofloxacina en monoteràpia. La soca multiresistent tenia una CIM de ciprofloxacina de 32 mg/l, mentre que la soca inicial tenia una CIM de 0,25 mg/l. Els investigadors associaren aquest increment a la sobreexpressió de MexAB-OprM. Carmeli

SISTEMES D’EXPULSIÓ ACTIVA I LLUR RELACIÓ AMB LA RESISTÈNCIA ALS AGENTS ANTIBACTERIANS

et al. (1999) fan un seguiment de 271 pacients amb infeccions per P. aeruginosa i tractats amb diverses teràpies antimicrobianes (ciprofloxacina, imipenem, ceftazidima i piperacillina), i observen que en vint-i-vuit pacients (10,2 %) s’aïlla durant el tractament una soca resistent i els resultats indiquen que l’agent antimicrobià que ocasiona aparició de soques multiresistents amb més freqüència és l’imipenem. El millor tractament per a infeccions ocasionades per bacteris en els quals es pot produir amb facilitat una sobreexpressió de sistemes d’expulsió activa no és conegut, però l’optimització de l’agent antibacterià, i també la combinació de diversos agents antibacterians que siguin substrats de diferents sistemes d’expulsió activa poden representar una estratègia terapèutica raonable. INHIBIDORS DELS SISTEMES D’EXPULSIÓ ACTIVA Els mecanismes d’expulsió activa es troben actualment àmpliament reconeguts com a components majoritaris de resistència en diverses classes d’agents antibacterians. Per combatre la resistència mitjançada pels sistemes d’expulsió activa existeixen dues possibilitats: a) Modificacions estructurals dels agents antimicrobians disponibles actualment perquè es vegin afectats mínimament per aquests sistemes. b) Descobriment i desenvolupament d’agents terapèutics capaços d’inhibir l’activitat transportadora de les bombes d’expulsió activa, i que puguin utilitzar-se en combinació amb els antimicrobians més utilitzats en teràpia clínica. Com a exemple, tenim una nova classe de tetraciclines semisintètiques, les glicilciclines, que són capaces d’evitar la resistència mitjançada per bombes d’expulsió activa, ja que no són reconegudes per la proteïna transportado-

ra (Sum et al., 1998). També s’han descobert fluoroquinolones que no es veuen afectades pels sistemes d’expulsió NorA i PmrA presents en bacteris grampositius (Lomovskaya i Watkins, 2001). Recentment, s’ha demostrat l’existència de diverses substàncies capaces d’inhibir aquests sistemes i, per tant, capaces de millorar considerablement l’activitat antibacteriana de molts antibiòtics (Lomovskaya i Watkins, 2001). Abans d’utilitzar un determinat inhibidor, primer s’ha de demostrar la seva bona farmacocinètica, la seva mínima toxicitat i la compatibilitat amb els diferents agents antimicrobians amb els quals s’administrarà. A més, s’han de detectar els agents antimicrobians i les dianes bacterianes en les quals serà més productiu emprar-los. Els factors que s’han de tenir en compte per assegurar-ne l’òptima activitat i, per tant, aconseguir una eficiència clínica total, són (Lomovskaya i Watkins, 2001): — Estudiar la prevalença de la resistència mitjançada pels sistemes d’expulsió. — Avaluar la multiplicitat de les bombes d’expulsió activa. — Estudiar l’existència d’altres factors responsables de resistència a un determinat agent antibacterià. — Estudiar la interacció entre diferents mecanismes de resistència. A més, per qualificar aquests compostos com a bons i veritables inhibidors s’han de complir els criteris següents (Lomovskaya i Watkins, 2001): — Han de potenciar l’activitat dels múltiples substrats de la bomba a inhibir. — No han de potenciar l’activitat dels agents antimicrobians que no són expulsats per la bomba. — No han de tenir activitat en soques bacterianes que no presenten bombes d’expulsió activa. — Han d’augmentar l’acumulació intracellular i disminuir l’expulsió dels substrats de les bombes.

J. VILA, J. SÁNCHEZ-CÉSPEDES I A. RIBERA

Taula 1. Inhibidors

Inhibidors de sistemes d’expulsió activa (Lomovskaya i Watkins, 2001)

Bombes inhibides Transportadors especíﬁcs

13-CPTC a

Agents antimicrobians Transportadors MDR d

afectats (↓ CMI e)

Tet A

Doxiciclina

Tet B

Tetraciclina, doxiciclina

UK-57,562

Tet C

Tetraciclina

Ro 07-3149

Tet K

Tetraciclina

Reserpina

NorA, PmrA, MdfA, EmrE

Fluoroquinolones

INF 55,271

NorA, PmrA

Fluoroquinolones

MC-207,110

Mex, AcrAB

Levofloxacina, ciprofloxacina

CCCP b

AcrAB c

Fluoroquinolones, tetraciclina, cloramfenicol

a 13-CPTC: 13-ciclopentil tetraciclina. b CCCP: carbonil cianida m-clorfenilhidrazona. És un inhibidor del flux de protons (PMF, de l’anglès proton motive force). c Okusu et al., 1996; Li et al., 1994. d MDR: de l’anglès multidrug resistance. e CMI: Concentració mínima inhibitòria.

— No han d’afectar el flux de protons que es produeix a la membrana interna. Aquest esquema s’ha utilitzat amb èxit per identificar inhibidors de la bomba NorA de S. aureus i les bombes Mex de P. aeruginosa. Normalment, els compostos sintètics o extractes de productes naturals capaços d’inhibir el creixement bacterià en presència però no en absència d’agents antimicrobians serien ideals com a inhibidors. A la taula 1 trobem els inhibidors més importants de sistemes d’expulsió activa tant de bacteris grampositius com gramnegatius (Lomovskaya i Watkins, 2001). Podem dir que els inhibidors que han mostrat més activitat enfront de bombes d’expulsió de múltiples antimicrobians, i que, per tant, tindrien una repercussió més important, són la reserpina i l’MC-207,110. a) La reserpina (vegeu la figura 5) és un alcaloide que primerament va ésser conegut com a inhibidor de les bombes d’expulsió activa de bacteris grampositius, el sistema Bmr de B. subtilis (Neyfakh et al., 1991) i NorA de S. aureus, que fa que les soques que la presenten manifestin un increment en la sensibilitat enfront de les fluoroquinolones hidrofíliques, però no hidrofòbiques (Kaatz i Seo, 1997), i en

soques de S. pneumoniae on s’ha trobat que és capaç de disminuir la CIM de certes fluoroquinolones. A més, cal esmentar que el tractament amb reserpina de soques de S. aureus i S. pneumoniae no solament inhibeix els transportadors actius sinó que també és capaç de prevenir l’emergència de resistència en aquestes soques (Markham i Neyfakh, 1996; Markham, 1999). També, s’ha descrit la seva activitat en bacteris gramnegatius, com en el cas de Bacteroides fragilis (Miyamae et al., 1998; Peterson et al., 1999). b) MC-207,110: Fenil-arginil-β-naftilamida (vegeu la figura 6). És un dipèptid d’amida sintètic de baix pes molecular (Renau et al., 1999). S’ha demostrat que posseeix una mínima activitat antibacteriana intrínseca i que inhibeix els sistemes d’expulsió activa de tipus Mex de P. aeruginosa, i disminueix la CIM de levofloxacina en un mínim de vuit vegades (Renau et al., 1999). També inhibeix el sistema AcrAB d’E. coli i de S. typhimurium (Mazzariol et al., 2000; Baucheron et al., 2002). Com a punt important cal destacar la necessitat d’incentivar i insistir en la recerca de nous compostos d’aquest tipus capaços d’inhibir els sistemes d’expulsió activa presents

SISTEMES D’EXPULSIÓ ACTIVA I LLUR RELACIÓ AMB LA RESISTÈNCIA ALS AGENTS ANTIBACTERIANS

Figura 6. 207,110.

Figura 5. reserpina.

Estructura química de la molècula de

en la majoria de bacteris (tant grampositius com gramnegatius) i, per tant, capaços de potenciar l’efecte de l’agent antimicrobià amb el qual s’administrin. Aquests compostos podrien aportar una gran quantitat d’efectes beneficiosos, però manquen encara molts estudis perquè aquests inhibidors puguin ésser introduïts en clínica i perquè puguin estar totalment acceptats per la comunitat mèdica. BIBLIOGRAFIA Adewoye, L.; Sutherland, A.; Srikumar, R.; Poole, K. (2002). «The MexR represor of the mexAB-oprM multidrug efflux operon in Pseudomonas aeruginosa: characterization of mutations compromising activity». J. Bacteriol., vol. 184, pàg. 4308-4312. Barbosa, T.; Levy, S. B. (2000). «Diferential expression of over 60 chromosomal genes in Escherichia coli by constitutive expression of MarA». J. Bacteriol., vol. 182, pàg. 34673474. Baucheron, S., Imberechts, H.; Chaslus-Dancla, E.; Cloeckaert, A. (2002). «The AcrAB multidrug transporter plays a major role in high level fluoroquinolone resistance in Salmonella enterica serovar Typhimurium phage type DT204». Microb. Drug Resist., vol. 8, pàg. 281289. Borges-Walmsley, M. I.; Walmsley, A. R. (2001). «The structure and function of drug pumps». Trends in Microbiol., vol. 9, pàg. 71-79. Carmeli, I.; Troillet, N.; Eliopoulos, G. M.; Samore, M. H. (1999). «Emergence of antibiotic-resistant Pseudomonas aeruginosa: Comparison of risks associated with

Estructura de la molècula de MC-

different antipseudomonal agents». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 43, pàg. 1379-1382. Evans, K.; Adewoye, L.; Poole, K. (2001). «MexR repressor of the mexAB-oprM multidrug efflux operon of Pseudomonas aeruginosa: identification of MexR binding sites in the mexA-mexR intergenic region». J. Bacteriol., vol. 183, pàg. 807-812. Grkovic, S.; Brown, M. H.; Skurray, R. A. (2001). «Transcriptional regulation of multidrug efflux pumps in bacteria». Semin. Cell Dev. Biol., vol. 12, pàg. 225-237. Jellenritter, A. S.; Kern, W. V. (2001). «Enhanced expression of multidrug efflux pumps AcrAB and AcrEF associated with insertion element transposition in Escherichia coli mutants selected with a fluoroquinolone». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 45, pàg. 1467-1472. Kaatz, G. W.; Seo, S. M. (1997). «Mechanisms of fluoroquinolone resistance in genetically related strains of Staphylococcus aureus». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 41, pàg. 2733-2737. Köhler, T.; Epp, S. F.; Curty, L. K.; Pechere, J. C. (1999). «Characterization of MexT, the regulator of the MexEMexF-OprN multidrug efflux system Pseudomonas aeruginosa». J. Bacteriol., vol. 181, pàg. 6300-6305. Le Thomas, I.; Covetdic, G.; Clermont, O.; Brahimi, N.; Plasiat, P.; Bingen, E. (2001). «In vivo selection of a target/efflux double mutant of Pseudomonas aeruginosa by ciprofloxacin therapy». J. Antimicrob. Chemother., vol. 48, pàg. 553-555. Li, X. Z.; Livermore, D. M.; Nikaido, H. (1994). «Role of efflux pump(s) in intrinsic resistance of Pseudomonas aeruginosa: resistance to tetracycline, chloramphenicol and norfloxacin». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 38, pàg. 1732-1741. Lomovskaya, O.; Watkins, W. (2001). «Inhibition of efflux pumps as a novel approach to combat drug resistance in bacteria». J. Mol. Microbiol. Biotechnol., vol. 3, pàg. 225-236. Ma, D.; Alberti, M.; Lynch, C.; Nikaido, H.; Hearst, J. E. (1996). «The local repressor AcrR plays a modulating role in the regulation of acrAB genes of Escherichia coli by global stress signals». Mol. Microbiol., vol. 19, pàg. 101-112. Markham, P. N. (1999). «Inhibition of the emergence of ciprofloxacin resistance in Streptococcus pneumoniae by the

J. VILA, J. SÁNCHEZ-CÉSPEDES I A. RIBERA

multidrug efflux inhibitor reserpine». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 43, pàg. 988-989. Markham, P. N.; Neyfakh, A. A. (1996). «Inhibition of the multidrug transporter NorA prevents emergence of norfloxacin resistance in Staphylococcus aureus». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 40, pàg. 2673-2674. Mazzariol, A.; Tokue, Y.; Kanegawa, T. M.; Cornaglia, G.; Nikaido, H. (2000). «High-level fluoroquinolone-resistant clinical isolates of Escherichia coli overproduce multidrug efflux protein AcrA». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 44, pàg. 3441-3443. Miyamae, S.; Nikaido, H.; Tanaka, Y.; Yoshimura, F. (1998). «Active efflux of norfloxacin by Bacteroides fragilis». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 42, pàg. 2119-2121. Nelson, M. L. (2002). «Modulation of antibiotic efflux in bacteria». Cur. Med. Chem-Antiinfect. Agents., vol. 1, pàg. 3. Neyfakh, A. A.; Bidnenko, B. E.; Chen, L. B. (1991). «Efflux-mediated multidrug resistance in Bacillus subtilis: similarities and dissimilarities with the mammalian system». Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 88, pàg. 4781-4785. Nikaido, H. (1994). «Prevention of drug access to bacterial targets: Permeability barriers and active efflux». Science, vol. 264, pàg. 382-388. Nishino, K.; Yamaguchi, A. (2002). «EbgA of the twocomponent signal transduction system modulates production of the YhiUV multidrug transporter in Escherichia coli». J. Bacteriol., vol. 184, pàg. 2319-2323. Okusu, H. D.; Ma, D.; Nikaido, H. (1996). «AcrAB efflux pump plays a major role in the antibiotic-resistance phe-

notype of Escherichia coli multiple-antibiotic-resistance (mar) mutants». J. Bacteriol., vol. 178, pàg. 306-308. Peterson, M. L.; Hovde, L. B.; Wright, D. H.; Hoang, A. D.; Raddatz, J. K.; Boysen, P. J.; Rostchofer, J. C. (1999). «Fluoroquinolone resistance in Bacteroides fragilis following sparfloxacin exposure». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 43, pàg. 2251-2255. Putman, M.; Veen, H. W. van; Konings, W. N. (2000). «Molecular properties of bacterial multidrug transporters». Microbiol. Molec. Rev., vol. 64, pàg. 672-693. Rahmati, S.; Yang, S.; Davidson, A. L.; Zechiedrich, E. L. (2002). «Control of the AcrAB multidrug efflux pump by quorum-sensing regulator SdiA». Mol. Microbiol., vol. 43, pàg. 677-685. Renau, T. E.; Leger, R.; Flamme, E. M.; Sangalang, J.; She, M. W.; Yen, R.; Gannon, C. L.; Griffith, D.; Chamberland, S.; Lomovskaya, O.; Hecker, S. J.; Lee, V. J.; Ohta, T.; Nakayama, K. (1999). «Inhibitors of efflux pumps in Pseudomonas aeruginosa potentiate the activity of the fluoroquinolone antibacterial levofloxacin». J. Med. Chem., vol. 42, pàg. 4928-4931. Sum, P. E.; Sum, F. W.; Projan, S. J. (1998). «Recent developments in tetracycline antibiotics». Curr. Pharm. Des., vol. 4, pàg. 119-132. Ziha-Zarifi, I.; Llanes, C.; Köhler, T.; Pechere, J. C.; Plesiat, P. (1999). «In vivo emergence of multidrug resistant mutants of Pseudomonas aeruginosa overexpressing the active efflux system MexA-MexB-OprM». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 43, pàg. 287-291.

Antimicrobians (Joaquim Ruiz, ed.) Treballs de la SCB. Vol. 55 (2004) 61-66

ANTIBIOTICOTERÀPIA EN LA PRÀCTICA DE LA MEDICINA TROPICAL Manel Corachan Centre de Salut Internacional, Hospital Clínic, IDIBAPS. Adreça per a la correspondència: Manel Corachan. Centre de Salut Internacional, Hospital Clínic, IDIBAPS. Villarroel, 170. 08036 Barcelona. Adreça electrònica: corachan@ub.edu. RESUM Els tractaments antibiòtics són de fàcil accés als països anomenats del primer món, però als països de baixa renda la majoria dels agents emprats a les nostres àrees són econòmicament inaccessibles, la qual cosa fa que es facin servir agents antics, amb potència més limitada, i sovint sense la informació microbiològica adient. En aquest article es fa una ullada a la situació d’aquests països, i també als agents més emprats. Paraules clau: països de baixa renda, antibiòtics, problemes de salut. SUMMARY Antibiotic treatments are something usual in developed countries; however, in developing areas, a great number of those agents used in our areas is economically non-accessible. This fact results in the use of ancient antibiotics, with a limited potency, and usually without the necessary microbiological information. In this chapter it is performed an analysis of the situation in these countries, either with a vision of the agents used in them. Keywords: developing countries, antibiotics, health problems. INTRODUCCIÓ En aquest article ens limitarem a descriure la utilització de l’antibioticoteràpia i els seus problemes en la pràctica de la medicina, però només pel que fa a l’àrea intertropical. El treball mèdic en aquesta zona geogràfica coincideix amb una situació socioeconòmica particular, com és la dels països de baixa

renda (PBR), la qual cosa condiciona enormement l’actuació mèdica. En realitat no es tracta de problemes de salut que afectin persones que viuen en una zona geogràfica d’elevades temperatures; es tracta d’aquells problemes que es relacionen amb una situació d’extrema pobresa. Aquesta situació condiciona les decisions dels ministeris de salut pel que fa a l’abastament d’antimicrobians. Així, lluny

M. CORACHAN

d’adquirir les darreres novetats del mercat, s’inclinen per aquells d’àmplia utilització i provada eficàcia, comprovada en països industrialitzats, que ja han baixat llurs preus. Tal com el metge hospitalari en un país industrialitzat que s’enfronta a una malaltia provinent del tròpic disposarà d’amplis mitjans diagnòstics i terapèutics, aquell que treballi als PBR es veurà molt limitat en aquests aspectes. Enfront d’un diagnòstic precís, com en la situació de no-diagnòstic davant una malaltia infecciosa, el clínic hauria de prendre la decisió terapèutica més adient i racional. Amb això assenyalem ja que en la pràctica de la medicina al tròpic és freqüent que es duguin a terme tractaments d’antibioticoteràpia a cegues, amb tots els condicionants que això implica. Principalment la facilitat amb què es produirà una selecció d’organismes resistents, que podrà ésser seguida d’infeccions creuades en nous hostes. Per tant, en aquest medi serà d’una gran importància l’actitud del metge i la seva decisió terapèutica. LA PRESA DE DECISIONS No hi ha dubte que moltes malalties infeccioses es resolen per si mateixes. D’altres, no obstant això, evolucionaran envers complicacions més o menys severes, i deixaran importants seqüeles, i fins i tot portaran el malalt a la mort. En tot aquest procés, com portarà a terme el metge clínic la seva presa de decisions? Tractarà o no tractarà? De què disposo per a tractar? Quant de temps tractaré? Sense cap mena de dubte, els condicionadors socioeconòmics són molt importants en aquesta presa de decisions. Així, la pràctica d’aquesta medicina requereix metges amb una excell. ent formació clínica, amb la qual hauria d’extreure la màxima informació de l’examen físic del malalt, atesa la penúria de mitjans tecnològics. Les antigues escoles de medicina sovint posaven un gran èmfasi en la semiologia clínica i

produïen metges que restaven més ben dotats per a aquestes tasques que no pas el joves metges que surten de les nostres facultats, mimats pels avenços de la biotecnologia que inhibeix la pràctica de l’examen clínic del malalt. En tot cas, és aquesta una situació en la qual el metge es troba sovint confrontat a una situació de desconeixement etiològic que l’empeny a decidir un tractament ex juvantibus recolzat en la presència d’una síndrome determinada. Això també pot tenir lloc al nostre medi, però de nou ens trobem amb impediments i trets diferencials. Així, als nostres hospitals disposarem d’antibiòtics de molt ampli espectre, que presenten més garanties de curació en una situació de tractament a cegues. Als PBR no se sol trobar aquesta mena d’antibioticoteràpia a la farmacopea estatal oficial, malgrat que un reduït nombre de tractaments amb antibiòtics d’ampli espectre es pot trobar en alguns centres privats o en dosis aïllades que arriben al país per mitjà de donacions esporàdiques. Freqüentment ens trobem davant situacions en què l’elecció de l’antibiòtic no es basa en els principis racionals en els quals vàrem ésser formats. Les mostres obtingudes, sang o pus, no es podran processar excepte en hospitals de referència (menys que dits té la mà). Una teràpia antibiòtica anterior no podrà ésser precisada en molts casos. Tampoc disposarem de les dades locals sobre la susceptibilitat antibiòtica dels patògens locals. És a dir, no podrem seguir un algorisme lògic que desemboqui en la prescripció adient, tal i com se’ns aconsella en una formació de microbiologia clínica: un cop tenim la història i l’examen físic del pacient, haurem de refiar-nos del nostre diagnòstic provisional i simplement considerar si és necessària una teràpia coadjuvant, com podria ésser el drenatge quirúrgic d’una collecció purulenta (Whitty i Mabey, 2004). La manipulació en el laboratori de les mostres recollides serà una exclusiva dels escassos centres de referència a cada país. La via per la qual haurem d’administrar l’antibiòtic també és motiu de reflexió. El ni-

ANTIBIOTICOTERÀPIA EN LA PRÀCTICA DE LA MEDICINA TROPICAL

vell d’asèpsia que regna a la majoria d’aquests països és baix, la qual cosa condiciona el manteniment de les vies endovenoses i també augmenta la possibilitat de transmetre per via parenteral amb agulles intramusculars no estèrils. El tètan i la infecció per VIH són dos exemples de suficient entitat per a fer-nos reflexionar sobre la conveniència i la durada dels tractaments per via parenteral, pel perill inherent que suposen. Tots els comentaris referits a les dificultats i penúries poden ésser vàlids per a zones rurals en PBR de qualsevol continent, però poden ésser estesos als hospitals regionals quan es tracta del continent africà, on exclusivament els hospitals de referència poden disposar de mitjans diagnòstics i terapèutics d’un millor nivell. CLASSES D’ANTIBIÒTICS MÉS EMPRATS I LLURS INDICACIONS Generalitats Els patrons d’activitat i de resistència antibiòtica als PBR porten un cert parall. elisme amb el que ocorre als països industrialitzats, però amb un cert retràs històric. Així, per exemple, la resistència de Streptococcus pneumoniae a la penicill. ina es xifra en un 5 % en països de l’Àfrica de l’est. Ningú no dubta que la tendència anirà in crescendo i que serà necessari seguir-ne l’evolució, i també la de la variabilitat entre països d’aquesta i d’altres zones geogràfiques. En tot cas, els aspectes particulars de resistència al món occidental, com ara el problema de l’MRSA (Staphylococcus aureus resistent a la meticill. ina), l’enterococ resistent a la vancomicina o l’alt nivell de resistència a la gentamicina no són encara preocupants als PBR. Malgrat això, sí que veiem amb notable aprensió el desenvolupament de Mycobacterium tuberculosis multiresistents, que ja és motiu de preocupació en alguns països de l’Àfrica.

L’activitat dels antibiòtics a l’àrea de la medicina tropical no es redueix tan sols a llur activitat antibacteriana, ja que alguns, com les tetraciclines, el cotrimoxazole o el metronidazole, tenen una reconeguda acció antiparasitària sobre els protozous. Indirectament també són útils a una malaltia per nematodes filariformes, com és el cas de l’oncocercosi o «ceguesa dels rius». Els bacteris simbionts que viuen als teixits dels helmints adults (macrofilàries) són susceptibles a les tetraciclines, i així l’ús de les tetraciclines combinat amb filaricides permet una millor acció contra les macrofilàries i escurçar els tractaments.

Les penicill. ines Amoxicill. ina, ampicill. ina i penicill. ina G són antibiòtics distribuïts al tròpic, fins i tot en petits centres assistencials. Continuen essent tractament de primera línia per a infeccions respiratòries (les més freqüents són aquelles causades per S. pneumoniae) i per a quadres meningítics de l’adult (causats principalment per Neisseria meningitidis i S. pneumoniae). Les freqüents cell. ulitis i ferides infectades es beneficiarien d’una antibioticoteràpia amb amoxicill. ina amb clavulànic o amb flucloxacina, però rarament es troben en centres estatals de PBR, especialment en aquells de l’Àfrica, on únicament es pot trobar la cloxacill. ina en alguns centres. La penicill. ina V és emprada en profilaxi a llarg termini per a dos problemes prevalents als PBR, com són les quimioprofilaxis secundàries de la febre reumatoide i també en casos d’anèmia drepanocítica.

Cefalosporines Aquelles que es poden trobar més freqüentment en situacions rurals en PBR corresponen a les de primera generació, ja que llur preu,

M. CORACHAN

actualment, s’ha abaratit d’una manera relativa. Amb això no es guanya pas gaire a l’hora d’ampliar l’espectre de les penicill. ines. És veritat que disposarem d’alguna activitat sobre determinats bacils gramnegatius però no n’hi haurà pas sobre N. meningitidis, la qual cosa seria sense cap mena de dubte d’una gran vàlua als PBR. La cefuroxima, la ceftazidima, la cefotaxima i la ceftriaxona, que permetrien tractar un gran nombre d’infeccions, tant causades per grampositius com per gramnegatius, solament són incloses en alguns programes de donacions altruistes, i és necessari restar a l’aguait de les dates de caducitat, que sovint són un greu contratemps d’aquests tipus de programes.

Tetraciclines En aquest grup d’antimicrobians hem de tenir especial atenció amb allò que ha estat esmentat sobre les caducitats, ja que aquests antibiòtics no tan sols perdran activitat, sinó que es tornaran activament tòxics. Llur utilització en el camp de la medicina tropical té un ampli espectre d’actuació, però és molt selectiu de certes infeccions: aquest és el cas de les infeccions per Chlamydia, com algunes uretritis i el tracoma, que gaudeixen d’una molt àmplia distribució. En el cas d’infeccions per Vibrio cholerae que requereixen quimioteràpia (sovint guariran amb rehidratació oral) es preferiran tetraciclines d’acció perllongada com, per exemple, la doxiciclina (OMS, 1993). També és el cas de les infeccions vehiculades per paparres, com és el cas de les borreliosis, rickettsiosis i febre Q (Coxiella). Altres utilitzacions puntuals serien el cas de les pneumònies atípiques i de la brucell. osi. Finalment cal recordar que llur activitat no és tan sols antibacteriana, sinó que inclou protozous com Entamoeba histolytica i Plasmodium sp. (Bannister, 2000).

Cloramfenicol Contràriament al que té lloc a Europa, on pràcticament s’ha fet desaparèixer, la seva utilització és molt estesa als PBR. Sense cap mena de dubte, una de les raons principals la trobem en el seu preu, però també s’ha de tenir en compte el seu ampli espectre, que cobreix tant grampositius com gramnegatius. La seva màxima prescripció és en els quadres meningítics de la infantesa, ja que és actiu enfront de N. meningitidis, S. pneumoniae i Haemophilus inﬂuenzae. En situacions epidèmiques el tractament amb dosi única per via parenteral de la forma oliosa ha demostrat la seva alta eficàcia (Greenwood, 2000). Tanmateix, és útil en infeccions per rickèttsies, quan hi ha contraindicacions per a emprar tetraciclines, i també per a tractar febre tifoidea. La preparació tòpica d’ús oftàlmic és de distribució cosmopolita. Encara que s’ha de tenir en compte el risc d’una anèmia aplàstica, s’ha comprovat que en la pràctica els casos idiosincràtics són raríssims i no justifiquen la no-prescripció del medicament, encara que resten els casos on la descurança mèdica provocaria una acumulació tòxica suficient que podria conduir a l’anèmia aplàstica.

Aminoglicòsids El primer a ésser descobert va ésser l’estreptomicina, encara àmpliament utilitzada en la primera fase del tractament de la tuberculosi en un bon nombre de PBR, encara que és, tanmateix, activa en el tractament de la brucell. osi. El més incorporat a la farmacopea d’un gran nombre de països i molt emprat davant la sospita d’infeccions per gramnegatius és la gentamicina, encara que no és activa enfront de N. meningitidis. Sovint s’afegeix a la penicill. ina en quadres sèptics, atesa l’existència d’un efecte sinèrgic. Atesa la manca de recursos diagnòstics (hemocultius) a la gran

ANTIBIOTICOTERÀPIA EN LA PRÀCTICA DE LA MEDICINA TROPICAL

majoria d’hospitals, en els casos clínicament sèptics i amb toxèmia se sol emprar a cegues una combinació assequible com és gentamicina + penicill. ina + metronidazole. De nou aquí (com hem esmentat abans per al cloramfenicol), haurem d’estar a l’aguait per evitar tractaments massa perllongats, ja que poden concloure en una toxicitat renal i del nervi auditiu. La neomicina és un altre aminoglicòsid d’ús freqüent als PBR, que sol emprar-se per a aplicacions tòpiques en oftalmologia i otorinolaringologia. La kanamicina, amikacina, netilmicina i tobramicina no solen estar presents en la farmacopea oficial dels ministeris de salut i llur presència als hospitals sol ésser producte de l’atzar.

front de grampositius i gramnegatius (la seva sinergia és més evident in vitro que in vivo), i és d’utilitat en la pràctica de la medicina tropical per als tractaments de Brucella sp., Haemophilus ducreyi i la infecció oportunista per Pneumocystis carinii. D’especial interès és la seva utilitat en els casos de micetomes bacterians, és a dir, no fúngics, que són produïts per espècies de Nocardia, Actinomadura i Streptomices (Welsh, 1991). També, l’important paper que podia tenir en el tractament de les pneumònies de S. pneumoniae s’ha esvaït amb la creixent resistència d’aquest microorganisme, que a les àrees tropicals és deguda, probablement, a la seva àmplia i cosmopolita utilització en el programa d’infeccions respiratòries agudes (IRA) de l’OMS.

Macròlids El que es troba amb més gran regularitat als PBR és l’eritromicina. Posseeix un ampli ventall d’indicacions, i és el substitut indicat de la penicill. ina en casos d’all. èrgia a la mateixa. Es troba indicada en situacions de pneumònia atípica i en la malaltia inflamatòria pèlvica de l’embaràs (afegint metronidazole des del segon semestre), on romandrien contraindicades les tetraciclines. Tanmateix, en les malalties de transmissió sexual (MTS), és indicada per a tractar infeccions de Clamydia. Altres macròlids com l’azitromicina, la claritromicina o l’espiromicina es troben únicament en situacions excepcionals. L’exemple més clar són els països que estan inclosos en el programa de l’OMS per a lluitar contra el tracoma, i que es denomina SAFE (de l’anglès surgery, antibiotics, facial cleaness and environment). Dins aquest programa l’antibiòtic d’elecció és l’azitromicina, com a antibiòtic contra Chlamydia trachomatis (Huper, 2003).

Trimetoprim/sulfametoxazole Posseeix un ampli espectre d’activitat en-

Metronidazole Malgrat la seva activitat exclusiva davant gèrmens anaerobis, no podem oblidar la seva activitat antiprotozoària (de manera principal davant Giardia lamblia, Trichomonas vaginalis, Balantidium coli i E. histolytica). Així, la quimioprofilaxi en cirurgia abdominal i ginecològica als PBR ha de fer-se obligatòriament amb aquest antibiòtic, atesa l’elevada freqüència d’aquests microorganismes al tracte intestinal dels habitants d’aquells països. Tanmateix, pot ésser emprat en el tractament coadjuvant d’abscessos tissulars: cerebrals, hepàtics, pulmonars i peridentals.

Quinolones L’únic membre d’aquest grup que té una distribució cosmopolita és l’àcid nalidíxic, ja que la resta de les fluoroquinolones mantenen preus inassequibles per a la majoria de governs de PBR. En alguns d’aquests països amb una extensa xarxa de generalistes amb pràctica privada, com és el cas de l’Índia, comencen

M. CORACHAN

a assenyalar-se casos de resistència a ciprofloxacina (Vila, 2000). L’àcid nalidíxic, útil en infeccions urinàries, ha provat també la seva eficàcia en diverses situacions de desastre (inundacions, camps de refugiats...) que varen ésser seguides d’epidèmies de diarrea disentèrica produïda per Shigella sp. resistent als fàrmacs habituals (Aseffa, 1997) recomanats en infeccions per enteropatògens. En qualsevol cas, en casos de disenteria bacteriana haurà de seguir-se la regla de canviar l’antibiòtic si a les quarantavuit hores de tractament no s’obté milloria clínica. Cal assenyalar que a la darreria del segle passat es començaren a descriure brots de Salmonella multiresistents en llocs molt distants entre si, com el nord de l’Àfrica, Albània, Sudàfrica o l’Índia; a més, sense la participació de reservoris animals (Lewin, 1991). L’activitat de les quinolones és seguida amb interès als PBR, atesa llur acció envers els micobacteris, tant M. tuberculosis com M. leprae (Hooper, 2000), cosa que suposaria un impuls important envers el control d’aquestes malalties si s’aconseguís un abaratiment dels preus o l’autorització de fabricar medicaments genèrics d’aquesta família d’antimicrobians.

El tractament de suport No hi ha cap dubte que l’èxit terapèutic d’un tractament antiinfecciós es fonamenta en la utilització d’antibiòtics, però aquests assoliran millors resultats sempre que s’acompanyin d’un bon tractament de suport. La rehidratació, bona oxigenació del malalt i possible drenatge de coll. eccions purulentes (quan estigui indicat), són la base d’aquesta teràpia d’acompanyament, que de nou serà de més difícil compliment als PBR. Les causes principals són la pitjor situació d’higiene intrahospitalària, atenció d’infermeria de més

baixa qualitat i horaris mèdics anàrquics, que no permeten un seguiment estricte de cada cas, i produeixen situacions de deterioració clínica detectades més tard del que és desitjable. També seria desitjable un millor estat nutricional dels pacients, a fi de millorar l’eficàcia terapèutica dels antimicrobians, però un desenvolupament de la temàtica del cercle viciós immunitat, nutrició, infecció necessitaria un nou capítol. BIBLIOGRAFIA Aseffa, A.; Gedlu, E.; Asmelash, T. (1997). «Antibiotic resistance of prevalent Salmonella and Shigella strains in northwest Ethiopia». E. Afr. Med. J., vol. 74, pàg. 708-713. Bannister, B. (2000). «Antimicrobial Therapy». A: Bannister, B. A.; Begg, N. T.; Gillespie, S. H. Infectious Diseases. 2a ed. Ames, Blackwell Science, pàg. 51-80. Greenwood, B. M. (2000). «Meningococcal disease». A: Strickland, T. [ed.] Hunter’s Tropical Medicine. 8a ed. Filadèlfia: WB Saunders, pàg. 465-471. Hooper, D. C. (2000). «Quinolonas». A: Mandell, G. L.; Bennett, J. E.; Dolin, R. [ed.] Enfermedades infecciosas. Principios y práctica. 5a ed. Buenos Aires: Panamericana, pàg. 497-520. Huper, H.; Solomon, A.W.; Buchan, J.; Zondervan, M.; Foster, A.; Mabey, D. (2003). «A critical review of the SAFE strategy for the prevention of blinding trachoma». Lancet Infect. Dis., vol. 3, pàg. 372-381. Lewin, C. S.; Nandivada, L. S.; Amyes, S. G. B. (1991). «Multiresistant salmonella and fluoroquinolones». J. Antimicrob. Chemoter., vol. 27, pàg. 147-149. Organització Mundial de la Salut (1993). Guidelines for Cholera Control. Gènova: OMS. Vila, J.; Vargas, M.; Ruiz, J.; Corachan, M.; Jiménez de Anta, M. T.; Gascón, J. (2000). «Quinolone resistance in enterotoxigenic Escherichia coli causing diarrea in travellers to India in comparison with travellers to other geographical areas». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 44, pàg. 1731-1733. Welsh, O. (1991). «Mycetoma: current concepts in treatment». Int. J. Dermatol., vol. 30, pàg. 387-398. Whitty, C.; Mabey, D. (2004). «The diagnosis and treatment of infection». A: Parry, E.; Godfrey, R.; Mabey, D.; Hill, G. [ed.] Principles of medicine in Africa. 3a ed. Cambridge University Press.

Antimicrobians (Joaquim Ruiz, ed.) Treballs de la SCB. Vol. 55 (2004) 67-80

NOVES TECNOLOGIES EN LA RECERCA D’ANTIMICROBIANS Cristina Tarragó, Cristina Alemany, Celia Palacín, José Terencio i Antonio Guglietta Centre d’Investigació i Desenvolupament Farmacèutic de Ferrer Internacional. Adreça per a la correspondència: Cristina Tarragó. Departament de Malalties Infeccioses, Centre I+D Laboratoris Ferrer Internacional. Joan de Sada, 32. 08028 Barcelona. Adreça electrònica: ctarrago-research@ferrergrupo.com. RESUM Les infeccions bacterianes són una important causa de mort en els nostres dies i diversos factors són responsables de la seva transcendència, com el mal ús dels antibiòtics, la capacitat d’adaptació bacteriana a les teràpies actuals i la manca de noves famílies d’antibiòtics que apareguin a la mateixa velocitat que els patògens es fan resistents als productes del mercat. Per superar aquest problema la comunitat científica inverteix importants esforços en la recerca de nous antibacterians, a través tant de la utilització del coneixement adquirit dels antibiòtics existents i de les tecnologies clàssiques, com de la incorporació de la genòmica per a la recerca de noves dianes, de fonts de productes naturals no explorades, de noves tecnologies de síntesi, i del rastreig d’alt rendiment per a una major optimització en la detecció d’antibiòtics potencials. Al llarg d’aquest article s’intenta repassar l’evolució en la recerca d’antimicrobians, des del problema que representa l’adaptació dels bacteris a l’ús dels antibiòtics, fins a arribar a la utilització de noves tecnologies en la recerca de productes amb nous mecanismes d’acció. Paraules clau: antibiòtics, resistència, descobriment de drogues, noves dianes, noves tecnologies. SUMMARY Infectious diseases are the leading cause of death worldwide, and the main reasons for the accelerated development and dissemination of bacterial resistance are the increase of the global selective pressure through inappropriate use of antimicrobials in therapy, the bacterial ability to select for resistant organisms, and the lack of development of new drugs as fast as bacteria can adapt to current antibacterials. The scientific community and drug companies are refocusing their discovery efforts in developing novel agents with new modes of action, adding to the classical antibiotic knowledge and detection methods the use of rapidly emerging technologies including genomics, combinatorial chemistry, high throughput scanning, and novel sources of natural products. This review summarize the evolution of the antimicrobial drug discovery process through the use of novel technologies in order to fight against resistant pathogens.

C. TARRAGÓ, C. ALEMANY, C. PALACÍN, J. TERENCIO I A. GUGLIETTA

Keywords: antimicrobial, resistance, drug discovery, new targets, novel technologies. INTRODUCCIÓ El descobriment, desenvolupament i explotació dels antibiòtics ha estat un dels avenços més significatius en medicina del segle xx, juntament amb la millora de les condicions de salut pública. L’era daurada de la recerca d’antimicrobians va ser la compresa entre 1940 i el final dels anys seixanta, i d’aquells esforços va resultar un ampli ventall d’agents estructuralment diversos i efectius per a tractar les infeccions bacterianes. A finals dels setanta, la batalla davant les infeccions es va considerar guanyada; era aquesta una sensació de victòria excessiva i prematura (Spellberg et al., 2004). En els últims anys les resistències als antibiòtics, tant als hospitals com en la comunitat, estan augmentant d’una manera alarmant, a causa sobretot d’un grup de patògens que han esdevingut resistents a múltiples antibiòtics del mercat. Aquests patògens són els Staphylococcus aureus resistents a la meticill. ina (MRSA) o amb sensibilitat intermèdia a la vancomicina (VISA), els Enterococcus resistents a la vancomicina (VRE) i els Streptococcus pneumoniae amb sensibilitat disminuïda a la penicill. ina i a altres antibacterians, juntament amb organismes com Pseudomonas sp. multiresistent, Klebsiella sp., Enterobacter sp. i Acinetobacter sp. . SITUACIÓ ACTUAL. APARICIÓ INEVITABLE DE RESISTÈNCIES Quan s’introdueix una nova classe d’antibiòtics en l’ús clínic, aquesta és efectiva al principi, però eventualment es pot seleccionar la supervivència d’una petita fracció de població bacteriana amb un mecanisme de resistència intrínseca o adquirida. Quan emergeixen els patògens resistents a múltiples antibiòtics ho acostumen a fer en tot el món, i més o menys al

mateix temps (Walsh, 2003). Aquest problema afecta de manera molt directa la vancomicina, fins fa poc considerada teràpia de darrera elecció, i que avui dia està perdent la seva efectivitat davant algunes soques multiresistents. Els mecanismes de resistència es poden resumir en bloqueig de l’entrada de l’antibiòtic, afavoriment de l’expulsió, modificació de la diana i desactivació enzimàtica o bypass. Tot i que els bacteris resistents són infreqüents dins una població normal (p. ex.: un de cada 10 8), en presència contínua d’un antibiòtic determinat les resistents augmenten respecte als bacteris que no són capaços de sobreviure. El termini per al desenvolupament de resistències clínicament significants és multifactorial i depèn de la quantitat d’antibiòtic utilitzat, l’amplitud de la prescripció, la freqüència d’ús de nivells subterapèutics d’antibiòtics, els reservoris de mecanismes de resistència existents, el nombre de mutacions requerides perquè emergeixi resistència en una diana determinada i la capacitat de supervivència dels organismes resistents. La realitat és que les resistències bacterianes, al llarg del temps, s’han desenvolupat davant cada una de les classes d’antibiòtics, tant naturals com sintètics (entre un any o una dècada després del seu primer ús clínic). La resistència, doncs, no és una qüestió de si apareix, sinó de quan ho fa. Des del moment que entra a la clínica un nou antibacterià, el rellotge comença a comptar per a la primera aparició de soques resistents. El nombre de nous antibiòtics que es necessiten per a tractar la mateixa infecció bacteriana va augmentant en el temps a mesura que apareixen soques resistents als antibiòtics usats. L’últim exemple és l’oxazolidinona linezolid, per a la qual les primeres soques resistents van aparèixer només un any després de l’aprovació del producte per la FDA (Schmidt, 2004).

NOVES TECNOLOGIES EN LA RECERCA D’ANTIMICROBIANS

CANVI D’ESTRATÈGIES EN L’EMPRESA ACTUAL El 2003, el mercat global d’antimicrobians es va estimar en trenta-dos bilions de dòlars i s’espera que estigui per sobre dels trenta-vuit bilions el 2006 (Basbaum, 2003). Les indústries farmacèutiques valoren aquest fet i també la postura de les administracions d’intentar fomentar la investigació en aquest camp, però la realitat és que inverteixen cada cop menys en antibacterians. La primera causa que ho explica és l’elevat cost de la recerca i el desenvolupament (estimacions de 400-800 milions de dòlars/producte aprovat) (Smolinski et al., 2003). Una altra és el fet que aquest tipus de productes són econòmicament menys atractius per al desenvolupament que altres tipus de fàrmacs, ja que s’utilitzen com a teràpia de curta durada enfront dels medicaments indicats per a malalties cròniques (Projan, 2003). També, l’elevat nombre d’antimicrobians aprovats és un competidor important a l’hora d’intentar nous registres, juntament amb el fet que els organismes de salut pública transmetin a l’opinió mèdica la necessitat de limitar l’ús d’antibiòtics d’ampli espectre amb l’objectiu de minimitzar les pressions que originen l’aparició de resistències i, per tant, desaconsellin l’ús com a primera opció dels nous antibacterians (Powers, 2003). La situació afecta de manera diferent petites companyies farmacèutiques o de biotecnologia que poden estar més interessades en aquest camp, ja que preveuen el desenvolupament de fàrmacs amb mercat més reduït, i per tant, amb menor marge econòmic (Spellberg et al., 2004). Òbviament, també disposen de menys recursos, però sovint la coll. aboració entre aquestes o amb diferents grups de treball acadèmics intenta suplir aquesta mancança. De totes maneres, qualsevol tipus de companyia farmacèutica que treballi en aquest camp ha de preveure la recerca en la identificació i validació de noves dianes, ha de disposar d’experiència en mecanismes de

rastreig d’alt rendiment (HTS) i també en sistemes i programes per a la identificació i optimització de leads. ESTRATÈGIES CLÀSSIQUES EN LA RECERCA D’ANTIMICROBIANS En el passat, el mètode tradicional utilitzat per al desenvolupament de nous antibiòtics era la síntesi d’anàlegs de compostos existents o el rastreig de substàncies naturals i l’avaluació de tots aquests amb la recerca de millores en l’activitat terapèutica i en l’espectre. S’utilitzaven també mètodes in vitro i in vivo per a determinar la seva activitat bacteriostàtica o bactericida, però sempre amb organismes sencers (bacteris o animals d’experimentació). A continuació, es definien les relacions d’estructura-activitat amb sèries d’anàlegs químics fins a identificar el millor compost per al desenvolupament clínic. La situació habitual era identificar l’activitat antimicrobiana i després l’estructura de la molècula responsable i les dianes involucrades (Yuan et al., 2001). Aquesta aproximació va tenir èxit durant dècades i va permetre la identificació d’un nombre limitat d’antibacterians que, tot i no ser baix, condueix a situacions de resistència creuada, ja que molts tenen com a diana els mateixos processos cell. ulars o els mateixos enzims (vegeu la taula 1). Algunes companyies farmacèutiques encara utilitzen aquest procés i, tot i que hi ha hagut certa innovació al llarg del temps, han passat més de trenta anys entre la introducció de les quinolones l’any 1962 i la següent classe estructural d’antibiòtics, l’oxazolidinona linezolid (Rachakonda i Cartee, 2004). Avui dia, sis antibiòtics superen un bilió de dòlars en vendes: dos β-lactàmics (ceftriaxona i amoxicill. ina/clavulànic), dos macròlids (azitromicina i claritromicina) i dues fluoroquinolones (ciprofloxacina i levofloxacina). Aquests productes reflecteixen tres classes estructurals

C. TARRAGÓ, C. ALEMANY, C. PALACÍN, J. TERENCIO I A. GUGLIETTA Taula 1. Llistat d’antibiòtics representants de les principals classes d’antibiòtics, amb les seves dianes d’acció i la dècada de la seva introducció clínica Dècada

Compost (classe)

Diana bacteriana

1930

Sulfonamides

Metabolisme dels àcids grassos (àc. fòlic)

1940

Penicill. ines (β-lactàmics)

Síntesi de la paret cell. ular

Estreptomicina (aminoglicòsids)

Síntesi de proteïnes

Cloramfenicol

Síntesi de proteïnes

Tetraciclines

Síntesi de proteïnes

Vancomicina (glicopèptids)

Síntesi de la paret cell. ular

Eritromicina (macròlids)

Síntesi de proteïnes

Cefalosporines (β-lactàmics)

Síntesi de la paret cell. ular

Piostacina (estreptogramines)

Síntesi de proteïnes

Àcid nalidíxic (quinolones)

Replicació del DNA

Fluoroquinolones (quinolones)

Replicació del DNA

Cefalosporines de 3a generació (β-lactàmics)

Síntesi de la paret cell. ular

Carbapenems (β-lactàmics)

Síntesi de la paret cell. ular

Segona generació de macròlids

Síntesi de proteïnes

1990

Quinudalfopristina (estreptogramines parenterals)

Síntesi de proteïnes

2000

Linezolid (oxazolidones)

Síntesi de proteïnes

Telitromicina (ketòlids)

Síntesi de proteïnes

1950

1960

1980

que han estat les més importants durant quatre dècades (Walsh, 2003). Una estratègia per a superar les resistències bacterianes és la identificació de substàncies que interfereixen amb els trets de resistència. Aquest concepte va ser introduït amb èxit en la teràpia a començaments de la dècada dels vuitanta amb la comercialització per part de GlaxoSmithKline de l’àcid clavulànic, un inhibidor de β-lactamases obtingut a partir de Streptomyces clavuligerus, conjuntament amb la preparació amb amoxicill. ina. També és, doncs, molt important en la recerca de nous antibacterians la modificació de l’estructura química dels antibiòtics per neutralitzar els mecanismes de resistència i la recerca de nous compostos amb mecanismes d’acció desconeguts (Schmidt, 2004). Molts dels compostos que estan avui en desenvolupament són encara modificacions menors de les famílies β-lactàmiques, macròlids i fluoroquinolones; les segones i terceres generacions d’aquestes molècules són extremadament importants en la millora en eficàcia i farmacocinètica. Variants d’altres

classes d’antibiòtics, com les tetraciclines i glicopèptids, s’han obtingut amb l’objectiu d’augmentar l’eficàcia davant bacteris patògens importants. La daptomicina (lipopèptid), pot ser efectiva especialment davant VRE (Walsh, 2003). Oritanvancina i dalbavancina són derivats glicopèptids amb una vida mitjana en sèrum molt llarga i activitat davant molts dels grampositius resistents a altres antibiòtics. Altres exemples a comentar són les noves fluoroquinolones i les desfluoroquinolones, que han incrementat molt la seva activitat davant microorganismes grampositius, fins i tot resistents a les anteriors fluoroquinolones. També, les glicilglicines són compostos que han estat modificats químicament per superar les resistències a la tetraciclina mitjançant protecció ribosòmica i l’eﬄux. D’aquestes molècules, la tigeciclina presenta tan bona activitat davant grampositius, anaerobis i enterobacteris com una molt disminuïda toxicitat gastrointestinal per via endovenosa. Finalment, els ketòlids són derivats dels macròlids no subjectes al mecanisme de resistència d’aquests, a causa de l’eﬄux, no indueixen re-

NOVES TECNOLOGIES EN LA RECERCA D’ANTIMICROBIANS

sistència als macròlids i tenen activitat relativa davant soques amb els gens erm (Douthwaite i Champney, 2001). INCORPORACIÓ DE LA GENÒMICA A LA RECERCA DE NOVES DIANES La major part dels antibiòtics actuals estan dirigits a un nombre reduït de funcions cellulars, com la síntesi de la paret bacteriana, replicació del DNA, transcripció i traducció (Moir et al., 1999). La identificació de funcions cell. ulars no explorades com a dianes potencials és necessària per al desenvolupament de nous antibiòtics. En aquest punt, la genòmica ha esdevingut una nova estratègia per a la identificació de noves dianes que ha revolucionat totes les àrees terapèutiques, especialment el camp de la microbiologia. El primer genoma bacterià totalment seqüenciat va ser el d’Haemophilus inﬂuenzae l’any 1995 (Fleischmann et al., 1995), i actualment ja són més de cent els genomes bacterians completament seqüenciats disponibles en les bases de dades públiques. Aquesta gran quantitat d’informació ha impulsat el desenvolupament d’extensos programes per a cercar noves dianes, tant en la indústria com en el món acadèmic. Malgrat tot, aquest procés no és senzill, ja que s’han de tenir en compte molts criteris per a triar una diana i després s’han de desenvolupar diferents eines per a validar-la.

Elecció d’una nova diana antimicrobiana A partir de la seqüència de DNA bacterià, i mitjançant programes bioinformàtics d’anàlisi i comparació de seqüències (Galperin, 2004), es poden localitzar els marcs oberts de lectura (ORF) i assignar-los possibles funcions per homologia amb altres proteïnes, per anàlisi dels dominis o per l’estructura de l’operó (McDevitt et al., 2002). Dels milers d’ORF

nous identificats s’han de tenir en compte una sèrie de criteris per a poder triar els més indicats per a esdevenir una diana potencial. El primer dels criteris és l’espectre. Per al desenvolupament d’antibiòtics d’ampli espectre es poden identificar aquells gens que estan altament conservats en un gran nombre d’organismes patògens comparant múltiples seqüències genòmiques bacterianes i incloent-hi genomes de diferents soques de les mateixes espècies. En principi l’ampli espectre és el més buscat en un antibiòtic, atès que té un mercat major i, a més, seria d’elecció en els casos en què la teràpia s’hagués d’iniciar abans d’haver identificat l’agent causal de la infecció. De totes maneres, l’elecció de dianes d’espectre més reduït presenta l’avantatge de desenvolupar agents antimicrobians amb menors efectes secundaris, a causa de la conservació de la flora comensal i la menor aparició de resistències (McDevitt i Rosenberg, 2001). El segon criteri a tenir en compte és la selectivitat enfront de l’home. Gràcies a la seqüenciació del genoma humà (Venter et al., 2001) es pot determinar la presència o no d’un gen concret o si les diferències són suficientment importants per a preveure que un compost serà selectiu entre la diana bacteriana i la humana. Un cop definit l’espectre i la selectivitat, s’ha de definir l’essencialitat de la diana. Mitjançant diferents tecnologies que es discutiran al següent apartat de validació de noves dianes, s’ha de determinar el paper essencial de la nova diana en el creixement o la viabilitat cellular. Sembla raonable pensar que els gens que resulten essencials per al creixement o la viabilitat en medis de cultiu del laboratori també ho seran a l’hoste infectat. Malgrat això, s’ha observat que determinats gens varien el seu patró d’expressió en un procés d’infecció, i aquells que resultaven essencials en les condicions experimentals del laboratori ja no ho són a l’hoste (Moir et al., 1999; Rachakonda i Cartee, 2004). Per tant, aquest gen ha perdut el seu interès com a diana terapèutica. Finalment, és important poder caracteritzar

C. TARRAGÓ, C. ALEMANY, C. PALACÍN, J. TERENCIO I A. GUGLIETTA

funcionalment la nova diana, per desenvolupar assaigs bioquímics, si és possible en format de HTS, i poder mesurar l’activitat de diferents compostos químics (McDevitt i Rosenberg, 2001).

Validació de noves dianes terapèutiques La validació d’una diana consisteix a determinar el seu paper essencial en la supervivència cell. ular mitjançant diferents metodologies. Malgrat que el gen es trobi conservat en diferents espècies, establir l’essencialitat del gen en una soca bacteriana no implica l’essencialitat en la resta. Per tant, l’essencialitat d’una diana potencial s’ha de determinar en un ampli ventall d’espècies patògenes (Donadio et al., 2002). Algunes de les metodologies per a validar una diana es basen en la disrupció del gen i l’estudi de l’efecte de la pèrdua de funció del gen destruït sota diferents condicions de creixement. Les insercions que tinguin lloc en gens essencials conduiran a la mort del bacteri. Els mètodes que provoquen la disrupció d’un gen són ràpids i senzills. Exemples d’aquests mètodes són el test d’inserció de transposons (Miesel et al., 2003; Gerdes et al., 2002) o la mutagènesi per inserció de plasmidis (Link et al., 1997; Vagner et al., 1998). Ambdues tècniques es diferencien en el fet que la primera consisteix en la introducció aleatòria de transposons al llarg de tot el genoma bacterià, mentre que la inserció de plasmidis va dirigida a un gen en concret. A més, en la mutagènesi per inserció de plasmidi s’eviten els efectes polars que es poden produir en la inserció de transposons (Link et al., 1997). Altres metodologies per a validar una diana utilitzen soques mutants condicionals. Aquestes aproximacions permeten l’estudi de gens essencials gràcies al fet que en condicions de cultiu permissives, el gen s’expressa i la soca creix, mentre que en condicions més restrictives en què el gen no s’expressa, la soca no

sobreviu. La utilització de mutants condicionals permet identificar i caracteritzar gens essencials i compostos antimicrobians. Hi ha diferents estratègies dins els mutants condicionals, com a) els mutants termosensibles, en què s’introdueix una mutació que converteix la proteïna essencial en termolàbil (Schmid et al., 1989); b) RNA antisentit, que inhibeix la traducció totalment o parcialment, tant in vitro com in vivo (Ji et al., 1999) i c) el control de l’expressió gènica per substitució o disrupció del promotor endogen del gen diana per un promotor regulable mitjançant la incubació amb un inductor (Greendyke et al., 2002). Aquestes metodologies s’utilitzen per a estudiar l’essencialitat d’un gen en concret, però també han estat adaptades, per exemple, en el cas d’empreses farmacèutiques per a la identificació massiva de multitud de gens essencials en una mateixa soca patògena (Forsyth et al., 2002). Mitjançant tècniques de genòmica s’han pogut identificar i validar dianes concretes, com la pèptid-deformilasa, i fins i tot vies bioquímiques senceres, com la ruta biosintètica dels àcids grassos bacterians, la via del corismat i la via del MEP per a la biosíntesi d’isoprenoides, exemplificats al final d’aquest treball. . FONTS D’ANTIMICROBIANS. PASSAT I FUTUR L’ús de compostos naturals va ser l’estratègia dominant entre 1940 i 1960 en l’època daurada del descobriment d’antibiòtics. El descobriment de l’activitat antibacteriana dels productes naturals va facilitar el desenvolupament d’assaigs per a la purificació i caracterització de penicill. ines, cefalosporines, aminoglicòsids, tetraciclines, macròlids, etc. Els antibiòtics d’origen natural acostumen a tenir estructures i grups funcionals complexos per a la interacció específica o reconeixement per les dianes dels bacteris patògens. Aquestes estructures complexes normalment són produï-

NOVES TECNOLOGIES EN LA RECERCA D’ANTIMICROBIANS

des a gran escala per processos de fermentació, més que per síntesi. També, s’han utilitzat de base química per a crear posteriors generacions de derivats semisintètics que han arribat al mercat (Walsh, 2003). Les fonts d’on normalment s’extreien aquests tipus de productes (fongs, bacteris i plantes medicinals) s’han esgotat després de cinquanta anys de rastreig intensiu. Actualment hi ha empreses que criben l’activitat antibiòtica de compostos procedents d’orígens no explorats anteriorment, com organismes marins, pèptids procedents d’insectes, o plantes de diferents zones del món. Cal també recordar i considerar que només una petita part dels microbis existents són cultivables en laboratori. Això fa que més del 90 % del metagenoma, o conjunt de genomes del total de microbis presents en la natura, sigui desconegut, i és una font de dianes i de productes naturals (Daniel, 2004) encara per explotar. Mitjançant el clonatge de grans fragments (50-100 kb) de DNA a partir de microbis aïllats en entorns naturals, i la seva expressió en un microorganisme de laboratori com E. coli, s’han pogut identificar nous gens. Aquesta aproximació és molt nova i malgrat la gran quantitat d’esforços invertits, encara no ha permès revelar noves estructures químiques. La segona línia de descobriment d’antibiòtics van ser els antibacterians sintètics procedents d’estructures que no es troben a la natura. En són exemple les sulfonamides, les fluoroquinolones i les oxazolidinones, la darrera família d’antibiòtics descoberta i que té el linezolid (Zyvox®) com a únic representant en el mercat. L’habilitat de la química combinatòria de sintetitzar ràpidament un nombre elevat de compostos diferents ha permès generar una gran quantitat de quimioteques de compostos sintètics, que són el punt de partida per a la cerca i l’optimització de nous antibacterians. La metodologia que s’utilitza per a la síntesi d’una àmplia matriu de compostos és un procés ite-

ratiu d’enllaçar peces (building blocks). Es van creant noves estructures basades en la seqüència o disposició de les unitats monomèriques que s’han afegit, i un cop testejades les seves activitats biològiques es poden convertir en lead compounds. La validesa de la química combinatorial realment radica en la diversitat dels compostos creats i en la utilització de tècniques de HTS que fa que sigui avaluada la possible activitat biològica d’aquests milers o milions de compostos en un període de temps relativament curt. Les quimioteques petites es consideren més adequades per a explorar farmacòfors específics (grups estructurals amb activitat biològica) i han representat un gran impacte en els projectes de recerca d’antibiòtics basats en el mecanisme d’acció (Trias, 2001). Les quimioteques de molts compostos, en canvi, posseeixen una diversitat estructural molt gran i són més adequades per a projectes dirigits a identificar un lead o un hit, amb els quals es pot iniciar un programa de química mèdica. També s’ha utilitzat la química combinatorial per a augmentar la diversitat al voltant d’antibiòtics existents, com els β-lactàmics i les quinolones, però és difícil trobar noves molècules al voltant de les classes extensament explorades en el passat. A més, l’elevat nombre de publicacions és una barrera per a la patentabilitat de les noves molècules. Els projectes que, en canvi, explorin la diversitat química al voltant dels nous antibiòtics (p. ex.: oxazolidinones) segurament tindran major probabilitat d’èxit.

Rastreig d’alt rendiment Per a poder avaluar l’activitat biològica de les quimioteques diverses davant les dianes potencials s’han desenvolupat mètodes d’alt rendiment que permeten el cribratge d’un gran nombre de productes, i a més en un període de temps raonable. Els mètodes clàssics

C. TARRAGÓ, C. ALEMANY, C. PALACÍN, J. TERENCIO I A. GUGLIETTA

consisteixen a testejar els candidats a fàrmacs utilitzant cèll. ules o organismes sencers (wholecell scanning). Com a avantatge tenen que es criben moltes dianes alhora i de manera senzilla i, com a desavantatge, que s’han de superar les barreres naturals d’accés a totes (embolcalls cell. ulars, degradació enzimàtica...). Amb aquests mètodes s’obtenen productes amb activitat final, tot i que sense coneixement sobre el mecanisme d’acció, a diferència de quan es fa el rastreig amb dianes aïllades. L’avantatge d’utilitzar dianes aïllades per al rastreig de compostos és que es posa en contacte directe el potencial inhibidor amb la diana, mentre que el desavantatge és que segurament qualsevol producte actiu haurà de ser químicament optimitzat perquè mantingui l’activitat en els organismes sencers després de travessar les barreres naturals. Els assaigs amb dianes aïllades i amb mètodes de rastreig d’alt rendiment permeten avui cribar tantes dianes quasi com amb les cèll. ules completes, i alhora disposar de coneixement sobre el mecanisme d’acció d’un compost (Schmidt, 2004). Un altre tipus de rastreig és el que s’utilitza quan es disposa d’una proteïna diana lliure en solució i de sistemes automàtics d’identificació de lligands. S’anomena rastreig amb aﬁnitat pel lligands i estan sent utilitzats per companyies de biotecnologia. Una altra possibilitat és el rastreig virtual (in silico), que implica l’avaluació de les estructures químiques segons un model computacional. Aquest model pot ser una equació tradicional QSAR, un farmacòfor 3D, o l’acoblament a una estructura cristall. ina d’una proteïna. Les familiars regles de Lipinski o àrea de superfície polar són eines per a calcular l’absorció, i són també exemples de rastreig virtual. El dogma principal del disseny de productes basat en l’estructura és l’obtenció de l’estructura tridimensional de la diana que s’utilitza per a fer rastreig. La situació òptima és disposar del complex diana-inhibidor, ja que permet la identificació del lloc actiu. Es construeix un algorisme

que s’utilitzarà per a poder predir l’acoblament de molècules al lloc actiu de la diana i es necessita disposar d’accés a una sèrie de quimioteques; per mitjà d’una computadora potent es podran escanejar in silico grans quantitats de molècules d’acord amb la disponibilitat de l’estructura tridimensional. Cal puntualitzar que el rastreig virtual no substitueix mai el rastreig in vitro real; s’utilitza per a identificar noves estructures que puguin complir un determinat perfil entre bases de dades de compostos existents, sense requerir una mostra física de la molècula per a ser criada. Tot i aquests aspectes prometedors, encara no s’ha desenvolupat cap antibiòtic a partir de les aproximacions combinatòries i de l’ús massiu de tècniques de rastreig. Una de les possibles raons és que el disseny de derivació química dels compostos de les quimioteques és massa a l’atzar i no es basa en el coneixement precís dels mecanismes de resistència. Conseqüentment, és raonable també escollir estratègies més racionals per a investigar l’estructura de les dianes bacterianes alhora que s’intenten entendre precisament quines propietats són interessants per a dissenyar les modificacions químiques, com ha passat en el cas de la vancomicina (Nicolaou, 2001). Aquestes tècniques permetran que quimioteques de bilions d’estructures teòriques siguin testejades en funció de la seva capacitat d’encaixar en un determinat receptor bacterià. De la mateixa manera, i com ja hem dit, les eines de preselecció poden ajudar a crear quimioteques més focalitzades i, així, reduir el nombre de compostos a sintetitzar (Rusinko et al., 2002). DIANES POTENCIALS EN EL DESCOBRIMENT DE NOUS ANTIMICROBIANS Durant tot aquest temps s’ha anat treballant en la recerca d’antibacterians derivats d’estructures conegudes o inhibidors de dianes

NOVES TECNOLOGIES EN LA RECERCA D’ANTIMICROBIANS

considerades essencials per a la viabilitat cellular. Actualment s’ha ampliat la recerca a la possibilitat d’inhibir altres dianes que no afecten les funcions metabòliques essencials, sinó factors responsables de la colonització tissular, superació del sistema immunitari de l’hoste, virulència, patogenicitat o comunicació cellular (Schmidt, 2004). Un avantatge d’aquest nou enfocament és que, en no representar funcions cell. ulars vitals, la inhibició d’aquests sistemes podria tenir menys incidència sobre els fenòmens de resistència. Entre els processos essencials per a la supervivència cell. ular, la replicació del DNA i la síntesi proteica continuen sent una font de possibles noves dianes. En el cas de la replicació del DNA intervenen vora trenta proteïnes amb un alt grau d’homologia entre bacteris, de manera que poden donar lloc a inhibidors d’ampli espectre. A més, gràcies a les noves metodologies de rastreig, s’han pogut desenvolupar assaigs en format de HTS, cosa que probablement aportarà nous compostos amb activitat antibacteriana en els propers temps. Pel que fa a la síntesi proteica, ha estat font de molts grups d’antibacterians, com tetraciclines, macròlids, o les recents oxazolidinones. Actualment, la síntesi proteica s’està explorant per a la cerca de nous compostos des de diferents punts de vista. D’una banda, desenvolupant assaigs d’alt rendiment, igual que en el cas del procés de replicació; d’altra banda, i gràcies a la disponibilitat de l’estructura del ribosoma procariòtic (Ban et al., 2000), hi ha empreses que estan desenvolupant rastreig in silico (com Rib-X). I per acabar, amb la introducció de la genòmica s’han identificat noves dianes potencials com la pèptid-deformilasa (PDF), enzim procariòtic que intervé en l’eliminació de la formilmetionina de la proteïna naixent. L’èxit recent de l’ús d’un inhibidor de la PDF en un model d’infecció bacteriana valida aquest enzim com una nova diana per a antibiòtics (Clemens et al., 2001) La divisió cell. ular també és crítica per a la supervivència bacteriana, i és probablement un

dels processos que menys s’entenen fins ara, tot i que se sap que implica una xarxa d’interaccions proteïna-proteïna necessària per a la formació dels septes. Aquest procés és regulat, entre d’altres, per les proteïnes Fts. Una de les proteïnes involucrades, i que seria una diana potencial, és la FtsZ, ja que la seva concentració regula la freqüència de formació del septe previ a la divisió cell. ular (Lutkenhaus, 1993). Les cobertes i barreres de membrana en bacteris són estructures interessants com a dianes en la recerca d’antimicrobians, com ho demostra el fet que al mercat hi ha nombrosos productes que interfereixen amb la seva estructura o el seu funcionament. Aquestes estructures no solament actuen com a barrera física, sinó que, a més, els bacteris són capaços d’expulsar productes a través d’aquestes, o de bloquejarne específicament l’entrada. El bloqueig dels sistemes expulsors de molècules, la desestabilització de la membrana externa o la interferència en diversos punts de la construcció de la paret cell. ular poden conduir a l’obtenció de bons candidats a antibiòtics. Entre els enzims que participen en la síntesi de la paret bacteriana, la fosfo-N-acetilmuramil-pentapèptid-translocasa (o translocasa i) catalitza la primera reacció a la membrana de la biosíntesi del peptidoglicà. S’han descobert dos antibiòtics nucleòsids que inhibeixen aquest enzim, la mureidomicina A i la liposidomicina B (Brandish et al., 1996) que, contràriament a la tunicamicina, inhibidor de la biosíntesi de glicoproteïnes de mamífers, no són tòxics en ratolins. Un altre enzim essencial que participa en la síntesi de la paret, i per al qual s’estan desenvolupant inhibidors, és el producte del gen murA. Fins ara només es coneix la fosfomicina. Recents anàlisis dels genomes microbians han revelat que els cocs grampositius tenen dues còpies de murA (murA1 i murA2) (Du et al., 2000), i només la deleció de totes dues és letal. Per tant, els inhibidors que es desenvolupin han de ser capaços, igual que la fosfomicina, d’inhibir tots dos enzims.

C. TARRAGÓ, C. ALEMANY, C. PALACÍN, J. TERENCIO I A. GUGLIETTA

Dins encara l’estructura de la paret bacteriana com a font de noves dianes, la recerca d’inhibidors dels sistemes d’efflux bacterians és una de les estratègies més atractives per als nous antimicrobians. Moltes de les bombes d’efflux estan àmpliament distribuïdes entre les cèll. ules procariotes, i els bacteris les utilitzen per a expulsar tant restes metabòliques i toxines com agents antimicrobians, cosa que contribueix a la resistència als antibiòtics en certes espècies bacterianes. S’han desenvolupat alguns inhibidors efectius fins al moment (Malléa et al., 2003), però atès que hi ha una considerable redundància en l’existència de mecanismes d’efflux, els agents haurien d’inhibir-los tots per a ser efectius. Entre els processos no essencials per a la supervivència cell. ular, un exemple de noves dianes són els sistemes de percepció de quòrum, o senyals cèll. ula-cèll. ula. Les poblacions bacterianes coordinen les seves activitats gèniques mitjançant la producció i intercanvi extracell. ular de molècules senyal o autoinductors (Schmidt, 2004). A més d’activitats com la simbiosi, motilitat, competència, conjugació, esporulació i producció d’antibiòtics, els autoinductors són també responsables de la formació de factors de virulència mèdicament rellevants (Branny et al., 2001), i de la formació de biofilms per algunes soques. Els biofilms escuden o protegeixen els microbis de les defenses immunitàries de l’hoste, dels antibiòtics, i fins i tot dels desinfectants. Els anàlegs dels autoinductors són bons candidats a antibacterians, ja que bloquegen els llocs dels receptors sense induir l’activitat gènica (Schmidt, 2004). Els sistemes de transducció de senyals de dos components (TCST) són sistemes d’interacció amb el medi extern (Roychoudhury et al., 1993), que consisteixen en dues proteïnes anomenades sensor i regulador (transductor), i que controlen molts gens de virulència. Els bacteris els utilitzen per a monitoritzar el seu ambient extern i adaptar-se per a la supervivència. Aquest tipus de sistema en P. aeruginosa, per exemple, condueix a la síntesi d’una

coberta bacteriana d’exopolisacàrids que té un paper crític en la patogènesi de la fibrosi cística. Un inhibidor de sistemes TCST podria ser d’ampli espectre i selectiu, i segurament seria capaç de comprometre l’adaptació i supervivència bacteriana en qualsevol ambient. També s’estan dedicant molts esforços a la investigació de determinades vies metabòliques com a possibles dianes antibacterianes. La genòmica bacteriana ha proporcionat un gran coneixement de la via biosintètica dels àcids grassos bacterians, de la via del corismat i de la biosíntesi d’isoprenoides. També s’han trobat atractives altres vies, com les de síntesi de glicogen i secreció de proteïnes. La biosíntesi lipídica o d’àcids grassos és duta a terme pel sistema FAS o de la sintasa d’àcids grassos. En mamífers trobem el sistema FAS de tipus i, mentre que en bacteris, protozous i plantes existeix el sistema FAS II. La validació de la síntesi bacteriana dels àcids grassos com a diana antimicrobiana s’ha demostrat recentment en descobrir el mecanisme d’acció de la isoniazida i amb la detecció de dos leads que inhibeixen l’enzim FabI del sistema FAS II, i que tenen activitat antibacteriana (McDevitt et al., 2002). Una altra via essencial que s’ha revelat com a font de dianes antibacterianes és la via de la biosíntesi de corismat (McDevitt et al., 2002). Els bacteris necessiten aquesta via per a la síntesi d’aminoàcids aromàtics, àcid p-aminobenzoic, vitamina K, ubiquinona i enterquelina. Els mamífers no posseeixen aquesta via i, per tant, és altament selectiva. És evident que els bacteris no poden obtenir els productes finals dels hostes, de manera que és essencial per a créixer in vivo i per a mantenir la infecció. Aquesta essencialitat s’ha demostrat predominantment en gramnegatius, en els quals una mutació o deleció d’un dels gens, com l’EPSP-sintasa, dóna lloc in vivo a soques altament atenuades pel que fa a la seva virulència. S’ha desenvolupat un assaig en format de HTS per a la detecció de l’activitat EPSP-sintasa de S. pneumoniae, que s’espera que serveixi per

NOVES TECNOLOGIES EN LA RECERCA D’ANTIMICROBIANS

a detectar antibiòtics que serien d’ampli espectre. Per a la biosíntesi d’isoprenoides s’han descrit dues vies: la clàssica del mevalonat i la més recentment identificada com a la del no-mevalonat o via del metileritritol (MEP). La via del mevalonat es troba en animals, fongs, citoplasma de les plantes, arquees i alguns eubacteris (Wilding et al., 2000). Mitjançant anàlisis genòmiques comparatives s’han identificat tots els enzims de la via en estreptococs, estafilococs i enterococs, i s’ha comprovat que són suficientment diferents dels de mamífers, de manera que hi ha un racional de selectivitat potencial d’aquesta diana. La via del MEP és present en eubacteris (pràcticament en tots els gramnegatius —excepte Borrelia burdogferi— i alguns grampositius —Bacillus subtilis, Sarcina lutea...—), en alguns eucariotes unicellulars, en el paràsit responsable de la malària Plasmodium falciparum i als cloroplasts de tots els organismes fotòtrofs (Rodríguez-Concepción i Boronat, 2002); en canvi, no és utilitzada pels mamífers per a sintetitzar isoprenoides. Tots els enzims de la via del MEP són, per tant, dianes potencials per a antibacterians, productes antimalàrics i herbicides (RodríguezConcepción, 2004). Recentment s’ha afegit un nou candidat com a diana potencial en la síntesi d’isoprenoides, una isopentenil-difosfatisomerasa que, diferentment de les descrites fins ara, és essencial per a la viabilitat cell. ular (Rohmer, 2004). A part de noves dianes potencials, també hi ha molts exemples de noves famílies de compostos com a possibles antimicrobians. S’està estudiant, per exemple, la possible activitat antimicrobiana dels anàlegs dels nucleòsids (Rachakonda i Cartee, 2004). Compostos d’aquest tipus han mostrat una moderada o bona activitat davant algunes soques bacterianes. Els 5 -peptidilnucleòsids semblen una classe interessant, i tenen com a diana l’enzim PDF. Recentment, la informació genètica i la comparació de les vies corresponents i de les funcions individuals entre els patògens i l’hos-

te humà han centrat l’atenció en el metabolisme de cofactors adenilats, com el NAD(P), el coenzim A i el dinucleòtid d’adenina i flavina (FAD), ja que també podrien actuar com a dianes potencials per als antibacterians. A més, es creu que inhibidors de les vies bacterianes involucrades en la síntesi o utilització del NAD i d’altres cofactors adenilats podrien ser específics i és probable que siguin del tipus nucleòsid o anàleg de nucleòsid. Una altra aproximació investigada és el desenvolupament d’oligonucleòtids antisentit que s’uneixin a segments crítics de DNA o RNA a la cèll. ula bacteriana. Entre tots els possibles problemes, la dificultat per a l’entrega intacta dels oligonucleòtids a les dianes intracell. ulars sembla la més important, tot i que podria ser superada en un futur utilitzant liposomes o bacteriòfags. El problema de la inestabilitat química o metabòlica dels oligonucleòtids podria solucionar-se sintetitzant oligòmers morfolino-antisentit, que serien molt més estables que els clàssics oligonucleòtids. Fa ja un temps que es disposa de quimioteques peptídiques. Els pèptids naturals posseeixen per se activitat antimicrobiana, ja que són part de les defenses innates dels hostes. La química per a sintetitzar quimioteques peptídiques està ben establerta, i es disposa de l’activitat antimicrobiana de moltes quimioteques. Els pèptids antimicrobians són sovint agents actius contra membrana i poden formar canals transmembranosos ocasionals, però molts tenen també activitat hemolítica i són tòxics. Un objectiu, sembla que possible, serà que l’acció sobre membranes sigui selectiva per a bacteris i no afecti mamífers, de manera que no presentin toxicitat i es puguin utilitzar per a la recerca d’antibacterians. CONCLUSIONS Clarament hi ha una necessitat creixent d’antimicrobians capaços de combatre les infeccions causades per bacteris resistents a al-

C. TARRAGÓ, C. ALEMANY, C. PALACÍN, J. TERENCIO I A. GUGLIETTA

tres fàrmacs. Per això, la recerca de nous antibiòtics ha de ser l’objectiu dels esforços de les indústries farmacèutiques i de la comunitat científica en els nostres dies per intentar aturar aquest problema creixent. La genòmica ens proporciona una gran quantitat de noves dianes potencials, des de molts aspectes diferents de la fisiologia cellular bacteriana. També, les noves tecnologies de rastreig i de síntesi aporten diversitat i la possibilitat d’estudiar gran nombre de compostos davant un important grup de dianes validades. El repte actual és l’optimització d’aquesta fase inicial de descobriment fins a fer els leads adequats per a la seva avaluació clínica. Aquesta tasca complexa implica combinar en la mateixa molècula diverses característiques, com la potència davant la diana en l’organisme clau, l’activitat antimicrobiana tant en el cultiu cell. ular com durant la infecció, la manca d’interacció amb el CitP450 humà, juntament amb propietats farmacocinètiques idònies. Factors com l’alt cost del desenvolupament dels fàrmacs, la curta durada dels tractaments antibacterians i l’elevat nombre de compostos existents i de dianes ja explorades, han provocat una disminució de l’interès de les indústries farmacèutiques en aquest camp. Malgrat això, sembla possible arribar a obtenir compostos interessants dels esforços que avui dia s’inverteixen en la recerca de nous antimicrobians. Noves estratègies en la recerca d’antibacterians han estat donades per l’evolució en biotecnologia, biologia molecular, química combinatorial i rastreig d’alt rendiment, juntament amb l’exploració de noves fonts de productes. La combinació d’aquestes noves eines amb les tècniques clàssiques de recerca d’antibiòtics fan possible creure en una propera revolució de la teràpia antimicrobiana. Hem de fer també èmfasi en el fet que una de les principals raons pel a l’accelerat desenvolupament i disseminació de resistències, a més de l’enorme creixement mundial i l’era

de les comunicacions, és l’augment de la pressió global selectiva a través de l’ús inadequat d’antibacterians en la teràpia humana i l’abús com a acceleradors del creixement en animals de granja. Per tant, destacarem que, tot i trobar nous antibacterians, la recerca ha d’anar acompanyada de l’esforç dels governs, de les autoritats legislatives i de la comunitat mèdica per poder garantir l’ús apropiat d’antibacterians sota la vigilància de les recomanacions de l’Organització Mundial de la Salut. Sembla ser aquest l’únic camí per a guanyar o, almenys controlar, la cursa contra la supremacia microbiana en les infeccions. BIBLIOGRAFIA Ban, N.; Nissen, P.; Hansen, J.; Moore, P. B.; Steitz, T. A. (2000). «The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 Å resolution». Science, vol. 289, pàg. 905-920. Basbaum, A. (2003). «Anadys Pharmaceuticals, Inc.» Pharmacogenomics, vol. 4, pàg. 511-518. Brandish, P. E.; Kimura, K. I.; Inuki, M.; Southgate, R.; Lonsdale, J. T.; Bugg, T. D. (1996). «Modes of action of tunicamycin, liposidomycin B, and mureidomycin A: inhibition of phospho-N-acetylmuramyl-pentapeptide translocase from Escherichia coli». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 40, pàg. 1640-1644. Branny, P.; Pearson, J. P.; Everett, C. P.; Köhler, T.; Iglewsky, B. H.; Delden, C. van (2001). «Inhibition of quorum sensing by a Pseudomonas aeruginosa dksA homologue». J. Bacteriol., vol. 183, pàg. 1531-1539. Clements, J. M.; Beckett, R. P.; Brown, A.; Catlin, G.; Lobell, M.; Palan, S.; Thomas, W.; Whitaker, M.; Wood, S.; Salama, S. [et al.] (2001). «Antibiotic activity and characterization of BB-3497, a novel peptide deformylase inhibitor» Antimicrob. Agents Chemother., vol. 45, pàg. 563-570. Daniel, R. (2004). «The soil metagenome–a rich resource for the discovery of novel natural products». Curr. Opin. Biotechnol., vol. 15, pàg. 199-204. Donadio, S.; Carrado, L.; Brandi, L.; Serina, S.; Soffientini, A.; Raimondi, E.; Montanini, N.; Sosio, M.; Gualerzi, C. O. (2002). «Targets and assays for discovering antibacterial agents». Journal of Biotechnology, vol. 99, pàg. 175-185. Douthwaite, S.; Champney, W. S. (2001). «Structures of ketolides and macrolides determine their mode of interaction with the ribosomal target site». J. Antimicrob. Chemother., vol. 48, pàg. 1-8.

NOVES TECNOLOGIES EN LA RECERCA D’ANTIMICROBIANS

Du, W.; Brown, J. R.; Sylvester, D. R.; Huang, J.; Chalker, A. F.; So, C. Y.; Holmes, D. J.; Payne, D. J.; Wallis, N. G. (2000). «Two active forms of UDP-Nacetylglucosamine enolpyruvyl transferase in gram-positive bacteria». J. Bacteriol., vol. 182, pàg. 4146-4152. Fleischmann, R. D.; Adams, M. D.; White, O.; Clayton, R. A.; Kirkness, E. F.; Kerlavage, A. R.; Bult, C. J.; Tomb, J. F.; Dougherty, B. A.; Merrick, J. M. [et al.] (1995). «Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus inﬂuenzae Rd». Science, vol. 269, pàg. 496-512. Forsyth, R. A.; Haselbeck, R. J.; Ohlsen, K. L.; Yamamoto, R. T.; Xu, H.; Trawick, J. D.; Wall, D.; Wang, L.; Brown-Driver, V.; Froelich, J. M. [et al.] (2002). «A genome-wide strategy for the identification of essential genes in Staphylococcus aureus». Mol. Microbiol., vol. 43, pàg. 1387-1400. Galperin, M. Y. (2004). «The molecular biology database collection: 2004 update». Nucl. Acids Res., vol. 32, pàg. D3D22. Gerdes, S. Y.; Scholle, M. D.; D’Souza, M.; Bernal, A.; Baev, M. V.; Farrell, M.; Kurnasov, O. V.; Daugherty, M. D.; Mseeh, F.; Polanuyer, B. M. [et al.] (2002). «From genetic footprinting to antimicrobial drug targets: examples in cofactor biosynthetic pathways». J. Bacteriol., vol. 184, pàg. 4555-4572. Green, D. V. S. (2003). «Virtual screening of virtual libraries». Progress in Medicinal Chemistry., vol. 41, pàg. 6197. Greendyke, R.; Rajagopalan, M.; Parish, T.; Madiraju, M. V. (2002). «Conditional expression of Mycobacterium smegmatis dnaA, an essential DNA replication gene». Microbiology, vol. 148, pàg. 3887-3900. Ji, Y.; Marra, A.; Rosenberg, M.; Woodnutt, G. (1999). «Regulated antisense RNA eliminates alpha-toxin virulence in Staphylococcus aureus infection». J. Bacteriol., vol. 181, pàg. 6585-6590. Link, A. J.; Phillips, D.; Church, G. M. (1997). «Methods for generating precise deletions and insertions in the genome of wild-type Escherichia coli: application to open reading frame characterization». J. Bacteriol., vol. 179, pàg. 6228-6237. Lutkenhaus, J. (1993). «FtsZ ring in bacterial cytokinesis». Mol. Microbiol., vol. 9, pàg. 403-409. Malléa, M.; Mahamoud, A.; Chevalier, J.; AlibertFranco, S.; Brouant, P.; Barbe, J.; Pagès, J. M. (2003). «Alkylaminoquinolines inhibit the bacterial antibiotic efflux pump in multidrug-resistant clinical isolates». Biochem. J., vol. 376, pàg. 801-805. McDevitt, D.; Payne, D. J.; Holmes, D. J.; Rosenberg, M. (2002). «Novel targets for the future development of antibacterial agents». Journal of Applied Microbiology Symposium, vol. 92 (supl.), pàg. 28S-34S. McDevitt, D.; Rosenberg, M. (2001). «Exploiting genomics to discover new antibiotics». Trends in Microbiology, vol. 9, pàg. 611-617. Miesel, L.; Greene, J.; Black, T. A. (2003) «Genetic strate-

gies for antibacterial drug discovery». Nature, vol. 4, pàg. 442-456. Moir, D. T.; Shaw, K. J.; Hare, R. S.; Vovis, G. F. (1999). «Genomics and antimicrobial drug discovery». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 43, pàg. 439-446. Nicolaou, K. C. (2001). «Behind enemy lines». Sci. Am., vol. 284, pàg. 46-53. Powers, J. H. (2003). «Development of drugs for antimicrobial-resistant pathogens». Curr. Opin. Infect. Dis., vol. 16, pàg. 547-551. Projan, S. J. (2003). «Why is Big Pharma getting out of antibacterial drug discovery?» Curr. Opin. Microbiol., vol. 6, pàg. 427-430. Rachakonda, S.; Cartee, L. (2004). «Challenges in antimicrobial drug discovery and the potential of nucleoside antibiotics». Current Medicinal Chemistry, vol. 11, pàg. 775793. Rodríguez-Concepción, M. (2004) «The MEP pathway: a new target for the development of herbicides, antibiotics and antimalarial drugs». Curr. Phar. Design, vol. 10, pàg. 2391-2400. Rodríguez-Concepción, M.; Boronat, A. (2002) «Elucidation of the methylerythritol phophate pathway for isoprenoid biosynthesis in bacteria and plastids. A metabolic milestone achieved through genomics». Plant Physiol., vol. 130, pàg. 1079-1089. Rohmer, M.; Grosdeange-Billiard, C.; Seemann, M.; Tritsch, D. (2004). «Isoprenoid biosynthesis as a novel target for antibacterial and antiparasitic drugs». Current opinion in investigational drugs, vol. 5, pàg. 154-162. Roychoudhury, S.; Zielinski, N. A.; Ninfa, A. J.; Allen, N. E.; Jungheim, L. N.; Nicas, T. I.; Chakrabarty, E. M. (1993). «Inhibitors of two-component signal transduction systems: inhibition of alginate gene activation in Pseudomonas aeruginosa». Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 90, pàg. 965-969. Rusinko, A.; Young, S. S.; Drewry, D. H.; Gerritz, S. W. (2002). «Optimization of focused chemical libraries using recursive partioning». Comb. Chem. High Throughput Screen, vol. 5, pàg. 125-133. Schmid, M. B.; Kapur, N.; Isaacson, D. R.; Lindroos, P.; Sharpe, C. (1989). «Genetic analysis of temperature-sensitive lethal mutans of Salmonella typhimurium». Genetics, vol. 123, pàg. 625-633. Schmidt, F. R. (2004). «The challenge of multidrug resistance: actual strategies in the development of novel antibacterials». Appl. Microbiol. Biotechnol., vol. 63, pàg. 335343. Spellberg, B.; Powers, J. H.; Brass, E. P.; Miller, L. G.; Edwards Jr., J. E. (2004). «Trends in antimicrobial drug development: implications for the future». Clin. Infect. Dis., vol. 38, pàg. 1279-1286. Smolinski, M. S.; Hamburg, M. A.; Lederberg, J. (2003). Microbial threats to health: emergence, detection, and response. Washington, DC: Institute of Medicine. Trias, J. (2001). «The role of combichem in antibiotic discovery». Curr. Opinion Microbiol., vol. 4, pàg. 520-525.

C. TARRAGÓ, C. ALEMANY, C. PALACÍN, J. TERENCIO I A. GUGLIETTA

Vagner,V.; Dervyn, E.; Ehrlich, S. D. (1998). «A vector for systematic gene inactivation in Bacillus subtilis». Microbiology, vol. 144, pàg. 3097-3104. Venter, J. C. [et al.] (2001). «The sequence of the human genome». Science, vol. 291, pàg. 1304-1351. Walsh, C. H. (2003). «Where will new antibiotics come from?» Nature Reviews Microbiology, vol. 1, pàg. 65-70. Wilding, E. I.; Brown, J. R.; Bryant, A. P.; Chalker, A. F.; Holmes, D. J.; Ingraham, K. A.; Iordanescu,

S.; So, C. Y.; Roserberg, M.; Gwynn, M. N. (2000). «Identification, evolution and essentiality of the mevalonate pathway for isopentenyl diphosphate biosynthesis in gram-positive cocci». J. Bacteriol., vol. 182, pàg. 43194327. Yuan, Z.; Trias, J.; White, R. J. (2001). «Deformylase as a novel antibacterial target». Drug Discov. Today, vol. 6, pàg. 954-61.

Antimicrobians (Joaquim Ruiz, ed.) Treballs de la SCB. Vol. 55 (2004) 81-87

RESISTÈNCIA I VIRULÈNCIA Sara M. Soto Departament de Microbiologia, Hospital Clínic, IDIBAPS. Adreça per a la correspondència: Sara M. Soto. Departament de Microbiologia, Hospital Clínic, IDIBAPS. Villarroel, 170. 08036 Barcelona. Adreça electrònica: sarasotog@yahoo.es. RESUM Avui dia, molts tractaments per a guarir les infeccions produïdes per microorganismes patògens no són eficaços. Una de les causes d’aquesta manca d’eficàcia és que l’agent o agents infecciosos a tractar són resistents a l’antimicrobià que s’empra. A més a més, el sistema immunitari de l’hoste pot no ser capaç d’eliminar el bacteri, atès que hi són presents diversos factors de virulència que els protegeixen d’aquesta defensa i que els permeten colonitzar, envair, danyar els teixits. En aquest article s’exposen diversos exemples de com l’adquisició de resistències enfront d’antimicrobians i la capacitat de virulència d’un microorganisme poden estar relacionades, ja sigui perquè l’adquisició de resistència origina un increment o disminució de la virulència, ja sigui perquè ambdues propietats es poden transferir conjuntament mitjançant un element genètic mòbil entre microorganismes de la mateixa o diferent espècie. Paraules clau: virulència, E. coli uropatogènica, resistència. SUMMARY Currently, a high number of infections treatments remain non-effective. One of the reasons is infectious agent being resistant to antimicrobial agents used. Besides this, the host’s immunological system may be unable to clear the bacteria, due to the presence of different virulence factors that may protect the bacteria from host defences, and may allow bacteria to colonize, invade or damage tissues. In this chapter we explain different examples showing that acquisition of antimicrobial resistance may be related with the virulence capacity of a microorganism, either because adquisition of resistance results in an increase or decrease of virulence, or because both properties might be transferred together by a mobile genetic element between microorganisms of the same of different species. Keywords: virulence, uropathogenic E. coli, resistence.

S. M. SOTO

QUÈ ÉS LA VIRULÈNCIA? La patogenicitat bacteriana, o poder patogènic, es defineix com els mecanismes bioquímics que confereixen als microorganismes la capacitat de causar malaltia (Smith, 1984). La patogenicitat és complexa i multifactorial (Finlay i Falkow, 1989), depenent de la interacció de dos grups de factors: a) els relacionats amb l’hoste i la seva immunitat i b) els relacionats amb el microorganisme: dosi infectiva i factors de virulència, adhesines, invasines, toxines, càpsules, sideròfors, resistència al sèrum i a altres mecanismes de defensa de l’hoste. El terme virulència s’empra per a indicar el grau, més o menys gran, de patogenicitat entre les diferents soques d’una mateixa espècie, i s’expressa com la dosi de cèll. ules necessàries per a provocar una resposta patològica en l’hoste. Així, dins d’una espècie patògena poden existir soques amb diferents graus de virulència. Alguns d’aquests factors de virulència formen part de regions del genoma anomenades illes de patogenicitat (IPA), les quals es caracteritzen per contenir gens de virulència, ser presents en soques patògenes, i absents, o amb una distribució esporàdica, en soques de baixa patogenicitat, posseir un contingut G+C diferent en comparació amb el DNA de la cèll. ula hoste, ocupar àmplies regions del cromosoma (sovint de més de 30 kb), ser associades amb gens tRNA o seqüències d’inserció (seqüències IS) localitzades als seus extrems, presentar elements genètics relacionats amb mobilitat (seqüències IS, integrases, transposases) i orígens de replicació de plasmidis. A més, aquestes IPA sovint són inestables. Així, per exemple, s’han definit cinc IPA en diferents microorganismes del gènere Salmonella i en soques uropatògenes d’Escherichia coli, i també en d’altres espècies, com Yersinia sp., Staphylococcus aureus, etc. Alhora, existeixen petites regions del cromosoma que també contribueixen a la virulència del microorganis-

me, anomenades illots de patogenicitat. Altres factors de virulència es troben en plasmidis capaços de transferir-se horitzontalment entre soques de la mateixa o diferent espècie, i això afavoreix, d’aquesta manera, la disseminació de la virulència. EL PROBLEMA DE LA RESISTÈNCIA ENFRONT DELS ANTIMICROBIANS Els antibiòtics són utilitzats, no tan sols amb fins terapèutics, en clínica i veterinària, sinó que també són emprats en producció animal amb dos propòsits diferents: prevenció d’infeccions bacterianes i promotors del creixement. La majoria dels agents antimicrobians emprats habitualment en medicina humana i veterinària són substàncies de pes molecular relativament baix que inhibeixen el creixement dels bacteris o que poden matar-los a molt baixes concentracions. Com a resultat de l’exposició dels bacteris als antimicrobians, s’han seleccionat un gran nombre de gens de resistència. Aquests gens són usualment transmesos verticalment, però també horitzontalment a traves d’elements genètics mòbils. Els bacteris sensibles a un antimicrobià es poden tornar resistents mitjançant dos mecanismes genètics: mutació i adquisició de nous gens. La mutació és un mecanisme espontani que aporta l’avantatge de crear una subpoblació resistent, en ser els bacteris sensibles ràpidament eliminats per l’antimicrobià. D’aquesta manera, el mecanisme més freqüent de resistència a quinolones sembla ser degut a mutacions als gens que codifiquen les subunitats dels enzims DNA-girasa i topoisomerasa iv. Per una altra banda, els bacteris poden adquirir gens de resistència provinents dels organismes productors d’antimicrobians, i posteriorment modificar-los per al seu benefici. Dins dels elements genètics mòbils que tenen un paper important en la transferència

RESISTÈNCIA I VIRULÈNCIA

horitzontal de la resistència, trobem plasmidis, transposons i cassettes de gens a integrons. Resistència als antimicrobians i virulència dels microorganismes no són fets independents, del cert. Sovint, aquests conceptes o propietats estan fortament relacionats. En aquest article es comenten alguns exemples de la relació resistència-virulència en diferents microorganismes. RELACIÓ VIRULÈNCIA-RESISTÈNCIA EN MICROORGANISMES GRAMNEGATIUS Escherichia coli Una de les relacions que s’han pogut demostrar al llarg de diferents estudis és que l’adquisició de resistència enfront de determinats agents antimicrobians pot dur associat un minvament dels nivells de virulència d’un microorganisme. L’exemple més clar es troba en les soques uropatògenes d’E. coli. És ben conegut que aquestes soques posseeixen determinats factors de virulència que els permeten colonitzar el tracte urinari, produir cistitis, pielonefritis i prostatitis i, fins i tot, arribar a la sang. Molts d’aquests factors de virulència, com l’hemolisina, factor necrotitzant, fímbries P, sistemes de sideròfors, fímbries S, yersiniobactina, autotransportadors de toxines, etc., són en regions del cromosoma anomenades illes de patogenicitat (Hacker et al., 1997). Al llarg dels darrers anys, al nostre país s’ha observat un increment del nivell de resistència a antimicrobians com les quinolones en aquests microorganismes, possiblement degut al fet de ser considerats com a tractament d’elecció per a infeccions del tracte urinari. En aquest període de temps s’han dut a terme estudis on s’analitzaven aïllaments clínics d’E. coli uropatògena causants de cistitis (CT), pielonefritis (PNA) o prostatitis, per a establir-ne el patró de resistència, virulència i la possibilitat que ambdós patrons estiguessin relacionats.

Vila et al. (2002) realitzaren un estudi on varen analitzar ambdós patrons en quaranta-dos aïllaments d’E. coli causants de PNA i cinquanta-vuit de CT en dones. Els resultats mostraren que en les soques resistents a quinolones es produïa una disminució en l’expressió de fímbries de tipus 1, en comparació amb les soques sensibles (p = 0,019). Aquest resultat és similar a l’obtingut per Bagel et al. (1997), que varen mostrar que el percentatge d’aïllaments clínics d’E. coli no fimbriats era més gran en les soques resistents a quinolones que no pas en les sensibles. Cal tenir en compte que les fímbries del tipus 1 són més importants per a la colonització de l’epiteli que no pas del ronyó, mentre que les fímbries P tenen un tropisme més gran pel ronyó (Johnson, 1991). Tanmateix, ha estat observat que la producció d’hemolisina és més freqüent en aïllaments de malalts amb PNA que en malalts amb CT (Johnson, 1991). Malgrat això, un percentatge més gran de soques productores d’hemolisina fou trobat en soques sensibles a quinolones, i també va ser més freqüent en aquestes soques la presència dels gens implicats en virulència cnf1 i sat (Vila et al., 2002). Aquest estudi mostra que aïllaments d’E. coli uropatògenes resistents a quinolones posseeixen menys factors de virulència, i també presenten una disminució en l’expressió de fímbries de tipus 1. Factors de virulència cromosòmics com aerobactina i fímbries P són sovint absents en aïllaments d’E. coli resistents a antimicrobians (Johnson et al., 1988). Una possible explicació a aquests resultats seria: a) Quan la soca és resistent a quinolones per una mutació al codó 83 de la DNA-girasa, aquesta mutació produeix una reducció del grau de superenrotllament del DNA catalitzat per aquest enzim (Bagel et al., 1999). L’expressió d’alguns gens s’ha relacionat amb el superenrotllament negatiu, com és el cas de ﬁmA, que codifica les fímbries de tipus 1. b) Durant el desenvolupament de la re-

S. M. SOTO

sistència a quinolones, probablement facilitada per l’exposició a aquests antimicrobians, aquests agents poden actuar, i incrementen la deleció i transposició de regions de DNA (com les IPA). Aquestes IPA comparteixen algunes característiques de bacteriòfags, i s’ha demostrat que pròfags inserits al cromosoma s’escindeixen per l’activitat del sistema SOS. Com les quinolones activen el sistema SOS, aquests antimicrobians semblen contribuir a l’escissió d’IPA per una via dependent de SOS. Una hipòtesi no exclou l’altra, i ambdós mecanismes poden ser observats concomitantment. De fet, a l’estudi de Vila et al. (2002), soques d’E. coli que no expressen ﬁmA no porten els gens hly i cnf1 associats a IPA. Un altre estudi (Martínez-Martínez et al., 1999) sembla confirmar la hipòtesi abans esmentada, ja que varen trobar que soques resistents a quinolones d’E. coli uropatògenes eren menys hemolítiques que les sensibles a quinolones. L’absència d’hemòlisi pot ser deguda a la manca del gen o a una disminució de la seva expressió. Tanmateix, ha estat trobat (Hariharan et al., 1992) que la resistència a cotrimoxazole, neomicina i tetraciclina en aïllaments d’E. coli procedents de porcs amb diarrea es presentava menys sovint en soques productores d’enterotoxina termolàbil (LT) i hemolisina que en soques sense aquests factors, mentre que la resistència a gentamicina era més freqüent en soques productores de LT i hemolisina que en les no productores. Però la pregunta que sorgeix d’aquests estudis és: l’adquisició de resistència indueix la pèrdua dels factors de resistència, o les soques menys virulentes tendeixen a fer-se més resistents que les que posseeixen menys factors de virulència? Estudis recents realitzats in vitro amb aïllaments d’E. coli uropatògenes han mostrat que els antimicrobians i, concretament, les quinolones, indueixen la pèrdua de factors de virulència continguts en determinades illes de patogenicitat; també poden induir mutacions

en gens puntuals que impedeixin la sortida a l’exterior cell. ular o modifiquin la funcionalitat de determinats factors de virulència, com l’hemolisina (Soto, dades no publicades). Ara queda per elucidar si aquest fenomen de pèrdua de virulència com a causa de guany de resistència es produeix també in vivo, és a dir, que succeeix quan un malalt amb infecció urinària causada per E. coli és tractat amb quinolones i es continuen aïllant E. coli en successives anàlisis. Tindran més o menys factors de virulència? Altres estudis han mostrat que les soques d’E. coli uropatògenes que presentaven fímbries P són més freqüentment resistents a tetraciclina i carbenicill. ina que soques en les quals les fímbries P no són detectades, i totes són resistents a amoxicill. ina, en contrast amb les que no posseeixen fímbries P. Aquesta relació observada entre presència de fímbries P i resistència a antimicrobians en soques de diferents serogrups d’E. coli suggereix la possibilitat de transferència horitzontal dels gens que codifiquen aquestes propietats (Vranes et al., 1994). Salmonella sp. La transferència horitzontal de gens de resistència està sent estudiada arreu per molts equips de recerca, atesa la importància que té aquest mecanisme per a la dispersió de resistències a antimicrobians, no tan sols entre soques de la mateixa espècie, sinó també entre membres d’espècies distintes que tenen en comú un mateix nínxol ecològic. D’uns anys ençà, s’ha trobat la transferència de gens de resistència en combinació amb gens de virulència mitjançada per plasmidis, que solen rebre el nom de plasmidis híbrids de resistènciavirulència. Un dels casos millor estudiats el trobem en soques de Salmonella enterica serotip Typhimurium (Guerra et al., 2004). S. enterica és una espècie zoonòtica que pot adquirir resis-

RESISTÈNCIA I VIRULÈNCIA

tència al medi. Els productes d’origen animal són vectors importants per a la transferència de bacteris resistents als antimicrobians des dels animals cap a l’ésser humà. S. typhimurium (fórmula antigènica [4,5,12:1:1,2]) és un dels serotipus més freqüents com a causa de salmonell. osi, tant en animals com en humans. Moltes soques d’aquest serotipus són multiresistents a quatre o més antimicrobians, i s’han dut a terme nombroses investigacions sobre la seva emergència i prevalença. Els darrers anys, un llinatge d’aquest serotipus, que comprèn soques dels fagotips DT104b, DT120, PNR i NT, caracteritzats per presentar el mateix fenotipus de resistència (ampicill. ina [Amp], cloramfenicol [Cm], estreptomicina [Str], sulfadiazina [Sd] i tetraciclina [Tc]) associat a un plasmidi conjugatiu de 140 kb, s’ha aïllat al nostre país. Aquest perfil de resistència està codificat per gens diferents dels presentats pel llinatge pandèmic DT104. Aquests gens de resistència són: oxa1 (Amp), catA1 (Cm), aadA1a (Str), sul1 (Sd), i tet(B) (Tc). El gen oxa1 només ha estat trobat en aquest grup genòmic i en la configuració de cassette de gens (oxa1-aadA1a), contingut en un integró de classe 1. Aquest integró apareix associat al transposó Tn2603 (derivat del Tn21), que, tanmateix, conté l’operó mer, que confereix resistència al mercuri. Aquestes soques de S. typhimurium no presenten el plasmidi de virulència específic de serotipus (pLT90), i al seu lloc presenten un plasmidi de 140 kb (denominat pUO-StVR2: plasmidi de la Universitat d’Oviedo-Salmonella typhimurium virulència resistència 2), capaç de transferir-se (en posseir l’operó tra), i que du gens de virulència i de resistència. Com també porten gens de virulència els gens spv (salmonella virulence plasmid), que incrementen la taxa de creixement de les salmonell. es a les cèll. ules de l’hoste i afecten la interacció del bacteri amb el sistema immunitari del mateix i el gen rck, que confereix resistència al complement. Com a gens de resistència con-

té l’integró abans esmentat, i també els gens catA1 i tet(B), i el Tn2602. La hipòtesi de la generació d’aquest inusual plasmidi podria ser que al reservori animal, una S. typhimurium amb el seu plasmidi de virulència guanyaria dos o més plasmidis de resistència; després hi hauria un procés de recombinació-transposició entre el plasmidi de virulència i els de resistència que generaria el plasmidi híbrid pUO-StVR2. Aquest plasmidi pertany a la família del pLT90, ja que porta els gens repII, traT, spv i rck, però és més gran per haver incorporat set gens de resistència, cinc dels quals són al Tn2602, i presumiblement també una part important de material críptic. Finalment, aquest plasmidi s’hauria mantingut al reservori animal, i hauria passat de manera esporàdica a humans per mitjà de la cadena alimentària. El darrer està recolzat pel fet d’haver estat aïllat en femtes humanes des de 1993 ençà. RELACIÓ RESISTÈNCIA-VIRULÈNCIA EN MICROORGANISMES GRAMPOSITIUS Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus és la causa més comuna d’infecció adquirida a l’hospital i contribueix significativament a la morbiditat i mortalitat del malalt. L’any 1960, dos anys després de la introducció de la meticill. ina, va ser detectada la primera resistència a aquest antimicrobià. Els següents trenta anys, les soques de S. aureus resistents a meticill. ina (MRSA) varen establir la seva distribució mundial. La incidència de MRSA com una important causa d’infecció nosocomial continua en increment en nombrosos països (Schmitz et al., 1997). El patró de resistències de MRSA inclou resistència enfront de molts no-β-lactàmics, i redueix les opcions terapèutiques. MRSA pot ocasionar infeccions severes en malalts hospitalitzats, especialment en immunodeprimits, i

S. M. SOTO

pot ser fatal. El risc d’adquisició de MRSA està relacionat amb la duració de l’hospitalització, tipus de diagnòstic invasiu i procediments terapèutics, i la dosi i durada de l’administració de l’antimicrobià. S. aureus suposa, aproximadament, el 12 % de les infeccions nosocomials. Malgrat que els pacients rarament moren de bacterièmia nosocomial per S. aureus, ja siguin MRSA o sensibles a meticill. ina (MSSA), aquest organisme posseeix una varietat de factors de virulència, incloent-hi molècules d’adhesió, peptidoglicà de la paret cell. ular, enzims extracell. ulars i toxines. Amb l’excepció de la malaltia mitjançada per toxina, la importància relativa d’aquests factors de virulència i el seu paper patogènic queda sense aclarir. MRSA i MSSA són capaces de produir una varietat de productes extracell. ulars, com coagulasa, leucocidina, hemolisina, toxina exfoliativa, enterotoxina, TSST-1, lipases, nucleases i proteases. La virulència d’una soca de S. aureus és el resultat de la suma d’un nombre d’aquests factors biològics, i no depèn de manera exclusiva de cap d’aquests. Amb l’ajut d’aquestes substàncies, S. aureus és capaç de penetrar al teixit i multiplicar-se localment i parcialment, malgrat el sistema immunitari de l’hoste. Estudis recents (Melzer et al., 2003) demostren un augment de la taxa relativa de mort deguda a infecció bacterièmica per MRSA. La possible explicació de la diferent virulència entre MRSA i MSSA podria raure en la gran tendència de MRSA per a disseminar-se en llocs secundaris. Malalts amb infecció disseminada presentaven taxes de mortalitat més grans que pacients sense infecció o disseminació (p < 0, 001). Si MRSA és més virulent que MSSA i els seus factors d’adherència són importants factors de virulència, aleshores MRSA tindrà una alta tendència a adherirse i causar infeccions en llocs secundaris. S’ha estudiat la correlació entre producció de toxina i sensibilitat a mucopirocina o aminoglucòsids en S. aureus (Schmitz et al., 1997). Així, varen observar que MRSA resistents a mucopirocina s’associaven més freqüentment

a infeccions agudes o cròniques que els sensibles. Això pot ser degut al fet que la mucopirocina sembla inhibir la isoleucina tRNAsintasa. Enterococcus sp. Els enterococs són part de la microbiota intestinal normal. En les darreres dues dècades, els enterococs han estat identificats com a agents causants d’infeccions nosocomials amb alta freqüència, parall. elament a l’adquisició de resistència a antimicrobians d’ús habitual. Emergències d’enterococs resistents a vancomicina (VRE) han alarmat la comunitat per diverses raons: — Aquesta emergència deixa poques opcions per al tractament de la malaltia. — Aquesta resistència s’ha transferit des d’enterococs a S. aureus. — Estudis epidemiològics desenvolupats als EUA i Europa han identificat diferents pressions de selecció per a la proliferació i expansió de VRE. — Un cop establerta la població resistent és difícil eliminar-la. Les infeccions enterocòcciques poden ser degudes, almenys, a dotze espècies, i les més freqüents són E. faecalis i E. faecium. Emergències de llinatges genètics dins d’aquest gènere amb una més gran virulència resulten de l’adquisició de noves marques per intercanvi genètic Aquest fenomen implica una diversitat d’elements genètics, com l’Acmes, un element genètic de 52 kb que codifica resistència a meticill. ina en S. aureus, illes de patogenicitat que codifiquen toxines, adhesines i d’altres factors de virulència associats, conversions de fags per a producció de toxines i adquisició de factors de virulència en plasmidis i transposons. En enterococs, les marques que han estat adquirides per alguns llinatges continuen relacionades amb la capacitat de causar malaltia, incloent-hi determinants de resistència a

RESISTÈNCIA I VIRULÈNCIA

antimicrobians, una toxina citolítica, gelatinasa, sistema d’agregació, producció extracellular de superòxid i proteïnes de la superfície enterocòccica. Totes aquestes marques fan que l’enterococ més resistent i més virulent elimini els seus competidors a l’hora de causar malalties (Mundy et al., 2000). En conclusió, virulència i resistència dels microorganismes són dues característiques que estan íntimament relacionades, i ofereixen als bacteris els avantatges de sobreviure malgrat les defenses de l’hoste i els tractaments amb antimicrobians, i de causar malalties més severes o cròniques. BIBLIOGRAFIA Bagel, S.; Heisig, P.; Wiedemann, B. (1997). «Fluoroquinolone resistance of Escherichia coli frequently is associated with decreased expression of type 1 fimbriae». A: Program and abstracts of the 37 th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy (Toronto). Washington DC: American Society for Microbiology, pàg. 52. Bagel, S.; Hüllen, V.; Wiedemann, B.; Heisig, P. (1999). «Impact of gyrA and parC mutations on quinolone resistance, doubling time, and supercoiling degree of Escherichia coli». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 43, pàg. 868-875. Finlay, B. B.; Falkow, S. (1989). «Common themes in microbial pathogenicity». Microbiol. Rev., vol. 53, pàg. 210230. Guerra, B.; Junker, E.; Miko, A.; Helmuth, R.; Mendoza, M. C. (2004). «Characterization and localization of drug resistance determinants in multidrug-resistant, integron-carrying Salmonella enterica serotype Typhimurium strains». Microbiol. Drug Resist., vol. 2, pàg. 83-91. Hacker, J.; Blum-Oehler, G.; Mühldorfer, I.; Tschäpe, H. (1997). «Pathogenicity islands of virulent bacteria: structure, function and impact on microbial evolution». Mol. Microbiol., vol. 23, pàg. 1089-1097.

Hariharan, H.; Heaney, S.; Bryenton, J.; Daley, J. (1992). «Observations on production of hemolysin, heatlabile enterotoxin and antimicrobial drug resistance among enterotoxigenic Escherichia coli from pigs». Comparative Immunol. Microbiol. Infect. Dis., vol. 15, pàg. 229234. Johnson, J. R. (1991). «Virulence factors of Escherichia coli urinary tract infections». Clin. Microbiol. Rev., vol. 4, pàg. 80-128. Johnson, J. R.; Moseley, S. L.; Roberts, P. L.; Stamm, W. E. (1988). «Aerobactin and other virulence factors genes among strains of Escherichia coli causing urosepsis: association with patient characteristics». Infect. Immun., vol. 56, pàg. 405-412. Martínez-Martínez, L.; Fernández, F.; Perea, E. (1999). «Relationship between haemolysis production and resistance to fluoroquinolones among clinical isolates of Escherichia coli». J. Antimicrob. Chemother., vol. 43, pàg. 277279. Melzer, M.; Eykyn, S. J.; Gransden, W. R.; Chinn, S. (2003). «Is methicillin-resistant Staphylococcus aureus more virulent than methicillin-susceptible Staphylococcus aureus? A comparative cohort study of british patients with nosocomial infection and bacteremia». Clin. Infect. Dis., vol. 37, pàg. 1453-1460. Mundy, L. M.; Sahm, D. F.; Gilmore, M. (2000). «Relationships between enterococcal virulence and antimicrobial resistance». Clin. Microbiol. Rev., vol. 13, pàg. 513-522. Schmitz, F. J.; Mackenzie, C. R.; Geisel, R.; Wagner, S.; Idel, H.; Verhoef, J.; Hadding, U.; Heinz, H. P. (1997). «Enterotoxin and toxic shock syndrome toxin-1 production of methicillin-resistant and methicillin-susceptible Staphylococcus aureus strains». Eur. J. Epid., vol. 13, pàg. 699-708. Smith, H. (1984). «The biochemical challenge of microbial pathogenicity». J. Appl. Bacteriol., vol. 57, pàg. 395-404. Vila, J.; Simon, K.; Ruiz, J.; Horcajada, J. P.; Velasco, M.; Barranco, M.; Moreno, A.; Mensa, J. (2002). «Are quinolone-resistant uropathogenic Escherichia coli less virulent?» J. Infect. Dis., vol. 186, pàg. 1039-1042. Vranes, J.; Schonwald, S.; Zagar, Z. (1994). «Relation between P-fimbriae and resistance to amoxicillin, carbenicillin and tetracycline in uropathogenic strains of Escherichia coli». Lĳec. Vjesn., vol. 116, pàg. 178-181.

Principals grups d’agents antibacterians

Antimicrobians (Joaquim Ruiz, ed.) Treballs de la SCB. Vol. 55 (2004) 91-106

ELS β-LACTÀMICS Elisenda Miró, Alba Rivera i Raúl-Jesús Mesa Servei de Microbiologia, Hospital de la Santa Creu i Sant Pau, Barcelona Adreça per a la correspondència: Elisenda Miró. Servei de Microbiologia, Hospital de la Santa Creu i Sant Pau. Sant Antoni M. Claret, 167. 08025 Barcelona. Adreça electrònica: emiro@santpau.es. RESUM Els β-lactàmics són la família més àmplia dins l’arsenal terapèutic i la més usada tant per l’ampli espectre d’acció com per les seves bones propietats farmacocinètiques. La seva acció és relativament independent de la concentració plasmàtica, tenen una baixa toxicitat i un ampli marge terapèutic. Es classifiquen en penicill. ines, cefalosporines, monobactams i carbapenems, però tots tenen en comú l’anell β-lactàmic, essencial per a l’acció. Són agents bactericides que actuen unint-se covalentment amb les PBP, enzims implicats en la síntesi de la paret bacteriana. El seu espectre d’activitat inclou els bacteris grampositius i gramnegatius, però no rickèttsies, micoplasmes ni micobacteris. Com a mecanismes de resistència s’han descrit alteracions en les PBP que disminueixen l’afinitat de la PBP per l’antibiòtic, alteracions en la permeabilitat cell. ular, els sistemes d’expulsió activa i la producció de β-lactamases. La resistència als β-lactàmics ha esdevingut un problema d’ençà que es van introduir en la pràctica clínica. El seu espectre d’activitat ha anat incrementant al llarg dels anys amb la incorporació de noves molècules, les quals superaven els mecanismes de resistència ja existents. Tanmateix, la progressiva adquisició de nous mecanismes ha limitat l’ús empíric dels β-lactàmics i la seva eficàcia en certes situacions. Paraules clau: β-lactàmics, mode d’acció, mecanismes de resistència. SUMMARY β-lactam antibiotics are among the most commonly used antimicrobial agents. These agents have very favourable pharmacokinetic properties. Their action is relatively independent of plasma concentration, little toxicity and a broad therapeutic margin. They include penicillins, cephalosporins, monobactams, and carbapenems. All of them have a β-lactam ring, which is essential for antibacterial activity. β-lactam antibiotics are bactericidal because they act on PBPs, which are involved in bacterial cell-wall synthesis. Their spectrum of activity included Grampositive and Gram-negative bacteria, but not mycoplasmae, rickettsiae and mycobacteria. The mechanism of resistance to β-lactams involved mutations in PBPs resulting in reduced affinity for β-lactam antibiotics, reduced uptake due to changes in the cell wall, active efflux, and

E. MIRÓ, A. RIVERA I R.-J. MESA

β-lactamase production. Resistance to β-lactam antibiotics has been a problem for as long as these drugs have been used in clinical practice. Their spectrum has increased over the years with the incorporation of new molecules having greater activity against gram-negative bacilli. Nevertheless, the progressive emergence of acquired resistance has limited the empirical use of β-lactams and their efficacy in certain situations. Keywords: β-lactams, action, resistance mechanisms. INTRODUCCIÓ La història dels β-lactàmics comença l’any 1928 quan Fleming va descobrir la penicill. ina G a partir d’una soca de Penicillium notatum. No és, però, fins el 1941 quan es començà a comercialitzar la penicill. ina i a desenvoluparse la recerca per a la síntesi de noves molècules que n’ampliessin l’espectre antibacterià i en milloressin les propietats farmacocinètiques. Actualment, la família dels β-lactàmics és la més nombrosa dins l’arsenal terapèutic, ja que inclou les penicill. ines, les cefalosporines, els monobactams i els carbapenems, i es caracteritza per un ampli espectre antibacterià (Sahm et al., 1985; Donowitz i Mandell, 1988; Livermore, 1996; Marín i Gudiol, 2003). ESTRUCTURA I CLASSIFICACIÓ DELS ANTIBIÒTICS β-LACTÀMICS El nom de la família dels β-lactàmics s’explica per la presència de l’anell β-lactàmic en la seva estructura química (vegeu la figura 1). La unió d’aquest anell a un de secundari origina els diferents grups descrits dins la família (vegeu la taula 1), i condiciona el seu espectre d’acció i les seves propietats farmacocinètiques. Les penicill. ines són un grup d’antibiòtics naturals i semisintètics, derivats de l’àcid 6-aminopenicill. ànic, constituït per un anell β-lactàmic i tiazolidina, a més d’una cadena lateral en posició 6 que defineix l’espectre antimicrobià i les propietats farmacològiques de cada un dels components d’aquest grup. El grup dels inhibidors de β-lactamases amb

ús clínic el componen l’àcid clavulànic, el sulbactam i el tazobactam. En l’àcid clavulànic, l’àtom de sulfur de l’anell tiazolidínic és substituït per un oxigen, i el sulbactam i tazobactam presenten una oxidació del sulfur present a l’anell β-lactàmic. Les cefalosporines es classifiquen en generacions d’acord amb el desenvolupament històric i l’espectre antimicrobià. A més, s’inclouen altres grups de compostos químicament diferents, com les cefamicines, els carbacefems i els oxacefems. El nucli de les cefalosporines és l’àcid 7-aminocefalosporànic, format per la fusió dels anells β-lactàmic i dihidrotiazínic. Les diferències en l’espectre d’activitat i propietats farmacològiques dels membres d’aquest grup resulten de les substitucions de les cadenes laterals situades en les posicions 3 i 7. Les cefamicines comparteixen el mateix nucli però presenten un radical metoxi en posició 7. En els carbacefems, l’àtom de sulfur de l’anell dihidrotiazínic és substituït per un carboni d’un grup metilè, i en els oxacefems l’àtom de sulfur és substituït per un oxigen. Els monobactams són compostos monocíclics, derivats de l’àcid 3-aminomonobactàmic, en què el nitrogen de l’anell β-lactàmic es troba unit a un radical sulfònic que activa el nucli. Finalment, els carbapenems presenten la fusió de l’anell β-lactàmic, en què el sulfur és substituït per un grup metilè, i l’anell pirrolínic. Les substitucions químiques de les cadenes laterals i la disposició espacial d’aquestes condiciona una gran afinitat per les proteïnes fixadores de penicill. ina (PBP) d’un ampli rang de bacteris, i la resistència a la major part de βlactamases.

ELS β-LACTÀMICS

Figura 1.

Estructura química dels β-lactàmics.

MECANISME D’ACCIÓ Els antibiòtics β-lactàmics són agents bactericides que inhibeixen la síntesi del peptidoglicà, principal component estructural de la paret bacteriana; per això la seva acció bactericida només es produeix quan les cèll. ules estan en fase de creixement. El peptidoglicà és constituït per cadenes llargues i parall. eles d’oligosacàrids que alternen residus d’àcid N-acetilglucosamínic (GlcNAc) amb residus d’àcid N-acetilmuràmic (MurNAc), ambdós units per enllaços β-(1-4). A cada unitat de MurNAc es troba unida la cadena lateral d’un tetrapèptid. Les cadenes parall. eles d’oligosacàrids es troben unides transversalment per cadenes polipeptídiques curtes diferents segons l’espècie (Lorian, 1991). La síntesi del peptidoglicà es podria dividir en tres fases. En la primera es produeix la síntesi dels precursors de la paret i té lloc al citoplasma. En la segona, els precursors del peptidoglicà, en forma de GlcNAcMurNAc-pentapèptid-fosfolípid, surten cap a l’exterior de la membrana citoplasmàtica mitjançant la intervenció d’un fosfolípid transportador. I, en la tercera fase, que té lloc a

la paret, es produeix l’acoblament i creixement del peptidoglicà. En aquesta darrera fase intervenen tres enzims: les transglicosilases, encarregades de la unió del GlcNAc-MurNAc-pentapèptid al peptidoglicà mitjançant enllaços β(1-4), les transpeptidases, que formen els ponts interpeptídics que estableixen la unió entre les cadenes d’oligosacàrids i les D,D-carboxipeptidases, que regulen la síntesi del peptidoglicà i impedeixen la transpeptidació. Alguns d’aquests enzims que catalitzen les reaccions d’unió entre els diferents polímers que constitueixen el peptidoglicà són anomenats genèricament PBP (penicillin-binding proteins), per la capacitat d’unir-se covalentment a l’anell β-lactàmic (Lorian, 1991). La majoria de bacteris produeixen diferents PBP, que difereixen pel seu pes molecular, per l’afinitat als β-lactàmics o per la seva funció fisiològica com a transpeptidases, carboxipeptidases o endopeptidases. El mecanisme pel qual els β-lactàmics lisen el bacteri és complex i no està del tot elucidat. S’ha proposat que el grup –CO-N de l’anell βlactàmic funciona com un anàleg estructural del substrat de les PBP implicades en la reac-

E. MIRÓ, A. RIVERA I R.-J. MESA

Taula 1.

Classificació dels β-lactàmics

Classe

Grup

β-lactàmic i via d’administració

Penicill. ines

Penicill. ines naturals

Penicill. ina G, im, iv penicill. ina V o

Aminopenicill. ines

Ampicill. ina, iv amoxicill. ina o

Ureidopenicill. ines

Mezlocill. ina, im, iv piperacill. ina iv

Carboxipenicill. ines

Carbenicill. ina, im, iv ticarcill. ina im, iv

Penicill. ines isoxazòliques

Oxacill. ina, iv, o cloxacill. ina, o dicloxacill. ina o

Inhibidors de

Àcid clavulànic

Amoxicill. ina-àcid clavulànic, iv, o ticarcill. ina-àcid clavulànic iv

β-lactamases

Sulbactam

Ampicill. ina-sulbactam iv, o

Tazobactam

Piperacill. ina-tazobactam iv

Cefalosporines 1a generació

Cefazolina, im, iv cefalotina, iv cefradina, im, iv, o cefalexina, o cefradoxil o

Cefalosporines 2a generació

Cefuroxima, im, iv cefamandole, im, iv cefaclor, o cefuroxima axetil o

Cefalosporines

Cefalosporines 3a generació

Cefotaxima, im, iv ceftriaxona, im, iv ceftazidima, im, iv cefoperazona im, iv Cefibutè, o cefixima, o cefpodoxima, o cefdinir o

Cefalosporines 4a generació

Cefepima, im, iv

Cefamicines

Cefoxitina, im, iv cefotetan im,iv

Oxacefems

Moxalactam im, iv

Carbacefems

Loracarbef o

Monobactams

Aztreonam im, iv

Carbapenems

Imipenem, iv meropenem, iv ertapenem iv

Im: intramuscular; iv: parenteral; o: oral.

ció d’entrecreuament (transpeptidació entre el pèptid del peptidoglicà naixent i el del peptidoglicà acceptor). El β-lactàmic es combina al centre actiu de la transpeptidasa i dóna lloc a un complex enzim-β-lactàmic inactiu i força estable. La inhibició o disminució de la síntesi de la capa de peptidoglicà juntament amb reaccions que desencadenen l’alliberament d’autolisines (amidases i glucosidases) encarregades de degradar la capa del peptidoglicà fa que el bacteri acabi lisant-se per l’acció de tots aquests factors. No obstant això, el mecanisme precís pel qual aquests agents lisen els bacteris sensibles continua sent poc clar (Tomasz, 1979; Spratt, 1983). L’activitat antibacteriana dels β-lactàmics seria, doncs, fruit de la unió covalent de l’antibiòtic amb el centre actiu de la PBP, i s’establiria una competència que interferiria amb el procés normal de transpeptidació o carboxipeptidació (la transglicosilació no es veu afectada pels β-lactàmics) que es tradueix en

una paret cell. ular defectuosa que pot acabar lisant-se. ESPECTRE D’ACTIVITAT L’espectre d’activitat dels β-lactàmics inclou els bacteris gramnegatius, grampositius i espiroquetes. No són actius davant els bacteris intracell. ulars com Chlamydia o Rickettsia, els micoplasmes o els micobacteris. De les penicill. ines naturals (penicill. ina G, penicill. ina V) cal destacar que han estat àmpliament utilitzades des de la seva introducció però les seves indicacions clíniques són cada vegada més limitades per l’aparició de microorganismes resistents. Són actives davant els estreptococs, especialment els estreptococs betahemolítics (Streptococcus pyogenes i S. agalactiae), pneumococs, encara que actualment existeix un alt percentatge de soques resistents, meningococs, gonococs (excepte les soques productores de β-lactamasa), Corynebac-

ELS β-LACTÀMICS

terium diphteriae, Bacillus anthracis, Pasteurella multocida, Treponema pallidum, Actinomyces israelii i bacteris anaerobis amb l’excepció dels productors de β-lactamases. Les aminopenicillines (ampicill. ina, amoxicill. ina) incrementen l’espectre en alguns bacils gramnegatius com E. coli, Proteus mirabilis, Salmonella i Shigella i són més actives que les penicill. ines naturals contra els enterococs, listèries i hemòfils. Les carboxipenicill. ines (ticarcill. ina) i ureidopenicill. ines (piperacill. ina) es caracteritzen per la seva activitat davant Pseudomonas aeruginosa i alguns enterobacteris resistents a aminopenicill. ines. Les ureidopenicill. ines presenten, a més, una bona activitat davant els bacteris anaerobis. Les penicill. ines isoxazòliques resistents a penicill. inases (cloxacill. ina, oxacill. ina) són els antimicrobians d’elecció en el tractament d’infeccions produïdes per estafilococs productors de penicill. inasa. Els inhibidors de β-lactamases (àcid clavulànic, sulbactam, tazobactam) presenten escassa activitat antibacteriana intrínseca però inhibeixen l’activitat enzimàtica. S’utilitzen en combinació amb penicill. ines, les quals protegeixen de la hidròlisi produïda pels enzims i recuperen d’aquesta manera l’activitat del β-lactàmic perduda per acció de les β-lactamases. Les combinacions més utilitzades en clínica són amoxicill. inaàcid clavulànic, ampicill. ina-sulbactam, ticarcill. ina-àcid clavulànic i piperacill. ina-tazobactam. Les cefalosporines de primera generació (cefalotina, cefazolina) són actives davant cocs grampositius, incloent-hi estafilococs productors de penicill. inasa, E. coli, Klebsiella sp. i P. mirabilis. Les cefalosporines de segona generació (cefuroxima, cefamandole) constitueixen un grup heterogeni amb espectre d’activitat variable. En general, presenten una major activitat davant els bacils gramnegatius com Haemophilus inﬂuenzae, Moraxella catarrhalis i alguns enterobacteris, a causa de la resistència davant les β-lactamases dels gramnegatius. Les cefamicines (cefoxitina, cefmetazole), presenten un espectre similar al de les de segona generació però tenen una marcada activitat davant els

bacteris anaerobis. De les cefalosporines de tercera generació, cefotaxima, ceftriaxona i cefixima són actives davant els enterobacteris, estreptococs, H. inﬂuenzae i neissèries, mentre que de ceftazidima i cefoperazona es destaca la seva activitat davant P. aeruginosa. Les cefalosporines de quarta generació (cefepima) mostren activitat davant els enterobacteris i P. aeruginosa resistents a cefalosporines de tercera generació per hiperproducció de la β-lactamasa cromosòmica. També són actives contra els estreptococs i estafilococs, però en aquests darrers l’activitat és inferior a la de les cefalosporines de primera generació. Totes les cefalosporines són inactives davant els enterococs, listèries i estafilococs resistents a la meticill. ina (MRSA). L’espectre de l’aztreonam, únic monobactam amb ús clínic, es limita a bacils gramnegatius aerobis facultatius. Finalment, els carbapenems són els β-lactàmics de més ampli espectre, que inclou bacteris gramnegatius i grampositius, aerobis i anaerobis. Són actius davant els enterobacteris productors i no productors de βlactamases, P. aeruginosa i d’altres bacils gramnegatius no fermentadors com Acinetobacter, hemòfils productors i no productors de β-lactamases, estafilococs excepte els resistents a meticill. ina, estreptococs, pneumococs, enterococs excepte els resistents a ampicill. ina i de bacteris anaerobis com bacteroides, clostridis i fusobacteris. FARMACOCINÈTICA Els β-lactàmics assoleixen ràpidament concentracions plasmàtiques elevades per via parenteral, i l’absorció a través del tracte gastrointestinal és variable per als diferents compostos: en general s’obtenen pics sèrics d’una a dues hores després de la ingestió. La unió a proteïnes plasmàtiques presenta valors compresos entre el 10 % per a carbapenems i el 98 % per a cloxacill. ina. La semivida pren valors entre mitja i dues hores, encara que la d’alguns compostos com la ceftriaxo-

E. MIRÓ, A. RIVERA I R.-J. MESA

na és de 8-9 hores, amb la qual cosa es pot administrar amb intervals de vint-i-quatre hores. Presenten una bona distribució en teixits i fluids corporals; la penetració a través de la barrera hematoencefàlica s’afavoreix quan existeix inflamació meníngia, i s’obtenen concentracions terapèutiques principalment amb cloxacill. ina i cefalosporines de tercera i quarta generació. La penetració intracell. ular és escassa atès que són substàncies poc lipofíliques. La major part de compostos no es metabolitzen, a excepció de la cefalotina i la cefotaxima, que sofreixen desacetilació, i de l’imipenem, que és desactivat per les hidroxipeptidases renals, raó per la qual s’administra amb cilastatina. L’excreció es produeix majoritàriament per via renal, encara que en alguns preparats com la cefoperazona i la ceftriaxona predomina l’excreció biliar. MECANISMES DE RESISTÈNCIA Com en d’altres famílies d’antimicrobians, són diversos els mecanismes de resistència que han desenvolupat els bacteris per fer front als β-lactàmics. Aquests mecanismes poden presentar-se sols, però cada vegada pren més força la hipòtesi que són diversos els mecanismes implicats en una mateixa resistència. Un dels mecanismes de resistència són les alteracions gèniques en les PBP, que confereixen resistència perquè, per una banda, disminueixen l’afinitat de la PBP per l’antibiòtic i, per l’altra, la PBP pot mantenir, en part, la seva funció fisiològica (Georgopapadakou, 1993). Aquest mecanisme de resistència és més freqüent en grampositius com Staphylococcus aureus resistents a la meticill. ina (Katayama et al., 2004), Streptococcus pneumoniae (Pàgliero et al., 2004) o Enterococcus (Arbeloa et al., 2004). Però també en gramnegatius com H. inﬂuenzae (Mendelman et al., 1984), neissèries (Dougherty et al., 1980) o P. mirabilis (Neuwirth et al., 1995), quan el mecanisme no és la producció de β-lactamasa.

La presència en els bacteris gramnegatius d’una membrana externa és ja una barrera per a l’actuació de molts antimicrobians. Un exemple són els bacils gramnegatius no fermentadors, com Pseudomonas, Stenotrophomonas maltophilia o Acinetobacter baumannii, que presenten una resistència intrínseca a la major part de β-lactàmics, atesa la composició de la seva membrana externa (Hancock, 1997). Els β-lactàmics són majoritàriament molècules hidrofíliques que necessiten un canal proteic per a travessar la membrana externa. Aquests canals proteics, anomenats genèricament OMP (outer membrane protein) s’agrupen en diferents famílies (Yen et al., 2002), però a grans trets es classifiquen en funció de l’especificitat que tenen pel substrat. Així, tenim les proteïnes mínimament selectives, les selectives (perquè tenen un lloc específic de reconeixement dins el canal) i les que són altament específiques (Hancock, 1997). Les proteïnes implicades en la resistència als antimicrobians acostumen a pertànyer a les mínimament selectives. Han estat moltes les descripcions d’alteracions en la permeabilitat cell. ular en enterobacteris que, juntament amb d’altres mecanismes de resistència, principalment la producció de β-lactamases, confereixen resistència a la pràctica totalitat de β-lactàmics (Chow i Shlaes, 1991; Raimondi et al., 1991; Miró et al., 1995; Mainardi et al., 1997; Weindorf et al., 1998). També cal citar l’exemple, en P. aeruginosa, de l’alteració de la porina OprD, proteïna altament selectiva, que confereix resistència a l’imipenem (carbapenem) (Wolter, 2004). Tanmateix, les alteracions que disminueixen la permeabilitat de la membrana no confereixen resistència per si mateixes sinó que normalment hi ha altres mecanismes implicats, com l’expressió de β-lactamases o la presència de sistemes d’expulsió activa (Hancock, 1997; Fernández-Cuenca et al., 2003; Miró et al., 2004). Els sistemes d’expulsió activa són proteïnes de transport implicades en l’expulsió de subs-

ELS β-LACTÀMICS

tàncies tòxiques. Es troben tant en bacteris grampositius com gramnegatius. Els gens que codifiquen aquestes proteïnes poden formar part d’un operó, amb un sistema de regulació gènica on un increment de l’expressió comporta un increment en la resistència. També s’han descrit en plasmidis, l’expansió dels quals afavoreix l’expansió de la resistència. Aquests sistemes han estat ben estudiats en Campylobacter jejuni, E. coli, Salmonella enterica, P. aeruginosa, S. pneumoniae i S. aureus i, encara que confereixen principalment resistència a quinolones, també afecten la sensibilitat d’altres famílies d’antimicrobians com els β-lactàmics (Webber i Piddock, 2003; Miró et al., 2004). El principal mecanisme de resistència a βlactàmics és, però, la producció de β-lactamases, que es troben en els microorganismes, ja sigui de manera natural o adquirida. La majoria d’enterobacteris, a excepció de Salmonella i probablement P. mirabilis, codifiquen al seu cromosoma una β-lactamasa, i hi ha una correlació entre el tipus de β-lactamasa i l’espècie bacteriana. Les β-lactamases són enzims que es postula que deriven de les PBP, amb les quals guarden similitud seqüencial i estructural. La seva funció original podria haver estat participar en la síntesi de la paret bacteriana (PérezLlanera, 1997) o fer de protector en aquells microorganismes que produeixen β-lactàmics (Cundliffe, 1989). La desactivació del β-lactàmic per part de la β-lactamasa resulta de la unió no covalent amb l’enzim, el qual hidrolitza l’enllaç amida de l’anell β-lactàmic, i en resulta un derivat àcid inactiu. Els gens que codifiquen β-lactamases poden trobar-se al cromosoma o en plasmidis i, en aquest darrer cas, poden formar part d’estructures mòbils, com els transposons, o d’integrons, estructures amb la capacitat d’integrar nombrosos gens. Tanmateix, s’han descrit enzims de localització plasmídica que en segons quina espècie tenen una localització cromosòmica, com és el cas de la β-lactamasa plasmídica

SHV-1 que es troba al cromosoma de la majoria de les Klebsiella pneumoniae o, a l’inrevés, enzims de localització cromosòmica que han passat a formar part d’elements mòbils, com és el cas de les cefamicinases plasmídiques que deriven de les β-lactamases cromosòmiques d’Enterobacter, Citrobacter i Morganella morganii. Així, pot observar-se que en aquest mecanisme de resistència existeix una gran mobilitat entre diferents espècies bacterianes i diferents zones geogràfiques, principalment, a causa de la presència de diferents elements mòbils i a la pressió selectiva que exerceixen els antibiòtics. D’ençà la seva aparició són múltiples les classificacions de β-lactamases que han sorgit. Actualment se n’usen dues: la classificació d’Ambler (Ambler, 1980), basada en la seqüenciació proteica del gen estructural de la β-lactamasa, i la classificació de Bush, Jacoby i Medeiros, basada en els caràcters funcionals d’aquests enzims, perfil d’hidròlisi de diferents substrats, si són o no inhibits per l’àcid clavulànic, o necessiten ions com el zinc per a ser actius i, per tant, no presenten activitat quan hi ha l’EDTA (quelant de ions) (Bush et al., 1995). Ambdues classificacions estan correlacionades (vegeu la taula 2). En el grup 1 de Bush, s’inclouen les β-lactamases de classe C d’Ambler caracteritzades per hidrolitzar la majoria de β-lactàmics excepte l’imipenem, i es remarca el fet diferencial que són capaces d’hidrolitzar les cefamicines (cefoxitina) i no s’inhibeixen amb l’àcid clavulànic. Inicialment, en aquest grup tots els enzims eren d’origen cromosòmic, però darrerament han aparegut les anomenades cefamicinases plasmídiques, que són enzims que deriven de les primeres i que presenten les mateixes característiques fenotípiques, hidrolitzen la cefoxitina (excepte les ACC) i no són inhibides per l’àcid clavulànic (excepte MOX). El grup 2 és format per sis subgrups (2a, 2b, 2c, 2d, 2e i 2f), tots de la classe A d’Ambler excepte el 2d, que pertany a la classe D. En el subgrup 2a es descriuen les penicill. inases de

E. MIRÓ, A. RIVERA I R.-J. MESA

Taula 2. Classe

Grup

Perﬁl de substrats preferents

molecular funcional

Classificació de les β-lactamases Inhibició

Enzims representatius

AC EDTA

Penicill. ines; cefalosporines de 1a, 2a, 3a generació; monobactams

–

Cromosòmiques dels bacteris gramnegatius com E. coli (constitutiva) o Enterobacter cloacae, Citrobacter freundii, Serratia marcescens, Morganella morganii, Pseudomonas aeruginosa (induïble). En plasmidis: FOX-1 a FOX-5, MIR-1, MOX-1, MOX-2, LAT-1 a LAT-4, CMY 1 a CMY-13, BUT-1, BIL-1, ABA-1, DHA-1.

Penicill. ines

–

Penicill. inases de bacteris grampositius, que poden ser cromosòmiques o plasmídiques.

Penicill. ines; cefalosporines de 1a generació

–

En plasmidis: TEM-1, TEM-2, SHV-1, OHIO-1 i ROB-1. Al cromosoma: SHV-1 de K. pneumoniae.

2be

Penicill. ines; cefalosporines de 1a i 3a generació; monobactams

–

2br

Penicill. ines

–

En plasmidis: TEM-3 a TEM-29, TEM-42, TEM-43, TEM-46 a TEM-50, TEM-52 a TEM-58, TEM-60 a TEM-64, TEM-66 a TEM-72, TEM-75, TEM-79 a TEM-102, TEM-104 a TEM-132; SHV-2 a SHV-53 (excepte SHV-10); CTX-M-1 a CTX-M-33; TOHO-1, TOHO-2, UOE-1 i UOE-2, SFO-1, FEC-1, VEB-1, PER-1, PER-2, GES-1, IBC-1, IBC-2, TLA-1. Al cromosoma: K oxy de Klebsiella oxytoca, KLUA-1 i KLUA-2 de Kluyvera ascorbata, KLUC-1 de Kluyvera cryocrescens i KLUG-1 de Kluyvera georgiana. En plasmidis: TEM-30 a TEM-41, TEM-44 a TEM-45, TEM-51, TEM-59, TEM-65, TEM-73, TEM-74, TEM-76 a TEM-78, TEM-81 a TEM-84, TEM-103 i SHV-10.

–

Penicill. ines (carbenicill. ines) Penicill. ines; cefalosporines de 1a generació; cefuroxima

–

Penicill. ines; cefalosporines de 1a, 2a, 3a generació; carbapenems

–

NMC-A i IMI-1 d’Enterobacter cloacae, SME-1 a SME-3 de Serratia marcescens i L-2 de Stenotrophomonas maltophilia.

Penicill. ines, cefalosporines i carbapenems (excepte els monobactams)

–

En plasmidis: IMP-1 a IMP-17, VIM-1 a VIM-10, MET-1 i GES-2, KPC-1 i KPC-2.

En plasmidis: PSE-1 (CARB-2), PSE-3, PSE-4 (CARB-1), PSE-5 (CARB-7), CARB-3 a CARB-8. Cefalosporinasa cromosòmica induïble de Proteus vulgaris, Proteus penneri, Citrobacter koseri i Citrobacter sedlakii.

–

Al cromosoma: CphA i Sfh-1 d’Aeromonas hydrophila.

–

Al cromosoma. Induïble. L1 i THIN-B de Stenotrophomonas maltophilia i Janthinobacterium lividum.

Penicill. ines (isoxazòliques) Penicill. ines

–

Al cromosoma. FEZ-1 de Legionella gormanii.

+/–

–

OXA-1 a OXA-40.

–

Penicill. inasa cromosòmica o plasmídica de Burkholderia cepacia.

bacteris grampositius. El subgrup 2b engloba la majoria de β-lactamases d’ampli espectre capaces d’hidrolitzar les penicill. ines (ampicil-

lina i ticarcill. ina i, en menor grau, la piperacill. ina), i si la seva expressió és elevada poden arribar a conferir resistència a cefalosporines

ELS β-LACTÀMICS

de primera generació. Són inhibides per l’àcid clavulànic. En aquest grup destaquen les de tipus TEM o SHV, perquè d’aquestes deriven per una part el subgrup 2be, les anomenades βlactamases d’espectre ampliat (BLEA) i, per l’altra, el subgrup 2br, les β-lactamases resistents als inhibidors (IRT). Les BLEA són enzims capaços d’hidrolitzar, a més de les penicill. ines i les cefalosporines de primera generació, les cefalosporines de tercera generació i els monobactams (aztreonam), i són més sensibles que les d’ampli espectre pel que fa a la inhibició per àcid clavulànic. En aquest subgrup trobem, a més de les derivades del tipus TEM o SHV, les β-lactamases de la família CTX-M. També, les IRT es caracteritzen per presentar el mateix perfil d’hidròlisi que les β-lactamases plasmídiques d’ampli espectre, però són resistents als inhibidors de β-lactamases com l’àcid clavulànic, el tazobactam i el sulbactam. La majoria deriven del tipus TEM, d’aquí el nom de IRT (inhibitor resistant TEM-type), encara que també se n’ha descrit una derivada de SHV, la SHV-10. En el subgrup 2c i subgrup 2d tenim les anomenades carbenicill. inases i les oxacill. inases, respectivament. El seu perfil d’hidròlisi és similar a les β-lactamases d’ampli espectre, però són més resistents a l’acció de l’àcid clavulànic; de fet, fenotípicament poden confondre’s amb les IRT. Les mutacions al gen estructural els confereixen activitat davant les cefalosporines de tercera generació, i adquireixen aleshores el fenotipus de BLEA. Algunes oxacill. inases, a més, han adquirit la capacitat d’hidrolitzar els carbapenems. En el subgrup 2e s’inclouen les cefalosporinases cromosòmiques pròpies de Proteus vulgaris, Citrobacter koseri i C. sedlakii. A diferència de les cefalosporinases del grup 1, aquestes pertanyen a la classe A d’Ambler i són inhibides per l’àcid clavulànic. Finalment, el subgrup 2f inclou les noves carbapenemases plasmídiques de classe A d’Ambler, capaces d’hidrolitzar tots els β-lactàmics inclosos els carbapenems. Dins el grup 3, també hi ha tres subgrups, que es poden diferenciar tant pel perfil d’hi-

dròlisi com per la seva estructura molecular. Tots es caracteritzen per pertànyer a la classe B d’Ambler i per necessitar per a la seva acció enzimàtica cations divalents, principalment el zinc (d’aquí que també rebin el nom de metalloenzims). El seu perfil d’hidròlisi inclou tots els β-lactàmics. Inicialment es trobaven al cromosoma de certes espècies com Aeromonas hydrophila, Bacillus sp., Janthinobacterium lividum, Legionella gormanii o S. maltophila, però actualment també se n’han descrit de plasmídiques, com les VIM o IMP en bacils gramnegatius. Finalment hi ha el grup 4, que només inclou la penicill. inasa de Burkholderia cepacia. DETECCIÓ I CARACTERITZACIÓ DELS MECANISMES DE RESISTÈNCIA A β-LACTÀMICS L’increment continuat de la resistència fa que sigui necessari determinar la sensibilitat dels microorganismes amb significació clínica als β-lactàmics (i als antimicrobians en general), no solament per donar un tractament adequat al pacient, sinó també per poder evitar la implantació de soques multiresistents i, per tant, l’aparició de brots nosocomials. Classificar les soques en sensibles o resistents no és suficient, sinó que cal una lectura interpretada dels resultats. Per això, després de realitzar una correcta identificació del bacteri a estudiar, cal conèixer el seu perfil de resistència natural i saber si el patró de resistència que tenim és normal, rar o impossible. Per a determinar aquest patró de resistència cal caracteritzar en molts casos el mecanisme de resistència implicat. Recentment, la Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica ha fet una sèrie de revisions sobre la lectura interpretada de l’antibiograma en bacteris grampositius, enterobacteris i bacils gramnegatius no fermentadors (Cantón, 2002; Torres, 2002; Navarro et al., 2002; Vila i Marco, 2002). Les diferents tècniques per a la detecció de

100

E. MIRÓ, A. RIVERA I R.-J. MESA

les resistències als β-lactàmics estan enfocades a la detecció dels dos principals mecanismes de resistència, la presència en bacteris grampositius de PBP amb afinitat disminuïda i l’expressió de les β-lactamases en bacteris gramnegatius. La major part de tècniques fenotípiques estan estandarditzades per diferents societats, com el National Committee for Clinical Laboratory Standards (2004), el Comité de l’Antibiogramme de la Sociétée Française de Microbiologie (2004) o la Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica (García-Rodriguez et al., 2001). En general, als laboratoris de microbiologia clínica només s’estudia la presència de mecanismes relacionats amb alteracions de les PBP, bàsicament en els gèneres Staphylococcus, Streptococcus i Enterococcus (Torres, 2002). En els estafilococs la resistència a la meticill. ina es deu a la producció de la PBP 2a codificada pel gen mecA (MRSA), a la desactivació de l’antibiòtic per una producció incrementada de la β-lactamasa del grup 2a de Bush (BORSA) i a la producció d’altres PBP modificades (MODSA) amb afinitat disminuïda (Fluit et al., 2001). La producció de la PBP 2a és el tipus de resistència més freqüent i, des de la perspectiva clínica, és important caracteritzar-lo, perquè implica resistència creuada amb la resta de βlactàmics encara que mostrin activitat in vitro. Les soques amb resistència codificada pel gen mecA poden expressar la resistència de manera homogènia o heterogènia. L’expressió homogènia és fàcilment detectada, ja que totes les cèll. ules expressen la resistència; en canvi, l’expressió heterogènia pot ser més difícil de detectar, en funció de la proporció de cèllules que expressin la resistència. En aquests casos la detecció de la resistència es pot afavorir utilitzant medis suplementats amb clorur sòdic (del 2 % al 4 %) o una temperatura d’incubació menor (30 oC), o bé la incorporació en l’antibiograma d’un disc de cefoxitina (30 μg) que, segons el diàmetre de l’halo d’inhibició, ens alertarà de la possible resistència a

oxacill. ina (Cauwelier et al., 2004). A més d’aquestes tècniques fenotípiques també s’usen tècniques moleculars com la PCR (Fluit et al., 2001) o el DNA cycling probe assay [Velogene (Alexon-Trend)], que detecten la presència del gen mecA, o tècniques d’aglutinació, més ràpides i senzilles, basades en la detecció de la proteïna PBP2a, com poden ser MRSA-screen test (Denka-Seikin Co., Japó), o PBP 2 latex aglutination test (Oxoid Limited, RU). La resistència a oxacill. ina mitjançada per la producció de β-lactamasa és, normalment, de baix nivell i pot ser detectada per tècniques de difusió, per un augment de la sensibilitat a oxacill. ina quan aquesta se situa al costat d’un inhibidor de la β-lactamasa com l’àcid clavulànic. La resistència a penicill. ina en S. pneumoniae s’atribueix a alteracions en les PBP, especialment la PBP2. La complexitat genètica dels gens que codifiquen aquestes PBP (gens mosaic) fa que la detecció de la resistència es faci només per tècniques fenotípiques. En el cas que es faci per mitjà de la tècnica de difusió de disc, s’utilitza un disc d’oxacill. ina d’1 μg per a predir la resistència a les penicill. ines. Quan l’halo d’inhibició a oxacill. ina és inferior a 19 mm, la soca es considera moderada o altament resistent a les penicill. ines, per la qual cosa s’ha de determinar la concentració inhibitòria mínima (CIM) (National Committee for Clinical Laboratory Standards, 2004). El gènere Enterococcus és normalment sensible a la penicill. ina i l’ampicill. ina, amb l’excepció d’Enterococcus faecium, en el qual amb molta freqüència es poden trobar soques resistents a causa d’una alteració en la PBP5 . La detecció de la resistència a penicill. ina, ampicill. ina i amoxicill. ina-àcid clavulànic es realitza amb tècniques de sensibilitat estàndards (Torres, 2002). La resistència per producció de β-lactamases és extremadament infreqüent i, atès que no es detecta en l’antibiograma convencional, es recomana efectuar alguna tècnica de detecció en aïllaments de mostres sistèmiques (National Committee for Clinical Laboratory Standards, 2004).

ELS β-LACTÀMICS

En la detecció de mecanismes relacionats amb la producció de β-lactamases, cal diferenciar els microorganismes productors de penicill. inases, com H. inﬂuenzae, M. catarrhalis, Neisseria, estafilococs, enterococs o bacils gramnegatius anaerobis, dels bacils gramnegatius, com enterobacteris o no fermentadors. Per al primer grup s’han desenvolupat diferents mètodes fenotípics per a la detecció precoç: els mètodes cromogènics, els acidimètrics i els iodomètrics (Livermore i Brown, 2001). Cal considerar que un resultat negatiu no descarta completament la resistència: hi poden estar involucrats altres mecanismes, o pot haver-hi una falta d’inducció de l’enzim, com per exemple en els estafilococs, on la producció de β-lactamasa és induïble. En aquests casos es recomana observar el creixement de la perifèria de l’halo d’inhibició del disc d’un βlactàmic, com la penicill. ina, o bé realitzar una altra tècnica de detecció microbiològica com la de Gots, Hodge o el test tridimensional. En general aquestes tècniques es basen a sembrar en una placa una soca sensible als β-lactàmics i situar al mig un disc carregat amb l’antibiòtic a estudiar (per exemple, penicill. ina), del qual parteix una estria de la soca problema (a vegades es fa un solc on s’aboca un extracte del bacteri). Si la soca problema és productora de β-lactamasa, hidrolitzarà l’antibiòtic del seu entorn i permetrà el creixement de la soca sensible al voltant de l’estria (Livermore i Brown, 2001). Per al grup dels enterobacteris i bacils gramnegatius no fermentadors s’han estandarditzat tècniques per a la detecció de la β-lactamasa cromosòmica pròpia d’espècie i per a la detecció de BLEA, però resten encara en estudi tècniques per a la detecció de les cefamicinases plasmídiques i per a les carbapenemases. Dins les β-lactamases cromosòmiques pròpies d’espècie hi ha les del grup 1 de Bush (classe C) constitutives, com la d’E. coli, o induïbles, com les d’Enterobacter, Citrobacter freundii, Morganella morganii, Serratia marces-

101

cens, Providencia, Hafnia alvei, o P. aeruginosa, i les del grup 2e de Bush (classe A) de Proteus vulgaris, P. penneri, Klebsiella oxytoca i Citrobacter koseri. L’expressió de les β-lactamases cromosòmiques induïbles del grup 1 es posa de manifest en l’antibiograma convencional per difusió de disc per la presència d’una imatge d’antagonisme entre inductors dèbils com la cefotaxima o la ceftazidima i inductors forts com la cefoxitina o l’imipenem. Mutacions als gens reguladors originen la desrepressió de l’enzim i disminueixen la sensibilitat a cefalosporines de tercera generació, aztreonam i, en menor grau, cefepima (cefalosporina de quarta generació). L’expressió de la β-lactamasa cromosòmica constitutiva d’E. coli és basal i no confereix resistència, sinó que per mutacions s’hiperexpressa i passa a tenir el mateix fenotipus que les induïbles un cop s’han desreprimit. Finalment hi ha les induïbles del grup 2e, que també s’expressen normalment a nivells basals però que quan s’hiperexpressen el fenotipus que donen és el d’una soca portadora d’una BLEA, perquè la β-lactamasa en aquest cas és sensible a l’acció de l’àcid clavulànic. Derivades de les β-lactamases cromosòmiques del grup 1 de Bush són les cefamicinases plasmídiques, on el patró fenotípic resulta indistingible de la hiperproducció dels enzims del grup 1. Malgrat que no existeixen tècniques estandarditzades per a la detecció s’han descrit algunes tècniques que poden resultar d’utilitat. Aquestes tècniques es basen en la detecció de la hidròlisi de cefamicines i en els efectes de compostos com Ro 47-8284, Ro 481220, Ro 48-1256 o cloxacill. ina, que inhibeixen les β-lactamases de tipus AmpC (Manchanda i Singh, 2003). La detecció de les β-lactamases d’espectre ampliat (BLEA) es basa en la propietat d’aquests enzims de ser inhibits per l’àcid clavulànic. L’NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards, 2004) estableix una sèrie de recomanacions que inclouen mètodes de cribratge, on s’indiquen nous punts

102

E. MIRÓ, A. RIVERA I R.-J. MESA

de tall per a cefotaxima, ceftazidima, cefpodoxima, ceftriaxona o aztreonam i proves confirmatòries basades en una reducció en la CIM de tres o més dobles dilucions o un augment de com a mínim 5 mm dels halos d’inhibició de cefotaxima o ceftazidima en presència de 4 μg/ml d’àcid clavulànic respecte de la cefalosporina testejada sola. Aquestes tècniques estan indicades per a soques d’E. coli, K. pneumoniae i K. oxytoca, encara que teòricament poden ser aplicables a altres espècies. Altres mètodes de fàcil aplicació són el test de sinergia amb doble disc i la determinació de la CIM a una cefalosporina de tercera o quarta generació amb i sense àcid clavulànic per mitjà de l’Etest (AB Biodisk, Solna, Suècia). Els tests de sinergia amb doble disc consisteixen en la realització d’un antibiograma convencional situant un disc d’amoxicill. inaclavulànic a una distància de 2,5-3 cm d’un disc d’una cefalosporina de tercera o quarta generació i aztreonam. La presència de BLEA es posa de manifest per la formació d’una zona expandida dels halos d’inhibició de les cefalosporines o aztreonam situats a la zona pròxima al disc d’amoxicill. ina-clavulànic. Per a la tècnica de l’Etest s’utilitzen tires que contenen en un extrem un gradient de cefotaxima o ceftazidima i a l’altre extrem un gradient de la cefalosporina amb una concentració fixa de 4 μg d’àcid clavulànic, de manera que una disminució de tres o més dilucions de la cefalosporina amb àcid clavulànic indica la presència d’una BLEA (Bradford, 2001). La detecció de BLEA amb la utilització d’aquests procediments en aquells enterobacteris o P. aeruginosa que presenten les β-lactamases cromosòmiques és difícil, especialment si estan desreprimits, perquè són enzims resistents a l’àcid clavulànic i, per tant, s’emmascara l’efecte sinèrgic. En aquests casos, aquest efecte es pot apreciar millor amb cefepima. Finalment cal assenyalar les metodologies per a la detecció de les β-lactamases capaces d’hidrolitzar els carbapenems, que en els darrers anys han pres importància pel fet que han

estat descrites en diferents elements mòbils, raó per la qual han pogut trobar-se en espècies fins ara sensibles als carbapenems com les dels enterobacteris. Els mètodes que s’han desenvolupat es basen en la utilització de quelants metàll. ics com EDTA o tiols i, per tant, només són útils per a la detecció de les carbapenemases de la classe B que requereixen cations divalents (Zn 2+) com a cofactors per a la seva activitat. La tècnica més emprada és la comparació dels halos d’inhibició d’imipenem respecte els d’imipenem amb EDTA, bé per la tècnica de difusió de disc, bé per la de l’Etest. En aquest darrer cas, una disminució de la CIM de tres o més dobles dilucions en la zona d’imipenem-EDTA respecte de la zona d’imipenem o la presència d’una zona fantasma entre les dues seccions de gradients indica la possible presència d’una metall. o-β-lactamasa. També s’ha utilitzat el test de Hodge modificat, que permet detectar la hidròlisi enzimàtica de carbapenems (Walsh et al., 2002; Lee et al., 2003). Les metodologies descrites fins ara només detecten la possible existència del mecanisme de resistència. Per a la caracterització del mecanisme és necessari recórrer a les tècniques moleculars estàndards (isoelectroenfocament, hibridacions, PCR, seqüenciació) que precisen el mecanisme o mecanismes implicats. Caracteritzar els diferents mecanismes de resistència permet confirmar la lectura interpretada de l’antibiograma i conèixer la prevalença de cadascun dels diferents mecanismes implicats. EPIDEMIOLOGIA DE LA RESISTÈNCIA ALS β-LACTÀMICS Els β-lactàmics, doncs, són la família més àmplia dins l’arsenal terapèutic i la més usada per les seves bones propietats farmacocinètiques. Tanmateix, però, la mateixa amplitud es pot trobar en els mecanismes de resistència

ELS β-LACTÀMICS

que els microorganismes han anat adquirint. Només sorgir la penicill. ina aparegueren les penicill. inases; neixen les aminopenicill. ines i les cefalosporines de primera, segona i tercera generació i apareixen les β-lactamases d’ampli espectre, les cefamicinases i les β-lactamases d’espectre ampliat, respectivament. A aquesta evolució estructural de les β-lactamases cal afegir que són enzims que es troben en estructures genètiques que els permeten una ràpida difusió. Per tant, tenim una constant evolució i expansió del principal mecanisme de resistència, unida a la idea que en tota resistència es veuen involucrats diferents mecanismes; d’aquí la importància d’un seguiment epidemiològic. La resistència a la meticill. ina en els estafilococs, freqüent tant en l’àmbit hospitalari com en la comunitat, és un exemple del desenvolupament i expansió d’una resistència després d’haver-se introduït l’antibiòtic en l’ús clínic (McNeil i Solomon, 1985; Ayliffe, 1997; Trilla i Wenzel, 1991). Tanmateix, estudis primerencs sobre l’expansió de soques MRSA mostren la presència d’aquestes soques en poblacions on la meticill. ina encara no havia estat introduïda (Polònia, Turquia o l’Índia). A partir de 1960, quan foren descrites les primeres soques a Anglaterra i als Estats Units, i també els primers brots nosocomials, el nombre de soques resistents i de brots nosocomials descrits ha anat incrementant considerablement, sobretot al continent europeu i Austràlia. El 1986, un estudi multicèntric realitzat entre setanta-dos hospitals de l’Estat espanyol mostra que la prevalença de soques MRSA fou de l’1,5 % de les soques de S. aureus aïllades en un dia concret. Actualment la seva prevalença en hospitals i residències varia entre el 10 % i el 40 %, i són soques emergents de la comunitat (Marín i Gudiol, 2003.) La resistència a la penicill. ina en S. pneumoniae s’inicia el 1967 a Austràlia, on es va descriure la primera soca resistent i, posteriorment, a Nova Guinea i Sud-àfrica. A l’Estat espanyol entre els anys 1979 i 1982 s’observà

103

que un 8,7 % de les soques eren resistents a la penicill. ina. Actualment, aquest percentatge s’ha vist incrementat de manera significativa fins a arribar al voltant d’un 40 %, i la meitat de les soques presenten una resistència d’alt nivell (Mirelis et al., 2001). De manera parall. ela pot observar-se un increment de la resistència a la resta de β-lactàmics, amb un 10 % de soques resistents a la cefotaxima, però no s’ha aïllat cap soca resistent a l’imipenem (Marín i Gudiol, 2003). L’aparició de les β-lactamases ha anat lligada a la introducció en clínica dels β-lactàmics. La descripció de la primera β-lactamasa fou a la dècada dels anys cinquanta, poc després d’introduir-se la penicill. ina en clínica (Moellering, 1993). De la mateixa manera, poc després d’introduir-se les aminopenicill. ines i carboxipenicill. ines, es descriu el 1965 la TEM-1 (Mathew, 1979) i el 1972 la SHV-1 (Roupas i Pitton, 1974), de les quals han derivat la quasi totalitat de BLEA. Avui dia, només un percentatge molt reduït d’estafilococs (menys del 10 %) són sensibles a la penicill. ina (Torres, 2002) i les β-lactamases d’ampli espectre TEM-1 o SHV-1 s’han estès de tal manera que es poden descriure tant en enterobacteris com en Haemophilus o Neisseria (Livermore, 1996). Posteriorment, amb el desenvolupament de nous β-lactàmics aquests enzims ampliaren el seu espectre d’activitat, i sorgiren les primeres BLEA. La primera fou la SHV-2, aïllada l’any 1983 a Alemanya, i de la qual dos anys més tard es descriu el primer brot nosocomial a França (Gniadkowski, 2001). Actualment hi ha més d’un centenar de BLEA descrites (http://www.lahey.org/studies/webt.htm), cosa que demostra la ràpida evolució i expansió d’aquests enzims. A més de la TEM o SHV, s’han descrit noves famílies com les OXA, CTX-M, PER, VEB i GES. Les oxacill. inases comencen a descriure’s cap als anys vuitanta (Naas i Nordmann, 1999). Les primeres, OXA-1, OXA-2 o OXA-10, es caracteritzen per ser penicill. inases amb una major afinitat per la cloxacill. ina. Posteriorment, aparegueren en-

104

E. MIRÓ, A. RIVERA I R.-J. MESA

zims derivats de l’OXA-2 i de l’OXA-10 capaços d’hidrolitzar les cefalosporines de tercera generació, i l’any 1993 es descriu la primera oxacill. inasa amb activitat davant els carbapenems (Paton et al., 1993). Els primers enzims de la família de les CTX-M, tots considerats com a BLEA, es van descriure l’any 1990 de soques d’E. coli aïllades a França d’un pacient provinent d’Itàlia. Deu anys després aquests enzims han estat descrits en la pràctica totalitat d’enterobacteris arreu del món (Navarro i Miró, 2002). També són fruit de l’expansió i l’evolució les cefamicinases, que confereixen el mateix problema terapèutic que la desrepressió de la β-lactamasa cromosòmica però amb l’agreujament que aquests enzims es troben situats en plasmidis i, per tant, poden difondre’s més ràpidament, amb el risc de conferir brots nosocomials. La majoria d’aquests enzims han estat descrits en E. coli i K. pneumoniae, encara que s’incrementa el nombre de soques d’altres espècies (Pérez-Pérez i Hanson, 2002). Finalment, també cal citar la resistència adquirida a l’imipenem en enterobacteris, P. aeruginosa i A. baumannii (Livermore, 1997). Pel que fa a les carbapenemases adquirides de classe A, l’any 1982 es descriu l’enzim SME-1 de dues soques de S. marcescens aïllades a Anglaterra. El 1984 l’IMI-1 d’una soca d’Enterobacter cloacae al sud de Califòrnia, el 1990 a França l’NMC-A, també d’un E. cloacae, i el 2001 el KPC-1 aïllat als Estats Units en K. pneumoniae. De moment, aquests enzims es presenten en soques puntuals, i les β-lactamases de tipus SME són les més freqüentment aïllades, principalment als Estats Units. En canvi, la prevalença de les carbapenemases adquirides de classe B pren cada cop més importància, no solament perquè s’incrementa el nombre de soques amb aquests enzims, sinó que, també, ja s’han descrits diferents brots nosocomials. A l’Estat espanyol la primera carbapenemasa adquirida fou la VIM-2 descrita el 1996 en P. aeruginosa (Prats et al., 2002) i des d’aleshores la seva prevalença és molt baixa (Miró et al., 2004), i s’ha descrit

també en E. coli (Larrosa et al., 2004) i K. pneumoniae (Tórtola et al., 2004). BIBLIOGRAFIA Ambler, R. P. (1980). «The structure of beta-lactamases». Philos. Trans. R. Soc. Lon. Biol. Sci., vol. 289, pàg. 321-331. Arbeloa, A.; Segal, H.; Hugonnet, J. E.; Josseaume, N.; Dubost, L.; Brouard, J. P.; Gutmann, L.; Mengin-Lecreulx, D.; Arthur, M. (2004). «Role of class A penicillin-binding proteins in PBP5-mediated betalactam resistance in Enterococcus faecalis». J. Bacteriol., vol. 186, pàg. 1221-1228. Ayliffe, G. A. J. (1997). «The progressive intercontinental spread of methicillin-resistant Staphylococcus aureus». Clin. Infec. Dis., vol. 24 (supl. 1), pàg. S74-S79. Bradford, P. A. (2001). «Extended-spectrum beta-lactamases in the 21 st century: characterization, epidemiology, and detection of this important resistance threat». Clin. Microbiol. Rev., vol. 14, pàg. 933-951. Bush, K.; Jacoby, G. A.; Medeiros, A. A. (1995). «A functional classification scheme for beta-lactamases and its correlation with molecular structures». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 39, pàg. 1211-1233. Cantón, R. (2002). «Lectura interpretada del antibiograma: ¿ejercicio intelectual o necesidad clínica?» Enferm. Infecc. Microbiol. Clin., vol. 20, pàg. 176-186. Cauwelier, B.; Gordts, B.; Descheemaecker, P.; Landuyt, H. van (2004). «Evaluation of a disk diffusion method with cefoxitin (30 μg) for detection of methicillinresistant Staphylococcus aureus». Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis., vol. 23, pàg. 389-392. Chow, J. W.; Shlaes, D. M. (1991). «Imipenem resistance associated with the loss of a 40 kDa outer membrane protein in Enterobacter aerogenes». J. Antimicrob. Chemother., vol. 28, pàg. 499-504. Cundliffe, E. (1989). «How antibiotic-producing organisms avoid suicide». Annu. Rev. Microbiol., vol. 43, pàg. 207-233. Donowitz, G.; Mandell, G. L. (1988a). «Beta-lactam antibiotics (First of two parts)». New England J. Med., vol. 25, pàg. 419-426. — (1988b). «Beta-lactam antibiotics (Second of two parts)». New England J. Med., vol. 25, pàg. 490-500. Dougherty, T. J.; Koller, A. E.; Tomasz, A. (1980). «Penicillin-binding proteins of penicillin-susceptible and intrinsically resistant Neisseria gonorrhoeae». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 18, pàg. 730-737. Fernández-Cuenca, F.; Martínez-Martínez, L.; Conejo, M. C.; Ayala, J. A.; Perea, E. J.; Pascual, A. (2003). «Relationship between beta-lactamase production, outer membrane protein and penicillin-binding protein profiles on the activity of carbapenems against clinical iso-

ELS β-LACTÀMICS lates of Acinetobacter baumannii». J. Antimicrob. Chemother., vol. 51, pàg. 565-574. Fluit, A. D. C.; Visser, M. R.; Schmitz, F. J. (2001). «Molecular detection of antimicrobial resistance». Clin. Microbiol. Rev., vol. 14, pàg. 836-871. García-Rodríguez, J. A.; Cantón, R.; García-Sánchez, J. E.; Gómez-Lus, M. L.; Martínez-Martínez, L.; Rodríguez-Avial, C. (2001). «Métodos básicos para el estudio de la sensibilidad a los antimicrobianos». A: Picazo, J. J. [ed.] Procedimientos en microbiología clínica. http://www.seimc.org. Georgopapadakou, N. H. (1993). «Penicillin-binding proteins and bacterial resistance to beta-lactams». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 37, pàg. 2045-2053. Gniadkowski, M. (2001). «Evolution and epidemiology of extended-spectrum beta-lactamases (ESBLs) and ESBLproducing microorganisms». Clin. Microbiol. Infec. Dis., vol. 7, pàg. 597-608. Hancock, R. (1997). «The bacterial outer membrane as a drug barrier». Trends Microbiol., vol. 5, pàg. 37-42. Katayama, Y.; Zhang, H. Z.; Chambers, H. F. (2004). «PBP 2a mutations producing very-high-level resistance to beta-lactams». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 48, pàg. 453-459. Larrosa, M. N.; Miró, E.; Bartolomé, R. M.; Planeéis, I.; Navarro, F.; Tórtola, T.; Lavilla, S.; Palomar, M.; Prats, G. (2004). «Escherichia coli multirresistente productora de una metalo-beta-lactamasa». Enferm. Infecc. Microbiol. Clin., vol. 22 (supl. 1), pàg. 124. Lee, K.; Lim, Y. S.; Yong, D.; Yum, J. H.; Chong, Y. (2003). «Evaluation of the Hodge test and the imipenem-EDTA double-disk synergy test for differentiating metallo-beta-lactamase-producing isolates of Pseudomonas spp. and Acinetobacter spp.» J. Clin. Microbiol., vol. 41, pàg. 46234629. Livermore, D. M. (1996). «Beta-lactams: mode of action and mechanisms of bacterial resistance». A: Lorian, V. [ed.] Antibiotics in Laboratory Medicine. 4a ed. Baltimore: Williams and Wilkins, pàg. 505-578. — (1997). «Acquired carbapenemases». J. Antimicrob. Chemother., vol. 39, pàg. 673-676. Livermore, D. M.; Brown, D. F. J. (2001). «Detection of beta-lactamase mediated resistance». J. Antimicrob. Chemother., vol. 48, pàg. 59-64. Lorian,V. (1991). Antibiotics in laboratory medicine. 3a ed. Londres: Williams and Wilkins, cap. 16, pàg. 599-664. Mainardi, J. L.; Mugnier, P.; Coutrot, R.; Buu-Hoï, A.; Collatz, E.; Gutmann, L. (1997). «Carbapenem resistance in a clinical isolate of Citrobacter freundii». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 41, pàg. 2352-2354. Manchanda, V.; Singh, N. P. (2003). «Occurrence and detection of AmpC beta-lactamases among Gram-negative clinical isolates using a modified three-dimensional test at Guru Tegh Bahadur Hospital, Delhi, India». J. Antimicrob. Chemother., vol. 51, pàg. 415-418. Marín, M.; Gudiol, F. (2003). «Antibióticos betalactámicos». Enferm. Infecc. Microbiol. Clin., vol. 21, pàg. 42-55.

105

Mathew, M. (1979). «Plasmid mediated beta-lactamases of gram-negative bacteria: propierties and distribution». J. Antimicrob. Chemother., vol. 5, pàg. 349-358. McNeil, M. M.; Solomon, S. L. (1985). «The epidemiology of methicillin-resistant Staphylococcus aureus». Antimicrob. Newsletter, vol. 7, pàg. 49-56. Mendelman, P. M.; Chaffin, D. O.; Stull, T. L.; Rubens, C. E.; Mack, K. D.; Smith, A. L. (1984). «Characterization of non-beta-lactamase-mediated ampicillin resistance in Haemophilus inﬂuenzae». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 26, pàg. 235-244. Mirelis, B.; Sánchez, F.; Pericas, R.; Miró, E.; Roig, C.; Coll, P.; Prats, G. (2001). «Sensibilidad del neumococo a los antimicrobianos». Vacunas, vol. 2, pàg. 32-37. Miró, E.; Alonso, C.; Navarro, F.; Mirelis, B.; Prats, G. (1995). «Resistencia al imipenem en Enterobacter aerogenes». Enferm. Infecc. Microbiol. Clin., vol. 13, pàg. 278282. Miró, E.; Navarro, F.; Gómez, L.; Pericas, R.; Sánchez, F.; Mirelis, B.; Coll, P. (2004). «Carbapenemasas en Pseudomonas aeruginosa: seguimiento epidemiológico desde 1996». Enferm. Infecc. Microbiol. Clin., vol. 22 (supl. 1), pàg. 157. Miró, E.; Vergés, C.; García, I.; Mirelis, B.; Navarro, F.; Coll, P., Prats, G.; Martínez-Martínez, L. (2004). «Resistencia a quinolonas y betalactámicos en Salmonella enterica, y su relación con mutaciones en las topoisomerasas, alteraciones en la permeabilidad celular y expresión de un mecanismo de expulsión activa». Enferm. Infecc. Microbiol. Clin., vol. 22, pàg. 204-211. Naas, T.; Nordmann, P. (1999). «OXA-type beta-lactamases». Current Pharmaceutical Design., vol. 5, pàg. 865879. National Committee for Clinical Laboratory Standards (2004). «Performance standards for antimicrobial susceptibility testing». Fourteenth Informational Supplement. NCCLS document M100-S14. Wayne, Pa: NCCLS. Navarro F.; Miró, E. (2002). «Update on CTX-M-type beta-lactamases». Rev. Med. Microbiol., vol. 13, pàg. 63-73. Navarro, F.; Miró, E.; Mirelis, B. (2002). «Lectura interpretada del antibiograma de enterobacterias». Enferm. Infecc. Microbiol., vol. 20, pàg. 225-34. Neuwirth, C.; Siébor, E.; Duez, J. M.; Péchinot, A.; Kazmierczak, A. (1995). «Imipenem resistance in clinical isolates of Proteus mirabilis associated with alterations in penicillin-binding proteins». J. Antimicrob. Chemother., vol. 36, pàg. 335-342. Pàgliero, E.; Chesnel, L.; Hopkins, J.; Croize, J.; Dideberg, O.; Vernet, T.; Diguilmi, A. M. (2004). «Biochemical characterization of Streptococcus pneumoniae penicillin-binding protein 2b and its implication in beta-lactam resistance». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 48, pàg. 1848-1855. Paton, R.; Miles, R. S.; Hood, J.; Amyes, S. G. B. (1993). «ARI-1: Beta-lactamase mediated imipenem resistance in Acinetobacter baumannii». Int. J. Antimicrob. Agents., vol. 2, pàg. 81-88.

106

E. MIRÓ, A. RIVERA I R.-J. MESA

Pérez-Llanera, F.; Martín, J. F.; Galleni, M.; Coque, J. J.; Fuente, J. L.; Frere, J. M.; Liras, P. (1997). «The bla gene of the cephamycin cluster of Streptomyces clavuligerus encodes a class A beta-lactamase of low enzymatic activity». J. Bacteriol., vol. 179, pàg. 6035-6040. Pérez-Pérez, F. J.; Handson, N. D. (2002). «Detection of plasmid-mediated AmpC beta-lactamase genes in clinical isolates by using multiplex PCR». J. Clin. Microbiol., vol. 40, pàg. 2153-2162. Prats, G.; Miró, E.; Mirelis, B.; Poirel, L.; Bellais, S.; Nordmann, P. (2002). «First isolation of a carbapenemhydrolyzing beta-lactamase in Pseudomonas aeruginosa in spain». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 46, pàg. 932933. Raimondi, A.; Traverso, A.; Nikaido, H. (1991). «Imipenem- and meropenem-resistant mutants of Enterobacter cloacae and Proteus rettgeri lack porins». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 35, pàg. 1174-1180. Roupas, A.; Pitton, J. (1974). «R factor and chromosomal resistance to ampicillin in Escherichia coli». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 5, pàg. 186-191. Sahm, D. F.; Thonsberry, C.; Jones, R. N. (1985). «Betalactam antibiotics: the original and penicillinase-resistant penicillins». Antimicrob. Newsletter, vol. 2, pàg. 5-7. Spratt, G. (1983). «Penicilin-binding proteins and the future of beta-lactam antibiotics». J. Gen. Microbiol., vol. 129, pàg. 1247-1250. Tomasz, A. (1979). «The mechanism of the irreversible antimicrobial effects of penicillin: how the beta-lactam antibiotics kill and lyse bacteria». Ann. Rev. Microbiol., vol. 33, pàg. 113-137. Torres, C. (2002). «Lectura interpretada del antibiograma de cocos grampositivos». Enferm. Infecc. Microbiol. Clin., vol. 20, pàg. 354-364.

Tórtola, M. T.; Lavilla, S.; Miró, E.; Navarro, F.; Mirelis, B.; Prats, G. (2004). «Carbapenemasa VIM-1 producida por Klebsiella pneumoniae». Enferm. Infecc. Microbiol. Clin., vol. 22 (supl. 1), pàg. 107. Trilla, A.; Wenzel, R. P. (1991). «Infecciones nosocomiales por Staphylococcus aureus resistentes a la meticilina. Un reto para el control de infecciones». Enferm. Infecc. Microbiol. Clin., vol. 4, pàg. 193-195. Vila, J.; Marco, F. (2002). «Lectura interpretada del antibiograma de los bacilos gramnegativos no fermentadores». Enferm. Infecc. Microbiol. Clin., vol. 20, pàg. 225-234. Walsh, T. R.; Bolmstrom, A.; Qwarnstrom, A.; Gales, A. (2002). «Evaluation of a new E-test for detecting metallo-beta-lactamases in routine clinical testing». J. Clin. Microbiol., vol. 40, pàg. 2755-2759. Webber, M. A.; Piddock, L. J. V. (2003). «The importance of efflux pumps in bacterial antibiotic resistance». J. Antimicrob. Chemother., vol. 51, pàg. 9-11. Weindorf, H.; Achmidt, H.; Martin, H. H. (1998). «Contribution of overproduced chromosomal beta-lactamase and defective outer membrane porins to resistance to extended-spectrum beta-lactam antibiotics in Serratia marcescens». J. Antimicrob. Chemother., vol. 41, pàg. 189195. Wolter, D. J.; Hanson, N. D.; Lister, P. D. (2004). «Insertional inactivation of oprD in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa leading to carbapenem resistance». FEMS Microbiol. Lett., vol. 236, pàg. 137-143. Yen, M. R.; Peabody, C. R.; Partovi, S. M.; Zhai, Y.; Tseng, Y. H.; Saier, M. H. Jr. (2002). «Protein-translocating outer embrane porins of Gram-negative bacteria». Biochim. Biophys. Acta, vol. 1562, pàg. 6-31.

Antimicrobians (Joaquim Ruiz, ed.) Treballs de la SCB. Vol. 55 (2004) 107-119

ANTIBIÒTICS AMINOGLICÒSIDS M. Pilar Goñi, 1 M. Carmen Agudo 2 i Rafael Gómez-Lus 1 1 Centro de Referencia Microbiológico de Aragón, Departamento de Microbiología,

Facultat de Medicina, Universitat de Saragossa. 2 Departamento de Medicina Preventiva y Salud Pública, Facultat de Medicina,

Universitat de Saragossa. Adreça per a la correspondència: M. Pilar Goñi. Centro de Referencia Microbiológico de Aragón, Departamento de Microbiología, Facultat de Medicina, Universitat de Saragossa. Domingo Miral, s/n. 50009 Saragossa. Adreça electrònica: pgoni@unizar.es. RESUM Els aminoglicòsids són antibiòtics que varen ésser introduïts en la pràctica clínica a mitjan anys quaranta, en els albors de l’era antibiòtica. Actuen sobre els ribosomes i són actius enfront d’un gran nombre de patògens. Actualment es coneixen diferents mecanismes de resistència i, sense cap mena de dubte, la modificació i desactivació dels antibiòtics és el més important. Paraules clau: aminoglicòsid, mecanisme d’acció, resistència. SUMMARY Aminoglycosides were introduced in clinical training in the middle of the forties, in the beginning of the antibiotic era. Those agents act in ribosomes, and are active against a great number of pathogens. Currently different resistance mechanisms are known, being, surely, antibiotics modification and inactivation the most important of all. Keywords: aminoglycoside antibiotics, mechanism of action, resistance. INTRODUCCIÓ El primer antibiòtic aminoglicòsid, l’estreptomicina, va ésser descobert el 1944, i és també el primer antibiòtic actiu enfront de Mycobacterium tuberculosis (Waskaman, 1943; Schatz et al., 1944). Posteriorment, s’aïllaren i intro-

duïren en la pràctica clínica un gran nombre de compostos com la neomicina (1949), kanamicina (1957), paromomicina i espectinomicina (1959), gentamicina (1963) i tobramicina (1967), tots provinents de Streptomyces, Bacillus o Micromonospora. Però la toxicitat d’aquestes molècules, juntament amb l’aparició

108

M. P. GOÑI, M. C. AGUDO I R. GÓMEZ-LUS

de bacteris resistents derivada de llur àmplia utilització, en limitaren l’ús. Des d’aleshores ençà, els esforços adreçats a reduir-ne la toxicitat i evitar els mecanismes de resistència varen donar com a resultat el desenvolupament de noves molècules semisintètiques, que s’obtingueren per modificació química de les molècules preexistents. Podem esmentar com a exemple la dibekacina i l’amikacina (1972), que són derivats de kanamicina B i A, respectivament, o la sisomicina i les netilmicines, derivats de la gentamicina. ESPECTRE D’ACTIVITAT Actualment, els antibiòtics aminoglicòsids continuen essent actius davant una gran part dels bacils aerobis gramnegatius. En infeccions greus produïdes per aquests microorganismes són emprades freqüentment en combinació amb β-lactàmics. L’efecte sinèrgic que presenten amb els antimicrobians que actuen a la paret cell. ular, com penicill. ines, cefalosporines, monobactam, carbapenem o glicopèptids, els fa actius davant Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, estreptococs del grup viridans, Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcescens o Listeria monocytogenes (Eliopoulos i Moellering, 1996). L’estreptomicina té més activitat in vitro davant M. tuberculosis i l’espectinomicina s’ha emprat com a tractament en la infecció gonocòccica. Davant Haemophilus sp. i Legionella sp. presenten activitat in vitro, però no es fan servir en la pràctica clínica en infeccions causades per aquests agents. No posseeixen activitat davant Stenotrophomonas maltophilia, bacteris anaerobis, rickèttsies, fongs ni Mycoplasma sp. (Edson i Terrell, 1999; Gilbert, 2000).

ESTRUCTURA I PROPIETATS QUÍMIQUES Els antibiòtics aminoglicòsids constitueixen un ampli grup d’agents antimicrobians, normalment d’origen natural, produïts per Streptomyces, Micromonospora sp., Bacillus sp. i Pseudomonas sp., o derivats semisintètics obtinguts per modificació química d’aquests. Bàsicament, llur estructura es caracteritza per posseir dos o més aminosucres units glicosídicament a un nucli hexosa o aminociclitol, que es troba generalment en posició central, per la qual cosa seria més correcte anomenarlos aminoglicòsids-aminociclitols (Rienhart i Suami, 1980). Segons l’aminociclitol central, es poden dividir en els següents grups (vegeu la taula 1 i la figura 1): a) L’aminociclitol central és una estreptidina. L’estreptomicina pertany a aquest grup, ja que és constituïda per un nucli central d’estreptidina al qual s’uneixen una hexosa i una pentosa (pseudodisacàrid). b) Quan l’aminociclitol central és la 2desoxiestreptamina es poden distingir tres subgrups: 1. L’aminociclitol central és una 2-desoxiestreptamina central que està substituïda a les posicions 4 i 5. Exemples d’aquest grup són la butirosina, neomicina, paromomicina i ribostamicina. 2. La 2-desoxiestreptamina central està substituïda a les posicions 4 i 6, com és el cas de la kanamicina, tobramicina o gentamicina. 3. La 2-desoxiestreptamina està substituïda a la posició 4, com en l’apramicina. c) Els que no corresponen a cap dels grups anteriors i són mancats d’aminosucres es consideren aminoclitols purs, com per exemple l’espectinomicina. Llur propietat més notable, relacionada amb llur activitat i amb els mecanismes de resistència, és que a pH fisiològic es troben en forma de polications, atès que els grups fun-

ANTIBIÒTICS AMINOGLICÒSIDS

ESTREPTOMICINA

109

ESPECTINOMICINA

KANAMICINES

NEOMICINES GENTAMICINES

Figura 1.

Principals famílies d’antibiòtics aminoglicòsids i enzims que els modifiquen.

cionals presents són grups amino i hidroxil (Davies, 1986). Tanmateix, com s’ha demostrat

mitjançant assaigs de modificació, sembla ésser que els responsables de l’activitat i de la

110

M. P. GOÑI, M. C. AGUDO I R. GÓMEZ-LUS Taula 1.

Classificació dels antibiòtics aminoglicòsids segons llur estructura química

Estreptidina

Estreptomicina

2-desoxiestreptamina 4-monosubstituïts

4,5-disubstituïts

4,6-disubstituïts

Apramicina

Ribostamicina Paromomicina Lividomicina B (3 desoxiparomomicina) Neomicina (6 -aminoparomomicina) Butirosina A (1-HABAxilostatina) butirosina B (1-HABAribostamicina)

Kanamicines A, B, C Amikacina (1-HABA-kanamicina A) Tobramicina (9 -desoxikanamicina B) Dibekacina (3 -4 -didesoxikanamicina B) Gentamicines C1, C2, C1a Sisomicina (4,5-deshidrogentamicina C1a) Netilmicina (1-N-etilsisomicina) 2 -etil-netilmicina 6 -etil-netilmicina Isepamicina (1-HAPAgentamicina B)

toxicitat de la molècula són els grups amino (Fillastre et al., 1982; Umezawa, 1987). MECANISME D’ACCIÓ Malgrat que se sap que el mecanisme d’acció dels aminoglicòsids implica la unió al ribosoma bacterià i la inhibició de la síntesi de proteïnes, el mecanisme precís pel qual això té lloc encara roman sense estudiar. L’òrgan diana d’aquest grup d’antibiòtics és, per tant, el ribosoma bacterià, al qual s’uneixen mitjançant enllaç covalent i, així, irreversible. Més concretament, els aminoglicòsids com les kanamicines (4,6-disubstituïdes) i la neomicina (4,5-disubstituïdes) interaccionen amb el lloc aminoacil-tRNA al 16S rRNA. Pel fet d’ésser polications a pH neutre, penetren molt pobrament a través de la membrana, de tal manera que l’entrada a la cèll. ula ha de produir-se per un mecanisme de transport actiu. Bryan ho ha descrit com un procés en tres fases (Bryan, 1984): en la primera fase, la molècula de l’antibiòtic s’uneix als llocs aniònics de la superfície cell. ular (lipopolisacàrids, fosfolípids i proteïnes en gramnegatius i àcids teïcoics en grampositius). Les altres

Aminociclitols

Espectinomicina Higromicina B Fortimicina Dactimicina Trospectomicina

dues fases són dependents d’energia, i es denominen EDP-I i EDP-II. En la fase EDP-I, l’antibiòtic travessa la membrana per efecte de la diferència de potencial elèctric, o amb la participació d’un transportador específic. En la EDP-II es produeix una acceleració de l’entrada de l’antibiòtic a través de la membrana citoplasmàtica, utilitzant l’energia de la cadena transportadora d’electrons i la hidròlisi d’ATP. Un cop a l’interior de la cèll. ula, l’aminoglicòsid s’uneix a la subunitat ribosòmica 30S, que té un paper essencial en la traducció del material genètic, i inhibeix la síntesi de proteïnes. A concentracions subinhibitòries, es produeix una lectura errònia de l’mRNA, amb obtenció de proteïnes defectuoses, la qual cosa recolza un mecanisme d’acció en què l’entrada inicial d’unes poques molècules donarà lloc a la síntesi de proteïnes defectuoses (Davis, 1987). Algunes d’aquestes proteïnes van destinades a la membrana, i formen canals que permeten l’entrada de més antibiòtic; això augmenta la síntesi de proteïnes defectuoses, cosa que, per la seva banda, accelera la penetració de l’antibiòtic. Aquest s’uneix als ribosomes implicats en el principi de la ca-

ANTIBIÒTICS AMINOGLICÒSIDS

dena de síntesi de proteïnes, bloquejant-los i aturant la síntesi de les mateixes. La unió al ribosoma no és igual per a tots els aminoglicòsids, i hi ha detalls diferents. Així, els aminoglicòsids que contenen una 2-desoxiestreptamina s’uneixen a l’RNA 16S al solc major de l’hèlix H44; l’estreptomicina, que posseeix una estreptidina com a anell central, interacciona amb els nucleòtids 13, 256, 915 i 1490 de l’rRNA 16S i la proteïna S12 (Carter et al., 2000). L’espectinomicina, un aminociclitol pur, s’uneix al solc menor de l’hèlix H34, prop d’on ho fa la paromomicina (2-desoxiestreptamina). MECANISMES DE RESISTÈNCIA Com ja s’ha fet esment, la utilitat d’aquest grup d’antibiòtics s’ha vist minvada per l’aparició de mecanismes de resistència i per llur ràpida disseminació. El desenvolupament de mecanismes de resistència pot ésser conseqüència de la utilització massiva dels antibiòtics del grup, per la qual cosa presentarà un fort component geogràfic i llur disseminació es veurà influïda per l’ús i pel tipus de mecanisme de resistència de què es tracti. Existeixen quatre mecanismes descrits pels quals un bacteri pot expressar la resistència als antibiòtics aminoglicòsids (Phillips i Shannon, 1984; Davies, 1986), i que esmentarem seguidament.

Alteracions en la permeabilitat de la membrana Suposa la disminució en l’acumulació de l’antibiòtic per l’alteració de la permeabilitat de la membrana, disminució del transport a través de la membrana interna o eﬄux actiu (Magnet et al., 2001). Aquest mecanisme sol conferir resistència creuada a tots els aminoglicòsids. És un mecanisme sense importància clínica, tret dels organismes anaerobis. Els

111

bacteris anaerobis estrictes, que no fan servir una cadena de transport electrònic, són resistents, ja que els manca un transportador carregat negativament o un potencial adient que pugui permetre l’entrada de l’antibiòtic. En algunes espècies, com ara P. aeruginosa, E. coli, S. aureus i Salmonella sp. s’han trobat soques amb mutacions que afecten el transport electrònic, i donen com a resultat el creixement de «petites colònies» que reverteixen en absència d’antibiòtic.

Mutacions a l’òrgan diana Aquest mecanisme, de caire cromosòmic, és sovint el responsable de la resistència a l’estreptomicina (Buckel et al., 1977). Suposa l’adquisició de mutacions a les proteïnes de la subunitat ribosòmica 30S, a les quals s’uneixen els antibiòtics, que fan minvar l’afinitat de l’antibiòtic pel ribosoma. És un mecanisme poc freqüent en aïllaments clínics, malgrat que ha estat descrit en bacteris productors d’antibiòtics aminoglicòsids. Atès que l’estreptomicina es fa servir en el tractament de la tuberculosi, la resistència a estreptomicina en soques clíniques de M. tuberculosis té gran rellevància clínica.

Desactivació de l’antibiòtic per modiﬁcació enzimàtica El bacteri produeix enzims modificadors d’aminoglicòsids (EMAG), que són capaços de modificar la molècula de l’antibiòtic, i donen lloc a un producte inactiu. La molècula modificada no és capaç d’unir-se correctament al ribosoma, cosa que permet al bacteri sobreviure en presència de l’antibiòtic. Per la gran importància clínica que té aquest mecanisme, el desenvoluparem en detall.

112

M. P. GOÑI, M. C. AGUDO I R. GÓMEZ-LUS

Enzims modiﬁcadors d’aminoglicòsids Les EMAG poden ésser de tres tipus (vegeu la taula 2 i la figura 2): a) N-acetiltransferases (AAC). Catalitzen una reacció d’acetilació, en la qual un grup acetat es transfereix des de l’acetilcoenzim A fins a un grup amino de l’antibiòtic. b) O-fosfotransferases (APH). Catalitzen una reacció de fosforilació, és a dir, la transferència d’un grup fosfat des d’ATP fins a un grup hidroxil de l’antibiòtic. c) O-nucleotidiltransferases (ANT). Catalitzen una reacció de nucleotidilació, és a dir, la transferència d’un nucleòtid monofosfat des d’un nucleòtid trifosfat cap a un grup hidroxil de l’antibiòtic, sovint utilitzant ATP com a cofactor. La producció d’EMAG generalment produeix resistència d’alt nivell, malgrat que existeixin diferències entre microorganismes i entre soques individuals, ja que depèn de diversos factors, com la quantitat d’enzim produït, la seva eficiència catalítica o el tipus d’aminoglicòsid de què es tracti. Les EMAG són proteïnes amb pesos moleculars que oscill. en entre 23.000 i 63.000 Da i necessiten la presència de cations divalents per a llur activitat. Pel que respecta a llur localització, es pensa que pot ésser citoplasmàtica. Malgrat això, en alguns gramnegatius s’han trobat a l’espai periplasmàtic (Hollingshead i Vapnek, 1985), fet que dotaria d’eficiència el mecanisme de resistència, que barra el pas de molècules d’antibiòtic sense modificar, de manera que la localització de la proteïna té un paper important a l’hora de definir el nivell de resistència. Un altre factor que té un paper primordial és la relació entre les constants cinètiques de l’enzim que defineixen la seva activitat (K m i V màx) i la velocitat d’entrada de l’antibiòtic. Atès que els grups funcionals que reconeixen aquests enzims són grups amino i hidroxil, un mateix enzim pot modificar diversos antibiòtics aminoglicòsids, i un mateix antibi-

òtic pot ésser modificat per diversos enzims (Benveniste i Davies, 1971, 1973a). Per una altra banda, pot donar-se el cas que un antibiòtic modificat encara conservi activitat antibiòtica, com succeeix amb la 6 -N-acetil-neomicina (Phillips i Shannon, 1984). Per anomenar-los, s’indica en primer lloc el tipus de reacció que catalitzen, és a dir, AAC per a acetiltransferasa, APH per a fosfotransferasa o ANT si es tracta d’una nucleotidiltransferasa. Seguidament, un nombre entre parèntesis ens indica la posició de la molècula d’antibiòtic que es modifica. Diversos enzims que modifiquin una mateixa posició però que tinguin diferents perfils de substrat es diferencien per nombres romans. Si presenten el mateix perfil però existeix alguna variació genètica o bioquímica s’hi afegeix a més una lletra minúscula (p. ex.: AAC(3)IIIa o AAC(3)IIIb). Els EMAG es poden identificar per diversos mètodes, malgrat que clàssicament el més emprat ha estat l’assaig radioenzimàtic, per la seva rapidesa, sensibilitat i per la manca de necessitat de purificar l’enzim. Malgrat això, aquest assaig és costós i requereix una complexa infraestructura, raó per la qual s’està imposant la detecció i identificació dels gens que codifiquen els enzims per tècniques de biologia molecular (Benveniste i Davies, 1973a; Haas i Dowding, 1975). Tanmateix, la identificació de l’enzim mitjançant assaig radioenzimàtic suposa determinar el seu perfil de substrat amb el desenvolupament de la reacció amb una selecció d’antibiòtics que ens indiqui el grup modificat. Si una soca determinada produeix diversos enzims, és possible que el seu perfil de substrat se superposi i la identificació sigui difícil de realitzar. En aquests casos la detecció genètica es fa totalment necessària. La distribució d’enzims modificadors d’aminoglicòsids és variable, tant geogràficament, ja que la política antibiòtica que s’aplica a cada localitat influeix decisivament en l’ad-

ANTIBIÒTICS AMINOGLICÒSIDS Taula 2. Enzim

113

Perfil de substrat dels enzims modificants d’aminoglicòsids Perﬁl de substrat

AAC(1)

Apra, Lv, Pm, Rb

AAC(3)I

Gm, Sis, Dact

AAC(3)II

Gm, Sis, Tm, Dkb, Net

AAC(3)III

Km, Gm, Sis, Tm, Dkb, Net, Nm, Lv, Pm

AAC(3)IV

Gm, Sis, Tm, Dkb, Net, Apra

AAC(3)V

Gm, Sis, Tm, Dkb, Net

AAC(3)VI

AAC(3)VII

Descoberta en actinomicets productors d’aminoglicòsids

AAC(3)VIII

Descoberta en actinomicets productors d’aminoglicòsids

AAC(3)IX

Descoberta en actinomicets productors d’aminoglicòsids

AAC(3)X

Descoberta en actinomicets productors d’aminoglicòsids

AAC(6 )I

Km, Sis, Tm, Dkb, Net, Ak

AAC(6 )II

Km, Gm, Sis, Tm, Dkb, Net

AAC(2 )

Gm, Tm, Dkb, Net, Nm

APH(3 )I

Km, Nm, Lv, Pm, Rb, GmB

APH(3 )II

Km, Nm, Bt, Pm, Rb, GmB

APH(3 )III

Km, Nm, Lv, Bt, Pm, Rb, GmB, Ak

APH(3 )IV

Km, Nm, Bt, Pm, Rb

APH(3 )V

Nm, Pm, Rb

APH(3 )VI

Km, Nm, Bt, Pm, Rb, GmB, Ak

APH(3 )VII

Km, Nm

AAC(6 )/APH(2 )Ia

Km, Gm, Sis, Tm, Dkb, Net, Ak, Dact

APH(2 )Ib, Id

Km, Gm, Sis, Tm, Dkb, Net

APH(2 )Ic

Km, Gm, Tm

APH(3 )Ia, Ib

APH(7 )Ia

Hyg

APH(4)Ia, Ib

Hyg

APH(6)Ia, Ib, Ic, Id

APH(9)Ia, Ib

Spc

ANT(2 )

Km, Gm, Sis, Tm, Dkb

ANT(3 )(9)

Sm, Spc

ANT(4 )(4 )Ia

Km, Tm, Dkb, Ak

ANT(4 )(4 )IIa

Km, Tm, Ak

ANT(6)

ANT(9)

Spc

Ak: amikacina; Apra: apramicina; Bt: butirosina; Dact: dactimicina; Dkb: dibekacina; Gm: gentamicina; GmB: gentamicina B; Hyg: higromicina; Km: kanamicina; Lv: lividomicina; Nm: neomicina; Net: netilmicina; Pm: paromomicina; Rb: ribostamicina; Sis: sisomicina; Sm: estreptomicina; Spc: espectinomicina; Tm: tobramicina.

quisició de resistències i llur disseminació, com pel que fa a gèneres bacterians, ja que hi ha, per exemple, enzims propis de grampositius i d’altres de gramnegatius. Atès el gran nombre d’EMAG descrits fins al moment (vegeu la taula 2), farem esment de

les característiques generals dins de cada tipus. AAC: Modifiquen només els aminoglicòsids que contenen la 2-desoxiestreptamina, utilitzant acetilcoenzim A com a donador de grups acetil. L’acetilació pot produir-se en

114

M. P. GOÑI, M. C. AGUDO I R. GÓMEZ-LUS

N-Acetiltransferases (AAC): aac Ab–NH2 + CH3 –CO–S–CoA −−− −−−−−→ Ab–NH–CO–CH3 + Coenzim A O–Fosfotransferases (APH): aph Ab–OH + ATP −−− −−−−−→ Ab–O–PO2 –OH + AMP O–Nucleotidiltransferases (ANT): ant Ab–OH + ATP −−− −−−−−→ Ab–O–PO2 –O–Adenosina + HO–PO2 –O–PO2 –O–H

Figura 2.

Reaccions generals dels enzims modificants d’aminoglicòsids.

quatre grups diferents (1, 3, 2 i 6 ), la qual cosa determina l’existència de quatre tipus d’acetiltransferases: AAC(1), AAC(3), AAC(2 ) i AAC(6 ). Totes disposen d’un perfil de substrat molt ampli, i les acetiltransferases del tipus AAC(3) són les que posseeixen un nombre més gran de subclasses. La immensa majoria de les acetiltransferases descrites tenen llurs gens clonats i s’ha cristall. itzat i determinat l’estructura de l’AAC(3)Ia de S. marcescens i de l’AAC(6 )Ii d’Enterococcus sp. L’enzim AAC(I) es caracteritza per conferir resistència a apramicina, lividomicina, paromomicina, ribostamicina, neomicina i butirosina (Hedges i Shannon, 1984). Va ésser trobat en soques d’origen animal i, potser, per la seva baixa repercussió clínica els seus gens no es troben clonats. Els més de catorze isoenzims del tipus AAC(3) descrits actualment presenten patrons de resistència diferents i característics, però en general tots modifiquen gentamicina i sisomicina. Alguns dels enzims del tipus AAC(6 ) són capaços de modificar aminoglicòsids importants en clínica, com la tobramicina, netilmicina, amikacina, fortimicina, sisomicina i gentamicines C1a i C2, però són menys capaços de modificar gentamicina C1 i isepa-

micina. Existeixen almenys vint-i-quatre enzims AAC(6 )I identificats tant en grampositius com en gramnegatius, i tan sols dos AAC(6 )II. Una particularitat dins el grup la constitueix l’enzim bifuncional AAC(6 )/APH(2 ) detectat en grampositius (Ferretti et al., 1986). Ambdues activitats es troben codificades per gens adjacents, la lectura dels quals es produeix amb l’aparició d’una única proteïna capaç d’exercir les dues funcions, que confereix resistència pràcticament a tots els antibiòtics aminoglicòsids d’importància clínica, exceptuant l’estreptomicina, espectinomicina i apramicina. Estudis duts a terme sobre aquest enzim han demostrat la possible expressió dissociada d’ambdues activitats, i ha estat trobada en S. aureus una forma de l’enzim que tan sols expressa l’activitat acetiladora (Goñi et al., 1991). L’enzim AAC(2 ) produeix resistència a gentamicina, tobramicina, dibekacina, netilmicina i 6 -etil-netilmicina. La més freqüent és l’AAC(2 )Ia produïda pel grup d’organismes Providencia/Proteus (Shimizu et al., 1985), però també han estat detectades les AAC(2 )Ib, Ic, Id i Ie, amb un 63-79 % d’homologia, en M. tuberculosis, microorganisme en el qual es troben com a enzim codificat per gens cromosòmics (Ainsa et al., 1997), malgrat que no es coneix

ANTIBIÒTICS AMINOGLICÒSIDS

gens bé la seva funció en aquest microorganisme, ja que no intervenen en la resistència als antibiòtics. APH: Catalitzen la fosforilació dependent d’ATP, de grups hidroxil específics de l’antibiòtic. Poden utilitzar com a cofactor ATP o altres nucleòtids, ja que en realitat prenen un fosfat del cofactor i el transfereixen a l’aminoglicòsid. Hi ha set classes de fosfotransferases: APH(3 ), APH(2 ), APH(3 ), APH(4), APH(7 ), APH(6), APH(9). La família més nombrosa és la de les APH(3 ), que modifiquen l’hidroxil en posició 3 de kanamicina. A més a més, es caracteritzen per conferir resistència variable a d’altres antibiòtics, com neomicina, butirosina, lividomicina, amikacina, isepamicina o gentamicina B (Mitsuhashi, 1975). Existeixen set isoenzims identificats, d’APH(3 )I a APH(3 )VII. L’enzim APH(2 )Ia constitueix l’extrem Cterminal del suara esmentat enzim bifuncional AAC(6 )/APH(2 ). Aquest, com s’ha fet esment, confereix resistència a gairebé tots els aminoglicòsids disponibles en clínica. Ha estat trobat en estafilococs, enterococs i estreptococs. Recentment s’han identificat els enzims APH(2 )Ib, Ic i Id en enterococs (Chow et al., 1997; Tsai i Smith, 1998; Kao et al., 2000). L’enzim APH(3 ) modifica específicament l’estreptomicina al grup hidroxil 3 (Heinzel et al., 1988), de la mateixa manera que l’enzim APH(6) ho fa al grup hidroxil 6. L’enzim APH(4) modifica la higromicina, que és un antibiòtic d’ús exclusiu en veterinària. La seva presència es troba associada generalment a la presència de l’enzim AAC(3)IV, ja que els gens que codifiquen ambdós enzims normalment es troben formant un operó (Salauze et al., 1990). Els enzims APH(7 ) i APH(9) confereixen resistència a higromicina i espectinomicina, respectivament, i no són significatius en clínica. ANT: Com en els casos anteriors, hi ha cinc tipus de nucleotidiltransferases, segons si mo-

115

difiquen l’antibiòtic en el grup hidroxil 2 , 3 , 4 , 6 o 9. Les ANT(2 ) confereixen resistència a gentamicina, tobramicina, dibekacina, sisomicina i kanamicina, i es troben àmpliament distribuïdes entre els gramnegatius (Cameron et al., 1986). L’enzim ANT(3 ) confereix resistència davant estreptomicina i espectinomicina, i ambdues molècules modifiquen els hidroxils 3 i 9, respectivament, raó per la qual també s’anomena ANT(3 )(9) (Davies i Smith, 1978; Hollingshead i Vapnek, 1985). Les ANT(4 )(4 ) confereixen resistència davant aquells antibiòtics aminoglicòsids que continguin en llur molècula un grup 4 , com és el cas de tobramicina, amikacina o isepamicina (Jacoby et al., 1990). Com a exemple d’especificitat podem esmentar que l’enzim ANT(4 )I és específic de grampositius, mentre que l’ANT(4 )II ho és de gramnegatius (Schewotzer et al., 1978; Miller et al., 1980; Jacoby et al., 1990). Per acabar, els enzims ANT(6) i ANT(9) modifiquen exclusivament estreptomicina i espectinomicina, respectivament, i són propis de grampositius (Davies i Smith, 1978; Murphy, 1985; Ounissi et al., 1990). BASES GENÈTIQUES Respecte de l’origen dels gens que codifiquen els EMAG, s’han establert diverses teories. Així, podrien tenir llur origen en microorganismes productors d’antibiòtics, on constituirien llur mecanisme de protecció (Benveniste i Davies, 1973b; Cundliffe, 1989) o podria haver succeït que davant la pressió selectiva exercida per l’ús d’antimicrobians, alguns gens del metabolisme bacterià haguessin evolucionat per a donar lloc a aquests gens de resistència (Piepersberg et al., 1988). Els gens de resistència en gramnegatius es troben localitzats en plasmidis R conjugatius, en transposons i en integrons. Aquests plas-

116

M. P. GOÑI, M. C. AGUDO I R. GÓMEZ-LUS

midis es disseminen entre bacteris, els transposons es propaguen entre replicons i els integrons, que es troben formant part dels transposons, capten nous gens, els empaqueten en cassettes i contribueixen a llur expressió fenotípica. En grampositius, com ara enterococs i estreptococs, l’intercanvi de gens es fa per altres mecanismes, com ara la conjugació mitjançada per plasmidis mobilitzables, amb la participació de transposons conjugatius cromosòmics. Els gens que codifiquen els enzims modificadors es troben localitzats tant al cromosoma com en plasmidis transferibles. Tanmateix, molts es troben associats a elements transposables. La presència d’aquests gens en plasmidis i transposons és la responsable de la ràpida disseminació entre els diferents gèneres i espècies bacterians. L’expressió dels gens que codifiquen els EMAG sembla ésser constitutiva, si bé es poden seleccionar soques resistents amb concentracions subinhibitòries d’antibiòtic i, fins i tot, promoure l’augment del nombre de còpies dels plasmidis que els contenen.

Metilació de l’rRNA 16S Aquest mecanisme, que ha estat descrit recentment, té el seu origen en els microorganismes productors d’aminoglicòsids, que l’empren com a mecanisme defensiu davant llurs propis productes, i implica la metilació posttranscripcional de l’rRNA amb la utilització de S-adenosil-metionina com a cofactor. Els aminoglicòsids actuen produint errors de lectura en la traducció i impedint la translocació (Davies i Davis, 1968). Per a això, s’uneixen a un motiu altament conservat de l’rRNA 16S, i produeixen alteracions en la funció del ribosoma. L’alteració per substitució o metilació de les bases implicades en la unió entre l’rRNA 16S i els aminoglicòsids pot produir la pèrdua d’afinitat per l’antibiòtic i resistèn-

cia a l’hoste (Cundliffe, 1990; Kotra et al., 2000; Prammananan et al., 1998). De moment, s’ha trobat en Enterobacteriaceae (gens armA) (Galimand et al., 2003), en P. aeruginosa (gens rmtA) (Yokayama et al., 2003) i en S. marcescens (gens rmtB) (Doi et al., 2004). En tots els casos, els gens que codifiquen aquestes metilases es troben localitzats en plasmidis conjugatius i confereixen resistència a kanamicines i gentamicines, és a dir, davant les desoxiestreptamines 4,6-disubstituïdes, i no es veuen afectades les 4,5-disubstituïdes, ni apramicina, estreptomicina o espectinomicina.

Futur de la resistència als antibiòtics aminoglicòsids La resistència als antibiòtics aminoglicòsids en soques clíniques varia en funció de l’antibiòtic específic, del microorganisme, del mecanisme de resistència i de l’àrea geogràfica, entre d’altres factors. S’han establert programes d’estudi, com per exemple el SENTRY, desenvolupat als Estats Units, Canadà, Amèrica del Sud i Europa (Schmitz et al., 1999). En aquests estudis es posa de manifest la complexitat de l’epidemiologia de la resistència als aminoglicòsids, per la gran quantitat d’enzims modificadors que existeixen per a aquests antibiòtics, i també per la presència de mecanismes de resistència dispars, diferents de la desactivació enzimàtica. També han demostrat que amb les diferents pautes d’ús dels antibiòtics, tant en intensitat com en diversitat, s’han seleccionat diferents combinacions d’enzims modificants entre diferents països, i tot sovint entre diferents hospitals d’un mateix país. Si els patrons de resistència dels enzims modificants resten influïts per l’ús clínic d’aquests antibiòtics (Miller et al., 1997), cal suposar que la definició de polítiques antibiòtiques restrictives conduiria envers la reducció de la resistència a aquests agents. Però, atès que els

ANTIBIÒTICS AMINOGLICÒSIDS

gens que codifiquen els EMAG es troben molt sovint en plasmidis i transposons, juntament amb determinants de resistència davant altres antimicrobians, podem dir que el consum total d’antimicrobians pot influir en l’epidemiologia de la resistència als aminoglicòsids. Davant d’aquesta situació, un dels majors reptes que es presenten actualment és el desenvolupament de molècules que siguin «immunes» als mecanismes de resistència presents als bacteris. Malgrat això, la dificultat que suposa aconseguir noves molècules d’antibiòtic, amb el coneixement cada cop més gran que es té dels EMAG, fa que els esforços s’adrecin envers la descoberta de substàncies inhibidores de llur activitat, que ens puguin permetre rescatar l’activitat dels antibiòtics aminoglicòsids (Wright, 1999). Existeixen precedents als estudis desenvolupats amb la 7hidroxitropolona com a inhibidor de l’enzim ANT(2 ), on es posa de manifest que la dificultat d’aquesta estratègia és deguda a l’alt nombre d’enzims diferents a inhibir, i al fet que llurs mecanismes bioquímics en molts casos romanen sense estudiar. Per aquesta raó els estudis actuals busquen inhibidors adreçats envers una característica comuna. Així, el descobriment que l’estructura de l’APH(3 )III és molt semblant a la de les cinases de proteïna eucariotes ha suggerit la possibilitat que els inhibidors de les proteïna-cinases puguin ésser actius davant les APH(3 ). Els estudis al voltant d’això mostren resultats alleujadors (Daigle et al., 1997; Burk i Berghuis, 2002). També, l’aparició de resistència mitjançada per metilases, que a més es transfereix per conjugació, pot proporcionar una nova perspectiva en la disseminació de la resistència als antibiòtics aminoglicòsids i, per tant, en les vies emprades per a tractar de contenir-la. BIBLIOGRAFIA Ainsa, J. A.; Perez, E.; Berthet, F. X.; Gicquel, B.; Martin, C. (1997). «Aminoglycoside 2 -N-acetyltrans-

117

ferase genes are universally present in mycobacteria: characterization of the aac(2 )-Ic gene from Mycobacterium tuberculosis and the aac(2 )-Id gene from Mycobacterium smegmatis». Mol. Microbiol., vol. 24, pàg. 431-441. Benveniste, R.; Davies, J. (1971). «Enzymatic acetylation of aminoglycoside antibiotics by Escherichia coli carrying an R factor». Biochemistry, vol. 10, pàg. 1787-1796. — (1973a). «Aminoglycoside antibiotic-inactivating enzymes in actinomycetes similar to those present in clinical isolates of antibiotic-resistant bacteria». Proc. Nat. Acad. Sci. USA, vol. 70, pàg. 2276-2280. — (1973b). «Mechanisms of antibiotic resistance in bacteria». Ann. Rev. Biochem., vol. 42, pàg. 471-506. Bryan, L. E. (1984). Antimicrobial drug resistance. Orlando: Academic Press, pàg. 241-277. Buckel, P.; Bucherger, A.; Bock, A.; Witiman, H. G. (1977). «Alteration of ribosomal protein L6 in mutants E. coli resistant to gentamicin». Mol. Gen. Genet., vol. 158, pàg. 47-54. Burk, K. D.; Berghuis, A. (2002). «Protein kinase inhibitors and antibiotic resistance». Pharmacol. Ther., vol. 93, pàg. 283-292. Cameron, F. H.; Groot Obbink, D. J.; Ackerman, V. P.; Hall, R. M. (1986). «Nucleotide sequence of the AAD(2 ) aminoglycoside adenylyltransferase determinant aadB. Evolutionary relationship of this region with those surrounding aadA in R538-1 and dhfrII in R388». Nucl. Acid. Res., vol. 14, pàg. 8625-8635. Carter, A. P.; Clemons, W. M.; Brodersen, D. E.; Morgan-Warren, R. J.; Wmberl, B. T.; Pamakrishnan, V. (2000). «Functional insights from the structure of 30S ribosomal subunit and its interactions with antibiotics». Nature, vol. 407, pàg. 340-348. Chow, J. W.; Zervos, M. J., Lerener, S. A.; Thal, L. A.; Donbedian, S. M.; Jaworski, D. D.; Tsai, S.; Shaw, K. J.; Clewel, D. B. (1997). «A novel gentamicin resistance gene in Enterococcus». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 41, pàg. 511-514. Cohn, D. L.; Bustreo, F.; Raviglione, M. C. (1997). «Drug-resistant tuberculosis: review of the worldwide situation and the WHO/IUATLD Global Surveillance Project. International Union against tuberculosis and lung disease». Clin. Infect. Dis., vol. 24 (supl. 1), pàg. S121S130. Cundliffe, E. (1989). «How antibiotic-producing organisms avoid suicide». Annu. Rev. Microbiol., vol. 43, pàg. 207-233. — (1990). «Recognition sites for antibiotics within rRNA.» A: Hill, W. E.; Moore, P. B.; Dahlberg, A.; Schlessinger, D.; Garrett, R. A.; Warner, J. R. [ed.] The ribosome: structure, function, and evolution. Washington, DC: American Society for Microbiology, pàg. 479-490. Daigle, D. M.; McKay, G. A.; Wright, G. D. (1997). «Inhibition of aminoglycoside antibiotic resistance enzymes by protein kinase inhibitors». J. Biol. Chem., vol. 272, pàg. 24755-24758.

118

M. P. GOÑI, M. C. AGUDO I R. GÓMEZ-LUS

Davis, B. D. (1987). «Mechanism of bactericidal action of aminoglycosides». Microbiol. Rev., vol. 51, pàg. 341-350. Davies, J. (1986). «Aminoglycoside-aminocyclitol antibiotics and their modifying enzymes». A: Lorian, V. [ed.] Antibiotics in laboratory medicine. 2a ed. Baltimore: Williams & Wilkins, cap. 21, pàg. 790-809. Davies, J; Davis, B. D. (1968). «Misreading of ribonucleic acid code words induced by aminoglycoside antibiotics». J. Biol. Chem., vol. 243, pàg. 3312-3316. Davies, J; Smith, D. I. (1978). «Plasmid-determined resistance to antimicrobial agents». Annu. Rev. Microbiol., vol. 32, pàg. 469-518. Doi, Y.; Yokoyama, K.; Yamane, K.; Wachino, J.; Shibata, N.; Yagi, T.; Shibayama, K.; Kato, H.; Arakawa, Y. (2004). «Plasmid-mediated 16S rRNA methylase in Serratia marcescens conferring high-level resistance to aminoglycosides». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 48, pàg. 491-496. Edson, R. S.; Terrell, C. L. (1999). «The aminoglycosides». Mayo Clinic Proc., vol. 74, pàg. 519-528. Eliopoulos, G. M.; Moellering, R. C. (1996). «Antimicrobial combinations». A: Lorian, V. [ed.] Antibiotics in laboratory medicine, 4a ed. Baltimore: Williams & Wilkins, pàg. 330-383. Ferretti, J. J.; Gilmore, K. S.; Courvalin, P. (1986). «Nucleotide sequence analysis of the gene specifying the bifunctional 6 -aminoglycoside acetyltransferase 2 aminoglycoside phosphotransferase enzyme in Streptococcus faecalis and identification and cloning of gene regions specifying the two activities». J. Bacteriol., vol. 167, pàg. 631-638. Fillastre, J. P.; Morin, J. P.; Godin, M.; Viotte, G.; Olier, B.; Josse, S. (1982). «Néprotoxicité des aminoglycosides». A: Modaï, J. [ed.] Les aminosides. París: Librairie Arnette, pàg. 69-102. Galimand, M.; Courvalin, P.; Lambert, T. (2003). «Plasmid-mediated high-level resistance to aminoglycosides in Enterobacteriaceae due to 16S rRNA methylation». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 47, pàg. 2565-2571. Gilbert, D. N. (2000). «Aminoglycosides». A: Mandell, G. L.; Benett, J. E.; Dolin, R. [ed.] Mandell, Douglas and Benett’s Principles and practice of infections diseases, 5a ed. Filadèlfia: Churchill Livingstone, pàg. 307-336. Goñi, P.; Rivera, M. J.; Agudo, M. C.; Madero, P.; GómezLus, R. (1991). «6 -N-aminoglycoside acetyltransferase activity in gentamicin-kanamycin resistant Staphylococcus spp.» J. Chemother., supl. 4, pàg. 173-175. Haas, M. J.; Dowding, J. E. (1975). «Aminoglycoside-modifying enzymes». A: Hash, L. H. [ed.] Methods in enzymology, vol. xliii: Antibiotics. Nova York: Academic Press Inc., pàg. 611-640. Hedges, R. W.; Shannon, K. P. (1984). «Resistance to apramycin in Escherichia coli isolated from animals: detection of a novel aminoglycoside-modifying enzyme». J. Gen. Microbiol., vol. 130, pàg. 473-482. Heinzel, P.; Werbitzky, P. O.; Distler, J.; Piepersberg, W. (1988). «A second streptomycin resistance gene from

Streptomyces griseus codes for streptomycin-3 -phosphotransferase». Arch. Microbiol., vol. 150, pàg. 184-192. Hollingshead, S.; Vapnek, D. (1985). «Nucleotide sequence analysis of a gene encoding a streptomycin/spectinomycin adenyltransferase». Plasmid, vol. 13, pàg. 1730. Jacoby, G. A.; Blaser, M. J.; Santanam, P.; Hächler, H.; Kayser, F. H.; Hare, R. S.; Miller, G. H. (1990). «Appearance of amikacin and tobramycin resistance due to 4 -aminoglycoside nucleotidyltransferase [ANT(4 )II] in gram-negative pathogens». Antimicrob. Agents. Chemother., vol. 34, pàg. 2381-2386. Kao, S. J.; You, I.; Clewel, D. B.; Donbedian, S. M.; Zervos, M. J.; Petrin, J.; Shaw, K. J.; Chow, J.W. (2000). «Detection of the high-level aminoglycoside resistance gene aph(2)Ib in Enterococcus faecium». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 44, pàg. 2876-2879. Kotra, L. P.; Hadad, J.; Mobashery, S. (2000). «Aminoglycosides: perspectives on mechanisms of action and resistance and strategies to counter resistance». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 44, pàg. 3249-3256. Magnet, S.; Courvalin, P.; Lambert, T. (2001). «Resistance-nodulation-cell division-type efflux pump involved in aminoglycoside resistance in Acinetobacter baumannii strain BM4454». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 45, pàg. 465-470. Miller, G. H.; Sabatelli, F. J.; Hare, R. S.; Glupczynski, Y.; Mackey, P.; Shlaes, D.; Shimizu, K.; Shaw, K. J.; Groups Saars (1997). «The most frecuent aminoglycoside resistance mechanisms change with time and geographic area: a reflection of aminoglycoside usage patterns?» Clin. Infect. Dis., vol. 24 (supl. 1), pàg. S46-S62. Miller, G. H.; Sabatelli, F. J.; Hare, R. S.; Waitz, J. A. (1980). «Survey of aminoglycoside resistance patterns». Dev. Ind. Microbiol., vol. 21, pàg. 91-104. Mitsuhashi, S. (1975). «Proposal for a rational nomenclature for phenotype, genotype and aminoglycosideaminocyclitol modifying enzymes». A: Mitsuhashi, S.; Rosival, L.; Krcmery, V. Drug inactivating enzymes and antibiotic resistance. Berlín: Springer-Verlag KG, pàg. 115119. Murphy, E. (1985). «Nucleotide sequence of a spectinomycin adenyltransferase AAD(9) determinant from Staphylococcus aureus and its relationship to AAD(3 )(9)». Mol. Gen. Genet., vol. 200, pàg. 33-39. Ounissi, H.; Derlot, E.; Calier, C.; Courvalin, P. (1990). «Gene homogeneity for aminoglycoside-modifying enzymes in gram-positive cocci». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 34, pàg. 2164-2168. Phillips, I.; Shannon, K. (1984). «Aminoglycoside resistance». J. Med. Bull., vol. 40, pàg. 28-35. Piepersberg, W.; Distler, J.; Heinzel, P.; Perez-Gonzalez, J. A. (1988). «Antibiotic resistance by modification: many resistance genes could be derived from cellular control genes in actinomycetes—a hypotesis». Actinomycetologica, vol. 2, pàg. 83-98. Prammananan, T.; Sander, P.; Brown, B. A.; Frisch-

ANTIBIÒTICS AMINOGLICÒSIDS

korn, K.; Onyi, G. O.; Zhang, Y.; Bottger, E.; Wallace, R. J. (1998). «A single 16S ribosomal RNA substitution is responsible for resistance to amikacin and other 2-deoxystreptamine aminoglycosides in Mycobacterium abcessus and Mycobacterium chelonae». J. Infect. Dis., vol. 177, pàg. 1573-1581. Rienhart, K. W. J.; Suami, T. (1980). «Aminocyclitol antibiotics». ACS Symposium Series 125. American Chemical Society, pàg. 133-144. Salauze, D.; Otal, I.; Gómez-Lus, R.; Davies, J. (1990). «Aminoglycoside acetyltransferase 3-IV (aacC4) and hygromycin B 4-I phosphotransferase (hph B) in bacteria isolated from human and animal sources». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 34, pàg. 1915-1920. Schatz, A.; Bugie, E.; Waskman, S. A. (1994). «Streptomycin, a substance exhibiting antibiotic activity against gram-positive bacteria». Proc. Soc. Exp. Biol., vol. 55, pàg. 66-69. Schewotzer, U.; Kayser, F. H.; Schewotzer, W. (1978). «R-plasmid mediated aminoglycoside resistance in Staphylococcus epidermidis: structure determination of the products of an enzyme nucleotidylating the 4 and 4 hydroxyl group of aminoglycoside antibiotics». FEMS Microbiol. Lett., vol. 3, pàg. 29-33. Schmitz, F. J.; Verhoef, J.; Fluit, A. C. (1999). «Prevalence of aminoglycoside resistance in 20 European university

119

hospitals participating in the European SENTRY Antimicrobial Surveillance Programme». Eur. J. Clin. Microbiol., vol. 18, pàg. 414-421. Shimizu, K.; Kumada, T.; Hsieh, W. C.; Chung, H. Y.; Chong, Y.; Hare, R. S.; Miller, G. H.; Sabatelli, F. J.; Howard, J. (1985). «Comparison of aminoglycoside resistance patterns in Japan, Formosa, and Korea, Chile and the United States». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 28, pàg. 282-288. Tsai, S.; Zervos, M. J.; Clewel, D. B.; Donbedian, S. M.; Sahmand, D. F.; Shaw, K. J.; Chow, J. W. (2000). «A new high-level gentamicin resistance gene aph(2)Id in Enterococcus spp.» Antimicrob. Agents Chemother., vol. 42, pàg. 1229-1232. Umezawa, H. (1987). «Studies on antibiotics and enzyme inhibitors». Rev. Infect. Dis., vol. 9, pàg. 147-164. Waskaman, S. A. (1943). «Production and activity of streptomycin». J. Bacteriol., vol. 46, pàg. 299-310. Wright, G. D. (1999). «Aminoglycoside-modifying enzymes». Curr. Op. Microbiol., vol. 2, pàg. 499-503. Yokoyama, K.; Doi, Y.; Yamane, K.; Kurokawa, H.; Shibata, N.; Shibayama, K.; Yagi, T.; Kato, H.; Arakawa, Y. (2003). «Acquisition of 16S rRNA methylase gene in Pseudomonas aeruginosa». Lancet, vol. 6, pàg. 1888-1893.

Antimicrobians (Joaquim Ruiz, ed.) Treballs de la SCB. Vol. 55 (2004) 121-134

TETRACICLINES Anna Ribera Servei de Microbiologia, Centre de Diagnòstic Biòmedic, Hospital Clínic, IDIBAPS. Adreça per a la correspondència: Anna Ribera. Servei de Microbiologia, Centre de Diagnòstic Biòmedic, Hospital Clínic, IDIBAPS. Villarroel, 170. 08036 Barcelona. Adreça electrònica: ariberallovera@yahoo.es. RESUM Les tetraciclines són agents antimicrobians d’ampli espectre que exhibeixen activitat davant una gran varietat de bacteris grampositius i gramnegatius. Aquests antibiòtics actuen inhibint la síntesi proteica unint-se a la subunitat 30S del ribosoma. Els bacteris desenvolupen resistència a aquest tipus d’agents majoritàriament per dos mecanismes: a) bombes d’expulsió activa i b) protecció del ribosoma. Malgrat això, existeixen altres mecanismes de resistència que fan que aquests antibiòtics siguin incapaços de fer front a moltes infeccions causades per microorganismes multiresistents. Paraules clau: tetraciclines, resistència, protecció ribosòmica, expulsió activa. SUMMARY Tetracyclines are expanded-spectrum antimicrobial agents active against a great variety of Gram-positive and Gram-negative bacteria. These type of antibiotics act by binding to the 30S ribosomal subunit, resulting in the inhibition of protein synthesis. Bacteria develop resistance to this kind of antibiotics mainly by two different mechanisms: 1) active efflux or 2) ribosomal protection. However, there are other resistance mechanisms that make these antibiotics unable to act against multiple resistant microorganism infections. Keywords: tetracyclins, resistance, ribosomal protection, active efflux. BREU HISTÒRIA Els primers membres d’aquesta família d’antibiòtics van ésser descoberts a finals dels anys quaranta (clorotetraciclina i oxitetraciclina). Aquestes molècules eren productes de Streptomyces aureofaciens i Strep-

tomyces rimosus, respectivament. Altres tetraciclines es van identificar posteriorment, tant com a molècules naturals (tetraciclina de S. aureofaciens, S. rimosus i Streptomyces viridofaciens i dimetilclorotetraciclina de S. aureofaciens) o com a productes semisintètics, com metaciclina, doxiciclina i minoci-

122

A. RIBERA

clina. Malgrat el prematur èxit de les tetraciclines, es van sintetitzar anàlegs que permetien una millor solubilitat, una administració parenteral i una millor absorció oral. Aquests compostos semisintètics són la rolitetraciclina i la limeciclina. El grup de tetraciclines semisintètiques més recent és el grup de les glicilciclines (9-(N,N-dimetilglicilamido)-6-dimetil-6-desoxitetraciclina, 9-(N,N-dimetilglicilamido)-minociclina, i 9-t-(butilglicilamido)-minociclina. Aquests compostos posseeixen un substituent 9-glicilamida. Els antibiòtics de 1a generació serien aquells que van des de 1948 (clorotetraciclina i oxitetraciclina) fins a 1963 (clomociclina) (vegeu la taula 1), els de 2a generació correspondrien a aquells que van de 1967 (doxiciclina) a 1972 (minociclina), i els de 3a generació serien les glicilciclines. Del 9-t-(butilglicilamido)minociclina, anomenat formalment tigilcycline o GAR-936, van començar els estudis de fase i l’octubre de 1999, i actualment es troba en els estudis clínics de fase ii. Alguns dels compostos més antics s’han retirat ja del mercat, tals com la clomociclina, i altres (rolitetraciclina, limeciclina i clorotetraciclina) no es troben disponibles en tots els països (Chopra i Roberts, 2001). ESTRUCTURA Les molècules de tetraciclina estan formades per un nucli tetracíclic (quatre anells benzènics), on s’uneixen diferents grups funcionals que donen lloc a les diferents molècules de tetraciclines. La tetraciclina més simple per a detectar la mínima activitat antibacteriana és la 6-desoxi-6-demetiltetraciclina (vegeu la figura 1); així doncs, aquesta estructura ha d’ésser considerada com el mínim farmacòfor (Chopra i Roberts, 2001). Una de les característiques importants per a no perdre l’activitat antibacteriana entre les tetraciclines és la de mantenir la linealitat del nucli, que està relacionada amb la configura-

ció estereoquímica natural de les posicions 4a, 12a (en la junta de l’anell A-B) i del grup dimetilamina de la posició 4; també és important la conservació del sistema cetoenol (de les posicions 11, 12 i 12a) propera a l’anell fenòlic D (vegeu la figura 2). Les tetraciclines són agents quelants forts i, per tant, les seves propietats antimicrobianes i farmacocinètiques es veuen influenciades per la quelació dels ions metall. Els llocs de quelació estan situats en els grups de l’anell A i inclouen: el sistema β-dicetònic (posicions 11 i 12), l’enol (posicions 1 i 3) i la carboxamida (posició 2) (vegeu la figura 2). Les noves glicilciclines també formen complexos quelants amb cations divalents. La substitució de la carboxamida en posició 2 per altres grups generalment comporta una disminució de l’activitat antibacteriana, probablement perquè disminueix l’acumulació d’aquests anàlegs a l’interior bacterià. En canvi, l’addició de substituents en el nitrogen de l’amida comporta un augment de la solubilitat en aigua, com són el cas de la rolitetraciclina i la limeciclina. Les substitucions a les posicions 1, 3, 4a, 10, 11 o 12 invariablement produiran una disminució de l’activitat antimicrobiana. No obstant això, substitucions en diferents posicions dels anells B, C i D són tolerades, i les molècules que presenten aquestes substitucions han permès la introducció de les tetraciclines en la pràctica clínica, tal com les noves glicilciclines que es troben en procés d’assaig clínic actualment. Altres estudis han demostrat que en les molècules, per a mantenir l’activitat, el nucli tetracíclic ha d’ésser de sis membres i purament carbocíclic, amb una única excepció, les 6-tiatetraciclines, que posseeixen un àtom de sulfur a la posició 6 de l’anell C, en lloc d’un àtom de carboni, i mantenen propietats antimicrobianes molt elevades. S’ha trobat, però, que aquestes tetraciclines, juntament amb les anhidrotetraciclines, les 4-epi-anhidrotetraciclines i les xelocardines formen un grup de tetraciclines que actuen de manera diferent de la majoria de tetraciclines. Suposadament,

TETRACICLINES

Taula 1.

123

Principals membres de la família de les tetraciclines

Nom químic

Nom genèric

Nom comercial

A. D. a

7-clorotetraciclina

Clorotetraciclina

Aureomicina

1948

5-hidroxitetraciclina

Oxitetraciclina

Terramicina

1948

Tetraciclina

Acromicina

1953

6-demetil-7-clorotetraciclina

Demetilclorotetraciclina

Declomicina

1957

2-N-pirrolidinometiltetraciclina

Rolitetraciclina

Reverin

1958

2-N-lisinometiltetraciclina

Limeciclina

Tetralisal

1961

N-metilol-7-clorotetraciclina

Clomociclina

Megaclor

1963

6-metilè-5-hidroxitetraciclina

Metaciclina

Rondomicina

1965

6-desoxi-5-hidroxitetraciclina

Doxiciclina

Vibramicina

1967

7-dimetilamino-6-demetil-6-

Minociclina

Minocina

1972 1993

Desoxitetraciclina 9-(t-butilglicilamido)-

Terciari-

Tigilciclina

Minociclina

butilglicilamidominociclina

(En fase ii)

a Any del descobriment: — De 1948 a 1963: tetraciclines 1a generació. — De 1965 a 1972: tetraciclines 2a generació. — Glicilciclines: tetraciclines 3a generació.

pertorbarien la membrana citoplasmàtica dels microorganismes i provocarien una resposta bactericida, i actuarien així d’una manera totalment diferent de les tetraciclines típiques. Aquestes interaccionarien directament amb el ribosoma amb la inhibició de la síntesi proteica i la producció d’un efecte bacteriostàtic reversible (Chopra i Roberts, 2001). Aquestes tetraciclines atípiques no s’utilitzen en la pràctica clínica a causa dels seus efectes secundaris, ja que actuen tant davant cèll. ules procariotes com eucariotes. Per tal de restablir el potencial de les tetraciclines com a agents antibacterians d’ampli espectre, ja que la resistència a les tetraciclines de primera i segona generació havia augmentat en excés, a començaments dels anys noranta es va realitzar una dura recerca per a descobrir nous anàlegs. Aquesta investigació va tenir com a resultat el descobriment de les glicilciclines (9-gliciniltetraciclines). Durant els anys noranta, un grup americà va veure que els derivats de minociclina i 9-acilamida mostraven l’activitat antibacteriana de les tetraciclines clàssiques, però no actuaven davant microorganismes resistents. Quan el grup acil

va ésser modificat per la N,N-dialquilamina (6-demetil-6-desoxitetraciclina) i derivats de la minociclina com el GAR-936, no solament es va mantenir l’activitat antibacteriana clàssica, sinó que també actuaven davant bacteris que contenien gens de resistència (gens tet) responsables tant de codificar bombes d’expulsió activa (de Tet (A) a Tet (D) i Tet (K)), com protecció del ribosoma (Tet (M)). Cal dir que s’haurien de sintetitzar noves molècules capaces de complementar les anteriors allà on no són actives, tenint en compte que haurien d’incorporar a la posició 9 un N-alquil glicilamida. La figura 2 presenta un resum de les característiques que ha de contenir la molècula de tetraciclina per a posseir una activitat antibacteriana òptima. CLASSIFICACIÓ Les dades referents a la classificació de les tetraciclines es troben resumides a la taula 1.

124

A. RIBERA

APLICACIONS CLÍNIQUES Les tetraciclines són agents d’ampli espectre que exhibeixen activitat davant una gran varietat de bacteris grampositius i gramnegatius, bacteris atípics com Chlamydia, Mycoplasma i Rickettsia, i protozous paràsits. Les seves propietats antimicrobianes favorables i l’absència d’efectes secundaris importants n’han permès l’ús extens en la teràpia d’infeccions en humans i en animals. S’administren normalment per via oral, encara que algunes estan disponibles per via parenteral. Exceptuant les tetraciclines de 3a generació, que es troben actualment en assaigs clínics de fase ii, les altres tetraciclines es van introduir fa trenta anys. Durant tot aquest temps han anat apareixent resistències i altres agents antimicrobians amb millor activitat antimicrobiana i amb una millor tolerància. Com a conseqüència d’aquest escenari, l’ús de les tetraciclines ha disminuït significativament en molts països, fins al punt de no ésser considerats com a antibiòtics de primera opció en determinades situacions (Chopra i Roberts, 2001). També, els han donat altres aplicacions, com, per exemple, com a part d’una teràpia triple per al tractament de gastritis o d’úlcera pèptica associada a Helicobacter pylori. Les tetraciclines també són actives davant la malària, i estan esdevenint importants com a profilaxi, a causa del ràpid augment de resistència a la mefloquina per part de Plasmodium falciparum.

Figura 1. Estructura de la 6-desoxi-6-demetiltetraciclina, el mínim farmacòfor de la tetraciclina.

Com a primera opció les tetraciclines s’utilitzen per a tractar una pneumònia atípica, produïda per Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae i Chlamydia psittaci, per còlera, com a profilaxi per a la diarrea del viatger, per a tractar la uretritis no gonocòccica, per a tractar cervicitis, limfogranuloma veneri, malaltia inflamatòria pèlvica, granuloma inguinal, per a la febre de les Muntanyes Rocalloses, per al tifus endèmic i epidèmic, per a la febre Q, per a tractar brucell. osis (en combinació amb rifampicina o estreptomicina), malaltia de Lyme, infeccions periodontals (teràpia tòpica amb tetraciclina o minociclina) i per a tractar acne (tractament tòpic i sistèmic). També s’utilitzen com a alternativa a altres agents antimicrobians. Com a resum podem dir que les tetraciclines en humans primordialment s’utilitzen com a profilaxi i tractament d’infeccions en la comunitat, i presenten un paper molt minoritari com a agent terapèutic hospitalari (Janknegt et al., 2000). Cal esmentar, però, que la utilització d’aquests agents antimicrobians en la comunitat ha anat disminuint al llarg dels anys (es veu reflectit en la disminució de les prescripcions de les tetraciclines). Els països on s’ha vist més la reducció de prescripcions són Espanya, els EUA i el Regne Unit (Chopra i Roberts, 2001). També s’utilitzen en veterinària. Les tetraciclines s’afegeixen directament als aliments o a l’aigua o poden ésser administrades amb aerosols. S’administren tant en animals de granja com per al tractament d’infeccions d’animals domèstics. En aquest camp no solament s’han utilitzat per al tractament d’infeccions, sinó que també, a dosis subterapèutiques, com a promotors del creixement. El 1969, però, Swann (1969) va publicar al Regne Unit que dosis subterapèutiques de tetraciclines en animals podrien contribuir al desenvolupament de resistències en soques d’humans. Arran d’això es va prohibir la seva utilització com a promotors de creixement a Europa, a començaments dels anys setanta. Malgrat això,

TETRACICLINES

Figura 2. Estereoquímica i substituents requerits per a una òptima activitat antimicrobiana en la sèrie de les tetraciclines. Anells (A-B-C-D) = lineals i fusionats. Anells (D-C-B) C-10, C-11, C12 = sistema cetoenol fenòlic. Anell (A) C-1, C-2, C-3 = sistema cetoenol del tipus tricarbonil. R 2 = NH 2 o NHR, on R és un aminoalquil. R 4 = (α) dimetilamino grup superior. C–4a = (α)-protó. R 5= (H) (tetraciclines) o OH (oxitetraciclines). C-5a = (α)-protó. R 6 = combinació de (β)-OH o (α)-CH 3, sense substitució, o amb un grup metilè. R 7 = H (tetraciclines), Cl (clorotetraciclines) o dialquilamino (tipus minociclina), o NO 2. R 8 = H. R 9 = glicilamido. R 12a = H.

estudis realitzats a mitjan dècada dels noranta demostren que les tetraciclines encara s’utilitzaven amb aquesta finalitat en molts altres països (EUA, Canadà, Austràlia, Nova Zelanda) (Grave et al., 1999; JETACAR, 1999). Altres aplicacions serien en cultius d’aigua, per a controlar infeccions en salmons i llagostes. També en agricultura s’utilitzen en esprais per a tractar infeccions per Erwinia amylovara, en arbres fruiters i altres plantes; també en palmeres per a tractar les infeccions per mycoplasma (lethal yellow), per a controlar la infecció per Xanthomonas campestris en llavors (black rot). També s’han utilitzat com a tractament d’insectes (Chopra i Roberts, 2001). MECANISMES D’ACCIÓ Les tetraciclines inhibeixen la síntesi proteica dels bacteris i eviten l’associació de l’aminoacil-tRNA amb el ribosoma bacterià. Per tant, per interaccionar amb les seves dianes, les tetraciclines han de travessar una o dues membranes (depenent si el bacteri és grampositiu o gramnegatiu). Aquests agents antimicrobians travessen la membrana externa dels bacteris gramnegatius a través dels canals

125

de les porines OmpF i OmpC, com a complexos de cations (probablement de magnesi). El complex de metall catiònic-antibiòtic és atret pel potencial de la membrana externa i fa que s’acumuli al periplasma, on es produeix la dissociació del complex i s’allibera la tetraciclina sense càrrega; actua com una molècula poc lipofílica però capaç de difondre’s a través de les regions lipídiques de la membrana interna (citoplasmàtica). De la mateixa manera, la forma lipofílica electroneutral se suposa que és la forma que travessa la membrana citoplasmàtica dels bacteris grampositius. La captació de les tetraciclines a través de la membrana citoplasmàtica és un procés dependent d’energia. A l’interior citoplasmàtic és probable que les tetraciclines siguin quelades, ja que el pH intern i la concentració de metalls divalents és superior que a l’exterior cell. ular. De fet, és probable que la forma activa del fàrmac que s’uneix al ribosoma sigui un complex de tetraciclina i magnesi. L’associació de les tetraciclines amb el ribosoma és totalment reversible, i això explica l’efecte bacteriostàtic d’aquest antibiòtic. Diversos estudis indiquen que existeix una única unió i amb una elevada afinitat de la tetraciclina amb la subunitat ribosòmica 30S, amb indicacions que la proteïna S7 i les bases G693, A892, U1052, C1054, G1300 i G1338 de l’rRNA 16S contribueixen al punt d’unió. També, altres autors declaren que aquests llocs d’interacció aparents no reflecteixen necessàriament els punts d’unió reals (Chopra i Roberts, 2001). De fet, la primera interpretació és complicada, atès que la unió de la tetraciclina (que mesura aproximadament de 8 a 12 Å) al ribosoma sembla que provoqui una gran quantitat de canvis estructurals a l’rRNA 16S. No obstant això, mutants naturals de Propionibacterium resistents a les tetraciclines contenen un canvi de citosina a guanina a la posició 1058 de l’rRNA 16S, fet que suggeriria que les bases U1052 i C1054 podrien tenir una funció significativa en el procés d’unió de la tetraciclina a la subunitat 30S del ribosoma (Chopra i Roberts, 2001).

126

A. RIBERA

Taula 2.

Mecanismes de resistència (gens tet i otr) agrupats segons McMurry i Levy a

Bombes d’expulsió

Protecció de ribosoma

Desactivació enzimàtica

Altres

tet(A), tet(B), tet(C),

tet(M), tet(O), tet(S),

tet(X)

tet(U) e

tet(D), tet(E), tet(G),

tet(W)

tet(H), tet(I), tet(J),

tet(Q), tet(T)

tet(Z), tet(30), tet(31),

otr(A), tetB(P), tet d

otr(C) e

tet(K), tet(L) otr(B), tcr3 d tetA(P) tet(V) tet(Y) c a Agrupació segons McMurry i Levy (2000). b tet(I) no ha estat seqüenciat, però s’associa amb una proteïna d’expulsió activa. c La relació entre el grup 1 i 6 (punt següent) no és totalment clara, ja que el gen no ha estat gaire estudiat. d Aquests gens encara no han estat designats (Levy et al., 1999). e tet(U) ha estat seqüenciat, però sembla no estar relacionat ni amb bombes d’expulsió ni amb protecció del ribosoma. otr(C) no ha estat encara seqüenciat (Chopra i Roberts, 2001).

Una absència d’activitat contra les cèll. ules eucariotes a causa d’una dèbil inhibició de la síntesi proteica que té lloc a les subunitats ribosòmiques 80S i d’una pobra acumulació d’aquest antibiòtic en les cèll. ules de mamífers explicaria les propietats antimicrobianes selectives de les tetraciclines. No obstant això, aquests agents antimicrobians tenen l’habilitat d’inhibir la síntesi proteica al mitocondri, a causa de la presència de subunitats 70S del ribosoma en aquests orgànuls (per això, s’ha relacionat la presència de mitocondris en P. falciparum amb l’activitat antiparasitària de les tetraciclines) (Chopra i Roberts, 2001). MECANISMES DE RESISTÈNCIA A mitjan dècada dels cinquanta, la majoria dels bacteris tant comensals com patògens eren sensibles a les tetraciclines. Així, l’augment de resistència ha estat relativament recent, i ha anat associat amb la introducció d’aquests antibiòtics en clínica, en veterinària i en agricultura. L’increment de resistències ha desencadenat la necessitat d’establir els mecanismes a través dels quals els diferents microorganismes es transfereixen els determinants

genètics responsables de resistència per via horitzontal. La causa principal de resistència a les tetraciclines és deguda a l’adquisició, per part dels bacteris, dels gens tet (vegeu la taula 2). Fins avui, han estat caracteritzats vinti-nou gens de resistència a tetraciclina (tet) i tres gens de resistència a oxitetraciclina (otr). Divuit dels gens tet i un dels gens otr codifiquen bombes d’expulsió activa, i set dels gens tet i otr(A) codifiquen proteïnes de protecció del ribosoma. Així, els principals mecanismes de resistència són: a) Bombes d’expulsió activa específiques per a tetraciclines. b) Protecció de ribosoma. A part d’aquests més importants també tenim: c) Desactivació enzimàtica. d) Altres gens tet. e) Disminució de l’acumulació de les tetraciclines a l’interior bacterià. 1. Alteracions en la permeabilitat de la membrana externa. 2. Sistemes d’expulsió activa no específics per a tetraciclines. f ) Alteracions en la diana de les tetraciclines. No existeixen diferències importants entre

TETRACICLINES

els gens de resistència tet i otr; el fet que s’anomenin de manera diferent és perquè els gens d’oxatetraciclina van ésser primerament identificats en organismes productors d’oxitetraciclines. Així doncs, els gens tet es troben en una gran varietat de bacteris aïllats en humans, en animals i en el medi ambient, i la majoria d’aquests gens estan associats amb plasmidis mòbils, transposons, transposons conjugatius, i integrons. Aquests elements mòbils han permès que els gens de resistència a tetraciclina hagin passat d’espècie a espècie i de gènere a gènere mitjançant conjugació (Chopra i Roberts, 2001). BOMBES D’EXPULSIÓ ACTIVA ESPECÍFIQUES PER A TETRACICLINES Aquestes proteïnes són les més ben estudiades. Els gens que codifiquen aquestes bombes pertanyen a la superfamília de facilitació major (MFS), que inclou més de tres-centes proteïnes. Tots els gens tet relacionats amb bombes d’expulsió codifiquen proteïnes aproximadament d’uns 46 kDa associades a membrana, les quals exporten la tetraciclina de l’interior cell. ular. L’exportació redueix la concentració de droga del citoplasma. Les proteïnes de bombes d’expulsió intercanvien un protó per un complex de tetraciclina-catió en contra d’un gradient de concentració, i posseeixen estructures i aminoàcids similars a altres bombes d’expulsió activa involucrades en la resistència a múltiples antibiòtics, en la resistència a l’amoni quaternari, al cloramfenicol i a les quinolones. La majoria de proteïnes confereixen resistència a la tetraciclina i doxiciclina però no a la minociclina ni a les glicilciclines, exceptuant Tet (B) que confereix resistència a la tetraciclina, doxiciclina i minociclina, però no a les glicilciclines. Cal tenir en compte que mutacions en tet(A) i tet(B) produïdes en el laboratori aportarien resistència a aquestes tetraciclines de 3a ge-

127

neració, cosa que suggeriria que un augment en terapèutica de les glicilciclines comportaria a la llarga un augment de resistències envers aquest grup. Aquestes proteïnes s’han dividit en sis grups segons la identitat de la seqüència d’aminoàcids (vegeu la taula 2): — Grup 1: Tet (A), Tet (B), Tet (C), Tet (D), Tet (E), Tet (G), Tet (H), Tet (Z) i probablement Tet (I), Tet (J) i Tet (30). D’aquest grup, l’únic que s’ha trobat en grampositius ha estat Tet (Z); els altres només s’han descrit en gramnegatius. — Grup 2: inclou Tet (K) i Tet (L). Aquestes proteïnes s’han trobat majoritàriament en grampositius. — Grup 3: inclou Otr (B) i Tcr3, ambdues trobades en Streptomyces sp. Similars topològicament al grup 2. — Grup 4: inclou TetA (P) de Clostridium sp. El gen tet(P) és bastant inusual, perquè consisteix en un gen que codifica una bomba d’expulsió funcional tetA(P), unit a un gen que codifica una proteïna de protecció de ribosoma, tetB(P). tetA(P) ha estat trobat sol, però tetB(P) sempre s’ha trobat unit al gen tetA(P). — Grup 5: inclou Tet (V) de Mycobacterium smegmatis. — Grup 6: inclouen determinants encara sense cap nom concret, de Corynebacterium striatum (no presents a la taula 2) i inclou una proteïna que es creu que utilitza ATP en lloc d’un gradient de protons com a font d’energia. Cal dir que la regulació de l’expressió dels gens de resistència tet és lleugerament diferent en bacteris gramnegatius i grampositius. Els determinants d’expulsió activa en gramnegatius estan formats per dos gens, orientats divergentment i amb els operadors i promotors sobreposats. Un gen codifica un repressor i l’altre codifica la bomba d’expulsió pròpiament dita, i ambdós gens són regulats per la presència de tetraciclina. En absència de tetraciclina, la proteïna repressora actua com un homodímer que uneix les seves dues subunitats α-hèlix als dos operadors de tet, i blo-

128

A. RIBERA

Taula 3.

Distribució dels gens de resistència tet relacionats amb bombes d’expulsió activa en bacteris gramnegatius

Un gen

Dos o més gens

Gènere

Gen

Gènere

Gen

Actinobacillus

tet(B)

Edwardsiella

tet(A), tet(D)

Erwinia

tet(B)

Acinetobacter

tet(A), tet(B)

Moraxella

tet(B)

Providencia

tet(B), tet(E), tet(I)

Pantoea

tet(B)

Plesiomonas

tet(A), tet(B), tet(D)

Treponema a

tet(B)

Enterobacter

tet(B), tet(C), tet(D)

Yersinia

tet(D)

Mannheimia

tet(B), tet(G), tet(H)

Alcaligenes

tet(E)

Proteus

tet(A), tet(B), tet(C), tet(J)

Eubacterium b

tet(K)

Pseudomonas

tet(A), tet(C), tet(E), tet(G)

Agrobacterium

tet(30) c

Serratia

tet(A), tet(B), tet(C), tet(E)

Citrobacter

tet(A), tet(B), tet(C), tet(D)

Klebsiella

tet(A), tet(B), tet(C), tet(D)

Shigella

tet(A), tet(B), tet(C), tet(D)

Salmonella

tet(A), tet(B), tet(C), tet(D), tet(G)

Aeromonas

tet(A), tet(B), tet(D), tet(E), tet(31) c

Vibrio

tet(A), tet(B), tet(C), tet(D), tet(E), tet(G)

Escherichia

tet(A), tet(B), tet(C), tet(D), tet(E), tet(I), tet(Y)

a Treponema denticola és una espècie anaeròbia, però no totes les espècies d’aquest gènere són anaeròbies. b Espècies anaeròbies. c És el començament de la designació amb nombres dels gens tet.

queja així la transcripció dels gens estructurals tant de la proteïna repressora com de la responsable de l’expulsió. A més, quan apareix el complex tetraciclina-Mg 2+ i s’uneix a la proteïna repressora, canvia la seva conformació, evita així la unió amb la regió de DNA dels operadors i indueix el sistema d’expulsió. Aquest sistema és un dels sistemes descrits de regulació transcriptora induïbles més sensible, ja que només calen concentracions nanomolars de tetraciclina perquè s’indueixi la transcripció dels gens estructurals i del repressor (Chopra i Roberts, 2001). Aquest tipus de regulació succeeix en la majoria de gens d’expulsió descrits en gramnegatius: tet(A), tet(C), tet(D), tet(E), tet(G), tet(H) i probablement també tet(I), exceptuant el gen tet(B), ja que la proteïna repressora se sintetitza abans de l’expressió de la bomba d’expulsió (vegeu la taula 3). En el cas dels grampositius, no s’ha trobat cap proteïna repressora, ni en tet(K), ni en tet(L), però si en tet(Z) (vegeu la taula 4).

La majoria dels gens tet presents en bacteris gramnegatius que codifiquen bombes d’expulsió activa es troben localitzats en plasmidis i es poden transferir mitjançant conjugació. Normalment els gens estan inserits en transposons que es transporten en diferents grups de plasmidis que procedeixen de diversos grups d’incompatibilitat (Chopra i Roberts, 2001, Ribera et al., 2003a). Aquests plasmidis sovint transporten altres gens de resistència a antibiòtics, gens de resistència a metalls pesants i factors de patogenicitat com toxines. Així, la selecció d’algun d’aquests factors selecciona el plasmidi i, per tant, comporta una selecció creuada que ha contribuït a l’increment espectacular en el nombre de bacteris multiresistents en els darrers quaranta anys (Chopra i Roberts, 2001). A més, els gens responsables d’expulsió activa de tetraciclines en bacteris grampositius estan associats amb plasmidis petits. S’ha especulat sobre la possibilitat que gens com tet(E), que presenten limitacions en el

TETRACICLINES

Taula 4.

129

Distribució dels gens de resistència tet relacionats amb bombes d’expulsió activa en bacteris grampositius

Un gen Gènere

Dos o més gens Gen

Gènere

Gen

Nocardia

tet(K)

Bacillus

tet(K), tet(L)

Actinomyces a

tet(L)

Listeria

tet(K), tet(L)

Corynebacterium

tet(Z)

Staphylococcus

tet(K), tet(L)

Clostridium a

tet(K), tet(L)

Peptostreptococcus a

tet(K), tet(L)

Enterococcus

tet(K), tet(L)

Streptococcus

tet(K), tet(L)

Mycobacterium

tet(K), tet(L), tet(V)

Streptomyces b

tet(K), tet(L), otr(B), tcr3

a Espècies anaeròbies. b Microorganisme multicell. ular.

nombre d’espècies que actuarien com a hostes seus, estiguin localitzats en plasmidis immòbils, fet que reduiria les oportunitats de transferència a altres gèneres i espècies (Chopra i Roberts, 2001). PROTECCIÓ DEL RIBOSOMA Aquest mecanisme de resistència a tetraciclines és degut a la presència en els bacteris de gens tet que codifiquen la síntesi d’unes proteïnes citoplasmàtiques que presenten la funció de protegir el ribosoma davant l’acció d’aquests agents antimicrobians. A diferència de les bombes d’expulsió, aquestes proteïnes confereixen resistència a tetraciclina, minociclina i doxiciclina; per tant; confereixen un major espectre de resistències que les bombes d’expulsió específiques per a tetraciclines. Són proteïnes que presenten certa homologia amb els factors d’elongació EF-Tu i EF-G, i tenen la màxima homologia amb l’àrea Nterminal, la qual conté el domini d’unió del GTP. En aquest grup, nou proteïnes han estat determinades: Tet (M), Tet (O), TetB (P), Tet (Q), Tet (S), Tet (T), Tet (W), Otr (A) i una altra present a la taula 2, a la qual encara no s’ha assignat cap nom específic. Entre aquestes, les més ben caracteritzades han estat Tet (M) i Tet

(O) (Chopra i Roberts, 2001). Aquestes dues proteïnes presenten una activitat en el ribosoma que és dependent de GTPasa. L’acció de Tet (M) no és afectada per la presència de tetraciclina, però s’inhibeix amb tiostrepton, el qual també inhibeix la unió de la proteïna EFG. Aquesta, juntament amb el Tet (M), competeix per la unió als ribosomes, encara que és Tet (M) el que presenta una major afinitat. Segons Burdett (1996) Tet (M) permet la unió de l’aminoacil-tRNA al ribosoma en presència de concentracions de tetraciclina que normalment inhibirien aquesta unió. En presència tant de Tet (M) com de Tet (O), la unió de la tetraciclina al ribosoma es veu reduïda quan GTP i no GDP és present. Burdett va afirmar que l’energia alliberada de la hidròlisi del GTP permetia l’alliberament de la tetraciclina del ribosoma. També, Trieber et al. (1998) van trobar que la hidròlisi del GTP permetia la dissociació del Tet (O) dels ribosomes. Cal dir, però, que aquestes diferències entre ambdues proteïnes no estan del tot demostrades. Encara que només s’hagi aprofundit en aquestes dues proteïnes, s’ha assumit que les altres proteïnes relacionades amb la protecció del ribosoma actuen de manera similar (presentarien també activitat GTPasa), atesa la similitud que presenten a la seqüència d’aminoàcids.

130

A. RIBERA

Taula 5.

Distribució dels gens de resistència tet relacionats amb la protecció del ribosoma en bacteris gramnegatius

Un gen Gènere

Dos o més gens Gen

Gènere b

Butyrivibrio

Gen a

tet(O), tet(W)

Acinetobacter

tet(M)

Eikenella

tet(M)

Mitsuokella a

tet(Q), tet(W)

Kingella

tet(M)

Selenomonas a

tet(Q), tet(W)

Neisseria

tet(M)

Porphyromonas a

tet(Q), tet(W)

Haemophilus

tet(M)

Bacteroides a

tet(M), tet(Q)

Pasteurella

tet(M)

Fusobacterium a

tet(M), tet(W)

Prevotella a

tet(Q)

Veillonella a

tet(M), tet(Q)

Campylobacter

tet(O)

Capnocytophaga

tet(Q)

a Espècies anaeròbies. b Ribera et al., 2003b.

El mecanisme d’acció d’aquestes proteïnes seria el següent: primer s’unirien al ribosoma, i causarien una alteració de la seva conformació (aquest canvi en la conformació del ribosoma es produiria amb l’energia alliberada de la hidròlisi del GTP), i s’evitaria així la unió de la tetraciclina però sense alterar ni parar la síntesi proteica; posteriorment la proteïna protectora s’ha d’alliberar del ribosoma per tal de permetre la unió d’EF-G, ja que els seus llocs d’unió al ribosoma estan sobreposats. L’expressió de Tet (M), de Tet (O) i de Tet (S), aparentment, sembla que estigui regulada. S’ha descrit, tant en Estreptococcus com en S. aureus, que una preexposició a concentracions subinhibitòries de tetraciclina en soques que presentarien tet(M) donaria com a resultat tant un increment de la resistència a aquest antibiòtic com un augment en el nivell de transcripcions de mRNA de tet(M) (Chopra i Roberts, 2001). No obstant això, hi ha moltes controvèrsies i aquesta inducibilitat no està del tot confirmada. Les proteïnes de protecció de ribosoma es divideixen en tres grups, igual que les proteïnes d’expulsió activa, segons la identitat de la seqüència d’aminoàcids (vegeu la taula 2): Grup 1: inclou Tet (M), Tet (O), Tet (S) i Tet (W).

Grup 2: inclou Otr (A) i TetB (P). Grup 3: Tet (Q) i Tet (T). S’han descrit també quatre gens en estreptococs relacionats amb la protecció del ribosoma, però cap hibrida amb els gens ja descrits; per tant, la seva relació amb els gens tet ja descrits és del tot desconeguda (Clermont et al., 1997). Existeix una hipòtesi que diu que els gens tet(M) procedeixen de bacteris grampositius. Altres gens inclosos dins el grup de gens tet pertanyents als grampositius serien tet(O) i tet(S), entre d’altres, ja que gens tet responsables de bombes d’expulsió de tetraciclines, com tet(K) i tet(L), també hi estan considerats. Aquests gens, però, cada vegada es troben més en espècies gramnegatives, sobretot tet(M), tet(O), tet(K) i tet(L) (Ribera et al., 2003b). A més, el gen tet(Q) va ésser primer trobat en gramnegatius, concretament en Bacteroides, s’ha trobat també en grampositius i està normalment associat amb transposons conjugatius que codifiquen la seva pròpia transferència, i també tet(M) (família del transposó Tn916). Aquests transposons es poden integrar en plasmidis i també al cromosoma bacterià i presenten al seu interior, a més de la resistència a tetraciclines, altres gens de resistència, com per exemple a eritromicina, kanamicina i cloramfenicol. Altres gens com

TETRACICLINES

131

tet(O) i tet(S) es troben en plasmidis conjugatius o al cromosoma, immòbils. A les taules 5 i 6 es troben els gens tet relacionats amb la protecció del ribosoma que s’han descrit en bacteris gramnegatius i grampositius, respectivament. S’han descrit mutacions als gens miaA i rpsL que interfereixen en la funció de les proteïnes encarregades de la protecció del ribosoma, de manera que redueixen la resistència a tetraciclina (Trieber et al., 1998). Així, les mutacions en miaA en presència de Tet (M) redueixen el nivell de resistència a tetraciclina en E. coli. No s’ha trobat que modifiqui la resistència en presència de Tet (O). En canvi, mutacions en rpsL, que codifica la proteïna ribosòmica S12, disminueixen la resistència a tetraciclina tant en presència de Tet (M) com de Tet (O) (McMurry i Levy, 2000).

cia a tetraciclines codifica una proteïna d’aproximadament uns 11,8 kDa que conté cent cinc aminoàcids; per tant, és molt més petita que les proteïnes d’expulsió (45 kDa) i que les relacionades amb la protecció del ribosoma (72 kDa). Existeix un 21 % de similitud entre els aminoàcids propers a l’extrem carboxiterminal d’aquesta proteïna i Tet (M), encara que no s’inclou el lloc d’unió a GTP (factor important relacionat amb l’activitat de les proteïnes de protecció del ribosoma). Cal dir, però, que la proteïna sencera no s’assimila ni a les proteïnes d’expulsió ni a les de protecció. A més, els mecanismes de resistència del gen de Streptomyces otr(C) no s’han determinat perquè encara no ha estat seqüenciat. Existeix, però, una hipòtesi que no relaciona aquest gen ni amb proteïnes d’expulsió ni de protecció (Chopra i Roberts, 2001).

DESACTIVACIÓ ENZIMÀTICA

DISMINUCIÓ DE L’ACUMULACIÓ DE LES TETRACICLINES A L’INTERIOR BACTERIÀ (A I B)

El gen tet(X) és l’únic exemple de resistència a tetraciclina a causa d’una alteració enzimàtica de l’antibiòtic. Aquest gen s’ha trobat en dos transposons molt relacionats de Bacteroides, i va ésser trobat perquè està lligat al gen erm(F), que codifica un gen de metilació de l’rRNA. Aquest gen tet produeix una proteïna citoplasmàtica, d’aproximadament uns 44 kDa, que modifica químicament les tetraciclines en presència d’O 2 i NADPH; per tant, no és actiu d’una manera natural en Bacteroides (anaerobi), ja que necessita l’O 2 per a actuar. No obstant això, aquest gen tet no té gaire importància clínica, ja que no s’ha trobat en altres bacteris i, per tant, la seva activitat només s’ha demostrat in vitro (Chopra i Roberts, 2001). ALTRES GENS tet, MECANISMES DE RESISTÈNCIA DESCONEGUTS El gen tet(U) que confereix baixa resistèn-

Els bacteris posseeixen, de manera innata, una sèrie de proteïnes codificades pel cromosoma que transporten molècules dins i fora la cèll. ula. Aquestes proteïnes s’han dividit en diferents grups, en els quals s’inclou l’MFS, la família RND (resistance nodulation cell division), la petita família de resistència a múltiples antibiòtics (SMR), que codifica bombes d’expulsió activa que depenen del flux de protons, amb un mecanisme d’antiport de protons, i la família de transportadors d’unió a ATP (ABC). Algunes (no totes) d’aquestes bombes d’expulsió activa confereixen resistència a les tetraciclines. Un gran nombre de bombes d’expulsió de la família RND tenen la tetraciclina com a substrat. Aquestes són bombes totalment diferents de les bombes d’expulsió específiques de tetraciclines, que són de la família MFS, ja que principalment es troben en bacteris gramnegatius i estan involucrades a expulsar molts

132

A. RIBERA

Taula 6.

Distribució dels gens de resistència tet relacionats amb la protecció del ribosoma en bacteris grampositius

Un gen

Dos o més gens

Gènere

Gen

Gènere

Gen

Abiotrophia

tet(M)

Aerococcus

tet(M), tet(O)

Bacterionema

tet(M)

Biﬁdobacterium b

tet(M), tet(W)

Gemella

tet(M)

Gardnerella

tet(M), tet(Q)

Mycoplasma a

tet(M)

Lactobacillus

tet(O), tet(Q)

Ureaplasma a

tet(M)

Mobiluncus b

tet(O), tet(Q)

Actinomyces

tet(M)

Eubacterium b

tet(M), tet(Q)

Corynebacterium

tet(M)

Listeria

tet(M), tet(S)

Bacillus

tet(M)

Staphylococcus

tet(M), tet(O)

Mycobacterium

otr(A)

Clostridium b

tet(M), tetB(P), tet(Q)

Peptostreptococcus b

tet(M), tet(O), tet(Q)

Enterococcus

tet(M), tet(O), tet(S)

Streptococcus

tet(M), tet(O), tet(Q), tet(T)

Streptomyces c

otr(A), tet d

a Bacteris sense paret cell. ular i amb un metabolisme de grampositiu. b Espècies anaeròbies. c Microorganisme multicell. ular. d Encara no li han donat cap número d’assignació.

tipus de lligands (tant antibiòtics, com ions metall tòxics) fora de la cèll. ula. A més, s’associen a una proteïna que actua com a lligand i a un canal de membrana externa. Així, de tipus de bombes RND que transportarien tetraciclina trobem més o menys les mateixes que també transportarien quinolones (esmentades anteriorment) (Chopra i Roberts, 2001): — Sistema Acr trobat en E. coli. — El sistema múltiple de Mex, trobat en Pseudomonas aeruginosa. — Sistema Mtr trobat en Neisseria gonorrhoeae. — Sistema SmeDEF descrit en Stenotrophomonas maltophilia. — Sistema AdeABC descrit en Acinetobacter baumannii. — Un sistema relacionat amb l’operó MexAMexB-OprM ha estat trobat en soques multiresistents de Burkholderia cepacia. — En Haemophilus inﬂuenzae també s’ha descrit una bomba d’expulsió homòloga a AcrAB. Altres tipus de bombes que no pertanyen a

la família RND i que també tenen tetraciclina com a substrat són (Putman et al., 2000): — El sistema trobat en Campilobacter jejuni (Cmr) (família MFS). — LmrP i LmrA de Lactococcus lactis (MFS i ABC, respectivament). — MdfA i EmrE d’E. coli (MFS i SMR, respectivament). El locus mar té un paper important en aquesta resistència. Les mutacions en la regió de marR augmenten la resistència a un gran nombre d’antimicrobians, inclosa la tetraciclina. També, mutants que expressen elevats nivells de MarA mostren una disminució en l’acumulació de tetraciclina i, per tant, una major resistència. Una elevada expressió de MarA també provoca una disminució de l’expressió de la porina OmpF i un augment de l’expressió de la bomba d’expulsió AcrAB (tal com succeeix en les quinolones). Aquests tipus d’operons que confereixen resistència a tetraciclina també s’han descrit en Klebsiella pneumoniae, Serratia marcescens, Enterobacter sp. i Campylobacter sp. (Chopra i Roberts, 2001).

TETRACICLINES

A més, la presència de mutacions que alterin la permeabilitat de les porines o dels lipopolisacàrids de la membrana externa pot també afectar la sensibilitat a la tetraciclina i a altres antibiòtics. Un exemple seria N. gonorrhoeae, que posseeix mtrCDe, que codifica una bomba d’expulsió activa. Quan hi ha una deleció d’una A o una inserció de doble TT dins els 13 pb de l’IR (inverted repeat) de la regió del promotor de l’mtrR, la cèll. ula hoste augmenta aproximadament quatre vegades la seva resistència a la tetraciclina, penicill. ina i eritromicina (Zarantonelli et al., 1999). En aquest microorganisme, la resistència mitjançada cromosòmicament és molt més freqüent que la resistència a antibiòtics mitjançada per plasmidis, i aquest fet és de gran importància clínica. Altres mutacions en bombes d’expulsió activa s’han descrit en: B. cepacia, C. jejuni, E. coli, Enterobacter sp., H. inﬂuenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa, S. marcescens i S. maltophilia (Roberts, 2003). ALTERACIONS EN LA DIANA DE LES TETRACICLINES Recentment, en quinze soques clíniques resistents a tetraciclina (CMI a tetraciclina de 2 a 64 μg/ml i CMI a doxiciclina d’1 a 32 μg/ml) de Propionibacterium cutania, es va trobar que en lloc d’una guanina a la posició 1058 del gen de l’rRNA 16S hi havia una citosina (ja citat anteriorment). Aquest canvi s’associa amb l’augment de resistència a aquest antibiòtic, encara que no és del tot clara la seva repercussió clínica (Ross et al., 1998). El que sí que és del tot conegut és que aquesta regió de l’rRNA 16S, coneguda com a hèlix 34, és important per a l’acabament de la cadena peptídica i per a garantir un bon resultat de traducció. En aquest punt s’han descrit mutacions en Helicobacter pylori (Trieber i Taylor, 2002).

133

BIBLIOGRAFIA Burdett, V. (1996). «Tet(M)-promoted release of tetracycline from ribosomes in GTP dependent». J. Bacteriol., vol. 178, pàg. 3246-3251. Chopra, I.; Roberts, M. (2001). «Tetracycline antibiotics: mode of action, applications, molecular biology, and epidemiology of bacterial resistance». Microbiol. Mol. Biol. Rev., vol. 65, pàg. 232-260. Clermont, D., Chesneau, O.; Céspedes, G. de; Horaud, T. (1997). «New tetracycline resistance determinants coding for ribosomal protection in streptococci and nucleotide sequence of tet(T) isolated from Streptococcus pyogenes A498». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 41, pàg. 112-116. Dámaso, D. (1990). «Tetraciclinas». A: Antimicrobianos. Marketing Pharm, pàg. 331-357. Grave, K.; Lingaas, E.; Bangen, M.; Ronning, M. (1999). «Surveillance of the overall consumption of antibacterial drugs in humans, domestic animals and farmed fish in Norway in 1992 and 1996». J. Antimicrob. Chemother., vol. 43, pàg. 243-252. Janknegt, R.; Lashof, A. O.; Gould, I. M.; Meer, J. W. M. van der (2000). «Antibiotic use in Dutch hospitals 19911996». J. Antimicrob. Chemother., vol. 45, pàg. 251-256. Joint Expert Advisory Committee on Antibiotic Resistance (JETACAR) (1999). The use of antibiotics in foodproducing animals: antibiotic-resistant bacteria in animals and humans. Canberra, Austràlia: Commonwealth Department of Health and Aged Care and Commonwealth Department of Agriculture, Fisheries and Forestry. Levy S. B.; Buu-Hoi, A.; Marshall, B. (1984). «Transposon Tn10-like tetracycline resistance determinants in Haemophilus parainﬂuenzae». J. Bacteriol., vol. 160, pàg. 8794. Levy, S. B.; McMurry, L. M.; Barbosa, T. M.; Burdett, V.; Courvalin, P.; Hillen, W.; Roberts, M. C.; Rood, J. I.; Taylor, D. E. (1999). «Nomenclature for new tetracycline resistance determinants». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 43, pàg. 1523-1524. McMurry, L. M.; Levy, S. B. (2000). «Tetracycline resistance in gram-positive bacteria». A: Fischetti, V. A.; Novick, R. P.; Ferretti, J. J.; Portnoy, D. A.; Rood, J. I. [ed.] Gram-positive pathogens. Wahington, DC: American Society for Microbiology, pàg. 660-677. Putman, M.; Veen, H. W. van; Konings, W. N. (2000). «Molecular properties of bacterial multidrug transporters». Microbiol. Molec. Rev., vol. 64, pàg. 672-693. Ribera, A.; Roca, I.; Ruiz, J.; Gibert, I.; Vila, J. (2003a). «Partial characterization of a transposon carrying the Tet A determinant in one clinical isolate of Acinetobacter baumannii». J. Antimicrob. Chemother., vol. 52, pàg. 477-480. Ribera, A.; Ruiz, J.; Vila, J. (2003b). «Presence of the Tet M determinant in one clinical isolate of Acinetobacter baumannii». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 47, pàg. 23102312.

134

A. RIBERA

Roberts, M. C. (2003). «Tetracycline therapy». Up. Antimicrob. Resist., vol. 36, pàg. 462-467. Ross, J. I.; Eady, E. A.; Cove, J. H.; Cunliffe W. J. (1998). «16SrRNA mutation associated with tetracycline resistance in a gram-positive bacterium». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 42, pàg. 1702-1705. Swann, M. M. (1969). Report of joint committee on the use of antibiotics in animal husbandry and veterinary medicine. Cmnd. 4190. Londres: Her Majesty’s Stationery Office. Trieber, C. A.; Burkhardt, N.; Niehaurs, K. H.; Taylor, D. E. (1998). «Ribosomal protection from tetracy-

cline mediated by Tet (O): Tet (O) interaction with ribosomes is GTP-dependent». Biol. Chem., vol. 379, pàg. 847855. Trieber, C. A.; Taylor, D. E. (2002). «Mutations in the 16S rRNA genes of Helicobacter pylori mediate resistance to tetracycline». J. Bacteriol., vol. 184, pàg. 2131-2140. Zarantonelli, L.; Borthagaray, G.; Lee, E. H.; Shafer, W. M. (1999). «Decreased azithromycin susceptibility of Neisseria gonorrhoeae due to mtrR mutations». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 43, pàg. 2468-2472.

Antimicrobians (Joaquim Ruiz, ed.) Treballs de la SCB. Vol. 55 (2004) 135-142

. QUINOLONES. ACCIÓ I RESISTÈNCIA Joaquim Ruiz Centre de Salut Internacional, Hospital Clínic, IDIBAPS. Adreça per a la correspondència: Joaquim Ruiz. Centre de Salut Internacional, Hospital Clínic, IDIBAPS. Villarroel, 170. 08036 Barcelona. Adreça electrònica: joruiz@clinic.ub.es. RESUM Les quinolones són agents sintètics amb un ampli ventall d’acció. Han estat dels agents més emprats al món, la qual cosa ha conduït a l’aparició d’alts nivells de resistència als mateixos. Actualment es coneixen diferents mecanismes de resistència: a) mutacions a les dianes, b) problemes de permeabilitat, c) acció de bombes d’expulsió, d) protecció de les dianes i e) nivells d’expressió dels gens codificadors de les dianes de les quinolones. Paraules clau: quinolones, resistència, DNA-girasa, topoisomerasa iv, eﬄux actiu, qnr. SUMMARY Quinolones are synthetic agents with a wide activity spectrum. These agents have been extensively used, being considered one of the most consumed antibacterials at world wide level. This fact has resulted in the appearance of high levels of quinolone-resistance. Currently different mechanisms of resistance have been described: 1) target mutations, 2) impermeability, 3) efflux pumps, 4) target protection and 5) levels of target expression. Keywords: quinolones, resistance, DNA gyrase, topoisomerase iv, active efflux, qnr. INTRODUCCIÓ Les quinolones són antibacterians d’origen sintètic, que deriven de l’àcid nalidíxic (NAL), agent sintetitzat l’any 1962 (Lesher et al., 1962). Originalment aquests agents només eren útils davant d’infeccions urinàries, però des de la incorporació d’un àtom de fluor a la posició 6, fet que succeí a la darreria dels anys setanta, i amb el desenvolupament de la norfloxacina, agent que obrí l’era de les quinolones fluo-

rades o ﬂuoroquinolones (FQ), varen ampliar considerablement llur espectre d’acció i varen abastar un ampli ventall d’aplicacions, fins al punt que a les acaballes del segle xx la ciprofloxacina, possiblement el membre més conegut d’aquest grup d’antibacterians, esdevingué l’agent antibacterià més emprat al món (Acar i Goldstein, 1997). Aquest elevat nivell d’ús amaga, no obstant això, fortes diferències geogràfiques, associades d’una manera directa al seu elevat cost econòmic, que ha fet que

136

J. RUIZ

en nombrosos països pobres hagin estat molt poc o gens emprades. De fet, fins no fa gaire temps, els patògens provinents d’aquestes àrees geogràfiques eren molt sensibles a les quinolones, però d’un temps ençà hi ha un constant increment de soques resistents, fet que ha estat relacionat amb problemes de control de l’ús que es fa dels antimicrobians, i amb la introducció de quinolones de primera generació, com l’àcid nalidíxic per al tractament de diverses malalties, o amb l’ús de quinolones de producció ill. egal que no tenen cap garantia (Hart i Kariuki, 1998). També cal fer esment que llurs aplicacions no es limiten a la medicina humana: són emprats a bastament en veterinària. De fet, aquest ús veterinari s’ha associat en alguns casos específics, com Campylobacter jejuni, amb l’increment dels nivells de resistència (Endtz et al., 1991). MECANISMES D’ACCIÓ Les quinolones actuen inhibint l’acció de les topoisomerases de tipus ii. Actualment es coneixen dos enzims pertanyents a aquest grup, la DNA-girasa i la topoisomerasa iv. Ambdós són enzims tetramèrics que posseeixen una forta semblança estructural i són formats per dues subunitats A i dues subunitats B (GyrA i GyrB en el cas de la DNA-girasa, i ParC i ParE pel que fa a la topoisomerasa iv); també s’assemblen en la seqüència d’aminoàcids (existeix una forta homologia entre GyrA i ParC per una banda, i entre GyrB i ParE per l’altra), i estan relacionats amb els processos de replicació i segregació del cromòfor bacterià. Així, la funció principal de la DNAgirasa és la de catalitzar el superenrotllament negatiu del DNA, mentre que, pel que fa a la topoisomerasa iv, sembla ser la segregació dels cromosomes després de la duplicació (Ruiz, 2003). Per a exercir aquesta inhibició, les quinolones interaccionen a la vegada amb el DNA i la

diana. En el cas de la DNA-girasa, s’ha postulat que les quinolones produeixen l’existència de forquetes de replicació obertes, atès l’ancoratge d’aquest enzim amb el DNA, que el bacteri interpreta com la presència de lesions al seu cromòfor, amb la qual cosa activa el sistema SOS, que en l’intent de reparar aquestes lesions acabaria provocant la mort bacteriana (Piddock i Walters, 1992). MECANISMES DE RESISTÈNCIA Actualment es coneixen cinc mecanismes de resistència a quinolones. Aquests són: a) Alteracions de llurs dianes. b) Impermeabilitat de membrana. c) Expulsió activa. d) Protecció de les dianes. e) Expressió de les dianes. De tots aquests el més rellevant en soques clíniques és la presència d’alteracions en les topoisomerases de tipus ii (Ruiz, 2003), malgrat que recents estudis semblen indicar que fins ara la contribució real dels sistemes d’expulsió activa al desenvolupament de resistències a quinolones ha estat menyspreada (Sáenz et al., 2004).

Alteracions a les dianes La diana primària de les quinolones depèn de dos factors: el tipus de microorganisme i la quinolona específica. De manera general, en microorganismes gramnegatius la diana principal és GyrA, mentre que en grampositius és ParC (anomenat GrlA en Staphylococcus aureus), encara que algunes quinolones, com la clinafloxacina o la moxifloxacina, posseeixen la mateixa afinitat per tots dos enzims (Takei et al., 2001). El major nombre d’estudis s’ha desenvolupat sobre Escherichia coli. En aquest microorganisme s’han descrit mutacions relacionades amb el desenvolupament de resistència a

. QUINOLONES. ACCIÓ I RESISTÈNCIA

quinolones als gens codificadors de les quatre subunitats (vegeu les taules 1 i 2), encara que no totes aquestes mutacions posseeixen la mateixa importància. Així, in vivo, les mutacions més importants són al gyrA, i les de parC són les segones en importància, mentre que són gairebé absents les mutacions en gyrB i no se n’han descrit en parE (Ruiz, 2003). In vitro, les mutacions en gyrA i parC continuen essent les més importants, però hi han estudis que donen la mateixa rellevància a les mutacions de gyrB (Nakamura et al., 1989). Tanmateix, únicament in vitro s’ha descrit una mutació en parE (Breines et al., 1997), i s’ha de tenir en compte que només comporta un increment en la resistència a quinolones en presència d’una mutació concomitant en gyrA. Aquest esquema seria extrapolable a la gran majoria de microorganismes gramnegatius, mentre que en els grampositius les mutacions en gyrB i parE es troben en més codons i més freqüentment que en gramnegatius, malgrat que el rol d’algunes com a causa de resistència a quinolones no està plenament establert i fins i tot és dubtós (Ruiz, 2003). De la mateixa manera, no totes les substitucions descrites en una mateixa subunitat tenen la mateixa importància, ni afecten igualment els nivells de resistència. Clàssicament, en gyrA la regió on es detecten les mutacions implicades en el desenvolupament de resistència a quinolones ha estat anomenada amb les sigles QRDR (de l’anglès quinolone resistant determining region), i s’estén des del codó 67 fins al 106. No obstant això, ja s’han descrit mutacions en codons situats fora d’aquesta regió, i s’ha demostrat, almenys pel que fa a les situades al codó 51 d’E. coli, llur paper en el desenvolupament de resistència a quinolones (Friedman et al., 2001). El mateix succeeix en d’altres microorganismes gramnegatius, on també s’han descrit mutacions fora de la QRDR, com seria el cas de les mutacions al codó 119 de Salmonella sp. (Griggs et al., 1996). En E. coli, actualment, s’han descrit mutaci-

137

Taula 1. Substitucions associades amb resistència a quinolones en GyrA i GyrB d’E. coli Codó

Aminoàcid salvatge

Substitucions descrites

a) Substitucions descrites en GyrA 51

Ala

Val

Ala

Ser

Gly

Cys, Asp

Asp

Gly

Ser

Leu, Trp, Ala, Val

Ala

Pro, Val

Asp

Asn, Gly, Val, Tyr, His

106

Gln

Arg, His

b) Substitucions descrites en GyrB 426

Asp

Asn

447

Lys

Glu

ons als codons 51, 67, 81, 82, 83, 84, 87 i 106, encara que les mutacions als codons 51, 67, 82 i 106 només s’han trobat en mutants de laboratori (vegeu la taula 1). De totes les mutacions suara esmentades les més freqüentment descrites tant en E. coli com en la gran majoria de microorganismes gramnegatius són les que afecten el codó 83. Aquest, de fet, es podria considerar el primer punt de mutació en aquests microorganismes (Ruiz, 2003). Una de les possibles i escasses excepcions seria Salmonella sp., microorganisme on semblen ser més freqüents les mutacions que ocupen el codó 87 (Cabrera et al., 2004; Piddock et al., 1998). La presència de només una d’aquestes mutacions al gyrA s’associa amb un alt nivell de resistència a NAL, però tan sols amb una sensibilitat disminuïda a les fluoroquinolones, i és necessari el concurs d’altres mutacions al gyrA o en altres dianes (normalment parC) per a assolir resistència plena a fluoroquinolones. Cal fer esment que, com veurem més endavant quan parlem de bombes d’expulsió, aquest fet, malgrat que és plenament considerat arreu, fins al punt que en alguns microorganismes es considera el NAL com a marcador de resistència del grup de les quinolones (Hakanen et al., 1999; Ruiz et al., 2002), cosa

138

J. RUIZ

que en clínica és plenament vàlida, no és estrictament veritat. L’ús dels nivells de resistència a l’àcid nalidíxic per a determinar la viabilitat dels tractaments amb fluoroquinolones es deu al fet que s’ha descrit un major nombre de fallides terapèutiques amb fluoroquinolones en soques NAL R sensibles a fluoroquinolones (Wain et al., 1997); tanmateix, estudis in vitro han mostrat que aquestes soques esdevenen més fàcilment resistents a fluoroquinolones que soques sense cap mutació a les dianes (Ruiz et al., 2002), ja que veuen facilitada la possibilitat d’adquirir una nova mutació. Com s’ha dit, diferents substitucions en un mateix codó donen lloc a diferents nivells de resistència; així, a tall d’exemple, diferents estudis han mostrat que les substitucions al codó 83 que donen com a resultat un residu Ala donen nivells de resistència més minsos que quan la substitució és Leu o Val, per exemple. En aquest sentit és notable que a partir d’una soca resistent a NAL (MIC de 32 μg/ml) que posseïa una Ala al codó 83 es varen obtenir, fent-la créixer en presència de lomefloxacina, una soca mutant in vitro amb una MIC de NAL de 2.048 μg/ml, on només variava el fet que el codó 83 havia mutat i en comptes d’una Ala hi havia una Val (Tavio et al., 1999). Aquestes soques amb Ala al codó 83 semblen ser més freqüents en treballs desenvolupats amb soques provinents de països de baixa renda (Vila et al., 2000, 2001), possiblement pel fet que en aquests països la quinolona més emprada és el NAL, la menys potent de les quinolones comercialitzades. Aquests fets s’han associat amb els mecanismes d’interacció entre les quinolones i llurs dianes. Actualment el més acceptat és el que considera que l’aminoàcid 83 és el punt d’interacció del radical que les quinolones posseeixen en posició 1, mentre que l’aminoàcid 87 seria on interaccionaria el radical en posició 7 de les quinolones. Així, diferents substitucions afectarien de manera diferent aquestes interaccions, afavorint o interferint amb la unió de les quinolones.

Malgrat tot, cal assenyalar que el fenotipus NAL S FQ R ha estat descrit de manera puntual tant in vitro com in vivo. In vitro ha estat descrit en E. coli, i és degut a les mutacions Gly-81 en Asp o Asp-82 en Gly. Tanmateix, s’ha descrit en algunes soques esporàdiques de Campylobacter jejuni, sense que s’hagi aclarit el mecanisme responsable (Ruiz, 2003). L’únic microorganisme d’interès clínic en què sembla que aquest fenotipus sigui la norma habitual és Stenotrophomonas maltophilia, microorganisme en què, de manera interessant, les mutacions a les dianes de les quinolones sembla que no tenen cap paper en la resistència a quinolones, i s’ha suggerit la presència de potents bombes d’expulsió (Ribera et al, 2002b; Ruiz, 2003). La forta semblança estructural que hi ha entre les dues dianes fa que les principals mutacions descrites en parC siguin ubicades en punts equivalents als descrits per a gyrA. Així, en E. coli, s’han descrit mutacions als codons 78, 80 i 84 (que equivalen als 81, 83 i 87 de gyrA) (vegeu la taula 2); en altres microorganismes s’han descrit mutacions en d’altres codons, com al 79 —descrites en Shigella ﬂexneri, Haemophilus inﬂuenzae o Streptococcus pneumoniae (Ruiz, 2003). Una mutació descrita tan sols en S. aureus afecta el codó 116 (Ala a Glu o Pro); aquesta mutació seria a l’aminoàcid anàleg al 119 de gyrA de Salmonella sp. Les mutacions a les subunitats gyrB i parE gaudeixen de molta menys importància, especialment pel que pertoca a gramnegatius. En E. coli s’han descrit mutacions als codons 426 i 447 de gyrB i al 445 de parE (vegeu les taules 1 i 2). Tanmateix, en Salmonella sp. s’ha associat la presència de mutacions al codó 463 de gyrB (Ser a Tyr) amb el desenvolupament de resistència a quinolones (Gensber et al., 1995). En grampositius la rellevància de les mutacions en aquestes subunitats sembla més gran, encara que normalment hi són presents en companyia de mutacions en gyrA o parC. En microorganismes grampositius s’ha descrit la capacitat d’adquirir per transformació natural fragments dels gens gyrA o parC d’es-

. QUINOLONES. ACCIÓ I RESISTÈNCIA

Taula 2. Substitucions associades amb resistència a quinolones en ParC i ParE d’E. coli Codó

Aminoàcid salvatge

Substitucions descrites

a) Substitucions descrites en ParC 78

Gly

Asp

Ser

Ile, Arg

Glu

Lys, Val, Gly

b) Substitucions descrites en ParE 445

Leu

His

pècies properes i incorporar-los en llur genoma. Si aquests fragments estan mutats, amb aquests s’adquireix la resistència a quinolones. A hores d’ara s’ha descrit aquest fenomen en Streptococcus pneumoniae i en Streptococcus del grup viridans (Janoir et al., 1999; Ruiz, 2003)

Impermeabilitat de membrana Els problemes de permeabilitat afecten desigualment les quinolones en funció de llur grau d’hidrofòbia. Així, totes les quinolones poden penetrar als bacteris per porines, però només aquelles més hidrofòbiques poden passar pel mig de la bicapa lipídica. Usualment, els problemes de permeabilitat s’associen amb un minvament en l’expressió d’alguna porina. En E. coli s’ha associat un descens en el nivell de la porina OmpF amb un increment en els nivells de resistència de determinades quinolones (Ruiz, 2003). Aquest és un mecanisme de resistència múltiple que afecta altres antibiòtics no emparentats, ja que aquesta porina és la porta d’entrada de diversos antimicrobians (Cohen et al., 1989). La regulació de la síntesi d’OmpF està mitjançada per micF, un regulador antisentit, que produiria una repressió posttranscripcional de la síntesi d’OmpF. La presència d’aquest regulador, a la vegada, estaria controlada pels sistemes MarRAB o SoxRS, sistemes de regulació induïbles per diferents substrats, incloses les

139

quinolones, que estan rere el control de diferents gens i afavoreixen alhora el descens de la presència de determinades porines (p. ex.: OmpF) i la sobreexpressió d’algunes bombes d’expulsió. Cal fer esment que la composició particular de la membrana externa de diferents bacteris ha estat associada amb nivells més grans de resistència basal a quinolones, com seria el cas d’Acinetobacter baumannii i Pseudomonas aeruginosa (Ruiz, 2003).

Expulsió activa L’expulsió de quinolones ha estat considerada durant molt de temps com un sistema complementari, capaç de modular els nivells de resistència deguts a la presència de mutacions a les dianes, i que només en casos excepcionals de sobreexpressió podria donar lloc a resistència a aquests antimicrobians. Estudis recents han demostrat que la realitat és més complexa, i d’aquesta manera s’ha mostrat la presència de trenta-set sistemes putatius d’expulsió activa en E. coli amb un rol encara desconegut en la resistència a aquests i d’altres agents (Nishino i Yamaguchi, 2001). Així mateix, com s’ha esmentat abans, existeixen microorganismes, com S. maltophilia amb potents bombes d’expulsió, que per si mateixes poden donar lloc a elevats nivells de resistència (Ribera et al., 2002a; Ruiz, 2003). De la mateixa manera, s’ha descrit en E. coli que en presència de determinats inhibidors de bombes d’expulsió, com la Phe-Arg-β-naftilamida, una mutació al codó 83 de gyrA no pot per si mateixa produir resistència a NAL (Sáenz et al., 2004). D’aquesta manera, soques amb una mutació en gyrA i amb nivells de resistència a NAL de 64-1.024 μg/ml presenten nivells de resistència de 4-16 μg/ml quan s’afegeix al medi aquest inhibidor. El mateix efecte es detecta amb soques sensibles, sense cap mutació en llurs dianes; en aquestes el nivell basal de resistència a NAL cau des

140

J. RUIZ

de 2-4 μg/ml en absència de l’inhibidor fins a < 0, 25-0,5 μg/ml. Aquests resultats suggereixen la presència constitutiva d’una bomba d’expulsió amb la capacitat de reenviar NAL al medi. En aquest mateix estudi s’observa que la resistència a ciprofloxacina només es veu afectada quan és més elevada del que caldria esperar pel nombre i tipus de mutacions en les seves dianes, la qual cosa fa pensar que aquesta hipotètica bomba capaç de reenviar NAL al medi podria —a causa de petites alteracions estructurals que augmentessin la seva afinitat per la ciprofloxacina o d’una sobreexpressió—, encara que amb baixa eficiència, reenviar al medi ciprofloxacina i modular els nivells de resistència a aquest antimicrobià. Encara que menor, aquest inhibidor també ha mostrat posseir un cert efecte en els nivells de resistència de NAL en altres microorganismes gramnegatius, com per exemple A. baumannii (Ribera et al., 2002b). En els microorganismes grampositius s’han descrit sistemes d’expulsió que poden reenviar al medi quinolones; el millor estudiat és el sistema NorA, de S. aureus. Aquest sistema és dependent d’ATP, i és capaç de reenviar al medi quinolones hidrofíliques, com norfloxacina, però no afecta les més hidrofòbiques (Ruiz, 2003). Actualment es coneixen diferents bombes d’expulsió relacionades amb NorA en altres microorganismes grampositius.

Protecció de les dianes El 1998 Martínez-Martínez et al. (1998) varen fer la primera demostració ferma de la transferència plasmídica de la resistència a quinolones, assumpte que havia estat centre d’àmplies discussions i que, malgrat que s’havien fet diverses descripcions al llarg de la història d’aquests agents, mai no havia estat plenament establert (Ruiz, 2003). Posteriors anàlisis d’aquests plasmidi varen demostrar que carregava un gen, que va ser anomenat qnr, el producte del qual interaccionava

amb les dianes de les quinolones i minvava la seva afinitat per les quinolones (Tran i Jacoby, 2002), encara que el mecanisme exacte d’interacció roman sense identificar. Aquest gen es troba flanquejat per l’ORF513, ORF que ha estat descrit com a part dels anomenats integrons complexos, cosa que fa pensar que aquest gen es troba dins d’un integró complex de classe 1. Aquest gen només ha estat descrit en E. coli i en Klebsiella pneumoniae, però la seva localització plasmídica i el fet que estigui, probablement, en un integró de classe 1, són motius prou suficients per a pressuposar-li una certa facilitat per a estendre’s no tan sols dins d’aquestes espècies, sinó a d’altres. Actualment el gen qnr ja ha estat descrit en països tan llunyans com la Xina i els Estats Units, i s’han trobat en el primer d’aquests països prevalences de més del 7 %, i de l’11 % als Estats Units. (Wang et al., 2003, 2004).

Expressió de les dianes Recentment, l’any 2003, es va descriure per primer cop un increment en la resistència a quinolones mitjançant un minvament en els nivells d’expressió de la topoisomerasa iv (raonablement, el mateix efecte s’hauria d’aconseguir amb un descens en els nivells d’expressió de la DNA-girasa). Aquest alentiment s’associa amb la presència de mutacions al promotor del gen que feien minvar el seu nivell de transcripció (Ince i Hooper, 2003). Aquest fenomen es podria associar amb observacions dels anys noranta en les quals es veia que un alentiment de la velocitat de creixement d’E. coli es traduïa en uns nivells més grans de resistència a les quinolones (Dalhoff et al., 1995). El fenomen roman sense explicar, malgrat que es podria explicar per la presència d’un menor nombre de lesions al DNA, i un temps més gran perquè l’actuació del sistema SOS pugui acabar reparant-les.

. QUINOLONES. ACCIÓ I RESISTÈNCIA

BIBLIOGRAFIA Acar, J. F.; Goldstein, F. W. (1997). «Trends in bacterial resistance to fluoroquinolones». Clin. Infect. Dis., vol. 24 (supl. 1), pàg. 67-73. Breines, D. V.; Ouabdesselam, S.; Ng, E. Y.; Tankovic, J.; Shah, S.; Soussy, C. J.; Hooper, D. C. (1997). «Quinolone resistance locus nfxD of Escherichia coli is a mutant allele of the parE gene encoding a subunit of topoisomerase iv». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 41, pàg. 175-179. Cabrera, R.; Ruiz, J.; Arroyo, M.; Marco, F.; Oliveira, I.; Aladueña, A.; Usera, M. A.; Jiménez de Anta, M. T.; Gascón, J.; Vila, J. (2004). «Mechanisms of resistance to several antimicrobial agents in Salmonella clinical isolates causing of traveler’s diarrhea». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 48, pàg. 3934-3939. Cohen, S. P., McMurry, L.; Hooper, D. C.; Wolfson, J. S.; Levy, S. B. (1989). «Cross resistance to fluoroquinolones in multiple-antibiotic-resistance (Mar) Escherichia coli selected by tetracycline or chloramphenicol: decreased drug acumulation asociated with membrane changes in addition to OmpF reduction». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 33, pàg. 1318-1325. Dalhoff, A.; Matutat, S.; Ullmann, U. (1995). «Effect of quinolones against slowly growing bacteria». Chemotherapy, vol. 41, pàg. 92-99. Endtz, H. P.; Ruijs, G. J.; Klingeren, B. van; Jansen, W. H.; Reyden, T. van der; Mouton, R. P. (1991). «Quinolone resistance in campylobacter isolated from man and poultry following the introduction of fluoroquinolones in veterinary medicine». J. Antimicrob. Chemother., vol. 27, pàg. 199-208. Friedman, S.; Lu, T.; Drlica, K. (2001). «Mutation in the DNA gyrase A gene of Escherichia coli that expands the quinolone resistance-determining region». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 45, pàg. 2378-2380. Gensber, K.; Yin, Y. F.; Piddock, L. J. V. (1995).«A novel gyrB mutation in a fluoroquinolone-resistant clinical isolate of Salmonella typhimurium». FEMS Microbiol. Lett., vol. 132, pàg. 57-60. Griggs, D.; Gensber, K.; Piddock, L. J. V. (1996). «Mutations in gyrA gene of quinolone-resistant Salmonella serotypes isolated from human and animals». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 40, pàg. 1009-1013. Hakanen, A.; Kotilainen, P.; Jalava, A.; Siitonen, A.; Huovinen, P. (1999). «Detection of decreased fluoroquinolone susceptibility in Salmonellas and validatio of nalidixic acid screening test». J. Clin. Microbiol., vol. 37, pàg. 3572-3577. Hart, C. A.; Kariuki, S. (1998). «Antimicrobial resistance in developing countries». BMJ, vol. 317, pàg. 647-650. Ince, D.; Hooper, D. C. (2003). «Quinolone resistance due to reduced target enzyme expression». J. Bacteriol., vol. 23, pàg. 6883-6892.

141

Janoir, C.; Podglajen, I.; Kitzis, M. D.; Poyart, C.; Gutmann, L. (1999). «In vitro exchange of fluoroquinolone resistance determinants between Streptococcus pneumoniae and viridans streptococci and genomic organization of the parE-parC region in S. mitis». J. Infect. Dis., vol. 180, pàg. 555-558. Lesher, G. Y.; Froelich, E. J.; Gruett, M. D.; Bailey, J. H.; Brundage, R. P. (1962). «1,8-naphthyridine derivatives: a new class of chemotherapy agents». J. Med. Pharm. Chem., vol. 5, pàg. 1063-1065. Martínez-Martínez, L.; Pascual, A.; Jacoby, G. A. (1998). «Quinolone resistance from a transferable plasmid». Lancet, vol. 351, pàg. 797-799. Nakamura, S.; Nakamura, M.; Kojima, T.; Yoshida, H. (1989). «gyrA and gyrB mutations in quinolone-resistant strains of Escherichia coli». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 33, pàg. 254-255. Nishino, K.; Yamaguchi, A. (2001). «Analysis of a complete library of putative drug transporter genes in Escherichia coli». J. Bacteriol., vol. 183, pàg. 5803-5812. Piddock, L. J. V.; Ricci, V.; McLaren, I.; Griggs, D. J. (1998). «Role of mutation in the gyrA and parC genes of nalidixic-acid-resistant Salmonella serotypoes isolated from animals in the United Kingdom». J. Antimicrob. Chemother., vol. 41, pàg. 635-641. Piddock, L. J. V.; Walters, R. N. (1992). «Bactericidal activities of five quinolones for Escherichia coli strains with mutations in genes encoding the SOS response or cell division». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 36, pàg. 819825. Ribera, A.; Domènech-Sánchez, A.; Ruiz, J.; Benedí, V. J.; Jiménez de Anta, M. T.; Vila, J. (2002a). «Mutations in gyrA and parC QRDRs are not relevant for quinolone resistance in epidemiological unrelated Stenotrophomonas maltophilia clinical isolates». Microb. Drug Resist., vol. 8, pàg. 245-252. Ribera, A.; Ruiz, J.; Jiménez de Anta, M. T.; Vila, J. (2002b). «Effect of an efflux pump inhibitor in the MIC of nalidixic acid for Acinetobacter baumannii and Stenotrophomonas maltophilia clinical isolates». J. Antimicrob. Chemother., vol. 49, pàg. 697-698. Ruiz, J. (2003). «Mechanisms of resistance to quinolones: target alterations, decreased accumulation and DNA gyrase protection». J. Antimicrob. Chemother., vol. 51, pàg. 1109-1117. Ruiz, J.; Gómez, J.; Navia, M. M.; Ribera, A.; Sierra, J. M.; Marco, F.; Mensa, J.; Vila, J. (2002). «High prevalence of nalidixic acid resistant, ciprofloxacin susceptible phenotype among clinical isolates of Escherichia coli and other Enterobacteriaceae». Diagn. Microbiol. Infect. Dis., vol. 42, pàg. 257-261. Sáenz, Y.; Ruiz, J.; Zarazaga, M.; Teixidó, M.; Torres, C.; Vila, J. (2004). «Effect of the efflux pump inhibitor Phe-Arg-β-naphthylamide on the MIC values of the quinolones, tetracycline and chloramphenicol, in Escherichia coli isolates of different origin». J. Antimicrob. Chemother., vol. 53, pàg. 544-545.

142

J. RUIZ

Takei, M.; Fukuda, H.; Kishii, R.; Hosaka, M. (2001). «Target preference of 15 quinolones against Staphylococcus aureus based on antibacterial activities and target inhibition». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 45, pàg. 35443547. Tavio, M. M.; Vila, J.; Ruiz, J.; Ruiz, J.; MartínSánchez, A. M.; Jiménez de Anta, M. T. (1999). «Mechanisms involved in the development of resistance to fluoroquinolones in Escherichia coli strains». J. Antimicrob. Chemother., vol. 44, pàg. 735-742. Tran, J. H.; Jacoby, G. A. (2002). «Mechanisms of plasmid mediated quinolone resistance». Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 99, pàg. 5638-5642. Vila, J.; Vargas, M.; Ruiz, J.; Corachan, M.; Jiménez de Anta, M. T.; Gascón, J. (2000). «Quinolone resistance in enterotoxigenic Escherichia coli causing diarrhea in travelers to India in comparison with travelers to other geographical areas». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 44, pàg. 1731-1733. Vila, J.; Vargas, M.; Ruiz, J.; Espasa, M.; Pujol, M.; Corachan, M.; Jiménez de Anta, M. T.; Gascón,

J. (2001). «Susceptibility patterns of enteroaggregative Escherichia coli associated to traveller’s diarrhoea. Emergence of quinolone resistance». J. Med. Microbiol., vol. 50, pàg. 996-1000. Wain, J.; Hoa, N. T. T.; Chinh, N. T.; Vinh, H.; Everett, M. J.; Diep, T. S.; Day, N. P.; Solomon, T.; White, N. J.; Piddock, L. J.; Parry, C. M. (1997). «Quinolone-resistant Salmonella typhi in Viet Nam: molecular basis of resistance and clinical response to treatment». Clin. Infect. Dis., vol. 25, pàg. 1404-1410. Wang, M.; Sahm, D. F.; Jacoby, G. A.; Hooper, D. C. (2004). «Emerging plasmid-mediated quinolone resistance associated with the qnr gene in Klebsiella pneumoniae clinical isolates in the United States». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 48, pàg. 1295-1299. Wang, M.; Tran, J. H.; Jacoby, G. A.; Zhang, Y.; Wang, F.; Hooper, D. C. (2003). «Plasmid-mediated quinolone resistance in clinical isolates of Escherichia coli from Shanghai, China». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 47, pàg. 2242-2248.

Antimicrobians (Joaquim Ruiz, ed.) Treballs de la SCB. Vol. 55 (2004) 143-150

. GLICOPÈPTIDS. MECANISMES D’ACCIÓ I MECANISMES DE RESISTÈNCIA M. Ángeles Domínguez Servei de Microbiologia, Hospital Universitari de Bellvitge, Universitat de Barcelona. Adreça per a la correspondència: M. Ángeles Domínguez. Servei de Microbiologia, Hospital Universitari de Bellvitge, Universitat de Barcelona. Feixa Llarga, s/n. 08907 Hospitalet de Llobregat. Adreça electrònica: adominguez@csub.scs.es. RESUM Els antibiòtics glicopèptids (vancomicina i teicoplanina) actuen inhibint la síntesi de la paret bacteriana en bacteris grampositius. L’augment de la incidència de les infeccions per bacteris grampositius, especialment entre les infeccions adquirides a l’hospital, han fet reprendre l’interès pels glicopèptids. Aquests antibiòtics han mantingut una eficàcia excell. ent, tret d’algunes excepcions (Enterococcus i, més recentment, Staphylococcus aureus), enfront de grampositius. Paraules clau: glicopèptids, vancomicina, teicoplanina. SUMMARY Glycopeptides (vancomicine and teicoplanine) act inhibiting the cell wall synthesis in Grampositive bacteria. The increasing number of infections by Gram-positive bacteria, mainly those acquired into hospitals, has been attracting the use of glycopeptides. These antibiotics have retained an excellent activity (with some exceptions as Enterococcus and quite recently Staphylococcus aureus), against Gram-positive bacteria. Keywords: glycopeptides, vancomicine, teicoplanine. INTRODUCCIÓ Els antibiòtics glicopèptids van ser introduïts en la pràctica mèdica el 1958. Actuen inhibint la síntesi de la paret bacteriana en bacteris grampositius. El primer compost d’aquesta família, la vancomicina, fou l’únic agent disponible al llarg de gairebé trenta anys. Origi-

nàriament era obtingut de la fermentació produïda per Streptomyces orientali. Els primers preparats de vancomicina presentaven importants efectes tòxics. La vancomicina s’absorbeix molt poc al tracte digestiu i produeix necrosi en l’administració intramuscular, raons per les quals ha de ser administrada per via endovenosa. El 1985 s’incorporà al mer-

144

M. Á. DOMÍNGUEZ

cat europeu un segon glicopèptid, la teicoplanina, que era obtinguda, en un principi, d’Actinoplanes teichomyticus. La teicoplanina no en tenia, gairebé, d’efectes tòxics, i permetia d’aquesta manera l’administració intramuscular. Aquests dos components són els únics disponibles actualment per a l’ús terapèutic en humans, i existeixen d’altres derivats àmpliament emprats com a inductors de l’engreixament del bestiar. L’augment de la incidència de les infeccions per bacteris grampositius, especialment pel que fa a les infeccions d’origen intrahospitalari —infeccions nosocomials—, ha fet desfermar l’interès pels glicopèptids. Aquests antibiòtics han mantingut una eficàcia excell. ent, tret d’algunes excepcions (Enterococcus i, més recentment, Staphylococcus aureus) enfront de grampositius. Cal fer esment que l’aparició i disseminació de la resistència a vancomicina entre enterococs i estafilococs ha empès la recerca de nous glicopèptids al llarg dels darrers deu anys. Actualment, estan en procés d’investigació un seguit de derivats semisintètics, entre els quals destaquen l’oritavancina (LY333328) i la dalbavancina (BI397), que encara romanen en les fases ii/iii d’estudi clínic (Bambeke et al., 2004). MECANISMES D’ACCIÓ DELS GLICOPÈPTIDS La vancomicina i la teicoplanina posseeixen una estructura bioquímica semblant, un esquelet heptapèptid on varien els radicals complementaris (N-metil-leucina i asparagina en la vancomicina, hidroxifenil-glicina, Nacetilglucosamina i N-acilglucosamina en la teicoplanina). Els mecanismes d’acció dels glicopèptids consisteixen en la inhibició de la síntesi de peptidoglicà, i actuen en els darrers estadis d’aquesta. La biosíntesi de peptidoglicà es resumeix en tres passos: a) la síntesi citoplasmà-

tica dels precursors del peptidoglicà, constituïts per pentapèptids fixos a un disacàrid, b) l’acoblament d’aquests precursors a un transportador lipídic, i la transferència de la molècula resultant a la cara externa de la membrana cell. ular i, finalment, c) l’entrecreuament dels precursors individuals per mitjà de reaccions de transpeptidació i transglicosilació, a la vegada que el transportador lipídic s’allibera i es recicla cap endins de la membrana cellular. Els bacteris que creixen en presència de vancomicina acumulen precursors citoplasmàtics, la qual cosa indica que el glicopèptid interfereix en l’entrecreuament del peptidoglicà, en particular bloquejant les reaccions de transglicosilació (Bambeke et al., 2004). Des d’un punt de vista molecular, la diana primària de la vancomicina és l’extrem DAla-D-Ala de les molècules precursores. Estudis de composició molecular i estudis experimentals han mostrat que la vancomicina forma un complex entre el dipèptid D-Ala-DAla i l’esquelet peptídic del glicopèptid, mitjançant la formació de cinc ponts d’hidrogen (Reynolds, 1989; Arthur et al., 1996). La formació d’aquest complex inhibeix les reaccions de transpeptidació. L’estabilitat de la interacció entre el glicopèptid i el residu terminal DAla-D-Ala pot millorar-se per dos mecanismes: a) com que té lloc amb la vancomicina, mitjançant la formació de dímers de glicopèptid, aquests dímers es formen mitjançant ponts d’hidrogen entre les dues molècules de glicopèptid i atrapen el terminal D-Ala-D-Ala com si fos una butxaca, i donen una notable rigidesa estructural al complex (Schafer et al., 1996), o b) com ocorre amb la teicoplanina i els seus derivats que posseeixen un extrem lipofílic, mitjançant l’ancoratge d’aquest extrem de l’antibiòtic a la membrana (Beauregard et al., 1995). La presència de terminals lipofílics fa que l’antibiòtic es mantingui prop de la seva diana. Els mecanismes d’acció de la vancomicina i la teicoplanina són, doncs, semblants, i impedeixen la polimerització del peptidogli-

. GLICOPÈPTIDS. MECANISMES D’ACCIÓ I MECANISMES DE RESISTÈNCIA

cà. També actuen secundàriament, alterant la permeabilitat cell. ular i la síntesi de RNA. En general, exerceixen una ràpida acció bactericida, però tan sols en bacteris amb creixement actiu. ESPECTRE ANTIBACTERIÀ. PROPIETATS FARMACOLÒGIQUES L’espectre d’activitat dels antibiòtics glicopèptids afecta cocs i bacils grampositius, com estafilococs, estreptococs, Corynebacterium diphteriae, Listeria monocytogenes, etc. No són actius enfront de bacteris gramnegatius, micobacteris, clamídies, micoplasmes o fongs. Entre els bacteris anaerobis inhibeixen els cocs, Clostridium sp. (incloent-hi Clostridium diﬃcile), Eubacterium sp. i alguns Actinomyces sp. L’activitat intrínseca de vancomicina i teicoplanina és semblant, tret del que respecta als estreptococs, que són més sensibles a la teicoplanina (Malabarba i Ciabatti, 2001). Entre les propietats farmacodinàmiques la diferència més important és la capacitat de la teicoplanina d’unir-se a proteïnes del sèrum (90 %), molt superior a la que presenta la vancomicina (10-55 %). Aquest fet explica la llarga vida mitjana de la teicoplanina a l’organisme, entre vuitanta-tres i cent seixanta-vuit hores, comparat aamb la de la vancomicina, que és de 4-8 hores. Malgrat això, la capacitat d’unió a proteïnes sols necessita tenir-se en compte per a controlar l’activitat de l’antibiòtic, ja que solament la fracció lliure de l’antibiòtic al sèrum és la directament activa (Bambeke et al., 2004). Tal vegada, pel seu caràcter lipofílic, la teicoplanina té un volum de distribució més gran que la vancomicina, cosa que li permet assolir concentracions terapèutiques en greix, músculs (incloent-hi pericardi i miocardi) i, en menor proporció, en os i cartílag, encara que no arriba al sistema nerviós central (Wilson, 2000). La concentració pic que s’assoleix després de l’administració de l’antibiòtic varia entre els 20-50 mg/l per a la

145

vancomicina i els 43 mg/l per a la teicoplanina. Els models farmacodinàmics in vitro mostren que la vancomicina presenta una activitat bactericida, dependent del temps d’exposició, contràriament a la majoria dels microorganismes grampositius; malgrat això, és bacteriostàtica enfront d’enterococs (Houlihan et al., 2000). L’activitat bactericida de la vancomicina enfront d’enterococs pot assolir-se en combinar-la amb un aminoglucòsid. MECANISMES DE RESISTÈNCIA A GLICOPÈPTIDS El National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) dels Estats Units ha xifrat els punts de tall per a definir sensibilitat i resistència respectivament en ≤ 4 i ≥ 16 μg/ml per a la vancomicina i en ≤ 8 i ≥ 32 μg/ml per a la teicoplanina. Al llarg dels darrers anys dos microorganismes d’importància mèdica, enterococs i S. aureus, han desenvolupat diferents mecanismes de resistència a glicopèptids.

Resistència a glicopèptids en enterococs La resistència a vancomicina en enterococs es descrigué per primer cop a Anglaterra el 1988 (Leclerq et al., 1988; Uttley et al., 1988), i el mateix any es comunicà a França i Alemanya. Als Estats Units, l’aparició d’enterococs resistents a vancomicina (ERV) fou seguida per una disseminació tan important, que la resistència a aïllaments procedents d’hemocultius es duplicà des d’un 13 % el 1995 fins a un 26 % el 2000 (Bonten et al., 2001). Contràriament, la prevalença d’ERV a Europa ha estat molt baixa (3 %) i relacionada sols amb infeccions d’adquisició intrahospitàlaria (Schouten et al., 2000). Malgrat això, la colonització d’animals per ERV és freqüent a Europa, la qual cosa podria ser deguda a l’ús massiu de l’a-

146

M. Á. DOMÍNGUEZ

voparcina, un antibiòtic glicopèptid amb un mecanisme d’acció idèntic al de la vancomicina, i que ha estat emprat amb molta freqüència com a inductor de l’engreixament del bestiar (Bogaard et al., 1997; Braak et al., 1998). La prohibició de l’ús d’avoparcina als països de la Unió Europea originà en molts la disminució de la colonització per ERV, tant en animals com en humans (Klare et al., 1999; Bogaard i Stobberiagh, 2000; Aarestrup et al., 2001). El mecanisme de resistència a glicopèptids en enterococs consisteix a sintetitzar el peptidoglicà per una via alternativa, en la qual es produeixen precursors amb un extrem terminal D-Ala-D-Lac o D-Ala-D-Ser en comptes del terminal D-Ala-D-Ala; a la vegada, el bacteri elimina els precursors que acaben en DAla-D-Ala. La substitució de D-Ala per D-Lac elimina un dels cinc ponts d’hidrogen que s’estableixen entre el glicopèptid i la seva diana, fet que fa minvar mil vegades l’afinitat entre aquestes dues molècules. La substitució de D-Ala per D-Ser ocasiona un canvi conformacional, que també redueix l’afinitat per la vancomicina, encara que no d’una manera tan efectiva com el D-Lac (Bugg et al., 1991; Arthur et al., 1996). Perquè la resistència sigui detectable fenotipícament i amb significació clínica, es requereix l’acció coordinada de diferents enzims. Així, el bacteri necessita sintetitzar DLac (gen vanH) o D-Ser (gen vanT), i D-AlaD-Lac o D-Ala-D-Ser (gens vanA, B, D, o C, E, G); el bacteri també necessita degradar D-AlaD-Ala (gen vanX) o eliminar D-Ala dels precursors existents (gen vanY) o ambdues coses alhora (gen vanXY). A més, existeix un sistema regulador d’aquests gens compost per dos elements (gens vanS-vanR), la inducció del qual dóna lloc a l’expressió de la resistència. La inducció pot ser el resultat de l’exposició a la vancomicina (fenotipus VanB, C, E o G), o a vancomicina i teicoplanina (fenotipus VanA) (Arthur et al., 1996; Perichon et al., 1997; Fines et al., 1999). Les proteïnes responsables de la resistència són codificades per gens agrupats en operons que són als plasmidis o al cro-

mosoma, i poden ser transferits amb facilitat, fins i tot entre diferents espècies (Arthur et al., 1996). S’han descrit sis fenotipus d’ERV, els quals es diferencien per la composició genètica, la regulació d’expressió i el nivell de resistència assolit; les característiques de cada fenotipus es resumeixen a la taula 1. El fenotipus VanA presenta resistència d’alt nivell a la vancomicina i a la teicoplanina; aquesta resistència és induïble, i en alguns casos els determinants del fenotipus es localitzen en plasmidis (Arthur et al., 1996). S’ha pogut comprovar que els gens relacionats amb aquest fenotipus són en un transposó anomenat Tn1546 (Leclerq et al., 1988; Arthur i Courvalin, 1993). Totes aquestes dades impliquen un possible risc de disseminació d’aquest tipus de resistència a d’altres bacteris grampositius. Les soques d’enterococ pertanyents al fenotipus VanB presenten resistència moderada a la vancomicina, i romanen sensibles a la teicoplanina. Aquesta resistència no és transferible, i és probablement deguda a un gen cromosòmic. Cal fer esment, no obstant això, que en els darrers anys, tant a Europa com als Estats Units, s’han aïllat soques d’Enterococcus faecalis i Enterococcus faecium amb fenotipus VanB, en què la resistència a vancomicina ha pogut ser transferida per conjugació a d’altres enterococs, probablement per mitjà de transposons (Boyce et al., 1994). Les soques corresponents al fenotipus VanC són moderadament resistents a la vancomicina i sensibles a la teicoplanina. Aquest tipus de resistència és constitutiva i no transferible.

Resistència a glicopèptids en estaﬁlococs Al contrari del que té lloc amb els enterococs, tots els estafilococs resistents a vancomicina són resistents a la teicoplanina. Entre els estafilococs coagulasanegatius (ECN), és més comuna la resistència a la teicoplanina que a la vancomicina. El 1981 es descrigué la

. GLICOPÈPTIDS. MECANISMES D’ACCIÓ I MECANISMES DE RESISTÈNCIA Taula 1. Resistència

VanA

147

Principals característiques dels enterococs resistents a glicopèptids

Espècies

Expressió

Mecanisme de resistència

E. faecium

Induïble

Modificació de la diana

E. faecalis

(per vancomicina

(D-Ala-D-Lac)

E. avium

i teicoplanina)

CMI (μg/ml) vancomicina

teicoplanina

64-1.000

16-512

4-1.000

0,5-1

2-32

0,5-1

64-128

4-64

0,5

E. durans E. hirae E. mundii E. raﬃnosus E. gallinarum E. casseliﬂavus VanB VanC

E. faecium

Induïble

Modificació de la diana

E. faecalis

(per vancomicina)

(D-Ala-D-Lac)

E. gallinarum

Constitutiva

Modificació de la diana

E. casseliﬂavus

o induïble

(D-Ala-D-Lac)

E. ﬂavescens VanD

E. faecium

Constitutiva

Modificació de la diana (D-Ala-D-Lac)

VanE VanG

E. faecalis E. faecalis

Induïble

Modificació de la diana

(per vancomicina)

(D-Ala-D-Ser)

Induïble

Modificació de la diana

(per vancomicina)

(D-Ala-D-Ser)

CMI: concentració mínima inhibitòria.

primera sèrie d’ECN resistents a glicopèptids (Cherubin et al., 1981). El mecanisme de resistència a la teicoplanina no és ben conegut encara, i sembla que s’adquireix esglaonadament i s’associa a una estructura anormal de la paret cell. ular amb una alteració de les proteïnes fixadores de penicill. ina. La resistència a glicopèptids en S. aureus aparegué inicialment en certs aïllaments com una elevació de les CMI a la vancomicina (fins a 8-16 μg/ml) o a la teicoplanina. Aquest fet fou descrit al Japó el 1996 en soques de S. aureus resistents a meticill. ina (SARM). La disminució de la sensibilitat a la vancomicina motivà la denominació de vancomycin-intermediate S. aureus (VISA) o glycopeptide-intermediate S. aureus (GISA) (Hiramatsu et al., 1997). D’aleshores ençà, s’han aïllat soques VISA o GISA en molts països, en general en malalts que havien rebut un tractament perllongat amb vancomicina (Hiramatsu, 2001; Liñares, 2001). Aquests

microorganismes, fenotípicament, es caracteritzen per tenir engrossida la paret cell. ular, per produir abundant material extracell. ular i per presentar una disminució en la capacitat de divisió cell. ular (Hamilton-Miller, 1999). Aquests canvis són deguts a la producció d’un peptidoglicà alterat, amb un augment en la proporció de terminals lliures D-Ala-D-Ala (menor entrecreuament del peptidoglicà, els quals poden atrapar les molècules de vancomicina i bloquejar l’accés de l’antibiòtic a la seva diana (Bambeke et al., 2004). La paret cellular engruixida d’una soca VISA pot contenir des del doble fins a quatre vegades més residus D-Ala-D-Ala que la paret cell. ular d’una soca sensible a vancomicina; tanmateix, la paret cell. ular d’un VISA pot fixar entre tres i sis vegades més vancomicina que la necessària per a bloquejar la síntesi de peptidoglicà. Aquest mecanisme produeix també un entrecreuament més senzill del peptidoglicà, la

148

M. Á. DOMÍNGUEZ

qual cosa sembla tenir relació amb la disminució de l’activitat de les proteïnes fixadores de penicill. ina o PBP, o amb l’alteració dels precursors de la mureïna (Cui et al., 2000). Els determinants genètics o les mutacions responsables d’aquests canvis encara no han estat identificats. Una nova manera de resistència a glicopèptids en S. aureus —més efectiva, ja que permet assolir alts nivells de resistència a vancomicina i teicoplanina— ha estat descrita recentment en dos hospitals diferents dels Estats Units (Chang et al., 2003; Tenover et al., 2004). En ambdós casos les soques eren SARM, portadores dels gens vanA, que havien estat transferits des de soques d’enterococ amb fenotipus VanA. La disseminació d’aquest tipus de soques als hospitals suposa un perill alarmant, per la manca d’elements terapèutics efectius per a combatre llurs infeccions. INDICACIONS CLÍNIQUES PER A L’ÚS DE GLICOPÈPTIDS La vancomicina va ser introduïda inicialment en la pràctica clínica per al tractament d’infeccions produïdes per soques de S. aureus productores de β-lactamases. Però l’aparició en el mercat d’antibiòtics menys tòxics com les penicill. ines isoxazòliques (meticill. ina) i cefalosporines, o la combinació amb inhibidors de β-lactamases (com l’àcid clavulànic o el sulbactam), va fer que l’ús de la vancomicina es reduís al tractament per via oral de la diarrea produïda per C. diﬃcile. Als anys setanta es generalitzaren als hospitals les infeccions per soques de S. aureus resistents a meticill. ina (SARM), aquestes soques, a part de ser resistents als β-lactàmics, en general presentaven resistència enfront d’altres grups d’antibiòtics, com aminoglucòsids, macròlids, lincosamides o quinolones (Livermore, 2000). L’augment d’infeccions nosocomials per SARM a tot el món va fer de la vancomicina el tractament d’elecció empíric per a les infeccions

greus d’aquests microorganismes multiresistents. Però l’ampli ús de la vancomicina als Estats Units s’ha acompanyat d’un increment, gairebé parall. el, en la resistència a vancomicina en els enterococs (Kirst et al., 1998; Fridkin et al., 2001). Aquest fet conduí les autoritats sanitàries americanes a restringir l’ús de glicopèptids en el tractament empíric, amb l’objectiu de mantenir l’activitat d’aquests antibiòtics en situacions en les quals no fos possible una altra alternativa (CDC, 1993, 1995; Hamilton et al., 2000). En general, els glicopèptids sols podrien emprar-se empíricament (és a dir, sense disposar d’un cultiu positiu i d’un estudi de sensibilitat antibiòtica) en infeccions greus que afectin malalts immunocompromesos (p. ex.: malalts cremats, malalts sèptics en unitats de vigilància intensiva...) ingressats en centres amb elevats percentatges de resistència a meticill. ina en S. aureus o en infeccions greus associades a la presència de cossos estranys (p. ex.: catèters, vàlvules cardíaques) (CDC, 1995). De fet, la vancomicina és menys bactericida que les penicill. ines isoxazòliques enfront de soques de S. aureus sensibles a meticill. ina; per tant se n’ha d’evitar l’ús, i també el de la teicoplanina, quan existeixi evidència microbiològica que la infecció està causada per soques sensibles a penicill. ines isoxazòliques, amb l’excepció de casos d’all. èrgia a βlactàmics (Bambeke et al., 2004). Així, a banda de les infeccions greus per estafilococs multiresistents, les principals indicacions per a l’ús de vancomicina haurien de limitar-se a: a) infeccions diftèriques greus, en malalts amb all. èrgia a β-lactàmics mitjançada per IgE, b) la combinació de vancomicina amb cefotaxima o ceftriaxona en infeccions del sistema nerviós central causades per soques de Streptococcus pneumoniae resistents a penicill. ina, i c) l’ús de vancomicina oral, en les colitis greus que no responen al tractament amb metronidazole (CDC, 1995; Gordts et al., 2000). La teicoplanina pot ser utilitzada en la majoria de les indicacions esmentades per a la vancomicina, amb l’excepció de les infeccions

. GLICOPÈPTIDS. MECANISMES D’ACCIÓ I MECANISMES DE RESISTÈNCIA

del sistema nerviós central, on la teicoplanina no assoleix la concentració suficient. Els seus principals avantatges són la possibilitat d’administració intramuscular una vegada al dia i la menor incidència d’efectes secundaris (Bambeke et al., 2004). BIBLIOGRAFIA Aarestrup, F. M.; Seyfarth, A. M.; Emborg, H. D.; Pedersen, K.; Hendriksen, R. S.; Bager, F. (2001). «Effect of abolishment of the use of antimicrobial agents for growth promotion on occurrence of antimicrobial resistance in fecal enterococci from food animals in Denmark». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 45. pàg. 20542059. Arthur, M.; Courvalin, P. (1993). «Genetics and mechanisms of glycopeptide resistance in enterococci». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 37, pàg. 1563-1571. Arthur, M.; Reynolds, P.; Courvalin, P. (1996). «Glycopeptide resistance in enterococci». Trends Microbiol., vol. 4. pàg. 401-407. Bambeke, F. van; Laethem, Y. van; Courvalin, P.; Tulkens, P. M. (2004). «Glycopeptide antibiotics; from conventional molecules to new derivatives». Drugs, vol. 64, pàg. 913-936. Beauregard, D. A.; Williams, D. H.; Gwynn, M. N.; Knowles, D. J. (1995). «Dimerization and membrane anchors in extracellular targeting of vancomycin group antibiotics». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 39, pàg. 781-815. Bogaard, A. E. van den; Mertens, P.; London, N. H.; Stobberingh, E. E. (1997). «High prevalence of colonization with vancomycin- and pristinamycin-resistant enterococcis in healthy humans and pigs in the Netherlands: is the addition of antibiotics to animal fees to blame?» J. Antimicrob. Chermother., vol. 40, pàg. 454-456. Bogaard, A. E. van den; Stobberingh, E. E. (2000). «Epidemiology of resistance to antibiotics: links between animals and humans». Int. J. Antimicrob. Agents, vol. 14, pàg. 327-335. Bonten, M. J.; Willems, R.; Weinstein, R. A. (2001). «Vancomycin-resistant enterococci: why are they here; and where do they come from?» Lancet Infect. Dis., vol. 1, pàg. 314-325. Boyce, J. M.; Opal, S. M.; Chow, J. W.; Zervos, M. J.; Potter-Bynoe, G.; Sherman, C. B.; Romulo, R. L.; Fortna, S.; Medeiros, A. A. (1994). «Outbreak of multidrug-resistant Enterococcus faecium with transferable vanB class vancomycin in resistance». J. Clin. Microbiol., vol. 32, pàg. 1148-1153. Braak, N. van den; Belkum, A. van; Keulen, M. van; Vliegenthart, J.; Verbrugh, H. A.; Endtz, H. P.

149

(1998). «Molecular characterization of vancomycin-resistant enterococci from hospitalized patients and poultry products in the Nederlands». J. Clin. Microbiol., vol. 36, pàg. 1927-1932. Bugg, T. D.; Wright, G. D.; Dutka-Malen, S.; Arthur, M.; Courvalin, P.; Walsh, C. T. (1991). «Molecular basis for vancomycin resistance in Enterococcus faecium BM4147: biosynthesis of a depsipeptide peptidoblycan precursor by vancomycin resistance proteins VanH and VanA». Biochemistry, vol. 30, pàg. 10408-10415. Centers for Disease Control and Prevention (1993). «Nosocomial enterococci resistant to vancomycin: United States, 1989-1993». MMWR Morb. Mortal Wkly. Rep., vol. 42, pàg. 597-599. — (1995). «Recommendations for preventing the spread of vancomycin resistance: Hospital Infection Control Practies Advisory Committee (HICPAC)». Infect. Control Hosp. Epidemiol., vol. 16, pàg. 105-113. Chang, S.; Sievert, D. M.; Hageman, J. C.; Boulton, M. L.; Tenover, F. C.; Downes, F. P.; Shah, S.; Rudrik, J. T.; Pupp, G. R.; Brown, W. J.; Cardo, D.; Fridkin, S. K.; Vancomycin-Resistant Staphylococcus aureus Investigative Team (2003). «Infection with vancomycinresistant Staphylococcus aureus containing the vanA resistance gene». N. Engl. J. Med., vol. 348, pàg. 1342-1347. Cherubin, C. E.; Corrado, M. L.; Sierra, M. F.; Gombert, M. E.; Shulman, M. (1981) «Susceptibility of Gram-positive cocci to various antibiotics including cefotaxima, moxalactam, and N-formimydoiol thienamycin». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 20, pàg. 553555. Cui, L.; Murakami, H.; Kuwahara-Arai, K.; Hanaki, H.; Hiramatsu, K. (2000). «Contribution of a thickened cell wall and its glutamine nonamidated component to the vancomycin resistance expressed by Staphylococcus aureus Mu50». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 44, pàg. 2276-2285. Fines, M.; Perichon, B.; Reynolds, P.; Sahm, D. F.; Courvalin, P. (1999). «VanE, a new type of acquired glycopeptide resistance in Enterococcus faecalis BM4405». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 43, pàg. 2161-2164. Fridkin, S. K.; Edwards, J. R.; Courval, J. M.; Hill, H.; Tenover, F.; Lawton, R.; Gaynes, R. P.; McGowan Jr, J. F.; Intensive Care Antimicrobial Resistance Epidemiology (ICARE) Project and the National Nosocomial Infections Surveillance (NNIS) System Hospitals (2001). «The effect of vancomycin and third-generation cephalosporins on prevalence of vancomycin-resistant enterococci in 126 US adult intensive care units». Ann. Intern. Med., vol. 135, pàg. 175-183. Gordts, B.; Firre, E.; Jordens, P.; Legrand, J. C.; Maertens, J.; Struelens, M.; Infectious Diseases Advisory Board (2000). «National guidelines for the judicious use of glycopeptides in Belgium». Clin. Microbiol. Infect., vol. 6, pàg. 585-592. Hamilton, C. D.; Drew, R.; Janning, S. W.; Latour, J.

150

M. Á. DOMÍNGUEZ

K.; Hayward, S. (2000). «Excessive use of vancomycin: a successul intervention strategy at an academic medical center». Infect. Control Hosp. Epidemiol., vol. 21, pàg. 4245. Hamilton-Miller, J. M. (1999). «Glycopeptide-resistant staphylococci». Int. J. Antimicrob. Agents, vol. 13, pàg 6365. Hiramatsu, K. (2001). «Vancomycin resistant Staphylococcus aureus: a new model of antibiotic resistance». Lancet Infect. Dis., vol. 1, pàg. 147-55. Hiramatsu, K.; Hanaki, H.; Ino, T.; Yabuta, K.; Oguri, T.; Tenover, F. C. (1997). «Methicillin-resistant Staphylococcus aureus clinical strain with reduced vancomycin susceptibility». J. Antimicrob. Chemother., vol. 40, pàg. 135136. Houlihan, H. H.; Stokes, D. P.; Rybak, M. J. (2000). «Pharmacodynamics of vancomycin and ampicillin alone and in combination with gentamicin once daily or thrice daily against Enterococcus faecalis in an in vitro infection model». J. Antimicrob. Chemother., vol. 46, pàg. 7986. Kirst, H. A.; Thompson, D. G.; Nicas, T. I. (1998). «Historical yearly usage of vancomycin». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 42, pàg. 1303-1304. Klare, I.; Badstubner, D.; Konstabel, C.; Bohme, G.; Claus, H.; Witte, W. (1999). «Decreased incidence of VanA-type vancomycin-resistant enterococci isolated from poultry meat and from fecal samples of humans in the community after discontinuation of avoparcin usage in animal husbandry». Microb. Drug Resist., vol. 5, pàg. 45-52. Leclercq, R.; Derlot, E.; Duval, J.; Courvalin, P. (1988). «Plasmid-mediated resistance to vancomycin and teicoplanin in Enterococcus faecium». N. Engl. J. Med., vol. 319, pàg. 157-161.

Liñares, J. (2001). «The VISA/GISA problem: therapeutic implications». Clin. Microbiol. Infect. Dis., vol. 7, pàg. 815. Livermore, D. M. (2000). «Antibiotic resistance in staphylococci». Int. J. Antimicrob. Agents., vol. 16 (supl. 1), pàg. S3-S10. Malabarba, A.; Ciabatti, R. (2001). «Glycopeptide derivatives». Curr. Med. Chem., vol. 14, pàg. 1759-1573. Perichon, B.; Reynolds, P.; Courvalin, P. (1997). «VanD-type glycopeptide-resistant Enterococcus faecium BM4339». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 41, pàg. 2016-2018. Reynolds, P. E. (1989). «Structure; biochemistry and mechanism of action of glycopeptide antibiotics». Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis., vol. 8, pàg. 943-950. Schafer, M.; Schneider, T. R.; Sheldrick, G. M. (1996). «Crystal structure of vancomycin». Structure, vol. 4, pàg. 1509-1515. Schouten, M. A.; Hoogkamp-Korstanje, J. A.; Meis, J. F.; Voss, A.; European VRE Study Group (2000). «Prevalence of vancomycin-resistant enterococci in Europe». Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis., vol. 19, pàg. 816822. Tenover, F. C.; Weigel, L. M.; Appelbaum, P. C.; McDougal, L. K.; Chaitram, J.; McAllister, S.; Clark, N.; Killgore, G.; O’Hara, C. M.; Jevitt, L.; Patel, J. B.; Bozdogan, B. (2004). «Vancomycin-resistant Staphylococcus aureus isolate from a patient in Pennsylvania». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 48, pàg. 275-280. Uttley, A. H.; Collins, C. H.; Naidoo, J.; George, R. C. (1988). «Vancomycin-resistant enterococci». Lancet, vol. 1, pàg. 57-58. Wilson, A. P. (2000). «Clinical pharmacokinetics of teicoplanin». Clin. Pharmacokinet., vol. 39, pàg. 167-183

Antimicrobians (Joaquim Ruiz, ed.) Treballs de la SCB. Vol. 55 (2004) 151-163

. MACRÒLIDS. MECANISMES D’ACCIÓ I DE RESISTÈNCIA Carmen Torres, Yolanda Sáenz i Aránzazu Portillo Área de Bioquímica y Biología Molecular, Centro Científico Tecnológico, Universitat de la Rioja. Adreça per a la correspondència: Carmen Torres. Área de Bioquímica y Biología Molecular, Centro Científico Tecnológico, Universitat de la Rioja. Madre de Dios, 51. 26006 Logronyo. Adreça electrònica: carmen.torres@daa.unirioja.es. RESUM Els macròlids són agents descrits per primera vegada als anys cinquanta, molt emprats en el tractament de microorganismes grampositius. Actuen al ribosoma, unint-se de manera reversible a la subunitat 50S. Actualment se’n coneixen diferents mecanismes de resistència, que van des de la modificació de la diana fins a la desactivació de l’antibiòtic, passant per bombes d’expulsió o problemes de permeabilitat. Paraules clau: macròlids, resistència, erm. SUMMARY Macrolides are agents described by first time in the 50s. These agents are extensively used in the infections by gram-positive microorganisms. They act in the ribosome, by means of a reversible union with the 50S subunit. Currently we know different resistance mechanisms, and those include target modification, antibiotic inactivation, efflux pumps or impermeability. Keywords: macrolides, resistance, erm.

Els macròlids han estat emprats per al tractament de malalties infeccioses des de la dècada de 1950. El primer macròlid que va ser obtingut fou l’eritromicina, el 1952, provinent d’una soca de Streptomyces erythreus, i es va convertir en el prototipus d’agent antibacterià del grup dels macròlids. La majoria dels macròlids naturals han estat obtinguts per la fermentació de soques de Streptomyces i de Micromonospora sp., malgrat que poden ser produïts per altres gèneres bacterians. Des d’a-

quests macròlids naturals s’han desenvolupat una gran quantitat de macròlids semisintètics, per a millorar llur activitat i estabilitat. ESTRUCTURA QUÍMICA Els macròlids són molècules complexes, que estan formades per un gran anell bàsic lactònic, una macrolactona de dotze a vint-itres àtoms, on s’uneix un sucre aminat mit-

152

C. TORRES, Y. SÁENZ I A. PORTILLO Taula 1.

Classificació dels macròlids en funció del nombre d’àtoms

Catorze àtoms

Quinze àtoms

Setze àtoms

Naturals

Semisintètics

Naturals

Semisintètics

Eritromicina

Claritromicina

Azitromicina

Espiramicina

Rokitamicina

Oleandomicina

Roxitromicina

Josamicina

Miocamicina

Sporeamicina

Diritromicina

Midecamicina

Fluritromicina

Tilosina

jançant enllaços glicosídics. Malgrat que hi ha una gran quantitat de compostos que presenten aquestes característiques, en la pràctica, el nom de macròlids és reservat per a aquells antibiòtics que restin conformats per anells de catorze, quinze o setze àtoms, als quals s’uneixen un o més sucres neutres o bàsics. L’eritromicina pertany al grup de macròlids de catorze àtoms de carboni. És una base feble (pKa = 8,8) d’elevat pes molecular (700 Da) que al medi àcid de l’estómac es degrada i origina diversos productes sense activitat antimicrobiana. Per a millorar la seva estabilitat, s’han sintetitzat sals, èsters, sals d’èsters i d’altres derivats amb modificacions en els grups químics que participen en la degradació. Així, la claritromicina és un derivat semisintètic de l’eritromicina que conté un grup metoxi en comptes de l’hidroxil del C-6 (és la 6-O-metileritromicina), cosa que la converteix en una molècula resistent a la degradació per àcid, a la vegada que millora el seu espectre antibacterià in vitro i in vivo. La roxitromicina és un altre macròlid semisintètic de catorze àtoms, en el qual l’anell principal ha estat modificat per prevenir la desactivació pel medi gàstric, i per minvar la toxicitat gastrointestinal d’altres macròlids. El representant tipus dels macròlids de quinze àtoms és l’azitromicina, que posseeix un àtom addicional (N) a l’anell lactònic, el qual li confereix característiques especials (millor farmacocinètica i activitat que l’eritromicina). Els macròlids de setze àtoms (espiramicina, josamicina i midecamicina) són més estables en medi àcid que l’eritromicina. A la taula 1 es presenten els macròlids classificats pel nombre d’àtoms i llur

naturalesa (natural o semisintètica) i a la figura 1 es mostra l’estructura química d’alguns. ESPECTRE D’ACCIÓ Els macròlids són antibiòtics molt emprats, sobretot en el tractament d’infeccions respiratòries. En general són actius enfront de: a) cocs i bacils grampositius, especialment cocs pertanyents als gèneres Streptococcus i Staphylococcus, i diferents bacils com Clostridium, Propionibacterium, Corynebacterium, Bacillus, Listeria, Rhodococcus, Lactobacillus, entre d’altres; b) alguns microorganismes gramnegatius com Moraxella sp., Bordetella pertusis, Campylobacter jejuni, Neisseria sp. i d’altres (però cal fer esment que la majoria de bacteris gramnegatius són resistents als macròlids); c) microorganismes de creixement intracell. ular o juxtacell. ular com Mycoplasma, Chlamydia, Legionella, Borrelia i Coxiella, i d) alguns protozous són moderadament sensibles (Toxoplasma gondii, Cryptosporidium i Plasmodium) (Mensa et al., 2003). MECANISME D’ACCIÓ Els macròlids penetren a la cèll. ula bacteriana per difusió passiva i llur activitat antibacteriana s’incrementa a pH alcalí, ja que la forma no ionitzada es difon millor per la membrana citoplasmàtica. L’activitat antibacteriana dels macròlids es considera bacteriostàtica enfront de la majoria de microorganismes. Però cal considerar que a concentracions elevades, en medi alcalí o enfront de determinats bacteris

. MACRÒLIDS. MECANISMES D’ACCIÓ I DE RESISTÈNCIA Taula 2.

Tipus de gens erm, codificants de metilases de l’rRNA 23S, relacionats amb la resistència a macròlids a Gens inclosos

Gèneres bacterians b

erm(A)

erm(A), erm(TR)

erm(B)

erm(AM), erm(B), erm(AMR), erm(BC), erm(P), erm(BP), erm(IP), erm(Z), erm(BZ1), erm(BZ2), erm, erm(2)

Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Actinobacillus, Peptostreptococcus Streptococcus, Staphylococcus, Enterococcus, Actinobacillus, Clostridium, Bacillus, Enterobacteriaceae, Neisseria, Pediococcus, Wolinella, Acinetobacter, Pseudomonas

erm(C)

erm(C), erm(IM), erm(M)

Nomenclatura

153

actual del gen

Actinobacillus, Bacillus, Eubacterium, Lactobacillus, Neisseria, Staphylococcus, Streptococcus, Wolinella, Enterococcus

erm(D)

erm(D), erm(J), erm(K)

Bacillus

erm(E)

erm(E), erm(E2)

Streptomyces

erm(F)

erm(F), erm(FS), erm(FU)

Actinobacillus, Actinomyces, Bacteroides, Clostridium, Eubacterium, Fusobacterium, Gardnerella, Haemophilus, Neisseria, Porphyromonas, Prevotella, Peptostreptococcus, Selenomonas, Streptococcus, Treponema, Veillonella, Wolinella

erm(G)

Bacillus, Bacteroides

erm(H)

car(B)

Streptomyces

erm(I)

mdm(A)

Streptomyces

erm(N)

tlr(D)

Streptomyces

erm(O)

lrm, srm(A)

Streptomyces

erm(Q)

Actinobacillus, Clostridium, Streptococcus, Wolinella

erm(R)

Aeromicrobium

erm(S)

erm(SF), tlr(A)

Streptomyces

erm(T)

erm(GT)

Lactobacillus

erm(U)

lmr(B)

Streptomyces

erm(V)

erm(SV)

Streptomyces

erm(W)

myr(B)

Micromonospora

erm(X)

erm(CD), erm(CX)

Corynebacterium

erm(Y)

erm(GM)

Staphylococcus

erm(Z), erm(30), erm(31), erm(32)

Streptomyces

erm(33)

Staphylococcus

erm(34)

Bacillus

erm(35)

Bacteroides

erm(36)

Micrococcus

erm(37), erm(38), erm(39)

Mycobacterium

a Classificació d’acord amb la nomenclatura de Roberts et al. (1999) i l’actualització publicada a http://faculty.washington.edu/marylinr. En negreta hi ha els gens detectats en cocs grampositius dels gèneres Streptococcus, Staphylococcus o Enterococcus. b Referències: Bozdogan et al., 2004; Jensen et al., 1999; Matsuoka et al., 2002; Pechere, 2001; Portillo et al., 2000; Rasmussen et al., 1986; Reig et al., 2001; Roberts et al., 1999; Roberts, 2002; Schmitz et al., 2000; Seppäla et al., 1998; Syrogiannopoulos et al., 2001, entre d’altres.

com Streptococcus pyogenes i Streptococcus pneumoniae, especialment quan es troben en fase de creixement logarítmic, poden comportarse com bactericides (Mensa et al., 2003).

Els macròlids s’uneixen de manera reversible a la subunitat 50S ribosòmica i inhibeixen la síntesi de proteïnes, pel bloqueig de la funció del centre de la peptidiltransferasa

154

C. TORRES, Y. SÁENZ I A. PORTILLO

Figura 1. Estructura de macròlids representatius dels grups de catorze, quinze i setze àtoms: a) eritromicina, b) azitromicina i c) espiramicina, respectivament.

i, en definitiva, la formació de l’enllaç peptídic (Retsema i Fu, 2001). Els macròlids produeixen l’alliberament prematur de cadenes peptídiques incompletes, i provoquen així la mort cell. ular. Els llocs d’unió dels macròlids i d’altres antibiòtics relacionats, com les lincosamides o les estreptogramines del tipus B, es localitzen junts en dominis del centre de la peptidiltransferasa, i alguns se superposen. En estudis recents s’ha vist que, a més d’impedir l’elongació peptídica, els macròlids també afecten l’acoblament de subunitats ribosòmiques naixents 50S (Champney, 1999). Avui dia, se sap que els macròlids s’uneixen reversiblement al domini v de l’rRNA 23S. L’esmentada unió es realitza per mitjà de ponts d’hidrogen entre diferents radicals hidroxil del macròlid (especialment entre l’OH a la posició 2 del sucre desosamina) i determinades bases de l’rRNA 23S (especialment A2058 i A2059, tot seguint la numeració d’Escherichia coli). És possible que també es produeixi una interacció feble entre la cladinosa i el domini ii de l’rRNA 23S. En E. coli determinades mutacions al domini ii són implicades en la resistència a eritromicina (Douthwaite et al., 1985; Douthwaite i Champney, 2001; Weisblum, 2000). MECANISME DE RESISTÈNCIA La resistència intrínseca a macròlids de

bacils gramnegatius, en particular enterobacteris, Pseudomonas sp. i Acinetobacter sp., probablement és deguda a la relativa impermeabilitat de la membrana externa a aquests compostos hidrofòbics (Mao i Putterman, 1968). S’han descrit quatre mecanismes de resistència adquirida a antibiòtics macròlids: a) modificació de la diana per l’acció de metilases, b) eﬄux actiu de l’antibiòtic, c) modificació de la diana per mutació de l’rRNA 23S o proteïnes ribosòmiques i d) desactivació enzimàtica.

Modiﬁcació de la diana per acció de metilases Aquest és el mecanisme més freqüent i el millor conegut. És degut a l’acció d’enzims metilases, que monometilen o dimetilen un residu d’adenina (A2058) del domini v de l’rRNA 23S a la posició N 6 (Lai i Weisblum, 1971). La metilació provoca un canvi de conformació al ribosoma, que redueix la unió a la subunitat 50S de macròlids i d’altres antibiòtics relacionats, com les lincosamides i les estreptogramines del grup B, probablement perquè els llocs d’unió d’aquests antibiòtics als ribosomes són superposats (Fernández-Muñoz et al., 1971). Aquest mecanisme no afecta les estreptogramines del tipus A, i es manté la sinergia entre estreptogramines

. MACRÒLIDS. MECANISMES D’ACCIÓ I DE RESISTÈNCIA Taula 3. Nomenclatura

155

Gens relacionats amb sistemes d’efflux que confereixen resistència a macròlids a

Gens inclosos

Fenotipus b

Transportador

Microorganismes c

actual del gen msr(A)

msr(A), msr(B)

M, MS

Primari (ABC)

Staphylococcus, Streptococcus

msr(C)

Primari (ABC)

Intrínsec en E. faecium

Primari (ABC)

Streptococcus

Primari (ABC)

Streptomyces

msr(D)

ole(B)

ole(C)

Primari (ABC)

Streptomyces

srm(B)

Primari (ABC)

Streptomyces

tlr(C)

Primari (ABC)

Streptomyces

mef (A)

mef (A), mef (E)

Secundari (facilitador major)

Streptococcus, Enterococcus, Staphylococcus, Micrococcus, Corynebacterium, gramnegatius (Enterobacteriaceae, Acinetobacter, Pseudomonas, Stenotrophomonas, Neisseria).

a Nomenclatura de Roberts et al. (1999). b M: resistència a macròlids; MS: resistència a macròlids i estreptogramines; ms: sensibilitat disminuïda a macròlids i estreptogramines. c Referències: Daly et al., 2004; Ojo et al., 2004; Pechere, 2001; Portillo et al., 2000; Roberts, 1999; Roberts et al., 2002; Singh et al., 2001, entre d’altres.

del tipus A i B enfront d’aquestes soques. L’expressió d’aquestes metilases es caracteritza per conferir resistència creuada a macròlids de catorze, quinze i setze àtoms, i a lincosamides i estreptogramines del grup B, i tot plegat dóna lloc a l’anomenat fenotipus de resistència MLS B. En general, els gens que codifiquen aquestes metilases s’han denominat gens erm (erythromycin resistance methylase), encara que hi ha excepcions, especialment en organismes productors d’antibiòtics (Weisblum, 1998). S’han aïllat gens erm en un gran nombre de bacteris aerobis gramnegatius (des d’E. coli fins a Haemophilus inﬂuenzae) i grampositius (des de S. pneumoniae fins a Corynebacterium sp.), fins i tot en diferents bacteris anaerobis, tant grampositius com gramnegatius (Roberts et al., 1999). Les seqüències aminoacídiques de les metilases codificades per aquests gens estan relacionades entre si, la qual cosa indica que deriven d’un avantpassat comú, probablement d’un microorganisme productor d’antibiòtics (Arthur et al., 1987). Per mitjà de la comparació de seqüències i de la hibridació en condicions estrictes, s’han diferenciat nombrosos determinants erm de resistència. Da-

vant el creixent nombre de gens erm existent a la bibliografia, i atès que llur denominació no havia estat consistent en molts casos, Roberts et al. (1999) varen proposar una nova nomenclatura per a nomenar els gens de resistència a macròlids. Segons aquesta nova classificació, dos gens que codifiquen proteïnes amb una identitat d’aminoàcids superior o igual al 80 % són designats amb la mateixa lletra i són inclosos en la mateixa classe, mentre que dos gens que codifiquen proteïnes amb una identitat inferior són designats amb lletres diferents. A la taula 2 es troben les classes de gens erm, i també llur nomenclatura (antiga i nova) i els gèneres bacterians on són presents (Bozdogan et al., 2004; Jensen et al., 1999; Matsuoka et al., 2002; Ojo et al., 2004; Portillo et al., 2000; Reig et al., 2001; Schmitz et al., 2000; Syrogiannopoulos et al., 2001; Roberts et al., 1999; Roberts, 2002; Weisblum, 2000). En lletra negreta es destaquen els gens erm que han estat trobats en cocs grampositius d’interès clínic (gèneres Streptococcus, Staphylococcus o Enterococcus). Cal assenyalar que existeix una pàgina web, coordinada per la Dra. Roberts de la Universitat de Washington (EUA), on s’actualitzen tots els determinants de resistència a macròlids,

156

C. TORRES, Y. SÁENZ I A. PORTILLO

Taula 4.

Mutacions a l’rRNA 23S més rellevants, relacionades amb la resistència a macròlids

Mutacions en posicions de l’rRNA 23S a

Microorganismes b

U754A

Escherichia coli

A2057G+G2032A

Helicobacter pylori

G2057A

Escherichia coli, Propionibacteria

A2058 G/C/U

C2452U

Enterobacteriaceae, Propionibacteria, Helicobacter pylori, Mycobacterium, Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Micoplasma pneumoniae Mycobacterium, Propionibacteria, Micoplasma pneumoniae, Helicobacter pylori, Streptococcus pneumoniae Sulfolobus acidocaldarius

C2611A/G/U

Streptococcus pneumoniae, Enterobacteriaceae, Streptococcus pyogenes

A2059G/C

a Numeració de les posicions segons E. coli. b Referències: Poehlsgaard i Douthwaite, 2002; Vester i Douthwaite, 2001.

inclosos els gens erm, seguint la nova nomenclatura (http://faculty.washington.edu/marylinr). En S. pneumoniae i en Enterococcus la resistència amb fenotipus MLS B és generalment mitjançada pel gen erm(B), i en S. pyogenes per erm(A) (subtipus erm(TR)) o erm(B) (Morosini et al., 2003; Portillo et al., 1999a, 1999b, 2000, 2001). En soques de Streptococcus β-hemolítics dels grups B, C i G amb fenotipus MLS B, sovint es detecten els gens erm(A) o erm(B) (Portillo et al., 2001). En el cas de Staphylococcus, predominen els determinants erm(A) i erm(C). El gen erm(A) és fonamentalment disseminant en soques resistents a la meticill. ina, i es troba sovint en transposons relacionats amb Tn554, mentre que el gen erm(C) és generalment el responsable de la resistència a macròlids en soques sensibles a meticill. ina, i es troba localitzat en plasmidis (Leclercq, 2002). L’expressió dels gens erm pot ser de caràcter constitutiu o induïble, i ambdós tipus d’expressió poden ser diferenciades per mitjà del test de doble difusió de disc (Seppälä et al., 1993). A la figura 2 es presenten antibiogrames representatius de soques de Streptococcus amb els fenotipus MLS B constitutiu (cMLS B) i induïble (iMLS B). Quan l’expressió és constitutiva, les soques són resistents a tots els macròlids, i presenten també resistència a lincosamides i estreptogramines del tipus B. La inducció de l’expressió dels gens erm s’ha relacionat amb la presència de cladino-

sina als macròlids de catorze i quinze àtoms, mentre que els macròlids de setze àtoms o la clindamicina no indueixen l’activitat de la metilasa, perquè no tenen aquest sucre (Weisblum, 1995). Així, si l’expressió és induïble, les soques són resistents a macròlids de catorze i quinze àtoms, i queden actius els de setze àtoms, les lincosamides i estreptogramines (tret que existeixi una inducció prèvia per antibiòtics inductors). Aquest comportament és més evident en el cas de Staphylococcus o de S. pyogenes, mentre que d’altres espècies de Streptococcus o Enterococcus podrien presentar una major diversitat de fenotipus (Leclercq, 2002). El caràcter induïble o constitutiu de l’expressió dels gens erm està relacionat amb la seqüència del domini regulador situat davant de la regió estructural que codifica la metilasa. El mecanisme d’inducció ha estat molt estudiat en Staphylococcus, específicament pel que fa al determinant ermC, fins i tot al plasmidi pE194, que és explicat per mitjà d’un mecanisme d’atenuació de la traducció (Weisblum, 1985). Un altre mecanisme proposat és el de l’atenuació de la transcripció, que explica la regulació del determinant erm(K). En aquest cas, l’absència d’eritromicina impedeix la síntesi completa de l’mRNA (Choi et al., 1997).

. MACRÒLIDS. MECANISMES D’ACCIÓ I DE RESISTÈNCIA

Taula 5.

157

Gens relacionats amb la desactivació de macròlids

Gens inclosos

Fenotipus a

Enzim

Microorganismes b

mph(A)

mph(A), mph(K)

2 -Fosfotransferasa de macròlids (de 14 i 16)

Enterobacteriaceae, Pseudomonas, Pantoeae, Stenotrophomonas

mph(B)

2 -Fosfotransferasa de macròlids (de 14 i 16)

Enterobacteriaceae, Pantoeae, Pseudomonas

mph(C)

mph(C), mph(BM)

Fosfotransferasa de macròlids (de 14)

Staphylococcus

mph(D)

Fosforilasa

Enterobacteriaceae, Pantoeae, Pseudomonas, Stenotrophomonas

ere(A)

Esterasa d’eritromicina de tipus i

Enterobacteriaceae, Vibrio cholerae, Pseudomonas

ere(B)

Esterasa d’eritromicina de tipus ii

Enterobacteriaceae, Pseudomonas

Nomenclatura actual del gen

a M: resistència a macròlids; d i m com a subíndex representen degradació i modificació, respectivament. b Referències: Kim et al., 2002; Ojo et al., 2004; Roberts et al., 1999; Roberts, 2002.

Efflux de l’antibiòtic En cocs grampositius s’han descrit dos sistemes d’efflux de macròlids, que confereixen els fenotipus de resistència MS (macròlids de catorze i quinze àtoms i estreptogramines de tipus B) i M —macròlids de catorze i quinze àtoms (Pechere, 2001). Ross et al. (1989) estudiaren un grup de soques de Staphylococcus epidermidis amb fenotipus MS i el gen responsable de la resistència fou anomenat mrsA (macrolide streptogramin resistance). Aquest gen presenta dos dominis d’unió a ATP homòlegs als d’una família de proteïnes transportadores de gramnegatius i de cèll. ules eucariotes (Ross et al., 1990). El sistema és multicomponent, i abasta els gens msr(A), smp o stp per a constituir una bomba d’efflux totalment operativa. No és gens clar el paper desenvolupat per cada proteïna en aquest sistema d’efflux, però sembla evident que Msr(A) deu ser present per a expressar el fenotipus MS (Ross et al., 1995). Tanmateix, ha estat descrit un gen que sembla ser específic d’Enterococcus faecium, amb un 53 % d’identitat amb msr(A) de Staphylococcus, que ha rebut

el nom de msr(C) (Portillo et al., 2000; Singh et al., 2001). El bloqueig d’aquest gen ha estat associat amb una minva de 2-8 vegades la CIM de macròlids de catorze, quinze i setze àtoms, i d’estreptogramines del grup B, la qual cosa podria explicar la major resistència intrínseca a macròlids que presenta l’espècie E. faecium respecte als estreptococs (Singh et al., 2001). De manera recent ha estat descrit un gen relacionat amb un sistema d’efflux en S. pneumoniae, homòleg al de Staphylococcus, i que s’ha anomenat msr(D) (Daly et al., 2004). El fenotipus de resistència anomenat M es caracteritza per la seva resistència a macròlids de catorze i quinze àtoms, i és sensible a macròlids de setze àtoms, lincosamides i estreptogramines, fins i tot després de la inducció amb eritromicina. Aquest fenotipus es detecta mitjançant el test de difusió de doble disc (eritromicina i clindamicina) (vegeu la figura 2). La seva expressió és deguda a la presència d’una bomba d’efflux dependent d’energia (Sutcliffe et al., 1996). Els gens mef (A) (macrolide efflux) i mef (E) codifiquen proteïnes implicades amb l’efflux de macròlids en S. pyogenes i S. pneumoniae, respectivament. L’anàlisi

158

C. TORRES, Y. SÁENZ I A. PORTILLO

Taula 6. Fenotipus i mecanismes de resistència a macròlids i altres antibiòtics relacionats, com la clindamicina i estreptogramines en cocs grampositius Antibiòtic a 14-M

15-M

Fenotipus 16-M

Producte

Mecanisme

Freqüència

Sa S. pneumoniae

MLS B b

erm(B) c

Modificació diana

mef (E) d

Bomba expulsió

rplD (L4)

Modificació diana

+/–

M 16S

rrl (rRNA 23S)

Modificació diana

+/–

rrl (rRNA 23S)

Modificació diana

+/–

mef (A)

Bomba expulsió

+++

MLS B

erm(B)

Modificació diana

Mutació rRNA 23S

Modificació diana

–/+

MLS B

erm(B)

Modificació diana

mef (A), mef (E)

Bomba expulsió

MLS B

erm(C), erm(A)

Modificació diana

+++

I/R

M, MS

msr(A), msr(B), erp(A)

Bomba expulsió

+++

S. pyogenes

Streptococcus β-hemolítics dels grups B, C i G

Staphylococcus

Enterococcus R

MLS B

erm(B) f

Modificació diana

+++

mef (A)

Bomba expulsió

+/–

a 14, 15, 16-M: macròlids de catorze, quinze o setze àtoms; L: lincosamides; Sa: estreptogramines del grup A; Sb: estreptogramines del grup B; S: sensible; R: resistent; r: resistència de baix nivell. b L’expressió d’aquest fenotipus pot ser de caràcter constitutiu o induïble. c El gen erm(TR) també s’ha detectat ocasionalment en soques de S. pneumoniae. d El gen mef (A) també s’ha detectat ocasionalment en S. pneumoniae. e El gen erm(Y) també s’ha detectat en soques de Staphylococcus aureus (Matsuoka et al., 2003). f El gen erm(A) també s’ha detectat en aquest gènere (Portillo et al., 2000). Referències: Jalava et al., 2004; Pechere, 2001; Torres, 2002.

de la seqüència d’aminoàcids mostrà la presència de dotze dominis transmembranosos, i els assaigs d’eﬄux en presència d’arsenat suggeriren que Mef(A) i Mef(E) depenien d’una força motriu de protons (Clancy et al., 1996; Tait-Kamradt et al., 1997). Segons la nomenclatura actual, ambdós es designen com a mef (A) (Roberts et al., 1999) per posseir un 90 % d’identitat. El fenotipus M, associat a gens mef, és molt freqüent en S. pyogenes al nostre país (Portillo et al., 1999a; Morosini et al., 2003; Alós et al., 2000), i és menys freqüent en S. pneumo-

niae (Morosini et al., 2001; Seral et al., 2001). Els gens mef s’han descrit en d’altres grampositius, com Enterococcus sp., Micrococcus luteus, Streptococcus del grup viridans i Streptococcus agalactiae (Arpin et al., 1999a, 1999b; Luna et al., 1999), i en gramnegatius (Acinetobacter junii i Neisseria gonorrhoeae) (Cousin et al., 2003; Luna et al., 2000, Ojo et al., 2004, Pechere, 2001). En soques de S. pneumoniae ha estat trobat que el gen mef (E) forma part d’un element d’inserció genètica, mega (macrolide eﬄux genetic assembly), associat a l’augment de la re-

. MACRÒLIDS. MECANISMES D’ACCIÓ I DE RESISTÈNCIA

159

Figura 2. Fenotipus de resistència representatius de soques de Streptococcus sp.: a) fenotipus MLS B constitutiu, b) fenotipus MLS B induïble i c) fenotipus M.

sistència a macròlids (Gay i Stephens, 2001; Tait-Kamradt et al., 1997). Mega conté un operó al qual dos gens (mef i un altre anomenat mel) es cotranscriuen, i són part d’un sistema d’efflux dual: mef (E) codifica un transportador dependent de protons, tal com va ser descrit per Tait-Kamradt et al. (1997), i mel ho fa amb un transportador ABC, homòleg a l’msr(A) d’estafilococs (Gay i Stephens, 2001). Segons aquests autors, sembla que mega és relacionat amb un transposó conjugatiu, hipòtesi recolzada per diversos estudis (Santagati et al., 2000). El gen mre(A) (macrolide resistance efflux) fou inicialment considerat un gen d’efflux de macròlids en S. agalactiae (Clancy et al., 1997). Més tard s’ha observat que aquest gen codifica una flavocinasa, que podria posseir una funció metabòlica, i s’ha detectat el possible caràcter intrínsec del mateix en S. agalactiae (Clarebout et al., 2001). Queda per demostrar la implicació d’aquest gen en la resistència a macròlids en S. agalactiae, malgrat que s’ha provat que la transferència del gen en E. coli li confereix resistència a macròlids per un mecanisme encara desconegut (Clarebout et al., 2001). A la taula 3 hi ha els gens relacionats amb bombes d’efflux de macròlids i els microorganismes on han estat trobades.

Modiﬁcació de la diana per mutació de l’rRNA 23S o proteïnes ribosòmiques Després del descobriment dels gens erm, s’han identificat altres mecanismes de resistència, que porten associats una modificació de l’estructura de l’rRNA 23S. Així, s’han descrit mutacions als dominis ii i v de l’rRNA 23S com a responsables de la resistència a macròlids en una gran varietat d’espècies bacterianes (Canu et al., 2002; Depardieu i Courvalin, 2001; Poehlsgaard i Douthwaite, 2002; Tait-Kamradt et al., 2000a, 2000b; Vester i Douthwaite, 2001). A la taula 4 es presenten les mutacions a l’rRNA 23S més rellevants de la resistència als macròlids descrites tant en soques clíniques com en mutants de laboratori. Les mutacions a les posicions 2058 o 2059 del domini v de l’rRNA 23S confereixen els valors més grans de resistència per a determinats macròlids, i el canvi A2058G és el més freqüentment trobat en soques clíniques (Helicobacter pylori, Mycobacterium sp., S. pneumoniae i Campylobacter sp.). Els fenotipus de resistència que confereixen varien entre microorganismes, i les mutacions que produeixen un fenotipus MLS B són, per exemple, A2058U en soques d’E. coli, A2058C/G/U en H. pylori o A2058G en Propionibacterium sp. i Streptomyces ambofaciens (Vester i Douthwaite, 2001). Els

160

C. TORRES, Y. SÁENZ I A. PORTILLO

microorganismes patògens que presenten resistència a macròlids per modificació de la diana per mutacions a les posicions A2058 o A2059 solen posseir d’un a tres operons de rRNA (rrn), com en el cas d’H. pylori, Campylobacter sp. i Mycobacterium sp. En microorganismes amb múltiples operons rrn, com Enterococcus, Streptococcus i Staphylococcus sp., són més freqüents altres mecanismes, com bombes d’eﬄux o metilacions per gens erm. A més, les posicions 2057, 2452 i 2611, malgrat que són properes a l’estructura secundària de l’RNA 23S, es troben lleugerament allunyades del lloc d’interacció dels macròlids, raó per la qual confereixen menors nivells de resistència (Vester i Douthwaite, 2001). Actualment s’estan descrivint mutacions a l’rRNA 23S en d’altres espècies bacterianes com S. pyogenes (Jalava et al., 2004), i en d’altres posicions de l’rRNA 23S, com seria el cas de les posicions 2144 i 2182 en H. pylori, que confereixen una elevada resistència a macròlids (Khan et al., 2004). Per una altra banda, s’han identificat mutacions, insercions o delecions als gens codificadors de les proteïnes ribosòmiques L4 o L22 de soques de S. pneumoniae, S. pyogenes, i Staphylococcus aureus resistents a macròlids, malgrat que és un mecanisme de resistència poc freqüent en aquestes espècies bacterianes (Malbruny et al., 2002; Pérez-Trallero et al., 2003; Prunier et al., 2002; Tait-Kamradt et al., 2000b). Aquestes mutacions modifiquen l’estructura de l’rRNA 23S i permeten que una molècula d’eritromicina contacti alhora amb els dominis ii i v (Gregory i Dahlberg, 1999).

Desactivació enzimàtica Un altre mecanisme de resistència, poc freqüent en soques clíniques, és el constituït per gens que desactiven antibiòtics macròlids mitjançant la modificació de la seva estructura. Wondrack et al. (1996) varen descriure una soca de S. aureus, productora d’esterases, que podia desactivar macròlids de catorze i set-

ze àtoms (a diferència de les esterases trobades en E. coli, que desactiven macròlids de catorze i quinze àtoms), i que a més posseïa un determinant d’eﬄux msr(A). Posteriors estudis varen identificar en aquesta soca el gen mph(C) (macrolide phosphotransferase), codificador d’una fosforilasa que pot desactivar macròlids de catorze àtoms i que és al mateix operó que msr(A) (Cheng et al., 1999). Per una altra banda, Matsuoka et al. (1998) descrigueren, en una soca de S. aureus, la presència d’un plasmidi que duia tres gens de resistència a macròlids: mph(BM), actualment designat com a mph(C) (Roberts et al., 1999), que codifica una fosfotransferasa; msr(SA), actualment anomenat msr(A) (Roberts et al., 1999), que codifica una proteïna d’eﬄux de macròlids de tipus ABC i un gen erm, que encara roman sense caracteritzar. Anys ençà, els mateixos autors identificaren aquest darrer gen, i el varen situar darrere de mph(C), el suara esmentat plasmidi, com erm(Y) (Matsuoka et al., 2002). Posteriors estudis suggeriren que el gen msr(A) és necessari per a l’expressió del gen mph(C) (Matsuoka et al., 2003). Molt recentment s’han descrit enzims desactivadors de macròlids en dotze nous gèneres de bacteris gramnegatius aïllats de nens sans amb poca exposició a antibiòtics (Ojo et al., 2004), però de moment no s’han descrit en enterococs ni estreptococs. Tots els gens relacionats amb aquest mecanisme són descrits en detall a la taula 5. La taula 6 presenta els fenotipus i els mecanismes de resistència a antibiòtics macròlids, i a lincosamides i estreptogramines, i també la freqüència de detecció dels mateixos en diferents espècies de Streptococcus, Staphylococcus i Enterococcus. BIBLIOGRAFIA Alós, J. I.; Aracil, B.; Oteo, J.; Torres, C.; GómezGarcés, J. L. (2000). «High prevalence of erythromycinresistant, clindamycin/miocamycin-susceptible (M phe-

. MACRÒLIDS. MECANISMES D’ACCIÓ I DE RESISTÈNCIA

notype) Streptococcus pyogenes: results of a Spanish multicentre study in 1998. Spanish Group for the Study of Infection in the Primary Health Care Setting». J. Antimicrob. Chemother., vol. 45, pàg. 605-609. Arpin, C.; Canron, M. H.; Maugein, J.; Quentin, C. (1999a). «Incidence of mefA and mefE genes in viridans group streptococci». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 43, pàg. 2335-2336. Arpin, C.; Daube, H.; Tessier, F.; Quentin, C. (1999b). «Presence of mefA and mefE genes in Streptococcus agalactiae». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 43, pàg. 944946. Arthur, M.; Brisson-Noël, A.; Courvalin, P. (1987). «Origin and evolution of genes specifying resistance to macrolides, lincosamide and streptogramin antibiotics: data and hypotheses». J. Antimicrob. Chemother., vol. 20, pàg. 783-802. Bozdogan, B.; Galopin, S.; Leclercq, R. (2004). «Characterization of a new erm-related macrolide resistance gene present in probiotic strains of Bacillus clauii». Appl. Environ. Microbiol., vol. 70, pàg. 280-284. Canu, A.; Malbruny, B.; Coquemont, M.; Davies, T. A.; Appelbaum, P. C.; Leclerc, R. (2002). «Diversity of ribosomal mutations conferring resistance to macrolides, clindamycin, streptogramin, and telithromycin in Streptococcus pneumoniae». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 46, pàg. 125-131. Champney, W. S. (1999). «Macrolide antibiotic inhibition of 50S ribosomal subunit formation in bacterial cells». Recent Res. Devel. in Antimicrob. Agents Chemother., vol. 3, pàg. 39-58. Cheng, J.; Grebe, T.; Wondrack, L.; Courvalin, P.; Sutcliffe, J. (1999). «Characterization of genes involved in erythromycin resistance in a clinical strain of Staphylococcus aureus». 39 th Intersci. Conf. Antimicrob. Agents Chemother., resum núm. 837. Choi, S. S.; Kimn, S. K.; Oh, T. G.; Choi, E. C. (1997). «Role of mRNA termination in regulation of ermK». J. Bacteriol., vol. 179, pàg. 2065-2067. Clancy, J.; Dib-Hajj, F.; Petitpas, J.; Yuan, W. (1997). «Cloning and characterization of a novel macrolide efflux gene, mreA, from Streptococcus agalactiae». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 41, pàg. 2719-2723. Clancy, J.; Petitpas, J.; Dib-Hajj, F.; Yuan, W.; Cronan, M.; Kamath, A. V.; Bergeron, J.; Retsema , J. A. (1996). «Molecular cloning and functional analysis of a novel macrolide-resistant determinant, mefA, from Streptococcus pyogenes». Mol. Microbiol., vol. 22, pàg. 867-879. Clarebout, G.; Villers, C.; Leclercq, R. (2001). «Macrolide resistance gene mreA of Streptococcus agalactiae encodes a flavokinase». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 45, pàg. 2280-2286. Cousin Jr, S.; Whittington, W. L.; Roberts, M. C. (2003). «Acquired macrolide resistance genes in pathogenic Neisseria spp. isolated between 1940 and 1987». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 47, pàg. 38773880.

161

Daly, M.; Doktor, S.; Flamm, R.; Shortridge, D. (2004). «Characterization and prevalence of MefA, MefE, and the associated msr(D) gene in Streptococcus pneumoniae clinical isolates». J. Clin. Microbiol., vol. 42, pàg. 35703574. Depardieu, F.; Courvalin, P. (2001). «Mutation in 23S rRNA responsible for resistance to 16-membered macrolides and streptogramins in Streptococcus pneumoniae». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 45, pàg. 319-323. Douthwaite, S.; Champney, W. S. (2001). «Structures of ketolides and macrolides determine their mode of interaction with the ribosomal target site». J. Antimicrob. Chemother., vol. 48, pàg. 1-8. Douthwaite, S.; Prince, J. B.; Noller, H. F. (1985). «Evidence for functional interaction between domains ii and v of 23S ribosomal RNA from an erythromycin resistant mutant». Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 82, pàg. 83308334. Fernández-Muñoz, R.; Monro, R. E.; Torres-Pinedo, R.; Vasquez, D. (1971). «Substrate- and antibioticbinding sites at the peptidyl-transferase centre of Escherichia coli ribosomes. Studies on the cloramphenicol, lincomycin and erythromycin sites». Eur. J. Biochem., vol. 23, pàg. 185-193. Gay, K.; Stephens, D. S. (2001). «Structure and dissemination of a chromosomal insertion element encoding macrolide efflux in Streptococcus pneumoniae». J. Infect. Dis., vol. 184, pàg. 56-65. Gregory, S. T.; Dahlberg, A. E. (1999). «Erythromycin resistance mutations in ribosomal proteins L22 and L4 perturb the higher order structure of 23S ribosomal RNA». J. Mol. Biol., vol. 289, pàg. 827-834. Jalava, J.; Vaara, M.; Houvinen, P. (2004). «Mutation at the position 2058 of the 23S rRNA as a cause of macrolide resistance in Streptococcus pyogenes». Ann. Clin. Microbiol. Antimicrob., vol. 3, pàg. 5. Jensen, L. B.; Frimodt-Moller, N.; Aarestrup, F. M. (1999). «Presence of erm gene classes in Gram-positive bacteria of animal and human origin in Denmark». FEMS Microbiol. Lett., vol. 170, pàg. 151-158. Khan, R.; Nahar, S.; Sultana, J.; Ahmad, M. M.; Rahman, M. (2004). «T2182C mutation in 23S rRNA is associated with clarithromycin resistance in Helicobacter pylori isolates obtained in Bangladesh». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 48, pàg. 3567-3569. Kim, Y. H.; Cha, C. J.; Cerniglia, C. E. (2002). «Purification and characterization of an erythromycin esterase from an erythromycin-resistant Pseudomonas sp.» FEMS Microbiol. Lett., vol. 210, pàg. 239-244. Lai, C. J.; Weisblum, B. (1971). «Altered methylation of ribosomal RNA in an erythromycin-resistant strain of Staphylococcus aureus». Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 68, pàg. 856-860. Leclercq, R. (2002). «Staphylococci resistant to antibiotic therapy». Ann. Fr. Anesth. Reanim., vol. 21, pàg. 375-383. Luna, V. A.; Coates, P.; Eady, E. A.; Cove, J. H.; Nguyen, T. H. T.; Roberts, M. C. (1999). «A variety of Gram-pos-

162

C. TORRES, Y. SÁENZ I A. PORTILLO

itive bacteria carry the mobile mef genes». J. Antimicrob. Chemother., vol. 44, pàg. 19-25. Luna, V. A.; Cousin, S.; Whittington, W. L. H.; Roberts, M. C. (2000). «Identification of the conjugative mef gene in clinical Acinetobacter junii and Neisseria gonorrhoeae isolates». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 44, pàg. 2503-2506. Malbruny, B.; Nagai, K.; Coquemont, M.; Bozdogan, B.; Andrasevic, A. T.; Hupkova, H.; Leclercq, R.; Appelbaum, P. C. (2002). «Resistance to macrolides in clinical isolates of Streptococcus pyogenes due to ribosomal mutations». J. Antimicrob. Chemother., vol. 49, pàg. 935939. Mao, J. C. H.; Putterman, M. (1968). «Accumulation in Gram-positive and Gram-negative bacteria as a mechanism of resistance to erythromycin». J. Bacteriol., vol. 96, pàg. 111-117. Matsuoka, M.; Endou, K.; Kobayashi, H.; Inoue, M.; Nakajima, Y. (1998). «A plasmid that encodes three genes for resistance to macrolide antibiotics in Staphylococcus aureus». FEMS Microbiol. Lett., vol. 167, pàg. 221227. Matsuoka, M.; Inoue, M.; Endo, Y.; Nakajima, Y. (2003). «Characteristic expression of three genes, msr(A), mph(C) and erm(Y), that confer resistance to macrolide antibiotics on Staphylococcus aureus». FEMS Microbiol. Lett., vol. 220, pàg. 287-293. Matsuoka, M.; Inoue, M.; Nakajima, Y.; Endo, Y. (2002). «New erm gene in Staphylococcus aureus clinical isolates». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 46, pàg. 211-215. Mensa, J.; García-Vazquez, E.; Vila, J. (2003). «Macrólidos, ketólidos y estreptograminas». Enferm. Infecc. Microbiol. Clin., vol. 21, pàg. 200-207. Morosini, M. I.; Cantón, R.; Loza, E.; Campo, R. del; Almaraz, F.; Baquero, F. (2003). «Streptococcus pyogenes isolates with characterized macrolide resistance mechanisms in Spain: in vitro activities of telithromycin and cethromycin». J. Antimicrob. Chemother., vol. 52, pàg. 50-55. Morosini, M. I.; Cantón, R.; Loza, E.; Negri, M. C.; Galán, J. C.; Almaraz, F.; Baquero, F. (2001). «In vitro activity of telithromycin against Spanish Streptococcus pneumoniae isolates with characterized macrolide resistance mechanisms». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 45, pàg. 2427-2431. Ojo, K. K.; Ulep, C.; Kirk, N. van; Luis, H.; Bernardo, M.; Leitao, J.; Roberts, M. C. (2004). «The mef (A) gene predominates among seven macrolide resistance genes identified in Gram-negative strains representing 13 genera, isolated from healthy Portuguese children». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 48, pàg. 34513456. Pechere, J. C. (2001). «Macrolide resistance mechanisms in Gram-positive cocci». Int. J. Antimicrob. Agents, vol. 18, pàg. S25-S28. Pérez-Trallero, E.; Marimón, J. M.; Iglesias, L.; Larruskain, J. (2003). «Fluoroquinolone and macrolide

treatment failure in pneumococcal pneumonia and selection of multi-drug resistant isolates». Emerg. Infect. Dis., vol. 9, pàg. 1159-1162. Poehlsgaard, J.; Douthwaite, S. (2002). «The macrolide binding site on the bacterial ribosome». Curr. Drug Targets Infect. Disord., vol. 2, pàg. 67-78. Portillo, A.; Lantero, M.; Gastañares, M. J.; RuizLarrea, F.; Torres, C. (1999a). «Macrolide resistance phenotypes and mechanisms of resistance in Streptococcus pyogenes in La Rioja, Spain». Int. J. Antimicrob. Agents, vol. 13, pàg. 137-140. Portillo, A.; Lantero, M.; Gastañares, M. J.; RuizLarrea, F.; Zarazaga, M.; Olarte, I.; Torres, C. (1999b). «MLS phenotypes and mechanisms of resistance in Streptococcus pneumoniae». A: Zinner, S. H.; Young, L. S.; Acar, J. F.; Neu, H. C. [ed.] New considerations for macrolides, azalides, streptogramins, and ketolides. Nova York: Marcel Dekker, pàg. 237-242. Portillo, A.; Lantero, M.; Olarte, I.; Ruiz-Larrea, F.; Torres, C. (2001). «MLS resistance phenotypes and mechanisms in β-haemolytic group B, C and G Streptococcus isolates in La Rioja, Spain». J. Antimicrob. Chemother., vol. 47, pàg. 113-114. Portillo, A.; Ruiz-Larrea, F.; Zarazaga, M.; Alonso, A.; Martínez, J. L.; Torres, C. (2000). «Macrolide resistance genes in Enterococcus spp.» Antimicrob. Agents Chemother., vol. 44, pàg. 967-971. Prunier, A. L.; Malbruny, B.; Tande, D.; Picard, B.; Leclercq, R. (2002). «Clinical isolates of Staphylococccus aureus with ribosomal mutations conferring resistance to macrolides». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 46, pàg. 3054-3056. Rasmussen, J. L.; Odelson, D. A.; Macrina, F. L. (1986). «Complete nucleotide sequence and transcription of ermF, a macrolide-lincosamide-streptogramin B resistance determinant from Bacteroides fragilis». J. Bacteriol., vol. 168, pàg. 523-533. Reig, M.; Galán, J. C.; Baquero, F.; Pérez-Díaz, J. C. (2001). «Macrolide resistance in Peptostreptococcus spp. mediated by ermTR: possible source of macrolidelincosamide-streptogramin B resistance in Streptococcus pyogenes». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 45, pàg. 630-632. Retsema, J.; Fu, W. (2001). «Macrolides: structures and microbial targets». Int. J. Antimicrob. Agents, vol. 18 (supl. 1), pàg. S3-S10. Roberts, M. C. (2002). «Resistance to tetracycline, macrolide-lincosamide-streptogramin, trimethoprim, and sulfonamide drug classes». Mol. Biothecnol., vol. 20, pàg. 261283. Roberts, M. C.; Sutcliffe, J.; Courvalin, P.; Jensen, L. B.; Rood, J.; Seppälä, H. (1999). «Nomenclature for macrolide and macrolide-lincosamide-streptogramin B resistance determinants». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 43, pàg. 2823-2830. Ross, J. I.; Eady, E. A.; Cove, J. H.; Baumberg, S. (1995). «Identification of a chromosomally encoded ABC-trans-

. MACRÒLIDS. MECANISMES D’ACCIÓ I DE RESISTÈNCIA

port system with which the staphylococcal erythromycin exporter MsrA may interact». Gene, vol. 153, pàg. 93-98. Ross, J. I.; Eady, E. A.; Cove, J. H.; Cunliffe, W. J.; Baumberg, S.; Wootton, J. C. (1990). «Inducible erythromycin resistance in staphylococci is encoded by a member of the ATP-binding transport supergene family». Mol. Microbiol., vol. 4, pàg. 1207-1214. Ross, J. I.; Farell, M. A.; Eady, E. A.; Cove, J. H.; Cunliffe, W. J. (1989). «Characterisation and molecular cloning of the novel macrolide-streptogramin B resistance determinant from Staphylococcus epidermidis». J. Antimicrob. Chemother., vol. 24, pàg. 851-862. Santagati, M.; Iannelli, F.; Oggioni, M. R.; Stefani, S.; Pozzi, G. (2000). «Characterization of a genetic element carrying the macrolide efflux gene mef (A) in Streptococcus pneumoniae». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 44, pàg. 2585-2587. Schmitz, F. J.; Sadurski, R.; Kray, A.; Boos, M.; Geisel, R.; Kohrer, K.; Verhoef, J.; Fluit, A. C. (2000). «Prevalence of macrolide-resistance genes in Staphylococcus aureus and Enterococcus faecium isolates from 24 European university hospitals». J. Antimicrob. Chemother., vol. 45, pàg. 891-984. Seppälä, H.; Nissinen, A.; Yu, Q.; Huovinen, P. (1993). «Three different phenotypes of erythromycin-resistant Streptococcus pyogenes in Finland». J. Antimicrob. Chemother., vol. 32, pàg. 885-891. Seppäla, H.; Skurnik, M.; Soini, H.; Roberts, M. C.; Huovinen, P. (1998). «A novel erythromycin resistance methylase gene (ermTR) in Streptococcus pyogenes». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 42, pàg. 257-262. Seral, C.; Castillo, F. J.; Rubio-Calvo, M. C.; Fenoll, A.; García, C.; Gómez-Lus, R. (2001). «Distribution of resistance genes tet(M), aph3 -III, catpC194 and the integrase gene of Tn1545 in clinical Streptococcus pneumoniae harbouring erm(B) and mef (A) genes in Spain». J. Antimicrob. Chemother., vol. 47, pàg. 863-866. Singh, K. V.; Malathum, K.; Murray, B. E. (2001). «Disruption of an Enterococcus faecium species-specific gene, a homologue of acquired macrolide resistance genes of staphylococci, is associated with an increase in macrolide susceptibility». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 45, pàg. 263-266. Sutcliffe, J.; Tait-Kamradt, A.; Wondrack, L. (1996). «Streptococcus pneumoniae and Streptococcus pyogenes resistant to macrolides but sensitive to clindamycin: a common resistance pattern mediated by an efflux system». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 40, pàg. 1817-1824.

163

Syrogiannopoulos, G. A.; Grivea, I. O.; Tait-Kamradt, A.; Katopodis, G. D.; Beratis, N. G.; Sutcliffe, J.; Appelbaum, P. C.; Davies, T. A. (2001). «Identification of an erm(A) erythromycin resistance methylase gene in Streptococcus pneumoniae isolated in Greece». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 45, pàg. 342344. Tait-Kamradt, A.; Clancy, J.; Cronan, M.; Dib-Hajj, F.; Wondrack, L.; Yuan, W.; Sutcliffe, J. (1997). «mefE is necessary for the erythromycin-resistant M phenotype in Streptococcus pneumoniae». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 41, pàg. 2251-2255. Tait-Kamradt, A.; Davies, T.; Appelbaum, P. C.; Depardieu, F.; Courvalin, P.; Petitpas, J.; Wondrack, L.; Walker, A.; Jacobs, M. R.; Sutcliffe, J. (2000a). «Two new mechanisms of macrolide resistance in clinical strains of Streptococcus pneumoniae from Eastern Europe and North America». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 44, pàg. 3395-3401. Tait-Kamradt, A.; Davies, T.; Cronan, M.; Jacobs, M. R.; Appelbaum, P. C.; Sutcliffe, J. (2000b). «Mutations in 23S rRNA and ribosomal protein L4 account for resistance in pneumococcal strains selected in vitro by macrolide passage». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 44, pàg. 2118-2125. Torres, C. (2002). «Lectura interpretada del antibiograma de cocos Gram-positivos». Enferm. Infecc. Microbiol. Clin., vol. 20, pàg. 354-364. Vester, B.; Douthwaite, S. (2001). «Macrolide resistance conferred by base substitutions in 23S rRNA». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 45, pàg. 1-12. Weisblum, B. (1985). «Inductible resistance to macrolides, lincosamides and streptogramin type B antibiotics: the resistance phenotype, its biological diversity, and structural element that regulate expression – a review». J. Antimicrob. Chemother., vol. 16, pàg. 63-90. — (1995). «Insights into erythromycin action from studies of its activity as inducer of resistance». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 39, pàg. 797-805. — (1998). «Macrolide resistance». Drug Resist. Update, vol. 1, pàg. 29-41. — (2000). «Resistance to the macrolide-lincosamide-streptogramin antibiotics». A: Fischeti, V. A. [ed.] Gram positive pathogens. Washington: ASM. Wondrack, L.; Massa, M.; Yang, B. V.; Sutcliffe, J. (1996). «Clinical strain of Staphylococcus aureus inactivates and causes efflux of macrolides». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 40, pàg. 992-998.

Antimicrobians (Joaquim Ruiz, ed.) Treballs de la SCB. Vol. 55 (2004) 165-174

ALTRES ANTIBACTERIANS Carme Vidal, 1 Marina Segura 2 i Carmen Santos 1 1 Unitat de Seqüenciació, Hospital Son Dureta. 2 Servei de Microbiologia, Hospital Son Dureta.

Adreça per a la correspondència: Carme Vidal. Unitat de Seqüenciació, Hospital Son Dureta. Andrea Doria, 55. 07014 Palma de Mallorca. Adreça electrònica: cvidal@hsd.es. RESUM Es fa un breu repàs a un seguit d’antimicrobians, analitzant els seus mecanismes d’acció i els principals mecanismes de resistència. Paraules clau: cloramfenicol, sulfamides, lincosamides, oxazolidones. SUMMARY A brief report of action mechanisms in a series of antimicrobial agents is performed, taking resistance mechanisms into account. Keywords: chloramphenicol, sulphamydes, lincosamides, oxazolidons. SULFAMIDES Les sulfamides varen ser els primers agents antibacterians eficaços emprats en el tractament de les infeccions en l’home, i el seu descobriment en la dècada dels anys 19301940 fou el punt de partida del tractament antiinfecciós. Són antimicrobians sintètics, bacteriostàtics, d’ampli espectre, amb activitat, inicialment, enfront de gran varietat de microorganismes grampositius i gramnegatius, però amb el posterior desenvolupament d’una elevada resistència. Dins de les sulfamides existeixen nombrosos compostos amb propietats farmacocinètiques i efectes secundaris diferents; malgrat això, tots comparteixen

el mateix mecanisme d’acció i les resistències creuades són freqüents (Greenwood, 2003; Skold, 2000; Huovinen, 2001; Perez-Trallero i Iglesias, 2003). Actuen sinèrgicament amb components de la família de la diaminopirimidina, com la piremetamina i el trimetoprim. Actualment el paper terapèutic de les sulfamides soles és excepcional, i la sulfadiazina i la combinació sulfametoxazole més trimetoprim són les úniques sulfamides d’ús sistèmic utilitzades. La combinació de sulfadoxina amb piremetamina (Fansidar), no està comercialitzada a Espanya, però es pot obtenir mitjançant medicaments estrangers.

166

C. VIDAL, M. SEGURA I C. SANTOS

Taula 1.

Principals components de les sulfamides

Mecanismes d’acció

Nom genèric

Sulfamides d’acció curta o intermèdia

Sulfamides d’ús general Sulfatiazole Sulfadiazina Sulfadimidina Sulfametoxazole Compostos altament solubles Sulfisoxazole Sulfametizole Sulfasomidina

Sulfamides d’acció perllongada

Sulfametoxipiridazina Sulfadimetoxina Sulfadoxina

Sulfamides d’ús intestinal

Sulfaguanidina Sulfatalidina Sulfasuxidina Sulfasalazina

Sulfamides d’ús tòpic

Acetat de mafenida Sulfadiazina argèntica Sulfacetamida de Na

Estructura i classiﬁcació Les sulfamides d’utilització en clínica són derivats de la sulfanilamida, i la seva estructura és similar a l’àcid paraaminobenzoic (PABA), un factor que necessiten els bacteris per a la síntesi de l’àcid fòlic (vegeu les figures 1 i 2). La classificació de les sulfonamides utilitzades en la clínica es basa en els diferents patrons d’absorció i excreció, i es poden agrupar actualment en quatre classes (vegeu la taula 1).

cid fòlic necessari per a la síntesi de precursors dels àcids nucleics bacterians. Les sulfamides presenten una major afinitat per l’enzim dihidropteroic-sintasa en lloc del seu substrat natural, i això en comporta la interferència, una disminució en la síntesi d’àcid fòlic i, secundàriament, la producció de nucleòtids per part del bacteri, fet que es manifesta en un efecte bacteriostàtic amb la consegüent inhibició del creixement bacterià (Zinner i Mayer, 2000).

Mecanisme de resistència Mecanisme d’acció El mecanisme d’acció és similar en tots els membres del grup, i és secundari a la seva analogia estructural amb el PABA. Aquesta analogia els permet establir un antagonisme competitiu per l’enzim bacterià dihidropteroicsintasa, enzim que catalitza al bacteri el pas de PABA a àcid dihidropteroic, precursor de l’à-

La resistència a sulfamides és un fenomen creixent i generalitzat que afecta un gran nombre de bacteris, i la resistència creuada és freqüent entre els components del grup. Han estat implicats diferents mecanismes: disminució de la permeabilitat, expulsió activa i alteracions enzimàtiques que permeten la producció d’àcid fòlic per una via alternativa o per hiperproducció de PABA (Landy et

ALTRES ANTIBACTERIANS

al., 1943). La resistència pot ser deguda a mutacions en els gens dhps del cromosoma bacterià que indueixen modificacions en l’estructura de l’enzim dihidropteroic-sintasa, que fa perdre l’afinitat per l’antimicrobià (Wolf i Hotchkiss, 1943; Jonsson et al., 2003). També s’han descrit almenys dos plasmidis (suII i suIII) codificadors d’enzims que impliquen modificacions de la sintasa i disminució de la permeabilitat (Swedberg et al., 1979; Radstrom i Swedberg, 1988). DIAMINOPIRIMIDINES I ASSOCIACIONS Les diaminopirimidines, trimetoprim i pirimetamina són anàlegs al radical pteridínic de l’àcid dihidrofòlic. El trimetoprim és la 2,4-diamino-5-(3 ,4 ,5 -trimetoxibenzil)-pirimidina, que s’uneix a l’enzim dihidrofolatreductasa, i impedeix la síntesi de l’àcid folínic (vegeu la figura 3). Potencia l’activitat de les sulfamides en produir una inhibició seqüencial de la síntesi de l’àcid fòlic. El trimetoprim pot trobar-se sol o associat amb el sulfametoxazole. Trimetoprim i pirimetamina són fàrmacs bacteriostàtics.

Mecanisme d’acció El trimetoprim actua inhibint la síntesi dels àcids nucleics secundària a la inhibició de l’enzim dihidrofolat-reductasa. És un mecanisme similar al de les sulfamides, però actua en un pas previ. El trimetoprim interfereix en la conversió de l’àcid dihidrofòlic a àcid tetrahidrofòlic, precursor de la síntesi de l’àcid fòlic. El bloqueig seqüencial de la mateixa via metabòlica per part de sulfamides i trimetoprim confereix a ambdós grups la possibilitat d’una activitat sinèrgica altament eficaç enfront d’un ampli espectre de microorganismes. El fet que l’ésser humà no sintetitzi l’àcid fòlic, sinó que hagi d’incorporar-lo de manera

167

exògena a partir de la dieta, fa que pugui ser utilitzat en la clínica (Burchall, 1975; Hitchings, 1973). El trimetoprim és actiu in vitro enfront de cocs grampositius i de molts bacils gramnegatius, a excepció de Pseudomonas aeruginosa i Bacteroides sp. Treponema pallidum, Mycobacterium tuberculosis, Mycoplasma sp. i la majoria de gèrmens anaerobis són resistents. La pirimetamina té el mateix mecanisme d’acció, i és molt eficaç enfront d’alguns protozous, però amb una toxicitat més elevada. Associada a la sulfonamida, és activa en la toxoplasmosi i en els paludismes resistents a cloroquina. La combinació de sulfametoxazole i trimetoprim 5:1 (cotrimoxazole) és la més utilitzada actualment, i actua en el bloqueig seqüencial de la mateixa via metabòlica, per mecanismes sinèrgics. És l’antibiòtic d’elecció en la pneumònia per Pneumocystis carinii.

Mecanisme de resistència Els bacteris poden presentar resistència al trimetoprim per diversos mecanismes, que poden ser cromosòmics o bé plasmídics. El més important des del punt de vista clínic és la presència de plasmidis codificadors de dihidrofolat-reductases diferents de l’original (Burchall et al., 1982; Houvinen, 1987). També es poden trobar soques hiperproductores de l’enzim que esgoten la capacitat d’inhibició del fàrmac, o bé alteracions de la permeabilitat cell. ular que afectarien l’associació trimetoprim-sulfametoxazole (Smith i Tucker, 1976). CLORAMFENICOL El cloramfenicol és un antibiòtic d’ampli espectre derivat de Streptomyces venezuelae, un fong aïllat per primer cop el 1947 d’una terra recoll. ectada de Veneçuela (Ehrlich et al., 1947, 1948). És actiu enfront dels cocs grampositius i gramnegatius, bacils gramnegatius (incloent-

168

C. VIDAL, M. SEGURA I C. SANTOS

Figura 2. Figura 1.

Estructura de la sulfanilamina.

Estructura del PABA.

hi anaerobis), Rickettsia, Mycoplasma i Chlamydia. Aquest antibiòtic té una estructura amb una porció nitrobenzè i és un derivat de l’àcid dicloroacètic (vegeu la figura 4). Actualment es produeix sintèticament.

també pugui inhibir la síntesi proteica dels mitocondris, i aquest fet és una de les principals causes dels seus efectes secundaris (Roodyn i Wilkie, 1968).

Mecanisme de resistència Mecanisme d’acció El cloramfenicol exerceix els seus efectes mitjançant la unió reversible a la subunitat 50S del ribosoma bacterià, fet que impedeix la unió de l’aminoacil-tRNA al receptor del ribosoma i, en conseqüència, la síntesi de polipèptids bacterians (Goldberg, 1965). El cloramfenicol inhibeix la transpeptidació (Pongs et al., 1973), i el lloc de fixació al ribosoma bacterià és molt proper al dels macròlids i la clindamicina, fet que afavoreix la inhibició competitiva entre si. El bloqueig en la síntesi de proteïnes produeix un efecte bacteriostàtic en la majoria dels microorganismes susceptibles. En canvi, és bactericida enfront d’alguns patògens meningis com són Haemophilus inﬂuenzae, Streptococcus pneumoniae i Neisseria meningitidis, però no enfront dels estreptococs del grup B ni els enterobacteris en les concentracions terapèutiques (Turk, 1977; Rahal i Simlerkoff, 1979; Weeks et al., 1981). Malgrat que les cèll. ules dels mamífers contenen el ribosoma 80S, que no és afectat pel cloramfenicol, els ribosomes mitocondrials presenten la subunitat 70S. La semblança entre els ribosomes mitocondrials i els bacterians (ambdós són 70S) fa que el cloramfenicol

La resistència al cloramfenicol pot ser secundària a l’alteració de la permeabilitat de la membrana cell. ular bacteriana o a la producció de l’enzim acetiltransferasa que acetila l’antibiòtic a un derivat diacetil inactiu (Okamoto et al., 1964, 1965). Aquest darrer mecanisme és mitjançat per un factor R i ha esdevingut el responsable de la generalització d’epidèmies de febre tifoidea i disenteria per Shigella resistents a cloramfenicol a Amèrica Central i del Sud, Vietnam, l’Índia i d’altres països. LINCOSAMIDES Les lincosamides són un grup d’antibiòtics derivats de Streptomyces lincolnensis, amb propietats biològiques similars a les dels macròlids, però amb estructura química totalment diferent. La lincomicina va ser el primer compost aïllat, l’any 1962. Modificacions posteriors de la seva estructura varen donar lloc a nous derivats, entre els quals hi ha la clindamicina, amb més vigència en l’ús clínic actualment. La clindamicina millora, respecte a la lincomicina, la seva biodisponibilitat, i augmenta la potència bacteriana fins a deu vegades i el seu espectre d’acció (McGehee et al., 1968). L’estructura bà-

ALTRES ANTIBACTERIANS

Figura 5. Figura 3.

Estructura del trimetoprim.

sica de les lincosamines és un aminoàcid unit a un aminosucre. Els diferents derivats s’han obtingut per modificacions de les cadenes laterals R1 i R2. (vegeu les figures 5 i 6).

Mecanisme d’acció Les lincosamines actuen inhibint la síntesi proteica per bloqueig de la transpeptidació al ribosoma 50S. Lincosamida i clindamicina tenen el mateix lloc diana que els macròlids i el cloramfenicol a la subunitat 50S dels ribosomes. La síntesi proteica és inhibida en l’elongació inicial de la cadena per interferència en la reacció de transpeptidació, pel bloqueig del pèptid P (Reusser, 1975). Com els macròlids, també poden estimular la dissociació del peptidil-tRNA dels ribosomes (Menninger i Colemm, 1993).

Figura 4.

Estructura de la lincomicina.

169

Estructura del cloramfenicol.

Poden ser bacteriostàtics o bactericides, depenent de la seva concentració, de l’inòcul i de l’espècie bacteriana de què es tracti, i són actius, principalment, enfront de bacteris gramnegatius anaerobis (Bacteroides, Prevotella, Fusobacterium i Porphyromonas), grampositius (Staphilococcus, Streptococcus, Clostridium, Corynebacterium diphteriae, Bacillus anthacis), Nocardia, Actinomyces, Plasmodium, Toxoplasma, Babesia i P. carinii. No són actius enfront d’Enterococcus.

Mecanisme de resistència Hi ha diversos mecanismes de resistència en el grup dels antibiòtics lincosamides. Primer, l’alteració puntual en una proteïna de la porció 50S ribosòmica del receptor que dificulta la unió de l’antibiòtic. Aquesta resistència és una resistència creuada amb els macròlids (Tai i Daris, 1985). Segon, l’alteració a l’rRNA 23S de la subunitat 50S ribosomal deguda a la metilació de l’adenina (Leclerq i Courvalin, 1991a). És una resistència de transmissió plasmídica que afecta també macròlids i estreptogramines del grup B (fenotipus MLS B). Algunes soques de Staphylococcus aureus i Bacteroides fragilis exhibeixen aquest tipus de resistència a la clindamicina. Tercer, resistència conferida mitjançant la desactivació enzimàtica (Leclerq i Corvalin, 1991b). Finalment, alguns microorganismes com les Enterobacteriaceae, Pseudomonas i Acinetobacter presenten una resistència natural a la clindamicina, a causa de la disminució de la permeabilitat de la membrana externa envers aquest fàrmac (Leclerq i Corvalin, 1991b).

170

C. VIDAL, M. SEGURA I C. SANTOS

una estructura tricíclica, anomenats eperezolid i linezolid (Diekema i Jones, 2001; Pigrau, 2003).

Estructura química

Figura 6.

Estructura de la clindamicina.

El linezolid té una estructura tricíclica (vegeu la figura 7) responsable de la seva activitat enfront d’estafilococs resistents a meticill. ina. A més, posseeix un anell fluorat i grups piperazínics que en potencien l’activitat, i un grup morfolínic que n’augmenta la solubilitat i en millora el perfil farmacocinètic.

OXAZOLIDINONES Mecanisme d’acció Les oxazolidinones són una família d’antibiòtics preparats mitjançant síntesi orgànica, constitueixen una nova classe d’antimicrobians amb un mecanisme d’acció diferent dels coneguts fins ara, i s’han introduït per fer front a l’aparició de bacteris grampositius multiresistents als antimicrobians disponibles actualment, fonamentalment S. aureus i Enterococcus faecium. El desenvolupament de les oxazolidinones va començar l’any 1978 fet pel laboratori EI DuPont de Nemours and Company, Inc. en patentar una sèrie de 5-(halometil)-3-aril-2oxazolidinones amb activitat antimicrobiana enfront de patògens de les plantes. Posteriors manipulacions d’aquestes molècules varen permetre el desenvolupament de dos agents que presentaven activitat enfront de patògens humans (Slee et al., 1987). Aquests agents, anomenats DuP-105 i DuP-721, s’absorbien oralment i presentaven activitat antimicrobiana enfront d’una varietat d’estreptococs i estafilococs comparables a la que presenta la vancomicina i els β-lactàmics, però varen ser abandonats per problemes de toxicitat i de farmacocinètica experimental. Posteriorment, a començament de la dècada dels noranta, els laboratoris Pharmacia-Upjohn varen sintetitzar dos derivats exempts de toxicitat amb

Les oxazolidinones són inhibidors de la síntesi proteica i són bacteriostàtics enfront d’una gran varietat de bacteris, fonamentalment cocs grampositius. El mecanisme d’acció és únic i es relaciona amb una inhibició de la síntesi proteica en fase inicial (Lin et al., 1997; Dresser i Rybak, 1998). Aquest fàrmacs s’uneixen a la subunitat 50S ribosòmica i inhibeixen la formació del complex d’iniciació 70S. La unió és inhibida competitivament pel cloramfenicol i la lincomicina, fet que suggereix que els llocs diana són compartits o propers entre si (Lin et al., 1997). Malgrat això, a diferència del cloramfenicol i la lincomicina, les oxazolidinones no interfereixen en la formació del complex N-formilmetionina-tRNA, en l’elongació, ni en la terminació de la síntesi proteica (Shinabarger et al., 1997).

Mecanismes de resistència In vitro, és difícil induir l’aparició de mutants resistents en passis successius de S. aureus i enterococ en plaques amb concentracions creixents. La resistència es produeix per l’aparició de mutacions al gen 23SrRNA, i afecta la fixació de l’antimicrobià al riboso-

ALTRES ANTIBACTERIANS

Figura 7.

Estructura del linezolid.

ma (Diekema i Jones, 2001; García de Lomas, 2002; Pigrau, 2003). No es va observar resistència creuada en soques d’estafilococ, enterococ i estreptococ que presentaven gens de resistència a cloramfenicol, tetraciclines, lincosamines, estreptogramines i macròlids. Recentment, s’ha observat l’aparició de resistències a linezolid durant el tractament en pacients amb infeccions per enterococ que han rebut tractament perllongat amb aquest fàrmac (Gonzales et al., 2001), fonamentalment malalts trasplantats, amb infecció per E. faecium resistent a vancomicina i un abscés drenat inadequadament o bé amb una infecció del catèter amb tractament perllongat amb linezolid (Gonzales et al., 2001). ESTREPTOGRAMINES Les estreptogramines constitueixen un grup d’antibiòtics de naturalesa diversa que segons la seva estructura es classifiquen en dos grups, A i B. Les estreptogramines del grup A són macrolactones i les del grup B són polipèptids cíclics. Una de les principals característiques d’aquests compostos és la seva capacitat d’actuar sinèrgicament, fet que ofereix dos avantatges clars: aconseguir un efecte bactericida enfront d’una gran part dels bacteris sensibles, fet que no s’aconsegueix per separat, i reduir la possibilitat d’aparició de resistències (Pechere, 1996; Chant i Rybak, 1995). Dins del grup de les estreptogramines podem trobar derivats naturals i semisintètics. Els derivats naturals procedeixen de diferents

171

espècies de Streptomyces i podem destacar, en el grup A, la pristinamicina ii A i la pristinamicina ii B, i en el grup B, la pristinamicina i A i la virginiamicina S 1. Entre els compostos semisintètics destaquen l’associació quinupristinadalfopristina, que té una gran activitat enfront dels cocs grampositius aerobis i anaerobis, incloent-hi els estafilococs resistents a meticill. ina, enterococs resistents a glicopèptids i pneumococs resistents a penicill. ina. També són actius enfront d’alguns gramnegatius com H. inﬂuenzae, Neisseria gonorrhoeae, N. meningitidis, Moraxella catarralis i Legionella pneumophila (Finch, 1996).

Mecanisme d’acció Els derivats semisintètics quinupristinadalfopristina s’associen en una proporció 30:70 i procedeixen de la pristinamicina i A i la pristinamicina ii B, respectivament (Pechere, 1996). La quinupristina-dalfopristina inhibeix la síntesi proteica bacteriana per una fixació irreversible a diferents nivells de la subunitat del ribosoma 50S durant la fase d’elongació, i això implica la penetració per difusió a l’interior del bacteri i la formació d’un complex terciari quinupristina-ribosoma-dalfopristina. La quinupristina inhibeix l’elongació de la cadena peptídica, mentre que la dalfopristina interfereix directament mitjançant un bloqueig de la peptidiltransferasa (Aumercier et al., 1992; Bouanchaud, 1992; Vannuffel i Cocito, 1996).

Mecanisme de resistència La resistència a la quinupristina-dalfopristina pot ser deguda a tres mecanismes (Fekety, 2000), i el més important és una modificació de la diana secundària a la metilació de la subunitat 23S ribosòmica, que confereix resistència creuada entre macròlids, lincosamines i estreptogramines del grup B (quinupristina)

172

C. VIDAL, M. SEGURA I C. SANTOS

i que es coneix com a resistència MLS B. Aquest mecanisme no afecta les estreptogramines del grup A (dalfopristina). Un altre mecanisme de resistència és la desactivació de les estreptogramines del grup A mitjançant acetilases o per hidrolases en el grup B. Més infreqüentment, la resistència és secundària al bloqueig de les permeases que actuen en el transport transmembranós; s’ha descrit per a les estreptogramines del grup B (Pechere, 1996). Molts bacils gramnegatius són intrínsecament resistents a les estreptogramines, ja que la membrana externa impedeix l’entrada de molècules de gran pes molecular i de caràcter hidrofílic (Pechere, 1996).

da i d’ampli espectre amb activitat enfront de bacteris grampositius i negatius, incloent-hi anaerobis. Actua inhibint la síntesi de la paret cell. ular dels bacteris, i aquesta acció es produeix en la primera etapa de la síntesi del peptidoglicà de la paret bacteriana en competir, per analogia estructural, amb el PEP. Aquesta acció afecta bacteris en creixement, no bacteris en fase de repòs (Kahan et al., 1974). L’aparició de resistència és freqüent, i els mecanismes principals en són dos: alteració de la permeabilitat de la paret cell. ular i desactivació enzimàtica (O’Hara, 1993). Malgrat la seva baixa toxicitat, la seva aplicació clínica és poc freqüent.

ÀCID FUSÍDIC

ANTIBIÒTICS POLIPEPTÍDICS

L’àcid fusídic és un derivat del fong Fusidium coccineum i té una estructura esteroidea, relacionada químicament amb la cefalosporina P. L’espectre d’acció està restringit a bacteris grampositius, especialment estafilococs resistents als β-lactàmics, i és efectiu, també, enfront de Neisseria i Bordetella. És un fàrmac bacteriostàtic, i es pot comportar com a bactericida a concentracions elevades. Actua inhibint la síntesi proteica i interfereix en la traducció ribosòmica, pas final de la síntesi de les cadenes peptídiques (Harvey et al., 1966). L’aparició de resistències està lligada a mutacions cromosòmiques que permeten una reducció de l’afinitat per l’àcid fusídic (Tanaka et al., 1971).

El grup d’antibiòtics polipeptídics inclou: polimixina B, colistina (polimixina E), bacitracina i capreomicina. Són antibiòtics amb una notable toxicitat i el seu ús sol ser tòpic. La bacitracina és produïda per una espècie de Bacillus, inicialment classificada com a B. sultilis però actualment anomenada B. licheniformis (Katz i Demain, 1977). És un antibiòtic polipeptídic amb un anell tiazole, que actua en fases inicials de la síntesi del peptidoglicà en el lípid transportador (Strominger, 1973). És bactericida enfront dels cocs grampositius amb alguna activitat sobre els cocs gramnegatius. Atesa la seva toxicitat, fonamentalment renal, només s’utilitza tòpicament. Les polimixines són antibiòtics obtinguts de Bacillus polymyxa, que inicialment es varen utilitzar en el tractament de les infeccions per Pseudomonas, però actualment el seu ús és només tòpic. En clínica s’han utilitzat la polimixina B i l’E (colistina). Són antibiòtics polipeptídics que interaccionen amb els fosfolípids i desestructuren la membrana cell. ular (Dixon i Chopra, 1986). Són bactericides enfront de gramnegatius, i s’utilitzen en infeccions de pell, ull i otitis externes, freqüentment associades a bacitracina i neomicina. Esporà-

FOSFOMICINA La fosfomicina és un antibiòtic natural, aïllat el 1969 a partir de Streptomyces fradiae en una mostra de terra d’Alacant (Hendlin et al., 1969). Presenta una estructura epoxídica, anàloga al fosfoenolpiruvat (PEP), un dels precursors utilitzats pels bacteris en la síntesi dels peptidoglicans, i té un efecte bacterici-

ALTRES ANTIBACTERIANS

dicament s’han fet servir com a ús sistèmic en sepsis per soques multiresistents de K. pneumoniae (Karabinis et al., 2004), P. aeruginosa i Acinetobacter baumannii (Markou et al., 2003). La capreomicina és també un antibiòtic polipeptídic. El seu espectre d’acció és limitat als micobacteris. BIBLIOGRAFIA Aumercier, M.; Bouhallab, S.; Capmau, M. L.; Le Goffic, F. (1992). «RP 59500: a proposed mechanism for its bactericidal activity». J. Antimicrob Chemother., vol. 30 (supl. A), pàg. 9-14. Bouanchaud, D. H. (1992). «In-vitro and in-vivo synergic activity and fractional inhibitory concentration (FIC) of the components of a semisynthetic streptogramin, RP 59500». J. Antimicrob. Chemother., vol. 30 (supl. A), pàg. 95-99. Burchall, J. J. (1975). «Trimethoprim and pyrimethamine». (1975). A: Corcoran, J. W.; Hanhn, F. E. [ed.] Antibiotics III: Mechanism of antimicrobial and antitumor agents. Berlín: Springer-Verlag, pàg. 304. Burchall, J. J; Pelwell, L.; Fling, M. E. (1982). «Molecular mechanism of resistance to trimethoprim». Rev. Infect. Dis., vol. 4, pàg. 246-254. Chant, C.; Rybak, M. J. (1995). «Quinupristin-dalfopristin: a new streptogramin antibiotic». Ann. Pharmacother., vol. 29, pàg. 1022-1027. Diekema, D. J.; Jones, R. N. (2001). «Oxazolidinone antibiotics». Lancet, vol. 358, pàg. 1975-1982. Dixon, R. A.; Chopra, I. (1986). «Polymyxin B and polymyxin B nonapeptide alter cytoplasmic membrane permeability in Escherichia coli». J. Antimicrob. Chemother., vol. 18, pàg. 557-563. Dresser, L. D.; Rybak, M. J. (1988). «The pharmacological and bacteriologic properties of oxazolidinones, a new class of synthetic antimicrobials». Pharmacotherapy, vol. 18, pàg. 456-462. Ehrlich, J.; Bartz, Q. R.; Smith, R.M. (1947). «Chloromycetin; a new antibiotic from a soil actinomycete». Science, vol. 106, pàg. 417. Ehrlich, J.; Gottlieb, D.; Burkholder, P. R. (1948). «Streptomyzes venezuelae sp., the source of chloromycetin». J. Bacteriol., vol. 56, pàg. 467. Fekety, R. (2000) «Vancomycin, teicoplanin, and the streptogramins: quinupristin/dalfopristin». A: Mandell, G. L.; Bennet, J. E.; Dolin, R. [ed.] Principles & practice of infectious diseases. 5a ed. Nova York: Churchill Livingstone, pàg. 382-392. Finch, R. G. (1996). «Antibacterial activity of quinupristin/dalfopristin. Rationale for clinical use». Drugs, vol. 51 (supl. 1), pàg. 31-37.

173

García de Lomas, J.; Gimeno, C.; Esteban, E. (2002). «Las oxazolidinonas: Una nueva clase de antimicrobianos». Enf. Infecc. Microbiol. Clin., vol. 1 (supl. 1). pàg. 814. Goldberg, I. H. (1965). «Mode of action of antibiotics. II: Drugs affecting nucleic acid and protein synthesis». Am. J. Med., vol. 39, pàg. 722-752. Gonzales, R. D.; Schreckenberg, P. C.; Graham, M. B.; Kelkar, S.; DenBesten, K.; Quinn, J. P. (2001). «Infections due to vancomycin resistant Enterococcus faecium resistant to linezolid». Lancet, vol. 357, pàg. 1179. Greenwood, D. (2003). «Sulphonamides». A: Finch, R. G.; Greenwood, D.; Norrby, S. R.; Whitley, R. J. Antibiotic and chemotherapy. 8a ed. Filadèlfia: Churchill Livingstone, pàg. 385-392. Harvey, C. L.; Knight, S. G.; Sih, C. J. (1966). «On the mode of action of fusidic acid». Biochemistry, vol. 5, pàg. 3320-3327. Hendlin, D.; Stapley, E. O.; Jackson, M.; Wallick, H.; Miller, A. K.; Wolf, F. J.; Miller, T. W.; Chaiet, L.; Kahan, F. M.; Foltz, E. L.; Woodruff, H. B.; Mata, J. M.; Hernandez, S.; Mochales, S. (1969). «Phosphonomycin; a new antibiotic produced by strains of streptomyces». Science, vol. 166, pàg. 122-123. Hitchings, G. T. (1973). «The biochemical basis for the antimicrobial activity of septrin». A: Berstein, L. S.; Salter, A. J. [ed.] Trimethropim/sulphametoxazol in bacterial infections. Edimburg i Londres: Churchill Livingstone, vol. 9, pàg. 736-740. Houvinen, P. (1987). «Trimethoprim resistance». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 31, pàg. 1451-1456. — (2001). «Resistance to trimethoprim-sulfamethoxazole». Clin. Infect. Dis., vol. 32, pàg. 1608-1614. Jonsson, M.; Strom, K.; Swedberg, G. (2003). «Mutations and horizontal transmission have contributed to sulphonamide resistance in Streptococcus pyogenes». Microb. Drug Resist., vol. 9, pàg. 147-153. Kahan, F. M.; Kahan, J. S.; Cassidy, P. J.; Kropp, H. (1974). «The mechanism of action of fosfomycin (phosphonomycin)». Ann. NY Acad. Sci., vol. 235, pàg. 364386. Karabinis, A.; Paramythiotou, E.; Mylona-Petropoulou, D.; Kalogeromitros, A.; Katsarelis, N.; Kontopidou, F.; Poularas, I.; Malamou-Lada, H. (2004). «Colistin for Klebsiella pneumoniae-associated sepsis». Clin. Infect. Dis., vol. 38, pàg. 7-9. Katz, E.; Demain, A. L. (1977). «The peptide antibiotics of Bacillus: chemistry, biogenesis, and possible functions». Bacteriol. Rev., vol. 41, pàg. 449-474. Landy, M.; Larkun, N. W.; Oswald, E. J. (1943). «Increased synthesis of p-aminobenzoic acids associated with the development of resistance in Staphylococcus aureus». Science, vol. 97, pàg. 265-267. Leclercq, R.; Courvalin, P. (1991a). «Bacterial resistance to macrolide, lincosamide, and streptogramin antibiotics by target modification». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 35, pàg. 1267-1272.

174

C. VIDAL, M. SEGURA I C. SANTOS

— (1991b). «Intrinsic and unusual resistance to macrolides, lincosamide, and streptogramin antibiotics in bacteria». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 35, pàg. 1273-1276bis. Lin, A. H.; Murray, R. W.; Vidmar, T. J.; Marotti, K. R. (1997). «The oxazolidinone eperezolid binds to the 50s ribosomal subunit and competes with binding of chloramphenicol and lincomycin». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 41, pàg. 2127-2136. Markou, N.; Apostolakos, H.; Koumoudiou, C.; Athanasiou, M.; Koutsoukou, A.; Alamanos, I.; Gregorakos, L. (2003). «Intravenous colistin in the treatment of sepsis from multiresistant Gram-negative bacilli in critically ill patients». Crit. Care, vol. 7, pàg. R78-R83. McGehee, R. F. Jr.; Smith, C. B.; Wilcox, C.; Finland, M. (1968). «Comparative studies of antibacterial activity in vitro and absorption and excretion of lincomycin and clinimycin». Am. J. Med. Sci., vol. 256, pàg. 279-292. Menninger, J. R.; Coleman, R. A. (1993). «Lincosamide antibiotics stimulate dissociation of peptydyl-tRNA from ribosomes». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 37, pàg. 2027-2029. O’Hara, K. (1993). «Two different types of fosfomycin resistance in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae». FEMS Microbiol. Lett., vol. 114, pàg. 9-16. Okamoto, S.; Mizuno, D. (1964). «Mechanism of chloramphenicol and tetracycline resistance in Escherichia coli». J. Gen. Microbiol., vol. 35, pàg. 125-133. Okamoto, S.; Suzuki, Y. (1965). «Chloramphenicol-, dihydrostreptomycin- and kanamycin-inactivating enzymes from multiple drug-resistant Escherichia coli carrying episome ‘R’». Nature, vol. 208, pàg. 1301. Pechere, J. C. (1996). «Streptogramins. A unique class of antibiotics». Drugs, vol. 5, pàg. 13-19. Perez-Trallero, E.; Iglesias, L. (2003). «Tetraciclinas, sulfamidas y metronidazol». Enferm. Infecc. Microbiol. Clin., vol. 21, pàg. 520-529. Pigrau, C. (2003). «Oxazolidinonas y glucopéptidos». Enferm. Infecc. Microbiol. Clin., vol. 21, pàg. 157-165. Pongs, O.; Bald, R.; Erdmann, V. A. (1973). «Identification of chloramphenicol-bindin protein in Escherichia coli ribosomes by affinity labelling». Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 70, pàg. 2229-2233. Radstrom, P.; Swedberg, G. (1988). «RSF1010 and a conjugative plasmid contain sulII, one of two known genes for plasmid-borne sulphonamide resistance dihydropteroate synthase». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 32, pàg. 1684-1692. Rahal, J. J.; Simberkoff, M. S. (1979). «Bacterial and bacteriostatic action of chloramphenicol against meningeal pathogens». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 16, pàg. 13-18. Reusser, F. (1975). «Effect of lincomycin and clindamycin on peptide chain initiation». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 7, pàg. 32.

Roodyn, D. B.; Wilkie, D. (1968). The biogenesis of mitochondria. Londres: Methuen. Shinabarger, D. L.; Marotti, K. R.; Murray, R. W.; Lin, A. H.; Melchior, E. P.; Swaney, S. M.; Dunyak, D. S.; Demyan, W. F.; Buysse, J. M. (1997). «Mechanism of action of oxazolidones: effects of linezolid and eperozolid on translation reactions». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 41, pàg. 2132-2136. Skold, O. (2000). «Sulphonamide resistance: Mechanisms and trends». Drug Resist. Updat., vol. 3, pàg. 155-160. Slee, A. M.; Wuonola, M. A.; McRipley, R. J.; Zajac, I.; Zawada, M. J.; Bartholomew, P. T.; Gregory, W. A.; Forbes, M. (1987). «Oxazolidinone, a new class of synthetic antibacterial agents: In vitro and in vivo activities of DuP-105 and DuP-721». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 31, pàg. 1791-1797. Smith, H. W.; Tucker, J. F. (1976). «The virulence of trimethoprim resistant thymine-requiring strains of salmonella». J. Hyg., vol. 76, pàg. 97-108. Strominger, J. L. (1973). «The actions of penicillin and other antibiotics on bacterial cell wall synthesis». Johns Hopkins Med. J., vol. 133, pàg. 63-81. Swedberg, G.; Castensson, S.; Skold, O. (1979). «Characterization of mutationally altered dyhidropteroate syntethase and its ability to form a sulphonamidecontaining dyhidrofolate analog». J. Bacteriol., vol. 137, pàg. 129-136. Tai, P. C.; Daris, B. D. (1985). «The actions of antibiotics on the ribosome». A: Greenwood, D.; O’Grady, F. [ed.] The scientiﬁc basis of antimicrobial chemotherapy. Cambridge: Cambridge University Press, pàg. 41-68. Tanaka, N.; Kawano, G.; Kinoshita, T. (1971). «Chromosomal location of a fusidic acid resistant marker in Escherichia coli». Biochem. Biophys. Res. Commun., vol. 42, pàg. 564-567. Turk, D. C. (1977). «A comparison of chloramphenicol and ampicilin as bacterial agents for Haemophilus inﬂuenzae type B». J. Med. Microbiol., vol. 10, pàg. 127-131. Vannuffel, P.; Cocito, C. (1996). «Mechanism of action of streptogramins and macrolides». Drugs., vol. 51 (supl. 1), pàg. 20-30. Weeks, J. L.; Mason, E. O.; Baker, C. J. (1981). «Antagonism of ampicillin and chloramphenicol for meningeal isolates of group B streptococci». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 20, pàg. 281-285. Wolf, B.; Hotchkiss, R. D. (1963). «Genetically modified folic acid synthesising enzymes of Pneumococcus». Biochemistry, vol. 2, pàg. 145-150. Zinner, S. H.; Mayer, K. H. (2000). «Sulphonamide and trimethoprim». A: Mandell, G. L.; Bennet, J. E.; Dolin, R. [ed.] Principles & practice of infectious diseases. 5a ed. Nova York: Churchill Livingstone, pàg. 3942-4004.

Altres antimicrobians

Antimicrobians (Joaquim Ruiz, ed.) Treballs de la SCB. Vol. 55 (2004) 177-186

AGENTS ANTIRETROVIRALS CONTRA EL VIH Cristina Gil i José M. Gatell Unitat de Recerca de la Sida, Servei de Microbiologia i Servei de Malalties Infeccioses, Hospital Clínic. Adreça per a la correspondència: Cristina Gil. Unitat de Recerca de la Sida, Servei de Microbiologia i Servei de Malalties Infeccioses, Hospital Clínic. Villarroel, 170. 08036 Barcelona. Adreça electrònica: cgil@clinic.ub.es. RESUM La sida ha estat una de les malalties que va adquirir més embranzida a la darreria del segle passat. La recerca en el tractament d’aquesta malaltia ha conduït a la consecució de dinou substàncies capaces de combatre-la. Aquestes substàncies es poden catalogar en tres grups principals: a) inhibidors de la transcriptasa inversa, b) inhibidors de la proteasa i c) inhibidors de l’entrada del virus. Paraules clau: sida, antiretrovirals, resistència. SUMMARY AIDS has been one of the most important illnesses in the latest years of the last century. Research to find treatments has resulted in nineteen substances able to act against it. Those substances might be classified in three main categories: 1) inhibitors of reverse transcriptase, 2) inhibitors of protease and 3) inhibitors of virus-entrance. Keywords: AIDS, antiretrovirals, resistance. INTRODUCCIÓ La síndrome d’immunodeficiència adquirida (sida) és causada pel virus de la immunodeficiència humana (VIH), aïllat per primera vegada el 1983. El VIH pertany a la família dels retrovirus i és el responsable d’una de les majors pandèmies del segle xx. La seva principal cèll. ula hoste és el limfòcit T CD4+, el qual és essencial per activar una resposta immunitària efectiva contra qualsevol infecció.

Actualment es disposa de dinou medicaments antiretrovirals contra el VIH, que poden classificar-se en tres famílies segons l’etapa del cicle vital del virus en què actuen: a) inhibidors de la transcriptasa inversa, b) inhibidors de la proteasa i c) inhibidors de l’entrada del virus (vegeu la taula 1). Les característiques bioquímiques i de biodisponibilitat han estat recentment revisades per Clercq (2004). L’objectiu principal del tractament antire-

178

C. GIL I J. M. GATELL

Taula 1. Família

Nom genèric

Característiques dels antiretrovirals contra el VIH

Especialitat

Activitat

Mecanisme d’acció

registrada ITIAN a

Competeixen amb els dNTP naturals i causen la terminació de la cadena de DNA víric.

Timidina

Zidovudina (ZDV)

Retrovir

VIH (1 i 2)

Adenosina

Didanosina (DDI)

Videx

VIH (1 i 2)

Citosina

Zalzatabina (DDC)

Hivid

VIH (1 i 2)

Timidina

Estavudina (D4T)

Zerit

VIH (1 i 2)

Citosina

Lamivudina (3TC)

Epivir

VIH (1 i 2) i VHB

Guanina

Abacavir (ABC)

Ziagen

VIH (1 i 2)

Citosina

Emtricitabina (FTC)

Emtriva

VIH (1 i 2) i VHB

Adenosina

Tenofovir (TNF)

Viread

VIH (1 i 2) i VHB

ITINAN b

S’uneixen a l’enzim TI i bloquegen la síntesi de DNA víric. Nevirapina (NVP)

Viramune

VIH-1

Delavirdina (DLV)

Rescriptor

VIH-1

Efavirenz (EFV)

Sustiva

VIH-1

IP c

S’uneixen a la proteasa vírica i impedeixen la proteòlisi de les poliproteïnes precursores de les proteïnes estructurals i funcionals del virus. Saquinavir (SQV)

Invirase/Fortavase

VIH (1 i 2)

Ritonavir (RTV)

Norvir

VIH (1 i 2)

Indinavir (IDV)

Crixivan

VIH (1 i 2)

Nelfinavir (NFV)

Viracept

VIH (1 i 2)

Amprenavir (APV)

Argenerase

VIH (1 i 2)

Lopinavir (LPV)

Kaletra

VIH (1 i 2)

Atazanavir (ATV)

Reyataz

VIH (1 i 2)

I. Entrada d

Inhibeix l’entrada del virus unint-se a la regió HR1 de la GP41 i no permet la interacció entre HR1 i HR2. Emfurtide

T-20/Fuceon

VIH-1

a Inhibidors de la transcriptasa inversa anàlegs als nucleòsids o nucleòtid (ITIAN). b Inhibidors de la transcriptasa inversa no anàlegs als nucleòsids (ITINAN). c Inhibidors de la proteasa (IP). d Inhibidors de l’entrada o fusió.

troviral contra el VIH és obtenir la màxima supressió de la replicació vírica i aconseguir el restabliment del sistema immunitari, per la qual cosa cal utilitzar tractaments altament agressius (HAART), consistents en la combinació d’almenys tres antiretrovirals

d’almenys dues famílies. Amb aquest tipus de tractaments s’ha aconseguit mantenir la virèmia controlada per sota del límit de detecció de la càrrega vírica amb tècniques de PCR ultrasensibles (actualment, vint còpies de RNA/ml) i obtenir la recuperació del nom-

AGENTS ANTIRETROVIRALS CONTRA EL VIH

bre de limfòcits T CD4+ cooperadors específics contra VIH en la majoria dels pacients tractats (Gulick et al., 1997; Palella et al., 1998; Yeni et al., 2004). Tanmateix, tot i els avanços tècnics en el tractament antiretroviral, encara no s’ha aconseguit eradicar el virus. L’escassa penetració dels antiretrovirals en determinats santuaris com el sistema nerviós central o en limfòcits T CD4+ de memòria o cèll. ules seminals permet que la replicació del virus continuï a molt baix nivell (Wong et al., 1997; Martínez-Picado et al., 2000). Els tractaments efectuats amb els antiretrovirals en règim de monoteràpia amb un sol inhibidor o de teràpia combinada durant períodes de temps prolongats poden traduir-se en fracàs víric en alguns pacients. Existeix una correlació molt important entre el fracàs víric i l’aparició de virus resistents als inhibidors, encara que no es pot descartar la influència d’altres factors, com per exemple factors cell. ulars o la no-adherència al tractament (Turriziani et al., 2000; Turriziani et al., 2002). MECANISMES D’ACCIÓ DELS ANTIRETROVIRALS Les diferents famílies d’antiretrovirals intervenen en diferents etapes del cicle vital del virus. El VIH infecta bàsicament les cèllules que contenen la molècula CD4, receptora principal, que permet l’entrada del virus. Una vegada les proteïnes de l’embolcall del virus (gp41 i gp120) es posen en contacte amb la molècula CD4 i una de les molècules coreceptores presents en la membrana cell. ular (principalment, CXCR4, CCR5 o DC-SIGN), es produeixen canvis conformacionals que permeten l’entrada del genoma víric a l’interior de la cèll. ula. En aquest punt del cicle actuen els inhibidors de l’entrada. El genoma del virus està constituït per dues cadenes idèntiques de RNA de 9,6 kb. A l’interior de la cèll. ula, l’enzim transcriptasa inversa del virus (TI) sintetitza una doble cadena de DNA a partir de la

179

transcripció inversa d’una de les cadenes de RNA víric amb la utilització com a substrat dels nucleòtids endògens de la cèll. ula (dNTP). En aquesta etapa actuen els diferents inhibidors de la TI mimetitzant els nucleòsids endògens. A continuació, la doble cadena de DNA s’integra al genoma cell. ular i s’inicia la transcripció i traducció del genoma víric en poliproteïnes precursores. Aquestes poliproteïnes contenen dianes peptídiques específiques que són reconegudes per l’enzim aspartilproteasa específic del virus. L’acció d’aquesta proteasa té com a resultat la formació de les proteïnes funcionals i estructurals que formaran els nous virions. En aquesta etapa del cicle actuen els inhibidors de la proteasa.

Inhibidors de la transcriptasa inversa La TI és un enzim amb activitat polimerasa dependent de DNA i de RNA i amb activitat RNAasa. Aquestes funcions són essencials per polimeritzar una cadena doble de DNA amb la informació completa del virus. La TI està formada per dues subunitats heterodímeres: una subunitat (p66) formada per cinc-cents seixanta aminoàcids (aa) que contenen el centre actiu de l’enzim polimerasa i un domini amb activitat RNAasa H i una segona subunitat (p51) que comprèn els primers quatrecents quaranta aa de la p66. La molècula està formada per nou dominis que es disposen formant una estructura conformacional semblant a una mà (Kohlstaedt et al., 1992). Els inhibidors de la TI actuen durant la retrotranscripció de RNA a DNA i poden classificar-se en dos grups en funció de les seves característiques i mecanismes d’acció: a) als anàlegs als nucleòsids i nucleòtids i b) els no anàlegs als nucleòsids. Inhibidors de la transcriptasa inversa anàlegs als nucleòsids o nucleòtid (ITIAN): Els ITIAN foren els primers antiretrovirals que s’introduïren en el tractament de la infecció per VIH. Al principi s’utilitzaren com

180

C. GIL I J. M. GATELL

a monoteràpia i més tard en combinació. Es tracta de nucleòsids sintètics anàlegs als nucleòsids naturals de les pirimidines i les purines però als quals els manquen el grup 3 OH de la desoxiribosa necessària per a la incorporació de nous nucleòtids. La seva eficàcia depèn de la incorporació de tres grups fosfat mitjançant la fosforilació sequencial del nucleòsid sintètic a trifosfat que es realitza a l’interior de les cèll. ules (ITIAN, ITIAN-MP, ITIAN-DP, ITIAN-TP). Aquesta fosforilació es du a terme amb enzims cinases cell. ulars durant l’activació cell. ular amb cinètiques variables per als diferents anàlegs (Gao et al., 1994b; Kewn et al., 1997). Els ITIAN-TP són acceptats com a substrat per la TI vírica i inhibeixen la retrotranscripció de l’RNA víric a DNA mitjançant dos mecanismes: a) competint amb els NTP naturals pel lloc d’unió de la TI i incorporant-se a la cadena de DNA i b) actuant com a acabadors durant la síntesi de DNA províric. Quan la TI del virus introdueix l’ITIAN-TP al DNA no permet la incorporació de qualsevol altre nucleòtid i evita l’elongació de la cadena. El grup d’ITIAN el componen la zidovudina (ZDV), la didanosina (DDI), l’estavudina (D4T), la zalzatabina (DDC), la lamivudina (3TC), l’abacavir (ABC) i l’emtricitabina (FTC), que actuen inhibint la TI del VIH-1 i el VIH-2. El tenofovir (TNF) és l’únic ITIAN anàleg als nucleòtids utilitzat en el tractament antiretroviral. Es tracta d’un nou inhibidor anàleg del d’ATP que només necessita dues fosforilacions que es duen a terme mitjançant enzims cell. ulars inespecífics per convertir-se en el metabòlit actiu. El TNF és administrat com a profàrmac (tenofovir disoproxil fumarat, o TDF), el qual necessita la hidròlisi del dièster abans de convertir-se en TNF. De la mateixa manera que els ITIAN, quan la TI del virus l’incorpora al DNA no permet la incorporació de qualsevol altre nucleòtid, i evita l’elongació d’aquesta cadena. Inhibidors de la transcriptasa inversa no anàlegs als nucleòsids (ITINAN): Els ITINAN són molècules de naturalesa

molt diversa que tenen una alta afinitat pel centre actiu de la subunitat p66 de la TI (Hsiou et al., 2001). La unió forma un canvi conformacional al centre actiu de l’enzim i impedeix la polimerització del DNA (Kohlstaedt et al., 1992; Spence et al., 1995). A diferència dels ITIAN, no requereixen la fosforilació prèvia per ser actius. Actualment es disposa de tres ITINAN molt efectius per al tractament de la infecció per VIH-1: nevirapina (NVP), efavirenz (EFV) i delavirdina (DLV, no aprovat a Europa), que solen ser administrats en combinació amb ITIAN i amb inhibidors de la proteasa. L’eficàcia dels ITINAN és molt dependent de la conformació del centre actiu, i això fa que la variabilitat existent entre els virus VIH en els residus essencials que permeten la unió d’aquests inhibidors a la TI no permeti que siguin efectius contra els virus del grup O i el VIH-2 (Descamps et al., 1997; Ren et al., 2002).

Inhibidors de la proteasa (IP) La proteasa del VIH és una proteasa aspàrtica que es compon de dos monòmers idèntics de noranta-nou aa associats no covalentment. La seva activitat proteolítica permet el correcte processament de les poliproteïnes precursores generades durant el cicle de replicació vírica en proteïnes funcionals i estructurals que formaran els virions madurs a l’interior de la cèll. ula hoste (Navia et al., 1989). Entre aquestes poliproteïnes precursores destaca la poliproteïna Gag-Pol, en què l’escissió condueix a les proteïnes estructurals de la càpsida (p7, p9, p17 i p24) i les proteïnes funcionals, com la TI, la RNAasa H, la integrasa i la proteasa. Els inhibidors de la proteasa actuen inhibint el centre catalític de la proteasa i impedeixen la correcta maduració de les partícules víriques. Com a resultat, es formen virus immadurs incapaços d’iniciar el cicle d’infecció en noves cèll. ules hoste. Avui dia, es disposa de sis inhibidors de la proteasa:

AGENTS ANTIRETROVIRALS CONTRA EL VIH

saquinavir (SQV), ritonavir (RTV), nelfinavir (NFV), amprenavir (APV), lopinavir (LPV) i atazanavir (ATV). Aquests inhibidors són específics de la proteasa de VIH i no afecten les proteases cell. ulars, ja que s’han dissenyat a partir de pèptids que mimetitzen l’estructura del substrat natural d’aquesta proteïna (Erickson i Kempf, 1994; Flexner, 1998). L’aparició dels inhibidors de la proteasa constituí un progrés important en el tractament de la infecció en la dècada dels noranta. La seva administració en combinació amb inhibidors de la TI va permetre controlar la virèmia en plasma fins a nivells per sota del límit de detecció. Actualment, molts tractaments que inclouen IP estan basats en l’administració conjunta d’un IP amb baixes dosis de RTV. Les propietats farmacocinètiques de l’RTV permeten inhibir el metabolisme d’altres IP com l’LPV i, per tant, augmentar la vida mitjana i concentració en plasma d’aquests altres IP (Moyle, 2002).

Inhibidors de l’entrada o fusió del virus Recentment s’ha incorporat al tractament un inhibidor de la fusió conegut com a enfurvirtide (T-20). En l’inici de la infecció la glicoproteïna gp120 situada a la càpsida del virus es posa en contacte amb les molècules receptores i coreceptores i es formen canvis conformacionals que permeten l’apropament de la glicoproteïna vírica gp41. Aquesta proteïna gp41 conté uns dominis anomenats HR1 i HR2, en què la interacció és essencial perquè es formi la fusió de membranes entre el virus i la cèll. ula. El T-20 és un pèptid sintètic de trenta-sis aa que mimetitza el domini HR2 des del residu 127 al 162 de la gp41 i no permet la interacció entre HR1 i HR2 (Wild et al., 1994). És un inhibidor molt efectiu contra VIH-1, amb independència de la molècula coreceptora que utilitzi en l’entrada (CXCR4 o CCR5), però no és efectiu contra el VIH-2.

181

MECANISMES DE RESISTÈNCIA ALS ANTIRETROVIRALS En general, la resistència als antiretrovirals es deu a la introducció de mutacions en el genoma víric. Aquestes mutacions es formen essencialment com a conseqüència de fets dependents de la TI vírica: a) la seva elevada taxa d’error se situa al voltant de 10 –4-10 –5 substitucions per nucleòtid i ronda de còpia i b) la falta d’activitat exonucleasa 3 → 5 d’aquest enzim, que no permet la correcció dels errors deguts a substitucions, insercions o delecions durant el procés de retrotranscripció. L’elevada taxa de replicació i d’error dóna lloc a variacions moleculars en el genoma que formen un espectre de variants víriques que coexisteixen en un mateix entorn, anomenades quasiespècies. Algunes d’aquestes quasiespècies presenten mutacions que afavoreixen la supervivència del virus davant la pressió de determinats inhibidors, ja sigui de manera directa o indirecta (Coffin, 1995; Najera et al., 1995; Havlir i Drichman, 1996). Els estudis moleculars basats en la seqüenciació dels gens implicats en la diana dels diferents inhibidors i els estudis de sensibilitat als mateixos, realitzats in vitro a partir de virus aïllats de pacients i de virus de laboratori, han permès establir la correlació entre la presència de determinades mutacions en el genoma del virus i la falta de sensibilitat als diferents inhibidors. A més, aquests estudis han provat que les vies d’escapament del virus a la pressió antivírica no són en absolut simples. Moltes d’aquestes mutacions, tot i proporcionar la supervivència del virus, tenen un efecte negatiu en la taxa de replicació (Menéndez-Arias et al., 2003). En altres ocasions, les mutacions de resistència provocades per alguns ITIAN provoquen la hipersusceptibilitat als ITINAN o les mutacions de resistència als ITINAN resensibilitzen virus resistents a alguns ITIAN (Shulman et al., 2001; Whitcomb et al., 2002). Les mutacions de resistència als antiretrovirals utilitzats en el tractament es troben re-

182

C. GIL I J. M. GATELL

lativament ben caracteritzades, tot i que encara es necessiten més estudis per catalogar mutacions de resistència a inhibidors de més recent incorporació i comprendre el paper de la presència de certs polimorfismes (Hirsch et al., 2003).

Resistències als anàlegs als nucleòsids i nucleòtid La pèrdua de susceptibilitat als ITIAN s’associa fonamentalment a l’aparició de mutacions al gen de la TI, encara que hi ha factors intracell. ulars, com la disminució de l’expressió de timidina-cinases cell. ulars, que podrien influir en els nivells de fosforilació dels ITIAN i, per tant, en la disminució de sensibilitat (Hoever et al., 2003). Les mutacions de resistència al gen TI poden alterar les propietats de l’enzim i reduir l’activitat dels inhibidors per dos mecanismes: a) eliminant l’anàleg incorporat a la cadena de DNA mitjançant un procés de pirofosfòlisi —durant aquest procés cal un donador de fosfats, que sol ser l’ATP o el pirofosfat (PP i) (Meyer et al., 1999; Boyer et al., 2002)— i b) produint canvis conformacionals al centre catalític de la TI que no permetrien la incorporació de l’anàleg a la cadena (Huang et al., 1998). Les mutacions de resistència als ITIAN han estat les més estudiades. Les més comunes es troben en l’anomenat complex de mutacions NAM, constituït per les mutacions M41L, E44D, D67N, K70R, V118I, L210W, T215YF i K219QE, que apareixen de manera seqüencial. Encara que inicialment van ser associades a la resistència de la ZDV, posteriorment també s’han associat a la pèrdua de sensibilitat al D4T i als ITIAN en general, amb l’excepció del 3TC (de cinc a quatre vegades al D4T i a l’ABC i de dues a tres vegades al DDI i al DDC) (Larder et al., 1989, 1991; Gao et al., 1994a; Mouroux et al., 2001; Ross et al., 2001; Margot et al., 2002; Becher et al., 2003). L’acumulació d’aquestes mutacions eleva el nivell de resistèn-

cia. Aquest fenomen és anomenat barrera genètica de resistència alta. La seva presència podria afavorir el mecanisme d’eliminació de l’anàleg incorporat a la cadena (Naeger et al., 2002). Altres mutacions com la M184V, la L74V i la K65R solen aparèixer durant els tractaments que contenen algun dels següents inhibidors: 3TC, DDI, ABC, TNF o FTC (Gao et al., 1993; Lee et al., 2001; Tisdale et al., 1997; Margot et al., 2002; Schooley et al., 2002). Aquestes mutacions es denominen barrera genètica de resistència baixa perquè la seva sola presència pot disminuir el nivell de sensibilitat, el qual varia en funció de l’inhibidor. Les mutacions de resistència específiques per al D4T són més difícils de catalogar, tot i que alguns estudis in vitro associen la presència de les mutacions V75T o K65R amb la disminució de la sensibilitat a aquest inhibidor (Lacey i Larder, 1994; Garcia Lerma et al., 2003). El mecanisme d’acció utilitzat per aquestes mutacions seria evitar la incorporació de l’inhibidor a la cadena. Finalment, en alguns virus aïllats de pacients tractats amb ITIAN s’ha detectat la presència de mutacions com la Q151M, i la inserció T69S-S/ins, catalogades com a mutacions de multiresistència a tots els ITIAN, encara que la prevalença d’aquestes mutacions de multiresistència és molt baixa (Shafer et al., 1994; Shirasaka et al., 1995; Jong et al., 1999; Vaerenbergh et al., 2000).

Resistències als no anàlegs dels nucleòsids Tot i la seva elevada eficàcia, sorprèn la facilitat amb la qual el virus escapa de l’acció d’aquest tipus d’inhibidors mitjançant la generació de mutacions de resistència entre els codons 100-110, 180-190 i 225-236, que eviten la unió de l’inhibidor a la RT. La presència d’una sola mutació pot reduir l’eficàcia de l’inhibidor. Les mutacions de resistència als ITINAN més freqüents són L100I, K103N, V106A, V108I, Y181C/I, Y188CL, G190A/E/S, p225H i P236L (Bacheler et al., 2000). Les mu-

AGENTS ANTIRETROVIRALS CONTRA EL VIH

tacions K103N i Y188L han estat descrites com a mutacions de multiresistència, ja que la seva presència redueix considerablement l’eficàcia dels ITINAN.

Resistències als inhibidors de les proteases La resistència als inhibidors a la proteasa es deu fonamentalment a mutacions produïdes de l’enzim que no permeten la correcta unió a l’inhibidor i tenen com a conseqüència una pèrdua de l’eficiència de l’enzim, que se sol compensar amb l’aparició de mutacions acompanyants als residus 10, 20, 36, 71 i 77, en què la seva funció és paliar aquesta disminució d’activitat (Chen et al., 1995; Muzammil et al., 2003). Les mutacions de resistència més comunes són V82A/I84V, situades al centre actiu (IDV, RTV) i D30N (NFV), M46I/I54V a la regió d’encavalcament i en L10I/L90M a la regió de dimerització (SQV). Es diu que els IP tenen una barrera genètica de resistència alta, ja que per si sols tenen poc impacte en la resistència i necessiten l’acumulació de mutacions per elevar el nivell de resistència, que augmenta, ja que es produeix un efecte de cooperativitat entre mutacions (Wu et al., 2003; Ohtaka et al., 2003). En el cas de l’APV i l’LPV ens cal una acumulació de mutacions de resistència. Alguns estudis indiquen que la presència de mutacions a les dianes de tall situades a la poliproteïna precursora poden incrementar el nivell de resistència.

Resistències a l’inhibidor de l’entrada: T-20 Diversos estudis realitzats in vitro i in vivo localitzen la presència de mutacions de resistència al T-20 a la regió compresa entre els residus 36 i 45 del domini HR1. Les mutacions més comunes són G36D/S, I37V, V38A/M, Q39R, N42T i N43D (Rimsky et al., 1998; Wei et al., 2002).

183

LIMITACIONS DEL TRACTAMENT ANTIRETROVIRAL La disponibilitat d’antiretrovirals d’ampli espectre d’acció ha suposat un clar avanç en el tractament de la infecció per VIH, i ha permès el control de la virèmia i la recuperació del sistema immunitari en la majoria dels pacients tractats i, com a conseqüència, la prolongació de l’esperança de vida. Tanmateix, tot i controlar la virèmia fins a nivells indetectables, no s’ha aconseguit eradicar el virus definitivament, i s’ha convertit en una infecció crònica, en què el control necessita tractament antiretroviral per sempre. En moltes ocasions, aquesta dependència del tractament per vida i la toxicitat que presenten els antiretrovirals, en general a mig i llarg termini, pot derivar en problemes d’adherència (no compliment del tractament), que pot ser total, la qual cosa deriva a una falta de resposta; o bé pot ser parcial, cosa que afavoreix l’aparició de mutacions de resistència i de resistència creuada a diversos inhibidors, amb l’augment de la complexitat relativa en l’elecció d’un tractament eficaç, sobretot en règims de rescat (Hirsch et al., 2003; Yeni et al., 2004). BIBLIOGRAFIA Bacheler; L. T.; Anton, E. D.; Kudish, P.; Baker, D.; Bunville, J.; Krakowski, K.; Bolling, L.; Aujay, M.; Wang, X. V.; Ellis, D.; Becker, M. F.; Lasut, A. L.; George, H. J.; Spalding, D. R.; Hollis, G.; Abremski, K. (2000). «Human immunodeficiency virus type 1 mutations selected in patients failing efavirenz combination therapy». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 44, pàg. 24752484. Becher, F.; Pruvost, A. G.; Schlemmer, D. D.; Creminon, C. A.; Goujard, C. M.; Delfraissy, J. F.; Benech, H. C.; Grassi, J. J. (2003). «Significant levels of intracellular stavudine triphosphate are found in HIV-infected zidovudine-treated patients». AIDS, vol. 17, pàg. 555-561. Boyer, P. L.; Sarafianos, S. G.; Arnold, E.; Hughes, S. H. (2002). «Nucleoside analog resistance caused by insertions in the fingers of human immunodeficiency virus

184

C. GIL I J. M. GATELL

type 1 reverse transcriptase involves ATP-mediated excision». J. Virol., vol. 76, pàg. 9143-9151. Chen, Z.; Li, Y.; Schock, H. B.; Hall, D.; Chen, E.; Kuo, L. C. (1995). «Three-dimensional structure of a mutant HIV-1 protease displaying cross-resistance to all protease inhibitors in clinical trials». J. Biol. Chem., vol. 270, pàg. 21433-21436. Clercq, E. de (2004). «Antiviral drugs in current clinical use». J. Clin. Virol., vol. 30, pàg. 115-133. Coffin, J. M. (1995). «HIV population dynamics in vivo: implications for genetic variation; pathogenesis, and therapy». Science, vol. 267, pàg. 483-489. Descamps, D.; Collin, G.; Letourneur, F.; Apetrei, C.; Damond, F.; Loussert-Ajaka, I.; Simon, F.; Saragosti, S.; Brun-Vezinet, F. (1997). «Susceptibility of human immunodeficiency virus type 1 group O isolates to antiretroviral agents: in vitro phenotypic and genotypic analyses». J. Virol., vol. 71, pàg. 8893-8898. Erickson, J.; Kempf, D. (1994). «Structure-based design of symmetric inhibitors of HIV-1 protease». Arch. Virol. Suppl., vol. 9, pàg. 19-29. Esnouf, R. M.; Ren, J.; Hopkins, A. L.; Ross, C. K.; Jones, E. Y.; Stammers, D. K.; Stuart, D. I. (1997). «Unique features in the structure of the complex between HIV1 reverse transcriptase and the bis(heteroaryl)piperazine (BHAP) U-90152 explain resistance mutations for this nonnucleoside inhibitor.» Proc. Nat. Acad. Sci. USA, vol. 94, pàg. 3984-3989. Flexner, C. (1998). «HIV-protease inhibitors». N. Engl. J. Med., vol. 338, pàg. 1281-1292. Gao, Q.; Gu, Z.; Parniak, M. A.; Cameron, J.; Cammack, N.; Boucher, C.; Wainberg, M. A. (1993). «The same mutation that encodes low-level human immunodeficiency virus type 1 resistance to 2 ,3 -dideoxyinosine and 2 ,3 -dideoxycytidine confers high-level resistance to the (-) enantiomer of 2 ,3 -dideoxy-3 -thiacytidine». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 37, pàg. 1390-1392. Gao, Q; Gu, Z.; Salomon, H.; Nagai, K.; Parniak, M. A.; Wainberg, M. A. (1994a). «Generation of multiple drug resistance by sequential in vitro passage of the human immunodeficiency virus type 1». Arch. Virol., vol. 136, pàg. 111-122. Gao, W. Y.; Agbaria, R.; Driscoll, J. S.; Mitsuya, H. (1994b). «Divergent anti-human immunodeficiency virus activity and anabolic phosphorylation of 2 ,3 dideoxynucleoside analogs in resting and activated human cells». J. Biol. Chem., vol. 269, pàg. 12633-12638. García-Lerma, J. G.; Macinnes, H.; Bennett, D.; Reid, P.; Nidtha, S.; Weinstock, H.; Kaplan, J. E.; Heneine, W. (2003). «A novel genetic pathway of human immunodeficiency virus type 1 resistance to stavudine mediated by the K65R mutation». J. Virol., vol. 77, pàg. 5685-5693. Gulick, R. M.; Mellors, J. W.; Havlir, D.; Eron, J. J.; Gonzalez, C.; McMahon, D.; Richman, D. D.; Valentine, F. T.; Jonas, L.; Meibohm, A.; Emini, E. A.; Chodakewitz, J. A. (1997). «Treatment with indinavir, zidovudine, and lamivudine in adults with

human immunodeficiency virus infection and prior antiretroviral therapy». N. Engl. J. Med., vol. 337, pàg. 734739. Havlir, D. V.; Drichman, D. (1996). «Viral dynamics of HIV: implications for drug development and therapeutic strategies». Ann. Intern. Med., vol. 124, pàg. 984-994. Hirsch, M. S.; Brun-Vezinet, F.; Clotet, B.; Conway, B.; Kuritzkes, D. R.; D’Aquila, R. T.; Demeter, L. M.; Hammer, S. M.; Johnson, V. A.; Loveday, C.; Mellors, J. W.; Jacobsen, D. M.; Richman, D. D. (2003). «Antiretroviral drug resistance testing in adults infected with human immunodeficiency virus type 1: recommendations of an International AIDS Society-USA Panel». Clin. Infect. Dis., vol. 37, pàg. 113-128. Hoever, G.; Groeschel, B.; Chandra, P.; Doerr, H. W.; Cinatl, J. (2003). «The mechanism of 3 -azido-2 ,3 dideoxythymidine resistance to human lymphoid cells». Int. J. Mol. Med., vol. 11, pàg. 743-747. Hsiou, Y.; Ding, J.; Das, K.; Clark Jr., A. D.; Boyer, P. L.; Lewi, P.; Janssen, P. A.; Kleim, J. P.; Rosner, M.; Hughes, S. H.; Arnold, E. (2001). «The Lys103Asn mutation of HIV-1 RT: a novel mechanism of drug resistance». J. Mol. Biol., vol. 309, pàg. 437-445. Huang, H.; Chopra, R.; Verdine, G. L.; Harrison, S. C. (1998). «Structure of a covalently trapped catalytic complex of HIV-1 reverse transcriptase: implications for drug resistance». Science, vol. 282, pàg. 1669-1675. Jong, J. J. de; Goudsmit, J.; Lukashov, V. V.; Hillebrand, M. E.; Baan, E.; Huismans, R.; Danner, S. A.; Veen, J. H. ten; Wolf, F. de; Jurriaans, S. (1999). «Insertion of two amino acids combined with changes in reverse transcriptase containing tyrosine-215 of HIV1 resistant to multiple nucleoside analogs». AIDS, vol. 13, pàg. 75-80. Kewn, S.; Veal, G. J.; Hoggard, P. G.; Barry, M. G.; Back, D. J. (1997). «Lamivudine (3TC) phosphorylation and drug interactions in vitro». Biochem. Pharmacol., vol. 54, pàg. 589-595. Kohlstaedt, L. A.; Wang, J.; Friedman, J. M.; Rice, P. A.; Steitz, T. A. (1992). «Crystal structure at 3.5 Å resolution of HIV-1 reverse transcriptase complexed with an inhibitor». Science, vol. 256, pàg. 1783-1790. Lacey, S. F.; Larder, B. A. (1994). «Novel mutation (V75T) in human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase confers resistance to 2 -didehydro-2 ,3 dideoxythymidine in cell culture». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 38, pàg. 1428-1432. Larder, B. A.; Coates, K. E.; Kemp, S. D. (1991). «Zidovudine-resistant human immunodeficiency virus selected by passage in cell culture». J. Virol., vol. 65, pàg. 5232-5236. Larder, B. A.; Kemp, S. D. (1989). «Multiple mutations in HIV-1 reverse transcriptase confer high-level resistance to zidovudine (AZT)». Science, vol. 246, pàg. 1155-1158. Lee, K.; Chong, Y.; Chu, C. K. (2001). «Understanding the mode of action of L-nucleosides as antiviral agents: a molecular modeling approach». Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids, vol. 20, pàg. 385-388.

AGENTS ANTIRETROVIRALS CONTRA EL VIH

Margot, N. A.; Isaacson, E.; McGowan, I.; Cheng, A. K.; Schooley, R. T.; Miller, M. D. (2002). «Genotypic and phenotypic analyses of HIV-1 in antiretroviral-experienced patients treated with tenofovir DF». AIDS, vol. 16, pàg. 1227-1235. Martínez-Picado, J.; DePasquale, M. P.; Kartsonis, N.; Hanna, G. J.; Wong, J.; Finzi, D.; Rosenberg, E.; Gunthard, H. F.; Sutton, L.; Savara, A.; Petropoulos, C. J.; Hellmann, N.; Walker, B. D.; Richman, D. D.; Siliciano, R.; D’Aquila, R. T. (2000). «Antiretroviral resistance during successful therapy of HIV type 1 infection». Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 97, pàg. 1094810953. Menéndez-Arias, L.; Martínez, M. A.; Quinones-Mateu, M. E.; Martínez-Picado, J. (2003). «Fitness variations and their impact on the evolution of antiretroviral drug resistance». Curr. Drug. Targets. Infect. Disord., vol. 3, pàg. 355-371. Meyer, P. R.; Matsuura, S. E.; Mian, A. M.; So, A. G.; Scott, W. A. (1999). «A mechanism of AZT resistance: an increase in nucleotide-dependent primer unblocking by mutant HIV-1 reverse transcriptase». Mol. Cell., vol. 4, pàg. 35-43. Mouroux, M.; Descamps, D.; Izopet, J.; Yvon, A.; Delaugerre, C.; Matheron, S.; Coutellier, A.; Valantin, M. A.; Bonmarchand, M.; Agut, H.; Massip, P.; Costagliola, D.; Katlama, C.; Brun-Vezinet, F.; Calvez, V. (2001). «Low-rate emergence of thymidine analogue mutations and multi-drug resistance mutations in the HIV-1 reverse transcriptase gene in therapy-naive patients receiving stavudine plus lamivudine combination therapy». Antivir. Ther., vol. 6, pàg. 179-183. Moyle, G. (2002). «Overcoming obstacles to the success of protease inhibitors in highly active antiretroviral therapy regimens». AIDS Patient Care STDS, vol. 16, pàg. 585-597. Muzammil, S.; Ross, P.; Freire, E. (2003). «A major role for a set of non-active site mutations in the development of HIV-1 protease drug resistance». Biochemistry, vol. 42, pàg. 631-638. Naeger, L. K.; Margot, N. A.; Miller, M. D. (2002). «ATP-dependent removal of nucleoside reverse transcriptase inhibitors by human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 46. pàg. 2179-2184. Najera, I.; Holguin, A.; Quinones-Mateu, M. E.; Muñoz-Fernandez, M. A.; Najera, R.; Lopez-Galindez, C.; Domingo, E. (1995). «Pol gene quasispecies of human immunodeficiency virus: mutations associated with drug resistance in virus from patients undergoing no drug therapy». J. Virol., vol. 69, pàg. 23-31. Navia, M. A.; Fitzgerald, P. M.; McKeever, B. M.; Leu, C. T.; Heimbach, J. C.; Herber, W. K.; Sigal, I. S.; Darke, P. L.; Springer, J. P. (1989). «Three-dimensional structure of aspartyl protease from human immunodeficiency virus HIV-1». Nature, vol. 337, pàg. 615-620. Ohtaka, H.; Schon, A.; Freire, E. (2003). «Multidrug resistance to HIV-1 protease inhibition requires cooperative

185

coupling between distal mutations». Biochemistry, vol. 42, pàg. 13659-13666. Palella Jr., F. J.; Delaney, K. M.; Moorman, A. C.; Loveless, M. O.; Fuhrer, J.; Satten, G. A.; Aschman, D. J.; Holmberg, S. D. (1998). «Declining morbidity and mortality among patients with advanced human immunodeficiency virus infection. HIV Outpatient Study Investigators». N. Engl. J. Med., vol. 338, pàg. 853-860. Ren, J.; Bird, L. E.; Chamberlain, P. P.; StewartJones, G. B.; Stuart, D. I.; Stammers, D. K. (2002). «Structure of HIV-2 reverse transcriptase at 2.35-Å resolution and the mechanism of resistance to non-nucleoside inhibitors». Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 99, pàg. 1441014415. Rimsky, L. T.; Shugars, D. C.; Matthews, T. J. (1998). «Determinants of human immunodeficiency virus type 1 resistance to gp41-derived inhibitory peptides». J. Virol., vol. 72, pàg. 986-993. Ross, L.; Henry, K.; Paar, D.; Salvato, P.; Shaefer, M.; Fisher, R.; Liao, Q.; St Clair, M. (2001). «Thymidine-analog and multi-nucleoside resistance mutations are observed in both zidovudine-naive and zidovudineexperienced subjects with viremia after treatment with stavudine-containing regimens». J. Hum. Virol., vol. 4, pàg. 217-222. Schooley, R. T; Ruane, P.; Myers, R. A.; Beall, G.; Lampiris, H.; Berger, D.; Chen, S. S.; Miller, M. D.; Isaacson, E.; Cheng, A. K.; Study 902 Team (2002). «Tenofovir DF in antiretroviral-experienced patients: results from a 48-week, randomized, double-blind study». AIDS, vol. 16, pàg. 1257-1263. Shafer, R. W.; Kozal, M. J.; Winters, M. A.; Iversen, A. K.; Katzenstein, D. A.; Ragni, M. V.; Meyer 3rd, W. A.; Gupta, P.; Rasheed, S.; Coombs, R. (1994). «Combination therapy with zidovudine and didanosine selects for drug-resistant human immunodeficiency virus type 1 strains with unique patterns of pol gene mutations». J. Infect. Dis., vol. 169, pàg. 722-729. Shirasaka, T.; Kavlick, M. F.; Ueno, T.; Ygao, W.; Kojima, E.; Alcaide, M. L.; Chokekijchai, S.; Roy, B. M.; Arnold, E.; Yarchoan, R. (1995). «Emergence of human immunodeficiency virus type 1 variants with resistance to multiple dideoxynucleosides in patients receiving therapy with dideoxynucleosides». Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 92, pàg. 2398-2402. Shulman, N.; Zolopa, A. R.; Passaro, D.; Shafer, R. W.; Huang, W.; Katzenstein, D.; Israelski, D. M.; Hellmann, N.; Petropoulos, C.; Whitcomb, J. (2001). «Phenotypic hypersusceptibility to non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors in treatment-experienced HIV-infected patients: impact on virological response to efavirenz-based therapy». AIDS, vol. 15, pàg. 1125-1132. Spence, R. A.; Kati, W. M.; Anderson, K. S.; Johnson, K. A. (1995). «Mechanism of inhibition of HIV-1 reverse transcriptase by nonnucleoside inhibitors». Science, vol. 267, pàg. 988-993. Tisdale, M.; Alnadaf, T.; Cousens, D. (1997). «Combi-

186

C. GIL I J. M. GATELL

nation of mutations in human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase required for resistance to the carbocyclic nucleoside 1592U89». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 41, pàg. 1094-1098. Turriziani, O.; Antonelli, G.; Dianzani, F. (2000). «Cellular factors involved in the induction of resistance of HIV to antiretroviral agents». Int. J. Antimicrob. Agents., vol. 16, pàg. 353-356. Turriziani, O.; Scognolari, C.; Bambacioni, F.; Bellomi, F.; Focher, F.; Gentile, M.; Antonelli, G. (2002). «Selection of a T-cell line resistant to stavudine and zidovudine by prolonged treatment with stavudine». Antivir. Ther., vol. 7, pàg. 105-111. Vaerenbergh, K. van; Laethem, K. van; Albert, J.; Boucher, C. A. [et al.] (2000). «Prevalence and characteristics of multinucleoside-resistant human immunodeficiency virus type 1 among European patients receiving combinations of nucleoside analogues». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 44, pàg. 2109-2117. Wei, X.; Decker, J. M.; Liu, H.; Zhang, Z.; Arani, R. B.; Kilby, J. M.; Saag, M. S.; Wu, X.; Shaw, G. M.; Kappes, J. C. (2002). «Emergence of resistant human immunodeficiency virus type 1 in patients receiving fusion inhibitor (T-20) monotherapy». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 46, pàg. 1896-1905. Whitcomb, J. M.; Huang, W.; Limoli, K.; Paxinos, E.; Wrin, T.; Skowron, G.; Deeks, S. G.; Bates, M.; Hellmann, N. S.; Petropoulos, C. J. (2002). «Hypersuscep-

tibility to non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors in HIV-1: clinical, phenotypic and genotypic correlates». AIDS, vol. 16, pàg. F41-F47. Wild, C. T.; Shugars, D. C.; Greenwell, T. K.; McDanal, C. B.; Matthews, T. J. (1994). «Peptides corresponding to a predictive alpha-helical domain of human immunodeficiency virus type 1 gp41 are potent inhibitors of virus infection». Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 91, pàg. 9770-9774. Wong, J. K.; Hezareh, M.; Gunthard, H. F.; Havlir, D. V.; Ignacio, C. C.; Spina, C. A.; Richman, D. D. (1997). «Recovery of replication-competent HIV despite prolonged suppression of plasma viremia». Science, vol. 278, pàg. 1291-1295. Wu, T. D.; Schiffer, C. A.; Gonzales, M. J.; Taylor, J.; Kantor, R.; Chou, S.; Israelski, D.; Zolopa, A. R.; Fessel, W. J.; Shafer, R. W. (2003). «Mutation patterns and structural correlates in human immunodeficiency virus type 1 protease following different protease inhibitor treatments». J. Virol., vol. 77, pàg. 4836-4847. Yeni, P. G.; Hammer, S. M.; Hirsch, M. S.; Saag, M. S.; Schechter, M.; Carpenter, C. C.; Fischl, M. A.; Gatell, J. M.; Gazzard, B. G.; Jacobsen, D. M.; Katzenstein, D. A.; Montaner, J. S.; Richman, D. D.; Schooley, R. T.; Thompson, M. A.; Vella, S.; Volberding, P. A. (2004). «Treatment for adult HIV infection: 2004 recommendations of the International AIDS SocietyUSA Panel». JAMA, vol. 292, pàg. 251-265.

Antimicrobians (Joaquim Ruiz, ed.) Treballs de la SCB. Vol. 55 (2004) 187-195

MECANISMES D’ACCIÓ DELS ANTIFÚNGICS I RESISTÈNCIA EN LLEVATS Josep M. Torres-Rodríguez, Yolanda Morera i Eidi Alvarado Unitat de Recerca en Micologia Experimental i Clínica, Institut Municipal d’Investigació Mèdica, IMAS, Universitat Autònoma de Barcelona. Adreça per a la correspondència: Josep M. Torres. Unitat de Recerca en Micologia Experimental i Clínica, Institut Municipal d’Investigació Mèdica, IMAS, Universitat Autònoma de Barcelona. Dr. Aiguader, 80. 08003 Barcelona. Adreça electrònica: jmtorres@imim.es. RESUM Si bé s’ha avançat en la síntesi de nous antifúngics i se’n coneix el mode d’acció, els mecanismes moleculars de resistència encara són insuficientment coneguts, i afecten principalment els llevats i els azoles. El fluconazole ha estat un dels antifúngics en els quals més s’ha aprofundit l’estudi de les resistències, i s’ha comprovat que aquestes poden ser degudes a mecanismes múltiples, entre els quals la major activitat dels transportadors o bombes d’eﬄux tenen un paper important, ja que expulsen a l’exterior l’antifúngic que ha penetrat a la cèll. ula. Les alteracions de la diana cell. ular i l’alteració de la via de síntesi de l’ergosterol present a la membrana també tenen un paper important. Els gens CDR1 i BEN-R estan implicats en aquests mecanismes de resistència. En altres antifúngics com l’amfotericina B i les equinocandines les resistències no semblen ser problemes clínics importants. Candida albicans pot presentar resistències secundàries a la 5fluorocitosina per pèrdua d’activitat enzimàtica i disminució de l’efecte del metabòlit actiu. La relació entre resistències i manca de resposta terapèutica ha estat demostrada en models animals i estudis clínics, tot i que la resposta al tractament antifúngic depèn en molts casos d’altres factors com l’estat immunitari del malalt, l’espècie fúngica causal, la farmacocinètica i la biodisponibilitat del fàrmac, entre d’altres. Paraules clau: antifúngics, resistència, sensibilitat in vitro, llevats. SUMMARY Most of our knowledge on antifungal resistance mechanisms is related to yeasts and azoles. Fluconazole is the most studied antifungal and several resistance mechanisms have been demonstrated. Efflux pump seems to be the most important, but cell-target changes and modifications in the ergosterol metabolic way are also relevant.

188

J. M. TORRES-RODRÍGUEZ, Y. MORERA I E. ALVARADO

CDR1 and BEN-R are two genes involved in those resistance mechanisms. Resistance is not a major clinical problem with amphotericin B and echinocandins, but Candida albicans can have secondary resistances to 5-fluorocitosyne when enzymatic activity is lost and the active metabolite is lacking. Relationship among antifungal resistance and therapeutic response has been shown in experimental animal models and in clinical studies, but response to the treatment is also related to immunological status of the patient as well to the fungal species, and pharmacological aspects of the drug. Keywords: antifungal agents, resistance, in vitro susceptibility, yeast. INTRODUCCIÓ En les darreres dues dècades s’han produït els avenços més importants pel que fa al desenvolupament de nous antifúngics, fet que ha estat motivat en gran part per l’increment de les infeccions fúngiques sistèmiques greus com a conseqüència de l’existència d’importants grups de risc, principalment els malalts immunosuprimits i els ingressats en unitats de vigilància intensiva, que són particularment susceptibles de contraure infeccions fúngiques oportunistes (Petri et al., 1997; Sandven, 2000). Els llevats del gènere Candida són els agents etiològics més freqüents d’aquestes infeccions o micosis, seguits a distància de floridures com Aspergillus, diferents zigomicets (Rhizopus, Absidia, Rhizomucor) i altres espècies que, si bé són excepcionals, comporten un pèssim pronòstic per al malalt infectat, a causa de la seva resistència primària a pràcticament tots els antifúngics disponibles; entre aquests es troba Scedosporium proliﬁcans, Fusarium sp. i d’altres (Guarro i Gené, 1995; Idigoras et al., 2001). Entre els llevats, C. albicans ocupa el primer lloc com a agent d’infeccions invasores i candidèmies, tot i que en alguns estudis o en grups particulars de malalts C. parapsilosis, C. tropicalis o C. glabrata l’han reemplaçada. En tot cas, l’increment de candidosis per espècies diferents de C. albicans sembla ser una constant i aquest fet determina que algunes, com C. krusei o C. lusitaniae, siguin resistents

de manera intrínseca a antifúngics de primera magnitud, com ara els triazòlics o l’amfotericina B, respectivament. L’aparició i expansió de les infeccions pel virus de la immunodeficiència humana (VIH), que al nostre país va tenir la seva màxima expressió des de finals dels anys vuitanta fins a mitjan dècada dels noranta, va portar a una inusual freqüència de candidosis mucoses (orofaríngia, esofàgica, vaginal) com a resultat de la davallada dels limfòcits CD4. Aquestes infeccions van conduir a l’administració, de manera mai vista fins aleshores, d’antifúngics sistèmics i, principalment, del fluconazole (FNZ), triazole de primera generació. L’ús generalitzat i a vegades poc controlat d’aquest antifúngic va portar que apareguessin els primers fracassos terapèutics i es van trobar soques de C. albicans resistents a l’FNZ, la majoria de les vegades compartides també per l’itraconazole (ITZ), l’altre triazòlic de primera generació. Aquests fets, la comprovació de l’existència d’espècies de Candida intrínsecament resistents als triazòlics (C. krusei) i l’adquisició de resistències a aquests antifúngics (C. albicans, C. glabrata) van comportar les següents situacions: a) El desenvolupament de tècniques estandarditzades per estudiar la sensibilitat in vitro als antifúngics. b) La recerca per conèixer els mecanismes moleculars de les resistències. c) La síntesi de nous antifúngics més actius o amb dianes diferents. En la present revisió s’analitzen els coneixe-

MECANISMES D’ACCIÓ DELS ANTIFÚNGICS I RESISTÈNCIA EN LLEVATS

ments actuals sobre els mecanismes de resistència dels llevats als antifúngics i, principalment, als triazoles. ANTIFÚNGICS DISPONIBLES EN CLÍNICA HUMANA I MECANISME D’ACCIÓ A la taula 1 es presenten els antifúngics utilitzats en clínica humana per al tractament de micosis sistèmiques. L’amfotericina B (AMB) forma part dels grups dels antifúngics poliènics que inhibeixen la síntesi de l’ergosterol. Aquest antifúngic i els seus derivats lipídics són força utilitzats en les micosis sistèmiques greus, a causa de la seva gran activitat, l’efecte fungicida i l’ampli espectre d’acció. En llevats s’ha registrat un molt baix nombre de resistències, excepte en espècies de Candida poc freqüents, com C. lusitaniae, C. norvergensis o C. guilliermondii. L’elevada incidència d’efectes tòxics de l’AMB-desoxicolat o l’alt preu de les AMB associades a lípids fan que el seu ús no sigui tan generalitzat. Els triazòlics i, principalment, el fluconazole, han estat els més utilitzats, per la seva eficàcia i bona tolerància, però l’efecte fungistàtic i l’aparició de resistències han portat al desenvolupament dels anomenats triazoles de segona generació, entre els quals fins ara només s’ha comercialitzat el voriconazole (VCZ), en el qual s’ha incrementat l’espectre d’activitat i s’han reduït les resistències, si bé no s’han eliminat per complet (Kauffman i Zarins, 1998). En els darrers temps, la caspofungina, com a primer representant de les equinocandines, s’ha incorporat a la terapèutica antifúngica. Aquest fàrmac aporta un nou mecanisme d’acció, el més específic dels coneguts fins ara, ja que actua sobre la paret de la cèll. ula fúngica. La caspofungina és activa sobre soques de Candida resistents a altres antifúngics, però no sobre Cryptococcus neoformans. No es coneixen

189

fins al moment resistències adquirides de llevats a aquest antifúngic (Marco et al., 1998). Altres antifúngics com la 5-fluorocitosina (5-FC) tenen un ús molt més reduït, i es consideren d’associació amb l’AMB en la criptococcosi meníngia. La 5-FC, que actua sobre la síntesi del DNA del fong i ocasiona un efecte fungistàtic, presenta com a principal inconvenient el desenvolupament de resistències secundàries en C. albicans (Pfaller et al., 2002). A la figura 1 es mostren esquemàticament els diferents llocs d’acció dels antifúngics comentats. MECANISME D’ACCIÓ DELS TRIAZOLES El miconazole per via intravenosa i el ketoconazole per via oral van ser els primers antifúngics azoles a utilitzar-se en teràpia humana. Aquests imidazoles tenen un limitat espectre i escassa biodisponibilitat. Per la freqüència i importància dels efectes secundaris, es van deixar d’utilitzar (miconazole) o es va restringir a indicacions molt específiques. Amb l’aparició dels triazoles (fluconazole, itraconazole i voriconazole) se’n va ampliar l’espectre, i amb el mateix mecanisme d’acció es van poder reduir els efectes secundaris. Actualment es disposa de nous triazoles en fases de desenvolupament, com són el posaconazole, el ravuconazole i l’albaconazole. El voriconazole és el darrer triazole comercialitzat al nostre país. Comparteix característiques farmacocinètiques amb el fluconazole i l’itraconazole, i és més actiu que el primer, ja que inclou espècies que són resistents a l’FNZ, com C. glabrata o C. krusei, si bé les concentracions inhibitòries mínimes (CIM) són superiors que amb C. albicans. També és actiu enfront de Cryptococcus, Trichosporon i sobre alguns fongs miceliars com Aspergillus fumigatus. El mecanisme d’acció dels triazoles és el bloqueig de l’enzim 14α-desmetilasa. Aquesta inhibició es produeix en formar-se un com-

190

J. M. TORRES-RODRÍGUEZ, Y. MORERA I E. ALVARADO

Taula 1. Antifúngics disponibles a l’Estat espanyol per al tractament de les micosis sistèmiques produïdes per llevats Grup antifúngic

Fàrmac

Poliens

Amfotericina B

Pirimidines fluorades

5-fluorocitosina

Azoles

Fluconazole

Itraconazole Voriconazole Equinocandines

Caspofungina a

a Sense acció sobre Cryptococcus neoformans.

plex entre el triazole i part del citocrom P-450 del fong, que impedeix el pas del lanosterol a l’ergosterol, component fonamental de la membrana citoplasmàtica de la cèll. ula fúngica. L’alteració de la permeabilitat de la membrana i el cúmul de peròxids no solament aturen la reproducció, sinó que produeixen un dany cell. ular que la fa més susceptible al sistema fagocític i immunitari de l’hoste. Segons el grau d’especificitat de l’antifúngic pel citocrom P-450, que també es troba present a les cèll. ules dels mamífers, hi haurà més o menys efectes adversos en els pacients que rebin la medicació. RESISTÈNCIA ALS AZOLES En els antifúngics azoles, els mecanismes de resistència clínica poden ser deguts a: a) La resistència intrínseca de la soca. b) El desplaçament de soques sensibles per altres de resistents, sigui de la mateixa espècie o d’espècies diferents. c) Les resistències adquirides durant el tractament. Les resistències als azoles són degudes a alteracions genètiques o a l’expressió temporal de gens de resistència.

Figura 1. Representació esquemàtica dels llocs d’acció dels principals antifúngics d’administració sistèmica sobre Candida sp.

MECANISMES MOLECULARS DE LA RESISTÈNCIA ALS AZOLES En els llevats, i principalment en Candida, fins ara s’han descrit els següents mecanismes de resistència als azoles: a) Major activitat per increment de les bombes transportadores d’eﬄux de l’antifúngic. b) Resistència als azoles per alteracions de la diana cell. ular. c) Mecanisme de resistència als azoles a causa d’alteracions en la ruta de la biosíntesi de l’ergosterol. d) Combinació de mecanismes de resistència. MAJOR ACTIVITAT PER INCREMENT DE LES BOMBES TRANSPORTADORES D’EFFLUX DE L’ANTIFÚNGIC Els dos transportadors implicats són els anomenats transportadors ABC (ATP-binding cassette) o eﬄux multidrug i el de la classe MF o transportadors MFS (major facilitator superfamily). El gen principal del transportador ABC és el CDR1 i el de l’MF correspon al BEN-R, també anomenat MDR1 (vegeu la figura 2). En les soques de llevats resistents hi ha

MECANISMES D’ACCIÓ DELS ANTIFÚNGICS I RESISTÈNCIA EN LLEVATS

Figura 2. Bombes transportadores d’efflux. Els gens principals dels transportadors ABC són el grup CDR, i els dels transportadors MSF són del grup MDR.

una sobreexpressió dels gens que codifiquen aquests grups de transportadors. Els transportadors ABC són una superfamília de proteïnes que es troben formant porus a la membrana de la cèll. ula fúngica i que posseeixen dos dominis citoplasmàtics (vegeu la figura 2). Aquestes proteïnes requereixen ATP perquè es produeixi el transport de substrats mitjançant bombeig a través d’una seqüència específica d’aminoàcids (coneguda com a binding cassette) (Ghannoum i Rice, 1999). S’ha descrit que aquestes bombes realitzen el transport de múltiples components, incloenthi diversos tipus d’azoles cap a l’espai extracell. ular. Fins ara, es coneixen diversos gens que codifiquen el sistema de transport ABC, obtinguts de Candida (Prasad et al., 1995). Dintre d’aquests s’ha demostrat que la sobreexpressió dels gens CDR1 té un paper important en el desenvolupament de la resistència (Ramage et al., 2002). S’ha observat en C. albicans, C. glabrata, C. dubliniensis i, recentment, en Cryptococcus neoformans, la presència del gen CDR1, que codifica proteïnes transportadores ABC i confereix resistència al fluconazole, amb gran semblança amb l’estructura de la Pglicoproteïna humana. Funciona com a bomba multidroga i està associada amb resistència a diversos agents quimioterapèutics (Ghannoum i Rice, 1999). Walsh et al. (1996) van observar que C. albicans podria tenir un o més gens diferents del CDR1, que també codificari-

191

en les proteïnes ABC, i fins ara se n’han descrit almenys cinc (CDR1-CDR5) que podrien estar relacionats amb el desenvolupament de la resistència als azoles. Els transportadors MFS són un grup de proteïnes que també formen porus a la membrana de la cèll. ula fúngica (vegeu la figura 2) i estan codificades per diversos gens. Fins ara l’MDR1 (també anomenat BEN-R) és l’únic clonat que sembla ser clínicament important. Aquest transportador ha demostrat conferir resistència contra diversos productes com la cicloheximida. Pel que fa als triazoles, sembla ser específic per al fluconazole. Ambdós tipus de sistemes de transport són importants mecanismes de resistència contra els azoles, ja que s’ha observat que la inhibició de l’expressió dels gens CDR (transportadors ABC) i els gens MDR1 (transportadors MFS) confereix hipersensibilitat als azoles i a altres drogues i, al contrari, la seva sobreexpressió incrementa la resistència (White et al., 1998). En aïllats de C. albicans que presenten resistències creuades amb altres derivats azòlics, s’ha comprovat que hi havia una sobreexpressió del gen CDR2. Aquest important mecanisme consisteix a expulsar l’antifúngic de la cèll. ula fúngica al medi extracell. ular per acció de proteïnes de membrana o intracell. ulars que provoquen un bombeig actiu (o eﬄux) que produeix una disminució de la concentració intracell. ular de l’antifúngic. Parkinson et al. (1995), van comparar aïllaments de C. glabrata que abans del tractament amb fluconazole eren sensibles i després van resultar resistents, i van observar que la quantitat de fluconazole acumulat en les soques resistents era menor. La baixa concentració de l’azole a l’interior de la cèll. ula fúngica resistent era conseqüència de l’acció de bombes d’eﬄux, dependents d’energia. En C. glabrata s’ha descrit un altre mecanisme d’adquisició de resistència als azoles que consisteix en la pèrdua del DNA mitocondrial, si bé no és clar com es regulen els gens d’aquests transportadors.

192

J. M. TORRES-RODRÍGUEZ, Y. MORERA I E. ALVARADO

La resistència als azoles pot ser reversible (Marr et al., 1998) però en moltes ocasions es mantenen durant un gran nombre de generacions in vitro. Les modificacions en els transportadors poden produir resistències creuades amb altres antifúngics. Els substrats dels transportadors estan inclosos en els codificats pels gens CDR1 i CDR2 i fins ara s’han comprovat els següents: fluconazole, itraconazole, posaconazole, ravuconazole i també en altres antifúngics no azoles com la terbinafina i amorolfina. En canvi, en els codificats pel gen MDR1 el fluconazole és l’únic substrat conegut. L’amfotericina B i la 5fluorocitosina no actuarien de substrats per a aquests tipus de transportadors. RESISTÈNCIA ALS AZOLES PER ALTERACIONS . ULAR DE LA DIANA CELL En aquest mecanisme s’incrementa la producció de l’enzim 14α-desmetilasa, cosa que provoca que l’acció de l’azole sigui incompleta. S’ha observat que la sobreexpressió i amplificació del gen ERG11 produeix aquest efecte (White, 1997). La sobreexpressió del gen ERG11 ha estat descrita en diversos aïllaments clínics de C. albicans amb fenotip resistent (Sanglard et al., 1995). La importància que pugui tenir aquest tipus d’alteració genètica de l’ERG11 sobre el desenvolupament de resistència als azoles s’ha vist limitada, atès que en les investigacions realitzades s’ha observat que la sobreexpressió sempre ha estat acompanyada per altres alteracions, ja sigui la mutació R467K o la sobreexpressió de gens del sistema de bombes d’eﬄux. És necessari ampliar més els estudis sobre aquest tipus d’alteració per avaluar en quin grau contribueix al desenvolupament de la resistència. L’amplificació genètica és un altre tipus de mecanisme de resistència àmpliament utilitzat per les cèll. ules eucariotes. L’increment en

el nombre de còpies d’un gen (amplificació) usualment comporta un increment de la seva expressió. Existeixen dades contradictòries pel que fa a l’estreta relació que tenen la sobreexpressió del gen ERG11 i la seva amplificació. Sanglard et al. (1995) i White et al. (1998) suggereixen que la sobreexpressió del gen ERG11 en C. albicans no estaria associada amb la seva amplificació. En canvi, Marichal et al. (1997) van observar en aïllaments clínics de C. glabrata nivells elevats de la 14α-desmetilasa pressumptament relacionats amb una amplificació de l’ERG11. Les alteracions genètiques esmentades anteriorment signifiquen un important mecanisme de resistència en cèll. ules eucariotes i, pel que sembla, tenen un paper important en l’obtenció de cèll. ules resistents en C. albicans i probablement en altres fongs. MECANISME DE RESISTÈNCIA ALS AZOLES A CAUSA D’ALTERACIONS EN LA RUTA DE LA BIOSÍNTESI DE L’ERGOSTEROL Un mecanisme comú de resistència a les drogues és provocar canvis moleculars en els compostos que serveixen de diana o en aquells que hi estiguin relacionats. L’acció dels azoles és principalment sobre el citocrom P-450 (ERG11) i la 14α-desmetilasa (també anomenada 14-lanosterol-desmetilasa) els quals són molt importants en la síntesi de l’ergosterol. Ambdós elements poden sofrir mutacions que n’impedeixin el reconeixement per part dels azoles. S’han identificat almenys dues alteracions genètiques que modifiquen l’estructura del gen ERG11 de C. albicans: mutacions puntuals i conversió-recombinació mitòtica. En un estudi realitzat en C. albicans, es va observar la presència d’una mutació puntual a la posició 467 de l’estructura del gen ERG11. Un sol canvi d’arginina per lisina (R467K) va ser suficient per causar resistència als azoles, per

MECANISMES D’ACCIÓ DELS ANTIFÚNGICS I RESISTÈNCIA EN LLEVATS

la qual cosa sembla que aquesta substitució es va donar de manera espontània en resposta a la presència del fàrmac (White, 1997). No obstant això, és possible que tinguin lloc alteracions simultànies perquè es produeixi aquest fenomen. La manipulació genètica al laboratori ha permès produir modificacions en la seqüència del gen ERG11, com el cas observat per Lamb et al. (1997), que van provocar una mutació puntual en C. albicans amb el canvi de treonina per alanina en la posició 315 (T315A), que ocupa un lloc molt proper al lloc actiu de l’enzim. Això va disminuir l’afinitat de la 14α-desmetilasa pel fluconazole i va produir resistència. La conversió i la recombinació mitòtica del gen ERG11 també ha tingut lloc en les cèll. ules fúngiques, White et al. (1998) van observar la conversió dels dos all. els del gen ERG11 a una versió mutada, i va donar com a resultat un canvi molecular de la 14α-desmetilasa i resistència al fluconazole. CANVIS EN LA COMPOSICIÓ DE LA MEMBRANA Les interaccions entre els esterols i els fosfolípids presents al citoplasma afecten la fluïdesa i la asimetria de la membrana fúngica i, com a conseqüència, alteren el transport de productes a través d’aquesta. Hitchcock et al. (1987) van observar que la presència de grans quantitats de lípids a la membrana podrien alterar el pas del fluconazole a l’interior cellular i reemplaçar l’ergosterol per esterols metilats. COMBINACIÓ DE MECANISMES DE RESISTÈNCIA ALS AZOLES En llevats aïllats de pacients en tractament es pot anar observant l’increment en les CIM als azoles. Això indica que existeixen diferents mecanismes de resistència i que actuen de manera seqüencial, i explica que hi hagi

193

aïllaments amb valors molt elevats de resistència al fluconazole (> 64 μg/ml). Es donen a la vegada mecanismes de resistència per a les dues famílies de transportadors i alteracions en la diana d’alguns enzims. Hi ha una diversitat tan gran de mecanismes de resistència que existeixen multitud de patrons en les mutacions d’ERG11 i en l’expressió de les proteïnes transportadores. RESISTÈNCIES A ALTRES ANTIFÚNGICS Mecanismes de resistència als poliens Fins ara la resistència als poliens no es considerava un problema clínic; no obstant això, s’han comunicat casos aïllats de soques resistents, com per exemple, l’aïllament clínic de C. tropicalis resistent a AMB (White et al., 1998). També s’han modificat soques de C. albicans al laboratori que, probablement, per alteracions en l’esterol de la membrana, han desenvolupat resistència (Broughton et al., 1991). També in vitro s’han obtingut soques de C. neoformans resistents a l’AMB, si bé el mecanisme no és prou clar i podria deure’s a alteracions en l’esterol o a mutacions al gen que ho codifica (Kelly et al., 1994).

Resistències a la 5-ﬂuorocitosina Com a pirimidina fluorada, la 5-FC, d’estructura molt pròxima al 5-fluoruracil, inhibeix la síntesi d’àcids nucleics per a llevats com Candida sp. i Cryptococcus. De fet, la 5-FC, per acció de la permeasa, entra a l’interior de la cèll. ula i és convertida per l’enzim citosinadesaminasa en 5-fluoruracil, i aquest passa a àcid fluorouridílic (FUMP), que després de ser fosforilat s’incorpora a l’RNA i inhibeix la síntesi de proteïnes (Polak i Scholer, 1975). Les resistències primàries s’han descrit en

194

J. M. TORRES-RODRÍGUEZ, Y. MORERA I E. ALVARADO

C. albicans en un petit nombre de soques, mentre que la secundària o adquirida sembla ser força més freqüent en funció de l’ús clínic de l’antifúngic i sobretot si s’administren dosis infraterapèutiques. Els mecanismes de resistència són el resultat d’una disminució en la incorporació de la 5-FC a la cèll. ula fúngica, per pèrdua de l’activitat permeasa o per disminució de l’activitat enzimàtica que transforma la 5-FC en FUMP (Whelan, 1987). El bloqueig en la formació del FUMP per pèrdua de l’activitat de la citosina-desaminasa o la disminució en l’activitat de la uracil-fosforibosiltransferasa (UPTRasa) confereix resistència a la 5-FC. Aquests canvis serien conseqüència de mutacions. IMPORTÀNCIA CLÍNICA DE LA RESISTÈNCIA ALS ANTIFÚNGICS EN LLEVATS Actualment s’utilitza un nombre limitat d’agents antifúngics, incloent-hi azoles, poliens i anàlegs de pirimidines per combatre les infeccions causades per llevats patògens. Certs factors clínics poden contribuir al fracàs del tractament antifúngic, i això inclou el tipus i grau d’immunodeficiència, el compliment adequat del tractament, la dosi òptima, i aspectes farmacocinètics de l’antifúngic mateix. També, els llevats exposats a aquests agents poden ser intrínsecament resistents o adquirir mecanismes de resistència específics, segons s’ha descrit anteriorment. La resistència microbiològica pot ser definida com una disminució en la susceptibilitat a l’antifúngic. Actualment es disposa de mètodes de laboratori per mesurar la sensibilitat dels llevats patògens als antifúngics disponibles, i per distingir entre organismes sensibles i resistents. Aquesta distinció, de manera ideal, hauria de predir l’èxit o el fracàs del tractament des d’un punt de vista clínic, però com

s’ha indicat, intervenen altres factors independents de la resistència antifúngica. Nombrosos estudis han buscat relacionar la sensibilitat a un determinat antifúngic mesurant les concentracions inhibitòries mínimes i les concentracions fungicides mínimes, i comparant aquests valors amb els punts de tall de sensibilitat per predir l’èxit o el fracàs terapèutic d’aquest antifúngic davant de l’aïllament en concret. En models experimentals s’ha pogut relacionar la resposta terapèutica amb el nivell de sensibilitat o resistència i també en alguns assaigs clínics, però possiblement encara estem lluny de disposar dels coneixements suficients per poder assegurar que la resposta al tractament està directament relacionada amb la sensibilitat in vitro a un antifúngic concret. BIBLIOGRAFIA Broughton, M. C.; Bard, M.; Lees, N. D. (1991). «Polyene resistance in ergosterol producing strains of Candida albicans». Mycoses, vol. 34, pàg. 75-93. Ghannoum, M. A.; Rice, L. B. (1999). «Antifungal agents: Mode of action, mechanisms of resistance, and correlation of these mechanisms with bacterial resistance». Clin. Microbiol. Rev., vol. 12, pàg. 501-517. Guarro, J.; Gené, J. (1995). «Opportunistic fusarial infections in humans». Europ. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis., vol. 14, pàg. 7541-7545. Hitchcock, C. A.; Barrett-Bee, K. A.; Russell, N. J. (1987). «The lipid composition and permeability to azole of an azole- and polyene-resistant mutant of Candida albicans». J. Med. Vet. Mycol., vol. 25, pàg. 29-37. Idigoras, P., Pérez-Trallero, E.; Pineiro, L.; Larruskain, J.; Lopez-Lopategui, M. C.; Rodríguez, N.; González, J. M. (2001). «Disseminated infection and colonization by Scedosporium proliﬁcans: a review of 18 cases 1990-1999». Clin. Infect. Dis., vol. 32, pàg. 158-165. Kauffman C. A.; Zarins, I. T. (1998). «In vitro activity of voriconazole against Candida sp.» Diagn. Microbiol. Infect. Dis., vol. 31, pàg. 297-300. Kelly, S. L.; Lamb, C.; Taylor, M.; Corran, A. J.; Baldwin, B. C.; Powderly, W. G. (1994). «Resistance to amphotericin B associated with defective sterol delta 8 → 7 isomerase in a Cryptoccus neoformans strain from an AIDS patient». FEMS Microbiol. Lett., vol. 122, pàg. 39-42. Lamb, D. C.; Kelly, D. E.; Schunck, W. H.; Shyadehi, A. Z.; Akhtar, M.; Lowe, D. J.; Baldwin, B. C.;

MECANISMES D’ACCIÓ DELS ANTIFÚNGICS I RESISTÈNCIA EN LLEVATS

Kelly, S. L. (1997). «The mutation T315A in Candida albicans sterol 14 alpha-demethylase causes reduced enzyme activity and fluconazole resistance through reduced affinity». J. Biol. Chem, vol. 272, pàg. 5682-5688. Marco, F.; Pfaller, M. A.; Messer, S. A.; Jones, R. N. (1998). «Activity of MK-0991 (L-743.872), a new echinocandin, compared with those of LY303366 and four other antifungal agents rested against blood stream isolates of Candida spp». Diag. Microbiol. Infect. Dis., vol. 31, pàg. 33-37. Marichal, P.; Bossche, H. van den; Odds, F. C.; Nobels, G.; Warnock, D. W.; Timmerman, V.; Broeckhoven, C. van; Fay, S.; Mosse Larsen, P. (1997). «Molecular-biological characterization of an azole-resistant Candida glabrata isolate». Antimicrob. Agents. Chemother, vol. 41, pàg. 2229-2237. Marr, K. A.; Lyons, C. N.; Rustad, T. R.; Bowden, R. A.; White, T. C.; Rustad, T. (1998). «Rapid transient fluconazol resistance in Candida albicans is associated with increased mRNA levels of CRD». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 42, pàg. 2584-2589. Parkinson, T.; Falconer, D. J.; Hitchcock, C. (1995). «Fluconazole resistance due to energy-dependent drug efflux in Candida glabrata». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 39, pàg. 1696-1699. Petri, M. G.; Konig, J.; Moecke, H. P.; Gramm, H. J.; Barkow, H.; Kujath, P.; Dennhart, R.; Schafer, H.; Meyer, N.; Kalmar, P.; Thulig, P.; Muller, J.; Lode, H. (1997). «Epidemiology of invasive mycosis in ICU patients: a prospective multicenter study in 435 non-neutropenic patients». Intensive. Care Med., vol. 23, pàg. 317325. Pfaller, M. A.; Messer, S. A.; Boyken, L.; Huynh, H.; Hollis, R. J.; Diekema, D. J. (2002). «In vitro activities of 5-fluorocytosine against 8,803 clinical isolates of Candida spp.: global assessment of primary resistance using National Committee for Clinical Laboratory Standards susceptibility testing methods». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 46, pàg. 3518-3521.

195

Polak, A.; Scholer, H. (1975). «Mode of action of 5-fluorocytosine and mechanisms of resistance». Chemotherapia, vol. 21, pàg. 113-130. Prasad, R.; Wergifosse, P. de; Goffeau, A.; Balzi, E. (1995). «Molecular cloning and characterization of a novel gene of Candida albicans, CDR1, conferring multiple resitance to drugs and antifungals». Curr. Genet., vol. 27, pàg. 320-329. Ramage, G.; Bachmann, S.; Patterson, T. F.; Wickes, B. L.; López-Ribot, J. L. (2002). «Investigaction of multidrug efflux pumps inrelation to fluconazole resistance in Candida albicans biofilms». J. Antimicrob. Chemother, vol. 49, pàg. 973-980. Sandven, P. (2000). «Epidemiology of candidemia». Rev. Iberoamer. Micol., vol. 17, pàg. 73-81. Sanglard, D.; Kuchler, K.; Ischer, F.; Pagani, J. L.; Monod, M.; Bille, J. (1995). «Mechanisms of resistance to azole antifungal agents in Candida albicans isolates from AIDS patients involve specific multidrug transporters». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 39, pàg. 2378-2386. Walsh, T. J.; Kasai, M.; Francesconi, A.; Landsman, D.; Chanock, S. J. (1996). «New evidence that Candida albicans possesses additional ATP-binding cassette MDR-like genes: implication for antifungal azole resistance». J. Med. Vet. Mycol., vol. 35, pàg. 133-137. Whelan, W. L. (1987). «The genetic basis of resistance to 5-fluorocytosine in Candida species and Cryptococcus neoformans». Crit. Rev. Microbiol., vol. 15, pàg. 45-56. White, T. C. (1997). «The presence of an R467K amino acid substitution and loss of allelic variation correlate with an azole-resistant lanosterol 14-alpha-demethylase in Candida albicans». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 41, pàg. 1488-1494. White, T. C.; Marr, K. A.; Bowden, R. A. (1998) «Clinical, cellular, and molecular factors that contribute to antifungal drug resistance». Clin. Microbiol. Rev., vol. 11, pàg. 382-402.

Antimicrobians (Joaquim Ruiz, ed.) Treballs de la SCB. Vol. 55 (2004) 197-212

RESISTÈNCIES ALS PRINCIPALS FÀRMACS ANTITUBERCULOSOS. IMPORTÀNCIA, DETECCIÓ I ALTERACIONS GENÈTIQUES ASSOCIADES Julià González i Griselda Tudó Servei de Microbiologia, Hospital Clínic de Barcelona, IDIBAPS. Adreça per a la correspondència: Julià González. Servei de Microbiologia, Hospital Clínic. Villarroel, 170. 08036 Barcelona. Adreça electrònica: juliangonzalez@ub.edu. RESUM Anualment es declaren de vuit a nou milions de casos de tuberculosi al món, amb gairebé dos milions de morts. El 10 % dels casos són resistents a algun dels fàrmacs. Diferents factors influeixen en les resistències, com el tractament previ, la immigració, i les condicions socioeconòmiques. Per determinar les resistències existeixen diferents mètodes. Els fenotípics, basats en l’antibiograma, són els més estesos i de referència, però presenten l’inconvenient de necessitar de tres a quatre setmanes per al resultat. En els darrers anys s’han comercialitzat variants basades en medis líquids, amb lectura semiautomatitzada, que escurcen el temps a una o dues setmanes. Els mètodes genotípics, basats en la detecció de mutacions responsables de resistència, es preveuen com l’alternativa potencial. Tot i que no es coneixen totes les mutacions responsables de resistència, les dels fàrmacs més importants han estat estudiades a bastament. Actualment es treballa en la implementació de tècniques per detectar directament les mutacions en les mostres. La tecnologia de PCR a temps real suposa una eina útil per a aquesta estratègia. Els reptes de futur són incrementar la sensibilitat de les tècniques de detecció directa en les mostres i establir clarament el poder de transmissió i la virulència de les soques resistents. Paraules clau: tuberculosi, tractament, resistència, mutacions i transmissió. SUMMARY From 8-9 million cases of tuberculosis and two million deaths from this disease are declared yearly around the world. Ten percent of the cases are resistant to some of the drugs used in the treatment of tuberculosis. Different factors are related to drug resistance such as previous treatment and immigration as well as economic conditions. Different techniques may be used to determine drug resistance, with phenotypic methods based on sensitivity tests being the most commonly used, and these methods are considered to be the reference ones. Nonetheless, 34 weeks are required to achieve reliable results. In recent years attempts have been made to

198

J. GONZÁLEZ I G. TUDÓ

shorten the incubation time with methods based on liquid media and semi-automatic readings providing results within 1-2 weeks. Another potential alternative is genotyping methods based on the detection of resistance mutations. Although, to date, not all resistance mutations have been determined, those with resistance to the most important drugs have been widely studied and techniques for direct detection of mutations in samples are currently under study. Future challenges include the development of techniques which increase the sensitivity of direct detection methods in samples and the establishment of the transmission power and virulence of resistant strains. Keywords: tubercle, treatment, resistence, mutations, transmission. . LA TUBERCULOSI AL MÓN. INCIDÈNCIA I SITUACIÓ ACTUAL La tuberculosi acompanya l’espècie humana des de fa milers d’anys i continua essent a l’inici del segle xxi una de les malalties infeccioses amb més incidència i mortalitat del món (OMS, 2003). Durant la llarga etapa preantibiòtica, el 50 % dels malalts morien i el 25 % es curaven amb seqüeles. En gran mesura, la seva persistència és deguda a la capacitat d’adaptació que té el bacteri que causa la malaltia, Mycobacterium tuberculosis. Aquesta capacitat d’adaptació s’evidencia en diferents aspectes vinculats a l’estructura lipídica de la seva paret i al seu metabolisme lent que, contràriament al que podria semblar, li proporciona avantatges, com la resistència a condicions ambientals adverses, la resistència a la immunitat local i sistèmica, la lenta resposta als antibiòtics i la capacitat de romandre latent durant anys. En la pràctica es tradueix en tres de les barreres més importants que es troben els programes de control i eradicació de la malaltia: primer, les persones infectades, que mantenen de manera latent un petit nombre de bacteris i poden desenvolupar la malaltia en qualsevol moment de la seva vida. Per tant, mentre hi hagi infectats hi haurà malalts. Segon, la llarga durada del tractament afavoreix que s’incompleixi, sobretot després de les primeres setmanes, quan ja han desaparegut els símptomes, cosa que dificulta el guariment total. Tercer, no existeix una vacuna eficaç que permeti iniciar una cam-

panya mundial de gran abast per prevenir o disminuir la incidència de la malaltia o de la infecció. Dades recents de l’OMS (OMS, 2003) indiquen que un terç de la població mundial està infectada. Tanmateix, es declaren al voltant de vuit a nou milions de casos anuals de tuberculosi, amb gairebé dos milions de morts (aproximadament cinc mil cada dia). Aquestes xifres tan elevades no repercuteixen a tot arreu per igual. Així, més del 80 % dels casos es localitzen en vint-i-dos països, que, amb l’excepció de Rússia i el Brasil, que poden considerar-se emergents, són països pobres. Entre els factors més importants que influeixen en la incidència destaquen la pobresa, cada cop més agreujada per l’augment demogràfic i la mancança de millora econòmica, i la pandèmia del VIH, que des de la seva aparició ha causat un augment dels casos de tuberculosi fins i tot als països industrialitzats, en causar una supressió de la immunitat cell. ular. Per aquestes raons, l’OMS va llençar el 1994 una campanya on considerava la tuberculosi com una emergència mundial i es proposà la difusió de tractaments directament supervisats per assegurar-ne el compliment íntegre i la curació. Aquesta estratègia s’anomena DOT (direct observed treatment) i constitueix la base del control actual de la malaltia. Malgrat tot, l’epidèmia segueix sense disminucions significatives, llevat dels països desenvolupats, fonamentalment pel seu lligam amb el VIH i les condicions socioeconòmiques. A Espanya la situació és heterogènia a les

RESISTÈNCIES ALS PRINCIPALS FÀRMACS ANTITUBERCULOSOS

diferents comunitats autònomes, i es concentra més en ciutats grans i regions del nord, com Galícia. En conjunt es pot considerar que la incidència mitjana estaria al voltant de trenta-dos casos per cada cent mil habitants. Durant els darrers anys vuitanta i els primers anys noranta, hi hagué un important augment del nombre de casos, atribuïts en gran mesura a l’epidèmia del VIH (Balagué et al., 2003). A partir de la introducció dels tractaments antiretrovirals actuals i la millora del control, hi ha hagut una disminució, que en alguns llocs com Catalunya ha estat fins i tot del 54 % (Balagué et al., 2003). El repte de la tuberculosi a curt i mig termini no és el mateix a tot arreu del món. Als països pobres és un problema de control molt lligat a les condicions socioeconòmiques i al VIH. Als països industrialitzats el repte és la tuberculosi en immigrants. No únicament per la repercussió que té en la incidència, sinó perquè presenta problemes de control que requereixen solucions diferents a les utilitzades per a la població autòctona. BASES DEL TRACTAMENT I POBLACIONS BACTERIANES EN LES LESIONS TUBERCULOSES El 1944 s’inicià l’etapa antibiòtica en el tractament de la tuberculosi, amb la introducció de l’estreptomicina. Poc després s’introduïren el PAS (àcid p-aminosalicílic, 1946) i la isoniazida (1952). Inicialment s’usaren en règim de monoteràpia, però ràpidament es veié que després d’unes setmanes de millora clínica i radiològica la malaltia tornava a la situació anterior. La millora inicial s’atribuí a l’eliminació dels bacteris sensibles, amb la selecció dels resistents, que assoleixen la concentració inicial coincidint amb el retorn de la clínica. El 1958 s’introdueix la primera pauta combinada, usant els fàrmacs existents. Més tard apareixen l’etambutol (1968) i la rifampicina (1972), i comencen les pautes de nou mesos.

199

En els anys vuitanta, amb la introducció de la pirazinamida, s’iniciaren les pautes de sis mesos. Actualment, l’esquema de tractament es compon de dues fases, una inicial d’atac amb tres o quatre fàrmacs, en la qual s’eliminen la majoria dels bacteris de les lesions, i una segona fase de seguiment, amb dos fàrmacs, en la qual s’elimina la població latent, menys activa metabòlicament. Les resistències de M. tuberculosis als fàrmacs són d’origen cromosòmic i no s’han trobat resistències relacionades amb plasmidis o altres mecanismes coneguts. Actualment s’accepta que poden sorgir mutants resistents de manera espontània, sense haver-se exposat prèviament al tractament, cosa que explicaria casos de resistència inicial sense que es coneguin antecedents de resistència en els seus contactes. A més, els mutants resistents poden ser seleccionats per tractament inadequat, i poden causar resistència a altres fàrmacs i augmentar el grau de resistència al fàrmac inicial. En estudis duts a terme en els anys seixanta, Canetti i Grosset (1961) van establir que la freqüència de les mutacions espontànies no era la mateixa per als diferents fàrmacs. Determinaren que els mutants resistents apareixien en un de cada 10 5-10 7 bacteris per a la isoniazida, l’etambutol i l’estreptomicina, un de cada 10 710 9 per a la rifampicina i un de cada 10 2-10 4 per a la pirazinamida. La freqüència d’aparició de mutants resistents a més d’un fàrmac serà igual a la suma de les freqüències individuals. També s’establí el nombre de bacteris presents en els diferents tipus de lesions, des de 10 3-10 5 en infiltrats de poca extensió fins a 10 8-10 9 en lesions cavitades, i va quedar palès que el tractament amb un sol fàrmac és insuficient i en una alta proporció de casos desembocaria en resistència. La utilització de tres o quatre fàrmacs de manera simultània fa impossible l’aparició de mutants resistents a tots. El 1979 Mitchison va definir les diferents poblacions bacill. ars presents a les lesions. Hi

200

J. GONZÁLEZ I G. TUDÓ

hauria una primera població metabòlicament activa, extracelull. ar, que creix en pH neutre i amb tensió d’oxigen elevada, que correspondria a la major part dels bacteris (10 8-10 9). La isoniazida seria el fàrmac més actiu per a aquesta població. Una segona població estaria formada per 10 3-10 5 bacteris intracell. ulars que creixen a pH àcid. La pirazinamida seria el fàrmac més eficaç. Una tercera població seria la formada per bacteris poc actius, que es multipliquen esporàdicament i que estarien a l’interior de lesions de caseum. Quedaria una darrera població, molt poc nombrosa, no activa i latent durant llargs períodes i, per tant, no susceptible als fàrmacs (Mitchison, 1979). Tret de la primera població, les altres estarien implicades en les recidives, en les reactivacions endògenes i en l’explicació de per què el tractament ha de ser tan llarg. Aquest esquema de poblacions bacill. ars no explica totalment aspectes relacionats amb la latència i amb la reactivació ni la bona resposta que té en general el tractament profilàctic de la infecció. Malgrat això, continua essent vàlid. No tots els fàrmacs actuen igual pel que fa a les lesions. El que interessa és que hi hagi acció bactericida per disminuir de manera important el nombre de bacteris i acció esterilitzant per eliminar els bacteris poc actius. La isoniazida seria el fàrmac més bactericida, mentre que la rifampicina i la pirazinamida serien els més esterilitzants. La resta del fàrmacs, llevat dels aminoglucòsids, tindrien activitat bacteriostàtica. CONCEPTE DE RESISTÈNCIA ALS FÀRMACS. RESISTÈNCIA MICROBIOLÒGICA I RESISTÈNCIA CLÍNICA En termes generals, parlem de resistència quan el tractament perd parcialment o totalment la seva eficàcia. Des d’un punt de vista clínic, l’evolució esperada del pacient envers

la curació no succeeix com s’espera, amb persistència o reaparició dels símptomes i signes. Per diferenciar la resistència d’una resposta lenta o un mal acompliment del tractament, s’estableixen uns criteris de resistència en el maneig dels pacients: a) persistència de la clínica als dos mesos d’iniciar el tractament, b) recaiguda de la malaltia pocs mesos després de finalitzar correctament el tractament, c) persistència de bacill. oscòpia positiva en les mostres als quatre mesos de tractament. Un factor addicional que recolza la sospita és l’antecedent de tuberculosi anterior sense resposta al tractament. El concepte epidemiològic de resistència es basa en l’observació i l’aïllament de bacteris en cultius de les mostres després d’iniciar el tractament. Es considera que cal esperar quatre mesos abans no considerem que el tractament fracassa, tot i que en molts països els programes de control indiquen canvis en el tractament si als dos mesos s’observen bacteris a les mostres. No obstant això, la confirmació de la resistència només pot fer-se amb mitjans microbiològics que comprovin l’eficàcia de cada fàrmac. L’antibiograma és la prova de referència que permet confirmar la resistència a cada fàrmac. Actualment es considera que quan l’1 % de la població bacteriana present és resistent a una concentració prèviament fixada de l’antibiòtic, cal entendre que el bacteri és resistent al fàrmac. CLASSIFICACIÓ EPIDEMIOLÒGICA DE LES RESISTÈNCIES Des d’una perspectiva individual, tenir una soca resistent presenta pocs matisos. Però des del punt de vista epidemiològic és important definir l’origen de la resistència. La classificació de les resistències ha canviat diverses vegades al llarg dels anys. L’objectiu sempre ha estat diferenciar els casos previsibles dels que no ho són. Recentment l’OMS ha definit

RESISTÈNCIES ALS PRINCIPALS FÀRMACS ANTITUBERCULOSOS

les següents categories (OMS/IUATLD, 2000; Schwoebel et al., 2000): a) Resistències en casos nous: soques aïllades de malalts sense antecedents de tractament previ o que n’han rebut durant menys d’un mes. Corresponen al que es coneixia com a resistències primàries. b) Resistències en casos tractats: soques aïllades en malalts que ja han rebut tractament previ durant més d’un mes. Corresponen al que es coneixia com a resistències adquirides. c) Resistència combinada: suma de totes les resistències en una àrea determinada. Indica la càrrega de soques resistents que hi ha en una comunitat. d) Multiresistència: resistència conjunta com a mínim a la isoniazida i a la rifampicina. e) Poliresistència: resistència a més d’un fàrmac però sense que inclogui simultàniament la isoniazida i la rifampicina. La nova denominació de resistències en casos nous i casos prèviament tractats, en lloc de primàries i adquirides, és una diferenciació semàntica que classifica més adequadament les resistències pel que fa a l’antecedent de tractament previ, sense entrar en la discussió de com es va generar la resistència, aspecte que en molts casos és impossible de provar. Així, en el concepte de primàries podrien entrar casos que es van contagiar amb una soca resistent, casos que han generat espontàniament la resistència durant el tractament i també casos tractats prèviament que desenvolupen resistència per a una soca que no correspon a l’episodi previ, sinó a un nou contagi. De la mateixa manera, el concepte de resistència adquirida va incloure malalts que havien fet bé el tractament i malalts que no i, per tant, amb gènesi o no de resistències vinculades a aquest tractament. La diferenciació entre aquests dos tipus de resistències té importants implicacions epidemiològiques, ja que tradicionalment s’entén que les resistències en casos prèviament tractats tradueixen mancances de funcionament dels programes de control, ja que es generen

201

durant el tractament i són les que amb una bona gestió es poden corregir per no comprometre el control futur. SITUACIÓ ACTUAL DE LES RESISTÈNCIES AL MÓN Entre 1994 i 1999 es va dur a terme un estudi de l’OMS i de la UNION (International Union Against Tuberculosis and Lung Diseases) per avaluar les resistències a fàrmacs de primera línia en diferents països del món (OMS/IUATLD, 2000; Espinal, 2003). Malgrat que només participaren setanta-dos països o zones geogràfiques i que el 50 % dels vint-idos països amb més tuberculosi no hi estaven inclosos, ha estat l’estudi de més abast que s’ha fet mai. En el 58 % dels països participants s’observa una incidència de resistència a algun fàrmac en més del 10 % dels casos nous. Les resistències més elevades s’observen en països africans, del sud-est asiàtic, algunes zones de l’Amèrica del Sud i zones de l’antiga URSS. Catorze països tenen 3 % o més de casos multiresistents en casos nous i en quatre són més del 9 % (la Xina, Rússia, Lituània i Estònia). Als països africans la situació és poc coneguda a causa de la baixa participació, però les dades disponibles fan pensar que com a mínim es mouen en resistències en casos nous superiors al 10 %. A l’Àsia la situació és preocupant en zones de la Xina on no hi ha cobertura del tractament DOT i on s’han comptat centenars de casos multiresistents. Tanmateix, es desconeix la situació exacta en cinc dels països amb més casos de tuberculosi del món (Xina, Índia, Indonèsia, Bangladesh i Pakistan). Als EUA s’observà una incidència de resistències en casos nous superior al 10 %, sobretot a causa de brots de multiresistència en diferents punts del país, sobretot a Nova York (Frieden et al., 1993). En alguns punts d’Europa de l’Est, com Estònia, Lituània i àrees de Rússia, sobretot en

202

J. GONZÁLEZ I G. TUDÓ

institucions penitenciàries, la prevalença de resistències és la més elevada del món, probablement relacionada amb mancances de finançament dels programes sanitaris després de la caiguda de la Unió Soviètica i el descontrol en l’administració dels fàrmacs del tractament. Tampoc no es coneix la situació en zones políticament inestables com alguns països balcànics i repúbliques asiàtiques exsoviètiques. A Europa occidental s’observen dues situacions diferents: països que han augmentat la seva prevalença respecte a anys anteriors, a causa de l’arribada de població immigrant, que constitueixen el gruix de les resistències i dels casos de tuberculosi, com són Holanda, Dinamarca, França o la Gran Bretanya, i països que han disminuït respecte a la situació anterior i que reben poca població immigrant, com pot ser Portugal (March, 2001). A Espanya les resistències en casos nous estan al voltant del 4,5 % amb un 0,4 % de multiresistents. Les resistències en casos tractats estarien entre l’11 i el 45 % amb una mitjana del 24 % (March, 2001). Aquestes xifres de resistència comparables a les de molts països europeus criden l’atenció en un país amb una de les incidències de tuberculosi i sida més elevades del continent (OMS, 1998; Global AIDS, 2000) i amb una manca de política de control nacional ben organitzada. Alguns autors (March, 2001) han assenyalat que seria a causa de la conjunció de diferents factors, com la inexistència d’augment de les resistències a causa del VIH l’existència d’una xarxa interdisciplinària no organitzada de professionals que cobreixen els diferents aspectes de la tuberculosi. IMPACTE DE DIFERENTS FACTORS EPIDEMIOLÒGICS EN LA RESISTÈNCIA AL TRACTAMENT DE LA TUBERCULOSI Segons les dades de l’estudi de l’OMS i la UNION (OMS/IUATLD, 2000), actualment

cal considerar la influència de quatre factors: la immigració de països pobres a països industrialitzats, l’edat dels pacients, l’antecedent de tractament previ i l’epidèmia del VIH.

Immigració En països industrialitzats que reben població immigrant des de fa anys, la prevalença de tuberculosi entre la població immigrant és superior a l’autòctona (OMS/IUATLD, 2000; March, 2001). La majoria d’immigrants desenvolupen tuberculosi en els dos a cinc anys següents a la seva arribada, cosa que suggereix que la major part de contactes es van fer al país d’origen. La prevalença de tuberculosi resistent també és superior en immigrants, cosa que probablement tradueix la situació en l’origen. No obstant això, la prevalença de multiresistència és similar a l’autòctona, cosa que possiblement indica que és un fenomen d’uns pocs països i la majoria d’immigrants no en provenen.

Tractament previ L’antecedent de tractament previ és un important predictor de resistència, sobretot de multiresistència (OMS/IUATLD, 2000). Malgrat tot, no tots els pacients que han rebut tractament previ tenen més risc que els que es diagnostiquen per primera vegada. Hi ha pacients que recidiven després d’un tractament correcte, per manca de total eliminació de les poblacions bacterianes; n’hi ha que tenen un segon episodi per reinfecció amb una soca diferent, altres recauen després d’abandonar completament el tractament abans d’acabar i altres tenen un segon episodi després de seguir el tractament de manera parcial, ja sigui voluntàriament o per intolerància o manca d’absorció d’algun dels fàrmacs. Aquests darrers són els candidats a desenvolupar resistència. Malgrat aquests importants matisos,

RESISTÈNCIES ALS PRINCIPALS FÀRMACS ANTITUBERCULOSOS

en la pràctica es fa difícil esbrinar exactament davant de quin cas ens trobem i s’analitzen conjuntament.

Edat S’ha relacionat l’edat superior a seixanta-cinc anys amb més risc de resistència (OMS/IUATLD, 2000). Diverses hipòtesis ho podrien explicar. Podria ser degut a una disminució actual de les soques resistents, ja que les persones de més edat serien dipositàries de soques resistents del passat. També s’ha dit que per l’edat haurien tingut major possibilitat d’exposició a les soques resistents. La primera hipòtesi es refermaria amb la constatació que la prevalença de resistències a rifampicina i etambutol no seria major en aquesta franja d’edat. Això s’explica pel fet que són fàrmacs d’introducció més recent en el temps.

VIH Segons una perspectiva teòrica seria raonable pensar que hi ha relació entre VIH i resistència al tractament de la tuberculosi, ja que la tuberculosi té més incidència en els seropositius, la contribució de la immunitat en la curació és menor, amb una major proporció de recidives i part dels malalts VIH pertanyen a coll. ectius marginats que poden seguir amb més dificultats el tractament. Durant els anys noranta es van descriure als EUA una sèrie de brots de tuberculosi que afectaven població marginal i amb VIH, amb resistències en casos nous del 23 % i multiresistències del 7 % (Frieden et al., 1993). Aquests brots aparegueren en un context de relaxament de les mesures de control i foren causa d’alarma a tot el món, i es va considerar que la infecció de VIH tenia un paper fonamental en el desenvolupament de les resistències. A la resta de països industrialitzats, tret d’alguns brots, aquestes previsions no es

203

confirmaren. A Espanya s’han dut a terme més de vint estudis en els darrers quinze anys i la majoria recolzen la tesi de la no-influència del VIH en les resistències (March, 2001). L’únic estudi realitzat a escala mundial (OMS/IUATLD, 2000) conclou que no existeix aquesta relació, tot i que el VIH pot afavorir la disseminació de soques resistents en comunitats tancades. Tot i així, en els països on més coexistència hi ha de VIH i tuberculosi, subsaharians i sud-est asiàtic, gairebé no s’han realitzat estudis i cal ser prudents abans de descartar aquesta relació amb investigacions més extenses. MÈTODES PER A LA DETECCIÓ DE RESISTÈNCIES Els mètodes per detectar les resistències de M. tuberculosis als fàrmacs es poden classificar en tres grans categories: mètodes fenotípics, basats a demostrar l’acció directa dels antibiòtics sobre els bacteris, mètodes fenotípics no convencionals, que es basen en la demostració de propietats o característiques fenotípiques per mètodes diferents a la interacció microorganisme/fàrmac i mètodes genètics, que demostren directament les mutacions o alteracions genètiques que causen la resistència. MÈTODES FENOTÍPICS CONVENCIONALS Es basen en la realització de l’antibiograma amb els fàrmacs utilitzats en el tractament. En els anys seixanta, l’OMS va encomanar a un grup d’experts el disseny de la metodologia per realitzar l’antibiograma. La principal peculiaritat de M. tuberculosis era la lentitud en el creixement que feia invàlids els mètodes usats per a altres bacteris. Es va proposar la utilització de medis sòlids amb tres sistemes diferents d’interpretació, que es van anomenar mètode de les concentracions absolutes, mètode

204

J. GONZÁLEZ I G. TUDÓ

de la ratio de resistència i mètode de les proporcions crítiques. Tots es basen en la utilització de concentracions fixes d’antibiòtic capaces de diferenciar sensibilitat de resistència. El mètode de les proporcions crítiques va esdevenir ràpidament el més utilitzat, perquè era menys estricte en el càlcul de l’inòcul i actualment la majoria de mètodes se’n deriven (Canetti et al., 1963). En el mètode de les proporcions crítiques s’analitza la resposta de dues concentracions conegudes de bacteri a una determinada concentració d’antibiòtic (crítica). Quan més de l’1 % de la població del bacteri és capaç de créixer en presència del fàrmac, es considera que la soca en qüestió és resistent al fàrmac. El mètode fou validat en models animals i posteriorment s’ha usat com a referència a l’hora d’estandarditzar nous mètodes. Inicialment s’avaluà en medi de Lowenstein-Jensen, tot i que poc després als EUA es validà pels medis Middlebrook 7H10 i 7H11. Des de l’inici de la utilització dels antibiogrames diferents factors n’han limitat la difusió: a) la lentitud de creixement del bacteri, que feia necessàries tres o quatre setmanes per obtenir un resultat; b) certa complexitat en la realització, que va recloure la tècnica a centres grans i de referència; c) la bioseguretat, que restringí l’ús a centres amb install. acions adients i d) el cost, que feia i fa que no s’assumeixi en molts centres de països desenvolupats i en pràcticament cap país pobre, on hi ha la majoria dels malalts. Per aquestes raons, des dels anys setanta i vuitanta es realitzaren esforços per trobar alternatives que permetessin obviar alguns d’aquests inconvenients. Fins als anys vuitanta, la majoria de les alternatives van ser optimitzacions del mètode sòlid, com l’ús directe de mostres amb bacill. oscòpia positiva, sense cultiu previ, l’ús de capes fines d’agar i observació microscòpica del creixement de microcolònies. Més recentment l’ús de tires Etest impregnades d’antibiòtic s’ha promogut com un mètode senzill, amb l’avantatge que determina directament la concentració mínima

inhibitòria (CMI) de l’antibiòtic. També, per fer òptim el cost i fer-ne possible l’ús en països pobres, s’han proposat opcions en medis d’agar que preveuen només usar els antibiòtics més importants (isoniazida i rifampicina) a concentracions concretes, de manera que el cost estaria al voltant d’un o dos dòlars (Heifets i Cangelosi, 1999). Probablement, on s’ha fet més èmfasi ha estat a escurçar el temps necessari per tenir un resultat. Així, els antibiogrames amb medi sòlid d’agar o Lowenstein-Jensen s’han intentat a partir de la mostra directa sense fer el cultiu. Els dos aspectes a controlar són les contaminacions i l’inòcul. Tot i que la reproductibilitat respecte al mètode indirecte és superior al 95 % quan la bacill. oscòpia és intensament positiva, la necessitat d’estandardització en cada centre n’ha impedit la difusió (Heifets i Cangelosi, 1999). La utilització de medis de cultiu líquids amb lectura semiautomatitzada és l’alternativa més estesa actualment per tenir resultats ràpids. El mètode radiomètric BACTEC 460 és actualment en països desenvolupats el mètode més utilitzat, i s’ha convertit en referència conjuntament amb els basats en medi sòlid com Lowenstein-Jensen i Middlebrook 7H10 i 7H11. Es basa en la detecció radiomètrica de creixement, ja que el bacteri consumeix una font de carboni marcada amb C 14 que és eliminada en forma de CO 2. Està estandarditzat per a fàrmacs de primera línia i té un ús potencial per a fàrmacs de segona línia. Els avantatges més importants respecte als mètodes amb agar són un càlcul de l’inòcul més senzill, una lectura més estandarditzada i l’obtenció d’un resultat en menys temps, entre set i dotze dies en lloc de quatre setmanes. Els inconvenients més importants són un cost cinc o deu vegades superior i l’ús de substàncies radioactives. En els darrers anys s’han desenvolupat mètodes semiautomatitzats no radiomètrics per al cultiu que tenen aplicació per a l’antibiograma. Els més coneguts són el mycobacteria

RESISTÈNCIES ALS PRINCIPALS FÀRMACS ANTITUBERCULOSOS

grow indicator tube (MGIT), el MB/BacT system i l’ESP myco system. Tots utilitzen medi líquid Middlebrook 7H9, igual que el BACTEC 460, i el creixement és detectat d’acord amb el CO 2 produït o el consum d’oxigen. L’MGIT detecta consum d’oxigen mitjançant fluorescència que detecta canvis en un indicador d’oxigen immobilitzat amb silicona al fons del tub. L’ESPdetecta la pressió negativa del consum d’oxigen, mentre que l’MB/BacT té un sensor de color capaç de detectar canvis de pH causats pel CO 2. Tots tenen alguns avantatges i desavantatges. Han estat primerament avaluats per cultiu. Actualment el més usat és l’MGIT. MB/BacT té alguns problemes administratius que n’han frenat l’expansió. El test per a la pirazinamida no està adequadament resolt en cap d’aquests. La situació actual és que coexisteixen diferents mètodes, elegits d’acord amb els paràmetres interns en cada laboratori, entre els quals es consideren complexitat, reproducció del resultat i cost. Probablement el mètode més estès sigui el radiomètric, tot i que les seves alternatives basades en medis líquids guanyen difusió. En països on el cost és el factor més important s’usen els medis sòlids. MÈTODES FENOTÍPICS NO CONVENCIONALS

205

al. (1989) basat en la incubació en medi sanguini d’un portaobjectes on s’ha fixat la mostra; després d’una incubació d’una setmana s’observa tenyit per comptar els bacteris presents. Dins d’aquest grup hi hauria mètodes que detecten activitats metabòliques presents en soques resistents, com són la detecció per bioluminescència de l’activitat ATP del bacteri, mètodes colorimètrics o citometria de flux, per detectar bacteris capaços d’hidrolitzar diacetat de fluoresceïna. D’altres no fan necessari el creixement previ, com són els que utilitzen fags (Alcaide et al., 2003). En síntesi, poden usar-se dues variants: amb fags que han estat manipulats i contenen el gen de la luciferasa i amb fags «salvatges». Els fags només infecten cèll. ules viables, per la qual cosa els bacteris sensibles a l’antibiòtic no s’infectaran. Si contenen luciferasa podran detectar-se amb un luminòmetre. Si no porten aquest gen es detecten indirectament, infectant en segona fase un cultiu de M. smegmatis, que creix ràpidament i es prova amb la formació de clapes quan el fag és present, és a dir, si prèviament ha infectat M. tuberculosis resistent. MÈTODES GENÈTICS PER A LA DETECCIÓ DE LES RESISTÈNCIES Mecanismes moleculars de les resistències

En la bibliografia existeixen nombrosos exemples de mètodes, molts fruït de considerable enginy. En general, no han aconseguit una acceptació important. Hi contribueixen diferents raons. Alguns han estat descrits recentment, d’altres tenen major complexitat que els mètodes estàndard, d’altres són difícils d’estandarditzar. Probablement també hi ha una certa resistència entre la comunitat professional a utilitzar mètodes indirectes per detectar la resistència als fàrmacs. Alguns necessiten un precreixement del bacteri, com ara alguns mètodes líquids d’incubació curta, com el descrit per Dickinson et

En els darrers anys s’han identificat els gens o les zones genètiques, i les mutacions puntuals, delecions o insercions responsables de les resistències als principals fàrmacs utilitzats en la teràpia antituberculosa: isoniazida, rifampicina, pirazinamida, etambutol i estreptomicina. Del coneixement dels mecanismes moleculars, que determinen la resistència de les soques de M. tuberculosis i de les bases d’actuació dels diferents antibiòtics, s’esdevé una eina important per al desenvolupament de noves estratègies en la detecció de la resistència com a alternativa a l’antibiograma

206

J. GONZÁLEZ I G. TUDÓ

convencional i per al disseny de nous fàrmacs. Les alteracions genètiques que actualment s’associen a la resistència als principals fàrmacs són: Isoniazida. S’han descrit diferents gens implicats (Ramaswamy i Musser, 1998). L’activació de la isoniazida implica la seva transformació en el compost actiu, l’àcid nicotínic, mitjançant l’enzim catalasa-peroxidasa, una proteïna codificada pel gen katG (Zhang et al., 1992). Alteracions en aquest gen provoquen resistència i impedeixen que l’antibiòtic sigui activat. En general, entre el 50 % i el 60 % de les soques resistents estudiades presenten alguna mutació puntual, petites delecions o insercions en aquest gen (Ramaswamy i Musser, 1998). La mutació més freqüent en soques d’origen geogràfic diferent, de 32 % a 92 % (Haas et al., 1997; Marttila et al., 1998; Verdú et al., 2002), afecta el c315 i provoca un canvi d’aminoàcid de Ser a Thr. Altres mutacions puntuals observades són c463Leu (s’ha suggerit que pot ser una mutació silenciosa), c104, c108, c138, c148, c270, c275, c321 i c381, de moltes de les quals es desconeix el significat (Ramaswamy i Musser, 1998). Una altra zona genètica associada a la resistència a la isoniazida és el locus inhA, constituït, al cromosoma micobacterià, pel gen mabA, que codifica l’enzim 3-cetoacil-ACP-reductasa, i l’inhA, que codifica l’enoïl-ACP-reductasa. Ambdós participen en la síntesi de la paret bacteriana. A l’extrem 5 d’aquest locus es troba la zona reguladora RBS (ribosome binding site) (Banerjee et al., 1994; Rozwarski et al., 1998). S’han descrit mutacions tant a la zona reguladora com a la zona estructural (Ramaswamy i Musser, 1998). Les alteracions que afecten la primera provoquen un augment en la producció de l’enzim que compensa l’acció inhibidora de l’antibiòtic sobre la síntesi de la paret. Les mutacions a la zona estructural produeixen modificacions en l’enzim, i impedeix el reconeixement de la isoniazida, i eviten que s’activi. Les mutacions associades a aquest lo-

cus expliquen el 25-30 % de les resistències a isoniazida (Banerjee et al., 1994). També s’ha relacionat amb resistència a la isoniazida la zona intergènica oxyR-ahpC. En aquest cas, el gen ahpC és regulat pel gen oxyR que codifica l’enzim ahpC, que destrueix els radicals peròxid (Telenti et al., 1997). El gen ahpC es manté inactiu quan el gen katG funciona correctament i les mutacions en aquesta zona apareixen quan el gen katG està mutat, per compensar la seva acció de destoxicació (Ramaswamy i Musser, 1998). Altres gens com són kasA, furA, ndh, també han estat relacionats amb la resistència, però el seu paper és incert (Ramaswamy i Musser, 1998; Lee et al., 2001). Es pot trobar una correlació entre el tipus de mutació i la CMI. Així, mutacions al gen katG es relacionen amb resistència a concentracions elevades (superiors a 1 μg/ml). Alteracions al gen inhA s’associen a CMI baixa (Banerjee et al., 1994; Lonca et al., 2002). També s’ha observat una estreta relació entre resistència associada al gen inhA i resistència a l’etionamida, un dels fàrmacs de segona línia, emparentat amb la isoniazida (Banerjee et al., 1994). Rifampicina. La rifampicina actua interferint el procés de síntesi de l’mRNA, unintse a la subunitat β de l’RNA-polimerasa i provocant la inhibició de l’inici del procés de transcripció (McClure i Cech, 1978). La resistència a la rifampicina està determinada per mutacions puntuals i petites delecions o insercions en el gen rpoB que codifica la subunitat abans esmentada (Ramaswamy i Musser, 1998). Aquest fet provoca un canvi d’aminoàcids i, conseqüentment, de conformació del lloc d’unió de l’antibiòtic a l’RNA-polimerasa. Més del 95 % de les soques resistents estudiades tenen alguna alteració localitzada en una regió de 81 pb, que codifica vint-i-set aminoàcids (codons 432 a 458) del gen rpoB, anomenada regió determinant de la resistència a la rifampicina (RDRR) (Telenti et al., 1993; Verdú et al., 2002). Les mutacions més freqüents són les que afecten els codons, 456Ser i 451Histidina. Les substitucions

RESISTÈNCIES ALS PRINCIPALS FÀRMACS ANTITUBERCULOSOS

d’aminoàcids més comunes són Ser456Leu i His451Tirosina (Ramaswamy i Musser, 1998). Diferents treballs han observat una forta correlació entre determinades mutacions i el nivell de la CMI de la rifampicina. Així, s’han associat les mutacions als codons 451 i 456 amb un alt nivell de resistència, > 32 μg/ml, i les mutacions als c436, 441, 443 i 447 amb CMI baixes, alhora que les mutacions al codó 441 romanen susceptibles a la rifabutina (Ramaswamy i Musser, 1998; Espasa et al., 2002). Etambutol. La seva acció és inhibir la biosíntesi de la paret cell. ular, i actua sobre l’enzim arabinosiltransferasa. La resistència a l’etambutol està associada amb canvis en l’operó emb, constituït per tres gens embC, A, B (Telenti et al., 1997). La resistència es produeix per una sobreexpressió de proteïnes emb, associada freqüentment amb CMI baixes i per mutacions de caràcter estructural al gen embB (Telenti et al., 1997), relacionades, en més del 65 % de les soques, amb nivells elevats de resistència. La majoria d’aquestes mutacions afecten els codons c306Metionina (89 %), c406Glicina, c328Asparagina i c497Glutamina (Ramaswamy i Musser, 1998). Estreptomicina. Les alteracions responsables de la seva resistència s’han identificat als gens rrs i rpsL, que codifiquen l’RNA 16S i la proteïna ribosòmica S12, respectivament, ambdós relacionats amb la subunitat ribosòmica 30S. Aquestes alteracions provoquen la inhibició del procés de síntesi proteica (Sreevatsan et al., 1996). Entre el 65-75 % de les soques resistents tenen alguna mutació associada als dos gens esmentats. En la resta, se’n desconeix el mecanisme. La mutació més comuna es produeix al codó 43 del gen rpsL, on la lisina és substituïda per una arginina. Al gen rrs les alteracions apareixen al loop 530 o a la regió 915 (Sreevatsan et al., 1996). Existeixen de 25 % a 35 % de soques resistents amb els dos gens intactes, cosa que suggereix que hi pot haver altres mecanismes responsables de la resistència. S’ha trobat una correlació

207

entre les alteracions genètiques i el nivell de resistència in vitro (Meier et al., 1996). Canvis al gen rpsL es correlacionen amb nivells elevats de resistència (> 500 μg/ml), i mutacions al gen rrs ho fan amb nivells menys alts (< 250 μg/ml). Generalment, les soques sense cap alteració als dos gens presenten resistència més baixa (< 50 μg/ml). Pirazinamida. La resistència s’associa majoritàriament (70 %) a mutacions en el gen pncA, que codifica una proteïna de només cent vuitanta-sis aminoàcids, la pirazinamidasa, encarregada de transformar el fàrmac en àcid pirazinoic, que és el compost actiu. Es desconeix el mecanisme en el percentatge restant. Qualsevol tipus d’alteració, en aquest gen, s’ha correlacionat amb nivells elevats de resistència (Ramaswamy i Muser, 1998). MÈTODES DE DETECCIÓ DE LES ALTERACIONS GENÈTIQUES La utilització de les tècniques de biologia molecular en l’estudi de resistències en els micobacteris es va iniciar a començaments de la dècada dels noranta. Contràriament als mètodes fenotípics descrits prèviament, aquestes tècniques són independents del creixement bacterià. Per a la detecció de les resistències s’han descrit diferents mètodes.

Tècniques fonamentades en l’electroforesi PCR-SSCP (single-strand conformation polymorphism) (Telenti et al., 1993). La tècnica té com a fonament l’estudi de la mobilitat d’una de les dues cadenes de DNA en un gel de poliacrilamida d’alta resolució. Una mutació en un gen provoca un canvi conformacional de la cadena i n’altera també la mobilitat. És un mètode estandarditzat, ràpid i fàcil. Heterodúplex (Williams et al., 1998). Aquesta tècnica inclou una PCR de la regió que interessa; es desnaturalitza i es barreja amb un altre

208

J. GONZÁLEZ I G. TUDÓ

amplicó també desnaturalitzat d’una soca de referència. Es deixa reconstituir la cadena de DNA. Si no hi ha cap mutació la homologia entre els amplicons de les dues cadenes, la soca problema i la de referència serà total. En cas contrari, es formaran heterodúplexs, que presentaran mobilitat electroforètica distinta dels amplicons originals.

caide et al., 1997; Marttila et al., 1998; Lee et al., 2001). Detecta exactament el lloc de la mutació, però cal disposar de la soca. Malgrat que tècnicament aquest mètode és complex, es planteja com una bona alternativa, sobretot en l’estudi epidemiològic de soques. TRANSMISSIBILITAT DE LES SOQUES RESISTENTS

Tècniques fonamentades en la hibridació La més coneguda és la LiPA, (Rossau et al., 1997), desenvolupada comercialment per a la detecció de les principals mutacions a la rifampicina. Té utilitat com a marcador ràpid de multiresistència. Altres tècniques són les basades en PCR-ELISA (García et al., 2001) i, darrerament, les basades en microxips (Troesch et al., 1999) que encara han de desplegar el seu potencial. En aquest grup cal destacar les tècniques basades en PCR a temps real. Permeten l’amplificació i la detecció del producte simultàniament mitjançant sondes fluorescents. Existeixen diferents tipus de sondes marcades, les d’ús més freqüent són les sondes Taqman i les sondes FRET ( ﬂuorescenceresonance-energy-tranfer). S’han aplicat a l’estudi i detecció de les mutacions implicades amb la resistència als principals fàrmacs, en soques aïllades de cultius (Torres et al., 2000; García de Viedma et al., 2002) i també directament en mostra clínica (Espasa et al., 2002). Aquesta darrera possibilitat presenta avantatges importants, com és la rapidesa en la detecció, de vint-i-quatre a quaranta-vuit hores, amb una elevada especificitat i una sensibilitat significativa, d’un 97 % en mostres amb bacilloscòpies positives i d’un 47-65 % en mostres negatives.

Tècniques fonamentades en la seqüenciació Es considera el mètode de referència (Al-

El potencial de transmissió de les soques resistents respecte de les sensibles sempre ha estat una font de controvèrsia. Durant anys s’ha pensat que les soques resistents eren menys transmissibles, atès que en l’entorn de malalts resistents crònics no es generaven nous casos resistents i en els treballs portats a terme en conills d’Índies per Cohn i Middlebrook en els anys cinquanta es demostrava que les soques resistents eren menys virulentes. Es va relacionar la pèrdua de la capacitat catalasa-peroxidasa amb la resistència a la isoniazida i amb la disminució de la capacitat de virulència. Uns anys més tard, es descobrí que l’enzim catalasa-peroxidasa estava sintetitzat pel gen katG, i que les mutacions en aquest gen provocaven la pèrdua de l’activitat enzimàtica i de la transformació de la isoniazida a la forma activa (Zhang et al., 1992). En un treball ja clàssic, Snider et al. (1985) compararen les freqüències d’infecció de persones contactes de casos resistents i sensibles, i van observar que les proporcions d’infecció (mitjançant tuberculina) eren similars en ambdós tipus de contactes. Les dades de Snider no contradiuen les hipòtesis anteriors, i més aviat indiquen que la transmissió és un fenomen complex, que teòricament pot dividir-se en fases. Una primera fase és de transmissió física del bacteri del malalt a la persona exposada i desenvolupament de la resposta immunitària, una segona fase de latència del bacteri o de contenció per la immunitat local i els mediadors químics i cell. ulars i, finalment, la fase en què es manifesta la malaltia. Aquesta darrera únicament

RESISTÈNCIES ALS PRINCIPALS FÀRMACS ANTITUBERCULOSOS

passaria en el 10 % de les infeccions. L’estudi de Snider demostra que la capacitat de transmissió dels micobacteris resistents durant la primera fase no ha de ser diferent del sensibles, ja que és un fet físic lligat a la gènesi de partícules contagioses on el patró de susceptibilitat no té cap paper actiu. Amb la idea d’avaluar la importància i l’efecte en l’agressivitat de les soques amb alteracions al gen katG, Li et al. (1998) van comparar la capacitat de creixement de bacteris amb el gen delecionat i, posteriorment, restaurat. Com s’esperava, les soques sense gen perdien la capacitat de créixer però aquesta es recuperava en reintroduir el gen. Aquest fenomen provava que el gen katG és un factor de virulència per a M. tuberculosis. A més, quan els bacils van ser transformats en gens katG que presentaven mutacions puntuals, el nivell original de creixement detectat variava depenent del lloc de la mutació. S’ha calculat que entre el 50 % i el 60 % de les soques resistents a isoniazida estudiades presenten alguna alteració en aquest gen (Ramaswamy i Musser, 1998). La mutació més freqüent afecta el codó 315 i comporta un canvi d’aminoàcid (Haas et al., 1997; Marttila et al., 1998; Verdú et al., 2002). En els darrers anys s’han publicat diversos treballs que aporten més informació al fenomen de la transmissió. Soolingen et al. (2000) estudien soques resistents a isoniazida amb mutació al codó 315 del gen katG i proven que la mutació determina diferències en la transmissió. Altres estudis basats en epidemiologia molecular indiquen que la transmissió i producció de malaltia de les soques resistents i sensibles és similar (Alland et al., 1994; Marttila et al., 1998; Soolingen et al., 1999; GodfreyFaussett et al., 2000; Rie et al., 2000; Kruuner et al., 2001; Toungoussova et al., 2002; Vukovic et al., 2003). D’altres treballs han analitzat el nombre de soques agrupades segons el tipus d’antibiòtic per al qual són resistents, i distingeixen les monoresistències i les multiresistències (Teixeira et al., 2001). És remarcable l’estudi de Burgos et al., en què s’estudia

209

un volum important de casos i s’analitzen els casos secundaris apareguts durant un període de nou anys. Els autors estableixen un índex de transmissió de les soques resistents, i observen que les soques resistents a la isoniazida i les resistents a més d’un fàrmac es transmeten tres o quatre vegades menys que les sensibles, mentre que les resistents a estreptomicina o rifampicina no es veuen afectades. A més, altres treballs demostren amb epidemiologia molecular que soques resistents a la isoniazida amb mutacions al gen inhA es transmeten de manera similar a les soques sensibles (Tudó et al., 2004). Un altre aspecte a destacar és que les observacions experimentals mostren una correlació entre el tipus de mutació i la CMI de l’antibiòtic, i s’associen alteracions al gen katG amb resistència a concentracions elevades de la isoniazida (superiors a 1 μg/ml) i mutacions al gen inhA amb CMI baixes (Banerjee et al., 1994; Lonca et al., 2002). Així, les soques resistents a isoniazida amb el gen katG mutat, sense activitat enzimàtica detectable o molt disminuïda i amb CMI elevades, presentarien virulència atenuada, atès que les alteracions afecten dos enzims fonamentals per a la vida i el manteniment intracell. ular del bacil. En contraposició, les soques amb alteracions al gen inhA tindrien activitat catalasa-peroxidasa conservada i CMI baixa, i mantindria intacta la capacitat de transmissió. La influència dels altres fàrmacs sobre la capacitat de transmissió de les soques resistents és poc important, ja que no tenen un efecte directe sobre la viabilitat metabòlica del bacil i són ràpidament compensades per altres mutacions. També, la resistència simultània a més d’un fàrmac, la multiresistència, no és més que l’acumulació de les resistències individuals dels antibiòtics generades pel mateix tipus de mutacions. Sembla ser que en aquest tipus de soques la suma de totes les mutacions parcials podria disminuir considerablement la viabilitat metabòlica de la soca. Malgrat això, s’han descrit soques, com la Bei-

210

J. GONZÁLEZ I G. TUDÓ

jing, molt prevalent a la Xina i la resta d’Àsia que, tot i ser multiresistents, es transmetrien com les sensibles (Espinal, 2003). Així, es pot assumir que els malalts amb tuberculosi multiresistent sense afectació del gen katG mantindrien la capacitat de transmissió com si es tractés d’una soca sensible, però disminuirien la possibilitat de desenvolupar una tuberculosi activa, atès que l’elevat nombre de mutacions tindria un cost important en la viabilitat metabòlica del bacil, tot i les mutacions compensatòries produïdes. Atesa la informació disponible, serien raonables les següents conclusions: a) les pèrdues en la capacitat de transmissió es relacionarien amb dificultats per passar de l’estat latent a malaltia i no amb la capacitat d’infectar; b) la majoria de les soques resistents a fàrmacs diferents de la isoniazida conservarien la capacitat de transmissió; c) la resistència a la isoniazida per alteracions al gen katG, almenys les que afecten el codó 315 i les delecions, comportarien una disminució en el ﬁtness del bacteri, i en disminuirien la capacitat de transmissió; d) existeix una clara relació, encara que no sempre es compleixi, entre la CMI i el gen afectat; e) quan més alta és la CMI més difícil és la transmissió, tot i que pot tractar-se de soques on no s’han trobat alteracions al gen katG i f ) hi ha soques multiresistents, com la soca Beijing, que semblen conservar la seva transmissibilitat, tot i acumular resistències elevades a la isoniazida i a altres fàrmacs. RELACIÓ ENTRE LA CMI A LA ISONIAZIDA I LA RESISTÈNCIA CLÍNICA Quan es van establir les condicions de realització dels antibiogrames (Canetti i Grosset, 1961) es van definir una o dues concentracions per a cada fàrmac, utilitzades per decidir si una soca era o no resistent. Durant anys, la indicació d’antibiograma ha estat condicionada per la presència de símptomes

clínics que ho indiquessin. Darrerament, des de l’emergència de la tuberculosi amb la sida i l’aparició de brots multiresistents als EUA, s’ha difós la conducta de realitzar l’antibiograma sistemàticament. Aquest fet ha permès trobar soques amb resistència de baix nivell, properes al punt de tall. Això s’ha traduït en la troballa de soques resistents, sobretot a la isoniazida, amb mutació comprovable i que no es provaven clínicament (Tudó et al., 2004). S’explicaria per la persistència d’un efecte parcial del fàrmac i per l’acció compensatòria dels altres fàrmacs que es donen conjuntament. Aquest seria més evident amb l’ús de les teràpies combinades actuals que inclouen tres o quatre fàrmacs potents capaços de superar aquesta pèrdua d’activitat (Heifets i Cangelosi, 1999). Això planteja una qüestió pràctica en el maneig dels malalts: és necessari modificar el tractament d’acord amb l’antibiograma? No es pot respondre amb precisió, ja que intervenen altres factors que poden influir, com són l’estat immunitari del malalt (per exemple, si és VIH-positiu), l’extensió de la malaltia i, per tant, la càrrega bacteriana i la gravetat de cada cas. Aquest és un repte al qual caldrà respondre amb futurs estudis. BIBLIOGRAFIA Alcaide, F.; Gali, N.; Dominguez, J.; Berlanga, P.; Blanco, S.; Orus, P.; Martín, R. (2003). «Usefulness of a new mycobacteriophage-based technique for rapid diagnosis of pulmonary tuberculosis». J. Clin. Microbiol., vol. 41, pàg. 2867-2871. Alcaide, F.; Pfyffer, G. E.; Telenti, A. (1997). «Role of embB in natural and acquired resistance to ethambutol in mycobacteria». Antimicrob. Agents. Chemther., vol. 41, pàg. 2270-2273. Alland, D.; Kalkut, G.; Moss, A. [et al.] (1994). «Transmission of tuberculosis in New York City». N. Engl. J. Med., vol. 330, pàg. 1710-1716. Balagué, M.; Orcau, A.; Sánchez, P.; Tortajada, C.; Caylà, J. A. (2003). «Epidemiología actual de la tuberculosis en España: hacia una mejor vigilancia y control». Control de Calidad SEIMC. Banerjee, A.; Dubnau, E.; Quemard, A. [et al.] (1994). «InhA, a gene encoding a target for isoniazid and ethion-

RESISTÈNCIES ALS PRINCIPALS FÀRMACS ANTITUBERCULOSOS

amide in Mycobacterium tuberculosis». Science, vol. 263, pàg. 227-230. Canetti, G.; Froman, S.; Grosset, J. [et al.] (1963). «Mycobacteria: laboratory methods for testing drug sensitivity and resistance». Bull WHO, vol. 29, pàg. 565-578. Canetti, G.; Grosset, J. (1961) «Teneur des souches sauvages de Mycobacterium tuberculosis en variants resistants a la isoniazide et a variants resistants a la streptomicyne sur milieu de Löwenstein-Jensen». An. Inst. Pasteur, vol. 101, pàg. 28-46. Dickinson, J. M.; Allen, B. W.; Mitchison, D. A. (1989). «Slide culture sensitivity tests». Tubercle., vol. 70, pàg. 115121. Espasa, M.; González, J.; Alcaide, F. [et al.] (2002). «Use of real time PCR for direct detection in clinical samples of genetic polimorphism causing resistance to isoniazid and rifampicin in Mycobacterium tuberculosis. XII European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Disease». Clin. Microbiol. Infect., vol. 8 (supl. 1), pàg. 15. Espinal, M. A. (2003). «The global situation of MDR-TB». Tuberculosis, vol. 83, pàg. 4-51. Frieden, T. R.; Sterling, T.; Pablos-Méndez, A. [et al.] (1993). «The emergence of drug-resistant tuberculosis in New York City». N. Engl. J. Med., vol. 328, pàg. 521-526. García, L.; Alonso-Sanz, M.; Rebollo, M. J.; Tercero, J. C.; Chaves, F. (2001). «Mutations in the rpoB gene of rifampin resistant Mycobacterium tuberculosis isolates in Spain and their rapid detection by PCR-enzymelinked immunosorbent assay». J. Clin. Microbiol., vol. 39, pàg. 1813-1818. García de Viedma, D.; Díaz Infantes, M. S.; Lasala, F.; Chaves, F.; Alcalá, L.; Bouza, E. (2002). «New real time PCR able to detect in a single tube multiple rifampin resistance mutations and high level isoniazid resistance mutations in Mycobacterium tuberculosis». J. Clin. Microbiol., vol. 40. pàg. 988-995. Global AIDS Surveillance (2000) «Part I. Global situation of the HIV/AIDS pandemic, end 2000». Weekly Epidemiol. Rec., vol. 75. pàg. 379-383. Godfrey-Faussett, P.; Sonnenberg, P.; Shearer, S. C.; Bruce, M. C.; Mee, C.; Morris, L.; Murray, J. (2000). «Tuberculosis control and molecular epidemiology in a South Africa gold-mining community». Lancet, vol. 356, pàg. 1066-1071. Haas, W. H.; Schilke, K.; Brand, J. [et al.] (1997). «Molecular analysis of katG gene mutations in strains of Mycobacterium tuberculosis complex from Africa». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 41, pàg. 1601-1603. Heifets, L. B.; Cangelosi, G. A. (1999). «Drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosi: a neglected problem at the turn of the century». Int. J. Tuberc. Lung. Dis., vol. 3, pàg. 564-581. Kruuner, A.; Hoffner, S. E.; Sillastus, H. [et al.] (2001). «Spread of drug resistant pulmonary tuberculosis in Estonia». J. Clin. Microbiol., vol. 39, pàg. 3339-3345. Lee, A. S.; Teo, A. S.; Wong, S. Y. (2001). «Novel mutations in ndh in isoniazid-resistant Mycobacterium tuberculosis

211

isolates». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 45, pàg. 21572159. Lonca, J.; Manterola, J. M.; Alcaide, F. [et al.] (2002). «The relationship between the isoniazid resistant molecular mechanisms with the minimum inhibitory concentration and the catalase activity in Mycobacterium tuberculosis. XII European Congress of Clinical Microbiology and infectious Diseases». Clin. Microbiol. Infect., vol. 8 (supl. 1), pàg. 95. March, P. de (2001). «Resistencia a los fármacos antituberculosos en España. Evolución e influencia del virus de la inmunodeficiencia humana». Med. Clin. (Barc)., vol. 117, pàg. 59-63. Marttila, H. J.; Soini, H.; Eerola, E. [et al.] (1998). «A Ser315Thr substitution in katG is predominant in genetically heterogeneous multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates originating form the St. Petersburg area in Russia». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 42, pàg. 2443-2445. McClure, W. R.; Cech, C. L. (1978). «On the mechanism of rifampicin inhibition of RNA synthesis». J. Biol. Chem., vol. 253, pàg. 8949-8956. Meier, A.; Sander, P.; Schaper, K. J.; Scholz, M.; Bottger, E. C. (1996). «Correlation of molecular resistance mechanisms and phenotyping resistance levels in streptomycin-resistant Mycobacterium tuberculosis». Antimicrob. Agents. Chemother., vol. 40, pàg. 2452-2454. Mitchison, D. A. (1979). «Basic mechanisms of chemotherapy». Chest., vol. 76 (supl.), pàg. 771-781. OMS (1998). «Tuberculosis surveillance. European region, 1995-1996». Weekly Epidemiol. Rec., vol. 73, pàg. 347-351. OMS (2003). Global Tuberculosis Control. Surveillance, planning, ﬁnancing: 2003 report. Gènova, Suïssa. [WHO/CDS/ TB. 2003.316] OMS/IUATLD (2000). Anti-tuberculosis drug resistance in the world. Report n. 2. Prevalence and Trends. The WHO/IUATLD global project on anti-tuberculosis drug resistance surveillance. Gènova: Suïssa. [WHO/CDS/TB/2000.278] Ramaswamy, S.; Musser, J. M. (1998). «Molecular genetic basis of antimicrobial agent resistance in Mycobacterium tuberculosis: 1998 update». Tubercle. Lung. Dis., vol. 79, pàg. 3-29. Rie, A. van; Warren, R.; Richarson, M. [et al.] (2000). «Classification of drug-resistant tuberculosis in an epidemic area». Lancet, vol. 356, pàg. 22-25. Rossau, R.; Traore, H.; Beenhower, H. de [et al.] (1997). «Evaluation of the INNO-LIPA Rif. TB assay, a reverse hybridization assay for the simultaneous detection of Mycobacterium tuberculosis complex and its resistance to rifampin». Antimicrob. Agents. Chemoter., vol. 41, pàg. 20932098. Rozwarski, D. A.; Grant, G. A; Barton, D. H. R. [et al.] (1998). «Modification of the NADH of isoniazid target (inhA) from Mycobaterium tuberculosis». Science, vol. 279, pàg. 98-102. Schwoebel, V.; Lambregts-van Weezenbeek, C. S. B.; Moro, M. L.; Drobniewski, F.; Hoffner, S. E.; Ra-

212

J. GONZÁLEZ I G. TUDÓ

viglione, M. C.; Rieder, H. L. (2000). «Standardization of antituberculosis drug resistance surveillance in Europe». Eur. Respir. J., vol. 15, pàg. 364-371. Snider Jr., D. E.; Kelly, G. D.; Cauthen, G. M.; Thompson, N. J.; Kilburn, J. O. (1985). «Infection and disease among contacts of tuberculosis cases with drug-resistant and drug-susceptible bacilli». Am. Rev. Respir. Dis., vol. 13, pàg. 125-132. Soolingen, D. van; Borgdorff, M. W.; Haas, P. E. de [et al.] (1999). «Molecular epidemiology of tuberculosis in the Netherlands: a nation-wide study from 1993 through 1997». J. Infect. Dis., vol. 180, pàg. 726-736. Soolingen, D. van; Haas, P. E. de; Doorn, H. R. van; Kuijper, E.; Rinder, H.; Borgdoff, M. W. (2000). «Mutations at amino acid position 315 of the katG gene associated with high-level resistance to isoniazid, other drug resistance, and successful transmission of Mycobacerium tuberculosis in The Netherlands». J. Infect. Dis., vol. 182, pàg. 1788-1790. Sreevatsan, S.; Pan, X.; Stockbauer, K. E. [et al.] (1996). «Characterization of rpsL and rrs mutations in streptomycin resistant Mycobacterium tuberculosis isolates from diverse geographic localities». Antimicrob. Agents. Chemother., vol. 40, pàg. 1024-1026. Teixeira, L.; Perkins, M. D.; Johnson, J. L. [et al.] (2001). «Infection and disease among household contacts of patients with multidrug-resistant tuberculosis». Int. J. Tuberc. Lung. Dis., vol. 5, pàg. 321-328. Telenti, A.; Honoré, N.; Bernasconi, C. [et al.] (1997). «Genotypic assessment of isoniazid and rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis: a blind study at reference laboratory level». J. Clin. Microbiol., vol. 35, pàg. 719723. Telenti, A.; Imboden, P.; Marchesi, F.; Schmidheini, T.; Bodmer, T. (1993). «Direct, automated detection of rifampin resistant Mycobacterium tuberculosis by polymerase chain reaction and single strand conformation polymorphism». Antimicrob. Agents. Chemother., vol. 37, pàg. 2054-2058. Torres, M. J.; Criado, A.; Palomares, J. C.; Aznar, J. (2000). «Use of real time PCR and fluorimetry for rapid

detection of rifampin and isoniazid resistance associated mutations in Mycobacterium tuberculosis». J. Clin. Microbiol., vol. 38, pàg. 3194-3199. Toungoussova, O. S.; Sandven, P.; Mariandyshev, A. O.; Nizovtseva, N. I.; Bjune, G.; Caugant, D. A. (2002). «Spread of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis strains of the Beijing genotype in the Archangel Oblast, Russia». J. Clin. Microbiol., vol. 40, pàg. 1930-1937. Troesch, A.; Nguyen, H.; Miyada, C. G.; Desvarenne, S.; Gingeras, T. R.; Kaplan, P. M. [et al.] (1999). «Mycobacterium species identification and rifampin resistance testing with high-density DNA probe arrays». J. Clin. Microbiol., vol. 37, pàg. 49-55. Tudó, G.; González, J.; Obama, R.; Rodríguez, J. M.; Franco, J. R.; Espasa, M.; Simarro, P.; Escaramís, G.; Ascaso, C.; García, A.; Jiménez de Anta, M. T. (2004). «Study of resistance to anti-tuberculosis drug in five district of Equatorial Guinea: rates, risk factors, genotyping of gene mutations and molecular epidemiology». Int. J. Tuberc. Lung. Dis., vol. 8, pàg. 15-22 Verdú, E.; March, F.; Cortés, P. [et al.] (2002). «Molecular mechanism of isoniazid and rifampicin resistance in Mycobacterium tuberculosis from Barcelona. XII European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Disease». Clin. Microbiol. Infect., vol. 8 (supl. 1), pàg. 9495. Vukovic, D.; Rüsch-Gerdes, S.; Savic, B.; Niemann, S. (2003). «Molecular epidemiology of pulmonary tuberculosis in Belgrade, Central Serbia». J. Clin. Microbiol., vol. 41, pàg. 4372-4377. Williams, D. L; Spring, L.; Gillis, T. P.; Salfinger, M.; Persing, D. H. (1998). «Evaluation of a polymerase chain reaction-based universal heteroduplex generator assay for direct detection of rifampin susceptibility of Mycobacterium tuberculosis from sputum specimens». Clin. Infect. Dis., vol. 26, pàg. 446-450. Zhang, Y.; Heym, B.; Allen, B.; Young, D.; Cole, S. T. (1992). «The catalase-peroxidase gene and isoniazid resistance of Mycobacterium tuberculosis». Nature., vol. 358, pàg. 591-593.

Antimicrobians (Joaquim Ruiz, ed.) Treballs de la SCB. Vol. 55 (2004) 213-229

TERAPÈUTICA ANTIPARASITÀRIA Inés M. Oliveira Unitat de Medicina Tropical i Salut Internacional, Hospital Clínic de Barcelona. Adreça per a la correspondència: Inés M. Oliveira Souto. Unitat de Medicina Tropical i Salut Internacional, Hospital Clínic de Barcelona. Rosselló, 132. 08036 Barcelona. Adreça electrònica: inessoli@yahoo.es. RESUM Els paràsits són els més oblidats dels microorganismes patògens. El fet que la seva major prevalença es doni als països de l’àrea tropical, països pobres en la seva major part, potser influeix en aquest fet. Actualment es disposen de diferents productes amb capacitat de combatre infeccions d’aquests microorganismes. Paraules clau: Antiparasitaris, mecanismes de resistència, protozous, helmints, artròpodes. SUMMARY Parasites are the least studied pathogenic microorganisms. The fact that they are a problem mainly in tropical areas, where there are a big number of developing countries, possibly underlies this reality. Currently we can use different products active against those microorganisms. Keywords: Antiparasitic agents, resistance mechanisms, protozoa, helminths, arthropoda. INTRODUCCIÓ La quimioteràpia antiparasitària abraça tres grans grups de fàrmacs: els antihelmíntics, els antiprotozoaris i els fàrmacs utilitzats en el tractament dels ectoparàsits. Atesa la gran diversitat de paràsits existents, trobarem diferents famílies de fàrmacs en cadascun d’aquests grups. Actualment es coneixen set dianes d’acció dels fàrmacs antiparasitaris: síntesi de cofac-

tors, síntesi d’àcids nucleics, síntesi de proteïnes, síntesi de la membrana, funció microtubular, metabolisme energètic i funció neuromuscular (sols en helmints i artròpodes). De manera general la majoria dels fàrmacs antiprotozoaris actuen en el metabolisme biosintètic, mentre que els antihelmíntics afecten el metabolisme energètic o la funció neuromuscular (Aparicio et al., 2003). A continuació es descriuen les característiques farmacocinètiques, indicacions i me-

214

I. M. OLIVEIRA

canismes de resistència dels fàrmacs antiparasitaris. Atesa l’extensió del tema a tractar, únicament ens centrarem en els fàrmacs amb una utilitat més gran actualment. QUIMIOTERÀPIA DE LES HELMINTIASIS

Els antihelmíntics són compostos eficaços que guareixen relativament totes les infeccions causades per distomes o per helmints intestinals. Malgrat això, les infeccions sistèmiques causades per helmints tissulars, com la cisticercosi, l’equinococcosi, la filariasi i la triquinosi poden reaccionar sols de manera parcial als fàrmacs de què es disposa actualment.

Infeccions per helmints Els helmints, o verms patògens, són pluricell. ulars i macroscòpics, a diferència d’altres grups d’agents infecciosos, com els virus, fongs, bacteris i protozous. Es desenvolupen en diversos estadis, seguint cicles biològics en què poden intervenir un o diversos hostes. Les formes immadures envaeixen l’organisme humà travessant la pell intacta (sovint per picades d’insectes vectors) o pel tub digestiu. Dins de l’hoste, migren fins a arribar a l’òrgan diana i evolucionen fins a transformar-se en organismes madurs completament diferenciats. En general la població d’helmints sols pot incrementar-se amb una nova exposició a la font d’infecció, malgrat que hi ha excepcions, com Strongyloides stercoralis i Echinococcus sp. (Martínez Sánchez, 1999). Els helmints afecten més de dos mil milions de persones al món, amb una distribució geogràfica irregular, però amb un clar predomini en zones tropicals i subtropicals (Tracy i Webster, 2003c; Chan, 1997). A la taula 1 es mostra la relació dels principals helmints que parasiten l’home i la seva localització. Els helmints d’interès mèdic es divideixen en dos grans grups. Nematodes o cucs cilíndrics: No segmentats i amb sexes separats. Platihelmints o cucs plans: A la vegada es divideixen en dues classes: 1) Cestodes o tènies: Són segmentats i hermafrodites. També anomenats cucs en forma de cinta. 2) Trematodes o distomes: Són no segmentats, hermafrodites o bisexuats. Tenen forma de fulla d’arbre.

PROPIETATS FARMACOLÒGIQUES DELS ANTIHELMÍNTICS A la taula 2 es mostra la classificació dels principals antihelmíntics en relació amb la seva composició química. Benzimidazoles. A partir del descobriment el 1961 del tiabendazole per Brown et al. (1961), diversos antihelmíntics d’aquesta família van ser introduïts progressivament en la pràctica clínica. Els benzimidazoles són antihelmíntics d’ampli espectre caracteritzats per posseir un anell benzimidazole (unió d’anells benzè i imidazole). Els derivats de més gran utilitat terapèutica són els que posseeixen modificacions en les posicions 2, 5 o ambdues alhora en aquest anell (Martínez Sánchez, 1999). En general són poc hidrosolubles i, malgrat que són absorbits irregularment al tracte digestiu, la seva activitat antihelmíntica s’exerceix majoritàriament a aquest nivell, i exerceixen un rellevant paper en el tractament de les helmintiasis intestinals. Els benzimidazoles produeixen diversos canvis bioquímics en els nematodes sensibles, com per exemple inhibició de la fumarat-reductasa mitocondrial, disminució del transport de glucosa dependent dels microtúbuls i desacoblament de la fosforilació oxidativa que produeix la interrupció en la producció d’ATP (Lacey, 1988; Lacey, 1990). Cal dir, no obstant això, que la seva acció principal s’exerceix per mitjà de la interacció amb una proteïna del citosquelet, anomenada β-tubulina, que inhibeix la polimerització de microtúbuls. Tots aquests proces-

TERAPÈUTICA ANTIPARASITÀRIA

Taula 1. Espècie

215

Principals helmints que parasiten l’home Localització

Nematodes Enteroius vermicularis Trichuris trichiura Ascaris lumbricoides Ancylostoma duodenale/ Necator americanus Strongyloides stercoralis Capillaria philippinensis Trichostrongylus sp. Anisakis sp./Pseudoterranova sp. Trichinella spiralis Toxocara canis/Toxocara cati Angiostrongylus sp. Gnathostoma spinigerum Diroﬁlaria inmitis Dracunculus medinensis Wuchereria bencrofti Brugia malayi Loa loa Onchocerca volvulus Mansonella perstans

Intestinal Intestinal Intestinal Intestinal Intestinal Intestinal Intestinal Digestiva Tissular Tissular Tissular Tissular Tissular Tissular Limfàtica/hemàtica Limfàtica/hemàtica Tissular/hemàtica Tissular/hemàtica Tissular/hemàtica

Trematodes Fasciolopsis buski Fasciola hepatica Clonorchis sinensis Paragonimus westermani Schistosoma mansoni Schistosoma japonicum Schistosoma haematobium Schistosoma intercalatum Schistosoma mekongi

Intestinal Hepàtica/vies biliars Hepàtica/vies biliars Pulmonar Venes mesentèriques inferiors/sistema porta Venes mesentèriques sup. i inferiors/sistema porta Venes vesicals. Venes del recte i sistema porta Venes mesentèriques sup. i inferiors/sistema porta Venes mesentèriques superiors/sistema porta

Cestodes Taenia saginata Taenia solium Taenia asiatica Dyphyllobothrium latum Hymenolepis nana Dipylidium caninum Echinococcus granulosus Echinococcus multilocularis

Intestinal Intestinal/tissular Intestinal Intestinal Intestinal Intestinal Tissular Tissular

Akira, I. [et al.] (2003). «Human taeniasis and cisticercosis in Asia». Lancet, vol. 362, pàg. 1918-1920.

sos condueixen a la immobilització i la mort del paràsit. La toxicitat selectiva d’aquests compostos es deu al fet que la unió amb la β-tubulina del paràsit es produeix en concen-

tracions molt més petites que les necessàries per a unir-se a proteïnes de mamífers (Tracy i Webster, 2003c) Els benzimidazoles més emprats són el

216

I. M. OLIVEIRA Taula 2. Principals fàrmacs antihelmíntics en funció de la seva composició química

Grup químic

Fàrmacs

Benzimidazoles

mebendazole tiabendazole albendazole triclabendazole niclosamida bitionol ivermectina suramina metrifonat citrat de piperazina dietilcarbamazina praziquantel pamoat de pirantel oxamniquina

Derivats fenòlics Lactona macrocíclica Naftilamidina sulfatada Organofosforats Piperazina Pirazinoisoquinolina Tetrahidropirimidina Tetrahidroquinoleïna

mebendazole i l’albendazole. Tabendazole, flubendazole i triclabendazole són emprats en menor mesura per la seva menor eficàcia o per la seva major toxicitat, encara que existeixen malalties, com la fasciolasi, en què no existeixen alternatives terapèutiques al triclabendazole (Wessely et al., 1988). Mecanismes de resistència. Els mecanismes identificats de resistència a aquests fàrmacs s’associen amb la reducció de la unió a la tubulina, 1994), i es creu que és causada per canvis en els aminoàcids propers al domini d’unió al GTP, de manera que es modifica la unió benzimidazole-tubulina (Kwa et al., 1993). Encara que s’han notificat canvis en diversos aminoàcids, la mutació més important codifica una tirosina en lloc d’una fenilalanina a la posició 2000 de la β-tubulina (Kwa et al., 1994; Albonico et al., 2004). Albendazole. L’albendazole és un carbamat benzoimidazòlic amb efectes antihelmíntics tissulars i intestinals. Va ser introduït originalment com a droga d’ús veterinari el 1975, i posteriorment va ser emprada en humans. És més actiu que el mebendazole i menys tòxic que altres benzimidazoles (Bennet i Guyatt, 2000). Propietats farmacocinètiques. L’albendazole s’absorbeix menys del 5 % després de l’admi-

nistració oral. El fàrmac sofreix ràpidament un metabolisme de primer pas al fetge i no es detecta generalment en plasma. El sulfòxid d’albendazole és el metabòlit actiu, i té una semivida plasmàtica molt variable (entre quatre i quinze hores). Aquest metabòlit s’uneix a les proteïnes plasmàtiques en un 70 % (Jung et al, 1992). Assoleix concentracions plasmàtiques de quinze a vint cops superiors a les del mebendazole i després de creuar la barrera hematoencefàlica, la concentració al líquid cefaloraquidi és un terç de la plasmàtica. L’eliminació es produeix principalment al ronyó, i només n’apareix una petita proporció a la bilis (Marriner et al., 1986). Indicacions terapèutiques. L’albendazole té activitat larvicida i vermicida enfront de nematodes i ovicida enfront d’Ascaris lumbricoides i Trichuris trichiuria. Nematodes intestinals: Ascaris lumbricoides, Oxiuros, Ancylostoma duodenale, Necator americanus, Strongyloides stercoralis, Trichuris trichiuria i Capillaria philippinensis. Nematodes tissulars: Toxocara sp., Ancylostoma canis, Ancylostoma braziliense, Gnathostoma sp., Mansonella perstans, Trichinella spiralis. Cestodes: Echinococcus granulosis, E. multilocularis i neurocisticercosis (Taenia solium). Trematodes: Clonorchis sp. Mebendazole. Des de 1971 el mebendazole és el carbamat benzoimidazòlic prototipus en el tractament de les infeccions intestinals per cucs rodons (Brumgmans et al, 1971). És menys actiu que l’albendazole i menys tòxic que altres benzimidazoles. Propietats farmacocinètiques. El mebendazole presenta baixa absorció al tracte gastrointestinal, a causa de la seva hidrosolubilitat limitada. Sofreix una important eliminació de primer pas al fetge (80 %) i es lliga a proteïnes plasmàtiques en una proporció del 95 %. Presenta una vida plasmàtica que oscill. a entre 1,5 i 5,5 hores. La seva excreció es produeix en forma activa i metabolitzada per l’orina (Florez, 2003). Indicacions terapèutiques. És el tractament

TERAPÈUTICA ANTIPARASITÀRIA

d’elecció en infeccions per nematodes intestinals: Ascaris lumbricoides, Enteroius vermicularis, Ancylostoma duodenale, Necator americanus i Trichuris trichiura. Nematodes tissulars: Gnathostoma sp. i Mansonella perstans. Pot ser un tractament alternatiu en infeccions per Toxocara, Trichinella spiralis, Capilaria philippinensis, Onchocerca volvulus i Equinococcus granulosus. Tiabendazole. El tiabendazole posseeix un anell tiazole en la posició 2 (2-[4 -tiazoli]-benzimidazole). El seu ús clínic ha declinat en els darrers anys, atès que presenta un nombre més gran de reaccions adverses que altres fàrmacs benzimidazòlics igual d’eficaços. Propietats farmacocinètiques. S’absorbeix molt bé i amb rapidesa al tub digestiu (90 %). És metabolitzat gairebé en la seva totalitat per hidroxilació i ulterior conjugació al fetge. Assoleix concentracions màximes en plasma passada una hora i presenta principalment excreció renal (Florez, 2003; Martínez Sánchez, 1999). Indicacions terapèutiques. Nematodes intestinals: Strongyloides stercoralis, tractament tòpic de la larva cutània migrans, larva visceral causada per Toxocara canis i Toxocara catis. Pot produir un cert benefici en la triquinosi primerenca, i ataca les larves en desenvolupament. En canvi, posseeix poca activitat enfront de larves migrans, femelles adultes i cists de Trichinella spiralis (Tracy i Webster, 2003c). Triclabendazole. El triclabendazole és un antihelmíntic d’espectre reduït amb acció específica contra trematodes. És altament efectiu contra Fasciola hepatica i Fasciola gigantica (Wessely et al., 1988). Es diferencia estructuralment dels altres benzimidazoles (6-cloro-5[2,3-diclorofenoxi]-2-metiltio-benzimidazole) i la seva activitat fasciolicida sembla relacionada amb la forma del grup metilsulfinil en posició 2, del sulfòxid de triclabendazole (Martínez Sánchez, 1999; Lipkowitz i McCracken, 1991). Propietats farmacocinètiques. Presenta absorció oral ràpida i es metabolitza al fetge. Es

217

transforma en dos metabòlits: sulfòxid i sulfona. Indicacions terapèutiques. Fasciolicida per al tractament i control de tots els estadis (immadur jove, immadur i adult) de Fasciola hepatica i Fasciola gigantica (Apt et al., 1995). Ús veterinari i humà.

Derivats fenòlics Niclosamida. La niclosamida és un derivat salicilanilídic halogenat introduït a la dècada dels seixanta amb un espectre pràcticament limitat als cestodes de localització intestinal. Mecanisme d’acció. Bloqueja el metabolisme energètic dels cestodes inhibint la fosforilació oxidativa de l’ADP mitocondrial als escòlexs i als primers anells de la tènia adulta (Martínez Sánchez, 1999; Aparicio et al., 2003). Propietats farmacocinètiques. Absorció gairebé null. a al tub digestiu, per la qual cosa no és actiu enfront de les larves dels cestodes. Eliminació fecal. Indicacions terapèutiques. Cestodes adults: Taenia saginata, Taenia solium, Taenia asiatica, Diphyllobothrium latum i Hymenolepis nana.

Lactona macrocíclica Ivermectina. La ivermectina pertany a la família de les avermectines, una classe de lactones aïllades a partir del cultiu de l’actinomicet de la terra Streptomyces avermitilis (Burg et al., 1979). És un fàrmac que s’utilitza a bastament en infeccions causades per nematodes i artròpodes des que la FDA aprovà el seu ús en humans el 1996. Mecanisme d’acció. El fàrmac immobilitza els microorganismes induint paràlisi tònica als seus músculs. Actua als canals de les membranes cell. ulars incrementant l’entrada de ions carregats negativament, sobretot de Cl –. La hiperpolarització de les membranes produeix la paràlisi muscular en nematodes i artròpodes.

218

I. M. OLIVEIRA

Abans es creia que la diana de la ivermectina eren els canals de Cl – regulats per GABA, però finalment s’ha demostrat que indueix el pas de Cl – per canals independents d’aquest neurotransmisor (Martínez Sánchez, 1999; Ottesen i Campbell, 1994). Propietats farmacocinètiques. Absorció digestiva ràpida. La ivermectina té una semivida plasmàtica de dotze hores, i els seus metabòlits de tres dies. Presenta bona difusió tissular, s’uneix en gran percentatge a les proteïnes plasmàtiques (93 %) i s’elimina principalment per les femtes (Klotz et al., 1990). Indicacions terapèutiques. Microfilaricida: Onchocerca volvulus, Wuchereria bancrofti, Brugia malayi, Loa loa i Mansonella ozzardi. Altres indicacions: Strongyloides stercoralis, Ascaris lumbricoides, Trichuris trichiura, Enteroius vermicularis, larva cutània migrans, acaricida i insecticida.

Piperazina Dietilcarbamazina (DEC). Mecanisme d’acció. Provoca paràlisi i immobilització de les microfilàries per mitjà de la hiperpolarització de les seves membranes, i afavoreix el seu desplaçament. A més, la DEC modifica les membranes de les microfilàries, i les fa més susceptibles a la fagocitosi per part del sistema de monòcits tissulars. També presenta una certa acció enfront dels cucs adults de Wuchereria bancrofti, Loa loa i espècies de Brugia malayi, malgrat que se’n desconeix el mecanisme. El fàrmac exerceix poc efecte in vitro, malgrat que in vivo posseeix una gran activitat. Aquest fet fa suposar que necessita algun factor desencadenat per la interacció entre fàrmac, paràsit i malalt (Tracy i Webster, 2003c; Florez, 2003). Propietats farmacocinètiques. Presenta una absorció digestiva ràpida, amb una semivida plasmàtica de 8-12 hores, depenent del pH de l’orina (si és alcalí, s’augmenta la vida mitja-

na). Es distribueix en tots els teixits, excepte a l’adipós, i presenta, fonamentalment, eliminació urinària (Martínez Sánchez, 1999). Indicacions terapèutiques. Microfilaricida: Wuchereria bancrofti, Onchocerca volvulus, Brugia malayi, Brugia timori i Loa loa. A grans dosis i durant períodes prolongats pot ser macrofilaricida en els casos anteriors, a excepció d’Onchocerca volvulus.

Pirazinoisoquinolina Praziquantel. El praziquantel és un derivat pirazinoisoquinolínic. Les seves propietats anticestocides i antitrematodocides van ser descrites inicialment en animals el 1977 (Gönnert i Andrews, 1977). Un any més tard, es realitza el primer estudi en voluntaris (Leopold et al., 1978), i el 1979 els primers assaigs clínics demostraren la seva efectivitat en el tractament de l’esquistosomosi (Katz et al., 1979). Mecanisme d’acció. El mecanisme molecular precís de l’acció del praziquantel encara és desconegut (Day et al., 1992). Se sap que produeix un augment de l’activitat muscular que termina en contracció i paràlisi espàstica de la musculatura dels esquistosomes adults, i que causa danys als teguments dels cucs (vacuolització i vesiculització) a més grans concentracions. Aquest efecte probablement sigui causat pel flux ràpid de Ca +2 dins de l’esquistosoma (Cioli i Picca-Mattoccia, 2003; Florez, 2003). Propietats farmacocinètiques. Absorció important i ràpida. S’assoleixen les concentracions plasmàtiques màximes en 1-2 hores. Pateix un metabolisme de primer pas important al fetge i es fixa a proteïnes plasmàtiques en més del 70 %. Semivida plàsmatica d’1-5 hores en funció de la dosi, ja que la seva farmacocinètica guarda relació amb la dosi administrada. Travessa la barrera hematoencefàlica en un 1020 %. L’excreció es realitza fonamentalment en forma de metabòlits a l’orina al llarg de

TERAPÈUTICA ANTIPARASITÀRIA

les primeres vint-i-quatre hores (Florez, 2003; Martínez Sánchez, 1999). Indicacions terapèutiques. Trematodes: Esquistosomosi (Schistosoma mansoni, Schistosoma haematobium, Schistosoma japonicum, Schistosoma intercalatum), Clonorchis sinensis i Paragonimus westermani, entre d’altres. Cestodes adults: Taenia solium, Taenia saginata, Taenia asiatica, Diphylobotrium latum i Hymenolepis nana. Cestodes larvals: Taenia solium. Mecanismes de resistència. Des de les primeres crides sobre la possible resistència al praziquantel al nord del Senegal el 1994 (Gryseels et al., 1994), atribuïdes inicialment a les peculiaritats epidemiològiques d’aquest focus —elevat nombre de verms per malalt, alt percentatge de paràsits immadurs i ràpida reinfecció (Cioli, 2000; Gryseels et al., 2001)—, s’han descrit diverses soques on s’ha demostrat, tant in vitro (Ismail et al., 1999) com in vivo (Benett et al., 1997), una disminució de la seva sensibilitat al praziquantel. Existeixen diverses hipòtesis per a explicar la resistència, retard en la maduració del paràsit, mutacions als receptors del fàrmac o regulació de l’exposició de les proteïnes superficials del paràsit, però el mecanisme exacte encara no es coneix (Martínez Sánchez, 1999).

Tetrahidroquinoleïna Oxamniquina. L’oxamniquina és un derivat 2-aminometiltetrahidroquinolínic emprat com a fàrmac de segona elecció en la terapèutica d’infeccions per Schistosoma mansoni. Mecanisme d’acció. Produeix activació enzimàtica dependent de l’ATP. L’oxamniquina produeix un èster fosfat inestable que es dissocia en un producte químicament actiu que, a la vegada, alquila macromolècules essencials i inhibeix la síntesi de DNA, RNA i proteïnes (Martínez Sánchez, 1999). Els cucs mascles adults són més sensibles al fàrmac i les femelles residuals deixen de posar ous des-

219

prés de l’exposició al fàrmac (Aparicio et al., 2003). Propietats farmacocinètiques. Aquest fàrmac presenta bona absorció digestiva, malgrat que pateix un procés de primer pas i intensa metabolització al fetge. Semivida plasmàtica d’13 hores, biodisponibilitat del 60 %. L’eliminació es produeix fonamentalment per l’orina en forma de metabòlits inactius. Indicacions terapèutiques. Schistosoma mansoni. QUIMIOTERÀPIA DELS PROTOZOUS Dins de les infeccions per protozous són incloses malalties de gran morbiditat i mortalitat al món, com la malària, la tripanosomiasi i la leishmaniosi. A diferència de gairebé tots els helmints, els protozous poden multiplicarse sexualment, asexualment o d’ambdues maneres dins de l’hoste. Les vies fonamentals de transmissió són la via fecal-oral per als protozous intestinals i Toxoplasma gondii i per mitjà de vectors, generalment insectes, per a la majoria dels protozous hemàtics i tissulars. Els principals patògens protozoaris per a l’espècie humana es recullen a la taula 3, mentre que a la taula 4 són mostrats els principals compostos emprats en la terapèutica antiprotozoària. Seguidament es descriu la farmacocinètica, indicacions i mecanismes de resistència per als principals fàrmacs de cada grup.

Els antipalúdics Els antipalúdics, fàrmacs utilitzats en el tractament de la malària o paludisme, constitueixen un grup molt important, pel fet de ser la malaltia parasitària humana més devastadora. Es calcula que dels 300-500 milions de persones que contrauen la malaltia cada any, en moren dos o tres, i el 95 % d’aquestes morts són a l’Àfrica subsahariana (Murray et al., 2004).

220

I. M. OLIVEIRA

Taula 3.

Principals protozous patògens en humans

Classe

Gènere

Espècie

Sarcodina

Entamoeba

histolytica fowleri culberstsoni castellani astronyxis poliphaga

Naegeria Acanthamoeba

Mastigophora (flagelats)

Leishmania

Dientamoeba Trypanosoma

Ciliphora (ciliata)

Giardia Trichomonas Balantidium

Sporozoa

Plasmodium

Toxoplasma Pneumocystis Isospora Cryptosporidium

donovano tropica braziliensis mexicana fragilis gambiense rhodesiense cruzi lamblia vaginalis coli falciparum malariae vivax ovale gondii carinii hominis belli

En funció de la seva activitat enfront de les diferents etapes del cicle vital de Plasmodium aquests compostos es classifiquen en tres grups: esquizonticides sanguinis, esquizonticides tissulars i gametocitocides. Alguns fàrmacs posseeixen més d’una activitat antipalúdica. La resistència de Plasmodium als diversos fàrmacs antimalàrics constitueix avui dia un dels principals reptes sanitaris al món. Actualment l’OMS aposta per la combinació de diferents antipalúdics per alentir l’aparició de resistències. Un exemple clar és l’acord assolit per GlaxoSmithKline, Iniciativa per Medicines per a la Malària (MMV, Medicines for Malaria Venture) i l’OMS/TDR per al desenvolupament i comercialització de la combinació de tres antimalàrics: el clorproguanil, la dapsona i l’artesunat, sota el nom comú de CDA (Kanyok, 2004).

Esquizonticides sanguinis. Aquests fàrmacs actuen enfront de les etapes eritrocítiques asexuades dels paràsits, interrompen l’esquizogònia eritrocítica i produeixen la cura clínica del paludisme. Per a l’eliminació completa del paràsit es necessita una teràpia ininterrompuda al llarg del tractament. La terapèutica inadequada amb esquizonticides hemàtics pot produir recrudescència de la infecció per esquizogònia eritrocítica. Dins d’aquest grup podem dividir els fàrmacs en funció de si exerceixen l’acció esquizonticida de manera ràpida o més lenta. En general se n’associen dos d’acció ràpida o un d’acció ràpida i un d’acció més lenta, encara que la tendència actual és associar fins a tres compostos. Esquizonticides tissulars: Són els fàrmacs necessaris per a l’eliminació dels hipnozoïts en la malària per P. vivax i P. ovale. Gametocitocides: Són els fàrmacs que destrueixen les formes sexuades eritrocítiques del plasmodi, i eviten així la transmissió als mosquits. No és habitual l’ús d’aquests fàrmacs en humans únicament per les seves accions gametocitocides. A continuació es descriuen els antipalúdics amb major utilitat clínica per ordre alfabètic.

Aminoquinolines i arilaminoalcohols Amodiaquina. Pertany al grup de les 4aminoquinolines i posseeix característiques molt similars a les de la cloroquina. Existeixen soques de P. falciparum que, sent resistents a la cloroquina, són encara sensibles a l’amodiaquina. Propietats farmacocinètiques. Absorció digestiva ràpida. Biodisponibilitat elevada. A l’organisme es converteix en un metabòlit actiu, la desetilamodiaquina, amb una semivida molt prolongada. Cloroquina. La cloroquina va ser dels primers derivats de les 4-aminoquinolines que mostrava activitat antipalúdica. El compost

TERAPÈUTICA ANTIPARASITÀRIA

Taula 4.

Principals fàrmacs antiprotozoaris en funció de la seva composició química o mecanisme d’acció

Grup químic

Fàrmacs

5-nitroimidazoles 8-hidroxiquinolines Aminoglucòsids Quinolines i compostos relacionats Inhibidors de la dihidrofolat-reductasa Derivats de qinghaosu Antibacterians Tripanosomicides

Metronidazole, nimorazole, secindazole, ornidazole i tinidazole Iodoquinol, primaquina Paramomicina Cloroquina, quinina, mefloquina, halofantrina Pirimetamina, proguanil Artemisina, artemeter Doxiciclina, clindamicina, azitromicina i cotrimoxazole Pentamidina, suramina, eflornitina, melarsoprol, nifurtimox, antimonials pentavalents, amfotericina B, ketoconazole, itraconazole i alupurinol Amfotericina B, pentamidina, antimonials pentavalents

Leishmanicides

221

va ser desenvolupat a Alemanya des de 1934 (Tracey i Webster, 2003a). Actualment la cloroquina presenta importants limitacions a causa de l’aparició creixent de soques resistent de P. falciparum en molts països d’Àfrica, Amèrica del Sud i Àsia. Propietats farmacocinètiques. Presenta ràpida absorció al tub digestiu després de l’administració oral. El 30 % és metabolitzada per mitjà del sistema del citocrom P450 en dos compostos parcialment actius: desetilcloroquina i bidesetilcloroquina. La cloroquina es distribueix amb lentitud en un volum molt gran, en produir-se un segrest intens del fàrmac als teixits, cosa que contribueix a la lenta eliminació de l’organisme. S’uneix de manera moderada a proteïnes plasmàtiques (60 %) i la seva excreció es produeix parcialment per l’orina (Florez, 2003). Mecanisme d’acció. El mecanisme íntim de l’acció esquizonticida de la cloroquina i d’altres 4-aminoquinolines està per aclarir, però el mecanisme més acceptat és la inhibició de la polimerització de l’hemo en estadis inicials del cicle del paràsit (Slater i Ceremi, 1992). La digestió de l’hemoglobina pels paràsits intraeritrocitaris té lloc a l’interior dels vacúols digestius. Els esquizonticides mostren afinitat per un dels pigments propis d’aquesta degradació oxidativa que realitza el paràsit de l’hemoglobina: la ferriprotoporfirina ix o hemina. Aquest pigment, que és tòxic per al

paràsit, ha de ser transformat en un altre complex inert gràcies a la unió amb una proteïna sintetitzada per Plasmodium per a formar el pigment palúdic o hemozoïna. Tant la cloroquina com la quinina tenen capacitat d’unirse amb gran afinitat a la ferriprotoporfirina ix i impedeixen que aquesta s’uneixi a la proteïna fixadora i és destoxicada en hemozoïna. Finalment, el complex format per la cloroquinaferriprotoporfirina ix lesiona les membranes de Plasmodium i produeix la seva mort (Florez, 2003). Mecanismes de resistència. La resistència a la cloroquina s’associa amb una disminució de la concentració del fàrmac a les vacuoles àcides on es produeix la digestió de l’hemoglobina. Els paràsits resistents expulsen el fàrmac quaranta o cinquanta vegades més depressa que els Plasmodium sensibles (Segovia Hernández et al., 1999). S’han associat els següents marcadors moleculars amb la resistència a la cloroquina (Wongsrichanalai et al., 2002): — Fortament associat: pfcrt Thr76. — Possiblement associats: pfmdr1 Tyr86, Phe 184, Cys 1034, Asp 1042, Tyr1246. Indicacions terapèutiques. Posseeix activitat antiinflamatòria, amebicida i antipalúdica. Activitat antipalúdica: activa sobre les formes asexuades eritrocitàries de P. malariae, P. ovale, P. vivax i algunes soques de P. falciparum sensibles. És gametocida sobre P. malariae i P.

222

I. M. OLIVEIRA

vivax. Utilitzada com a profilaxi i tractament, excepte en zones de P. falciparum resistents. Activitat antiinflamatòria: inhibidor de la síntesi de prostaglandines (ciclooxigenasa). Útil en el tractament de l’artritis reumatoide, artritis juvenil, espondiloartritis i malalties autoimmunitàries. Activitat amebicida: activa enfront de formes extraintestinals d’Entamoeba histolytica. Halofantrina. És un 9-fenantrenometanol amb estructura similar a la quinina que posseeix activitat esquizonticida enfront de soques de Plasmodium sensibles i resistents a la cloroquina, incloses les soques de P. falciparum multiresistents. El mecanisme d’acció és poc conegut, i s’han proposat com a possibles mecanismes la inhibició de la ferroprotorfirina ix, la inhibició d’una bomba de protons present a la interfície hoste-paràsit i alteracions mitocondrials. Han aparegut resistències a aquest fàrmac en malalts tractats únicament amb mefloquina, cosa que indica la possible resistència creuada entre els dos fàrmacs (Segovia Hernández et al., 1999; Bryson i Goa, 1992). Lumefantrina. És un arilaminoalcohol, semblant a l’halofantrina, desenvolupat per l’exercit xinès fa més de vint anys. No s’empra en monoteràpia, sinó associat a l’artemeter en la malària per P. falciparum no complicada. El sinergisme de la combinació es deu al fet que ambdós compostos interfereixen en l’hemodestoxicació. L’eficàcia de l’associació lumefantrina-artemeter pot estar limitada en determinades regions per les resistències creuades amb la mefloquina (Wiesner et al., 2003). Meﬂoquina. És un derivat químic quinolínic-metanol de la quinina, amb la qual té semblances estructurals i de funció. Activa enfront dels estadis intraeritrocitaris de Plasmodium. Propietats farmacocinètiques. Només disponible per a ús oral. Presenta bona absorció digestiva, es distribueix àmpliament i en un 99 % s’uneix a les proteïnes plasmàtiques. La seva vida mitjana és llarga, amb una mitjana de tres setmanes. La mefloquina es metabolitza

en gran mesura al fetge i la seva eliminació es realitza a través de bilis i femtes (Tracy i Webster, 2003a). Mecanisme d’acció. El seu mecanisme exacte d’acció no és conegut clarament, i es creu que podria ser semblant al de la quinina, però no s’intercala dins de les fibres del DNA. És esquizonticida sanguini i presenta gran afinitat per les membranes dels eritròcits, i es fixa fortament als fosfolípids. Aquesta és la raó per la qual actua sobre el paràsit durant l’etapa de trofozoït, a l’eritròcit (Florez, 2003). Mecanismes de resistència. Existeixen proves de l’existència de soques resistents a aquesta droga abans de la introducció del fàrmac en determinades àrees geogràfiques. Aquest fet podria indicar que l’ús previ de fàrmacs estructuralment similars ha pogut seleccionar soques resistents. Indicacions terapèutiques. Tractament de malària no complicada (només és disponible per a ús oral i no parenteral) per P. falciparum en zones resistents a la cloroquina. Profilaxi antipalúdica en àrees resistents a cloroquina. En ambdós casos no s’emprarà com a tractament o profilaxi en zones del sud-est asiàtic i la conca amazònica, atesa l’existència de soques resistents. Quinina. La quinina, principal alcaloide de l’escorça de l’arbre Chinchona oﬃcinalis, fou el primer fàrmac utilitzat amb èxit en el tractament del paludisme. Propietats farmacocinètiques. Presenta bona absorció digestiva o intramuscular. La seva farmacocinètica varia segons la intensitat de la infecció, i es troben xifres sanguínies més elevades en subjectes sans que en malalts amb malària. En el paludisme greu es genera una glucoproteïna (δ-1-glucoproteïna) que s’uneix a la quinina, cosa que fa minvar la fracció lliure del fàrmac i la seva toxicitat. Els efectes secundaris de la quinina són dependents de la dosi, reversibles i s’anomenen circonise. Mecanisme d’acció. No es coneix exactament

TERAPÈUTICA ANTIPARASITÀRIA

el seu mecanisme d’acció, però és semblant al de la cloroquina. Actua fonamentalment com a esquizonticida eritrocític i posseeix certa acció gametocida enfront de P. vivax i P. malariae. Indicacions terapèutiques. Posseeix activitat esquizonticida sobre totes les espècies de Plasmodium i gametocitocida sobre P. vivax i P. malariae. Tractament d’elecció en la malària complicada associada a fàrmacs antifolats o antibiòtics tant en àrees de P. falciparum resistent a cloroquina com multiresistent. Primaquina. És una 8-aminoquinolina i actualment és l’únic fàrmac existent efectiu per a evitar les recaigudes produïdes pels hipnozoïts de P. vivax i P. ovale. També presenta una lleu activitat gametocitocida, però aquesta propietat no té rellevància en el seu ús clínic. Propietats farmacocinètiques. Presenta bona absorció digestiva, es metabolitza ràpidament al fetge i els seus metabòlits són els que exerceixen l’acció. Mecanisme d’acció. Interfereix en la cadena transportadora d’electrons als mitocondris de Plasmodium i en la síntesi de pirimidina (Segovia Hernández et al., 1999). Mecanismes de resistència. Els darrers anys s’han descrit soques de P. vivax que no responien a les dosis habituals de primaquina en diverses parts del món com el sud-est asiàtic, Amèrica Central i Llatinoamèrica. En aquests casos la dosi total ha de ser augmentada per a evitar les recaigudes. Indicacions terapèutiques. S’utilitza de manera complementària a la cloroquina en el tractament del paludisme per P. vivax i P. ovale, i eradica les formes latents del paràsit al fetge. Artemisina i derivats. L’artemisinina és un producte extret de la planta qing hao (Artemisia annua), que ha estat utilitzada des de fa més de dos mil anys per la medicina xinesa per al tractament de les malalties febrils. A la dècada dels setanta s’aïllà el principal ingredient antipalúdic de la planta, el qinghaosu, ara conegut com a artemisinina, i es confir-

223

mà la seva activitat antipalúdica amb estudis clínics. Posteriorment, a partir de l’artemisina, se sintetitzaren tres derivats amb més potència antipalúdica: la dihidroartemisinina, l’artemeter (liposoluble) i l’artesunat (hidrosoluble) (Klayman, 1985). Mecanisme d’acció. La seva activitat antipalúdica s’exerceix pel trencament del pont de peròxid, provocada pel Fe, i amb la consegüent producció de radicals lliures orgànics. L’artemisina interacciona amb l’hemo del paràsit, i el Fe de l’hemo actua com a catalitzador. Els radicals lliures es fixen posteriorment a les proteïnes de membrana i es produeixen radicals alquil que acaben destruint el paràsit. D’aquesta manera l’endoteli microvascular evita la citoadherència per part del paràsit i la formació de rosetes. L’artemisina i els seus derivats produeixen un efecte antimalàric molt ràpid. La inhibició del creixement s’aprecia ja a les quatre o cinc hores, una mica més tard que amb la cloroquina (Florez, 2003; Hien i White, 1993). Propietats farmacocinètiques. Alguns estudis indiquen que aquests compostos tenen bona absorció i una eliminació ràpida, amb una vida mitjana de minuts per a l’artesunat i d’hores per a l’artemeter. A excepció de l’artemisinina, els altres compostos són hidrolitzats ràpidament al metabòlit actiu dihidroartemisina, que té un temps mitjà d’eliminació de quaranta-cinc minuts (Segovia Hernández et al., 1999). Mecanismes de resistència. L’existència de resistències creuades entre paràsits resistents als derivats de l’artemisinina i a altres antipalúdics com la cloroquina, la quinina i la mefloquina, amb diferents mecanismes d’acció, suggereix que la resistència pot estar mitjançada per canvis a la membrana del paràsit que impedeixen l’entrada dels fàrmacs a les seves diferents dianes (Barradell i Fitton, 1995). Atovaquona. L’atovaquona es crea com un derivat amb potent activitat enfront de les diferents espècies de Plasmodium i d’altres protozous patògens oportunistes, però els

224

I. M. OLIVEIRA

estudis clínics posteriors demostraren altes taxes de recaigudes en els malalts amb malària no complicada tractats amb monoteràpia amb atovaquona. L’associació del proguanil a l’atovaquona va resoldre el problema de les recaigudes, amb altes taxes de curació i toxicitat mínima. Actualment existeix una combinació fixa d’ambdós fàrmacs comercialitzada sota el nom de Malarone. Mecanisme d’acció. L’activitat antiprotozoària de l’atovaquona es deu a la seva capacitat per a inhibir selectivament el transport d’electrons del mitocondri, amb la qual cosa s’inhibeix la síntesi de les pirimidines. El lloc exacte on du a terme aquesta inhibició sembla ser el complex del citocrom bc1 dels mitocondris dels paràsits susceptibles. El sinergisme entre el proguanil i l’atovaquona es deu a la capacitat del proguanil d’augmentar l’activitat coll. apsant del potencial de membrana de l’atovaquona (Vaidya, 1998). Propietats farmacocinètiques. Atès el seu caràcter molt lipòfil, la seva absorció és variable. Després d’una dosi única de fàrmac per via oral, l’absorció és lenta i erràtica, però quan s’administra amb un aliment gras la seva absorció augmenta dos o tres cops. El fàrmac s’uneix a les proteïnes del plasma en més del 99 % i és capaç de travessar la barrera hematoencefàlica i assolir concentracions en líquid cefaloraquidi menors de l’1 %. La circulació enterohepàtica és molt important, i s’excreta en les femtes un 94 % de la dosi administrada en forma d’atovaquona sense alterar. No s’han identificat metabòlits (Tracy i Webster, 2003a). No es coneixen els paràmetres farmacocinètics de l’atovaquona en subjectes amb insuficiència renal o hepàtica. Indicacions terapèutiques. Tractament de la malària associat al proguanil. L’atovaquona està també indicada per al tractament de la pneumònia lleu o moderada per Pneumocystis carinii en malalts que no toleren el trimetoprim-sulfametoxazole, i té certa eficàcia en infeccions cerebrals i oculars per Toxoplasma gondii.

Inhibidors de la dihidrofolat-reductasa i sulfamides. Aquests compostos han estat utilitzats sols o majoritàriament associats a sulfamides de llarga durada, per al tractament i profilaxi del paludisme. La sinergia entre aquests compostos i altres antifolats es deu al fet que ambdós actuen en fases successives de la via de l’àcid fòlic. Per als Plasmodium els derivats reduïts de l’àcid fòlic són factors essencials perquè sintetitzen la pirimidina de novo. Pirimetamina. És un esquizonticida lent que actua en la fase eritrocítica del cicle de Plasmodium. S’utilitza a bastament associat a sulfamides. Propietats farmacocinètiques. Presenta absorció lenta però completa per via oral, i assoleix valors màxims en 4-6 hores. Indicacions terapèutiques. Tractament del paludisme en àrees resistents a cloroquina. Associada a la sulfadoxina, s’usa com a profilaxi antipalúdica durant l’embaràs en àrees d’alta prevalença de malària. Associada a la sulfadiazina, és el fàrmac utilitzat en el tractament de la toxoplasmosi. Pirimetamina + sulfadoxina (SP). Associació utilitzada en dosi única com a tractament en zones amb resistència a la cloroquina o com a teràpia complementària d’altres tractaments antipalúdics. Actualment és recalcable el seu ús com a profilaxi antipalúdica intermitent (TI) en embarassades d’àrees d’alta prevalença de malària. Proguanil. El proguanil va ser el primer fàrmac antipalúdic desenvolupat, que actuava interaccionant amb la dihidrofolat-reductasa de Plasmodium. Els seus mecanismes d’acció i resistència són similars als de la pirimetamina. Propietats farmacocinètiques. Presenta absorció lenta després de l’administració oral i la seva vida mitjana és d’unes vint hores. Es metabolitza per oxidació i s’obté un metabòlit actiu, que és la triazina, i un altre d’inactiu (4-clorfenilbiguanida). Principalment s’excreta per l’orina.

TERAPÈUTICA ANTIPARASITÀRIA Taula 5.

Antibiòtics amb activitat antimalàrica Diversos antibiòtics presenten activitat antimalàrica gràcies al fet que exerceixen diferents accions a l’apicoplast del paràsit, com la inhibició de l’RNA semblant al procariòtic (per part de la rifampicina) o la inhibició de la síntesi proteica dins de l’apicoplast (en el cas de les tetraciclines, macròlids i lincosamides) (Wiesner et al., 2003). Entre aquests cal destacar: doxiciclina, clindamicina, rifampicina i azitromicina.

Amebicides A la taula 5 es recull la classificació dels amebicides. Metronidazole. És un derivat de la sèrie de 5-nitroimidazoles, on són inclosos compostos d’estructura i activitat similar al metronidazole, com el secnidazole, l’ornidazole i el tinidazole. Mecanisme d’acció. El metronidazole penetra a les cèll. ules per difusió passiva, i un cop a dins actua com a acceptor d’electrons, i pateix una activació reductora fins a la seva forma hidroxilamina corresponent. Els microorganismes anaerobis contenen components de transport d’electrons, com ferredoxines, proteïnes Fe-S petites que posseeixen un potencial d’oxidoreducció suficientment negatiu per a donar electrons al metronidazole. La transferència de l’electró únic forma un radical nitrat molt reactiu que mata els microorganismes susceptibles per mecanismes mitjançats pel radical i que s’adrecen al DNA i a altres molècules vitals (Tracy i Webster, 2003b). Mecanismes de resistència. La resistència del metronidazole en Trichomonas vaginalis sembla que es deu a una disminució o absència d’activitat de la ferredoxina. No s’ha documentat l’aparició de resistències al metronidazole en Entamoeba histolytica (Segovia Hernández et al., 1999). Propietats farmacocinètiques. L’absorció del

225

Fàrmacs amebicides

Luminals

Tissulars

Luminals i tissulars

Parmomicina Iodoquinolol Diloxànid

Cloroquina Emetina Deshidroemetina

Metronidazole Tinidazole Ornidazole Secnidazole

Luminals (també anomenats de contacte): Fàrmacs que exerceixen la seva acció sobre les amebes que es troben a la llum intestinal. Tissulars: Fàrmacs que actuen sobre les amebes que parasiten la paret intestinal o d’altres òrgans.

metronidazole oral és molt bona, amb una biodisponibilitat de més del 90 %. El metronidazole es distribueix a bastament per tot l’organisme, i és metabolitzat al fetge per hidroxilació, oxidació i conjugació amb l’àcid glucurònic. El metabòlit més important, el 2-hidroximetil-metronidazole, posseeix certa activitat bactericida i antiprotozoària. La major part del metronidazole s’elimina en l’orina (60-80 %). Indicacions terapèutiques. El metronidazole és un nitroimidazole amb propietats antiprotozoàries i antibacterianes enfront de tots els cocs anaerobis i bacils gramnegatius anaerobis. Entre els protozous sensibles s’inclouen Entamoeba histolytica, Giardia lamblia, Trichomonas vaginalis i Balantidium coli. Paramomicina. La paramomicina és un antibiòtic aminoglucòsid que presenta activitat enfront de protozous com Entamoeba histolytica (com a amebicida intraluminal) i Giardia. Com la majoria dels aminoglucòsids, la seva absorció digestiva és molt pobra (Aparicio et al., 2003).

Els leishmanicides Antimoniat de meglumina (glucantime). És un compost antimonial pentavalent que presenta poca absorció digestiva, per la qual cosa s’administra per via parenteral. Mecanisme d’acció. Inhibeix la glucòlisi i l’o-

226

I. M. OLIVEIRA

xidació d’àcids grassos, amb una disminució neta en la generació d’ATP i GTP. Mecanismes de resistència. La resposta al fàrmac varia segons l’espècie de Leishmania, l’estat immunitari del malalt i el temps d’evolució de la malaltia. El mecanisme de resistència consisteix en una disminució de l’acumulació intracell. ular del fàrmac per un augment de l’expulsió del mateix (Segovia Hernández et al., 1999). Indicacions terapèutiques. Leishmaniosi visceral, cutània i mucocutània. Pentamidina. És una diamidina aromàtica introduïda el 1937 que presenta activitat enfront de Leishmania, l’estadi inicial de la infecció per Trypanosoma brucei gambiense, la babesiosi i la pneumocistosi (Aparicio et al., 2003). El mecanisme de resistència es deu a canvis en el transport transmembranós d’aquest compost (Bray et al., 2003). Amfotericina B. L’amfotericina B, un antifúngic obtingut per fermentació de Streptomyces nodosus, també presenta propietats antiprotozoàries enfront de diferents espècies de Leishmania. El mecanisme d’acció antileishmanicida no és conegut exactament, malgrat que es creu que podria ser similar a la seva acció antifúngica, amb la unió a l’ergosterol de la membrana del paràsit i amb l’alteració de la seva estructura (Segovia Hernández et al., 1999). Propietats farmacocinètiques. Aquesta molècula s’absorbeix escassament després de l’administració oral, per la qual cosa la via d’elecció és la intravenosa. S’uneix a lipoproteïnes plasmàtiques en aproximadament un 95 %. L’amfotericina es metabolitza parcialment al fetge, i és eliminada per bilis i orina. La semivida d’eliminació en l’adult amb funció renal normal és de vint-i-quatre hores, però després d’un tractament crònic la semivida d’eliminació pot allargar-se fins als quinze dies (Hartsel i Bolard, 1996). Indicacions terapèutiques. Alternativa al tractament de la leishmaniosi visceral (Mishra et al., 1994), cutània i mucocutània en malalts

sense resposta després del tractament amb antimonials o quan existeix mala tolerància als mateixos (Leishmania braziliensis, Leishmania donovani, Leishmania mexicana i Naegleria fowleri). Candidiasi invasiva greu i micosis sistèmiques greus.

Els tripanomicides Fàrmacs utilitzats en el tractament de la tripanosomiasi americana o malaltia de Chagas: Benznidazole. És un derivat nitroimidazòlic que interfereix en la síntesi proteica i de l’RNA de Trypanosoma cruzi. S’administra per via oral. Nifurtimox. El nifurtimox és un compost nitrofurà que s’absorbeix bé al tub digestiu, es difon ràpidament als teixits i té una vida mitjana de tres hores. La seva acció tripanocida sembla dependre de la capacitat de formar anions superòxid, peròxid d’hidrogen i radicals lliures. L’acció dels radicals lliures sobre les macromolècules produeix dany cell. ular amb peroxidació de lípids i lesió de la membrana, desactivació d’enzims, lesió del DNA i mutagènesi (Segovia Hernández et al, 1999). Fàrmacs utilitzats en el tractament de la tripanosomiasi africana o malaltia de la son: Existeixen dos tipus de tripanosomiasis africanes, la d’Àfrica de l’est, causada per Trypanosoma brucei rhodesiense i la d’Àfrica de l’oest, produïda per Trypanosoma brucei gambiense. El tractament estàndard d’ambdues entitats no ha canviat durant decennis, i consisteix en règims parenterals molt prolongats amb fàrmacs relativament tòxics, com suramina, melarsoprol i pentamidina. L’eflornitina, el fàrmac més nou del grup, va néixer com un fàrmac contra el càncer però ha demostrat eficàcia enfront de la infecció en humans per T. brucei gambiense, malgrat que no és efectiva en monoteràpia enfront de la malaltia d’Àfrica de l’oest. Estadis inicials: suramina i pentamidina. Estadis tardans: nifurtimox i melarsoprol.

TERAPÈUTICA ANTIPARASITÀRIA

És un derivat arsènic també conegut com a Mel B, introduït a l’Àfrica el 1949. Mecanisme d’acció. Malgrat que no es coneix completament, la inhibició d’enzims glucolítics que produeix un bloqueig en la glucòlisi i posteriorment la lisi del paràsit és un dels mecanismes d’acció més acceptats. Mecanismes de resistència. L’increment de resistències a aquesta droga en el terreny sembla ser resultat d’una alteració en la captació del compost per mitjà de la tripanosomal-P2purina, que introdueix el compost dins del paràsit (Fairlamb, 2003). Indicacions terapèutiques. Actiu enfront dels estadis tardans de les infeccions per T. brucei gambiense i T. brucei rhodesiense. Eﬂornitina. Mecanisme d’acció. És un inhibidor catalític irreversible de la descarboxilasa d’ornitina, tant de mamífers com de tripanosomes, enzim que catalitza la primera fase cineticolimitant de la biosíntesi de poliamines necessàries per a la divisió cell. ular (McCann i Pegg, 1992). L’acció tripanostàtica selectiva de l’eflornitina sobre T. brucei gambiense s’explica perquè tant l’home com T. brucei rhodesiense reemplacen amb molta més rapidesa l’enzim inhibit que T. brucei gambiense i, a més, T. brucei rhodesiense té xifres més altes d’activitat de descarboxilasa d’ornitina que T. brucei gambiense (Wang, 1997). Els tripanosomes tractats amb eflornitina es transformen en paràsits que no es repliquen i en aquesta fase estacionària s’eliminen ràpidament del torrent sanguini. Propietats farmacocinètiques. S’administra per via oral o intravenosa. La seva biodisponibilitat després d’ingerida és d’aproximadament un 54 %. S’assoleixen concentracions plasmàtiques màximes després de quatre hores de l’administració oral. La seva vida mitjana és de dos-cents minuts. No es lliga a proteïnes i es distribueix àmpliament. Presenta bona penetració al líquid cefaloraquidi. Més del 80 % s’elimina pels ronyons (Tracy i Webster, 2003b). Indicacions terapèutiques. Tractament de la

227

tripanosomiasi africana de l’oest tant en la fase hemolimfàtica com en la meningoencefàlica. L’eflornitina és eficaç en les fases tardanes de l’afectació del sistema nerviós central (SNC), en els malalts infectats amb soques resistents al melarsoprol i en les recaigudes després del tractament amb els tripanosomicides arsènics (Pépin i Milford, 1994).

Quimioteràpia dels ectoparàsits Els artròpodes que parasiten l’ésser humà són l’àcar Sarcoptes scabei, productor de la ronya, i uns insectes no alats anomenats Pediculus (polls), causants de les pediculosis. En l’home les pediculosis són produïdes per tres tipus de polls: Phthirus pubis (cabres), Pediculus humanus (varietat corporis o vestimenti) i Pediculus humanus (varietat capitis). Els fàrmacs utilitzats per al tractament d’aquests artròpodes són d’ús extern, en forma de xampús, aerosols, locions o cremes. Piretrines. Són productes naturals obtinguts de les flors de la planta Chrysanthemum cinerariae folium. L’activitat insecticida de la flor del Piretrum es deu a dos grups d’èsters. El Piretrum és tòxic per a molts insectes, i actua ràpidament per contacte, però la seva acció és relativament curta sense l’addició d’inhibidors enzimàtics que minvin la degradació de les piretrines i la potenciïn. Les permetrines més utilitzades contra la pediculosi són: permetrina, fenotrina o sumitrina, bioaletrina i tetrametrina (Florez, 2003). Lindà. És l’hexaclorociclohexà o isòmer γ de l’hexaclorur de benzè. Presenta gran liposolubilitat i exerceix la seva acció penetrant als paràsits i amb la paràlisi del seu sistema nerviós. Útil en el tractament de la sarna i pediculosi (Florez, 2003). Ivermectina. Suara descrit a l’apartat on pertoca. Mesulfè. És el 2,7-dimetiltiantrè, que posseeix propietats parasiticides i antipruríti-

228

I. M. OLIVEIRA

ques. Emprat en les pediculosis i en la sarna (Florez, 2003). Carbaril. És l’1-naftilmetilcarbamat, amb capacitat d’inhibir la colinesterasa. Útil com a insecticida i en el tractament de la pediculosi (Florez, 2003). Crotamitó. És la N-etil-N-O-tolilcrotonamida, que posseeix potent activitat acaricida, especialment en el tractament de la sarna (Florez, 2003). BIBLIOGRAFIA Albonico, M.; Wright, V.; Bickle, Q. (2004). «Molecular analysis of the β-tubulin gene of human hookworms as a basis for possible benzimidazole resistance on Pemba Island». Molecular & Biochemical Parasitology, vol. 134, pàg. 281-284. Aparicio, P.; Rodríguez, E.; Gárate, T.; Molina, R.; Soto, A.; Alvar, J. (2003). «Terapéutica antiparasitaria». Enferm. Infecc. Microbiol. Clin., vol. 21, pàg. 579-592. Apt, W.; Aguilera, X.; Vega, F.; Miranda, C.; Zulantay, I.; Pérez, C.; Gabor, M.; Apt, P. (1995). «Treatment of human chronic fascioliasis with triclabendazole: Drug efficacy and serologic response». Am. J. Trop. Med. Hyg., vol. 52, pàg. 532-535. Barradell, L. B.; Fitton, A. (1995). «Artesunate. A review of its pharmacology and therapeutic efficacy in the treatment of malaria». Drugs, vol. 50, pàg. 714-741. Bennett, J. L.; Day, T.; Feng-Tao, L.; Ismail, M.; Farghally, A. (1997). «The development of resistance to antihelmints: a perspective with an emphasis on the antischistosomal drug praziquantel». Exp. Parasitol., vol. 87, pàg. 260-267. Bennett, A.; Guyatt, H. (2000). «Reducing intestinal nematode infection: efficacy of albendazole and mebendazole». Parasitol. Today, vol. 16, pàg. 271-274. Bray P. G.; Barret, M. P.; Ward, S. A.; Koning, H. P. de (2003). «Pentamidine uptake and resistance in pathogenic protozoa: past, present and future». Trends in Parasitology, vol. 5, pàg. 232-236. Brown, H. D.; Matzuk, A. R.; Ilves, I. R.; Peterson, L. H.; Harris, S. A.; Sarett, L. H.; Egerton, J. R.; Yakstis, J. J.; Campbell, W. C.; Cuckler, A. C. (1961). «Antiparasitic drugs. IV: 2-(4 -thiazolyl)-benzimidazole, a new antihelmintic». J. Am. Chem. Soc., vol. 83, pàg. 17641765. Brumgmans, J. P.; Thienpont, D. C.; Wijngaarden, I. van; Vanparijs, O. F.; Schuermans, V. L.; Lauwers, H. L. (1971). «Mebendazole in enterobiasis. Radiochemical and pilot clinical study in 1,278 subjects». JAMA, vol. 217, pàg. 313-316.

Bryson, H. M.; Goa, K. L. (1992). «Halofantrine: A review of its antimalarial activity, pharmacokinetic properties and therapeutic potential». Drugs, vol. 43, pàg. 236259. Burg, R. W.; Miller, B. M.; Baker, E. E.; Birnbaum, J.; Currie, S. A.; Hartman, R.; Kong, Y. L.; Monaghan, R. L.; Oslo, G.; Putter, I.; Tunac, J. B.; Wallick, H.; Stapley, E. O.; Oiwa, R.; Omura, S. (1979). «Avermectins, new family of potent anthelmintic agents: producing organism and fermentation». Antimicrob. Agents Chemother., vol. 15, pàg. 361-367. Chan, M. S. (1997). «The global burden of intestinal nematode infections-Fifty years on». Parasitol. Today, vol. 11, pàg. 438-443. Cioli, D. (2000). «Praziquantel: is there real resistence and are there alternatives?» Curr. Opin. Infect. Dis., vol. 13, pàg. 659-663. Cioli, D.; Pica-Mattoccia, L. (2003). «Praziquantel». Parasitol. Res., vol. 90, pàg. S3-S9. Day, T. A.; Bennett, J. L.; Pax, R. A. (1992). «Praziquantel: the enigmatic antiparasitic». Parasitol. Today, vol. 8, pàg. 342-344. Fairlamb, A. H. (2003). «Chemotherapy of human African trypanosomiasis: current and future prospects». Trends in Parasitology, vol. 19, pàg. 488-493. Florez, J. (2003). Fármacos antiparasitarios I. Protozoos. Farmacología humana. 4a ed. Barcelona: Masson. Gönnert, R.; Andrews, P. (1977). «Praziquantel, a new broad-spectrum antischistosomal agent». Z. Parasitenkd, vol. 52, pàg. 129-150. Gryseels, B.; Mbaye, A.; Vlas, S. J. de; Stelma, F. F.; Guisse, F.; Lieshout, L. van; Faye, D.; Diop, M.; Ly, A.; Ltchuem-Tchente, L. A.; Engels, D.; Polman, K. (2001). «Are poor responses to praziquantel for treatment of Schistosoma mansoni infections in Senegal de to resistance? An overview of the evidence». Trop. Med. Int. Health, vol. 6, pàg. 864-873. Gryseels, B.; Stelma, F. F.; Talla, I.; Dam, G. J. van; Polman, K.; Sow, S.; Diaw, M.; Sturrock, R. F.; Doehring-Schwerdtfeger, E.; Kardoff, R.; Decam, C.; Niang, M.; Deelder, A. M. (1994). «Epidemiology, immunology and chemotherapy of Schistosoma mansoni infections in a recently exposed community in Senegal». Trop. Geogr. Med., vol. 46, pàg. 209-219. Hartsel, S.; Bolard, J. (1996). «Amphotericin B: new life for an old drug». Trends. Pharmacol. Sci. Dec., vol. 12, pàg. 445-449. Hien, T. T.; White, N. J. (1993). «Qinghaosu». Lancet, vol. 341, pàg. 603-607. Ismail, M.; Botros, S.; Metwally, A.; William, S.; Farghally, A.; Tao, L. F.; Day, T. A.; Bennett, J. L. (1999). «Resistance to praziquantel: direct evidence from Schistosoma mansoni isolated from Egyptian villagers». Am. J. Trop. Med. Hyg., vol. 60, pàg. 932-935. Jung H.; Hurtado, M.; Sanchez, M.; Medina, M. T.; Sotelo, J., (1992). «Clinical pharmacokinetics of alben-

TERAPÈUTICA ANTIPARASITÀRIA

dazole in patients with brain cysticercosis». J. Clin. Pharmacol., vol. 32, pàg. 28-31. Katz, N.; Rocha, R.; Chaves, A. (1979). «Preliminary trials with praziquantel in human infections due to Schistosoma mansoni». Bull. World Health Organ., vol. 57, pàg. 781-785. Kanyok, T. (2004). «Artesunate combinations are coming: partenership develops CDA». TDR news, vol. 72, pàg. 2. Klayman, D. L. (1985). «Qinghaosu (artemisinin): an antimalarial drug from China». Science, vol. 228, pàg. 10491055. Klotz, U.; Ogbuokiri, J. E.; Okonkwo, P. O. (1990). «Ivermectin binds avidly to plasma proteins». Eur. J. Clin. Pharmacol., vol. 39, pàg. 607-608. Kwa, M. S. G.; Veenstra, J. G.; Dijk, M. van; Roos, M. H. (1993). «Molecular characterization of tubulin genes present in benzimidazoles resistant populations of Haemonchus contortus». Mol. Biochem. Parasitol., vol. 60, pàg. 133-144. Kwa, M. S. G.; Jetty, G. V.; Roos, M. H. (1994). «Benzimidazole resistance in Haemonchus contortus is correlated with a conserved mutation at amino acid 200 in β-tubulin isotype 1». Mol. Biochem. Parasitol., vol. 63, pàg. 299303. Lacey, E. (1988). «The role of the cytoskeletal protein, tubulin, in the mode of action and mechanism of drug resistance to benzimidazoles». Int. J. Parasitol., vol. 18, pàg. 885-936. — (1990). «Mode of action of benzimidazoles». Parasitol. Today, vol. 6, pàg. 112-115. Lacey, E.; Gill, J. H. (1994). «Biochemistry of benzimidazole resistance in helminths». Acta Trop., vol. 56, pàg. 245262. Leopold, G.; Ungethum, W.; Groll, E.; Diekmann, H. W.; Nowak, H.; Wegner, D. H. (1978). «Clinical pharmacology in normal volunteers of praziquantel, a new drug against schistosomes and cestodes. An exemple of a complex study covering both tolerance and pharmacokinetics». Eur. J. Clin. Pharmacol., vol. 14, pàg. 281-291. Lipkowitz, K. B.; McCracken, R. O. (1991). «A molecular modelling approach to in vivo efficacy of triclabendazole». J. Parasitol, vol. 77, pàg. 998-1005. Marriner, S. E.; Morris, D. L.; Dickson, B.; Bogan, J. A. (1986). «Pharmacokinetics of albendazole in man». Eur. J. Clin. Pharmacol., vol. 30, pàg. 705-708. Martínez Sánchez, A. M. (1999). «Antihelmínticos». A: García Sánchez, E.; Lopez, R.; Prieto, J. [ed.] Antimicrobianos en medicina. Madrid: Sociedad Española de Quimioterapia, pàg. 491-500. McCann, P. P.; Pegg, A. E. (1992). «Ornithine decarboxylase as an enzyme target for therapy». Pharmacol. Ther., vol. 54, pàg. 195-215.

229

Mishra, M.; Biswas, U. K.; Jha, D. N.; Khan, A. B. (1994). «Amphotericin versus stibogluconate in first-line treatment of Indian Kala-azar». Lancet, vol. 72, pàg. 931-936. Murray, H. W.; Pépin, J.; Nutman, T. B.; Hoffman, S. L.; Mahmoud, A. A. F. (2004). «Recent advances. Tropical medicine». BMJ, vol. 320, pàg. 490-494. Ottesen, E. A.; Campbell, W. C. (1994). «Ivermectin in human medicine». J. Antimicrob. Chemother., vol. 34, pàg. 1995-2003. Pépin, J.; Milford, F. (1994). «The treatment of human African trypanosomiasis». Adv. Parasitol., vol. 33, pàg. 147. Segovia Hernández, M.; Yagüe Guirao, G.; Cámara Simón, M.; Martínez Toldos, M. C. (1999). «Antiprotozoarios». Antimicrobianos en medicina, cap. 27, pàg. 477489. Slater, A. F. G.; Ceremi, A. (1992). «Inhibition by chloroquine of novel polimerase enzyme activity in malaria trophozoites». Nature, vol. 355, pàg. 167-169. Tracy, J. W., Webster, L. T. (2003a). «Fármacos usados en la quimioterapia de infecciones causadas por protozoos: paludismo». A: Hardman, J. G.; Limbird, L. E. [ed.] Las bases farmacológicas de la terapéutica. 2a ed. Mèxic: Mc Graw Hill, vol. 2, pàg. 1085-1112. — (2003b). «Fármacos usados en la quimioterapia de infecciones causadas por protozoarios (continuación). Amebiasis, giardiasis, tricomoniasis, leishmaniasis y otras infecciones por protozoarios». A: Hardman, J. G.; Limbird, L. E. [ed.] Las bases farmacológicas de la terapéutica. 10a ed. Mèxic: Mc Graw Hill, vol. 2, pàg. 1113-1136. — (2003c) «Fármacos utilizados en la quimioterapia de las helmintiasis». A: Hardman, J. G.; Limbird, L. E. [ed.] Las bases farmacológicas de la terapéutica. 10a ed. Mèxic: Mc Graw Hill, vol. 2, pàg. 1137-1155. Vaidya, A. B. (1998). «Mitochondrial physiology as a target for atovaquone and other antimalarials». A: Sherman, I. W. [ed.] Malaria: Parasite biology, pathogenesis, and protection. Washington DC: ASM Press, pàg. 355-368. Wang, C. C. (1997). «Validating targets for antiparasitic chemotherapy». Parasitology, vol. 114, pàg. S31-S44. Wessely, K.; Reischig, H. L.; Heinerman, M.; Stempka, R. (1988). «Human fascioliasis treated with triclabendazole (FasinexR) for the first time». Trans. R. Soc. Med. Hyg., vol. 82, pàg. 743-745. Wiesner, J.; Ortmann, R.; Jomaa, H.; Schlitzer, M. (2003). «New antimalarial drugs». Angew. Chem. Int., vol. 42, pàg. 5274-5293. Wongsrichanalai, C. H.; Pickard, A. L.; Wernsdorfer, W. H.; Meshnick, S. R. (2002). «Epidemiology of drug-resistant malaria». Lancet Inf. Dis., vol. 2, pàg. 209218.

ÍNDEX D’AUTORS Agudo, M. C. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Alemany, C. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Alvarado, E. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Badiola, I ........................... Corachan, M. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Domínguez, M. Á. . . . . . . . . . . . . . . . . . García, A. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Gatell, J. M. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Gil, C. .............................. Gómez-Lus, R. ..................... González, J. ....................... Goñi, M. P. ......................... Guglietta, A. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Llagostera, M. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Marco, F. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Mesa, R.-J. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Miró, E. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Morera, Y. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Navarro, F. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Oliveira, I. M. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

107 67 187 19 61 143 29 177 177 107 197 107 67 19 11 91 91 187 29 213

Palacín, C. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67 Pérez, A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 Portillo, A. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 151 Rebollo, M. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29 Ribera, A. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49, 121 Rivera, A. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91 Ruiz, J. ........................... 7, 135 Saco, M. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 Sáenz, Y. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 151 Sánchez-Céspedes, J. . . . . . . . . . . . . . . . 49 Santos, C. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 165 Segura, M. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 165 Soto, S. M. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81 Tarragó, C. ......................... 67 Terencio, J. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67 Torres, C. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 151 Torres-Rodríguez, J. M. . . . . . . . . . . 187 Tudó, G. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 197 Vidal, C. ........................... 165 Vila, J. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49

SOCIETAT CATALANA DE BIOLOGIA Consell Directiu President Vicepresident 1r Vicepresident 2n Secretària General Vicesecretari Tresorer Vocal 1r, Lexicografia Vocal 2n, Recerca Vocal 3r, Sessions Vocal 4t, Relacions Exteriors Vocal 5è, Publicacions Vocal 6è, Estudiants Delegat de l’IEC

Jaume Reventós i Puigjaner, HVH Ferran Azorín i Marín, CSIC Montserrat Vendrell i Rius, PCB Àurea Navarro i Sabaté, UB Arcadi Navarro i Cuartiellas, UPF Montserrat Aguadé i Porres, UB Ricard Roca i Pascual Lluís Tort i Bardolet, UAB Josep Clotet i Erra, UIC Cristina Junyent i Rodríguez Francesc Piferrer i Circuns, ICM Mar Fatjó-Vilas i Mestre, UB Ricard Guerrero i Moreno, UB

SOCIETAT CATALANA DE BIOLOGIA Seccions especialitzades Biofísica Biologia del desenvolupament Biologia evolutiva Biologia i indústria Biologia molecular Biologia molecular del càncer Biologia de la reproducció Biologia i societat Ecologia Endocrinologia experimental Ensenyament Enzimologia i regulació metabòlica Fisiologia vegetal Microbiologia Neurobiologia experimental Virologia Estudiants Secció de la SCB a Alacant Secció de la SCB a Lleida Secció de la SCB a València

Esteve Padrós Jordi Garcia David Comas Luís Ruiz-Ávila Lluís Cornudella Gabriel Capellà Maria Gràcia Bozzo i Sergi Bonet Cristina Junyent Jordi Catalán i Paloma Martín Francesca Rivera-Fillat i Roser Casamitjana Montserrat Vallmitjana Marta Cascante Josep M. Torné Jordi Mas-Castellà Teresa Vilaró Jordi Gómez Mar Fatjó-Vilas Ángel Nadal M. Ángeles de la Torre Isabel Mingarro

ACTIVITATS DEL CURS 2003-2004 I.

SESSIÓ INAUGURAL DEL CURS 2003-2004

5 de novembre de 2003 SESSIÓ INAUGURAL DE LA SCB Sala Prat de la Riba, IEC. C/ Carme, 47. Barcelona. Los códigos del RNA Juan Valcárcel, ICREA-CRG, Barcelona

II.

CONGRESSOS I SIMPOSIS

1 i 2 de juliol de 2004 Sala Prat de la Riba, IEC. C/ Carme, 47. Barcelona. XII Seminari Conjunt de Biologia Molecular i del Desenvolupament

III.

CURSOS

Del 16 al 20 d’octubre de 2003 L’Aldea, delta de l’Ebre 14è Curs Avençat d’Ecologia Microbiana Director del curs: Ricard Guerrero, Universitat de Barcelona Del 24 al 26 de setembre de 2003 II Curs de Tècniques de Fisiologia Cell. ular Organitza: Secció d’Alacant de la SCB

IV.

JORNADES

10 d’octubre de 2003 Sala d’Actes del CID. C/ Jordi Girona, 18-26. Barcelona. «Llum i desenvolupament vegetal: nous reptes» Organitza: Secció de Fisiologia vegetal de la SCB 10 d’octubre de 2003 Sala Prat de la Riba de l’IEC. C/ Carme, 47. Barcelona. I Jornada sobre Resistencia Bacteriana a los Antibióticos: Una visión global Organitza: Secció de Microbiologia de la SCB

236

Del 12 al 15 d’octubre de 2003 Auditori Winterthur i IEC III Jornada de Virologia de Catalunya. VIII Congreso Nacional de Virología Organitza: Sociedad Española de Virología i Secció de Virologia de la SCB 14 de novembre de 2003 Centre d’Estudis Avançats de Blanes. Accés cala St. Francesc, 14. Blanes. II Jornada d’Avenços en Ecologia Organitza: Secció d’Ecologia de la SCB 16 d’abril de 2004 Aula Magna, Fac. de Biologia, UB. Av. Diagonal, 645. Barcelona. «I després què? Sortides professionals per a futurs llicenciats en ciències biològiques» Organitzen: Secció d’Estudiants de la SCB i la revista Omnis Cellula 13 i 14 de maig de 2004 Sala Prat de la Riba. IEC. C/ Carme, 47. Barcelona. «Unitat i diversitat en microbiologia» Reunió anual Plenària de Microbiologia (RECAM 2004) i Reunió Intercongressual del 17è CMBLC Organitza: Secció de Microbiologia 5 de juliol de 2004 Sala Prat de la Riba, IEC. C/ Carme, 47. Barcelona IV Jornada de Biologia Evolutiva Organitza: Secció de Biologia evolutiva de la SCB Coordinador: Lluís Serra, Dept. de Genètica, UB

ALTRES ACTIVITATS / SESSIONS EXTRAORDINÀRIES

3 i 4 de setembre de 2003 Institut d’Estudis Catalans i Escola T. S. d’Enginyeria Industrial Conferències «Cinquanta anys de l’estructura del DNA» B. M. Alberts 14 de novembre de 2003 Gimcana «Construeix la doble hèlix» La Secció de Biologia i societat, juntament amb el Consell Directiu, organitzen una gimcana dins de la Setmana de la Ciència. Adreçat a estudiants de secundària 18 de novembre de 2003 Sala Prat de la Riba, IEC. C/ Carme, 47. Barcelona. «Vessaments d’hidrocarburs: conseqüències ecològiques i bioremediació» Sessió Conjunta ICHN-SCB

237

5 de desembre de 2003 Sala Nicolau d’Olwer, IEC. C/ Carme, 47. Barcelona. Conferència sobre el Premi Nobel de Medicina 2003: «El Nobel de Medicina 2003 o el reconeixement de l’aportació de la ressonància magnètica al diagnòstic mèdic» Jaume gili, IDI, Hospital Vall d’Hebron, Barcelona 12 de desembre de 2003 La microbiologia de l’estany de Banyoles i dels estanyols Visita guiada i pràctiques de camp Dirigida per: Ricard Guerrero, Jordi Urmeneta, Tony Navarrete i Mercedes Berlanga (UB) 24 de febrer de 2004 Sala Prat de la Riba, IEC. C/ Carme, 47. Barcelona. Reunió anual de la Xarxa de Genòmica i Proteòmica 7 i 14 de febrer de 2004 Sant Cugat i Barcelona Pràctica matinal de biologia molecular i cell. ular Coordinadors: Josep Clotet i Montserrat Coromines Organitza: Secció d’Ensenyament 3 de març de 2004 Sala Prat de la Riba, IEC. C/ Carme, 47. Barcelona. «Planeta simbiòtic: cicles biogeoquímics i microorganismes» Ricard Guerrero, UB, Barcelona 19 de març de 2004 Sala Prat de la Riba, IEC. C/ Carme, 47. Barcelona. Cicle de Trobades Interprofessionals Fòrum Barcelona 2004: «Animal i recerca: què, com i per què» Organitza: Coll. egi de Biòlegs de Catalunya i Sociedad Española para las Ciencias del Animal de Laboratorio 6 i 7 de maig de 2004 IEC. C/ Carme, 47. Fira VCC04 «Viu la ciència contemporània» Organitza: Parc Cientíﬁc de Barcelona i SCB 19 de maig de 2004 Aula Magna, Fac. de Medicina, UdL. C/ Rovira Roure, 44. Lleida. Sessió monogràﬁca sobre la importància de l’ús de les cèll. ules mare en investigació Organitza: Consell Directiu de la SCB i Secció de la SCB a Lleida Coordinadors: Ferran Azorín i M. Àngeles de la Torre

Interior cubierta.qxd

21/12/2005

13:35

PÆgina 2

INFORMATION FOR CONTRIBUTORS TO TREBALLS DE LA SOCIETAT CATALANA DE BIOLOGIA Treballs de la Societat Catalana de Biologia (Treballs de la SCB) publishes: a) review articles on topics of general interest especially commisioned by the Society; b) communications presented at regular or extraordinary sessions held by the Society and its constituent sections; c) contributions of invited lecturers or monographs; d) reports of scientific sessions held by the Society. Submission of manuscripts Manuscripts should be written in clear, concise Catalan. The use of any other language would require the consent of the Executive Committee. The Editorial Board will seek independent reviewers for evaluation, who will report whether a paper conforms to the general criteria for publication. Authors will be notified of the Editorial decissions. When it appears that a manuscript could be improved by revision, it will be returned to the authors with the referee’s comments in writing. If a manuscript is rejected, only the original copy, together with all the figures, will be returned to authors. Submission of a paper implies that it reports unpublished work and is not under consideration for publication elsewhere. Papers should be submitted as word-processor files on a 3 1/2” disk or by e-mail to scb@iec.es, using a Microsoft Word program (Macintosh or PC). Figures, tables and illustrations should also be submitted in a hard copy. Use the name of the author as a file name. Indicate on the disk: author’s name, address and operating system used. Manuscripts submitted on paper can be accepted only under exceptional circumstances. Illustrations should be of good quality and fitting within jounal size. Articles, including illustrations, cannot exceed 20 typed pages. Commissioned review articles or monographs are not subjected to the above restrictions although their authors should consult the Editorial Board of Treballs de la Societat Catalana de Biologia. Manuscripts and general editorial correspondence should be addressed to the Editor of Treballs de la Societat Catalana de Biologia, Carme, 47. E-08001 Barcelona. Spain. Organizations of manuscripts The manuscript should be headed by the full title, followed by complete names of all authors in capitals and location of the institutions at which the work was performed. Footnotes should be avoided. All pages should be numbered consecutively starting with the title page. Summary The abstract and the title should be written in English and Catalan, and not exceed 200 words. Up to five key-

words in English should be given at the end of the abstract.

Tables and illustrations Black and white photographic prints should be of good quality and contrast; in the back there must be indicated the name of the author, the number of the figure and the top with an arrow. Authors must indicate the original figures for publication and the copies. Tables should include a descriptive title and be numbered consecutively with Roman characters.

References Manuscripts should include references arranged in alphabetical order according to the first author’s name and should be referreed to in the text in chronological order by the author’s names and the date of publication. If more than two authors are mentioned in a reference, the first name followed by «et al» should be used. References should be assembled in the following order; authors in small caps, year in parenthesis, title of article, name of journal, abbreviated and italic, volume number and inclusive page numbers. References to chapters and monographs should include the title of the work followed by the name of editor, the title book, city of publication and publisher. Inclusive pagination should be indicated at the end of the citation.

Note carefully the following examples: CODINA, C.; VILADOMAT, F.; BASTIDA, J.; LLABRÉS, J. M. (1989). «Potencial biotecnològic del cultiu de cèl·lules vegetals per a l’obtenció de productes farmacèutics». Treb. Soc. Cat. Biol., vol. 40, pàg. 47-70. GLICK, T. F. (1989). «Biologia i context social: la nova historiografia del Darwinisme». Treb. Soc. Cat. Biol., vol. 40, pàg. 7-18. MELLADO, R. P. (1987). «Vectores utilizados para la manipulación y expresión de genes». A: Vicente, M.; Renart, J. Ingeniería genética. Madrid: CSIC, núm. 215, pàg. 2136. YUNIS, J. J.; PRAKASH, O. (1982). «The origin of man: a chromosomal pictorial legacy». Science, núm. 215, pàg. 1525-1530.

Proofs Proofs of accepted articles will be sent to the first author, for correction. Proofs should be returned to the secretary SCB. Corrections other than printer’s errors are not acceptable. After publication 20 reprints will be sent free of charge to the author.

13:30

PÆgina 1

TREBALLS DE LA SOCIETAT CATALANA DE BIOLOGIA

VOLUM 55, 2004

ÍNDEX

ANTIMICROBIANS

21/12/2005

TREBALLS DE LA SOCIETAT CATALANA DE BIOLOGIA

ANTIMICROBIANS

19 29

VOLUM 55, 2004

49 61 67 81

91 107

FILIAL DE L’INSTITUT D’ESTUDIS CATALANS

121 135 143 151 165

177 187 197 213

TREB. SOC. CAT. BIOL., VOL. 55, 2004

Cub. Volum 55.qxd

BARCELONA 2005

13:37

PÆgina 1

ANTIMICROBIANS

21/12/2005

TREB. SOC. CAT. BIOL., VOL. 55, 2004

SobreCub. Volum 55.qxd

ANTIMICROBIANS JOAQUIM RUIZ EDITOR

TREBALLS DE LA SOCIETAT CATALANA DE BIOLOGIA VOLUM 55, 2004

13:37

PÆgina 1

ANTIMICROBIANS

21/12/2005

TREB. SOC. CAT. BIOL., VOL. 55, 2004

SobreCub. Volum 55.qxd

ANTIMICROBIANS JOAQUIM RUIZ EDITOR

TREBALLS DE LA SOCIETAT CATALANA DE BIOLOGIA VOLUM 55, 2004