Issuu

13:37

PÆgina 1

ANTIMICROBIANS

21/12/2005

Il·lustració de la sobrecoberta Sífilis, de Ramon Casas Original per a cartell; llapis conté i pastel; 46 × 28 cm; Barcelona, 1900 Museu Nacional d’Art de Catalunya, Barcelona [MNAC/GDG 108770]

TREB. SOC. CAT. BIOL., VOL. 55, 2004

SobreCub. Volum 55.qxd

ANTIMICROBIANS JOAQUIM RUIZ EDITOR

TREBALLS DE LA SOCIETAT CATALANA DE BIOLOGIA VOLUM 55, 2004

Aquest dibuix és l’original per al cartell de Casas Sífilis, que anunciava el sanatori del doctor Abreu, que tenia la seu al carrer Major de la Bonanova de Barcelona, dedicat a la curació de malalties de transmissió sexual. El cartell, imprès per la Casa Thomas, incloïa les llegendes següents: «Sífilis», amb les esses en forma de serp, a la part superior, i «Curación absoluta y radical en el Sanatorio para sifilíticos» a la inferior, i, en lletres més petites, les dades de l’establiment. L’artista fa servir una figura d’una dona tapada amb un mantó de Manila, com en altres cartells d’anuncis seus, però aquí li dóna un sentit diferent en introduir-hi elements clarament simbòlics al·lusius a la malaltia i a la perillositat del contacte sexual. La dona ofereix un lliri blanc amb la mà esquerra, però amaga la malaltia, representada per la serp que té agafada amb la mà dreta i s’enfila pel mantó. Casas no podia saber que la sífilis està produïda per Treponema pallidum, una espiroqueta petitíssima que podria recordar una serp microscòpica. Atès que la sífilis era una malaltia que els homes contreien principalment a través del contacte amb prostitutes, Casas va triar la imatge colpidora d’una d’aquelles dones, que va representar demacrada i amb aspecte de malalta. A començament del segle XX, la sífilis era la malaltia de transmissió sexual més temuda, no únicament pels efectes i les complicacions que podia causar en les persones afectades, sinó perquè el reconeixement públic de la malaltia era un estigma social.

ÍNDEX

Les malalties del segle xxi Presentació . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . J. Barquinero i J. Reventós

La tuberculosi? No s’havia eradicat? Cent anys del bacteri més persistent . . . . . . . . . . . . . . . . . P.-J. Cardona

Accions metabòliques de la vitamina D molt més enllà del que podíem imaginar fa uns anys A. Rabassa i J. Salas-Salvadó

Seqüenciació de nova generació i salut en el segle xxi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . F. Vidal

L’envelliment, aproximació a un procés complex i heterogeni . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A. Selva i M. Vilardell

Teràpies avançades: present i futur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . J. Barquinero

El VIH, nou gens que han canviat la biologia i el món . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . M. Curriu, B. Clotet i J. Blanco

Usos de biomaterials i cèŀlules en regeneració de cartílag articular . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . J. Vives i F. Gòdia

La cardiologia del segle xxi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . J. Brugada

107

La traducció genètica mitocondrial i malalties associades . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . T. Guitart i L. Ribas de Pouplana

113

Nanobiotecnologia i nanomedicina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . J. Samitier

131

Les metàstasis o la clau per vèncer el càncer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . R. R. Gomis

139

Biomarcadors de diagnòstic, pronòstic i predicció de resposta a tractaments oncològics . . . . . M. Rigau, M. Olivan, M. Llauradó, E. Colás, A. Doll i J. Reventós

153

LES MALALTIES DEL SEGLE XXI

VOLUM 64, 2013

TREBALLS DE LA SOCIETAT CATALANA DE BIOLOGIA biofísica molecular VOLUM 53, 2002

Filial de l’Institut d’Estudis Catalans

TREB. SOC. CAT. BIOL., VOL. 64, 2013

TREBALLS DE LA SOCIETAT CATALANA DE BIOLOGIA

BARCELONA 2002

Portadelles.qxd

23/12/99

17:57

Página 1

TREBALLS DE LA SOCIETAT CATALANA DE BIOLOGIA FILIAL DE L INSTITUT D ESTUDIS CATALANS

VOLUM 53, 2002

BARCELONA 2002

Portadelles.qxd

23/12/99

17:57

Página 2

CONSELL DE REDACCIÓ CÈLIA MARRASÉ I PEÑA, presidenta LLUÍS CORNUDELLA I MIR MERCÈ DURFORT I COLL CRISTINA JUNYENT I RODRÍGUEZ MERCÈ PIQUERAS I CARRASCO FRANCESCA VIDAL I DOMÍNGUEZ

Editat per la Societat Catalana de Biologia (filial de l Institut d Estudis Catalans) Carrer del Carme, 47. 08001 Barcelona http://www.iecat.net/scb Compost per Fotocomposició gama, s.l. Carrer d Arístides Maillol, 3, 1r, 1a. 08028 Barcelona Imprès a Limpergraf, SL Polígon industrial Can Salvatella. Carrer de Mogoda, 29-31 08210 Barberà del Vallès ISSN: 0212-3037 Dipòsit Legal: B. 12164-1963

Portadelles.qxd

23/12/99

17:57

Página 3

BIOFÍSICA MOLECULAR

ESTEVE PADRÓS editor

TREBALLS DE LA SOCIETAT CATALANA DE BIOLOGIA VOLUM 53, 2002

Portadelles.qxd

23/12/99

17:57

Página 4

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 5

TREBALLS DE LA SOCIETAT CATALANA DE BIOLOGIA

VOLUM 53, 2002

ÍNDEX

BIOFÍSICA MOLECULAR Presentació . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . E. PADRÓS

La llum de sincrotró: estructura molecular i funció dels teixits musculars . . . . . . . . . . . . J. BORDAS, J. CAMPMANY, J. JUANHUIX I A. SVENSSON

Influència del potencial dipolar en la interacció de macromolècules amb biomembranes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . J. CLADERA I P. O SHEA

Aproximacions experimentals a l estudi del procés d agregació de la proteïna b-amiloide: una avaluació crítica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . M. CRUZ, D. GRILLO, F. RABANAL I E. GIRALT

Restriccions físiques per a la formació d estructures amb elevada concentració local de DNA als cromosomes metafàsics . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . J.-R. DABAN

Aplicació de l espectroscòpia infraroja a l anàlisi estructural de la permeasa de melibiosa d Escherichia coli . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . N. DAVE, V. A. LÓRENZ-FONFRÍA, J. VILLAVERDE, R. LEMONNIER, G. LEBLANC I E. PADRÓS

Tècniques bioinformàtiques aplicades a la modelització i simulació de l estructura i l activitat de receptors acoblats a proteïnes G . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . X. DEUPÍ, M. OLIVELLA I L. PARDO

Nanotecnologies en mecànica molecular i cel·lular . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . M. GRABULOSA, L. BUSCEMI, J. ALCARAZ, X. TREPAT, F. RICO I D. NAVAJAS

Estructura de proteïnes per ressonància magnètica nuclear amb la utilització d acoblaments dipolars residuals . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . M. PONS

101

Estructura de grans agregats moleculars: Estudis combinats de cristal·lografia de raigs X i microscòpia electrònica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . N. VERDAGUER, W. F. OCHOA, D. BLAAS I I. FITA

115

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 6

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 7

Biofísica molecular (Esteve Padrós, ed.) Treballs de la SCB. Vol. 53 (2002) 7-8

PRESENTACIÓ ESTEVE PADRÓS Unitat de Biofísica. Departament de Bioquímica i de Biologia Molecular. Facultat de Medicina. Universitat Autònoma de Barcelona. Adreça per a la correspondència: Esteve Padrós. Unitat de Biofísica. Universitat Autònoma de Barcelona. 08193 Bellaterra. Barcelona. Tel.: 935 811 870. Fax: 935 811 907. Adreça electrònica: esteve.padros@uab.es.

Malgrat el que pugui semblar, la biofísica no és una ciència d aparició recent. Per exemple, ja en el segle XVIII, Galvani estudiava la resposta dels músculs a les excitacions elèctriques; i a començaments del segle XX, els treballs de Nernst van permetre d emprendre l estudi dels canals iònics i els potencials de membrana. Però tal com passava a començaments del segle XX amb la bioquímica, la biofísica és encara avui una disciplina que no posseeix unes fronteres ben definides, i es mescla tant amb la bioquímica com amb la fisiologia, la física mèdica, la biologia, i d altres. Què tracta la biofísica? Si analitzem els temes coberts en les reunions anuals de la societat de biofísica més important del món, la Biophysical Society, hi trobarem des de bioenergètica fins a l estudi dels mecanismes de les reaccions enzimàtiques, passant per l estructura i funció de macromolècules biològiques, els músculs i els motors moleculars, la neurobiologia, la fotobiologia, la biofísica teòrica i d altres. Així, pocs aspectes del funcionament

dels organismes vius estan fora de la biofísica. Essent, doncs un camp tan ampli, convé establir una certa delimitació de continguts, que podem establir entre la biofísica molecular i la biofísica de sistemes. Per posar un parell d exemples aclaridors, l estudi dels fenòmens físics i fisicoquímics que tenen lloc a la percepció visual (és a dir, la interacció de les cèl·lules receptores amb la llum i la transformació d aquest estímul en impulsos nerviosos) correspon clarament a la biofísica molecular, mentre que l estudi de la circulació dels fluids en els organismes vius el situaríem dins la biofísica de sistemes. Per tant, podem dir que la biofísica molecular utilitza els mètodes de la física, les matemàtiques i la química per a estudiar, a nivell de les molècules, com funcionen els organismes vius. Com a conseqüència dels objectius i els mètodes utilitzats, algunes de les tècniques de la biofísica molecular són d una enorme complexitat. Per exemple, la determinació, mitjançant tècniques de difracció de raigs X, de l estructura tridimensional

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 8

8 ESTEVE PADRÓS

de proteïnes que formen microcristalls, no seria possible sense els sincrotrons. En aquest món nostre tan accelerat, és especialment satisfactori agrair als autors dels treballs següents haver trobat temps per a redactar i enviar les seves contribucions. Aquest volum conté una sèrie de treballs que espero que donin una idea de la feina que es fa actualment al nostre país sobre bio-

física molecular. Com passa normalment, el recull que es presenta no cobreix pas tota la recerca en biofísica molecular, ja que, per diverses raons, alguns grups de recerca que treballen activament a l àrea no hi han pogut participar. Però crec que els articles que conté constitueixen una mostra suficientment reveladora de l activitat actual en l àrea a casa nostra.

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 9

Biofísica molecular (Esteve Padrós, ed.) Treballs de la SCB. Vol. 53 (2002) 9-21

LA LLUM DE SINCROTRÓ: ESTRUCTURA MOLECULAR I FUNCIÓ DELS TEIXITS MUSCULARS JOAN BORDAS, JOSEP CAMPMANY, JORDI JUANHUIX I AGNETA SVENSSON * Laboratori de Llum de Sincrotró (LLS). Edifici Cn. Campus de la Universitat Autònoma de Barcelona. * Professor visitant. Departament de Física i Astronomia. Universitat de Leicester. Leicester. Regne Unit. Adreça per a la correspondència: J. Bordas. Laboratori de Llum de Sincrotró (LLS). Edifici Cn. Campus de la Universitat Autònoma de Barcelona. 08193 Bellaterra. Adreça electrònica: jbordas@ifae.es. Paraules clau: Llum de sincrotró, estructura i funció muscular, actina, miosina. Keywords: Synchrotron radiation, structure and function of muscle, actin, myosin. RESUM L ús de la llum de sincrotró és l únic mètode que permet l estudi de l estructura molecular i la redistribució molecular que experimenten teixits musculars sencers, totalment funcionals i no alterats, durant el procés de contracció muscular. Això és així perquè és l única tècnica que permet enregistrar diagrames de difracció de raigs X amb una escala de temps de mil·lèsimes de segon o menys, és a dir, commensurable amb les constants de temps de les diverses formes de contracció muscular. Es presenta un breu resum d alguns dels treballs realitzats durant els darrers vint anys. Els recents resultats han portat a plantejar-se un cert nombre de qüestions noves, que cal resoldre, referents als mecanismes moleculars que controlen la contracció muscular. Es posa èmfasi en la importància de les tecnologies més noves, procedents del desenvolupament de les anomenades fonts de llum de sincrotró de tercera generació, en relació a aquestes qüestions.

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 10

10 JOAN BORDAS, JOSEP CAMPMANY, JORDI JUANHUIX I AGNETA SVENSSON

SUMMARY Synchrotron radiation is the only method that allows the study of the molecular structure and molecular rearrangements that whole, fully functional and undisturbed muscle tissues undergo during the process of muscular contraction. This is because it is the only technique that allows the recording of X-ray diffraction data in a time scale of milliseconds or less, i.e. conmensurate with the time constants of the various forms of muscular contraction. A brief summary of some of the work carried out in the last twenty years is presented. The latest results have led to a number of new questions, that need to be addressed, regarding the molecular mechanisms governing muscular contraction. The importance of the newer technologies arising from the development of the so-called third generation Synchrotron Radiation sources is emphasised in connection with these questions. INTRODUCCIÓ A L ESTRUCTURA DELS TEIXITS MUSCULARS La funció dels teixits musculars és convertir energia química en força o moviment. Això s assoleix utilitzant l energia alliberada en el trencament de les molècules d ATP i, d alguna manera, produint la funció requerida. El procés de transducció de l energia és realitzat per un ensamblatge complex de proteïnes filamentoses que s organitzen amb un elevat grau d ordenació. De fet, l ordre és d unes característiques inusualment complexes, per a una estructura biològica en funcionament. En conseqüència, hom pot obtenir i mesurar patrons de difracció de raigs X de teixits musculars no pertorbats. Aquests diagrames porten informació sobre la disposició i estructura de les molècules i àtoms constitutius. Tot i això, desentrellar aquesta informació i aconseguir esbossar els processos moleculars que governen la contracció muscular és extremadament complicat. Ho és tant, que la major part de les idees actuals sobre com succeeix la contracció s han de considerar encara models de treball, més que hipòtesis provades. Expliquem breument la base d aquesta complexitat. L estructura supramolecular dels teixits del múscul estriat és raonable-

ment ben coneguda (figura 1), encara que no és igual per a totes les espècies. La mostra que s empra més sovint és el múscul sartorius de les granotes, i una altra que també s utilitza, encara que menys, és el múscul semitendinosus de la mateixa espècie. En aquest cas, la major part de la massa (> 75 %) està formada pels filaments prims i gruixuts. Els filaments prims estan formats per hèlixs de monòmers d actina G (Kabsch et al., 1990) que tenen aproximadament 1000 nm de llargària. En una primera aproximació, el filament d actina es pot veure com una hèlix de DNA levògira amb una separació d uns 5,9 nm, i pas de rosca d uns 2,73 nm, amb 54 subunitats d actina en 25 voltes helicoïdals. El fet que dos nomòmers consecutius d actina G estiguin rotats aproximadament 167° (és a dir, 25/54 ´ 360°) confereix a aquesta estructura helicoïdal una apariència de doble hèlix dextògira. Aquesta hèlix forma un complex amb les molècules de tropomiosina que se situen al llarg de la ranura també helicoïdal, però de pas de rosca molt més gran, que deixa oberta l estructura de doble hèlix. A més, hi ha un parell de molècules de troponina per cada 14 molècules d actina, és a dir, espaiades uns 38,0 nm al llarg de l hèlix d actina (figura 2a). A la pràctica, l hèlix d actina no es exactament helicoïdal, i la si-

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 11

LA LLUM DE SINCROTRÓ: ESTRUCTURA MOLECULAR I FUNCIÓ DELS TEIXITS MUSCULARS 11

FIGURA 1. a) Detall d una fibra muscular. b) Aspecte d un sarcòmer vist amb microscopi electrònic (a dalt), i esquema que representa les diferents parts de què és compost (a sota). La foscor de cada banda o línia en la microfotografia electrònica és directament proporcional a la seva densitat electrònica. c) Seccions transversals del sarcòmer que corresponen a cada zona. a. La banda I conté filaments prims que formen una xarxa aproximadament quadrada. b. A la zona de solapament de la banda A, els filaments prims d actina se situen en les posicions trigonals de l estructura haxagonal dels filaments gruixuts de miosina. c. Fora de la zona de solapament, els filaments gruixuts resten amb la mateixa estructura. d. Al disc M, els filaments gruixuts queden units per petits filaments transversals, compostos per diverses proteïnes estructurals.

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 12

12 JOAN BORDAS, JOSEP CAMPMANY, JORDI JUANHUIX I AGNETA SVENSSON

metria que acabem de descriure s ha de veure com una aproximació a l estructura real. L estructura atòmica del filament d actina s ha modelitzat de forma refinada (Holmes et al., 1990) utilitzant l estructura cristal·logràfica de l actina G (Kabsch et al., 1990). Els filaments gruixuts estan formats per unes 300 unitats de l anomenada miosina II, és a dir, la varietat de miosina més abundant als músculs esquelètics. Les llargues cues a-helicoïdals dels parells de molècules de miosina (figura 2b) s acoblen amb altres per a formar l «espinada» (esquematitzat pel cilindre central de la figura 2c) del filament gruixut. En aquest muntatge, els caps globulars de miosina (sovint designats com a subfragments S1; encerclats a la figura 2b) sobresurten d aquesta espinada del filament gruixut seguint una simetria que aproximadament és una triple hèlix (esquematitzats pels cilindres petits a la figura 2c). Cadascuna d aquestes tres hèlixs consisteix en 9 parells de caps de miosina per una volta d hèlix d uns 129 nm, amb un espaiat axial d uns 14,3 nm, és a dir, una hèlix 9/1 (figura 2c). Malgrat tot, a causa de la disposició en triple hèlix, el filament gruixut es repeteix cada tres voltes d hèlix o, com sovint es diu a les descripcions, cada tres corones (Luther et al., 1981). Una corona és el nom donat a cada nivell de 3 parells de caps de miosina repetits al llarg del filament (figura 2c, a sota i a l esquerra). Com que cada corona té 3 parells idèntics de caps de miosina, és natural esperar que la seva projecció axial de masses siguin dos lòbuls, on cadascun correspon a la projecció d un dels caps. Com veurem més endavant, ha estat possible resoldre aquests lòbuls mitjançant la difracció de raigs X. A més, al llarg de tota la llargària dels filaments gruixuts (d una longitud d uns 800 nm), es troben tota una sèrie de proteïnes accessòries, com ara la proteïna C, la proteïna X, i la proteïna H (Bennet et al., 1986). Entre elles, la proteïna C és la més

abundant i regularment ordenada al llarg del filament gruixut. La proteïna C és una molècula allargassada d uns 35-40 nm de llargària i uns 2-3 nm de diàmetre (Offer, 1972), i forma un complex amb els filaments gruixuts, de manera que la unitat que es repeteix és una sèrie de 7-11 amb separacions entre unitats d uns 44 nm (Offer et al., 1973). De nou, cal emfasitzar que la simetria dels filaments gruixuts que acabem d esbossar s ha d esguardar com una primera aproximació. A la pràctica, hi ha desviacions significatives d aquesta simetria ideal, tal com clarament proven multitud de pics de difracció que haurien de ser absents del diagrama, i que tot i això apareixen (les anomenades reflexions prohibides). Des d un punt de vista cristal·logràfic, l estructura supramolecular que es repeteix als teixits musculars és el sarcòmer (figura 1b) i, per tant, s ha de considerar la cel·la cristalogràfica unitària. El sarcòmer està delimitat per les anomenades línies Z, que es repeteixen més o menys indefinidament al llarg de l eix muscular. Els filaments prims emanen de cada cara d aquestes línies Z amb polaritats oposades. Al centre del sarcòmer hi ha un altre pla d estructures proteíniques, les anomenades línies M, que el parteixen per la meitat. Els filaments gruixuts emanen de cada cara d aquests plans M, també amb polaritats oposades. A la regió on els filaments prims amb llargària de 1000 nm s interpenetren amb els filaments gruixuts de 800 nm de llargària, els dos conjunts de filaments estan empaquetats formant una xarxa haxagonal (figura 1c), en la qual els filaments prims ocupen les posicions trigonals de la xarxa hexagonal definida pels gruixuts. A la pràctica, com que de cada tres filaments gruixuts un està rotat 60 graus, és a dir, conforma la que es designa com a xarxa no three alike, l empaquetat hexagonal forma una superxarxa, més que no pas la petita xarxa que hom esperaria si cada filament

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 13

LA LLUM DE SINCROTRÓ: ESTRUCTURA MOLECULAR I FUNCIÓ DELS TEIXITS MUSCULARS 13

gruixut tingués la mateixa orientació en cada grup de tres. De la mateixa manera que els filaments gruixuts surten de la línia M, hi ha una regió d uns 150 nm, és a dir, aproximadament la longitud de la llarga cua a-helicoïdal de les molècules de miosina, on no hi ha caps de miosina sobresortint de l «espinada» (regió central de la figura 1c). Això és degut al fet que, atès que les molècules de miosina s acoblen per a formar els filaments gruixuts, les seves cues terminals són les que s enganxen a les línies M. Per tant, atesa l existència d aquesta zona fosca, tenim un cristal·lit, o

unitat de difracció, de caps de miosina a cada costat de la línia M, col·locats de forma que tenen polaritats oposades. Per a una explicació extensa dels detalls estructurals dels filaments prim i gruixut, i sobre l estructura supramolecular dins del sarcòmer, el lector interessat pot remetre s a Squire (1981). Difracció de raigs X amb resolució temporal de teixits musculars funcionals. El diagrama de difracció del múscul estriat és molt ric en detalls. Només pel fet que

A) b)

c)B)

C) FIGURA 2. a) Disposició de l actina (A), tropomiosina (TM), i les 3 subunitats de la troponina (Tn-C, Tn-I i Tn-T) en el filament prim. Dessota, mostrem una visió ampliada del punt d unió de les tres proteïnes. S observa el punt d unió de les tropomiosines a l alçada de la Tn-T. b) Dímer de miosina. Es marquen les cadenes lleugeres RLC i ELC, i les longituds de les parts de la MHC (LMM, S2 i S1, excepte les cadenes lleugeres) que formen cada monòmer. L extrem carboxílic (C, COO-) de la MHC se situa a l extrem de la LMM, mentre que l extrem amino (N, NH3+) és al subfragment S1. Els subfragments S1 i S2 formen la HMM (heavy meromyosin). c) Esquema de l arranjament de les corones de caps de miosina en el filament gruixut. Cada corona té tres parells de caps de miosina (cilindres), i se situa a 14,3 nm i 40° de l anterior. El filament es repeteix idènticament cada 3 × 14,3 = 42,9 nm.

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 14

14 JOAN BORDAS, JOSEP CAMPMANY, JORDI JUANHUIX I AGNETA SVENSSON

els filaments prim i gruixut tenen simetries helicoïdals molt diferents, és possible a la pràctica utilitzar aquests detalls. Això és així perquè, excepte a la part equatorial del diagrama, on contribueixen simultàniament els dos tipus de filaments, pràcticament a tota la resta del diagrama els pics de difracció esperats a partir de les disposicions respectives dels filaments prim i gruixut s ubiquen en espaiats axials diferents. Quan un múscul, mantingut en el medi fisiològic apropiat, s activa mitjançant l aplicació de l estímul elèctric adequat, desenvoluparà una tensió (si el múscul se sosté isomètricament) o s escurçarà (si al múscul se li deixa canviar la longitud lliurement). El temps necessari per a fer la transició entre l estat de repòs i l estat de desenvolupar la màxima tensió, per a un múscul sartorius de granota, és d uns 200 ms (aquest temps varia una mica segons les espècies, paràmetres estacionals i, en particular, amb la temperatura a la qual es manté la mostra). Durant aquesta estona, tenen lloc un cert nombre d esdeveniments: els filaments prims s activen; els caps de miosina interactuen amb ells i, d alguna manera, el resultat és la producció de tensió i/o moviment. Relacionar de quina manera el reordenament de l organització molecular de les proteïnes del múscul porta a la producció de força o tensió és l objectiu central dels estudis de difracció de raigs X amb resolució temporal. Aquí, la llum de sincrotró és essencial, ja que no hi ha cap altra font de raigs X que pugui donar simultàniament les característiques geomètriques que es necessiten per a resoldre les enormes grandàries de cel·la unitat dels teixits musculars, d una banda, i la intensitat necessària per a recollir les dades en un lapse de temps prou curt per a capturar els canvis estructurals que succeeixen durant les diverses formes de contracció muscular. Amb l adveniment de la segona generació de fonts de llum de sincrotró, en conjun-

ció amb el desenvolupaments de les cambres de raigs X apropiades i els sistemes de detecció associats, va ser possible resoldre els pics de difracció i, més encara, fer-ho amb resolució temporal durant el cicle de contracció. La figura 3 mostra la diferència entre dos diagrames de difracció de raigs X bidimensionals obtinguts a partir d un múscul sartorius de granota en repòs i al replà de tensió isomètrica. Les àrees més clares corresponen a les línies de difracció que han desaparegut, o que s han reduït de forma significativa durant la contracció, mentre que les àrees fosques corresponen a línies que apareixen o creixen en intensitat durant la contracció. Sense baixar als detalls més intrincats que requereix qualsevol interpretació quantitativa, és suficient remarcar la gran quantitat d àrees clares i fosques que són presents en aquest diagrama diferencial de difracció, cosa que clarament indica que hi ha reordenacions substancials en l estructura molecular del múscul durant la contracció. Les diverses àrees incloses en caixes a la figura 3 mostren les parts del patró de difracció que, des del primer estudi de difracció de raigs X que va tenir èxit (Huxley et al., 1980), s han explorat amb una resolució temporal d aproximadament 1 ms. Un exemple d aquest tipus d experiment es dóna a la figura 4, on es mostra el canvi de la distància entre la distribució dels caps de miosina simètricament disposats a cada banda de la línia M (longitud d interferència), després d imposar un canvi de longitud a un múscul en el pic de la contracció isomètrica. És a dir, durant la transició de contracció isomètrica a isotònica. En aquesta maniobra mecànica la tensió (línia negra contínua) baixa des d un màxim a 0, mentre que el múscul es contrau a màxima velocitat. Les dades estan escalades respecte del canvi percentual de la distància mitjana entre les unitats de difracció de miosina a cada banda de la línia M. Hi ha dues mesures in-

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 15

LA LLUM DE SINCROTRÓ: ESTRUCTURA MOLECULAR I FUNCIÓ DELS TEIXITS MUSCULARS 15

dependents a aquest canvi (quadrats i rombes), extretes de dues reflexions meridio-

nals del diagrama de difracció mostrat a la figura 3. L escala de temps està referida a un

FIGURA 3. Diagrama diferencial de difracció entre els estats de contracció isomètrica i de repòs d un múscul. Les àrees clares corresponen a pics de difracció que s esmorteeixen molt durant la contracció, i les fosques als que es fan més intensos. Les caixes marquen les parts del diagrama que s han mesurat en mode de resolució temporal amb una resolució de prop d 1 ms. La fletxa indica l espaiat de la reflexió meridional més intensa, que en el múscul en repòs és de 14,34 nm. Per raons gràfiques, la intensitat del disc central s ha reduït artificialment. Les línies de difracció clares a la caixa rectangular central són produïdes per la desaparició de la primera a la vuitena línies de difracció de la miosina. El parell de línies de difracció més fosques a les vores de la caixa és produït per la intensificació de les línies de difracció a 5,9 i 5,1 nm de l actina. La causa d això és, almenys parcialment, la formació del complex actomiosina. Les línies més difuses de les altres caixes corresponen a la intensificació de la segona línia de difracció de l actina, a causa del moviment de la tropomiosina que succeeix durant l activació.

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 16

16 JOAN BORDAS, JOSEP CAMPMANY, JORDI JUANHUIX I AGNETA SVENSSON

zero que coincideix amb el moment d iniciar el canvi de longitud. En aquest cas, la resolució temporal és de 0,5 ms. Sense entrar en interpretacions detallades d aquests resultats, és clar que la coincidència temporal d aquests canvis de longitud d interferència amb el canvi de tensió indiquen un comportament elàstic dels components estructurals que contribueixen a aquestes reflexions. S han dut a terme al llarg dels anys molts experiments d aquest tipus. Un sumari succint d aquest coneixement acumulat és que durant la contracció isomètrica es poden distingir i mesurar quatre intervals diferents. L interval més ràpid correspon a l activació dels filaments prims. Aquí, la troponina s aixeca de la posició de repòs i produeix unes reflexions més contrastades les reflexions provinents de la troponina al meridià del diagrama creixen en intensitat amb una constant de temps d uns 16 ms (Bordas et al., 1991) , i pràcticament de forma simultània, les molècules de tropomiosina roden sobre el filament d actina, presumiblement destapant els punts d enllaç actina-miosina (Kress et al., 1986). Això indueix un desordre estructural de tota la combinació de proteïnes, on el desordre s esdevé amb una constant de temps d uns 35 ms. El desordenament succeeix perquè, encara que els caps de miosina son ara capaços d interactuar amb el filament d actina, només ho poden fer abandonant les posicions ordenades que ocupen en repòs. En aquest moment, el mostreig cristal·logràfic relativament fort que s observa als músculs en repòs pràcticament desapareix. Simultàniament es produeix l esdeveniment cinètic de la formació d un complex d actomiosina (AM) (Bordas et al., 1993; Martin-Fernandez et al., 1994a; Bordas et al., 1999). Finalment, hi ha un cert nombre d esdeveniments estructurals associats amb la reorientació dels caps de miosina que duren un temps idèntic

al del desenvolupament de la tensió, és a dir, una constant de temps d uns 65 ms (Martin-Fernandez et al., 1994b). A més, és possible de seguir els esdeveniments relatius a determinades parts del diagrama de difracció, notablement les reflexions meridionals més fortes de la miosina, que porten informació sobre l orientació relativa dels caps de miosina durant els estats transitoris que resulten d aplicar contraccions i estiraments ràpids (al voltant d 1 ms). La hipòtesi que hi havia al darrere d aquests experiments és que si les diferents disposicions axials dels caps de miosina que interactuen amb l actina estiguessin sincronitzades amb els canvis mecànics, resultaria que la major part de la població de caps estarian en un estat estructural ben definit (Huxley et al., 1981). Una de les conclusions inqüestionables que es va extreure d aquest tipus d experiments és que els caps de miosina passen per un canvi d orientació significatiu durant els canvis de longitud associats a les contraccions, és a dir, durant els estiraments o arronsaments ràpids, es torcen, de mitjana, cap a una posició menys perpendicular respecte l eix del filament prim. Malgrat tot, encara hi ha un conjunt d observacions que cal explicar. La hipòtesi de treball sobre la contracció muscular que té més ressò és que l energia mecànica necessària per a sostenir la tensió prové dels caps de miosina (Huxley i Simmons, 1971) i, en conseqüència, després d una contracció ràpida, quan la tensió baixa fins a valors negligibles, s espera que les intensitats de les reflexions sensibles a aquesta disposició dels caps de miosina segueixin una evolució temporal idèntica a la transició de canvi de longitud o de tensió (és a dir, s espera un comportament similar de les intensitats al que s ha trobat per a la longitud d interferència; veg. la figura 4). A la pràctica, això no passa, i els canvis en la intensitat de les reflexions rellevants estan retardades prop d 1 ms.

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 17

LA LLUM DE SINCROTRÓ: ESTRUCTURA MOLECULAR I FUNCIÓ DELS TEIXITS MUSCULARS 17

Més encara: una altra suposició central és que els únics elements elàstics de l estructura són als caps de miosina, i llavors l «espinada» del filament gruixut ha de ser inextensible. Tot i això, gràcies a l alta brillància de les fonts de llum de sincrotró, es pot mesurar l extensibilitat dels filaments fins a un nivell de precisió mai assolit fins ara. Aquest tipus de mesures ha demostrat que els filaments prims poden experimentar una extensió d un 0,3 % de la longitud en repòs durant la transició de l estat de repòs al replà de contracció isomètrica (Huxley et al.,

1994; Wakabayashi et al. 1994; Bordas et al., 1999). A més, s ha pogut mostrar que al llarg d una maniobra d arronsament des del replà de contracció isomètrica dissenyada de manera que la tensió desenvolupada caigui fins a zero, el filament prim redueix la longitud prop d un 0,4 %, cosa que produeix un canvi molt subtil de la simetria helicoïdal (Bordas et al., 1999). La manera en què aquestes observacions es poden incorporar als models clàssics de contracció és actualment objecte de controvèrsia. Finalment, la importància de la tercera

LONGITUD D INTERFERÈNCIA

FIGURA 4. Exemple d informació cinètica obtinguda de l anàlisi dels diagrames de difracció. Es representa el percentatge de la variació de la distància mitjana, o longitud d interferència, entre les unitats de difracció de miosina a cada costat de la línia M (figura 1c), quan un múscul en contracció isomètrica s allibera de sobte i es deixa que s escurci lliurement. En aquesta situació, la tensió desenvolupada pel múscul (línia negra contínua) decau «instantàniament» des del màxim de contracció isomètrica a zero. Les dades marcades amb quadrats i rombes mostren el canvi de la longitud d interferència a partir de dos pics de difracció diferents. A l eix horitzontal, representem el temps passat des del moment en què el múscul es deixa escurçar lliurement. La resolució temporal en aquest cas és de 0,5 ms. Tenint en compte que es necessiten de l ordre de 24 hores per a aconseguir un diagrama de difracció d un teixit muscular amb una font de raig X convencional, aquest tipus d experiments són impracticables excepte si es fa servir llum de sincrotró.

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 18

18 JOAN BORDAS, JOSEP CAMPMANY, JORDI JUANHUIX I AGNETA SVENSSON

generació de font de llum de sincrotró per a la recerca muscular és immensa. El desenvolupament més important aquí ha estat la possibilitat de produir raigs X amb onduladors amb una brillància sense precedents. L European Sinchrotron Radiation Facility és el principal exemple, tot i que no l únic, d una font de tercera generació d aquest tipus. La conseqüència pràctica d aquesta brillància és que ara és possible de resoldre els diagrames de difracció de raigs X de teixits musculars durant la contracció amb resolucions angulars sense precedent. És sabut des de fa temps que els mateixos tipus de fenòmens d interferència presents als pics de difracció meridionals dels músculs en repòs són presents també a l estat de contracció (Bordas et al., 1995). Tot i això, és només des de l entrada en funcionament de les fonts de raigs X de tercera generació que aquests fenòmens d interferència s han pogut mesurar bé. Aquests efectes sorgeixen del fet que les dues unitats de difracció de la miosina situades a cada cara de la línia M estan separades per una zona neutra, de tal forma que succeeix un fenomen comparable a l efecte clàssic de difracció de dues escletxes. Tot i això, aquí les projeccions axials de dues unitats de difracció són mirall una de l altra, a causa de la disposició polar dels filaments gruixuts. En aquesta situació, les intensitats difractades porten la informació de fase necessària per a reconstruir la projecció de masses dels caps de miosina al llarg de l eix del múscul. Aquest fenomen ja s ha explotat per a determinar la disposició estructural del parell de caps de miosina a la corona al replà de contracció isomètrica (Juanhuix et al., 2001). Els resultats són clarament indicatius del fet que cada cap dels parells que formen les corones té disposicions estructurals distintes, i que només un dels caps del parell interactua estereoespecíficament amb el filament prim cada vegada. Per tant, és bas-

tant probable que el 50 % dels caps que estan enllaçats estereoespecíficament a l actina sigui el responsable de l aparició de les línies de difracció de l actina durant la contracció isomètrica, mentre que els caps no enllaçats siguin els responsables de les línies de difracció remanents de l estat de repòs (Bordas et al., 1993; Martin-Fernandez et al., 1994a; Bordas et al., 1999). Això porta d alguna manera a explicar les diferències entre els diagrames de difracció mesurats durant la contracció isomètrica i els obtinguts de músculs en rigor. La situació al replà de contracció isomètrica es presenta a la figura 6, mentre que la figura 5 il·lustra una part del diagrama de difracció meridional i mostra els efectes d interferència pronunciats que afecten els pics de difracció, i que es poden utilitzar per a extreure la informació de fase rellevant (Juanhuix et al., 2001). Atès el comportament de les intensitats de difracció durant un arronsament i, també, els càlculs d energia que demostren que quan hi ha plena interacció entre miosina i actina amb la formació del complex AM estereoespecífic, el cap de miosina és gairebé perpendicular a l eix del múscul (Díaz Baños et al., 1996), és molt probable que sigui el cap més perpendicular dels dos mostrats a la figura 4 el que formi el complex AM estereoespecífic responsable d estirar el filament prim, de forma que incrementi la longitud en un 0,4 % i s obtingui la simetria helicoïdal pròpia del filament prim activat (Bordas et al., 1999). Queda per demostrar si aquesta distorsió del filament prim és capaç d emmagatzemar, almenys parcialment, la tensió mecànica que el teixit desenvolupa en el replà de contracció isomètrica. És també atractiu especular que el cap inclinat i no enllaçat està disponible per a reemplaçar el que forma el complex AM quan el múscul se sotmet de sobte a un arronsament de llargària apropiada, de forma que la tensió es pugui resta-

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 19

LA LLUM DE SINCROTRÓ: ESTRUCTURA MOLECULAR I FUNCIÓ DELS TEIXITS MUSCULARS 19

FIGURA 5. Esquerra: Porció del diagrama de difracció meridional produït per un múscul al replà de contracció isomètrica. Mostra els ordres meridionals tercer (3M) i sisè (6M), que són sensibles a la disposició axial dels caps de miosina que sobresurten de l «espinada» del filament gruixut. Les altres etiquetes apunten a les reflexions produïdes per la proteïna C (C), troponina (T) i col·lagen (col). El col·lagen no té una única orientació en els teixits musculars, i per aquest motiu la seva contribució apareix en forma d anells de difracció. Dreta: Empremtes molt expandides de la distribució axial d intensitat, que mostra la divisió dels pics induïda per efectes d interferència, als ordres meridionals 3M (a sota) i 6M (a dalt) de la miosina. La línia vermella és l ajustament a les dades experimentals a partir del qual s ha trobat la fase.

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 20

20 JOAN BORDAS, JOSEP CAMPMANY, JORDI JUANHUIX I AGNETA SVENSSON

z (nm)

5 x (nm)

r (z) (u.a.)

FIGURA 6. Distribució de la densitat electrònica derivada experimentalment que correspon a la projecció axial de masses del parell de caps de miosina en una corona (cercles). La línia és la distribució de densitat electrònica derivada a partir de dos caps de miosina disposats tal com es mostra al panell de l esquerra. Noteu que al teixit muscular, l «espinada» del filament de miosina està situat al costat dret i en direcció vertical en aquesta representació; la doble hèlix formada pel filament d actina hauria de col·locar-se verticalment al costat esquerre.

blir ràpidament. Aquesta possibilitat s ha proposat (Huxley i Tideswell, 1996) com una manera de reconciliar l existència de l elasticitat del filament prim (Huxley et al., 1994; Wakabayashi et al., 1999; Bordas et al., 1999) amb el comportament de les fibres musculars subjectes a arronsaments sobtats. A més, una situació estructural com la mostrada a la figura 4 implica que la probable raó per la qual els dos caps no poden tenir posicions idèntiques respecte al filament prim és que el cap que forma el complex AM obstruiria el possible enllaç de l altre cap, si tinguessin la mateixa configuració. Cal una gran quantitat de nous experiments per a establir si les idees fins aquí esbossades s apliquen o no a la pràctica. L accés a fons de llum de sincrotró de tercera generació continuarà essent el requeriment central per a aquest tipus de recerca.

BIBLIOGRAFIA BENNETT, P.; R. CRAIG; R. STARR; G. OFFER (1986). «The ultrastructural location of C-protein, X-protein and H-protein in rabbit muscle». J. Mus. Res. Cell Motility, núm. 7, pàg. 550-657. BORDAS, J.; G. P. DIAKUN; F. G. DIAZ; J. E. HARRIES; R. A. LEWIS; J. LOWY; G. R. MANT; M. L. MARTIN-FERNANDEZ; E. TOWNS-ANDREWS (1993).«Two-dimensional time resolved X-ray diffraction studies of live isometrically contracting frog sartorius muscle». J. Mus. Res. Cell Motility, núm. 14, pàg. 311-324. BORDAS, J.; G. P. DIAKUN; J. E. HARRIES; R. A. LEWIS; G. R. MANT; M. L. MARTIN FERNANDEZ; E. TOWNS-ANDREWS (1991).«Two-dimensional time resolved X-ray diffraction of muscle: recent results». Adv. Biophys., núm. 27, pàg. 15-33. BORDAS, J.; J. LOWY; A. SVENSSON; J. E. HARRIES; G. P. DIAKUN; J. GANDY; C. MILES; G. R. MANT; E. TOWNS-ANDREWS (1995). «X-ray evidence that in contracting muscle there exist two distinct populations of myosin heads». Biophys. J., núm. 68, pàg. 99-105. BORDAS, J.; A. SVENSSON; M. ROTHERY; J. LOWY; G. P. DIAKUN; P. BOESECKE (1999). «Extensibility and

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 21

LA LLUM DE SINCROTRÓ: ESTRUCTURA MOLECULAR I FUNCIÓ DELS TEIXITS MUSCULARS 21 symmetry of actin filaments in contracting muscles». Biophys. J., núm. 77, pàg. 3197-3207. DIAZ-BAÑOS, F. G.; J. BORDAS; J. LOWY; A. SVENSSON; J. CAMPMANY (1996). «Small segmental rearrangements in the myosin head can explain force generation in muscle». Biophys. J., núm. 71, pàg. 576-589. HOLMES, K. C.; D. POPP; W. GEBHARD; W. KABSCH (1990). «Atomic model of the actin filament». Nature, núm. 347, pàg. 44-49. HUXLEY, H. E.; A. R. FARUQI; J. BORDAS; M. H. J. KOCH; J. R. MILCH (1980). «Use of synchrotron radiation in time-resolved X-ray diffraction studies of myosin layer line reflections during muscle contraction». Nature, núm. 284, 5752, pàg. 140-143. HUXLEY, A. F.; R. M. SIMMONS (1971). «Proposed mechanism of force generation in striated muscle». Nature, núm. 233, pàg. 533-538. HUXLEY, H. E.; R. M. SIMMONS; A. R. FARUQI; M. KRESS; J. BORDAS; M. H. J. KOCH (1981). «Millisecond time-resolved changes in X-ray reflections from contracting muscle during rapid mechanical transients, recorded using synchrotron radiation». Proc. Natl. Acad. Sci. USA, núm. 78, pàg. 2297-2301. HUXLEY, H. E.; A. STEWART; H. SOSA; T. IRVING (1994). «Xray diffraction measurements of the extensibility of actin and myosin filaments in contracting muscle». Biophys. J., núm. 67, pàg. 2411-2421. HUXLEY, A. F.; S. TIDESWELL (1996). «Filament compliance and tension transients in muscle». J. Mus. Res. Cell Motility, núm. 17, pàg. 507-511. JUANHUIX, J.; J. BORDAS; A. SVENSSON; M. L. BASSFORD; T. NARAYANAN (2001). «Axial disposition of myosin heads in isometrically contracting muscles». Biophys. J., núm. 80, pàg. 1429-1441. KABSCH, W.; H. H. MANNHERZ; D. SUCK; E. F. PAI; K. C. HOLMES (1990). «Atomic structure of the actin:

DNase I complex». Nature, núm. 347, pàg. 37-44. KRESS, M.; H. E. HUXLEY; A. R. FARUQI (1986). «Structural changes during activation of frog muscle studied by time-resolved X-ray diffraction». J. Mol. Biol., núm. 188, pàg. 325-342. LUTHER, P. K.; P. M. MUNRO; J. M. SQUIRE (1981).«Threedimensional structure of vertebrate muscle Aband. III M-region structure and myosin filament symmetry». J. Mol. Biol., núm. 151, pàg. 703-730. MARTIN-FERNANDEZ, M. L.; G. P. DIAKUN; F. G. DIAZ; J. E. HARRIES; R. A. LEWIS; J. LOWY; G. R. MANT; E. TOWNSANDREWS; J. BORDAS (1994a). «X-ray diffraction evidence for a specific actomyosion complex in live isometrically contracting frog sartorius muscle». A: Synchrotron Radiation in Life Sciences, pàg. 435442. Oxford University Press. MARTIN FERNANDEZ, M. L.; J. BORDAS; G. P. DIAKUN; J. E. HARRIES; J. LOWY; G. R. MANT; A. SVENSSON; E. TOWNS-ANDREWS (1994b). «Time resolved X-ray diffraction studies of myosin head movements in live frog sartorius muscle during isometric and isotonic contractions». J. Mus. Res. Cell Motility, núm. 15, pàg. 319-348. OFFER, G. (1972). «C-Protein and the periodicity in the thick filaments of vertebrate skeletal muscle». Cold Spring Harbour Symp. Quant. Biol., núm. 37, pàg. 8796. OFFER, G.; C. MOOS; R. STARR (1973). «A new protein of the thick filaments of vertebrate skeletal myofibrils». J. Mol. Biol., núm. 74, pàg. 653-676. SQUIRE, J. M. (1981). The Structural Basis of Muscular Contraction. Nova York: Plenum Press. WAKABAYASHI, K.; Y. SUGIMOTO; H. TANAKA; Y. UENO; Y. TAKESAW; Y. AMEMIYA. (1994). «X-ray evidence for the extensibility of actin and myosin filaments during muscle contraction». Biophys. J., núm. 67, pàg. 2422-2435.

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 22

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 23

Biofísica molecular (Esteve Padrós, ed.) Treballs de la SCB. Vol. 53 (2002) 23-33

INFLUÈNCIA DEL POTENCIAL DIPOLAR EN LA INTERACCIÓ DE MACROMOLÈCULES AMB BIOMEMBRANES JOSEP CLADERA1 I PAUL O SHEA2 Unitat de Biofísica. Departament de Bioquímica i de Biologia Molecular. Universitat Autònoma de Barcelona. 2 Cell Biophysics Group. Departament de Ciències Biomèdiques. Universitat de Nottingham Regne Unit. 1

Adreça per a la correspondència: Josep Cladera. Unitat de Biofísica. Departament de Bioquímica i de Biologia Molecular. Universitat Autònoma de Barcelona. 08193 Bellaterra. Adreça electrònica: Josep.Cladera@uab.es. Paraules clau: Potencial dipolar, membrana, bicapa lipídica, moment dipolar, pèptid. Keywords: Dipole potential, membrane, lipidic bilayer, dipole moment, peptide. RESUM La importància de l anomenat potencial dipolar de membrana per als sistemes biològics és encara poc coneguda. Aquest potencial és generat per dipols moleculars presents a les molècules que constitueixen les membranes, com són els associats als grups carbonil de l enllaç èster dels fosfolípids i a l enllaç amida de les proteïnes, o el dipol que es forma entre el grup fosfat i el grup colina de la fosfatidilcolina, així com els dipols de molècules d aigua orientades a la interfase lípid-aigua de les bicapes. En la present revisió es fa repàs dels avenços que s han produït en l última dècada pel que fa, principalment, a la mesura del potencial dipolar de membrana mitjançant tècniques de fluorescència, les quals, a través d un mètode de doble longitud d ona, han contribuït a l estudi de la importància d aquest potencial electrostàtic en sistemes biològics. Es presenten exemples d aquesta influència en la interacció de pèptids senyal amb membranes model, de pèptids de fusió del virus d immunodeficiència adquirida amb membranes model i cel·lulars, i de compostos orgànics com l inhibidor de la proteasa del virus d immunodeficiència humana amb membranes model i cel·lulars i en la penetració de compostos a través de la pell.

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 24

24 JOSEP CLADERA I PAUL O SHEA

SUMMARY The relevance of the so-called membrane dipole potential in biological systems is not yet well established. This electrostatic potential is generated by the molecular dipoles present on the lipid and protein molecules, as for example the carbonyl groups of ester and amide bonds, the dipole between the phosphate and choline groups of phosphatidylcholine and the electric dipole associated to water molecules oriented at the lipid-water interface. In the present paper we review the contribution that the development of fluorescence techniques based on the application of a dual-wavelength method have made to the study of the role of the dipole potential in biological systems in the past ten years. Examples are presented of the influence of this potential on the interaction of signal peptides with model membranes, the interaction of HIV fusion peptides with model and cellular membranes, the interaction of the HIV protease inhibitor, saquinavir, with model an cellular membranes and the transdermal delivery of drugs. INTRODUCCIÓ L any 1972 Singer i Nicolson proposaren el model anomenat de mosaic fluid sobre l estructura de les membranes biològiques (per a una revisió, veg. Singer, 1992), que consisteix en una bicapa lipídica fluida a la qual s associen proteïnes perifèriques i integrals. Al llarg dels anys el model ha anat guanyant en complexitat, tant estructural com dinàmica; a la riquesa en composició lipídica s ha d afegir la presència a la superfície de la bicapa de les estructures hidrofíliques de les proteïnes integrals i les proteïnes perifèriques, que en ambdós casos estan freqüentment glicosilades o associades a polímers altament sulfatats, coneguts com a glicans. També és ben coneguda la possibilitat de translació lateral tant de lípids com de proteïnes en el si de la bicapa, així com la possibilitat de moviment dels lípids des d una capa a l altra (flip-flop). Finalment, avui dia és àmpliament acceptada l existència de microdominis estructurals rics en colesterol i esfingolípids en el si de la membrana, coneguts com a rafts o caveolae, la importància dels quals en tota mena de processos associats a membranes guanya un significat creixent. El model de Singer i Ni-

colson representa la base conceptual que permet la interpretació del paper que les membranes, amb tota la complexitat descrita anteriorment, juguen en multitud de processos cel·lulars i fisiològics, com ara la transducció de senyals, el reconeixement cel·lular, el metabolisme energètic i diversos processos patològics. Les membranes fan possible la compartimentació d aquests processos i el seu caràcter vectorial, i juguen així un paper fonamental en el manteniment dels sistemes apartats de l equilibri termodinàmic, característica fonamental dels éssers vius. La caracterització molecular de l estructura de les membranes biològiques resulta, per tant, essencial per a definir la naturalesa de les interaccions entre els diferents components de les biomembranes, i els paràmetres fisicoquímics que en governen la interacció amb molècules. Juntament amb l efecte hidrofòbic (White i Wimley, 1998), les interaccions electrostàtiques es troben a la base dels processos pels quals les molècules s uneixen a membranes biològiques o s hi insereixen, ja sigui a través de receptors específics o directament a la bicapa lipídica. Així, és lògic pensar que els camps elèctrics derivats dels potencials electrostàtics asso-

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 25

INFLUÈNCIA DEL POTENCIAL DIPOLAR EN LA INTERACCIÓ DE MACROMOLÈCULES AMB BIOMEMBRANES 25

ciats a biomembranes afectaran aquest tipus d interaccions, les quals representen una contribució rellevant a l energia lliure total d unió i/o inserció. Normalment trobem associats a biomembranes tres tipus diferents de potencials electrostàtics: el potencial transmembrana, el potencial de superfície i el potencial dipolar. El potencial transmembrana, conegut normalment com a potencial de membrana, és el que ha estat més ben caracteritzat dels tres, i resulta del gradient de càrregues elèctriques a través de la membrana (Mitchell 1968; Nicholls i Ferguson, 1992). El paper d aquest potencial en processos com la conducció de l impuls nerviós o la síntesi d ATP és ben conegut. El potencial de superfície és generat per les càrregues elèctriques a la superfície de la membrana. La teoria física que descriu la manifestació d aquest potencial segons el model de Gouy-Chapman-Stern ha estat revisada per MacLaughlin (1989) i Cevc (1990). El potencial de superfície pot afectar el curs de reaccions que tenen lloc a la superfície de la membrana i un nombre divers de processos, com els que impliquen l associació de pèptids carregats positivament amb membranes. Els pèptids antimicrobians (Zhang et al., 2001) i hemolítics (Hristova et al., 2001), pèptids senyal (Golding et al., 1996), la tirosina cinasa c-SRc (Murray et al., 1998) i el substrat miristoilat ric en alanina de la proteïna cinasa C (MARCKS) (Wang et al., 2001) en són exemples eloqüents. Finalment, el potencial dipolar de membrana, generat per dipols moleculars presents a les molècules que constitueixen les membranes, és el menys caracteritzat dels tres i el seu paper en processos biològics s està tot just començant a dilucidar. A la seva descripció i a la presentació d exemples en els quals adquireix significat biològic es dedica la resta d aquesta revisió.

EL POTENCIAL DIPOLAR DE MEMBRANA El potencial dipolar de membrana té el seu origen en polaritzacions associades a les molècules de fosfolípids i proteïnes. Els dipols que trobem a les molècules lipídiques són els associats al grups carbonil de l enllaç èster i als enllaços fòsfor-oxigen dels fosfats i fòsfor-nitrogen dels grups fosfat i colina. A les proteïnes, l acoblament del moment dipolar del carbonil de l enllaç peptídic dóna lloc a moments resultants d important magnitud, com els associats a les hèlixs a. D altra banda, els moments dipolars de les molècules d aigua orientades a la interfase lípid-aigua semblen també contribuir al potencial dipolar, encara que la importància d aquesta contribució es motiu de certa controvèrsia (Brokmann, 1994; Clarke, 2001). La resultant vectorial del moments dipolars d una meitat de la bicapa és positiva cap a l interior de la membrana. El potencial dipolar pot arribar a ser de centenars de milivolts, una magnitud important comparada amb la del potencial de superficie, normalment d unes desenes de milivolts. La magnitud del potencial dipolar de membrana augmenta molt ràpidament quan passem de la superfície de la membrana a la interfase (figura 1), on es dóna un gradent de polaritat (transició des de la fase aquosa a la fase hidrofòbica de les cadenes alifàtiques de l interior de la bicapa), i té un efecte sobre els cossos polaritzats, com ara els grups polars de pèptids i proteïnes, en un espai de tan sols al voltant d un nanòmetre. MESURA DEL POTENCIAL DIPOLAR DE MEMBRANA En el cas de monocapes lipídiques a la interfase aigua-aire o aigua-oli, és possible determinar potenciomètricament la magnitud

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 26

26 JOSEP CLADERA I PAUL O SHEA

P o te n c ia l E le c(mV) tric (m V ) Potencial elèctric

200

-6 0

-5

-1

-3

D is ta n c iaene nm n n des m ddel es del Distància C e n treded la e la M e m b ra n a centre membrana

O 3 S (C H 2 )3 N

CH N (C H 2 )7 C H 2

D i-8 -A N E P P S FIGURA 1. Valor del potencial elèctric associat a una bicapa lipídica, en absència de potencial transmembrana (-.-.-). Contribució del potencial dipolar de membrana (----). S indica la posició putativa de la sonda di-8-ANEPPS i la seva estructura.

del potencial dipolar (Brockmann, 1994). En el cas de bicapes lipídiques, en canvi, aquest tipus de mesura no és possible a causa de consideracions teòriques, i del gruix reduït de la bicapa (Brockmann, 1994). En bicapes lipídiques, el potencial dipolar s ha estimat normalment a partir de la cinètica del transport d anions i cations hidrofòbics a través de la membrana (Franklin i Cafiso, 1993). Va ser precisament el fet que el transport d anions hidrofòbics és unes 105 vegades més ràpid que el de cations (en membranes model neutres i absència de potencial transmembrana) el que va portar a la formulació del concepte de potencial dipolar. D altra banda, Seelig et al. (1987) establiren un mètode qualitatiu basat en la mesura

de la separació quadrupolar de les molècules de fosfolípid marcades amb deuteri, com a conseqüència de la pertorbació del moment dipolar del cap polar a causa de variacions en el potencial dipolar (un cop corregida la contribució del potencial de superfície). Durant els últims vint anys, el desenvolupament de sondes, la fluorescència de les quals varia en funció del camp elèctric segons un mecanisme electrocròmic, o de desplaçament de la càrrega molecular (Loew et al., 1979), ha permès disposar d una eina addicional per a seguir de manera principalment qualitativa els canvis en el potencial dipolar i el potencial transmembrana (les mesures de variació del potencial dipolar, per tant, s han de portar a terme en absència de variacions del potencial transmembrana). La fluorescència d aquestes sondes no és sensible a canvis en el potencial de superfície (Gross et al., 1994; Cladera i O Shea, 1998). Exemples d indicadors fluorescents d aquest tipus són la betaïna 1-(3-sulfonatopropil)-4-[b[2-(di-n-octil-amino)-6-naftil]vinil] piridina, coneguda com a di-8-ANEPPS (figura 1) i la forma di-n-butil-amino, o di-4ANEPPS, així com la N-4(sulfobutil)-4-(4(p-(dipentilamino)fenil) butadienil)-piridina, coneguda com a RH421 (Clarke i Cane, 1997). Tal com demostraren Montana et al. (1989), la intensitat de la fluorescència d aquestes sondes, tot i respondre a canvis en el camp elèctric, es pot veure afectada per contribucions artifactuals, com ara les que s originen a conseqüència de la interacció directa entre els compostos objecte d estudi i les sondes. El desplaçament del màxim de l espectre d excitació (al voltant de 468 nm) és, en canvi, tal com demostren els autors, sensible únicament a variacions del camp elèctric. Per a seguir el desplaçament del màxim, i tal com s il·lustra a la figura 1, s ha de calcular l espectre de diferència després

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 27

INFLUÈNCIA DEL POTENCIAL DIPOLAR EN LA INTERACCIÓ DE MACROMOLÈCULES AMB BIOMEMBRANES 27

de normalitzar la intensitat dels espectres d excitació (abans i després de la pertorbació que causa la variació del camp elèctric). En el cas de compostos que causen un augment del potencial dipolar de membrana (com el 6-cetocolestanol) l espectre de diferència reflecteix un desplaçament cap al blau, amb un màxim al voltant de 450 nm i un mínim al voltant de 520 nm. Compostos com la floretina, que causen una disminució del potencial dipolar, originen un desplaçament cap al vermell, amb un mínim a 450 i un màxim a 520 nm. L existència d aquests màxims i mínims en l espectre de diferència, ha permès, també, el disseny d un mètode de doble longitud d ona d excitació, consistent a il·luminar la mostra a 450 i 520 nm, tot mesurant la relació d intensitats de la llum emesa a 580 nm (màxim d emissió). Això permet el seguiment de la variació de la relació R(450/520), la qual reflecteix el desplaçament del màxim d excitació i, per tant, les variacions del potencial en funció del temps (figura 1). Les seccions següents es dediquen a il·lustrar l aplicació d aquests mètodes a l estudi de la influència del potencial dipolar de membrana en la interacció de molècules amb membranes. INFLUÈNCIA DEL POTENCIAL DIPOLAR EN LA INTERACCIÓ DE MACROMOLÈCULES AMB MEMBRANES En comparació al potencial transmembrana o al potencial de superfície, la importància del potencial dipolar per als sistemes biològics fa molt poc que s ha començat a posar de manifest. L existència d una barrera, l origen de la qual s associà als dipols moleculars presents a la membrana i que afectava la translocació d ions hidrofòbics, era coneguda des de 1969 (Liberman i To-

play, 1969), però només al llarg dels últims sis o set anys han aparegut treballs que il·lustren la influència d aquests dipols en la interacció entre macromolècules i membranes. Experiments portats a terme al nostre laboratori amb la sonda di-8-ANEPPS (Cladera i O Shea, 1998) i resultats publicats per Voglino et al. (1998), estableixen clarament la influència dels dipols moleculars en la capacitat d unió de pèptids senyal. Utilitzant monocapes i bicapes lipídiques, Shapovalov et al. (1999) i Antonenko et al. (1999) estudiaren la relació entre la capacitat de la gramicidina per a formar canals iònics i la magnitud del potencial dipolar, i establiren una correlació entre la dissociació dels dimers de gramicidina i la disminució del potencial. Maggio (1999) demostrà que l activitat de la fosfolipasa A2 sobre monocapes lipídiques és modulada a través de les propietats dipolars específiques de glicoesfingolípids i que les reaccions redox a la interfase membrana-aigua es veuen també afectades pel potencial dipolar (Alakoskela et al., 2001). La seva influència s ha estudiat també en la interacció dels pèptids de fusió amb membranes model (Cladera et al., 1999), la interacció d inhibidors de la proteasa de VIH amb microdominis de membranes cel·lulars (Asawarkan et al., 2001) i la difusió de substàncies a través de la pell (Valenta et al., 2001). Alguns d aquests exemples, estudiats en el nostre laboratori, s amplien en els apartats següents. INFLUÈNCIA DEL POTENCIAL DIPOLAR EN LA INTERACCIÓ DEL PÈPTID DE FUSIÓ DEL VIRUS D IMMUNODEFICIÈNCIA DE SIMI (SIV) AMB MEMBRANES MODEL El pèptid de fusió del virus d immunodeficiència de simi (SIV) comprèn 12 residus del segment N-terminal de la proteïna

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 28

28 JOSEP CLADERA I PAUL O SHEA 0.2

Fluorescència Fluorescència

0.1

Longitud d’ona (nm)

0.0

-0.1 350

400

450 500 Longitut d'ona (nm) R(460/520)

550

5.0

B 4.0 Fluorescència Fluorescencia

SIV 5 PM

SIV 20 PM

3.0 O

=460 nm

exc

2.0 1.0 O

=520 nm

exc

100

200

300

Temps (s)

FIGURA 2. a) Espectre de diferència obtingunt restant l espectre d excitació de vesícules lipídiques marcades amb la sonda di-8-ANEPPS de l espectre d excitació de les mateixes vesícules després d afegir el pèptid de fusió del virus d immunodeficiència de simi (VIS, 10 mM). Abans d efectuar la resta es normalitzaren les intensitats dels espectres d excitació perquè l espectre de diferència reflectís tan sols desplaçaments de longitud d ona. L insert mostra una representació esquemàtica de la inserció obliqua de l estructura helicoïdal que el pèptid adopta en interaccionar amb la membrana, així com del moment dipolar associat a l hèlix (vector orientat cap a la superfície de la membrana) i el moment dipolar de la membrana (vector orientat cap al centre de la bicapa). b) Mesura de doble longitud d ona de la variació temporal del potencial dipolar de vesícules lipídiques marcades amb di-8-ANEPPS, amb l addició de les concentracions indicades de VIS. La mostra es va excitar a 450 i 520 nm. La fluorescència es va mesurar a 580 nm i es va determinar la relació R(450/520), els canvis en la qual corresponen a canvis en la magnitud del potencial dipolar de membrana. Composició de les vesícules lipídiques: 50 mol% fosfatidilcolina : 50 mol% fosfatidiletanolamina. c) Mesura de la fusió de vesícules lipídiques marcades amb les sondes NBD-fosfatidiletanolamina i rodamina-fosfatidiletanolamina induïda pel pèptid de fusió del VIS. Es mesurà la disminució en transferència d energia (FRET) entre les dues sondes a 530 nm. Traça 1: Vesícules de fosfatidilcolina/fosfatidiletanolamina (50:50); traça 2: Vesícules suplementades amb 30 mol% de 6-cetocolestanol, que incrementa el potencial dipolar; traça 3: Vesícules suplementades amb 15 mol% de floretina, la qual disminueix el potencial dipolar. Un major increment de la fluorescència a 530 nm reflecteix una disminució més elevada de la transferència d energia, a causa de la dissolució de les sondes en el si de les membranes que es fonen. Una variació més gran de la intensitat de fluorescència indica, per tant, més fusió.

1 Fluorescència Fluorescència

Peptid de Pèptid de Fusio Fusió del del SIV SIV 10 microM

50 Temps (s)

100

gp32, involucrada en el procés de fusió entre la membrana vírica i la membrana cel·lular i és, per tant, un element essencial per a l entrada del virus a la cèl·lula (Kowalski et al., 1987). La seqüència del pèptid de fusió es compon de residus hidrofòbics, i en dimetilsulfòxid el pèptid forma agregats moleculars organitzats en forma d estructures beta. En aigua, forma grans agregats coloïdals. La presència de membranes, en canvi, causa la

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 29

INFLUÈNCIA DEL POTENCIAL DIPOLAR EN LA INTERACCIÓ DE MACROMOLÈCULES AMB BIOMEMBRANES 29

desagregació del pèptid (Cladera et al., 1999) i aquest s insereix obliquament en la bicapa lipídica i forma una hèlix a (Martin et al., 1994; Brasseur et al., 1997), la qual es creu que causa la desestabilització de la membrana i el desencadenament del procés de fusió. Tal com es mostra a la figura 1, la interacció del pèptid de fusió amb membranes model (liposomes) causa una disminució de la magnitud del potencial dipolar. Aquesta s ha mesurat en forma de mínim a 450 nm i màxim a 520 nm a l espectre de diferència de la sonda di-8-ANEPPS (Cladera et al., 1999), tot coincidint amb l espectre de diferència originat per molècules que disminueixen el potencial dipolar, com la floretina (Franklin i Cafiso, 1993). Aquest efecte del pèptid de fusió és corroborat per la disminució de la relació de fluorescència R(450/520) quan interacciona amb les membranes (figura 1b). L efecte del pèptid sobre el potencial revela que les hèlixs a s insereixen a la bicapa oposant el moment dipolar de l hèlix al de la bicapa, és a dir, amb l extrem N-terminal prop de la superfície i l extrem C-terminal apuntant cap al centre de la bicapa. La importància de la modificació del potencial dipolar per part del pèptid de fusió quedà palesa en estudiar l extensió del procés de fusió en funció de la magnitud d aquest potencial (figura 1c). La variació de la magnitud inicial del potencial en membranes model s aconseguí tractant les membranes amb 6-cetocolestanol i floretina, els quals l augmenten i disminueixen, respectivament. Els resultat de la mesura de la fusió de les bicapes mitjançant transferència d energia (FRET) posa de manifest que la disminució del potencial redueix l extensió del procés de fusió, mentre que el seu augment l incrementa. Aquest efecte pot estar relacionat amb la influència del potencial dipolar en l orientació de les hèlixs a, i per tant, dels seus moments dipolars en el si de la bicapa, encara que caldran nous estudis per a

dilucidar aquest extrem. Aquests estudis adquireixen especial rellevància si considerem el fet que la membrana vírica conté un alt percentatge de colesterol (Aloia et al., 1993), el moment dipolar del qual pot contribuir de manera important al potencial dipolar, i pot resultar, per tant, un element significatiu per al mecanisme d entrada del virus a la cèl·lula. INFLUÈNCIA DELS DIPOLS MOLECULARS EN LA INSERCIÓ D UN PÈPTID SENYAL EN MEMBRANES MODEL La unió del pèptid senyal (p25) de la subunitat IV de la citocrom oxidasa a la superfície de membranes model (liposomes), és seguida de la inserció de part de l estructura del pèptid a l interior de la bicapa i la formació d una hèlix amfipàtica (Golding et al., 1996), amb els residus polars i els carregats positivament agrupats a una cara de l hèlix i els hidrofòbics a l altra. Estudis amb membranes model marcades amb la sonda di-8ANEPPS (Cladera i O Shea, 1998) han demostrat que la interacció del pèptid p25 amb les bicapes causa una disminució de la magnitud del potencial dipolar (figura 3). L ajustament matemàtic de les traces a un doble procés exponencial, revela que la constant cinètica aparent, de l ordre de 0,29 s-1, coincideix amb la constant cinètica del procés d inserció del pèptid a la bicapa, calculada per altres mitjans (Golding et al., 1996). D altra banda, estudis d espectroscòpia infraroja de transformada de Fourier indicaren que l augment del potencial dipolar de la membrana amb la utilització de 6-cetocolestanol origina un augment del percentage d hèlixs a. Aquesta es una indicació clara de la importància del potencial dipolar per a la conformació de pèptids associats a biomembranes.

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 30

30 JOSEP CLADERA I PAUL O SHEA

(460/520) oR=EQ S M LR O M F

m `Jm e

m `Jh` M KM M Q

NM NR OM 10 15 20 qÉ ã é ë =Eë F Temps (s)

OR 25

PM 30

FIGURA 3. Variació temporal de la relació de fluorescència R(450/520) i, per tant, del potencial dipolar, causada per l addició del pèptid senyal p25 a una suspensió de vesícules lipídiques de fosfatidilcolina (PC), mesurada amb una tècnica de cinètica ràpida (stopped flow). La proporció de floretina (PC-PH) i 6-cetocolestanol (PC-KC) és 15 mol%. Concentració de lipid: 200 mM; concentració de pèptid: 15 mM. Temperatura ambient. PH: 7,4. Les traces s ajustaren matemàticament a dobles processos exponencials, dels quals es deduïren les constants cinètiques aparents.

EFECTE DEL POTENCIAL DIPOLAR DE MEMBRANA EN LA INTERACCIÓ DE LA PROTEASA DEL VIRUS D IMMUNODEFICÈNCIA ADQUIRIDA I LA MEMBRANA DE CÈL·LULES CACO-2 Els dos apartats anteriors posen de manifest la importància del potencial dipolar per a la interacció de macromolècules amb membranes model. Per a determinar, però, de manera més directa i significativa, la influència d aquest potencial en processos biològics, són necessaris estudis amb membranes cel·lulars. En un treball publicat recentment (Asawakarn et al., 2001) hem encetat aquesta tasca amb l estudi de la interacció de l inhibidor de la proteasa del VIH, conegut com a sa-

quinavir, amb cèl·lules d epiteli intestinal (cèl·lules Caco-2). En l estudi es demostra que el marcatge de les membranes cel·lulars amb la sonda di-8-ANEPPS és factible i es pot utilitzar la disminució del potencial dipolar causada per la interacció de l inhibidor amb les mateixes per a caracteritzar el procés d unió. Estudis anteriors demostren que els inhibidors de la proteasa de VIH són substrats de la la glicoproteïna P, una proteïna de membrana implicada en la multiresistència a medicaments mitjançant el bombeig d aquests cap a l exterior de la cèl·lula. Experiments d unió competitiva efectuats per Asawarkan et al., (2001) amb colquicina, un altre substrat conegut de la glicoproteïna P, corroboren aquest extrem. És sabut que la glicoproteïna P es troba, en les membranes cel·lulars, associada a microdominis lipídics rics en colesterol i esfingolípids coneguts com a rafts, la importància dels quals en tota mena de processos biològics està adquirint una rellevància creixent (Simons i Ikonen, 1997). El tractament de les cèl·lules Caco-2 amb b-ciclodextrina, un segrestador de colesterol, disminueix el potencial dipolar de membrana, tal com es mostra a la figura 4 en forma de disminució de la relació de fluorescència R(450/520). L estudi de la interacció de saquinavir en funció de la seva concentració posa de manifest que l eliminació del colesterol de la membrana redueix la capacitat d unió de l inhibidor, això és, el nombre total de molècules que s uneixen a la membrana nivell de variació màxima de la relació R(450/520). És sabut que l eliminació de colesterol de la membrana provoca la destrucció dels microdominis lipídics. Els resultats, per tant, representen la primera prova de la possible relació entre el potencial dipolar de membrana i els processos biològics associats a rafts, en aquest cas, la capacitat d unió d un lligam a un receptor ubicat en aquests microdominis.

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 31

INFLUÈNCIA DEL POTENCIAL DIPOLAR EN LA INTERACCIÓ DE MACROMOLÈCULES AMB BIOMEMBRANES 31

3,5 3.5

1.5

3,0 3.0 R(425/520) R (425/520)

1.0

0.5

2.5 2,5

2.0 2,0

200

400

S aquin avir ( PM )

1.5 1,5 1.0 1,0 00

50 50

100 150 100 150 Saquinavir (P(mM) M) Saquinavir

200 200

FIGURA 4. Variació de la relació de fluorescència R(450/520) en funció de la concentració de saquinavir, afegit a una suspensió de cèl·lules Caco-2 marcades amb la sonda di-8ANEPPS (els triangles situats cap avall) i a una suspensió equivalent de cèl·lules pretractades amb b-ciclodextrina (els triangles situats cap amunt) per eliminar el colesterol de la membrana. L insert representa les dues corbes després de normalitzar el valor inicial de la relació R(450/520) a zero, per a facilitar la comparació de l amplitud de la variació a concentracions saturants de saquinavir (diferència en la capacitat d unió a la membrana). Concentració de cèl·lules: 40 × 104/ml. Concentració de di-8-ANEPPS: 1 mM. Temperatura: 37° C; pH: 7,4.

INFLUÈNCIA DEL POTENCIAL DIPOLAR DE MEMBRANA EN LA PENETRACIÓ DE SUBSTÀNCIES A TRAVÉS DE LA PELL Finalment, i per posar de relleu la importància del potencial dipolar de membrana a diferents nivells de complexitat biològica, ens referirem a la influència de la seva modulació en la penetració de compostos a través de la pell humana. L epidermis, la capa més externa de la pell, es compon de diferents capes cel·lulars. A la més externa, l estrat corni, trobem una gran quantitat de bicapes lipídiques apilades, les quals representen una barrera formidable per a la penetració de substàncies. Des del punt de vista farmacològic, un ampli ventall de productes químics s utilitza per a modificar la penetra-

bilitat de substàncies d interés mèdic. Tenint en compte que molts d aquests compostos tenen una càrrega elèctrica neta, o moments dipolars associats, és raonable pensar que el potencial dipolar de les membranes de l estrat corni pugui influir en la seva penetració. En un estudi recent (Valenta et al., 2001), es demostra que el pretractament d epidermis humana amb liposomes carregats de floretina, la qual disminueix el potencial dipolar de membrana, intensifica la capacitat de penetració de l anestètic linocaïna. D altra banda, mesures de microscòpia confocal han demostrat que el tractament de l epidermis amb 6-cetocolestanol intensifica la penetració de l antibiòtic bacitracina (figura 5). CONSIDERACIONS FINALS De tot el que hem exposat fins ara, el potencial dipolar de membrana emergeix com un important paràmetre físic en el si de la complexitat de la interfase lípid-aigua a les membranes biològiques. La interfase, la determinació de l estructura i aspectes dinàmics de la qual és de cabdal importància per a la descripció acurada de les interaccions entre molècules i membranes, constitueix al voltant del 50 % del gruix total de la membrana. Fins i tot en membranes model simples, la concentració en aquest espai de grups químics tan diversos com els grups fosfocolina, glicerol, carbonil i metilè (veg. White i Wimley, 1999), ens aboca a considerar la idealització de la membrana com una capa hidrofòbica que separa dues fases aquoses com una aproximació particularment inadequada. De manera especial si considerem l efecte de factors com el potencial dipolar en processos associats a membranes, una influència que dependrà altament de la configuració geomètrica de tots aquests components químics. La complexi-

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 32

32 JOSEP CLADERA I PAUL O SHEA

PLFUHV

tot formant estructures helicoïdals sigui coneguda, en combinació amb tècniques com el dicroisme d infraroig, que permetin estudiar la influència del potencial en l orientació de les hèlixs a, un tipus estructural dominant en proteïnes de membrana. En segon lloc, estudis destinats a valorar la contribució del potencial dipolar de membrana, i en aquest sentit, la seva modulació a través de la concentració de colesterol, en els microdominis lipídics coneguts com a rafts.

PLFUHV

BIBLIOGRAFIA

6XSHUILFLH 6XSHUItFLH (SLGHUPLV HSLGHUPLV PLFUHV

6XSHUILFLH 6XSHUItFLH (SLGHUPLV HSLGHUPLV

FIGURA 5. Imatge confocal (secció ortogonal a la superfície de la pell) de la penetració de l antibiòtic bacitracina marcat amb fluoresceïna a través d epidermis humana (a) i epidermis pretractada amb liposomes carregats amb 6-cetocolestanol (30 mol%) (b). Imatges obtingudes 48 després de l aplicació de la bacitracina sobre les mostres d epidermis. Les motres es pretractaren amb 6-cetocolestanol durant 12 hores.

tat fisicoquímica de la interfase es tradueix en un canvi molt espectacular de polaritat al llarg d una distància molt petita, que genera així un gradient de polaritat que jugarà un paper important en la distribució dels residus polars i apolars presents en les molècules que interaccionen amb les membranes. Des del punt de vista del modelatge molecular, la disponibilitat d eines que permetin modelar finament la riquesa de la interfase incorporant acuradament els dipols moleculars, facilitarà una predicció teòrica mínimament satisfactòria dels mecanismes d interacció de molècules amb membranes. Per últim, des del punt de vista de la determinació experimental de la importància del potencial dipolar de membrana, dos tipus d estudis resultaran, en la nostra opinió, de cabdal importància en el futur proper. D una banda, la utilització de pèptids la inserció dels quals en membranes model

ALAKOSKELA, J. I.; P. K. J. KINNUNEN (2001). «Control of a redox reaction on lipid bilayer surfaces by membrane dipole potential». Biophys. J., núm. 80, pàg. 294-304. ALOIA, R. C.; H. TIAN; F. C. JENSEN (1993). «Lipid composition and fluidity of the human immunodeficiency virus envelope and host cell plasma membranes». Proc. Natl. Acad. Sci. USA, núm. 90, pàg. 5181-5185. ANTONENKO, Y. N.; T. I. ROKITSKAYA; E. A. KOTOVA (1999). «Effect of dipole modifiers on the kinetics of sensitized photoinactivation of gramicidin channels in bilayer lipid membranes». Membr. Cell Biol., núm. 13, pàg. 111-120. ASAWAKARN, T.; J. CLADERA; P. O SHEA (2001). «Effects of the membrane dipole potential on the interaction of saquinavir with phospholipid membranes and plasma membrane receptors of caco2 cells». J. Biol. Chem., núm. 276, pàg. 38457-38463. BRASSEUR, R.; T. PILLOT; L. LINS; J. VANDEKERCKHOVE; M. ROSSENEU (1997). «Peptides in membranes: tipiing the balance of membrane stability». TIBS, núm. 22, pàg. 167-171. BROCKMANN, H. (1994). «Dipole potential in lipid membranes». Chem Phys. Lipids, núm. 73, pàg. 57-79. CEVC, G. (1990). «Membrane electrostatics». Biochim. Biophys. Acta., núm. 1031-3, pàg. 311-382. CLADERA, J.; I. MARTIN; J.M. RUYSSCHAERT; P. O SHEA (1999). «Characterization of the sequence of interactions of the fusion domain of the simian immunodeficiency virus with membranes». J. Biol. Chem., núm. 274, pàg. 29951-29959. CLADERA, J.; P. O SHEA (1998). «Intramembrane molecular dipoles affect the membrane insertion and folding of a model amphiphilic peptide». Biophys. J., núm. 74, pàg. 2434-2442. CLARKE, R. J. (2001). «The dipole potential of phospholip-

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 33

INFLUÈNCIA DEL POTENCIAL DIPOLAR EN LA INTERACCIÓ DE MACROMOLÈCULES AMB BIOMEMBRANES 33 id membranes and methods for its detection». Adv. Colloid Interface Sci., núm. 89-90, pàg. 263-281. CLARKE, R. J.; D. J. KANE (1997). «Optical detection of membrane dipole potential: avoidance of fluidity and dye-induced effects». Biochim. Biophys. Acta, núm. 1323, pàg. 223-239. FRANKLIN, J. C.; D. S. CAFISO (1993). «Internal electrostatic potentials in bilayers: measuring and controlling dipole potentials in lipid vesícules». Biophys. J., núm. 65, pàg. 289-299. GOLDING, C., S. SENIOR; M. T. WILSON; P. O SHEA (1996). «Time resolution of binding and membrane insertion of a mitochondrial signal peptide: correlation with structural changes and evidence of cooperativity». Biochemistry, núm. 35, pàg. 10931-10937. HRISTOVA, K.; C. E. DEMPSEY; S. H. WHITE (2001). «Structure, location and lipid perturbations of melittin at the membrane interface». Biophys. J., núm. 80, pàg. 801-811. KOWALSKI, M.; J. POTZ; L. BASIRIPOUR; T. DOTFMAN; W. CHUN GOH; E. TERWILLIGER; A. DAYTON; C. ROSEN; W. HASELTINE; J. SODROSKI (1987). «Functional regions of the envelope glycoprotein of Human Immunodeficiency Virus type-1». Science, núm. 237, pàg. 1351-1355. LIBERMAN, E. A.; V. P. TOPALY (1969). «Permeability of biomolecular phospholipid membranes for fatsoluble ions». Biophysics, núm. 14, pàg. 477-487. LOEW, L. M.; S. SCULLY; L. SIMPSON; A. S. WAGGONER (1979). «Evidence for a charge-shift electrochromic mechanism in a pobe of membrane potential». Nature, núm. 281, pàg. 497-499. MAGGIO, B. (1999). «Modulation of phospholipase A2 by electrostatic fields and dipole potential of glycosphingolipids in monolayers». J. Lip. Res., núm. 40, pàg. 930-939. MARTIN, I.; M. C. DUBOIS; F. DEFRISE-QUERTAIN; T. SAERMARK; A. BURNY; R. BRASSEUR; J.-M. RUYSSCHAERT (1994). «Correlation between fusogenicity of synthetic modified peptides corresponding to the NH2-terminal extremity of simian immunodeficiency virus gp32 and their mode of insertion into the lipid bilayer: an infrared spectroscopy study». J. Virol., núm. 68, pàg. 1139-1148. MCLAUGHLIN, S. (1989). «The electrostatic properties of membranes». Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem., núm. 18, pàg. 113-136.

MITCHELL, P. D. (1979) «Keilin s respiratory chain concept and its chemiosmotic conseuences». Science, núm. 206, pàg. 1148-1159. MURRAY, D.; L. HERMIDA-MATSUMOTO; C. A. BUSER; J. TSANG; C. T. SIGAL; N. BEN-TAL; B. HONIG; M. D. RESH; S. MCLAUGHLIN (1998). «Electrostatics and the membrane association of Src: Theory and Experiment». Biochemistry, núm. 37, pàg. 2145-2159. NICHOLLS, D.; S. FERGUSON (1992). Bioenergetics. (2a edició) J. Wiley & Son, Inc. Regne Unit. SEELIG, J.; P. M. MACDONAL; P. G. SCHERER (1987). «Phospholipid headgroups as sensors of electric charges in membranes». Biochemistry, núm. 26, pàg. 75357541. SHAPOVALOV, V.; E. A. KOTOVA; T. I. ROKITSKAYA; Y. N. ANTONENKO (1999). «Effect of gramicidin A on the dipole potential of phospholipid membranes». Biophys. J., núm. 77, pàg. 299-305. SIMONS, K.; E. IKONEN (1997). «Functional rafts in cell membranes». Nature, núm. 387, pàg. 569-572. SINGER, S. J. (1992). «The structure and function of membranes: a personal memoir». J. Membr. Biol., núm. 129, pàg. 3-12. VALENTA; C.; J. CLADERA; P. O SHEA; J. HADGRAFT (2000). «Effect of phloretin on the percutanoeus absortion of lignocaine across human skin». J. Pharm. Sci., núm. 90, pàg. 485-492. VOGLINO, L.; T. J. MCINTOSH; S. A. SIMON (1998). «Modulation of the binding of signal peptides to lipid bilayers by dipoles near the hydrocarbon-water interface». Biochemistry, núm. 37, pàg. 12241-12252. WANG, J.; A. ARBUZOVA; G. HANGYÁS-MIHÁLYNÉ; S. MCLAUGHLIN (2001). «The effector domain of myristoylated alanine-rich C Kinase substrate binds strongly to phosphatidylinositol 4,5-biphosphate». J. Biol. Chem., núm. 276, pàg. 5012-5019. WHITE, S.H.; W.C. WIMLEY (1998). «Hydrophobic interactions of peptides with membrane interfaces». Biochim. Biophys. Acta, núm. 1376, pàg. 339-352. WHITE, S. H.; W. C. WIMLEY (1999). «Membrane protein folding and stability: physical principles». Annu. Rev. Biophys. Biol. Struct., núm. 28, pàg. 319-365. ZHANG, L.; A. ROZEK; R. E. HANCOCK (2001). «Interaction of cationic antimicrobial peptides with model membranes». J. Biol. Chem. Jul 25 [e-pub ahead of print].

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 34

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 35

Biofísica molecular (Esteve Padrós, ed.) Treballs de la SCB. Vol. 53 (2002) 35-52

APROXIMACIONS EXPERIMENTALS A L ESTUDI DEL PROCÉS D AGREGACIÓ DE LA PROTEÏNA b-AMILOIDE: UNA AVALUACIÓ CRÍTICA MONTSERRAT CRUZ, DOLORS GRILLO, FRANCESC RABANAL* I ERNEST GIRALT* Departament de Química Orgànica. Facultat de Química. Universitat de Barcelona. * Adreça per a la correspondència: Departament de Química Orgànica. Facultat de Química. Universitat de Barcelona. Carrer de Martí i Franquès, 1-11. 08029 Barcelona. Adreça electrònica: giralt@qo.ub.es; rabanal@qo.ub.es. Paraules clau: Proteïna b-amiloide, malaltia d Alzheimer, fibril·logènesi, estudis estructurals, cinètica. Keywords: b-amyloid protein, Alzheimer s disease, fibrillogenesis, structural assays, kinetics. RESUM L estudi de les proteïnes amiloides i del seu comportament en solució ha adquirit en els darrers anys una rellevància especial a causa de la implicació que tenen en una amplia varietat de malalties, com la malaltia d Alzheimer. Aquest article és una recopilació sobre els diferents aspectes de l agregació de les proteïnes amiloides, on es descriuen les diverses tècniques emprades en aquest camp per a la detecció, quantificació i estudi estructural de les fibril·les amiloides, tot aprofundint en els seus avantatges i inconvenients. També s analitzen alguns models rellevants proposats com a mecanisme de l agregació amb la utilització aquestes tècniques. SUMMARY There is an increased interest in studying amyloid proteins and its properties due to their implication in a variety of disorders such as Alzheimer s disease. This article is an overview on the different aspects of amyloid aggregation. Several techniques that are commonly used to study amyloid fibril detection and quantification are summarised. Structural and kinetic studies as well as some of the most relevant models proposed are discussed.

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 36

36 MONTSERRAT CRUZ, DOLORS GRILLO, FRANCESC RABANAL I ERNEST GIRALT

INTRODUCCIÓ

Eix de propagació de la fibril·la

Avui dia es coneixen en l organisme humà més de vint proteïnes amb capacitat amiloïdogènica (Kisilevsky, 2000). Aquestes proteïnes no estan relacionades en la seva estructura primària ni en el seu origen biològic, sinó que presenten com a característica comuna la seva capacitat d associar-se, partint d una estructura soluble, per a donar lloc a dipòsits de fibril·les insolubles amb una estructura central b creuada, com s esquematitza a la figura 1 (Sunde i Blake, 1997), anomenades fibril·les amiloides. L elevat interès en l estudi d aquestes proteïnes es justifica pel fet que els dipòsits amiloides estan relacionats amb malalties tan diverses i rellevants com són la malaltia d Alzheimer, la diabetis de tipus II i la malaltia de Creuzfeldt-Jacob (incloent-hi la variant humana de l encefalopatia espongiforme bovina, popularment anomenada malaltia de les «vaques boges»). A més, s ha observat que un elevat nombre de proteïnes i pèptids poden donar lloc a fibril·les amiloides in vitro sota condicions apropiades.

O N H

O N H O N H

H N

N H

O N H

H N O

H N

N H

H N O H N O

FIGURA 1. L estructura b-creuada es caracteritza perquè presenta l esquelet peptídic en forma de làmines b que es disposen perpendicularment a la direcció de creixement de la fibra. Els enllaços d hidrogen són paral·lels a la direcció de creixement de la fibra.

Així doncs, l estudi del procés de fibril·logènesi no solament té interès científic per a ampliar els coneixements sobre el plegament de proteïnes, sinó que també pot donar lloc a noves aproximacions a la prevenció i tractament de les malalties amiloïdogèniques. Un fet que cal destacar en aquestes malalties és que encara que algunes són sistèmiques (generalitzades), normalment els dipòsits es localitzen en un únic òrgan, cosa que sembla indicar l existència de factors desencadenants del plegament anormal de les proteïnes amiloïdogèniques. En el conjunt de les proteïnes amiloides, la proteïna b-amiloide (bA) és una de les més estudiades, ja que diverses dades apunten que té un paper destacat en la malaltia d Alzheimer (Iversen et al., 1995), el tipus de demència senil més comú al voltant d un 15 % de la població major de 65 anys presenta algun tipus de demència senil, i es calcula que d aquí a 5 anys hi haurà uns 22 milions d afectats només als Estats Units (GeorgeHyslop, 2001). La proteïna bA es presenta dipositada en forma de fibril·les en les anomenades plaques neurítiques. La hipòtesi amiloide sobre la malaltia d Alzheimer sosté que la fibril·logènesi de la proteïna bA és la causant de la cascada de processos que desemboquen en la mort neuronal i el deteriorament de les capacitats cognitives pròpies d aquesta alteració. Per aquesta raó, l elucidació del mecanisme pel qual té lloc la fibril·logènesi presenta una rellevància especial. El terme bA es fa servir en referència a una família de proteïnes amb una llargada que oscil·la entre 39 i 43 aminoàcids i que, en condicions normals, se segrega a les neurones per escissió d una proteïna transmembranal anomenada proteïna precursora de la proteïna bA (APP) (Selkoe, 1998). Les mutacions que comporten tant la sobreproducció d APP com un augment de l activitat d al-

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 37

ESTUDI DEL PROCÉS D AGREGACIÓ DE LA PROTEÏNA b-AMILOIDE 37

gunes de les proteases implicades en la formació de bA poden donar lloc a l inici prematur de la malaltia i a casos aguts, com succeeix en el cas de les persones amb síndrome de Down (Dumery et al., 2001; Sinha i Lieberburg, 1999). Malgrat que no s ha descobert encara la funció fisiològica concreta de la proteïna bA, s ha vist que es presenta en concentracions que oscil·len entre 10 i 500 pM en el líquid cerebroespinal i en el torrent sanguini de les persones sanes, i no es troben diferències significatives amb les concentracions observades als malalts d Alzheimer. Les formes més abundants de la proteïna bA són bA(1-40) i bA(1-42), i encara avui existeix controvèrsia sobre el desencadenant del procés d agregació in vivo, tot i que molts autors mantenen que és la variant de 42 aminoàcids la que presenta una major capacitat amiloïdogènica (Jarret et al., 1993). Els estudis in vitro apunten que només les formes agregades d estructura fibril·lar de la proteïna bA són neurotòxiques; per tant, l estudi del procés de fibril·logènesi (també anomenat d envelliment) i dels seus factors prenen part en la comprensió de la malaltia (Zagorski et al., 1999). Tot i que molts aspectes de la malaltia d Alzheimer no s han aclarit encara, sembla que l estudi i elucidació del mecanisme pel qual la proteïna bA agrega i dóna fibril·les pot ser crucial per a comprendre els processos bioquímics i biofísics associats amb ella i, potser, amb altres malalties causades per proteïnes amiloides. Així doncs, avui dia trobem una gran quantitat de material bibliogràfic on, basant-se en diverses aproximacions, s estudia tant l estructura de les fibril·les amiloides madures de bA, com el procés que porta a la seva formació, a més de la seva citotoxicitat i interrelació amb altres compostos. Malgrat això, gran part de la bibliografia presenta resultats contradictoris i l únic tema sobre el qual

tots els investigadors han estat sempre d acord és la dificultat que implica l estudi de bA. L inconvenient més important que es troba a l hora de treballar amb un pèptid amiloide és la dificultat que implica la seva manipulació, proporcional a la seva capacitat amiloïdogènica. Un exemple clar el constitueix la discrepància de resultats que es poden obtenir fent servir lots diferents de pèptid bA, atribuïts, entre d altres causes, a la diferencia dels estats d agregació inicial (Howlett et al., 1995), a més de a la presencia d ions metàl·lics polivalents, sals, diferències de pH, dissolvents orgànics i contaminants de naturalesa diversa (Zagorski et al., 1999). Així, l elevat nombre de factors que influeixen en la fibril·logènesi, juntament amb la impossibilitat d obtenir fibril·les de bA en forma cristal·lina per al seu estudi mitjançant tècniques d alta resolució, com són difracció de raigs X o ressonància magnètica nuclear (RMN), són les principals causes de confusió en els articles especialitzats. Un avantatge de les proteïnes amiloides que s intenta aprofitar al màxim és l elevada semblança en l estructura de les fibril·les que formen, tot i estar constituïdes per una gran varietat de proteïnes i pèptids amb llargàries i seqüències molt variades. Aquesta observació és el fonament de molts estudis on s extrapolen els resultats obtinguts amb proteïnes amiloides de més fàcil manipulació, com ara la transtiretina (TTR) o fragments peptídics sintètics, a proteïnes amiloides més problemàtiques, com la bA. Aquest elevat grau de similitud entre les estructures donades per diferents proteïnes amiloides porta a pensar en la possibilitat de trobar un mecanisme d agregació general partint de l estudi d una d aquestes proteïnes, cosa que podria comportar una forma de tractament universal per a les malalties amiloides.

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 38

38 MONTSERRAT CRUZ, DOLORS GRILLO, FRANCESC RABANAL I ERNEST GIRALT

EL PROCÉS D AGREGACIÓ DE bA

Quantitat de fibril·les

El procés d agregació, com ja hem dit, encara no es troba aclarit. Ara per ara només podem assegurar que bA és segregada a la membrana cel·lular en forma soluble i que mitjançant un mecanisme d associació no totalment entès, dóna lloc a agregats fibril·lars, els quals desencadenen la mort neuronal. Els experts encara es troben a l estadi de postular noves hipòtesis basant-se en observacions experimentals realitzades en condicions cada vegada més properes a les condicions in vivo i acotant més els factors responsables de la variabilitat i irreproduïbilitat, a més de fer servir tècniques amb major sensibilitat. Però aquests models encara no estan lliures de possibles artefactes associats al treball in vitro i la precisió dels mètodes utilitzats no permet encara una resolució a nivell atòmic ni del procés d agregació ni dels productes d aquest. Generalment s ha acceptat que el procés d agregació de les proteïnes amiloides té

lloc mitjançant un mecanisme dependent de nucleació, com s indica a la figura 2. En aquest procés es postula que, partint d una espècie soluble de bA, aquesta s associa i dóna un nucli d agregació al qual ràpidament s incorporen més espècies solubles, i dóna lloc així a les fibril·les madures. Aquesta teoria es basa en l observació d una cinètica d agregació sigmoïdal i és corroborada per la desaparició del temps d inducció quan s empren fibril·les madures per a sembrar (Jarret et al., 1993; Goldsbury et al., 2000). Alguns autors, anant una mica més lluny, apunten que l agregació de les proteïnes amiloides in vivo és consistent amb un procés de nucleació governat per factors específics de teixit, ja que tot i que molts pèptids amiloïdogènics es troben circulant lliurement pel torrent sanguini i presenten la mateixa concentració en tots el òrgans, la seva deposició es fa de forma selectiva en alguns òrgans, cosa que fa pensar que el procés no solament depèn de la concentració

bA bA endissolució dissolució en lent Lent

bA E$ enHQ GLV dissolució VROXFL´

ràpid Ràpid

F ib ril·le s amiloides a m ilo id e s fibril·les

E$n

Temps Temps FIGURA 2.

Mecanisme hipotètic d agregació dependent de nucleació.

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 39

ESTUDI DEL PROCÉS D AGREGACIÓ DE LA PROTEÏNA b-AMILOIDE 39

(com és el cas als processos dependents de nucleació) sinó que també està relacionat amb altres variables del medi fisiològic on es troben (Kisilevsky, 2000). Actualment, la utilització de noves tècniques en els estudis cinètics han donat lloc a models d agregació més complexos que els que introduïm aquí. Per a poder determinar l interès i les limitacions d aquests models és necessari introduir alguns conceptes addicionals sobre les tècniques emprades en l estudi d aquestes estructures. Les fibril·les amiloides, resultat final del procés d agregació, es van descriure per primera vegada el 1959, gràcies a la utilització de la microscòpia electrònica, i el 1967 ja es va postular el primer model sobre la seva estructura (Shiraham i Cohen, 1967), el qual és vigent encara avui dia. Es va observar que les fibril·les de transtiretina presenten un diàmetre de 75-80 Å i estan formades per cinc protofibril·les de 25-35 Å. Aquestes protofibril·les estan formades a la seva vegada per subprotofibril·les de 10-15 Å, com es mostra a la figura 3.

25-30 Å

75-80 Å

FIGURA 3. Fibril·la de TTR segons el model proposat per Shiraham i Cohen (1967).

Aquestes fibril·les no presenten ramificacions i, a més de caracteritzar-se per la seva morfologia, també poden ser identificades

NH2

NH2 N N

N N

SO3

SO3 roig Congo FIGURA 4.

per les seves propietats enfront de determinats colorants. Així l ordenació en forma d estructura b creuada fa que el roig Congo (CR) s orienti en presencia de fibril·les amiloides i doni, en ser observat sota llum polaritzada, birefringència d un color verd poma característic, prova del caràcter amiloide de les estructures observades (Castaño et al., 1986). Un comportament similar s observa amb la tioflavina T (ThT), una substància fluorescent que presenta un augment en la seva intensitat d emissió i un desplaçament en la seva longitud d ona d excitació, que passa de 415 nm a 450 nm en presència de fibril·les amiloides i que s utilitza com a mètode de quantificació del grau de fibril·logènesi. Tot i que són àmpliament utilitzades actualment, la crítica més estesa a aquestes substàncies és el desconeixement sobre el tipus d interacció amb les fibril·les amiloides. Quan es vol començar a estudiar l agregació de la proteïna bA, i atesos els problemes que comporta, sorgeix una pregunta molt important: Quina ha de ser la proteïna amb la qual s ha de treballar? És millor treballar amb models peptídics o amb bA naturals? En els estudis del procés d agregació de la proteïna bA es troben diverses aproximacions que intenten donar solució tant als problemes generals presents en les proteïnes amiloides, com als particulars de bA. D aquesta forma hi ha estudis tant amb proteïnes bA naturals com amb diversos models. Dins dels treballs on es fa servir la proteïna natural, podem observar com una major part d ells opten per l ús de la variant H3C

S N CH3 tioflavina T

Estructura del roig Congo i la tioflavina T, compostos que interaccionen amb fibril·les amiloides.

CH3 N CH3 CH3

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 40

40 MONTSERRAT CRUZ, DOLORS GRILLO, FRANCESC RABANAL I ERNEST GIRALT

bA(1-40) i només alguns fan servir la proteïna bA(1-42) tot i que els resultats in vitro semblen indicar que aquesta segona és la iniciadora del procés d agregació (Jarret et al., 1993): 1 Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-SerGly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-LeuVal-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-SerAsn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-ValGly-Gly-Val-Val-Ile-Ala-43Thr Aquesta possible incongruència té un origen pragmàtic: la proteïna bA(1-42), per la seva elevada capacitat amiloïdogènica, resulta altament insoluble en condicions aquoses, sobretot entre pH 4 i 7, i això fa necessari l ús d additius per a poder iniciar l experiment amb el pèptid en dissolució en les concentracions de treball habituals. Aquests additius (normalment dissolvents orgànics, com l acetonitril, o agents desestructurants, del tipus del sulfòxid de dimetil, hexafluoroisopropanol, trifluoroetanol, urea o clorur de guanidini) poden influir de forma crítica en la cinètica d agregació, a més de fer-ho sobre les propietats de les fibril·les obtingudes (Zagorski et al., 1999; Goldsbury et al., 2000). Tot i aquests inconvenients, l ús d additius és també freqüent amb el pèptid bA(1-40), amb el qual es fan servir per a facilitar la seva solubilitat o, simplement, per a obtenir resultats més reproduïbles. Una raó a favor de la utilització de bA(1-40) en lloc de bA(1-42) és el fet que, malgrat que sota un punt de vista cinètic els dos pèptids es comporten de manera molt diferent (i això fa que sigui tan difícil treballar amb bA(1-42) però també que, probablement, sigui l iniciador del procés d agregació in vivo), sembla que les fibril·les a les quals donen lloc presenten una estabilitat termodinàmica comparable, i a més presenten una morfologia equivalent (Jarret et al., 1993). Una altra aproximació comuna per a simplificar la problemàtica que presenta el treball experimental amb la proteïna bA, és

la utilització de models peptídics. Normalment es fan servir pèptids que, tot contenint part de la seqüència de la proteïna natural, són capaços de donar lloc a fibril·les amiloides in vitro. Així, podem trobar articles on es fan servir fragments relativament grans, com el bA(1-28) o el bA(10-35) i d altres més curts com el bA(12-28), el bA(12-26) o el bA(26-42). En la majoria dels casos, tots aquest pèptids són molt més solubles que les formes naturals de la proteïna bA. L elecció d aquests pèptids model és complexa, ja que és molt desitjable que presentin el màxim nombre de propietats de la proteïna natural, i la capacitat de formació de fibril·les és la més important per a l estudi del procés d agregació, però no l única important. La majoria dels pèptids model inclouen el fragment bA(17-23), ja que experiments de mutagènesi dirigida han fet palesa la importància d aquesta seqüència en el procés d agregació (Wood et al., 1995; Soto et al., 1995), i els han identificat així com a residus importants en el plegament de la proteïna nativa que dóna lloc a les fibril·les amiloides. D altres estudis (Jarret et al., 1993) també proven l elevada importància de l extrem C-terminal en la solubilitat cinètica dels pèptids bA; és a dir, que els fragments que no presenten aquesta regió transmembranal són solubles, de forma metaestable, tot i trobar-se molt per sobre del màxim de solubilitat a l equilibri o solubilitat termodinàmica, la qual es molt semblant per a la majoria de segments de bA estudiats. Per aquest motiu els pèptids com el bA(26-42) no constitueixen bons models de bA, ja que presenten, de forma accentuada, els mateixos problemes de manipulació difícil associats a la proteïna natural. Un altre criteri per a l elecció d un model peptídic, sobretot si es vol estudiar la relació estructura fibril·lar/capacitat d agregació i resposta in vivo, és la citotoxicitat, la qual és

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 41

ESTUDI DEL PROCÉS D AGREGACIÓ DE LA PROTEÏNA b-AMILOIDE 41

característica de la proteïna bA natural. D aquesta manera, un model molt emprat per a l assaig d inhibició de la toxicitat de bA és el fragment bA(25-35), del qual s ha descrit que presenta toxicitat independentment del seu estat d agregació (Forloni et al., 1997), encara que la seva capacitat amiloïdogènica és encara motiu de controvèrsia. D altres autors fan servir com a criteris d elecció per als seus models, a més dels esmentats anteriorment, la capacitat del pèptid de dipositar-se sobre plaques amiloides madures (Lynn i Meredith, 2000), com és el cas del fragment bA(10-35), o bé criteris de solubilitat cinètica en les condicions de realització de l experiment, molt important quan volen utilitzar-se tècniques que, com la ressonància magnètica nuclear, requereixen treballar amb concentracions elevades de pèptid. Coneixent l àmplia varietat de models que s han fet servir en l estudi del comportament del pèptid bA, cal no oblidar el risc que implica treballar-hi, ja que es poden treure conclusions no extrapolables a la proteïna natural, i aquesta probabilitat és major quan més simple és el model emprat. També és important, a l hora de comparar resultats de diferents investigacions, parar atenció al pèptid model, ja que això ens pot donar una idea sobre la generalització de les observacions. ESTUDIS CINÈTICS. EINES I RESULTATS Un mètode molt emprat per a mesurar l agregació en sistemes biològics és la turbidimetria. Aquesta tècnica, que es basa a mesurar la disminució de la llum transmesa a través d una mostra a causa de les pèrdues per dispersió en incidir sobre les partícules en suspensió (normalment a una l » 350450 nm), té l avantatge de ser accessible a molts laboratoris, ja que requereix, simple-

ment, un espectrofotòmetre d ultraviolat visible. Un inconvenient és que, per a obtenir una dependència lineal entre la turbidimetria (T) i la concentració, és necessari: a) que l agregat sigui un cilindre rígid de monòmers òpticament isotròpics; b) que els cilindres siguin monodispersos; c) que estiguin orientats aleatòriament; d) que el diàmetre del cilindre sigui molt més petit que la seva longitud i més petit, també, que la longitud d ona de la radiació utilitzada; e) que la relació entre la longitud del cilindre i la longitud d ona sigui més gran que 3,5, cosa que implica, fent servir condicions estàndards de mesura, unes fibril·les de longitud superior a 1,2 mm. Quan es fa servir la turbidimetria com a mètode per a quantificar el procés de fibril·logènesi s ha de tenir en compte que aquesta tècnica no proporciona ni informació estructural ni informació sobre els oligòmers més petits. A més, s ha de recordar que les mostres normalment no són homogènies, com seria desitjable per a una mesura correcta, i poden coexistir agregats fibril·lars juntament amb estructures amorfes, les quals també contribueixen a la dispersió total. Així doncs, tot i que els primers estudis cinètics de l agregació de bA (Jarret et al., 1993) es van fer mitjançant un seguiment turbidimètric i van donar una idea aproximada sobre el procés d agregació, cal ser molt crítics a l hora d interpretar els resultats que proporciona. Per aquest motiu, tot i que avui dia encara es fa servir la turbidimetria per a avaluar l estat d agregació de bA (Goldsbury et al., 2000), cal combinar-la sempre amb altres tècniques que donin informació sobre la naturalesa dels agregats, com són l assaig de CR quantitatiu o bé les mesures de fluorescència amb ThT (Klunk et al., 1999; LeVine, 1993). Tant l assaig de CR quantitatiu com el de fluorescència amb ThT resulten d una gran utilitat quan es pretén determinar el contin-

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 42

42 MONTSERRAT CRUZ, DOLORS GRILLO, FRANCESC RABANAL I ERNEST GIRALT

gut, de forma quantitativa, d estructures amiloides. Un problema que presenten, com ja hem dit, és la desconeixença que es té sobre la seva forma d actuació. Per aquest motiu, i tot i la utilitat que han presentat en corroborar les dades cinètiques observades mitjançant turbidimetria, aquests assaigs s han de fer servir amb molta cura, ja que s ha observat inespecifitat de ThT en alguns casos, on no ha estat capaç de distingir fibril·les amiloides d altres tipus de morfologies (Tjernberg, 1999). A més a més, hi ha descrites incongruències entre resultats amb ThT i CR: Goldsbury i els seus col·laboradors (2000) van observar en lots antics de bA(1-40) una absència de resposta en presencia de ThT, mentre que els assaigs de CR i l observació mitjançant microscòpia electrònica de transmissió (TEM) amb tinció negativa donaven resultats equiparables als obtinguts amb lots nous. Així doncs, tot i la seva utilitat, per tal com són mètodes d assaig fàcilment aplicables i donen normalment una bona estimació del contingut amiloide, no hem d oblidar que el desconeixement del mecanisme mitjançant el qual interaccionen amb les fibril·les no permet confiar únicament en una d aquestes tècniques. D altres tècniques que poden donar informació sobre la quantitat d estructura b, i per tant, fer una estimació indirecta de la formació de fibril·les amiloides, són el dicroisme circular i l espectroscòpia infraroja de transformada de Fourier la primera utilitzada només amb dissolucions (Szabo et al., 1999). Aquestes tècniques, igual que les anteriors, no donen informació sobre la morfologia de les fibril·les presents, i no asseguren l absència d agregats d estructura no fibril·lar si aquests presenten el pèptid amb làmines b. Aquest darrer problema, però, queda aparentment resolt a partir dels estudis publicats molt recentment per Zurdo et al. (2001) en què s aprofita la resistèn-

cia a proteases que presenten les fibril·les amiloides per a eliminar del medi els agregats amorfs que poden interferir en la detecció. D altra banda, i sempre de manera complementària, s han fet servir tècniques com la ultracentrifugació analítica i la cromatografia d exclusió molecular com a eines en l avaluació de la mida i la quantitat de les espècies solubles. Les tècniques de dispersió de llum làser, tant estàtica com dinàmica, permeten obtenir informació estructural, ja que es basen en una utilització més elaborada de les propietats de dispersió de llum ja vistes en el cas de la turbidimetria. En aquestes tècniques es mesura la llum làser dispersada per les partícules a un angle, normalment entre 15 i 150º, respecte del feix incident. L avantatge més significatiu és la possibilitat d estimar la mida de les partícules en suspensió i obtenir informació sobre la seva morfologia mitjançant una combinació de les tècniques estàtiques i dinàmiques. Aquesta eina dóna la possibilitat de fer un model tenint en compte no solament el contingut amiloide, sinó també l evolució de les fibril·les formades al llarg del temps. Així, l aplicació de l espectroscòpia de dispersió quasi elàstica va permetre a Lomakin i als seus col·laboradors (1996) postular un model matemàtic detallat que permet descriure el comportament de bA(1-40) en un medi de HCl 0,1 M, incloent-hi hipòtesis tant per a la generació de noves fibril·les com per al creixement d aquestes. Aquest model es basa en l observació de dos comportaments diferents, segons la concentració emprada: a concentracions superiors a 100 mM, concentració denominada crítica, la mida i la velocitat de creixement de les fibril·les és independent de la concentració, mentre que per sota sí que s observa una dependència entre la velocitat de creixement i la concentració de monòmer. A més a més, s obtenen fibril·les més llargues com més petita és la concentració.

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 43

ESTUDI DEL PROCÉS D AGREGACIÓ DE LA PROTEÏNA b-AMILOIDE 43

Aquestes observacions es van explicar fent servir la capacitat tensioactiva de bA (Soreghan, 1994). Així, Lomakin va postular que per sobre de la concentració crítica, el pèptid bA era capaç de donar lloc a micel·les, les quals donarien lloc a nuclis fibril·lars que iniciarien de manera irreversible la formació de fibril·les per addició de monòmers, com s esquematitza a la figura 4. En situacions on no s arribés a la concentració crítica, la nucleació seria un procés heterogeni, desencadenat per petites partícules presents en la mostra. Aquest model estima que les micel·les corresponen a un radi hidrodinàmic de 7 nm, mentre que el nucli fibril·lar tindria un radi hidrodinàmic de només 4 nm. La major crítica que es pot fer al model proposat per Lomakin i els seus col·laboradors és que es basa en assaigs realitzats en HCl 0,1 M com a dissolvent. Tot i que és comprensible la seva utilització, ja que permet un alentiment de la velocitat d agregació, en principi massa elevada per a l estudi detallat mitjançant aquesta tècnica, i que es pot justificar pel fet que mitjançant TEM no es van observar diferències amb les fibril·les obtingudes respecte a les observades a plaques amiloides, l HCl 0,1 M es troba molt lluny de ser el que considerem condicions fisiològiques. Tenint en compte aquesta crítica, Murphy i Pallitto, (2000) van fer un estudi en condicions més similars a les fisiològiques (PBS, pH = 7,4). L alentiment del procés d agregació per al seu estudi espectroscòpic es va aconseguir en aquest cas treballant amb dissolucions mare de pèptid bA(1-40) desnaturalitzat amb urea 8 M, cosa que permet partir

monòmers Monòmers FIGURA 5.

micel·la Micel·la

de monòmers desestructurats, com va permetre corroborar la utilització de cromatografia d exclusió molecular. Els resultats obtinguts amb aquest assaig semblen indicar que a concentracions elevades el creixement de les fibril·les es dóna majoritàriament per associació entre els extrems de fibril·les més petites, mentre que a concentracions més baixes el que es formen són fibril·les d un diàmetre de 4,8 nm, dada que és coherent amb el que es postula que presenten les protofibril·les, les quals acaben entrecreuant-se i formant macroagregats que precipiten. Un fet observat, i que no estava inclòs al model de Lomakin i els seus col·laboradors, és la dissociació d espècies solubles, molt probablement monòmers, de les fibril·les formades. En aquest resultats, tot i obtenir-se en condicions més properes a les condicions fisiològiques, també es pot criticar la presència d urea com a agent desestructurant en una concentració final de 0,4 M cosa que podria influir en la morfologia de les fibril·les i el fet de no fer servir tècniques complementàries, com la corroboració mitjançant TEM de les estructures fibril·lars descrites mitjançant la tècnica de dispersió de llum làser estàtica. ESTRUCTURA DE LES FIBRIL·LES AMILOIDES. RAIGS X I MICROSCÒPIA ELECTRÒNICA DE TRANSMISSIÓ Una vegada analitzat el mecanisme de formació de les fibril·les amiloides, encara

nucli Nuclifibril·lar fibril·lar

fibril·la Fibril·la

Mecanisme de nucleació homogeni proposat per Lomakin per a concentracions superiors a la crítica.

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 44

44 MONTSERRAT CRUZ, DOLORS GRILLO, FRANCESC RABANAL I ERNEST GIRALT

FIGURA 6. Micrografies: a) feix de fibril·les amiloides obtingut al nostre laboratori després d envellir una dissolució 40 mM del pèptid bA(1-42) en tampó fosfat amb pH = 7,4 (200.000 augments); b) feix de fibril·les observat en una dissolució aquosa de bA(25-35) envellida 7 dies (150.000 augments); c) fibril·les aïllades de bA(1-42) obtingudes en aigua a una concentració 100 mM; d) fibril·les amiloides del pèptid bA(12-28) obtingudes a 600 mM en tampó PBS i pH = 7,4; e) feix de fibril·les de bA(25-35) obtingudes en les mateixes condicions que a l apartat b.

queda una pregunta cabdal: quina és l estructura tridimensional d aquest agregat? La resposta a aquesta qüestió, a més, podria donar també informació sobre la cinètica del procés d agregació, sobretot si trobem una resposta a nivell atòmic que ens

permeti esbrinar quina és la conformació que presenta el pèptid a l interior d aquesta estructura ordenada i, per tant, quins són els requeriments previs per a la incorporació d aquest sobre les fibril·les en creixement.

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 45

ESTUDI DEL PROCÉS D AGREGACIÓ DE LA PROTEÏNA b-AMILOIDE 45

FIGURA 6b.

L anàlisi mitjançant difracció de raigs X de diverses estructures amiloides presenta reflexions en forma d arcs diametralment oposats, cosa que s interpreta com a prova de la disposició de la proteïna en forma de làmina b-creuada. El model àmpliament acceptat per a aquest tipus d estructura és el proposat per Pauling i Corey al 1951 per a la proteïna fibroïna de la seda (Pauling i Corey,

1951), on les làmines b es disposen de forma perpendicular a l eix fibril·lar, el qual és paral·lel a la direcció dels ponts d hidrogen de l esquelet. Els estudis amb TTR, la proteïna amiloide de la qual es disposa de més informació estructural i amb major resolució, van suggerir a Blake i Serpell (Blake i Serpell, 1996) que en realitat cada làmina b es troba empaquetada segons un gir de 15º res-

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 46

46 MONTSERRAT CRUZ, DOLORS GRILLO, FRANCESC RABANAL I ERNEST GIRALT

FIGURA 6c.

pecte del seu veí més proper, tot formant una «hèlix de làmines b» (Sunde i Blake, 1997), el qual es correspon amb dades obtingudes mitjançant la RMN en estat sòlid (Lansbury et al., 1995). En aquest model cada protofibril·la està composta per quatre làmines b paral·leles. En canvi, Inouye i els seus col·laboradors (1998) van proposar, basantse en resultats de difracció de raigs X molt

similars als de Blake i Serpell, un model format per monòmers de TTR apilats axialment per a donar lloc a una protofibril·la, on el monòmer no patia cap canvi de conformació i l obtenció de fibril·les seria mitjançant la interacció lateral entre protofibril·les. Com ja s ha dit anteriorment, l estudi mitjançant TEM de la proteïna TTR va donar lloc al model microscòpic, encara vàlid,

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 47

ESTUDI DEL PROCÉS D AGREGACIÓ DE LA PROTEÏNA b-AMILOIDE 47

FIGURA 6d.

de la figura 3. L anàlisi microscòpica de diverses proteïnes amiloides concorda amb aquestes dades, tot i que també es descriuen variacions en el nombre de protofibril·les associades lateralment per a donar la fibril·la amiloide. Goldsbury i els seus col·laboradors van fer recentment un intent d explicar els diferents tipus de fibril·les observades per agregació de bA(1-40), tant en condi-

cions habituals com sota agitació. La combinació de TEM, i microscòpia electrònica de transmissió d escombrat va permetre seguir l evolució de les fibril·les amb el temps, a més d estudiar la seva morfologia amb detall, cosa que els va permetre postular un model de fibril·logènesi que dóna lloc a tres tipus de fibril·les madures, compostes per dues, tres o quatre protofibril·les i en què

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 48

48 MONTSERRAT CRUZ, DOLORS GRILLO, FRANCESC RABANAL I ERNEST GIRALT

FIGURA 6e.

fins i tot es descriu l existència d estructures esfèriques d una grandària corresponent a 50-200 monòmers i que podrien correspondre a les micel·les descrites al model de Lomakin. Tant els models microscòpics com els obtinguts a partir de raigs X no proporcionen prou dades per a saber l orientació de les cadenes peptídiques. Per a obtenir més detalls

sobre el plegament del pèptid s han fet servir tècniques de la RMN, les quals s han dut a terme, en la majoria dels casos, amb pèptids model, o bé amb dissolvents orgànics o micel·les. La RMN en estat sòlid dóna informació sobre la disposició relativa de les cadenes peptídiques. Així, es pot trobar a la bibliografia els estudis de Lynn (Benzinger et al., 1998; 2000), on es descriu una conforma-

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 49

ESTUDI DEL PROCÉS D AGREGACIÓ DE LA PROTEÏNA b-AMILOIDE 49

ció de làmina b paral·lela per al fragment bA(10 35), el qual es veu corroborat per les dades de la RMN en estat sòlid de multiple quanta obtingudes amb el pèptid bA(1-40) pel grup de Tycko (Antzutkin et al., 2000). Aquestes dades però, estan en discrepància aparent amb les de Lansbury i els seus col·laboradors (1995), que descriuen una estructura antiparal·lela a l organització del pèptid bA(34-42), com l estructura descrita pel fragment bA(16-22) també pel grup de Tycko (Balbach et al., 2000). Aquestes dades semblen indicar que les proteïnes amiloides presenten una organització supramolecular variada, la qual depèn de la seqüència primària estudiada. Finalment, una altra font de models que proven d explicar l estructura amiloide és el modelatge molecular. Així, podem trobar

models basats en l homologia amb altres proteïnes amb capacitat amiloïdogènica (Contreras et al., 1999), o be d altres que uneixen dades biofísiques de diferents investigadors i proven de trobar una estructura que s ajusti a totes les dades, com el que van fer Li i els seus col·laboradors (1999) en compatibilitzar el model de Blake (Blake i Serpell, 1996) amb la informació sobre els possible girs presents a l estructura (Hilbich et al., 1991). L aparició de nous estudis, que combinen tècniques biofísiques d elevada resolució, juntament amb altres estudis estructurals i de modelatge molecular, poden proporcionar en el futur una explicació més acurada sobre el mecanisme d agregació de models peptídics i proteïnes amiloides i l estructura tridimensional a la qual donen lloc,

FIGURA 7. Modelització molecular del pèptid bA(12-42) realitzat amb el programa Insight segons la proposta de Li et al. (1994). Les cintes en blanc representen l esquelet peptídic de cada una de les 48 còpies de pèptid. En gris hi ha les cadenes laterals.

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 50

50 MONTSERRAT CRUZ, DOLORS GRILLO, FRANCESC RABANAL I ERNEST GIRALT

ja que, tot i que els models més recents expliquen moltes de les dades observades, no acaba d haver-hi un acord entre diferents autors ni sobre quin és el model més raonable ni sobre la validesa de la majoria de condicions experimentals. PERSPECTIVES FUTURES El futur en aquest camp ve marcat per la manca de dades experimentals prou acurades que permetin obtenir d una manera fiable una descripció a nivell atòmic de la proteïna b-amiloide agregada en forma de fibril·les. Fa de mal predir si serà la RMN (probablement en estat sòlid) o la difracció de raigs X, la tècnica que permetrà tenir accés a aquesta informació. També es fa difícil anticipar si caldrà esperar uns pocs mesos, alguns anys o moltes dècades. El que és, però, indubtable, és que en el moment en què aquest descobriment tingui lloc és produirà un canvi qualitatiu molt important amb vista a la comprensió de les malalties causades per proteïnes amiloïdogèniques. El desenvolupament d inhibidors del procés de fibril·logènesi és una de les aproximacions terapèutiques proposades per la malaltia d Alzheimer, i tot i que no és l aproximació més senzilla, el seu atractiu rau en la possibilitat d obtenir una resposta extrapolable a diverses malalties molt importants. Així, en el nostre laboratori hem descobert recentment que alguns pèptids N-metilats basats en la seqüència b(17-21) són capaços d interaccionar amb la proteïna bA(1-42), n inhibeixen la toxicitat enfront de cultius cel·lulars, i presenten, a més, una resistència enfront de proteases. Encara queda, però, trobar una correlació fiable entre l activitat d aquests pèptids i la forma en què interfereixen en el procés de fibril·logè-

nesi, encara que hi ha molts altres grups que es troben en la mateixa situació (Ghanta et al., 1996; Lowe et al., 2001; Gordon et al., 2001) Totes les aproximacions experimentals descrites en el present article prenen una importància especial en el context dels estudis de la relació entre l estructura i l activitat d aquests inhibidors. En efecte, cal esperar que els propers anys siguin decisius per a veure si tots els esforços de tants laboratoris per entendre l agregació de la proteïna bamiloide permetran finalment desenvolupar un primer fàrmac eficaç per al tractament, o potser la prevenció, de malalties tan terribles per a la qualitat de vida com la malaltia d Alzheimer. BIBLIOGRAFIA ANTZUTKIN, O. N.; J. J. BALBACH; R. D. LEAPMAN; N. W. RIZZO; J. REED; R. TYCKO (2000). «Multiple quantum solid-state NMR indicates a parallel, not antiparallel, organizati-on of b-sheets in Alzheimer s b amyloid fibrils». Proc. Natl. Acad. Sci. USA, núm. 97, pàg. 13045-13050. BALBACH, J. J.; Y., ISHII; O. N. ANTZUTKIN; R. D. LEAPMAN; N. W. RIZZO; N. W. DYDA; J. REED; R. TYCKO (2000). «Amyloid fibril formation by a16-22, a seven-residue fragment of the Alzheimer s b-amyloid peptide, and structural characterization by solid state NMR». Biochemistry, núm. 39, pàg. 13748-13759. BENZINGER, T. L.; D. M. GREGORY; T. S. BURKOTH; H. MILLER-AUER; D. G. LYNN; R. E. BOTTO; S. C. MEREDITH (1998). «Propagating structure of Alzheimer s bamyloid(10-35) is parallel b-sheet with residues in exact register». Proc. Natl. Acad. Sci. USA, núm. 95, pàg. 13407-13412. BENZINGER, T. L.; D. M. GREGORY; T. S. BURKOTH; H. MILLER-AUER; D. G. LYNN; R. E. BOTTO; S. C. MEREDITH (2000). «Two-dimensional structure of b-amyloid(10-35) fibrils». Biochemistry, núm. 39, pàg. 3491-3499. BLAKE, C.; L. SERPELL (1996). «Synchrotron X-ray studies suggest that the core of the transthyretin amyloid fibrils is a continuous b-sheet helix». Structure, núm. 4, pàg. 989-998. CASTAÑO, E. M.; J. GHISO; F. PRELLI; P. D. GOREVIC; A. MIGHELI; B. FRANGIONE (1986). «In vitro formation of

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 51

ESTUDI DEL PROCÉS D AGREGACIÓ DE LA PROTEÏNA b-AMILOIDE 51 amyloid fibril from two synthetic peptides of different lenghts homologous to Alzheimer s disease bprotein». Biochem. Biophys. Res. Commun., núm. 141, pàg. 782-790. CONTRERAS, C. F.; M. A. CANALES; A. ALVAREZ; G. V. DEFERRARI; N. C. INESTROSA (1999). «Molecular modeling of the amyloid-b-peptide using homology to a fragment of triosephosphate isomerase that forms amyloid in vitro». Protein Eng., núm. 12, pàg. 959966. DUMERY, L.; F. BOURDEL; Y. SOUSSAN; A. FIALKOWSY; S. VIALE; P. NICOLAS; M. REBOUD-RAVAUX (2001). «b-Amyloid protein aggregation: its implication in the physiopathology of Alzheimer s disease». Pathol. Biol., núm. 49, pàg. 72-85. FORLONI, G.; E. LUCCA; N. ANGERETTI; P. D. TORRE; M. SALMONA (1997). «Amidation of b-amyloid peptide strongly reduced the amydoilogenic activity without alteration of the neurotoxicity». J. Neurochem., núm. 69, pàg. 2048-2054. GEORGE-HYSLOP, P. H. (2001). «Componentes de la enfermedad de Alzheimer». Investigación y Ciencia, núm. febrer, pàg. 50-57. GHANTA, J.; C. SHEN; L. L. KIESSLING; R. M. MURPHY (1996). «A Strategy for Designing Inhibitors of b-Amyloid Toxicity». J. Biol. Chem., núm. 271, pàg. 2952529528. GOLDSBURY, C. S.; S. WIRTZ; S. A. MÜLLER; S. SUDERJI; P. WICKI; U. AEBI; P. FREY (2000). «Studies on the in vitro assembly of Ab 1-40: Implications for the search for ab- fibril formation inhibitors». J. Struct. Biol., núm. 130, pàg. 217-231. GORDON, D. J.; K. L. SCIARRETTA; S. C. MEREDITH (2001). «Inhibition of b-amyloid(40) fibrillogenesis and disassembly of b-amyloid(40) fibrils by short b-amyloid congeners containing n-methyl amino acids at alternate residues». Biochemistry, núm. 40, pàg. 8237-8245. HILBICH, C.; B. KISTERS-WOIKE; R. REED; C. L. MASTERS; K. BEYREUTHER (1991). «Aggregation and secondary structure of synthetic amyloid b-A4 peptides of Alzheimer s disease». J. Mol. Biol., núm. 218, pàg. 149-163. HOWLETT, D. R.; K. H. JENNINGS; D. C. LEE; M. S. G. CLARK; F. BROWN; R. WETZEL; S. J. WOOD; P. CAMILLERI; G. W. ROBERTS (1995). «Aggregation state and neurotoxic properties of Alzheimer beta-amyloid peptide». Neurodegeneration, núm. 4, pàg. 23-32. INOUYE, H.; F. S. DOMINGUES; A. M. DUMAS; M. J. SARAIVA; E. LUNDGREN; E. SANDGEN; D. A. KIRSCHNER (1998). «Analysis of X-ray-diffraction patterns from amyloid of biopsied vitreous-humor and kidney of transthyretin (Ttr) Met30 familial amyloidotic polyneuropathy (Fap) patients axially arrayed Ttr monomers constitute the protofilament». Amyloid: Int. J. Exp. Clin. Invest., núm. 5, pàg. 163-174.

IVERSEN, L. L.; R. J. MORTISHIRE-SMITH; S. J. POLLACK; M. S. SHEARMAN (1995). The toxicity in vitro of b-amyloid protein». Biochemistry, núm. 311, pàg. 1-16. JARRET, J. T.; E. P. BERGER; P. T. LANSBURY (1993). «The carboxy terminus of the b amyloid protein is critical for the seeding of amyloid formation: implications for the pathogenesis of Alzheimer s disease». Biochemistry, núm. 32, pàg. 4693-4697. KISILEVSKY, R. (2000). «Amyloidogenesis Unquestioned answers and unanswered questions». J. Struct. Biol., núm. 130, pàg. 99-108. KLUNK, W. E.; R. F. JACOB; R. P. MASON (1999). «Quantifying amyloid b-peptide (Ab) aggregation using the Congo red (CR-Ab) spectrophotometric assay». Anal. Biochem., núm. 266, pàg. 66-76. LANSBURY, P. T.; P. R. COSTA; J. M. GRIFFITHS; E. J. SIMON; M. AUGER; K. J. HALVERSON; D. A. KOCISKO; Z. S. HENDSCH; T. T. ASHBURN; R. G. S. SPENCER (1995). «Structural model for the beta-amyloid fibril based on interstrand alignment of an antiparallel-sheet comprising a C-terminal peptide». Nat. Struct. Biol., núm. 2, pàg. 990-998. LEVINE, H. (1993). «Thioflavin T interaction with synthetic Alzheimer s disease b-amyloid peptides: Detection of amyloid aggregation in solution». Protein Sci., núm. 2, pàg. 404-410. LI, L.; T. A. DARDEN; L. BARTOLOTTI; D. KOMINOS; L. G. PEDERSEN (1999). «An atomic model for the pleated bsheet structure of Ab amyloid protofilaments». Biophys. J., núm. 76, pàg. 2871-2878. LOMAKIN, A.; D. S. CHUNG; G. B. BENEDEK; D. A. KIRSCHNER (1996). «On the nucleation and growth of amyloid b-protein fibrils: Detection of nuclei and quantitation of rate constants». Proc. Nat. Acad. Sci. USA, núm. 93, pàg. 1125-1129. LOWE, T. L.; A. STRZELEC; L. L. KIESSLING; R. M. MURPHY (2001). «Structure-Funtion Relationships for Inhibitors of b-Amyloid Toxicity Containing the Recognition Sequence KKLVFF». Biochemistry, núm. 40, pàg. 7882-7889. LYNN, D. G.; S. C. MEREDITH (2000). «Model peptides and the physicochemical approach to b-amyloids». J. Struct. Biol., núm. 130, pàg. 153-173. MURPHY, R. M.; M. M. PALLITTO (2000). «Probing the kinetics of b-amyloid self-association». J. Struct. Biol., núm. 130, pàg. 109-122. PAULING, L.; R. COREY (1951). «Configuration of polypeptide chains with favoured orientation around single bonds: two new pleated sheets». Proc. Natl. Acad. Sci. USA, núm. 37, pàg. 729-739. SELKOE, D. J. (1998). «The cell biology of b-amyloid precursor protein and presenilin in Alzheimer s disease». Tr. Cell Biol., núm. 8, pàg. 447-453. SHIRAHAM, T.; A. COHEN (1967). «High-resolution electron microscopic analysis of the amyloid fibril». J. Cell Biol., núm. 33, pàg. 679-708.

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 52

52 MONTSERRAT CRUZ, DOLORS GRILLO, FRANCESC RABANAL I ERNEST GIRALT SINHA, S.; I. LIEBERBURG (1999). «Cellular mechanism of b-amyloid production and secretion». Proc. Natl. Acad. Sci. USA, núm. 96, pàg. 11049-11053. SOREGHAN, B. (1994). «Surfactant properties of Alzheimer s beta peptides and the mechanism of amyloid aggregation». J. Biol.Chem, núm. 269, pàg. 2855128554. SOTO, C.; E. M. CASTAÑOS; B. FRANGIONE; N. C. INESTROSA (1995). «The a-helical to b-strand transition in the amino-terminal fragment of the amyloid b-peptide modulates amyloid formation». J. Biol. Chem., núm. 270, pàg. 3063-3067. SUNDE, M.; C. BLAKE. (1997). «The structure of amyloid fibrils by electron microscopy and X-ray diffraction». Advan. Prot. Chem., núm. 50, pàg. 123-159. SZABO, P.; E. KLEMENT; K. JOST; M. ZARÁNDI; K. SOÓS; B. PENKE (1999) «An FT-IR study of the b-amyloid conformation: standardization of aggregation grade» Biochem. Biophys. Res. Commun., núm. 265, pàg. 297-300. TEPLOW, D. B. (1998). «Structural and kinetic features of amyloid b-protein fibrillogenesis». Amyloid: Int. J. Exp. Clin. Invest., núm. 5, pàg. 121-142.

TJERNBERG, L. O.; D. J. E. CALLAWAY; A. TJERNBERG; S. HAHNE; C. LILLIEHÖÖK; L. TERENIUS; J. THYBERG; C. NORDSTEDT (1999). «A molecular model of Alzheimer amyloid b-peptide fibril formation». J. Biol. Chem., núm. 274, pàg. 12619-12625. TSENG, B. P.; W. P. ESLER; C. B. CLISH; E. R. STIMSON; J. R. GHILARDI; H. V. VINTERS; P W. MANTYH; J. P. LEE; J. E. MAGGIO (1999). «Deposition of monomeric, not oligomeric, ab mediates growth of Alzheimer s disease amyloid plaques in human brain preparations». Biochemistry, núm. 38, pàg. 1042410431. WOOD, S. J.; R. WETZEL; J. D. MARTIN; M. R. HURLE (1995). «Prolines and amyloidogenicity in fragments of the Alzheimer s peptide b/A4». Biochemistry, núm. 34, pàg. 724-730. ZAGORSKI, M. G.; J. YANG; H. SHAO; K. MA; H. ZENG; A. HONG (1999). «Methodological and chemical factors affecting amyloid b-peptide amyloidogenicity». Meth. Enzymol., núm. 309, pàg. 189-235. ZURDO, J.; I. GUIJARRO; C. M. DOBSON (2001). «Preparation and characterization of purified amyloid fibrils». J. Am. Chem. Soc., núm. 123, pàg. 8141-8142.

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 53

Biofísica molecular (Esteve Padrós, ed.) Treballs de la SCB. Vol. 53 (2002) 53-63

RESTRICCIONS FÍSIQUES PER A LA FORMACIÓ D ESTRUCTURES AMB ELEVADA CONCENTRACIÓ LOCAL DE DNA EN ELS CROMOSOMES METAFÀSICS JOAN-RAMON DABAN Departament de Bioquímica i de Biologia Molecular. Facultat de Ciències. Universitat Autònoma de Barcelona. Bellaterra. Adreça per a la correspondència: Departament de Bioquímica i de Biologia Molecular. Facultat de Ciències (Edifici Cs). Universitat Autònoma de Barcelona. 08193 Bellaterra (Barcelona). Adreça electrònica: joanramon.daban@uab.es. Paraules clau: Cromatina, cromosomes, DNA. Keywords: Chromatin, chromosomes, DNA. RESUM El nostre coneixement actual de les bases físiques que permeten la condensació del DNA en els cromosomes és molt limitat. Les longituds de les molècules de DNA dels genomes eucariòtics són molt més grans que les dimensions dels cromosomes metafàsics on estan contingudes durant la mitosi. A partir d aquesta observació s ha assumit generalment que la raó d empaquetament lineal del DNA és una mesura adequada del grau de compactació del DNA. En aquest capítol es consideren diverses proves que indiquen que la concentració local de DNA és més apropiada que el la raó d empaquetament lineal per a estudiar la condensació de la cromatina. La concentració local de DNA als cromosomes metafàsics imposa una restricció física general que cal considerar per a la validació dels models d estructura de la cromatina. SUMMARY Our present knowledge of the physical principles that allow the condensation of DNA into the chromosomes is very limited. The lengths of the DNA molecules of eukaryotic genomes are much greater than the dimensions of the metaphase chromosomes in which

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 54

54 JOAN-RAMON DABAN

they are contained during mitosis. From this observation it has been generally assumed that the linear packing ratio of DNA is an adequate measure of the degree of DNA compaction. In this chapter I consider different evidences indicating that the local concentration of DNA is more appropriate than the linear packing ratio for the study of chromatin condensation. The local concentration of DNA in metaphase chromosomes place a general physical constraint that must be considered for the validation of structural models for chromatin. CONDENSACIÓ DEL DNA ALS CROMOSOMES METAFÀSICS

MESURA DEL GRAU DE COMPACTACIÓ DEL DNA

La condensació de la cromatina per a formar els cromosomes visibles durant la mitosi va ser descrita en 1882 per Walther Flemming (Gall, 1996). Encara avui dia, però, els aspectes físics més bàsics de l empaquetament del DNA dins els cromosomes són en gran part desconeguts. Coneixem amb elevada resolució l estructura de la part central (partícula nucli) del nucleosoma (Luger et al., 1997). El nucleosoma (format per histones associades al DNA) és tan sols la subunitat estructural fonamental de la cromatina (Wolffe, 1998). No estan resoltes les estructures de la resta de nivells estructurals que, en últim terme, permeten la condensació del DNA en el cromosoma metafàsic. Es tracta de complexos relativament irregulars, i d una enorme massa molecular, per als quals han estat proposats diversos models de plegament (vegeu Daban, 1998; Roca, 1998; Woodcock i Dimitrov, 2001). En aquest capítol es presenta un estudi sobre restriccions físiques bàsiques que cal tenir en compte per a la validació dels diversos models proposats per a l estructura de cromatina. Gran part del material que es presenta ha estat extret d una publicació recent de l autor d aquest capítol (Daban, 2000).

Molts autors fan servir la raó d empaquetament lineal, definida com la relació entre la longitud del DNA estès i la longitud de l estructura que conté aquest DNA, per a quantificar el nivell de compactació del DNA (DuPraw, 1970; Wolffe, 1998; Lewin, 2000). Com que la longitud de les molècules de DNA que hi ha dins els cromosomes metafàsics és molt gran en comparació amb la longitud d aquestes estructures biològiques, els valors trobats per a la raó d empaquetament lineal són molt elevats. Per exemple, a la figura 1 es pot veure com en cadascun dels nivells de plegament considerats per Pienta i Coffey (1984) hi ha un gran augment de la raó d empaquetament lineal. A la cromàtide corresponent al cromosoma metafàsic final, el valor assolit és superior a 104. Probablement, aquests valors tan elevats trobats per a la raó d empaquetament lineal del DNA han fet que no es tractés adequadament el tema dels límits físics que tenen les estructures cromatíniques proposades pels diversos autors per a arribar a formar els cromosomes metafàsics. Tal com es veurà en els propers apartats, aquests límits físics es palesen clarament quan en lloc de considerar la raó d empaquetament lineal es té en compte la concentració local de DNA en les estructures estudiades. La concentració local de DNA es defineix com la massa de DNA per unitat de volum de l estructura biològica que conté aquest DNA.

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 55

RESTRICCIONS FÍSIQUES PER A LA FORMACIÓ D'ESTRUCTURES 55

FIGURA 1. Model estructural per al cromosoma metafàsic proposat per Pienta i Coffey (1984). Es pot apreciar com cadascuna de les estructures cromatíniques successives considerades pels autors (nucleosomes/fibra de 30 nm solenoïdal/llaçades/cromàtide amb minibandes) produeix un notable augment de la raó d empaquetament lineal del DNA (packing ratio). Reproducció autoritzada de Pienta i Coffey (1984), Ó 1984 The Company of Biologists Ltd.

CONCENTRACIÓ LOCAL DEL DNA ALS CROMOSOMES DE DIVERSES ESPÈCIES Tal com es pot veure a la taula 1, la concentració de DNA als nuclis de les cèl·lules eucariotes a la interfase és superior a la que es troba als nucleoides bacterians. El diàmetre dels nuclis és molt variable, però a les cèl·lules de nucli petit (~ 5 mm de diàmetre) la concentració de DNA pot arribar a ser

0,10 g/ml (equivalent a 0,10 pg/mm3). La concentració local de DNA als cromosomes metafàsics ha estat determinada per diversos tipus de cèl·lules en diversos laboratoris, fent servir diverses tècniques de microscòpia (Bennett et al., 1983; Bohrmann et al., 1993; Heslop-Harrison et al., 1989; Fritzsche i Henderson, 1996). La mitjana dels valors obtinguts és 0,17 g/ml (Daban, 2000). Aquest valor és més elevat que l observat als nuclis interfàsics, però resulta molt infe-

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 56

56 JOAN-RAMON DABAN

Estructura

DNA (g/ml)

Nucleoide bacterià (1)

0,02

Nucli interfàsic (2,3)

0,10

Cromosomes metafàsics fibroblasts humans (4,5) limfòcits humans (6) plantes monocotiledònies (4) plantes dicotiledònies (4) Euglena (7)

0,16 0,12 0,18 0,18 0,20

Espermatozoides S. purpuratus (8) ratolí (9)

0,19 0,85

Bacteriòfags (1,7)

0,80

TAULA 1. Concentració local de DNA en diverses estructures biològiques (1) Kellenberger et al. (1986); (2) Lewin (2000); (3) Manuelidis i Chen (1990); (4) Bennett et al. (1983); (5) HeslopHarrison et al. (1989); (6) Fritzsche i Henderson (1996); (7) Bohrmann et al. (1993); (8) Green i Poccia (1985); (9) Pogany et al. (1981). En el cas dels cromosomes humans, la concentració de DNA ha estat calculada considerant 3,5 pg (3.2·109 pb) de DNA per genoma haploide (Morton, 1991; International Human Genome Squencing Consortium, 2001). Per a més detalls vegeu Daban (2000).

rior a la concentració de DNA que es troba als caps dels bacteriòfags. En diverses espècies estudiades (ratolins i alguns insectes) la concentració local de DNA en els nuclis espermàtics és tan elevada com en els bacteriòfags (Pogany et al., 1981; Suzuki i Wakabayashi, 1988). Hi ha, però, una excepció coneguda: els caps dels espermatozoides de l eriçó de mar Strongylocentrotus purpuratus tenen una concentració local de DNA similar a la dels cromosomes metafàsics (Green i Poccia, 1985).

LÍMITS FÍSICS PER A LA CONCENTRACIÓ LOCAL DE DNA ALS NUCLEOSOMES Per què la concentració de DNA dels cromosomes metafàsics i del nucli espermàtic de S. purpuratus és tan petita en relació a la que s observa als bacteriòfags o als espermatozoides de diverses espècies? La resposta a aquesta pregunta es troba en el fet que els cromosomes eucariòtics i els espermatozoides de S. purpuratus tenen el DNA associat a histones, i això, tal com veurem, limita notablement la concentració local assolible. En canvi, als bacteriòfags el DNA pot arribar a formar cristalls líquids amb una elevada concentració local (Lepault et al., 1987), i als nuclis espermàtics de diverses espècies el DNA forma un complex amb protamines o altres proteïnes bàsiques nohistones que no impedeixen un empaquetament d elevada densitat (Pogany et al., 1981; Suzuki i Wakabayashi, 1988; Del Valle et al., 1998). A la partícula nucli del nucleosoma el DNA està enrotllat sobre l octàmer d histones i, en conseqüència, tan sols ocupa la part externa de l estructura (figura 2a). Això fa que la concentració local de DNA estimada per a aquestes estructures sigui baixa (0,29 g/ml). Fins i tot quan es considera el nucleosoma completat amb el DNA d unió, la concentració local de DNA és relativament baixa, uns 0,32-0,39 g/ml per nucleosomes amb 20-80 pb de DNA d unió (Daban, 2000). La conclusió és, doncs, que, en contrast amb el que s observa en el cas dels empaquetaments de DNA sense histones, l estructura del nucleosoma fa que una part molt important del volum d aquesta partícula no pugui ésser ocupada pel DNA. Si els nucleosomes no canvien significativament les dimensions quan formen part d estructures cromatíniques més comple-

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 57

RESTRICCIONS FÍSIQUES PER A LA FORMACIÓ D'ESTRUCTURES 57

=) a) Partícula Partícula nucli nucli 0,29 0,29 g/ml g/ml Nucleosoma Nucleosoma (60 DNA d unió) (60pbpb DNA 0,37 g/ml d’unió) 0,37 g/mL

>) b) Ziga-zaga Ziga-zaga 3D 3D irregular irregular (Bednar et al., 1998) (Bednar et al., 0,04-0,14 g/ml 1998) 0,04-0,14 g/ml

FIGURA 2. Estimació de la concentració local de DNA en els nucleosomes i en diversos models estructurals proposats per a les fibres de cromatina de 30-40 nm. a) Partícula nucli: DNA de 146 pb en un disc de 11 nm de diàmetre i 5,7 nm d alçada (Luger et al., 1997); nucleosoma: partícula nucli més 60 pb de DNA d unió. b) Fibra de ~ 33 nm de diàmetre que conté, segons les condicions iòniques, entre 1,6 i 5,9 nucleosomes per 11 nm (Bednar et al., 1998). c) Sis nucleosomes per 11 nm en una fibra de 32 nm de diàmetre (Widom i Klug, 1985). d) 13,6 nucleosomes per 11 nm en una fibra de 36 nm de diàmetre (Daban i Bermúdez, 1998). En b, c i d la concentració local de DNA ha estat estimada considerant que les fibres de cromatina són cilindres que tenen les dimensions i el nombre de nucleosomes indicats; en els càlculs s ha considerat que tots els nucleosomes tenen 60 pb de DNA d unió. Aquesta figura ha estat preparada a partir de reproduccions autoritzades de Bednar et al., 1998 (b, Ó 1988 National Academy of Sciences, USA), Widom i Klug, 1985 (c, Ó 1985 Elsevier Science) i Daban i Bermúdez, 1998 (a i d, Ó 1998 American Chemical Society).

xes, les consideracions fetes en aquest apartat porten a una restricció física més general: en totes les estructures que es constitueixen a partir de nucleosomes la concentració local de DNA està limitada a un valor màxim de 0,3-0,4 g/ml.

?) Solenoide c) (Widom i Klug, (Widom 1985) i Klug, 1985) 0,15 g/ml 0,15 g/ml

@) d) Solenoide Solenoide interdigitat interdigitat (Daban (Daban i Bermúdez, i Bermúdez, 1998) 1998)g/ml 0,27 0,27 g/ml

CONCENTRACIÓ LOCAL DE DNA A LES FIBRES DE CROMATINA DE 30-40 nm En el segon nivell de plegament de la cromatina, els nucleosomes formen una fibra que té un diàmetre de 30-40 nm (Daban, 1998). La concentració local de DNA estimada per a tres models representatius proposats per a aquestes fibres es presenta a la figura 2. En el model de plegament irregular de Bednar et al. (1998), els nucleosomes formen una ziga-zaga tridimensional que té el DNA d unió estès a l interior de la fibra (figura 2b). Aquest model està basat en estudis recents de criomicroscòpia electrònica que permeten detectar la posició dels nucleosomes individuals en fibres que tenen un baix nivell de compactació. En conseqüència, la

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 58

58 JOAN-RAMON DABAN

concentració local de DNA en aquest model és molt baixa (0,04 g/ml), però en condicions de força iònica intermèdia arriba a tenir una densitat de DNA superior (0,14 g/ml). Altres autors, a partir d estudis de reconstrucció d imatges de microscòpia electrònica (Subirana et al., 1985), de dispersió de raigs X de sincrotró (Bordas et al., 1986; Koch, 1989) i de microscòpia de força atòmica (Leuba et al., 1994), han proposat models de plegament irregular amb el DNA d unió estès que tenen concentracions locals de DNA compreses entre 0,06 i 0,15 g/ml. En el model del solenoide (Widom i Klug, 1985) el DNA d unió es plega i els nucleosomes formen una hèlix senzilla (figura 2c). Aquest model està basat en estudis de microscòpia electrònica de transmissió i de difracció de raigs X i té una concentració local de DNA de 0,15 g/ml. El model més dens descrit fins ara és el del solenoide interdigitat compacte (0,27 g de DNA/ml). Aquest model, basat en estudis de petits fragments de cromatina mitjançant electroforesi no MODELS

desnaturalitzant en presència de Mg2+ i microscòpia electrònica de transmissió, considera que els successius pisos d una hèlix primària de nucleosomes s interdigiten i formen hèlixs secundàries que estan estabilitzades gràcies a la interacció lateral dels nucleosomes (figura 2d; Daban i Bermúdez, 1998). Es pot veure, doncs, que la concentració de DNA està limitada per la disposició a l espai dels nucleosomes en cadascun dels models de la fibra de cromatina. En tots els models proposats la concentració local de DNA a les fibres de 30-40 nm és inferior a la corresponent als nucleosomes isolats amb la mateixa longitud de DNA d unió (figura 2, compareu b, c i d amb a). Les estimacions efectuades indiquen que fins i tot en el cas del model del solenoide interdigitat (Daban i Bermúdez, 1998), que és el més compacte, hi ha una part molt important del volum de la fibra (~ 27%) que no és ocupat pels nucleosomes. En el model del solenoide normal, i en altres models que tenen aproxima-

Disminució Nivells de plegament per sobre de la fibra de 30-40 nm de la concen_____________________________________________ tració de Primer Segon Tercer DNA (%)

Amb llaçades (1-7)

Llaçades

Fibra intermèdia (200-300 nm)

Helicoïdal múltiple (8-10)

Fibra intermèdia (200-400 nm)

Cromàtide

Irregular (11-12)

Fibra intermèdia Fibra intermèdia (60-80 nm) (100-130 nm)

Cromàtide

21-37 53-77

Cromàtide

TAULA 2. Nivells de plegament en diversos models estructurals proposats pels cromosomes metafàsics: estimació de la concentració local de DNA a l estructura condensada final. (1) Paulson i Laemmli (1977); (2) Boy de la Tour i Laemmli (1988); (3) Saitoh i Laemmli (1994); (4) Pienta i Coffey (1984); (5) Rattner i Lin (1985); (6) Manuelidis i Chen (1990); (7) Filipski et al. (1990); (8) Bak et al. (1977); (9) Sedat i Manuelidis (1978); (10) Taniguchi i Takayama (1986); (11) Belmont et al. (1987); (12) Belmont i Bruce (1994). La disminució de concentració local de DNA, respecte a la fibra de 30-40 nm, ha estat calculada assumint un empaquetament hexagonal compacte de les fibres en cadascun dels nivells de plegament, i tenint en compte els forats centrals de les fibres únicament en els casos en els quals els autors dels treballs originals ho han indicat explícitament. Per a més detalls vegeu Daban (2000).

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 59

RESTRICCIONS FÍSIQUES PER A LA FORMACIÓ D'ESTRUCTURES 59

dament 0,15 g de DNA/ml, la fracció de volum no ocupada pels nucleosomes és propera al 60 %. Aquestes observacions generen dubtes sobre la possibilitat de formar cromosomes condensats amb nucleosomes continguts en estructures que tenen una eficiència molt limitada per a aconseguir concentracions elevades de DNA. CONCENTRACIÓ LOCAL DE DNA ALS NIVELLS DE PLEGAMENT SUPERIORS A LES FIBRES DE 30-40 nm Els models estructurals proposats per als cromosomes metafàsics consideren una sèrie progressiva de nivells de plegament que comencen en la fibra de 30-40 nm. A la taula 2 es pot veure que en el model de llaçades/bastida (loops/scaffold) proposat per Laemmli i col·laboradors (Paulson i Laemmli, 1977; Boy de la Tour i Laemmli, 1988; Saitoh i Laemmli, 1994), i en altres models que inclouen llaçades (Pienta i Coffey, 1984; Rattner i Lin, 1985; Manuelidis i Chen, 1990; Filipski et al., 1990), el primer nivell d empaquetament per sobre de la fibra de 30-40 nm consisteix en el plegament d aquesta fibra amb la formació d unitats estructurals que contenen 50-100 kb de DNA. En aquests models la llaçada formada en el primer nivell dóna lloc a fibres intermèdies de 200-300 nm que constitueixen el segon nivell. Finalment, en el tercer nivell, les fibres intermèdies es pleguen helicoïdalment i formen la cromàtide del cromosoma metafàsic. Hi ha altres autors que han proposat models amb un plegament helicoïdal successiu sense llaçades inicials (Bak et al., 1977; Sedat i Manuelidis, 1978; Taniguchi i Takayama, 1986). En aquests models tan sols hi ha dos nivells de plegament per sobre de la fibra de 30-40 nm: una fibra intermèdia de 200-400 nm i la cromàtide final. També s ha proposat un model irregular (Belmont et al., 1987; Bel-

mont i Bruce, 1994) en el qual hi ha tres nivells de plegament superiors a la fibra de 3040 nm. Almenys hi ha dos elements estructurals que poden reduir la concentració local de DNA als diversos nivells de plegament considerats a la taula 2. Primer, cal tenir en compte que en estructures condensades, com els cristalls, les molècules que s empaqueten no poden ocupar tot l espai. Per exemple, en el cas dels cristalls de proteïna, les molècules de proteïna tan sols ocupen aproximadament el 75 % del volum total (Schulz i Schirmer, 1979). Els cossos de forma aproximadament cilíndrica com el DNA s empaqueten hexagonalment en els cristalls i en fibres parcialment ordenades (Lerman et al., 1976; Cantor i Schimmel, 1980). L empaquetament hexagonal és molt compacte, però la fracció de volum ocupat per les fibres és tan sols, aproximadament, el 91 %. En segon lloc, cal tenir en compte que moltes estructures biològiques de forma cilíndrica amb components helicoïdals (microtúbuls, flagels i pili bacterians, virus de càpside helicoïdal) tenen un forat al llarg de tot l eix central (Alberts et al., 1994). De fet, en diversos models per a l estructura del cromosoma considerats a la taula 2, els autors indiquen explícitament l existència de forats centrals en diversos nivells de plegament. Aquests forats també representen una pèrdua d eficiència pel que fa a l ocupació de l espai per part de les fibres de cromatina. Per exemple, en el cas del model de tipus llaçada/fibra intermèdia/cromàtide de Manuelidis i Chen (1990), es pot calcular que la disminució de concentració local de DNA que es deu als forats centrals és aproximadament del 12 %. Si a més es tenen en compte les pèrdues de concentració provocades per l empaquetament helicoïdal de les fibres dels tres nivells de plegament, el càlcul global indica que la concentració fi-

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 60

60 JOAN-RAMON DABAN

Raó d empaquetament Coeficient d’empaquetament

a) RAÓ COEFICIENT D’EMPAQUETAMENT =) D EMPAQUETAMENT LINEAL LINEAL

Concentració de DNA (g/ml)

b) CONCENTRACIÓ LOCAL DE DNA

FIGURA 3. a) Augment de la raó d empaquetament lineal en els successius nivells de plegament dels cromosomes metafàsics. b) Disminució de la concentració local de DNA en els diversos nivells de plegament dels cromosomes metafàsics. En ambdues figures els càlculs han estat fets considerant el model per al cromosoma metafàsic proposat per Manuelidis i Chen (1990). A la figura a, el model de fibra de cromatina de 30-40 nm que s ha tingut en compte és el solenoide normal (figura 2c). Per a obtenir les tres corbes de la figura b, s han considerat les concentracions locals de DNA corresponents als tres models per a la fibra de 30-40 nm presentats a la figura 2 b i d.

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 61

RESTRICCIONS FÍSIQUES PER A LA FORMACIÓ D'ESTRUCTURES 61

nal de DNA, en aquest model concret, és aproximadament un 37 % inferior que a la fibra de 30-40 nm. Les estimacions fetes a la taula 2 corresponen a les disminucions mínimes de concentració local de DNA corresponents als diversos models considerats. Els valors obtinguts indiquen que hi ha una notable disminució de la concentració local de DNA quan les fibres de cromatina de 30-40 nm es pleguen per a formar les cromàtides condensades del cromosoma metafàsic. La mitjana dels valors obtinguts pels diversos models considerats correspon a una disminució de concentració del 40 % (Daban, 2000). LA RAÓ D EMPAQUETAMENT LINEAL NO ÉS ADEQUADA PER A LA VALIDACIÓ DE MODELS ESTRUCTURALS DE LA CROMATINA El conjunt d observacions fetes als apartats anteriors indiquen que en cadascun dels nivells de plegament del DNA, que porten des dels nucleosomes fins als cromosomes metafàsics, hi ha una disminució significativa de la concentració local de DNA. La concentració relativament alta de DNA en el nucleosoma (~ 0,37 g/ml; figura 2a) es redueix molt quan aquestes partícules formen la fibra de cromatina de 30-40 nm (0,040,27 g/ml; figura 2b-d), i després encara es redueix un 40 % més al final de la sèrie de plegaments que es consideren en els diferents models proposats pels cromosomes metafàsics (taula 2). En contrast amb aquestes observacions fetes respecte a la concentració local de DNA, hi ha el conegut fet que la raó d empaquetament lineal augmenta molt en tots els nivells de plegament que porten a la formació de les cromàtides dels cromosomes metafàsics. A l apartat 2 s han considerat el remarcable augment dels valors de la raó

d empaquetament lineal corresponents al model de Pienta i Coffey (1984) presentat a la figura 1. Es troben resultats molt semblants (vegeu la figura 3a) quan els càlculs es fan amb el model de Manuelidis i Chen (1990). Aquests resultats són particularment representatius perquè aquest model es pot considerar com una síntesi dels models estructurals que inclouen llaçades i una fibra intermèdia abans d arribar al nivell de cromàtide (taula 2). Es pot concloure doncs que existeix una aparent paradoxa entre la raó d empaquetament lineal i la concentració local de DNA, de tal manera que l augment de la primera magnitud va acompanyat d una disminució de la concentració local de DNA que, a priori, era inesperada. De fet, quan tan sols es té en compte la raó d empaquetament lineal, no es descobreixen les limitacions físiques que tenen els diversos nivells de plegament de la cromatina per a arribar a formar cromosomes condensats. Aquestes observacions impliquen la necessitat de revalorar moltes consideracions prèvies sobre la possibilitat de formar cromosomes metafàsics amb els diversos models proposats per a l estructura de les fibres de cromatina. La revaloració dels models de cromatina ha de tenir en compte dos factors: a) la restricció general imposada per les dades experimentals disponibles sobre la concentració local de DNA als cromosomes metafàsics (0,17 g/ml); b) les disminucions de concentració local de DNA que es produeixen en els successius nivells de plegament de la cromatina. A la figura 3b es presenten els càlculs de concentració local de DNA efectuats amb els tres models d estructura de la fibra de cromatina de 30-40 nm considerats a la figura 2b-2d. Es pot veure que el model irregular de baixa densitat dóna una concentració local de DNA a la cromàtide final que és molt més petita que la corresponent

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 62

62 JOAN-RAMON DABAN

als cromosomes metafàsics reals. Quan aquest tipus de model parteix d una fibra més densa pot arribar a concentracions locals de DNA semblants a les trobades amb el model del solenoide normal. També en el cas del solenoide normal, però, la concentració de DNA a la cromàtide final és menor que la del cromosoma (amb aquest model tan sols s arriba aproximadament al 50 % de la concentració de DNA necessària per a formar cromosomes). Únicament el model del solenoide interdigitat compacte té una concentració local de DNA prou elevada per a permetre que, després de tots els nivells de plegament, es formi una cromàtide amb una densitat de DNA propera als valors experimentals trobats per als cromosomes condensats. AGRAÏMENTS Les figures per a aquest treball han estat preparades al Laboratori d Anàlisi i Fotodocumentació del Departament de Bioquímica i de Biologia Molecular, Universitat Autònoma de Barcelona. Aquest treball ha estat subvencionat en part amb els ajuts PB98-0858 (Dirección General de Investigación) i 2000SGR65 (Generalitat de Catalunya). BIBLIOGRAFIA ALBERTS, B.; D. BRAY; J. LEWIS; M. RAFF; K. ROBERTS; J. D. WATSON (1994). Molecular biology of the cell. Nova York: Garland Publishing. BAK, A. L.; J. ZEUTHEN; F. H. C. CRICK (1977). «Higher-order structure of human mitotic chromosomes». Proc. Natl. Acad. Sci. USA, núm. 74, pàg. 1595-1599. BEDNAR, J.; R. A. HOROWITZ; S. A. GRIGORYEV; L. M. CARRUTHERS; J. C. HANSEN; A. J. KOSTER; C. L. WOODCOCK (1998). «Nucleosomes, linker DNA, and linker histones form a unique structural motif that directs the higher-order folding and compaction of chromatin». Proc. Natl. Acad. Sci. USA, núm. 95, pàg. 14173-14178.

BELMONT, A. S.; K. BRUCE (1994). «Visualization of G1 chromosomes: A folded, twisted, supercoiled chromonema model of interphase chromatid structure». J. Cell Biol., núm. 127, pàg. 287-302. BELMONT, A. S.; J. W. SEDAT; D. A. AGARD (1987). «A three-dimensional approach to mitotic chromosome structure: Evidence for a complex hierarchical organization». J. Cell Biol., núm. 105, pàg. 77-92. BENNETT, M. D.; J. S. HESLOP-HARRISON; J. B. SMITH; J. P. WARD (1983). «DNA density in mitotic and meiotic metaphase chromosomes of plants and animals». J. Cell Sci., núm. 63, pàg. 173-179. BOHRMANN, B.; M. HAIDER; E. KELLENBERGER (1993). «Concentration evaluation of chromatin in unstained resin-embedded sections by means of low-dose ratio-constrast imaging in STEM». Ultramicroscopy, núm. 49, pàg. 235-251. BORDAS, J.; L. PEREZ-GRAU; M. H. J. KOCH; M. C. VEGA; C. NAVE (1986). «The superstructure of chromatin and its condensation mechanism. II. Theoretical analysis of the X-ray scattering patterns and model calculations». Eur. Biophys. J., núm. 13, pàg. 175-185. BOY DE LA TOUR, E.; U. K. LAEMMLI (1988). «The metaphase scaffold is helically folded: Sister chromatids have predominantly opposite helical handedness». Cell, núm. 55, pàg. 937-944. CANTOR, C. R.; P. R. SCHIMMEL (1980). Biophysical chemistry. San Francisco: Freeman. DABAN, J.-R (1998). «Empaquetament funcional del DNA: El nucleosoma i les estructures d ordre superior de la cromatina». Treb. Soc. Cat. Biol., núm. 48, pàg. 167-181. DABAN, J.-R (2000). «Physical constraints in the condensation of eukaryotic chromosomes: Local concentration of DNA versus linear packing ratio in higher order chromatin structures». Biochemistry, núm. 39, pàg. 3861-3866. DABAN, J.-R.; A. BERMÚDEZ (1998). «Interdigitated solenoid model for compact chromatin fibers». Biochemistry, núm. 37, pàg. 4299-4304. DEL VALLE, L.; P. GIMÉNEZ; N. SAPERAS; M. CHIVA (1998). «Empaquetament del DNA en els espermatozoides». Treb. Soc. Cat. Biol., núm. 48, pàg. 199-224. DUPRAW, E. J. (1970). DNA and chromosomes. Nova York: Holt, Rinehart and Winston, Inc. FILIPSKI, J.; J. LEBLANC; T. YOUDALE; M. SIKORSKA; P. R. WALKER (1990). «Periodicity of DNA folding in higher order chromatin structures». EMBO J., núm. 9, pàg. 1319-1327. FRITZSCHE, W.; E. HENDERSON (1996). «Volume determination of human metaphase chromosomes by scanning force microscopy». Scanning Microsc., núm. 10, pàg. 103-110. GALL, J. G (1996). Views of the cell. Bethesda: The American Society for Cell Biology.

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 63

RESTRICCIONS FÍSIQUES PER A LA FORMACIÓ D'ESTRUCTURES 63 GREEN, G. R.; D. L. POCCIA (1985). «Phosphorylation of sea urchin sperm H1 and H2B histones precedes chromatin decondensation and H1 exchange during pronuclear fromation». Dev. Biol., núm. 108, pàg. 235-245. HESLOP-HARRISON, J. S.; A. R. LEITCH; T. SCHWARZACHER; J. B. SMITH; M. D. ATKINSON; M. D. BENNETT (1989). «The volumes and morphology of human chromosomes in mitotic reconstructions». Hum. Genet., núm. 84, pàg. 27-34. International Human Genome Squencing Consortium (2001). «Initial sequencing and analysis of the human genome». Nature, núm. 409, pàg. 860-921. KELLENBERGER, E.; E. CARLEMALM; J, SECHAUD; A. RYTER; G. DE HALLER (1986). «Considerations on the condensation and degree of compactness in non-eukaryotic DNA-containing plasmas». A: Gualerzi, C. O.; Pon, C. L. Bacterial chromatin. Berlin: Springer-Verlag, pàg. 11-25. KOCH, M. H. J. (1989). «Structure and condensation of chromatin». A: Saenger, W.; Heinemann, U. Protein-nucleic acid interaction. London: McMillan Press. pàg. 163-204. LEPAULT, J.; J. DUBOCHET; W. BASCHONG; E. KELLENBERGER (1987). «Organization of double-stranded DNA in bacteriophagues: A study by cryo-electron microscopy of vitrified samples». EMBO J., núm. 6, pàg. 1507-1512. LERMAN, L. S; L. S. WILKERSON; J. H. VENABLE; B. H. ROBINSON (1976). «DNA packing in single crystals inferred from freeze-fracture-etch replicas». J. Mol. Biol., núm. 108, pàg. 271-293. LEUBA, S. H.; G. YANG; C. ROBERT; B. SAMORI; K. VAN HOLDE; J. ZLATANOVA; C. BUSTAMANTE (1994). «Three-dimensional structure of extended chromatin fibers as revealed by tapping-mode scanning force microscopy». Proc. Natl. Acad. Sci. USA, núm. 91, pàg. 11621-11625. LEWIN, B. (2000). Genes VII. Oxford: Oxford University Press. LUGER, K.; A. W. MÄDER; R. K. RICHMOND; D. F. SARGENT; T. J. RICHMOND (1997). «Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 Å resolution». Nature, núm. 389, pàg. 251-260. MANUELIDIS, L.; T. L. CHEN (1990). «A unified model of eukaryotic chromosomes». Cytometry, núm. 11, pàg. 8-25.

MORTON, N. E. (1991). «Parameters of the human genome». Proc. Natl. Acad. Sci. USA, núm. 88, pàg. 7474-7476. PAULSON, J. R.; U. K. LAEMMLI (1977) «The structure of histone-depleted metaphase chromosomes». Cell, núm. 12, pàg. 817-828. PIENTA, K. J.; D. S. COFFEY (1984) «A structural analysis of the role of the nuclear matrix and DNA loops in the organization of the nucleus and chromosome». J. Cell Sci. Suppl., núm. 1, pàg. 123-135. POGANY, G. C.; M. CORZETT; S. WESTON; R. BALHORN (1981) «DNA and protein content of mouse sperm». Exp. Cell Res., núm. 136, pàg. 127-136. RATTNER, J. B.; C. C. LIN (1985). «Radial loops and helical coils coexist in metaphase chromosomes». Cell, núm. 42, pàg. 291-296. ROCA, J. (1998). «Dinàmica del DNA en el cromosoma». Treb. Soc. Cat. Biol., núm. 48, pàg. 183-197. SAITOH, Y.; U. K. LAEMMLI (1994). «Metaphase chromosome structure: Bands arise from differential folding path of the highly AT-rich scaffold». Cell, núm. 76, pàg. 609-622. SCHULZ, G. E.; R. H. SCHIRMER (1979). Principles of protein structure. Nova York: Springer-Verlag. SEDAT, J.; L. MANUELIDIS (1978). «A direct approach to the structure of eukaryotic chromosomes». Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., núm. 42, pàg. 331350. SUBIRANA, J. A.; S. MUÑOZ-GUERRA; J. AYMAMÍ; M. RADERMACHER; J. FRANK (1985). «The layered organization of nucleosomes in 30 nm chromatin fibers». Chromosoma, núm. 91, pàg. 377-390. SUZUKI, M.; T. WAKABAYASHI (1988). «Packaging of DNA in cricket sperm. A compact mode of DNA packaging». J. Mol. Biol., núm. 204, pàg. 653-661. TANIGUCHI, T.; S. TAKAYAMA (1986). «Higher-order structure of metaphase chromosomes: Evidence for a multiple coiling model». Chromosoma, núm. 93, pàg. 511-514. WIDOM, J.; A. KLUG (1985). «Structure of the 300 Å chromatin filament: X-ray diffraction from oriented samples». Cell, núm. 43, pàg. 207-213. WOLFFE, A. (1998). Chromatin structure and function. Londres: Academic Press. WOODCOCK, C. L.; S. DIMITROV (2001). «Higher-order structure of chromatin and chromosomes». Curr. Opin. Gen. Dev., núm. 11, pàg. 130-135.

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 64

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 65

Biofísica molecular (Esteve Padrós, ed.) Treballs de la SCB. Vol. 53 (2002) 65-76

APLICACIÓ DE L ESPECTROSCÒPIA INFRAROJA A L ANÀLISI ESTRUCTURAL DE LA PERMEASA DE MELIBIOSA D ESCHERICHIA COLI NATÀLIA DAVE1, VÍCTOR A. LÓRENZ-FONFRÍA1, JOAQUIM VILLAVERDE1, RAYMONDE LEMONNIER2, GÉRARD LEBLANC2 i ESTEVE PADRÓS1 Unitat de Biofísica. Departament de Bioquímica i de Biologia Molecular. Facultat de Medicina. Universitat Autònoma de Barcelona. 08193 Bellaterra. Barcelona. 2 Laboratori de Fisiologia de les Membranes Cel·lulars - LRC-CEA 16V. Universitat de Niça Sophia-Antipolis i CNRS (URA 6078). 06238 Villefranche-sur-Mer Cedex. França.

Adreça per a la correspondència: Esteve Padrós. Unitat de Biofísica. Facultat de Medicina. Universitat Autònoma de Barcelona. 08193 Bellaterra. Barcelona. Adreça electrònica: esteve.padros@uab.es. Paraules clau: Espectroscòpia infraroja, bescanvi protó/deuteró, melibiosa, canvis conformacionals. Keywords: Infrared spectroscopy, proton/deuteron exchange, melibiose, conformational changes. RESUM En aquest treball es revisa l aplicació de l espectroscòpia infraroja de transformada de Fourier (FTIR) a l estudi de la permeasa de melibiosa d Escherichia coli. L estimació del contingut d estructura secundària mitjançant FTIR està d acord amb una estructura de dotze hèlixs a transmembrana, amb un contingut aproximat d estructura b d un 20 %. L accessibilitat de la proteïna reconstituïda pel dissolvent aquós es va estudiar seguint el bescanvi protó/deuteró per espectroscòpia de FTIR de reflexió total atenuada. A partir de les dades de quatre condicions que donen lloc a complexos diferents amb els substrats (H+, Na+, melibiosa), es demostra que la interacció amb melibiosa (és a dir, en el complex H+·melibiosa·permeasa) protegeix la proteïna envers el bescanvi, especialment pel que fa a les estructures b. En menor magnitud, les hèlixs a també es troben protegides en aquest complex, mentre que els girs reversos no mostren diferències. El conjunt de resultats suggereixen que la unió del sucre a la permeasa indueix una compactació de la proteïna, especialment pel que fa a les estructures b, les quals poden estar incloses en els llaços IV-V i X-XI. Finalment, es discuteix un possible paper catalític d aquests llaços en la funció de la permeasa.

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 66

66 N. DAVE, V. A. LÓRENZ-FONFRÍA, J. VILLAVERDE, R. LEMONNIER, G. LEBLANC I E. PADRÓS

SUMMARY The application of Fourier-transform infrared spectroscopy (FTIR) to the study of Escherichia coli melibiose permease is reviewed. Estimation of secondary structure content of melibiose permease by FTIR spectroscopy agrees with a disposition of the transporter in 12 transmembrane a helices and indicates the presence of about 20 % b sheets. The accessibility of the reconstituted protein to aqueous solvent was studied following hydrogen-deuterium exchange kinetics monitored by attenuated total reflection FTIR under four distinct conditions where MelB forms different complexes with its substrates (H+, Na+, melibiose). Analysis of the amide II band upon 2H2O exposure discloses a significant sugar protection of the protein against aqueous solvent. Investigation of the amide I exchange reveals clear substrate effects on b-sheet accessibility, being the complex H+·melibiose·permease the most protected state against exchange. Although of smaller magnitude, similar changes in a-helices plus non-ordered structures are detected. Finally, no differences are observed when analysing reverse turn structures. The results suggest that sugar binding induces a significant compactness of the carrier s structure, affecting mainly b-sheet domains of the transporter, which according to secondary structure predictions may include cytoplasmic loops IV-V and X-XI. A possible catalytic role of these two loops in the functioning of MelB is hypothesized. INTRODUCCIÓ Els sistemes de transport a través de les membranes biològiques formen un conjunt molt heterogeni que va des del transport d ions o de molècules petites com l aigua, fins al transport de molècules més grans i complexes com lípids, aminoàcids o pèptids. A més, els sistemes de transport adopten mecanismes diversos, des del transport passiu (a favor del gradient) fins al transport actiu que es realitza amb despesa d energia. En aquest treball, analitzarem un dels sistemes de transport de sucre, la permeasa de melibiosa (MelB). Existeixen un gran nombre de proteïnes de membrana que pertanyen a la família dels transportadors de Na+/solut de forma simport que, per causa de la dificultat de purificació i cristal·lització, tenen una organització estructural molt poc coneguda. La permeasa de melibiosa és una de les proteïnes d aquesta família que s ha pogut purificar i reconstituir en estat actiu en quantitats suficients per a permetre n l estudi estructural

(Pourcher et al., 1995). La MelB és un transportador de membrana d Escherichia coli codificada pel gen melB (Yazu et al., 1984) que catalitza l acumulació de-galactòsids a o b utilitzant els ions H+, Na+ o Li+ com a cotransportadors dins el citoplasma bacterià. Aquests ions competeixen pel mateix lloc d unió i augmenten l afinitat del sucre cotransportat per la proteïna, i el Na+ i el Li+ són millor activadors que el H+ (DamianoForano et al., 1986; Bassilana et al., 1988). La MelB és una proteïna molt hidrofòbica (el 70 % dels residus són apolars) de 473 aminoàcids que, sobre la base de diversos tipus d estudis immunològics (Botfield i Wilson, 1988; Pourcher et al., 1996), fusió de MelB-phoA (Botfield i Wilson, 1992; Pourcher et al., 1996), proteòlisi (Gwizdek et al., 1997) i FTIR (Dave et al., 2000) es prediu un model topològic de dotze hèlixs transmembrana amb el costat N i C-terminal a la cara citoplasmàtica (figura 1). Estudis de marcatge mitjançant activació per llum (Ambroise et al., 2000) i de mutagènesi dirigida, conjuntament amb fluorescència (Cor-

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 67

APLICACIÓ DE L ESPECTROSCÒPIA INFRAROJA A L'ANÀLISI ESTRUCTURAL 67 S Y V I F G + Y + G YH N - GT G D RG Y S D -E Q S T Q A E G V F T M F A I V V Q L L G L G A L V D Y 399 179 H F 253 326 N 98 267 A 408 V L L 37 168 106 317 I S F 40 L NV A P G V M G Q I V F V S DT V L F M F G M V P Q I L F Y V I Y T F P L G L I L F Y A C V Y T L I L N I G Y G V L V L T V T M I G S T L S C M F Y G A I V M L Y L L Y T L I L V G S S A F A L I IT A N V Y V L L L L N G P AI W A T V F V S V M Y V A A N P T Y G G A + F A V F I A I L R L V L T M N G V M T A F F L A L S I I F T A G F Y W - I L S V T A G A G I L D T M F T T S A I A I L G I W V A L T I M I V A V L L A F C A T D I W L + F D L N F F R+ F L + W K S D S L I I Q F R 199 233 17 287 428 346 60 V 379 P 148 G P P 297 I L P 78 P L 126 G N F I Q G Y Y F R R + K+ V I + P + D W K A M R M F F -EH VV L S N V G V + + YFR + G S + M L YK K + V L V K S L R A W T F V G I F Q L + -D I Q + G P S + W V E R R+ N I L Y V T S N R R+ S S V G D TL I A I Y A S + -D V D A L E Q TR T I I N Y LD K R + I K+ S + A L H Q G L T - + EP S K E + T D S C L + G HL A T Y K M R+ E + Y + K S I V + R KV + LH S NH + P + 3 + IDA P P - H E V V P + G A V V D K + S - A

COO

FIGURA 1. Model d estructura secundària de la MelB proposat per Pourcher et al. (1996). Les hèlixs transmembrana es representen amb rectangles.

dat et al., 2000) remarquen la importància del domini hèlix IV llaç IV-V hèlix V per a la funció de transport de la MelB. A més, diversos residus acídics o polars de les hèlixs I, II, o IV sembla que tingin un paper molt important en el reconeixement de l ió (Hama i Wilson, 1993; Pourcher et al., 1993). També hi ha proves que les hèlixs del costat C-terminal limiten el lloc d unió del sucre (Wilson i Wilson, 1992; Maehrel et al., 1998, MusVeteau et al., 1995; Cordat et al., 1998; Ding i Wilson, 2000). Una altra propietat estructural és la modificació cooperativa de l estructura de la MelB per efecte de l ió o del sucre, d acord amb mesures per mètodes espectroscòpics com l infraroig i fluorescència i mètodes bioquímics (Mus-Veteau i Leblanc, 1996; Gwizdek et al., 1997; Dave et al., 2000). Tal i com hem esmentat abans, a causa de la gran dificultat per a cristal·litzar les proteï-

nes de membrana, els mètodes espectroscòpics com la fluorescència (Mus-Veteau i Leblanc, 1996; Cordat et al., 1998) i el FTIR (Dave et al., 2000) representen unes eines molt útils per a aprofundir en l estructura i funció de la MelB. També, la caracterització de l estructura i funció de la MelB com a transportador d un sucre com la melibiosa pot servir com a guió per a entendre l estructura i funció d altres transportadors que intervenen en diverses malalties o que són dianes de l acció de fàrmacs i drogues. Per exemple, els transportadors de neurotransmissors pertanyents a la superfamília de sodium-solute transportes (Poolman i Konings, 1993; Reizer et al., 1994) situats en les terminacions sinàptiques, a més de la funció de neurotransmissió, també juguen un paper molt important en la neuroregulació i el desenvolupament

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 68

68 N. DAVE, V. A. LÓRENZ-FONFRÍA, J. VILLAVERDE, R. LEMONNIER, G. LEBLANC I E. PADRÓS

del cervell (Jursky i Nelson, 1999). Per aquestes raons, també estan implicats directament en l acció de fàrmacs antidepressius i en abusos de drogues (Pacholczyk et al., 1991; Tate et al., 1999). Aquesta família de transmissors té característiques estructurals i funcionals homòlogues a les del transportador de melibiosa, ja que consten de dotze o tretze hèlixs transmembrana i, a més, el transport és Na+-dependent (Uhl, 1992). També existeixen moltes malalties degudes a la mala absorció de glucosa, o bé degudes al transport deficient de glucosa al cervell, com la síndrome de la proteïna transportadora de glucosa (Klepper et al., 1999), o relacionades amb l entrada de drogues al cervell que utilitzen el transportador de glucosa (Jolliet-Riant i Tillement, 1999). Cal també indicar que existeix un grau d homologia elevat en el funcionament del transport Na+-dependent entre el transportador de glucosa humà i el transportador de melibiosa, cosa que no passa amb el transportador de lactosa d Escherichia coli, el qual utilitza el H+ en comptes de Na+ (Poolman i Konings, 1993; Reizer et al., 1994). De la mateixa manera, existeix una altra família de cotransportadors de membrana dependents de Na+, un membre de la qual és el transportador simport de sodi-iode de la tiroide, implicat en el hipotiroïdisme i el càncer de tiroide. Així, es plantegen teràpies d acumulació de iode radioactiu per a tractar el càncer de mama (Tazebay et al., 2000), cosa que implica un estudi en profunditat del transportador de iode, el qual té homologia funcional i estructural amb la MelB (Reizer et al., 1994). CANVIS ESTRUCTURALS ASSOCIATS AMB EL MECANISME DE TRANSPORT Les primeres indicacions de l existència de canvis conformacionals associats al trans-

port de melibiosa van procedir d una sèrie d estudis en què s utilitzava espectroscòpia de fluorescència. L addició, en condicions saturants de NaCl, de sucres a-galactòsids, incrementa el senyal de fluorescència un 1317 %, depenent de si són mono-, di- o trisacàrids i l addició de b-galactòsids en un 7 % del total del senyal de fluorescència (MusVeteau et al., 1995). Per contra, l addició d ions Na+ o Li+ disminueix el senyal total en un 2 %. A més, l addició de sucre posterior a l addició de Na+ o Li+ incrementa el senyal de fluorescència, cosa que fa pensar en un augment d afinitat del sucre per la MelB en presència de l ió. Es van fer mesures també de constant d afinitat i eren de l ordre d una magnitud més alta per als agalactòsids que per als b-galactòsids, de la mateixa manera que els canvis mesurats per fluorescència (Mus-Veteau et al., 1995). Així doncs, es pot parlar de complexos ternaris de MelB·sucre·ió que causen canvis conformacionals observables per fluorescència. ESPECTROSCÒPIA INFRAROJA Un dels mètodes que proporciona més informació dels sistemes de membrana és l espectroscòpia infraroja de transformada de Fourier (FTIR). D una banda, aquesta tècnica permet estimar els percentatges d estructura secundària de les proteïnes, així com estudiar els canvis estructurals que es produeixen durant l activitat de la proteïna. De l altra, el procés de substitució de protons de l enllaç amida per deuterons pot ser també seguit amb FTIR, i això permet l estudi de canvis en l accessibilitat de la cadena polipeptídica. Finalment, aquesta tècnica permet estudiar els altres components de les membranes, com son els lípids. Així doncs, en l absència d estructures tridimensionals obtingudes per mètodes de difracció, l espectroscòpia infraroja és capaç de

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 69

APLICACIÓ DE L ESPECTROSCÒPIA INFRAROJA A L'ANÀLISI ESTRUCTURAL 69

proporcionar informació estructural valuosa. En aquest treball presentem una sèrie de resultats obtinguts aplicant aquesta tècnica a l estudi estructural de la MelB tant en presència com en absència de substrats (Dave et al., 2002). ESTUDIS ESTRUCTURALS DE LA MELB PER ESPECTROSCÒPIA INFRAROJA El procés d obtenció de la proteïna en requereix l aïllament i purificació en estat solubilitzat, és a dir, en presència de detergent. Malgrat que el detergent utilitzat no desnaturalitza la proteïna, per a obtenir dades estructurals com més pròximes possibles a l estat natiu, cal reconstituir la proteïna en liposomes. Cal tenir en compte, doncs, que el resultat final d aquest procés dependrà, en una mesura o altra, d almenys dos paràmetres essencials: els lípids utilitzats per a la reconstitució, i la relació molar inicial lípid/proteïna. Després de realitzar una sèrie d estudis preliminars, es va determinar que els millors resultats quant a l activitat dels proteoliposomes s aconsegueixen amb una reconstitució amb un extracte de lípids d E. coli, a una relació molar lípid/proteïna de 120 (equivalent a una relació en pes/pes de 2). A la figura 2a es mostra un espectre d infraroig típic, obtingut per transmissió, d una suspensió de proteoliposomes. En la zona de 1.800-1.500 cm-1 es distingeixen tres bandes principals, que corresponen a l absorció dels lípids (banda a 1.740 cm-1), i a les bandes degudes a l absorció de la proteïna (amida I a 1.657 cm-1 i amida II a 1.545 cm-1). Aquests espectres ja han estat corregits per l absorció del tampó aquós emprat (vegeu la llegenda de la figura 2). Aquestes bandes resulten, en realitat, de la superposició d una sèrie de bandes més estretes. Per a tenir una idea de la localització d aquestes ban-

des components i de llur intensitat, cal aplicar mètodes matemàtics que ajudin a resoldre els espectres complexos. Així, a la figura 2b es mostra l espectre desconvulat, el qual presenta una sèrie de detalls que permeten identificar les bandes components. Les més importants corresponen a hèlixs a (bandes a 1.660 i 1.653 cm-1), la zona de 1.669-1.685 cm-1, que es pot assignar majoritàriament a girs reversos, i la regió de 1.6401.628 cm-1, en la qual apareixen les bandes corresponents a estructura b (Byler i Susi, 1986). En la regió de l amida II, la banda principal a 1.547 cm-1 confirma la presència majoritària d hèlixs a. De manera destacada, pot veure s la banda a 1.517 cm-1, que correspon a l anell de la tirosina. L estudi dels espectres desconvulats, tant en suspensió d aigua normal com en aigua pesada, ha permès comprovar que els percentatges d estructures secundàries estan d acord amb les prediccions d estructura secundària (Pourcher et al., 1996) i amb altres resultats com els experiments de proteòlisi enzimàtica (Gwizdeck et al., 1997). Tots aquests resultats són coherents amb una estructura formada per 12 hèlixs a transmembrana (al voltant d un 50 % de l estructura), una proporció relativament elevada de làmines b (aproximadament un 20 %), i la resta de l estructura (30%) repartida entre girs reversos i estructura no ordenada (Dave et al., 2000). ANÀLISI DE CANVIS ESTRUCTURALS DE LA MELB MITJANÇANT BESCANVI H/D El protó de l enllaç amida que forma la cadena polipeptídica pot bescanviar-se per un protó del medi, sempre que el protó de l enllaç amida sigui mínimament accessible al medi aquós. És a dir, els protons que siguin inaccessibles a causa de l estructura o

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 70

1.800 1800 1.750 1750 1.700 1700 1.650 1650 1.600 1600 1.550 1550 1.500 1500 Número (cm-1-1)) Número d ona d'ona (cm FIGURA 2. Espectres d infraroig de MelB reconstituïda en liposomes de lípids extrets d E. coli, resuspesos en fosfat potàssic 100 mM, pH 7,0. a) Espectre d absorció, després de restar la contribució del tampó. Es poden identificar tres bandes o regions: la banda amb màxim d absorció a 1.740 cm-1, corresponent a l absorció dels grups C=O dels lípids, la banda amida I, deguda als grups amida de la cadena polipeptídica, i la banda amida II, procedent principalment dels grups NH dels enllaços peptídics. b) Espectre desconvulat, utilitzant una amplada de banda de 14 cm-1 i un factor k (factor d aprimament) de 2,4. Pot observar-se com aquest tractament matemàtic permet descobrir la majoria de bandes constituents de l espectre, les quals estaven encavalcades abans d aplicar la desconvolució.

al fet que formen un pont d hidrogen fort, no es bescanviaran per protons del medi. Els estudis d accessibilitat es realitzen utilitzant deuterons: en el moment en què una proteïna es posi en presència d aigua pesada, hi haurà una sèrie de protons que es bescanviaran per deuterons. Mitjançant una espectroscòpia infraroja és possible detectar i quantificar aquest bescanvi, ja que la banda amida II conté principalment la vibració NH. El bescanvi per deuteró ( ND) fa que la vibració corresponent es desplaci 100 cm-1 cap a freqüències baixes i, per tant, es pot quantificar i estudiar la cinètica de bescanvi. La figura 3 mostra els espectres d absorció

de la MelB reconstituïda, obtinguts en presència d aigua normal, i en presència d aigua pesada. Pot observar-se perfectament que la banda de l amida II (1.500-1.600 cm-1) ha disminuït en l espectre pres en D2O, com a conseqüència del bescanvi d una certa proporció de protons de la cadena polipeptídica per deuterons. La figura 4 mostra la disposició experimental que permet realitzar aquests tipus d experiments. Es parteix de la tècnica d ATR (reflexió total atenuada), en què la mostra es diposita en la superfície del cristall. Tal i com es detalla en la llegenda de la figura 4, això permet realitzar el bescanvi protó-deuteró al mateix temps que es controlen els diferents paràmetres de l experiment. Una vegada començada l adquisició d espectres, a un ritme d un cada 5 minuts, es comença el bombeig de nitrogen gasós, el qual s ha fet bombollejar per una sèrie de recipients que contenen D2O. D aquesta manera s aconsegueix que el nitrogen que finalment es fa arribar a la mostra estigui saturat d aigua pesada. Així, comença el procés de substitució dels protons accessibles de la proteïna per deuterons. Per a evitar artefactes, és important que tot el Absorbància (unitats arbitràries) Absorbància (unitats arbitràries)

Absorbància (unitats arbitràries) Absorbància (unitats arbitràries)

70 N. DAVE, V. A. LÓRENZ-FONFRÍA, J. VILLAVERDE, R. LEMONNIER, G. LEBLANC I E. PADRÓS

Tyr T

1700 1.700

1650 1600 1550 1.650 1.600 1.550 -1 -1 Número d ona (cm Número d'ona (cm ) )

1500 1.500

FIGURA 3. Comparació dels espectres desconvulats de MelB, obtinguts en H2O (A) i en D2O (B). Els espectres s han escalat a la mateixa concentració de proteïna, tal i com es pot comprovar comparant l àrea de la banda de tirosina a 1.517 cm-1.

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 71

APLICACIÓ DE L ESPECTROSCÒPIA INFRAROJA A L'ANÀLISI ESTRUCTURAL 71

N2 saturat de D2O

bany termostàtic exterior interior de l’aparell FTIR feix d’IR

cristall d’ATR

FIGURA 4. Disposició dels elements per a realitzar el bescanvi protó/deuteró. En la modalitat d ATR (reflexió total atenuada), el feix d infraroig incideix sobre el cristall i forma l angle adequat perquè en la superfície es produeixi la reflexió total interna. A la superfície superior es diposita la mostra en forma de film sec. A cada reflexió, el feix d infraroig penetra una certa distància en el film (0,5 mm, depenent de la freqüència), i se n obté així l espectre.

muntatge es mantingui a la mateixa temperatura, i fins i tot que aquesta temperatura sigui el més semblant possible a la temperatura ambient; el més adequat és realitzar l experiment en un laboratori mantingut amb termòstat a temperatura constant. Cal tenir en compte que l experiment dura unes 14 h. i, si no es fes així, les oscil·lacions naturals de temperatura podrien influir en els resultats. Una vegada obtinguts els espectres d absorció al llarg de l experiment de bescanvi, cal realitzar una sèrie de correccions, entre les quals podem esmentar: a) la correcció de la contribució dels lípids en les zones de l amida I i amida II; b) la correcció per les bandes d absorció del vapor d aigua residual; c) la correcció per l inflament del film. Aquesta darrera correcció és, segurament, la més important, i cal, doncs, comentar-la més extensament. En el moment inicial, el film és sec, però a mesura que es va hidratant amb el vapor d aigua pesada es va inflant, i això comporta una separació de la superfície del cristall, i per tant una disminució de l absorbància. Per a corregir aquest inflament es va normalitzar pel factor amida II/amida I. A la figura 5 es mostra la representació gràfica

de la disminució de l àrea de l amida II, en quatre condicions diferents, una vegada realitzades totes les correccions esmentades. Pot observar-se que en finalitzar l experiment (és a dir, després d unes 13 h. d haver començat l administració de vapor d aigua deuterada), el percentatge de bescanvi per als complexos binaris H+·MelB i Na+·MelB són similars, de l ordre del 54 %. En canvi, el complex ternari Na+·mel·MelB mostra un bescanvi del 50 %, mentre que el complex ternari H+·mel·MelB mostra un 46 %. Aquests resultats indiquen que la interacció del sucre amb la permeasa indueix canvis conformacionals que protegeixen del bescanvi de protons per deuterons. Cal indicar que la interacció amb la sacarosa, un sucre que no és un substrat de la permeasa, no indueix cap variació en el bescanvi, i això demostra que l efecte observat per la melibiosa és específic.

1,0 1,0

Fracció no no bescanviada bescanviada Fracció

N2 sec vasos amb D2O

0,9 0,9 0,8 0,8 0,7 0,7 0,6 0,6 0,5 0,5 0,4 0,4

200 200

400 600 400 600 Temps (min) Temps (min)

800 800

FIGURA 5. Representació de la fracció no bescanviada de l amida II en funció del temps d exposició al vapor d aigua pesada, en quatre condicions diferents (tampó MES 20 mM, KCl 10 mM, pH 6,6). Els símbols corresponen a la incubació amb: (!) sense substrats; (o) NaCl 10 mM; (¡) melibiosa 5 mM; (") NaCl 10 mM i melibiosa 5 mM. Les barres corresponen a l error estàndard calculat a partir de tres experiments.

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 72

72 N. DAVE, V. A. LÓRENZ-FONFRÍA, J. VILLAVERDE, R. LEMONNIER, G. LEBLANC I E. PADRÓS

Per un altre costat, la banda amida I també és sensible al bescanvi protó-deuteró, ja que les bandes d absorció corresponents a les diferents estructures són conseqüència principalment de la vibració del grup C=O, que forma pont d hidrogen amb el grup NH, o amb les molècules d aigua del medi, en el cas d estructures exposades al dissolvent. Naturalment, el bescanvi del protó per deuteró afectarà la vibració del grup

A t1678 h1660

Absorbància relativa Absorbància relativa

0,01 0,01

0,00 0,00

-0,01 -0,01

1800 1.800

0,005 0,005

Absorbànciarelativa relativa Absorbància

b1626

1700 1600 1.700 1.600 -1 1 Número (cm Número d ona d'ona (cm ) )

1500 1.500

B b1626

0,000 0,000

línia base

-0,005 -0,005 t1678

-0,010 -0,010

h1660

-0,015 -0,015

200 400 600 200 400 600 Temps Temps (min) (min)

800 800

FIGURA 6. Gràfica superior a): diferència d espectres desconvulats, corresponents a la resta d espectres obtinguts a temps diferents després d iniciar el flux de vapor d aigua deuterada, i la mostra inicial (film assecat, però amb protons). Gràfica inferior b): representació de les intensitats mesurades als números d ona indicats a la gràfica superior, en funció del temps. S ha inclòs també la intensitat a 1.860 cm-1, la qual serveix com a línia base.

C=O, i es produirà un desplaçament de la freqüència de vibració envers valors menors. En aquest cas, però, el desplaçament és de l ordre d una desena de cm-1 i, per tant, és més difícil d analitzar, a causa de la superposició amb bandes corresponents als grups no bescanviats. Malgrat aquesta dificultat, és possible realitzar aquests estudis si abans es fa una selecció acurada dels valors de les freqüències a les quals se segueix la variació de cada estructura. La figura 6a mostra diferències entre parelles d espectres desconvulats: un espectre adquirit a un temps t després de l inici del bescanvi es desconvula i se li resta l espectre a temps zero, desconvulat. Així, aquests espectres de diferència ens indiquen a quins valors de la freqüència trobarem els canvis més importants, dins de cada zona corresponent a una estructura secundària concreta. D aquesta manera, es poden seleccionar els següents valors de la freqüència: 1678 cm-1 per a seguir els canvis en els girs reversos; 1.660 cm-1 per a les hèlixs a i estructures no ordenades, i 1.626 cm-1 per a les estructures en làmina b. A la figura 6b es mostren els canvis d intensitat, mesurats en aquests valors en funció del temps, a més de la variació observada a 1.860 cm-1, que s utilitza com a línia base, ja que en aquesta freqüència no hi ha cap absorció. Pot observar-se com la cinètica corresponent als girs reversos (1.678 cm-1) és molt ràpida, mentre que la corresponent a les hèlixs més estructura no ordenada és una mica més lenta, i la corresponent a les estructures b és encara més lenta. Aquest tipus d anàlisi, però, és especialment interessant quan es volen comparar els efectes de diferents substrats. A la figura 7 es presenten les cinètiques de deuteració corresponents als tres tipus d estructures esmentats. S observa que les cinètiques corresponents als girs reversos són molt semblants entre elles, mentre que les cinètiques corresponents a les estructures b presenten diferèn-

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 73

APLICACIÓ DE L ESPECTROSCÒPIA INFRAROJA A L'ANÀLISI ESTRUCTURAL 73

Intensitat normalitzada Intensitat normalitzada -1 1) (1.678cm cm (1678 )

Intensitat normalitzada Intensitat normalitzada Intensitat normalitzada Intensitat normalitzada -1 1 1 -1 (1.660cm cm (1.626 cmcm )) (1660 ) ) (1626

cies importants, i les hèlixs més estructures no ordenades tenen un comportament intermedi. En correspondència amb el comportament observat per a l amida II (figura 5), s observa que la incubació de la permeasa amb el sucre melibiosa proporciona una elevada protecció en el bescanvi protó/deuteró de les estructures en làmina plegada b, i la forma més bescanviada és la corresponent a la incubació amb Na+. Quant a les hèlixs a més estructures no ordenades, s observa un comportament intermedi, tenint en compte que la proporció d aquest conjunt d estructures és majoritari en la permeasa. Arribem, doncs, a la conclusió que la interacció del sucre melibiosa amb la per-

1,8 1,8

1,4 1,4

Beta

1,0 1,0 1,0 1,0

Hèlix + no ordenada ordenada Hèlices

0,9

0,9 0,8

0,8 1,0 1,0

Girs

0,8 0,8

0,6 0,6

200

400 Temps Temps (min) (min)

600 600

800

FIGURA 7. Representació de les intensitats mesurades als números d ona indicats a l eix vertical, en funció del temps d exposició al vapor d aigua deuterada, corresponents a les estructures secundàries indicades. Els símbols corresponen a la incubació amb: (!) sense substrats; (o) NaCl 10 mM; (¡) melibiosa 5 mM; (") NaCl 10 mM i melibiosa 5 mM.

measa indueix un canvi conformacional en la proteïna que té com a resultat la disminució del bescanvi protó/deuteró, especialment pel que fa a les estructures b. En aquest context, és molt interessant considerar les característiques de dos llaços citoplàsmics (IV-V i X-XI). En efecte, les prediccions d estructura secundària indiquen que ambdós llaços tenen una alta probabilitat d adoptar estructura b i, per altra banda, s ha demostrat que alguns residus d aquests llaços tenen un paper destacat en el mecanisme de transport. Així, l Arg141 en el llaç IV-V és modificada específicament per un anàleg fotoactivable de la melibiosa (Ambroise et al., 2000), i si aquesta arginina és reemplaçada per un residu neutre, s inhibeix el transport de melibiosa (Abdeldayem et al., enviat a publicar). Algunes mutacions en el llaç XXI també alteren la translocació del sucre. Per exemple, la neutralització del residu Glu365 inhibeix el transport de melibiosa (Ding i Wilson, 2000). Encara més, una anàlisi comparativa de la seqüència d aminoàcids dels llaços hipotètics IV-V i X-XI de la permeasa d E. coli, amb les seqüències homòlogues de transportadors bacterians ens revela que hi ha una sèrie d aminoàcids molt conservats: en el llaç IV-V, trobem la seqüència (P/G)132-(X)4-D-X-R-E-R141 en gairebé cadascun dels transportadors analitzats (vegeu la figura 8a). Quant al llaç X-XI (figura 8b), cal notar la seqüència conservada (D351-(X)2-(E/D)-Y-G-(X)6-R364) en aquests transportadors homòlegs (Poolman et al., 1996). Aquestes dades realcen encara més la importància funcional i estructural d aquests llaços. A partir d aquestes consideracions, és lícit plantejar la hipòtesi que aquests dos llaços puguin interaccionar entre ells i comportar-se com a llaços mòbils, de manera que en el mecanisme del transport anirien a raure en la zona interna del transportador, entre les hèlixs a transmembrana. De fet, en

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 74

74 N. DAVE, V. A. LÓRENZ-FONFRÍA, J. VILLAVERDE, R. LEMONNIER, G. LEBLANC I E. PADRÓS PHOEBHFROL ):6/937,7/'.5(5(4/93<35) PHOEBVDOW\ ):6/937,7/'.5(5(4/93)35) PHOEBNOHSQ ):6/937,7/'.5(5(4/93<35) PHOEBHQWDH ):6/937,7/'.5(5(4/93<35) ODFSBVWD[\ <:6:/31/7+'35(5((/69,35) \DJJBHFROL <&$03*9,7$'3.(5+$/46:5)) [\OSBODFSH ,76,/36/76134(597/67,54) ODF\BODFGH ):$0,3$/6/'65(5(.767)$59 \LFMBHFROL <&$/**9,71'3745,6/46:5)9 ODF\BOHXOD <:*093$,6('6.(5*,)76/*6) UDISBSHGSH ):60/36/77'65(5(.7$7)$5/ JXWDBEDFVX 916/7*507169((579/77750, ODF\BVWUWU ):60,3$/6/'6+(5(.0$7)$5, ,

alguns sistemes de transport ja ha estat descrita la presència de llaços mòbils com, per exemple, en els transportadors de glutamat (Slotboom et al., 2001). En la permeasa de melibiosa el moviment d aquests llaços podria ser un element essencial en el procés del transport, amb la interacció amb la molècula de sucre i la canalització d aquest cap a una zona de la molècula en què l espai entre les hèlixs tingués característiques hidrofíliques. Dintre d aquesta hipòtesi, la següent etapa del transport seria ja l alliberament de la molècula de sucre a l espai intracel·lular. AGRAÏMENTS

PHOEBHFROL ,09$',9'<*(<./+95&(6,$<6947099.* PHOEBVDOW\ ,09$'79'<*()./1,5&(6,$<6947099.* PHOEBNOHSQ ,09$'79'<*(<701,5&(6,$<6947/99.$ PHOEBHQWDH ,09$'79'<*(<701,5&(6,$<6947/99.$ \LKSBHFROL $/96'79(<*(:57*956(*79<7*)7))5.9 XLGEBHFROL $'79(<*(</7*95,(*/7<6/)6)75.& \MPEBEDFVX 96',,'<*(:.6*(5.($77<6/)1)65./ \LKRBHFROL $/93'79'<*(:.7*,5$(*69<7*<7))5., JXWDBEDFVX *09$'&9'<$(:.7*,5$'*99,6606),1./ ODFSBVWD[\ 96/$'9,'<*(9.)*451(6,,76717)/7.7 \FU BHUZKH $'9$'<*(:64*.50'*,,)67)/$9/./ [\OSBODFSH 90/$'69'<*(:.1*95$(*,976)66)6$.) \LFMBHFROL 6'79'<*(:&1*.5/7*,6)$*7/)9/./ -

FIGURA 8. Comparació de les seqüències d aminoàcids corresponents als llaços IV-V (a) i X-XI (b) de la permeasa de melibiosa d E. Coli, amb les corresponents a proteïnes homòlogues: permeasa de melibiosa de Salmonella typhimurium (melb_salty), Klebsiella pneumoniae (melb_klepn) i Enterobacter aerogenes (melb_entae); permeasa de lactosa de Staphylococcus xylosus (lacp_staxy), Lactobacillus delbrueckii (lacy_lacde), Leuconostoc lactis(lacy_leula) i Streptococcus thermophilus (lacy_strtr); YAGG d E. coli (yagg_ecoli), transportador de xilosa de Lactobacillus pentosus (xylp_lacpe), permeasa de rafinosa de Pediococcus pentosaceus (rafp_pedpe), YICJ d E. coli (yicj_ecoli), transportador de glucitol de Bacillus subtilis (guta_bacsu), simporters d E. coli (yihp_ecoli), (yiho_ecoli) i Bacillus subtilis (yjmb_bacsu), transportador de glucurònid d E. coli (uidb_ecoli) i la proteïna de 29,9 kDa (ycr3_erwhe). La numeració segueix la seqüència d aminoàcids de la permeasa de melibiosa d E. coli.

Aquest treball ha estat possible gràcies al finançament següent: Bio4-CT97-2119 (European Commission); Picasso 98127; BMC2000-0121 (Dirección General de Investigación, MCYT); HF1997-0239 (SEUID); BIO97-1918-CE (CICYT); i 1999SGR-0102 (Direcció General de Recerca, DURSI). N. D. i J.V. agraeixen les beques de l European Commission (Bio4-CT97-2119). V. L. agraeix una beca de la Generalitat de Catalunya (1998-FI-00215). BIBLIOGRAFIA AMBROISE, Y.; G. LEBLANC; B. ROSSEAU (2000). «Activesite-directed photolabeling of the melibiose permease of Escherichia coli». Biochemistry, núm. 39, pàg. 1338-1345. BASSILANA, M.; T. POURCHER; G. LEBLANC (1988). «Melibiose permease of Escherichia coli». J. Biol. Chem., núm. 263, pàg. 9663-9667. BOTFIELD, M. C.; T. H. WILSON (1988). «Mutations that simultaneously alter both sugar and cation specificity in the melibiose carrier of Escherichia coli». J. Biol. Chem., núm. 263, pàg. 12909-12915. BYLER, D. M.; H. SUSI (1986). «Examination of the secondary structure of proteins by deconvolved FTIR spectra». Biopolymers, núm. 25, pàg. 469-487.

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 75

APLICACIÓ DE L ESPECTROSCÒPIA INFRAROJA A L'ANÀLISI ESTRUCTURAL 75 CORDAT, E.; G. LEBLANC; I. MUS-VETEAU (2000). «Evidence of a role of helix IV in connecting cation and sugarbinding sites of Escherichia coli melibiose permease». Biochemistry, núm. 39, pàg. 4493-4499. CORDAT, E.; I. MUS-VETEAU; G. LEBLANC (1998). «Structural studies of the melibiose permease of Escherichia coli by fluorescence resonance energy transfer». J. Biol. Chem., núm. 273, pàg. 33198-33202. DAMIANO-FORANO, E.; M. BASSILANA; G. LEBLANC (1986). «Sugar binding properties of the melbiose permease in Escherichia coli membrane vesicles». J. Biol. Chem., núm. 261, pàg. 6893-6899. DAVE, N.; A. TROULLIER; I. MUS-VETEAU; M. DUÑACH; G. LEBLANC; E. PADRÓS (2000). «Secondary structure components and properties of the melibiose permease from Escherichia coli: A Fourier transform infrared spectroscopy analysis». Biophys. J., núm. 79, pàg. 747-755. DAVE, N.; V. A. LÓRENZ; J. VILLAVERDE; R. LEMONNIER; G. LEBLANC; E. PADRÓS (2002). «Study of amide-proton exchange of Escherichia coli melibiose permease by ATR-FTIR: evidence of structure modulation by substrate binding». J. Biol. Chem., núm. 277, pàg. 3380-3387. DING, P. Z.; T. H. WILSON (2000). «Sugar recognition mutants of the melibiose carrier of Escherichia coli: possible structural information concerning the arrangement of membrane-bound helices and sugar-cation recognition site». J. Membr. Biol., núm. 174, pàg. 135-140. GWIZDEK, C.; G. LEBLANC; M. BASSILANA (1997). «Proteolytic mapping and substrate protection of the Escherichia coli melibiose permease». Biochemistry, núm. 36, pàg. 8522-8529. HAMA, H.; H. WILSON (1993). «Cation-coupling in chimeric melibiose carriers derived from Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae». J. Biol. Chem., núm. 268, pàg. 10060-10065. JOLLIET-RIANT, P.; J. P. TILLEMENT (1999). «Mechanisms of nutrient and drug transfer through the bloodbrain barrier and their pharmacological changes». Encephale, núm. 25, pàg. 135-145. JURSKY, F.; N. NELSON (1999). «Developmental expression of the neurotransmitter transporter NTT4». J. Neurosci. Res., núm. 55, pàg. 24-35. KLEPPER, J.; D. WANG; J. FISCHBARG; J. C. VERA; I. T. JARJOUR; K. R. O DRISCOLL; D. C. DE VIVO (1999). «Defective glucose transport across brain tissue barriers: a newly recognized neurological syndrome». Neurochem. Res., núm. 24, pàg. 587-594. MAEHREL, C.; E. CORDAT; I. MUS-VETEAU; G. LEBLANC (1998). «Structural studies of the melibiose permease of Escherichia coli by fluorescence resonance energy transfer». J. Biol. Chem., núm. 273, pàg. 33192-33197. MUS-VETEAU, I.; G. LEBLANC (1996). «Melibiose permea-

se of Escherichia coli: structural organization of cosubstrate binding sites as deduced from tryptophan fluorescence analyses». Biochemistry, núm. 35, pàg. 12053-12060. MUS-VETEAU, I.; T. POURCHER; G. LEBLANC (1995). «Melibiose permease of Escherichia coli: substrate-induced conformational changes monitored by tryptophan fluorescence spectroscopy». Biochemistry, núm. 34, pàg. 6775-6783. PACHOLCZYK, T.; R. D. BLAKELY; S.G. AMARA (1991). «Expression cloning of a cocaine and antidepressant-sensitive human noradrenaline transporter». Nature, núm. 350, pàg. 350-354. POOLMAN, B.; W. N. KONINGS (1993). «Secondary solute transport in bacteria». Biochim. Biophys. Acta, núm. 1183, pàg. 5-39. POOLMAN, G. T.; J. KNOL; C. VAN DER DOES; P. J. F. HENDERSON; W-J. LIANG; G. LEBLANC; T. POURCHER; I. MUS-VETEAU (1996). «Cation and sugar selectivity determinants in a novel family of transport proteins». Mol. Microbiol., núm. 19, pàg. 911-922. POURCHER, T.; E. BIBI; R. KABACK; G. LEBLANC (1996). «Membrane topology of the melibiose permease of Escherichia coli». Biochemistry, núm. 35, pàg. 4161-4168. POURCHER, T.; S. LECLERCQ; G. BRANDOLIN; G. LEBLANC (1995). «Melibiose permease of Escherichia coli: large scale purification and evidence that H+, Na+, and Li+ sugar symport is catalyzed by a single polypeptide». Biochemistry, núm. 34, pàg. 4412-4420. POURCHER, T.; M. L. ZANI; G. LEBLANC (1993). «Mutagenesis of acidic residues in putative membrane spanning segments of the melibiose permease of Escherichia coli». J. Biol. Chem., núm. 268, pàg. 32093215. REIZER, J.; A. REIZER; H. S. MILTON (1994). «A functional superfamily of sodium/solute symporters». Biochim. Biophys. Acta, núm. 1197, pàg. 133-166. SLOTBOOM, D. J.; W. N. KONINGS; J. S. LOLKEMA (2001). «The structure of glutamate transporters shows channel-like features». FEBS Lett., núm. 492, pàg. 183-186. TATE, C. G.; E. WHITELEY; M. J. BETENBAUGH (1999). «Molecular chaperones stimulate the functional expression of the cocaine-sensitive serotonin transporter». J. Biol. Chem., núm. 274, pàg. 17551-17558. TAZEBAY, U. H.; I. L. WAPNIR; O. LEVY; O. DOHAN; L. S. ZUCKIER; Q. H. ZHAO; H. F. DENG; P. S. AMENTA; S. FINEBERG; R. G. PESTELL; N. CARRASCO (2000). «The mammary gland iodide transporter is expressed during lactation and in breast cancer». Nat. Med., núm. 6, pàg. 871-878. UHL, G. R. (1992). «Neurotransmitter transporters (plus): a promising new gene family». Trends Neurosci., núm. 15, pàg. 265-268. WILSON, D. M.; T. H. WILSON (1992). «Asp-51 and

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 76

76 N. DAVE, V. A. LÓRENZ-FONFRÍA, J. VILLAVERDE, R. LEMONNIER, G. LEBLANC I E. PADRÓS Asp-120 are important for the transport function of the Escherichia coli melibiose carrier». J. Bacteriol., núm. 174, pàg. 3083-3086. YAZU, H.; S. SHIOTA-NIIYA; T. SHIMAMOTO; H. KANAZAWA;

M. FUTAI; T. TSCUCHIYA (1984). «Nucleotide sequence of the Melb gene and characteristics of deduced aminoacid sequence of the melibiose carrier of Escherichia coli». J. Biol. Chem., núm. 259, pàg. 4320-4326.

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 77

Biofísica molecular (Esteve Padrós, ed.) Treballs de la SCB. Vol. 53 (2002) 77-90

TÈCNIQUES BIOINFORMÀTIQUES APLICADES A LA MODELITZACIÓ I SIMULACIÓ DE L ESTRUCTURA I L ACTIVITAT DE RECEPTORS ACOBLATS A PROTEÏNES G XAVIER DEUPÍ, MIREIA OLIVELLA i LEONARDO PARDO* Laboratori de Medicina Computacional. Unitat de Bioestadística. Facultat de Medicina. Universitat Autònoma de Barcelona. 08193 Bellaterra. *Autor corresponent. Adreça electrònica: Leonardo.Pardo@uab.es. Paraules clau: Receptors acoblats a proteïnes G, modelització, dinàmica molecular, TSHr, CCR5. Key Words: G protein-coupled receptors, modeling, molecular dynamics, TSHr, CCR5. RESUM El receptor de la tirotropina (TSHr) i el receptor de quimiocines CCR5 pertanyen a la família dels receptors acoblats a proteïnes G. Hi ha diverses malalties associades al seu funcionament anòmal, des del desenvolupament de tumors a la tiroide fins a la sida. La dificultat de cristal·litzar aquests receptors, ja que són proteïnes de membrana, fa que només es conegui l estructura tridimensional d una proteïna d aquesta família, la rodopsina. Partint d aquesta estructura s han utilitzat tècniques bioinformàtiques per a desenvolupar models tridimensionals teòrics de TSHr i CCR5. Mitjançant la comparació de seqüències i la cerca en bases de dades d estructures tridimensionals s han identificat els residus Asp6.44 i Asn7.49 en el TSHr i el motiu Thr-X-Pro (TXP) en la segona hèlix transmembranosa del CCR5, que són específics d aquestes subfamílies. A través de simulacions de dinàmica molecular s ha explorat el comportament dinàmic d aquests motius i el seu paper en el mecanisme d activació dels receptors. SUMMARY The thyrotropin receptor (TSHr) and the chemokine receptor CCR5 belong to the family of G protein-coupled receptors. Several diseases, such as the development of thyroid adenomes or AIDS, are related to its malfunction. These membrane proteins are particularly diffi-

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 78

78 XAVIER DEUPÍ, MIREIA OLIVELLA I LEONARDO PARDO

cult to structurally characterize, so only the high resolution structure of bovine rhodopsin is available. Starting from this structure and aplying bioinformatic tools we have developed theoretical models of the THSr and CCR5 structure. Inspection of sequence alignments and survey of structural databases have lead to the identification of Asp6.44 and Asn7.49 in TSHr and a Thr-X-Pro (TXP) motif in the second transmembrane helix of CCR5, specific within these subfamilies. The dynamic behaviour of these motifs and its role in the activation mechanism have been studied by molecular dynamics simulations. INTRODUCCIÓ Els receptors acoblats a proteïnes G (GPCR) constitueixen la família més important de proteïnes que es troba a l organisme, amb més de 1000 d identificats fins ara (Horn et al., 1998). Aquestes proteïnes es troben a la membrana de la cèl·lula i s encarreguen de transmetre els senyals extracel·lulars cap al seu interior. Els GPCR són capaços d unir una gran varietat de lligands en la seva regió extracel·lular, com amines biogèniques, pèptids, glicoproteïnes, lípids, nucleòtids, ions i proteases, i, a més a més, transmeten estímuls externs com la llum, l olor i el sabor (Ji et al., 1998). La unió de lligands agonistes estabilitza els receptors en una conformació activa que afavoreix la unió en la seva regió intracel·lular de proteïnes G. La formació del complex ternari lligand-receptor-proteïna G afavoreix l intercanvi de GDP a GTP en la subunitat a de la proteïna G. Aquest intercanvi afavoreix la divisió de la proteïna G heterotrimèrica en les subunitats a i bg, que són capaces d influir en diversos sistemes efectors com, per exemple, l estimulació o inhibició d adenilat ciclasa, l activació de fosfolipases i la regulació de l activitat dels canals de calci i potassi (Hamm, 1998). D acord amb el model del complex ternari de l activació dels GPCR (Samama et al., 1993; Leff, 1995), els receptors es troben en equilibri entre les conformacions inactiva i activa. En la proteïna nativa existeixen una sèrie d interaccions intramoleculars que

mantenen el receptor en un estat inactiu. Els agonistes s uneixen amb alta afinitat a la conformació corresponent a l estat activat i estabilitzen canvis conformacionals en alguns residus clau i, d aquesta manera, desplacen l equilibri cap a la conformació activa. L estabilització de la forma activa del receptor també pot ser provocada per la mutació de certs residus. Els canvis locals en l estructura tridimensional del receptor en unir un lligand o patir una mutació desencadenen una sèrie de canvis, com la protonació de certs residus o el moviment d estructures secundàries (Gether et al., 1998). Aquests canvis inicien el procés de transducció del senyal. Diverses malalties es troben associades al funcionament anòmal dels GPCR (Whitehead et al., 2001; Marinissen et al., 2001). Així doncs, aquests són sistemes que tenen un alt interès farmacèutic, i s estima que el 60 % dels fàrmacs prescrits estan dirigits a actuar selectivament sobre aquesta família de receptors (Gurrath, 2001). En el camp de la recerca farmacèutica, un dels mètodes que s utilitzen per a trobar compostos amb activitat farmacològica és l anomenat disseny racional de fàrmacs. Aquest procediment consisteix en l estudi de les interaccions moleculars específiques de reconeixement entre les molècules del fàrmac i de l objectiu al qual aquest va dirigit; per exemple, un GPCR. Amb aquesta informació, es dissenyen molècules que actuïn específicament sobre un receptor determinat. Aquests dissenys in silico seran

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 79

TÈCNIQUES BIOINFORMÀTIQUES 79

zona extracel·lular

TM7

TM3 TM6

TM4 TM1 N

TM2

zona intracel·lular

TM5

R Y

R W

FIGURA 1. Representació esquemàtica de l estructura general dels GPCR. La figura mostra la disposició en set hèlixs que travessen la membrana connectades per llaços. El residu més conservat en cada hèlix, que s utilitza en el mètode de numeració de Ballesteros et al. (vegeu «Mètodes»), es ressalta amb fons gris. Altres residus molt conservats es ressalten amb fons negre.

després provats experimentalment, i podran esdevenir caps de sèrie a partir dels quals es desenvolupin fàrmacs més actius (Muller, 2000). Per a utilitzar la tècnica del disseny racional cal partir d una estructura tridimensional de l objectiu farmacològic. La dificultat de cristal·litzar proteïnes de membrana ha fet que fins fa poc no s hagi pogut resoldre mitjançant difracció de raigs X la primera estructura tridimensional d un membre de la família dels GPCR, la rodopsina bovina (Palczewski et al., 2000). L estructura revela una diposició en forma de set hèlixs a que travessen la membrana cel·lular connectades entre elles a través de llaços intracel·lulars i extracel·lulars (figura 1). Aquesta disposició ja havia estat proposada fruit d estudis de mutagènesi dirigida i d estructures de baixa resolució obtingu-

des mitjançant difracció d electrons (Unger et al., 1997; Baldwin et al., 1997). La seqüència a la zona transmembranosa de tots els GPCR està molt conservada, cosa que fa suposar que existeix una gran similitud estructural en aquesta regió. Això permet utilitzar l estructura tridimensional de la regió transmembranosa de la rodopsina per a modelitzar altres GPCR. També, la necessitat d unir de forma específica una gran diversitat de lligands en la regió extracel·lular fa pensar en l existència de característiques estructurals diferenciades i específiques per a cada receptor particular. Per a desenvolupar models específics de GPCR caldrà, doncs, tenir en compte aquestes divergències. El receptor de la tirotropina (TSHr) s engloba dins de la família 1 dels GPCR, con-

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 80

80 XAVIER DEUPÍ, MIREIA OLIVELLA I LEONARDO PARDO

cretament dins la subfamília dels receptors d hormones glicoproteiques (Gether, 2000). Aquest receptor es caracteritza per la presència d un gran fragment aminoterminal, amb dominis rics en leucina, on s uneixen els seus agonistes naturals, les hormones glicoproteiques (Costagliola et al., 1998; Da Costa et al., 1998). El TSHr mostra activitat constitutiva, és a dir, exhibeix certa activitat en absència d agonistes. Aquest comportament també s explica mitjançant el model del complex ternari, que proposa que si la barrera energètica entre les conformacions inactiva i activa del receptor és suficientment baixa, part de la població pot passar espontàniament de l estat inactiu a l estat activat, cosa que es tradueix en activació constitutiva en absència de senyal. Certes mutacions poden incrementar de manera molt important aquesta activitat constitutiva (Scheer et al., 1996), i algunes d elles es troben de forma natural i estan associades a diverses malalties (Allen et al., 1991; Duprez et al., 1997). En aquest treball es mostra com l anàlisi d aquestes mutacions a nivell molecular en el context del receptor es pot utilitzar per a estudiar el mecanisme general d activació dels GPCR i per a identificar-ne alguns dels residus implicats. El CCR5 pertany a la subfamília dels receptors de quimiocines, dins també de la família 1 dels GPCR, i respon a quatre quimiocines naturals: RANTES, MIP1-a, MIP1-B i MCP2. La importància d aquesta proteïna rau en el fet que es tracta d un coreceptor del virus d inmunodeficiència humana (VIH), i la majoria dels homozigots que presenten la mutació CCR5A32 no s expressen en la superfície cel·lular i, per tant, no uneixen el VIH, i així prevenen de la infecció del virus (Liu et al., 1996). Per tant, la inactivació d aquest receptor mitjançant antagonistes selectius podria portar a un possible mètode terapèutic per a combatre la infecció del VIH. Diversos estudis mostren com els resi-

dus de Pro, Thr o Ser distorsionen les hèlixs a (Blundell et al., 1983; Barlow et al., 1988; Ballesteros et al., 2000). A la segona regió transmembranosa (TM2) dels receptors de quimiocines es troba un motiu de seqüència Thr-residu hidrofòbic-Pro (TXP) característic i molt conservat. Els resultats mostren que aquesta combinació de Thr i Pro aporta unes característiques estructurals específiques a la TM2 que afectarien la conformació de la resta del receptor. MATERIALS I MÈTODES Numeració dels residus Per a identificar els residus dins d una seqüència determinada s ha utilitzat el sistema de numeració de Ballesteros i Weinstein (Ballesteros et al., 1994), on la posició de cada residu s especifica mitjançant dos nombres: el primer correspon a l hèlix en la qual es troba el residu, i el segon defineix la seva posició relativa al residu més conservat en aquella hèlix, al qual se li assigna arbitràriament la posició 50. Per exemple, Asn674 del receptor TSHr humà correspon a Asn7.49, ja que es troba immediatament abans de la Pro altament conservada de TM7. Modelització del TSHr El domini transmembranós del TSHr s ha construït mitjançant modelització comparativa, utilitzant com a patró l estructura tridimensional de la rodopsina bovina. Per a construir el model, primer s alineen les seqüències de rodopsina i del receptor per modelitzar utilitzant com a punts de referència els residus altament conservats presents en els dominis transmembranosos de tota la família dels GPCR (figura 1). A continuació, se substitueix la sequència del receptor sobre les coordenades atòmiques de

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 81

TÈCNIQUES BIOINFORMÀTIQUES 81

l esquelet peptídic de la rodopsina. Allà on els residus coincideixen, a més a més es mantenen les coordenades de les cadenes laterals. En els residus que difereixen, les orientacions de les cadenes laterals s escullen utilitzant una biblioteca de rotàmers que té en compte la configuració de l esquelet peptídic (McGregor et al., 1987). Aquesta estructura s utilitza com a punt de partida per a l estudi posterior mitjançant simulacions de dinàmica molecular, tal com s exposa més endavant. Anàlisi del domini estructural TXP en bases de dades d estructures tridimensionals de proteïnes i simulacions de dinàmica molecular S ha portat a terme una cerca de segments d hèlix a que continguin els motius TXP o SXP, on X denota qualsevol residu, en una edició recent del Protein Data Bank (Berman et al., 2000). En aquesta cerca s inclouen tant proteïnes globulars com transmembranoses, a causa de la migradesa d estructures tridimensionals de proteïnes de membrana. Es van inspeccionar les estructures amb una resolució igual o superior a 3 Å, i es van eliminar aquells segments que presentaven més d una Pro, o bé altres residus de Thr o Ser a prop de la Pro. A més a més, es van eliminar aquelles estructures on hi havia molècules d aigua interaccionant amb l esquelet de l hèlix a, ja que provoquen distorsions que no es donen en l entorn hidrofòbic de les proteïnes de membrana. L angle de doblegament d aquestes estructures es calcula com a l angle entre els eixos de l hèlix abans i després de la Pro. Per a conèixer les propietats conformacionals de les hèlix a que contenen el motiu TXP s han portat a terme simulacions de dinàmica molecular del pèptid Ace-Ala11-XAla11-Nme, on X és AAP, TAP o SAP. Les Ser i Thr s han estudiat en diverses confor-

macions, ja que el patró de ponts d hidrogen intramolecular depèn de la conformació de la cadena lateral (Ballesteros et al., 2000). Aquestes simulacions s han portat a terme en les condicions que s exposen a continuació. Simulacions de dinàmica molecular En aquestes simulacions s estudia l evolució temporal de les propietats estructurals de les regions transmembranoses. Per a representar l entorn hidrofòbic del cor de la membrana lipídica on es troben immersos aquests receptors s utilitza una capsa de molècules de metà. La densitat de 0,4-0,5 g+ cm 3 de la capsa de metans és d aproximadament la meitat de la densitat observada en la membrana cel·lular. Això és degut a la diferent distància d equilibri entre els carbonis a la caixa de metans i a la cadena policarbonada del lípid. Aquesta aproximació ha estat validada tot comparant els angles de torsió j i y de l esquelet de proteïnes de membrana depositades al Protein Data Bank i simulacions de dinàmica molecular (Olivella et al., 2002). És important ressaltar que l estructura dels llaços que connecten les hèlixs transmembranoses, i que estan exposades a l entorn hidrofílic, no està modelitzada a causa de la falta d homologia entre les diferents famílies de GPCR. Això no ens permet modelitzar la interfase amb aigua. Aquest mètode o d altres similars ja han estat emprats prèviament per a estudiar el comportament dinàmic de proteïnes de membrana (Aqvist et al., 2000; Govaerts et al., 2001; Govaerts et al., 2001). El sistema receptor-metà se sotmet a 500 iteracions de minimització d energia, i 1,5 ns de dinàmica molecular a volum constant fent servir el mètode particle mesh Ewald per a avaluar les interaccions electroestàtiques. Tots els càlculs de dinàmica molecular s han portat a terme utilitzant el programa

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 82

82 XAVIER DEUPÍ, MIREIA OLIVELLA I LEONARDO PARDO

FIGURA 2. Alineament múltiple de seqüències de les regions TM6-ECL3-TM7 de receptors de glicohormones i de la rodopsina bovina. Per claredat, només es mostren les seqüències d alguns receptors de diversos organismes, des de mamífers fins a anemones marines, i la de la rodopsina bovina. Per a identificar els residus s utilitza el sistema de numeració generalitzat de Ballesteros et al. (vegeu «Mètodes»). Els residus Asp 6.44 i N7.45 es mostren en negreta, i els residus intercanviats es ressalten. Els límits de les hèlixs s han escollit d acord amb els observats en l estructura tridimensional de la rodopsina bovina.

AMBER 5. Aquest programari s ha mostrat capaç de reproduir canvis conformacionals del DNA i de les proteïnes (Duan et al., 1998). RESULTATS I DISCUSSIÓ TSHr com a model per l estudi del mecanisme d activació dels GPCR L alineament de les seqüències de TM6 i TM7 dels receptors de glicohormones (figura 2) permet veure els motius de seqüència conservats dins d aquesta família com, per exemple, Pro6.50 a TM6 o NPxxY a TM7. Mentre que aquests dos motius es troben altament conservats en tots els GPCR, l Asp6.44 només es troba conservat dins de la família

dels receptors de glicohormones; dins de la família de la rodopsina, aquesta posició està ocupada per una Phe o una Tyr en un 81 % dels casos. L estudi d aquest alineament revela un fet notable: en la seqüència corresponent al receptor DLGR1 de Drosophila la posició 6.44 està ocupada per una Asn en lloc de l Asp conservat dins d aquesta família. En aquesta mateixa seqüència la posició 7.49 ja no correspon a la Asn del motiu NPxxY, sinó que correspon a un Asp, és a dir, que aquestes dues posicions es troben intercanviades. Aquests tipus de mutacions correlacionades suggereixen una interacció directa entre ambdós residus (Larson et al., 2000). A més a més, en l estructura cristal·logràfica de la rodopsina, aquestes dues posicions es troben encarades i prou a prop per a poder per-

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 83

TÈCNIQUES BIOINFORMÀTIQUES 83

metre una interacció entre les cadenes laterals. Per altra banda, la mutació de Asp6.44 ha estat trobada en una serie d adenomes de la tiroide, i està associada a l activació constitutiva del receptor. Aixi doncs, s hipotetitza que la interacció entre Asp6.44 i Asn7.49 és important per a mantenir el receptor en la seva conformació inactiva. Per a comprovar aquesta hipòtesi es van portar a terme una sèrie de simulacions de dinàmica molecular dels dominis transmembrànics del receptor de TSH, i es van analitzar les interaccions entre els residus de TM6 i TM7. Durant tota la simulació del model de la proteïna nativa, es pot observar com Asp6.44 i Asn7.49 interaccionen mitjançant una interacció de pont d hidrogen. Aquesta interacció entre TM6 i TM7 en realitat involucra una xarxa més complexa d interaccions. Per exemple, Asn7.45, que es troba just per sobre de Asn7.49, interacciona també amb Asp6.44 i amb Asn7.49, mentre que Asp6.44 també forma un pont d hidrogen amb Ser3.39. Per a comprovar en el model la importància d aquestes interaccions en l estructura i l activitat del receptor s han portat a terme simulacions de dinàmica molecular sobre diferents mutants del TSHr, que eliminen o bé modifiquen aquestes interaccions (figura 3). D6.44A: L absència de la cadena polar en la posició 6.44 comporta l eliminació la interacció amb Asn7.49, cosa que obliga a una reestructuració de les cadenes laterals dels residus involucrats en les interaccions entre TM6 i TM7. Per exemple, en aquest mutant s observa com Asn7.49 rota per poder interaccionar amb Asp2.50. D6.44N: En aquest mutant, en canvi, es mantenen les interaccions entre TM6 i TM7, ja que les dues Asn en les posicions 6.44 i 7.49 poden interaccionar mitjançant enllaços de pont d hidrogen. A més a més, Asn7.49 forma una interacció addicional amb Thr6.43. N7.49A: En aquest mutant es perd la

interacció entre 7.49 i 6.44, ja que Ala i Asn no poden interaccionar mitjançant interaccions de pont d hidrogen. Malgrat això, TM6 i TM7 encara interaccionen mitjançant l enllaç de pont d hidrogen format entre Asp6.44 i Asn7.45. Asp6.44 també interacciona amb Thr6.43. N7.49D: En aquest mutant es produeix un canvi molt important en la xarxa d interaccions entre les hèlixs TM6 i TM7. La repulsió electrostàtica entre Asp6.44 i Asp7.49, ambdós aspàrtics en aquest mutant, fa que el primer s allunyi de TM7 i vagi cap a TM3, i formi dos ponts d hidrogen amb Ser3.36 i Ser3.39, mentre que el segon interacciona amb Asn7.45 i Thr6.43. D6.44N/N7.49D: En aquest mutant, que correspon al receptor de Drosophila, el patró de la xarxa de ponts d hidrogen està invertit respecte al de la proteïna nativa, però es mantenen les interaccions entre TM6 i TM7. L aspàrtic Asp7.49 interacciona amb Asn6.44 i Asn7.45. A més, Asn6.44 interacciona amb Asn7.45 i Ser3.39. Com s ha vist, hi ha diverses raons que apunten envers l existència d una interacció directa entre Asp6.44 i Asn7.49 en el TSHr. Es proposa com a hipòtesi que aquesta interacció entre Asp6.44 i Asn7.49 manté el receptor en la conformació inactiva, i que les mutacions que la trenquin portaran l activació espontània del receptor mutant. Per exemple, la mutació N7.49D provoca la repulsió electrostàtica entre les posicions 6.44 i 7.49, i provoca l activació del receptor. El receptor es podria tornar a l estat inactiu rescatant aquesta interacció mitjançant la mutació complementària D6.44N, i obtindríem aleshores la situació corresponent al receptor de Drosophila. Aquesta hipòtesi s ha comprovat experimentalment: la mutació N7.49D augmenta l activació constitutiva més de quinze vegades, mentre que la doble mutació N7.49D/D6.44N recupera l activitat basal de la proteïna nativa (Govaerts et al., 2001).

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 84

84 XAVIER DEUPÍ, MIREIA OLIVELLA I LEONARDO PARDO

Les simulacions de dinàmica molecular suporten aquesta hipotètica interacció, ja

que en la proteïna nativa la intenció Asn7.49Asp6.44 es manté durant tota la trajectòria, i

FIGURA 3. Estructures representatives dels diferents models de TSHr. Per a cada sistema s ha escollit una estructura representativa de la simulació de dinàmica molecular. Les etiquetes dels panells indiquen el mutant que es representa. Es mostra una visió local de les hèlixs TM6 i TM7, on les hèlixs es mostren com cintes acolorides i les cadenes laterals dels residus d interès com barres sòlides. Els àtoms de carboni es mostren en verd, els de nitrogen en blau, els d oxigen en vermell i els d hidrogen en blanc. Els enllaços per pont d hidrogen es representen mitjançant línies de punts blancs. Els residus estan numerats segons l esquema general de numeració de Ballesteros et al. (vegeu «Mètodes»).

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 85

TÈCNIQUES BIOINFORMÀTIQUES 85

això indica que aquesta interacció encaixa bé en el model tridimensional de la rodopsina. El mateix passa amb les simulacions del doble mutant D6.44N/N7.49D. Les simulacions, a més a més, poden ajudar a proposar una explicació als diversos fenotips associats amb els diversos mutants del TSHr. En la completa eliminació de la interacció Asn7.49-Asp6.44, per exemple, les mutacions N7.49D o D6.44A provoquen els majors augments de l activitat basal, mentre que l afebliment de la interacció només comporta un augment moderat de l activitat constitutiva, per exemple en els mutants D6.44N i D6.44N/N7.45D (Govaerts et al., 2001). Cal remarcar que, encara que el mutant N7.49A no està constitutivament activat i uneix el lligand amb la mateixa afinitat que la proteïna nativa, no es veu activat en absolut per la hormona. Això permet deduir que aquest residu duu a terme algun paper important durant l activació. Es proposa que, un cop el receptor s activa i es trenca la interacció entre Asp6.44 i Asn7.49, aquest últim residu s orientaria cap als residus Asp2.50-Asn1.50,

Estat inactiu inactiu Estat

altament conservats en els GPCR (figura 4). D aquesta manera s alteraria la xarxa d interaccions que estabilitza l estat inactiu del receptor, cosa que podria portar a una reorganització que provoqués canvis en l estructura global del receptor, com moviments de les TM3 i TM6, que portessin a l estabilització de la conformació activa. Asp6.44 només està conservat en la família dels receptors de glicohormones. En la resta de GPCR, el seu paper en el manteniment de l estat inactiu del receptor el podrien realitzar la Tyr o Phe que es troben en aquesta posició, mitjançant un tipus diferent d interacció amb els residus propers. Estudi de la influència del motiu TXP en l estructura del CCR5 L anàlisi de la seqüència aminoacídica dels receptors de quimiocines revela la presència d una Thr a la posició 2.56 i una Pro a 2.58 que constitueixen un motiu TXP altament conservat, que també es troba present en altres receptors de pèptids. En alguns ca-

Estat actiu actiu

N DN

FIGURA 4. Model del primer pas de l activació del TSHr. En estat inactiu l Asn7.49 interacciona amb Asp6.44 (no es mostra a la figura). La unió d un agonista o certes mutacions trenquen aquesta interacció, i fan que l Asn7.49 es reorienti cap als residus Asn1.50 i Asp2.50. D aquesta manera es reorganitzen les interaccions polars d aquesta regió del receptor, i es provoquen canvis que el porten a l activació.

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 86

86 XAVIER DEUPÍ, MIREIA OLIVELLA I LEONARDO PARDO

FIGURA 5. Alineament de les seqüències del fragment TM2 de diversos receptors de quimiocines i de la rodopsina bovina. Per claredat només es mostren seqüències corresponents a humans. Els residus estan numerats segons l esquema general de Ballesteros et al. (vegeu «Mètodes»). Els motius TXP i SXP estan marcats en negreta. S ha afegit a l alineament la seqüència corresponent al segment TM2 de la rodopsina bovina, cosa que permet observar l alt grau de conservació en la regió citosòlica.

sos la posició 2.56 és ocupada per una Ser, i forma, doncs, un motiu SXP (figura 5). En canvi, en la rodopsina, les posicions 2.56 i 2.57 estan ocupades per dues Gli. L alineament de seqüències també mostra com l estructura primària de les quimiocines a la part citosòlica és molt semblant a la de la rodopsina, però que a partir del motiu TXP aquestes presenten diferències en l estructura primària que ens apunta envers una estructura i funció característica en la part més extracel·lular del receptor. La cerca de motius TXP i SXP realitzada en el Protein Data Bank dóna com a resultat sis segments, que presenten un elevat angle d inclinació, de fins a 49º (taula 1). L angle d inclinació que provoca la Pro en solitari és

aproximadament d uns 25º; per tant, sembla que la presència de residus de Ser o Thr provoca un increment d aquest angle. Tot i així, el reduït nombre de casos fa que aquest resultat només sigui orientatiu. Per a entendre aquest canvi en la magnitud de l angle de doblegament s han emprat simulacions de dinàmica molecular d una hèlix a model que conté els motius AAP, TAP i SAP. Els resultats es mostren en la taula 2. Per cada motiu estructural es mostra la mitjana en graus i la desviació estàndard de l angle d inclinació obtingut en les simulacions. Cada valor s obté sobre una mostra de 100 estructures igualment espaciades durant la dinàmica. S ha utilitzat una anàlisi de la variància d un factor i una prova t de Dunnet unilateral per a determinar si els angles d inclinació dels diferents motius difereixen significativament del control AAP. Els asteriscs denoten diferències significatives respecte el control AAP (p < 0,001). Aquests resultats mostren de quina manera per al sistema AAP l angle d inclinació és d uns 20º, valor que concorda amb l obtingut en altres estudis de la distorsió provocada per la Pro (Barlow et al., 1988). En canvi, la presència de Ser o Thr dues posicions abans de la Pro fa que l angle d inclinació augmenti fins a 28-35º. Això és degut a la capacitat d aquests residus de formar un pont d hidrogen entre la seva cadena lateral i el l esquelet de l hèlix. A més a més, l anàlisi de les simulacions indica que la magnitud i la direcció de la inclinació de l hèlix a depenen de les conformacions de Ser i Thr. Aquestes conformacions es diferencien en l orientació de l hidroxil de la cadena lateral, que indueix diferents tipus de pont d hidrogen intramolecular (Gray et al., 1984). Així, en les conformacions g+ i g- de la Thr i g+ de la Ser el pont d hidrogen intramolecular es forma amb el carbonil en la posició i-4, mentre que en la conformació g- de la Ser es forma amb el carbonil en i-3 (figura 6a i 6b).

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 87

TÈCNIQUES BIOINFORMÀTIQUES 87

PDB id

Motiu

Segment helical

Posició Pro

Angle d inclinació

1VHB 1FIY 1B7E 1RVE 1AR1 1AR1

TVP TDP TDP SRP SLP SLP

A7®A20 823®856 349®379 B37®B59 A219®A248 B85®B103

A15 838 373 B50 A236 B98

28º 44º 49º 26º 35º 29º

TAULA 1. Angles d inclinació dels motius (T/S)XP trobats al Protein Data Bank.

Aquest petit canvi en la xarxa d interaccions que estabilitza l hèlix a provoca un gran canvi en la seva estructura global, incrementa l angle d inclinació fins a 35º i canvia la direcció del doblegament. Estructures representatives de les simulacions dels sistemes TAPg+ i SAP g- s han superposat sobre la de AAP, que s utilitza com a sistema de referència (figura 6c). Si s observa l estructura tridimensional de la rodopsina sembla que les dues glicines a les posicions 2.56 i 2.57 provoquen que TM2 s apropi a TM1, a causa de l increment de flexibilitat que proporcionen aquests residus. En aquesta regió, el CCR5 presenta un motiu TVP. La informació obtinguda de les simulacions del motiu TXP s ha utilitzat per a estudiar els canvis estructurals que pot provocar aquesta diferència en les seqüències. Sobre el segment TM2 de l estructura de la rodopsina s han Motiu

Angle de torsió

Desviació estàndard

AAP TAP g+ TAP gSAP g+ SAP gCAP g+ VAP

19.9º 28.4º* 26.6º* 30.1º* 35.0º* 31.3º* 21.0º

7.3 7.1 7.8 11.9 10.0 10.8 5.5

TAULA 2. Angle d inclinació mesurat en les diferents simulacions.

superposat les estructures resultants de les simulacions de les hèlixs a model amb els motius TAP i AAP (figura 6d). Aquest exercici de modelització permet observar que mentre que la presència d una prolina sola provocaria que TM2 s aproximés cap a la TM3, la presència de la TAP doblega encara més la TM2 cap a la TM3 i la dirigeix cap el centre del receptor. Així doncs sembla que el motiu TXP provocaria un acostament entre la TM2 i TM3, mitjançant la modulació del doblegament induït per Pro. Aquesta hipòtesi es veu reforçada per la presència a la part extracel·lular de la TM2 i TM3 de residus aromàtics, que podrien estabilitzar aquest acostament a través d interaccions de tipus hidrofòbic. CONCLUSIONS Mitjançant modelització molecular s ha estudiat el paper de la interacció entre els residus Asp6.44 i Asn7.49 del TSHr en el seu mecanisme d activació. Es planteja la hipòtesi que el trencament d aquesta interacció fa que Asn7.49 s orienti cap als residus Asp2.50Asn1.50, i desencadeni canvis en l estructura del receptor que portarien a l estabilització de la conformació activa. Per altra banda, s ha identificat el motiu de seqüència TXP en els receptors de quimiocines. L anàlisi de bases de dades d estructures i de simulacions de dinàmica mo-

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 88

88 XAVIER DEUPÍ, MIREIA OLIVELLA I LEONARDO PARDO

TAPg+ AAP

SAPg-

Ser g+

TM1 TM1

TM7 TM7

Rho

Ser g-

AAP

TM6

TAPg+ TM3 TM2 TM4

COi-4

TM5

COi-3

FIGURA 6. Influència del motiu TXP en el CCR5. a) Patró dels ponts d hidrogen intramoleculars. La figura representa la distància del pont d hidrogen (en Å) d acord amb el temps transcorregut en la simulació (en ps). Es pot veure com TAP g+ i g i SAP g+ formen el pont d hidrogen amb el residu i-4 (en taronja), mentre SAP g el forma amb i-3 (en blau). b) Representació del pont d hidrogen entre la cadena lateral i el carbonil del residu en i-4 (taronja) i el carbonil del residu en i-3 (blau). c) Efecte dels motius estructurals AAP i TAPg+ en la conformació de les hèlixs a. En la figura es mostren estructures representatives extretes de les simulacions de dinàmica molecular dels sistemes AAP (en groc) i TAPg+ (en vermell) en el context de l estructura tridimensional de la rodopsina bovina (Rho). Les dues hèlixs estan superposades sobre TM2 de la rodopsina per la regió citoplasmàtica, que és la que mostra un grau més alt de conservació de seqüència. d) Nou model del CCR5. Les hèlixs de rodopsina es mostren com cilindres de color turquesa, excepte la part extracel·lular de TM2, que es mostra com una cinta. La perspectiva de la figura correspon a la visió del receptor des de la part extracel·lular. Es pot veure com la influència de la Thr sobre la distorsió causada per la Pro fa que l hèlix es doblegui cap a l interior del receptor.

lecular mostren que aquest motiu té la capacitat d accentuar i modular el doblegament de les hèlixs a induït per la Pro. Amb aquesta informació s ha desenvolupat un nou mo-

del específic per al CCR5, on es pot veure com la part extracel·lular de TM2 es col·loca en el centre del receptor i molt a prop de TM3.

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 89

TÈCNIQUES BIOINFORMÀTIQUES 89

Així doncs, aquest treball representa un pas més envers la construcció de models tridimensionals de GPCR, que ens poden permetre entendre el funcionament d aquests receptors (Govaerts et al., 2001a; Govaerts et al., 2001b) i ens pot ajudar en el disseny de lligands selectius (López-Rodríguez et al., 2001). BIBLIOGRAFIA ALLEN, L. F.; R. J. LEFKOWITZ; M. G. CARON; S. COTECCHIA (1991). «G-protein-coupled receptor genes as protooncogenes: constitutively activating mutation of the alpha 1B-adrenergic receptor enhances mitogenesis and tumorigenicity». Proc. Natl. Acad. Sci. USA, núm. 88, pàg. 11354-11358. AQVIST, J.; V. LUZHKOV (2000). «Ion permeation mechanism of the potassium channel». Nature, núm. 404, pàg. 881-884. BALDWIN, J. M.; G. F. SCHERTLER; V. M. UNGER (1997). «An alpha-carbon template for the transmembrane helices in the rhodopsin family of G-proteincoupled receptors». J. Mol. Biol., núm. 272, pàg. 144-164. BALLESTEROS, J. A.; X. DEUPI; M. OLIVELLA; E. E. HAAKSMA; L. PARDO (2000). «Serine and threonine residues bend alpha-helices in the chi(1) = g(-) conformation». Biophys. J., núm. 79, pàg. 2754-2760. BALLESTEROS, J. A.; H. WEINSTEIN (1995). «Integrated methods for the construction of three dimensional models and computational probing of structurefunction relations in G-protein coupled receptors». Methods Neurosci., núm. 25, pàg. 366-428. BARLOW, D. J.; J. M. THORNTON (1988). «Helix geometry in proteins». J. Mol.Biol., núm. 201, pàg. 601-619. BERMAN, H. M.; J. WESTBROOK; Z. FENG; G. GILLILAND; T. N. BHAT; H. WEISSIG; I. N. SHINDYALOV; AND P. E. BOURNE (2000). «The Protein Data Bank». Nucleic Acids Res., núm. 28, pàg. 235-242. BLUNDELL, T.; D. BARLOW; N. BORKAKOTI; J. THORNTON (1983). «Solvent-induced distortions and the curvature of alpha-helices». Nature, núm. 306, pàg. 281-283. COSTAGLIOLA, S.; D. KHOO; G. VASSART (1998). «Production of bioactive amino-terminal domain of the thyrotropin receptor via insertion in the plasma membrane by a glycosylphosphatidylinositol anchor». FEBS Lett., núm. 436, pàg. 427-433. DA COSTA, C. R.; A. P. JOHNSTONE (1998). «Production of the thyrotrophin receptor extracellular domain as a glycosylphosphatidylinositol-anchored membrane protein and its interaction with thyrotrophin and

autoantibodies». J. Biol. Chem., núm. 273, pàg. 11874-11880. DUAN, Y.; P. A. KOLLMAN (1998). «Pathways to a protein folding intermediate observed in a 1-microsecond simulation in aqueous solution». Science, núm. 282, pàg. 740-744. DUPREZ, L.; J. PARMA; S. COSTAGLIOLA; J. HERMANS; J. VAN SANDE; J. E. DUMONT; G. VASSART (1997). «Constitutive activation of the TSH receptor by spontaneous mutations affecting the N-terminal extracellular domain». FEBS Lett., núm. 409, pàg. 469-474. GETHER, U. (2000). «Uncovering molecular mechanisms involved in activation of G protein-coupled receptors». Endocr. Rev., núm. 21, pàg. 90-113. GETHER, U.; B. K. KOBILKA (1998). «G protein-coupled receptors. II. Mechanism of agonist activation». J. Biol. Chem., núm. 273, pàg. 17979-17982. GOVAERTS, C.; C. BLANPAIN; X. DEUPI; S. BALLET; J. A. BALLESTEROS; S. J. WODAK; G. VASSART; L. PARDO; M. PARMENTIER (2001a). «The TXP motif in the second transmembrane helix of CCR5. A structural determinant of chemokine-induced activation». J. Biol. Chem., núm. 276, pàg. 13217-13225. GOVAERTS, C.; A. LEFORT; S. COSTAGLIOLA; S. J. WODAK; J. A. BALLESTEROS; J. VAN SANDE; L. PARDO; G. VASSART (2001b). «A conserved Asn in transmembrane helix 7 is an on/off switch in the activation of the thyrotropin receptor». J. Biol. Chem., núm. 276, pàg. 22991-22999. GRAY, T. M.; B. W. MATTHEWS (1984). «Intrahelical hydrogen bonding of serine, threonine and cysteine residues within alpha-helices and its relevance to membrane-bound proteins». J. Mol. Biol., núm. 175, pàg. 75-81. GURRATH, M. (2001). «Peptide-binding g protein-coupled receptors: new opportunities for drug design». Curr. Med. Chem., núm. 8, pàg. 1257-1299. HAMM, H. E. (1998). «The many faces of G protein signaling». J. Biol. Chem., núm. 273, pàg. 669-672. HORN, F.; J. WEARE; M. W. BEUKERS; S. HORSCH; A. BAIROCH; W. CHEN; O. EDVARDSEN; F. CAMPAGNE; G. VRIEND (1998). «GPCRDB: an information system for G protein-coupled receptors». Nucleic Acids Res., núm. 26, pàg. 275-281. JI, T. H.; M. GROSSMANN; I. JI (1998). «G protein-coupled receptors. I. Diversity of receptor-ligand interactions». J. Biol. Chem., núm. 273, pàg. 17299-17302. LARSON, S. M.; A. A. DI NARDO; A. R. DAVIDSON (2000). «Analysis of covariation in an SH3 domain sequence alignment: applications in tertiary contact prediction and the design of compensating hydrophobic core substitutions». J. Mol. Biol., núm. 303, pàg. 433-446. LEFF, P. (1995). «The two-state model of receptor activation». Trends Pharmacol. Sci., núm. 16, pàg. 89-97.

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 90

90 XAVIER DEUPÍ, MIREIA OLIVELLA I LEONARDO PARDO LIU, R.; W. A. PAXTON; S. CHOE; D. CERADINI; S. R. MARTIN; R. HORUK; M. E. MACDONALD; H. STUHLMANN; R. A. KOUP; N. R. LANDAU (1996). «Homozygous defect in HIV-1 coreceptor accounts for resistance of some multiply-exposed individuals to HIV-1 infection». Cell, núm. 86, pàg. 367-377. LÓPEZ-RODRÍGUEZ, M. L.; M. J. MORCILLO; E. FERNÁNDEZ; M. L. ROSADO; L. PARDO; K.-J. SCHAPER (2001). «Synthesis and Structure-Activity Relationships of a New Model of Arylpiperazines. 6. Study of the 5-HT1A Affinity/Selectivity by Classical Hansch Analysis, Artificial Neural Network, and Computational Simulation of Ligand Recognition». J. Med. Chem., núm. 44, pàg. 198-207. MARINISSEN, M. J.;J. S. GUTKIND (2001). «G-protein-coupled receptors and signaling networks: emerging paradigms». Trends Pharmacol. Sci., núm. 22, pàg. 368-376. MCGREGOR, M. J.; S. A. ISLAM; M. J. STERNBERG (1987). «Analysis of the relationship between side-chain conformation and secondary structure in globular proteins». J. Mol. Biol., núm. 198, pàg. 295-310. MULLER, C. E. (2000). «Adenosine receptor ligands-recent developments part I. Agonists». Curr. Med. Chem., núm. 7, pàg. 1269-1288. OLIVELLA, M.; X. DEUPI; C. GOVAERTS; L. PARDO (2002). «Influence of the Environment in the Conforma-

tion of a-Helices Studied by Protein Database Search and Molecular Dynamics Simulations». Biophys. J., núm. 82, pàg. 3207-3213 PALCZEWSKI, K.; T. KUMASAKA; T. HORI; C. A. BEHNKE; H. MOTOSHIMA; B. A. FOX; T. I. LE; D. C. TELLER; T. OKADA; R. E. STENKAMP; M. YAMAMOTO; M. MIYANO (2000). «Crystal structure of rhodopsin: A G protein-coupled receptor». Science, núm. 289, pàg. 739745. SAMAMA, P.; S. COTECCHIA; T. COSTA; R. J. LEFKOWITZ (1993). «A mutation-induced activated state of the beta 2-adrenergic receptor. Extending the ternary complex model». J. Biol. Chem., núm. 268, pàg. 4625-4636. SCHEER, A.; F. FANELLI; T. COSTA; P. G. DE BENEDETTI; S. COTECCHIA (1996). «Constitutively active mutants of the alpha 1B-adrenergic receptor: role of highly conserved polar amino acids in receptor activation». EMBO J., núm. 15, pàg. 3566-3578. UNGER, V. M.; P. A. HARGRAVE; J. M. BALDWIN; G. F. SCHERTLER (1997). «Arrangement of rhodopsin transmembrane alpha-helices». Nature, núm. 389, pàg. 203-206. WHITEHEAD, I. P.; I. E. ZOHN; C. J. DER (2001).«Rho GTPase-dependent transformation by G proteincoupled receptors». Oncogene, núm. 20, pàg. 15471555.

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 91

Biofísica molecular (Esteve Padrós, ed.) Treballs de la SCB. Vol. 53 (2002) 91-99

NANOTECNOLOGIES EN MECÀNICA MOLECULAR I CEL·LULAR MIREIA GRABULOSA, LARA BUSCEMI, JORDI ALCARAZ, XAVIER TREPAT, FELIX RICO I DANIEL NAVAJAS Unitat de Biofísica i Bioenginyeria. Departament de Ciències Fisiològiques I. Facultat de Medicina. Centre de Recerca en Bioelectrònica i Nanobiociència. - Universitat de Barcelona - IDIBAPS Adreça per a la correspondència: Daniel Navajas. Unitat de Biofísica i Bioenginyeria. Facultat de Medicina. Carrer de Casanova, 143. 08036 Barcelona. Tel.: 934 024 515. Fax: 934 024 516. Adreça electrònica: dnavajas@medicina.ub.es. Paraules clau: Nanobiotecnologia, microscopi de força atòmica, trampes òptiques, micropartícules magnètiques. Key words: Nanobiotechnology, atomic force microscopy, optical traps, magnetic beads. RESUM Algunes nanotècniques recents permeten la manipulació de biomolècules i cèl·lules en escala nanomètrica amb la mesura simultània de la força aplicada amb resolució de piconewtons. Aquestes escales de desplaçament i força, i la possibilitat de treballar en medi líquid, fan que siguin eines molt útils per a l estudi de les propietats mecàniques de molècules i cèl·lules individuals en condicions fisiològiques. Entre les tècniques més utilitzades es troben el microscopi de força atòmica, les trampes de làser i les microesferes magnètiques. En aquest treball es descriuen els principis de funcionament d aquestes tècniques en aplicacions biològiques i, en particular, en l estudi de la mecànica molecular i cel·lular. SUMMARY Recent nanotechnologies have enabled the manipulation of biomolecules and cells at the nanometric scale and the simultaneous measurement of the applied force with resolution in the piconewton range. These displacement and force scales and the possibility of working in liquid medium enhance the utility of these tools for studying the mechanical properties of single molecules and cells in physiological conditions. The most commonly used techniques

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 92

92 MIREIA GRABULOSA, LARA BUSCEMI, JORDI ALCARAZ, XAVIER TREPAT, FELIX RICO I DANIEL NAVAJAS

include the atomic force microscope, laser traps and magnetic beads. We describe the principles of these techniques in biological applications and, particularly, in the study of cell and molecular mechanics.

INTRODUCCIÓ Les propietats mecàniques de les cèl·lules són determinants de moltes funcions cel·lulars fonamentals, com la forma, integritat estructural, motilitat, mecanotransducció i expressió gènica. Per la seva banda, la mecànica cel·lular està determinada per les propietats mecàniques de les molècules que constitueixen l esquelet cel·lular i pels mecanismes moleculars de generació de força i moviment. Malgrat el seu paper essencial, les propietats i el comportament mecànic de les molècules i cèl·lules és encara poc conegut a causa de l absència, fins fa poc, de tècniques adients de manipulació a escala molecular i cel·lular. El recent desenvolupament de nanotècniques que permeten manipular la matèria en l escala del nanòmetre i mesurar forces en l escala del piconewton ha obert noves possibilitats per a la recerca de la mecànica molecular i cel·lular. A més, aquestes tècniques poden treballar en medi líquid, i això les converteix en eines especialment adequades per a la recerca molecular i cel·lular en condicions fisiològiques. Amb part d aquestes nanotècniques es manipula la matèria per contacte directe d una sonda mecànica. Amb d altres es fa la manipulació mitjançant l aplicació de forces generades per camps òptics o magnètics externs. La nanotècnica de manipulació mecànica amb una sonda de contacte més utilitzada actualment és el microscopi de força atòmica (MFA). Entre les tècniques de camp extern cal destacar la manipulació de microesferes magnètiques mitjançant camps magnètics i les denominades trampes òptiques, que manipulen microesferes transparents

amb feixos de làser. En aquest treball es descriu el principi de funcionament d aquestes tècniques en la seva aplicació biològica i, en particular, en l estudi de la mecànica molecular i cel·lular. MICROSCOPI DE FORÇA ATÒMICA El microscopi de força atòmica va ser inventat per Binnig i Quate (1986). L MFA utilitza un microflexor microfabricat amb silici com a sonda per a explorar la superfície de

FIGURA 1. Imatges de microflexors de microscopi de força atòmica (MFA) obtingudes amb microscòpia electrònica de rastreig. A dalt: imatge de microflexors rectangulars i triangulars de diverses dimensions. A sota: detall de la punta d exploració d una sonda rectangular.

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 93

NANOTECNOLOGIES EN MECÀNICA MOLECULAR I CEL·LULAR 93

la mostra (figura 1). A l extrem del microflexor es troba una punta molt fina amb un radi de contacte de l ordre de 10 nm. Habitualment, la mostra per explorar se situa sobre un actuador piezoelèctric que permet un desplaçament en les tres direccions de l espai (figura 2). La força realitzada per la sonda sobre la superfície de la mostra es mesura enfocant un feix de làser (1-5 mW) sobre l extrem del microflexor. El feix reflectit es fa incidir en un fotodetector segmentat. Quan no hi ha contacte entre la punta de la sonda i la superfície de la mostra, el feix reflectit incideix en el centre del fotodetector i la diferència de corrent entre els dos segments és nul·la. Apropant la mostra a la sonda amb el piezoelèctric s estableix contacte i la sonda es flexiona i provoca un desviament del feix de làser cap a un dels segments del fotodetector, i en resulta una distribució asimètrica de llum. La diferència de corrent entre els dos segments permet determinar el grau de flexió de la sonda i, coneixent la seva constant elàstica, la força aplicada. Aquest sistema de detecció òptica es pot utilitzar en medi líquid, la qual cosa permet estudiar biomolècules i cèl·lules en condicions fisiològiques. Els actuadors piezoelèctrics actuals permeten desplaçar la sonda en els tres eixos amb resolució (RMS) subnanomè-

fotodetector fotodetector

làser làser

microflexor microflexor

piezoelèctric piezoelèctric

FIGURA 2. Principi de funcionament del microscopi de força atòmica.

FIGURA 3. Microflexor triangular en contacte amb la superfície d una cèl·lula epitelial bronquial humana (BEAS2B) en cultiu. Imatge obtinguda amb un microscopi òptic invertit amb camp brillant.

trica en un rang de ~ 100 µm en el pla de la mostra (X-Y) i ~ 10 µm en alçada (Z) . A més, utilitzant els microflexors més flexibles disponibles actualment (~ 0,01 nN/nm) es poden mesurar forces amb resolució de l ordre del pN. En aplicacions biològiques és important visualitzar la sonda i la mostra simultàniament. Això es pot aconseguir muntant l MFA sobre la platina d un microscopi òptic invertit. En aquest cas és convenient acoblar la sonda al piezoelèctric, per a efectuar l exploració desplaçant la sonda sobre la superfície de la mostra mentre aquesta es manté centrada en el camp visual del microscopi (figura 3). Inicialment l aplicació biològica més freqüent de l MFA va ser l obtenció d imatges de biomolècules i cèl·lules adherents (Le Grimellec et al., 1998; Muller et al., 1995 ). Per a obtenir imatges topogràfiques de la superfície es desplaça la mostra en el pla X-Y mentre un sistema de retroalimentació ajusta el desplaçament vertical (Z) per mantenir la força en un nivell constant prefixat (figura 4). No obstant això, com que el sistema de retroalimentació no té resposta instantània, la sonda no pot mantenir amb precisió la

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 94

94 MIREIA GRABULOSA, LARA BUSCEMI, JORDI ALCARAZ, XAVIER TREPAT, FELIX RICO I DANIEL NAVAJAS

5 Pm FIGURA 4. Imatge de MFA d una cèl·lula epitelial bronquial humana en cultiu. Esquerra: Imatge de topografia de superfície. Dreta: Imatge d error.

força prefixada. Per tant, la imatge topogràfica de la superfície de la mostra no és obtinguda realment amb un nivell de força constant. La imatge d error, calculada en cada punt com la diferència entre la força real i la prefixada, mostra detalls fins de la morfologia de la superfície o canvis locals de la duresa cel·lular. Aquests s interpreten com el reflex d estructures del citosquelet o orgànuls interiors. Cada vegada és més freqüent utilitzar l MFA per a investigar les propietats mecàniques de biomolècules i cèl·lules individuals. En lloc d explorar la superfície de la mostra amb força constant es poden estudiar les propietats mecàniques cel·lulars prement suaument la sonda en un punt de la superfície i mesurant la relació força-desplaçament (F-Z) (figura 5). Analitzant la relació F-Z amb un model elàstic apropiat, que tingui en compte el progressiu augment de l àrea de contacte entre la punta del microflexor i la superfície, es pot determinar el mòdul de Young (E) de la mostra (A-Hassan et al., 1998; Weisenhorn et al., 1993). La figu-

ra 5 mostra la corba de retracció per sota de la corba de compressió. Aquesta histèresi reflecteix una dissipació d energia i, per tant, la cèl·lula presenta propietats viscoelàstiques. També pot observar-se que la corba de separació mostra una regió de forces negatives que indica l existència d adhesió inespecífica de la punta de la sonda amb la membrana cel·lular. El comportament viscoelàstic de la cèl·lula i, en particular, la separació entre l energia emmagatzemada i dissipada i la seva dependència amb la velocitat pot determinar-se més acuradament a partir de corbes F-Z obtingudes fent oscil·lar sinusoïdalment la sonda al voltant d un valor de força o desplaçament prefixat (figura 6). Aquest procediment permet calcular el mòdul elàstic complex (G = G + iG ; Ö̀-̀1; Mahaffy et al., 2000). La part real es denomina mòdul d emmagatzematge (G ) i caracteritza el comportament elàstic de la mostra. La part imaginària o mòdul de pèrdua (G ) reflecteix la viscositat o fricció interna de la cèl·lula. En les mesures dinàmiques efectuades

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 95

NANOTECNOLOGIES EN MECÀNICA MOLECULAR I CEL·LULAR 95

FF(nN) (nN)

33 22 11 00

1 -1

1000 2.000 2000 3.000 3000 4.000 4000 5.000 5000 6.000 6000 1.000 Z (nm) Z (nm)

FIGURA 5. Corbes força-desplaçament registrades en una cèl·lula BEAS-2B.

en medi líquid cal tenir en compte la força de fricció hidrodinàmica que és conseqüència del moviment relatiu del microflexor i el medi líquid. Aquest artefacte es pot corregir fàcilment estimant el coeficient hidrodinàmic del microflexor en contacte a partir de mesures oscil·latòries del coeficient de fricció efectuades a diferents separacions de la superfície de contacte (Alcaraz et al., 2002). En l obtenció d imatges i en la mesura dels mòduls elàstic o viscoelàstic l exploració de la mostra es realitza en condicions de força positiva en les quals la punta del microflexor comprimeix la mostra. Una alternativa és el recobriment de la punta del microflexor amb un lligand específic d una molècula d interès. Així, quan s estableix contacte es formen unions entre les molècules que recobreixen la punta i la molècula estudiada. Aquest procediment permet estudiar-ne les propietats mecàniques fixant un extrem de la molècula a un substrat i registrant les corbes força-extensió mentre s estira l altre extrem amb la punta del microflexor. Aquest mètode, denominat espectroscòpia de força, ha permès mesurar l elasticitat molecular i investigar el mecanisme de desplegament de proteïnes (Fisher et al.,

1999). Recobrint la sonda amb un lligand d un receptor específic i separant-la fins a produir el trencament de la unió es poden determinar les forces de ruptura de l enllaç lligand-receptor (Merkel et al., 1999; Willemsen et al., 2000). Els experiments d adhesió molecular es poden efectuar també amb receptors de membrana en cèl·lules en cultiu. La figura 7 mostra corbes d aproximació i retracció obtingudes en una cèl·lula BEAS-2B en cultiu recobrint la punta de la sonda amb un pèptid sintètic que conté la seqüència arginina-glicina-àcid aspàrtic (RGD), i que s uneix específicament a integrines de la membrana. Les corbes de retracció mostren zones de forces negatives d adhesió amb dents de serra. Els bruscs salts de força s associen a ruptura d enllaços intermoleculars. TRAMPES DE LÀSER La sonda de l MFA és una eina molt útil per a manipular micropartícules, biomolècules o cèl·lules. No obstant això, aquesta tècnica requereix el contacte de la sonda amb l objecte per manipular. Això representa una limitació quan no hi ha accés directe a 0.3 0,3 9.3 Hz

0.2 0,2

1.0 Hz

0.1 0,1

FF (nN) (nN)

0.12 Hz

0.0 0,0 -0.1 -0,1 -0.2 -0,2 -0.3 -0,3

20 20

40 40

60 60

(nm) ZZ(nm)

80 80

100 100

120 120

FIGURA 6. Resposta oscil·latòria de la cèl·lula de la figura 5 obtinguda a diferents freqüències al voltant d un punt de força de ~ 1 nN.

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 96

96 MIREIA GRABULOSA, LARA BUSCEMI, JORDI ALCARAZ, XAVIER TREPAT, FELIX RICO I DANIEL NAVAJAS 0.5 0,5 0.4 0,4

FF(nN) (nN)

0.3 0,3 0.2 0,2 0.1 0,1 0.0 0,0 -0.1 -0,1

0 0

500 500

1000 1.500 1500 2000 2500 3.000 3000 3.500 3500 1.000 2000 2.500

(nm) ZZ(nm)

FIGURA 7. Corbes força-desplaçament obtingudes en una cèl·lula BEAS-2B recobrint la punta de la sonda de MFA amb un pèptid sintètic que conté RGD. La corba de separació mostra salts (fletxes) que corresponen a la ruptura d enllaços amb receptors de membrana.

l objecte com, per exemple, en estudiar estructures intracel·lulars. Alternativament, la manipulació es pot fer utilitzant camps externs. En general, això requereix la unió prèvia d una partícula micromètrica a l objecte per manipular. Les trampes de làser es basen en les forces aplicades en una microesfera transparent per la pressió de radiació produïda per un feix de làser enfocat (Ashkin et al., 1986; Ashkin, 1997; Wuite et al., 2000). La figura 8 descriu el principi d utilització d aquesta tècnica per a la manipulació molecular i cel·lular. Un feix de làser travessa un objectiu de microscopi d elevada obertura numèrica i provoca un fort gradient de llum en el focus de l objectiu. Una microesfera transparent centrada en el focus està sotmesa a una força resultant nul·la. Si l esfera, però, se separa lateralment de l eix, la pressió de radiació provoca una força resultant dirigida cap a l eix òptic que tendeix a retornar l esfera al centre focal. D aquesta manera la microesfera es troba «atrapada» pel gradient òptic. Desplaçant la posició del feix de làser es pot moure l esfera atrapada amb resolució nanomètrica. Recobrint la microesfera amb un lligand ade-

quat, la trampa de làser es converteix en una eina molt útil per a manipular biomolècules i cèl·lules individuals (Bustamante et al., 2000). També és possible manipular estructures intracel·lulars introduint la microesfera a l interior de la cèl·lula. Per a estudiar la mecànica molecular i cel·lular no solament cal provocar desplaçaments controlats sinó també conèixer simultàniament la força aplicada. En el cas que l esfera estigui sotmesa a una força, es desplaçarà del centre de la trampa fins que la força òptica equilibri la força aplicada per l objecte manipulat. Així, la separació de la microesfera respecte al centre de la trampa indica la força aplicada. El desplaçament de la microesfera es pot determinar agafant la imatge microscòpica amb una càmera digital (CCD) d alta resolució i calculant el centre geomètric amb algorismes de processament d imatge. Amb aquests algorismes es pot mesurar el desplaçament del centre geomètric de l esfera amb resolució nanomètrica. Per petites separacions el desplaçament és proporcional a la força aplicada. Calibrant prèviament la relació força-desplaçament de la trampa, es poden mesurar forces amb resolució del pN. Aug-

microesfera

objectiu

FIGURA 8. Trampa òptica. Esquerra: microesfera situada al punt focal amb una força resultant nul·la. Dreta: microesfera sotmesa a una força lateral F que la desplaça de l eix òptic fins que la força de la trampa FT equilibra F.

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 97

NANOTECNOLOGIES EN MECÀNICA MOLECULAR I CEL·LULAR 97

FIGURA 9. Imatge obtinguda amb microscopi òptic invertit amb camp brillant d un cultiu cel·lular de BEAS-2B al qual s han adherit a la membrana cel·lular microesferes ferromagnètiques (5 µm) (fletxes) recobertes amb pèptid-RGD.

mentant convenientment la intensitat del feix de làser, el rang de forces pot estendre s fins a ~ 102 pN. No obstant això, cal tenir en compte que una intensitat de llum molt elevada pot causar danys o alteracions en la mostra (Ashkin, 1997). MICROPARTÍCULES MAGNÈTIQUES A causa que, excepte en pocs casos, les biomolècules i cèl·lules no tenen propietats magnètiques, és possible manipular micropartícules magnètiques aplicant forces elevades (nN) amb camps magnètics externs sense provocar cap efecte apreciable en la mostra. La figura 9 mostra cèl·lules BEAS-2B en cultiu sobre les quals s han adherit microesferes ferromagnètiques de 5 µm de diàmetre recobertes amb pèptid-RGD. En primer lloc, les esferes són sotmeses breument (~ 1 ms) a un camp magnètic horitzontal molt intens (~ 100 mT) que magnetitza totes

les esferes en la mateixa direcció i produeix un moment magnètic remanent. Si a continuació s aplica un camp magnètic uniforme vertical d intensitat més baixa (~ 2 mT), per a no remagnetitzar les esferes, es provoca un moment de torsió que les fa girar respecte el seu punt d unió amb la membrana. La relació entre el moment de torsió aplicat i el gir produït en l esfera permet estudiar el comportament mecànic cel·lular i en particular les propietats mecàniques del citoesquelet i els processos de mecanotransdució (Fabry et al., 2001; Maksym et al., 2000; Puig-deMorales et al., 2001). Fent funcionals les esferes amb diferents lligands es poden explorar distintes vies de transmissió de forces a través de la membrana cel·lular. En lloc d un moment de torsió, es pot induir una força de translació en les esferes sotmetent-les a l acció d un gradient de camp magnètic aplicat en la direcció del seu moment remanent (Bausch et al., 1999). Els camps magnètics també permeten manipular microesferes paramagnètiques (Smith et al., 1992; Guttemberg et al., 2000). Els materials paramagnètics no tenen magnetisme remanent significatiu i només presenten el moment magnètic induït per l acció d un camp magnètic extern. Per a desplaçar esferes paramagnètiques cal aplicar un camp magnètic no uniforme que generi una força de translació en la direcció del gradient magnètic (Ziemann et al., 1994). Atès que les esferes paramagnètiques tenen un eix preferent de magnetizació, també és possible generar moments de torsió en girar el camp magnètic extern (Strick et al., 1996). Si bé es poden generar moments de torsió i forces de translació tant en esferes paramagnètiques com ferromagnètiques, aquestes últimes exhibeixen una magnetització per unitat de volum notablement superior, per la qual cosa les forces generades poden ser d ordres de magnitud superiors. Un aspecte remarcable de la manipulació magnètica és la possibili-

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 98

98 MIREIA GRABULOSA, LARA BUSCEMI, JORDI ALCARAZ, XAVIER TREPAT, FELIX RICO I DANIEL NAVAJAS

tat d aplicar el mateix camp i gradient sobre tota una zona d estudi, per la qual cosa totes les esferes estan sotmeses simultàniament a la mateixa força o moment. Això, en contraposició a les trampes de làser, permet manipular simultàniament diverses partícules. CONCLUSIONS La microscòpia de força atòmica i la manipulació de microesferes amb camps externs han obert noves possibilitats a l estudi de les propietats mecàniques de molècules i cèl·lules en condicions fisiològiques. Aquestes tècniques no solament permeten la manipulació espacial amb resolució nanomètrica, sinó també la mesura simultània de la força aplicada en resolució del pN, que són les escales de desplaçament i força rellevants en biomolècules i cèl·lules. A més, es poden mesurar en temps real els canvis induïts per fàrmacs o altres tractaments experimentals. Cal tenir en compte, no obstant això, que cada tècnica presenta avantatges i limitacions respecte de les altres, per la qual cosa cal triar en cada cas la que és més adient a les condicions experimentals concretes. Quan la mostra es pot manipular per contacte directe, l MFA és una eina molt útil. Pot controlar amb precisió tant el desplaçament de la sonda com la força aplicada. El control de desplaçament és en les tres dimensions i amb resolució nanomètrica, però en un rang limitat (~ 10 µm en Z, i ~ 100 µm en X-Y). El rang de forces de la sonda és molt ampli en Z, i va des del pN a desenes de nN. No obstant això, és difícil mesurar forces paral·leles a la sonda (X-Y). Amb les pinces òptiques és complicat controlar amb precisió la força i el desplaçament. El rang de desplaçament en el pla X-Y és molt ampli i es poden aplicar forces amb una resolució molt elevada (inferior al pN) en el pla perpendicular al feix, però, la manipulació en la direcció de l eix òptic és difícil. Per a no danyar la

mostra, la força màxima es limita a 10-100 pN. Amb les microesferes magnètiques es controla directament la força amb molta precisió (~ 10-3 pN), i és complicat controlar-ne el desplaçament. No és fàcil arribar a forces superiors a uns pocs pN, però és la tècnica més útil per a aplicar moments de torsió. Com que la força es pot aplicar simultàniament a un nombre elevat de partícules, s obté ràpidament informació estadística de l experiment. A més, el fet de no utilitzar llum de làser permet la manipulació magnètica amb visualització simultània mitjançant microscòpia convencional i de fluorescència. Futures millores d aquestes tècniques com, per exemple, el desenvolupament de microflexors piezoresistius d alta sensibilitat i susceptibles de treballar en medi líquid podran substituir el sistema de detecció per làser i simplificaran substancialment l aplicació de l MFA en estudis en biomolècules i cèl·lules vives. S obren també noves perspectives amb la combinació de les nanotècniques de manipulació amb les tècniques de fluorescència de molècules individuals (Ishijima i Yanagida, 2001). La possibilitat de manipular estructures cel·lulars visualitzant simultàniament canvis dinàmics a escala molecular ha d aportar un avenç significatiu en la comprensió del comportament mecànic cel·lular. AGRAÏMENTS Aquest treball ha estat finançat en part per la Dirección General de Enseñanza Superior e Investigación Científica (PM980027). BIBLIOGRAFIA A-HASSAN, E.; W. F. HEINZ; M. D. ANTONIK; N. P. D COSTA; S. NAGESWARAN; C. SCHOENENBERG; J. H. HOH

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 99

NANOTECNOLOGIES EN MECÀNICA MOLECULAR I CEL·LULAR 99 (1998). «Relative microelastic mapping of living cells by atomic force microscopy». Biophys. J., núm. 74, pàg. 1564-1578. ALCARAZ, J.; L. BUSCEMI; M. PUIG-DE-MORALES; J. COLCHERO; A. BARÓ; D. NAVAJAS (2002). «Correction of microrheological measurements of soft samples with atomic force microscopy for the hydrodynamic drag on the cantilever». Langmuir, núm. 18, pàg. 716-721. ASHKIN, A.; J. DZIEDZIC; J. BJORKHOLM; S. CHU (1986). «Observation of a single-beam gradient force optical trap for dielectric particles». Optical Lett, núm. 11, pàg. 288-290. ASHKIN, A. (1997). «Optical trapping and manipulation of neutral particles using lasers». Proc. Natl. Acad. Sci.USA, núm. 94, pàg. 4853-4860. BAUSCH, A. R.; W. MÖLLER; E. SACKMANN (1999). «Measurement of local viscoelasticity and forces in living cells by magnetic tweezers». Biophys, J. núm. 76, pàg. 573-579. BINNIG, G.; C. F. QUATE (1986). «Atomic force microscope». Phys. Rev. Lett., núm. 56, pàg. 930-933. BUSTAMANTE, C.; J. C. MACOSKO; G. J. L. WUITE (2000). «Grabbing the cat by the tail: manipulating molecules one by one». Nat. Rev. Mol. Cell. Biol., núm. 1, pàg. 130-136. FABRY, B., G. N. MAKSYM; J. P. BUTLER; M. GLOGAUER; D. NAVAJAS; J. J. FREDBERG (2001). «Scaling the microrheoloy of living cells». Phys. Rev. Lett, núm. 87, pàg. 148102. FISHER, T. E.; A. F. OBERHAUSER; M. CARRION-VAZQUEZ, P. E. MARSZALEK; J. M. FERNANDEZ (1999). «The study of protein mechanics with the atomic force microscope». Trends Biochem. Sci., núm. 24, pàg. 379-384. GUTTEMBERG, Z.; A. R. BAUSH; B. HU; R. BRUINSMA; L. MORODER; E. SACKMANN (2000). «Measuring ligandreceptor unbinding forces with magnetic beads; molecular leverage». Langmuir, núm. 16, pàg. 89848993. ISHIJIMA, A.; T. YANAGIDA (2001). «Single molecule nanobioscience». Trends Biochem. Sci., núm. 26, pàg. 438444. LE GRIMELLEC, C.; E. LESNIEWSKA; M. C. GIOCONDI; E. FINOT; V. VIE; J. P. GOUDONNET (1998). «Imaging of the sur face of living cells by low-force contact-mode atomic force microscopy». Biophys. J., núm. 75, pàg. 595-703.

MAHAFFY, R. E.; C. K. SHIH; F. C. MACKINTOSH; J. KAS (2000). «Scanning probe-based frequency-dependent microrheology of polymer gels and biological cells». Phys. Rev. Lett., núm. 85, pàg. 880-883. MAKSYM, G. N.; B. FABRY; J. P. BUTLER; D. NAVAJAS; D. J. TSCHUMPERLIN, J. LAPORTE; J. J. FREDBERG (2000). «Mechanical properties of cultured human airway smooth muscle cells from 0.05 to 0.4 Hz». J. Appl. Phsyiol., núm. 89, pàg. 1619-1632. MERKEL, R.; P. NASSOY, A. LEUNG, K. RITCHIE, E. EVANS (1999). «Energy landscapes of receptor-ligand bonds explored with dynamic force spectroscopy». Nature, núm. 397, pàg. 50-53. MULLER, D. J.; F. A. SCHABERT; G. BULDT; A. ENGEL (1995). «Imaging purple membranes in aqueous solutions at sub-nanometer resolution by atomic force microscopy». Biophys. J., núm. 68, pàg.1681-1686. PUIG-DE-MORALES, M.; M. GRABULOSA; J. ALCARAZ; J. MULLOL; G. N. MAKSYM; J. J. FREDBERG; D. NAVAJAS (2001). «Measurement of cell microrheology by magnetic twisting cytometry with frequency domain demodulation». J. Appl. Physiol., núm. 91, pàg.1152-1159. SMITH, S. B.; L. FINZI; C. BUSTAMANTE (1992). «Direct mechanical measurements of the elasticity of single DNA molecules by using magnetic beads». Science, núm. 258, pàg. 1122-1126. STRICK, T. R.; J. F. ALLEMAND; D. BENSIMON; A. BENSIMON; V. CROQUETTE (1996). «The elasticity of a single supercoiled DNA molecule». Science, núm. 271, pàg. 1835-1837. WEISENHORN, A. L.; M. KHORSANDI; S. KASAS; V. GOTZOS; H. J. BUTT (1993). «Deformation and height anomaly of soft surfaces studied with an AFM». Nanotechnology, núm. 4, pàg. 106-113. WILLEMSEN, O. H.; M. M. E. SNEL; A. CAMBI; J. GREVE; B. G. DE GROOTH; C. G. FIGDOR (2000). «Biomolecular interactions measured by atomic force microscopy». Biophys. J., núm. 79, pàg. 3267-3281. WUITE, G. J. L.; R. J. DAVENPORT; A. RAPPAPORT, C. BUSTAMANTE (2000). «An integrated laser trap/flow control video microscope for the study of single biomolecules». Biophys. J., núm. 79, pàg. 1155-1157. ZIEMANN, F.; J. RÄDLER; E. SACKMANN (1994). «Local measurements of viscoelastic moduli of entangled actin networks using an oscillating magnetic bead microrheometer». Biophys. J., núm. 66, pàg. 2210-2216.

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 100

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 101

Biofísica molecular (Esteve Padrós, ed.) Treballs de la SCB. Vol. 53 (2002) 101-113

ESTRUCTURA DE PROTEÏNES PER RESSONÀNCIA MAGNÈTICA NUCLEAR AMB LA UTILITZACIÓ D ACOBLAMENTS DIPOLARS RESIDUALS MIQUEL PONS Departament de Química Orgànica, Universitat de Barcelona. Adreça per a la correspondència: Miquel Pons. Departament de Química Orgànica. Universista de Barcelona. Carrer de Martí i Franquès, 1-11. 08028 Barcelona. Adreça electrònica: mpons@qo.ub.es. Paraules clau: RMN, acoblaments dipolars, anisotropia, orientació, estructura de proteïnes. Keywords: NMR, dipolar couplings, anisotropy, orientation, protein structure. RESUM La determinació de l estructura de proteïnes per mitjà de la ressonància magnètica nuclear ha experimentat un salt important amb la introducció de l ús de les constants d acoblaments residuals mesurades en mostres parcialment orientades. Aquestes mesures proporcionen informació angular a llarga distància que complementa la informació de curta distància derivada dels nOe. Aquesta informació millora la precisió de les estructures obtingudes i, en general, millora la concordança entre les estructures de ressonància magnètica nuclear i les obtingudes per difracció de raigs X. També són especialment importants en l estudi de proteïnes amb diversos dominis, en els quals la seva orientació relativa és difícil d obtenir per mètodes convencionals de RMN, i que sovint està afectada per l empaquetament cristal·lí. Els acoblaments dipolars residuals són prometedors per a la determinació ràpida d estructures en el context dels projectes de genòmica estructural. Els acoblaments dipolars residuals contenen també informació sobre la dinàmica en escales de temps que arriben als mil·lisegons. SUMMARY The use of residual dipolar couplings has had an enormous impact on the determination of protein structures by NMR. Residual dipolar couplings can be measured in partially

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 102

102 MIQUEL PONS

oriented molecules and provide long-range angular information that is complementary to that obtained from nOe measurements. Residual dipolar coupling restraints lead to more precise structures and, in general, closer to those obtained by X-ray. On the other hand, residual dipolar couplings provide information that allows the determination of the relative orientation of domains in multidomain proteins in solution. This information is difficult to obtain by conventional NMR methods and is often affected by crystal packing. Residual dipolar couplings show promise in high-throughput structure determinations in the context of structural genomics projects. Dynamic information contained in residual dipolar couplings extents to the millisecond timescale, that is not well characterized by relaxation measurements. INTRODUCCIÓ. DETERMINACIÓ D ESTRUCTURES DE MACROMOLÈCULES PER RESSONÀNCIA MAGNÈTICA NUCLEAR La ressonància magnètica nuclear (RMN) és una tècnica ben establerta per a la determinació de l estructura tridimensional de macromolècules que, en contrast amb les tècniques de difracció, no requereix l obtenció de cristalls. Aquesta afirmació denota una diferència que va més enllà d una qüestió experimental i reflecteix les profundes diferències en la forma com les dues tècniques RMN i difracció de raigs X aconsegueixen extreure la informació sobre la distribució espacial dels àtoms que componen la macromolècula estudiada. En una mostra cristal·lina la informació s extreu de les dades obtingudes a partir d experiments en què es mesura la difracció d un feix de radiació que incideix en una direcció ben definida respecte al cristall i, per tant, respecte a les molècules que formen la xarxa cristal·lina. Tots i cada un dels punts de la xarxa cristal·lina contribueixen a les intensitats dels feixos difractats i la seva anàlisi proporciona una imatge global de la distribució de la densitat electrònica que permet, finalment, localitzar la posició dels àtoms i deduir l estructura tridimensional de la molècula.

També, en un experiment clàssic de RMN, les molècules es troben totalment desordenades i en constant moviment isotròpic, és a dir, sense direccions preferents en el si de la dissolució. Això implica que la informació estructural no pot provenir de mesures que impliquin una direcció externa, com en el cas de la difracció de raigs X, sinó que s ha de basar en relacions internes, dins de la molècula, que es mantenen constants en el temps tot i que la molècula pugui girar o moure s en qualsevol direcció dins de la dissolució. Aquestes relacions poden ser les distàncies entre dos àtoms o els angles definits per tres o més àtoms. Diferents paràmetres mesurables amb la utilització d experiments de RMN contenen informació geomètrica rellevant: l efecte nuclear Overhauser (nOe) depèn, entre altres coses, de la distància entre parells de nuclis, i les constants d acoblament escalars a tres enllaços depenen de l angle diedre definit pels quatre nuclis implicats. De l anàlisi dels corresponents experiments de RMN, se n extreu un gran nombre d aquestes relacions que corresponen a restriccions que l estructura correcta de la macromolècula ha de complir. Coneguda la connectivitat (l estructura primària) aquest conjunt de restriccions només el pot complir un conjunt d estructures, idealment molt properes entre elles, que defineixen «l estructura» tal com la veu la RMN.

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 103

ESTRUCTURA DE PROTEÏNES PER RESSONÀNCIA MAGNÈTICA NUCLEAR 103

El grau de definició de l estructura depèn de la fracció de l espai conformacional de la macromolècula que aquestes restriccions permeten descartar. L observació d efecte nOe entre nuclis que es troben allunyats entre si a la seqüència és especialment important a l hora de definir el plegament de la macromolècula. Malauradament, les característiques del procés físic que origina l nOe fan que la seva intensitat decreixi molt ràpidament amb la distància i que la seva observació sigui impossible si els nuclis implicats estan separats per més de quatre o cinc Angstroms. Així, la informació sobre el plegament global de la proteïna s obté a partir d observacions de caràcter local. En el cas d estructures globulars, l existència d una xarxa espessa de restriccions assegura una bona descripció de la forma global. A més, per a estructures esteses, en què els contactes directes només tenen lloc entre un nombre reduït d àtoms, l acumulació d errors, o bé la simple absència de dades pot donar lloc a estructures que, tot i ser localment correctes, no proporcionen una bona definició de l estructura global. En el camp de les proteïnes, això passa sovint en el cas d estructures multidomini en què els contactes entre els diferents dominis poden ser limitats i difícils de detectar. L ACOBLAMENT DIPOLAR La interacció dipolar entre dos nuclis amb moment magnètic no nul s origina per l efecte que el camp magnètic local generat per cada un dels nuclis té sobre l altre. En el cas d un parell de nuclis amb espín 1/2, que poden existir en dos estats (a i b, que podem associar a un moment magnètic dirigit a favor o en contra del camp extern) aquesta interacció es manifesta experimentalment com un desdoblament del senyal de RMN dels dos nuclis. Aquesta interacció depèn de l invers del cub de la distància i, atès que el

moment magnètic de cada un dels nuclis està sempre dirigit en la direcció del camp magnètic extern, també de l orientació del vector internuclear respecte al camp extern.

E T

FIGURA 1. L acoblament dipolar. La freqüència dels senyals de RMN depèn de la diferència d energia entre els estats a i b. Si hi ha un nucli proper, la diferència d energia serà diferent si aquest veí es troba en l estat a o b, i això origina un desdoblament del senyals. L acoblament disminueix amb la distància i depèn de l angle entre el vector internuclear i el camp extern.

INTERACCIONS ANISOTRÒPIQUES Si bé la RMN s aplica majoritàriament a mostres líquides, és possible també mesurar espectres de mostres sòlides utilitzant tècniques especials. La RMN de mostres sòlides posa de manifest que la major part de les interaccions que donen lloc a paràmetres mesurables depenen de l orientació de la molècula respecte a una direcció externa definida per l intens camp magnètic extern imprescindible en qualsevol experiment de RMN. Així, un paràmetre com l apantallament d un nucli, característic del seu entorn químic i que determina la freqüència del senyal, canvia quan fem girar un cristall de la molècula que el contingui respecte al camp magnètic extern. L apantallament químic és, doncs, una magnitud tensorial. Les interaccions anisotròpiques, en principi, permeten estudiar l estructura de la molècula respecte a una direcció externa i, per tant, relacionar l orientació de parts arbitràriament distants de la molècula.

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 104

104 MIQUEL PONS

FIGURA 2. Anisotropia d apantallament. L apantallament, i per tant el desplaçament químic, depèn de l orientació de la molècula respecte al camp magnètic extern. En un cristall tots els nuclis en posicions equivalents tenen el mateix desplaçament químic però això canvia quan fem girar el cristall (esquerra). En una mostra policristal·lina, els senyals de nuclis químicament equivalents però diferentment orientats se sobreposen per a donar un senyal de forma característica (centre). En un cristall líquid, la reorientació ràpida dóna lloc a valors mitjans d apantallament, però com que la reorientació no és igual per a totes les direccions, el senyal resultant encara té una dependència residual de l orientació (dreta). En una dissolució isotròpica, l apantallament observat és independent de la reorientació.

Igualment, en el cas de l acoblament dipolar, si féssim girar el cristall que conté la molècula respecte al camp magnètic, observaríem que la separació dels senyals canvia. Els acoblaments dipolars són també magnituds tensorials. En un sistema sòlid però no ordenat, per exemple, una mostra policristal·lina, tindríem una superposició dels senyals i observaríem un senyal ample amb una forma característica. En un sistema fluid no observaríem la superposició dels doblets sinó la seva mitjana que, en un sistema isotròpic, dóna lloc a la seva cancel·lació, i no observarem cap tipus de desdoblament a causa de les interaccions dipolars. Els desdoblaments que s observen en els espectres de RMN en dissolució tenen un origen diferent i són independents de l orientació de la molècula respecte al camp extern. Per això els anomenem acoblaments escalars. Els acoblaments dipolars contenen una important informació estructural però no son observables en molècules en dissolucions isotròpiques. D altra banda, en els es-

pectres de mostres sòlides estàtiques, els efectes d un gran nombre d interaccions i les particulars característiques de relaxació dels sòlids s ajunten de manera que els espectres de RMN es redueixen a una banda molt ampla. L aplicació de tècniques especials, com la rotació en l angle màgic, o determinades seqüències d impulsos, proporcionen espectres interpretables perquè eliminen, precisament i entre altres coses, els acoblaments dipolars. Un intent històric de trobar una manera d explotar el contingut estructural dels acoblaments dipolars fou la utilització de cristalls líquids com a dissolvents en RMN (Emsley i Lindon, 1975). En aquests sistemes la posició de les molècules canvia amb el temps, com en els líquids, però la seva orientació només fluctua dins un marge restringit. Molts cristalls líquids s orienten en camps magnètics, i molècules dissoltes en aquestes fases esdevenen fortament orientades respecte a aquest camp. Així, els acoblament dipolars no s anul·len. Malauradament, si ens

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 105

ESTRUCTURA DE PROTEÏNES PER RESSONÀNCIA MAGNÈTICA NUCLEAR 105

centrem en l observació de l espectre de RMN de protó, el nombre d acoblaments pot ser molt elevat i la seva magnitud és sovint més gran que la diferència de desplaçaments químics. Això complica seriosament l anàlisi de qualsevol molècula d interès, fora de les més senzilles. L explosió actual de l ús dels acoblaments dipolars en l estudi de proteïnes deriva de dos avenços tecnològics significatius: l ús de molècules marcades isotòpicament obtingudes per expressió en medis enriquits, i la introducció de sistemes orientadors modulables (Tjandra-Bax, 1997). El primer ha permès centrar els estudis en els acoblaments dipolars entre nuclis directament enllaçats, per exemple els grups NH o CH de l esquelet proteic. D aquesta manera, l acoblament dipolar entre els nuclis d interès és el més important i no hem de preocupar-nos dels possibles acoblaments amb altres nuclis propers. D altra banda, la utilització de sistemes que indueixen un grau d orientació molt petit permet reduir els

acoblaments dipolars a una magnitud prou petita perquè no representin una complicació important en l espectre. L ús dels acoblaments dipolars ha estat revisat recentment (Prestegard et al., 2000; Bax et al., 2001; De Alba i Tjandra, 2002). És important destacar que els acoblaments dipolars han demostrat la seva utilitat també en sistemes estesos i amb una gran anisotropia intrínseca, com són els àcids nucleics (Al Hashimi et al., 2001; Trantirek et al., 2000), i per a l estudi d interaccions intermoleculars (Olejniczak et al., 1999). Tot i això, aquesta revisió es concentrarà en l aplicació en el camp de les proteïnes. ORIENTACIÓ MAGNÈTICA L orientació parcial d una molècula pot aconseguir-se per interacció amb el mateix camp magnètic, per interacció amb un sistema ja orientat sigui per efecte del camp magnètic o qualsevol altra raó , o per inter-

FIGURA 3. Acoblaments residuals en sistemes orientats. La separació dels doblets deguts a l acoblament dipolar en estat sòlid és de milers de Hz i depèn de l orientació. Els espectres són complexos, ja que hi ha molts nuclis acoblats simultàniament. En una mostra policristal·lina s observen els anomenats doblets de Pake. En mostres parcialment orientades els acoblaments dipolars residuals són molt més petits i només s observen entre nuclis molt propers (per exemple, els que estan directament enllaçats). Això dóna espectres molt més senzills i comparables als que s obtenen en dissolucions isotròpiques, però amb informació sobre l orientació relativa dels diferents vectors internuclears.

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 106

106 MIQUEL PONS

acció amb algun altre camp de força com, per exemple, un camp elèctric. L energia d interacció d una molècula amb un camp magnètic està regida per una propietat que s anomena susceptibilitat magnètica. La susceptibilitat magnètica determina la capacitat d un camp magnètic extern per a generar un camp induït que interaccionarà amb el camp extern. Intuïtivament pot associar-se a la circulació d electrons induïda pel camp extern i és fàcil de veure que segons el tipus d enllaços i la seva distribució en la molècula la circulació d electrons serà més fàcil per a certes orientacions de la molècula respecte al camp magnètic extern que no per a altres. La susceptibilitat magnètica també és una magnitud tensorial. L energia d interacció amb el camp magnètic extern és la que resulta entre el camp extern i el camp induït (que és proporcional al mateix camp i a la susceptibilitat magnètica). Així, la diferència d energia màxima entre dues orientacions és proporcional a l anisotropia de susceptibilitat magnètica i al quadrat del camp extern. Imaginem, per exemple, el cas d una molècula de benzè. La circulació electrònica del sistema p al voltant de l eix de simetria C6 és clarament més fàcil que la circulació en una direcció perpendicular. Així, el benzè és una molècula que manifesta una forta anisotropia de susceptibilitat magnètica. Quan una molècula de benzè es col·loca en un camp magnètic intens, l energia d interacció amb el camp magnètic de les molècules que estan orientades amb el seu eix de màxima simetria dirigit en la direcció del camp o perpendicular en aquest és diferent, i la forma de menor energia predominarà seguint la típica distribució de Boltzmann. Per a una molècula de benzè aïllada aquesta diferència és molt petita però en macromolècules formades per molts anells aromàtics orientats de la mateixa manera, per exemple, un fragment de DNA, els efec-

tes són additius, i el grau d orientació en els camps magnètics intensos utilitzats en RMN passa a ser mesurable. Altres enllaços, com els enllaços peptídics, presenten fortes anisotropies de susceptibilitat magnètica que poden manifestar-se si la seva orientació relativa es manté de forma que els efectes se sumin. Aquest és el cas de les hèlixs a, en què tots els enllaços amida estan orientats amb el grup carbonil dirigit aproximadament en la direcció de l eix de l hèlix. Els sistemes que contenen electrons desaparellats, per exemple, per la presència de cations paramagnètics, presenten també fortes anisotropies de susceptibilitat magnètica que determinen la seva orientació en un camp magnètic. Les primeres mesures d acoblaments dipolars en proteïnes es van fer amb una proteïna paramagnètica (Tolman et al., 1996). La substitució del calci per ions lantànids paramagnètics, de mida semblant a l ió calci, permet convertir en paramagnètiques aquelles proteïnes que uneixen calci de forma natural, i així orientar-les en un camp magnètic (Contreras et al., 1999). L orientació magnètica directa del sistema d interès obre la possibilitat d estudiar l orientació selectiva d un component en una barreja, i també d estudiar fenòmens d associació en què un component de baixa anisotropia esdevé orientat per interacció amb una altra molècula que està ben orientada. SISTEMES ORIENTADORS De la mateixa manera que la susceptibilitat dels diferents enllaços d una molècula s addiciona si tots estan orientats de la mateixa manera, en sistemes orientats com els cristalls líquids, l anisotropia de susceptibilitat magnètica global és prou gran per a donar orientacions properes al 100 % a les temperatures i camps magnètics habituals. Per a evitar els problemes associats a la

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 107

ESTRUCTURA DE PROTEÏNES PER RESSONÀNCIA MAGNÈTICA NUCLEAR 107

extrema complexitat dels espectres de molècules molt orientades, les aplicacions recents a la mesura d acoblaments dipolars s han fet utilitzant cristalls líquids diluïts. Molts dissolvents clàssics que formen fases amb característiques de cristall líquid ho fan només a concentracions elevades en què es manifesten les interaccions intermoleculars responsables del seu ordenament. En disminuir la concentració, les interaccions intermoleculars no són suficients per a establir una ordenació de llarg abast i el sistema esdevé isotròpic. D altra banda, en sistemes de caire micel·lar o constituïts per microcris-

FIGURA 4. Orientació d una proteïna per mitjà de bicel·les. L anisotropia de la susceptibilitat magnètica de les bicel·les fa que estiguin orientades amb la normal del pla de la membrana perpendicular al camp magnètic extern. Una proteïna dissolta en aquest medi exprimenta una orientació parcial com a resultat de les restriccions estèriques imposades per les bicel·les a les molècules que es troben prop de la seva superfície. En altres sistemes, la interacció entre la proteïna i el sistema orientador pot tenir un fort component electrostàtic.

talls discrets, la cooperativitat dins la micel·la o el microcristall pot ser prou gran per a assegurar l orientació de cada una de les partícules. En aquests sistemes, la dilució te només un efecte moderat, ja que no afecta l ordre dins la partícula, tot i que sí disminueix l ordenament cooperatiu del conjunt de les partícules. Evidentment, la dilució modifica el nombre de partícules orientades per unitat de volum i la separació mitjana entre les partícules i, per tant, l efecte orientador que puguin exercir sobre una macromolècula present en la dissolució. Així, una característica important dels cristalls líquids diluïts és la possibilitat de determinar a voluntat el grau d ordre i, per tant, l escala dels acoblaments dipolars que es volen mesurar. El primer tipus de cristall líquid diluït que es va introduir en l estudi de biomolècules foren les bicel·les (Sanders-Prosser 1998). Les bicel·les estan constituïdes fonamentalment per barreges de fosfolípids (p. ex., dimiristoilfosfatidilcolina, DMPC en anglès) i detergents (p. ex., dihexanoilfosfatidilcolina, DHPC). Inicialment les bicel·les es van introduir com a models de membrana amb la idea d utilitzar-les per a alinear proteïnes de membrana per a estudiar-los en fase sòlida amb RMN i s utilitzaven en altes concentracions. En condicions diluïdes (3 10 % pes/volum) cal treballar en un rang estret de proporcions relatives dels dos components DHPC:DMPC (2,9-3,7) i de temperatura (35-42 ºC), fora del qual no s observa alineament. La transició reversible entre una fase ordenada i una fase isotròpica al voltant dels 25 ºC és útil per a poder mesurar en condicions semblants un espectre de referència per a separar les contribucions dels acoblaments escalars (presents a les dues temperatures) i dipolars (només observables per sobre de 35 ºC). Les bicel·les són estructures discoïdals d algunes desenes de nanòmetres (20-25 nm) de

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 108

108 MIQUEL PONS

diàmetre i uns 4 nm de gruix. En un camp magnètic s orienten amb la normal al pla perpendicular al camp magnètic. En una concentració d un 5 % la separació entre bicel·les supera els 40 nm i, en absència d interaccions específiques, la difusió rotacional de les proteïnes dissoltes en el medi no es veu afectada i poden obtenir-se espectres de RMN d alta qualitat. La utilització de bicel·les presenta diversos problemes a causa de la seva limitada tolerància a diferents condicions experimentals i la seva poca estabilitat. S han descrit modificacions que augmenten la seva estabilitat (p. ex., la substitució dels enllaços èster per èter, o l addició de detergents carregats), el rang útil de temperatura o la seva orientació respecte al camp. Els fragments de membrana porpra són un altre sistema orientador que presenta característiques interessants (Koenig et al., 1999; Sass et al., 1999). Es tracta de fragments especialitzats de la membrana d Halobacterium salinarium constituïts en un 70 % per una única proteïna integral de membrana anomenada bacteriorodopsina, acompanyada de lípids àcids que confereixen una forta càrrega negativa a la superfície. Els fragments de membrana tenen un diàmetre al voltant de 750 nm i un gruix de 5 nm. La bacteriorodopsina te set hèlixs transmembranals i s agrupa formant una xarxa cristal·lina bidimensional amb una mitjana de 40.000 molècules per fragment, que dóna lloc a una gran anisotropia de susceptibilitat magnètica i causa l alineació completa dels fragments individuals, amb la normal al pla de la membrana dirigida en la direcció del camp magnètic. Recentment s ha demostrat que és possible canviar l orientació dels fragments de membrana porpra utilitzant certs lantànids (Bernadó et al., 2002). Els fragments de membrana porpra tendeixen a unir de manera transitòria algunes proteïnes. Un altre sistema que ha estat extensa-

ment utilitzat és el format per partícules víriques (Hansen et al., 1998). El bacteriòfag Pf1 està format per una molècula de DNA circular monocatenari empaquetat en una càpsida proteica que forma un filament de 6 nm de diàmetre i uns 2.000 nm de longitud que s orienta amb el seu eix dirigit en la direcció del camp magnètic. El bacteriòfag és estable en diferents condicions experimentals i manté l ordre en un ampli rang de temperatures i de concentracions. El bacteriòfag Pf1 té càrrega negativa a pH fisiològic i no pot modificar-se. Els espectres de referència s han d obtenir a partir d una segona mostra de la proteïna en la qual no s ha addicionat el bacteriòfag. Els microcristalls de cel·lulosa han estat descrits com una possible alternativa (Fleming et al., 2000). Formats per hidròlisi parcial de la cel·lulosa del paper, els microcristalls són estructures cilíndriques (d uns 200 nm de longitud per 10 nm de diàmetre) que formen una fase nemàtica en concentracions superiors a 4,5 % pes/volum i que és estable en un extens rang de pH i temperatura, però és poc tolerant a la presència de sals. Els microcristalls de cel·lulosa tenen una feble càrrega negativa a causa dels grups sulfat introduïts durant la hidròlisi amb àcid sulfúric, i s orienten amb l eix del cilindre paral·lel al camp magnètic extern. Altres sistemes es basen en la utilització de barreges de tensioactius: clorur o bromur de cetilpiridini/hexanol (Prosser et al., 1998; Barrientos et al., 2000), n-alquilpoli (etilen glicol)/n-alquil alcohols (Rückert i Otting, 2000), glucopone (una barreja de sucres alquilats)/hexanol (Stradner et al., 1999) i és previsible que aquesta llista continuï augmentant. La possibilitat d induir l orientació utilitzant sistemes alternatius al camp magnètic ha estat igualment explorada. S han utilitzat camps elèctrics, continus o alterns, per a induir l orientació (Plantenga et al., 1982;

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 109

ESTRUCTURA DE PROTEÏNES PER RESSONÀNCIA MAGNÈTICA NUCLEAR 109

Peshkovsky i McDermott, 2000; Riley i Augustine, 2000), tot i que la necessitat d utilitzar instruments modificats necessàriament en restringeixen l aplicació. El seu principal avantatge potencial és la possibilitat de canviar ràpidament de la forma orientada a la forma isotròpica, i així poder establir correlacions entre les dues formes. Molt recentment s ha demostrat l orientació mecànica de proteïnes per compressió anisotròpica de gels de poliacrilamida (Tycko et al., 2000).. Aquest sistema és estable en la majoria de les condicions experimentals d interès biològic, no està carregat i no s uneix a proteïnes i permet obtenir espectres d alta resolució. És possible utilitzar diverses formes de compressió o expansió, i en aquest moment, sembla un dels sistemes més prometedors, atès el seu caràcter universal. MESURA DELS ACOBLAMENTS DIPOLARS La mesura del valor de la constant d acoblament dipolar residual (DAB ) en un medi orientat utilitza els mateixos tipus d experiments que es poden fer servir per a la mesura acurada de les constants d acoblament escalars (JAB). De fet, en molts casos, i certament quan els nuclis implicats estan directament units, la mesura dels acoblaments dipolars es fa per diferència entre els valors obtinguts en un medi orientat, que proporcionen JAB + DAB, i en un medi isotròpic on únicament es mesura JAB. El mètode més senzill per a mesurar els acoblaments és l eliminació del pols de 180º que habitualment s utilitza en els experiments de HSQC per a suprimir els acoblaments. Així, a la dimensió indirecta aquella en què es mesura el desplaçament de l heteroàtom els senyals apareixen desdoblats i pot mesurar-se n la separació. En el

cas dels acoblaments petits és possible augmentar-ne la separació incloent a la seqüència un temps addicional en què només evoluciona l acoblament (Tolman i Prestegard, 1996). En el cas de constants d acoblament grans i espectres complicats, la complexitat addicional deguda al fet que el nombre de senyals es duplica per causa dels acoblaments pot dificultar-ne l anàlisi. En aquests casos la utilització de mètodes que permeten l observació separada dels senyals de camp alt i camp baix proporciona dos espectres amb els mateixos senyals però separats pel valor de les constants d acoblament. El més utilitzat d aquests mètodes és l anomenat IPAP (Ottiger et al., 1998). Quan les constants per mesurar són molt petites, comparables o més petites que l amplada de banda, la mesura dels acoblaments es pot fer utilitzant mètodes basats en els experiments E-COSY (Wang et al., 1998), o a partir de mesures de la intensitat d un senyal modulat per l evolució de l acoblament d interès durant un interval de temps variable (Tjandra i Bax, 1997). Aquest mètodes permeten mesurar acoblaments amb precisions de 0,1-0,2 Hz. UTILITZACIÓ D ACOBLAMENTS DIPOLARS EN EL CÀLCUL D ESTRUCTURES Els acoblaments dipolars proporcionen informació sobre l orientació de diferents vectors internuclears respecte d un sistema de referència comú. Aquesta informació angular s obté amb una precisió elevada i és independent de la separació entre els diferents vectors. La utilització d aquesta informació per a la determinació d estructures està subjecte a algunes limitacions: en primer lloc, els paràmetres que defineixen l orientació global de tota l estructura no es co-

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 110

110 MIQUEL PONS

D AB

º P 0 J AJ B h ª 3 cos 2 - 1 3 S « Ax 2 Rh( sin 2- cos 2M )» 2 3 4S 2S rAB ¬ 2 ¼

FIGURA 5. Degeneració de les solucions. Un mateix valor de la constant d acoblament DAB és compatible amb infinites orientacions si el sistema té simetria axial. Les solucions possibles estan representades per la superfície dels dos cons que formen un angle en la direcció del camp. La distorsió respecte a la simetria axial està representada pel terme ròmbic (Rh). Si aquest terme és important cal tenir en compte també l angle q.

neixen a priori i cal trobar-los. En segon lloc, no hi ha una correspondència directa entre les constants dipolars residuals i els angles polars que defineixen l orientació, sinó que per a cada valor de la constant dipolar residual existeix un nombre infinit de solucions, que defineixen la superfície de dos cons. Els components axial i ròmbic del tensor d alineament es poden obtenir sense coneixement previ de l estructura a partir de la distribució dels valors de les constants d acoblament sempre que el nombre de mesures sigui prou gran i els vectors corresponents estiguin distribuïts uniformement en totes les orientacions possibles (Clore et al., 1998). D altra banda, l orientació dels tensor d alineament respecte a la molècula està definida per tres paràmetres angulars que s ajusten per a obtenir el millor acord entre els valors experimentals i el model. La solució al problema de la degeneració passa per la determinació de diferents conjunts independents d acoblaments dipolars, generalment obtinguts a partir de diferents sistemes orientadors. La utilització de dos

sistemes independents redueix la degeneració en les direccions dels vectors a vuit punts (Ramírez i Bax, 1998). Si es mesuren simultàniament diversos vectors amb una orientació relativa coneguda (p. ex., perquè formen part d un enllaç amida o una altra estructura plana) existeixen vuit solucions quan s utilitza un sol sistema orientador, que es redueixen a quatre utilitzant dos sistemes d alineament. Finalment, si es mesuren un mínim de cinc acoblaments en un fragment tridimensional conegut, hi ha quatre solucions si s utilitza un sol sistema orientador, i la degeneració desapareix si s usen dos sistemes orientadors independents. Recentment, l estructura de la proteïna ubiquitina ha estat determinada utilitzant només acoblaments dipolars obtinguts en dos sistemes orientadors diferents (Hus et al., 2001). La incorporació d acoblaments dipolars residuals millora la precisió de les estructures determinades per ressonància magnètica nuclear i, en general, també la seva semblança amb les estructures de les obtingudes per difracció de raigs X, almenys en el cas de les estructures globulars compactes.

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 111

ESTRUCTURA DE PROTEÏNES PER RESSONÀNCIA MAGNÈTICA NUCLEAR 111

Per posar un exemple, la diferència quadràtica mitjana entre els àtoms de l esquelet del conjunt d estructures per al domini B1 de la proteïna G en afegir acoblaments dipolars va disminuir de 2,88 Å a 1,37 Å i la diferència amb l estructura de raigs X va passar de 4,33 Å a 1,12 Å (Clore et al., 1999a). Els acoblaments dipolars s han utilitzat per a definir un factor R, anàleg al que s utilitza habitualment en cristal·lografia, que compara la diferència entre els valors observats i calculats i la que s esperaria si els vectors estiguessin distribuïts a l atzar (Clore i Garrett, 1999b). El camp on els acoblaments dipolars residuals tenen una aplicació més evident és en el de les proteïnes multidomini. En aquests casos la determinació de l orientació relativa dels dominis sovint és problemàtica, atesa la baixa densitat de l nOe a la interfase entre dominis, però la inclusió d acoblaments dipolars proporciona, precisament, la informació angular per a desfer les ambigüitats. És interessant constatar que els problemes de distorsió de l estructura a causa de l empaquetament cristal·lí poden ser importants precisament en el cas de proteïnes multidomini, i cal esperar, com sembla que succeeix, que el nombre de casos en què les estructures de raigs X i de RMN no són idèntiques augmentarà a mesura que s estudiïn més exemples de proteïnes multidomini. UTILITZACIÓ DELS ACOBLAMENTS DIPOLARS EN GENÒMICA ESTRUCTURAL Un dels avantatges dels acoblaments dipolars com a font d informació estructural és la facilitat amb què poden mesurar-se i assignar-se, i això ha disparat l interès d utilitzar-los en el camp de la genòmica estructural (Prestegard et al., 2001). Els acobla-

ments dipolars residuals poden utilitzar-se per a la cerca qualitativa en el Protein Data Bank (PDB) de tipus de plegaments semblants (Annila et al., 1999) o per a la comparació quantitativa amb proteïnes completes (Meiler et al., 2000). El grup de Bax ha proposat un esquema de reemplaçament de fragments moleculars, basat en la cerca en el PDB de fragments de set residus que donen una bona concordança amb els valors dels acoblaments dipolars observats per a un segment de la mateixa longitud. Les semblances amb els mètodes utilitzats en cristal·lografia per al traçat automàtic de la cadena peptídica a partir dels mapes de densitat electrònica és reveladora (Delaglio et al., 2000). Recentment s ha proposat un altre mètode que permet identificar motius de plegament local utilitzant acoblaments dipolars residuals (Andrec et al., 2001). LES CONSTANTS D ACOBLAMENT DIPOLARS EN ESTRUCTURES FLEXIBLES Les macromolècules no són estructures rígides, sinó que experimenten fluctuacions en diferents escales de temps. Típicament, els aspectes dinàmics s estudien per mitjà de mesures de temps de relaxació que s analitzen per a obtenir els paràmetres d ordre que indiquen l amplitud de les fluctuacions en una escala de temps més ràpida que el moviment global de la molècula (ps-ns). Els acoblaments dipolars estan afectats per la mobilitat interna en una escala de temps que arriba fins als mil·lisegons i, per tant, poden proporcionar una informació dinàmica molt valuosa. Cal distingir dues situacions. En el primer cas els moviments són locals i no afecten significativament la forma global de la molècula, i resulta raonable esperar que no

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 112

112 MIQUEL PONS

en condicionin el grau d alineament. En el segon cas, els moviments són de gran amplitud i àmpliament cooperatius p. ex., la reorientació de dominis. En aquest cas no és evident que la mobilitat no estigui afectada per la interacció amb el medi orientador, o que l orientació global no sigui una mitjana de les orientacions induïdes en les diferents formes que s estan interconvertint. El primer cas ha estat estudiat independentment pels grups de Kay i Prestegard, d una banda (Tolman et al., 2001), i de Griesinger i Brüschweiler, de l altra (Meiler et al., 2001). Els primers autors conclouen que les fluctuacions de baixa amplitud (< 10º) tenen poc efecte en la qualitat de les estructures obtingudes i presenten criteris per a distingir aquells residus que poden estar afectats per fluctuacions. Els segons analitzen l efecte de la mobilitat sobre un factor de qualitat de les estructures segons el tipus de tractament de dades que s utilitzi. A més, proposen que l estudi de diferents sistemes d alineament pot proporcionar informació sobre la mobilitat. L estudi dels moviments de gran amplitud pot abordar-se a partir del coneixement de les estructures dels dominis individuals, ajustant els valors experimentals dels acoblaments dipolars a l estructura per a extreure n el tensor d orientació corresponent. Si l estructura global és rígida, els dos tensors han de ser iguals, però això no passarà si la unió entre els dominis és flexible. Fins i tot sense conèixer les estructures dels dominis, els valors que caracteritzen el tensor d orientació poden extreure s de la distribució dels valors de les constants d acoblament dipolar. La comparació entre les distribucions en els diferents dominis és, doncs, suficient per a detectar la rigidesa o la flexibilitat de la unió (Braddock et al., 2001).

BIBLIOGRAFIA AL-HASHIMI, H. M.; J. R. TOLMAN; A. MAJUMDAR; G A. ORIN; D. J. PATEL (2001). «Determining the stoichiometry in homomultimeric nucleic acid complexes using magnetic field induced residual dipolar couplings». J. Am. Chem. Soc., núm 123, pàg. 5806-5807. ANNILA, A.; H. AITIO; E. THULIN; T. DRAKENBERG (1999). «Recognition of protein folds via dipolar couplings». J. Biomol. NMR, núm. 14, pàg. 223-230. ANDREC, M.; P. DU; R. M. LEVY (2001).«Protein structural motif recognition via NMR residual dipolar couplings». J. Am. Chem. Soc., núm. 123, pàg. 12221229. BARRIENTOS, L. G.; C. DOLAN; A. M. GRONENBORN (2000). «Characterization of surfactant liquid crystal phases suitable for molecular alignment and measurement of dipolar couplings». J. Biomol. NMR, núm. 16, pàg. 329-337. BAX, A.; G. KONTAXIS; N. TJANDRA (2001). «Dipolar Couplings in macromolecular structure determination». Meth. Enzymol., núm. 339, pàg. 127-174. BERNADÓ, P.; R. BARBIERI; E. PADRÓS; C. LUCHINAT; M. PONS (2002). «Lanthanide modulation of the orientation of macromolecules induced by purple membrane». J. Am. Chem. Soc., núm. 124, pàg. 374-375. BRADDOCK, D. T.; M. CAI; J. L. BABER; Y. HUANG; G. M. CLORE (2001). «Rapid identification of medium to large scale interdomain motion in modular proteins using dipolar couplings». J. Am. Chem. Soc., núm. 123, pàg. 8634-8635. CLORE, M.; A. M. GRONENBORN; N. TJANDRA (1998). « Direct structure refinement against residual dipolar couplings in the presence of rhombicity of unknown magnitude». J. Magn. Reson., núm. 131, pàg. 159-162. CLORE, G. M.; M. R. STARICH; C. A. BEWLEY; M. L. CAI; J. KUSZEWSKI (1999a). «Impact of residual dipolare couplings on the accuracy of NMR structures determined from a minimal number of NOE restraints». J. Am. Chem. Soc., núm. 121, pàg. 65136514. CLORE, G. M.; D. S. GARRETT (1999b). «R-factor, free R, and complete cross-validation for dipolar coupling refinement of NMR structures». J. Am. Chem. Soc., núm. 121, pàg 9008-9012. CONTRERAS, M. A.; J. UBACH; O. MILLET; J. RIZO; M. PONS (1999). «Measurement of one bond dipolar couplings through lanthanide-induced orientation of a calcium binding protein». J. Am. Chem. Soc., núm. 121, pàg. 8947-8948. DE ALBA, E.; N. TJANDRA (2002). «NMR dipolar couplings for the structure determination of biopolymers in solution». Progress in NMR Spectroscopy, núm. 40, pàg. 175-197. DELAGLIO, F.; G. KONTAXIS; A. BAX (2000). «Protein struc-

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 113

ESTRUCTURA DE PROTEÏNES PER RESSONÀNCIA MAGNÈTICA NUCLEAR 113 ture determination using molecular fragment replacement and NMR dipolar couplings». J. Am. Chem. Soc., núm. 122, pàg. 2142-2143. FLEMING, K.; D. GRAY; S. PRASANNAN; S. MATTHEWS (2000). «Cellulose crystallites: a new and robust liqueid crystalline medium for the measurement of residual dipolar couplings». J. Am. Chem. Soc., núm. 122, pàg. 5224-5225. HANSEN, M. R.; L. MUELLER; A. PARDI (1998). «Tunable alignment of macromolecules by filamentous phage yields dipolar coupling interactions». Nat. Struct. Biol., núm. 5, pàg. 1065-1074. HUS, J-C.; D. MARION; M. BLACKLEDGE (2001). «Determination of protein backbone structure using only residual dipolar couplings». J. Am. Chem. Soc., núm. 123, pàg. 1541-1542. KOENIG, B. W.; J. S. HU; M. OTTIGER; S. BOSE; R. W. HENDLER; A. BAX (1999).«NMR measurement of dipolar couplings in proteins aligned by transient binding to purple membrane fragments». J. Am. Chem. Soc., núm. 121, pàg. 1385-1386. MEILER, J.; W. PETI; C. GRIESINGER (2000). «DipoCoup: a versatile program for 3D-structure homology comparison based on residual dipolar couplings and pseudocontact shifts». J. Biomol. NMR, núm. 17, pàg. 283-294. MEILER, J.; J. J. PROMPERS; W. PETI; C. GRIESINGER; R. BRÜSCHWEILER (2001).«Model-free approach to the dynamic interpretation of residual dipolar couplings in globular proteins». J. Am. Chem. Soc., núm. 123, pàg. 6098-6107. OLEJNICZAK, E. T.; R. P. MEADOWS; H. WANG; K. L. CAI; D. G. NETTESHEIM; S. W. FESIK (1999). «Improved NMR Structures of Protein/Ligand Complexes Using Residual Dipolar Couplings». J. Am. Chem. Soc., núm. 121, pàg. 9249-9250. OTTIGER, M; F. DELAGLIO; A. BAX (1998). «Measurement of J and dipolar couplings from simplified two-dimensional NMR spectra». J. Magn. Reson., núm. 131, pàg. 373-378. PESHKOVSKY, A.; A. E. MCDERMOTT (2000). «Dipolar interactions in molecules aligned by strong AC electric fields». J. Magn. Reson., núm. 147, pàg. 104-109. PLANTENGA, T. M.; P. C. M. VANZIJL; C. MACLEAN (1982). «Studies of quadrupolar and dipolar electric field effects in the NMR spectra of binary mixtures of liquids». Chem. Phys., núm. 66, pàg. 1-9. PRESTEGARD, J. H.; H. M. AL-HASHIMI; J. R. TOLMAN (2000). «NMR Structures of biomolecules using field oriented media and residual dipolar couplings». Q. Rev. Biophys, núm. 33, pàg. 371-424. PRESTEGARD, J. H.; H. VALAFAR; J. GLUSHKA; F. TIAN (2001). «Nuclear magnetic resonance in the era of structural genomics». Biochemistry, núm. 40, pàg. 8677-8685. PROSSER, R. S.; J. A. LOSONCZI; I. V. SHIYANVSKAYA (1998). «Use of novel aqueous liquid crystalline medium

for high-resolution NMR of macromolecules in solution». J. Am. Chem. Soc., núm. 120, pàg. 111010111011. RAMIREZ, B. E.; A. BAX (1998). «Modulation of the alignment tensor of macromolecules dissolved in a dilute liquid crystalline medium». J. Am. Chem. Soc., núm. 120, pàg. 9106-9107. RILEY, S. A.; M. P. AUGUSTINE (2000). «Extracting residual NMR coupling constants from electrically aligned liquids». J. Phys. Chem. A, núm. 104, pàg. 3326-3331. RÜCKERT, M.; G. OTTING (2000). «Alignment of biological macromolecules in novel nonionic liquid crystalline media». J. Am. Chem. Soc., núm. 122, pàg. 77937797. SANDERS, C. R.; R. S. PROSSER (1998). «Bicelles: a model membrane system for all seasons?». Struct. Fold. Des., núm. 6, pàg. 1227-1234. SASS, J.; F. CORDIER; A. HOFFMANN; M. ROGOWSKI; A. COUSIN; J. G. OMICHINSKI; H. LÖWEN; S. GRZESIEK (1999). «Purple membrane induced alignment of biological macromolecules in the magnetic field». J. Am. Chem. Soc., núm. 121, pàg. 2047-2055. STRADNER, A.; B. MAYER; T. SOTTMAN; A. HERMETTER; O. GLATTER (1999). «Sugar surfactant-based solutions as hosts systems for enzyme activity measurements». J. Phys. Chem. B, núm. 103, pàg. 6680-6689. TJANDRA, N.; A. BAX (1997). «Measurement of dipolar contributions to (1)J(CH) splittings from magneticfield dependence of J modulation in two dimensional NMR spectra». J. Magn. Reson, núm 124, pàg. 512-515. TOLMAN, J. R.; J. H. PRESTEGARD (1996). «Measurement of amide N-15-H-1 one bond couplings in proteins using accordion heteronuclear-shift-correlation experiments». J. Magn. Reson. Ser B., núm. 112, pàg. 269-274. TOLMAN, J. R.; H. M. AL-HASHIMI; L. E. KAY; J. H. PRESTEGARD (2001). «Structural and dynamic analysis of residual dipolar coupling data for proteins». J. Am. Chem. Soc., núm. 123, pàg. 1416-1424. TRANTIREK, L.; M. URBASEK; R. STEFL; J. FEIGON; V. SKLENAR (2000). «A method for direct determination of helical parameters in nucleic acids using residual dipolar couplings». J. Am. Chem. Soc., núm. 122, pàg. 10454-10455. TYCKO, R.; F. J. BLANCO; Y. ISHII (2000). «Alignment of biopolymers in strained gels: a new way to create detectable dipole-dipole couplings in high resolution biomolecular NMR». J. Am. Chem. Soc., núm. 122, pàg. 9340-9341. WANG, H.; J. L. MARQUARDT; P. WINGLFIELD; S. J. STAHL; S. LEE-HUANG; D. TORCHIA; A. BAX (1998). «Simultaneous measurement of 1H-15N, 1H-13C , and 15N13C dipolar couplings in a perdeuterated 30kDa protein dissolved in a dilute liquid crystalline phas». J. Am. Chem. Soc., núm. 120, pàg. 7385-7386.

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 114

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 115

Biofísica molecular (Esteve Padrós, ed.) Treballs de la SCB. Vol. 53 (2002) 115-124

ESTRUCTURA DE GRANS AGREGATS MOLECULARS: ESTUDIS COMBINATS DE CRISTAL·LOGRAFIA DE RAIGS X I MICROSCÒPIA ELECTRÒNICA NÚRIA VERDAGUER1, WENDY F. OCHOA1, DIEFER BLAAS2 I IGNACIO FITA1 1 2

Institut de Biologia Molecular de Barcelona (CSIC). Institut de Bioquímica. Facultat de Medicina. Universitat de Viena

Adreça per a la correspondència: Ignacio Fita. Institut de Biologia Molecular de Barcelona (CSIC). Carrer de Jordi Girona Salgado, 18-26. 08034 Barcelona. Adreça electrònica: ifrcri@cid.csic.es. RESUM Els mapes de baixa resolució, obtinguts de les reconstruccions tridimensionals de les imatges de criomicroscòpia electrònica (crio-EM) dels grans agregats moleculars, poden combinar-se amb les estructures atòmiques dels seus components individuals, determinades per difracció de raigs X. La relació que hi ha entre les dues tècniques ha resultat ser una de les eines més poderoses de què disposem actualment per a interpretar imatges d aquestes maquinàries macromoleculars en el context d estructures d alta resolució. El modelatge dels complexos entre el rhinovirus humà serotip 2 (HRV2) i els fragments Fab de dos anticossos neutralitzants, 8F5 i 3B10, en els mapes derivats de la microscòpia electrònica, ha permès d establir els diferents patrons d interacció que caracteritzen el reconeixement d epítops lineals i conformacionals per a anticossos dirigits contra el lloc antigènic B del virus. ABSTRACT The low resolution crio-electron microscopy (crio-EM) maps of large macromolecular assemblies can be combined with the atomic structures of their isolated components determined by x-ray crystallography. The interplay between both techniques results in one of the most powerful tools, actually available, to interpret low resolution snapshots of complex macromolecular machines in the context of high resolution structures. The fitting of the complexes between human rhinovirus 2 (HRV2) and the Fab fragments

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 116

116 NÚRIA VERDAGUER, WENDY F. OCHOA, DIEFER BLAAS I IGNACIO FITA

of the neutralising antibodies 3B10 and 8F5, in the crio-EM reconstructed density, allowed to define the different pattern of interactions which characterise the recognitions mechanisms of lineal and conformational epitopes by antibodies directed against the virus antigenic site B. INTRODUCCIÓ El desenvolupament de la virologia estructural ha estat espectacular en els darrers cinc anys. Això es deu principalment a dos fets: a) l increment en l ús de diverses aproximacions a l estudi de grans estructures, especialment pel que fa a la interrelació entre la difracció de raigs X, i la microscòpia electrònica, i b) l augment del nombre d estudis enfocats a provar com funcionen aquests complexos macromoleculars a partir de correlacionar els diferents estudis bioquímics i biofísics. Aquest desenvolupament s ha concretat en la determinació a nivell atòmic d estructures de virus i pseudopartícules víriques no infectives cada cop més grans i complexes. Les estructures de càpsides de virus resoltes darrerament a alta resolució amb cristal·lografia de raigs X ens han mostrat nous tipus de plegaments per a les proteïnes de les càpsides, que difereixen completament del clàssic motiu en bsandwich. Aquests nous tipus de plegament s han trobat a les estructures recents, ja sigui com a subunitats independents, com el plegament a-helicoïdal de les subunitats que formen el core del virus de l hepatitis B o l estructura de la capa interna del core del virus de la «llengua blava» (Grimes et al., 1998), o com un domini fusionat al b-sandwich clàssic, tal com s ha trobat a l estructura del virus Norwalk (Prasad et al., 1999). Són importants, també, els avenços assolits en la determinació d estructures que mostren una part important del material genòmic ordenat a l interior dels virions (Gouet et al., 1999). Finalment, l ús de les tècniques de criomicroscòpia electrònica (crio-EM) i re-

construcció tridimensional d imatges de partícules aïllades, obre un nou camí per a respondre problemes biològics amb un detall estructural raonable per a l estudi de partícules que no poden ser cristal·litzades. Un dels aspectes més remarcables del desenvolupament de la crio-EM és la consistència entre els mapes que provenen de les reconstruccions 3D i les estructures de raigs X. La reconstrucció tridimensional d objectes no cristal·lins immersos en una solució vitrificada permet obtenir mapes 3D compatibles amb els mapes derivats de les estructures que provenen de la difracció de raigs X. La resolució d aquests mapes és encara limitada (15-30 Å, a causa de l elevat grau de subenfocament necessari per a obtenir un contrast adient en les imatges) però és suficient per a posicionar les estructures atòmiques dels diferents dominis i subunitats. El desenvolupament de programari per a fer les superposicions de les estructures atòmiques en els mapes crio-EM és una àrea d estudi que actualment es troba en plena activitat (Rossmann, 2000; Saibil, 2000). L estratègia d aïllar, cristal·litzar i determinar l estructura dels diferents components d un complex macromolecular, i combinar després les estructures per a formar un model del complex d acord amb els mapes 3D obtinguts de les reconstruccions de crio-EM s ha aplicat amb gran èxit a la resolució de les estructures de diferents partícules víriques en complex amb receptors i anticossos neutralitzants. La visualització dels receptors cel·lulars en complex amb rhinovirus del grup major (Kolatkar et al., 1999), poliovirus (He et al., 2000; Xing et al., 2000) i coxsackievirus (He et al., 2001) ha revelat

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 117

ESTRUCTURA DE GRANS AGREGATS MOLECULARS 117 )$%

9,586 3XULILFDFLy GH OD SURWHwQD L SUHSDUDFLy GH OD PRVWUD 2EWHQFLy GH PRQRFULVWDOOV

2EWHQFLy GH OHV LQWHQVLWDWV GH GLIUDFFLy

&ULRFULVWDOÂORJUDILD 2EWHQFLy GH OHV GDGHV D SDUWLU G¶XQ ~QLF FULVWDOO FRQJHODW D .

0XQWDWJH L UHFROOLGD GH OHV GDGHV D WHPSHUDWXUD DPELHQW 2EWHQFLy GHOV GLIUDFWRJUDPHV D SDUWLU GH FHQWHQDUV GH FULVWDOOV

2EWHQFLy GH OHV IDVHV 5HPSODoDPHQW PROHFXODU

0$3$ ,1,&,$/

([WHQVLy GH OHV IDVHV PLWMDQoDQW XQ SURFHVV LWHUDWLX GH PRGLILFDFLRQV GH OD GHQVLWDW HOHFWUzQLFD

237,0,7=$&,Ï '(/ 02'(/ 6LVWHPHV JUjILFV

$),1$0(17

0$3$ ),1$/

0$3$ ,1,&,$/

$),1$0(17

02'(/ ),1$/

0$3$ ),1$/ 02'(/ ),1$/

FIGURA 1.

Diagrama del procediment que cal seguir per a la determinació d una estructura cristal·logràfica.

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 118

118 NÚRIA VERDAGUER, WENDY F. OCHOA, DIEFER BLAAS I IGNACIO FITA

com receptors diferents s uneixen de manera diferent en depressions semblants a la superfície de les partícules i, excepcionalment, com un receptor s uneix a una regió completament exposada a la superfície d un rhinovirus de grup menor (Hewat et al., 2000). A més, la resolució de diferents estructures de complexos virus-anticossos ha permès localitzar els epítops, definir les diferents propietats de neutralització sobre la base de les orientacions relatives dels fragments Fab units a les càpsides, i també identificar els residus involucrats en contacte entre les dues molècules (Smith et al., 1993; Hewat et al., 1996, 1997, 1998; Verdaguer et al., 1999). En aquesta comunicació es presentarà esquemàticament la metodologia emprada per a l obtenció de models estructurals d aquests grans agregats moleculars per combinació de Crio-EM i cristal·lografia de raigs X, fent servir com a exemple la determinació de l estructura del virus del refredat comú de tipus 2 (HRV2) en complex amb dos anticossos monoclonals, 8F5 i 3B10, dirigits contra el lloc antigènic B del virus (Verdaguer et al., 2000), i que presenten diferents propietats de neutralització. L anticòs 8F5 reconeix un epítop continu que es localitza en el llaç antigènic E-F de la proteïna VP2 del virus. L anticòs s uneix de manera bivalent a la superfície de HRV2 a través dels eixos binaris de la partícula, fet que suggereix un mecanisme de neutralització basat a impedir el desacoblament del virus (Tormo et al., 1994; Hewat & Blaas, 1996). L anticòs 3B10, en canvi, reconeix un epítop conformacional que inclou residus de les proteïnes víriques VP1 i VP2. A banda, 3B10 s uneix a la superfície de HRV2 en una orientació que només és compatible amb la unió monovalent de l anticòs. Aquesta observació dóna suport a les anàlisis bioquímiques que mostren que 3B10 neutralitza la infectivitat de HRV2 per agregació de les partícules víriques (Hewat et al., 1998).

DETERMINACIÓ DE L ESTRUCTURA DELS COMPLEXOS HRV2-8F5 I HRV2-3B10 Per a abordar l estudi dels complexos HRV2-8F5 i HRV2-3B10 combinant les tècniques de difracció de raigs X i crio-EM és necessari: a) resoldre les estructures cristal·logràfiques dels diferents components aïllats el virus HRV2 i els fragments Fab dels anticossos 8F5 i 3B10 , i b) obtenir la reconstrucció tridimensional dels complexos virus-Fab o virus-anticòs fent servir crio-EM (figures 1-3). a) Determinació de les estructures cristal·logràfiques L obtenció de cristalls tridimensionals adients per a la difracció és un pas clau en la cristal·lografia. Per a aconseguir-ho és necessari obtenir les proteïnes amb un alt grau de puresa. Els fragments Fab es van obtenir a partir de líquid ascític de ratolí i es van purificar mitjançant diferents passos cromatogràfics (Tormo et al., 1994 ; Ochoa et al., en preparació); i el virus es va obtenir a partir de cultius cel·lulars infectats i es va purificar per ultracentrifugació en gradients de sacarosa (Verdaguer et al., 1999). Un cop obtinguts els cristalls, s ha de procedir a la recollida de les intensitats de difracció. La possibilitat de congelar els cristalls de 8F5 i 3B10 a temperatures de nitrogen líquid i la utilització de radiació de sincrotró va permetre obtenir dades completes a partir d un sol cristall de cada anticòs. En el virus, en canvi, no es van poder aplicar les tècniques de criocristal·lografia i les dades de difracció es van obtenir a partir de quasi un centenar de cristalls, muntats en capil·lars, i irradiats a temperatura ambient (figura 1). La determinació de les estructures, tant del virus com dels fragments Fab, s ha fet per reemplaçament molecular d un model

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 119

ESTRUCTURA DE GRANS AGREGATS MOLECULARS 119

3XULILFDFLy L SUHSDUDFLy GH OD PRVWUD &RQJHODFLy UjSLGD HWj OtTXLG 3UHVD GH PLFURJUDILHV

'LJLWDOLW]DFLy GH OHV PLFURJUDILHV

,QGLYLGXDOLW]DFLy GH OHV SDUWtFXOHV 1RUPDOLW]DFLy L DMXVWDPHQW GH OHV LPDWJHV /RFDOL]DFLy GHOV FHQWUHV

< 'HWHUPLQDFLy GH OHV RULHQWDFLRQV /tQLHV FRPXQHV ; 8QLWDW DVLPqWULFD LFRVDKqGULFD DPE XQ HL[ ELQDUL XQ HL[ WHUQDUL L GRV TXLQDULV DGMDFHQWV

5HGHILQLFLy GHOV RUtJHQV 5HRULHQWDFLy $IHJLU KL SDUWtFXOHV L $XJPHQWDU QH OD UHVROXFLy

5HFRQVWUXFFLy WULGLPHQVLRQDO

5HSURMHFFLy GH O¶HVWUXFWXUD HQ ' HQ LPDWJHV ' SHU D FRPSDUDU HOV RULJLQDOV L UHGHILQLU QH OHV RULHQWDFLRQV

,17(535(7$&,Ï '( /¶(6758&785$

FIGURA 2. Diagrama del procediment que se segueix en la reconstrucció tridimensional de partícules icosaèdriques a partir d imatges de crioelectromicroscòpia.

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 120

120 NÚRIA VERDAGUER, WENDY F. OCHOA, DIEFER BLAAS I IGNACIO FITA

d estructura coneguda (Tormo et al., 1994; Verdaguer et al., 2000; Ochoa et al., en preparació). La resolució del virus HRV2 presentava algunes peculiaritats: les fases inicials a baixa resolució (5 Å) es van calcular a partir del posicionament de les coordenades d un altre rhinovirus, HRV1A (Kim et al., 1989), a la cel·la de HRV2 que presentava la simetria del grup espacial I222, on la partícula icosaèdrica s orientava seguint els eixos binaris cristal·logràfics. L afinament i extensió de fases es va fer amb un procés iteratiu de modificació de la densitat electrònica per aplanament del solvent desordenat i aplicant les restriccions de la simetria icosaèdrica del virus (figura 1). Els mapes de densitat electrònica obtinguts mitjançant aquest procés van permetre de reconstruir l estructura sencera de HRV2. Els models finals s obtenen a partir de cicles d afinament per minimització d energia que s alternen amb processos de reconstrucció manual de parts de l estructures que s han de retocar per a ajustar-les a la densitat electrònica experimental. b) Obtenció i reconstrucció d imatges de criomicroscòpia electrònica La preparació de la mostra és força més senzilla que en el cas de la cristal·lografia, ja que no és necessari obtenir cristalls; malgrat tot, també es requereix un alt grau de puresa de les mostres. Per a formar el complex s incuba el virus amb l anticòs en excés, durant una hora, per a assegurar la saturació dels llocs antigènics. Posteriorment s elimina l excés d anticòs amb una cromatografia d exclusió molecular. Es col·loca la solució en una reixeta del microscopi recoberta de carbó i es congela ràpidament en età líquid. amb aquest procés s aconsegueix la vitrificació de la mostra, i així se n manté l estat natiu hidratat i, a la vegada, es prevenen els danys per irradiació del feix d electrons. Durant tot

l experiment la mostra es mantindrà a temperatura de nitrogen líquid (100 K) i en condicions de buit dins del microscopi. La base de la formació de la imatge en microscòpia electrònica és la interacció dels electrons amb l objecte. Les lents electromagnètiques realitzen la funció de les lents òptiques del microscopi convencional, encara que presenten diverses aberracions esfèriques i cromàtiques: l astigmatisme, coherència posicional, etc., que obliguen a treballar amb obertures petites. Això limita la resolució del microscopi electrònic a 1-2 Å, tot i que es treballa a longituts d ona de 0,025 Å. La mida petita de l obertura té conseqüències importants a l hora de determinar les estructures tridimensionals, i això dóna lloc a una gran profunditat de camp, que fa que totes les parts d una mostra estiguin en el mateix focus. Això significa que la imatge d una preparació biològica prima, és una projecció bidimensional, i no una secció òptica. La densitat tridimensional completa s obté a partir d un gran nombre de projeccions que corresponen a les diferents vistes de l objecte. Un cop preses les imatges, les micrografies es digitalitzen i s analitzen amb mètodes informàtics. El procés de reconstrucció requereix, en primer lloc, la determinació de les diferents orientacions de les molècules individuals que s inclouran a l anàlisi (figura 2). El mètode de les línies comunes permet de determinar les orientacions relatives a partir de les línies comunes que presenten necessàriament els plànols corresponents a les transformades de Fourier de les diferents projeccions. En partícules icosaèdriques, la simetria de la mateixa partícula redueix considerablement el nombre de projeccions necessàries per a la reconstrucció tridimensional a una determinada resolució. Un altre aspecte important en la crio-EM és el contrast, especialment crític en l anàlisi

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 121

ESTRUCTURA DE GRANS AGREGATS MOLECULARS 121

326,&,21$0(17 , $-867$0(17 $ /¶ (63$, 5($/ $),1$0(17 $ /¶(63$, 5($/ , 5(&Ë352&

&5,67$/Â/2*5$),$ '( 5$,*6 ;

&5,20,&526&Ñ3,$ (/(&75Ñ1,&$

),77,1*

02'(/$7 '¶(6758&785(6 36(8'2$7Ñ0,48(6

FIGURA 3. Diagrama del procediment que cal seguir per a modelar les estructures de complexos virus-Fab partint dels mapes obtinguts a partir de les coordenades cristal·logràfiques dels diferents components (virus i Fab) en els mapes tridimensionals de la microscòpia.

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 122

122 NÚRIA VERDAGUER, WENDY F. OCHOA, DIEFER BLAAS I IGNACIO FITA

de partícules aïllades on hi hagi molt poca diferència de dispersió entre les macromolècules i el gel. Amb la finalitat d augmentar-ne el contrast i poder visualitzar l objecte d estudi és necessari obtenir les imatges fora de focus. Treballar fora de focus permet també alterar la funció de contrast de transferència (CTF), que ha de ser corregida en les anàlisis de mitjana i alta resolució. La pèrdua d informació a conseqüència d aquesta correcció es resol a força de recollir diferents conjunts d imatges a diferents valors de focus i de combinar la informació obtinguda. La utilització de microscopis cada cop més potents i coherents, com el Field Emision Gun (FEG), suposen un avenç important, encara que car, en l augment de la resolució de la microscòpia electrònica. Un cop coneguts els paràmetres d orientació de les partícules, les imatges es combinen per a obtenir un mapa de densitat electrònica tridimensional que es refina amb la comparació i la combinació amb noves imatges. Cada una es compara un altre cop amb el mapa, i això dóna lloc a un procés iteratiu d afinament que optimitza els paràmetres i millora el mapa de densitat (figura 2). Finalment, les estructures a alta resolució dels components del complex, virus i Fab, obtinguts per cristal·lografia (figura 1), s ajustaran als mapes de baixa resolució obtinguts del complex amb crio-EM (figura 2). L ajustament inicial es fa a l espai real mitjançant programes gràfics, i encaixant manualment els diferents components dins del mapa. Aquest primer model després s optimitzarà amb un procés d afinament de cos rígid a l espai real o recíproc (figura 3; Rossmann et al., 2000). CONCLUSIONS La combinació de les tècniques de criomicroscòpia electrònica i cristal·lografia de raigs X, permet obtenir informació estructu-

ral a resolució quasi atòmica de grans agregats moleculars difícilment cristal·litzables. L aplicació d aquestes tècniques al nostre laboratori ha permès la determinació de l estructura de complexos entre el virus del refredat comú, HRV2, i dos anticossos amb diferents propietats neutralitzants, que reconeixen dos tipus diferents d epítops: el 3B10 s uneix a un epítop estructural, i el 8F5 reconeix un epítop lineal, dintre del mateix lloc antigènic B del virus. El modelatge d ambdós complexos amb la utilització de mapes crio-EM ha permès de definir les interaccions que caracteritzen els dos tipus de reconeixement: a) La unió de l anticòs 3B10 a la càpsida de HRV2 es dóna per mitjà de contactes amb cadenes laterals d aminoàcids que es localitzen en diferents llaços de les proteïnes VP1 i, majoritàriament, dins de VP2 al virus (figura 4a i 4b). Aquest reconeixement pot donar-se sense que hi hagi cap canvi conformacional important a la superfície de HRV2. b) El reconeixement de HRV2 fet per l anticòs 8F5 es dóna exclusivament per contactes directes amb el llaç E-F de VP2. En el complex 8F5-HRV2, el llaç E-F, presenta una conformació i disposició espacial completament diferents de la que es va determinar a l estructura nativa del virus (figura 4c i 4d). AGRAÏMENTS Les dades de difracció del virus HRV2 i de l anticòs 3B10 s han recollit a l ESRF (Grenoble) Agraïm a Elizabeth Hewat els mapes de crio-EM dels complexos HRV2-8F5 i HRV23B10.

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 123

ESTRUCTURA DE GRANS AGREGATS MOLECULARS 123

FIGURA 4. a) Estructura dels complexos HRV2-3B10. Les tres proteïnes del virus es mostren en el codi de colors estandard: VP1 (blau), VP2 (verd) i VP3 (vermell). 3B10 (rosa) interactua amb HRV2 mitjançant contactes que es donen amb residus de diferents llaços de VP2 i VP1. b) Ampliació de la zona de contacte, on es mostra el detall de les interaccions. c) Diferents posicions del llaç E-F de VP2 en l estructura del virus natiu (groc) i quan és reconegut per l anticòs 8F5 (blau cel). d) Detall de la superposició dels dos llaços E-F.

BIBLIOGRAFIA GOUET. P.; J. M. DIPROSE; J. M. GRIMES; J. N. BURROUGHS; S. ZIENTARA; D. I. STUAT; P. P. MERTENS (1999). «The

highly ordered double-stranded RNA genome of bluetongue virus revealed by crystallography». Cell, núm. 97, pàg. 481-490. GRIMES, J. M.; J. N. BURROUGHS; P. GOUET; J. M. DIPROSE; R. MALBY; S. ZIENTARA; P. P. MERTENS; D. I. STUAT (1998).

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 124

124 NÚRIA VERDAGUER, WENDY F. OCHOA, DIEFER BLAAS I IGNACIO FITA «The atomic structure of the bluetongue virus core». Nature, núm. 395, pàg. 470-478. HE, Y.; B. D. BOWMAN; S. MUELLER; C. M. BATOR; J. BELLA; X. PENG; T. BAKER; E. WIMMER; R. J. KUHN; M. G. ROSSMANN (2000). «Interaction of the poliovirus receptor with poliovirus». Proc. Natl. Acad. Sci. USA, núm. 97, pàg. 79-84. HE, Y.; P. R. CHIPMAN; J. HOWITT; C. M. BATOR; M. A. WHITT; T. S. BAKET; R. J. KUHN; C. W. ANDERSON; P. FREIMUTH; M. G. ROSSMANN (2001). «Interaction of coxackievirus B3 with the full length coxackievirus-adenovirus receptor». Nature Struc. Biol., núm. 8, pàg. 874-878. HEWAT, E. A.; D. BLAAS (1996). «Structure of a neutralising antibody bound bivalently to human rhinovirus 2». EMBO J., núm. 15, pàg. 1515-1523. HEWAT, E. A.; N. VERDAGUER; I. FITA; W. BLAKEMORE; S. BROOKES; A. KING; J. NEWMAN; E. DOMINGO; M. G. MATEU; D. STUART (1997). «Structure of the complex of an Fab fragment of a neutralizing antibody with foot-and-mouth disease virus: positioning of a highly mobile antigenic loop». EMBO J., núm. 16, pàg. 1492-1500. HEWAT, E. A.; T. C. MARLOVITS; D. BLAAS (1998). «Structure of a neutralizing antibody bound monovalently to human rhinovirus 2». J. Virol., núm. 72, pàg. 4396-4402. HEWAT, E. A.; E. NEWMANN; J. F. CONWAY; R. MOSER; T. C. MARLOVITS; D. BLAAS (2000). «The cellular receptor to human rhinovirus 2 bonds around the 5-fold axis and not in the canyon : a structural view». EMBO J., núm. 19, pàg. 6317-6325. KIM, S.; M. A. MCKINLAY (1989). «Crystal structure of human rhinovirus serotype-1A (HRV1A)». J. Mol. Biol., núm. 210, pàg. 91-111. KOLATKAR, P. R.; J. BELLA; N. H. OLSON; C. M. BATOR; T. S. BAKER; M. G. ROSSMANN (1999). «Structure of two rhinovirus serotypes complexed with fragments of their cellular receptor». EMBO J., núm. 18, pàg. 6249-6259.

PRASAD, B. V.; M. E. HARDY; T. DOKLAND; J. BELLA; M. G. ROSSMANN; M. K. ESTES (1999). «X-ray crystallographic structure of the Norwalk virus capsid». Science, núm. 286, pàg. 287-290. ROSSMANN, M. G. (2000). «Fitting atomic models into electron-microscopy maps». Acta Crystallogr. D., núm. 56, pàg. 1341-1349. SAIBIL, H. R. (2000). «Conformational changes studied by cryo-electron microscopy». Nature Struc. Biol., núm. 7, pàg. 711-714. SMITH, T. J.; N. H. OLSON; R. H. CHENG; E. S. CHASE; T. S. BAKER (1993). «Structure of a human rhinovirus-bivalently bound antibody complex: Implications for viral neutralisation and antibody flexibility». Proc. Natl. Acad. Sci. USA, núm. 90, pàg. 7015-7018. TORMO, J.; D. BLAAS; N. R. PARRY; D. ROWLANDS; D. STUART; I. FITA (1994). «Crystal structure of a human rhinovirus neutralising antibody complexed with a peptide derived from viral capsid protein VP2». EMBO J., núm. 13, pàg. 2247-2256. VERDAGUER, N.; G. SCHOEHN; W. F. OCHOA; I. FITA; S. BROOKES; A. KING; E. DOMINGO; M. G. MATEU; D. STUART, D.; A. HEWAT (1999a). «Flexibility of the major antigenic loop of foot-and-mouth disease virus bound to an Fab fragment of a neutralising antibody: Structure and Neutralisation». Virology, núm. 255, pàg. 260-268. VERDAGUER, N.; T. C. MARLOVITS; J. BRAVO; D. I. STUART; D. BLAAS; I. FITA (1999b). «Crystallisation and preliminary X-ray analysis of human rhinovirus serotype 2 (HRV2)». Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr., núm. 55, pàg. 1459-1461. VERDAGUER, N.; D. BLAAS; I. FITA (2000). «Structure of Human Rhinovirus serotype 2 (HRV2)». J. Mol. Biol., núm. 300, pàg. 1179-1194. XING, L.; K. TJARLUND; B. LINDQVIST; G. G. KAPLAN; D. FEIGELSTOCK; R. H. CHENG; J. M. CASASNOVAS (2000). «Distinct cellular receptor interactions in poliovirus and rhinoviruses». EMBO J., núm. 19, pàg. 12071216.

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 125

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 126

p005-124.qxd

23/12/99

17:54

Página 127

AQUESTA OBRA S HA ACABAT D IMPRIMIR A L OBRADOR DE LIMPERGRAF, SL A BARBERÀ DEL VALLÈS EL DIA 30 DE DESEMBRE DE 2002

13:37

PÆgina 1

ANTIMICROBIANS

21/12/2005

TREB. SOC. CAT. BIOL., VOL. 55, 2004

SobreCub. Volum 55.qxd

ANTIMICROBIANS JOAQUIM RUIZ EDITOR

TREBALLS DE LA SOCIETAT CATALANA DE BIOLOGIA VOLUM 55, 2004

13:37

PÆgina 1

ANTIMICROBIANS

21/12/2005

TREB. SOC. CAT. BIOL., VOL. 55, 2004

SobreCub. Volum 55.qxd

ANTIMICROBIANS JOAQUIM RUIZ EDITOR

TREBALLS DE LA SOCIETAT CATALANA DE BIOLOGIA VOLUM 55, 2004