Septiembre-Diciembre 2013 by ConScience & Art

Directorio Instituto Politécnico Nacional Yoloxóchitl Bustamante Díez Directora General Fernando Arellano Calderón Secretario General Daffny J. Rosado Moreno Secretario Académico Norma Patricia Muñoz Sevilla Secretaria de Investigación y Posgrado Óscar Jorge Súchil Villegas Secretario de Extensión e Integración Social María Eugenia Ugalde Martínez Secretaria de Servicios Educativos José Jurado Barragán Secretario de Gestión Estratégica Dely Karolina Urbano Sánchez Secretaria de Administración Cuauhtémoc Acosta Díaz Secretario Ejecutivo de la Comisión de Operación y Fomento de Actividades Académicas Salvador Silva Ruvalcaba Secretario Ejecutivo del Patronato de Obras e Instalaciones Adriana Campos López Abogada General Jesús Ávila Galinzoga Presidente del Decanato Ana Laura Meza Meza Coordinadora de Comunicación Social

“La Técnica al Servicio de la Patria”

VOLUMEN 1 • NÚMERO 1 •SEP-DIC 2013

www.ipn.mx

05 Inmunología

Immune and Therapeutic Roles of GM-CSF

23 Sociología de la Ciencia Oncohematología Medicina Interna

Leprosy patients recognize antigens of M.habana

Editor Responsable Editor Dr. Luis Jiménez Zamudio Comité Editorial Editorial Board Dra. Isabel Wong Baeza ENCB-IPN, México Dra. Iris Estrada García ENCB-IPN, México Dra. Jeanet Serafín López ENCB-IPN, México Dr. Javier Sánchez García ENCB-IPN, México Dr. Rommel Chacón Salinas ENCB-IPN, México Comité de Arbitraje Arbitration Commitee Dra. Esther Orozco Cinvestav-IPN, México Dr. Sergio Estrada Parra ENCB-IPN, México Equipo Editorial Editorial Staff Catalina López Saucedo Violeta Álvarez Jiménez Jacqueline Liszeth Oliva Ramírez Moisés Talavera Paulin Félix Matadamas Martínez Pablo Núriban Valero Pacheco Georgina Filio Rodriguez Alejandro Francisco Cruz Arte Art Fortino Vázquez Arellano Diseño y diagramación Design Nancy J. Tiol Reserva de Derechos al Uso Exclusivo: en trámite ISSN en línea: en trámite ISSN impreso: en trámite Publicación con arbitraje por pares Los artículos son responsabilidad exclusiva de sus autores y no reflejan necesariamente el criterio de la institución, a menos que se especifique lo contrario. Se autoriza la reproducción total o parcial siempre y cuando se cite explícitamente la fuente. Queda prohibida la reproducción total o parcial de las imágenes y fotografías de la portada y reseña de la portada sin consentimiento escrito del autor. Revista cuatrimestral, sin fines de lucro. Todos los derechos reservados 2013. ConScience & Art Para mayor información y permisos leadership@conscience-and-art.com conscienceandart@gmail.com Página de la revista: http://conscienceandart.wordpress.com/ Acceso en línea de la revista: http://issuu.com/inhoutes/docs/consciencen1v5

ÍNDICE

Inmunología 05 Revisión: GM-CSF: much more than a hematopoietin 22 Comentario: El romanticismo que tiñe de rojo al papel

SOM 32 Revisión Filosofía del acto médico 40 Revisión Sepsis 48 Caso clínico Embarazo Ectópico

53 Sección Monográfica Inmunidad humoral. Primera entrega

58 Reseña de la portada 62 Invitaciones 63 Itinerarios

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Con este número hace su presentación en sociedad una nueva revista:

EDITORIAL La nuestra presenta algunas características que creemos que la justifican plenamente:

En un mundo donde las revistas científicas pasan de 26,000 (sin mencionar las no científicas)*

¿Es realmente necesaria

una más? * Thomson Reuters Web of Knowledge examines 23,000 journals, 5,200 in the life sciences.

• Es el producto de la creatividad y del entusiasmo de un grupo de jóvenes que se inician en el campo de la ciencia. El concepto, el desarrollo de la idea, la búsqueda del contenido, su edición, construcción y difusión han estado a cargo de estos estudiantes de posgrado, cuyo único objetivo es lograr un vehículo diferente para la comunicación de los progresos en las disciplinas científicas en las que se inician. • Pretende integrar la ciencia con el arte, no como un recurso de mercado para atraer al lector, sino como un esfuerzo para lograr la interfertilización de las dos áreas, tanto durante la elaboración de la revista, que requerirá la interacción de científicos y artistas, como durante su lectura, la que llevará a la integración de las dos disciplinas en la atención del lector. Desde luego, nuestra revista es un organismo vivo, sujeto a cambios y a evolución. Para el éxito de esta aventura, dependemos totalmente del lector: de su atención, de su aprobación y sobre todo, de su crítica y de su retroalimentación, surgirán las ideas que determinen la trayectoria que la revista siga.

Dr. Luis Antonio Jiménez Zamudio

INMUNOLOGÍA

Review Of Narwhals And Unicorns, Or All That Glisters Is Not Gold.

In Medieval Europe, narwhal’s tusks were posed as unicorn’s horns; likewise, GM-CSF had been thought to be to be just a growth factor. In this review, the authors explain us why GM-CSF is not just another hemapotoietin.

Immune and Therapeutic Roles of the Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Alejandro Francisco-Cruz1,2, Dulce Mata-Espinosa2, Rogelio Hernández-Pando2 Department of Immunology, National School of Biological Sciences, National Polytechnic Institute, DF Mexico City 11340, Mexico Section of Experimental Pathology, Department of Pathology, National Institute of Medical Sciences and Nutrition “Salvador Zubirán”, DF Mexico City1400, Mexico.

1 2

Correspondence should be addressed to RHP (Section of Experimental Pathology, Department of Pathology, National Institute of Medical Sciences and Nutrition “Salvador Zubirán”, Vasco de Quiroga 15, Tlalpan, México D.F. ZC14000, México DF, Tel: +52-55 54 85 34 91, Fax: +52-55 54 85 34 91, email: rhdezpando@hotmail.com)

Summary

ranulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor (GM-CSF) is broadly known as hematopoietin, but its effect on increasing circulating leucocytes is less efficient than induced by other hematopoietins and it seems that its extra-hematopoietic functions are more relevant. Proinflammatory and immunomodulatory effects of GM-CSF are the leading roles linked with immune system homeostasis. GM-CSF induces the differentiation, proliferation and activation of macrophages (MØ) and dendritic cells (DC) for subsequent T helper cell type 1 (TH1) and cytotoxic T lymphocyte (CTL) activation. GM-CSF has significant physiological implications for the lung clearance since its absolute or relative deficiency induces pulmonary alveolar proteinosis (PAP) with immune dysfunctions. Regarding to its clinical implications, antitumor activity of GM-CSF is being investigated in several clinical trials. GM-CSF is the target of investigations for therapy in systemic inflammatory diseases such as rheumatoid arthritis and Crohn’s disease. Indeed, GM-CSF is positioned as an excellent adjuvant for prophylactic and therapeutic vaccines. The aim of this review is ponder the conventional indication and knowledge of GM-CSF as hematopoietin and the current results of investigations related to its non-hematopoietic functions and therapeutical implications.

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INMUNOLOGÍA

Immune and Therapeutic Roles of GM-CSF

Colony-stimulating factors (CSF) are crucial cytokines for the survival, proliferation, differentiation, maturation, and functional activation of hematopoietic cells.1 There are three types of CSF namely macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) or CSF1, granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) or CSF2, and granulocyte colonystimulating factor (G-CSF) or CSF3. CSF were discovered accidentally when solid-state culture systems allowed specific precursors of granulocytes and macrophages to proliferate and form colonies of maturing progeny which proliferation was not autonomous.1,2 The unknown function of a cell product that needs to be added to stimulate colony formation resulted in the operational name “colony-stimulating factor”.1,2 Beside to CSF, other hematopoietic cytokines have been described such as IL-3, IL-5, IL-11, stem cell factor (SCF), leukemia inhibitory factor (LIF), Flt3 ligand (Flt3L), erythropoietin (EPO) and thrombopoietin (TPO).1 As part of the hematopoietin family, GM-CSF is a four-helix packing cytokine (Figure 1A). GM-CSF gene is located in the 5q31 region; curiously the same chromosomal location associated with acute myeloid leukemia (AML) and other genes encoding cytokines such as IL-4, IL-5 and IL-13.2-4 GM-CSF was first described for its ability to induce mouse myelopoiesis, but early investigations on GM-CSF functions were confused due to the fact that some studies focused not only on granulocyte and macrophage colony formation, but also on eosinophil, megakaryocyte, and erythroid colony formation. Sometime after, IL-3 was discovered as the responsible for that “pluripoietic” effect.2-4 At that time, the lack of cloning and sequence techniques impeded the functional differentiation between these two cytokines and others, in fact cloning and sequencing of murine GM-CSF was done in 1994, and human GM-CSF was sequenced in 1985. GMCSF was the first cloned hematopoietic growth factor. In 1986, cloning technique revealed that the hypothetical human “pluripoietin” was actually G-CSF and thereafter it has being used as the most important hematopoietic factor in humans.2-5 In the early nineties, recombinant human GM-CSF (rhGM-CSF) was available in US for therapy use, it

was initially prescribed to enhance myeloid reconstitution in transplanted patients; since then rhGMCSF has been used as myeloproliferative agent.1,5,6 Later clinical trials revealed a pro-inflammatory effect, resulting in its potential usefulness as a prophylactic or adjuvant therapy for patients at high risk of infections such as immunosuppressed patients.7 In 1996, GM-CSF was approved by the Food and Drug Administration (FDA) for the treatment of leukopenia associated with fungal infections.7 Now, key functions of GM-CSF are recognized due its ability inducing inflammatory responses of differentiated cells such as eosinophils, neutrophils, MØ, and DC.1,5,6

GM-CSF expression and target cells Under physiological conditions, GM-CSF can be detected in the serum at concentrations ranging from 20-100 pg/ml.8 The production of GM CSF usually requires stimulation with cytokines, antigens, microbial products or inflammatory agents, such as IL-1, TNF-a, or LPS.8 Circulating levels of GM-CSF can be rapidly and markedly raised in response to LPS. In fact, GM-CSF was first purified from the conditioned medium of lung tissue from mice after LPS administration.8 GM-CSF under stimuli is produced by a variety of cells such as activated T cells (IL-23 induced GM-CSF production in TH17 cells, IL-1β potently enhanced GM-CSF production in both TH1 and TH17 cells), stromal cells, Paneth´s cells, MØ, DC, mast cells, endothelial cells, smooth muscle cells, fibroblasts and chondrocytes.8,9 T cell–derived GM-CSF has an important role in the crosstalk between antigen-presenting cells and T cells activation.8,9 In fact, the major target cells of GM-CSF are DC, inducing maturation; in granulocytes it induces activation, survival and differentiation; in alveolar MØ (AMØ) and invariant natural killer T (iNKT) cells GM-CSF induces steady-state d i f f e r - e n t i a - tion; and in microglia Provided by: http:www.strangescience.net and pneuOriginally published in: Monstrorum Historiae mocytes Now appears in: Monsters: A bestiary of the t y p e Bizarre by Christopher Dell I, it

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Introduction and background

INMUNOLOGÍA

Review

induces proliferation. The expression of GM-CSF receptor (GM-CSFR) has been described on lymphocytes, endothelial cells, and tumor derived cells but in these cell types its function is less clear.8-11 Early investigations with GM-CSF knock-out mice expected substantial effect on hematopoiesis and myeloproliferative activities, but interestingly these animals did not showed abnormalities in myelopoiesis, while in the lungs significant alterations were observed exhibiting the characteristic abnormalities of alveolar proteinosis (PAP), indicating a significant role of GM-CSF in the lung physiology.5,10 In addition, GM-CSF deficient mice have showed defects on the differentiation of iNKT cells during thymic ontogeny. Now it is known that GM-CSF acts at the early thymic iNKT cell precursor stage, after lineage commitment and positive selection by regulating the acquisition of secretory function for immune synapse-directed release of key immunoregulatory cytokines.5,10

GM-CSF receptor GM-CSF receptor (GM-CSFR) is an heterodimer formed by a ligand-specific alpha subunit (GMCSFRα or CD116; 60-80 kDa) and a beta subunit (GM-CSFRβc or CD131; 120-140 kDa) which is shared with IL-3 and IL-5 receptors.12 Both subunits are type I transmembrane glycoprotein and structurally are characterized by the presence of homology cytokine-receptor modules, which consist of two domains of fibronectin type III.13 GM-CSFRα binds its ligand with low affinity (K¬D = 0.2-100 nM), however the expression of GM-CSFRβc increases the affinity to KD = 100 pM.13 Eight conformational variants have been described for GM-CSFRα, but only two are biologically relevant for transductional effect. The α-1 and α-2 isoforms contain transmembrane and cytoplasmic regions with abundant serine and proline residues. The complete deletion of the cytoplasmic region of GM-CSFRα does not allow growth and cell differentiation. GM-CSFRβc is constitutively expressed in the cell surface.14 GM-CSFR is expressed at very low levels on the surface of hematopoietic cells, from 100 to 1,000 molecules per cell, similarly to IL-3R and IL-5R.13 GM-CSFR is also expressed on granulocytes and

macrophages progenitors cells, mature cells such as monocytes, MØ, DC, megakaryocytes, neutrophils, plasma cells, T lymphocytes, vascular endothelial cells, uterine cells, gastrointestinal tract epithelial cells, astrocytes, oligodendrocytes, and microglia cells.9,15,16

GM-CSF interactions with its receptor GM-CSF is able to bind subunit GM-CSFRβc in absence of GM-CSFRα, but only the formation of the heterodimer is able to transduce intracellular signals. It is thought that GM-CSFR activation follows the general rules regarding receptor dimerization followed by transphosphorylation of tyrosine residues in the receptor cytoplasmic domains. GM-CSFR does not have intrinsic tyrosine kinase activity; instead it requires the association of GM-CSFRβc with JAK-2 for GM-CSFRβc transphosphorylation, which requires two closer βc chains at the cytoplasmic region.17 Crystallographic studies have shown that GM-CSFRβc is in fact homodimeric but its cytoplasmic regions are quite separated (120 Å) avoiding transphosphorylation.17-19 A unique tertiary structure of the complex GMCSF:GM-CSFR has been described, it correspond to a coordinated dodecamer-structure which is necessary for receptor activation (Figure 2A). The association between GM-CSF and GM-CSFR involves three sites of interaction. The first consists of interaction between GM-CSF and GM-CSFRα. The second is the interaction between GM-CSF and two domains of two different GM-CSFRβc, finishing with a third stabilizing site which is formed between GMCSFRα and GM-CSFRβc. These sites of interaction determine the formation of a higher order dodecamer complex composed by two hexameric complexes linked by a fourth site of interaction. Antibodies and mutations directed to the fourth site of interaction significantly decrease GM-CSF transduction and lead the loss of the dodecamer complex.13 These interactions, which are only observed in GMCSFR, explain the transphosphorylation by GMCSF:GM-CSFR in which JAK-2 is only associated to the beta chain. The dodecamer complex product relocate closer two GM-CSFRβc, at a distance of 10 Å permitting transphosphorylation and subsequent signaling pathways.13,19

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INMUNOLOGÍA

Intracellular pathways activated by the interaction of GM-CSF with its receptor GM-CSFR transduction is similar to the IFNR family. The binding of GM-CSF with its receptor leads to activation of kinases of the Jak family which then phosphorylate STATs (signal transducers and activators of transcription) that migrate to the nucleus and bind specific DNA elements directing the transcription of specific genes related to cell differentiation. GMCSF induces cell proliferation mainly by activation and signaling of protein kinase C (PKC), preventing cell death by phosphatidylinositol 3 kinase (PI3K) and JAK/STAT5-Bcl-2 signaling. GM-CSF induces proliferating and inflammatory responses by MAPK and NFkB activation (Figure 2B).14,20 GM-CSF increases AMØ and neutrophils function. Proliferating AMØ increase the expression of TLR-4 and NFkB by direct GM-CSFR and IKB kinase interaction. GM-CSF regulates the expression of TLR-2 and TLR-4 in neutrophils and TLR-2 in monocytes. Additionally GM-CSF induces the release of IL-12 and TNF-α, and enhances the expression of MCP1 (monocyte chemoattractant protein 1) by Jak2Stat5 signaling.21,22 Recently, a specific signaling pathway has been described for inducing classic MØ phenotype or M1 and inflammatory DC, which is described below. SRC-like adapter protein (SLAP) functions as a negative regulator for DC maturation induced by GM-CSF. Overstimulation with GM-CSF on DC determines a defect in its maturation, suggesting a specific threshold for correct stimulation by SLAP action.23 Provided by: http: www.strangescience.net Originally published in: Perigrinationes ad Terram Sanctam Now appears in: The Unicorn by Nancy Hathaway

After the binding of GM-CSF with its receptor, the intracellular signals that induce inflammation, cell survival, differentiation and proliferation are mainly mediated by GM-CSFRβc. However, some signaling pathway by GM-CSFRα has been described. GM-CSFRα subunit-associated protein (GRAP) binds to the cytoplasmic region of the alpha chain; mRNA encoding GRAP is highly conserved and overexpressed in neoplastic cells but there is not described specific function.24 Curiously, there is evidence that GM-CSFRα signaling is relevant and necessary for inducing pain, particularly related to cancer.25 In certain systems, GM-CSFRα is able to increase glucose uptake through transporters.26 cKit and GM-CSFRα are well known markers of hematopoietic cells differentiation. Starting with a high level of c-Kit and negligible amount of GM-CSFRα, hematopoietic stem or progenitor cells down-regulate c-Kit and up-regulate GM-CSFRα when they enter to the granulocyte/macrophage lineage. Indeed GM-CSFRα interacts with c-Kit and inhibits c-Kit signaling.27,28 GM-CSFRα has two isoforms, stimulation of GMCSFRα1 isoform induces over expression of CD86 and F4/80 cell surface proteins and it can induce intense phosphorylation of JAK-2.29 GM-CSFRα2 isoform has a different cytoplasmic domain but generally exhibits similar properties than GM-CSFRα1 related to GM-CSFRβc association.30 There are soluble isoforms of both α-subunits derived from alternative mRNA splicing but their functions are not known.30,31

GM-CSF clinical uses and indications as hemopoietin. GM-CSF is the prototype of growth factor extensively used as hemopoietin in clinical practice. Sargramostim or Leukine® (Bayer HealthCare Pharmaceuticals) is the generic or brand name of rhGM-CSF produced in yeast (S. cerevisiae), whose amino-acid sequence is homologous to endogenous human GM-CSF, except that it contains leucine instead of proline at the 23rd position and may have different glycosylated motives. The degree of glycosylation affects biological activity,

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Immune and Therapeutic Roles of GM-CSF

INMUNOLOGÍA

Review

antigenicity, toxicity, and pharmacokinetics. Molgramostim is the rhGM-CSF produced in E. coli, and Regramostim is the rhGM-CSF produced in Chinese hamster ovary cells.7 Sargramostim is beneficial preventing infection in ad hoc patients by enhancing immune cell function, and it is the only growth factor approved in the US for treatment following induction chemotherapy in older adults with acute myelogenous leukemia (AML), to shorten the time for neutrophil recovery and reduce the incidence of severe and life-threatening infections.7,32 Sargramostim has also been approved in the US for it use in four additional indications: a) myeloid reconstitution following allogeneic bone marrow transplantation (BMT), b) myeloid reconstitution following autologous BMT, c) peripheral blood stem cell (PBSC) mobilization and subsequent myeloid reconstitution in patients undergoing PBSC transplantation, and d) bone marrow transplantation failure or engraftment delay.32

Pharmacokinetics and pharmacodynamics of rhGM-CSF When sargramostim is administered by intravenous infusion (IV) over two hours, the mean beta halflife is approximately 60 minutes. Peak concentrations of GM-CSF are observed in blood samples obtained during or immediately after completion of sargramostim infusion. GM-CSF is last detected in blood samples obtained at three or six hours. When sargramostim is administered by subcutaneous injection (SC) to normal volunteers, serum GM-CSF is detected at 15 minutes; the first sample point. The mean beta half-life is approximately 162 minutes. Peak levels are after one to three hours post injection, and sargramostim remains detectable for up to six hours. After SC administration, concentration of circulating GM-CSF reaches normal levels at 7 days post-treatment. No accumulation is observed after an administration supported by 28 days.7,32 Parenteral administration of rhGM-CSF alters the kinetics of myeloid progenitor cells in bone marrow causing rapid cell-cycle entry and reduced cell-cycle time up to 33%. These effects are reversible once administration is discontinued. However, counts of mobilized progenitor cells into the periphery by GMCSF (CD34+ mononuclear cells) in healthy donors and in patients is about 10 times lesser than G-CSF (12.6x106 cells vs 119x106cells, respectively), and

these effects are not synergistic when both CSF are administered. Thus, myelopoiesis could be more enhanced by G-CSF than GM-CSF.6,33

Indication of rhGM-CSF and rhG-CSF for leukopenia rhGM-CSF increases peripheral neutrophil count with minimal increment of circulating monocytes and currently it is indicated as second line for the treatment of patients with severe neutropenia.7,34 rhGM-CSF induces mild increase of circulating eosinophils and basophils and primes neutrophils enhancing its phagocytic function. Filgrastim and pegfilgrastim are currently approved by FDA for the prevention of chemotherapy-induced neutropenia.1,7 The deletion of the encoding gene of cytokines such as EPO, G-CSF, TPO, and M-CSF produces dramatic reductions in each respective cell population, being lethal in the case of EPO. This response is different in the case of the deletion of GM-CSF, which circulating cell counts are unaltered but functional activities of mature cells are quite reduced.1 Therapeutic use of rhGM-CSF for leukopenia could be overestimated. Leading recommendations of the use of CSF for neutropenia are based on results from trials with G-CSF, and head-to-head comparative studies about clinical benefits of G-CSF compared with other CSF such as GM-CSF are lacking even when several studies, in vitro and in vivo, have showed lower myeloproliferative activity for GM-CSF compared with G-CSF.7,34 Moreover, when comparing prophylactic or therapeutic doses of GCSF and GM-CSF there are ample differences even though their respective molecular weight is similar. NCCN guidelines recommend filgrastim at a daily dose of 5 µg/kg, and sargramostim in a daily dose of “250 µg/m2”.34

Non-hematopoietic functions of GM-CSF As mentioned previously, GM-CSF has significant non-hematopoietic effects in different crucial physiological processes. In this section are described significant functions of GM-CSF, specifically in inflammation and immune response:

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Immune and Therapeutic Roles of GM-CSF

Inflammation The contribution of GM-CSF in the inflammatory response has been evaluated by in vitro administration of rhGM-CSF in monocytes, MØ and neutrophils where GM-CSF induces longer survival, increased inflammatory mediators and contributes in the elimination of pathogens and tumors.35,36 An enhanced efficiency of MØ occurred with secondary stimuli such as LPS and IFN-γ, after initial stimulation with GM-CSF. Intraperitoneal administration of GM-CSF induces a strong recruitment of MØ in humans,37,38 and ex vivo studies with human monocytes and MØ obtained from mice treated with GMCSF show higher pro-inflammatory response after in vitro stimulation with LPS.38 One of the most interesting feature of pro-inflammatory effect of GM-CSF was obtained when GM-CSF was given to patients with Felty’s syndrome (rheumatoid arthritis, splenomegaly and neutropenia), arthritis was exacerbated with higher levels of IL6.39 Similarly, patients with reumathoid arthritis (RA) treated with GM-CSF after chemotherapy, experienced worsening of artritis.40 Experimental models of RA have confirmed that the administration of GMCSF exacerbates the severity of RA.41,42 GM-CSF has been implicated in the pathogenesis of asthma, but its role is controversial since its presence or absence in this disease depend on the stage and age of the patient.43,44 Antibodies against

GM-CSFRβc have been used for the treatment of asthma, with the rational that eosinophilia is conditioned by the stimulation of this chain subunit shared with IL-5, but the results are not convincent.45 Activation and regulation of the immune system GM-CSF enhances oxidative metabolism, cytotoxicity, and antibody-dependent phagocytosis. This cytokine also increases maturation, proliferation and migration of DC, and enhances the expression of MHC-II, CD80 and CD86.7,9 Human monocytes treated for 24-48 hrs with GM-CSF exhibited higher expression of MHC-II molecules and decrease the Class II-associated invariant chain peptide (CLIP), increasing CD86 and CD40, but not CD1a, or CD16.46 Indeed, GM-CSF is a DC-activating cytokine, and its manipulation in vitro and in vivo enhances response against antimicrobial agents.47 GM-CSF increases the expression of adhesion molecules on neutrophils (β-integrins), IgGFc and activated complemented receptors, enhancing neutrophils chemotaxis, phagocytosis, synthesis of leukotriene B4, arachidonic acid release and superoxide anion generation. Moreover, GM-CSF increases survival of neutrophils from 96 hours to 216 hours preventing its apoptosis. Interestingly, stimulation of human neutrophils with this cytokine, alone or in combination with

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Provided by: http: www.strangescience.net Originally published in: De Piscibus Now appears in: The Great Naturalist edited by Robert Huxley

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Review

IFN-γ, induces its MHC-II expression. However, this expression fails due to the absence of co-stimulatory molecules expression, but neutrophils are able to activate T cells in presence of superantigens.48,49 GM-CSF produced by the endometrium induces tolerance in early pregnancy, regulating the maturation of DC and MØ from the uterus.50 GM-CSF directs DC from the Central Nervous System (CNS) toward an inhibitory phenotype; in contrast DC recruited by GM-CSF from the peripheral circulation toward CNS have a pro-inflammatory phenotype. These contrasting functions have been related to the pathogenesis of autoimmune encephalomyelitis (AE).51 AMØ orchestrate resolution of inflammation and tissue repair of the lung, and coordinate structural and functional parenchyma repair processes that are essential for homeostasis.52 Different extracellular signals are integrated to shape pulmonary macrophage phenotypes during lung inflammation, but particularly TNF-a released from activated resident AMØ induces epithelial GM-CSF expression, which in turn initiates alveolar epithelial cell proliferation and contributes to restoring the alveolar barrier function possibly via Stat5-dependent autocrine signaling loop.53 Pneumocytes type II express both α and β GM-CSF receptor subunits. It is possible that in response to acute lesion, proliferating type II pneumocytes cells down-regulates GM-CSFR expression during its trans-differentiation into type I pneumocytes cells.52,53 GM-CSF regulates the inflammatory response by activation of the Jak kinase–STAT5 transcription factor pathway, inducing the expression of interferonregulating factor 5 (IRF5). A high IRF5 expression results in classical macrophage activation (M1) or inflammatory macrophage induction. IRF5 expression is induced specifically by GM-CSF or IFN-γ but is unresponsive to IL-4. IRF5 and Re1A act together inducing TNF-α gene expression. IRF5 inhibits the transcription of IL-10 and promotes IFN-γ expression. In contrast, when M-CSF predominates, IRF4 is overexpressed inducing a M2 MØ phenotype. Indeed M-CSF is constitutively produced by several cell types, including fibroblasts, endothelial cells, stromal cells and osteoblasts. Therefore, there is a steady-state production of M-CSF that probably polarizes macrophages toward M2 phenotype trough IRF4 control.54 In comparison, GM-CSF produces a

pro-inflammatory enviroment by the expression of IL12, IL6, and IL-23 by MØ.52,54 GM CSF has a greater role in the production of monocyte-derived DC than in the generation of other DC subsets. These cells acquire potent antigen-presenting capacity, including the ability to cross-present antigens. Thus, it is emerging that monocyte-derived DC are a crucial reservoir of professional antigen-presenting cells (APC).55 Expression and activation of STAT5 are gradually enhanced during the early stage of DC development but suppressed by cytokine inducible SH2-domain protein (CISH) expression at the later stage. The gene that codifies CISH is immediately activated by GM-CSF.56 CISH is a STAT5 target gene and its expression induces feedback inhibition of STAT5 activation. CISH is signiﬁcantly induced during DC development and plays an important role in DCmediated cytotoxic T lymphocytes (CTL) activation. A gradual increase in CISH expression during GMCSF-mediated DC development was observed, and gene silencing experiments revealed that CISH inhibits the proliferation of DC precursor triggering its differentiation at the later stage to strong type 1 polarized DC, which is essential for immune therapy or vaccination against pathogens or tumors.56 GM-CSF supports DC differentiation, survival and proliferation in part through phosphorylated STAT5 (pSTAT5) signaling. In parallel, pSTAT activity leads to an accumulation of cytoplasmic CISH which occurs during the period of GM-CSF treatment. After a threshold concentration of CISH is reached, CISH inhibits the GM-CSF-mediated STAT5 phosphorylation. The same signaling pathway also promotes MHC class I but not MHC class II expression, the up regulation of co-stimulatory molecules and production of cytokines like IL-12 when DC are matured by LPS. Thus, CISH can act as a molecular switch from the DC progenitor stage to immature DC and a control point for CTL but not TH1-cell priming by matured DC.55

GM-CSF, its relationships with disease The above described activity of GM-CSF in the regulation of immune cells has been related with diverse diseases such as autoimmune or cardiovascular and metabolic diseases. Regarding to autoimmunity, the regulatory role of GM-CSF in monocytes and DC maturation, MØ differentiation and

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Immune and Therapeutic Roles of GM-CSF

In a model of autoimmune myocarditis, GM-CSF is required for the response to IL-6 and IL-23 by DC and subsequent TH17 cell generation.58 Moreover, GM-CSF promoted autoimmunity by enhancing IL-6 dependent survival of antigen-specific T CD4+ cells. Similarly, local over expression of GM-CSF in the stomach of mice leads to autoimmune gastritis.58,59 Nevertheless more evidence is needed to back up these conclusions. Other autoimmune diseases related to GM-CSF are Felty’s syndrome and RA that were mentioned before. In fact, the human monoclonal antibodies mavrilimumab that binds to GMCSFRα with high affinity and specificity is being evaluated for the treatment of patients with RA.60 Regarding to the cardiovascular and metabolic implications of GM-CSF, this cytokine is apparently expressed by the adipose tissue, but there is not enough evidence to explain its role in this tissue. Interestingly

GM-CSF knockout mice are obese and hyperphagic.61 When these mice are exposed to a High-Fat Diet (HFD), they show larger mesenteric fat adipocytes, decreased number of MØ, lower transcription of pro-inflammatory cytokines and an enhanced peripheral uptake of glucose.61 Moreover, iNKT cells are abundant in the liver where they constitute up to 50% of liver lymphocytes and the relation between GM-CSF, liver iNKT cells, and metabolism is very intriguing but it has not been investigated yet.62 M-CSF has been detected in macrophages CD68+ in human fatty streaks and atherosclerotic plaques, suggesting that the relation between M-CSF:GMCSF is a factor of the macrophage heterogeneity in atherosclerotic lesions.63 It is also important the apparent antagonism described above between M-CSF and GM-CSF defining the functional polarization of MØ (M2 and M1 respectively), and the evidence that the M-CSF:GM-CSF ratio varies in vivo during the course of diverse inflammatory and metabolic disorders including chronic stable coronary heart disease and angor pectoris.64,65 MØ migration to areas of myocardial infarction are associated with greater impairment and extent of tissue damage in an experimental model, treatment with GM-CSF antibodies improved ventricular function and decreased the amount of damaged tissue after infarction.66 Regarding to the anti-inflammatory effect of GM-CSF in CNS, a model of cerebral ischemia showed that GM-CSF promotes the growth of collateral arteries, reducing the volume of cerebral ischemia.67

Provided by: http: www.strangescience.net Originally published in: Perigrinationes ad Terram Sanctam Now appears in: The Unicorn by Nancy Hathaway

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activation, implicate this cytokine as an important mediator of tolerance. There is some evidence linking GM-CSF in the pathophysiology of autoimmune diseases, since GM-CSF deficient mice are resistant to the development of experimental allergic encephalitis (EAE), myocarditis and collagen-induced arthritis.5,8,10 Regarding to EAE, GM-CSF has been described as the encephalitogenic factor produced by IL-23-driven pathogenic TH cells, and it is in vivo dependent on the activity of RORγt factor. Indeed, TH1and TH17-polarized cells are able to produce GM-CSF after in vivo transference, and in contrast to any other known TH cell cytokine, it does not have a redundant role in the development of EAE.57

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Review New therapeutic uses of GM-CSF

Crohn’s disease GM-CSF knockout mice are more susceptible to several infections and intestinal inflammation.68 This has engaged GM-CSF as active treatment of chronic inflammatory bowel diseases such as Crohn’s disease.69 The pathogenesis of Crohn’s disease could be related to a local deficiency of innate immunity, mainly in intestinal epithelium and phagocytic cells from lamina propria, including MØ, neutrophils and DC. In consequence, there would be persistent intraluminal microorganisms resulting in an aberrant intestinal inflammation mediated by T cells. Thus, the basis of treatment with GM-CSF is increasing the effectiveness of the intestinal innate immunity, rather than the suppression of the secondary inflammatory response. The therapeutic effect of GM-CSF in Crohn’s disease in multicenter randomized clinical trials has shown that subcutaneous administration for 56 days (6 mg/kg) induces significant remission of the disease, decreasing severity and improves quality of life compared with placebo.70 In pediatric patients, GM-CSF administration induces disease remission in patients dependend on corticosteroids.71,72 These therapeutic response show the immunomodulatory effect of GM-CSF on the gastrointestinal tract, where it could participate promoting tolerance through the DC recruitment. In fact, deficiency of CD11c+ cells in mice result in a significant phenotype of intestinal autoimmune inflammation with autoantibodies.73 Moreover, GM-CSF facilitates the recruitment and survival of intestinal DC in response to enteric bacterial microorganisms.69 In addition, mutations in the intracellular pattern recognition receptor NOD2 (Nucleotide-binding oligomerization domain-containing protein 2, also known as inflammatory bowel disease protein 1 [IBD1]), have been identified in patients with Crohn’s disease. These patients show a specific phenotype with deficiency in GM-CSF production subsequent to several stimuli with NOD2 and TLR7 ligands. Curiously, the capacity of TNF-α secretion in these patients is preserved.74 Pulmonary alveolar proteinosis (PAP) PAP is a fatal lung disease characterized by respiratory failure secondary to deficiency in alveolar

macrophage clearance, abnormalities in host defence, and accumulation of surfactant proteins that provokes inadequate gas exchange and hypoxia. This condition is usually congenital but may actually arise in adulthood.75 As mentioned before, experiments deleting GMCSF revealed that these KO mice did not show any alterations in the steady state of hematopoiesis, instead these animals acquired a particular lung injury phenotype characterized by accumulation of lipids and surfactant proteins in alveolar spaces, similar to the human condition described as PAP. Thus, GMCSF was not essential for hematopoiesis and these results revealing an unknown and unexpected critical role of GM-CSF in pulmonary homeostasis. In fact, the discovery of GM-CSF was made by pulmonary conditions.3,4,76 Subsequent confirmatory studies revealed that deficiency of GM-CSFRβc resulted in the same PAP phenotype with particular alterations in the maturation of AMØ, again without affecting hematopoiesis.77-79 Deficient expression of the GM-CSFRα or β chain and the presence of autoantibodies against GM-CSF, that are associated with congenital and acquired PAP respectively, have been described in humans.75 Delivery of rhGM-CSF by inhalation was shown to be beneficial in the treatment of PAP and it was well tolerated in healthy subjects.80 Gene therapy with retroviral vectors encoding GM-CSFRβc, in an experimental model of GM-CSFRβc deficiency, showed efficient reconstitution of the defect at 12 weeks post-treatment.81 Cancer Recent clinical evidences suggests an enhanced antitumor response by inducing the expression of GM-CSF. The first FDA approved vaccine strategy, the DC-targeted Sipuleucel-T (Provenge®), is a DCbased vaccine that incorporates the use of a key prostate cancer antigen and GM-CSF to activate DC ex vivo, which upon DC reconstitution recruit and stimulate T cells to destroy prostate cancer.82 Other methods against cancer in phase I have involved the co-expression of GM-CSF with TGF-β2 antisense gene sequence delivery, which are administrated together with vaccines based on au-

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Immune and Therapeutic Roles of GM-CSF

tologous tumor cells enhancing the tumor antigen recognition.83 A vaccine against lung cancer is currently in a phase III evaluation and it is based on immunotherapy expressing GM-CSF in allogeneic cancer cells together with IL-12.84,85 This kind of therapy has also been shown to be effective against colorectal cancer, metastatic renal cell carcinoma, and pancreatic adenocarcinoma.86-88 Experimentally, administration of an adenovirus encoding GM-CSF with an adenovirus encoding p16 tumor suppressor gene, has been successful in inducing a potent antitumor response by increasing the expression of MHC I molecules and the cytotoxic activity of CD8 T cells.89 Moreover, administration of therapeutic vaccines with plasmids encoding GM-CSF and tumor antigens, enhance antigen-specific IgG antibody response, production of IFN-γ and IL-6.76,90 An interesting experimental strategy is the combinated treatment of armed oncolytic adenovirus expressing IL-12 and GM-CSF with radiotherapy in a murine model of hepatocarcinoma which has shown effectiveness suppressing primary tumor growth.91 Infections The microbicidal activity of neutrophils and MØ evaluated in-vitro is enhanced by GM-CSF. Regarding to anti-fungal activity, GM-CSF prevents the immunosuppressant effect of dexamethasone, producing an effective activity against Aspergillus fumigatus hyphae. This effect is also observed with the administration of IFN-γ.92 Pre-incubation of neutrophils with GM-CSF increases the fungicidal activity against Candida glabrata,93 and it increases phagocytic index against Candida albicans with a fungicide efficiency of 90% against intracellular blastoconidia.94 GM-CSF improves fungistatic activity of MØ against Histoplasma capsulatum.7,95 Nevertheless there are no current clinical trials that focus on GMCSF effect as an adjuvant for the treatment against invasive fungal diseases.

Regarding to GM-CSF antibacterial activity, there are several reports about its activity in immunodeficient patients. GM-CSF enhances ex vivo neutrophil bactericidal activity against S. aureus in children with HIV infection.96 Antibacterial effectiveness of GM-CSF administration could be related to competent and sufficient target cells. In patients who had undergone hematopoietic stem cell transplantation, the use of GM-CSF resulted in a significant reduction in the incidence of documented infections, and GM-CSF prophylaxis decreased infection-related hospitalization rates but not febrile neutropenia hospitalization rates.97 Experimentally, local delivery of GM-CSF protects mice against lethal pneumococcal pneumonia, and the induction of GM-CSF mucosal expression has been related with protective immunity against Chlamydia trachomatis.98-100 Some trials have evaluated the immunological response of GM-CSF administration in septic patients, unfortunately without favorable results. Despite the modest increase of neutrophil counts after GM-CSF administration in small-for-gestational age babies, no significant difference was reported in neonatal sepsis-free survival.101 However, GM-CSF has been investigated as a predictive marker, since GM-CSF decrease rapidly in patients that subsequently develop septic shock and the persistent increase of GM-CSF and other cytokines are negatively related to survival.102 Regarding to intracellular bacterial infections, there are interesting studies in tuberculosis (TB). In vitro studies demonstrated that human MØ stimulation with GM-CSF enhances microbicidal response against M. tuberculosis,103 but involvement of GMCSF in the pathogenesis of pulmonary TB has not been completely studied in vivo. GM-CSF knockout mice are highly susceptible to mycobacterial infec-

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Provided by: http: www.strangescience.net Originally published in: Histoire Générale des Drogues Now appears in: The Unicorn by Nancy Hathaway

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Review tion with intra-bronchial and intra-alveolar lesions without formation of granulomas and protective cytokines, resulting in rapid bacilli growth and relapse after the cessation of drug treatment.104,105 On the other hand, in wild-type mice as well as in corrected GM-CSF knockout mice, there are granulomas formation and bacilli within MØ.106 GM-CSF has a protective role on alveolar structure and regulates early recruitment of MØ and DC which favors containment of mycobacteria through granulomas formation.107 However, it seems that there is a threshold of antimycobacterial GM-CSF levels because transgenic mice that overexpress GM-CSF showed after mycobacterial infection, smaller granulomas and extensive lesions with significant increment of several cytokines and inflammatory mediators that failed to focus T cells and MØ into sites of infection,105 indeed over expression of GM-CSF induces MØ accumulation, blindness and severe damages to various tissues,108 High doses of GM-CSF may have a negative impact on antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC).109 The administration of rhGM-CSF has been evaluated in one clinical trial in patients with active TB, but its efficacy and effectiveness has not yet been evaluated.110 Prophylactic vaccines based in GM-CSF for infectious diseases

Clinical Trials summary

The adjuvant role of GM-CSF in prophylactic vaccines against some infectious diseases has been evaluated in pre-clinical trials. Vaccines based on recombinant vectors encoding mycobacterial antigens or vaccines based on recombinant BCG have shown effectiveness in experimental models of TB which is greatly augmented when GM-CSF is used as adjuvant, improving the protection against disseminated infection associated with expansion and activation of APCs, increasing IL-12 and IFN-γ production with higher cytotoxicity response and antibody titers.111-116

Conclusion

Other prophylactic vaccines adjuvanted by GMCSF expression have been evaluated in animal models, such as the intracerebral administration of recombinant rabies virus encoding GM-CSF that prevents the development of rabies after infection with the wild type virus.117 Other similar vaccine that has been evaluated is a DNA vaccine co-expressing GM-CSF against Clostridium botulinum that has shown protection.118

The immunomodulatory effect of GM-CSF is currently applied as an adjuvant strategy for therapeutic vaccines against cancer such as prostate cancer, and it is being evaluated in clinical trials for the treatment of melanoma and hematologic malignancies. GM-CSF is related to the induction of tumor cell death by activation of circulating monocytes in addition to the effects mentioned above. On the other hand, for infectious diseases, GM-CSF is not being evaluated in clinical trials although it does in preclinical studies such as the experimental models of TB, Aspergilosis, Candida, and Influenza.5,10,119 A search in the clinicaltrials.gov page was made in July 2012 and 733 studies related to “sargramostim” or “GM-CSF” were found without regard to studies with unknown recruitment status. Most studies are analyzing the usefulness of GM-CSF in hematologic disorders and cancer as adjuvant therapy as well as for therapeutic vaccines against cancer. GM-CSF is being evaluated as adjuvant for prophylactic vaccines against infectious diseases such as HIV, and as treatment of sepsis, periodontitis and Crohn’s disease. Regarding to infectious diseases, only one study was found, examining the administration of antimony and GM-CSF for the treatment of leishmania skin lesions.

CSF have a long history of clinical use. However, their use have not been rationally evaluated since the increase of absolute numbers of circulating innate immune effectors cells differ among each CSF, being this effect preferentially performed by G-CSF which induces an accelerated bone marrow cells production. On the other hand, maturation and augmentation of the function of those cells such as chemotaxis, phagocytosis, and microbicidal functions, including oxidative burst activity is preferentially induced by GM-CSF which, instead to be a potent hematopoietin, is a great immunoregulatory cytokine being the lung its specific target. Regulatory functions of lymphoid cells and DC are highly complex and it is quite intriguing that there is little overlap in biological actions among lymphoid and hematopoietic regulatory factors, at the same time DC and MØ highly affect lymphocyte activation representing the first step for inducing adaptive im-

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Immune and Therapeutic Roles of GM-CSF

Biological therapy has revolutionized and changed the paradigm of the diseases treatment since it considers the own systems for inducing the cure. This is the basis of immu-

nomodulation and immunotherapy. GM-CSF expression affects the quality of the inflammatory response by means of a variety of producing and targeting cells in several systems and organs. Virus based immune agents, such as GM-CSF armed vectors, are among the early efforts to reach a potent immunostimulation therapy such as immunotherapeutic and prophylactic vaccines. GM-CSF has a wide range of lymphoid regulatory actions acting as the humoral and evolutionary bridge between the hematopoietic and lymphoid factors. GM-CSF could represent one of the leading soluble mediators for linking innate and adaptive immunity. Provided by: http: www.strangescience.net Originally published in: An Account of the Arctic Regions with a History and Description of the Northern Whale-Fishery Now appears at: NOAA Photo Library Treasures of the Library (http://photolib.noaa.gov/library/index.html)

Contributors AFC prepared the manuscript. Critical review and editing were performed by RHP and DME. Competing interests The authors have no competing interests for publication Funding None Ethics approval Review article

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munity. One difference between hematopoietic and lymphoid regulatory factors is the circumscribed site in bone marrow of their production and action confining its stimulation to specific cell colony type. This is one of the most important differences between G-CSF compared with GM-CSF and M-CSF, which should be considered as cytokines that affect principally the quality functions of leukocytes instead of the quantitative effect on leukocytes numbers that is the principal taking account effect in the clinical guidelines for therapeutical use.

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Review

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Immune and Therapeutic Roles of GM-CSF

INMUNOLOGÍA

Review

Artwork Of Narwhals And Unicorns, Or “All That Glisters Is Not Gold”* * The Prince of Morocco, Act II, Scene VII, in William Shakespeare’s The Merchant of Venice (1600)

The narwhal is a whale that lives in the waters of the Arctic and the North Atlantic Oceans. One of the hallmarks of the males is a long, straight tusk along the jaw. In Medieval Europe, the Vikings traded narwhal tusks, which were posing as unicorn horns. It was believed that these horns possessed magical powers and had the ability to cure poison. The true origin of these tusks was revealed gradually during the Age of Discovery. In 1555, the narwhal was described and called the monoceros, “a sea monster that had in his face a great horn, with which he could destroy ships and many people.” Throughout history, the unique features of this whale have sparked human imagination associated this animal with fantastic creatures, sea monsters, and as mentioned before, the origin of the unicorn. However, as in the case of GM-CSF, all that glitters, is not gold, not everything is, as it seems. What was initially thought to be a sea monster, with the passage of time, it was revealed that there was nothing more than a marine mammal; likewise, to a molecule initially described as a hematopoietin, it was found new functions, as illustrated in the current review by Francisco-Cruz et al.

Editorial Team

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INMUNOLOGÍA

Comentario

El romanticismo que tiñe de rojo al papel

Editorial Team 20 20

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Es en Europa en el siglo XIX en pleno período romántico, donde la tuberculosis era la causa número uno de muerte y la tisis se transforma en una enfermedad “de moda”, de la mano de escritores y artistas que la convierten en terrible compañera de sus héroes y heroínas. La tuberculosis ejerció una fascinación sobre los poetas y sobre los artistas cuya sensibilidad se vuelve más vulnerable, hasta el punto de decir (con alguna ironía) que si los artistas enfermaban, los enfermos eran más artistas. En esa misma época, Alejandro Dumas publica La dama de las camelias, la historia de Margarita Gautier, una elegante cortesana enredada con adinerados jóvenes burgueses, que también desfallece de tisis y de amor. Está plaga de tuberculosos que mueren sin miedo, beatíficos, especialmente gente joven como Little Eva en La cabaña del tío Tom, en donde Dickens describe la tuberculosis como la aterradora enfermedad que refina la muerte quitándole sus aspectos grotescos. Igualmente La Traviata de Verdi célebre ópera que inspiró la imagen musical de la tisis, pero ¿arte y vida se parecen?... Y a lo largo de la historia y de un tiempo inmemorial, todo el romanticismo quedará teñido por el rojo de la sangre en los pañuelos blancos y delicados, por la belleza lánguida y melancólica como rasgo estético, enfermedad como señal de espíritus sensibles, talentosos, nocturnos y rebeldes. Así la lista de escritores, poetas, músicos y artistas muertos por tuberculosis en el siglo XIX e inicios del XX, es larga y notable: Novalis, Schiller, John Keats, Bécquer, Chéjov, Chopin, Carl María von Weber, Modigliani, entre otros. Un caso extremo es el sucedido a las tres hermanas Brontë: todas ellas escritoras, quienes fallecieron en un lapso de siete años, víctimas de la tuberculosis: Emily (Cumbres borrascosas), Anne (La inquilina de Wildfell May) y Charlotte (Jane Eyre). Esto sin duda, acentuó la creencia de que la enfermedad estaba en la esencia de los individuos a través de una predisposición hereditaria; negaba la teoría infecciosa y, por lo tanto, el contagio. La leyenda comenzó a desvanecerse a partir de 1882 cuando Robert Koch descubrió el bacilo, agente causal de esta la infección, ya en el siglo XX la enfermedad sería asociada a la pobreza e insalubridad y su aura romántica se apagaría para siempre. Sin duda la tuberculosis deja un toque de romance y misterio plasmado en arte, con la más soberbia excitación de la pasión al tener la muerte tan cerca.

a tuberculosis (TB) ha sido muy probablemente, la enfermedad que más daño a causado a la especie humana a lo largo de toda su historia. En el año 460 antes de Cristo, Hipócrates escribió: “La tisis es la enfermedad más extendida y fatal de todos los tiempos”. Tisis es el nombre con el que se ha conocido a la TB a lo largo de miles de años, proviene del griego φθισις o phthisis, que significaba “consunción”.

Enoyl-CoA Hydratase and Ag85B of Mycobacterium habana are specifically recognized by antibodies in sera from leprosy patients Serafín-López J.1, Talavera-Paulin M.1, Amador-Molina J.C. 2, Alvarado-Riverón M.1, Vilchis-Landeros M.M.3, Méndez-Ortega P. 1#, Fafutis-Morris M.4, Paredes-Cervantes V.1, López-Santiago R.1, León C.I.5, Guerrero M.I.5, Ribas-Aparicio R.M.2, Mendoza-Hernández G3, Carreño-Martínez C6, EstradaParra S1& Estrada-García I.1*.

som

Original

eprosy is an infectious disease caused by Mycobacterium leprae which is a non-cultivable bacterium. One of the principal goals of leprosy research is to develop serological tests that will allow identifi cation and early treatment of leprosy patients. M. habana is a cultivable non-pathogenic mycobacterium and candidate vaccine for leprosy. Several antigens that cross-react between M. leprae and M. habana have been shown. The aim of the present study was to identify proteins of M. habana that reacted by immunoblotting with antibodies in sera samples from leprosy patients but not with antibodies in sera from tuberculosis patients (TB) or healthy donors (HD). A 28 kDa antigen that specifi cally reacted with sera from leprosy patients was identifi ed. To further characterize this antigen, protein spots in two dimensions (2DE) Western blots were aligned with Coomassie blue-stained gels and analyzed by mass spectrometry. Two proteins were identifi ed: enoyl- coenzyme A hydratase (lipid metabolism) (ML2498) and antigen 85B (Ag85B, mycolyltransferase) (ML2028). These proteins represent promising candidates for the design of a reliable tool for the serodiagnosis of LL cases which is the most frequent form in Mexico.

Serafín-López J.1, Talavera-Paulin M.1, Amador-Molina J.C.2, Alvarado-Riverón M.1, Vilchis-Landeros M.M.3, Méndez-Ortega P.1#, Fafutis-Morris M.4, Paredes-Cervantes V.1, López-Santiago R.1, León C.I.5, Guerrero M.I.5, Ribas-Aparicio R.M.2, Mendoza-Hernández G3, Carreño-Martínez C6, Estrada-Parra S1& Estrada-García I.1*. 1 Departamento de Inmunología, 2Departamento de Microbiología, Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, Instituto Politécnico Nacional. México, D.F. México 3Departamento de Bioquímica, Facultad de Medicina, Universidad Nacional Autónoma de México, México, D.F. México 4CIINDE Departamento de Fisiología, CUCS, Universidad de Guadalajara, Gdl., México.5Instituto Nacional de Dermatología. Centro Dermatológico Federico Lleras Acosta. Bogotá, Colombia 6Centro Nacional de Programas Preventivos y Control de Enfermedades (CENAPRECE). Secretaría de Salud, México, D.F, México #Present address: Biológicos y Reactivos de México (BIRMEX), México, D.F. México *Corresponding author: Iris Estrada-García Prolongación de Carpio y Plan de Ayala s/n, Col. Santo Tomás, México, D.F, C.P. 11340.México Telephone: (52)55 5729 6300 ext 62507 • Fax: (52)55 57296300 ext 46211 • email: iestrada5@hotmail.com

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Leprosy patients recognize antigens of M.habana

Intradermal immunization with killed Mycobacterium leprae renders mice immune to infection

with viable M. leprae (Shepard et al 1980).This protection is long lasting and systemic. However, when other mycobacteria are used to immunize mice against infection with viable M. leprae bacilli, they have been shown to be either ineffective (i.e. M. duvali) or to confer only partial protection (i.e. M. bovis BCG) (Shepard et al 1976). In 1985 and then 1989 M. habana TMC 5135 was found to be as effective as M. leprae in protecting mice against footpad infection (Singh et al 1985, Singh et al 1989). This was surprising since Shepard et al. found that among a large panel of mycobacteria tested only M. leprae and BCG were able to confer protection (Shepard et al 1983).

som

M. habana is a cultivable organism and protects mice against M. ulcerans challenge offering consistent protection against infection with Mycobacterium tuberculosis H37Rv and indigenous strains of M. tuberculosis (Gupta et al 1979, Gupta et al 1984). Some studies suggest that the secretory antigens released by actively growing M. habana bacilli are protective against tuberculosis infections (Chatuverdy et al 1999, Divya Jyothi et al 2000). Recent experimental data indicate that strains M. habana TMC 5135 and M. habana IPK-220, which differ in the fine structure of mycolates, are not equally immunogenic or virulent in a BALB/c mouse model of progressive pulmonary tuberculosis (Váldes et al 2007a,b). It is not clear which characteristics of M. habana renders it capable of protecting mice against infection with M. leprae, particularly in view of the large degree of antigenic cross-reactivity found throughout the genus. Previous work showed that M. habana and M. leprae share some antigenic epitopes. Using a panel of monoclonal antibodies raised against M. leprae Lamb et al. were able to show that the specifi c 18-kilodalton antigen of M. leprae is also present in M. habana as well as the 65KDa antigen (Lamb et al 1990). More recently Bisht et al. described the purifi cation and immunochemical characterization of a major 23 kDa cytosolic protein antigen of the vaccine candidate M. habana (Bisht 1996). Although a remarkable decrease in world leprosy prevalence from 􀂾5.4 million patients in 1985 to 􀂾0.2 million in first quarter of 2010 (http://www.who.int/wer/2010/wer8535/en/), incidence of the disease has remained almost unchanged for the last years. In Mexico, according to official reports the number of new cases detected during 2010 was 171 (www.dgepi.salud.gob.mx/boletin/2011/ sem1), the incidence in 1989 was 0.30 and in 2008 it was 0.187. The majority of reported cases belongs to the multibacillary form (MB) therefore presenting large amount of specifi c antibodies which may be useful for detecting infection or exposure to M. leprae. To our knowledge there are only three reports showing antigens in M. habana which are recognized by leprosy patient sera (Rana et al 1988, Singh et al 1994, Chaturvedi et al 1995). In this study we have analyzed antigens from M. habana TMC 5135 that specifi cally reacted with sera from leprosy patients (tuberculoidor lepromatous forms) but not with sera from healthy household contacts (HHC) and tuberculosis patients (TB). We detected a 28 KDa antigen that was identified as enoyl coenzyme A hydratase and antigen 85 (Ag85). These proteins from M. habana could be used to develop serological diagnostic test for the multibacillary forms of the disease.

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M. habana was first described following its isolation from 35 cases of pulmonary tuberculosis (Valdivia et al 1971), subsequently it was found to be closely related to the species Mycobacterium simiae serovar 1 and now is known as M. simiae serotype 1 (Meissner and Schroder 1975). In 1996 Khoo et al demonstrated that M. habana TMC 5135 and several M. simiae strains differed in their polar in glycopeptidolipid (GPL) composition and confering sufficient specificity for identification of M. habana as distinct serotype of M. simiae (Khoo et al, 1996).

Original

Mycobacteria. M. habana TMC 5135 was kindly provided by the late Dr. M. J. Colston (National institute for Medical Research, Mill Hill, London U.K) and was grown under stationary conditions for 2 to 4 weeks in Proskauer and Beck media, modifi ed by Youman (PBY) (1). The cell mass was then harvested under aseptic conditions by centrifugation at 8000g at 4°C (Sorvall RC5B, DuPont, Newtown, CT, USA).

Soluble extract of Mycobacterium habana (MHSE). Briefly, a soluble extract was prepared as follows: cells were washed in saline. This suspension was sonicated individually at 100 W for 15 min (1 min bursts with 1-min rests) on ice water bath using a Branson sonicator (Branson, Shelton, CT, USA). Extract was centrifuged at 10,000 x g at 4°C for 10 min to obtain cell free supernatant. Protein concentration was determined according to Lowry et al. (Lowry et al 1951). Serum samples. Sera of active untreated leprosy and active tuberculosis patients were taken at regional medical centers of the Mexican Ministry of Health (SSA). Sera from household contacts from Colombian leprosy patients were also included. All the samples were obtained with informed consent and permission from the local ethics committee of institutions involved in Mexico and Colombia. Active leprosy patients were classifi ed, according to the Ridley-Jopling criteria (Ridley and Jopling et al 1966) and the operational WHO classifi cation, prior to collection of sera. 129 serum samples were collected from leprosy patients [11 tuberculoid (TT), 96 from lepromatous (LL) and 22 from the indeterminate form of leprosy] over a 7 year period. Since Colombia has a similar epidemiological situation to that of Mexico, we analyzed 66 sera from household contacts (HHC) from Colombian leprosy patients [42 came from multibacillary (MB) cases and 24 from paucibacillary (PB) one]. Control sera were included: 23 from active pulmonary tuberculosis (TB) culture positive and 33 from healthy donors (HD) from area with similar leprosy prevalence and socioeconomic conditions.

Table 1. Sample group characteristics Sample category (total N°)

Male:female ratio

Median age in years (range)

Bacterial Index range

LL (96)

1:1

30 (8-64)

2-6

I (22)

1:3

40 (16-69)

TT (11)

1:2

35 (16-55)

HHC -PB (24)

1:1

17 (2-76)

N/A

HHC-MB (42)

1:1

22 (1-66)

N/A

HD (26)

1:1

21 (16-50)

N/A

LL, lepromatous leprosy ; I, indeterminate form; TT tuberculoid leprosy; HHCPB,household contacts from paucibacillary leprosy patients; HHC-MB, household contact from multibacillary leprosy patients; HD, healthy donors; N/A not wapplicable.

The characteristics of the individuals in the study groups are listed in Table 1. Polyacrilamide gel electrophoresis (PAGE) and Western blot (WB). Soluble extracts were separated by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) under reducing conditions on a 10% or a 13.5%

gel, as described by Laemmli, (Laemmli 1970). The proteins were blotted overnight onto a nitrocellulose membrane pore size 0.22 μm (Schleicher & Schuell, Inc. New Hampshire, USA) in a Tris-glycine methanol buffer as described by Towbin et al. (Towbin et al 1979). Membranes were washed in phosphate buffered saline (PBS) (Sigma, St. Louis, MO, USA) for 10 min, and then blocked at room temperature for 30 min with 2% skimmed milk in PBS with 0.05% Tween 20 (PBS-T). Blocked membranes were probed with human sera diluted 1:100 in 1% skimmed milk in PBS-T (PBS-TM) at 4°C for 16 h, and then washed twice with PBS-T. Membranes were incubated with a horseradish peroxidase (HRP)-conjugate anti-human immunoglobulin (IgG) (DAKO Corporation, Carpintaria, CA, USA), diluted 1:3,000 in PBS-TM, at 37°C for 1h. After washing twice with PBS-T and once with PBS, membranes were developed with 3-amino-9-ethyl-carbazolone (Sigma). The molecular weight of each band was calculated by comparison with “rainbow markers” (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) which were previously included in the gels and transferred. Two-Dimensional Polyacrylamide Gel Electrophoresis (2-DE). The isoelectric focusing was carried out according to Xolalpa et al with minor modifi cations (Xolalpa et al 2007). Briefl y, the soluble extract was first desalted in a Sephadex G25 column (NAP-10 column, GE Healthcare, Pittsburgh, PA, USA), then were concentrated by ultrafi ltration and requantifi ed by a microtiter plate Bradford assay (Bio-Rad). The protein pellet was resuspended and adjusted to 130μg with rehydration buffer (8 M urea, 2mM thiourea, 2% CHAPS, 0.5% of IPG buffer pH 4-7, and 2.8% DTT). The sample was used to rehydrate 7cm immobilized pH 4-7 linear gradient strips (Immobiline DryStrips, GE Healthcare) at room temperature (RT) for 16 h, following the manufacturer’s instructions. The electrofocusing program with the Ettan IPGphor III Electrophoresis Unit (GE Healthcare) involved 100V for 1h, 300V for 1h, 1000V for 0.5h and 5000V for 5h. After focusing, the strips were equilibrated for 10 min in equilibrium buffer (6 M urea, 2% SDS, 75 mM Tris-HCl, pH 8.8, 30% glycerol), and reequilibrated with 5ml of equilibrium buffer containing 250 mg of DTT for 10 min. Finally they were incubated with 5 ml of equilibrium buffer with 125 mg of iodoacetamide for 10 min. The strips were overlaid onto 10% SDS polyacrylamide gels, and after electrophoresis, proteins were stained with Coomassie Brilliant Blue R-250 and used to perform mass spectrometry (MS) or transferred to Immobilon-P® PVDF membranes (Millipore Co., Bedford, MA, USA) and used in immunoblotting assays.

som

MATERIALS AND METHODS

Membranes with transferred protein were incubated in methanol at room temperature for 5 min and rinse with PBS-T for 1h after membranes were probed with human sera diluted 1:200 in PBS-TM, at 4°C for 16 h. Membranes were rinsed with PBS-T and PBS and were incubated with a horseradish peroxidase (HRP) conjugate anti-human IgG (Invitrogen-Zymed Carlsbad, CA, USA) diluted 1:2000 in PBS-TM, at 37°C for 1h. After incubation membranes were rinsed with PBS-T and fi nally with PBS. Spots were developed with 3,3-diaminobenzidine in acetate buffer and 30% hydrogen peroxide diluited 1: 1000. Tandem mass spectrometry (LC/ESI-MS/MS). Antigen spots in Western blot were matched with the corresponding protein spots in the Coomassie stained gel and were considered for MS analysis. The protein spots were carefully excised from the 2-DE gel, digested with modified porcine trypsin (Promega, Madison, WI) and extracted as previously described Bienvenut et al. (3). The volume of the extracts was reduced by evaporation in a vacuum centrifuge at RT and then adjusted to 20 μL with 1% formic acid. MS analysis was carried out on a 3200 Q TRAP hybrid tandem mass spectrometer (Applied Biosystems/MDS Sciex, Concord, ON, Canada), equipped with a nano electrospray ion source (NanoSpray II) and a MicroIonSpray II head.

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Leprosy patients recognize antigens of M.habana Data interpretation and protein identifi cation were performed with the MS/MS spectra data sets using the MASCOT search algorithm (Version 1.6b9, Matrix Science, London, U.K., available at http://www.matrixscience.com). Searches were conducted using the Actinobateria subset of the National Center for Biotechnology Information nonredundant database (NCBInr, http://www.ncbi.nih.gov). Trypsin was used as the specifi c protease, and one missed cleavage was allowed with tolerances of 0.5 Da for the precursor and 0.3 Da for the fragment ion masses. A protein “hit” was accepted as a valid identifi cation when at least one MS/MS spectrum matched at 95% confi dence level (p < 0.05). Protein identifi cations based on a single peptide required a matching probability of >95% and were manually verifi ed. Manual validation of MS/MS spectra was based on mass accuracy of precursor ions and the presence of a consecutive b or y ion series of three or more amino acids.

RESULTS

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Antibody response to Mycobacterium habana proteins in leprosy patients. The humoral reactivity to soluble extracts of M. habana was assessed by Western Blotting. This was done using serum samples from LL (n=25) and TT (n=4) leprosy patients, pulmonary TB patients (n=13) and HD (n=13). All the samples were diluted 1:100. Reactivity to MHSE antigens in leprosy patient samples are shown in figure 1. Patients with the LL form of the disease (either nodular or diffuse) recognized an immunodominant protein with a molecular weight (mol wt) of 28 kDa. Sera from TT patients did not show antibodies against these antigens. Neither the sera from the TB patients or HD showed any antibodies to 28kDa antigens.

Figure 1. Western blot analyses of M. habana soluble extract in 10% PAGE with sera from: leprosy patients (LL=lepromatous), (TT=tuberculoid), active tuberculosis patients (TB) or healthy donors (HD) (dilution 1:100). Goat anti human IgG HRP conjugate was used as the second antibody.

Seropositivity rates of leprosy patients, TB patients, HHC and HD. To evaluate the seropositivity and specificity to the 28kDa MHSE antigen, the number of sera samples from different groups was increased: 129 from leprosy patients (n=96 LL, 11 TT, 22 indeterminate form), 23 from TB patients, 26 from HD. These numbers in the increased samples included those sera used in the first Western Blot shown in the figure 1. 66 sera samples from household contacts (HHC) were included also. 83% of the LL samples showed positive response to the 28 kDa antigens from M. habana while samples from TT and indeterminate form of leprosy showed 36.3 and 41% of seropositivity respectively. Immunoblotting of HHC sera revealed the positive immune response against these antigens only in 2 of the 66 samples (3%) (figure 2B).

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Original

The specificity of this test was considered 100% because serum from HD or TB patients did not show any reactivity against the 28 kDa antigen.

With the LL sera, antigen spots were detected and these proteins were not detectable with sera of TB patients or sera of HD (Figure 3A).

Identification of M. habana antigens that are recognized by antibodies in sera from lepromatous leprosy patients

The identified spots are indicated with arrows and numbered in the Western blot (figure 3A) and correspond to the spots that could be seen in the Coomassie blue stained gel (figure 3B). The protein spots corresponding to the assigned antigens were excised from the gel, destained and subjected to digestion with trypsin. The resulting tryptic fragments were analyzed by tandem mass spectrometry with MASCOT software. All searches were BLAST analyzed with non-redundant NCBI library database comprising annoted proteins of Actinobacterias complex since the Mycobacterium habana genome is not available.

Direct identifi cation of antigens from 1-dimensional SDSPAGE gels is not possible because of the complexity of the protein mixtures. We separated the proteins of MHSE by 2-DE and transferred onto PVDF membranes for Western blot analyses. These membranes were prepared to be individually probed with the sera of three LL patients. As controls sera from TB patients and HD were also tested.

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Figure 2. Western blot analyses of M. habana soluble extract (MHSE) in 13.5% PAGE using a pool of sera from healthy individuals (HD), active pulmonary tuberculosis patients (TB) or leprosy patients (LL) (A). Percentage of seropositivity of antibody response against the 28 kDa of M. habana analyzed by Western blot. Bars show percentages of leprosy patients (LL; TT, I), active tuberculosis patients (TB) and household contacts of leprosy patients (HHC) (B)

Figure 3. Identifi cation of M. habana antigens detected by sera of lepromatous leprosy patients (LL). MHSE was separated with an isoelectric focusing pH range of 4-7 and then separated in a 10 % SDS-PAGE. Proteins were blotted onto PVDF membranes and probed with the sera of one of the following: active lepromatous leprosy patient (LL), active tuberculosis patient (TB) or a healthy donor (HD). Sera dilutions were 1:200. Goat anti total human IgG HRPconjugate was used as the second antibody. The arrows indicate the antigens that were recognized by the LL patient (A). Results are representative of three independent experiments using three different set of sera. The protein spots that could be assigned to antigen spots visualized in the Western blot of the LL patient (arrows in A) were excised from the gel and treated with trypsin (arrows in B). The resulting fragments were analyzed by mass spectrofotometry to identify the antigens (B).

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Leprosy patients recognize antigens of M.habana Two proteins were identifi ed for the three spots and these corresponded to enoyl- coenzyme A (CoA) hydratase and antigen 85B (Ag85B), the results are listed in table 2. Both antigens were in the pH range of 5.2-5.6 and the theorical and experimental mol wt was similar for enoyl-CoA. In contrast differences were observed between the experimental and theoretical mol wt in Ag85B. The matching peptides identifi ed by mass spectrometry were aligned to their corresponding M. leprae counterparts (figure 4).

Table 2. Peptides identified by MS analysis from 2.D gel spots excised and digested with trypsin.

Protein name (Acc. number)

Exp/theo mol wt (kDa)

Exp/theo pI

Mowse score

Matched peptides

Sequence coverage %

enoyl-CoA hydratase Mycobacterium kansasii gi|240170297

28/27.22

5.25/ 5.22

Ag85A; Fibronectin-binding 28/35.62 protein Mycobacterium gordonae gi|13431271

5.25/7.66

85-B antigen Mycobacterium leprae gi|44381

28/34.97

5.25/5.17

Ag85B; Extracellular alpha- 28/34.88 antigen Mycobacterium avium gi|728748

5.25/5.33

2ª

enoyl-CoA hydratase Mycobacterium kansasii gi|240170297

28/27.2

5.33/5.22

101

3ª

enoyl-CoA hydratase Mycobacterium kansasii gi|240170297

28/27.2

5.6/5.22

Ag85B;: Extracellular alpha-antigen Mycobacterium avium gi|728748

28/34.9

5.33/5.35

124

Ag85B; Extracellular alpha-antigen; Mycobacterium avium gi|728748

28/34.9

5.6/5.33

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Spot #

Original

DISCUSSION In this work we described two M. habana proteins with a mol wt of 28 kDa which induce a potent humoral immune response in leprosy patients. These immunodominant antigens were recognized by 83% of LL sera tested. It was remarkable that neither active TB patients nor healthy individuals showed antibodies against these antigens. However, 3% of healthy leprosy household contacts (HHC) showed a positive reaction. This figure of 3 % is similar to that of contacts that may develop active disease in México which is less than 10% (www.cenavece.salud.gob.mx/descargas/pdf/lepra.pdf). Los porcentajes de seropositividad obtenidas con las muestras de los pacientes con lepra TT ( 36.3%) y lepra I (41%) no los consideramos relevantes debido al número tan reducido de muestras recolectadas.

The two M. habana antigens described here, enoyl-CoA hydratase and Ag85B had an expected mol wt of 28 kDa. EnoylCoA hydratase was identifi ed in more than one spot, an indication of the likely presence of isoforms within the preparation. In the case of Ag85B there was a discrepancy between the expected molecular mass (34 kDa) and the actual one observed in the gel (28 kDa). This could be explained due to the fact that M. habana Ag85B could be smaller than M. leprae Ag85B or that the latter could have post-translation modifi cation that could contribute to a larger mol wt.

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Figure 4. Aligment of the peptides matching the sequence of M. leprae enoyl CoA hydratase ML2498 (NCBI Reference Sequence: NP_302555) and Ag85B ML2028 (NCBI Reference Sequence: CAA43269). Boldface sequences indicate the matching peptides identifi ed for spots 1, 2 and 3. Underlined letters indicate mismatches

Enoyl-CoA hydratase is a key protein in the biosynthesis of fatty acids. In mycobacteria, this enzyme is involvedin the biosynthesis of major and essential lipids like mycolic acids. Sequence analysis predicted that these enzymes are synthesized as intracellular proteins and belong to the hydratase/ isomerase superfamily (Sacco et al 2007, Takayama et al In a previous report M. habana was used to detect M. leprae 2005). cross reactive antibodies in the sera of leprosy patients (Rana et al 1988). This cross reactivity was confirmed when M. ha- According with ours results enoyl-CoA could be considered as bana sonicates used to detect leprosy cases showed a better a candidate antigen for serodiagnosis of leprosy. This is not performance that M. leprae sonicate or M. leprae phenolic the fi rst time that this molecule is being proposed as and useglycolipid-I (PGL1), increasing the number of cases that were ful antigen for detection of M. leprae antibodies in the sera of leprosy patients. Having access to the complete genome detected ( Singh et al 1994). sequences of M. leprae, M. tuberculosis complex (principal Others authors showed that the M. habana 18 kDa protein members) and four environmental mycobacteria, Aráoz et al. has a cross reactive epitope shared with M. leprae 18 kDa used comparative genomic to establish a list of candidate M. that is not present in M. tuberculosis (Lamb et al 1990). These leprae antigens that could ultimately serve as the basis for fi ndings together with our results indicate that M. habana an immunodiagnostic test for leprosy. Twelve genes from M. contains several cross reactive epitopes with M. leprae which leprae were cloned and purifi ed, and the immunogenicity of each recombinant protein was then investigated in leprosy are not shared with M. tuberculosis.

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Leprosy patients recognize antigens of M.habana patients by measuring the reactivity of circulating antibody and gamma-interferon (IFN-g) production. Remarkably only two proteins showed marked humoral responses, one of them was the enoyl-CoA hydratase (ML2498), this protein is present in M. leprae with orthologues in others organisms besides mycobacteria (ArĂĄoz et al 2006). In this study we have shown for the fi rst time that M. habana enoyl-CoA is recognized by antibodies in sera from leprosy patients. Ag85B is a protein antigen secreted by live mycobacteria and plays and important role in humoral and cellular immune responses ( Launois et al 1994, Launis et al 1995, Rada et al 1999). This protein family is conform by three members: 85A, 85B and 85C with molecular masses of 32, 30 and 33 kDa respectively, each encoded by three distinct genes (Wiker et al 1990).

Although the degree of homology between enoyl CoA and Ag85B from M. leprae and M tuberculosis is high, 83% and 84 % respectively there are possible explanations for the fact that tuberculosis patients do not have antibodies against M. habana homologues. One of this is that the native M. leprae proteins expressed inside leprosy patients most have similar or identical epitopes to those present in the M. habana proteins, which are not present in M. tuberculosis. Using CLC Main Workbench and the Welling method (Welling et al. 1985) to identify antigenic regions in both proteins, we could confirm that there are putative epitopes in both M. leprae proteins, which are not present in the M. tuberculosis homologues (data not shown).

som

Alineamiento con M. leprae In conclusion, M. habana enoyl-CoA hydratase and Ag85B may be used to develop serological diagnostic tests for the lepromatous form of leprosy. This is particularly relevant since M. leprae can not be grown in vitro. The fact that M. habana TMC 5135 is an in vitro cultivable mycobacterium and that both identifi ed antigens are recognized in their native form, make them attractive candidates for the developement of serological tests, which so far have proven to be the easiest and cheapest diagnostic tool for leprosy. Currently M. leprae phenolic glycolipidic (PGL-I) is used as a specifi c antigen for leprosy serodiagnosis, but in practice, its sensitivity and specifi city are not as high as expected. Previous studies reported that the detection rate for multibacillary (MB) and paucibacillary (PB) patients were 57% and 20% respectively (Kai et al, 2008); while another study mentioned that the percentage of positivity (IgM anti PGL-I) observed with the MB sera was 79.6 % for the dipstick assay and 74.1 % for the ELISA (BĂźhrer et al 1998) Moura have indicated that the range of seropositivity for MB varies from 51.2% to 97.4 % and for the PB from 6.9% to 57.3%. This variation in seropositivity percentages is related to the differences in immunological response in different population (Moura et al 2008). In Mexico PGL-I has not been approved as a diagnostic tool for leprosy because there is no specific recognition of the PGL-I by serum from leprosy and tuberculosis patients (Rojas-Espinosa et al. 1999) Certainly using this already available test (i.e. PGL-I) together with the detection of antibodies against the M. habana antigens described here could increase the overall sensitivity of these antigens, increasing in turn the detection of leprosy cases.

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Since M. bovis Ag85 complex presents high homology with the same M. leprae complex, these antigens have been used to analyze T cell responses in leprosy (Launois et al 1994, Launis et al 1995, Naito et al 1999). Moreover, quantifi cation of antibody responses in leprosy sera against each member of the M. bovis Ag85 complex showed that Ag85B was recognized by 64% of LL but not by control sera. These results suggest that M. bovis Ag85B contains one or several epitopes specifi cally recognized by sera of LL patients (Drowart et al 1991).

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som

Original

“La danza es una de las manifestaciones más populares del arte cubano y, uno de los géneros donde las cubanas destacaron durante una buena parte del siglo XX fue la rumba. Las rumberas, además de ser protagonistas de cine y teatro, se convirtieron en el estandarte de libertad para las mujeres de la época. Entre las más destacadas encontramos a Amalia Aguilar, Maria Antonieta Pons y Ninón Sevilla, cuyas imágenes acompañan este artículo, en el cual los autores reportan que pacientes infectados con Mycobacterium leprae son capaces de reconocer antígenos que cruzan con M. habana, cuyo nombre evoca las figuras de estas espectaculares manifestaciones del arte cubano.”

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Revisión

Fundamentos filosóficos sobre el acto médico Francisco-Cruz Alejandro

Fundamentar filosóficamente un acto es pertinente en la medida que deseemos actuar éticamente, así convertimos las opiniones en verdaderos juicios al dar mayor sustento al análisis y solución de un dilema, de esta forma podríamos lograr un método mayéutico para el entendimiento de los dilemas éticos en medicina. Las varias cosmovisiones sobre la ética hacen cada vez más difícil el consenso para la aplicación de alguna forma apodíctica que dirija y oriente las actitudes médicas ante los diferentes retos en una práctica que es eminentemente social. El médico entonces no debe ignorar el desarrollo psicosocial del paciente cuando intenta comprender su rol y circunstancias en la evaluación del alcance del dilema. Conocer las cosmovisiones bioéticas nos permitirá identifi car el papel del médico en la salud, la enfermedad y la muerte. Actualmente podemos citar tres grandes cosmovisiones: la pragmática utilitarista o modernista como método usado principalmente en algunas naciones desarrolladas, la sociobiologisista y la filosofía personalista. La ética, rama de la filosofía práctica, es una disciplina de carácter científi ca toda vez que genera juicios y paradigmas respecto a lo normal (como norma) del derecho (lo que debiera ser) en las actividades del ser humano a diferencia de lo normal del hecho, como muchas veces se interpreta y que se refi ere a lo que suele suceder o es estadísticamente normal en el acto, y por tanto aceptado por una sociedad. Así la ética comprende, en su concepto real, los motivos de la moral y aplica un análisis a dicha práctica para determinar, con base en lo normal del derecho, si un acto persigue un bien.1 La ética es una materia de muchas cosmovisiones como resultado de la pluralidad de juicio en el ser humano que han surgido en un sistema moral particular de tiempo y espacio por lo que adoptar una corriente como absoluta,

ya sea para cualquier sociedad o toda actividad humana, sería equivocado mientras el tiempo y espacio sean cambiantes. Las teorías filosóficas más importantes que buscan explicar la calidad de las acciones del ser humano y que aportan alguna cosmovisión son el sustento actual de muchas tendencias éticas que han surgido a lo largo de la historia tras el análisis de dilemas éticos conforme el ser humano se desarrolla en nuevas actividades. Dichos dilemas se hacen más complejos en su alcance con respecto a las circunstancias específi cas en las que suceden en el interior de una sociedad cambiante. La medicina no es la excepción y como parte del campo bioético está inmersa en múltiples dilemas que, para los profesionales de la salud, resulta difícil resolver debido a la falta de preparación

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Instituto Nacional de Ciencias Médica y Nutrición “Salvador Zubirán” Departamento de Patología, Sección de Patología Experimental, inhoutes@yahoo.com.

La teoría utilitarista fue introducida por Jeremy Bentham y posteriormente afi nada por Stuart Mill y es aquella que nos habla de una acción correcta o incorrecta dependiendo de sus consecuencias, resulta ser una versión del consecuencialísimo con la diferencia de que atribuye el beneficio de un acto según su efecto en la persona como individuo a manera de un egoísmo ético, a diferencia del consecuencialísimo que analiza a la persona de manera colectiva. El utilitarismo asegura que la razón de la moral para una acción es agente-neutral o independiente de la calidad del actor. Le confieren la cualidad de bueno a una acción en la medida de su valor de utilidad. Se considera que es una teoría hedonista pues evita toda acción que pueda generar cualquier tipo de dolor o perjuicio. La ética Kantiana representa una teoría filosófica deontológica que por primera vez, de manera ordenada y laica, aborda aspectos como los deberes perfectos e imperfectos, los imperativos hipotéticos y los imperativos categóricos como un intento de generar una forma apodíctica de aplicación de la ética.3

La ética de las virtudes en cambio atribuye toda la responsabilidad de la cualidad de un acto a la calidad del actor como generador de actos y como depósito de los efectos de un acto; esta visión es el fundamento de la tendencia personalista de la aplicación de la ética. Son tres los niveles del estudio de la ética y a partir de él se determinan los parámetros que atribuyen a un acto como bueno o malo. La ética utilitarista se apoya en los principios de utilidad, eficiencia y consecuencia para determinar la calidad del acto; la ética Kantiana por su parte es independiente del efecto de un acto y de la calidad del actor al decretar los deberes de un individuo y una sociedad; la ética de virtudes, también llamada del carácter, asegura que un individuo en la medida de su buena calidad como ser humano generará siempre actos buenos (Fig.1). Podemos estudiar las teorías de la ética basándonos en los tres integrantes para la generación de un acto: el acto, el(los) actor(es) y la situación o circunstancia.4 Cuando se plantea el estudio de la ética basada en el acto surge la cosmovisión que centra la calidad del acto que depende del cumplimiento de principios éticos, esta corriente llamada principialista está siendo identificada como parte de una tendencia pragmática utilitarista que junto con el llamado individualismo radical representan cosmovi-

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en el campo de la ética y filosofía, teniendo que usar su sentido común como parámetro para la generación de un juicio.2

Niveles de estudio de la ética

Teorías centradas en la calidad del actor ÉTICA DE LAS VIRTUDES

Teorías centradas en los deberes y calidad del acto ÉTICA KANTIANA

Teorías centradas en la utilidad del acto y su efecto ÉTICA UTILITARISTA y CONSECUENCIALISMO

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Cuando nos basamos en el análisis del actor o del individuo partícipe del acto, citamos la cosmovisión basada en las virtudes aplicada por la tendencia personalista y humanista que son identificadas como las cosmovisiones clásicas y que erróneamente se asocian a normas morales religiosas.5

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Si el análisis de un dilema se centra en la situación como punto de partida, usamos entonces a la casuística y el relativismo como parte de las tendencias sociobiologisita y geocultural de la ética.6 Se caracterizan por dejar la particularidad del ser humano como individuo para analizar sus acciones desde un nivel organizativo y de adaptación; esta tendencia no ha tenido mucho eco en occidente donde se ha optado más por el estudio de la persona como individuo.7 Las teoría clásica elige a la persona como principal parámetro de medida ética; la teoría contemporánea critica el acto mismo y la teoría social estudia el comportamiento adaptativo respecto a la organización de una sociedad.8 Así descubrimos cosmovisiones y tendencias éticas desde una visión individualista hasta la que valúa los actos individuales que trascienden en la dinámica de una sociedad. De esta manera, las discrepancias entre una interpretación y otra llevan a divergencias cada vez mas acentuadas conforme se profundiza el alcance de un dilema; llegando a la propuesta de soluciones radicales que identifi can notablemente una de otra postura.

Cosmovisión principialista y pragmático utilitarista Han surgido ideas que tratan de dirigir de forma objetiva los actos médicos concretándose en teorías aplicables. La teoría principialista de Childress y Beauchamps sustenta cuatro principios en el acto médico: Respeto a la autonomía, benefi cencia, no malefi cencia y justicia.9 Se ha citado al modelo pragmático utilitarista como una tendencia fundamentada en la teoría principialista al criticar la ética basándose en el acto. Esta idea recuerda los imperativos categóricos de Kant resultando para muchos reduccionista respecto a la libertad del ser humano.10 Otra teoría con tendencia similar es el consecuencialismo, el cual prepondera el fi n de un acto sobre el medio necesario para lograrlo justifi cando las acciones que obtengan la felicidad para una mayoría.11

Cosmovisión personalista y humanista La teoría clásica o tradicional platea una ética de virtudes que determinan y cuestionan la calidad del ser humano como parte de su esencia refl ejada en su carácter. De esta manera se dice que la persona realizará buenos actos en la medida que su carácter lo permite; algo que para fines médicos podemos interpretar como la vocación para la profesión. Por ejemplo, en la decisión de cómo atender al paciente con Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (Sida) influye inmediatamente el carácter del médico más que su necesidad sincera por cumplir normas éticas. La calidad de este carácter depende de una disposición interna para el bien, de virtudes y valores que se refl ejan en el comportamiento habitual. La cosmovisión clásica no confi ere relevancia a la calidad del acto o a la novedad de un dilema médico, sino que cuestiona la calidad del medico o la enfermera; sus habilidades y hábitos que lo hacen virtuoso o considerado para tal servicio. Plantea el hecho de que las personas deben necesitar y desear actuar con ética para un buen efecto; pues es inútil sólo conocer las normas de comportamiento sin que trasciendan en el mismo actor. Esta es la forma de comprender la ética mediante la Vernunft, un modo de pensamiento holístico e introspectivo para la captación profunda de la axiología; a diferencia de la Verstand que es rigurosa y exacta con el uso de conceptos razonados, algo que cualquiera

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siones contemporáneas y se aplican cada vez más en las naciones desarrolladas.

Lo atractivo de esta tendencia es el uso de principios prácticos y necesarios pero que carecen de flexibilidad para ciertas situaciones intercambiando practicidad o rapidez de decisión por libertad de elección complicándose su posible aplicación universal para la jerarquización de valores. La teoría contemporánea nos habla de una ética de los actos y derechos individuales más que personales; ya no se cuestiona el carácter de la persona como la medida del bien sino el alcance de un acto, es decir, hasta dónde afecta al otro; jerarquiza la libertad como principal valor para los actos individuales. En el campo médico el consentimiento informado es una herramienta útil para el uso “responsable” de la autonomía como principio necesario en la relación médico paciente y así, por ejemplo, un mal juicio ha llevado al uso de la autonomía y el consentimiento “informado” para ejercerlos de manera rápida y utilitarista abusando del alcance de las libertades individuales sin la obtención de otro bien que el no interferir con el derecho de elección del paciente. Con esta visión limitante de la ética aparecen conflictos de todas partes que exigen el derecho a la libertad en todos los actos del individuo, pero ofrece herramientas para enfrentamos a problemas emergentes donde, en corto tiempo, necesitamos una solución para el menor daño posible aplicando los principios pragmáticamente.

que sabe leer puede entender y aplicar como imperativos categóricos. Así cualquier tema de actualidad no representaría un problema si inicialmente existieran las personas con vocación para enfrentar problemas que inmiscuyen a su profesión o especialidad.12

Esta nos aporta herramientas para entender la trascendencia de los actos. Una sociedad es humana y no puede desprenderse del proceso evolutivo individual. Esta teoría considera como acciones más adecuadas aquellas que aporten cierta seguridad de supervivencia; pero su esencia radica en el bien común y responsabilidad colectiva, acciones que afectan a todos y que finalmente mejoran sincrónicamente el desarrollo individual. Se plantea que de manera general puede irse caracterizando la calidad del ser humano conforme se va implicando en la sociedad. Es importante aclarar que esta cosmovisión a través del tiempo y el lugar depende de los criterios para califi car un acto como bueno o malo.

Alcances del acto médico Es indiscutible el papel pedagógico del médico en el ámbito de la salud, de manera que la enseñanza de los modelos pedagógicos deberían ser implementados en la preparación del Médico para ayudarlo a usar recursos como el cuestionamiento en el paciente como método de aprendizaje que busca dudas e inquietudes que a veces le resulta difícil expresar, así un oficio firmado apresuradamente cinco minutos antes de una intervención quirúrgica o terapéutica no es lo más adecuado, aunque sí lo más práctico. Los modelos de enseñanza-aprendizaje han ido cambiando a través del tiempo como los modelos de relación médico-paciente; una similitud que debería vincularse con seriedad toda vez que el médico tradicionalmente entendido como “Doctor”, (de la voz latina doscere enseñar)debe asegurar el aprendizaje de sus indicaciones médicas y la relevancia de la patología tratada, no de la manera técnica acostumbrada, más bien adecuándose al nivel cultural del paciente. La tendencia postmodernista de la enseñanza de Paulo Freire enfatiza claramente que enseñar exige la capacidad de escuchar, donde es necesaria una comprensión crítica de la realidad social, política y económica respeto a los saberes de los educandos13; de esta forma la situación social y económica del paciente no debe ignorarse cuando se trata de solucionar un problema de salud o un dilema ético; estas circunstancias de-

terminan el grado de comprensión que el paciente tiene de su patología y por tanto el apego a las indicaciones. En el caso de la relación medico-paciente, el modelo usado debe ser dinámico toda vez que la pluralidad de personalidades es constante día a día en el consultorio y donde incluso dependiendo de la situación (urgente o no) o del tipo de patología (potencial de curación a corto, largo plazo o latente) determinan que se adopten diferentes modelos de relación como sería el modelo paternalista para el primer caso y el responsable en el último.

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Cosmovisión sociobiologisista

Por otra parte cada individuo en la sociedad o grupo particular no tiene las mismas estructuras cognitivas para entender lo que el médico trata de explicar, si se lo propone; entonces identifi car tanto el nivel cognitivo, estructura social y de personalidad se convierten en alcances del acto médico que son indispensables para lograr una comunicación efectiva y el logro del bienestar del enfermo. ¿Quién enseña al médico, por ejemplo, que usar analogías como herramienta didáctica es una alternativa como otras herramientas pedagógicas que existen y que harían exitosa la relación médico-paciente? Es por lo anterior que la participación de la sociología en la medicina es importante ya que se identifican aspectos que involucran la actitud de una sociedad, la familia y las personas que se alteran cuando la enfermedad se presenta pues la curación cobra intereses sociales, psicológicas y/o económicas; es entonces cuando se vislumbra la enfermedad como una amenaza para la sociedad y el individuo.14

Dialéctica del acto médico

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Hegel llamó a este desarrollo de la conciencia como dialéctica y nos induce a pensar que existe un proceso evolutivo que se evidencia a corto, mediano y largo plazo sin que se separe de la visión evolutiva Darwiniana.15 Tal parece que en este proceso evolutivo de la conciencia una etapa envuelve a la anterior (tesis, antitesis, síntesis), similar a lo que sucede con el desarrollo psicosocial de E. Erickson donde cada etapa del desarrollo humano se va superando para poder enfrentarse al siguiente problema social.16 Es un proceso personal y social de desarrollo intelectual y emocional donde un estado de apreciación y valoración egocéntrica es el inicio para desarrollar una visión objetiva del mundo que identifica al otro ser, una otredad que fi nalmente aspira al llamado absoluto. Esta continuidad es arrítmica, por lo que psicológicamente se pueden apreciar mentes “maduras” de corta edad o viceversa, discrepancias biológicas con las mentales; pero ambos en proceso constante de cambio. Por ejemplo, cuando las características cognitivas y físicas de un recién nacido (tesis) tiene que cambiar completamente (antitesis) a una forma infantil más independiente (síntesis), que es una etapa nueva del desarrollo que nuevamente cambia para convertirse en un ser adulto conformando un sistema biológico dinámico. En el ser humano existe una parte subjetiva que lo hace ser, una situación que para fi nes prácticos y médicos hemos denominado conciencia y que incluso evaluamos objetivamente con escalas como la de Glasgow para fines técnicos, biológicos y legales. Así la “elección” del fin de la vida de un paciente incapaz de mostrar su voluntad por un estado de “inconciencia” médicolegalmente definido es difícil, por lo que decisiones pragmáticas y utilitaristas resultan más atractivas cuando por el otro lado se necesita de un análisis detallado. Lamentablemente hay decisiones que se basan en las necesidades de una nación que prefiere elegir lo más barato,-por ejemplo, al legislar la eutanasia por igual para pacientes ancianos, discapacitados, sin probabilidad de recuperación de conciencia o sin sanación.

Definición del acto médico El acto médico está defi nido por su objeto y sus límites, estos límites derivan de los alcances en la defi nición del objeto de la medicina. El objeto de la medicina puede ser entendida de dos formas según su planteamiento filosófico: objeto material y objeto formal. El objeto material del médico sin duda es el ser humano; y su objeto formal debe entenderse como el bien específico que busca para su objeto material; el bien formal es entonces la salud, de la misma forma que un órgano es a su función como el objeto material es a su objeto formal.17 Es así como podemos limitar los alcances del acto médico; primeramente que sólo se puede aplicar en la relación que se establece entre el médico con una persona enferma y segundo, lo que se hace para lograr la salud. En este quehacer la teoría principialista de Childress y Beauchamps puede ser un buen inicio para analizar principios que, como antes mencioné, deberían ser entendidos con la Vernunft o de forma casi instintiva, de manera que dichos principios sean parte del actuar cotidiano de la persona que los aplica, no como razonamiento sino como conocimiento holístico. En esta búsqueda de la salud, identifi camos principios éticos en la relación médico paciente que marcan sus límites: el de Autonomía del paciente, la Beneficencia como principal virtud del médico, la Justicia que debe rebasar por ejemplo los límites institucionales que en el medio hospitalario suelen existir y la no malefi cencia que no es sinónimo de beneficencia como evitar la muerte no es lo mismo que prolongar la vida.17,18

Tesis y primera limitante Los límites del acto médico podemos definirla primero analizando a los protagonistas de dicho acto: el paciente y el médico para después analizar el medio o las circunstancias en las que se relacionan, que permitirá

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Filosóficamente podemos referirnos al Ser como el generador de actos. En la filosofía fenomenológica de Hegel puede comprenderse cómo la conciencia del Ser sufre un proceso evolutivo individual a través del tiempo y de los tiempos que genera nuevas cosmovisiones, teorías y conocimientos a lo largo de la vida personal y de la historia del ser humano. En el contexto individual es un proceso de personalización de la conciencia capaz de diferenciar un individuo de otro y que se relaciona con las experiencias de vida.

Un planteamiento de orden axiológico interesante es la jerarquización de valores, la cual consiste en un proceso de valoración de valores para dar orden particular en una situación particular permitiendo asignar relevancia y prioridad a unos valores sobre otros de forma fundamentada. Se dice actualmente que vivimos una época de “crisis de valores” sin tomar en cuenta que el problema quizá radica en el proceso de valoración del sujeto, no en el valor mismo, su cualidad o cantidad. Estamos en una crisis de valoración donde el grado de conciencia del sujeto seguramente juega un papel importante. Valores que según su relevancia se convierten en principios como la autonomía que incluye a la libertad, la justicia a la igualdad, la benefi cencia y no malefi cencia que refieren al bien.

Antitesis y segunda limitante El paciente como bien material de la medicina y como ser humano enfermo no siempre tendrá en su consciencia la salud como bien máximo o aspiración, de manera que el objeto formal del acto médico se interpondría al bien máximo que busca o que carece el paciente, de otra manera fracasaría cualquier acto médico en la cual no existe

compromiso del paciente por no ser su bien máximo la salud, a veces no porque no la desee, sino porque es imposible lograrla; esto representa la segunda limitante del acto médico. Empaticemos con un paciente cuyo bien máximo no es la salud, donde las enfermedades que aun no tienen cura son protagonistas; en este margen de idea la autonomía del paciente debe ser respetada, pues reconoce la dignidad del ser humano al respetar su libertad de decisión, es entonces en este nivel la autonomía el principio rector. Por ejemplo un paciente que padece VIH sabe que no sanará y por tanto la salud no podrá ser ya su más grande aspiración como bien máximo. Es aquí donde el acto médico se debe enfrentar a su segunda limitante al no poder cumplir su objeto formal. El bien máximo que puede lograr un paciente en estas circunstancias debe rebasar el simple equilibrio somático o biologicista, pues la complejidad del ser humano radica en el equilibrio de otras necesidades al estar imposibilitada su salud. Entonces el acto médico debe escapar de lo que debe hacer por lo que pudiera hacer al identifi car una necesidad o un bien máximo de un paciente terminal, discapacitado permanentemente, o con una enfermedad incurable.17,19 Ayudarlo entonces a conseguir un bienestar más que la salud y aliviar su sufrimiento y padecer sería ahora el alcance del acto médico. Para lograr la benefi cencia del acto médico no debe olvidarse la autonomía del paciente, la beneficencia actúa en la medida que la autonomía lo permita siempre en un perfecto equilibrio con las circunstancias particulares del paciente; de manera que cualquier exceso en ambos principios nos alejan de lograr nuestro objeto formal generando en el caso de la beneficencia un paternalismo no buscado y una autodestrucción con el uso exagerado de la autonomía.

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comprender el alcance o la potencia del acto médico. La primera limitante se refi ere a los conocimientos y capacidades del médico algo relacionado con lo que Childress y Beauchamps llaman virtudes profesionales cardinales.6 La calidad del arte médico depende del grado de perfeccionamiento responsable en el conocimiento, no sólo medico o científi co, sino ético y pedagógico. Esto define las limitaciones médico-dependientes. Aquí el principio rector podría ser la beneficencia y no malefi cencia bajo la premisa de siempre no hacer daño. De esta forma el médico debe buscar lo mejor para su paciente no de forma obligada, la ética efectiva debe ser un deseo y una necesidad para poder ejercerla de manera libre; así se lograrán siempre las mejores decisiones encaminadas al bien máximo del paciente. Reconocer las propias insuficiencias y la preparación continua del médico son herramientas que ayudarán a superar esta limitante.

Síntesis y tercera limitante

La tercera limitante del acto médico, no depende del paciente o del médico, es un tercer nivel ético donde las circunstancias juegan un papel importante como medio en donde la relación médico paciente se gesta y desarrolla. Puede convertirse en una limitada acción que se genera en la normatividad interna de una institución pública o privada, o por una legislación particular que administra la relación médico paciente pero que no debe superar los principios éticos de dicha relación; de manera que en esta limitante la justicia se convierte en un principio rector. La normatividad no depende del médico pero si la aplicación del principio de justicia y aterrizar, con base en sus conocimientos éticos, la verdadera práctica de la medicina que prepondera por mucho el bienestar del paciente ante las propias necesidades institucionales, tratando en el mejor de los escenarios respetar la normatividad

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de las mismas pero siempre con justicia. De esta manera no debe ignorarse la justicia actuando con beneficencia, siendo necesario virar de la ética clínica a la bioética social; es aquí donde entran en contacto tanto la bioética como el derecho, herramientas que ayudarían a superar este límite.20 El análisis dialéctico del acto médico busca, en el marco del entendimiento fi losófi co, un paradigma que contribuya a la solución de cualquier problema que surja de la relación médico paciente. En la dialéctica del acto médico que aquí presentamos la primera limitante (tesis), determina la calidad del acto y la afi rmación de un problema al ser el médico el receptor de un desafío clínico y bioético, el paciente (antitesis) representa una negación conciente de un bien deseado que es la salud, esta limitante ofrece la pauta para dar dirección al acto que finalmente debe ser entendida (síntesis) bajo una visión holística al ser un acto particular que se desarrolla en un medio social.

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Análisis axiológico

Seguramente para aquellos que tienen que tomar decisiones públicas o recomendarlas, la variedad de teorías se torna confusa siendo que el tiempo que requieren para solucionar los dilemas es limitado. Se ha propuesto incluso la irrealidad en la aplicación generalizada de una teoría moral clasifi cada que se aplique de manera universal a los problemas bioéticos.21 También se descarta el uso inductivo como herramienta para poder llegar a las mejores teorías que solucionen de manera particular cada uno de los problemas éticos.22 De cualquier forma

Las posturas clásicas sobre la ética analizan la calidad del actor por lo que debiera ser respecto un acto, un campo de la ética deontológica; la visión pragmática utilitarista tiene aspectos de la postura del bien para la felicidad, campo de una ética teleológica. Pues bien, el actuar se vuelve pleno cuando se articulan ambas en lo cotidiano, lo que Gutiérrez Sáenz llama cosmovisión integradora. Si analizamos un problema particular como una enfermedad altamente trasmiscible como el VIH Sida, enfrentamos un problema que escapa del control meramente individual; ya que señala, en el sentido de lo necesario, medidas que sean pragmáticas y efectivas ante la urgencia de controlar la pandemia, situación que resulta peligrosa cuando se cuestionan ciertas acciones. Bajo este panorama existen fundamentalmente dos posturas polarizadas para las acciones que se han tomado respecto al Sida. El grupo conservador es aquel que se opone drásticamente a las medidas de prevención, cuestionan el uso del preservativo como la medida más segura y efectiva de protección al considerar que promueve también la promiscuidad y critica enérgicamente acciones como la repartición gratuita de preservativos y utensilios como jeringas y agujas estériles para usuarios de drogas inyectables. Consideran que la medida que debe promoverse son la abstinencia y la monogamia. Por otra parte se encuentran los liberales representados por algunas organizaciones no gubernamentales y centros nacionales quienes han adoptado las primeras mediadas mencionadas en un considerable porcentaje de infecciones debida a una u otra vía.23,24 La postura conservadora a veces resulta intolerante, poniendo en riesgo el respeto a los derechos humanos pero definitivamente sus cuestionamientos deben ser analizados. La causa por la que existen tantas cosmovisiones resulta ser muy sencilla; todo individuo de forma necesaria vive la ilusión de poseer una verdad holística, que se deriva de su entendimiento conciente

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el escepticismo o relativismo no son una opción, pues no aporta soluciones ni propuestas concretas o aplicables.

Cuando existe un daño incurable, la salud es consecuentemente imposible, de manera que el objeto formal de la medicina se des-

vanece ante su imposibilidad, por ello el valor máximo no puede ser la salud. Queda finalmente atender la parte vital del objeto material con los actos que pueden ser médicos al entender que la vida del ser humano es más que la vida misma. El motivo de la vida no debe ser la salud sino el bienestar del ser humano, y su bienestar esta determinado por muchas capacidades que lo hacen creativo, buscar este bienestar no es estrictamente un acto médico, es un acto del médico en la medida del propio valor de creatividad del médico. De esta forma siendo la salud el objeto formal del acto médico, y pudiendo ser el bien mayor del paciente, la vida que es el escenario donde se desarrolla el proceso de salud-enfermedad, resultaría ser el valor supremo en cualquier jerarquización de valores particularmente en la relación médico-paciente. Actuar en contra de la vida iría en contra de la fi gura del médico; debiendo reconocer que sin vida no hay salud y por tanto no hay acto médico. Su segunda naturaleza es confortar al paciente, no lo podrá curar, pero sí aliviar su sufrimiento, de esta forma aquel que realice acciones que van en contra de la salud o de la vida misma, no estaría realizando actos médicos, luego entonces ¿es médico?

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La escuela de Atenas refleja el proceso evolutivo del pensamiento filosófico. El presente artículo trata de dar una explicación sobre la evolución de la ética y las discrepancias entre una decisión médica en el contexto de la realidad que es cambiante. La fenomenología del acto intenta fundamentar una decisión. Una decisión que, como todas, pueden tener repercusiones, muchas de ellas que involucran a la vida o la muerte. Tratamos de hacer referencia a la aplicación de una metodología basada en la llamada dialéctica Hegeliana, con el objetivo de dirigir el acto en tres pasos consecutivos: tesis, antitesis y síntesis. Concebimos a la ética como la acción de dar sentido al acto. Este sentido puede ser analizado en el contexto de la evolución y la selección natural, una forma de visión organicista de la filosofía, de manera que las decisiones pueden cambiar de la misma forma que la sociedad y el ser humano evolucionan. La escuela de Atenas, de Rafael, es una representación muy interesante sobre la evolución de la filosofía en la representación temporal y espacial de sus exponentes. Algunos de los filósofos representados son fácilmente reconocibles. En el centro se encuentra Platón, a su lado Aristóteles, uno de los grandes pensadores sobre la ética, entre otros filósofos.

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sobre la materia y la forma del conocimiento sincrónicamente; esto es ampliamente comentado en el hilemorfi smo aristotélico, lo cual explica como en el desarrollo de nuestras vidas constantemente crece el alcance de nuestra cosmovisión; vamos interpretando la materia en base a conceptos predefi nidos y transmitidos según nuestro tiempo y espacio que van generando una interpretación dinámica y cambiante del mismo dependiente de la experiencia. Este proceso es real y existe en aquel con conocimientos formales o científi cos hasta aquel con conocimientos meramente empíricos, así todos ven al mundo con su propio lente inevitablemente. Por ello la adopción de una cosmovisión integradora podría ser la solución más cercana a la verdad cuando se inicia aceptando una pluralidad de ideas que es la que lleva al consenso y con ello la estructuración formal de una idea de la cual deriven valores y normas que a modo de imperativos no necesariamente categóricos generen apoyos para nuestras decisiones sociales y consecuentemente médicas.

Editorial Team

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Un certain regard:

SEPSIS

Jacqueline Liszeth Oliva-Ramírez

Departamento de Inmunología, Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, Instituto Politécnico Nacional. Laboratorio de Inmunorregulación. México DF; México. liszeth@gmail.com

Resumen La sepsis es un síndrome definido por infección en presencia de una respuesta inflamatoria sistémica, algunos de los signos generales y el desarrollo de la enfermedad se describirán a lo largo del artículo de manera molecular. La importancia del entendimiento de esta patología nos brindará un panorama que se ha intentado abordar desde hace más de una década como el uso de biomarcadores pronósticos y diagnósticos, empleo de nuevas terapias y perspectivas a nivel mundial para el mejor control de la enfermedad.

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Durante décadas el estudio la relación huésped-microorganismo ha sido ampliamente estudiado en la búsqueda de la preservación de la salud. Enfermedades sistémicas infecciosas como la sepsis, en el que la homeostasis del sistema se ve afectada actualmente se estudia para entender su fisiopatología y encontrar mejoras en el diangóstico, pronóstico y tratamiento. Históricamente algunas de las manifestaciones clínicas fueron descritas por Hipócrates que introduce el término de “putrefacción” o herida “putrefacta”, un siglo más tarde en Persia, Ib Sina observa que la infección se acompañaba de fiebre, sin embargo es hasta 1914 que se introduce la primera definición de sepsis que describe a la infección como parte fundamental [1]. En 1992 Roger Bone y colaboradores realizan el primer consenso para definir el síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS) y sepsis por la “Associated American Chest Physicians” y la “Society of Critical Care Medicine” [2, 3] La sepsis es un síndrome clínico definido por infección en presencia de una respuesta inflamatoria sistémica, se caracteriza en los pacientes por signos generales como fiebre > 38 ºC o hipotermia < 36 ºC, frecuencia cardiaca >90 latidos por minuto, frecuencia respiratoria >20 por minuto o PaCO2 <32mmHg y leucocitosis >12,000ml o leucopenia <4,000ml; la infección puede ser sospechada o documentada a través de cultivos de sangre u otros fluidos corporales, esta última es la única diferencia entre SIRS y sepsis. De acuerdo a la gravedad del estado general de paciente existen otras 2 clasificaciones: sepsis grave; cuando se asocia con falla orgánica, es decir, con disfunción progresiva y potencialmente reversible en más de dos órganos; y choque

séptico; es la hipotensión sostenida y refractaria a una adecuada reanimación de fluidos [2, 4]. A nivel mundial, la sepsis constituye una de las principales causas de morbi-mortalidad hospitalaria y se ha calculado una incidencia de 18 millones de casos al año, con una tasa de mortalidad del 30% [4, 5]. Estudios epidemiológicos reportan que de los casos de sepsis en unidades de cuidados intensivos, aproximadamente 28% corresponden a sepsis, 24% a sepsis grave y 30% a choque séptico [6]. Se estima que más de la mitad de todos los pacientes sépticos desarrollan sepsis grave y un cuarto de ellos choque séptico, con tasas de mortalidad de 30 a 35% para la sepsis grave y de 50% para el choque séptico [4, 7]. En México, la incidencia de sepsis hasta el año 2000 era de 58%, con una tasa de mortalidad de 25% [8]. En pacientes sometidos a cirugía mayor se reporta que la incidencia de sepsis puede ser de 35% [9]. Respuesta inflamatoria La inflamación es la respuesta provocada por agentes nocivos como lesión en los tejidos o infección que involucra el reclutamiento coordinado de componentes celulares y humorales al sitio de inflamación, provenientes gran parte de ellos de torrente sanguíneo [10]. La respuesta inflamatoria inicia con el reconocimiento de los agentes de daño o patógenos, estos agentes poseen moléculas que son sensadas por células del sistema inmune innato residentes de tejidos [11]. Cuando estas moléculas pertenecen a bacterias, hongos o virus, se les denomina patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs), se caracterizan por ser secuencias repetidas y conservadas entre especies; son detectados y reconocidos por el huésped a través de receptores de reconocimiento de patrón (PRRs) que se encuentran en la superficie de una gran variedad de

células como monocitos, neutrófilos, macrófagos residentes, mastocitos, células endoteliales, entre otras [12, 13] . Ejemplos claros de este reconocimiento son componentes bacterianos como el lipopolisacárido de bacterias Gram negativas por el TLR-4 en la superficie de monocitos. [13] Mediante este reconocimiento se desencadena intracelularmente una cascada de señalización que activa factores nucleares importantes en la transcripción de moléculas inflamatorias, como citocinas, quimiocinas, aminas vasoactivas, eicosanoides y proteínas de cascadas proteolíticas, estos son liberados por las células al medio extracelular y tienen diferentes funciones dependiendo de su naturaleza, se pueden distinguir 2 clases de mediadores inflamatorios, los proinflamatorios y los antiinflamatorios [14, 15]. Uno de los primeros eventos en la inflamación originado por citocinas proinflamatorias como TNF-a e IL-1b, es el aumento en el flujo sanguíneo y el infiltrado celular al sitio de inflamación, este requiere que el endotelio vascular se active liberando prostaglandinas (PGI2) y óxido nítrico (eNO) que permite la vasodilatación y la extravasación de leucocitos [16, 17]. Inicialmente de neutrófilos por acción de quimiocionas como IL-8, estas células contienen la infección eliminando a los patógenos mediante la fagocitosis y producción de especies reactivas del oxígeno y nitrógeno [18]. Estos primeros eventos dan origen a los signos cardinales de la inflamación: rubor, calor, dolor y edema [14]. Posteriormente migran al sitio monocitos de torrente sanguíneo que maduran a macrófagos, estos fagocitan a neutrófilos en estado de apoptosis, promoviendo una respuesta anti inflamatoria, mediante la liberación de citocinas como IL-10 y TGF-b. Los monocitos pueden también liberar derivados de eicosanoides denominados resolvinas, que ayudan en la reparación del tejido [19, 20]. Es importante puntualizar que en un inicio esta

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Sepsis, Inflamación sistémica, biomarcadores

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Sepsis, el inicio

Existen evidencias de que diferentes moléculas proinflamatorias pueden conducir la inflamación local a sistémica, dentro la que destaca C5a del complemento [21]. Durante la sepsis se activan cascadas proteolíticas del complemento por diferentes vías, que convergen en una proteína llamada C5; producida por el hígado y por granulocitos; al romperse por acción enzimática da origen a 2 subunidades, C5b que se une a la pared bacteriana y una anafilotoxina, C5a [22]. Los receptores para esta última subunidad se encuentran distribuidos en células como, neutrófilos, macrófagos, células dendríticas inmaduras, células del hígado, pulmón, bazo, cerebro, corazón, y endotelio vascular por lo que pueden activar a una variedad de sistemas [23]. Se han encontrado concentraciones séricas elevadas de C5a en pacientes sépticos, que se exacerba por la producción de IL-6 y la liberación de proteínas de fase aguda como CRP (proteína C reactiva) que también activa el complemento [24]. Este C5a se une a sus receptores, ocasionando la disminución en la apoptosis de neutrófilos, la producción de IL-8 en células endoteliales, liberación de HMGB1 de macrófagos y el incremento el factor tisular en la superficie del endotelio [25-27]. Esto último es de gran importancia ya que se activa la vía extrínseca de la coagulación, hay un aumento de P selectinas en las células endoteliales que facilitan la adhesión y agregación

plaquetaria aunado a la conversión de fibrinógeno en fibrina para formar microtrombos [28-30]. Esto representa en los pacientes un compromiso en la hemostasia pues los mecanismos naturales antitrombóticos o anticoagulantes; proteína C, proteína S, antitrombina III, el inhibidor del factor tisular, y la trombomodulina están disminuidos en la sepsis por acción de citocinas proinflamatorias TNF-a e IL-1b [31]. Estudios en ratón donde bloquean receptores de C5a demuestran aumento en la sobrevida, y disminución de IL-1b, TNFa, IL1Ra e IL-10 [32] Durante la evolución de sepsis a sepsis grave existen deficiencias en la perfusión a tejidos debido al aumento en la permeabilidad vascular, esto es causado por la sobre activación del endotelio con mediadores vasoactivos como la histamina, la trombina y el factor de crecimiento endotelial vascular, cada una de ellas al unirse con su receptor inducen la disociación de componentes de las uniones intercelulares y aumentan la vasoconstricción lo que permite la extravasación de plasma y proteínas con la consecuente disminución de la presión sanguínea, también hay aumento de la trombosis microvascular por aumento en la adhesión plaquetaria y disminución de los factores anticoagulantes arriba mencionados, esto lleva a la hipoxia celular y apoptosis celular [33, 34]. Cuando falta el oxígeno a los órganos puede ocasionarse falla orgánica, esta se define como la disfunción progresiva y en ocasiones reversibles de dos o más órganos [3]. Si esta hipotensión se mantiene aún con el tratamiento de elección que es la reanimación hídrica y vasopresores se conoce como choque séptico, durante este estado hay una disminución de las posibilidades de sobrevida [2]. Durante la falla orgánica el paciente se puede monitorear mediante la cuantificación de diferentes proteínas y moléculas solubles que representan

el compromiso de cada órgano, tal es el caso de la cuantificación de bilirrubinas, transaminasas, troponina, lactato, tiempos de coagulación, urea y creatinina en orina. Algunas moléculas liberadas durante este daño a los órganos durante la isquemia son las especies reactivas del oxígeno y del nitrógeno (ROS y RNS) [35]. Estos son radicales incluyen a anión superóxido, peróxido de hidrógeno, hipoclorito, óxido nítrico entre otros. Durante la hipoxia, hay disminución de la actividad de la cadena respiratoria incrementando ROS y RNS dando como resultado la disminución del pH y aumento del lactato, así como la disminución del potencial de membrana que favorece la apoptosis celular mediante la liberación de citocromo c y aumento en la activación de moléculas proapoptóticas, este es uno de los mecanismos que exacerba el daño en los órganos llevando a las células a apoptosis [36, 37] . La participación de cada una de las céluas durante el proceso de la inflamación de terminará la duranción y el cuadro y sistémico dependiendo de la constancia en la liberación de mediadores que serán descritos detalladamente. Participación de las células del sistema inmune en el desarrollo de la sepsis 1. Neutrófilos El porcentaje de neutrófilos en pacientes sépticos se ve aumentado, esto es debido a al aumento en la producción y salida de los neutrófilos de reserva de médula ósea. Se ha encontrado que en modelos de sepsis microbiana hay un aumento en la producción de quimiocinas como CXCL12 que promueven la salida en médula ósea de estas células, este mismo estudio encuentra que el bloqueo de esta quimiocina disminuye la neutrofilia durante la sepsis

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inflamación es aguda y local, en la mayoría de los casos puede resolverse eliminando al agente patógeno y reparando tejido, sin embargo, en el paciente séptico no hay resolución de la inflamación y la liberación de todos esto mediadores es a nivel sistémico, es decir que otras células distales al sitio inicial de la lesión participan liberando más moléculas inflamatorias que exacerban este fenómeno [10].

2. Monocitos Estas células mononucleares del sistema inmune innato ayudan a la homeostasis del sistema una vez que se transforman en macrófagos, son

fagocíticas y al activarse pueden secretar diversas citocinas dependiendo del estímulo al reconocer a los patógenos a través de sus PRRs [45]. Se ha descrito que en pacientes sépticos sobrevivientes hay un incremento en la expresión de TLR-4, TLR-2 y CD14 en monocitos circulantes respecto a pacientes que no sobreviven [46]. Dentro de otras moléculas que disminuyen y que correlacionan con pronóstico es HLA-DR, en la actualidad se conoce que el mecanismo de disminución en la expresión es debido endocitosis del receptor por la acción de IL-10; esta citocina se encuentra elevada también en pacientes sépticos y también correlaciona con mal pronóstico [47, 48]. Por otro lado existen células mononucleares con características de macrófagos que son residentes de tejidos, tal es el caso de células de kupffer en el hígado, macrófagos alveolares en pulmón, microglia en sistema nervioso entre otros. El papel que tienen los macrófagos residentes de tejidos, es importante durante la disfunción orgánica, ya que se han encontrado que en respuesta a moléculas endógenas (DAMPs, patrones moleculares asociados a daño) liberadas durante la isquemia por falta de perfusión sanguínea a los órganos y por activación de citocinas inflamatorias como HMGB1 o ácido hialurónico, pueden ser reconocidas por estas células a través de TLRs e inducir en el órgano la producción de citocinas proinflamatorias [49, 50]. Las células de kupffer, pueden reconocer estos DAMPs y producir quimiocinas como MIP-2 y citocinas proinflamatorias, esto es diferencial en modelos animales de sepsis polimicrobiana con deficiencia de TLR-4 en el que verifican daño hepático, encontrando menor cantidad de transaminasas, IL-6 e IL-10 y disminución en el infiltrado de neutrófilos al hígado [51, 52] . Por su parte macrófagos alveolares también responden de manera similar, estudios recientes encuentran que durante sepsis incrementan la expresión de TLR2 y TLR4 favoreciendo la

producción de MIP-2, MIF y TNF-a, no así en ratones deficientes de estos receptores, por lo que estos autores proponen que el aumento en el infiltrado de neutrófilos a este órgano se debe de igual forma a la activación de los macrófagos alveolares [53]. 3. Linfocitos La participación de estas células durante la sepsis está disminuida ya que el paciente puede cursar por una linfopenia, esto es debido al aumento en la apoptosis de estas células, sin embargo estudios recientes pueden explicar esta disminución ya que se ha encontrado que moléculas de coestimulación como PD-1; cuya acción en los linfocitos es la inhibición de la proliferación y en casos de infección aumento en la suceptibilidad a apoptosis; se encuentra incrementados en modelos de endotoxemia en modelos múridos, y su bloqueo puede disminuir la apoptosis de estas células y aumentar la sobrevida del ratón [54-56]. Diagnóstico Hasta la fecha la identificación del agente causal durante la sepsis se ha realizado mediante hemocultivos, sin embargo tienen algunas desventajas entre las que destacan el volumen de muestra que debe ser mas de 1ml, esto en pacientes neonatos representa un problema, el crecimiento bacteriano debe esperar más de 24 horas y cerca del 30 y 40% son falsos negativos. Existen técnicas actuales que pueden favorecer el diagnóstico como la búsqueda de ácidos nucleicos bacterianos a través de la reacción en cadena de la polimerasa, la cantidad de muestra necesaria es menor a 1ml y la sensibilidad es de hasta 40%. Existen estudios que demuestran que aún en pacientes contratamiento antimicrobiano equipos que detectan genoma universal bacteriano 16sRNA y 23sRNA como septifast puede determinar la presencia de algunos agentes patógenos [57].

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microbiana [38]. La función de estas células está restringida a la fagocitosis y posterior eliminación de patógenos una vez que son reclutadas al sitio de inflamación [39], estudios recientes han encontrado cambios en la quimiotáxis de neutrófilos en pacientes con sepsis, que se asocia a la gravedad de la enfermedad, esto es debido a que hay disminución de la infiltración de neutrófilos al sitio de la infección pero aumento en el infiltrado de estos en órganos distales, esto ocasiona la disminución en la eliminación de patógenos. Se ha descrito que esto es por la disminución de receptores de quimiocinas como CXCR2 pero aumento en la expresión de receptores como CCR2, ambos receptores responden a quimiocinas diferentes, como CXCL2 (MIP-2) y CCL2 (MCP-1). El bloqueo de CCR2 en modelo múrido de punción cecal, le confiere protección por la disminución del infiltrado a órganos como pulmón, corazón y riñón y niveles séricos bajos de indicadores de falla orgánica como transaminasas, creatinina y urea. Así mismo se sabe que los neutrófilos deben actuar en conjunto con otras células y que las citocinas liberadas por la activación de los neutrófilos pueden modular la actividad del monocito, el grupo de Ocuin et al, demostró en un modelo de punción cecal en ratón, que la interleucina 10 producida por los neutrófilos es necesaria para modular la producción de citocinas proinflamatorias en monocitos, este hallazgo aunado a la disminución del infiltrado a los sitos de lesión, pudiera estar en parte explicando la exacerbada activación de monocitos [40-44]. Estos nuevos estudios dan explicación a algunos de los fenómenos que se encuentran en los pacientes sépticos.

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Gran diversidad de moléculas que se incrementan durante la sepsis se han intentado asociar al diagnóstico y pronóstico de los pacientes, como amiloide sérico, la ceruloplasmina o la proteína unidora de lipopolisacárido, sin embargo pocas tienen valor predictivo [58]. Para el diagnóstico entre las más empleadas con valor predictivo se encuentran proteínas en circulación producidas por diferentes órganos. Algunas de ellas son las siguientes: La procalcitonina es un polipéptido de 116 aminoácidos precursor de la hormona calcitonina, su producción en sujetos sanos se limita a las células C de la tiroides, sin embargo se sabe que durante infecciones se producen por tejidos como hígado, riñón, páncreas, tejido adiposo y células del sistema inmune. Se asocia su actividad al aumento de la quimiotaxis de monocitos. Durante infecciones bacterianas incrementan los niveles séricos por arriba de 0.5ng/ml y puede hacer distinción entre pacientes infectados de aquellos que no lo están, algunos estudios muestran que la sensibilidad puede variar de un 75-97% y la especificidad del 7080% [59-61]. En comparación con otras moléculas solubles que se encuentran elevadas en los pacientes sépticos como proteína C reactiva; esta una proteína de fase aguda producida por el hígado en respuesta a IL-6, tiene una sensibilidad del 88% y una especificidad del 23%; la IL-6; citocina producida durante infección en gran cantidad por el endotelio, tiene una sensibilidad del 91% y especificidad del 41%. Estos estudios demuestran que la procalcitonina tiene mejores resultados en el diagnóstico al poder diferenciar entre pacientes con SIRS de aquellos que tienen sepsis [60]. Algunas otras proteínas correlacionan con el pronóstico de los pacientes sépticos como antes mencionamos,

es el caso de la IL-10, esta molécula soluble se puede cuantificar en suero y niveles altos se asocia con mal pronóstico, ya que está más elevada en pacientes sépticos no sobrevivientes. Otra molécula que se puede cuantificar es HLA-DR en la superficie de monocitos, esta también disminuye en pacientes con sepsis y correlaciona con mal pronóstico [62]. Existen estudios clínicos con otras moléculas de superficie cuantificadas en células que correlacionan con pronóstico, sin embargo al igual que con los marcadores diagnóstico no cuentan con valores pronóstico, tal es el caso de CD80 y CD40 en monocitos, CD64 en neutrófilos, moléculas de adhesión como ELAM-1 en endotelio, P-selectina en plaquetas, entre otros [58, 63, 64]. Escalas clínicas En la actualidad existen escalas que evalúan el compromiso del paciente con sepsis y se asocian con valores pronóstico, entre ellas están SOFA (Sepsis-related Organ Failure Assessement) y APACHE II (Acute Physiology and Chronic Health Evaluation), que evalúan la disfunción orgánica mediante la evaluación de 6 sistemas: el respiratorio, circulatorio, renal, hematológico, hepático y nervioso central, ambas están validadas estadísticamente y pueden predecir el porcentaje de mortalidad certeramente [65, 66]. Terapia estándar Una vez que se han evaluado los criterios de sepsis arriba mencionados, el manejo del paciente con sepsis grave se inicia en las primeras 6 horas con la resucitación a base de fluidos naturales o artificiales como coloides o cristaloides para inducir el aumento en la perfusión y llevar la presión venosa central entre 8-12mmHg y la presión arterial media >65mmHg. Posterior a esta maniobra se busca el

foco de infección con cultivos de sangre y de secreciones, puede ayudarse este diagnóstico mediante rayos x o tomografía computarizada, seguido de la administración de antibióticos vía intravenosa. Intervenciones necesarias dependiendo del paciente como drenaje de abscesos o laparotomía exploratoria se deben realizar en la brevedad, ya que esto puede orientar el mejor manejo del paciente. Se administran de igual forma vasopresores como norepinefrina o dopamina para corregir la hipotensión y se ayuda al paciente con ventilación mecánica [2, 67] . El uso de corticoesteroides intravenoso está restringido a adultos y solo después de confirmar baja respuesta a la resucitación con fluidos y a la terapia con vasopresores, algunos estudios sobre ensayos clínicos en pacientes son controversiales ya que hay grupos que apoyan que el uso en bajas dosis de hidrocotisona disminuye la mortalidad mientras que otros no recomiendan su empleo ya que aumenta la mortalidad en estos pacientes [2, 67]. Otras terapias como el empleo de proteína C, que es un anticoagulante que tiene diferentes acciones puede inhibir la producción de TNF-a, inhibir factores de la coagulación como Va y VIIa o plasminógeno de esta forma limita la formación del trombo y activa la fibrinólisis. Se recomienda su uso solo en pacientes adultos con alta mortalidad y APACHE >25. Algunas contraindicaciones son que el paciente curse con hemorragias internas o choque hemorrágico, presencia de catéter epidural o cirugías recientes intracraneales o intra espinales, uno de los riesgos es el aumento o aparición de hemorragias internas. A pesar de que desde el 2001 se aseveraba que había disminución en la mortalidad de los pacientes, los hallazgos son variados pues algunos estudios recientes obtienen buenos resultados y otros aseguran que el uso de la pro-

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Biomarcadores

Se ha propuesto también el uso de estatinas en pacientes con sepsis y neumonía desde el 2006 sin embargo estudios recientes demuestra que no hay diferencia en la disminución de la mortalidad ni efecto protector en estos pacientes al administrarles estatinas además del tratamiento convencional, los indicadores celulares como valor de leucocitos, proteínas sobre la superficie de estas o factores de la coagulación permanecen sin cambio respecto a pacientes sin administración de estatinas [69, 70]. Terapias experimentales Algunas terapias probadas en modelos animales como el bloqueo de INF-gamma, HMGB-1, anti trombina III y ghrelina muestran protección de sepsis y endotoxemia disminuyendo efectos como falla orgánica y aumentando sobre vida, los mecanismos son diversos, por ejemplo, la ghrelina activa al nervio vago y hay disminución de citocinas proinflamatorias. Ya que se sabe que HMGB-1 induce infiltrado en organos de neutrófilos, aumenta la producción de citocinas proinflamatorias, entre otras, el bloqueo de la forma activa de HMGB-1 mediante anticuerpos monoclonales disminuiría el efecto deletéreo ocasionado por el mismo [71-74]. Algunos grupos de investigación en la materia han propuesto a los TLRs y sus moléculas de señalización como blancos terapeúticos para la disminución de la respuesta inflamatoria, se ha probado hasta la fecha bloqueadores de moléculas adaptadoras de los TLRs importantes en la señalización en modelos de artritis e inflamación crónica con resultados deletéreos, hay disminución de citocinas proinflamatorias e inhibición de la proliferación

y diferenciación de linfocitos B. También se han usado inhibidores de IRAK-1 disminuyendo también IL-1b y TNF-a. Este campo de opciones terapéuticas aún está explorándose en modelos animales, la mayoría de ellos tienen resultados en controversia con otros grupos de investigación, sin embargo no se cierra la posibilidad de la continua experimentación [75]. Inmmunonutrición en el paciente séptico Este término se acuña por la habilidad de algunos nutrientes en disminuir los efectos deletéreos ocasionados por las complicaciones de la enfermedad y cuya actividad es directa en células del sistema inmune innato [76]. La inmuno nutrición puede promover la reactivación de células, la disminución de la inflamación, disminución del estrés oxidativo y la reparación del tejido. Algunos ejemplos de estos nutrientes son la glutamina, arginina, N-acetilcisteína, vitaminas antioxidantes, niacina, entre otros. Estudios demuestran correlacionando con las escalas clínicas como SOFA, que la administración de fórmulas comerciales con alto contenido en los nutrientes mencionados con anterioridad mejoran el pronóstico del paciente y disminuyen los valores de las escalas[77]. En la actualidad los mecanismos de acción de algunos de estos nutrientes empiezan a conocerse, tal es el caso de la niacina que bloquea la fosforilación del inhibidor de NfkB; que es un factor de transcripción necesario para la producción de citocinas proinflamatorias, este estudio demuestra que en pulmón se disminuyen los infiltrados y el daño al administrar la niacina [77]. Otro ejemplo es la glutamina, se sabe que la administración de este aumenta la expresión de moléculas citoprotectoras como proteínas de choque térmico entre ellas HsP70, y hay disminución de citocinas proinflamatorias [78]. La inmunonutrición es otro campo más

por explorarse, sin embargo, ya se emplea en los pacientes quirúrgicos, en pacientes quemados y en sepsis. Perspectivas En nuestro país la falta de estudios epidemiológicos en este campo, impide la obrención de cifras reales sobre incidencia, tasas de mortalidad y morbilidad. A nivel mundial los parámetros indican un aumento en la incidencia de la sepsis; los factores que se pueden estar sumando a este fenómeno son la falta de diagnóstico oportuno o nuevas alternativas en el tratamiento. La asociación Global Sepsis Alliance (GSA) innagurada en el 2010 en el que participan mas de 70 países ha puesto en marcha programas para el estudio de la sepsis, ya que en la actualidad solo el uso de escalas clínicas con poder predictivo es una de las mejores herramientas que poseen los clínicos para el manejo de los pacientes. Diversos grupos de investigación a nivel nacional e internacional tienen puestos los ojos en la búsqueda de marcadores pronóstico y/o diagnóstico oportuno, que puedan ayudar en la mejora del manejo de los pacientes. Lo que es real, es que aún faltan por comprenderse diversos mecanismos moleculares que puedan orientar a los clínicos y culminar en la salud del paciente. Es por ello que el fomento del estudio tanto básico como clínico de la sepsis debe seguir muy vigente.

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teína C no disminuye la mortalidad en adultos ni en pacientes pediátricos con sepsis grave, aumentando solo el riesgo a hemorragias [67, 68].

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La tormenta de citocinas, también conocida como hipercitocinemia, hace referencia a una respuesta inflamatoria fuera de control con consecuencias biológicas que comprometen la vida. Aunque los mecanismos fisiopatológicos no son suficientemente claros, el ojo del huracán se centra en procesos de origen infeccioso tal como se observa con la infección del virus de la influenza que determinó, con gran probabilidad, la causa de muerte de muchos casos en las pasadas pandemias. Sin duda, ambas reflejan un hecho del macro y microambiente majestuoso y mortal al mismo tiempo.

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Eder Eduardo Jimenez Gayosso1, Ana Yuridia Mendoza Gama1

Hospital de Ginecología y Obstetrcia No. 3 IMSS. Víctor Manuel Espinosa de los Reyes. Unidad Tocoquirúrgica 1 mendozagama@gmail.com

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ABSTRACT Ectopic pregnancy is an obstetric emergency, and is defined as the implantation of a fertilized egg outside the endometrial cavity. Among the risk factors for developing the disease highlights the clinical or subclinical infection by Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae associated with pelvic inflammatory disease, use of ovulation induction, tubal surgery, use of intrauterine devices, increased smoking. The most common site of localization is specifically tubal ampullary region. The diagnosis is clinical suspicion considering the patient history and risk factors identified, the presence of pelvic pain associated with amenorrhea and positive pregnancy test, be suspect in their diagnosis. Auxiliary exist in this disease diagnosis such as ultrasound and quantifying the fraction of human chorionic gonadotropin beta values between 1000 and 2500 IU in a normal pregnancy approximately 5 weeks of gestation, and the exponential increase in serum concentration to 24 to 48hrs. About 10% of the present resolution tubal ectopic pregnancy (tubal abortion, pregnancy ampullary). The 90% have tubal rupture, this due to poor distendibilidad its walls, heavy bleeding usually occurs because the trophoblast invades arterial vessels. We report the case of a tubal ectopic pregnancy with presence of unruptured gestational sac with fetus of 13 weeks gestation calculated by ultrasound, reported in the literature the most common diagnosis between 8 and 10 weeks of gestation. Patient admitted to emergency room with abdominal pain in the right iliac fossa predominant, data and delayed menstrual acute abdomen. Pregnancy test was performed, which was positive and ultrasound, which showed unruptured ectopic pregnancy with a fetus of 13 weeks gestation alive, by gestational age probably abdominal ectopic pregnancy. Exploratory laparotomy was performed finding right tubal ectopic pregnancy unruptured ampullary region with corresponding fetus to 12-13 weeks of gestation. Right salpingectomy was performed. No intraoperative and postoperative complications and satisfactory evolution. Keywords. - Ectopic pregnancy, tubal, fraction beta human chorionic gonadotropin,

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CASO CLÍNICO DE EMBARAZO ECTÓPICO TUBÁRICO DEL SEGUNDO TRIMESTRE

El embarazo ectópico es una emergencia obstétrica, y se define como la implantación de un óvulo fertilizado fuera de la cavidad endometrial. Entre los factores de riesgo para desarrollar la enfermedad destaca la infección clínica o subclínica por Chlamydia trachomatis y Neisseria gonorrhoeae, asociado a enfermedad pélvica inflamatoria, uso de inductores de la ovulación, cirugía tubárica, uso de dispositivos intrauterinos, el incremento del hábito tabáquico. El sitio más frecuente es de localización tubárica específicamente en la región ampular. El diagnóstico de sospecha es clínico teniendo en cuenta los antecedentes de la paciente y factores de riesgo identificados, la presencia de dolor pélvico asociado con amenorrea y prueba de embarazo positiva, harán sospechar en su diagnóstico. Existen auxiliares del diagnóstico en esta patología como es el ultrasonido y cuantificación de la fracción beta de gonadotropina coriónica humana con valores de entre 1000 y 2500 UI en un embarazo normal de aproximadamente 5 semanas de gestación, y el aumento exponencial en la concentración sérica a las 24 a 48hrs. Cerca del 10% de los embarazos ectópicos presentan resolución tubárica, (aborto tubárico, embarazos ampulares). El 90% presentan ruptura tubárica, esto debido a la poca distendibilidad de sus paredes, suele presentarse intensa hemorragia debido a que el trofoblasto invade vasos arteriales. Se reporta el caso de un embarazo ectópico tubárico, con presencia de saco gestacional no roto con feto de 13 semanas de gestación calculado por ultrasonido, reportado en la literatura el diagnóstico más frecuente entre las 8 y 10 semanas de gestación. Paciente que ingresó a la sala de urgencias con dolor abdominal predominante en fosa ilíaca derecha, datos de abdomen agudo y retraso menstrual. Se realizó prueba de embarazo, la cual fue positiva y ecografía, que mostró embarazo ectópico no roto con feto de 13 semanas de gestación vivo, por la edad gestacional, probable embarazo ectópico abdominal. Se realizó laparotomía exploratoria encontrando embarazo ectópico tubárico derecho en región ampular no roto con feto correspondiente a 12-13 semanas de gestación. Se realizó salpingectomía derecha. Sin complicaciones transquirúrgicas y evolución postoperatoria favorable.

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RESUMEN

Palabras clave.- embarazo ectópico, embarazo tubárico, fracción beta de gonadotropina coriónica humana.

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El embarazo ectópico es la implantación de un óvulo fertilizado fuera de la cavidad endometrial el término ectópico no es sinónimo de extrauterino, sino que tiene más amplitud, ya que hay gestaciones intrauterinas, como el embarazo intersticial y el cervical, las cuales también son ectópicas.1 La localizaciones más frecuentes son en orden de frecuencia tubárica (98%), de estos, ampular (80%), ístmo (12%), fimbria (6%), cornual o intersticial (2.2%), abdominal (1.4%), ovárica (0.15%) y cervical (0.15%). Cuando se diagnostica tempranamente, antes de los síntomas de la ruptura, pueden ser exitosamente tratados de forma conservadora. La incidencia total es del 1 a 2% de todos los embarazos. La frecuencia ha aumentado en los últimos años de un 0.4% hasta un 2% principalmente por los factores de riesgo, como la infección por Chlamydia trachomatis y Neisseria gonorrhoeae, asociado a enfermedad pélvica inflamatoria, y por aumento en las técnicas de reproducción asistida, cirugía tubárica, mayor uso de dispositivos intrauterinos, el incremento del hábito tabáquico así como el uso de progestágenos como método anticonceptivo (Tabla 1).2,3,4,5 Tabla 1. Factores de riesgo para embarazo ectópico

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FACTORES DE RIESGO

ODDS RATIO

ALTO RIESGO Cirugía tubárica Esterilización Embarazo ectópico previo Exposición intrauterina a DES Uso de DIU Patología Tubárica Documentada

21 9.3 8.3 5.6 4.2-45 3.8-21

RIESGO MODERADO Infertilidad Infecciones Genitales Previas Múltiples compañeros sexuales

2.5-21 2.5-3.7 2.1

LIGERO AUMENTO DE RIESGO Cirugía pélvico o abdominal previa Fumar cigarrillo Edad temprana de la primer relación sexual menor de 18 años

0.9-3.8 2.3-2.5 1.1-3.1 1.6

Pisarka MD, Carson SA, Buster JE Lancet 1998;351:1115-20

Sin embargo, tanto la morbilidad y la mortalidad asociada con el embarazo ectópico se han reducido durante el mismo período, en gran parte debido a la presentación temprana que conduce a un diagnóstico

precoz y mejorar las modalidades de tratamiento.4 Los síntomas de dolor abdominal o pélvico y sangrado transvaginal son las manifestaciones más importantes en el primer trimestre del embarazo ectópico. Los sitios múltiples de embarazo ectópico aumenta la complejidad diagnóstica, los síntomas pueden ser erráticos, variables y en algunos casos ausentes.6

Diagnóstico En la exploración física puede presentarse dolor difuso a la palpación en hipogastrio y fosas ilíacas en el embarazo ectópico evolutivo. En los casos de ruptura del embarazo ectópico habrá datos de abdomen agudo debido al hemoperitoneo, así como también la presencia de dolor a la movilización cervical. La detección por ultrasonido transvaginal de una masa anexial, combinada con una concentración de HGC de 1000 mUI/ml tiene una sensibilidad del 97%, una especificidad del 99% y valor predictivo positivo y negativo del 98% para diagnóstico de embarazo tubárico.6 Considerando que los niveles de HGC en embarazos normales se duplican cada 1.5 días a partir de la 5a semana de gestación y cada 3.5 días después de la séptima semana, a diferencia de lo que sucede en los embarazos ectópicos el incremento ponderal de las cifras de HGC en 48 hrs no es exponencial.4,7,8

Evolución Cerca del 10% de los embarazos ectópicos presentan resolución tubárica, (aborto tubario esto únicamente en embarazos ampulares).7 El 90% presentan ruptura tubárica, esto debido a la poca distendibilidad de sus paredes, suele presentarse intensa hemorragia debido a que el trofoblasto invade vasos arteriales.7 La edad gestacional diagnostica del embarazo ectópico tubárico, presenta una incidencia de 25.4% entre 8-10 semanas seguida de aquella entre 6-8 semanas en un 20.5%. No hay reportes de embarazos tubáricos del segundo trimestre (mayores de 13 semanas de gestación).1

Tratamiento Las opciones de tratamiento incluyen el quirúrgico, médico, expectante. El tratamiento de elección se valora de acuerdo a la evolución clínica. En pacientes asintomáticas, con cuantificación de HGC menor de 1500 mUI/ ml, se puede mantener una conducta expectante.5,9

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INTRODUCCION

Tratamiento médico

Fig. 1

Se realiza con metotrexate oral, parenteral, o inyectado de manera local, indicado únicamente cuando: se encuentra un diámetro del saco gestacional pretratamiento menor a 3.5 cm, un nivel de gonadotropina coriónica humana por debajo de 5000 mUI / ml, y en ausencia de: embrión, sangrado, datos de abdomen agudo y que no exista contraindicación para usar metotrexate. Se debe administrar acido folínico para prevenir toxicidad por metotrexate.10

Se prefiere el abordaje laparoscópico, considerando la localización, y el deseo de conservar la fertilidad, así como el estado hemodinámico de la paciente. La técnica conservadora, es la salpingostomía lineal, con aspiración del contenido ovular, en pacientes que desean conservar la fertilidad. Con posibilidad de recurrencia de embarazo ectópico ipsilateral. En los casos en los que la tuba este muy dañada, exista gestación ectópica recurrente, o el deseo genésico este cumplido, se realizara salpingectomía total. En caso de datos de inestabilidad hemodinámica, se realizará de manera urgente una laparatomia exploratoria.5,6,9

Con los datos descritos, se programó para lapatoromia exploratoria por embarazo ectópico abdominal. Hallazgos transquirúrgicos: hemoperitoneo de 1000 ml, embarazo ectópico no roto con producto correspondiente de 12-13 semanas de gestación en tuba derecha en fase abortiva con sangrado activo a nivel de fimbria ipsilateral, con útero aumentado de tamaño de 16x14x12 cm, de características gestacionales con miomatosis uterina de tipo intramural localizado en fondo uterino de 6x6 cm, salpingitis. Se realiza salpingectomia derecha. Sin complicaciones transquirúrgicas reportadas (Figura 2 y 3).

CASO CLÍNICO Paciente de 32 años de edad, gesta 3, para 2, antecedente de cervicovaginitis de repetición sin tratamiento, miomatosis uterina. Ingresó a sala de urgencias presentando dolor abdominal intermitente, amenorrea y sangrado transvaginal de un mes de evolución, el cual se agudizó 12 hrs previas a su ingreso. Tensión arterial de 100/60 mmHg, frecuencia cardíaca de 94 latidos por minuto, frecuencia respiratoria de 26 por minuto, temperatura de 36 grados centígrados. Ultrasonido en sala de urgencias reportó: útero aumentado de tamaño de 16x12 cm con imagen hipoecoica que ocupa prácticamente el fondo y cuerpo del útero, endometrio engrosado de 5 mm, cérvix con imágenes anecoicas. En región abdominal se observó saco gestacional con feto único vivo y frecuencia cardiofetal de 156 lpm, longitud cráneo caudal correspondia a 12.4 semanas de gestación. con actividad somática, por dichas características y localización se sospecha de embarazo ectópico abdominal. Presencia de líquido libre en espacio de Douglas (Figura 1).

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Tratamiento quirúrgico

Fig. 2 Saco gestacional ubárico en fase abortiva, con feto vivo. Fig. 3

Feto de 13 semanas de gestación

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Paciente con evolución postquirúrgica satisfactoria. Se egreso sin complicaciones del área de hospitalización a las 48 horas postevento quirúrgico.

DISCUSIÓN

som

Los avances en la tecnología, tales como equipos de ultrasonido de alta resolución, así como la determinación de la fracción beta de la hormona gonadotropina coriónica, han permitido desarrollar estrategias de intervención oportuna para el diagnóstico. Pérez y colaboradores encontraron en 102 casos incidencia de 2 embarazos ectópicos tubáricos con una edad gestacional maxima de 12 semanas.1 En toda paciente en edad reproductiva que presente retraso menstrual, dolor abdominal y sangrado transvaginal, con ausencia de saco gestacional intrauterino, aunado a factores de riesgo como son enfermedad pélvica inflamatoria, uso de técnicas de reproducción asistida, cirugía tubárica previa, presencia de dispositivo intrauterino, deberá sospecharse el diagnóstico de embarazo ectópico.6,12 El caso presentado se diagnosticó como probable embarazo ectópico abdominal, por saco gestacional extra pélvico y fetometría de 13 semanas de gestación, siendo descrito en la literatura una mayor incidencia entre la sexta a octava semana en embarazos ectópicos tubáricos. Se identificaron como factores de riesgo la presencia de salpingitis cronica corroborada por exámen histopatológico, además de cervicovaginitis de repetición. De acuerdo a la evolución clínica de la paciente, el abordaje terapeútico más adecuado fue la laparotomía exploratoria por la presencia de signos clínicos de choque hipovolémico, corroborados con presencia de líquido libre en fondo de saco posterior, asi como la presencia de feto vivo.

REFERENCIAS 1. José L. Pérez (2011).Ginecología y Obstetricia de México. Consideraciones sobre algunos aspectos del embarazo ectópico, análisis de 50 casos operados. Ginecol Obstet Mex ;79(6):389-401. 2. Kriebs JM, J Midwifery, Fahey JO (2006) Ectopic pregnancy. Womens Health 51:431–439. 3. HB, Xia Z, Hughes JM, Wilcox LS, Tylor LR, Trussell J (1997). The risk of ectopic pregnancy after tubal sterilization: US Collaborative Review of Sterilization Working Group. N Engl J Med ;336:762-7. 4. Cabero, Saldivar (2010). Operatoria Obstetrica: Una Visión Actual, editorial medica Panamericana, 52:54. 5. Liberato V, Mukul, Stephanie B. (2007). Current management of ectopic pregnancy. Obstet Gynecol Clin N AM 34 (2007) 403-419. 6. Instituto Mexicano del Seguro Social (2009). Guía de Practica Clínica Diagnostico y Tratamiento de Embarazo Tubarico. 9:23. 7. Donald L, Fylstra (2011). Ectopic pregnancy not within the (distal) fallopian tube: etiology, diagnosis, and treatment. American Journal Ginecology. 289:231. 8. Murray H, Baakdah H,Bardell T, Tulandi T, Diagnosis and treatment of ectopic pregnancy. CMAJ.2005 Oct 11; 173 (8): 905-912. 9. Vivek N, Isaac M (2008). Tubal ectopic pregnancy: diagnosis and management. Springer-Verlag. 433: 449. 10. Mohammed A.S, Tuladi T. Surgical tratament or ectopic pregnancy. Seminars in reproductive medicine. 2007 25(2): 177-122. 11. Leonel P, Jose C,(2010). Embarazo ectópico, Revisión de un año. Revista Medica Hondura vol. 58 1990, 11-15. 12. American College of Obstetricians and Gynecologists (2009). ACOG practice bulletin no. 94. Medical management of ectopic pregnancy. Obstet Gynecol; 111:1479-85.

En la mitología griega, Atenea nació ya adulta de la cabeza de Zeus, después de que Hefesto abrió el cráneo de Zeus con un hacha para curarlo de una cefalea insoportable. Atenea es la diosa de la sabiduría, de las artes y la artesanía por lo que representa la inteligencia creadora. Es también una diosa guerrera, pero que en lugar de la violencia aplica la valentía y la prudencia, tal como se describe en la Ilíada. Similar al nacimiento de Atenea, este caso clínico resulta de la implantación y desarrollo ectópico de un embrión, que desencadena actitudes médicas urgentes frente a los síntomas importantes como el dolor. Es interesante el hecho de ciertos casos de éxito de embarazo ectópico en otras localizaciones anatómicas como el abdominal, por lo que una de las principales razones de publicación de casos sobre embarazo ectópico son aquellos que llegan a semanas de gestación tardías en lugares anatómicos donde es prácticamente imposible el término del mismo. 50

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Resultado histopatológico: embarazo ectópico tubárico derecho, con feto de 7.0 cm de longitud que corresponde a 13 semanas de gestación, salpinge con datos de inflamación crónica inespecífica, presencia de polimorfonucleares dispersos.

Monográfica Primera entrega

I. Introducción

El sistema inmunológico es un conjunto de células y moléculas que cooperan entre si para proteger al organismo de agentes infecciosos y que proveen un sistema de vigilancia para monitorear la integridad de los tejidos del cuerpo. Aunque el sistema inmunológico es altamente complejo, sus funciones pueden ser resumidas en dos principales: reconocimiento de sustancias y organismos extraños que han entrado en el cuerpo, y la remoción de éstos por un repertorio diverso de células y moléculas que actúan en conjunto para eliminar las amenazas potenciales (Abbas, 1997). La defensa en contra de agentes extraños está mediada, en etapas tempranas, por la inmunidad innata y en etapas tardías por la inmunidad adaptativa. La inmunidad innata consiste en mecanismos de defensa celulares y bioquímicos que se encuentran en el lugar de la infección incluso antes de que ésta se establezca y que están listos para responder rápidamente. Los componentes principales de la inmunidad innata son las barreras anatómicas (piel y mucosas), barreras fi siológicas (temperatura, bajo pH, mediadores químicos), células fagocíticas (monocitos, neutrófi los, macrófagos tisulares) y las barreras infl amatorias (proteínas con actividad antibacteriana, citocinas) (Goldsby, 2002).

Inmunidad Humoral M. en C. Moisés Talavera Paulin Instituto Politécnico Nacional Escuela Nacional de Ciencias Biológicas Laboratorio de inmunología molecular II

En contraste con la inmunidad innata, la inmunidad adaptativa es estimulada por la exposición a agentes infecciosos e incrementa en magnitud y en capacidades defensivas con cada exposición sucesiva a un agente particular. Este sistema es capaz de reconocer y reaccionar a una gran cantidad de microorganismos específicos y sustancias inertes. La característica que define a la inmunidad adaptativa es la gran especifi cidad a diversas moléculas y microorganismos y su capacidad para recordar y responder vigorosamente a exposiciones repetidas al mismo agente. Por lo tanto, las características más importantes de la inmunidad adaptativa son: la especificidad antigénica, la diversidad, la memoria inmunológica y el reconocimiento de lo propio y lo no propio. La especificidad antigénica le permite distinguir, por ejemplo, entre dos proteínas que difi eren entre si en un aminoácido solamente. El sistema inmunológico es capaz de generar una gran diversidad en sus moléculas de reconocimiento, permitiéndoles identifi car millones de estructuras únicas en los antígenos. Una vez que el sistema inmunológico ha reconocido y respondido a un antígeno, éste adquiere memoria inmunológica; lo cual significa que en el segundo encuentro con el mismo

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antígeno inducirá un estado de reactividad inmune aumentada. Debido a este atributo, el sistema inmunológico puede conferir inmunidad de larga vida en contra de muchos agentes infecciosos después del encuentro inicial. Finalmente, el sistema inmunológico normalmente responde sólo a antígenos extraños indicando que puede reconocer lo propio de lo que no lo es (Goldsby, 2002).

cular que desencadenó la respuesta primaria. Esto a su vez producirá clonas de linfocitos que reconozcan al agente específico lo cual resultará en la inducción de células de memoria en caso de que el mismo antígeno se encuentre e algún momento en el futuro (Delves, 2011).

Hay dos tipos de respuestas inmunológicas adaptativas, la inmunidad humoral y la inmunidad celular, las cuales están mediadas por diferentes componentes del sistema inmunológico, y sus funciones están encaminadas a eliminar diferentes tipos de microorganismos.

Los linfocitos maduran dentro de la médula ósea; cuando salen, cada uno de ellos expresa un receptor en la membrana que será capaz de unir antígeno. Esta molécula, el receptor del linfocito B o BCR es una molécula de anticuerpo unida a la membrana. Los anticuerpos que son glicoproteínas, consisten de dos cadenas polipeptídicas pesadas idénticas y dos cadenas polipeptídicas ligeras. El extremo amino terminal de los pares de cadenas pesadas y ligeras forman un hueco en el que se une el antígeno. Cuando un linfocito B naive se encuentra por primera vez con su antígeno específi co, la unión con el antígeno provoca que la célula se divida rápidamente; esto inducirá que la progenie se diferencie a linfocitos B de memoria y en linfocitos B efectores llamados células plasmáticas (CP). Los linfocitos de memoria tienen una vida media mayor que los linfocitos naive. Las CP producen anticuerpos que pueden ser secretados y estas células también pueden presentan o no moléculas de anticuerpos asociados a la membrana. Aunque las CP viven sólo algunos días, secretan cantidades considerables de anticuerpos. Se ha estimado que una sola CP puede secretar más de 200 moléculas de anticuerpo por segundo. Los anticuerpos secretados son las principales moléculas efectoras de la inmunidad humoral (Goldsby, 2002).

La inmunidad humoral está mediada por anticuerpos que están presentes en la sangre y en las secreciones de las mucosas y que son producidos por linfocitos B efectores o células plasmáticas. La inmunidad humoral es el principal mecanismo de defensa en contra de microorganismos extracelulares y sus toxinas. Los anticuerpos por si mismos son moléculas especializadas y diferentes tipos de anticuerpos pueden activar otros mecanismos efectores. Por ejemplo, algunos tipos de anticuerpos promueven la fagocitosis, mientras que otros promueven la liberación de mediadores infl amatorios (Abbas, 1997).

II. Inmunidad adaptativa. La respuesta inmune adaptativa toma tiempo en tener un significado funcional, típicamente toma de 4 a 5 días después de que entra en función la respuesta inmune innata, y se “adapta” a la naturaleza del agente infeccioso. Importantemente, la respuesta inmune adaptativa mejora con cada encuentro con un agente infeccioso particular, una característica llamada memoria inmunológica. La respuesta inmune adaptativa está mediada principalmente por linfocitos T y B, las cuales expresan receptores específicos en la membrana plasmática que pueden ser utilizados para reconocer a una cantidad ilimitada de estructuras. Por definición, las moléculas que son reconocidas por los linfocitos T y B son llamadas antígenos. El reconocimiento de un antígeno por un linfocito induce la proliferación y diferenciación de dichas células y esto como consecuencia aumenta considerablemente el número de linfocitos capaces de reconocer el antígeno parti-

III. I Desarrollo de linfocitos B. Linfocitos pre-pro B. Los linfocitos pre-pro-B tienen baja expresión de los genes activadores de la recombinación (Rag1 y Rag2). Los genes que dan lugar a las cadenas pesadas y a las cadenas ligeras se encuentran en línea germinal y no están arreglados, de esta forma éstas células no pueden producir inmunoglobulinas (Ig) (figura 1a), (Matthias, 2005). Los linfocitos pro-B se distinguen por la expresión temprana de diversos precursores ya que en este estado es donde se inicia la recombinación VH(D)JH. Los linfocitos pro-B también difi eren de los pre-pro-B en que son el primer linaje de linfocitos B que expresan Ig􀁟, Ig􀁠 y la calnexina de superfi cie (pro-BCR) (Kurosaki, 2002). La recombinación de los genes de inmunoglobulinas comienza con el rearreglo de los genes de diversidad (D) junto con los genes del segmento de unión (JH). Después de la formación del rearreglo DJH, los genes VH se encuentran accesibles para la acción de la recombinasa VH(D) JH, y la transcripción de las unidades de las cadenas pesadas son ensambladas. El cambio para la recombinación DJH con VH(D)JH en los linfocitos pro-Bes probablemente regulado al nivel de la accesibilidad de los genes VH y parece ser depen-

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La inmunidad celular está mediada por linfocitos T. Microorganismos intracelulares, como virus y algunas bacterias, sobreviven y proliferan dentro de los fagocitos y otras células; en estas localizaciones se encuentran inaccesibles a los anticuerpos circulantes; la defensa en contra de estos microorganismos es la función principal de la inmunidad celular, la cual promueve la destrucción de los microorganismos que residen en los fagocitos o la destrucción de las células infectadas para eliminar los reservorios de la infección (Abbas, 1997).

III. Linfocitos B.

diente de IL-7, los factores de transcripción Pax5 y YY1, y altos niveles deRag1/Rag2 (Li, 2007, Jung, 2006, Chowdhury 2004, Zhang, 2006 y Labrie, 2005). Los requerimientos de IL-7 en la recombinación de los genes VH(D)JH concuerda con las recientes observaciones en que las células pro-B están en contacto con células estromales productoras de IL-7 en el microambiente de la médula ósea. En la médula ósea, muchos tipos de células estromales (al menos se han descrito tres tipos: osteoblastos, células reticulares CXCL12hi y células productoras de IL-7) han sido propuestas para funcionar como nichos específi cos para promover el desarrollo temprano de los linfocitos B (fi gura 1b) (Nagasawa, 2006). Muchas células pre-pro-B están en contacto con células reticulares CXCL12hi, mientras que las células pro-B se alejan de las células reticulares CXCL12hi y se asocian con las células estromales que expresan IL-7 (figura 1b).

Bone marrow

La accesibilidad de los genes VH es dependiente de elementos reguladores transcripcionales, incluyendo el potenciador de la cadena IgH y que está asociado con el inicio de la transcripción de los segmentos génicos de los genes de línea germinal VH. De hecho, se ha propuesto que la transcripción per se permite que los segmentos génicos VH estén accesibles a la recombinasa (Bates, 2007). Una segunda posibilidad es que los elementos reguladores cis en los promotores IgH y los potenciadores reclutan factores que remodelan los dominios de cromatina y hacen que los genes VH estén accesibles para la recombinación independientemente de la transcripción. Por ejemplo, YY1, una proteína con dedos de zinc, se une al potenciador intrónico (iEμ) del locus IgH, donde es esencial para la recombinación distal de VH a DJH (Liu, 2007). Finalmente la modifi cación de histonas por acetilación y desmetilación, contribuye a la accesibilidad de

Perifery

Antigen-independent Igα/Igβ Stem cell

Pre pro-B

Pro-B

Antigen-dependent Igμ

Igμ φL

Large pre-B

mIgM

Igκ or Igλ Small pre-B

Immature B

Transitional

mIgM

mIgD

Mature B

Autoreactive

Dμ

Receptor editing Deletion or anergy

RAG:

Low

IgH

DJH

VHDJH

IgL

VLJL

VLJL?

b BLOOD

Immature B

Endothelia

Bone marrow Stem cell

Immature B Pre pro-B

CXCL12-expressing reticular cell CXCL12

Pre-B

Pro-B IL-7 expressing cell

Figure 1. (a) Esquema de diferenciación de los linfocitos B y (b) modelo del movimiento de los precursores del linfocito B y como se desarrollan en la médula ósea. (a) Estadios de desarrollo en la linfopoyesis del linfocito B, expresión de RAG y el rearreglo del loci de las cadenas pesadas (IgH) y ligeras (IgL). (GL: loci de IgH o IgL en línea germinal). (b)Las células pre-pro-B se mueven a través de las células reticulares CXCLhi y se asocian con ellas, mientras que las células pro-B se alejan y se unen con las células que expresan IL-7. Subsecuentemente, las células pre-B dejan a las células productoras de Il-7. Las células que expresan IgM salen de la médula ósea y entran a la circulación para llega al bazo, donde maduran en linfocitos B periféricos que coexpresan IgD. No se muestra la gran proliferación durante los estadios pro-B y pre-B.

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Linfocitos pre-B. La expresión de μHC resulta en el ensamble del pre-BCR y marca la transición del estadio pre-B. El pre-BCR está compuesto de la forma transmembranal de μHC (mIgμ), las cadenas ligeras sustitutas (􀁨5 y VpreB), Ig􀁟 e Ig􀁠. Su expresión en la superfi cie celular, la cual ocurre después de que la célula ha hecho un adecuado rearreglo de los genes VH(D)JH, es un punto de control clave en el desarrollo del linfocito B (figura 1a). Las funciones principales del pre-BCR son llevar a cabo la expansión clonal, la exclusión alélica de las cadenas pesadas y la proliferación (Martensson, 2007). Sin embargo, el entrecruzamiento de los receptores es requerido para la señalización y las respuestas celulares dado que el desarrollo de los linfocitos B no puede ocurrir en ausencia de ITAM’s ubicados en los dominios citoplasmáticos de las cadenas Ig􀁟 e Ig􀁠 (Abram, 2007). Con respecto a las propiedades de autoagregación del BCR, Ohnishi y Melchers proponen un modelo en el que las regiones no parecidas a Ig del extremo amino terminal de la cadena 􀁨5 y del extremo carboxilo terminal de la cadena VpreB median la agregación constitutiva del pre-BCR en la superfi cie celular vía interacciones iónicas homotí-picas, las cuales son críticas para inducir la señalización y la internalización (Ohnishi, 2003). Este modelo ha sido comprobado por análisis de cristalografía y microscopía electrónica, los cuales revelan la presencia de dímeros de pre-BCR, los cuales están formados de dos monómeros de pre-BCR conectados por una bisagra flexible entre los extremos de los dominios variables (Bankovich, 2007). Algunos otros estudios apoyan este hecho, mostrando que la expresión de las cadenas sustitutas aumenta fuertemente la capacidad de la mIgμ de inducir el flujo de calcio independientemente del entrecruzamiento de los receptores (Meixlsperger, 2007). El pre-BCR transmite una señal para inducir varias rondas de división celular y eliminar la dependencia de los linfocitos B en desarrollo de IL-7. Después de la expansión clonal de los linfocitos que expresan mIgμ, las células pre-B se arrestan en la fase G1 y se convierten en células pre-B pequeñas. Debido a que la señalización del pre-BCR termina en la transcripción de los genes que codifi can 􀁨5 y VpreB, se ha propuesto que la transición a células pre-B pequeñas es causada por el silenciamiento de los genes que dan lugar a las cadenas sustitutas (Kurosaki,

2000). Sin embargo, se ha hipotetizado que en lugar de la regulación de la expresión del pre-BCR, la señalización del pre-BCR media la expresión rápida y transitoria de factores de transcripción claves para la proliferación, lo cual puede explicar por qué las células pre-B se arrestan en la fase G1 del ciclo celular. De acuerdo a esta hipótesis, cuando el nivel de estos factores cae por debajo de los niveles críticos, la expresión de los genes de proliferación disminuye, y la de los genes antiproliferativos posiblemente se aumenta, llevando a las células pre-B a un estado de reposo. La disminución a la respuesta hacia IL-7 en las células pre-B también podría contribuir a este estado de reposo. En concordancia con esto, las células pre-B se alejan de las células estromales productoras de IL-7 de la médula ósea (fi gura 1b), lo cual pudiera contribuir a conferir una respuesta atenuada de las células pre-B hacia la IL-7.

Linfocitos B inmaduros. Las células B inmaduras son las primeras células del linaje de linfocitos B en expresar el BCR en su superficie, y por lo tanto expresan IgM de superfi cie y/o poca IgD (figura 1a). Similar al pre-BCR, se piensa que el BCR en la superfi cie celular es capaz de inducir la señalización independiente de ligando (denominada señal tónica del BCR) ya que se ha demostrado que la expresión perse del BCR induce la fosforilación de tirosinas (Kurosaki, 2002, Lam, 1997 y Wienands, 1996). Los datos mostrados por la manipulación genética de las subunidades señalizadoras Ig􀁟-Ig􀁠 han apoyado este hecho. En ausencia del dominio intracitoplasmático de la subunidad Ig􀁟, el desarrollo de los linfocitos B inmaduros se ha visto afectado (Reichlin, 2001 y Kraus, 1999). Otros trabajos han demostrado el efecto de la pérdida del BCR en los estadios de diferenciación del linfocito B usando el sistema Cre-loxP para eliminarlo. La pérdida de la expresión del BCR resulta en la reversión del linfocito B a fenotipos más inmaduros, dando como lugar a la expresión de genes asociados a los estadios pre y pro-B, incluyendo Rag1, Rag2, 􀁨5 y VpreB. Estos estudios, junto con la idea de que la falta de la señal tónica del BCR atrapa a los linfocitos B en un estado en el que hay segunda recombinación (Yamagami, 1999 y Pelanda 1997), y justifi can el concepto de que la fuerza de la señalización tónica mediada por el BCR es un sensor crítico de los linfocitos B para tomar la decisión de quedarse como linfocito pre-B o linfocito B inmaduro. La expresión en la superfi cie de un BCR autorreactivo en los linfocitos B inmaduros lleva a la internalización de los complejos antígeno propio-BCR y a la activación de las señales intracelulares que ayudan a la sobreexpresión de Rag1/Rag2, detienen la diferenciación e inician el segundo rearreglo de genes Vk que reemplazan al rearreglo de genes original. A diferencia a la anergia de linfocitos B y los mecanismos de eliminación, este tipo de tolerancia, denominada edición del receptor, repone a los linfocitos B autorreactivos reemplazando sus receptores (figura 1a).

Desarrollo del linfocito B en la periferia. En el caso de los linfocitos B B2 convencionales, los linfocitos B inmaduros que migran de la médula ósea a la periferia son conocidos como linfocitos B transicionales 1 y 2 (T1 y T2) (fi gura 1a). Según el desarrollo,

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los genes VH dependientes de IL-7 y Pax5 respectivamente (Xu, 2008). Aunque el estado de la cromatina del locus IgH es un determinante importante para la recombinación mediada por Rag, otro mecanismo es la regulación transcripcional de los componentes de la transcripción. De hecho, la regulación de los genes Rag por FoxP1 ha sido demostrada (Hu, 2006). FoxP1 regula la expresión específi ca en linfocitos B de Rag1 y Rag2 en las células pro-B uniéndose directamente a secuencias en el potenciador Erag localizadas cerca de la porción terminal 5’ del gen Rag2. Este potenciador Erag es una secuencia crítica para la expresión específi ca de linaje de los genes Rag en los linfocitos B, pero no en los linfocitos T.

La señalización del BCR (presumiblemente independiente de ligando) parece ser un determinante muy importante en la transición de los linfocitos B T1/T2 hacia linfocitos B B2 maduros. Durante la transición entre células T1/T2 a linfocitos B B2 maduros, la señal de sobrevida mediada por el BCR e independiente de antígeno provista por la vía canónica de NF-􀁧B pudiera no ser suficiente por si sola para generar un número suficiente de linfocitos B maduros de larga vida. Para asegurarse de esta longevidad, los linfocitos B B2 adicionalmente requieren señales de sobrevida mediada por BAFFR provista por la vía no canónica de NF-􀁧B.

En las siguientes entregas: IV. Propiedades de los antígenos. V. Presentación de antígeno. VI. Activación del linfocito B. VI. Activación del linfocito B. VII. Generación del centro germinal. VIII. Células plasmáticas productoras de anticuerpos. IX. Vida y muerte de las células plasmáticas.

“El rio” del Artista Fortino Javier Vásquez Arellano El humorismo es una teoría históricamente importante sobre la composición y fisiología del cuerpo humano. Los médicos y filósofos griegos postulaban que el exceso o deficiencia de cualquiera de los cuatro fluidos (humores) corporales influían directamente sobre el temperamento y la salud. Desde Hipócrates la teoría humoral fue adoptada por médicos griegos, romanos e islámicos, y se convirtió en la base del entendimiento del cuerpo humano hasta el siglo XIX.

los linfocitos B T1 parecen preceder a los linfocitos B T2, los cuales, son considerados como los precursores inmediatos de los linfocitos B naive inmaduros. Los linfocitos B T1 y T2 son células de vida corta, y solamente del 10-30% de estas células son de larga vida (15 a 20 semanas en el caso de los ratones). Además de tener un BCR funcional, los linfocitos B inmaduros requieren señales de sobrevida mediadas por el factor activador de linfocitos B (BAFF) para su completa maduración. De hecho, la maduración de los linfocitos B en ratones defi cientes de BAFF se ve afectada más allá del estado T1. Evidencia reciente indica que los tres receptores de BAFF (BAFFR, BCMA y TACI) son expresados en linfocitos B a diferentes niveles, dependiendo de su estado de maduración y/o activación (Mackay, 2007).

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Reseña de la portada

Artistas y científicos ¿diferentes pasiones? En la entrevista para la revista ConScience & Art, Lisa Nilsson menciona que desde su infancia estuvo atraída e interesada por las formas que ofrece la medicina. Después de estar trabajando con la técnica filigrana de papel en obras religiosas antiguas, tuvo la oportunidad de recibir una fotografía de una sección transversal del tórax de un libro de medicina francés. En ese momento se dio cuenta que aquel corte compartía la textura y las formas que había estado experimentando con la filigrana de papel. Se ha inspirado en los objetos científicos y piezas anatómicas, en resumen, imágenes de la historia natural. De igual forma busca vínculos con motivos religiosos e imágenes de reliquias y manuscritos medievales. Su trabajo y habilidad son producto de una atracción innata por la naturaleza, que fue especializando a través del dibujo y la pintura. Su trabajo es ejemplo del dinamismo y reciprocidad entre la ciencia y el arte que, al respecto, comenta lo siguiente: …the intersection of Science and Art has resulted in a lovely marriage of complex and engaging subject matter with a complex and engaging technique that drives my work. More generally, through the pursuit of knowledge science produces images, information and ideas that provide inspiring raw material, actual material and subject matter for artists. In turn, artist’s work can inspire a sense of openness, creativity, fun and engagement that can fuel the work of scientist. Each in turn expands the others sense of what is possible. In a word what is produced is progress.

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“Angelico” de Lisa Nilsson, 2012 Mulberry paper Representa la sección sagital y medial de la cabeza de un ángel. La obra fue inspirada en el Ángel de la Anunciación de Fra Angélico. Lisa Nilsson es una artista de Massachusetts, EE. UU. Estudió ilustración en la escuela de diseño de Rhode Island.

“

Mantener la fe necesaria para seguir adelante requiere cierto tipo de ímpetu que puede ser fortalecido por la compañía, comprendiendo que científicos y artistas se añaden uno al otro.

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Lisa Nilsson es una artista consciente de la interrelación entre la ciencia y el arte, así como del artista y del científico. Define los fundamentos de la actividad artística y científica, justo en el momento en que son iguales. Así, comenta que uno de los productos más interesantes de la intersección de la ciencia y el arte es la admiración y el entendimiento mutuo, los artistas y los científicos trabajan en los límites de lo práctico y tangible así como de lo teórico y lo intangible. Los científicos y los artistas llegan a ser aplicados y comerciales como puros y finos, están encaminados a resolver problemas específicos como a explorar abiertamente y están motivados por la curiosidad y el éxito que, sin ninguna garantía del resultado, ofrecen su tiempo y energía a una creencia de que llegar a entender al mundo y a nosotros mismos adquiere valor en el acto mismo.

Entrevista con Lisa Nilsson Where were you born? Massachusetts, USA What did you study? Illustration at the Rhode Island School of design. Medical Assisting at the McCann Technical School in North Adams, Massachusetts; where I live. How did you start working with anatomy? I have been interested in cool-looking medical things since childhood. My anatomical paper sculptures evolved in this way: I was experimenting with quilling after encountering an antique religious piece of work owned by an antique dealer. During that time a friend sent a digital image of a hand-colored photograph of a cross-section of a torso from an early French medical text. I saw the shapes and textures I was finding in my experimental quilling in the cross-section and the work grew from there. What is (are) your influence(s)? I am most inspired by scientific objects and images (anatomical specimens, natural history imagery) and religious objects and images (reliquaries and medieval manuscript illumination).

“

Keeping the faith required to push on takes a certain kind of strength that can be fortified by the company, and understanding that scientists and artists can lend one another

“

What is produced by the intersection of Art and Science? In my case, the intersection of Science and Art has resulted in a lovely marriage of complex and engaging subject matter with a complex and engaging technique that drives my work. More generally, through the pursuit of knowledge science produces images, information and ideas that provide inspiring raw material, actual material and subject matter for artists. In turn, artist’s work can inspire a sense of openness, creativity, fun and engagement that can fuel the work of scientist. Each in turn expands the others sense of what is possible. In a word what is produced is progress. Another product is mutual admiration and understanding. Artists and scientists work at the outer limits of the practical/tangible and the theoretical/intangible. We are applied and commercial, pure and fine. We are driven to solve very specific problems and to openly explore. We may be motivated more by curiosity than success, investing time and energy without any guarantee of outcome, believing that to increase our understanding of our world and ourselves has value in it’s own right. ″Keeping the faith required to push on takes a certain kind of strength that can be fortified by the company, and understanding that scientists and artists can lend one another″

cs El equipo editorial de ConScience & Art agradece la generosidad de Lisa Nilsson por haber permitido usar su obra “Angelico” como la imagen del primer número.

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ITINERARIODE

CONGRESOS

INMUNOLOGÍA

FARMACOLOGÍA Vaccine & ISV Annual Global Congress 7th edition 27-29 October 2013 Sitges, Spain

World Immune Regulation Meeting: Innate and Adaptive Immune Response and Role of Tissues in Immune Regulation. 8th edition 19-22 March 2014 Davos, Switzerland International Primary Immunodeficiencies Congress (IPIC). 7-8 november 2013 Estoril (Lisbon), Portugal

World Congress of Immunopathology, Respiratory Allergy & Asthma October 12-15, 2013 Dubai, United Arab Emirates Pediatric Allergy and Asthma Meeting (PAAM) October 17-19 2013, Athens, Greece. 9th International Congress on Autoimmunity March 26-30, 2014 Niza, France.

26th European College of Neuropsychopharmacology Congress October 5-9 2013, Barcelona, Spain. IV Congreso de la rama de transducción de Señales de la Sociedad Mexicana de Bioquímica 10-13 Noviembre San Luis Potosí, México XX Congreso Latinoamericano de Farmacología y Terapéutica, X Congreso Iberoamericano de Farmacología, X Congreso Internacional y XI Congreso Nacional de Farmacología de la Sociedad Cubana de Farmacología 21- 25 Octubre 2013, La Habana, Cuba.

SOM

Cancer Vaccine Institute’s International Symposium on Immunotherapy 1st Edition 11 – 12 October 2013 The Royal Society London, UK European Society of Paediatric Haematology - Immunology Biennial Meeting 4 - 6 October 2013 Kiel, Germany I Curso Teórico-Práctico de Actualización en Química Clínica INCMNSZ 21-25 Octubre, 2013 México, D.F. Internal Medicine Update for Primary Care October 24-26, 2013 Sonoma, USA. Haematological Malignancies November 12- 13, London, United Kingdom.

I Congreso Conjunto de las Sociedades Española y Europea de Terapia Génica y Celular (SETGyC y ESGCT) 25-28 de Octubre de 2013 Palacio Municipal de Congresos de Madrid Madrid, Spain

Oncology: Phase III Trials November 21-22, 2013 London, United Kingdom.

XL Jornadas de Enfermería 10 y 11 Octubre, 2013 México, D.F.

XII Congreso de la Sociedad Latinoamericana y del Caribe de Trasplante 01- 04 Diciembre, 2013 Buenos Aires, Argentina

Breast Cancer: Treatment and Management November 28, 2013 London, United Kingdom.

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ITINERARIODE

CONVOCATORIAS

Premio a la innovación en bionanotecnología Cinvestav Neolpharma Disponible en http://premiobionano.cinvestav.mx Fecha límite de inscripción 25 de octubre de 2013

Apoyo a proyectos de desarrollo científico para atender problemas Nacionales CONVOCATORIA 2013 Disponible en http://www.conacyt.gob.mx/ Convocatorias/Paginas/ConvocatoriaApoyo. aspx Fecha límite de inscripción 28 de Octubre 2013

VII Convocatoria Premios Carlos Slim Premio Carlos Slim en Salud Disponible en http://www.salud.carlosslim. org/vii-convocatoria-premios-carlos-slim/ Fecha límite de inscripción 31 de Octubre 2013

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Instituto Politécnico Nacional

“La Técnica al Servicio de la Patria”

http://conscienceandart.wordpress.com

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