24 Atlas de la IASLC de Pruebas de ALK en Cáncer de Pulmón
probablemente debido a un artefacto de rotura o tal vez a una alteración genómica estocástica que no indica un gen de fusión específico (Figura 6). Como resultado, la distribución de las tasas de células con reordenamiento positivo en CPCNP es continua, y la diferencia entre CPCNP ALK-reordenado y de tipo nativo es una cuestión estadística. Por lo tanto, se debería efectuar obligatoriamente una cuidadosa evaluación cuantitativa para el resultado óptimo de la prueba. Se ha determinado un valor de corte del 15% para separar mejor entre CPCNP ALK reordenado (ALK positivo) y CPCNP ALK de tipo nativo (ALK negativo) (Camidge 2010, Kwak 2010, Yoshida 2011a). Para minimizar el sesgo técnico, se recomienda una estrategia de evaluación en dos etapas con dos marcadores independientes (Figura 11). El primer marcador clasifica 50 células tumorales. Una tasa de células de reordenamiento positivo de menos de 10% (es decir, de reordenamiento en menos de cinco de las 50 células) se considera negativa; una tasa mayor del 50% (es decir, más de 25 de las 50 células) se considera positiva, y una tasa de 10% a 50% (es decir, de 5 a 25 de las Primer marcador–50 células tumorales 50 células) se considera equívoca y por tanto se debe hacer una clasificación <10% positiva >50% positiva 10%-50% positiva adicional. En ese caso, un segundo marcador independiente clasificaría Equívoca 50 células tumorales adicionales, y una Segundo marcador–50 células tumorales tasa final de células de reordenamiento Primer y segundo marcador-50 células tumorales positivo se calcularía sobre la suma de la primera y la segunda. Si la tasa final es <15% positiva ≥15% positiva de 15% o más, la muestra se interpreta como positiva para el reordenamiento Muestra considerada Muestra considerada del gen ALK, y si la tasa es menor que negativa para el positiva para el reordenamiento reordenamiento 15%, la muestra se interpreta como del gen ALK del gen ALK negativa para el reordenamiento del Figura 11. Algoritmo de clasificación recomendado para FISH de ALK. gen ALK. Nota: El punto de corte del 15% se basa principalmente en pruebas con el Vysis LSI ALK Break Apart FISH Probe Kit (Abbott Molecular) y se debe confirmar cuando se utilice un reactivo diferente.
Validación del laboratorio La prueba FISH de ALK debe estar debidamente validada en el laboratorio antes de ofrecer la prueba en un entorno clínico (Halling 2012, Saxe 2012). La exactitud de los resultados- es decir, el grado en que el ensayo discrimina entre normal (ALK negativo) y anormal (ALK positivo) - debe compararse cuidadosamente en otro laboratorio donde el ensayo validado se está realizando correctamente y/o en comparación con un método previamente validado en el mismo laboratorio que ofrezca la misma precisión. La precisión o reproducibilidad de los resultados debe ser verificado teniendo en cuenta el grado de acuerdo entre las mediciones realizadas sobre la misma muestra por diferentes técnicos y/o en diferentes momentos, y todo el proceso de análisis debe ser corroborado y repetido periódicamente. Por otra parte, la sensibilidad analítica y especificidad de la prueba deben ser confirmadas en las muestras con genotipo conocido. El CPCNP con ALK de tipo nativo y el tejido benigno deben ser evaluados para determinar la distancia en una señal dividida como verdaderos positivos (una distancia de al menos dos veces el diámetro de la señal). Estas tareas son más sencillas cuando se utilizan reactivos comerciales y requieren un mayor nivel de detalle cuando se utilizan reactivos desarrollados por el laboratorio.