HKiD Streszczenia

Hematologia kliniczna

i doświadczalna

V międzynarodowa konferencja

Bezpieczeństwo składników krwi w lecznictwie

Streszczenia

Lublin

10-12 maja 2024 r.

Lubelskie Centrum Konferencyjne

Wystąpienia ustne

Prezentacje ustne w czasie sesji: HEMATOLOGIA

DOŚWIADCZALNA

Specjalizacja: hematologia

Tytuł:

Elucidating detrimental effects of systemic iron deficiency and inflammation on the functioning of red pulp macrophages

Autor: Komal Chouhan

Współautorzy:

Komal Chouhan¹, Pratik Kumar Mandal¹, Patryk Slusarczyk¹, Raghunandan Mahadev¹, Aneta Jończy¹, Katarzyna Mleczko-Sanecka¹

Afiliacja:

1. International Institute of Molecular and Cell Biology in Warsaw, Poland

Iron homeostasis is pivotal for cellular function, with deviations leading to pathological consequences. Iron deficiency is a globally prevalent condition with profound socio-medical consequences, but it remains poorly understood how specialized cell types are affected by systemic iron restriction. Splenic red pulp macrophages (RPMs) are specialized cells responsible for the removal of aged red blood cells in a process termed erythrophagocytosis, and the recycling of iron to plasma via the iron exporter ferroportin. Inflammation leads to reduced iron export via ferroportin, resulting in the retention of iron within RPMs, consequently lowering iron levels in the bloodstream. Since iron deficiency and inflammation often co-exist in humans, we aimed to investigate in detail how these two cues, when combined, affect the functioning of RPMs.

The ongoing study of our lab revealed that RPMs of iron-deficient (ID) mice surprisingly show an enhanced erythrophagocytosis capacity, reflected by high cytoplasmic labile iron levels in the presence of augmented membrane levels of ferroportin. Upon exposure of mice to sterile inflammation via lipopolysaccharide (LPS) injection, erythrophagocytosis was initially synergistically enhanced in RPMs of ID mice, but at the later time point it was strongly suppressed, losing the ‘rewiring’ phenotype compared to control mice. We have previously demonstrated that increased labile iron in RPMs results in the appearance of toxic lipid peroxides, disrupts proteostasis mechanisms, and can trigger ferroptotic cell death. We thus suspected that a concomitant boost of erythrophagocytosis in RPMs of ID mice upon inflammatory stimuli, accompanied by iron accumulation due to a drop in ferroportin-mediated iron export may impair the cellular RPM functions and lead to their demise.

To further explore this possibility, we employed a cellular model of RPMs previously generated in our laboratory (termed iRPMs), representing primary murine macrophages exposed to hemin and IL-33, factors that drive RPM differentiation. To model the co-existence of ID conditions and inflammation, we established two systems, one mimicking the iron retention in RPMs by treatment of cells with ferric ammonium citrate and, the second employing lentiviral-mediated ferroportin overexpression, an intervention that enhanced the uptake of red blood cells and levels of labile iron in iRPMs. Following the treatment with LPS in both systems, we observed a synergistic increase in lipid peroxidation that drives ferroptosis and oxidative stress which contributes to the impairment of cellular components and

subsequent cell demise. Current experiments using the same setup are ongoing to address cell viability, a burden of protein aggregating, and endoplasmic reticulum stress, ultimately leading to a better understanding of how ‘rewiring’ of RPM in ID conditions may expose them to cell damage upon concomitant LPS exposure.

In sum, our study uncovered that inflammation abrogates the rewiring of phagocytic functions of RPMs in ID conditions, a finding that is of high relevance due to frequent co-occurrence of low iron availability with proinflammatory cues in human populations.

OE2

Specjalizacja: hematologia

Tytuł:

Translational fidelity of early spliceosome instructs steady-state hematopoiesis

Autor:

Maciej Ciesla

Współautorzy:

Vladyslava Liudkovska, Ankita Kumari, Kevork Wakimian

Afiliacja:

IMol Polish Academy of Sciences, Warsaw, Poland

Splicing serves as a rapid amplifier of the coding capacity of the genome. This fundamental biological process is governed by a multi-modular ribonucleoprotein machinery known as the spliceosome. Genome-wide studies indicate that malfunctions in the spliceosome act as drivers of abnormal blood differentiation, collectively known as hematopoiesis. However, the underlying molecular pathways remain poorly defined.

In this study, we investigate the dynamics of splicing factors (SFs) during normal hematopoiesis. We identify cohorts of SFs, including components of early spliceosome complexes, that are regulated at the post-trans criptional level. Furthermore, we find that the core SF, Sf1, undergoes regulatory expression changes during the initial stages of hematopoietic stem cell (HSC) activation. This regulation is achieved through an evolutionarily conserved 5’UTR-dependent program that controls Sf1 levels, thus defining HSC differentiation routes. These findings elucidate specific molecular programs and differentiation rates of clonal HSC contributions toward mature hematopoietic cell subsets. Collectively, our results highlight a post-trans criptional gene expression nexus that reveals unexpected Sf1-dependent molecular circuitries critical for blood differentiation.

Specjalizacja: hematologia

Tytuł:

Badanie wpływu inhibitorów kinaz tyrozynowych na immunoterapię przeciwciałami anty-CD20 ostrej białaczki limfoblastycznej z obecnością chromosomu Filadelfia

Autor:

Krzysztof Domka

Współautorzy:

Krzysztof Domka, Agnieszka Dąbkowska, Martyna Janowska, Zuzanna Urbańska, Agata Pastorczak, Magdalena Winiarska, Klaudyna Fidyt, Mieszko Lachota, Elżbieta Patkowska, Łukasz Sędek, Bartosz Perkowski, Jaromir Hunia, Justyna Jakubowska, Beata Krzymieniewska, Ewa Lech-Marańda, Wojciech Młynarski, Tomasz Szczepański, Małgorzata Firczuk

Afiliacja:

Zakład Immunologii, Instytut Medycyny Doświadczalnej i Klinicznej PAN, Zakład Immunologii, Warszawski Uniwersytet Medyczny

Inhibitory kinaz tyrozynowych (TKIs) stanowią kluczowy element terapii ostrej białaczki limfoblastycznej z komórek B z obecnością chromosomu Filadelfia (Ph+ B-ALL). Leki te są stosowane równolegle z intensywną chemioterapią, a w przypadku dorosłych pacjentów, u których występuje ≥20% CD20+ blastów, również z rytuksymabem - monoklonalnym przeciwciałem anty-CD20. W niniejszym badaniu zaobserwowaliśmy występowanie CD20-pozytywnego fenotypu komórek białaczkowych u znacznej części pacjentów zdiagnozowanych z Ph+ B-ALL, co sugeruje częste stosowanie rytuksymabu w połączeniu z TKIs. W związku z tym zbadaliśmy wpływ czterech TKIs na skuteczność przeciwnowotworową przeciwciał anty-CD20 poprzez ocenę poziomów CD20 na powierzchni komórek B-ALL oraz przeprowadzenie testów funkcjonalnych in vitro oraz ex vivo. W tym celu porównaliśmy TKIs pierwszej, drugiej i trzeciej generacji (imatynib, dasatynib, ponatynib) oraz inhibitor allosteryczny asciminib, zatwierdzony do leczenia przewlekłej białaczki szpikowej. Wszystkie badane TKIs obniżyły ekspresję CD20 na komórkach białaczkowych, zmniejszając skuteczność cytotoksyczności zależnej od dopełniacza indukowanej rytuksymabem. Testowane TKIs wykazały jednak zróżnicowany wpływ na zależną od przeciwciał cytotoksyczność komórek NK oraz fagocytozę makrofagów. Spośród badanych leków, asciminib prezentował najbardziej korzystny profil immunologiczny, nie hamując odpowiedzi komórek efektorowych w żadnym z testowanych układów. W przeciwieństwie do tego, dasatinib spowodował znaczące zmniejszenie aktywności komórek cytotoksycznych we wszystkich przeprowadzonych testach, prowadząc do obniżenia zarówno naturalnej, jak i zależnej od przeciwciał cytotoksyczności komórek NK wobec blastów B-ALL. W mniejszym stopniu aktywność komórek NK była również hamowana przez ponatynib. Ponadto, dasatynib i imatynib wykazały hamujący wpływ na fagocytozę komórek pierwotnych B-ALL in vitro. Co ważne, potwierdziliśmy, że doustne podanie dasatynibu hamuje degranulację komórek NK we krwi pacjentów. Nasze wyniki wskazują, że poszczególne TKIs w zróżnicowany sposób wpływają na mechanizmy efektorowe związane z rytuksymabem i obinutuzumabem. Zastosowanie nowego, allosterycznego TKI asciminibu w połączeniu z immunoterapią opartą na przeciwciałach anty-CD20 może być obiecującym podejściem terapeutycznym w Ph+ B-ALL.

Specjalizacja: hematologia

Tytuł:

Indukowana auto-antygenem internalizacja receptora B komórkowego (BCR) jako źródło onkogennego sygnału w chłoniaku rozlanym z dużych komórek B (DLBCL)

Autor:

Patryk Górniak

Współautorzy:

Ondrej Havranek, Anna Polak, Anna Rams, Zofia Pilch, Przemysław Juszczyński

Afiliacja:

Zakład Hematologii Eksperymentalnej, Instytut Hematologii i Transfuzjologii

Sygnał pochodzący z receptora B komórkowego (BCR) jest kluczowy dla przeżycia prawidłowych i nowotworowych limfocytów B, w tym komórek DLBCL. Badania ostatnich lat wykazały, że patologiczny sygnał z BCR w komórkach DLBCL może być generowany nie tylko aktywującymi mutacjami w mediatorach szlaku od BCR, ale również być efektem ciągłej stymulacji BCR przez autoantygeny. Chociaż przeprowadzone analizy jednoznacznie wykazały kluczową rolę autoantygenów dla przeżycia komórek DLBCL, to ich wpływ na procesy komórkowe i ścieżki sygnałowe wspierające wzrost komórek DLBCL nie został zdefiniowany.

W tym celu wygenerowaliśmy modele komórkowe DLBCL ze zmodyfikowanymi regionami hiperzmiennymi BCR specyficznymi dla albuminy jaja kurzego, stosując metodę CRISPR-Cas9. Modele te pozwoliły na badanie roli autoantygenów w generowaniu onkogennego sygnału zależnego od BCR w ściśle kontrolowanych warunkach.

Zmiana specyficzności BCR prowadziła do zahamowania jego wiązania z natywnym autoantygenem, co z jednej strony skutkowało wzrostem poziomu BCR na błonie wskutek zahamowania indukowanej autoantygenem internalizacji BCR, ale z drugiej strony prowadziło do inhibicji szlaków sygnałowych, co prowadziło do obniżenia potencjału proliferacyjnego komórek DLBCL. Szlaki sygnałowe ulegające zahamowaniu w zmodyfikowanych komórkach zidentyfikowano w badaniach proteomicznych (technologia PamGene). Wykazaliśmy inhibicję aktywności wielu kinaz, w tym kinaz będących mediatorami sygnału od BCR, kinaz zależnych od cyklin, kinaz białkowych C oraz kinaz rybosomalnych S6. Co więcej, na podstawie przeprowadzonych badań PLA (Proximity Ligation Assay) wykazaliśmy, że wiązanie BCR z autoantygenem prowadzi do formowania kompleksów BCR-TLR9-pIkB w kompartmencie endosomalnym, będących aktywatorem czynnika NF-kB.

Powyższe wyniki sugerują, że indukowana autoantygenem internalizacja receptora BCR może być istotnym procesem w podtrzymywaniu sygnału kluczowego dla przeżycia komórek DLBCL.

Analiza dynamiki internalizacji BCR i aktywacji szlaków sygnałowych w powyżej opisanych modelach, a także reanaliza dostępnych danych z eksperymentów CRISPR-Cas9 screen, potwierdziła te obser-

wacje, wskazując na kluczowe dla przeżycia komórek DLBCL znaczenie procesu endocytozy zależnej od dynaminy-2 (DNM2) i klatryny.

DNM2 może być hamowana za pomocą klinicznie stosowanych pochodnych fenotiazyny, dlatego też, w celu ewaluacji DNM2 jako celu terapeutycznego w DLBCL, wygenerowaliśmy modele komórkowe charakteryzujące się indukowalną ekspresją formy dominująco-negatywnej (DN) DNM2, która hamuje endocytozę zależną od klatryny i DNM2. Eksperymenty przeprowadzone z użyciem powyższych modeli wykazały, że internalizacja BCR jest zależna od DNM2, a indukcja formy DN-DNM2 blokuje internalizację receptora BCR, powstawanie kompleksów BCR-TLR9-pIkB oraz aktywację szlaków sygnałowych, w tym czynnika transkrypcyjnego NF-kB, co istotnie hamowało wzrost komórek DLBCL. Ponadto, farmakologiczna inhibicja DNM2 z użyciem pochodnych fenotiazyny również hamowała endocytozę BCR oraz była toksyczna dla komórek DLBCL. Hamujący wpływ fenotiazyn na wzrost guzów DLBCL został potwierdzony w mysim modelu DLBCL.

Podsumowując, nasze obserwacje dowodzą, że indukowana autoantygenami endocytoza receptora BCR jest jednym z kluczowych mechanizmów podtrzymujących sygnał od BCR i zapewniających przeżycie chłoniaków B-komórkowych, a jej hamowanie może stać się opcją terapeutyczną w leczeniu tej grupy nowotworów.

Finansowanie: Narodowe Centrum Nauki (2019/35/D/NZ5/03354), Narodowa Agencja Wymiany Akademickiej (PPN/BEK/2020/1/00173)

OE5

Specjalizacja: hematologia

Tytuł:

Nutritional iron deficiency elicits unique metabolic adaptations of splenic red pulp macrophages

Autor:

Raghunandan Mahadeva

Współautorzy:

Raghunandan Mahadeva¹, Pratik Kumar Mandal¹, Patryk Slusarczyk¹, Komal Chouhan¹, Marta Niklewicz¹, Elizabeta Nemeth², Katarzyna Mleczko-Sanecka¹

Afiliacja:

1. International Institute of Molecular and Cell Biology in Warsaw, Poland

2. David Geffen School of Medicine at UCLA, Los Angeles, California, United States

Iron deficiency is a globally prevalent condition with profound socio-medical impacts. Yet, little is known about how specialized cells respond to iron-deficient (ID) conditions. Red pulp macrophages (RPMs) represent a macrophage population that resides in the spleen and is crucial for maintaining iron and blood balance by phagocytosing aged erythrocytes and recycling iron. It was unknown whether alterations in iron availability, particularly iron restriction, affect the capacity of RPMs for erythrocyte phagocytosis and digestion. Our research discovered that under nutritional ID conditions, RPMs increase their capacity for erythrophagocytosis and lysosomal erythrocyte degradation. This functional rewiring was accompanied by metabolic activation, a response unique compared to other cell types, and hallmarked by increased mitochondrial mass and membrane potential, augmented glucose uptake, and enhanced protein synthesis rate. Importantly, these adaptive changes were dependent on enhanced protein expression of the only known iron exporter ferroportin known to be stabilized on RPM membrane upon systemic iron restriction. Proteomic profiling followed by flow cytometric validation revealed further specialized metabolic adaptations of RPMs in ID mice, involving primarily a boost of branched-chain amino acid catabolism and fatty acid beta oxidation. The former response was additionally associated with increased protein expression of the amino acid exporter, suggesting a compensatory mechanism to maintain cellular amino acid homeostasis, whereas the latter was consistently linked with a decrease in lipid droplet formation. Notably, all these regulatory patterns were unique to RPMs in comparison to other macrophage subtypes of ID mice.

Utilizing in vitro models of primary macrophages, we further demonstrated enhanced erythrophagocytosis capability in cells exposed to branched-chain amino acid leucine, a phenomenon that was reverted by pharmacological inhibition of amino acid catabolism. Moreover, we identified suppression of erythrophagocytic capacity upon blockage of beta oxidation. Finally, replicating the observations from mice, we demonstrated that lentiviral mediated overexpression of ferroportin in primary macrophages enhanced phagocytic and metabolic functions of primary macrophages and that the former response was reverted by pharmacological inhibition of the branched-chain amino acid catabolism. Taken together, our findings highlight the unique intertwined relationship between amino acid and lipid metabolism, and the erythrophagocytosis capacity of RPMs, offering fresh insights into how these specialized macrophages adapt to systemic iron deficiency to sustain their augmented phagocytic activity. We expect that these global functional and metabolic adjustments likely aid in the adaptation of the whole organism to iron deficiency.

Specjalizacja: hematologia

Tytuł:

Indukcja endogennych cytokin jako nowa metoda mobilizacji krwiotwórczych komórek macierzystych ze szpiku kostnego do krwi

Autor: Agata Szade

Współautorzy:

Paweł Kożuch¹, Aleksandra Bednarz¹, Jadwiga Filipek-Gorzała¹ ², Izabella Skulimowska¹ ², Kacper Kowalski¹ ², Kinga Gawlińska¹, Neli Kachamakova Trojanowska³, Wiktoria Białończyk¹, Mateusz Sar², Kinga Mależyna¹, Patrycja Kwiecińska², Andrzej Kubiak², Natalia Bryniarska-Kubiak², Mehmet Eren², Agata Janczy², Krzysztof Szade²

Afiliacja:

1. Zakład Biotechnologii Medycznej, Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii, Uniwersytet Jagielloński; 2. Pracownia Biologii Komórek Macierzystych, Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii, Uniwersytet Jagielloński; 3. Małopolskie Centrum Biotechnologii, Uniwersytet Jagielloński

Farmakologiczna mobilizacja komórek ze szpiku kostnego do krwi jest stosowana w leczeniu neutropenii oraz do izolacji krwiotwórczych komórek macierzystych (HSC, ang. hematopoietic stem cells) do przeszczepienia. Na powodzenie przeszczepienia mają wpływ liczba i potencjał regeneracyjny HSC obecnych w preparacie mobilizowanej krwi. W przypadku przeszczepienia allogenicznego, jednym z największych problemów jest choroba przeszczep przeciw gospodarzowi (GVHD, ang. graft versus host disease). Jednym z mediatorów GVHD są limfocyty T obecne w przeszczepianym preparacie. W związku z tym istnieje zapotrzebowanie na nowe terapie mobilizujące, które pozwolą na pobranie od dawcy wystarczającej liczby funkcjonalnych HSC, minimalizując jednocześnie ryzyko wystąpienia choroby GVHD u biorcy.

Obecnie najczęściej stosowanym lekiem mobilizującym jest rekombinowany G-CSF (rhG-CSF). Naszym celem jest opracowanie alternatywnej strategii, która indukuje endogenny G-CSF i inne czynniki mobilizujące, aby przezwyciężyć ograniczenia obecnych strategii klinicznych.

We wcześniejszych badaniach zauważyliśmy, że protoporfiryna IX kobaltu (CoPP) powoduje mobilizację komórek ze szpiku kostnego. CoPP indukuje ekspresję endogennego G-CSF, ale także innych cytokin o właściwościach mobilizujących, takich jak interleukina-6 (IL-6), CXCL1 (GRO α) i CXCL2 (GRO β).

W celu zbadania kinetyki mobilizacji analizowaliśmy liczbę komórek we krwi od 1 do 72 godzin po jednokrotnym podaniu myszom C57BL/6 CoPP lub rhG-CSF. Dodatkowo analizowaliśmy efektywność mobilizacji po codziennym podawaniu CoPP przez 1 do 5 kolejnych dni. Przy codziennym podawaniu

myszom typu dzikiego rhG-CSF lub G-CSF, zaobserwowaliśmy wzrost liczby komórek HSPC we krwi począwszy od dnia 2 w obu grupach myszy. Jednak w dniu 4 u myszy nastrzykniętych CoPP, liczba HSPC gwałtownie wzrosła i była ok. 4 razy wyższa niż u myszy nastrzykniętych rhG-CSF. Dodatkowo zaobserwowaliśmy, że podanie CoPP efektywniej mobilizuje również granulocyty. Podczas gdy liczba dojrzałych granulocytów szybko, ale krótkotrwale wzrastała od 1 do 3 godzin po jednorazowym podaniu rhG-CSF, w przypadku CoPP, po jednokrotnym podaniu liczba dojrzałych granulocytów rosła niewiele później (1.5 – 6 godzin), ale osiągała znacznie większą wartość (1.7 razy wyższą niż po rhG-CSF) i utrzymywała się dłużej (nawet do 48 godzin). Przy wielokrotnych podaniach CoPP początkowa zwiększona liczba dojrzałych granulocytów utrzymywała się przez 3 dni, natomiast w dniach 4 i 5 obserwowaliśmy dalszy wzrost. Wielokrotne podania rhG-CSF powodowały wolniejszy w porównaniu do CoPP wzrost liczby dojrzałych granulocytów. Zwiększona liczba granulocytów utrzymuje się jeszcze przez dwa tygodnie po zakończeniu podawania CoPP, pomimo spadku stężenia endogennego G-CSF do poziomu bazalnego.

Podsumowując, CoPP indukuje bardziej wydajną i szybszą mobilizację komórek niż rhG-CSF. Różnice w kinetyce mobilizacji wywołanej CoPP i rekombinowanym rhG-CSF sugerują, że inne cytokiny mogą modulować działanie G-CSF i wpływać na właściwości funkcjonalne zmobilizowanych komórek. CoPP można uznać za potencjalny nowy lek mobilizacyjny, ponieważ w modelu mysim wywołuje wzrost ekspresji wielu endogennych czynników mobilizujących i tym samym efektywniejszą mobilizację zarówno HSC jak i granulocytów.

OE7

Specjalizacja: hematologia

Tytuł:

Comprehensive characterization of gene expression profiles and isoform usage in SF3B1- mutated chronic lymphocytic leukemia using long-read sequencing method

Autor: Monika Szelest

Współautorzy:

Michał Kiełbus, Magdalena Paziewska, Agnieszka Karczmarczyk, Krzysztof Giannopoulos

Afiliacja:

Department of Experimental Hematooncology, Medical University of Lublin, Poland

The gene encoding splicing factor 3B subunit 1 (SF3B1 ) is the most frequently mutated splicing factor among hematological malignancies. The incidence of SF3B1 mutations in newly diagnosed patients with chronic lymphocytic leukemia (CLL) and treated individuals varies from 5% to 17%, respectively. Different studies have reported changes in numerous cellular pathways, including MYC and NOTCH1 signaling, B-cell receptor signaling, DNA damage response, and telomere maintenance in the leukemic SF3B1 mutant samples. Nevertheless, the exact mechanisms underlying the aberrant regulation of signaling pathways in samples with mutated SF3B1 have remained a mystery. Thus, the aim of this study was to gain further insights into the functional consequences of SF3B1 mutation using long read-based sequencing technology that enables identification of full-length trans cripts.

Nine newly diagnosed and untreated CLL patients were enrolled to this study. Patients were profiled with molecular features via whole exome sequencing panel on short-read sequencing platform (Illumina). The Oxford Nanopore Technology MinION platform was used for trans criptome sequencing from full-length poly-A+ RNA of CLL patients, including five cases with SF3B1 MUT and four with SF3B1 WT. For the identification of differential gene expression, alternative trans cripts, as well as novel isoforms, DESeq2 and FullLength Alternative Isoform Analysis of RNA (FLAIR) packages were used.

A total of 64 million reads with PHRED quality score >9 were generated. On average, 80% of reads were considered full-length. Our analysis revealed 166 upregulated and 261 downregulated genes with at least three fold change and adjusted p-value ≤ 0.05. The FLAIR analysis showed also remarkable changes on splicing and alterative isoform expression between CLL patients harboring SF3B1 mutation and SF3B1 WT CLL patients. We found differential exon usage of leukemia-related BCL11A and NFKB1 genes. Furthermore, Gene Ontology identified enrichment of gene sets associated with chromatin organization, miRNA processing, and nucleocytoplasmic transport.

Long reads enabled us to better estimate isoform productivity and characterize AS complexity in full-length isoforms. Since nanopore sequencing provides a more complete picture of the trans criptome of leukemic cells, further studies on a larger cohort of patients might facilitate identification of specific cancer-related variants, which might serve as biomarkers of potential predictive and/or therapeutic relevance.

The study was founded by Medical University of Lublin (DS462 granted to KG), and supported by Interdisciplinary Centre for Mathematical and Computational Modelling at the University of Warsaw.

Referaty ustne

Specjalizacja: hematologia

Tytuł:

Impact of Atrial Fibrillation on Thrombotic Complications in MPN Ph-neg Patients: Real-Life Analysis

Autor:

Olga Chyrko¹

Współautorzy:

Magdalena Karasek², Jean Christophe Ianotto³, Danijela Lekovic⁴, Weronika Lebowa⁵, Tomasz Sacha⁵, Aleksandra Gołos⁶, Patryk Sobieralski⁷, Marek Skarupski⁸, Marta Szandruk-Bender⁹, Tomasz Wróbel², Marta Sobas².

Afiliacja:

1. University Clinical Hospital, Department of Hematology, Blood Neoplasms and Bone Marrow Transplantation, Wrocław, Poland

2. Wroclaw Medical University, Department of Hematology, Blood Neoplasms and Bone Marrow Transplantation, Wrocław, Poland

3. Institut de Cancéro-Hématologie, Hématologie Clinique, Brest, France

4. University Clinical Center Serbia, Clinic of Hematology, Belgrad, Serbia

5. Jagiellonian University Hospital in Krakow, Department of Haematology, Kraków, Poland

6. Medical University of Łódź, Department of Hematology, Łódź, Poland

7. Medical University of Gdansk, Department of Hematology and Transplantology, Gdańsk, Poland

8. Wrocław University of Science and Technology, Faculty of Pure and Applied Mathematics, Wrocław, Poland

9. Wroclaw Medical University, Department of Pharmacology, Wrocław, Poland

Introduction:

Thrombotic complications, both arterial and venous, are the most common causes of morbidity and mortality among patients with myeloproliferative neoplasms without Philadelphia chromosome (MPN Ph-neg). Atrial fibrillation (AF) is an independent risk factor for venous thrombosis, that require anticoagulant therapy. The incidence of AF in patients with MPN Ph-neg seems to be higher than in the general population (around 13% vs 1-3%) and arterial thrombosis is more frequent then venous in this population. There are no clear recommendation about thrombotic prophylaxis in MPN Ph-neg with AF.

Aims:

To evaluate the prevalence of AF in population of MPN Ph-neg and compare the incidence and outcome of thrombosis in patients with MPN Ph-neg with and without AF.

Methods:

We conducted a multi-center, retrospective, real-life analysis of 2072 patients with MPN Ph-neg diagnosed and treated between 1976-2024. Thrombotic risk was assessed with r-IPSET-t for ET and ELN risk score for PV. A comparative analysis of MPN Ph neg patients with and without AF was performed. The distribution of the ratio coefficients was estimated by bootstrap. A confidence range (CI) of 95% has been set to compare the results. The study used a two-sample t-test with Welch’s correction to compare mean age between groups with and without AF, and Chi-square or Fisher’s exact tests for categorical variables.

Results:

The clinical and analytical features of analyzed population are present in a table; patients are divided in two groups with AF (+) and without AF (-). Out of 2072 patients, 290 (13.9%) had AF: 64/290 (22,06%) were < 65; 160/290 (55,17%) were ≥ 65 <80 and 66/290 (22,75%) were > 80 years old at time of diagnosis of MPN Ph-neg. Patients with MPN Ph-neg AF (+) vs AF(-) were older (71.7 vs 60.76 respectively,p < 0.0001). The frequency of JAK2 mutation was higher in MPN Ph-neg AF (+) vs AF (-) 84% vs 75% respectively (p 0.01).

High thrombotic risk scores were more common in MPN Ph neg AF(+) group, retrospectively in ET (66,2% vs 30,5%, p<0,0001) and in PV (89,5% vs 62,6%, p<0,0001). Thrombosis before diagnosis, same as during FU was more frequent in MPN Ph neg AF (+) vs MPN Ph neg AF (-) in the comparative analysis (0.38 vs 0.22, p<0.0001) and (0.28 vs 0.16, p<0.0001). Arterial thrombosis diagnosed as before diagnosis as during FU was more frequent in MPN Ph neg AF (+), (0.67 vs 0.48, p=0.0004) and (0.66 vs 0.43, p=0.0004). The overall survival (OS) in MPN Ph-neg AF (+) is lower compared to MPN Ph-neg AF(-) (130 months vs. 232 months, p < 0.0001). Furthermore, the recurrence time from the first thrombotic event to the next is notably shorter in MPN Ph-neg AF (+) patients (165 months vs. 236 months, p < 0.0001). Higher mortality rates were exhibited in MPN Ph neg AF (+) group (51.7% vs 23.2%, p<0.0001).

Conclusions:

• The frequency of AF in the MPN group is notably higher compared to the general population, across all age groups.

• JAK mutations are more commonly observed among patients in MPN Ph neg AF (+) group then in MPN Ph neg AF (-) group.

• Increased risk of thrombosis complications among MPN Ph neg with AF translates into higher mortality.

• Arterial thrombosis is more prevalent in MPN Ph neg AF (+) patients.

• AF is more in MPN Ph neg than in the general population, requiring comprehensive cardiac monitoring, including Holter ECG, in all diagnosed patients.

• The shorter OS and recurrence times for thrombosis in MPN Ph-neg AF(+) contributes to higher mortality rates.

Specjalizacja: transfuzjologia

Tytuł:

7 lat nieinwazyjnej diagnostyki genotypu RHD płodu dla celowanej immunoprofilaktyki śródciążowej konfliktu RhD

Autor:

Agnieszka Orzińska

Współautorzy:

Agnieszka Orzińska1 , Magdalena Krzemienowska1 , Sylwia Purchla-Szepioła1 , Justyna SmolarczykWodzyńska1 , Kozioł Klaudia1 , Joanna Skulimowska1 , Monika Jurkowska 2 , Eliza Głodkowska-Mrówka1 , Katarzyna Guz 1

Afiliacja:

1. Department of Immunohematology, Institute of Hematology and Transfusion Medicine, Warsaw, Poland

2. GENOMED Health Care Centre, Warsaw, Poland

Wstęp:

Powszechna immunoprofilaktyka konfliktu Rh ograniczyła występowanie alloimmunizacji antygenem D u ciężarnych RhD ujemnych. Jednakże podanie preparatu immunoglobuliny anty-D w trakcie ciąży jest niepotrzebne, jeśli płód jest RhD-ujemny. Nieinwazyjna diagnostyka genu RHD płodu pozwala ustalić, czy płód jest zgodny z RhD-ujemną matką i można odstąpić od immunoprofilaktyki śródciążowej. Celem doniesienia jest podsumowanie 7 lat nieinwazyjnych badań genotypu RHD płodu dla celowanej immunoprofilaktyki anty-D prowadzonych w IHiT w latach 2017-2023.

Materiał i metody:

Materiałem do badań była krew 2086 kobiet ciężarnych RhD ujemnych od 8 do 38 tygodnia ciąży (418 kobiet w I, 1564 w II, 53 w III trymestrze ciąży, 52 kobiety - brak danych). DNA z osocza izolowano na aparacie easyMag (Biomerieux). Obecność genów RHD i CCR5 badano techniką real-time PCR na aparacie LC480II (Roche). Warianty RHD identyfikowano testem RBC FluoGene RBC-Dweak/variant (Inno-Train, Germany) lub protokołem typu home made.

Wyniki:

W 714/2086 przypadkach w DNA wyizolowanym z osocza ciężarnych nie wykryto genu RHD i rekomendowano odstąpienie od śródciążowego podania preparatu. W 1329/2086 przypadkach wykryto gen RHD płodu i rekomendowano podanie immunoglobuliny. W 3/1329 przypadkach dziecko urodziło się fenotypowo RhD ujemne, ale powtórna analiza potwierdziła występowanie genu RHD płodu w osoczach ciężarnych. W 43/2086 wykazano obecność genu RHD w genomie ciężarnej i wynik RHD płodu był nie do interpretacji i w tych przypadkach u 27 kobiet wykazano obecność wariantów RHD*01W.1, 2 lub 3. Mediana (i zakres) liczby kopii RHD w ml osocza w kolejnych trymestrach ciąży wynosiły: 27 (3322); 30 (2-396) i 50 (9-258), a w przypadkach kobiet z wariantami genu RHD w ich genomie: 347 (114-

2542). W 92 przypadkach na badanie dla celowanej immunoprofilaktyki śródciążowej skierowano kobiety z przeciwciałami anty-D. U 21 z nich nie wykryto genu RHD, lecz wynik genotypu RHD płodu był nie do interpretacji ze względu na brak możliwości potwierdzenia obecność materiału płodowego w badanym DNA z osocza ciężarnej.

Wnioski:

Nieinwazyjna diagnostyka RHD płodu dla celowanej immunoprofilaktyki śródciążowej pozwoliła na rekomendowanie odstąpienia od podania preparatu ze względu na RHD-ujemny genotyp płodu w 34% badanych przypadków. U 1,3% kobiet wykryto wariant genu RHD odpowiedzialny za powstanie fenotypu słabe D typu 1, 2 lub 3, który nie ulega immunizacji antygenem D i nie wymaga zastosowania immunoprofilaktyki.

Specjalizacja: hematologia

Tytuł:

The expression profile of p53 protein isoforms in chronic lymphocytic leukemia and its correlation with the concentration of main proteins from BCL family

Autor: Anna Maria Janik

Współautorzy:

Krzysztof

Jamroziak, Irena Misiewicz-Krzemińska, Zuzanna Tracz-Gaszewska

Afiliacja:

1. Department of Hematology, Transplantation, and Internal Medicine of the Medical University of Warsaw

2. Plasma Cell Neoplasm Lab in the Experimental Hematology Department of the Institute of Hematology and Transfusiology in Warsaw

Introduction:

In 2005 an alternative promoter in the TP53 gene was discovered resulting in the identification and description of the p53 isoforms. At this point we know that TP53 expresses at least twelve isoforms of p53 protein: TAp53 α , TAp53 β , TAp53 γ , Δ 40p53 α , Δ 40p53 β , Δ 40p53 γ , Δ133p53 α , Δ133p53 β , Δ133p53 γ , Δ 160p53 α , Δ160p53 β , and Δ160p53 γ proteins that can modulate its function. In recent years, it has been shown that p53 isoforms may affect prognosis of certain kinds of tumors. Different p53 isoform expression profiles have been associated with different cancer types. It has been observed that the p53 isoforms are co expressed and work together. Moreover, it has been observed that p53 isoforms have the potential to predict therapy response. The BCL family of proteins consists of pro- (Bax, Bak, Bad, Bim, NOXA, PUMA) and anti- apoptotic (Bcl-2, Bcl-xL, Mcl-1) proteins. Some of them are known to be regulated by p53, and particularly differentially by p53 isoforms. This pilot study aimed to analyze the expression patterns of p53 isoforms and proteins from BCL family in chronic lymphocytic leukemia cells.

Materials and methods:

The study was carried out in lymphocytes from peripheral blood obtained from patients with chronic lymphocytic leukemia. At first we extracted DNA/RNA and proteins from banked lymphocytes by ice-cold acetone precipitation. Then we quantify protein concentration using JESS™ system (ProteinSimple). Then, the samples that were of a good quality were all brought to the same concentration and we performed the test of p53 proteins using capillary electrophoresis immunoassay (CNIA) method and a set of specific antibodies. By the same method, we evaluated the proteins from the BCL family in those samples. The primary antibodies used in the study were: mouse monoclonal DO-11, whose epitope is present in the common region DBD and allows detection of all p53 protein isoforms; mouse monoclonal DO-1, whose epitope is situated in the transactivation domain 1 that is present only in the TAp53 α , TAp53 β , and TAp53 γ protein isoforms; rabbit polyclonal anti-p53 A300-249A-T, which is specific to the α isoforms (TAp53 α , Δ 40p53 α , Δ133p53 α , and Δ160p53 α );

and anti-GAPDH, which was used as the endogenous control. All protein data were analyzed with Compass™ software (ProteinSimple), qualitatively at first, using the virtual blots (analogous to the images of the long-established western blot) that showed the protein band with the expected size and also quantitatively, measuring the chemiluminescence peaks (peak area) that correspond to the expression of a particular protein. The protein expression was reported as relative to the endogenous control, GAPDH.

Results:

We have shown that using the proposed CNIA method, it is possible to quantify the expression levels of specific proteins, including p53. The final results will be presented at the conference.

Specjalizacja: hematologia

Tytuł:

Wdrożenie wieloetapowej diagnostyki genetycznej w rutynowej diagnostyce ostrej białaczki

szpikowej w oparciu o szybkie i zaawansowane metody cytogenetyczne i molekularne oraz sekwencjonowanie NGS

Autor:

Bartłomiej Sankowki

Współautorzy:

Imbierska S¹, Moskowicz A¹, Chudy A¹, Krop A¹, Machnicki M¹ ², Pastwińska A¹ ², Kulikowska A¹, Stefaniak A¹, Chmarzyńska-Mróz E¹, Basak GW³, Stokłosa T¹ ²

Afiliacja:

1. Pracownia Genetyki Molekularnej i Cytogenetyki, Laboratorium Genetyki, Uniwersyteckie Centrum Medycyny Laboratoryjnej, Uniwersyteckie Centrum Kliniczne Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego

2. Zakład Biologii i Genetyki Nowotworów, Warszawski Uniwersytet Medyczny

3. Klinika Hematologii, Transplantologii i Chorób Wewnętrznych, Uniwersyteckie Centrum Kliniczne Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego

Diagnostyka ostrej białaczki szpikowej jest oparta o różnorodne techniki genetyczne i podlega nieustannym zmianom, co związane jest z nowymi terapiami i programami lekowymi. W tym celu wykorzystywane są szybkie testy jedno lub kilkugenowe (FISH, metody PCR) oraz zaawansowane badania cytogenetyczne i molekularne (kariotyp, sekwencjonowanie NGS). Część wykrytych zmian zgodnie z wytycznymi ELN 2022, powinna zostać zaraportowana w jak najkrótszym czasie (w ciągu 5-7 dni roboczych) ze względu na konieczność decyzji terapeutycznych już w pierwszym etapie leczenia.

Od 2019 roku w Pracowni Genetyki Molekularnej i Cytogenetyki (PGMiC) Uniwersyteckiego Centrum Klinicznego Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego (UCK WUM) wdrażany jest wieloetapowy proces diagnostyki genetycznej ostrej białaczki szpikowej, zapewniający optymalną informację diagnostyczną poprzez połączenie metod molekularnych i cytogenetycznych. Wykonywany jest panel „szybkiej diagnostyki” metodami PCR obejmujący kilka genów oraz badania przy użyciu metod cytogenetyki klasycznej i FISH. Ostatnim etapem jest zaawansowane badanie genetyczne metodą NGS przy użyciu panelu genów (aktualnie analizowanych jest ponad 40 genów powiązanych z patogenezą ostrych białaczek).

W okresie czteroletnim (12.2019 r. – 12.2023 r.) w PGMiC UCK WUM wykonano opisany powyżej proces diagnostyczny dla 103 pacjentów z potwierdzoną diagnozą ostrej białaczki szpikowej leczonych w Klinice Hematologii, Transplantologii i Chorób Wewnętrznych UCK WUM (47 kobiet, mediana wieku 60 lat; 56 mężczyzn, mediana wieku 59 lat). Wszyscy chorzy wyrazili świadomą zgodę na zaawansowane badania genetyczne/cytogenetyczne.

Panel „szybkiej diagnostyki” pozwolił na wykrycie badanych zmian genetycznych u 36 chorych: FLT3-ITD (21%), NPM1 (20%), RUNX1::RUNX1T1 (7%), CBFB::MYH11 (6%).

Badania metodami cytogenetyki klasycznej i FISH pozwoliły stwierdzić fuzję genów RUNX1::RUNX1T1 (7%), CBFB::MYH11 (6%) oraz rearanżację genów: KMT2A (5%), kompleksu MECOM (1%), NUP98 (1%) i ETV6 (1%). Wykryto także inne aberracje cytogenetyczne (18%), kariotyp złożony (24%), a u 38% pacjentów kariotyp był prawidłowy.

Zaawansowane badanie NGS u trojga chorych (3/103) nie wykryło żadnych wariantów patogennych w analizowanych genach, u pozostałych 100 pacjentów wykryto przynajmniej jeden wariant określony jako patogenny lub o nieokreślonym znaczeniu (VUS), te ostatnie raportowano z odpowiednią adnotacją. Wykryto ponad 300 wariantów: z tego 90% patogennych, 10% uznano za VUS . Najczęściej wykrywano warianty w genach: FLT3 (40%), DNMT3A (29% ), ASXL1 (21%), TET2 (20%), TP53 (18%), NPM1 (18%) , SRSF2 (17%) , IDH1/2 (17%) , NRAS (16%) , RUNX1 (14%).

Spektrum zmian genetycznych, które wykryto w trakcie rutynowej diagnostyki u ponad 100 chorych z ostrą białaczką szpikową, jest zbliżone do spodziewanej częstości na podstawie danych literaturowych. Połączenie metod cytogenetycznych i molekularnych (w tym w szczególności NGS) pozwoliło dla każdego pacjenta wykryć przynajmniej jedną zmianę genetyczną. Ze względu na charakter OBSz, w niektórych przypadkach wykryto tylko zmiany molekularne (38%) lub tylko zmiany cytogenetyczne (3%), co pokazuje wzajemną komplementarność metod molekularnych i cytogenetycznych. Dla kilku pacjentów dzięki zastosowaniu badania panelem NGS udało się zidentyfikować potencjalne i nieoczywiste cele molekularne w OBSz (wariant V600E w genie BRAF ) lub pomóc w wyborze metody kondycjonowania przed allo-HSCT (wykryty wariant zarodkowy w genie ATM dyskwalifikujący z TBI). Wskazuje to na celowość stosowania wielogenowego badania NGS w rutynowej diagnostyce OBSz.

Specjalizacja: transfuzjologia

Tytuł:

Allogeneic serum eye drops for the treatment of ocular GvHD

Autor:

Katarzyna Chmielewska

Współautorzy:

Katarzyna Chmielewska¹, Joanna Janus¹, Karolina Wrzodak¹, Marta Stącel¹, Jolanta Antoniewicz-Papis¹

Afiliacja:

1. Institute of Hematology and Transfusion Medicine (IHTM), Warsaw

Background

Autologous serum eye drops (ASEDs) have been performed at the Institute of Haematology for more than 30 years. In 2019, allogeneic serum eye drops (alloSEDs) were introduced. This preparation has been used in patients with immunological diseases due to abnormal cytokine levels in their serum or after oncological treatment, where venous access is often difficult. AlloSEDs are used for Dry Eye Syndrome (DES) without underlying disease as well as for DES secondary to diseases of various etiology like: Graft versus Host Disease (GvHD ) or Sjögren’s Syndrome (SS). The ocular form of GvHD is very common and can severely affect patients’ quality of life.

Aims

Analysis of the OSDI and questionnaire developed by the IHTM for patients with ocular GvHD using alloSEDs who had previously used ASEDs.

Methods

31 men and 115 women participated in the study in 2019-2023. 450 ml of whole blood from healthy men with blood group AB with no transfusion history was collected in disposable bags without anticoagulant. Blood was incubated for a maximum of 2 hours at 37°C, centrifuged and pressed to separate serum, which was then centrifuged to remove residuals morphotic elements. Under sterile conditions, the serum was transferred to 0.5ml capsules, which could be stored at < -18°C for 12 months. In addition, serum inactivation with riboflavin and UV light has started from 2021. Patients were required to complete OSDI questionnaires before and 1 month after treatment.

Results

The OSDI survey and questionnaire were completed by 55/146 patients. 10 of 55 patients (4 women and 6 men) reported with ocular GvHD. 4 out of 10 patients used inactivated alloSEDs. All patients had previously used ASEDs. After 1 month of using allogeneic drops, the mean OSDI decreased from 44.55 (39.58-50) to 25.18 (4.11-58.33) for non-inactivated alloSEDs and from 86.64 (81-91.67) to 59.30 (76.23-81) for inactivated alloSEDs. Patients reported better eye lubrication and less frequent use of alloSEDs than ASEDs.

Summary

OSDI surveys show that there was a significant improvement in patients with ocular GvHD after the use of eye drops with allogeneic non-inactivated or inactivated serum. Ophthalmologic tests should be performed to understand more about the effects of drops on the ocular surface. Follow-up of a larger group of patients is also needed.

Specjalizacja: hematologia

Tytuł:

Transcriptional signatures of CLL cells with high XPO1 expression show altered B cell activation and p53 pathway downregulation

Autor: Monika Szelest

Współautorzy:

Agnieszka Karczmarczyk, Magdalena Paziewska, Michał Kiełbus, Krzysztof Giannopoulos

Afiliacja:

Department of Experimental Hematooncology, Medical University of Lublin, Poland

The intracellular location and regulation of specific proteins are critically important since aberrant localization of tumor suppressors and oncoproteins might result in their respective inactivation or hyperactivation. This incorrect localization may be mediated by exportin-1 (XPO1/CRM1), which recognizes nuclear export sequences (NES) of larger proteins and molecules, such as p53, p27, FOXO proteins, NF- κB, and nucleophosmin-1 (NPM1). Emerging data indicate that XPO1 is upregulated in various hematological malignancies, including chronic lymphocytic leukemia (CLL), and is associated with poor prognosis. It was also reported that increased expression and hyperactive transport capacity of XPO1 enables tumor cells to evade apoptosis, thus promoting tumor progression. Nevertheless, the mechanisms controlling the XPO1-dependent cell growth, proliferation, and apoptosis in CLL remain largely unexplored. Therefore, the aim of this study was to assess the prognostic role of XPO1 and identify a gene expression signature of XPO1 -overexpressing CLL cells.

The study included peripheral blood samples from 95 untreated patients with CLL. After the assessment of XPO1 mRNA expression in CLL samples using droplet digital PCR, we performed the analysis of the correlation of XPO1 level and prognosis. To investigate the influence of XPO1 overexpression on gene expression profile of CLL cells, RNA-seq (Illumina) was performed by comparing CLL samples of 12 XPO1high and 12 XPO1low cases. Patients were divided into high and low expression groups based on the cutoff value of 0.12 with maximally selected rank statistics. Differential gene expression was determined using DESeq2 with adjusted P-value ≤0.05, log2Fold Change ≥1.5. Functional enrichment from differentially expressed genes was identified by GO, GSEA, and KEGG.

We reported a significantly higher XPO1 expression in CLL cells with TP53 mutation, del17p, and del13q compared to cells with TP53 wt (p=0.0035), cells without del13q (p=0.0097), and without del17p (p=0.0016), respectively. Furthermore, there was a tendency to increased XPO1 expression in CLL cells with unmutated IGHV (p=0.09). On the other hand, we found a significantly lower XPO1 expression in CLL samples with tri12 in comparison to leukemic cells without tri12 (p=0.0202). Interestingly, we observed a significant negative correlation between XPO1 and NPM1 levels (p<0.0001, r=-0.4297). Trans criptome sequencing of XPO1high CLL cells revealed 539 differentially expressed genes (DEGs) (385 upregulated and 154 downregulated) compared to XPO1low CLL samples. Of note, relevant genes for cell metabolism, proliferation, and apoptosis were significantly dysregulated. Enrichment analysis of DEGs using GO enrichment analysis identified positive regulation of lymphocyte activation and B cell

activation as the most significantly altered. Moreover, pathway activity analysis using PROGENy showed decreased activation of p53 pathway in XPO1 high CLL cells in comparison to XPO1 low cases.

In conclusion, our study indicated that XPO1 could be an unfavorable prognostic factor for patients with CLL. Clinically, this observation might suggest the possibility to investigate the role of XPO1 inhibitors in treatment of CLL, as well as elucidate the precise mechanism of XPO1 activity in leukemic cells.

The study was founded by the Polish National Science Centre (2021/43/O/NZ5/01885), Medical University of Lublin (PBsd250 granted to M. Sz.), and supported by Interdisciplinary Centre for Mathematical and Computational Modelling at the University of Warsaw.

Specjalizacja: hematologia

Tytuł:

Immunological changes in patients with chronic myeloid leukemia after imatinib discontinuation depend on the transcript type of e13a2 and e14a2

Autor:

Paulina Kwaśnik

Współauotrzy:

Paulina Kwaśnik¹, Michał Kiełbus¹, Joanna Zaleska¹, Dorota Link-Lenczowska², Magdalena Zawada², Hubert Wysogląd³, Bogdan Ochrem³, Grażyna Bober⁴, Ewa Wasilewska⁶, Iwona Hus⁶ ⁷, Monika Szarejko⁸, Witold Prejzner⁸, Olga Grzybowska-Izydorczyk⁹, Agnieszka Klonowska-Szymczyk⁹, Ewa Mędraś¹⁰, Tomasz Sacha¹¹ and Krzysztof Giannopoulos¹

Afiliacja:

1. Department of Experimental Hematooncology, Medical University of Lublin, 20-093 Lublin, Poland

2. Department of Hematology Diagnostics, Jagiellonian University Hospital in Kraków, 30-688 Kraków, Poland

3. Department of Hematology, Jagiellonian University Hospital in Kraków, 30-688 Kraków, Poland

4. Department of Hematooncology and Bone Marrow Transplantation, Medical University of Silesia, School of Medicine in Katowice, 40-032 Katowice, Poland

5. Department of Hematology, Medical University of Białystok, 15-276 Białystok, Poland

6. Department of Hematology, Institute of Hematology and Transfusion Medicine, 02-776 Warsaw, Poland

7. Department of Clinical Transplantology, Medical University of Lublin, 20-093 Lublin, Poland

8. Department of Hematology and Transplantology, Medical University of Gdańsk, 80-214 Gdańsk, Poland

9. Department of Hematology, Medical University of Łódź, 93-513 Łódź, Poland

10. Department of Hematology, Neoplastic Blood Disorders and Bone Marrow Transplantation in Wrocław, 50-367 Wrocław, Poland

11. Department of Hematology, Jagiellonian University Medical College in Kraków, 31-501 Kraków, Poland

Background

Treatment-free remission (TFR) is achieved in approximately half of chronic myeloid leukemia (CML) patients treated with tyrosine kinase inhibitors. The mechanisms responsible for TFR maintenance remain elusive. Immunological and molecular mechanisms responsible for the recurrence of the disease are being sought. Most relapses occur within 9 months after discontinuation of treatment. Our previous results show that changes in the percentages of immune populations are already noticeable in the 3rd month of TFR. Studies indicate that after imatinib, the e14a2 trans cript is associated with a faster and deeper molecular response, resulting in better TFR rates. This may suggest that the BCR::ABL1 trans cript type may influence the immune response. In this study, we attempted to describe changes in the immune system of CML patients in relation to changes in the amount and type of the BCR::ABL1 trans cript.

Methods

Our study included 63 CML patients after imatinib discontinuation, in whom comprehensive analysis of changes in the immune system was performed by flow cytometry, and changes in the BCR::ABL1 were assessed by RQ-PCR and ddPCR. The populations identified using specific markers for distinct cell types were subjected to Principal Component Analysis (PCA) to reduce the number of variables and to detect the relationship structure between analyzed features.

Results

The analysis of alterations in the immune system about the BCR::ABL1 trans cript type showed that the patients with e13a2 trans cript had significantly higher values of CD56dimCD16+PD-1+ cells (median 4.89 vs 3.12%, P = .005; FDR < .02) and CD19+PD-1+ cells (median 16.20 vs 10.48%, P = .04; FDR < .07) and a tendency for higher values of the percentage of CD8+PD-1+ cells (median 23.15 vs 14.91%, P = .08; FDR < .09) when compared to patients with e14a2 trans cript. PCA revealed distinct clustering of CML patients, pointing towards substantial heterogeneity within the examined population. The first two principal components (PC1 and PC2) contributed the most to this separation and explained 73.6% of the variability (50.6% and 23% respectively), suggesting that the variation in the expression profiles of the analyzed cell populations primarily drove the observed clustering. The highest percentage of contribution of variables to the first principal component (Dim-1 or PC1) was seen for NKT+PD-1+, CD4+PD-1+ and CD8+PD-1+, whereas the most important features for the second component (Dim-2 or PC2) were CD4+CD25+CD127dimFOXP3+ and pDC PD-1+. We found significant associations between obtained Cluster metrics (Cluster 1 and 2) and BCL::ABL1 trans cript type e13a2 or e14a2 (P = .0306, 95% CI: 1.01 to 18.54, OR: 4.12, Fisher test, N=48), showing that the relative frequency of e13a2 is lower in patients subgrouped into Cluster 2 in comparison to Cluster 1, whereas e14a2 trans cript was more common for Cluster 2 patients in comparison to Cluster 1.

Conclusions

Our results suggest that immunological changes may be related to the BCR::ABL1 trans cript type, which affects the trans cript amount and thus may determine disease relapse. Perhaps the better TFR rates in patients with the e14a2 trans cript are related to its greater immunogenicity, which enables the immune control of residual leukemic cells. It is necessary to investigate the biological mechanisms responsible for the differences in tyrosine kinase activity determined by different types of trans cript.

Wystąpienia plakatowe

Hematologia

Prezentacje plakatowe w czasie sesji: SESJA PLAKATOWA

Specjalizacja: hematologia

Tytuł:

Chimeric Antigen Receptor (CAR) T-cell therapy in the treatment of multiple myeloma – the optimization of CAR-T cell production process: a preliminary study

Autor: Anna Andrzejczak

Współautorzy:

Emilia Jaskuła¹ ², Anna Tomkiewicz¹, Andrzej Gamian¹, Jarosław Dybko², Jagoda Mierzejewska¹, Adam Maciejczyk², Lidia Karabon¹

Afiliacja:

1. Ludwik Hirszfeld Institute of Immunology and Experimental Therapy, Polish Academy of Sciences, Wroclaw, Poland

2. Lower Silesian Centre of Oncology, Pulmonology and Heamatology, Wrocław, Poland

BACKGROUND

Chimeric antigen receptor T-cell (CAR-T) therapy represents a groundbreaking approach in cancer treatment, particularly in the context of hematological malignancies such as multiple myeloma (MM), a type of blood cancer characterized by the abnormal growth of plasma cells in the bone marrow. CAR-T therapy uses genetically modified T cells that, armed with a chimeric antigen receptor, are able to bind antigens present on the surface of tumor cells and destroy them. It offers a promising treatment for patients in particular with relapsed or refractory multiple myeloma, providing a potentially curative option when other therapies have failed. In March 2021, the U.S. Food and Drug Administration (FDA) approved the first CAR T therapy for MM. In Poland, currently, only commercial CAR-T cell therapies are available through treatment programs in ALL, DLBCL, or MCL, with those intended for MM therapy accessible solely within clinical trials. Additionally, the Polish market faces a challenge due to the absence of “academic” CAR-T cell therapies. Therefore, in this abstract we introduce our initial preliminary results obtained from the project that aims to develop a pipeline for CAR-T cell production in Poland for MM treatment, enabling their use in clinical settings.

METHODS

PBMC cells were isolated from a leukopack using Ficoll Paque Plus. Subsequently, CD3-positive or CD4 and CD8-positive T cells were separated using microbeads.CD3 T cells or a mixture of CD4 and CD8 T cells were seeded into G-Rex plates in an animal-free medium supplemented with interleukins and activated with a CD3/CD28 antibody cocktail or beads. Next, 24 hours after activation, cells were transduced with lentivirus carrying a CAR-T construct (anti-BCMA h(41BB-CD3 ζ ) and expanded for the next 9 days. On day 10, cells were harvested and analyzed by flow cytometry.

RESULTS

During the 10-day culture period, CD3 T cells expanded 55-fold, while CD4/CD8 T cells expanded 80fold. Moreover, the viability of harvested CAR-T cells was above 90%. Flow cytometry analysis showed a higher proliferation rate of CD4+ T cells and a slower proliferation rate of CD8+ T cells. Thus, the ratio of CD4+ T cells to CD8+ T cells changed during the culture. Additionally, the number of CD45RO+ T cells increased during the culture. The efficiency of the transduction was achieved at 15-45%.

CONCLUSION

Our preliminary studies have shown that we can effectively transduce T cells using a lentivirus carrying CAR anti-BCMA construct, and significantly expand vital CAR-T cells using animal-free reagents and mediums.

Study supported by the ABM grant 2022/ABM/06/00004 “BECAME”

Specjalizacja: hematologia

Tytuł:

The assessment of immune response to anti-SARS-CoV-2-mRNA vaccine in patients with multiple myeloma

Autor:

Paweł Cech

Współautorzy:

Paweł Cech, Hubert Warda, Paulina Kwaśnik, Magdalena Paziewska, Katarzyna Skórka, Krzysztof Giannopoulos,

Afiliacja:

Department of Experimental Hematooncology, Medical University of Lublin, ul. Chodźki 1 (Collegium Universum), 20-093, Lublin, Poland

Introduction:

COVID-19 is an infectious disease characterized by a varied course that can range from mild to severe, especially for the patients with comorbidities such as obesity, cardiovascular disorders and cancers. Due to numerous abnormalities of the immune system, patients with multiple myeloma (MM) are at increased risk for infection and developing potentially life threatening symptoms, as well as generally having poorer responses to vaccines. The study assessed the immune response of patients with MM followed by anti-SARS-CoV-2- mRNA vaccination (BNT162b2 or mRNA-1273).

Patients and methods: Blood samples were collected from 27 MM patients from eight hematology departments in Poland and assessed in three time points, including before vaccination (baseline), 2-5 weeks after the second dose (short-term follow-up), and 12 weeks after vaccination (long-term follow-up). Immune response in patients was analyzed via flow cytometry, which assessed the changes in B cell, T-cell, NKT cell and NK cell subpopulations, including subpopulations that express PD1, in short-term and long-term observation compared to baseline.

Results:

Cytometric analysis shows a statistically significant lower percentage of B-cell population with PD1 expression in the short-term observation compared to baseline (median: 39.33 vs 52.89, P=.01), as well as a statistically significant higher percentage of CD56 dim CD16 + NK cell subpopulation in the short-term observation compared to baseline (median: 8.50 vs 5.37, P=.04). Our research revealed a significantly higher proportion of CD4 + cells in both short term (median: 35.62 vs 22.91, P=.02) and long-term (median: 44.69 vs 24.3, P=.02) follow-ups, along with a higher CD4 + /CD8 + ratio in the long-term observation (median: 1.98 vs 0.9, P=.02) for MM patients in ISS stage II/III compared to those in ISS I stage. Additionally, similar results were observed when considering the R-ISS (median: 1.97 vs 0.9, P=.05). Furthermore, MM patients in ISS stage II/III exhibited a lower percentage of CD4 + PD1 + cells in both short-term (median: 19.2 vs 37, P=.05) and long-term (median: 22.72 vs 44.65, P=.04) fol -

low-ups, along with a decreased percentage of CD19 + cells in long-term follow-up (median: 6.63 vs 10.7, P=.01), compared to those in ISS I stage. Our findings revealed a higher percentage of Treg cells (median: 8.62 vs 4.29, P=.03) and B-cells expressing PD1 (median: 61.79 vs 45.67, P=.02) in patients undergoing steroid therapy compared to those not receiving this treatment in the long-term follow-up. The analysis showed statistically significant correlations between the percentages of B cell, T-cell and NK cell populations and the age of patients in long-term follow-up. Notably, a moderate negative correlation was observed among the T-cell CD8 + PD1 + population (r=-0.55, P=.01) and the B-cell population (r=-0.51, P=.01), as well as a moderate positive correlation in CD56 bright CD16 - (r= 0.48, P=.02).

Conclusions

Our findings suggest that despite immune impairment, anti-COVID-19 mRNA vaccines are able to induce immune response in MM patients. Furthermore, the study results show that the administration of anti-COVID-19 vaccine influences the decrease of PD1 expressing B-cell percentage, as well as the increase of CD56 dim CD16 + NK cell percentage. Obtained data also implies that there are notable differences in patients’ immune responses dependent on the assigned ISS and R-ISS stage, as well as the administration of steroid agents.

Specjalizacja: hematologia

Tytuł:

Charakterystyka genetyczna populacji pacjentów z ostrą białaczką limfoblastyczną

B-komórkową typu B-other i identyfikacja nowych genów fuzyjnych

Autor:

Adrianna Cieloch

Współautorzy:

Aneta Manda-Handzlik, Anna Rams, Magdalena Wołowiec, Paweł Łaguna, Piotr Mrówka, Eliza Głodkowska-Mrówka

Afiliacja:

Warszawski Uniwersytet Medyczny

Zgodnie z piątą edycją klasyfikacji Światowej Organizacji Zdrowia (WHO), większość przypadków ostrej białaczki limfoblastycznej wywodzącej się z komórek prekursorowych limfocytów B (BCP-ALL, B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia) jest klasyfikowana na podstawie znanych zaburzeń genetycznych, które można wykryć za pomocą badania kariotypu, fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) oraz metod molekularnych. Pozostała grupa około 30% pacjentów z B-ALL stanowi genetycznie heterogenną populację, tzw. B-other, charakteryzującą się brakiem typowych aberracji chromosomowych definiujących poszczególne podtypy BCP-ALL.

Postępy w profilowaniu ekspresji genów i sekwencjonowaniu umożliwiły identyfikację licznych czynników genetycznych, które determinują różne cechy kliniczne i rokownicze, przyczyniając się do lepszego poznania podgrupy B-other ALL. Niemniej jednak, złożone mechanizmy leżące u podstaw tego fenotypu sprawiają, że standardowe badania molekularne i cytogenetyczne nie są wystarczające do postawienia diagnozy.

W celu oceny częstości występowania znanych podtypów ostrej białaczki limfoblastycznej, aberracji genetycznych oraz ich związku z wynikami leczenia, a także czynnikami klinicznymi i demograficznymi, przeprowadzono analizę danych dotyczących kohorty pacjentów pediatrycznych z podtypem B-other ALL leczonych w Klinice Pediatrii i Hematologii Dziecięcej Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego w latach 2017-2023.

Badaniem objęto 54 pacjentów pediatrycznych w wieku od 1 do 18 lat, u których zdiagnozowano ostrą białaczkę limfoblastyczną - B-other ALL po wykluczeniu znanych aberracji genetycznych, takich jak hipodiploidia, hiperdiploidia, ETV6-RUNX1, BCR-ABL1, TCF3-PBX1 i fuzje KMT2A. Wszystkie próbki zostały poddane panelowemu sekwencjonowaniu RNA przy użyciu zestawu FusionPlex Acute Lymphoblastic Leukemia (ArcherDx). Sekwencjonowanie próbek przeprowadzono na platformie Illumina MiSeq. Dane zostały analizowane za pomocą oprogramowania Archer Analysis w wersji 7.0 w celu identyfikacji fuzji, mutacji punktowych i poziomów ekspresji w 81 genach. Dane kliniczne zostały retrospektywnie uzyskane z dokumentacji medycznej.

W analizowanej kohorcie stwierdzono, 35% przypadków BCR-ABL1-podobnej ALL, 2% przypadków ETV6-RUNX-podobnej ALL, a 5,5% przypadków z rearanżacją PAX5 (1 fuzja, 2 mutacje). Mutacje aktywujące sygnalizację RAS/RAF-MAPK były obecne w 64% przypadków i występowały we wszystkich podtypach. Aberracje związane z klasą JAK-STAT występowały w 37% przypadków, a aberracje związane z klasą ABL występowały w 7,2% przypadków. Zidentyfikowano trzy nowe transkrypty fuzyjne. Dwie z tych zmian dotyczyły sygnalizacji cytokin/kinaz związanych z fenotypem BCR ABL1-podobnym (TCOF3/PDGFRB i CD74/PDGFRB), natomiast jedna zmiana dotyczyła mechanizmów naprawy DNA (SSBP2/CHD1). Stwierdzono, że nowe aberracje były powiązane z niekorzystnym rokowaniem. Ponadto, u jednego pacjenta wykryto fuzję HOOK3/FGFR1, która wcześniej była opisana w innych nowotworach hematologicznych, ale nie w przypadku ostrej białaczki limfoblastycznej.

Nasze badanie prezentuje częstości występowania nowych podtypów ALL na poziomie populacyjnym, uwzględniające zarówno powtarzalne, jak i nowe aberracje genetyczne. Te wyniki poszerzają naszą wiedzę na temat zależności między aberracjami molekularnymi a przebiegiem klinicznym choroby i dostarczają wskazówek dotyczących optymalizacji diagnostyki.

Specjalizacja: hematologia

Tytuł:

Analiza trendów w częstości kolonizacji szczepami bakterii wielolekoopornych chorych poddanych transplantacji autologicznych komórek krwiotwórczych w latach 2018-2023 wraz z oceną wpływu kolonizacji na powikłania potransplantacyjne

Autor:

Magdalena Karasek

Współautorzy:

Maciej Majcherek, Agnieszka Szeremet, Bartłomiej Kuszczak, Krzysztof Przeorski, Agata Lewczuk, Tomasz Wróbel, Anna Czyż

Afiliacja:

Uniwersytet Medyczny im. Piastów Śląskich we Wrocławiu

Wstęp:

Powikłania infekcyjne dotyczą większości pacjentów poddawanych autologicznemu przeszczepieniu krwiotwórczych komórek macierzystych (autoHSCT), przede wszystkim z uwagi na stosowane kondycjonowanie mieloablacyjne skutkujące okresową ciężką neutropenią. Z tego względu infekcje wywołane przez szczepy bakterii wielolekoopornych (MDRB) stanowią istotne zagrożenie dla pacjentów w okresie po przeszczepieniu.

Cel:

Ocena wpływu kolonizacji MDRB pacjentów ze szpiczakiem plazmocytowym (PCM) i chłoniakami na wyniki autoHSCT.

Materiał i metody: Zgromadzono dane kliniczne wszystkich kolejnych pacjentów z PCM i chłoniakami poddanych autoHSCT w latach 2018-2023, u których bezpośrednio przed transplantacją wykonano badania mikrobiologiczne w celu wykrycia kolonizacji MDRB. Do badań mikrobiologicznych pobierano kał (lub wymaz z odbytu), mocz i wymaz z gardła zgodnie ze standardowymi procedurami obowiązującymi w ośrodku.

Wyniki:

Do analizy włączono 339 chorych poddanych autoHSCT z powodu szpiczaka plazmocytowego (n=238) lub chłoniaka (n=101). Kolonizację przynajmniej jednym szczepem bakterii MDR stwierdzono u 50% chorych, w tym MDRB G(+) u 30%, a G(-) u kolejnych 30% z nich. Analiza częstości występowania kolonizacji MDRB w odniesieniu do okresu, w którym przeprowadzana była transplantacja wykazała znamiennie niższy odsetek kolonizacji u chorych przeszczepianych w roku 2023 w porównaniu z chorymi przeszczepionymi we wcześniejszych latach (32,74% vs 67,26%, p=0,00018), co wynikało z mniejszego odsetka chorych skolonizowanych MDRB G(+) (29,8% vs 63,64%, p=0,0088). Dodatkowo w roku 2023 stwierdzono 4 przypadki kolonizacji szczepami bakterii K. pneumoniae z mecha -

nizmem oporności typu NDM, których wcześniej nie stwierdzano u chorych poddawanych autoHSCT (4,17% vs 0%, p=0,0039). Analiza częstości kolonizacji w odniesieniu do rozpoznania, wykazał znamiennie częstszą kolonizację chorych na PCM w porównaniu z chorymi na chłoniaki (73,5% vs 26,65% p=0,04375). W grupie chorych na PCM nie stwierdzono jednak związku między kolonizacją MDRB a częstością występowania FN, ciężkich powikłań infekcyjnych, w tym zakażenia krwi. Natomiast w grupie chorych na chłoniaki wykazano związek między kolonizacją MDRB przed transplantacją a wystąpieniem zakażenia łożyska naczyniowego (30% vs 10,4%, p=0,029) oraz ciężkich powikłań infekcyjnych ogółem (65,% vs 43,37%, p=0,002). W całej badanej grupie 339 chorych tylko jeden chory zmarł z przyczyny nie związanej z progresją/nawrotem choroby, stąd analiza wpływu kolonizacji MDRB przed transplantacją na śmiertelność związaną z transplantacją nie była zasadna.

Wnioski:

Kolonizacja MDRB u pacjentów z chłoniakiem przed autoHSCT wykazuje istotny związek z poważnymi powikłaniami infekcyjnymi po przeszczepieniu, w tym z bezpośrednio zagrażającą życiu bakteremią. Natomiast u pacjentów z PCM, mimo częstszej kolonizacji MDRB, nie wykazano jej wpływu na ciężkie powikłania infekcyjne po przeszczepie. Ponadto, mimo istotnie niższego odsetka kolonizacji MRDB w ostatnim roku analizy, po raz pierwszy odnotowano kolonizacje niezwykle wieloopornymi szczepami bakterii K. pneumoniae NDM. Obrazuje to problem znacznego narastania oporności bakterii przeciw znanym antybiotykom, o czym alarmują epidemiolodzy. Ostatecznie wskazuje to na kolejne wyzwania w profilaktyce infekcyjnej u pacjentów poddawanych procedurze transplantacji. Tym bardziej zasadnym staje się tworzenie regularnych raportów epidemiologicznych oraz w oparciu o nie modyfikowanie protokołów profilaktycznej oraz empirycznej antybiotykoterapii u pacjentów poddawanych autoHSCT.

Specjalizacja: hematologia

Tytuł:

Impact of infections in relapsed/refractory multiple myeloma patients receiving daratumumabbased therapies

Autor:

Marcin Kędzior

Współautorzy:

Grzegorz Mirocha; Magdalena Pawlak; Żaneta Witas; Łukasz Woźniak; Damian Mikulski M.D.; Professor Joanna Góra-Tybor M.D., Ph.D.

Afiliacja:

Oddział Hematoonkologii, Wojewódzkie Wielospecjalistyczne Centrum Onkologii i Traumatologii im. M. Kopernika w Łodzi

Introduction:

Daratumumab is the first monoclonal antibody used to treat multiple myeloma (MM). It provides new therapeutic options for patients at different stages of the disease and can be used either in combination with other drugs or as monotherapy. However, numerous reports have linked daratumumab use to infection susceptibility due to impaired cellular responses. Real-life data on infectious complications in patients treated with daratumumab remain limited.

Patients and methods: This retrospective, real-life study included MM patients treated with daratumumab-based regimens according to the Ministry of Health’s drug reimbursement program for MM patients (B.54) and Emergency access to medicines (RDTL) between July 2019 and December 2023. Infectious events were evaluated using the Common Terminology Criteria for Adverse Events (CTCAE) version 5.0. Treatment responses and occurrence of relapse/progression were categorized following the guidelines of the International Myeloma Working Group (IMWG).

Results:

The study group comprised 76 patients with a median age of 67 years (interquartile range, IQR: 60.572.0). The majority of patients (65.8%) received treatment with daratumumab, bortezomib, and dexamethasone (DVD), followed by daratumumab, lenalidomide, and dexamethasone (DRD, 28.9%), and daratumumab monotherapy (5.3%). In total, 30 patients (39.5%) experienced infectious complications during daratumumab-based treatment, with five patients (6.6%) encountering more than one infectious event. Respiratory tract infections were the most common (46.7%). Most infectious complications were assessed as grade 1 and 2 according to the CTCAE - 5 and 11 cases, respectively. Thirteen patients (17.1%) required hospitalization (grade ≥3 event) due to infectious complications, and four patients died as a result. Importantly, grade ≥3 infection occurrence was an independent factor (hazard ratio, HR 5.1, 95%CI: 1.1-23.6, p=0.0380) related to inferior progression-free survival in multivariate Cox regression analysis adjusted for age, International Staging System (ISS), sex, administered regimen, Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG) scale, and achieved response to treatment.

Among clinical parameters at the treatment initiation, patients who subsequently developed grade ≥3 infectious complications had lower baseline hemoglobin (Hgb) level (8.9 vs 11.5 g/dl, p=0.0002), lower platelets (110.2 vs 189.1 × 10^9/L, p=0.0010), higher Red Cell Distribution Width (RDW-SD) (57.0 vs 50.0 fl, p=0.0424) and higher aspartate transferase (AST) level (41.8 vs 22.7 U/L, p=0.0042). Finally, a multivariate logistic regression model was developed to identify high-risk patients. This model incorporated two variables: ECOG ≥2 (odds ratio, OR 7.0, 95%CI: 1.4-36.1, p=0.02) and Hgb level (OR 0.6, 95%CI: 0.4-0.9, p=0.006). Following 10-fold cross-validation, the model achieved an area under the curve (AUC) of 0.80, with sensitivity and specificity rates of 75.0% and 80.0%, respectively.

Conclusions:

Infectious complications are common among patients treated with daratumumab-based regimens and are associated with inferior treatment outcomes. Basic clinical and laboratory assessments can be valuable in identifying patients vulnerable to infections, facilitating personalized prophylactic strategies.

Specjalizacja: hematologia

Tytuł:

The influence of DNA methylation on the development of multiple myeloma

Autor:

Karolina Łuczkowska

Współautorzy:

Karolina Łuczkowska, Martyna Górska, Piotr Kulig, Iga Stukan, Bartłomiej Baumert, Patrycja Stodolak, Alina Jurewicz, Andrzej Bohatyrewicz, Edyta Paczkowska and Bogusław Machaliński

Afiliacja:

1. Department of General Pathology, Pomeranian Medical University, Szczecin, Poland

2. Department of Hematology and Transplantology, Pomeranian Medical University, Szczecin, Poland

3. Department of Orthopedics, Traumatology and Oncology of the Musculoskeletal System, Pomeranian Medical University, Szczecin, Poland

4. The Department of Specialized Nursing and Emergency Medical Care, Pomeranian Medical University, Szczecin, Poland

5. Pharmaceutical Facility of Pomeranian Medical University, Szczecin, Poland

Background:

Multiple myeloma (MM) is a type of monoclonal plasma cell neoplasia. It is characterized by bone marrow infiltration or solitary tumor formation by terminally differentiated plasma cells, the toxicity of which results from direct harmful effects and excessive excretion of monoclonal immunoglobulins and cytokines. Myelomagenesis begins with potentially premalignant and asymptomatic monoclonal gammopathy of undetermined significance (MGUS), which progresses to smoldering myeloma and ultimately symptomatic MM. Malignant transformation is a complex process, requiring both genetic and environmental transformation. The risk of development to the symptomatic stage of myeloma depends on the concentration of monoclonal protein, the number of plasma cells in the bone marrow, the ratio of free immunoglobulin light chains, and the presence of immunoparesis. Emerging evidence seems to point out the crucial importance of epigenetic alternations in the development of malignancy. Methylation changes occur during normal B cell maturation, such as gradual loss of non-CpG methylation and progression-related changes in CpG methylation. DNA methylation influences gene expression patterns and overall genome stability.

Methods and Results:

In this study, we presented the possible influence of DNA methylation processes on the pathogenesis of multiple myeloma in patients with MGUS, MM and healthy control patients using InfiniumMethylationEPIC and we confirmed the expression level of selected genes using the qRT-PCR method. We have shown that global DNA methylation levels gradually decrease during the transformation of healthy cells into MM. Two genes have been identified ( PHOX2 and CDH2) which, according to the

available literature, are significantly involved in the development of cancer and thus may potentially also have a significant impact on the development of myeloma. Within them, a decrease in methylation was demonstrated in patients with MM vs. MGUS ( PHOX2 0.1±0.06 vs. 0.5±0.16; CDH2 0.12±0.1 vs. 0.49±0.17), while increasing their expression at the mRNA level ( PHOX2 7.34±3.66 vs. 0.51±0.07; CDH2 53.92±26.9 vs. 0.69±0.01). Additionally, bioanalysis showed an increase in the methylation of one suppressor gene, HTATIP2, with a simultaneous decrease in its expression in patients with MM vs. MGUS (beta value 0.57±0.12 vs. 0.25±0.16; level of expression 15.08±10.34 vs. 69.57±3.47).

Conclusion:

Overall, our study confirmed that the development of MM is associated with a global loss of methylation. In patients with MM, a significant decrease in methylation of the PHOX2 and CDH2 genes was detected with a simultaneous increase in their expression at the mRNA level. It is widely known that the above relationship promotes carcinogenesis and correlates with poor prognosis, shortened survival time and increased frequency of metastases. At the same time, a significant increase in methylation of the HTATIP2 suppressor gene was demonstrated, with a simultaneous decrease in its expression in MM patients compared to MGUS. To sum up, the conducted global analysis of DNA methylation levels provided a lot of interesting information that can be used in the future to develop new treatment regimens and isolate a biomarker of disease progression. This will enable faster diagnosis and selection of the individual, most effective treatment method.

Funding:

This research was founded by the Minister of Science and Higher Education under the name “Regional Initiative of Excellence” in 2019–2022, project number 002/RID/2018/19.

Specjalizacja: hematologia

Tytuł:

Altered Firmicutes/Bacteroidota ratio is associated with outcome in chronic lymphocytic leukemia

Autor:

Magdalena Paziewska

Współautorzy:

Monika Szelest, Michał Kiełbus, Marta Masternak, Joanna Zaleska, Ewa Wawrzyniak, Aleksandra Kotkowska, Monika Siemieniuk-Ryś, Marta Morawska, Elżbieta Kalicińska, Paula Jabłonowska, Tomasz Wróbel, Anna Wolska-Washer, Jerzy Zdzisław Błoński, Tadeusz Robak, Lars Bullinger, Krzysztof Giannopoulos

Afiliacja:

Department of Experimental Hematooncology, Medical University of Lublin, Poland

Background:

The balance between Firmicutes and Bacteroidota , two major phyla in the gut microbiota, is increasingly recognized as a pivotal factor in human health and plays a critical role in modulating immune responses within the gut. Alterations in the Firmicutes/Bacteroidetes (F/B) ratio have been associated with various diseases, such as obesity, inflammatory bowel disease, and metabolic disorders. Recent studies have demonstrated significant changes in the intestinal microbiota in patients with hematological malignancies, including chronic lymphocytic leukemia (CLL). The imbalance of microbiota composition might be implicated in leukemogenesis through sustained inflammation and/or the secretion of metabolites. Moreover, intestinal dysbiosis disrupts the balance between cell proliferation and apoptosis and might induce unwanted innate and adaptive immune processes.

Aims:

As it has been reported that immunologic and inflammatory factors may contribute to the pathogenesis of CLL, and considering the known role of the human microbiome in cancer development, the aim of this study was to investigate gut microbiome structure of CLL patients.

Methods:

The study included 75 newly diagnosed and untreated CLL patients and 21 age- and BMI-matched healthy volunteers (HVs). The microbiota composition of stool samples from these donors was determined by 16S rRNA next-generation sequencing. The DADA2 tool was used to classify sequences into appropriate taxonomic groups. Then, the differences in taxonomic profiles of stool samples between CLL patients and HVs, as well as among CLL patients with distinct prognostic features were investigated using the Wilcoxon or Kruskall-Wallis tests.

Results:

The value of log F/B ratio was significantly higher in fecal samples collected from CLL patients compared to HVs (0.62 vs 0.22, p=0.017). Moreover, there was a significant increase in log F/B ratio in CLL patients with stage Binet B and stage Binet C compared to stage Binet A (p=0.012, and p=0.038, respectively). Furthermore, a tendency to a higher log F/B ratio was found in CLL patients with CD38+ in comparison to CD38- cases (p=0.062), and in CLL patients with unmutated IGHV compared to mutated IGHV (p=0.08). Although no significant correlation was found between the log F/B ratio and the numbers of WBC, lymphocytes, neutrophils, platelets, LDH, and ?-2 microglobulin levels, a weak negative correlation was observed between the log F/B ratio and hemoglobin level (R=-0.26, p=0.026), hematocrit value (R=-0.25, p=0.035), and RBC count (R=-0.24, p=0.0507).

Interestingly, in the univariate Cox regression analysis model, an intestinal log F/B ratio of less than -0.39 (calculated using maximally selected rank statistics), corresponding to the 17th percentile, was found to be a significant predictor of longer TTFT in CLL patients (HR 5.20, 95% CI 1.25-21.72, p=0.024). However, the multivariate analysis including established risk factors (stage Binet, IGHV mutation status, CD38 expression, del11q, isolated del13q) showed that fecal log F/B ratio had no impact on TTFT (HR 1.16, 95% CI 0.12-10.93, p=0.9).

Conclusions:

Gut microbiome of CLL patients show specific alterations in comparison to a healthy microbiome and its structure is associated with distinct prognostic features in CLL. Firmicutes/Bacteroidota (F/B) ratio might modulate survival of CLL patients.

This study was funded by a grant from the Polish National Science Centre (NCN 2018/29/B/ NZ5/02706) and a grant from the Medical University of Lublin DS 462.

Specjalizacja: hematologia

Tytuł:

Evaluation of clinical utility of the NGS method in detection of molecular and cytogenetic risk factors in chronic lymphocytic leukemia

Autor:

Marzena Wojtaszewska (wojtaszewska@gmail.com)

Współautorzy:

Wojtaszewska M¹, Szarawarska M¹, Lulek Sz², Skoczylas T¹, Markiewicz M¹ ²

Afiliacja:

1. Departament of Hematology University Hospital in Rzeszow

2. Departament of Hematology University of Rzeszow

Introduction:

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is the most prevalent hematological malignancy of adults. It is characterized by clonal expansion of mature lymphocytes, bearing various cytogenetic or genetic alterations. These lesions have either prognostic significance or may predict resistance to novel anti BCL-2 and anti-BTK agents. There are currently several different methods to detect these genetic lesions, either by cytogenetic (FISH) or molecular means (Sanger Sequencing, qPCR, NGS). The aim of the study was to compare the traditional cytogenetic and molecular diagnostic tests with the novel all-in-one NGS panel that may detect both mutations and cytogenetic aberrations present in CLL.

Materials and methods:

The study was conducted on retrospective samples from 24 patients with CLL , used previously for routine molecular and cytogenetic diagnostics in the Department of Hematology of University Hospital in Rzeszow. The samples were sequenced with an enrichment NGS panel “Sureseq CLL+CNV V3” by OGT (Sysmex). The CNV, SNV and In-Del variants detected by the panel were compared with the results of diagnostic tests routinely performed in the clinic with FISH (del11q, trisomy 12, del13q, del17p, del6q) and nextera NGS sequencing (mutations of TP53 and SF3B1 ). The study was co-financed from the programme „Studenckie Koła Naukowe tworzą innowacje” by Polish Ministry of Education and Science.

Results:

In our cohort we have achieved 100% concordance in terms of mutation detection, including low level >3% VAF mutations. In terms of cytogenetics, after detailed inspection, 98% of aberrations (39/40) have been described correctly by CNV analysis at the level of >20%. In addition, additional mutations were discovered, which may bear prognostic and predictive meaning.

Conclusions:

Next generation sequencing utilizing hybrid-capture enrichment is a robust, reliable method for detection of a wide range of cytogenetic and molecular alterations in CLL. The superiority of the methods lies in its ability of fast and accurate detection of a vast array of mutations involved in progression of the disease and resistance to novel agents targeting BCL2 or BTK signalling.

Specjalizacja: hematologia

Tytuł:

Zakażenia grzybicze u pacjentów pediatrycznych z ALL w oddziałach hematoonkologicznych w Polsce

Autor:

Joanna Zawitkowska

Współautorzy:

Joanna Zawitkowska1 , Katarzyna Drabko1 , Krzysztof Czyżewski 2 , Oliwia Grochowska 2 , Kamila Jaremek 2 , Patrycja Zalas-Więcek 3 , Paweł Łaguna 4 , Anna Szmydki-Baran 4 , Łukasz Hutnik4 , Aleksandra Minkowska4 , Katarzyna Pikora 4 , Walentyna Balwierz 5 , Szymon Skoczeń 5 , Katarzyna

Pawińska-Wąsikowska 5 , Wojciech Czogała 5 , Krzysztof Kałwak 6 , Małgorzata SalamonowiczBodzioch 6 , Renata Tomaszewska7, Agnieszka Książek7, Tomasz Szczepański 7, Katarzyna Derwich 8 , Marcin Płonowski 9 , Maryna Krawczuk-Rybak 9 , Aleksandra Królak 10 , Tomasz Ociepa10 , Tomasz Urasiński10 , Wojciech Młynarski11 , Filip Pierlejewski11 , Małgorzata Nowak 11 , Maciej Zdunek 11 , Ninela Irga-Jaworska12 , Ewa Bień12 , Agnieszka Mizia-Malarz 13 , Weronika Stolpa13 , Karolina Baranowska13 , Wanda Badowska14 , Tomasz Brzeski14 , Katarzyna Mycko14 , Grażyna Karolczyk 15 , Agnieszka UrbanekDądela15 , Radosław Chaber 16 , Wioletta Bal16 , Katarzyna Machnik 17, Sonia Pająk 17, Stefania Krawczyk 17 , Jan Styczyński 2 , Olga Zając-Spychała 8

Afiliacja:

1. Klinika Hematologii, Onkologii i Transplantologii Dziecięcej, Uniwersytet Medyczny, Lublin

2. Katedra Pediatrii, Hematologii i Onkologii, Collegium Medicum, Uniwersytet Mikołaja Kopernika, Bydgoszcz

3. Katedra i Zakład Mikrobiologii, Collegium Medicum, Uniwersytet Mikołaja Kopernika, Bydgoszcz

4. Katedra i Klinika Onkologii, Hematologii Dziecięcej, Transplantologii Klinicznej i Pediatrii Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego, Warszawa

5. Katedra i Klinika Onkologii i Hematologii Dziecięcej, Uniwersytecki Szpital Dziecięcy Collegium Medicum, Uniwersytet Jagielloński, Kraków

6. Katedra i Klinika Transplantacji Szpiku, Onkologii i Hematologii Dziecięcej, Uniwersytet Medyczny, Wrocław

7. Katedra i Klinika Pediatrii, Hematologii i Onkologii Dziecięcej, Śląski Uniwersytet Medyczny, Zabrze

8. Klinika Onkologii, Hematologii i Transplantologii Pediatrycznej, Uniwersytet Medyczny, Poznań

9. Klinika Onkologii Dziecięcej, Uniwersytet Medyczny, Białystok

10. Klinika Pediatrii, Hemato-Onkologii i Gastroenterologii Dziecięcej, Szczecin

11. Klinika Pediatrii, Onkologii, Hematologii i Diabetologii, Uniwersytet Medyczny, Łódź

12. Katedra i Klinika Pediatrii, Hematologii i Onkologii, Uniwersytet Medyczny, Gdańsk

13. Oddział Onkologii, Hematologii i Chemioterapii, Klinika Pediatrii, Śląski Uniwersytet Medyczny, Katowice

14. Kliniczny Oddział Onkologii i Hematologii Dziecięcej, Katedra Pediatrii Klinicznej UWM Collegium Medicum Uniwersytetu Warmińsko-Mazurskiego w Olsztynie, Wojewódzki Specjalistyczny Szpital Dziecięcy, Olsztyn

15. Oddział Onkologii i Hematologii Dziecięcej, II Klinika Pediatrii, Świętokrzyskie Centrum Pediatrii, Wojewódzki Specjalistyczny Szpital Dziecięcy, Kielce

16. Klinika Onkohematologii Dziecięcej, Wydział Medyczny Uniwersytet Rzeszowski, Kliniczny Szpital Wojewódzki Nr 2, Rzeszów

17. Oddział Hematologii i Onkologii Dziecięcej, Chorzowskie Centrum Pediatrii i Onkologii im. dr E. Hankego, Chorzów

Wstęp:

Wprowadzenie nowych metod diagnostycznych i zastosowanie skutecznych protokołów terapeutycznych poprawiło wyniki leczenia pacjentów z ostrą białaczką limfoblastyczną (ALL) u dzieci. Obecnie całkowite przeżycie dzieci z ALL przekracza 90%. Jednak nadal głównym problemem są powikłania infekcyjne związane z leczeniem przeciwnowotworowym. Z doniesień literaturowych wynika, że śmiertelność związana z infekcjami (IRM) u pacjentów z ALL stanowi 30% zgonów i 64% śmiertelności związanej z leczeniem. Około 20% zgonów jest spowodowana infekcjami grzybiczymi.

Cel:

Analiza zachorowalności, profilu zakażeń grzybiczych oraz śmiertelności u dzieci z ALL leczonych w ośrodkach hematologii dziecięcej w Polsce w latach 2022-2023 oraz porównanie częstości występowania i wskaźnika śmiertelności infekcji grzybiczych do lat 2020-2021. Materiał i metody. Badaną grupę stanowiło 543 pacjentów z ALL, w wieku od 1 do 18 r.ż., którzy byli leczeni w latach 2022-2023. Analizę przeprowadzono w programie statystycznym Epi Info™ (2022), α = 0,05.

Wyniki:

Zakażenia grzybicze występowały u 138/370 (37%) pacjentów, w tym potwierdzone u 19, prawdopodobne u 35, możliwe u 84 pts. Zdiagnozowanych było 156 epizodów infekcyjnych (1 epizod – 140 pts, > 1 epizod 16 pts). Wśród infekcji potwierdzonych najczęstszym patogen były grzyby Candida spp. Dwójka dzieci (1.2%) zmarła z powodu infekcji grzybiczej (aspergiloza ośrodkowego układy nerwowego, mukormykoza płucna). Częstość zakażeń grzybiczych u dzieci z ALL była wyższa w latach 20222023 w porównaniu do 2020-2021 i była to różnica istotnie istotna statystycznie (OR 0.46; p < 0.0001). Wskaźnik śmiertelności z powodu infekcji grzybiczej wynosił 5.1% (5/99 dzieci zmarło) w okresie 2020-2021, natomiast 1.2% w 2022-2023.

Wnioski:

Z powyższej analizy wynika, że w ostatnich dwóch latach zwiększyła się częstość zakażeń grzybiczych u dzieci z ALL. Liczba zgonów z powodu infekcji grzybiczej zmniejszyła się, co może świadczyć o poprawie diagnostyki i szybkiego wdrożenia przeciwgrzybiczego. Na podstawie naszych doświadczeń i doniesień literaturowych kierunki działania powinny obejmować poprawę profilaktyki, skrócić czas hospitalizacji oraz edukować rodziców i personel medyczny o powikłaniach (głównie infekcjach) podczas terapii przeciwnowotworowej.

Specjalizacja: hematologia

Tytuł: Mutacje PIM1 zwiększają potencjał migracyjny komórek DLBCL

Autor:

Aleksandra Żołyniak

Współautorzy:

Dorota Komar, Sonia Dębek, Filip Garbicz, Michał Pawlak, Przemysław Juszczyński

Afiliacja: Zakład Hematologii Eksperymentalnej, Instytut Hematologii i Transfuzjologii w Warszawie

Kinaza PIM1 jest protoonkogenem ulegającym ekspresji w nowotworach limfoidalnych. Reguluje kluczowe dla komórki nowotworowej procesy, takie jak proliferacja, apoptoza, metabolizm i migracja. W DLBCL gen PIM1 jest celem hipermutacji somatycznej i jest jednym z najczęściej zmutowanych genów u pacjentów z DLBCL. Mutacje PIM1 są częstsze w podtypach ABC i często współwystępują z mutacjami w MYD88 i CD79B. Analizy dostępnych danych klinicznych pokazują, że najbardziej znaczące różnice pomiędzy grupami pacjentów z DLBCL z mutacjami PIM1 lub bez tych mutacji dotyczą ogólnej liczby mutacji w komórkach nowotworowych, wieku w chwili rozpoznania oraz pozawęzłowej lokalizacji nowotworu, najczęściej dotyczącej jądra. Wiadomo również, że mutacje PIM1, MYD88 i CD79B są bardzo rozpowszechnione w pierwotnych pozawęzłowych chłoniakach z komórek B, zlokalizowanych w ośrodkowym układzie nerwowym (PCNSL), jądrach (PTL) lub przestrzeni wewnątrznaczyniowej (IVLBCL). Celem przeprowadzonych badań była ocena roli najczęstszych mutacji punktowych PIM1 w biologii i patogenezie komórek DLBCL.

Linię komórkową HBL-1 wybrano jako model podtypu ABC-DLBCL z mutacją MYD88 L265P. Knock-out genu PIM1 przeprowadzono metodą CRISPR/Cas9. Sekwencje PIM1 typu dzikiego, nieaktywną formę kinazy PIM1K67M i 4 najczęstsze mutanty (PIM1G28D, PIM1P81L, PIM1S97N, PIM1P125A) wprowadzono do komórek HBL-1 PIM1 KO przy użyciu wektorów retrowirusowych.

Mutacje PIM1 nie wpływały na proliferację komórek DLBCL i nie zwiększały oporności na doksorubicynę, co wyklucza szybkość proliferacji lub oporność na chemioterapię jako przyczyny złego rokowania pacjentów związanego z mutacjami PIM1. Analiza RNA-seq HBL-1-PIM1-MUT versus HBL-1-PIM1WT wykazała w przypadku mutantów najwyższy wzrost regulacji szlaków związanych z sygnalizacją interferonu gamma, IL-15, STAT3, cMET i semaforynami (zaangażowanymi w proliferację, dynamikę aktyny i migrację komórek nowotworowych). Zauważono również, że mutanty PIM1 powszechnie wykazują nadekspresję onkogenu cMET. Co więcej, analiza GSEA wykazała, że komórki z mutacją PIM1 wykazują cechy związane ze zmienioną polimeryzacją aktyny, GTPazami RHO i dynamiką błony komórkowej, co sugeruje zwiększony potencjał migracyjny komórek i ich skłonność do rozprzestrzeniania się do miejsc pozawęzłowych. Ekspresję powierzchniową cMET w komórkach z mutacją PIM1 potwierdzono za pomocą analizy FACS. Ponieważ cMET i CXCR4 współpracują w sygnalizacji migracji

komórki i aktywują ścieżkę AKT/mTOR, oceniliśmy, czy zmutowane komórki PIM1 będą wykazywały zwiększoną fosforylację AKT. Zgodnie z tą hipotezą zaobserwowaliśmy wyższy poziom fosforylacji AKT i ERK1/2 w komórkach z mutacjami PIM1 niż w komórkach PIM1 WT. Zwiększony potencjał migracyjny komórek z mutacjami PIM1 został potwierdzony w testach migracyjnych w gradiencie FBS.

Podsumowując, badania te wskazują, że mutanty PIM1 prawdopodobnie nie są powiązane ze zróżnicowaną odpowiedzią na lek, ale raczej ułatwiają rozprzestrzenianie się nowotworu i wpływają na komunikację ze środowiskiem zewnętrznym, co może być przyczyną gorszego rokowania pacjentów z DLBCL z mutacjami PIM1.

Specjalizacja: hematologia

Tytuł:

Badanie stężenia VEGFA, VEGFB, VEGFC i FEGF121 oraz IgA, IgM i IgG i ich korelacji z zaawansowaniem i przebiegiem leczenia wśród chorych na szpiczaka plazmocytowego (MM)

Autor:

Martyna Bednarczyk

Współautorzy:

Dariusz Łętowski, Nicola Szeja

Afiliacja:

Oddział Kliniczny Hematologii i Profilaktyki Chorób Nowotworowych, Wydział Zdrowia Publicznego w Bytomiu, Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach

Szpiczak mnogi (MM) jest heterogenną chorobą charakteryzującą się klonalną proliferacją komórek plazmatycznych wytwarzających immunoglobuliny. Stanowi 1% wszystkich nowotworów i 10% wszystkich nowotworów układu krwiotwórczego. Preferowanym schematem leczenia MM jest schemat VAD (winkrystyna, doksorubicyna, deksametazon), którego skuteczność wyleczenia waha się od 50% do 70%. Naukowcy zaobserwowali znaczny wzrost gęstości mikronaczyń (MVD) u pacjentów chorujących na MM, co było silnie skorelowane z proliferacją komórek szpiczaka. Kolejne badania wykazały, że czynnik wzrostu śródbłonka naczyń (VEGF) w surowicy jest podwyższony u pacjentów z MM i ulega nadekspresji w liniach komórkowych MM. Niski poziom VEGF w surowicy jest skorelowany z leczniczym efektem terapii, podczas gdy wysoki poziom VEGF w surowicy jest głównym czynnikiem prognostycznym złego rokowania u pacjentów ze MM. Występowanie, rozwój, inwazja i przerzuty raka opierają się na tworzeniu nowych sieci naczyń krwionośnych nowotworu, co silnie sugeruje, że VEGF w surowicy wpływa na rozwój i rokowanie MM poprzez angiogenezę szpiku kostnego. Ponadto, MM to nowotwór, w którym występuje większe prawdopodobieństwo wystąpienia hipogammaglobulinemii.

Celem niniejszego badania jest ocena stężenia VEGFA, VEGFB, VEGFC i FEGF121 oraz IgA, IgM i IgG u dorosłych chorych na MM. Ponadto kolejnym celem jest analiza dowodów na redukcję VEGF jako mechanizmu skuteczności leczenia MM. Do badania łącznie zrekrutowano 60 chorych w latach 2016-2019. Materiał do badań stanowiła krew żylna pobrana od pacjentów. Wszyscy pacjenci uzyskali odpowiedź na leczenie.

Stężenie VEGFA, VEGFB, VEGFC i FEGF121 oraz IgA, IgM i IgG oceniano metodą immunoenzymatyczną ELISA przed rozpoczęciem leczenia chemioterapeutycznego oraz po leczeniu pierwszoliniowym w czasie oceny efektu leczenia. Ocenę statystyczną wykonano przy użyciu Programu Statistica, wykorzystując test kolejności par Wilcoxona.

Analizując wyniki VEGF, zaobserwowano różnice istotne tylko w przypadku VEGFA, gdzie nastąpił spadek wartości po zastosowaniu leczenia (p=0.0117). W przypadku immunoglobulin obserwuje się istotny statystycznie spadek stężenia w przypadku IgA (p<.0001) oraz IgG (<.0001).

Podsumowując, chemioterapia stosowana w szpiczaku plazmocytowym wpływa istotnie na zmiany

stężenia VEGF oraz immunoglobulin po uzyskaniu odpowiedzi na leczenie. Potwierdzono wcześniejsze obserwacje, że monitorowanie tych parametrów może być użyteczne dla obecny efektu leczenia w tej grupie chorych.

Specjalizacja: hematologia

Tytuł: Jedna na… sto tysięcy

Autor:

Karol Bigosiński

Współautorzy:

Karol Bigosiński, Maciej Dubaj, Aneta Szudy-Szczyrek, Adrian Juda, Anna Kokoc, Olga Czabak, Marek Hus

Afiliacja:

Klinika Hematoonkologii i Transplantacji Szpiku, Uniwersytecki Szpital Kliniczny nr 1 w Lublinie

Wstęp

Ostra porfiria przerywana (AIP) jest bardzo rzadką chorobą metaboliczną spowodowaną niedoborem syntazy hydroksymetylobilanu (HMBS), czego skutkiem jest nadmierne gromadzenie się w organizmie prekursorów hemu, tj. porfobilinogenu (PBG) i kwasu δ -aminolewulinowego (ALA). W Polsce rozpoznawana jest z częstością 1,5/100 000 osób, dwukrotnie częściej dotyczy kobiet niż mężczyzn. Obraz kliniczny obejmuje bóle brzucha, nudności, wymioty, zaburzenia neurologiczne. Objawy występują napadowo, wywoływane są przez czynniki porfirynogenne, tj. wybrane leki, zmiany hormonalne, spożywanie alkoholu, palenie tytoniu czy nadmierną aktywność fizyczną. W napadzie porfirii niezwłocznie należy wdrożyć dożylną glukozę i heminę oraz wyeliminować czynnik sprawczy. Bez właściwego leczenia, objawy mogą prowadzić do porażenia czterokończynowego, niewydolności oddechowej, śpiączki, drgawek, zaburzeń rytmu serca i w konsekwencji do zgonu. W rozpoznaniu choroby kluczowe znaczenie ma wywiad kliniczny.

Opis przypadku

W czerwcu 2017 roku 29-letnia kobieta, 8 tygodni po porodzie 1. dziecka, karmiąca piersią, została przyjęta do szpitala rejonowego z objawami ostrego bólu brzucha. W badaniu USG, TK j. brzusznej nie uwidoczniono ewidentnej patologii. Wdrożono leczenie objawowe: leki rozkurczowe, nieopioidowe oraz opioidowe leki przeciwbólowe. Wobec braku efektu leczenia zachowawczego Chorą zakwalifikowano do zwiadowczej laparotomii wraz z appendektomią. W okresie pooperacyjnym obserwowano nadal nasilone kolkowe bóle brzucha, zaburzenia elektrolitowe, ponadto przeczulicę skóry i napady drgawkowe. Wykonano szereg badań laboratoryjnych, konsultacji specjalistycznych, TK głowy. Kluczowe w rozpoznaniu było stwierdzenie ściemnienia moczu po ekspozycji na światło słoneczne, przez co wysunięto podejrzenie porfirii. Chorą skierowano do ośrodka referencyjnego celem rozszerzenia diagnostyki. Potwierdzono zwiększone (~10 krotnie) wydalanie PBG i ALA z moczem. Ustalono rozpoznanie postaci jawnej AIP. W leczeniu zastosowano heminę oraz wlewy glukozy. Jako przyczynę wystąpienia choroby wysunięto zmiany hormonalne w okresie połogu oraz stosowanie leków porfirynogennych. W następnych latach pacjentka doznawała niewielkich zaostrzeń, leczonych w warunkach domowych. Aktualnie pacjentka pozostaje w obserwacji hematologicznej, stosując się do zaleceń typowych dla osoby chorującej na porfirię.

Wnioski

AIP jest najgroźniejszym schorzeniem z grupy porfiryn. Objawy choroby są na tyle niecharakterystyczne, że ustalenie rozpoznania bywa bardzo trudne. Należy jednak pamiętać, że ostry atak porfirii jest stanem bezpośredniego zagrożenia życia, kluczowa jest świadomość o chorobie, szybkie prawidłowe postępowanie objawowe oraz diagnostyka. Pacjenci mogą prowadzić normalne życie, mając na uwadze wszystkie zalecenia, które uchronią ich przed ponownym atakiem.

Specjalizacja: hematologia

Tytuł:

Charakterystyka kliniczna oraz czynniki rokownicze u chorych z pozaszpikową postacią szpiczaka plazmocytowego

Autor: Olga Czabak

Współautorzy:

Aneta Szudy-Szczyrek, Radosław Mlak, Adrian Juda, Anna Kokoć, Maciej Dubaj, Karol Bigosiński

Afiliacja:

Uniwersytet Medyczny w Lublinie

WSTĘP

Pozaszpikowy szpiczak plazmocytowy (and. extramedullary plasmacytoma, EMP) stanowi agresywną postać szpiczaka, która charakteryzuje się zdolnością klonu i/lub subklonu nowotworowego do ekspansji i wzrostu niezależnie od mikrośrodowiska szpiku. Występuje rzadko, u ok. 10% wszystkich chorych z rozpoznaniem szpiczaka plazmocytowego, zgodnie z literaturą u ok. 7-17% w chwili diagnozy, natomiast 6-20% na etapie progresji. Zmiany naciekowe mogą rozwijać się w skórze i tkankach miękkich; mogą obejmować wątrobę, nerki, węzły chłonne, centralny układ nerwowy, pierś, opłucną i osierdzie.

CEL PRACY:

Celem pracy jest ocena charakterystyki klinicznej, czynników prognostycznych i wyników leczenia chorych z rozpoznaniem EMP.

MATERIAŁ I METODY:

Dokonano retrospektywnej analizy 138 chorych z rozpoznaniem szpiczaka plazmocytowego zdiagnozowanych i leczonych w Klinice Hematoonkologii i Transplantacji Szpiku Uniwersyteckiego Szpitala Klinicznego nr 1 w Lublinie w latach 2014-2024.

WYNIKI:

Mediana okresu obserwacji wyniosła 42 miesiące (zakres: 1-146 miesięcy). Mediana wieku w chwili rozpoznania 66 lat (zakres 37-87). Dominowali chorzy w 3 stadium zaawansowania w skali ISS (ISS 1 - 27.7%, ISS 2 - 31.4%, ISS 3 - 40.9%). W momencie diagnozy 81.9% (n=113) chorych spełniało kryteria klasycznej wydzielającej postaci szpiczaka, 17.4% (n=24) postaci poronnej tj. choroby łańcuchów lekkich, natomiast u 1 chorego (0.7%) mnogie plasmocytoma. Spośród całej grupy - 9 chorych (12.4%) rozwinęło EMP przy progresji. Najczęstszą lokalizacją EMP była okolica głowy i szyi (węzły chłonne szyjne, żuchwa, kość skroniowa, czołowa, potyliczna, oczodół), n=5. Zmiany opisywano także w tkance podskórnej, otrzewnej, węzłach chłonnych, piersi, jądrach, a także w centralnym układzie nerwowym w 1 przypadku. W leczeniu I linii chorzy byli leczeni głównie schematami skojarzonymi z zastosowa -

niem talidomidu i/lub bortezomibu w skojarzeniu z deksametazonem (i) cyklofosfamidem (chemioterapia CTD, VCD, VTD, inne: 22.2%, 23%, 31.9%, 22.9%). W leczeniu kolejnych linii stosowano nowe leki przeciwszpiczakowe o różnym mechanizmie działania: iksazomib, karfilzomib, lenalidomid, pomalidomid, daratumumab, balantamamb mafadotin oraz klasyczne cytostatyki, tj. cyklofosfamid, etopozyd, cisplastyna, doksorubicyna, bendamustyna, a także radioterapię paliatywną. Mediana linii leczenia u chorych z EMP wyniosła 2 (zakres 1-5). Zaobserwowaliśmy, że w grupie chorych z EMP obecna jest istotnie częściej translokacja t(4:14) OR=6.75; 95%CI: 1.03-44.26; p=0.0466 (17.6% vs 3.1%) - zmiana wysokiego ryzyka cytogenetycznego. Mediana całkowitego przeżycia dla całej grupy wyniosła 99 mies., dla chorych z EMP 52 mies., aczkolwiek nie odnotowaliśmy różnicy o istotności statystycznej (prawdopodobnie w związku z małą liczebnością chorych z EMP). Ocena rokowania była niezależna od zastosowanego leczenia.

WNIOSKI:

Występowanie nacieków pozaszpikowych w szpiczaku znacznie pogarsza rokowanie. Dostępne dane dotyczące wyników leczenia chorych z EMP pochodzą niemal w całości z badań retrospektywnych, na niewielkich grupach pacjentów. Brakuje jasnych zaleceń dotyczących terapii. Co ciekawe, zaobserwowaliśmy związek częstszego występowania aberracji wysokiego ryzyka t(4:14) odpowiedzialnej za zwiększoną ekspresję onkogenów FGFR3 i MMSET. W celu lepszego określenia czynników rokowniczych i skuteczności leczenia chorych z EMP wskazane byłoby pełne profilowanie molekularne celem poszukiwania nowych celów terapeutycznych oraz kwalifikacja chorych do randomizowanych badań klinicznych.

Specjalizacja: hematologia

Tytuł:

Choroba Kikuchi-Fujimoto czy chłoniak - rzadki problem diagnostyczny

Autor:

Maciej Dubaj

Współautorzy:

Maciej Dubaj¹, Karol Bigosiński¹, Aneta Szudy-Szczyrek¹, Olga Czabak¹, Adrian Juda¹, Anna Kokoć¹, Justyna Szumiło², Marek Hus¹

Afiliacja:

1. Katedra i Klinika Hematoonkologii i Transplantacji Szpiku, Uniwersytet Medyczny w Lublinie

2. Katedra i Zakład Patomorfologii Klinicznej, Uniwersytet Medyczny w Lublinie

Wstęp

Choroba Kikuchi-Fujimoto (KFD, histiocytarne martwicze zapalenie węzłów chłonnych) jest rzadką, samoograniczającą się jednostką, charakteryzującą się ostrą lub podostrą jednostronną limfadenopatią szyjną, zwykle do 2-4 cm. Towarzyszą jej niespecyficzne objawy ogólne, takie jak: gorączka, wysypka, bóle stawów czy utrata masy ciała. Choć doniesienia o niej są kazuistyczne, najczęściej obserwuje się ją u młodych (20-30 lat) kobiet pochodzenia azjatyckiego. Diagnoza stawiana jest na podstawie wykluczenia odczynowej limfadenopatii i przeprowadzenia badań obrazowych oraz biopsji wycinającej węzła chłonnego. Choroba w większości przypadków ustępuje samoistnie w ciągu 1-6 miesięcy. Ze względu na podobieństwo objawów i skrajnie różne postępowanie, niezbędne jest przeprowadzenie diagnostyki różnicowej obejmującej przede wszystkim chłoniaka, wirusowe choroby zakaźne oraz tocznia rumieniowatego układowego.

Opis przypadku

18-letnia pacjentka zgłosiła się do Kliniki w styczniu 2023 roku z powodu lewostronnej limfadenopatii szyjnej, trwającej od około tygodnia. Nie zgłaszała gorączki, utraty masy ciała czy zmęczenia. Około miesiąc wcześniej chora przeszła infekcję górnych dróg oddechowych, nieleczoną farmakologicznie. Pacjentka bez istotnego wywiadu w kierunku chorób przewlekłych, alergii i nałogów. W ambulatoryjnie wykonanym badaniu ultrasonograficznym stwierdzono powiększenie węzłów chłonnych szyjnych dolnych (do 24 mm), zatartą strukturę i nieprawidłowe unaczynienie ich wnęk. Wyniki morfologii krwi obwodowej, stężenia białek ostrej fazy oraz badań biochemicznych mieściły się w zakresie referencyjnym. Badania serologiczne i molekularne w kierunku infekcji wirusami cytomegalii, Epsteina Barr, ludzkim herpeswirusem typu 6 i 8, parwowirusem B-19 oraz toksoplazmozą były negatywne. W badaniu PET-TK zaobserwowano aktywne metabolicznie węzły chłonne szyjne grupy IV po stronie lewej (SUVmax=13,2). Zdecydowano o wykonaniu biopsji wycinającej węzła chłonnego. W badaniu histopatologicznym uwidoczniono znaczne poszerzenie strefy T z małymi komórkami T oraz mnogie pola martwicy z ciałkami apoptotycznymi i naciekiem z neutrofili, makrofagów, małych komórek T i plazmocytów oraz rozplemem naczyń, co odpowiadało odczynowemu powiększeniu węzła chłonnego z dominującą reakcją w strefie T. Konsolidując wyniki badań oraz obraz kliniczny, zasugerowano diagnozę KFD.

Pacjentkę następnie hospitalizowano w kwietniu 2023 roku celem dalszej diagnostyki i kontroli. Wyniki wykonanych badań laboratoryjnych pozostawały w normie. Zdecydowano o wykonaniu re-biopsji węzłów chłonnych, od której odstąpiono z powodu samoistnego ustąpienia limfadenopatii. W kontrolnym badaniu PET-TK z sierpnia 2023 roku stwierdzono regresję metaboliczną i morfologiczną uprzednio zmienionych węzłów chłonnych.

Wnioski

KFD jest niezwykle rzadką, lecz sprawiającą trudności diagnostyczne chorobą. Nie odnaleziono charakterystycznych odchyleń klinicznych lub laboratoryjnych ułatwiających jej rozpoznanie. Kluczowy w tym przypadku jest wynik badania histopatologicznego. Chorobę tę należy uwzględniać jako kolejny punkt w diagnostyce różnicowej chorób rozrostowych układu chłonnego.

Specjalizacja: hematologia

Tytuł:

The role of the gut microbiota in the pathogenesis of plasma cell dyscrasias – a pilot study

Autor:

Marcin Jasiński

Współautorzy:

Jarosław Biliński, Albert Moskowicz, Kinga Zielińska, Paweł Hałakuc, Antoni Pietryga, Grzegorz W. Basak

Afiliacja:

Medical University of Warsaw, Department of Hematology, Transplantation and Internal Medicine, Warsaw, Poland Doctoral School, Medical University of Warsaw, 02-091 Warsaw, Poland

Introduction

Among many factors responsible for the pathogenesis of plasma cell dyscrasias, mainly multiple myeloma, antigenic stimulation is recently one of the greatest interests. The natural course of progression of plasma cell dyscrasias (PCD) is from monoclonal gammopathy of undetermined significance (MGUS), smoldering multiple myeloma (SMM), to symptomatic multiple myeloma (MM). Infections are common in patients with PCD, but it is not known whether infections result from secondary immunodeficiency caused by an underlying disease or that disease is triggered by infections and microbial compartments. Furthermore, researchers are trying to decipher how microorganisms causing inflammation could influence tumorigenesis, for instance, in the development of multiple myeloma. A giant reservoir of microbes in the human body is the intestines. It has already been proved that microbes constituting gut microbiota stimulate the immune system (cross talk) and significantly impact the phenotype of immune cells (pro and anti-inflammatory stimulation).

Aim

To show the possible correlation of the gut microbiome parameters (metagenomics) with the profile of immune-related genes expression in the blood of patients (trans criptomics) with newly diagnosed MGUS, SMM, and MM compared to healthy counterparts.

Methods

This prospective observational study is recruiting patients with no history of antibiotic therapy within the last month constituting 4 groups: MGUS, SMM, MM and healthy controls . It is a pilot study where first patient from each group was recruited. Samples of stool (for next-generation sequencing in the shotgun method) and blood (for trans criptomics) were collected. The stool samples were sequenced (shotgun metagenomic sequencing) and analyzed to define the microbiota profile and correlated with blood trans criptome (total RNA sequencing), focused on the expression of immune-related genes to determine its pro- or anti-inflammatory profile. The study has already been accepted by the Bioethics

Committee of the Medical University of Warsaw and received financing with PRELUDIUM-21 grant from the National Science Centre (NCN).

Results

On the species and family levels the taxonomy profiles of MGUS, SMM was most similar to healthy controls. MM sample differed significantly. It is a visible trend that MM microbiome is most “unhealthy”. Additionally, in the MM sample very abundant (6%) virus was found (Buorbuivirus hominis from the Crassvirales – a bacteriophage attacking Bacteroidetes). The expression of cytokines showed that patient with SMM had the most enhanced proinflammatory genes defined as such genes as IL-1, IL-6, IL18 or TNFα. Among anti-inflammatory genes that were identified as playing the role in the plasma cell dyscrasias were IL-10, IL-11 or HSP. The highest expression of that group of cytokines was also noted in patient with SMM. This was correlated with the biggest number of virulence genes in the microbiome sample.

Conclusions

In this pilot report, a microbiome and corresponding blood trans criptome of MGUS, SMM, MM and healthy control was described. It was observed that SMM patient had the highest expression of proinflammatory cytokines and virulence genes which could play the role in the progression of the disease.

Specjalizacja: hematologia

Tytuł:

Deciphering the Prognostic Significance of IGHV Somatic Hypermutation Mutation Status and TP53 Mutations in Chronic Lymphocytic Leukemia

Autor:

Emilia Jaskuła

Współautorzy:

Emilia Jaskuła¹ ², Anna Sobczyńska-Konefał¹ ², Marzena Wojtaszewska³, Iga Jendrysik², Anna Jaśkowiec², Monika Mordak-Domagała², Mariola Sędzimirska², Krzysztof Suchnicki², Lidia Karabon¹, Monika Jasek¹, Jarosław Dybko²

Afiliacja:

1. L. Hirszfeld Institute of Immunology and Experimental Therapy, Polish Academy of Sciences, Wroclaw, Poland

2. Department of Hematology and Transplant Center of the Lower Silesian Oncology Center in Wroclaw, Poland

3. Department of Hematology, University Hospital in Rzeszow, Poland

CLL involves the clonal proliferation of B lymphocytes, characterized by CD5+, CD23+, and CD19+ phenotypes, with a heterogeneous genetic basis. Historically, prognostic factors have included cytogenetic changes such as del(13q), trisomy 12, del(11q), and del(17p). Recent data focus to the somatic hypermutation status of IGHV and TP53 gene mutations, along with other CLL-related genes, as prognostic factors. In this study, we examined whether the mutation status of IGHV and gene mutations in TP53 are related to the clinical outcome of patients with CLL diagnosed at the Lower Silesian Oncology Center in Wroclaw.

Research was conducted on 116 patients (59 female, 57 male, median: 68 years, range 37-88 years) diagnosed with CLL. The cohort, spanning diagnoses from 2003 to 2023, included both prospective and retrospective patient samples. NGS techniques were used to determine the mutation status of IGHV and to analyze the mutation status of TP53 involving LymphoTrackDx IGHV Leader Somatic Hypermutation Assay Panel (Invivoscribe), SureSeq CLL + CNV Panel for sequencing 13 CLL-related genes (OGT), and Laboratory Developed Tests (LDTs) conforming to ERIC standards.

Analysis of the cohort provided the following Results:

1. Twenty-one percent of patients had deletion 11q, 8% trisomy 12, 64% deletion 13q, and 9% deletion 17p.

2. NGS detected TP53 gene mutations in 22 of 110 (20%) samples (VAF > 5%).

3. Fifty-six percent had unmutated IGHV status. Twelve patients were classified into CLL#1, CLL#2, or CLL#6 subgroups, indicative of aggressive disease.

4. The most frequent IGHV genes were IGHV 1-69*01 (12% of patients) and IGHV 3-21*01 (6%). In 12 patients, two IGHV clones were identified; in 9, both clones were productive, in 3, one clone was mutated, the other unmutated, and in 4, one clone was unproductive.

5. Compared to mutated IGHV status (M-CLL) patients, those with unmutated IGHV (U-CLL) had shorter time to first treatment (TFT) from diagnosis, p<0.001; M-CLL median: 2028 days, U-CLL: 516

days, HR= 2.321; 95%CI=1.466 to 3.676.

6. U-CLL patients had shorter time to second therapy (TST) than M-CLL (p<0.009; M CLL median: 4549 days, U-CLL: 2179 days, HR= 2.405; 95%CI=1.235 to 4.685). Trends noted for TP53 mutation showed shorter TST in mutated (median: 1908 days) versus non-mutated (median: 3062 days).

7. Patients with TP53 mutations or del 17p required multiple therapies, 70% with del 17p and 54% with TP53 mutations (p=0.009 and p=0.012 respectively), received two or more lines of therapy.

The study highlights the roles of BCR and IGHV mutations in CLL pathogenesis and prognosis. Key findings show the BCR signaling pathway as essential for CLL development and progression, with IGHV mutation status significantly impacting treatment timing. U-CLL Patients face a quicker need for treatment, underscoring CLL’s aggressiveness without these mutations. Although TP53 mutations remain significant, their importance has lessened with the advent of targeted therapies. The research emphasizes BCR signaling’s superiority over TP53 mutations in CLL development, suggesting BCR-mediated pathways as primary targets for intervention. This necessitates further studies on BCR stereotypes and mutations affecting its signal transduction, potentially revealing new prognostic markers and therapeutic targets. The study advocates for deeper exploration into BCR signaling to understand its pivotal role in CLL, indicating the need for additional research on BCR stereotypes and BCR pathway mutations.

Specjalizacja: hematologia

Tytuł:

Znaczenie rokownicze t(11;14) u chorych na szpiczaka plazmocytowego

Autor: Adrian Juda

Współautorzy:

Anna Kokoć¹, Aneta Szudy-Szczyrek¹, Olga Czabak¹, Radosław Mlak², Sylwia Chocholska¹, Maciej Dubaj³, Karol Bigosiński³, Marek Hus¹

Afiliacja:

1. Katedra i Klinika Hematoonkologii i Transplantacji Szpiku, Uniwersytet Medyczny w Lublinie

2. Zakład Fizjologii Człowieka, Uniwersytet Medyczny w Lublinie

3. Studenckie Koło Naukowe przy Katedrze i Klinice Hematoonkologii i Transplantacji Szpiku, Uniwersytet Medyczny w Lublinie.

Wstęp:

Szpiczak plazmocytowy (ang. multiple myeloma) to choroba nowotworowa charakteryzująca się klonalnym rozrostem plazmocytów. Wśród obserwowanych aberracji genetycznych jest translokacja chromosomu 11 i 14 [t(11;14)]. Jest ona związana z nadekspresją antyapoptotycznego białka Bcl2 oraz mniejszą prezentacją antygenu CD38 na powierzchni komórki, co może mieć implikacje kliniczne. Jej znaczenie prognostyczne i predykcyjne nie zostało jasno określone.

Materiał i metody:

Grupa badana obejmowała 128 chorych z nowo rozpoznanym szpiczakiem plazmocytowym, leczonych w Klinice Hematoonkologii i Transplantacji Szpiku w Lublinie w latach 2015-2020. Detekcji t(11;14) dokonano przy użyciu techniki fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (cytoplasmic immunoglobulin with the fluorescence in situ hybridization - cIg-FISH). Pacjenci otrzymali terapię pierwszej linii według schematów zawierających bortezomib, talidomid, cyklofosfamid i deksametazon.

Wyniki:

W grupie 98 pacjentów, u których wykonano badanie w kierunku t(11;14), obecność translokacji wykazano u 11 pacjentów (11,2%). Jej występowanie wiązało się ze statystycznie istotną redukcją czasu wolnego od progresji (ang. progression free survival, PFS) w porównaniu do grupy bez translokacji (mediana 9 vs 25 miesięcy, HR= 2,59). Nie obserwowano różnicy w całkowitym przeżyciu (ang. overall survival, OS) pomiędzy grupami.

Dyskusja:

Obecność t(11;14) może być niekorzystnym czynnikiem rokowniczym wczesnej progresji. Dotychczas nie jest ona oceniana w powszechnie używanych narzędziach, takich jak Zrewidowany Międzynarodowy Indeks Prognostyczny dla Szpiczaka Plazmocytowego (Revised Multiple Myeloma International Staging System, R-ISS) oraz jego drugiej rewizji. W dobie nowych leków, takich jak daratumumab czy wenetoklaks, wykazanie t(11;14) może być jednym z czynników wpływających na wybór optymalnej terapii. Konieczne są dalsze badania nad wpływem t(11;14) na patogenezę oraz kliniczny przebieg szpiczaka plazmocytowego.

Specjalizacja: hematologia

Tytuł:

Szpiczak plazmocytowy z niewydolnością nerek w dobie nowych leków przeciwszpiczakowychanaliza jednoośrodkowa

Autor: Anna Kokoć

Współautorzy:

Adrian Juda, Aneta Szudy-Szczyrek, Olga Czabak, Karol Bigosiński, Maciej Dubaj, Radosław Mlak², Marek Hus

Afiliacja:

1. Klinika Hematoonkologii i Transplantacji Szpiku, Uniwersytet Medyczny w Lublinie

2. Zakład Diagnostyki Laboratoryjnej, Uniwersytet Medyczny w Lublinie

Wstęp:

Szpiczak plazmocytowy ( multiple myeloma) stanowi ok. 1% wszystkich nowotworów złośliwych i jest trzecim co do częstości nowotworem hematologicznym. Charakteryzuje się klonalną proliferacją atypowych plazmocytów w szpiku kostnym, najczęściej wydzielających nieprawidłowe białko monoklonalne. Uszkodzenie nerek, definiowane przez podwyższone stężenie kreatyniny w surowicy krwi, obserwuje się u ok. 20-40% pacjentów, u ok. 8% przyjmuje obraz ciężkiej niewydolności i wymaga dializoterapii. Patogeneza nefropatii jest złożona, jedną z jej przyczyn jest odkładanie w kłębuszkach nerkowych złogów białka monoklonalnego, czemu może towarzyszyć włóknienie. Szczególnie narażeni są chorzy z rozpoznaniem choroby łańcuchów lekkich (ok. 40-60% pacjentów z nefropatią), hiperkalcemią, hiperkalciurią. Manifestacje kliniczne nefropatii szpiczakowej to m.in. nefropatia wałeczkowa, zespół nerczycowy, glomerulopatia, amyloidoza.

Cel pracy:

Celem badania była analiza i porównanie pacjentów z niewydolnością nerek z grupą pozostałych pacjentów ze szpiczakiem plazmocytowym, scharakteryzowanie ich i ocena efektów leczenia.

Materiały i metody:

Przeprowadziliśmy retrospektywną analizę 138 pacjentów z MM leczonych w Klinice Hematoonkologii i Transplantacji Szpiku w Lublinie w latach 2014-2023. Mediana wieku całej grupy wynosiła 66 lat (zakres 37-87). Przeważały kobiety (n=71, 51,4%). Mediana okresu obserwacji wynosiła 62 miesiące. Pacjenci z chorobą nerek zdefiniowaną jako obniżenie eGFR <60 ml/min/1,73m², choroba nerek w stadiach G3-G5, stanowili 40.6% grupy badanej (n=56). Pacjenci z eGFR<60ml/min/1,73m² byli leczeni w pierwszej linii schematami z użyciem daratumumabu, bortezomibu, talidomidu, lenalidomidu: CTD (n=16), VCD (n=12), VD (n=3), MPV (n=2), PAD (n=1), VTD (n=10), RVD (n=10), DaraVTD (n=2), a autoH -

SCT przeprowadzono u 10 pacjentów (7.24%). Zaobserwowaliśmy istotnie wyższe ryzyko skrócenia PFS (progression-free survival, czas wolny od progresji) (HR=1.93;1.25-2.98, p=0.0007) oraz OS (overall survival, całkowite przeżycie) w grupie chorych z towarzyszącą niewydolnością nerek eGFR<60 ml/min/1,73m² (HR=2.75;1.49-5.06, p=0.0004) w porównaniu do pozostałych. Ponadto u chorych ze współistniejącą chorobą nerek odnotowaliśmy istotnie wyższą częstość powikłań chemioterapii, takich jak: niedokrwistość (OR=3.98;p=0.0007), małopłytkowość (OR=3.17; p=0.002) oraz polineuropatia obwodowa (OR=2.21; p=0.0292).

Wnioski:

Chorzy z rozpoznaniem szpiczaka plazmocytowego i współistniejącą niewydolnością nerek stanowią grupę o niekorzystnym rokowaniu. Aktualne podejście do terapii opiera się na kojarzeniu dializoterapii, chemioterapii oraz w wybranych przypadkach autotransplantacji szpiku (AHSCT). Istnieje nagląca potrzeba pogłębienia badań w celu opracowania terapii spersonalizowanych.

Specjalizacja: hematologia

Tytuł:

Sygnalizacja zależna od IL-17 jako nowy potencjalny punkt uchwytu dla terapii adjuwantowej w szpiczaku plazmocytowym leczonym lenalidomidem. Doniesienie wstępne

Autor:

Piotr Kulig

Współautorzy:

Karolina Łuczkowska, Bogusław Machaliński, Bartłomiej Baumert

Afiliacja:

Zakład Patologii Ogólnej, Uniwersytecka Wytwórnia Farmaceutyczna; Pomorski Uniwersytet Medyczny w Szczecinie

Lenalidomid (LEN) jest powszechnie stosowanym lekiem w terapii szpiczaka plazmocytowego (MM). Niemniej, pomimo jego wysokiej skuteczności, z biegiem czasu wytwarza się lekooporność skutkująca nawrotem choroby. Ze względu na duże znaczenie kliniczne mechanizmy oporności na LEN są przedmiotem dokładnych badań. Jednakże mniej wiadomo na temat molekularnych czynników predykcyjnych dla dobrej odpowiedzi na ten lek. Celem pracy była identyfikacja szlaków molekularnych związanych z dobrą i długą odpowiedzią na LEN (przynajmniej bardzo dobra remisja częściowa - VGPR). Do badania włączono pacjentów z nowo zdiagnozowanym MM (NDMM) oraz pacjentów z MM leczonych w pierwszej linii LEN i deksametazonem (RD). Z komórek MM wyizolowano RNA i przeprowadzono sekwencjonowanie nowej generacji. Przeprowadzono kompleksową analizę bioinformatyczną, a uzyskane wyniki zwalidowano metodą qRT-PCR. W grupie RD, w porównaniu do NDMM, stwierdzono globalny wzrost ekspresji genów, co sugeruje udział mechanizmów epigenetycznych. Ponadto wykryto wzrost ekspresji genów kontrolujących interakcję w mikrośrodowisku szpiku kostnego. Dodatkowo wykazano zwiększoną ekspresję genów związanych z kontrolą odpowiedzi immunologicznej. W szczególności gen kodujący receptor IL-17 (IL-17R) ulegał nadekspresji w grupie RD, co jest zjawiskiem dotychczas nieopisywanym. Warto zaznaczyć, że IL-17 jest czynnikiem wzrostu dla plazmocytów, w tym komórek MM oraz posiada udowodniony związek z chorobą kostną w MM. Uzyskane wyniki sugerują, że terapia LEN powoduje wzrost ekspresji IL-17R, co może mieć potencjalne implikacje kliniczne, gdyż jest możliwość terapeutycznej interferencji z sygnalizowaniem zależnym od tej cytokiny (przeciwciała monoklonalne przeciwko IL-17 lub jej receptorowi). Ustalenie dokładnej roli sygnalizacji zależnej od IL-17 w MM, szczególnie leczonym LEN, wymaga dalszych badań. W przypadku uzyskania kolejnych pozytywnych wyników w modelach przedklinicznych te przeciwciała monoklonalne mogą, po weryfikacji w badaniach klinicznych, wzbogacić armamentarium leków stosowanych w leczeniu MM, szczególnie jako terapia adjuwantowa do schematów wykorzystujących LEN.

Specjalizacja: hematologia

Tytuł:

Charakterystyka zmian biochemicznych powodowanych przez mutację PLT3 w modelu in vitro

AML z użyciem spektroskopii ramanowskiej

Autor: Paulina Laskowska

Współautorzy:

Paulina Laskowska¹ ², Wiktoria Korona³, Sylwia Orzechowska³, Aleksandra Borek Dorosz³, Anna M. Nowakowska³, Małgorzata Zasowska¹, Aleksandra Szlachetka¹, Maciej Szydłowski¹, Przemysław Juszczyński¹, Małgorzata Barańska², Katarzyna Majzner², Piotr Mrówka¹ ² ⁴

Afiliacja:

1. Zakład Hematologii Eksperymentalnej, Instytut Hematologii i Transfuzjologii, ul. Indiry Gandhi 14, 02-776 Warszawa

2. BioBank, Instytut Hematologii i Transfuzjologii, ul. Indiry Gandhi 14, 02-776 Warszawa

3. Uniwersytet Jagielloński, Wydział Chemii, Grupa Obrazowania Ramanowskiego, ul. Gronostajowa 2, 30-387 Kraków

4. Zakład Biofizyki, Fizjologii i Patofizjologii, Warszawski Uniwersytet Medyczny, ul Chałubińskiego, 02-004 Warszawa

Receptorowa kinaza tyrozynowa FLT3 reguluje różnicowanie oraz wzrost hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych. Mutacje w genie FLT3 wykrywane są u co trzeciego pacjenta z ostrą białaczką szpikową (AML). Do najczęstszych mutacji należy, powodująca konstytutywną aktywność kinazy, FLT3 -ITD (ITD, ang. internal tandem duplication). Wiąże się ona z gorszym rokowaniem u pacjentów z AML, zwiększoną opornością na chemioterapię, wyższym odsetkiem nawrotów i krótszym czasem całkowitego przeżycia. Na poziomie biologii komórki , FLT3 -ITD powoduje zmianę w metabolizmie komórek na korzyść glutaminolizy, a także wzmaga biogenezę mitochondrialną.

Spektroskopia Ramanowska (RS, ang. Raman spectroscopy) jest techniką spektroskopii molekularnej, która pozwala uzyskać informacje o strukturze chemicznej i interakcjach molekularnych analizowanej próbki. Właściwości RS pozwalające na szybką, bezznacznikową ocenę stanu metabolicznego pojedynczej komórki in vivo czynią tę technikę szczególnie atrakcyjną dla zastosowań w hematologii.

Ponieważ procesy indukowane mutacją w FLT3 potencjalnie wpływają na profil biochemiczny komórek, a przez to na widma ramanowskie, w naszym badaniu wykorzystano mikroskopię RS do analizy skuteczności klinicznie stosowanego selektywnego inhibitora FLT3 drugiej generacji, Gilteritinibu (GLT). W tym celu do komórek linii THP-1 wprowadzono, za pomocą transdukcji lentiwirusosowej, kon -

strukty zawierające prawidłową wersję genu FLT3 (FLT3 WT) oraz zmutowaną ( FLT3 NPOS) w wektorze pSFFV. Komórki z konstruktami wysortowano i scharakteryzowano aktywność FLT3 za pomocą badania kinomu (PamGen), aktywności odpowiednich ścieżek sygnałowych (Westen blotting) oraz zmian w aktywności mitochondrialnej (mikroskopia fluorescencyjna). W celu oceny skuteczności działania GLT komórki inkubowano z 1,5 nM GLT lub DMSO przez 24 h. Następnie wykonano analizę działania cytostatycznego/cytotoksycznego za pomocą testu MTS. W celu wykonania oznaczeń widm ramanowskich komórki utrwalono i zobrazowano na mikroskopie WITec alpha300. Uzyskane dane poddano wielowymiarowej analizie chemometrycznej, najpierw analizę skupień metodą k-średnich (KMCA), a następnie analizę głównych składowych (PCA) i analizę dyskryminacji metodą częściowych najmniejszych kwadratów (PLS-DA).

Wprowadzenie zmutowanego genu FLT3 do komórek THP-1 prowadziło do charakterystycznych dla FLT3 -ITD+ komórek AML zmian w aktywności kinaz i ścieżek sygnałowych oraz biogenezy mitochondrialnej, potwierdzając prawidłowe funkcjonowanie modelu. Analiza widm ramanowskich wykazała, różnice w zawartości lipidów i hemoprotein pomiędzy komórkami FLT3 -ITD a komórkami kontrolnymi. Analizy PCA oraz PLS-DA wykazały możliwość odróżnienia komórek FLT3 -ITD+ od komórek WT na podstawie uśrednionych widm ramanowskich. Opracowano matematyczny model predykcyjny, którego skuteczność została potwierdzona na próbkach od pacjentów ze zweryfikowaną mutacją FLT3 -ITD. Pod wpływem GLT komórki FL3-ITD+ upodabniały się pod względem widma ramanowskiego do komórek WT, co oznacza, że inhibitor skutecznie hamował związane z aktywnością zmutowanego receptora zmiany biochemiczne i strukturalne komórek.

Uzyskane wyniki potwierdzają skuteczność RS w identyfikacji zmian biochemicznych wywołanych mutacją w genie FLT3 i możliwość monitorowania skuteczności odpowiedzi na inhibitor onkogenu w warunkach in vitro. W przyszłości RS mógłby znaleźć zastosowanie w diagnostyce funkcjonalnej nowotworów hematologicznych.

Specjalizacja: hematologia

Tytuł:

Ocena lęku i depresji u pacjentów w przebiegu ostrej białaczki – badanie wstępne

Autor:

Dariusz Łętowski

Współautorzy:

Nicola Szeja, Martyna Bednarczyk

Afiliacja:

Oddział Kliniczny Hematologii i Profilaktyki Chorób Nowotworowych, Wydział Zdrowia Publicznego w Bytomiu, Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach

Wstęp:

Ostra białaczka to poważne schorzenie hematologiczne, które wymaga intensywnego leczenia i może prowadzić do znacznego stresu psychicznego u pacjentów. Jednym z aspektów zdrowia psychicznego, który należy wziąć pod uwagę w opiece nad pacjentami z ostrą białaczką, jest ocena poziomu lęku i depresji. Skala HADS ( Hospital Anxiety and Depression Scale) stanowi użyteczne narzędzie w diagnostyce tych zaburzeń.

Cel badania:

Celem badania jest porównanie poziomu lęku i depresji przy użyciu skali HADS u pacjentów z ostrą białaczką szpikową przed zastosowaniem leczenia oraz po leczeniu.

Metody:

Badanie obejmowało grupę 12 pacjentów hospitalizowanych z powodu ostrej białaczki, którzy zgłosili się dobrowolnie do udziału w badaniu, mediana wieku pacjentów wynosi 65,5 lat.

Wyniki:

Wyniki tego badania wstępnego wykazały znaczący poziom lęku i depresji u pacjentów z ostrą białaczką. Średnie wyniki na Skali HADS przekroczyły wartości uznane za krytyczne dla zaburzeń lękowych i depresyjnych. Dodatkowo, analiza danych sugeruje istnienie związku między stopniem zaawansowania choroby a nasileniem objawów lękowych i depresyjnych.

Wnioski:

Wyniki tego badania wstępnego potwierdzają potrzebę rutynowej oceny lęku i depresji u pacjentów w przebiegu ostrej białaczki przy użyciu Skali HADS. Skuteczna identyfikacja i zarządzanie tymi zaburzeniami może poprawić jakość opieki nad pacjentami oraz ich ogólny stan psychiczny w trakcie leczenia. Dalsze badania są niezbędne w celu potwierdzenia tych wyników i opracowania strategii interwencyjnych mających na celu łagodzenie objawów lękowych i depresyjnych u pacjentów z ostrą białaczką.

Specjalizacja: hematologia

Tytuł:

Predicting Chemotherapy Toxicity in Multiple Myeloma: The Prognostic Value of Pre Treatment

Serum Cytokine Levels of Interleukin-6 (IL-6), Interleukin-8 (IL-8), Monocyte Chemoattractant Protein-1 (MCP-1), and Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF)

Autor:

Michał Mielnik

Współautorzy:

Martyna Podgajna-Mielnik¹, Aneta Szudy-Szczyrek¹, Iwona Homa-Mlak², Radosław Mlak³, Aneta Gorący¹, Marek Hus¹

Afiliacja:

1. Department of Hematooncology and Bone Marrow Transplantation, Medical University of Lublin, 20-081 Lublin, Poland

2. Department of Human Physiology, Medical University of Lublin, 20-080 Lublin, Poland

3. Laboratory of Body Composition Research of the Chair of Preclinical Sciences, Medical University of Lublin, 20-080 Lublin, Poland

Multiple Myeloma (MM), a prevalent hematological malignancy, poses significant treatment challenges due to varied patient responses and toxicities to chemotherapy. This study investigates the predictive value of pretreatment serum levels of interleukin-6 (IL-6), interleukin-8 (IL-8), monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1), and vascular endothelial growth factor (VEGF) for chemotherapy-induced toxicities in newly diagnosed MM patients. We hypothesized that these cytokines, pivotal in the tumor microenvironment, might correlate with the incidence and severity of treatment-related adverse events. We conducted a prospective observational study with 81 newly diagnosed MM patients, analyzing serum cytokine levels using the multiplex cytometric bead assay (CBA) flow cytometry method. The study used non-parametric and multivariate analysis to compare cytokine levels with treatment-induced toxicities, including lymphopenia, infections, polyneuropathy, and neutropenia.

Our findings revealed significant associations between cytokine levels and specific toxicities. IL-8 levels were lower in patients with lymphopenia (P=0.0454) and higher in patients with infections (P=0.0009) or polyneuropathy (P=0.0333). VEGF concentrations were notably lower in patients with neutropenia (P=0.0343). IL-8 demonstrated an 81% sensitivity (AUC=0.69; P=0.0015) in identifying infection risk. IL-8 was an independent predictor of lymphopenia (Odds Ratio [OR]=0.26; 95% Confidence Interval [CI]=0.07-0.78; P=0.0167) and infection (OR=4.76; 95% CI=0.07-0.62; P=0.0049). High VEGF levels correlated with a 4-fold increased risk of anemia (OR=4.13; P=0.0414).

Pre-treatment concentrations of IL-8 and VEGF in serum can predict hematological complications, infections, and polyneuropathy in patients with newly diagnosed MM undergoing chemotherapy. IL-6, IL-8, and VEGF may serve as simple yet effective biomarkers for detecting infections, lymphopenia, neutropenia, and treatment-related polyneuropathy, aiding in the personalization of chemotherapy regimens and the mitigation of treatment-related risks.

Specjalizacja: hematologia

Tytuł:

NPM1 gene mutations in AML cells can be identified using stimulated Raman spectroscopy

Autor:

Piotr Mrówka

Współautorzy:

Aleksandra Szlachetka¹, Paulina Laskowska¹ ², Joanna Purzycka³, Aleksandra Żołyniak¹, Maciej Szydłowski¹, Przemysław Juszczyński¹, Piotr Wasylczyk³, Piotr Mrówka¹ ² ⁴

Afiliacja:

1. Instytut Hematologii i Transfuzjologii, Zakład Hematologii Eksperymentalnej, Warszawa

2. Instytut Hematologii i Transfuzjologii, Biobank, Warszawa

3. Uniwersytet Warszawski, Wydział Fizyki, Zakład Optyki, Warszawa

4. Warszawski Uniwersytet Medyczny, Katedra Biofizyki, Fizjologii i Patofizjologii, Warszawa

Introduction

Raman spectroscopy (RS) is a label-free technique that uses the measurement of inelastic scattering of photons caused by the change in polarizability of a molecule during normal vibration. The spectrum obtained during the measurement is a “molecular fingerprint” of the cell - it provides information about its biochemical composition, and thus indirectly allows conclusions about its metabolic state. For this reason, RS is increasingly being proposed in innovative diagnostic techniques.

Acute myeloid leukemia (AML) is a malignant tumor that originate from hematopoietic cell. It is characterized by heterogeneity of symptoms and a diverse genetic background. NPM1 gene mutation occurs in 30% of AML patients, and since 2008, AML with NPM1 mutation has been recognized as a separate type of AML in the WHO classification.

The NPM1 gene encodes nucleophosmin - a nuclear protein involved in processes such as ribosome biosynthesis, genome stabilization, chromatin conformation changes, DNA repair, and thus in embryogenesis, regulation of cell division and apoptosis. The mutation known as NPM1c leading to the development of AML causes disruption of the protein’s functioning and its cytoplasmic localization. In this study, we created an in vitro model of cells with the NPM1c mutation and characterized it using Raman spectroscopy.

Materials and methods

In order to obtain an AML model with the NPM1c mutation, we cloned the normal gene (wild type - NPM1 WT) and the mutated gene (NPM1c) into a lentiviral vector used to transfect HEL cell. We imaged NPM1 protein relocations after immunofluorescence staining (DAPI and Alexa FluorTM 633) using a Leica DMiLLED Fluo fluorescence microscope and an Olympus Fluoview FV10i confocal microscope. We then performed cell imaging using an SRS (Stimulated Raman Scattering) microscope. SRS is a variant of RS that allows the amplification of the signal. Cells were analyzed at three selected bands assigned to specific groups of compounds - 2936 cm-1 (symmetric vibrations of -CH3 groups, proteins), 2850 cm-1 (symmetric vibrations of CH2 groups, lipids) and 3010 cm-1 (unsaturated groups = CH2, lipids).

Results

We engineered HEL cells with a mutated NPM1c and control NPM1 WT genes. In confocal fluorescent microscope observations in NPM1 WT cells immunofluorescently stained nucleophosmin was located near the nucleus and in the NPM1c line it was observed outside the cell nucleus similar as in NMP1 mutation carrying primary AML cells. We then imaged the cells using an SRS microscope and obtained cell images reflecting the intensity of the Raman shift for specific bands. The collected data after basic analysis allowed for the characterization of cell images. Analysis of the intensity of signals reflecting the chemical composition of the sample allowed for the demonstration of subtle differences between cells containing normal and mutant proteins. The differences are best visible in the ratio of signal intensities for the 2936 and 2850 cm-1 bands.

Conclusions

In our study, we present the characteristics of Raman spectra of AML cells with NPM1 gene mutationtheir so-called “molecular fingerprint”. The obtained results show the usefulness of SRS in identifying certain genetic aberrations based on biochemical composition, subcellular location of macromolecules and, indirectly, cell metabolism.

Specjalizacja: hematologia

Tytuł:

The screening of tumor-associated antigens in patients with chronic myeloid leukemia

Autor:

Michalina Pinkosz

Współautorzy:

Katarzyna Skórka, Paulina Kwaśnik, Hubert Warda, Paweł Cech, Martyna Stępień, Krzysztof Giannopoulos

Afiliacja:

Department of Experimental Hematooncology, Medical University of Lublin, ul. Chodźki 1 (Collegium Universum), 20-093, Lublin, Poland

Introduction

Chronic myeloid leukemia (CML) has a complex molecular background beyond the BCR-ABL1 fusion. There is much evidence suggesting the significance of encoding tumor-associated antigens (TAA) in the biology of CML. TAAs were shown to induce a response from cytotoxic T-cells in CML patients. Notably, certain TAAs upregulated by the BCR-ABL1 fusion were shown to lower the immunogenicity of leukemic cells, making them more prone to rapid progression and therapeutic resistance. Therefore, investigating TAAs can allow for a better characteristic and in-depth diagnosis of CML patients. Furthermore, imatinib was proven to enhance and stimulate the immune system of CML patients. Discovering and investigating CML related TAAs can help unravel the mechanisms responsible for the immunomodulatory properties of imatinib and provide a better understanding of CML’s immunobiology.

Aim of the study

The aim of our study was to assess mRNA expression of genes encoding TAAs including PRTN3 , HMMR , PRAME, AURKA , USP32, DNAJC2, SPAG9, and WT1 in 43 CML patients at the moment of diagnosis and correlate them with clinical parameters.

Materials and methods

The study material was obtained from 43 patients with CML. We performed the isolation of peripheral blood mononuclear cells and the subsequent isolation of RNA. One microgram of RNA was reversely transcribed into cDNA and used in further procedures. The assessment of the expression of the aforementioned genes was performed via quantitive real-time polymerase chain reaction(qRT-PCR), with GAPDH used as an internal control. Using graphpad prism, we performed statistical analysis of the obtained data.

Results

We confirmed the expression of all of the analyzed genes PRTN3 , HMMR , PRAME, AURKA , USP32, DNAJC2, SPAG9, and WT1 with the median expression assessed as 2^-∆∆Ct 752.527, 94.510, 65.426,

56.110, 55.993, 55.318, 55.101 and 26.785, respectively observed. There were notable correlations between pairs of analyzed genes, for example between PRTN3 vs. AURKA (p<0.0001), PRTN3 vs. HMMR (p<0.0001), or HMMR vs. WT1 (p=0.0043), HMMR vs. AURKA (p<0.0001) and DNAJC2 vs. USP32 (p=0.0002). The statistical analysis showed no statistically significant correlation between clinical parameters such as patient sex, age upon diagnosis, type of BCR-ABL1 trans cript, and the expression level of the analyzed markers.

Conclusions

PRTN3 (Me = 752,53) was the most highly expressed TAA compared with the other analyzed genes, and therefore it will be analyzed in the context of the induction of a CML-specific immune response in CML patients. The TAA expression screening confirmed those markers’ presence in CML patients, which is a first step for further functional analysis. The analyzed TAAs represent promising new targets for peptide based immunotherapy, and may also act as markers for assessing immune responses in CML patients. In the future, the findings of our study might provide a better understanding of the immune system of CML patients.

Specjalizacja: hematologia

Tytuł:

Chimeryzm hematopoetyczny po przeszczepieniu allogenicznych komórek krwiotwórczych we krwi obwodowej i subpopulacji komórek CD3+ w wybranych jednostkach chorobowych

Autor:

Sylwia Purchla-Szepioła

Współautorzy:

Klaudia Kozioł, Joanna Skulimowska, Justyna Smolarczyk-Wodzyńska, Magdalena Krzemienowska, Barbara Nasiłowska-Adamska, Joanna Mańko, Magdalena Tormanowska, Anna Paczek, Eliza Głodkowska-Mrówka, Agnieszka Orzińska, Katarzyna Guz, Kazimierz Hałaburda

Afiliacja:

Instytut Hematologii i Transfuzjologii

Allogeniczne przeszczepienie macierzystych komórek krwiotwórczych (HSCT) prowadzi do powstania w organizmie biorcy chimeryzmu potransplantacyjnego. Badanie kinetyki chimeryzmu służy monitorowaniu skuteczności przeszczepienia. Analiza chimeryzmu polega na ilościowej ocenie specyficznych markerów genetycznych różniących komórki dawcy od komórek biorcy. Z literatury wynika, że badanie chimeryzmu we frakcjach komórkowych zwiększa czułość badania i wykrycie chimeryzmu mieszanego, zanim będzie widoczny w badaniu z pełnej krwi.

Celem pracy jest ocena użyteczności badania chimeryzmu w subpopulacji komórek T CD3+ w rutynowej praktyce diagnostycznej.

Materiał

Materiałem do badań było DNA z krwi obwodowej oraz z jej subpopulacji komórek CD3+, pozyskanych od pacjentów w 30, 60, 90, 120 i 180 doby po HSCT. Analizą objęto 30 pacjentów podzielonych wg jednostek chorobowych: 1/ ostra białaczka limfoblastyczna (ALL, n=6); 2/ zespoły mielodysplastyczne (MDS, n=5), 3/ ostra białaczka szpikowa (AML, n=19).

Metody

Do separacji subpopulacji CD3+ z 1 ml krwi obwodowej użyto zestawu RosetteSepTM Human T Cell Enrichment Coctail z SepMateTM-15 (Stemcell). DNA z 250 ul krwi pełnej i całej subpopulacji CD3+ izolowano na aparacie Prepito (Chemagen).

Analizę chimeryzmu wykonano metodą STR-PCR, zestawem PowerPlex® ESX 16 Fast (Promega) na sekwenatorze ABI 3130 (Applied Biosystems; program GeneMapper ID). Określono proporcję markerów STR dawcy wobec markerów STR biorcy, wyliczając procent genotypu dawcy. Za istotną zmianę wartości chimeryzmu między subpopulacją CD3+, a pełną krwią przyjęto różnicę większą niż 5%. Istotność statystyczną analizowano testem Wilcoxona.

Wyniki

Zaobserwowano większą czułość wykrywania chimeryzmu mieszanego w subpopulacji CD3+, z lecz różnicą mediany CD3+ względem krew mieszczącą się w zakresie czułości metody STR-PCR (6%, 2%, 5%, 0% i 0% dla 30, 60, 90, 120 i 180 doby). Zwiększenie czułości badania chimeryzmu w CD3+ było istotne u 52%, 41%, 33%, 31% i 7% pacjentów badanych odpowiednio w 30, 60, 90, 120 i 180 doby. Istotnie wyższy chimeryzm mieszany w subpopulacjach komórek CD3+ zaobserwowano u pacjentów z:

1. ALL: 2 z 5 w 30 dobie (6% i 43%); 2 z 6 w 60 dobie (10% i 19%); 1 z 3 w 90 dobie (27%) i 1 z 5 w 180 dobie (28%); z istotnością statystyczną: p<0,001; p=000,1 i p = 0,0078 dla 30, 60 i 90 doby,

2. MDS: 2 z 5 w 30 dobie (18% i 30%); 2 z 5 w 60 dobie (13% i 23%); 1 z 3 w 90 dobie (23%); 1 w 120 dobie (9%) i 1 z 2 w 180 dobie (15%),

3. AML: 9 z 18 badanych w 30 dobie (6-29%), u 6 z 15 w 60 dobie (7-34%), u 3 z 15 w 90 dobie (16-49%), u 3 z 9 w 120 dobie (8-39%) i u 2 z 9 w 180 dobie (13% i 46%).

U 2 pacjentów nie udało się ocenić chimeryzmu z powodu zbyt niskiego stężenia DNA z subpopulacji CD3+. Stężenia DNA z limfocytów CD3+ wyniosły średnio: 5,4 ng/ul (0,5-13,3); 3,3 ng/ul (0,8-24,9); 5,3 ng/ul (1,3-16,4); 5,7 ng/ul (0,6-11,2) i 9,9 ng/ul (1,1-31,7) dla 30, 60, 90, 120 i 180 doby

Wnioski

Badania chimeryzmu w subpopulacji CD3+ poprawiło czułość wykrywania chimeryzmu mieszanego, choć zawierał się on w zakresie czułości metody PCR-STR. U pacjentów z AML zaobserwowano statystycznie istotną różnicę obniżonego chimeryzmu w subpopulacji CD3+ w odniesieniu do chimeryzmu z pełnej krwi, zwłaszcza we wczesnym okresie po przeszczepieniu. Liczba przypadków w pozostałych grupach jest zbyt mała by uzyskać odpowiednią moc statystyczną. We wczesnym okresie po przeszczepieniu trudno jest uzyskać z komórek CD3+ DNA o odpowiedniej jakości do badań.

Specjalizacja: hematologia

Tytuł:

Determination of Kinomic landscape of B-ALL cells by high-throughput kinase activity profiling –population study

Autor: Anna Rams

Współautorzy:

Ewa Lech-Marańda, Eliza Głodkowska-Mrówka

Afiliacja:

Instytut Hematologii i Transfuzjologii w Warszawie

B-cell acute lymphoblastic leukemia (B-ALL) is a heterogeneous group of diseases subclassified into multiple subcategories characterized by different biology and clinical courses. Despite often effective first line treatment, it is characterized by high relapse rates in adult patients. This is due to insufficient knowledge of the biology of this entity to improve the treatment efficacy. The complexity and difficulty of treatment of this malignancy are shown by the new subtypes that are constantly being identified. In 2022 the World Health Organization distinguished a new subtype of kinase-driven ALL, characterized by rearrangements and sequence mutations resulting in kinases signaling alterations. The current diagnostic approach does not allow detection of all cases of kinase-driven ALL since it is based on genetic and cytogenetic methods. Therefore change of the paradigm from genetic to functional may overcome diagnostic difficulties. A fast, cheap, high-throughput diagnostic method, covering all stages of the disease is needed. These needs are met by a new high-throughput method for profiling kinase activity, which in this project will be used to examine the kinase landscape in B-ALL cells derived from patients enrolled in the GETDex-GILTRAM clinical trial and its accompanying population-based study.

The project aims to study the role of kinases and signaling pathways involved in B-ALL biology across various genetic subtypes, search for new potential targets and biomarkers, and in the long term develop targeted therapies.

Up to date, 25% of patient samples have been collected throughout several collaborating hematology centers in Poland associated with the Polish Adult Leukemia Group (PALG). The project assumes the collection of a total of 200 patient samples. The genetic profiles of the collected samples have been determined. Validation and preliminary studies of high-throughput kinase activity profiling were performed on B-ALL cell lines. The relationship between phenotype and genotype was determined (NGS data).

Preliminary studies have shown that high-throughput kinase activity profiling highlights changes in signaling pathways and cellular processes among B-ALL subtypes. The next step will be to test patient samples. The results will allow us to deepen the knowledge about the role of kinases and kinase dependent signaling pathways in the biology of B-ALL, facilitate search for biomarkers and therapeutic targets, and perhaps support the diagnosis of this cancer in the future.

Specjalizacja: hematologia

Tytuł:

Accelerated chronic lymphocytic leukemia – the characteristics and retrospective analysis of treatment outcomes in polish hematology centers

Autor:

Oktawia Sośnia

Współautorzy:

Oktawia Sośnia¹, Elżbieta Iskierka-Jażdżewska², Anna Puła², Kamil Wiśniewski¹, Joanna Drozd-Sokołowska³, Marta Morawska⁴ ⁵, Urszula Gosik⁴, Dariusz Woszczyk⁶, Agata Ogłoza⁷, Jacek Kwiatkowski⁸, Kamil Wdowiak⁹, Ewa Paszkiewicz Kozik¹⁰, Ewa WąsikSzczepanek¹¹, Mirosław Markiewicz¹², Magdalena Zawartko¹³, Anna Kokoć¹¹, Anna SzumeraCiećkiewicz¹⁴, Monika Prochorec-Sobieszek¹⁴ ¹⁵, Tadeusz Robak², Ewa Lech-Marańda¹, Bartosz Puła¹

Afiliacja:

1. Department of Hematology, Institute of Hematology and Transfusion Medicine, Warsaw, Poland

2. Department of General Hematology, Copernicus Memorial Hospital, Medical University of Lodz, Poland

3. Department of Hematology, Transplantation and Internal Medicine, Medical University, Warsaw, Poland

4. Hematology Department, St. John’s Cancer Center, Lublin, Poland

5. Experimental Hematooncology Department, Medical University of Lublin, Poland

6. University of Opole, Provincial Hospital, Opole, Poland

7. Department of Hematology and Transplantology, Medical University of Gdansk, Gdansk, Poland

8. Department of Hematology and Cellular Transplantation, Lower Silesian Oncology Center, Wroclaw, Poland

9. Department of Internal Diseases and Oncological Chemotherapy Faculty of Medical Sciences, Medical University of Silesia, Katowice, Poland

10. Department of Lymphoid Malignancies, Maria Sklodowska-Curie National Research Institute of Oncology, Warszawa, Poland

11. Department of Hematooncology and Bone Marrow Transplantation, Medical University, Lublin, Poland

12. Department of Hematology, Institute of Medical Sciences, College of Medical Sciences, University of Rzeszow, Rzeszow, Poland

13. Department of Hematology, Provincial Hospital, Szczecin, Poland

14. Department of Pathology, Maria Sklodowska-Curie National Research Institute of Oncology, Warsaw, Poland

15. Diagnostic Hematology Department, Institute of Hematology and Transfusion Medicine, Warsaw, Poland

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is the most frequent form of leukemia in adults. The transformation to aggressive lymphoma, known as Richter transformation (RT), occurs in 10% of cases. The accelerated CLL (A-CLL) is a rare histological variant of CLL with a frequency of less than 1% of all CLL cases. Several available indicate a more aggressive course compared to classic CLL. Sometimes, its presentation is mistaken with RT. However, due to limited data on the characteristics of this group, the prognosis and the optimal management are not clearly defined.

A retrospective analysis of patients diagnosed with A-CLL in Poland was conducted. Clinical data from

111 patients treated in 13 different hematology centers between 2013 and 2023, were collected. The aim was to study the characteristics and treatment outcomes of patients with A-CLL. Moreover, we aimed to evaluate the impact of treatment on time to disease acceleration in patients diagnosed with CLL.

The group consisted of 64 treatment-naïve and 47 relapsed/refractory patients. The mean age at the time of CLL diagnosis was 59 (12.54) years and the mean age at the time of A-CLL diagnosis was 63 (11.2) years. At the time of acceleration, 32.4% of patients had CLL Rai stage IV, 80.2% were ECOG< 2, while the median Cumulative Illness Rating Scale (CIRS) was 4 (IQR 2-6). Forty-two patients experienced acceleration at the time of CLL diagnosis. Eighteen patients transformed during CLL treatment. 22.7% patients (20/88) had del17p and 29.0% (9/31) had TP53 mutation. The 5-year OS and PFS since A-CLL diagnosis were 51.6% (95%CI 39.1-68.1%) and 40.0% (95%CI 28.1-56.9%), respectively.

The median OS after A-CLL diagnosis was 5.85 years, and the median PFS was 4.02 years. Among patients previously diagnosed with CLL, treatment prolonged the time of the occurrence of acceleration (p< 0.0001), with younger patients having a statistically significantly longer time to acceleration (p< 0.0001). ECOG ≥2 at the time of A-CLL diagnosis was associated with worse OS (HR 6.3, 95% CI 3.1-12.9, p<0.0001; p<0.0001) and PFS (HR 3.99, 95% CI 2.03-7.85, p<0.0001; p<0.0001). Fludarabine-based therapy regimens are associated with better prognosis in OS (HR 0.165, 95%CI 0.050.56, p=0.004; p=0.001) and PFS (HR 0.214, 95%CI: 0.073-0.625, p=0.005; p=0.002) in the whole analyzed group compared to other used drugs. A similar trend was observed in the subgroup without del17p. R-CHOP like regimens were associated with worse PFS in the whole analyzed group (p=0.022) and worse OS (p=0.065). In a subgroup analysis, fludarabine-based regimens proved to be superior to bendamustine based regimens in OS (p=0.014) and PFS (p=0.023) and to R-CHOP-like protocols in both OS (p=0.002) and PFS (p=0.0014). However, there was no statistically significant difference in OS and PFS between fludarabine-based regimens and targeted therapy (Brutons tyrosine kinase inhibitors or BCL2 inhibitor) or in any other performed comparisons.

Our study represents one of the largest datasets of A-CLL patients and confirms its inferior prognosis. An ECOG score of 2 and above should be considered an important risk factor for disease progression or death. In conclusion, not only targeted therapy, but also fludarabine-based therapy regimens may be considered when selecting treatment for CLL.

Specjalizacja: hematologia

Tytuł:

Charakterystyka molekularna pacjentów Świętokrzyskiego Centrum Onkologii w Kielcach z ostrą białaczką szpikową z zastosowaniem sekwencjonowania nowej generacji

Autor:

Magdalena Stawiarz

Współautorzy:

Sylwia Kościołek-Zgódka, Artur Kowalik

Afiliacja:

Świętokrzyskie Centrum Onkologii, Zakład Diagnostyki Molekularnej (MS, AK), Świętokrzyskie Centrum Onkologii, Klinika Hematologii I Transplantacji Szpiku (SKZ), Uniwersytet Jana Kochanowskiego w Kielcach, Zakład Biologii Medycznej (MS, AK)

Ostra białaczka szpikowa (ang. acute myeloid leukemia, AML), to heterogenny nowotwór hematologiczny charakteryzujący się klonalną ekspansją blastycznych komórek mieloidalnych w szpiku kostnym, krwi obwodowej i innych tkankach. AML jest agresywną chorobą, o wysokim stopniu heterogenności pod względem nieprawidłowości chromosomalnych, mutacji genowych oraz zmian w ekspresji wielu genów i miRNA. Mediana zachorowalności na AML wynosi około 65 lat. Klasyfikacja AML zaproponowana w aktualnych rekomendacjach European Leukemia Net (ELN 2022) w istotnym stopniu opiera się o obecność charakterystycznych zmian molekularnych. Diagnostyka molekularna AML obejmuje identyfikację aberracji genetycznych, takich jak mutacje punktowe, indele, zmiany liczby kopii i rearanżacje strukturalne. Wdrożenie technologii sekwencjonowania nowej generacji (ang. next generation sequencing, NGS) pozwala na wszechstronną analizę pojedynczych genów i paneli genów, oferując wysoką czułość i swoistość w wykrywaniu i monitorowaniu zmian molekularnych, udoskonalając w ten sposób diagnostykę, prognozowanie i zastosowanie medycyny precyzyjnej w AML.

Celem badania było określenie profilu mutacji wśród pacjentów Świętokrzyskiego Centrum Onkologii w Kielcach z rozpoznaną ostrą białaczką szpikową, hospitalizowanych w latach 2019-2023. Grupę badaną stanowiło 129 pacjentów. Materiał do badań stanowiły DNA i RNA wyizolowane z próbek szpiku kostnego i/lub krwi obwodowej pacjentów ŚCO. Profil mutacji został określony przy użyciu metody NGS w technologii Ion Torrent i testu Oncomine™ Myeloid Research Assay firmy Thermofisher. Wykrywanie zmian w analizowanych genach przeprowadzono z wykorzystaniem narzędzi bioinformatycznych Ion Reporter. Średnia wieku pacjentów w momencie rozpoznania AML wynosiła 60 lat. Średnia przeżycia badanej grupy pacjentów, od momentu rozpoznania AML do czasu zgonu, wynosiła 192 dni (8-758 dni). Wśród pacjentów odnotowano 74 zgony. Dla badanej grupy pacjentów wykonano łącznie 144 sekwencjonowania w różnych punktach czasowych. Najwięcej wykrytych zmian stanowiły mutacje w genach FLT3 i NMP1, odpowiednio 22% i 16%. Zaobserwowano liczną grupę pacjentów z mutacją genu TP53 (11%), wiążącą się ze złym rokowaniem i stanowiącą osobną podgrupę w obrębie klasyfikacji AML. Wśród badanych osób odnotowano 3 przypadki, w których pacjenci byli obciążeni występowaniem jednocześnie dwóch zmian genu FLT3 , zarówno formy ITD jak i TKD. Spośród badanych

pacjentów w 14% (n=17) osób nie wykryto żadnej zmiany w analizowanych genach. Wśród badanych pacjentów wykryto zmiany w 33 różnych genach oraz 8 typów fuzji genowych. Część genów charakterystycznych dla AML wykazało obecność mutacji w charakterystycznych hotspotach np. geny FLT3 , IDH1, IDH2, podczas gdy inne wykazywały zróżnicowany profil mutacji np. gen TET2. Większość z raportowanych zmian miała charakter patogenny lub prawdopodobnie patogenny. Wyniki prezentowanych badań wykazały wysoką heterogenność genetyczną wśród badanych pacjentów z AML.

Specjalizacja: hematologia

Tytuł:

Ocena prognostycznej roli współczynnika zmienności rozkładu erytrocytów (RDW) oraz

stosunków poszczególnych populacji leukocytów i płytek krwi u pacjentów chorujących na ostrą białaczkę szpikową

Autor:

Paulina Stefaniuk

Współautorzy:

Paulina Stefaniuk¹, Monika Podhorecka², Marek Hus²

Afiliacja:

1. Szkoła Doktorska Uniwersytetu Medycznego w Lublinie

2. Katedra i Klinika Hematoonkologii i Transplantacji Szpiku Uniwersytetu Medycznego w Lublinie

Wskaźniki:

Neutrocytowo-limfocytowy (NLR), limfocytowo-monocytowy (LMR), płytkowo-limfocytowy (PLR), a także współczynnik zmienności rozkładu objętości erytrocytów (RDW), wyrażony jako współczynnik wariancji (RDW-CV) oraz jako odchylenie standardowe objętości erytrocytów (RDW-SD), stanowią czynniki prognostyczne w wielu nowotworach złośliwych, w tym w niektórych nowotworach hematologicznych. Celem niniejszego badania jest ocena wpływu NLR, LMR, PLR, RDW-SD i RDW-CV, oznaczonych w momencie rozpoznania, na rokowanie u pacjentów chorujących na ostrą białaczkę szpikową (AML).

Badanie miało charakter kohortowy, a grupę badawczą stanowiło 204 dorosłych pacjentów ze świeżo rozpoznaną AML, leczonych w Klinice Hematoonkologii i Transplantacji Szpiku Uniwersytetu Medycznego w Lublinie w latach 2006-2022. Analiza statystyczna została wykonana w oprogramowaniu R w wersji R4.1.2.

NLR, RDW-CV i RDW-SD przyjmowały wartości wyższe, a LMR niższe u pacjentów z brakiem odpowiedzi na leczenie indukujące remisję (NR), w porównaniu do pacjentów z częściową (PR) lub całkowitą odpowiedzią (CR), MD = 0,34 CI95 [0,08;0,49], p = 0,005; MD = 2,00 CI95 [1,10;2,60], p < 0,001; MD = 3,75 CI95 [0,10;6,70], p = 0,043; MD = -0,34 CI95 [-0,91;-0,05], p = 0,015, odpowiednio. W wyniku przeprowadzenia jednoczynnikowych analiz regresji logistycznej, stwierdzono, iż ryzyko NR rosło o 21% wraz z poziomem RDW-CV wyższym o 1 pp, OR = 1,21 CI95 [1,09 - 2,36], p < 0,001 i malało o 5% gdy LMR było wyższe o jednostkę, OR = 0,95 CI95 [0,89 - 0,99], p = 0,045. W wieloczynnikowym modelu regresji logistycznej, NLR i RDW-CV istotnie wpływały na ryzyko NR, OR = 1,02 CI95 [1,00 - 1,04], p = 0,035; OR = 1,05 CI95 [1,02 - 1,09], p = 0,006, wraz z: wiekiem w momencie rozpoznania, punktacją w skali ECOG oraz ryzykiem cytogenetyczno-molekularnym. NLR i RDW-CV były

także czynnikami wpływającymi w analizach jednoparametrycznych na czas wolny od progresji (PFS), HR = 1,20 CI95 [1,09 - 1,33], p < 0,001; HR = 1,10 CI95 [1,04 - 1,17], p = 0,002. W wieloczynnikowej analizie proporcjonalnego hazardu Cox’a, istotnymi czynnikami wpływającymi na PFS były: ryzyko cytogenetyczno-molekularne, poziom leukocytów, a także RDW-CV, HR = 1,15 CI95 [1,04 – 1,27], p = 0,009. Na podstawie krzywych Kaplana-Meiera stwierdzono istotny wpływ NLR, LMR, PLR oraz RDW-CV na czas całkowitego przeżycia (OS). NLR i RDW-CV przyjmowały wartości wyższe, a LMR i PLR niższe u pacjentów zmarłych w porównaniu do pacjentów żyjących po 3 latach od rozpoznania, MD = 0,29 CI95 [0,01;0,48], p = 0,035; MD = 1,50 CI95 [0,80;2,70], p = 0,001; MD = -0,71 CI95 [-1,69;-0,25], p = 0,001; MD = -16,92 CI95 [-25,25;-3,03], p = 0,004, odpowiednio. Chociaż na OS wpływały w analizach jednoparametrycznych: NLR, LMR i RDW-CV, HR = 1,05 CI95 [1,00 - 1,09], p = 0,034; HR = 0,94 CI95 [0,89 - 0,98], p = 0,010; HR = 1,06 CI95 [1,01 - 1,10], p = 0,014, odpowiednio, w wieloczynnikowej analizie nie potwierdzono istotnego statystycznie wpływu tych czynników na OS.

Wykazano, iż wyższe NLR, RDW-CV i RDW-SD, a także niższe LMR i PLR mogą stanowić czynniki złego rokowania w AML. Należy rozważyć przeprowadzenie wieloośrodkowych badań na większej grupie pacjentów celem określenia możliwości praktycznego zastosowania tych tanich i łatwo dostępnych markerów w AML.

Specjalizacja: hematologia

Tytuł:

Nanopore technology emerges from shadows – long-read sequencing-based approach for identification of clinically relevant alterations in chronic lymphocytic leukemia

Autor: Monika Szelest

Współautorzy:

Magdalena Paziewska, Agnieszka Karczmarczyk, Michał Kiełbus, Krzysztof Giannopoulos

Afiliacja:

Department of Experimental Hematooncology, Medical University of Lublin, Poland

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is an incurable disease with a heterogenous clinical course, for which prediction of an individual patient’s response to therapy, as well as an indication regarding long-term prognosis, relies on specific biomarkers, including TP53 mutations, del17p, and IGHV mutation status. Thus, diagnostic screening for these cytogenetic and molecular features is recommended in international clinical guidelines. Since conventional methods have remarkable drawbacks concerning the quantity and quality of input material required, speed, sensitivity, and overall cost, the aim of our study was to develop nanopore-based panels that would serve as a rapid and low-cost alternative to the established CLL testing methods. In this study, we report our experience with the nanopore technology to develop two CLL-specific screening assays.

Eighteen untreated CLL samples collected at diagnosis were included in the study, harbouring both mutated (n=9) and unmutated (n=9) IGHV, seven TP53 mutations, two NOTCH1 mutations, two SF3B1 mutations, one MYD88 mutation, one BIRC3 mutation, and three del17p events. Using the first assay (CLL panel), three cytogenetically characterized samples from peripheral blood of CLL patients were used to simultaneous investigation of TP53 mutations, IGHV mutation status, as well as del17p for an individual patient in a single sequencing run. The second assay (CLL gene panel) was based on multiplex long-template PCR to analyze five selected genes, which are frequently mutated in CLL (TP53 , NOTCH1, SF3B1, BIRC3 , and MYD88) in 18 patients with CLL. Primers for CLL gene panel assay were designed to amplify regions with mutation hotspots in the selected genes, while primers for CLL panel assay were used to amplify exons 1-11 of TP53 along with the IGHV locus. Each primer included specific tails enabling individual sample barcoding. Sequencing was performed using SQK-LSK109 kit according to the manufacturer’s instructions. All samples were sequenced on a MinION sequencer within a ~40 hours sequencing run. Sequencing reads were analyzed using in-house pipeline based on publicly available tools, including BWA-MEM and nglmr aligners, samtools, IGV, and R package ACE. Single nucleotide variants (SNV) and insertions/deletions (indels) were detected and annotated using Varscan and Snpeff, respectively. IGHV mutation status was investigated with NanoIG and mixcr. Results were compared to short-read sequencing data (whole exome sequencing, NextSeq, Illumina) and Sanger sequencing.

In terms of low-coverage whole genome sequencing (WGS) within CLL panel, sequencing of the 3 cases achieved coverage ranging from 1.7x to 3.2x, enabling identification of del17p events. After error

correction of sequencing reads, we could define the somatically hypermutated IGHV region in analyzed cases. Furthermore, we identified SNVs and indels in coding regions of targeted genes using the CLL gene panel with two PCRs per patient, although the average sequencing depth was higher for shorter amplicons.

Although further advances are needed to improve the accuracy of the nanopore technology, the presented strategies offer promise for a manageable and less expensive usage of long-reads-based tools for CLL screening.

The study was founded by Medical University of Lublin (PBsd250 granted to MSz and DS462 granted to KG), and supported by Interdisciplinary Centre for Mathematical and Computational Modelling at the University of Warsaw.

Specjalizacja: hematologia

Tytuł:

Enhanced Response Preceding Stem Cell Transplantation in Plasma Cell Myeloma: Daratumumab-VTD vs. VTD Alone – A Single Center Study

Autor:

Maciej Sławomir Tomasiewicz

Współautorzy:

Anna Czyż, Magdalena Olszewska, Bartłomiej Kuszczak, Agnieszka Szeremet, Maciej Majcherek, Aneta Filipek, Donata Szymczak, Tomasz Wróbel

Afiliacja:

Katedra i Klinika Hematologii, Nowotworów Krwi i Transplantacji Szpiku UM Wrocław

Background:

Plasma cell myeloma (PCM) is an uncurable hematological malignancy. Daratumumab is a monoclonal human IgG? antibody against CD38 on MM cells with direct and indirect antimyeloma activity. The primary aim of this study was to compare the rate of measurable residual disease (MRD) negativity in the bone marrow achieved prior to autologous hematopoietic stem cell transplant (autoHSCT) among the patients treated with daratumumab combined with bortezomib, thalidomide, and dexamethasone (Dara-VTD) and among patients receiving VTD or other three-drugs based regimens including bortezomib and immunomodulatory drug without daratumumab as the first-line treatment. The secondary aims were to compare the rates of responses defined according to International Myeloma Working Group (IMGW) criteria that were achieved prior to autoHSCT in the above mentioned groups. Moreover, we aimed to analyze the correlation between MRD negativity and normalization of the heavy/light chains pairs (HLC) of both normal and tumoral immunoglobulins.

Methods:

In this real-life-data study, we included patients treated with the first autoHSCT after receiving above-mentioned first-line treatment regimens between 2018 and 2024. The clinical data was obtained from medical records. All of the patients had established response to treatment according to IMWG criteria before transplantation. Additionally, in all the patients MRD was assessed in bone marrow prior to autoHSCT, using multiparameter flow cytometric method of sensitivity 10-5 . In addition to the standard myeloma proteins tests, we analyzed the heavy/light chains pairs (HLC) of both normal and tumoral immunoglobulins and their ratio (HLC r) using the Hevylite assay (Biokom product).

Results:

We examined a cohort of 137 individuals including patients with multiple myeloma (MM) (n=115), free light chains disease (n=20) and non-secreting myeloma (n=2) who underwent autoHSCT at our center. A total of 36 patients received Dara-VTD as the first-line treatment, 75 patients VTD regimen and 26 patients other triple therapy without daratumumab. The rate of MRD negativity was higher in Dara-VTD group than in non-daratumumab groups (44.12% vs 20.29% vs 12%; P=0,00784). Similarly, the rate of stringent complete response was higher in Dara-VTD group compared to non-daratumumab groups (57,58% vs. 26,67% vs. 19,23%; P=0.0018), as well as the rates of complete response or better (72.73% vs. 50,67% vs. 42.31%; P=0.00402), and very good partial response or better (93.94% vs. 74.67% vs. 73,08%; P=0.0534). In the

group of patients with negative MRD the rate of normalization of HLC kappa/lambda ratio was significantly higher than in the group of patients with sCR/CR with positive MRD (81.82% vs 49.23%; P=0.0039).

Conclusions:

PCM patients treated with Dara-VTD regimen achieved significantly deeper responses prior to autoHSCT with higher rate of MRD negativity compared to patients treated in the years when Dara-VTD was not available. MRD negativity is an important indicator of treatment response and suggests a deeper and more effective response to therapy. Given the prognostic significance of achieving MRD negativity in PCM patients, the introduction of Dara VTD into first-line treatment holds promise for further enhancing the outcomes of autoHSCT.

Specjalizacja: hematologia

Tytuł:

Gut microbiota and the status of minimal residual disease (MRD) during targeted therapy in chronic lymphocytic leukemia (CLL) – a pilot study

Autor:

Klaudia Zielonka

Współautorzy:

Klaudia Zielonka¹ ², Ewa Wąsiewicz¹, Marcin Jasiński¹ ², Joanna Drozd-Sokołowska¹, Dorota Kruk-Kwapisz³, Marcin Machnicki⁴, Krzysztof Jamroziak¹

Afiliacja:

1. Department of Hematology, Transplantation and Internal Medicine, Medical University of Warsaw, Warsaw, Poland

2. The Doctoral School of the Medical University of Warsaw, Warsaw, Poland

3. Medical University of Warsaw, Warsaw, Poland

4. Department of Tumor Biology and Genetics, Medical University of Warsaw, Warsaw, Poland

5. Human Biome Institute, Warsaw, Poland

Introduction

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is a lymphoid neoplasm of mature B lymphocytes, in the pathogenesis of which the role of gut microbiota (GMB) has been suggested. In recent decade, new targeted therapies like B-cell lymphoma 2 (Bcl-2) inhibitor venetoclax, replaced previous standard-of-care chemoimmunotherapy due to higher efficacy and favorable toxicity profile. However, little is known about predictors of depth of response to venetoclax in CLL including minimal residual disease (MRD) status.

GMB is a collection of microorganisms located within the gastrointestinal tract. Diseases and drugs may lead to its compositional and functional changes, called dysbiosis, which impacts the efficacy of antineoplastic therapy. For example in multiple myeloma, E. hallii was a predictor of MRD-, while F. prausnitzii correlated with MRD+ (Pianko et al., Blood Advances, 2019). In CLL patients treated with FCR (fludarabine, cyclophosphamide, and rituximab) in CLL8 trial, dysbiosis was detected even prior to therapy and correlated with a substantial decrease in progression-free and overall survival. The role of GMB in patients treated with venetoclax for CLL has not been analysed so far. Here we present the first study analyzing GMB in patients treated with venetoclax.

Aim

We aimed to correlate the pre-treatment gut metagenome with the response to first-line therapy with venetoclax and rituximab (VR) in a homogenously treated cohort of CLL patients.

Methods

Fecal samples from previously untreated patients with CLL who have been included to the VERITA PALG-CLL5 trial were collected prior to start of VR therapy and stored frozen at −80°C. For this pilot study, only patients who completed 12 cycles of VR with known MRD status were included. Patients with a history of gastrointestinal and inflammatory diseases and antibiotics one month prior to sampling were excluded. MRD was evaluated in peripheral blood (PB) and bone marrow (BM) samples via flow cytometry as per trial protocol. The bacterial DNA was extracted from the samples using QIAamp Power Fecal Pro DNA and evaluated by its quality. High throughput sequencing of bacterial DNA was performed with Illumina NovaSeq 6000. Taxonomical profiling was done using the QIIME, PATRIC, and other tools. The patients’ GMB profiles based on the taxonomy, alpha and beta diversity, and metabolic pathways were correlated with MRD status at 12 months of VR treatment.

Results

Seventeen CLL patients were included in the pilot study. Ten patients (59%) were male. The median age at VR initiation was 59 (42-77). The median ECOG was 1 (0-1). The median CIRS was 2 (0-9). The median CLL RAI stage was 2 (1-4). Three out of 17 (18%) had del(17p), and 1/17 (6%) had TP53 mutation. After 12 months of VR therapy, 7 (41%) patients were MRD+ (5 in BM, 1 in PB, and 1 in BM and PB), and 10 (59%) patients were MRD-. At the genus level, statistical difference between MRD status and 11 microbes was observed. Streptomyces and butyrate producer Christensenella correlated with MRD(p<0.05), whereas the abundance of Mitsuokella, Turicibacter, Paratractidigestivibacter, Coraliomargarita, Sodaliphilus, Mediterranea, Solobacterium, Fournierella, Haemophilus, Faecalitalea was increased in MRD+ (p<0.05).

This is the first pilot study to analyze GMB in VR therapy in CLL. Our preliminary results may suggest that pre-treatment composition of GMB may have some influence on the probability of achievement of MRD response to venetoclax-based treatment of CLL. Further studies on larger cohort are essential to confirm these early observations.

Wystąpienia plakatowe

Transfuzjologia

Prezentacje plakatowe w czasie sesji: SESJA PLAKATOWA

PT1

Specjalizacja: hematologia

Tytuł:

Charakterystyka serologiczna i molekularna odmian antygenu D – podsumowanie badań konsultacyjnych z lat 2017-2022

Autor: Magda Sierpińska

Współautorzy:

Weronika Kondrat, Monika Pelc-Kłopotowska, Magda Sierpińska, Anna Choromańska-Jurek, Magdalena Krzemienowska, Edyta Błażejewicz, Justyna Smolarczyk-Wodzyńska, Hanna Łopieńska, Sylwia Purchla-Szepioła, Joanna Skulimowska, Klaudia Kozioł, Eliza Głodkowska-Mrówka, Agnieszka Orzińska, Katarzyna Guz

Afiliacja:

Słowa kluczowe: kategorie antygenu D, słaba ekspresja antygenu D, allele RHD

Wstęp:

U około 1% osób rasy kaukaskiej wykrywa się odmiany antygenu D, które powodują trudności w interpretacji wyniku RhD. Określenie odmiany antygenu D metodami serologicznymi jest nieprecyzyjne i ogranicza się do rozróżniania niektórych kategorii antygenu D, podejrzenia D słabego, a w rzadkich przypadkach antygenu DEL. Dokładna charakterystyka odmian antygenu D jest możliwa wyłącznie przy użyciu metod molekularnych. Dawcy z odmianą antygenu D zawsze są określani jako RhD dodatni, ponieważ ich krew może immunizować RhD-ujemnych biorców. Pacjentów i kobiety ciężarne, z wyjątkiem osób u których wykryto allele odpowiedzialne za D słabe typ 1., 2. lub 3., traktuje się jako RhD ujemne. Celem niniejszej pracy była charakterystyka serologiczna i molekularna odmian antygenu D w badaniach konsultacyjnych z lat 2017-2022.

Materiały i metody:

Badano 425 próbek krwi (208 dawców, 167 pacjentów i 50 ciężarnych) z niejednoznacznymi wynikami RhD, przesłanych z Centrów Krwiodawstwa i Krwiolecznictwa. Oznaczenia antygenu D wykonano metodami serologicznymi z zastosowaniem odczynników anty-D różnych klonów: MS-201, RUM-1, alpha LDM1, optimum LDM1/ESD1M, blend LDM3/ESD1, TH28/MS26, zestawu przeciwciał monoklonalnych do określania kategorii D (AlbaBioscience), a także metody adsorpcji/elucji oraz metodami genetycznymi z zastosowaniem testów komercyjnych: RBC-FluoGene CDE, RBC-Dweak/variant (Inno-Train), ID RHD (Grifols), a w niektórych przypadkach konieczne było sekwencjonowanie celowanych eksonów genu RHD metodą Sangera.

Wyniki:

Metodami serologicznymi w 377 próbkach wykryto słabą ekspresję antygenu D. Wśród tych próbek metodami molekularnymi zidentyfikowano allele: RHD*01W.3 (158), RHD*01W.1 (112), RHD*01W.2 (74), RHD*11 (9), RHD*09 (5), RHD*25 (3), RHD*15 (3), RHD*17.05 (2), RHD*01W.1/*01W.3 (2), RHD*07.01/02 (2), RHD*01W.1/*11, RHD*01W.17, RHD*01W.41, RHD*01W.61, RHD*13.01, RHD*16.01, RHD*19. Allele RHD*01W.1, *01W.2 lub *01W.3 zidentyfikowano u 346/425 badanych, w tym u 225 kobiet, z czego 39 stanowiły kobiety ciężarne. Badaniami serologicznymi określono 33/425 (7,8%) próbek jako kategorie antygenu D (DFR (17): RHD*15 (12), RHD*17.01/05 (5); DVI: RHD*06.01/02/03 (9); DVII: RHD*07.01/02 (5); DIV: RHD*04.04; DV: RHD*05.05). W 1 próbce wykryto antygen DEL: RHD*11. Metodą sekwencjonowania zidentyfikowano allele: RHD*09, RHD*16.01, RHD*13.01, RHD*17 oraz RHD*01W.61. Pozostałe 14 przypadków wymaga dalszej identyfikacji alleli.

Wnioski:

Allele RHD*01W.1, *01W.2 lub *01W.3 wykryto u ponad 80% osób badanych, co pozwala określić je jako RhD dodatnie, niepodatne na alloimmunizację i przetaczać im krew RhD dodatnią. W tej grupie 65% stanowiły kobiety, które nie wymagałyby immunoprofilaktyki.

Praca została sfinansowana ze środków dotacji celowanej Ministra Zdrowia na zadania Instytutu wskazane w ustawie o Publicznej Służbie Krwi.

PT2

Specjalizacja: transfuzjologia

Tytuł:

Charakterystyka serologiczna i molekularna grup krwi ABO w badaniach konsultacyjnych w latach 2015-2022

Autor:

Edyta Błażejewicz

Współautorzy:

Sylwia Purchla-Szepioła, Weronika Kondrat, Anna Choromańska-Jurek, Magda Sierpińska, Monika Pelc-Kłopotowska, Joanna Skulimowska, Magdalena Krzemienowska, Justyna Smolarczyk-Wodzyńska, Klaudia Kozioł, Eliza Głodkowska-Mrówka, Agnieszka Orzińska, Katarzyna Guz

Afiliacja:

ZIHiT (Zakład Immunologii Hematologicznej i Transfuzjologicznej) Instytut Hematologii i Transfuzjologii w Warszawie

Słowa kluczowe:

grupa krwi ABO, słaba ekspresja antygenów A i/lub B, genotypowanie, allel ABO*A, allel ABO*B

Wprowadzenie:

Oznaczanie grupy krwi w układzie ABO jest podstawowym badaniem wykonywanym przed przetoczeniem krwi. W niektórych przypadkach obserwuje się słabą ekspresję antygenu A lub B, mieszaną populację krwinek czy odstępstwa od reguły Landsteinera (obecność/brak antygenów i/lub regularnych przeciwciał), co sprawia, że wydanie wyniku grupy krwi wymaga wykonania dodatkowych badań. Genotypowanie genu ABO umożliwia identyfikację molekularnego podłoża takich rozbieżności.

Cel:

Charakterystyka serologiczna i molekularna grup krwi ABO - podsumowanie 8-letnich badań konsultacyjnych u osób z nietypowymi wynikami grupy ABO.

Materiał:

Analizie poddano wyniki badań konsultacyjnych 260 próbek krwi badanych w latach 2015-2022 IHiT: 118 ze słabą ekspresją antygenu A, 26 ze słabą ekspresją antygenu B, 76 z odstępstwem od reguły Landsteinera, 40 z populacją mieszaną.

Metody:

Oznaczanie grupy ABO: 1) metoda mikrokolumnowa (DiaMed/Bio-Rad): DiaClon ID ABO/D: anty-A(A5); anty-B(G1/2); anty-A,B (ES131,ES15+BIRMA1+ES4); DiaClon ID ABD Confirmation for Donors: anty-A(M297/628=LA-2); anty-B(LM306/386=LB-2), 2) metoda probówkowa: anty-A(BIRMA1;A-11H5,c.9113D10), anty-B(LB-2,B-6F9, c.9621A8), krwinki wzorcowe A1, B, O. 3) metoda adsorpcji/elucji.

Genotypowanie genu ABO: 1) testy qPCR: RBC-Ready Gene ABO, RBC FluoGene ABO Basic, RBC NX FluoGene ABO Plus (Inno-Train); 2) sekwencjonowanie metodą Sangera: fragment +7.21kb (intron 1-3’UTR); dodatkowo ekson 1 i fragment +5.8kb w intronie 1, z użyciem primerów do PCR/sekwencjonowania (ThermoFisher).

Wyniki:

Słabą ekspresję antygenu A wykryto u 118/260 (45%) osób. W 105/118 (89%) przypadkach testami qPCR wykryto allel ABO*A. U 21/118 (18%) osób metodą sekwencjonowania ustalono obecność alleli: ABO*A_c.dup543_563 (7), ABO*AW.30.01 (5), ABO*AW.13 (3), ABO*A_c.900G>A (1), ABO*AW.04 (1), ABO*AW.06 (1), ABO*AW.31.02-05 (1), ABO*A2.12 (1). W 13/118 (11%) badań, w których nie wykryto allelu ABO*A testami qPCR, jedynie w 1 z 8 próbek sekwencjonowanie wykazało obecność mikrochimeryzmu allelu ABO*A.

Słabą ekspresję antygenu B obserwowano u 26/260 (10%) osób. Testy qPCR potwierdziły obecność allelu ABO*B u 22/26 (85%) przypadków. U 11 osób wykonano dodatkowo sekwencjonowanie i zidentyfikowano warianty: ABO*cisAB_c.796C>A (7), ABO*B c.28+5858T>C (3) z mutacją w regionie regulatorowym GATA box w intronie 1, ABO*O.01.02vB.01 (1). U 2/26 (4%) osób nie wykryto allelu ABO*B testami qPCR. W obu przypadkach wykonano sekwencjonowanie, które u jednej osoby wskazało obecność mikrochimeryzmu allelu ABO*B. U drugiej osoby nie wyjaśniono przyczyn rozbieżności.

U 76/260 (29%) przypadków w rutynowych oznaczeniach grupy krwi nie zaobserwowano regularnych przeciwciał anty-A i/lub anty-B. Zastosowanie dodatkowych testów serologicznych pozwoliło wykryć słabe przeciwciała anty-A i/lub anty-B. W 74/76 (97%) badania genetyczne potwierdziły grupę krwi badanych osób.

Próbki krwi z aglutynacją mieszaną stanowiły 40/260 (15%). W 37/40 (93%) badania genetyczne wykryły allel ABO*A lub ABO*B.

Wnioski:

Charakterystyka serologiczna i molekularna słabych odmian antygenów ABO w 245/260 (94%) pozwala na przetoczenie krwi jednoimiennej i zaoszczędzenie KKCz grupy O.

U 19/260 (7%) osób wykryto nowe warianty alleli ABO wpływające na aktywność transferaz A lub B.

Badania finansowane z dotacji na publiczną służbę krwi oraz z planu naukowego IHiT C10-T2-2019-2021.

PT3

Specjalizacja: transfuzjologia

Tytuł:

Optymalizacja dostępności koncentratów krwinek płytkowych o określonych antygenach płytkowych w RCKiK w Lublinie, jako postępowanie zwiększające bezpieczeństwo transfuzji u pacjentów zimmunizowanych

Autor:

Berta Fal

Współautorzy:

Anna Tatarczak, Małgorzata Orzeł

Afiliacja:

Regionalne Centrum Krwiodawstwa i Krwiolecznictwa w Lublinie

Wprowadzenie:

Zapewnienie skutecznego i bezpiecznego przetaczania składników krwi pacjentom z alloimmunizacją, wskutek niezgodności w antygenach układu HPA, wymaga dostępności koncentratów krwinek płytkowych (KKP) od dawców nieposiadających antygenów, będących przyczyną uodpornienia. Dysponowanie KKP o określonych antygenach HPA ma szczególne znaczenie w leczeniu alloimmunologicznej małopłytkowości płodu/noworodka (AIMPN). Około 80% przypadków AIMPN w populacji kaukaskiej rozwija się w wyniku immunizacji antygenem HPA-1a. Z tego względu dysponowanie KKP od dawców HPA-1a ujemnych jest istotnym aspektem zwiększającym możliwości terapeutyczne. W Pracowni Kontroli Jakości i Cytometrii Przepływowej RCKiK w Lublinie prowadzone są badania przesiewowe w kierunku obecności antygenu HPA-1a techniką cytometrii przepływowej. Postępowanie ma na celu efektywne wyodrębnienie grupy dawców należących do nielicznej populacji osób nieposiadających tego antygenu. Następnie w Pracowni Krwinek Płytkowych i Białych przeprowadzane są badania potwierdzające występowanie genotypu HPA-1b/b w próbkach krwi wytypowanych dawców z kolejnych dwóch pobrań oraz określenie pozostałych antygenów układu HPA (HPA-2 – 6, HPA-8 – 9, HPA11 i HPA-15) metodą PCR-SSP. Celem niniejszej pracy było podsumowanie wyników 2-letnich badań przesiewowych wielokrotnych dawców krwi w kierunku antygenu HPA-1a przeprowadzonych w RCKiK w Lublinie.

Materiał i metoda:

Materiałem do badań fenotypowania antygenu HPA-1a było osocze bogatopłytkowe dawców krwi. Kryteria włączenia do badań przesiewowych, w zależności od etapu zaawansowania, kwalifikowały mężczyzn w wieku od 18 do 55 lat oraz od 18 do 45 lat, będących wielokrotnymi dawcami krwi i jej składników, bez transfuzji w wywiadzie. Zasada metody opierała się na reakcji przeciwciał anty-CD61 klasy IgG1 (klon SZ21), specyficznych dla formy PIA1 (HPA-1a) i niewiążących się z formą PIA2 (HPA-1b) glikoproteiny płytkowej GPIIIa z antygenem HPA-1a.

Wyniki:

W latach 2022-2023 wykonano badania przesiewowe w kierunku antygenu HPA-1a w grupie 5 359 dawców. Fenotyp HPA-1a ujemny stwierdzono ogółem u 136 (2,54%) mężczyzn. W pierwszym etapie badań, trwającym 6 miesięcy, screening przeprowadzono z włączeniem wszystkich grup układów ABO i Rh, i wyodrębniono 91 (2,69%) dawców HPA-1a ujemnych. Dalszym testowaniem objęto wyłącznie dawców z grupą O i AB. Analiza rozkładu wyników wskazała na różnice w częstości występowania fenotypu HPA-1a ujemnego w poszczególnych grupach krwi. Odsetki dawców nieposiadających badanego antygenu wyniosły kolejno: w grupie A – 3,36% (44/1308, w tym 6 RhD-), w grupie O – 2,42% (64/2643, w tym 13 RhD-), w grupie B – 2,12% (16/756, w tym 4 RhD-), w grupie AB – 1,84% (12/652, w tym 2 RhD-). Dotychczas badania potwierdzające wykonano w grupie 90 ze 136 dawców HPA-1a ujemnych wytypowanych w badaniu przesiewowym, w tym 47 dawców z dwukrotnym wynikiem badań genotypu. Porównanie wyników badań przesiewowych i potwierdzających wskazało na 100% zgodność fenotypu i genotypu antygenu HPA-1a.

Wnioski:

Badania przesiewowe wielokrotnych dawców krwi w kierunku antygenu HPA-1a techniką cytometrii przepływowej stanowiły skuteczne i ekonomiczne narzędzie do wyodrębniania nielicznej populacji osób HPA-1a ujemnych do dalszego genotypowania HPA. Wdrożenie dwuetapowego schematu badań antygenów płytkowych wielokrotnych dawców krwi w RCKiK przyczynia się do poszerzenia rejestru dawców z określonymi, rzadziej występującymi antygenami HPA, umożliwiając optymalizację dostępności KKP i zwiększenie bezpieczeństwa transfuzji u pacjentów zimmunizowanych.

Specjalizacja: transfuzjologia

Tytuł:

Analiza zapotrzebowania na zgodne antygenowo KKCz dla pacjentów zimmunizowanych –raport wstępny z lat 2019-2021 poprzedzających program polityki zdrowotnej MZ „Zapewnienie samowystarczalności RP w krew i jej składniki na lata 2021-2026”

Autor:

Katarzyna Guz

Współautorzy:

Monika Pelc-Kłopotowska, Eliza Głodkowska-Mrówka, Agnieszka Orzińska

Afiliacja:

Instytut Hematologii i Transfuzjologii, Zakład Immunologii Hematologicznej i Transfuzjologicznej

Wstęp

Pierwotna immunizacja antygenami krwinek czerwonych wywołana ciążą i/lub przetoczeniem krwi dotyka ok. 1-3% populacji pacjentów. Ryzyko immunizacji wzrasta u wielokrotnych biorców koncentratów krwinek czerwonych (KKCz), m.in. w niektórych chorobach hematologicznych (16-19% w NAIH; 19-47% w hemoglobinopatiach; 3-59% w zespole MDS). Poszukiwanie zgodnego dawcy dla zimmunizowanych biorców krwi jest wyzwaniem dla publicznej służby krwi, zwłaszcza gdy są to alloprzeciwciała wieloswoiste lub skierowane do antygenów powszechnych. Dobieranie KKCz w próbie zgodności wymaga wtedy przebadania dużej liczby próbek i wiąże się z ryzykiem niepowodzenia. Możliwość przeszukania odpowiednio licznego rejestru dawców krwi z oznaczonym antygenami Rh(C,c,E,e), Kell (K,k), Jk(a.b), Fy(a,b), S,s (z tzw. rozszerzonym fenotypem), zawierającego też dawców o rzadkich grupach krwi, jest optymalnym rozwiązaniem skracającym czas poszukiwania zgodnych dawców. Dlatego w ramach programu polityki zdrowotnej Ministerstwa Zdrowia „Zapewnienie samowystarczalności Rzeczypospolitej Polskiej w zakresie krwi i składników krwi na lata 2021-2026” zaplanowano zwiększenie dostępności do dawców o homozygotycznych fenotypach w zakresie klinicznie istotnych antygenów czerwonokrwinkowych, w tym o rzadkich grupach krwi, a jego istotnym elementem było wstępne rozpoznanie potrzeb zimmunizowanych pacjentów w Polsce.

Cel:

Określenie wymagań transfuzjologicznych polskiej populacji biorców poprzez analizę częstości występowania i swoistości alloprzeciwciał u zimmunizowanych biorców KKCz w latach 2019-2021.

Materiał i metody:

W zbieraniu danych i wypełnieniu ankiet przygotowanych przez Instytut Hematologii i Transfuzjologii (IHiT) wzięło udział 17 Regionalnych Centrów Krwiodawstwa i Krwiolecznictwa (RCKiK). Formularze o liczbie zimmunizowanych pacjentów wypełniły wszystkie Centra, a 9 RCKiK podało szczegółowe dane o swoistości alloprzeciwciał. Analizę danych z odesłanych formularzy przeprowadzono w IHiT.

Wyniki:

W sumie do analizy włączono dane 22 038 pacjentów z wykrytymi alloprzeciwciałami do antygenów czerwonokrwinkowych. U 5934 (41,1%) z nich zaraportowano swoistość przeciwciał. U 79,9% osób obserwowano pojedyncze swoistości przeciwciał, a u 20,1% przeciwciała wieloswoiste (do 2-6 antygenów). Były to przeciwciała wobec antygenów: D, C, c, E, e z układu Rh (55,7%), antygenu K z układu Kell (19,9%), antygenów z układu Kidd, Duffy, MNS (19,7%), z następującym rozkładem swoistości do antygenów: M (6,4%), Jka (5,2%), Fya (4,2%), S (2,1%), Jkb (0,8%), Fyb (0,6%), s (0,2%) i N (0,2%); wobec innych antygenów (4,8%), w tym 0,24% wobec antygenów powszechnych (k, Kpb, H, LWa, Yta, Lub, Lan) lub o niskiej częstości występowania (Ytb, Kpa).

Wnioski:

Około 75% zimmunizowanych polskich pacjentów wymaga doboru w zakresie antygenów Rh (D, C, c, E, e) i fenotypu K-ujemnego, a kolejne 20% doboru w zakresie antygenów Jka, Jkb, Fya, Fyb, M, N, S lub s. Dlatego zasób dawców KKCz o oznaczonych homozygotycznych fenotypach w tych klinicznie istotnych antygenach powinien być stale poszerzany. Potrzeby pacjentów z wieloswoistymi przeciwciałami oraz z przeciwciałami do antygenów powszechnych, wytyczają zakres dodatkowego typowania metodami molekularnymi, jakimi powinni być objęci dawcy KKCz, w celu identyfikacji dawców o rzadkich grupach krwi, poszukiwanych dla polskich biorców.

PT5

Specjalizacja: transfuzjologia

Tytuł:

Analiza zasobów wielokrotnych dawców o ujemnych fenotypach w klinicznie istotnych antygenach czerwonokrwinkowych, w tym o rzadkich grupach krwi, w latach 2019-2021 – raport wstępny programu polityki zdrowotnej MZ „Zapewnienie samowystarczalności RP w krew i jej składniki na lata 2021-2026”

Autor:

Katarzyna Guz

Współautorzy:

Monika Pelc-Kłopotowska, Eliza Głodkowska-Mrówka, Agnieszka Orzińska

Afiliacja:

Instytut Hematologii i Transfuzjologii w Warszawie, Zakład Immunologii Hematologicznej i Transfuzjologicznej

Wstęp

Poszukiwanie zgodnego dawcy dla biorców zimmunizowanych antygenami czerwonokrwinkowymi stanowi wyzwanie dla publicznej służby krwi, jeśli u pacjenta obecne są alloprzeciwciała wieloswoiste lub skierowane do antygenów powszechnych. Dobieranie w próbie zgodności wymaga wtedy przebadania dużej liczby próbek i mimo to może być nieskuteczne. Optymalną drogą do wybrania potencjalnie zgodnych dawców jest przeszukanie odpowiednio licznego rejestru dawców krwi z oznaczonymi rozszerzonymi fenotypami, w tym o rzadkich grupach krwi. W ramach programu polityki zdrowotnej Ministerstwa Zdrowia „Zapewnienie samowystarczalności Rzeczypospolitej Polskiej w zakresie krwi i składników krwi na lata 2021-2026” zaplanowano zwiększenie dostępności do dawców o homozygotycznych fenotypach w zakresie klinicznie istotnych antygenów czerwonokrwinkowych oraz utworzenie krajowego rejestru dawców rzadkich grup krwi. Jego istotnym elementem było wstępne oszacowanie zasobów dawców wielokrotnych o homozygotycznych fenotypach w zakresie klinicznie istotnych antygenów i ocena dopasowania do potrzeb zimmunizowanych polskich pacjentów.

Cel:

3-letnia analiza (2019-2021) zasobów wielokrotnych dawców KKCz z oznaczonymi antygenami Rh (C, c, E, e), Kell (K, k), Jk (a, b), Fy (a, b), S, s, w celu oszacowania wymagań transfuzjologicznych polskiej populacji dawców i biorców.

Materiał i metody:

W zbieraniu danych i wypełnieniu ankiet przygotowanych przez Instytut Hematologii i Transfuzjologii (IHiT) wzięło udział 17 Regionalnych Centrów Krwiodawstwa i Krwiolecznictwa (RCKiK). Analizę danych z odesłanych formularzy przeprowadzono w IHiT.

Ankietowanie o zasobach wielokrotnych dawców KKCz obejmowało dawców grupy O+, O-, A+, A-, B+, B-; w wieku 18-45 lat, z min. 2 donacjami w latach 2019-2021, bez stałych dyskwalifikacji, z potwierdzonym fenotypem. Analiza dotyczyła 4 podgrup i stopnia oznaczenia antygenów Jk (a, b), Fy (a, b), Ss (brak, częściowe lub pełne oznaczenie) u dawców: 1/ z pełnym fenotypem Rh (C, c, E, e) i Kell (K+ k-, K- k+, K-); 2/ homozygot Rh (C, c,E, e, w tym C+ Cw+ c-) i Kell (K+ k-, K- k+, K-); 3/ wieloukładowych homozygot Rh (C, c, E, e, w tym C+ Cw+ c-), Kell (K+ k-, K- k+, K-), Jk (a+ b-), Jk (a- b+), Fy (a+ b-), Fy (ab+), S+ s-, S- s+; 4/ o rzadkich grupach krwi (wiek 18-65 lat, bez wymogu oznaczeń antygenów Rh, Kell, Jk, Fy, MNS).

Wyniki:

Analiza danych ankietowych wykazała następujące zasoby dawców KKCz w 4 podgrupach: 1/ pełen fenotyp Rh (C, c, E, e) i Kell (K+ k-, K- k+, K-): 267 027 dawców, w tym 6,4% z pełnym, a 19,2% z częściowym oznaczeniem antygenów Jk (a, b), Fy (a, b), S, s; 2/ homozygoty Rh (C, c, E, e) i Kell (K+ k-, K- k+, K-): 131 649 dawców, w tym 47,7% z częściowym lub pełnym oznaczeniem antygenów Jk (a, b) i/lub Fy (a, b) i/lub MNS (S, s, M, N), ale z 16-18% poziomem oznaczenia w poszczególnym antygenach; 3/ 3465 dawców wieloukładowych homozygot w głównych antygenach z układów Rh, K/k, Jk, Fy, MNS (5,5% spośród dawców z częściowym lub pełnym oznaczeniem antygenów Jka, Jkb, Fya, Fyb, S, s); 4/204 dawców K+k-, 19 dawców o innych rzadkich fenotypach: Yt(a-), Lan-, Rh51(-), Lu(b-), Kp(b-), Kn(a-), Fy3(-), OhA

Wnioski:

1. Zasób dawców KKCz o oznaczonych homozygotycznych fenotypach w klinicznie istotnych antygenach powinien być stale poszerzany, szczególnie u dawców homozygot Rh i K/k, bo poziom oznaczenia poszczególnych antygenów Jk, Fy, MNS wynosi poniżej 18%.

2. Dostępność dawców dla pacjentów z wieloswoistymi lub powszechnymi przeciwciałami jest ograniczona i wymaga dotypowania dużej skali dawców.

PT6

Specjalizacja: transfuzjologia

Tytuł:

Nieinwazyjna diagnostyka genotypu KEL*01.01 płodu dla kobiet z przeciwciałami anty-K

Autor:

Magdalena Krzemienowska

Współautorzy:

Agnieszka Orzińska, Sylwia Purchla-Szepioła, Justyna Smolarczyk-Wodzyńska, Klaudia Kozioł, Izabella Kopeć, Małgorzata Uhrynowska, Eliza Głodkowska-Mrówka, Katarzyna Guz

Afiliacja:

Instytut Hematologii i Transfuzjologii, Warszawa, Polska

Wstęp:

W trakcie ciąży kobiety K-ujemne mogą wytwarzać alloprzeciwciała skierowane przeciwko antygenowi K z układu Kell występującemu na krwinkach czerwonych płodu, co może prowadzić do choroby hemolitycznej płodu/noworodka. Przeciwciała anty-K nie są jednak groźne, jeśli płód nie odziedziczył antygenu K. Nieinwazyjne badania genotypu KEL*01.0 1 płodu wykonywane z DNA wyizolowanego z osocza kobiety ciężarnej pozwalają przewidzieć status dziecka i podjąć decyzję dotyczącą prowadzenia ciąży.

Cel:

Opracowanie protokołu badań nieinwazyjnych genotypu KEL*01.0 1 płodu u ciężarnych K- ujemnych techniką cyfrowego PCR (crystal digital PCR).

Metody:

W DNA wyizolowanym z osocza 7 kobiet z przeciwciałami anty-K (16-26 tydzień ciąży, miano anti-K 1:8-1024) i 3 dawców (K/k, k/k, 5% K+/SRY+) oznaczano obecność alleli KEL*01.0 1, KEL *02 i genu SRY (gen kontrolny płci męskiej) w reakcji typu tripleks techniką cdPCR, stosując sondy znakowane FAM, VIC lub Cy5, przy użyciu aparatu Naica 6-color Crystal Digital PCR (Stilla). Otrzymane wyniki KEL*01.0 1 porównano z fenotypem/genotypem i płcią dawcy/płodu.

Wyniki:

Uzyskane techniką cdPCR wyniki genotypowania KEL*01.01/*02 i SRY były zgodne z genotypem dawców, kobiet ciężarnych i ich dzieci. Całkowita frakcja cfDNA u 7 ciężarnych wynosiła od 855 do 3422 kopii/ml osocza. W 3 przypadkach kobiet noszących K dodatni płód allel KEL*01.0 1 wykryto na poziomie 16-169 kopii/ml osocza. W 4 przypadkach kobiet noszących K ujemny płód nie wykryto amplifikacji allelu KEL*01.01 (brak pozytywnych odczytów cdPCR). W 6 przypadkach kobiet noszących płód płci

męskiej wykryto 21-97 kopii genu SRY/ml osocza, natomiast w 1 przypadku kobiety noszącej płód płci żeńskiej brak było SRY pozytywnych odczytów cdPCR.

Wnioski:

Opracowany protokół nieinwazyjnego badania prenatalnego techniką ddPCR pozwala określić specyficznie genotyp KEL*01.0 1 płodu, jak i inne cechy kontrolne pochodzące od płodu lub matki w tym samym eksperymencie.

PT7

Specjalizacja: transfuzjologia

Tytuł:

Poważne niepożądane reakcje poprzetoczeniowe po transfuzji UKKP - opis serii przypadków

Autor:

Patrycja Łopacz

Współautorzy:

Łopacz Patrycja¹, Szczepaniak Beata¹, Sokół Ewelina¹, Główka Anna¹, Sierocka Beata¹, Spychała Paula¹, Cios Aleksandra¹, Orzińska Agnieszka¹, Uhrynowska Małgorzata¹, Witkowska Agnieszka², Nowak Jacek², Guz Katarzyna¹, Głodkowska-Mrówka Eliza¹

Afiliacja:

1. Zakład Immunologii Hematologicznej i Transfuzjologicznej, Instytut Hematologii i Transfuzjologii w Warszawie

2. Zakład Immunogenetyki, Instytut Hematologii i Transfuzjologii w Warszawie

WPROWADZENIE:

Przeciwciała anty-HLA/anty-HPA u biorcy mogą powodować oporność na transfuzje koncentratów krwinek płytkowych (KKP) i poważne niepożądane reakcje poprzetoczeniowe (PNRP). Odpowiedni dobór dawców KKP jest niezbędny do uzyskania poprawy skuteczności przetoczeń. Dobór dawców KKP częściowo zgodnych bez określenia swoistości przeciwciał anty-HLA u biorcy może być nieskuteczny i prowadzić do PNRP.MATERIAŁ: 3 pacjentów (P#1, P#2, P#3), u których doszło do PNRP w trakcie (P#1, P#2) lub po 50 min od transfuzji (P#3) UKKP. Pacjentom przetoczono 1 j. UKKP z aferezy od dawcy przypadkowego (P#1) lub dobranych na podstawie ujemnej próby krzyżowej w teście limfocytotoksycznym (LCT) (P#2, P#3). Do badań wykorzystano surowice sprzed i/lub po transfuzji 2 pacjentek zimmunizowanych antygenami HLA oraz 1 pacjentki - HLA i HPA; pozostałości 3 UKKP, krew pełną dawców pobraną na EDTA.

METODY:

Przeciwciała anty-HLA badano w testach: LCT, LABScreen Mixed, C1qScreen, Single Antigen Class I i Class II (One Lambda) w technologii Luminex. Przeciwciała przeciwpłytkowe badano w testach: immunoenzymatycznym MAIPA i PAKLx (Immucor) (Luminex). Genotyp HLA dawców UKKP oznaczono techniką PCR Luminex SSO (One Lambda).

WYNIKI:

P#1 Wykryte przeciwciała: anty-HLA kl. I i II w testach LCT (PRA 80%) i Luminex; anty-HPA-5b Dobór KKP: od przypadkowego dawcy Kompatybilność swoistości przeciwciał biorcy z antygenami HLA dawcy: anty-HLA A24, A30, B27, Cw2 odpowiadające antygenom HLA dawcy A*24, A*30, B*27, C*02 Możliwa przyczyna PNRP: Obecność przeciwciał anty-HLA; Przetoczenie KKP od przypadkowego

dawcy, zamiast dobranego w antygenach HLA i HPA P#2Wykryte przeciwciała: anty-HLA kl. I i II niereagujące w teście LCT Dobór KKP: próba krzyżowa w teście LCT Wynik próby krzyżowej: ujemny Przeciwciała w przetoczonym UKKP: nie wykryto Kompatybilność swoistości przeciwciał biorcy z antygenami HLA dawcy: anty-HLA B13, A30, DR7, DQ2, DQ5 odpowiadające antygenom HLA dawcy A*30, B*13, DRB1*07, DQA1*02, DQB1*02 DQA1*05 Możliwa przyczyna PNRP: Obecność przeciwciał anty-HLA niereagujących w teście LCT. P#3 Wykryte przeciwciała: anty-HLA kl. I i II w testach: LCT (PRA 82%)* i Luminex Dobór KKP: próba krzyżowa w teście LCT Wynik próby krzyżowej: ujemny wynik z surowicą pobraną sprzed 14 dni, dodatni z surowicą pobraną po wystąpieniu PNRP Przeciwciała w przetoczonym UKKP: nie wykryto Kompatybilność swoistości przeciwciał biorcy z antygenami HLA dawcy: anty-HLA Cw5, B8, B18, A 30 odpowiadające antygenom HLA dawcy C*05, B*08 , B*18, A*30 Możliwa przyczyna PNRP: Obecność nowych swoistości przeciwciał anty-HLA w surowicy biorcy, niewykryte w materiale pobranym sprzed 14 dni – fałszywie ujemny wynik próby krzyżowej w teście LCT (brak świeżo pobranego materiału biorcy).

WNIOSKI:

Systematyczne badanie przeciwciał anty-HLA w teście LCT u wielokrotnych biorców, u których wykryto przeciwciała tylko w testach Luminex, umożliwi lepszy nadzór nad prawidłowym doborem dawców KKP dla zapewnienia optymalnego doboru dawców KKP i ograniczenia ryzyka wystąpienia przypadków PNRP

• wskazane wykonywanie próby krzyżowej w teście LCT z surowicą biorcy, pobraną nie później niż 72 h przed przetoczeniem KKP

• przy doborze dawców z Rejestru zalecane badanie swoistości przeciwciał anty-HLA u wielokrotnych biorców- KKP dla biorców z przeciwciałami anty-HLA od dawców z Rejestru zgodnych w 3-4 antygenach HLA z biorcą, bez antygenów HLA do których biorca wytworzył przeciwciała.

Praca została częściowo sfinansowana ze środków dotacji celowanej MZ na zadania Instytutu wskazane w ustawie o PSK.

PT8

Specjalizacja: transfuzjologia

Tytuł:

Nieinwazyjna diagnostyka genotypu HPA-1a płodu dla kobiet z przeciwciałami anty HPA-1a

Autor:

Justyna Smolarczyk-Wodzyńska

Współautorzy:

Sylwia Purchla-Szepioła, Justyna Smolarczyk-Wodzyńska Agnieszka Orzińska, Magdalena Krzemienowska, Klaudia Kozioł, Izabella Kopeć, Małgorzata Uhrynowska, Eliza Głodkowska-Mrówka, Katarzyna Guz

Afiliacja:

Instytut Hematologii i Transfuzjologii, Warszawa, Polska

Wprowadzenie:

Najczęstszą przyczyną alloimmunologicznej małopłytkowości płodów/noworodków (AIMPN) jest alloimmunizacja kobiet HPA-1a ujemnych antygenem HPA-1a płodu/noworodka w trakcie ciąży lub po porodzie. Przeciwciała anty-HPA-1a nie wywołają choroby, jeśli płód nie odziedziczył antygenu HPA-1a. Nieinwazyjne badania genotypu antygenu HPA-1a płodu wykonywane z DNA wyizolowanego z osocza kobiety ciężarnej pozwalają przewidzieć status dziecka i podjąć decyzję dotyczącą dalszego prowadzenia ciąży.

Cel:

Opracowanie protokołu badań nieinwazyjnych antygenu HPA-1a płodu u ciężarnych HPA-1a ujemnych techniką cyfrowego PCR (crystal droplet PCR, cdPCR).

Materiał i metody:

DNA z próbek osocza od kobiet ciężarnych z wykrytymi przeciwciałami anty-HPA-1a, (n=6, od 15 do 23 tygodnia ciąży) wyizolowane automatycznie na aparacie easyMag (Biomerieux) badano metodą cdPCR na obecność alleli ITGB3, kodujących antygeny HPA-1a i HPA-1b, oraz genu SRY (gen kontrolny płci męskiej) w reakcji typu triplet, stosując allelospecyficzne sondy znakowane FAM, VIC ( Life Technologies) lub Cy5 ( Metabion), na aparacie Naica 6-color Crystal Digital PCR (Stilla). Otrzymane wyniki porównano z genotypem HPA-1 i płcią płodu.

Wyniki:

U 3/6 kobiet, noszących HPA-1a dodatni płód, techniką cdPCR wykryto od 2,23 do 3 kopii allelu HPA-1A/ml osocza (24-30 odczytów). W 2/3 przypadkach matek płodów płci męskiej, wykryto 2,44-3,3 kopii genu SRY (23-33 odczytów pozytywnych).

W 3/6 przypadkach ciężarnych noszących HPA-1a ujemny płód, uzyskano od 0,1 do 0,5 kopii allelu HPA-1a/ml osocza (1-6 odczytów pozytywnych). U 2 z tych kobiet noszących HPA-1a ujemnego chłopca wykryto 1,47-2,12 kopii genu SRY/ml osocza (16-21 odczytów pozytywnych).

U 2/6 ciężarnych noszących płód – dziewczynkę wykryto 0,1-0,2 kopii genu SRY/ml osocza (1-2 odczyty pozytywne).

Wnioski:

Zastosowany protokół badania genotypu HPA-1a i płci płodu pozwala na wykrycie allelu HPA-1a i genu SRY płodu w osoczu kobiet ciężarnych, lecz cdPCR wymaga dalszej optymalizacji w celu podwyższenia specyficzności badania allelu HPA-1a i genu SRY.

PT9

Specjalizacja: transfuzjologia

Tytuł:

Konflikt matczyno-płodowy w zakresie antygenów HPA w Polsce – analiza retrospektywna przypadków diagnozowanych w latach 2018-2022

Autor:

Ewelina Sokół

Współautorzy:

Sokół Ewelina, Łopacz Patrycja, Gierszon Agnieszka, Główka Anna, Sierocka Beata, Szczepaniak Beata, Cios Aleksandra, Spychała Paula, Uhrynowska Małgorzata , Łopieńska Hanna, Krzemienowska Magdalena, Smolarczyk-Wodzyńska Justyna,Kozioł Klaudia, Skulimowska Joanna, Orzińska Agnieszka, Guz Katarzyna, Głodkowska-Mrówka Eliza

Afiliacja:

Zakład Immunologii Hematologicznej i Transfuzjologicznej IHiT Warszawa

WPROWADZENIE

Badania przesiewowe w kierunku konfliktu matczyno-płodowego w zakresie antygenów płytek krwi (HPA) nie są w Polsce wykonywane rutynowo. Choroba jest zwykle rozpoznawana dopiero po urodzeniu dziecka z małopłytkowością lub jej powikłaniami. Poważnym następstwem konfliktu jest alloimmunologiczna małopłytkowość płodu/noworodka (AIMP/N), która może prowadzić do istotnych klinicznie krwawień w życiu płodowym lub tuż po urodzeniu, w tym krwawień do ośrodkowego układu nerwowego. Choroba może wystąpić już w pierwszej ciąży i zazwyczaj nawraca w kolejnych, co podkreśla zasadność prowadzenia kompleksowej diagnostyki.

W niniejszej pracy podjęliśmy się analizy retrospektywnej wyników badań w kierunku konfliktu matczyno-płodowego w zakresie antygenów HPA przeprowadzonych w Polsce w latach 2018-2022 w celu oceny skali problemu i roli diagnostyki w profilaktyce AIMP/N.

MATERIAŁ I METODY

Badaniem objęto populację kobiet n=2145 poddanym badaniom przesiewowym w kierunku obecności antygenu HPA-1a w latach 2018-2022 w Zakładzie Immunologii Hematologicznej i Transfuzjologicznej oraz n=191 przypadków ciąż z podejrzeniem AIMP/N.

Do wykrywania przeciwciał przeciwpłytkowych używano testów: immunoenzymatycznego MAIPA (Monoclonal Antibody Immobilization of Platelet Antigens), immunofluorescencyjnego PIFT (Platelet Immunofluorescence Test) oraz PAKLx (xMAP Luminex). Genotypowanie antygenów HPA wykonywano przy użyciu testów FluoGene HPA (real-time PCR; Inno-Train) oraz ID HPA (xMAP PCR, Grifols). Badanie fenotypu HPA-1a prowadzono metodą cytometrii przepływowej (FACS). Fenotyp HPA-1a ujemny (genotyp HPA-1bb) potwierdzano poprzez dyskryminację alleli HPA-1a/b (real time PCR).

WYNIKI

W 48/191 (25%) przypadkach podejrzanych o AIMP/N wykryto swoiste przeciwciała przeciwpłytkowe: anty-HPA-1a (32/48=67%), anty-HPA-5b (8/48=17%), anty-HPA-2b (2/48=4%) oraz wieloswoiste przeciwciała: anty-HPA-1a i anty-HPA-5b (2/48=4%) lub anty-HPA-1a i anty-HPA-15b (1/48=2%). Ponadto, w dwóch przypadkach wykryto przeciwciała skierowane do GPIaIIa (1/48=2%) oraz CD109 (1/48=2%), a w jednym, przeciwciała skierowane do dwóch glikoprotein: GPIIbIIIa i GPIaIIa (1/48=2%).

Genotypy HPA zbadano w 171/191 (90%) przypadkach, u matki i dziecka (62/171=36%) lub rodziców (109/171=64%). Niezgodność w antygenach HPA pomiędzy matką a dzieckiem/płodem lub ojcem wystąpiła w 136/171 (80%) przypadkach. Podczas badań profilaktycznych, fenotyp HPA-1a ujemny wykryto u 71/2145 (3,3%) kobiet: u 57/71 (79%) z nich oznaczono przeciwciała przeciwpłytkowe w 11/57 (19%) przypadkach wykryto przeciwciała o swoistości anty-HPA-1a, w 1/57(2%) anty-HPA-5b oraz anty-CD109 w 1/57(2%).

WNIOSKI

1. Fenotyp HPA-1a ujemny stwierdzono u 3,3% kobiet badanych, a obecność przeciwciał anty-HPA-1a u 19%. Przekracza to szacunkowe dane dla populacji polskiej i wskazuje na nieprzypadkowy dobór próby.

2. Niska liczba badań przesiewowych antygenu HPA-1a w IHiT w latach 2018-2022 w odniesieniu do liczby urodzeń w tym okresie wskazuje na konieczność ciągłej edukacji dotyczącej konfliktu matczyno-płodowego i jego profilaktyki oraz leczenia.

3. U 25% pacjentek badania wskazały AIMP/N jako prawdopodobną przyczynę małopłytkowości płodu.

4. Najczęściej wykrywano przeciwciała anty-HPA-1a, co uzasadnia rutynowe badania fenotypu antygenu HPA-1 u wszystkich kobiet w ciąży i/lub planujących ciążę.

PT10

Specjalizacja: transfuzjologia

Tytuł:

Raport z programu oceny jakości badań w zakresie wykrywania przeciwciał anty HLA w Regionalnych Centrach Krwiodawstwa i Krwiolecznictwa w 2022 roku

Autor: Beata Szczepaniak

Współautorzy:

Łopacz Patrycja, Główka Anna, Sokół Ewelina, Cios Aleksandra, Spychała Paula, Sierocka Beata, Gierszon Agnieszka, Uhrynowska Małgorzata, Guz Katarzyna, Głodkowska-Mrówka Eliza.

Afiliacja:

Zakład Immunologii Hematologicznej i Transfuzjologicznej, Instytut Hematologii i Transfuzjologii w Warszawie

WPROWADZENIE

Przeciwciała anty-HLA powstają w wyniku immunizacji w czasie ciąży, przetoczeń składników krwi, przeszczepienia narządów litych i krwiotwórczych komórek macierzystych. Mają znaczenie w diagnostyce transplantacyjnej, oporności na transfuzje płytek krwi, w patogenezie niehemolitycznych niepożądanych reakcji poprzetoczeniowych, m.in. ostrego poprzetoczeniowiowego uszkodzenia płuc (TRALI).

W ramach zadań Instytutu Hematologii i Transfuzjologii (IHiT), wskazanych w ustawie o publicznej służbie krwi w 2022 roku Pracownia Immunologii Leukocytów i Płytek Krwi przygotowała i przeprowadziła program zewnętrzlaboratoryjnej oceny jakości badań wykrywania przeciwciał anty-HLA dla 10 Regionalnych Centrów Krwiodawstwa i Krwiolecznictwa (w Białymstoku, Kaliszu, Kielcach, Krakowie, Lublinie, Łodzi, Olsztynie, Poznaniu, Rzeszowie, Warszawie).

13/23 Centrów Krwiodawstwa w Polsce nie zadeklarowało chęci udziału w programie oceny wykrywalności przeciwciał anty-HLA.

CEL

Celem pracy jest podsumowanie wyników programu „Zewnętrznej oceny jakości badań w zakresie wykrywania przeciwciał anty-HLA w Regionalnych Centrach Krwiodawstwa i Krwiolecznictwa w 2022 roku”.

MATERIAŁ

I METODY

Próbki surowic kontrolnych: H1 z przeciwciałami anty-HLA klasy I niereagującymi w teście limfocytotoksycznym, H2 z przeciwciałami anty-HLA klasy I oraz II reagującymi w testach limfocytotoksycznym oraz fazy stałej, H3 bez przeciwciał anty-HLA.

Metody zastosowane w IHiT: test limfocytotoksyczny (LCT), LABScreen Mixed, LABScreen Single Antigen HLA Class I i II w technologii xMAP (Luminex).

WYNIKI

● W programie wzięło udział 10 RCKiK. Pięć Centrów wykonało badania w testach LCT i w technologii xMAP, 1 Centrum w testach LCT i LATM, 3 Centra wyłącznie w teście LCT, 1 Centrum wyłącznie testem Lifecodes PAKPlus (Immucor). ]

● W 3 Centrach wykonujących badania testem LABScreen Mixed Class I & II uzyskano poprawne wyniki badań przeciwciał anty-HLA. Jedno Centrum uzyskało wynik różniący się od wyniku uzyskanego w IHiT w próbce H3.

● W 9 Centrach wykonujących badania przy użyciu testu LCT uzyskano wyniki identyczne jak u organizatora.

● Jedno Centrum wykonujące badanie przeciwciał przy użyciu testu Lifecodes Life Screen Deluxe uzyskało poprawne wyniki.

● W jednym Centrum przy użyciu testu enzymatycznego LATM uzyskano wynik badania przeciwciał w testach fazy stałej różniący się od wyniku uzyskanego w IHiT w próbce H1.

● W Centrum wykonującym badania wyłącznie testem Lifecodes PAKPlus nie wykryto przeciwciał anty-HLA klasy I w próbce H1 oraz przeciwciał anty-HLA klasy II w próbce H2.

WNIOSKI

● Wyniki badania przeciwciał anty-HLA wydane na podstawie diagnostyki przeprowadzonej wyłącznie przy użyciu testów limfocytotoksycznego lub Lifecodes PAKPlus mogą prowadzić do nieprawidłowych decyzji w procesie diagnostyczno terapeutycznym.

● W związku z ograniczeniami testów stosowanych przez RCKIK zaleca się wdrożenie dodatkowych metod do wykrywania przeciwciał anty-HLA klasy I i II.

Praca została częściowo sfinansowana ze środków dotacji celowanej Ministra Zdrowia na zadania Instytutu wskazane w ustawie o publicznej służbie krwi na rok 2022.

PT11

Specjalizacja: transfuzjologia

Tytuł:

Raport z programu oceny jakości badań w zakresie wykrywania przeciwciał anty HPA w Regionalnych Centrach Krwiodawstwa i Krwiolecznictwa w 2022 roku

Autor: Anna Główka

Współautorzy:

Łopacz Patrycja, Sokół Ewelina, Szczepaniak Beata, Cios Aleksandra, Spychała Paula, Sierocka Beata, Gierszon Agnieszka, Uhrynowska Małgorzata, Guz Katarzyna, Głodkowska-Mrówka Eliza

Afiliacja:

Zakład Immunologii Hematologicznej i Transfuzjologicznej, Instytut Hematologii i Transfuzjologii w Warszawie

WPROWADZENIE

Identyfikacja alloprzeciwciał przeciwpłytkowych anty-HPA, wytwarzanych w wyniku ciąży lub przetoczeń KKP, ma znaczenie w diagnostyce alloimmunologicznej małopłytkowości płodowo/noworodkowej, oporności na transfuzje KKP oraz poprzetoczeniowych skaz małopłytkowych.

W ramach zadań Instytutu Hematologii i Transfuzjologii (IHiT), wskazanych w Ustawie o publicznej służbie krwi w 2022 roku Pracownia Immunologii Leukocytów i Płytek Krwi przygotowała i przeprowadziła program zewnątrzlaboratoryjnej oceny jakości badań wykrywania przeciwciał anty-HPA dla 5 Regionalnych Centrów Krwiodawstwa i Krwiolecznictwa (w Białymstoku, Kaliszu, Kielcach, Lublinie, Warszawie).

18/23 Centrów Krwiodawstwa w Polsce nie zadeklarowało chęci udziału w programie oceny wykrywalności przeciwciał anty-HPA.

Celem pracy jest podsumowanie wyników programu „Zewnętrznej oceny jakości badań w zakresie wykrywania przeciwciał anty-HPA w Regionalnych Centrach Krwiodawstwa i Krwiolecznictwa w 2022 roku”.

MATERIAŁ I METODY

Próbki surowic kontrolnych: P1 – próbka z przeciwciałami anty-HPA-1a, anty HPA-5a, anty-HLA kl. I; P2 próbka z przeciwciałami anty-HPA-5b, bez przeciwciał anty-HLA; P3 – próbka bez przeciwciał anty-HPA, anty-HLA.

Metody zastosowane w IHiT: test immunoenzymatyczny MAIPA, immunofluorescencyjny PAKLx®(Immucor), immunoenzymatyczny PAKPlus®(Immucor).

WYNIKI

W programie uczestniczyło 5 Centrów:

1. 4 Centra wykonywały badania przy użyciu testu PAKPlus, natomiast 1 Centrum przy użyciu testów PAKLx Immucor. Z uwagi na ograniczenia testu PAKPlus, w badaniach wykonanych w próbce kontrolnej P1 żadne z 4 Centrów nie było w stanie określić swoistości wykrytych przeciwciał, skierowanych do epitopów antygenowych na glikoproteinie płytek krwi GPIIb/IIIa.

2. W próbce kontrolnej P1 jedno Centrum fałszywie wykryło przeciwciała skierowane do antygenu HPA-4a.

3. 2 Centra wykonujące badania przy użyciu metody PAKPlus do wyników badań wskazały, że w przypadku wątpliwości klinicznych należy wykonać badania przeciwciał przy użyciu innego testu.

4. Wszystkie 5 Centrów w próbce P1 wykryło przeciwciała anty-HLA klasy I.

5. Wszystkie 5 Centrów uzyskało prawidłowe wyniki badań w próbkach kontrolnych P2, P3.

6. Tylko 1 Centrum uzyskało prawidłowe wyniki badań we wszystkich próbkach kontrolnych.

WNIOSKI

Test PAKPlus nie umożliwia przeprowadzenia prawidłowej diagnostyki swoistości przeciwciał przeciwpłytkowych. Może być traktowany jedynie jako wstępna metoda przeglądowa, ponieważ jest zbyt mało czuły do wykrywania istotnych klinicznie przeciwciał przeciwpłytkowych w surowicy pacjenta. Nie powinien być stosowany jako jedyny test diagnostyczny do wykrywania przeciwciał przeciwpłytkowych, jeśli występują one w niskim mianie lub jeśli skierowane są do antygenów, których nie zastosowano w teście.

Zbyt mała czułość testu może wpłynąć na podjęcie niewłaściwych decyzji diagnostyczno-terapeutycznych w przypadku pacjentów zimmunizowanych antygenami płytek krwi lub diagnostyki w kierunku konfliktu matczyno-płodowego w zakresie antygenów HPA.

Praca została częściowo sfinansowana ze środków dotacji celowanej Ministra Zdrowia na zadania Instytutu wskazane w ustawie o publicznej służbie krwi na rok 2022.

PT12

Specjalizacja: transfuzjologia

Tytuł:

Analiza zasobów wielokrotnych dawców KKP i zapotrzebowanie na zgodne antygenowo KKP dla pacjentów zimmunizowanych w latach 2019-2021 – raport wstępny z programu MZ „Zapewnienie samowystarczalności Rzeczypospolitej Polskiej w krew i jej składniki na lata 2021-2026”

Autor:

Katarzyna Guz

Współautorzy:

Patrycja Łopacz, Eliza Głodkowska-Mrówka, Agnieszka Orzińska

Afiliacja:

Instytut Hematologii i Transfuzjologii w Warszawie, Zakład Immunologii Hematologicznej i Transfuzjologicznej Wstęp

Zapewnienie KKP o oznaczonych antygenach płytek krwi (HPA) i/lub HLA klasy I jest wyzwaniem dla publicznej służby krwi, gdyż typowanie tych antygenów nie jest prowadzone rutynowo. Wraz z popularyzacją diagnostyki alloimmunologicznej małopłytkowości płodów/noworodków (AIMP/N), w 85% przypadków wywołanej matczynymi przeciwciałami anty-HPA-1a, a w 5-10% anty-HPA-5b, rośnie zapotrzebowanie na dawców KKP o rzadkim fenotypie/genotypie HPA-1a(-); HPA-5b(-). Zwiększa się też skala pacjentów wymagających wielokrotnych przetoczeń KKP, co wiąże się z opornością na przetaczane płytki, głównie z powodu obecności przeciwciał anty-HLA. W ramach programu MZ „Zapewnienie samowystarczalności Rzeczypospolitej Polskiej w zakresie krwi i składników krwi na lata 20212026” zaplanowano zwiększenie dostępności do dawców o oznaczonych antygenach HPA-1,-2-3,-5 oraz HLA klasy I locus A i B. Jego istotnym elementem było wstępne oszacowanie zasobów dawców wielokrotnych, oddających KKP metodą trombaferezy, o oznaczonych antygenach HPA i/lub HLA kl. I oraz rozpoznanie potrzeb zimmunizowanych pacjentów.

Cel:

3-letnia analiza (2019-2021) zasobów wielokrotnych dawców, oddających KKP metodą trombaferezy, w tym z oznaczonymi antygenami HPA i/lub HLA, z analizą potrzeb zimmunizowanych pacjentów.

Materiał i metody:

W zbieraniu danych i wypełnieniu ankiet przygotowanych przez Instytut Hematologii i Transfuzjologii (IHiT) wzięło udział 15 Regionalnych Centrów Krwiodawstwa i Krwiolecznictwa (RCKiK). Analizę danych z odesłanych formularzy przeprowadzono w IHiT.

Ankietowanie o zasobach wielokrotnych dawców, oddających KKP metodą trombaferezy, obejmowało tylko dawców grupy O+ i O-: w wieku 18-45 lat, z minimum 2 donacjami w ciągu 3 lat (2019-2021), bez stałych dyskwalifikacji, bez transfuzji/ciąż w wywiadzie lub z ujemnymi wynikami badania przeciwciał anty-HLA. Analiza dotyczyła liczebności tych dawców w poszczególnych RCKiK oraz statusu oznaczenia antygenów HPA/HLA (brak, częściowe, pełne).

Formularze o liczbie pacjentów wymagających doboru KKP wypełniło 12/15 RCKiK; 3 Centra podały dane o swoistości alloprzeciwciał anty-HPA i/lub anty-HLA.

Wyniki: Analiza danych z 15 RCKiK wykazała, że zasób dawców KKP spełniających ww. kryteria wynosił 4328 osób i większość z nich (66.2%) pochodziła z 3 RCKiK (od 800 do 1100 dawców), w 9 RCKiK liczebność dawców wynosiła od 41 do 290 dawców, a w 3 RCKiK poniżej 10 dawców. Jedynie 678 dawców KKP (15,7%) miało oznaczone antygeny HLA kl. I w locus A i B, a tylko 49 dawców (1,1%) antygeny HPA w przynajmniej jednym układzie (14 miało rzadki genotyp HPA-1bb).

Łącznie w 12/15 RCKiK wykazano 419 pacjentów zimmunizowanych antygenami HLA kl.I i/lub HPA, z tego 66,8% danych pochodziło z 2 RCKiK-ów. U 87,8% pacjentów wykryto przeciwciała anty-HLA kl. I, u których wykonano 9137 prób krzyżowych w teście limfocytotoksycznym (LCT). Dla 25 pacjentów, mimo wykonania 346 prób krzyżowych w teście LCT, nie znaleziono zgodnych dawców (100% wskaźnik PRA). U 12,9% biorców KKP prócz przeciwciał anty-HLA obecne były przeciwciała do glikoprotein płytkowych o nieustalonej swoistości HPA, a jedynie reaktywne z glikoproteinami: anty-GPIIbIIIa (30 pacjentów), anty-GPIIbIIIa/GPIaIIa (15 pacjentów), anty-GPIaIIa (4 pacjentów). U pozostałych 6 biorców KKP wykryto przeciwciała: anty-GPIIbIIIa(2), anty-GPIIbIIIa + anty-HPA-2b(1), anty-HPA-1a(1), anty-HPA-1b(1), anty-HPA-5b(1).

Wnioski:

Dostępność dawców KKP o oznaczonych antygenach HLA/HPA jest bardzo ograniczona i wymaga dotypowania dużej skali dawców, by zapewnić dostęp do zgodnych genotypowo KKP dla zimmunizowanych pacjentów.

PT13

Specjalizacja: transfuzjologia

Tytuł:

Dodatni wynik BTA u dawcy - przypadek czy narastający problem? Analiza wyników otrzymanych w RCKiK w Gdańsku w latach 2019-2023

Autor:

Anna Jaźwińska

Współautorzy:

Anna Jaźwińska, Izabela Czesnowska

Afiliacja:

Regionalne Centrum Krwiodawstwa i Krwiolecznictwa w Gdańsku

Wstęp

Bezpośredni test antyglobulinowy (BTA) nie jest badaniem rutynowo wykonywanym u krwiodawców.

Jest stosowany w diagnostyce pacjentów z niedokrwistością autoimmunohemolityczną, w konfliktach matczyno-płodowych, po przeszczepieniu krwiotwórczych komórek macierzystych w niezgodności w ABO oraz po niezgodnych przetoczeniach składników krwi. Test wykrywa przeciwciała lub/i składniki dopełniacza opłaszczone in vivo na krwinkach czerwonych pacjenta. Ze względu na fakt, że do oddania krwi i jej składników kwalifikowane są zdrowe osoby, nie ma potrzeby zlecania dodatkowo BTA przy kwalifikacji krwiodawcy. Opłaszczenie krwinek dawcy przeciwciałami lub/i składnikami dopełniacza powoduje reakcję z surowicą antyglobulinową (AHG) stosowaną podczas próby zgodności, a interpretacja wyniku to niezgodna próba krzyżowa. W szpitalnych pracowniach immunohematologii przy niezgodności próby krzyżowej i braku u pacjenta przeciwciał odpornościowych do antygenów na błonie erytrocyta wykonywany jest BTA krwinek dawcy. Jeśli wynik jest dodatni, to jednostka jest reklamowana w RCKiK.

Cel:

Celem pracy była analiza zgłoszonych do RCKiK dodatnich BTA w KKCz, z którymi wykonywano próby zgodności w latach 2019-2023.

Materiały i metody:

Reklamowane jednostki KKCz były poddawane weryfikacji przy użyciu testów stosowanych w RCKiK Karta LISS/Coombs z poliwalentną surowicą wykrywającą IgG i/lub C3d oraz Karta DC-Screening II do różnicowania opłaszczenia erytrocytów przez cząsteczki IgG i C3d produkowanych przez DiaMed/ BIO-RAD.

Wyniki:

Do RCKiK w Gdańsku w ciągu 5 lat wpłynęło łącznie 548 reklamacji dotyczących wydanych do szpitali składników krwi. Personel pracowni szpitalnych oraz pracowni konsultacyjnej zgłaszał w 252 jednostkach KKCz podejrzenie dodatniego wyniku BTA, z czego 193 reklamacje zostały uznane (potwierdzono BTA+ w RCKiK).

Liczba wydanych KKCz Liczba podejrzeń BTA+ Liczba potwierdzonych donacji BTA+

KKCz

Przeanalizowano informacje o dawcach składników. U żadnego z dawców nie stwierdzono niedokrwistości autoimmunohemolitycznej – poziom hemoglobiny podczas kwalifikacji do oddania krwi był prawidłowy (12,5 g/dl K i 13,5 g/dl M), nie stwierdzono również żadnych przeciwwskazań do oddania krwi podczas badania podmiotowego oraz przedmiotowego. Dane literaturowe podają, że BTA jest dodatni u 0.008% zdrowych dawców. Dawcy z dodatnim BTA zostali zidentyfikowani na podstawie numeru donacji oraz wezwani na badania kontrolne.

Wnioski:

Problem występowania dodatniego BTA u dawców KKCz jest nadal niski, ale staje się coraz bardziej zauważalny – wzrasta liczba zgłaszanych reklamacji z powodu podejrzenia BTA+. Mimo wzrostu bezwzględnej liczby potwierdzonych dodatnich testów, w latach 2022-2023 spadł odsetek potwierdzeń. Zgodnie z przepisami o postępowaniu z dawcą z dodatnim BTA decyduje lekarz kwalifikujący dawcę do oddania krwi, ale nie ma żadnych wytycznych, jak takie postępowanie powinno wyglądać. Wskazane jest poddanie dawców długofalowej obserwacji w kierunku chorób autoimmunologicznych i hematologicznych w celu sprawdzenia, czy dodatni BTA nie jest czynnikiem predykcyjnym poważnych chorób.

PT14

Specjalizacja: transfuzjologia

Tytuł:

Malaria - czynnik zakaźny przenoszony przez krew, wpływający na zdrowie i życie człowieka

Autor: Monika Padysz

Współautorzy:

Krystyna Śpiewak, Monika Padysz

Afiliacja:

PT15

Specjalizacja: transfuzjologia

Tytuł:

Procedura zwiększania bezpieczeństwa składników krwi w ocenie jakościowej –proces inaktywacji w RCKiK w Lublinie

Autor: Anna Tatarczak

Współautorzy:

Berta Fal, Małgorzata Orzeł

Afiliacja: Regionalne Centrum Krwiodawstwa i Krwiolecznictwa w Lublinie

Wprowadzenie:

Procesy inaktywacji biologicznych czynników chorobotwórczych w składnikach krwi, zapewniające redukcję ryzyka przeniesienia wirusów, bakterii i pierwotniaków, stanowią skuteczne metody zwiększania bezpieczeństwa transfuzji. Niektóre systemy umożliwiają również dezaktywację resztkowych leukocytów, redukując ryzyko wystąpienia choroby przeszczep przeciw gospodarzowi (TA-GVHD) i niehemolitycznej gorączkowej reakcji poprzetoczeniowej (FNHTR), indukowanej cytokinami. Niemniej, w przebiegu procesów inaktywacji obserwuje się nieznaczne zmiany w zakresie parametrów jakościowych otrzymywanych składników krwi, co wymaga rutynowej kontroli oraz monitorowania długoterminowego. W RCKiK w Lublinie stosuje się inaktywację koncentratów krwinek płytkowych z aferezy (UKKP-Af. i UKKP-Af./RW) z ryboflawiną w systemie Mirasol PRT oraz inaktywację osocza z błękitem metylenowym w systemie Theraflex MB Plasma i Mirasol PRT. Celem niniejszej pracy było przedstawienie wyników badań kontroli jakości i badań walidacyjnych UKKP-Af., UKKP-Af./RW i osocza świeżo mrożonego (FFP) w procesie inaktywacji, otrzymanych w RCKiK w Lublinie w latach 20222023 wraz z oceną jego wpływu na jakość składników krwi.

Materiały i metody:

Badania kontroli jakości wykonano w próbkach UKKP-Af., UKKP-Af./RW i osocza przed oraz po procesie inaktywacji. Badania poziomu płytek krwi w UKKP-Af. i UKKP-Af./RW wykonano metodą impedancyjną z ogniskowaniem hydrodynamicznym, poziom pH ustalono, stosując metodę potencjometryczną. Aktywność czynnika VIII w osoczu zbadano metodą koagulometryczną jednostopniową, poziom fibrynogenu metodą koagulometryczną wg Claussa, natomiast poziom białka całkowitego metodą biuretową.

Wyniki:

Analiza porównawcza wydajności procesów otrzymywania FFP inaktyw. ryboflawiną oraz FFP inak-

tyw. błękitem metylenowym nie wykazał istotnych różnic ocenianych parametrów jakościowych. Średnie odsetki zachowania aktywności FVIII, poziomu fibrynogenu i białka całkowitego po inaktywacji i zamrożeniu dla FFP inaktyw. ryboflawiną wyniosły kolejno 78,0%, 84,3% i 99,2%, natomiast dla FFP inaktyw. błękitem metylenowym: 77,1%, 77,2% i 99,4%. We wszystkich przebadanych jednostkach FFP inaktyw. po inaktywacji i zamrożeniu stwierdzono aktywność FVIII ≥50 IU/100 ml oraz poziom białka całkowitego ≥50 g/l.

Średni odsetek zachowania PLT w UKKP-Af. inaktyw. względem wyjściowego poziomu tego parametru przed inaktywacją wyniósł 95,5% i 95,1% dla UKKP-Af./RW inaktyw. Wyniki badań PLT w ostatnim 5 dniu przechowywania UKKP-Af. inaktyw. wskazały na zachowanie średnio 93,6% poziomu tego parametru (średni spadek o 0,07 x 1011 PLT/skł.) względem wartości bezpośrednio po inaktywacji. Średnia wartość pH w 5 dniu przechowywania wyniosła 6,78. Badania jakościowe UKKP-Af./RW inaktyw. w czasie przechowywania wydłużono do 7 dnia od donacji, stwierdzając zachowanie 93,6% poziomu PLT (średni spadek o 0,14x1011 PLT/skł.) oraz wartość pH średnio 6,99. Kontrola czystości mikrobiologicznej, przeprowadzona w 4 punktach czasowych procesu otrzymywania UKKP-Af./RW inaktyw. i przechowywania do 7 dni nie wykazała wzrostu mikrobiologicznego.

Wnioski:

Monitorowanie tendencji długoterminowych parametrów kontroli jakości oraz wyniki badań walidacyjnych wskazały na stabilność procesów otrzymywania inaktywowanych składników krwi, prowadzonych w RCKiK w Lublinie oraz uzyskiwanie w sposób powtarzalny składników spełniających wymagania norm kontroli jakości. Inaktywacja stanowi skuteczną metodę zwiększania bezpieczeństwa transfuzji, nie powodując istotnych zmian jakościowych składników krwi.

Hematologia kliniczna

i doświadczalna

V międzynarodowa konferencja

Bezpieczeństwo składników krwi w lecznictwie

Lubelskie Centrum Konferencyjne Lublin

10-12 maja 2024 r.