167
Chương 9
Vi khuẩn quang hợp và cố định đạm I.Vi sinh vật quang hợp 1.Các vi khuẩn quang quang hợp (Phototrophic bacteria) 1.Vi khuẩn lưu huỳnh màu tía (Purple sulfur bacteria): a-HọChromatiaceae: b-HọEctothiorhodospiraceae: 2-Vi khuẩn không lưu huỳnh màu tía (Nonsulfure purple bacteria) 3.Vi khuẩn lưu huỳnh màu lục (Green sulfure bacteria) 4.Vi khuẩn không lưu huỳnh màu lục (Green nonsulfur bacteria) 5-Vi khuẩnlam(Ngành Cyanobacteria) a- Nhóm I (có tác giả gọi là bộ Chroococcales): b- Nhóm II (có tác giả gọi là bộ Pleurocapsales): c- Nhóm III (có tác giả gọi là bộ Oscillatorriales): d- Nhóm IV (có tác giả gọi là bộ Nostocales) : e- Nhóm V (có tác giả gọi là bộ Stigonematales) 1.1.Vi khuẩn lưu huỳnh màu tía (Purple sulfur bacteria) Thuộc nhóm này là các vi khuẩn kỵ khí bắt buộc, có khả năng quang tự dưỡng vô cơ (photolithoautotroph), tế bào có chứa chlorophyll a hoặc b , hệ thống quang hợp chứa các màng hình cầu hay hình phiến (lamellar) gắn với màng sinh chất. Để dùng làm nguồn cho điện tử (electron donors) trong quang hợp thường sử dụng H2, H2S hay S . Có khả năng di động với tiên mao mọc ở cực, có loài chu mao, tỷ lệ G+C là 45-70%. a- Họ Chromatiaceae: 1.1.Chi Thiospirium 1.2. Chi Chromatium 1.3. Chi Thiocapsa 1.4. Chi Thiocystis 1.5. Chi Thiospirillum 1.6. Chi Thiorhodovibrio 1.7. Chi Amoebobacter 1.8. Chi Lamprobacter 1.9. Chi Lamprocystis 1.10.Chi Thiodyction
168
1.11.Chi Thiopedia 1.12. Chi Rhabdochromatium 1.13. Chi Thiorhodococcus
Chromatium
Thiocapsa
Thiocystis
Thiospirillum
Lamprocystis
Thiopedia
Hình 9.1: Một số đại diện vi khuẩn lưu huỳnh màu tía thuộc Họ Chromatiaceae
169
b- Họ Ectothiorhodospiraceae: 1.1- Chi Ectothiorhodospirace 1.2- Chi Halorhodospira 1.2-Vi khuẩn không lưu huỳnh màu tía (Nonsulfure purple bacteria) Vi khuẩn không lưu huỳnh màu tía là nhóm vi khuẩn quang dị dưỡng hữu cơ (photoorganoheterotrophs) thường kỵ khí bắt buộc, một số loài là quang tự dưỡng vô cơ không bắt buộc (trong tối là hoá dị dưỡng hữu cơ- chemoorganoheterotrophs). Tế bào chứa chlorophyl a hoặc b, hệ thống quang hợp chứa các màng hình cầu hay hình phiến (lamellar) gắn với màng sinh chất. Để dùng làm nguồn cho điện tử (electron donors) trong quang hợp thường sử dụng chất hữu cơ, đôi khi sử dụng hợp chất lưu huỳnh dạng khử hoặc H2. Có khả năng di động với tiên mao mọc ở cực, hoặc không di động, một số loài có túi khí (gas vesicles), tỷ lệ G+C là 61-72%. 2.1- Chi Blastochloris 2.2- Chi Phaeospirillum 2.3- Chi Rhodobacter 2.4- Chi Rhodobium 2.5- Chi Rhodocista 2.6- Chi Rhodocyclus 2.7- Chi Rhooferax 2.8- Chi Rhodomicrobium 2.9- Chi Rhodoplanes 2.10-Chi Rhodopila 2.11- Chi Rhodopseudomonas 2.12- Chi Rhodospira 2.13- Chi Rhodospirillum 2.14- Chi Rhodothalassium 2.15- Chi Rhodovibrio 2.16-Chi Rhodovulum 2.17- Chi Rosespira 2.18- Chi Rubiviva
170
Rhodospirillum
Rhodospirillum dưới KHV điện tử
Rhodopseudomonas
Rhodopseudomonas dưới KHV điện tử
Rhodobacter
Rhodocyclus purpureus
Rhodopila
Rhomicrobium
Hình 9.2: Một số đại diện vi khuẩn không lưu huỳnh màu tía
171
1.3.Vi khuẩn lưu huỳnh màu lục (Green sulfure bacteria) Thuộc nhóm này là các vi khuẩn kỵ khí bắt buộc, có khả năng quang tự dưỡng vô cơ (photolithoautotroph), tế bào có chứa chlorophyll a cùng với b , c hoặc e, chứa caroten nhóm 5, hệ thống quang hợp liên quan đến các lục thể (chlorosom) và độc lập đối với màng sinh chất. Để dùng làm nguồn cho điện tử (electron donors) trong quang hợp thường sử dụng H2, H2S hay S . Hạt lưu huỳnh tích luỹ bên ngoài tế bào Không có khả năng di động , một số loài có túi khí; tỷ lệ G+C là 48-58%. 3.1- Chi Chlorobium 3.2- Chi Prosthecochloris 3.3- Chi Pelodictyon 3.4- Chi Ancalichliris 3.5- Chi Chloroherpeton
Chlorobium
Pelodictyon
Prosthecochloris
Hình 9.3: Một số đại diện vi khuẩn lưu huỳnh màu lục
1.4.Vi khuẩn không lưu huỳnh màu lục (Green nonsulfur bacteria) Thuộc nhóm này là các vi khuẩn đa bào, dạng sợi,thường kỵ khí không bắt buộc ,thường là quang dị dưỡng (photoheterotroph), có loài quang tự dưỡng hoặc hoá dị dưỡng. Tế bào có chứa chlorophyll a và c, trong điều kiện kỵ khí thấy có chlorosom. Để dùng làm nguồn cho điện tử (electron donors) trong quang dị dưỡng là glucose, axit amin, axit hữu cơ; trong quang tự dưỡng là H2, H2S. Di động bằng phương thức trườn (gliding) , tỷ lệ G+C là 53-55%. Chi điển hình là Chloroflexus., Chloronema
172
Chloronema
Chloroflexus
Hình 9.4: Một số đại diện vi khuẩn không lưu huỳnh màu lục
1.5- Vi khuẩn lam (Ngành Cyanobacteria) Theo NCBT (2005) thì Vi khuẩn lam bao gồm những bộ sau đây: • • • • • •
-Chlorococcales -Gloeobacteria -Nostocales -Oscillatoriales -Pleurocapsales -Prochlorales
Trước đây thường nhầm lẫn là Tảo lam (Cyanophyta). Thực ra đây là những cơ thể nhân nguyên thuỷ, không liên quan gì đến tảo , ngoài khả năng quang hợp hiếu khí (quang tự dưỡng vô cơ) và dùng H2O làm chất cho điện tử trong quá trình quang hợp. Vi khuẩn lam chứa chlorophyll a và phycocyanin- phycobiliprotein. Một số loài có sắc tố đỏ phycoerythrin. Chúng phối hợp với sắc tố lục tạo nên màu nâu. Màng liên kết với phycobilisom. Đơn bào hoặc đa bào dạng sơi. Không di động hoặc di động bằng cách trườn (gliding), một số loài có túi khí (gas vesicles).Nhiều loại có dị tế bào (heterocysts) và có khả năng cố định nitơ. Vi khuẩn lam có mặt ở khắp mọi nơi, trong đất, trên đá, trong suối nước nóng, trong nước ngọt và nước mặn. Chúng có năng lực chống chịu cao hơn so với thực vật đối với các điều kiện bất lợi như nhiệt độ cao, pH thấp. Một số loài có khả năng sống cộng sinh với các cơ thể khác như Rêu, Dương xỉ, Tuế...Nhiều loài cộng sinh với nấm để tạo ra Địa y (Lichen). Vi khuẩn lam có thể là sinh vật xuất hiện sớm nhất trên Trái đất
173
Vi khuẩn lam được chia thành 5 nhóm (subsection) như sau: a- Nhóm I (có tác giả gọi là bộ Chroococcales): Hình que hoặc hình cầu đơn bào, không có dạng sợi hay dạng kết khối (aggregate); phân đôi hoặc nẩy chồi; không có dị tế bào (heterocytes). Hầu hết không di động. Tỷ lệ G+C là 31-71% . Các chi tiêu biểu là: -Chamaesiphon -Chroococcus -Gloeothece -Gleocapsa -Prochloron
Chamaesiphon
Glooeothece
Chroococcus
Gleocapsa
Prochloron Hình 9.5: Một số đại diện vi khuẩn lam thuộc bộ Chroococcales b-Nhóm II (có tác giả gọi là bộ Pleurocapsales): Hình que hoặc hình cầu đơn bào. có thể tạo dạng kết khối (aggregate); phân cắt nhiều lần tạo ra các baeocytes; không có dị tế bào.Chỉ có các baeocytes là có di động. Tỷ lệ G+C là 40-46% . Các chi tiêu biểu là: • -Pleurocapsa • -Dermocapsa • -Chroococcidiopsis
174
Pleurocapsa
Dermocapsa
Chroococcidiopsis
Hình 9.6: Một số đại diện vi khuẩn lam thuộc bộ Pleurocapsales
c-Nhóm III (có tác giả gọi là bộ Oscillatorriales): Dạng sợi (filamentous) ; dạng lông (trichome) không phân nhánh chỉ có ở các tế bào dinh dưỡng; phân đôi trên mặt phẳng, có kiểu đứt đoạn (fragmentation); không có dị tế bào; thường di động. Tỷ lệ G+C là 3467%. Các chi tiêu biểu là: • -Lyngbya • -Osscillatoria • -Prochlorothrix • -Spirulina • -Pseudanabaena
Lyngbya
Oscillatoria
Spirulina
Prochlorothrix
Pseudanabaena
Hình 9.7: Một số đại diện vi khuẩn lam thuộc bộ Oscillatorriales
175
d-Nhóm IV (có tác giả gọi là bộ Nostocales) Dạng sợi ; dạng lông (trichome) không phân nhánh có thể chứa các tế bào biệt hoá (specialized cell) ; phân đôi trên mặt phẳng, có kiểu đứt đoạn tạo thành đoạn sinh sản (hormogonia) ; có tế bào dị hình ; thường di động có thể sản sinh bào tử màng dày (akinetes). Tỷ lệ G+C là 38-47%. Các chi tiêu biểu là : • -Anabaena • -Cylindrospermum • -Aphanizomenon • -Nostoc • -Scytonema • -Calothrix
Anabaena
Cylindrospermum
Anabaena trong Bèo hoa dâu
Calothrix
176
Nostoc
Scytonema
Hình 9.8: Một số đại diện vi khuẩn lam thuộc bộ Nostocales
e-Nhóm V (có tác giả gọi là bộ Stigonematales) : Lông (trichome) dạng sợi, phân nhánh hoặc do các tế bào nhiều hơn một chuỗi tạo thành ; phân đôi theo nhiều mặt phẳng, hình thành đoạn sinh sản (hormogonia) ; có tế bào dị hình ; có thể sản sinh bào tử màng dày ( alkinetes), có hình thái phức tạp và biệt hóa (differentiation). Tỷ lệ G+C là 42-44%. Các chi tiêu biểu là : -Fischerella -Stigonema -Geitlerinema
Stigonema
Fischerella
Geitlerinema
Hình 9.9: Một số đại diện vi khuẩn lam thuộc bộ Stigonematales
2.Trao đổi chất ở các vi sinh vật quang dưỡng Tất cả các vi khuẩn quang hợp đều chứa sắc tố quang hợp. Sắc tố quang hợp ở vi khuẩn được gọi là bacteriochlorophyll. Chlorophyll và bacteriochlorophyll còn được gọi là chất diệp lục và chất khuẩn lục. Chất diệp lục, chất khuẩn lục và huyết sắc tố có cấu trúc tương tự như nhau. Đó là một vòng pocphiril do 4 nhân pirol liên kết với nhau. Lõi của chất diệp lục và chất khuẩn lục là Mg, còn lõi của huyết sắc tố là Fe, chất diệp lục a
177
khác với chất khuẩn lục a,b,c,d,e ở 7 gốc R (từ R1 đến R7) có thể thấy rõ sự khác nhau này trong bảng sau đây: Bảng 9.1: Sự sai khác giữa chất diệp lục a và các loại chất khuẩn lục
Chú thích: a→ giữa C3 và C4 không có nối đôi, không thêm H b→ giữa C3 và C4 không có nối đôi, có thêm H Có thể thấy rõ hơn sự phân biệt của hai loại chlorophyll, bacteriochlorophyll và hem...bằng cách quan sát hình sau đây:
178
H. 9.10: Cấu trúc hóa học của một số sắc tố quang hợp
179
Ngoài các loại chlorophyll vi khuẩn tự dưỡng quang năng còn có chứa một số các sắc tố thuộc loại carotenoit. Carotenoit ở vi khuẩn không giống với carotenoit ở tảo hoặc thực vật. Dưới đây là vài ví dụ:
H. 9.11: Cấu trúc hóa học các loại carotenoit
Ở vi khuẩn tự dưỡng quang năng có hai loại phosphoryl hóa quang hợp: phosphoryl hóa quang hợp tuần hoàn và phosphoryl hóa quang hợp không tuần hoàn. Chú thích Bchl*: trạng thái kích phát của bacteriochlorophyll Ru-5-P: Ribulose-5-phosphate H2A: Chất vô cơ cho hydrogen
H.9.12:Phosphoryl hóa quang hợp kiểu tuần hoàn
Trong điều kiện kỵ khí một số vi khuẩn quang hợp có thể sử dụng năng lượng của ánh sáng để thực hiện phản ứng phosphoryl hóa sản sinh ra ATP. Electron từ bacteriochlorophyll được tách ra dưới tác dộng của ánh sáng, sau đó tham gia vào chuỗi hô hấp tuần hoàn và quay trở lại Bchl. Trên đường đi đã sản sinh ra ATP. Việc sinh ra ATP được thực hiện riêng rẽ với việc sinh ra [H] có năng lực khử. [H] có năng lực khử được sinh ra từ các chất vô cơ cho hydrogen (như H2S...).Quá trình quang hợp này không sản sinh ra oxi.
180
H.9.12: Phosphoryl hóa quang hợp kiểu không tuần hoàn
Chú thích: Chlb* và Chla* là ở trạng thái kích phát. Đây là kiểu phản ứng phosphoryl hóa quang hợp gặp ở vi khuẩn lam và cũng tương tự như ở tảo và cây xanh. Ở đây chuỗi vận chuyển electron là không tuần hoàn vì vậy còn gọi là dòng chảy electron không tuần hoàn. Quang hợp xảy ra trong điều kiện có oxi và có 2 hệ thống quang. Hệ thống quang I có chứa Chl a (chất diệp lục a) và có thể sử dụng được tia đỏ có bước sóng dài. Hệ thống quang II có chứa Chl.b và có thể sử dụng được tia sáng lam (bước sóng ngắn). Quá trình quang hợp này có sản sinh oxi và xảy ra đồng thời việc sinh ATP(ở hệ thống quang hợp II) và việc sinh [H] có năng lực khử (trong NAD PH2) là H+ và e-, được sinh ra sau sự quang giải nước. Sau quang giải nước sản sinh ra ½ O2 +2H+ + 2e, electron sẽ liên tiếp đi qua chuỗi electron (I và II), sau cùng đem electron đến cho NADP+ để sản sinh ra 2 phản ứng phophoryl hóa để sinh ATP. Ở hệ thống I có sinh NADPH2 và ATP, còn ở hệ thống II có sinh oxi và ATP. Một số vi khuẩn ưa mặn tự dưỡng quang năng có quá trình quang hợp khá dặc biệt. Đại diện cho nhóm này là các vi khuẩn hay gặp trên các hải sản ướp muối (như vi khuẩn Halobacterium halobium, H.eutirubrum...) Màng chất té bào của chúng phân thành 2 phần: phần màu đỏ và phần màu tía. Phần màu đỏ có chứa cytocrom, flavoprotein.. của chuỗi hô hấp dùng để oxi hóa phosphoryl hóa. Phần màu tía rất kì lạ. Trên màng hiện lên các vết khoang (đường kính khoảng 0,5μm), phân bố độc lập với
181
nhau, chiếm tới một nửa tổng diện tích của màng tế bào vi khuẩn. Màng này có khả năng thực hiện một quá trình quang hợp độc đáo. Có một loại protein gọi là bacteriorodopsin, rất giống với rodopsin, loại protein có trong tế bào hình trụ ở trên võng mạc của mắt. Bacteriorodopsin chiếm tới 75% màng màu tía. Những vi khuẩn này có thể sinh trưởng được trong tối hoặc ngoài sáng nếu có mặt oxi, khi không có mặt oxi chúng chỉ sinh trưởng được ngoài sáng. Chúng có 2 con đường thu nhận năng lượng: một đường oxi hóa phosphoryl hóa khi có oxi và một đường oxi hóa phosphoryl hóa khi được chiếu sáng (quang hợp). Tốc độ tạo ra ATP là cao nhất khi được chiếu sáng bằng bước sóng 550-600nm.
H.9.13: Sơ đồ minh họa 2 hệ thống quang
3. Cơ chế quang hợp 3.1. Pha sáng quang hợp Pha sáng là giai đoạn đầu của quang hợp, giai đoạn này ánh sáng là nhân tố trực tiếp tham gia vào quang hợp nên gọi là pha sáng. Pha sáng xảy ra qua 2 giai đoạn: giai đoạn quang lý và giai đoạn quang hoá. * Giai đoạn quang lý: Nhờ tính chất quang hoá của ánh sáng và khả năng hấp thụ năng lượng ánh sáng của phân tử chlorophyll mà năng lượng của ánh sáng được chuyển sang năng lượng của điện tử trong các phân tử chlorophyll. Năng lượng này lại chuyển đến 2 tâm quang hợp là λ700 và λ680 để thực hiện giai đoạn quang hoá tiếp. * Giai đoạn quang hoá: quang hoá là giai đoạn chuyển hoá năng lượng của các điện tử trong 2 tâm quang hợp đã được làm giàu bởi năng lượng ánh sáng thành năng lượng chứa đựng trong các hợp chất giàu năng lượng là ATP và NADPH2. Giai đoạn quang hoá xảy ra tại 2 tâm quang hợp bởi 2 phản ứng
182
quang hoá mà phần chính là quang phân ly nước và phosphoryl hoá. - Quang phân ly nước: Nhờ năng lượng ánh sáng với sự tham gia của sắc tố và hệ thống các chất oxi hoá trong lục lạp mà nước bị phân huỷ. 2H2O ( 4H+ + 4è + O2 ) - Phosphoryl hoá : đây là quá trình tổng hợp ATP nhờ năng lượng của quá trình oxi hoá xảy ra trong chuỗi vận chuyển è quang hợp. ADP + H3PO4 → ATP + H2O Có 3 hình thức Phosphoryl hoá xảy ra: + Phosphoryl hoá vòng. + Phosphoryl hoá không vòng. + Phosphoryl hoá hoá vòng giả. Kết quả chung của pha sáng là: 12H2O +18ADP +18H3PO4+12NADP+ →18ATP + 12NADPH+H+ + 6O2 + 18H2O Pha sáng đã tạo ra ATP và NADPH+H+ cung cấp cho pha tối quang hợp. 3.2. Pha tối quang hợp Sau khi pha sáng tạo ATP và NADPH+H+, giai đoạn tiếp theo của quang hợp là sử dụng ATP và NADPH+H+ để khử CO2 tạo sản phẩm sơ cấp của quang hợp là C6H12O6. Quá trình này không cần ánh sáng nên gọi là pha tối. Pha tối diễn ra nhiều con đường khác nhau, mỗi con đường đặc trưng cho một nhóm thực vật. Có 3 con đường đồng hoá CO2 trong quang hợp: chu trình Calvin, chu trình Hatch-Slack và chu trình CAM. * Chu trình Calvin (chu trình C3) - Đây là con đường đồng hoá CO2 phổ biến nhất do Calvin tìm ra. Chu trình xảy ra qua 3 giai đoạn chính: + Tiếp nhận CO2 : Ribulozo 1,5dP tiếp nhận CO2 sau đó biến đổi thành 2 phân tử APG. APG là sản phẩm đầu tiên nên chu trình còn được gọi là chu trình C3. + APG bị khử thành AlPG nhờ ATP và NADPH+H+ của pha sáng. + AlPG sẽ tái tạo lại Ribulozo 1,5dP đồng thời tạo nên sản phẩm của chu trình là C6H12O6. Tóm tắt chu trình Calvin:
183
C5 + CO2 + ATP + NADPH ---> C6H12O6 H. 9.14: Chu trình Calvin www.starsandseas.com/. ../cellcalvin.htm
II.Cố đinh nitrogen phân tử Trong không khí có rất nhiều N phân tử, nhưng tuyệt đại đa số sinh vật không sử dụng được nguồn N này. Chỉ có một số VSV là có thể hấp thụ được N. Qua hoạt động sống của chúng N sẽ được chuyển thành N hợp chất (protein và các sản phẩm thủy phân protein). Hoạt động này được gọi là sự cố định N phân tử. Quá trình cố định N có tác dụng rất lớn đến đời sống các sinh vật trên trái đất. Trên cơ bản trong nham thạch không chứa hợp chất N. Cho nên nguồn N trong đất hầu như hoàn toàn do tác dụng cố định N của VSV mà hình thành. Hàng năm cây trồng lại lấy đi một lượng N đáng kể. Hợp chất N được hình thành trong quá trình cố định này lại chính là nguồn N chủ yếu bổ sung cho đất. Các loại VSV cố định N không nhiều lắm, có thể chia làm hai loại lớn như sau: 1.Vi sinh vật cố định N sống tự do (không cộng sinh): bao gồm một số vi khuẩn, xạ khuẩn. Trong số này quan trọng nhất là các loài thuộc chi Azotobacter và loài Clostridium Pasteurianum. 1. Azotobacter 1.1.Sơ lược về Azotobacter Azotobacter là vi khuẩn cố định N sống tự do trong đất, hiếu khí, không có bào tử. Chúng đã được phân lập và nuôi cấy thuần khiết từ năm
184
1901 do nhà VSV Hà Lan Beijerinck. Đại diện điển hình của chi này là Azotobacter chroococcum. Do điều kiện nuôi cấy và lứa tuổi khác nhau mà Azotobacter có hình thái thay đổi. Lúc còn non Azotobacter là những trực khuẩn mập hình que, có tiên mao, có khả năng di động, khi già thì trở thành tế bào hình cầu có giáp mạc xung quanh. Azotobacter có thể sử dụng nhiều loại hợp chất hữu cơ làm nguồn thức ăn C. Chúng cũng cần nhiều nguyên tố khoáng, đặc biệt là 2 nguyên tố vi lượng bor (B) và molipbden (Mo)(Mo cần cho tác dụng cố định N). Khi sống trong điều kiện không có N hợp chất Azotobacter sẽ dùng N của không khí để biến thành hợp chất N của cơ thể sống. Khi sống trong môi trường đủ thức ăn N hữu cơ hoặc vô cơ thì tác dụng cố định N sẽ rất thấp hoặc không có. Azotobacter thích hợp với điều kiện hiếu khí vừa phải và pH trung tính hoặc hơi kiềm. Trong điều kiện thích hợp cứ mỗi khi tiêu thụ 1gam hydratcarbon Azotobacter có thể cố định được 10- 15mg N. Vì Azotobacter có khả năng cố định N mạnh mẽ như vậy nên từ cuối thế kỷ 18 đã có nhiều nước nghiên cứu sử dụng chúng làm phân vi khuẩn (gọi là phân Azotobacterin). Việc sử dụng Azotobacterin cũng đang phát triển mạnh ở nhiều nước và thu được kết quả. Tuy nhiên sử dụng Azotobacterin không phải là vấn đề tiếp giống đơn giản, mà còn phải tạo điều kiện để chúng phát triển mạnh cố định được nhiều N, nghĩa là sử dụng kỹ thuật liên hoàn. Để chế tạo Azotobacterin trước hết ta nuôi thật nhiều Azotobacter trên môi trường đặc hoặc lỏng có bơm không khí. Sau đó đem trộn chúng với than bùn hoặc các chất nuôi dưỡng khác để chế thành bột Azotobacterin. 1.2. Một số đặc điểm sinh học của vi khuẩn Azotobacter a. Hình thái khuẩn lạc Khi nuôi trong môi trường thạch,vi khuẩn Azotobacter có khuẩn lạc nhầy, lồi hoặc tan, lúc đầu không màu, sau biền thành màu nâu tối, thậm chí đến màu đen nhưng không làm nhuộm màu môi trường khuẩn lạc. Ngoài ra một số loài Azotobacter có dạng nhăn nheo, khuẩn lạc có màu vàng lục, màu hồng . Vỏ nhầy của vi khuẩn Azotobacter chứa khoảng 75% là chất hiđrit của acid uronic và chứa khoảng 0.023% N.
185
H. 9.15: Hình dạng tế bào Azotobacter sp. (a) dưới kính hiển vi điện tử (b) tiêu bản âm (www-micro.msb.le.ac.uk/ video/Azotobacter.html) b. Hình thái tế bào vi khuẩn Azotobacter Azotobacter là loại vi khuẩn Gram âm không sinh bào tử. Khi còn non tế bào có dạng que đầu tròn đứng riêng lẻ hay xếp thành từng đôi chồng chất, chất tế bào nhuộm màu đồng đều, có khả năng di động nhờ tiên mao, kích thước khoảng :2,0- 7,0 × 10- 2,5 μ m . Khi già tế bào Azotobacter mất khả năng di động, kích thước thu nhỏ lại biến thành dạng hình cầu. Sinh chất xuất hiện nhiều hạt lổn nhổn. Đó là các hạt volutin, granulose, các giọt mỡ… Lượng ADN trong tế bào Azotobacter thường thấp hơn so với nhiều loại vi khuẩn khác (0,70- 0,81%). Tóm lại hình dạng tế bào Azotobacter và chu kì biến đổi của chúng phụ thuộc vào tuổi của ống giống và điều kiện phát triển. 1.3. Các đặc tính sinh lí, sinh hoá. a. Đặc điểm nuôi cấy : Vi khuẩn Azotobacter thuộc loại vi khuẩn hiếu khí, sống theo phương thức dị dưỡng. Chúng sử dụng nhiều loại hợp chất hữu cơ khác nhau: disacarit, dextrin, tinh bột, acid hữu cơ, hợp chất thơm, … tuy vậy, nhiều tác giả cho biết có không ít các chủng Azotobacter không có khả năng đồng hoá lactose, manitol hoặc natribenzoat. b. Khả năng sử dụng nguồn N: Trên các môi trường không chứa N khuẩn lạc Azotobacter có dạng nhầy, lồi, đôi khi nhăn nheo. Chứng tỏ vi khuẩn Azotobacter có khả năng sinh trưởng trên môi trường không có N. Sở dĩ chúng tồn tại được là vì có khả năng đồng hoá muối amonium, urê. Một số chủng Azotobacter có khả
186
năng sử dụng nitrit, nitrat. Hai loại acid thích hợp nhất đối với nhu cầu dinh dưỡng của Azotobacter là acid glutamic và axtit asparaginic. 1.4. Đặc điểm phân loại của vi khuẩn Azotobacter Theo Becking (1974) thì vi khuẩn cố định đạm thuộc chi Azotobacter có 4 loài: A. chroococcum; A. beijerinckii; A. vinelandii; A. agilis . 1.5. Ảnh hưởng các nhân tố sinh thái đến sự sinh trưởng và phát triển của các vi khuẩn Azotobacter Vi khuẩn Azotobacter hiếu khí, sự phát triển và khả năng cố định N của chúng trong đất chịu ảnh hưởng của các điều kiện sau: a. Độ ẩm của đất Azotobacter đòi hỏi độ ẩm rất cao của đất. Nhu cầu về độ ẩm của chúng cao hơn so với các vi khuẩn khác, tương đương với nhu cầu của cây trồng. Vì vậy ít gặp chúng ở vùng khô hạn, sự khô hạn của đất chỉ có bào xác của chúng mới chịu đựng được. Ẩm độ thích hợp:75- 80%. b. Độ thoáng khí . Độ thoáng khí của đất có liên quan đến quá trình cố định N của Azotobacter. Tuy vậy vi khuẩn thuộc loại hiếu khí nhưng có thể phát triển được trong điều kiện vi hiếu khí. Quá trình cố định N của Azotobacter bị giảm khi thể ôxi hoá khử của môi trường cao quá +200 mv hoặc thấp quá (–) 200 mv. Như vậy, không khí quá mạnh cũng ức chế quá trình cố định N phân tử, khi nồng độ ôxi trong không khí là 4% quá trình cố định N vượt quá ba lần so với khi ôxi là 10- 20%. c . Nhiệt độ. Nhiệt độ ảnh hưởng đến Azotobacter không giống nhau ở các vùng địa lí khác nhau. Ở vùng nhiệt đới Azotobacter thích hợp với nhiệt độ 35400C. Ở nhiệt độ 70C Azotobacter có hoạt động cố định N thấp hơn 5 lần so với 450C. Tế bào sinh dưỡng của Azotobacter không sống được khi xử lí 500C trong 30 phút, ở nhiệt độ 800C sẽ chết rất nhanh. Nhiệt độ thích hợp đối với sự phát triển của Azotobacter vào khoảng 20-300C. d. pH của đất. pH của đất ảnh hưởng không giống nhau đến sự phát triển và khả năng cố định N của Azotobacter. Azotobacter thích hợp nhất với pH = 7,28,2, song có thể phát triển được ở pH = 4,5- 9,0. Các loài Azotobacter khác nhau mẫn cảm một cách khác nhau đối với pH của môi trường. Chẳng hạn: pH thấp nhất của môi trường đối với Azotobacter
187
chroococcum và A. beijerinck khoảng 5,5; đối với A. marocytoges là khoảng 4,6. Phần lớn Azotobacter chỉ phát triển ở pH lớn hơn 6, vì vậy ít gặp chúng ở đất chua. Cũng có thể phân lập được một số chủng từ đất chua nhưng các chủng này thường đã mất khả năng cố định N phân tử. e. Phân đạm Trong đất Azotobacter có khả năng đồng hoá các chất dinh dưỡng từ môi trường. Nguồn N đối với Azotobacter không phải chỉ là N phân tử mà còn là muối amon, nitrat, amino acid. Tuỳ thuộc vào nồng độ của các hợp chất chứa N có trong môi trường mà quá trình cố định N sẽ bị ức chế nhiều hay ít . g. Phân lân. Phốt pho rất cần cho quá trình cố định N của Azotobacter chỉ bắt đầu xảy ra khi nồng độ PO43- đạt đến 4 mg trong 100 ml môi trường. Ngược lại khi nồng độ PO43- đạt tới 800 mg trong 100 ml quá trình cố định N sẽ bắt đầu ngừng lại. Sự mẩn cảm mạnh mẽ của Azotobacter với phốt pho cho phép người ta sử dụng chúng như loại vi khuẩn chỉ thị để xác định nhu cầu về phospho của đất. h. Phân kali. Sự phát triển của Azotobacter rất cần đến kali, nhưng với lượng nhỏ. Nếu đưa vào môi trường một lượng muối kali quá dư thừa chúng sẽ làm ức chế sự phát triển của Azotobacter, có thể tác hại này là do gốc anion của muối này gây ra. i. Canxi. Canxi ảnh hưởng lớn đến sự phát triển của Azotobacter. Khi thiếu canxi tế bào Azotobacter sẽ tạo thành nhiều không bào ảnh hưởng xấu đối với việc tổng hợp ATP và sự tạo thành các polyphotphat. Những điều tra ở Việt Nam cho thấy trong đất có lượng chứa CaO cao hơn 0,4% luôn có mặt một số lượng lớn các tế bào Azotobacter. Hầu như không phát triển trong mẫu đất có có lượng chứa CaO dưới 0,25% (Nguyễn Lân Dũng 1965) Riêng đối với A.chroococcum nồng độ CaCl2 ,thích hợp nhất là 0,01% ,nếu cao hơn sẽ ảnh hưởng không tốt đối với hoạt động cố định N của chúng. Có tác giả đã dùng A. chroococum như là loài vi khuẩn chỉ thị để xác định nhu cầu về vôi của đất, nguyên tố Mg được Azotobacter đòi hỏi với số lượng cao hơn sắt khoảng 10 lần .
188
Cùng với nguyên tố đại lượng, các nguyên tố vi lượng cũng cần thiết đối với Azotobacter, đáng chú ý hơn cả là molybden, bo(Bo), mangan(Mn) k. Các nhân tố sinh học Sự phát triển và cố định N của Azotobacter trong đất còn chịu ảnh hưởng mật thiết của khu hệ các sinh vật đất. Bên cạnh các nhóm vi sinh vật có ảnh hưởng tốt còn có nhiều nhóm có khả năng ức chế sự phát triển của Azotobacter . Đã có nhiều công trình nghiên cứu đề cập đến mối quan hệ gữa Azotobacter với cây trồng với số lượng cao hơn nhiều so với ngoài vùng rễ . Một số chủng A.chroococum có khả năng sinh ra một số chất chống nấm có tác dụng khá rộng (ức chế Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Alternaria …) 1.6. Tình hình nghiên cứu ứng dụng Azotobacter. Trong nhiều năm, ở nhiều nước khác nhau ,người ta đã sản xuất ở quy mô công nghiệp hoặc thủ công nghiệp những chế phẩm Azotobacter và gọi là azotobacterin. Đó là những dịch nuôi cấy Azotobacter được hấp thụ vào than bùn hoặc các loại đất giàu chất hữu cơ đã trung hoà và bổ sung thêm một ít phân phospho, kali… Khác với nitragin, azotobacterin khi dùng để bón cho cây trồng thường đưa đến những hiệu quả không lớn và không ổn định (nếu có làm tăng sản lượng thường cũng không tăng quá 10% so với đối chứng ). Đa số các tác giả cho rằng hiệu quả của việc sử dụng azotobacterin chỉ tương đối với các đất giàu chất hữu cơ hoặc trong trường hợp được bón thêm nhiều phân khoáng. Có lẽ tác dụng chủ yếu của chúng không phải ở khía cạnh cố định N mà là ở khía cạnh tổng hợp các chất hoạt động sinh học có tác dụng kích thích sinh trưởng của cây trồng . Ở Việt Nam, việc sản xuất và sử dụng chế phẩm azotobacterin chỉ đặt ra trong những điều kiện thâm canh có khả năng dồi dào về phân bón, cần bón vôi và bón phân lân để làm tăng số lượng Azotobacter trong đất. Azotobacterin chỉ có tác dụng tương đối rõ đối với các loại đất giàu chất hữu cơ hoặc trong trường hợp được bón thêm nhiều chất khóang.Có lẽ tác dụng chủ yếu của chúng không phải ở khía cạnh cố định N mà là ở khía cạnh tổng hợp các chất hoạt động sinh học có tác dụng kích thích sự sinh trưởng của cây trồng . a. Các phương pháp tạo chế phẩm Azotobacter
189
* Dạng môi trường thạch nghiêng Chuẩn bị môi trường thạch nghiêng Thành phần môi trường (g/l):Glucose-20; K2HPO4.3H2O -0,2; MgSO4 .7H2O -0,2; NaCl- 0,2; K2SO4 -0,1; CaCO3 -5,0; H20 -1 lít ;Thạch 20 pH: 6,5-7. Chuẩn bị giống Azotobacter :Các ống giống đã được phân lập và tuyển chọn từ trước. Tạo chế phẩm: Cấy truyền giống vi khuẩn Azotobacter từ giống gốc vào những ống nghiệm thạch nghiêng. Ủ ấm ở nhiệt độ: 28-30 0 C trong thời gian 2-6 ngày, loại bỏ những ống bị nhiễm vi sinh vật khác ta thu được chủng Azotobacter thuần khiết. * Dạng dịch thể Chuẩn bị môi trường dịch thể Thành phần môi trường (g/l): Glucose 20 0,2 K2HPO4.3H2O MgSO4.7H2O 0,2 NaCl 0,2 K2SO4 0,1 CaCO3 5,0 1 lít H2O pH 6,5-7 Chuẩn bị giống vi khuẩn Azotobacter : Lấy 5-10 ml môi trường dịch thể (Có thành phần như trên không có thạch) đã khử trùng cho vào mỗi ống nghiệm φ 14 5ml Dùng que cấy gạt nhẹ, đưa dịch vi khuẩn vào bình nón (250500ml) đựng 150ml môi trường và nuôi chúng trên máy lắc(220 dao động/phút) . Khi khi dịch nuôi đạt mật độ 109 tế bào/ml thì có thể đem sử dụng * Dạng bột Nuôi cấy giống vi khuẩn Nhân giống Hâp thụ giống vào chất mang vi khuẩn Điểm quan trọng cua phương pháp này là lựa chọn chất mang vi khuẩn, chất mang vi khuẩn phải đạt yêu cầu thích hợp vớ sự tồn tại của Azotobacter trong quá trình bảo quản và độ sống sót trên hạt giống khi được tẩm vào, chất mang vi khuẩn có thể là than bùn, đất bột giàu chất hữu cơ, có nơi sử dụng cả trấu, bã bia làm chất mang vi khuẩn
190
Ngày nay chất mang vi khuẩn được sử dụng bởi than bùn thích hơp trong việc sử dụng chế phẩm vi khuẩn nói chung và chế phẩm Azotobacter nói riêng. Ngoài đặc tính của than bùn là không độc, có tính hấp thụ cao, giữ nước tốt , nó còn là nguyên liệu rẻ tiền sẳn có ở nhiều nơi. 1.2. Clostridium pasteurianum và một số VSV cố định N khác C.pasteurianum là trực khuẩn kị khí bắt buộc, có bào tử, bào tử nằm ở giữa làm tế bào phình lên như hình thoi. C. pasteurianum là một loại vi khuẩn butyric, chúng có thể sử dụng các hydratcarbon thông thường và làm lên men suinh ra acid butyric, acetic, CO2 và H2. Chúng có thể sử dụng hợp chất N vô cơ và hữu cơ làm nguồn thức ăn N, khi những hợp chất này đầy đủ thì tác dụng cố định N của chúng hạ thấp hoặc hoàn toàn không có. Tác dụng cố định N của C. pasteurianum thấp hơn Azotobacter. Cứ mỗi khi tiêu thụ 1g hydratcarbon thì chúng cố định được 2-3 mg N. Tuy nhiên C.Pasteurianum rất nhiều và phân bố rộng rãi hơn Azotobacter nên nguồn N mà chúng cố định cho đất là rất quan trọng. Chúng lại phát triển được ở ruộng ngập nước, yêu cầu pH không gắt gao nên thích hợp cho các loại ruộng của ta. Ngoài hai loài trên, trong các VSV cố định N còn có một số vi khuẩn thuộc chi Clostridium, Bacillus và Azotomonas. Tuy nhiên, vì những loài này phân bố không nhiều và hiệu lực cố định N cũng thấp nên tác dụng thực tế không lớn lắm. 2. Vi khuẩn cố định N cộng sinh. Phần lớn các cây thuộc họ đậu không cần thức ăn hợp chất, chúng có thể sử dụng được N không khí. Nhưng khả năng này không phải bản thân cây họ đậu có mà do những vi khuẩn nốt rễ cộng sinh với cây họ đậu mang lại. 2.1. Vi khuẩn nốt rễ Người đầu tiên chứng minh rằng các cây bộ đậu có thể sinh trưởng trong đất không chứa N là H. Hellrigel và H. Wilfarth (1886). Năm 1886 M.W.Beijerinck đã phân lập được vi khuẩn từ nốt rễ một số cây đậu. Giống (chi) Rhizobium (Franck, 1889) là loại vi khuẩn đơn bào ở đất, rất dễ nhầm với Pseudomonas, trực khuẩn tự do có kích thước 1,2(m x 0,5 chuyển động nhờ nhung mao và tiên mao ở cực, hiếu khí. Khi hình thành nốt sần thì trực khuẩn biến dạng (có hiện tượng đa hình thái), nó thay đổi hình dạng tùy theo lứa tuổi và điều kiện sống. Khi còn non chúng là trực khuẩn nhỏ bé, không có bào tử, di động nhờ tiên mao. Trong quá trình phát triển, chúng sẽ chuyển thành hình cầu và những dạng phân nhánh hình chữ Y, chữ V gọi là giả khuẩn thể (Bacteroids).
191
Năm 1963, Manil đã chia các vi khuẩn nốt sần thành 3 nhóm: -Rhizobium leguminosa (đậu Hà Lan), R. trifolii (cỏ ba lá), R. phaseoli (đậu cô ve, đậu xanh). -Rhizobium lupini (mục túc, linh lăng), gộp nhóm 1 và 2 thành Rhizobium mọc nhanh. - Rhizobium lupini (đậu đũa, lupin), R. Japonicum (đậu nành) với nhiều loài phụ. Nhóm này hiện nay được định loại là Bradyrhizobium (gồm tất cả các chủng mọc chậm. Hiện nay, người ta xếp vi khuẩn nốt rễ vào một chi chung là Rhizobium.Chúng có thể sử dụng nhiều hydratcarbon khác nhau làm nguồn C. Khi sống riêng lẻ trong đất hoặc trong môi trường nuôi cấy chúng không có khả năng cố định N. Về hô hấp, chúng là loại vi hiếu khí. Rhizobium có nhiều loài và có tính chất chuyên tính, nghĩa là mỗi loài chỉ có thể xâm nhập và tạo thành nốt rễ trong một số cây họ đậu nhất định. Vi khuẩn nốt rễ khi gặp cây họ đậu thích hợp sẽ xâm nhập vào tế bào rễ, kích thích rễ tạo thành những nốt rễ. Nốt rễ thường thường bằng hạt gạo, nốt rễ to bằng hạt đậu nhỏ, trong nốt rễ chứa đầy vi khuẩn. Sau khi hình thành nốt rễ giữa vi khuẩn và cây họ đậu làm thành một thể cộng sinh có lợi cho cả hai bên. Ngoài các cây họ đậu, một số rễ cây khác cũng có thể cộng sinh với vi khuẩn cố định N. Gần đây người ta còn thấy nốt sần ở lá một vài loài cây nhiệt đới. Trong nốt sần đó cũng chứa vi khuẩn cố định N gần giống ở rễ. 2.2.Phân bón nốt rễ (nitragin) Phân bón vi sinh do Noble Hiltner sản xuất đầu tiên tại Đức năm 1896 và được đặt tên là nitragin: Sau đó phát triển sản xuất tại một số nước khác như ở Mỹ (1896), Canada (1905), Nga (1907), Anh (1910) và Thụy Điển (1914). Nitragin là loại phân được chế tạo bởi vi khuẩn Rhizobium do Beijerink phân lập năm 1888 và được Fred đặt tên vào năm 1889 dùng để bón cho các loại cây thích hợp của họ đậu. Từ đó cho đến nay đã có nhiều công trình nghiên cứu nhằm ứng dụng và mở rộng việc sản xuất các loại phân bón vi sinh cố định nitơ mà thành phần còn được phối hợp thêm một số vi sinh vật có ích khác như một số xạ khuẩn cố định nitơ sống tự do Frankia spp, Azotobacter spp, các vi khuẩn cố định N sống tự do Clostridium pasteurianum, Beijerinkia indica, các xạ khuẩn có khả năng giải cellulose, hoặc một số chủng vi sinh vật có khả năng chuyển hóa các
192
nguồn dự trữ phospho và kali ở dạng khó hoà tan với số lượng lớn có trong đất mùn, than bùn, trong các quặng apatit, phosphorid v.v... chuyển chúng thành dạng dễ hoà tan, cây trồng có thể hấp thụ được. Trong các loại vi sinh vật kể trên, vi khuẩn nốt rễ có ý nghĩa hết sức to lớn trong nông nghiệp. Cường độ cố định N cộng sinh lớn hơn nhiều so với cường độ cố định N không cộng sinh. Sau khi trồng các cây họ đậu đất giàu thêm N rất nhiều. Chính vì vậy, từ đầu thế kỷ XX người ta nghiên cứu sử dụng phân bón nốt rễ với mục đích là để tiếp giống nhân tạo, làm cho đất không chứa vi khuẩn nốt rễ thích ứng sẽ có vi khuẩn thích ứng, làm cho cây họ đậu không sinh nốt rễ sẽ có thể sinh nốt rễ và những cây có thể sinh nốt rễ thì càng sinh nhiều hơn, cố định N càng mạnh mẽ hơn. Cách sử dụng phân bón vi khuẩn nốt rễ là đem trộn phân với hạt giống, rồi để khô, sau đó đem gieo. Cũng có thể dùng nốt rễ tốt, nghiền nát để trộn với hạt giống. Khi sử dụng có thể tăng sản lượng cây họ đậu lên 15- 20%. Ngoài hai nhóm vi khuẩn cố định N sống cộng sinh với thực vật và sống tự do trong đất như đã nói ở trên, còn một số vi khuẩn có khả năng cố định N sống trên bề mặt rễ và ăn sâu vào vào lớp tổ chức bề mặt rễ của một số cây hòa thảo như lúa, ngô, mía,... Đó là một loài vi khuẩn có dạng xoắn được phát hiện từ năm 1974 thuộc chi Azospirillum. Ngoài các nhóm vi khuẩn cố định N nói trên ra, còn có một số loài vi tảo đơn bào cũng có khả năng cố định N. Ví dụ như vi khuẩn lam sống tự do và sống cộng sinh trong bèo hoa dâu. Các loài này cũng đóng góp không nhỏ vào quá trình cố định N không khí.
Câu hỏi ôn tập chương 9 1.Hãy nêu tổng quát chu trình chuyển hóa N trong thiên nhiên và vai trò của vi sinh vật trong chu trình đó ? 2.Các nhóm vi sinh vật cố định N ? ý nghĩa thực tế của việc nghiên cứu vi sinh vật cố định đạm. 3.Nêu một số thành tựu hiện nay về nghiên cứu vi sinh vật cố định đạm. 4. Naza là gì ? Cơ chế hiện biết của quá trình cố định N phân tử. 5.Các loại phân bón vi sinh vật ? cơ sở khoa học của việc sản xuất và sử dụng các loại phân bón vi sinh vật? 6. Trình bày các bước chủ yếu điều chế Azotobacterin và Nitragin. Trong điều kiện hiện nay ở Việt Nam có thể sản xuất 2 chế phẩm này được không ? Tại sao ?