Complejo Asistencial de Soria. Laboratorio de Bioquímica Clínica
14.4. MEDIDA DE SUSTRATOS POR MÉTODOS DE ABSORCIÓN MOLECULAR_____________________________ Como se ha señalado antes, la absorbancia de una disolución está relacionada con la concentración de las sustancias de acuerdo con la ley de Lambert-Beer: A = acl Para determinar la concentración de un compuesto en disolución se mide su absorbancia; si el compuesto absorbe, se transforma en otro que absorba por medio de su reacción con los reactivos adecuados o se hace que forme parte de una reacción en la que otra sustancia experimente un cambio de sus propiedades de absorción de luz. A veces es necesario ligar varias reacciones para obtener un compuesto que absorba. La reacción en la que se transforma la sustancia que quiere medirse se denomina reacción auxiliar, mientras que la reacción utilizada para la medida se denomina reacción indicadora. Ambas reacciones pueden ser simples reacciones químicas o reacciones catalizadas por enzimas. La medida de la concentración de sustancias en disolución por técnicas espectroscópicas de absorción molecular se realiza con dos tipos fundamentales de métodos: los de punto final y los de medida de la velocidad de reacción. MÉTODOS DE PUNTO FINAL En los métodos de punto final, se incuba la disolución reaccionante con el espécimen y con el patrón de concentración conocida, el tiempo necesario para que se complete la reacción o se alcance el equilibrio. El nombre de punto final no debe conducir a equívoco; es más correcto el de método de equilibrio, ya que muchas veces la reacción se produce de forma que puede hacerse la medida antes de alcanzar el punto final. Cuando se usan enzimas como reactivos para medir sustancias en los métodos de punto final, el sistema debe contener todos los componentes necesarios en exceso. La cantidad de enzimas que se añada debe ser suficiente para que la reacción se complete en un tiempo corto. Si el equilibrio de la reacción no fuera favorable, habría que utilizar unas condiciones que lo invirtiese o añadir a la mezcla de reacción otros reactivos o sistemas enzimáticos que fuercen la reacción en la dirección deseada. La concentración del espécimen en estos métodos viene dada por el producto del cociente entre las absorbancias del espécimen y del patrón por la concentración de este de acuerdo con la fórmula: Ce = K (Ae - Ab) donde K - cpat/Apat – Ab, o sea el factor de calibración; ce = concentración del espécimen; cpat = concentración del patrón; Ab = absorbancia del blanco de reactivos; Apat = absorbancia del patrón; Ae = absorbancia del espécimen. En los métodos de punto final, en lugar de utilizar un único estándar de concentración conocida puede obtenerse una curva patrón con varios estándares y luego extrapolar en esta los valores de absorbancia de las muestras problemas. Hay que tener en cuenta que nunca debe extrapolarse más allá de la región que se haya calibrado. Cuando el valor de la absorbancia supere la del mayor calibrador, se diluirá el espécimen y se medirá de nuevo. Es importante señalar que cuando se representan las curvas de calibración, a pesar de que la ley de Lambert-Beer implique que la absorbancia de la concentración cero es cero, no debe forzarse que la línea atraviese el cero. Hay que trazar la línea que mejor se ajuste a los puntos, bien visualmente o con métodos de regresión. MÉTODOS CINÉTICOS En los métodos cinéticos o de medida de la velocidad de reacción, se determina la variación de la absorbancia con el tiempo, que se relaciona con la concentración. Cuando se empleen métodos que utilicen enzimas hay que tener en cuenta que se requieren enzimas con constante de Michaelís (Km) elevadas. En los casos en los que la Km sea demasiado baja, su valor aparente puede aumentarse añadiendo un inhibidor competitivo. Las reacciones enzimáticas son muy sensibles a las condiciones de la reacción, como el pH y la temperatura, por lo que los métodos cinéticos para determinar la concentración de sustancias deben mantener las condiciones constantes. Esto se consigue con facilidad en los analizadores automáticos, que son sistemas muy adecuados para los análisis cinéticos. Los métodos cinéticos son mucho más rápidos y menos sensibles a las interferencias externas, como la turbidez y el color del espécimen, que los métodos de punto final.
Manual para Técnicos de Laboratorio
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