29
nie zamkniętej substancji i jej potencjalna toksyczność oraz dodatkowe procesy, które pojawiają się podczas aplikacji i transportu pęcherzyków. Obecnie preparatyka liposomów opiera się na dwóch kategoriach metod: dyspersji mechanicznej oraz dyspersji z wykorzystaniem rozpuszczalnika. Do pierwszego typu zalicza się m.in. hydratację cienkiego filmu lipidowego, sonikację falami ultradźwiękowymi, zastosowanie prasy Frencha czy kalibrację (przeciskanie liposomów przez określonej wielkości pory [7,8]. Najbardziej popularne metody polegające na dyspersji za pomocą rozpuszczalnika to wstrzykiwanie roztworu etanolowego, wstrzykiwanie roztworu eterowego oraz odparowywanie techniką faz odwróconych. Pierwszą zastosowaną w skali laboratoryjnej metodą preparacji liposomów była tzw. metoda Banghama – hydratacji cienkiej warstwy lipidowej [9]. Metoda ta jest szeroko rozpowszechniona i łatwa w obsłudze, jednak uwodnienie suchego filmu fosfolipidów w większości daje populację liposomów wielowarstwowych (MLV) oraz niejednorodnych pod względem kształtu i wielkości. Proces dezintegracji liposomów MLV ultradźwiękami za pomocą sonikatorów prowadzi do uzyskania małych, równomiernych pęcherzyków jednowarstwowych [10]. Z kolei duże liposomy jednowarstwowe powstają w wyniku zastosowania metody REV (odparowywania faz odwróconych). Do roztworu fosfolipidów w rozpuszczalniku organicznym wprowadza się wodny roztwór substancji, która ma być zamknięta w liposomie. Następnie film lipidowy wytwarzany jest poprzez odparowanie rozpuszczalnika pod zmniejszonym ciśnieniem. Do pozostałości wprowadza się fazę wodną, co powoduje, że mikrokropelki pokrywają się drugą warstwą fosfolipidów i całość przekształca się w liposomy. Pęcherzyki uzyskane tą metodą charakteryzują się najwyższym wskaźnikiem objętości fazy wodnej, co pozwala na zamykanie stosunkowo znacznej ilości wodnego roztworu substancji aktywnej. Ich wadą jest natomiast pozostałość rozpuszczalników oraz możliwość denaturacji niektórych białek i zerwanie nici DNA w materiale, który ma być transportowany [11]. Kolejnymi z metod opartych na dyspersji rozpuszczalnika jest tzw. wstrzykiwanie roztworu etanolowego [12, 13] oraz eterowego [14]. Pierwsza z nich polega na roz-
e-wydanie do pobrania na:
www.farmacom.com.pl
puszczeniu lipidów w etanolu, a następnie na szybkim wstrzykiwaniu za pomocą strzykawki wodnego roztworu substancji, która ma być później zamknięta w liposomie. Wadą tej techniki jest formowanie się niejednorodnej, bardzo rozcieńczonej populacji liposomów MLV. Ponadto ze względu na to, że etanol tworzy mieszaninę azeotropową z wodą trudno jest go usunąć, a co za tym idzie w ich hydrofilowym wnętrzu mogą być zamykane jedynie biologicznie aktywnie związki trwałe w tym alkoholu. W metodzie wstrzykiwania eteru roztwór lipidów wprowadza się do wodnego roztworu ogrzanego do temperatury 55-65º lub pod zmniejszonym ciśnieniem, co prowadzi do utworzenia pęcherzyków. Tak jak poprzednio, głównym mankamentem tej metody jest niejednorodność powstałych pęcherzyków oraz to, że enkapsulowane substancje aktywne muszą być odporne na temperaturę. Produkcja liposomów na skalę przemysłową odbywa się za pomocą kilku technik, z których najbardziej popularną jest metoda ogrzewania [15] - stosunkowo nowa, przeznaczona do szybkiej produkcji liposomów. Obejmuje ona hydratację komponentów liposomowych, a następnie ich ogrzanie w obecności glicerolu do 120ºC. Obecność glicerolu powoduje zwiększenie stabilności liposomu, ponadto nie musi on być usuwany z końcowego produktu. Co więcej wyniki przeprowadzonych badań wskazują, że wysoka temperatura nie powoduje degradacji fosfolipidów oraz nie wymagana jest późniejsza sterylizacja, co znacznie redukuje czas i koszt produkcji liposomów.
Właściwości preparatów liposomowych Obecnie liposomy są głównym przedmiotem zainteresowania w dziedzinie farmacji, medycyny oraz kosmetologii. Ich niezwykła popularność jest związana z możliwością transportowania substancji aktywnych takich jak hormony [16], antybiotyki [17], leki przeciwnowotworowe [18], przeciwwirusowe [19] i grzybobójcze [20]. Istotną zaletą wykorzystania liposomów jako nośnika substancji aktywnych biologicznie jest selektywne dostarczenie leku do miejsca działania, redukcja toksyczności oraz zmniejszenie efektów ubocznych. Każda substancja chemiczna wprowadzona do organizmu w postaci wolnej bardzo szybko ulega metabolizmowi, a następnie jest z niego usuwana. Dlatego też, aby
2/2014
zwiększyć skuteczność i siłę działania należałoby zwiększyć jej dawkę, a co za tym idzie rośnie ryzyko wystąpienia efektów ubocznych. Wbudowanie np. leku do liposomu powoduje przedłużenie czasu przebywania w krwiobiegu a tym samym poprawę farmakokinetyki oraz biodystrybucji leku [21]. Liposomalne postacie leków cieszą się ogromną popularnością w onkologii. Na rynku dostępne są już liposomalne preparaty cytostatyczne [22], dla których w badaniach klinicznych stwierdzono znacznie mniejszą kardiotoksyczność w porównaniu z lekami konwencjonalnymi. Wynika to z faktu, że śródbłonek naczyń krwionośnych w obrębie tkanki guza nowotworowego nie jest tak szczelny jak śródbłonek tkanek niezmienionych chorobowo i umożliwia przepuszczanie stosunkowo dużej cząsteczki liposomu zawierającego lek do otaczających tkanek.
Stabilność liposomów Warunkiem koniecznym do tego, żeby liposomy mogły być wykorzystane jako transportery zamkniętych w nich substancji jest ich trwałość. Głównymi czynnikami wpływającymi na stabilność, a tym samym na płynność dwuwarstwy jest temperatura, skład błony lipidowej oraz rodzaj i stężenie wprowadzonej domieszki [23-26]. Wbudowanie innych cząsteczek lipidowych do dwuwarstwy np. cholesterolu, sfingomieliny, glikolipidów, glikozoaminoglikanów czy polimerów podnosi stabilność liposomów w warunkach zarówno in vivo jak i in vitro [27]. Natomiast modyfikacja powierzchniowej błony pęcherzyka poprzez inkorporację