56° Congresso Internazionale Multisala SCIVAC
Camco Stain Pack), sono rapide, efficaci e facilmente disponibili nella maggior parte delle strutture. Questi metodi non colorano l’area acrosomiale degli spermatozoi. L’inchiostro di China e l’eosina-nigrosina sono coloranti di sfondo che delineano gli spermatozoi piuttosto che colorarli direttamente. Per quest’ultima soluzione, si deve mescolare delicatamente su un vetrino da microscopia riscaldato una goccia di colorante di eosina-nigrosina ed una di seme, prima di preparare lo striscio che verrà poi lasciato asciugare all’aria. Lo Spermac® è un colorante rapido che presenta delle qualità differenziali esclusive. Il nucleo degli spermatozoi si colora di rosso, l’acrosoma, il tratto intermedio e la coda di verde e la regione equivoca dell’acrosoma di verde pallido. Lo Spermac può essere utilizzato su seme diluito, dato che i costituenti come il tuorlo d’uovo, il siero ed il latte comunemente inclusi nei mestrui non interferiscono con la colorazione. I leucociti non vengono colorati in modo differenziale con lo Spermac. La valutazione della morfologia degli spermatozoi deve essere effettuata al microscopio ad olio. Gli spermatozoi normali sono costituiti da cappuccio acrosomiale, testa, collo, tratto intermedio e coda. Negli spermatozoi normali, l’acrosoma è una struttura a cappuccio che ricopre un po’ più della metà anteriore della testa ed il tratto intermedio corrisponde a circa 1,5 volte la lunghezza della testa. Si devono esaminare i singoli spermatozoi alla ricerca di anomalie localizzate nella testa, nel tratto intermedio e nella coda. Quelle comunemente identificate sono rappresentate da teste distaccate, acrosomi ripiegati o distaccati, gocce di citoplasma prossimali e distali, riflessione (cioè curvatura) del tratto intermedio, code piegate, code strettamente avvolte a spirale sul tratto intermedio e code a spirale nella parte prossimale. Le anomalie possono essere ulteriormente distinte in primarie e secondarie. Si ritiene che le anomalie primarie rappresentino alterazioni della spermatogenesi (cioè all’interno dei testicoli), mentre quelle secondarie sono aspecifiche e possono insorgere durante il transito attraverso il sistema duttale (cioè all’interno dell’epididimo), durante la manipolazione del campione o in seguito ad infezione, trauma o febbre. Storicamente, è stato ipotizzato che i maschi normali debbano generalmente avere più del 70% di spermatozoi con morfologia normale e che le alterazioni primitive e secondarie debbano costituire, rispettivamente, meno del 10 e 20% dello sperma con difetti. Un’indagine più recente fa riferimento al 60% di morfologia normale degli spermatozoi come valore soglia fra quadri normali e subnormali. Un’altra indagine ha riscontrato che per prevedere la fertilità era più importante il numero totale di spermatozoi morfologicamente normali e dotati di motilità progressiva per eiaculato. L’inseminazione artificiale con più di 250 x 106 spermatozoi morfologicamente normali ha portato ad ottenere un tasso di gravidanza dell’82% circa nelle 27 cagne esaminate. Gli specifici difetti morfologici associati all’infertilità nel cane comprendono le anomalie dell’attacco del tratto intermedio o dell’ultrastruttura, la presenza di spermatozoi microcefalici e quella di gocce di citoplasma ritenute a livello prossimale. La concentrazione viene determinata utilizzando uno speciale fotometro (SpermaCue®, Minitube) oppure un emocitometro. Allo scopo, lo sperma viene diluito 1: 100 e si conta il numero di spermatozoi nel quadrato centrale grande (formato da 25 quadrati più piccoli) dell’emocitometro. Il numero degli spermatozoi contati per 106 è il numero di spermatozoi/ml. Il
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numero totale di spermatozoi nell’eiaculato si calcola come volume x concentrazione. Questo deve essere ≥ 200 x 106 e più prossimo a 400 x 106 nei cani di taglia più grande. In tutti i cani sottoposti ad una valutazione per infertilità si deve eseguire lo screening per Brucella canis. La qualità dello sperma può essere normale oppure anormale; può anche darsi che nell’eiaculato non ci siano spermatozoi visibili. L’infertilità è rara nei cani con una valutazione dello sperma normale e, nei casi in cui la si riscontra, bisogna riesaminare l’anamnesi alla ricerca di errori gestionali o infertilità della cagna. La presenza di leucociti o eritrociti nell’eiaculato suggerisce un’infiammazione delle vie genitali, rappresentata nella maggior parte dei casi da una prostatite; la coltura del fluido prostatico ed un trattamento appropriato possono contribuire alla fertilità. Se la qualità dello sperma è anormale, si deve riesaminare l’anamnesi per stabilire se il cane è stato recentemente malato oppure trattato con farmaci di qualsiasi tipo, in particolare steroidi anabolizzanti. Altre cause riconosciute di anomalie della qualità dello sperma sono rappresentate da infiammazione dello scroto o altri fattori che possono stare causando aumenti della temperatura scrotale, neoplasia testicolare (si raccomanda l’ecografia dei testicoli perché molte neoplasie di questi organi non sono palpabili), trauma nell’area dello scroto o brucellosi. Tuttavia, la maggior parte dei casi di bassa qualità dello sperma nel cane è idiopatica. Si può anche effettuare la valutazione dello status ipofisario del cane, che però di solito non rivela nulla di particolare. L’ormone luteinizzante e quello follicolostimolante sono tipicamente normali o elevati nei cani con alterazioni della qualità del seme, perché i testicoli in via di degenerazione non sono in grado di garantire il meccanismo di feed-back all’ipofisi. Poiché le alterazioni qualitative degli spermatozoi possono essere indotte da una malattia transitoria recente oppure dall’esposizione a sostanze tossiche e la spermatogenesi potrebbe riprendere, i prelievi vanno ripetuti ad intervalli di circa tre mesi per circa un anno prima di poter emettere una prognosi definitiva sulle capacità riproduttive dell’animale. La azoospermia è relativamente comune nel cane. Può essere dovuta all’incapacità dei testicoli dell’animale di produrre spermatozoi, oppure all’incapacità di questi ultimi di fuoriuscire dai testicoli a causa di un blocco dell’epididimo o di un’eiaculazione incompleta. L’eiaculato può essere sottoposto al test per verificare la presenza di fosfatasi alcalina, che viene secreta dall’epididimo. Un valore elevato (> 5000 UI/l [elevatissimo in confronto al sangue]) indica che è stato effettuato il prelievo di fluido proveniente dall’epididimo. Elevati valori di fosfatasi alcalina in un liquido privo di spermatozoi suggeriscono che i testicoli non li stanno producendo o che il loro transito è bloccato fra i testicoli e gli epididimi. Bassi valori suggeriscono un blocco dell’epididimo o di un’insufficienza dell’eiaculazione; i prelievi di seme devono essere ripetuti, utilizzando un forte stimolo come una cagna in estro. Per determinare se sia in atto una eiaculazione retrograda si deve effettuare la cateterizzazione della vescica; si possono anche eseguire dei tamponi vaginali di una cagna dopo un accoppiamento normale, per determinare se il cane non sta eiaculando a causa di una avversione al prelievo manuale. Si devono infine attuare l’accurata palpazione e l’esame ecografico per identificare ogni anomalia degli epididimi o dei funicoli spermatici, come l’assenza o il blocco degli epididimi.