4 Come si identificano i microrganismi

Identificare un microrganismo significa assegnarlo a un determinato genere e a una determinata specie. I metodi tradizionali si riferiscono alla determinazione delle caratteristiche della cellula batterica, come la morfologia cellulare e della colonia, la reattività alla colorazione di Gram, struttura, mobilità, capacità di formare spore. Queste caratteristiche possono essere studiate osservando il microrganismo al microscopio ottico, come vedremo a pag. 268. I metodi biochimici prevedono l’inoculo del microrganismo in terreni di coltura specifici contenenti il substrato da testare, determinando così la presenza/assenza di un enzima. Per questi test biochimici esistono ora in commercio sistemi di identificazione miniaturizzati, i cosiddetti kit enzimatici, che sono in grado di eseguire numerose prove nello stesso momento e usando quantitativi minimi di terreno di reazione. L’identificazione finale si ottiene mediante software specifici. I metodi molecolari utilizzano strumenti della biologia molecolare. In questo contesto il DNA e le proteine sono i target più usati per l’identificazione. Analizzando la molecola del DNA, in particolare la sequenza dei nucleotidi, tramite diverse tecniche, si può ottenere l’identificazione del microrganismo in esame. Le metodiche che oggi sono considerate le migliori per l’identificazione prevedono il sequenziamento dei geni codificanti le subunità dei ribosomi. Tutti questi metodi devono essere utilizzati uno a supporto dell’altro per una corretta identificazione: l’uso di uno solo dei tre, anche di quello genetico, che è quello più attuale, potrebbe portare a degli errori di identificazione. In che cosa consiste la colorazione di Gram

I batteri non sono visibili a occhio nudo, o meglio non li vediamo singolarmente, ma possono essere notati quando formano una popolazione batterica dove le cellule sono milioni di milioni. Ad esempio, possiamo notare la torbidità in un terreno di coltura liquido oppure la presenza di colonie in un terreno di coltura solido. L’osservazione dei batteri avviene grazie al microscopio. I microbiologi hanno a disposizione diversi tipi di microscopi, ma il più immediato nell’uso è il microscopio ottico, che riesce a ingrandire i batteri utilizzando un obiettivo con un ingrandimento 100x. Per l’osservazione, i batteri vengono fissati su un vetrino “portaoggetto” tramite il calore. La fissazione conserva e fissa le strutture interne ed esterne della cellula batterica, in modo che vengano mantenute durante la colorazione e l’osservazione. Inoltre, i batteri vengono uccisi in modo che non rappresentino un pericolo per l’osservatore. Una volta fissati sul vetrino, i preparati vengono sottoposti alla colorazione, una tecnica usata per visualizzare e identificare i microrganismi. Il metodo di colorazione più comune per l’osservazione dei batteri al microscopio ottico è la colorazione di Gram. La tecnica fu messa a punto nel 1884 dal medico danese Hans Christian Gram, dal quale prese il nome. In base alla diversa risposta che i batteri mostrano alla fine del procedimento, essi vengono distinti in due gruppi: Gram positivi e Gram negativi. Glossario

La scienza che studia le macromolecole biologicamente attive, i meccanismi e il flusso dell’informazione genetica.

Il metodo consiste in una colorazione con il colorante cristalvioletto e mordenzatura con ioduro di potassio, seguite da decolorazione con alcol. Il colorante interagisce con lo ioduro e forma un complesso che precipita nel citoplasma della cellula. A seconda della struttura e della composizione della parete cellulare dei batteri, alcuni di essi sono resistenti alla decolorazione con alcol e tratterranno il cristalvioletto. Essi appaiono blu-viola al microscopio e vengono detti Gram positivi. Altri, invece, con il lavaggio con alcol perdono il cristalvioletto e si decolorano. Così si procede con un secondo colorante, la safranina (colorante di contrasto rosa) che permette di visualizzare i Gram negativi. Questa non altera la colorazione blu dei Gram positivi e colora di rosa i Gram negativi.

Fasi nella colorazione di Gram

Fissazione al calore

Primo colorante: cristalvioletto Trattamento con iodio Decolorazione (alcol-acetone) Colorazione di contrasto: safranina

In che cosa si differenziano Gram positivi e negativi

La risposta alla colorazione di Gram ha acquisito un importante significato per la classificazione e l’identificazione dei batteri, quando si notò che essa era in relazione con la struttura della parete batterica. • I batteri Gram positivi hanno una parete spessa che circonda la membrana plasmatica. • I batteri Gram negativi possiedono una parete formata da uno strato molto più sottile, ma che presenta all’esterno una seconda membrana ricca di lipopolisaccaridi e lipoproteine.

Come si osserva al microscopio ottico un vetrino

Per l’osservazione dei batteri si usa un obiettivo a immersione. Si deve mettere una goccia di olio per immersione (olio di cedro) sul vetrino preparato e colorato e si deve usare l’obiettivo da cento ingrandimenti (100x). L’uso dell’olio permette di aumentare la risoluzione visiva del campione e migliorare la qualità dell’immagine rimpiazzando l’aria presente tra il vetrino e la lente dell’obiettivo.

Senza immersione in olio Con immersione in olio

Aria Olio di cedro

La presenza della goccia d’olio fa sì che la luce non venga deviata dall’aria presente tra il vetrino e il vetro dell’obiettivo. Si ottiene così una migliore risoluzione visiva.