De la Artemisina annua L. a las artemisininas

C APÍTULO 14

Estudios farmacológicos sobre la artemisinina Esquema del capítulo 1

Investigación sobre el efecto antipalúdico 1.1 1.2 1.3 1.4

2

269

Efecto de la artemisinina sobre Plasmodium 269 Efecto de la artemisinina sobre Plasmodium en fase tisular 273 Efecto antirrecrudescente de la artemisinina 273 Efecto de la artemisinina en la ultraestructura de Plasmodium de roedores 274

Estudios de farmacología general 283 2.1 Sistema nervioso 283 2.2 Sistema cardiovascular 283 2.3 Sistema respiratorio 284

3

Estudios farmacocinéticos 3.1 Animales 285 3.2 Cuerpo humano

Bibliografía

285

290

292

1 Investigación sobre el efecto antipalúdico 1.1 Efecto de la artemisinina sobre Plasmodium 1.1.1 Experimentos in vivo 1. Malaria en modelos de ratón a. Efecto inhibitorio sobre la cepa sensible a los medicamentos de Plasmodium berghei El experimento se llevó a cabo en ratones suizos de entre 18 g y 22 g de peso, según el método de Peter. A los ratones se les inoculó por vía intraperitoneal la cepa sensible al fármaco (o la cepa resistente al fármaco) de P. berghei 10 000 000 (1 × 107) el día 1 y luego se dividieron de forma geométrica en varios grupos de tratamiento y un grupo de control. Cada grupo constaba de diez animales. A los ratones con tratamiento se les administró la suspensión de artemisinina-Tween por vía oral o por inyección subcutánea una vez al día, del día 1 al 3 (o del día 1 al 4), con un total de tres dosis (o cuatro dosis). La parasitemia en cada grupo se detectó mediante la tinción de Giemsa de los frotis de sangre en el día 4 y la tasa de inhibición en cada grupo de tratamiento se calculó comparándola con la parasitemia en el grupo de control. Por lo demás, se realizó una observación microscópica de la conversión negativa del plasmodio para calcular la tasa de conversión negativa en cada grupo.

De la Artemisia annua L. a las artemisininas http://dx.doi.org/10.1016/B978-0-12-811655-5.00014-3

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Capítulo 14

Por último, se calculó estadísticamente la dosis de supresión del 50 % (DS50) y la dosis efectiva del 50 % (DE50), ambas expresadas en mg/kg/día.

Los resultados de la comparación de DS50 de los preparados de artemisinina se presentan en la Tabla 14.1. b. Efecto sobre diversas cepas resistentes a los medicamentos y comparación del índice de resistencia Los resultados del índice de resistencia mostraron que la artemisinina tenía un notable efecto antipalúdico sobre varias cepas resistentes a la cloroquina, la primaquina y la mefloquina y una resistencia cruzada a las cepas altamente resistentes a la cloroquina. Los resultados se recogen en la Tabla 14.2.

2. Malaria en modelos de mono a. Efecto terapéutico de la artemisinina administrada por vía oral para la malaria simia Se administró una dosis de 200 mg/kg/día de suspensión de artemisinina-agua durante 3 días consecutivos por vía oral a monos Rhesus que desarrollaron parasitemia tras la inoculación de esporozoítos de malaria simia (Plasmodium cynomolgi). Se utilizó cloroquina a una dosis de 20 mg/kg/día como control. El examen de los frotis de sangre se realizó diariamente tras el inicio del tratamiento y se observó que todos los animales resultaron negativos a la parasitemia 2 o 3 días después del tratamiento. Los resultados se recogen en la Tabla 14.3.

Tabla 14.1: Potencia antipalúdica de la artemisinina frente a la cepa normal de P. berghei Dosis experimental Grupo (mg/kg) (oral) I 5,75 II 11,06 III 23 IV 46 V 92 VI 184

Número de animales (n) 10 10 10 10 10 10

Tasa de conversión negativa ( %) 0 0 10 30 70 90

Tasa media de infección Unidad de probabilidad ( %) 18,5 11,14 3,7148 1,45 4,4756 0,38 5,5244 0,05 6,2816 0,017

Tasa de inhibición ( %) 23,4 51,5 93,8 98,4 99,8 99,9

Unidad de probabilidad 4,2743 5,0376 6,5382 7,1444 7,8782 8,0902

DE50 = 69,3 mg/kg (38,6-124,7 mg/kg). DS50 = 9,97 mg/kg (6,7-14,9 mg/kg).

Tabla 14.2: Efecto de la artemisinina frente a varias cepas resistentes a los medicamentos y comparación del índice de resistencia Cepa Cepa normal (N) Cepa resistente a la cloroquina (alta resistencia RC) Cepa resistente a la cloroquina (resistencia leve NS) Cepa resistente a la primaquina (P) Cepa resistente a la pirimetamina (PYR) Cepa resistente a la mefloquina (N/1100)

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DS50 (mg/kg/día) 0,9 46,5 4,4 1,7 2,0 1,6

DS90 (mg/kg/día) 2,1 78 8,4 2,7 3,9 2,9

Índice de resistencia I90 1,0 37,1 4,0 1,3 1,9 1,4

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Tabla 14.3: Efecto terapéutico de la artemisinina administrada por vía oral frente a la malaria simia Tiempo tras la inoculación Número de de los identificación esporozoítos Lotes Droga y dosis (día) del mono probados (mg/kg/día) Artemisinina 200 58 31 Batch 1 Artemisinina 200 50 31 Artemisinina 200 59 11 Cloroquina 20 45 47 Batch 2 Artemisinina 200 22 18 Artemisinina 200 23 18 Artemisinina 200 67 18 Artemisinina 200 66 18 Cloroquina 20 64 18

Tasa de parasitismo antes del tratamiento ( %) 1,00 6,00 0,01 16,00 6,0 2,0 0,10 13,00 1,00

Tiempo hasta la conversión a negativo (día) 3 2 3 2 2 2 2 2 2

Tiempo de recrudecimiento del parásito (día) 11

23 11 11 8

, no se observó recrudecimiento del parásito después de medio año de observación.

b. Efecto terapéutico de la artemisinina inyectada por vía intramuscular en la malaria simia Se inyectaron glóbulos rojos infectados por malaria simia (P. cynomolgi) por vía intravenosa a monos Rhesus y luego se les inyectó por vía intramuscular 20, 10, 4 o 1 mg/kg/día de suspensión de aceite de artemisinina, una vez al día durante 3 días consecutivos. El examen de los frotis de sangre se realizó diariamente después del inicio del tratamiento para observar la conversión negativa de los parásitos. Los resultados mostraron que la parasitemia en todos los monos Rhesus tratados con diferentes dosis de suspensión de aceite de artemisinina pasó a ser negativa entre 2 y 3 días después de la administración de la dosis. A excepción del grupo que recibió una dosis grande, cuya observación negativa duró medio año, en los demás grupos de tratamiento se observó un recrudecimiento del parásito entre 8 y 24 días después del tratamiento. Los resultados se recogen en la Tabla 14.4.

Los resultados mencionados demuestran que la artemisinina tiene un efecto terapéutico notable sobre el paludismo en fase hemática de los simios.

Tabla 14.4: Efecto terapéutico de la artemisinina inyectada por vía intramuscular en la malaria simia Droga

Dosis (mg/kg/día)

Tiempo hasta la conversión a negativo (día)

Tiempo de recrudecimiento del parásito (día)

Suspensión de aceite de artemisinina

20 20 10 10 4 4 1

2 2 2 2 4 2 3

— — 20 23 8 24 9

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Capítulo 14

1.1.2 Experimentos in vitro 1. Efecto de la artemisinina sobre el plasmodio de roedores cultivado in vitro Se extrajo sangre de ratón infectada por P. berghei con una tasa de parasitismo de aproximadamente el 2 %, después se centrifugó para eliminar el plasma y luego se diluyó con medio de cultivo (medio 199 con suero bovino fetal) hasta el volumen original; después, el diluyente resultante se transfirió a viales (0,42 ml por vial), a los que se añadieron 2,56 ml de medio de cultivo más ciertos fármacos como la solución de artemisinina en etanol, cloroquina, etc.; el etanol se utilizó como control. Los frascos se incubaron de 6 a 12 horas a una temperatura de 37 °C en un secador al vacío que contenía una determinada proporción de CO2 y lo obtenido del cultivo se inoculó después en ratones sanos. Se examinó con el microscopio el frotis de sangre a intervalos regulares para observar la aparición de parasitemia y los resultados mostraron que los ratones del grupo de dosis grandes de artemisinina no desarrollaron parasitemia, mientras que los ratones de los grupos de control correspondientes murieron todos debido a la progresión de la parasitemia (Tabla 14.5).

2. Efecto de la artemisinina sobre el Plasmodium falciparum humano cultivado in vitro [1] Se trató el 25 % de la suspensión de glóbulos rojos con una tasa de parasitismo del 1 % de P. falciparum con varios fármacos y se cultivó durante 48 horas a una temperatura de 37 °C para detectar la sensibilidad a los fármacos de P. falciparum humano in vitro, tal Tabla 14.5: Efecto de la artemisinina sobre el plasmodio de los roedores cultivado in vitro Lote 1

Droga y disolvente Artemisinina 50 µg/ml + solución salina normal Artemisinina 250 µg/ml + solución salina normal Artemisinina 25 µg/ml + etanol absoluto Artemisinina 125 µg/ml + etanol absoluto Cloroquina 450 µg/ml + solución salina normal Cloroquina 225 µg/ml + solución salina normal Cloroquina 112,5 µg/ml + solución salina normal Solución salina normal Solución salina normal + Tween Etanol absoluto

Lote 2

6 días tras la inoculación 0

8 días tras la inoculación 0

10 días tras la inoculación 2,00

6 días tras la inoculación 0

8 días tras la inoculación 0

10 días tras la inoculación 0

0

0

0

0

0

0

0

0

0.05

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0,15

Muerto

0

0

0

0

0,26

Muerto

0

0

0,8

0

0,01

Muerto

0

0

0

0,03 0,02

3,60 1,80

Muerto Muerto

0,02 0,03

0,92 0,62

Muerto Muerto

0,02

3,15

Muerto

0

0,12

Muerto

La tasa de parasitismo indicada en la tabla es la media de los valores medidos en seis ratones.

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como informó Rioherds. Se prepararon frotis de sangre para su tinción y observación al microscopio con el fin de detectar el parasitismo; los índices de inhibición se obtuvieron mediante la comparación con el grupo de control y, a continuación, se calculó la dosis efectiva al 50 % (DE50) y la dosis efectiva al 90 % (DE90) según los índices de inhibición en los diferentes grupos de dosis. Los resultados fueron los siguientes: la DE50 y la DE90 de la artemisinina fueron 1,99 y 4,52, respectivamente, mientras que la DE50 y la DE90 de la cloroquina fueron 2,24 y 7,95, respectivamente, lo que indica que la artemisinina es entre 1,13 y 1,76 veces más potente que la cloroquina.

1.2 Efecto de la artemisinina sobre el Plasmodium en fase tisular 1. Efecto de la artemisinina sobre el Plasmodium gollinaceum en fase preeritocítica Se dejó que Aedes aegypti o Aedes albopictus picaran a pollos infectados con P. gollinaceum entre 9 y 11 días después del desarrollo de un lote de gametocitos en la sangre y luego se les alimentó durante 8 o 10 días. Posteriormente, se disecaron las glándulas salivales del pollo para preparar una suspensión salina con esporozoítos y se administró a los pollos la suspensión por vía oral 30 minutos después de la inoculación, una vez al día, durante 6 días consecutivos; se prepararon frotis de sangre para examinarlas con el microscopio una vez al día desde el día 7. El resultado mostró que la artemisinina no era eficaz sobre P. gollinaceum en fase preeritocítica cuando se administraba a una dosis de entre 100 y 300 mg/kg/día durante 6 días consecutivos y que, cuando la dosis se aumentaba a 400 mg/kg/día, todos los animales del grupo morían por toxicidad del fármaco en los 7 días siguientes a 6 días consecutivos de dosificación.

2. Efecto de la artemisinina sobre el Plasmodium cyomolgi en fase tisular A los monos experimentales se les inoculó por vía intravenosa una suspensión preparada con esporozoítos recogidos de las glándulas salivales de Anopheles stephensi y se observó el efecto del fármaco sobre P. cynomolgi en la fase tisular temprana y tardía. Los resultados mostraron que la administración del fármaco no inhibió la aparición de parasitemia, tanto si se iniciaba el día 1 como el 5 de la inoculación, lo que indica que la artemisinina no es eficaz sobre P. cynomolgi ni en la fase preeritrocítica ni en la fase tisular.

1.3 Efecto antirrecrudescente de la artemisinina La recrudescencia del parásito se descubre tanto en las manifestaciones clínicas como en el laboratorio tras la administración de artemisinina a dosis terapéuticas. Para explorar las formas de prevenir la recidiva, los autores realizaron estudios desde el punto de vista del uso racional del medicamento, incluyendo el aumento de la dosis, la prolongación de la duración de la dosis, el aumento de la frecuencia de la dosis y el cambio de la vía de administración.

Los resultados preliminares mostraron que, cuando se aumentó la dosis a más de cuatro veces la dosis efectiva (la dosis total de 3 días fue de 1200 mg/kg), no se observó la recrudescencia del parásito durante 41 días consecutivos después de la inoculación en sangre total, que se

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llevó a cabo el día 2 después de la conversión negativa de los parásitos. Al cambiar la vía de administración con una dosis efectiva de artemisinina de la administración oral a la inyección subcutánea, tampoco se detectó el recrudecimiento del parásito en los quince ratones durante los 28 a 32 días de observación.

Discusión y conclusiones 1. La artemisinina tiene un claro efecto antipalúdico en los modelos de malaria de ratones y monos La administración de artemisinina a una dosis de 100 mg/kg durante 3 días consecutivos puede hacer que los ratones infectados por el plasmodio se vuelvan negativos y la administración de artemisinina a una dosis de 200 mg/kg puede hacer que los monos Rhesus infectados se vuelvan negativos. Los experimentos han demostrado que la artemisinina no es eficaz sobre el plasmodio en la fase preeritrócica ni en la fase tisular, y es principalmente eficaz sobre el plasmodio en fase hemática. Los resultados del cultivo in vitro han proporcionado pruebas preliminares de que la artemisinina actúa directamente sobre el plasmodio.

2. La artemisinina tiene el problema de una alta tasa de recrudescencia en el tratamiento de la malaria A través de la exploración experimental desde los aspectos del uso racional de los medicamentos se descubrió preliminarmente que, en modelos de malaria en ratones, la administración oral de 4 veces la dosis efectiva y la inyección hipodérmica de la suspensión de artemisinina en aceite inhibían la recurrencia del plasmodio en roedores.

1.4 Efecto de la artemisinina en la ultraestructura del Plasmodium de roedores Para exponer cómo actúa la artemisinina sobre el Plasmodium, en el presente experimento se utilizó el microscopio electrónico para investigar el efecto de la artemisinina sobre la ultraestructura del plasmodio de los roedores en la fase hemática.

1.4.1 Materiales y métodos Se inoculó la cepa P. berghei 1 × 107 por vía intraperitoneal en ratones sanos que pesaban entre 18 g y 22 g y se seleccionaron para el experimento aquellos que presentaron una parasitemia del plasmodio >10 % a los 3 o 4 días de la inoculación.

Los ratones se dividieron en cuatro grupos: a) grupo de control sano, b) grupo de dosis mínima efectiva de artemisinina (100 mg/kg), c) grupo de dosis máxima efectiva de artemisinina (800 mg/kg) y d) grupo de control de cloroquina (40 mg/kg). La sangre se recogió en intervalos a las 4, 8, 12, 16, 20 y 24 horas después de la administración intragástrica del fármaco para la preparación de las muestras mediante el método convencional de seccionamiento ultrafino.

La sangre se extrajo del plexo retroorbital de los ratones experimentales, de forma que se dejaron caer de 7 a 8 gotas en un frasco de vidrio de fondo plano y se esparcieron en el fondo;

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se añadió glutaraldehído al 5 % (preparado con una solución de tampón Palade, pH 7,4) para cubrir la superficie de la sangre e inmediatamente la sangre se coaguló; después, la sangre se fijó durante 1 hora (el coágulo de sangre se sacó a los 30 min y se cortó en fragmentos de 1 mm, que se volvieron a poner en el frasco para fijarse continuamente hasta 1 hora), seguido de un lavado con solución de tampón Palade durante 1 hora; la sangre se fijó con fijador de tetróxido de osmio isosmótico barbitúrico durante otra hora y luego se lavó con solución de tampón Palade durante 30 minutos, seguido de una deshidratación gradual con acetona a una concentración de entre el 50 % y el 100 % (todos los pasos mencionados se realizaron a una temperatura de 4 °C); al final de la deshidratación, se añadió una mezcla de 100 % de acetona y el medio de incrustación de resina epoxi 618 preparado (1:1) a los frascos que contenían las muestras de coágulos de sangre para impregnarlas y, 30 minutos más tarde, se sacaron los coágulos de sangre, se pusieron en cápsulas, se incrustaron con resina epoxi 618 y se colocaron en un termostato a 37 °C durante toda la noche; después, los coágulos de sangre se colocaron en un termostato a 60 °C durante 48 horas para la polirreacción. Los coágulos sanguíneos resultantes se seccionaron con el ultramicrotomo LKB y las secciones se tiñeron con acetato de uranilo y citrato de plomo y se observaron con el microscopio electrónico JEM-100B. 1.4.2 Resultados 1. Efecto de la artemisinina a una dosis de 100 mg/kg sobre la ultraestructura del plasmodio de los roedores en la fase hemática a. A las 4 horas: no hubo ningún cambio notable en comparación con la estructura normal del plasmodio (Figs. 14.1 y 14.2).

Rib ER

M

Nm

CI

Nm N

Hm

Figura 14.1: Estructura normal del Plasmodium en la fase hemática (×24 000).

El trofozoíto joven del Plasmodium normal tiene membrana parasitaria (PM), membrana eritrocitaria del huésped (Hm), núcleo (N), membrana nuclear (Nm), mitocondria (M), ribosoma (Rib) y retículo endoplásmico (ER).

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N

PM

ER

Figura 14.2: Estructura normal del Plasmodium en la fase hemática (×15 000).

El trofozoíto del Plasmodium normal tiene hendidura de citoplasma (CI), núcleo (N), membrana nuclear (Nm), retículo endoplásmico (ER), etc.

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Capítulo 14

M Fv

Phv

Figura 14.3: Estructura del Plasmodium de roedores en la fase hemática 8 horas después de la administración de artemisinina (grupo de 100 mg/kg).

La vacuola alimentaria (Fv) desarrolla hilos o prolongaciones internas de la membrana (flecha) 8 horas después de la administración oral de 100 mg/kg de artemisinina.

Figura 14.4: Estructura del Plasmodium de roedores en la fase hemática 12 horas después de la administración de artemisinina (grupo de 100 mg/kg) (×12 000).

La membrana externa de la mitocondria (M) dentro del trofozoíto se hincha, con vacuolas autofágicas (Phv), 12 horas después de la administración oral de 100 mg/kg de artemisinina.

Cyt

Phv

LM Fv

Figura 14.5: Estructura del Plasmodium de roedores en la fase hemática 12 horas después de la administración de artemisinina (grupo de 100 mg/kg) (×12 000).

Tanto las vacuolas digestivas como la membrana limitante (LM) del trofozoíto se enrosca 12 horas después de la administración oral de 100 mg/kg de artemisinina.

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Figura 14.6: Estructura del Plasmodium de roedores en la fase hemática 12 horas después de la administración de artemisinina (grupo de 100 mg/kg) (×15 000).

El citostoma (Cyt) se enrosca y las vacuolas autofágicas (Phv) son expulsadas del parásito 12 horas después de la administración oral de 100 mg/kg de artemisinina.

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Phv

Phv

M

Nm

LM Phv

Figura 14.7: Estructura del Plasmodium de roedores en la fase hemática 12 horas después de la administración de artemisinina (grupo de 100 mg/kg) (×9000).

Se produce una gran cantidad de vacuolas autofágicas dentro del trofozoíto y se desprende del parásito 12 horas después de la administración oral de 100 mg/kg de artemisinina.

Figura 14.8: Estructura del Plasmodium de roedores en la fase hemática 12 horas y 30 min después de la administración de artemisinina (grupo de 100 mg/kg) (×15 000).

Membrana limitante (LM), membrana nuclear hinchada (Nm), agregación asteroide de la cromatina intranuclear, vacuolas con citoplasma del parásito y mitocondrias hinchadas (M) dentro del trofozoíto 14 horas y 30 min después de la administración oral de 100 mg/kg de artemisinina.

b. A las 8 horas: algunas vacuolas digestivas dentro del trofozoíto empezaron a cambiar, observándose membranas enroscadas, mitocondrias hinchadas y pigmentos poco profundos; la mayoría de los trofozoítos mostraron cambios (Fig. 14.3). c. Entre 12 y 14 horas: las vacuolas digestivas dentro del trofozoíto estaban enroscadas y en algunos de los trofozoítos se observaba un citostoma notablemente hinchado y retorcido. Empezaron a aparecer hilos en la membrana limitadora y algunos eran incluso prolongaciones multicapa. La membrana externa mitocondrial se hinchó notablemente. Algunos de los ribosomas dentro del citoplasma se desprendieron de la retícula endoplásmica y se dispersaron; algunas de las retículas endoplásmicas estaban dispuestas de forma lineal, otras tenían forma de vacuola y otras se desintegraron de alguna manera. Membrana nuclear hinchada, con ensanchamiento de la región de la membrana nuclear y agregación de asteroides de la cromatina.

Unos pocos trofozoítos comenzaron a desarrollar vacuolas autofágicas, algunas de las cuales degeneraron fuera del parásito en los eritrocitos. Muy pocos trofozoítos presentaron cambios leves (Figs. 14.4-14.8). d. A las 16 horas: la membrana limitante dentro del trofozoíto se hinchó significativamente, con un ensanchamiento de la región de la membrana externa e interna complicada por las vacuolas cistiformes, las vacuolas digestivas se enroscaron, las mitocondrias se hincharon considerablemente y los retículos

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Capítulo 14

LM

Phv

Fv

LM

Figura 14.9: Estructura del Plasmodium de roedores en la fase hemática 16 horas después de la administración de artemisinina (grupo de 100 mg/kg) (×12 000).

Se observan vacuolas digestivas hinchadas, ensanchamiento de la región de la membrana externa e interna e hinchazón de la membrana limitante dentro del trofozoíto 16 horas después de la administración oral de 100 mg/kg de artemisinina.

Figura 14.10: Estructura del Plasmodium de roedores en la fase hemática 20 horas después de la administración de artemisinina (grupo de 100 mg/kg) (×24 000).

La estructura dentro del citoplasma del parásito se ha desintegrado completamente, con solo vacuolas autofágicas y una débil membrana limitante (LM) del parásito 20 horas después de la administración oral de 100 mg/kg de artemisinina.

endoplásmicos adoptaron forma de vacuola o se desintegraron. Hubo un mayor número de vacuolas autofágicas, algunas de las cuales acabaron con el parásito. La pigmentación aumentó y se expandió y la membrana nuclear se hinchó y se le agregó la cromatina en forma de asteroide o nucleólo. El merozoíto no se vio afectado significativamente y la membrana nuclear del esquizonte cariógeno se ensanchó (Fig. 14.9). e. A las 20 horas: los cambios de las vacuolas digestivas, las mitocondrias, los núcleos y el retículo endoplásmico dentro del trofozoíto eran similares a los de las 16 horas, con una disminución de los ribosomas y de los pigmentos aplastados, algunos de los cuales fueron expulsados al citoplasma del parásito; las vacuolas autofágicas se agrandaron, y muchas vacuolas autofágicas fueron expulsadas de los parásitos en el citoplasma de los eritrocitos; la estructura del citoplasma en algunos trofozoítos se desintegró totalmente, con solo vacuolas autofágicas y una débil membrana limitante.

Muy pocos trofozoítos presentaron cambios leves (Fig. 14.10). f. A las 24 horas: la mayoría de los parásitos dentro de los trofozoítos se desintegraron completamente y solo quedaron numerosas vacuolas autofágicas dentro de los eritrocitos del huésped. Los cambios del esquizonte fueron leves (Fig. 14.11).

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Phv

Figura 14.11: Estructura del Plasmodium de roedores en la fase hemática 24 horas después de la administración de artemisinina (grupo de 100 mg/kg) (×12 000).

La estructura dentro del citoplasma del parásito se ha desintegrado completamente, con vacuolas autofágicas residuales dentro de los eritrocitos del huésped 24 horas después de la administración oral de 100 mg/kg de artemisinina.

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Nm

Figura 14.12: Estructura del Plasmodium de roedores en la fase hemática 16 horas después de la administración de artemisinina (grupo de 800 mg/kg) (×12 000).

Membrana nuclear hinchada (Nm), agregación de asteroides de la cromatina e hinchazón.

Se observan mitocondrias dentro del trofozoíto 16 horas después de la administración oral de 800 mg/kg de artemisinina.

2. Efecto de la artemisinina a una dosis de 800 mg/kg sobre la ultraestructura del plasmodio de los roedores en la fase hemática a. A las 4 horas: en algunos trofozoítos ya había una acumulación irregular de ribosomas, el retículo endoplásmico se desintegró, la cromatina comenzó a agregarse y se formaron vacuolas autofágicas. b. A las 8 horas: la región de la membrana nuclear en el trofozoíto se expandió y se observó la agregación de cromatina, vacuolas digestivas enroscadas, disminución de los ribosomas y desintegración del retículo endoplásmico. c. A las 16 horas: algunas de las membranas limitantes dentro del trofozoíto desarrollaron vacuolas, con una membrana muy enroscada; la región de la membrana nuclear se expandió, con una agregación asteroide de la cromatina; los ribosomas se amontonaron, el retículo endoplásmico se desintegró en cierta medida y las mitocondrias se hincharon, con una densidad de electrones dramáticamente aumentada en el centro. Aparecieron vacuolas autofágicas, algunas de las cuales expulsaron el parásito (Figs. 14.12, 14.13 y 14.14). d. A las 20 horas: se observó una agregación extrema de la cromatina dentro de los núcleos del trofozoíto, con agregación de ribosomas, desintegración del retículo endoplásmico dispuesto linealmente y vacuolas autofágicas en expansión, algunas de las cuales expulsaron el parásito.

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Capítulo 14

Fv Phv

N Phv

Figura 14.13: Estructura de Plasmodium Figura 14.14: Estructura de Plasmodium de roedores en la fase hemática 16 horas de roedores en la fase hemática 16 horas después de la administración de artemisinina después de la administración de artemisinina (grupo de 800 mg/kg). (grupo de 800 mg/kg) (×24 000).

En el interior del trofozoíto se observan vacuolas Se observan prolongaciones en forma de alimentarias enroscada, ensanchamiento de la hilos profundos en la membrana nuclear del membrana nuclear, agregación de asteroides trofozoíto 16 horas después de la administración de la cromatina y vacuolas autofágicas, algunas oral de artemisinina (grupo de 800 mg/kg). de las cuales expulsaron el parásito 16 horas después de la administración oral de artemisinina (grupo de 800 mg/kg).

3. Efecto de la cloroquina a una dosis de 40 mg/kg sobre la ultraestructura de Plasmodium de roedores en la fase hemática La observación se realizó 4, 16 y 24 horas después de la administración intragástrica. Las características más destacadas en el grupo de control fueron las siguientes: se formaron grandes vacuolas autofágicas, con agregación masiva de pigmentos (los pigmentos aparecieron 4 horas después de la administración y se observaron pigmentos agrupados a las 16 horas, algunos de los cuales sobresalían en el citoplasma del parásito), y la región de la membrana nuclear en algunos trofozoítos se expandió. A las 24 horas, algunas de las vacuolas autofágicas sobresalían en el citoplasma de los eritrocitos del huésped junto con los pigmentos de agrupación) (Figs. 14.15 y 14.16).

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N

P Phv Phv

P

P

Figura 14.15: Estructura de Plasmodium de roedores en la fase hemática 16 horas después de la administración de cloroquina (40 mg/kg) (×18 000).

Los pigmentos agrupados (P) sobresalen en el citoplasma del parásito 16 horas después de la administración oral de 4 mg/kg de cloroquina.

Figura 14.16: Estructura de Plasmodium de roedores en la fase hemática 24 horas después de la administración de cloroquina (40 mg/kg) (×145,000).

Los pigmentos agrupados (P) aparecen en grandes vacuolas autofágicas (Phv) del trofozoíto 24 horas después de la administración oral de 4 mg/kg de cloroquina

Discusión y conclusiones La artemisinina afecta a la ultraestructura de Plasmodium de roedores en la fase hemática, actuando principalmente sobre la estructura del sistema de membranas de Plasmodium. En primer lugar, actúa sobre las vacuolas digestivas, las mitocondrias y la membrana limitante, tras lo cual el retículo endoplásmico y las mitocondrias se hinchan manifestándose como una región ensanchada entre las membranas externa e interna o prolongaciones en forma de hilos dentro de las vacuolas digestivas y la membrana limitante. Después, se producen cambios en el retículo endoplásmico y en la membrana nuclear, que se manifiestan en una disposición lineal o vacuola o retículo endoplásmico desintegrado y membrana nuclear hinchada. Además de los cambios en la estructura del sistema de membranas, también se observan cambios en los núcleos, manifestados por la agregación de la cromatina. Las vacuolas autofágicas se observaron de forma evidente 12 horas después de la administración, algunas de las cuales incluso expulsaron al parásito. Este fenómeno se desarrolló rápidamente: a las 20-24 horas, la estructura interna de algunos trofozoítos se desintegró y quedaron solo varias vacuolas autofágicas residuales. Las distintas dosis de artemisinina presentaron diferencias en la velocidad de acción más que en el lugar o las características de acción.

La artemisinina difiere de la cloroquina en el lugar y las características de acción. En los ratones a los que se les administró cloroquina por vía oral, las principales manifestaciones fueron el agrandamiento de la vacuola digestiva y la agrupación de pigmentos. Macomber et al. (1967) informaron de la formación de grandes vacuolas autofágicas con pigmento 2 horas después de la administración de cloroquina en un experimento in vivo. Ali et al. (1969) y Howells, Peters, Homewood y Warhurst (1970) señalaron que era el resultado de la afectación del metabolismo de la hemoglobina de Plasmodium. Sin embargo, Warhurst creía que era el

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Capítulo 14

resultado de la acción directa sobre los pigmentos y la vacuola digestiva, incluidos los cambios de la vacuola digestiva. Los autores también observaron esta acción característica de la cloroquina durante el experimento.

En la fase hemática, Plasmodium se nutre principalmente de la hemoglobina de los eritrocitos del huésped. Los estudios de microscopia electrónica han demostrado que el parásito se alimenta de manera que el citostoma se traga primero el citoplasma de los eritrocitos del huésped para formar una hendidura de citoplasma (CI), en la que la densidad de electrones coincide con la de los eritrocitos del huésped. La CI tiene dos capas de membranas: la membrana externa (membrana del parásito) y la membrana interna (membrana del eritrocito del huésped). Después de ingerido, el citoplasma del eritrocito, junto con su membrana externa, se corta en el citostoma para formar una vacuola digestiva que contiene dos capas de membranas, y el citostoma se sella. Después, el citostoma vuelve a ingerir el citoplasma de los eritrocitos del huésped para formar de nuevo vacuolas digestivas, y este ciclo se repite.

Por lo tanto, las vacuolas digestivas son la etapa más temprana de la ingesta de nutrientes por parte de Plasmodium. La hemoglobina del huésped en las vacuolas alimentarias se digiere y enzimoliza en las vacuolas digestivas, durante lo cual se forman vacuolas digestivas de una sola membrana y a veces se observan trozos de membrana residuales de los eritrocitos del huésped en las vacuolas digestivas. Durante el proceso de digestión se producen gránulos de pigmento insolubles. Por último, Plasmodium digiere la hemoglobina del huésped en aminoácidos y péptidos, que son la materia prima para la síntesis de proteínas del protozoo.

El sitio principal sobre el que actúa la artemisinina es el sistema de membranas del plasmodio.

Actúa directamente sobre las vacuolas digestivas para bloquear la etapa más temprana de la ingesta de nutrientes, lo que hace que el plasmodio busque aminoácidos para alimentarse, desarrolle vacuolas autofágicas rápidamente que se expulsan del parásito continuamente, con lo que el plasmodio pierde mucho citoplasma y luego muere. Theakston et al. (1969) demostraron que la película del plasmodio de los roedores contiene citocromo oxidasa.

Howelles et al. (1973) informaron de que las mitocondrias del plasmodio de los roedores en la fase de trofozoíto contenían principalmente citocromo oxidasa, tanto en la cepa sensible a la cloroquina como en la cepa resistente a la cloroquina. La película y las mitocondrias del plasmodio de los roedores también son morfológicamente similares. La artemisinina actúa principalmente sobre la estructura del sistema de membranas del plasmodio en sitios primarios como las vacuolas digestivas, la película y las mitocondrias. Se puede considerar que el efecto antimalárico de la artemisinina interfiere principalmente en la función pelicular-mitocondrial.

En el presente experimento se observaron cambios en la ultraestructura del plasmodio de los roedores tras la administración intragástrica de artemisinina y se comparó con el grupo de control de cloroquina. Los resultados demostraron que la artemisinina actúa principalmente sobre la estructura del sistema de membranas de Plasmodium; concretamente, actúa primero sobre las vacuolas digestivas, la película y las mitocondrias, y después sobre la membrana nuclear y el retículo endoplásmico. Los resultados también demostraron que la artemisinina tiene un cierto efecto sobre la cromatina dentro del núcleo. Creemos que el modo de acción de la artemisinina afecta sobre todo a la función pelicular-mitocondrial, bloqueando el suministro de nutrición que se basa principalmente en el citoplasma del eritrocito del huésped.

La artemisinina difiere significativamente de la cloroquina en el lugar de acción y en la tasa de desarrollo de la acción, lo que sugiere que la artemisinina puede lograr una conversión negativa más rápida del plasmodio que la cloroquina en el tratamiento clínico.

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Estudios farmacológicos sobre la artemisinina

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2 Estudios de farmacología general 2.1 Sistema nervioso 2.1.1 Prueba en perros 1. A dos perros se les administró por vía intragástrica una dosis única de artemisinina de 105 mg/kg y 158 mg/kg, respectivamente, y no se encontraron anomalías en el comportamiento general, las actividades y el estado neurológico durante los 14 días de observación tras la administración del fármaco.

2. Se utilizaron cuatro perros para la prueba, a cada uno de los cuales se le administró artemisinina por vía intragástrica a una dosis de 100 mg/kg diarios durante 5 días consecutivos. No se encontraron anomalías en el aspecto y las actividades de los perros durante la observación de una semana tras la administración del fármaco.

2.1.2 Prueba en ratas Veinticuatro ratas se dividieron por igual en tres grupos y se les administró por vía intragástrica una suspensión de artemisinina-agua a dosis de 250 mg/kg, 500 mg/kg y 1000 mg/kg, respectivamente, durante 14 días consecutivos. En ninguna de las ratas de los tres grupos de dosis se observaron anomalías en el comportamiento general tras la administración del fármaco.

Basándonos en los resultados mencionados de las pruebas en perros y ratas, concluimos que la artemisinina no tiene una actividad farmacológica evidente sobre el sistema nervioso.

2.2 Sistema cardiovascular 2.2.1 Prueba en perros 1. A los perros se les administró por vía intragástrica una dosis única de artemisinina de 105 mg/kg y 158 mg/kg, respectivamente, y se midieron sus frecuencias cardiacas (FC) y sus electrocardiogramas (ECG) a los 3, 7 y 14 días tras la administración del fármaco, y los datos se compararon con los recogidos antes de la administración del fármaco. Los resultados mostraron que la artemisinina no tenía efectos obvios sobre la FC y el ECG de los perros, y no se observaron anomalías en la FC y el ECG ni siquiera cuando se aumentó la dosis hasta 1200 mg/kg.

2. Se anestesió a tres perros con pentobarbital sódico mediante inyección intravenosa y se conectó un manómetro de mercurio a la arteria carótida común izquierda de cada perro para medir la presión arterial (PA). A cada uno de los perros se le administró por vía intragástrica una dosis de artemisinina de 100 mg/kg después de que se estabilizara su PA y a continuación se midieron y registraron su FC y su PA en las 2 horas siguientes a la administración del fármaco. La comparación con la FC y la PA antes de la administración del fármaco mostró que no había cambios evidentes. No se observaron anomalías en la FC y la PA de los perros ni siquiera cuando se administró artemisinina 100 mg/kg por inyección intraperitoneal.

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Capítulo 14

Además, también se utilizaron conejos y cobayas para la prueba mediante el método de administración intraperitoneal, y los resultados obtenidos para la FC, la PA y el ECG fueron idénticos a los obtenidos en la prueba mencionada.

2.2.2 Prueba en gatos Seis gatos se dividieron en dos grupos y se les administró por vía intragástrica, sin anestesiarlos, una dosis de artemisinina de 100 mg/kg y 500 mg/kg, respectivamente. Se registró el ECG de los gatos durante 2 o 3 horas después de la administración del fármaco y luego se comparó con los resultados obtenidos anteriores a la administración del fármaco.

Además, se anestesió a otros tres gatos con uretano y luego se les administró por vía intragástrica una dosis de artemisinina de 800 mg/kg, respectivamente; después, se registraron el ECG y la PA de los tres gatos hasta las 4 horas y luego se compararon con los datos anteriores a la administración del fármaco. Los resultados mostraron que la artemisinina en cualesquiera de las dosis mencionadas no afectó significativamente a la FC, la PA y el ECG de los gatos, tanto si estaban anestesiados como si no.

Según los resultados de las pruebas mencionadas, creemos que la artemisinina no tiene un efecto farmacológico significativo en los sistemas cardiovasculares de perros y gatos cuando se administra a una dosis ligeramente superior a la dosis eficaz contra Plasmodium.

2.3 Sistema respiratorio 2.3.1 Prueba en perros A cuatro perros se les administró artemisinina por vía intragástrica 100 mg/kg al día durante 5 días consecutivos y no se encontraron anomalías respiratorias durante la siguiente semana de observación.

2.3.2 Prueba en conejos Seis conejos domésticos fueron cateterizados y conectados al tambor de Marley tras la separación de la tráquea bajo anestesia local con procaína y luego se les inyectó por vía intraperitoneal una dosis de artemisinina de 100 mg/kg. No se encontraron cambios evidentes en la frecuencia y profundidad respiratoria de los conejos domésticos durante las 2 horas consecutivas de observación tras la administración del fármaco.

Los resultados anteriores permiten concluir que la artemisinina no tiene efectos evidentes sobre el sistema respiratorio de los perros y los conejos domésticos.

En resumen, los estudios experimentales sobre los efectos farmacológicos generales de la artemisinina han demostrado que esta, cuando se administra a un nivel de dosis ligeramente superior a su dosis efectiva contra el plasmodio, no tiene efectos farmacológicos evidentes

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