Секрет вечной молодости

СЕКРЕТ ВЕЧНОЙ МОЛОДОСТИ или Удивительные приключения альфа-фетопротеина

Родионов Сергей Юрьевич Доктор медицинских наук, член-корреспондент РАЕН, директор Пермского филиала Института иммунологии и физиологии УрО РАН. Автор научного открытия, 2 запатентованных лекарственных препаратов, 16 изобретений, 89 научных работ, опубликованных в российских и зарубежных научных изданиях, в том числе 2 монографии.

На Земле побывали представители внеземной цивилизации. Намеренно или по неосторожности они забыли здесь некое устройство. Лучшие умы человечества пытаются постигнуть, для какой цели служит эта непонятная «штуковина», какую пользу можно из нее извлечь. Но тщетно – «штуковина» ни за что не желает раскрывать свою тайну. Лишь спустя десятки или даже сотни лет, когда о существовании упомянутого аппарата уже почти никто на планете и не вспоминает, какому-то ученому чудаку удается разгадать секрет. И тут чудесным образом выясняется, что «штуковина», простоявшая без дела долгие годы, способна принести неоценимую пользу человечеству. Хеппи-энд. В предыдущем абзаце я вкратце изложил один из излюбленных писателями-фантастами сюжетов. Однако, как справедливо отмечают поклонники реализма, в жизни можно столкнуться с гораздо более удивительными сюжетами. Природа позаботилась о том, чтобы деятели науки не сидели без дела. Загадочные устройства разбросаны на Земле повсюду. Более того, они находятся у нас внутри. *** Серьезным изучением белков земляне начали заниматься совсем недавно, менее ста лет назад. И оказалось, что каждый белок - это сложнейшая биологическая машина, скрывающая не меньше загадок, чем выдуманная фантастам «инопланетная штуковина». Герой нашей статьи - белок альфа-фетопротеин, сокращенно АФП. История изучения альфа-фетопротеина насчитывает несколько десятков лет. Определен состав этого белка и его структура. Медикам сегодня точно известно, что концентрация АФП в крови взрослого человека повышается при тяжелых заболеваниях, а у женщин - при беременности. Разработаны методики биохимического анализа для определения уровня АФП в организме. В некоторых случаях АФП используют и в качестве реагента. АФП является сывороточным гликопротеином, принадлежащим к классу эмбриоэволюционных протеинов. Он привлек значительное внимание, т.к. было показано, что изменение его уровня в сыворотке во время беременности является признаком развития многочисленных эмбриональных расстройств. На протяжении прошедших 30 лет около 11 000 статей было опубликовано в отношении АФП, средняя частота - одна публикация в день с 1969 года. Большая часть публикаций касается применения протеина в диагностике, или другого вида использования АФП в биомедицине. Однако к настоящему времени удивительно мало известно о структурных свойствах этого протеина, а также о молекулярном механизме его функционирования. Тем не менее,

ученые, занимающиеся исследованиями механизма воздействия АФП на ткани и органы, получают совершенно поразительные результаты. Впрочем, не будем забегать вперед. Белки, входящие в состав тканей зародыша, содержат первичную информацию о последующем развитии организма. Применение их иногда позволяет, упрощенно говоря, вернуть клеткам память, заставить их "вспомнить", как они "должны себя вести". ЦИТАТА: "В медицинской литературе описан случай, когда австрийский врач Зейлерн-Ашпанг вылечил рак кожи у кур, применив растертую ткань эмбрионов самих кур. (Журнал "РОССИЯ", № 2 за 1996 год)

- Ошибки в функционировании клеток характерны для стареющего организма, клетки же молодого организма, как правило, делают меньше ошибок. Отсюда вытекает возможность использования фетальных белков (и, в частности АФП) для омоложения организма. Первые опыты по омоложению, когда брали растертый сушеный эмбрион лягушки и натирали раствором этого порошка пораженные ткани больной взрослой лягушки с поразительным эффектом, известны давно. Однако попыток выделить из порошка то или иное активное вещество поначалу не было, употребляли комплекс различных веществ, содержащихся в порошке. Лишь впоследствии удалось выяснить, что одним из активных белков в упомянутой смеси является альфа-фетопротеин. ЦИТАТА: "Использование имплантации фетальных тканей в России началось в конце прошлого века. Наибольшего распространения метод достиг в конце 30-х годов нынешнего века благодаря работам акад.Филатова и его учеников. Затем метод был незаслуженно забыт... В 1992 году в Москве был создан Международный институт биологической медицины (МИБМ). Главным предметом исследования в этом учреждении стало применение фетальных тканей человека для лечения различных заболеваний. В МИБМ накоплен большой клинический опыт, итоги которого были подведены на Первом симпозиуме по трансплантации фетальных тканей, который состоялся 4-7 декабря 1995 года". (Из аналитической записки МЗ "Лечение фетальными клетками и тканями человека в МИБМ")

В СССР ученые Г.И. Абелев и Ю.С. Татаринов впервые сумели выделить белок альфафетопротеин в чистом виде. Отчет об их удачном эксперименте появился в открытой печати. Поначалу область применения альфа-фетопротеина в медицине была весьма узкой, он использовался лишь в качестве реагента при диагностике определенного рода заболеваний. Никому не приходила в голову возможность применения АФП в качестве лечебного препарата. Один грамм этого вещества корпорация "Sigma" (США) продает примерно за 5 миллионов долларов.

- В конце семидесятых годов в Советском Союзе применением фетальных белков заинтересовалось министерство обороны. Перед сотрудниками закрытой биохимической лаборатории 3-го Главного управления МО СССР была поставлена задача создать препарат, который помогал бы при радиационных ожогах, химическом воздействии и прочих последствиях применения неконвенционального оружия вероятным противником. Вся информация об этих исследованиях была засекречена. В ходе исследований было подтверждено, что фетальные белки оказывают омолаживающее воздействие на ткани. Нашли объяснение и сведения о том, что многие зарубежные политики, деятели кино, миллионеры - то есть те, кто может позволить себе истратить огромное количество денег, пользуются фетальными белками для поддержания организма. Были получены достоверные результаты, и смесь фетальных белков под названием "омолаживающее средство" стала втайне применяться для лечения престарелых советских руководителей.

ЦИТАТА: "...Что могло объединять художников и диктаторов, политиков и рок-звезд, киноартистов и миллионеров? Оказывается, все они пользовались недоступным тогда для простых смертных новым методом лечения, получившим название клеточная или фетальная хирургия. В разное время пациентами фетальной хирургии были Фрэнк Синатра, Марлен Дитрих, Жаклин Онассис, Игорь Сикорский, султан Брунея, король Марокко, Тито, Чаушеску, Конрад Аденауэр, Менахем Бегин, Фидель Кастро, Ричард Никсон, Фердинанд Маркос, Жорж Сименон, Томас Манн, Чарльз Чаплин, София Лорен, Уинстон Черчилль, Дуайт Эйзенхауэр, Рональд Рейган, Герберт фон Караян, Генри Миллер, Пабло Пикассо, Сальвадор Дали, Грета Гарбо, Альфред Хичкок, Лиз Тейлор, Мэрилин Монро, Джон Рокфеллер, Джимми Картер, Джон Кеннеди и многие другие". ("Аргументы и факты", № 7 (56) за 1995 год, статья "Найден эликсир молодости")

- Позже было установлено, что одним из важнейших компонентов указанной смеси является альфа-фетопротеин. Исследовательская группа занялась разработкой собственной технологии выделения этого вещества, и через некоторое время эта работа завершилась успешно.

- Новая российская технология оказалась неизмеримо дешевле зарубежной. В результате открылась возможность более широкого использования альфа-фетопротеина в качестве лечебного средства. Эксперимент по применению альфа-фетопротеина для лечения начали проводить в восьмидесятые годы. Разумеется, с соблюдением требований Хельсинкской конвенции, то есть - сначала на животных и только потом на людях. Эксперимент продолжался около двадцати лет. Результаты были ошеломляющими. ЦИТАТА: "Как известно, фетальные клетки до определенного срока беременности иммунологически индифферентны, благодаря чему легко приживляются в чужом организма. Поэтому при их трансплантации не требуется применение иммуносупрессоров, дающих массу неприятных побочных эффектов. В этом и состоит главное преимущество клеточной терапии. После введения (как правило, в виде инъекционных доз) в организм больного фетальных тканей начинают происходить удивительные и еще не изученные до конца процессы - идет миграция клеток, их пролиферация, дифференцировка и замещение утраченных функций пораженных тканей и органов... К сожалению, исследования по клеточной терапии в России практически не финансируются" ("Медицинская газета" от 29 декабря 1995 года, статья "Трансплантация фетальных тканей - не панацея, но шанс").

- Результаты использования АФП при лечении тяжелых аутоиммунных заболеваний были настолько впечатляющими, что по решению Фармакологического комитета впервые в отечественной истории фармацевтики лекарство было передано в Израиль для проведения 2-ой фазы официальных клинических испытаний. *** ЦИТАТА: комментарии Яакова Ломкина, руководителя Иерусалимской клиники "Рам-Таль", на базе которой проводилась вторая фаза клинических испытаний препарата АФП. «Теоретически я был готов к тому, что появится подобный препарат, - говорит доктор Ломкин. - Меня всегда интересовали аутоиммунные заболевания, и в конце семидесятых годов я уже слышал об альфа-фетопротеине. В чистом виде я его не применял, однако композиции фетальных белков мы использовали при лечении тяжелых заболеваний, таких, как туберкулез и рак. До переезда в Израиль я работал в НИИ туберкулеза, и в некоторых случаях, когда, скажем, мальчик шестнадцати лет был безнадежен (ему оставалось жить месяц-два), мы шли на риск и полулегально применяли фетальные белки. Чтобы спасти мальчишку, я был готов на все. Мы получали фетальные белки у себя в лаборатории, и я видел, каким сильным исцеляющим действием они обладают. В России клинические испытания успешно идут уже два года, и я рад, что российский фармкомитет дал мне разрешение участвовать в процессе внедрения нового препарата. Я начал применять альфа-фетопротеин лишь около четырех месяцев назад, однако уже получены весьма обнадеживающие результаты. Например, я сейчас лечу пациентку шестидесяти семи лет, которая побывала в реанимации, шесть раз лежала в стационаре. У

нее целый букет заболеваний - астма, сердечная недостаточность, почечная недостаточность, легочная недостаточность, закупорка сосудов, нарушение мозгового кровообращения. Она была вынуждена ежедневно принимать две горсти разнообразных лекарств, фактически жила на стероидах. Ее родственники обратились ко мне, потому что в свое время я вылечил их дочь от язвенно-некротического колита. Всего через три недели применения альфа-фетопротеина в сочетании с другими лекарствами серология, формула крови, биохимия, в общем, все анализы у этой женщины заметно изменились к лучшему. Было трудно поверить, что это не ошибка. Другой пример. Женщина пятидесяти шести лет, страдающая гепатитом С и циррозом печени. Ее даже не взяли на пересадку печени. Когда она поступила ко мне, я взял анализ крови. Энзимы печени измерялись в тысячах. Буквально через несколько дней применения альфа-фетопротеина их уровень опустился до ста сорока при норме сорок. По прошествии трех недель у нее все показатели вернулись в норму, самочувствие отличное. Я считаю, что применение АФП показано при всех аутоиммунных заболеваниях: ревматизме, подагре, болезни Хашимото, рассеянном склерозе, астме, при некоторых формах туберкулеза, боковом, амиотрофическом склерозе, сахарном диабете, болезни Крона, язвенно-некротическом колите, миастениях, некоторых формах ДЦП. Кроме того, при всех - в том числе тяжелейших - заболеваниях кожи, при послеожоговой или послелучевой терапии, при реабилитации после химиотерапии. В России наработан опыт использования альфа-фетопротеина в онкологии. Постараюсь растолковать как можно проще механизм действия АФП. Любое химическое соединение может быть как другом, так и врагом нашего организма. Все зависит от количества этого соединения и от того, в нужном ли месте оно находится. Скажем, антитела. Если их содержание в норме - это наши друзья, но если их становится больше, чем нужно, то они превращаются во врагов. Иными словами, если организм начинает по ошибке производить избыток антител, то они его, организм, уничтожают. Возьмем, к примеру, ревматизм. Из-за чего сустав становится деформированным? Когда-то была травма или инфекция, сработала иммунная система, прибыли с кровью антитела, уничтожили очаг, ушли. Затем заживающая ткань может дать ложный сигнал, и тогда возникнет ошибка. Инфекции уже нет, но иммунная система включается вновь, вырабатываются антитела, которые приходят и разрушают здоровые клетки. Возникает деформация сустава. Сегодня все, даже неспециалисты, знают, что генетическая информация заложена в ДНК. Но одной лишь генетической информации для правильного развития тканей недостаточно, нужен, так сказать, сценарий размножения клеток тканей. Этот сценарий как раз и хранится в макромолекуле альфа-фетопротеина. Не случайно это вещество содержится в эмбриональной ткани, то есть в ткани человеческого зародыша. Роль АФП - следить за соблюдением упомянутого мной сценария. Если все в порядке - он, условно говоря, "отдыхает". Если же в организме по той или иной причине появляются видоизмененные клетки, нарушается биохимический баланс, скажем, появляются лишние антитела, то АФП "просыпается", включается в работу, принимается осаждать избыточные антитела и восстанавливает нарушенный баланс. На том же принципе основано и применение альфа-фетопротеина в качестве "омолаживающего средства". Клетки пожилого человека чаще ошибаются, а альфафетопротеин возвращает им память. Организм здорового человека "автоматически" поддерживает содержание АФП на уровне, достаточном для регулирования биохимического баланса. В организме больного человека альфа-фетопротеина не хватает, приходится его вводить. Однако альфа-фетопротеин - не панацея. Лечение непременно должно быть комплексным. С 13 по 22 марта этого года в Иерусалиме пройдет международный семинар "Организация здравоохранения в Израиле". В рамках семинара будет рассмотрен российский опыт применения альфа-фетопротеина в качестве лечебного препарата. А на нынешнее лето (более точные сроки пока неизвестны) намечено проведение в столице Израиля международной конференции "Медицинская реабилитация", где проблеме использования альфа-фетопротеина будет уделено особое внимание. Подробности можно узнать у организаторов конференции и семинара, среди которых муниципалитет Иерусалима, профсоюз израильских врачей, Союз ученых-репатриантов и ассоциация "Интеграция"».

(19 февраля 1998 г «Вести-2» Израиль)

О возрасте, старении, программе SENS и возможностях … АФП! Английский геронтолог, доктор наук Обри Ди Грей – организатор широкой международной программы под эгидой проекта SENS (Strategies for Engineered Negligible Senescence – стратегии достижения пренебрежимого старения инженерными методами). Ди Грей считает что, даже не зная фундаментальных причин старения, можно резко замедлить и даже сделать его пренебрежимым. Для этого необходимо разорвать цепочки процессов старения организма в их «слабых звеньях» – там, где ученые в состоянии это сделать.

SENS - стратегия достижения пренебрежимого старения инженерными методами

Свою концепцию, основанную на том, что терапии совершенствуются быстрее, чем накапливаются повреждения в организме, ди Грей называет «второй космической скоростью». Суть ее в том, что как только станет доступно первое поколение терапий, мы получим 20–30 дополнительных лет здоровой жизни. А за это время, выигранное нами с помощью «второй космической скорости», прогресс науки еще более убыстрится. Так, постепенно отвоевывая «по кусочку» годы у смерти, мы и достигнем бесконечной жизни. Цель программы SENS – создание доступной для каждого человека технологии, при помощи которой можно восстанавливать организм до любой степени омоложения и поддерживать его в таком состоянии в течение любого времени. Ди Грей выделяет несколько задач от решения, которых будет зависеть успех в стратегии коррекции биологического возраста.

Обри Ди Грей

Восполнение потери клеток

Потеря клеток (исчезновение клеток без появления новых) происходит в некоторых наиболее важных тканях – в особенности, в сердце и некоторых отделах мозга. Она также наблюдается в мышцах. Иногда образующиеся промежутки заполняются за счет того, что клетки становятся крупнее (сердце). В других случаях они заполняются клетками иного типа или фиброзным бесклеточным материалом (мозг и сердце), в третьих – заполнения не происходит вообще: ткань просто сжимается (мышцы). Можно бороться с потерей клеток тремя основными способами. Один из них – «естественное» стимулирование деления клеток. Это подобно тому, как физические упражнения ведут к росту мышечной массы. Другой способ – искусственное введение (например, с помощью инъекций) факторов роста, которые стимулируют деление клеток. Этот метод хорошо действует в мышцах и может оказаться эффективным для вилочковой железы, важной части иммунной системы. Однако, как естественное, так и искусственное стимулирование деления клеток имеет свои ограничения. Это происходит отчасти потому, что система противораковой защиты организма обладает разнообразными блокирующими механизмами, предотвращающими чрезмерное деление клеток. Поэтому наверняка понадобится третий способ борьбы с потерей клеток. Он заключается во внедрении в организм клеток, модифицированных таким образом, чтобы они делились и восстанавливали потерю клеток. Это должно происходить даже в том случае, когда присутствующие в организме клетки утратили способность к делению. В этом суть стволовой клеточной терапии.

Сергей Родионов, комментарии: Итак, рассмотрим роль стимулятора клеточного деления белок АФП исходя из его биологических свойств, которые были изучены и опубликованы в мировой научной литературе. Значение АФП для восполнения утраченных клеток. С телеологической точки зрения будет справедливо считать, что фетальный протеин АФП с известной активностью регуляции роста, будет воспроизводить ряд участков адгезии пептидов в своей первичной структуре, которые могут влиять на рост и дифференцировку клеток. Исследованиями Австралийских биологов было показано, что культуры клеток вне организма, находящиеся на питательных средах со временем деградируют, т.е. подвергаются, так называемому процессу «старения», однако при добавлении белка АФП в эти культуры клетки приобретали свойства «вечной молодости». Одной из основных проблем терапии стволовыми клетками является низкий процент «выживания» введенных клеток в организм реципиента в основном из-за иммунологической цензуры. Одним из наиболее интересных иммунорегуляторных белков, характерных для ранних стадий эмбриогенеза, является АФП. Результаты многочисленных экспериментальных исследований свидетельствуют об иммуносупрессорной активности АФП, поддерживающего иммунологическую толерантность в системе мать – плод. Это позволяет предположить, что на ранних этапах эмбриогенеза АФП играет защитную роль, подавляя местные иммунные реакции матери против антигенов эмбриональных клеток плода. В пользу этого свидетельствуют результаты многочисленных экспериментов, полученных в системе in vitro. Так установлено, что АФП подавляет наработку антител и созревание цитотоксических лимфоцитов на Т – зависимые антигены, не влияя на активность зрелых Т – и В – лимфоцитов; АФП подавляет пролиферативный ответ лимфоцитов на митоген; АФП повышает активность специфических Т – супрессоров. Из других свойств АФП отмечается его регулирующая роль в метаболизме стероидных гормонов и способность блокировать связывание антител с ацетилхолиновым рецептором, что препятствовало развитию экспериментального заболевания miastenia gravis. Способность АФП in vitro снижать реакции Т – зависимого гуморального и клеточного иммунитета успешно использована для предотвращения развития аутоиммунных процессов у иммунодефицитной линии мышей New Zelland. Большое внимание уделяется воздействию АФП на митотический цикл клетки – мишени. Исследователи отмечают зависимость эффекта от дозы АФП, степени его очистки, типа клеток и состава среды. Приведенные данные характеризуют АФП как белок с выраженными иммуносупрессорными свойствами, которые, по-видимому, можно использовать для снижения реакций трансплантационного иммунитета при пересадке органов и тканей. Вследствие вышеупомянутого логично утверждать, что АФП может эффективно защитить и сохранить трансплантируемые стволовые клетки, которые будут восполнять клеточные потери в процессе старения организма. Обри Ди Грей

Исключение хромосомных мутаций

Существуют два типа изменений, которые происходят в наших хромосомах в процессе старения: мутации и эпимутации. Мутации – это изменения в последовательности ДНК. А эпимутации – это внутренние изменения ДНК, которые контролируют генную активность. Обри ди Грей считает, что нет необходимости заниматься двумя этими явлениями по отдельности, потому что можно решить обе проблемы одним и тем же способом. По его мнению, в этой области старенияэволюция уже проделала за ученых всю черновую работу. Для предотвращения смерти от рака эволюция должна была разработать механизм контроля ДНК в раковых клетках. Поскольку рак способен убить организм, даже если в одной клетке произойдут соответствующие мутации (или эпимутации). А любые потери функциональности в генах других клеток, не имеющих никакого отношения к раку, безвредны до тех пор, пока они не затрагивают множество клеток данной ткани. Поэтому такие гены контролировать не нужно – они и так сохраняются в намного лучшем состоянии, чем это необходимо для нормальной продолжительности жизни.

По мнению Обри ди Грея, это означает, что возможно предотвратить хромосомные мутации вместо того, чтобы исправлять их. Все, что нужно – это создать действительно эффективное средство против рака. Средство, которое предпочитает ученый – предотвращение удлинения теломер во всем организме. По его мнению, это весьма амбициозный, но потенциально самый всеобъемлющий подход из всего, что существует или разрабатывается в настоящее время. Обри ди Грей предлагает полностью устранить из всех клеток, которые могут делиться, гены для

синтеза теломеразы и ALT-гены (альтернативный механизм удлинения теломер). Для этого ученый предлагает раз в десятилетие заменять все популяции стволовых клеток новыми. Теломеры в них будут восстановлены, а собственной теломеразы или ALT-генов в этих клетках не будет. Поэтому они смогут поддерживать ткани сколь угодно долго, одновременно предотвращая развитие рака до опасного для жизни уровня. При этом уже существующие в организме клетки нужно либо удалять, либо видоизменять их теломеразу и ALT-гены прямо на месте. Оба эти подхода уже близки к техническому воплощению на мышах. Сергей Родионов, комментарии: Соматический эмбриогенез как возможная основа злокачественного роста, противоречия иммунитета и противоопухолевая активность АФП. Существующие концепции злокачественного роста, при всём их многообразии (физико-химическая, вирусно-генетическая, дисонтогенетическая, полиэтиологическая) объясняют, как правило, лишь отдельные стороны проблемы онкогенеза, не охватывая все её многочисленные грани. В частности, отсутствуют пока ответы на три ключевых вопроса, от решения которых зависит, возможно, судьба проблемы в целом, а именно: I) биологическая функция, путь активации и программы функционирования онкогена; 2) причина отмены контактной ингибиции; 3) роль нарушений иммунологической цензуры в патогенезе злокачественного роста. Все они тесно связаны друг с другом, а второй и третий, скорее всего, представляют собою две плоскости одного и того же явления. В числе свойств необластомы, обусловливающих её высокую приспособляемость, следует, прежде всего, назвать интенсивную митотическую активность клеток и их способность ускользать из-под иммунологического контроля - даже в случае наличия у опухолевой ткани резкого антигенного контраста (аллогенные перевивные системы). Исходя из общего положения, согласно которому патологические явления представляют собою гипертрофированные проявления физиологических процессов, перспективен поиск физиологических аналогов, напоминающих по тем или иным параметрам злокачественный рост. Таких феноменов известно два. Это - регенерация и эмбриогенез, на сходство которых с онкогенезом обращалось внимание неоднократно, начиная со времён Вирхова и Конгейма. Регенерация, в свою очередь, тесно связана с воспалением; взаимосвязь же хронического воспалительного процесса с канцерогенезом клиницистам известна давно. Формируется, таким образом, четырёхкомпонентная система, составные части которой явно связаны друг с другом, хотя дешифровка этих связей является делом будущего. Ниже излагаются соображения, свидетельствующие о наличии общих черт эмбриогенеза, канцерогенеза и репаративной регенерации, и на их основании предпринимается попытка обоснования подходов к пониманию механизмов развития злокачественного роста как общебиологического явления. В основе каждой болезни, как правило, лежит повреждение структуры. Термин «структура» используется здесь расширительно, объединяя в себе уровни организации живого, начиная с субмолекулярного и кончая организменным. Принятое в литературе деление повреждений на обратимые и необратимые (невосстанавливаемые), специфические и неспецифические, хотя и не лишено условности, достаточно чётко отражает ситуацию, поэтому проявление повреждения на любом уровне прямо или косвенно связано с особенностями повреждающего этиологического фактора. Вне зависимости от того, каким фактором вызвано повреждение и на каком уровне оно реализуется, всегда и везде оно связано исходно с нарушением макромолекулярных структур, входящих в состав клеток, межклеточного вещества и ликворов организма. Это относится к белкам, нуклеиновым кислотам и, вероятно, к высокомолекулярным

полисахаридам. В первую очередь речь идёт о нарушении упорядоченности пептидной структуры белка, дестабилизации и раскручивании пептидных цепей, изменении их пространственной конфигурации, а также о деградации ядерной (и, возможно, митохондриальной) ДНК. Последнее наиболее характерно для воздействия мутагенных факторов - таких, как канцерогенные вещества, ионизирующая радиация, онковирусы. Важная роль в указанных явлениях принадлежит активации и синтезу новых нуклеаз. Повреждения субклеточных структур: митохондрий, лизосом, эргастоплазмы немедленно вызывают реактивные изменения их состояния, направленные на замещение и восстановление дефекта. Определяющим звеном этих процессов является усиление анаболизма ДНК, РНК и протеинов (реакция Кедровского-Касперссона-Браше), представляющее собою биохимическую основу запуска регенераторных процессов. Указанные явления входят как органическая составная часть в понятие реактивности, ибо последняя включает в себя не только способность организма воспринимать то или иное раздражение, но и отвечать на него комплексной реакцией. Такая трактовка реактивности, смещая акцент на защитно-приспособительную её суть, позволяет утверждать, что характер и итог компенсаторно-защитных реакций организма зависит, в конечном счёте, от исходного состояния биосистемы. Реактивность биосистемы оказывается органически сомкнутой с понятием резистентности, находящейся в большинстве случаев в обратном соотношении со степенью сложности организации индивидуума и его положения в эволюционном ряду. Стратегия адаптации низших организмов ориентирована преимущественно на приспособление к жизни во вредной среде, а не на борьбу с создавшимися условиями. Напротив, у высших организмов в процессе эволюции формируется система приспособлений для защиты от изменений условий внешней среды, становление которой тесно связано с эволюцией реактивности организма, а следовательно, и с эволюцией регенерации. Регенерация представляет собою, в широком смысле слова, восстановление структурных элементов и отражает принцип авторегуляции жизненных процессов. Она всегда локальна, т.е. связана с местом повреждения, и включает в себя восстановление структуры и функций на всех уровнях организации биосистемы. Преобладание той или иной формы регенерации (например, клеточной или внутриклеточной) в различных органах и тканях определяется их структурно-функциональной специализацией. В конечном счете, способностью к регенерации обладают все органы и ткани. Филогенез регенерации этапен; каждому его этапу присущи свои специфические черты. Общий регенераторный потенциал организма, судя по всему, в филогенезе уменьшается, хотя в литературе высказано и противоположное мнение, то же - и в ещё более отчётливой форме, имеет место и в онтогенезе. Регенерация представляет собою частный случай процесса развития. Это обстоятельство сближает её с эмбриогенезом. Наиболее отчётливо это сходство прослеживается на относительно ранних этапах эволюции - до уровня земноводных включительно, у которых в ходе регенерации утраченных структур наблюдается закладка новых органов и их дифференцировка. Полноценный регенераторный процесс непременно подразумевает наличие двух фаз: пролиферации и дифференцировки. Если период фазы пролиферации характеризуется размножением клеток - предшественников, то сущность фазы дифференцировки состоит в структурно-функциональной их специализации. Следовательно, регенерация есть ответ на повреждение, состоящий в полном, либо частичном восстановлении утраченных структур и функций, представляющий собой механизм вторичного развития, входящего в общий адаптационный синдром. Сходство эмбрионального и регенераторного развития очевидно. При эмбриональном развитии и при регенерации образуются одни и те же органы. Это имеет место, например, у губок, кишечнополостных, планарий, а также амфибий (регенерация конечности и хвоста).

Сложнее обстоит дело с сопоставлением регенерации, эмбрионального и постнатального развития паренхиматозных органов у высших организмов, однако и здесь отчётливо прослеживаются параллели, хотя в этом случае регенерация повторяет не столько эмбриональное, сколько постнатальное развитие. Таким образом, хотя знака равенства между эмбриогенезом и регенерацией ставить нельзя (главное отличие регенерации от эмбриогенеза состоит в повторном протекании процессов), явления эти имеют много общего - в особенности, если принять во внимание такой биологический феномен, как соматический эмбриогенез. Последний отличается от обычной регенерации тем, что в этом случае имеет место образование целого организма из его фрагмента, сопровождающееся нередко существенной перестройкой организации с закладкой новых осей симметрии и полярности, в то время как регенерация представляет собою восстановление, протекающее с сохранением прежней организации. Регенерация и соматический эмбриогенез - явления близкие, но не идентичные. Обстоятельство это исключительно важно, как мы увидим, для понимания проблемы онкогенеза. Характерно, что в онтогенезе способность к соматическому эмбриогенезу и к регенерации меняется прямо противоположным образом: если первая возрастает, то вторая, как уже говорилось, резко уменьшается. Так, у D.tigrina Girard, размножающейся бесполым путём, при вырезании фрагмента тела происходит не регенерация, а соматический эмбриогенез, который выражен тем лучше, чем старше животное. У Dendraenoculum Lacteum напротив, наблюдается не соматический эмбриогенез, а регенерация, и с возрастом она падает. И эмбриогенез, и регенерация представляют собою сложноорганизованные, строго регулируемые процессы. Регуляция их осуществляется: во-первых, генетическими механизмами, на основе принципа репрессии/дерепрессии, во-вторых, системами межклеточных, межтканевых и межорганных корреляций, осуществляемых путём обмена биохимическими и, возможно, биофизическими сигналами, и в-третьих, на путях нейроэндокринной и иммунной регуляции. Ни о какой автономии эмбриогенеза и регенерации не может, следовательно, быть и речи; в полной мере это относится и к соматическому эмбриогенезу, протекающему в физиологических условиях. Итак, регенерация и эмбриогенез имеют общие корни. Соматический эмбриогенез представляет собою промежуточное звено, сближающее оба эти явления. Основой их служат сменяющие друг друга процессы пролиферации и дифференцировки, контролируемые рядом механизмов слежения. Нарушение этого контроля не только нарушает естественный ход регенерации и морфогенеза, но и способно вывести клетку в режим пролиферативного взрыва. Следствием этого может быть ускорение соматического мутагенеза и, в конечном счёте, развитие злокачественной опухоли. Мнение о том, что злокачественный рост представляет собою патологический вариант эмбриогенеза, высказывалось неоднократно. Исторически оно восходит к теории «зародышевых зачатков» Конгейма. В последние годы эта концепция развивалась в работах Б.П. Токина (1959), Л.Б. Меклера (1977), А.С. Шевелёва (1978), В.Б. Винницкого (1981) . Л.Б. Меклер (1975) прямо пишет о том, что «злокачественная опухоль представляет собой патологический, диссеминированный, встроенный в ткани плод, возникший в результате слияния ядер соматических клеток на основе партеногенеза». Представляется необходимым рассмотреть вопрос о наличии сходства и различия между процессами регенерации и эмбриогенеза с одной стороны, и онкогенезом - с другой. Сходство регенерации, эмбриогенеза и онкогенеза, прежде всего в том, что в основе трёх названных состояний лежит интенсивный пролиферативный процесс. Итог же пролиферации оказывается совершенно различным: в первых двух случаях имеет место отмена её дифференцировкой, при онкогенезе - неограниченное её продолжение. Все три процесса имеют, таким образом, единый исток, но прямо противоположный финал. И для онкогенеза, и для регенерации свойственна дедифференцировка (эмбрионализация) клеток. Будучи документирована увеличением ядра и ядрышка, образованием свободных рибосом, уменьшением числа митохондрий, она является

непременной предпосылкой регенерации, обеспечивая выход клеток из-под коррелятивного «замка». Например, регенерация немертин, в ходе которой клетки утрачивают свою характерную структуру и преобразуются в клетки, сходные с эмбриональными. Ряд морфологических и функциональных особенностей сближает анаплазированные, опухолевые и эмбриональные клетки. Для них характерен атипизм ультраструктур (увеличение количества рибосом, изменение формы, величины и расположения митохондрий, увеличение количества лизосом, появление многочисленных и тесных контактов ядра, митохондрий и эндоплазматической сети). Морфологические признаки, присущие опухолевой клетке (атипичные митозы, гиперхромия ядер и т.д.) наблюдаются также при регенерации тканей, воспалении, что затрудняет дифференциальный диагноз. В отличие от дедифференцировки при злокачественном росте, дедифференцировка при регенерации обратима. Сближает с эмбриональной тканью злокачественную опухоль и ряд биохимических особенностей. В опухолевой ткани, как и в эмбриональной, гликолитические процессы преобладают над окислительными, что приводит к накоплению молочной кислоты. Изоэнзимный спектр ряда ферментов (пируваткиназы, лактатдегидрогеназы, глутаминазы, ДНК-полимеразы и др.) опухолевых и эмбриональных клеток сходен. В злокачественных опухолях синтезируются эмбриональные белки, появляющиеся также при беременности и на фоне регенерации, здесь же синтезируются и ряд других биологически активных веществ, вырабатываемых в тканях эмбриона. Наконец, сходство опухолевой и эмбриональной ткани состоит в их иммунологической неотторгаемости. Механизмы, обеспечивающие эти эффекты, имеют много общего. Есть основания полагать, что они имеют отношение к обеспечению контроля за регенераторным процессом. В пользу неформального сходства канцерогенеза и эмбриогенеза свидетельствует также эктопическая продукция некоторыми злокачественными опухолями гормонов беременности и наличие у эмбриональных антигенов иммунодепрессивных свойств. Для более наглядного отображения наиболее общих черт в сходстве эмбриогенеза, онкогенеза, репаративной регенерации приведена таблица. На основании всего сказанного можно сделать вывод о том, что физиологическими прототипами злокачественного роста являются эмбриогенез и репаративная регенерация, располагающие потенциально всеми механизмами, необходимыми для выхода в необластомогенез. В основе опухолевого развития лежит хроническое раздражение и повреждение клетки различными средовыми факторами. Детали этого процесса не выяснены, однако в качестве одного из возможных вариантов может быть предложена следующая гипотетическая схема. В результате хронически наносимого повреждения наступает истощение регенераторной способности клетки, а иногда - и полное её угнетение. В районе повреждения начинают действовать специфические и неспецифические механизмы стимуляции регенерации. В частности, в районе повреждения появляются вещества, стимулирующие клеточное деление («шаблоны»). Их количество значительно увеличивается по отношению к веществам, ингибирующим клеточное деление («кейлоны»). Например, в том числе, речь может идти о цАМФ и цГМФ. В случае невосстановления размножения, а именно так бывает при глубоком угнетении у клетки способности к регенерации, положительное изменение «индекса регенерации» достигает определённого пикового значения, что и ведёт, в конечном счёте, к переходу протоонкогена в онкоген. Последний включает репрессированную до этого в геноме программу соматического эмбриогенеза. Дальнейший ход событий определяется далеко идущим сходством эмбриональной и опухолевой ткани, общностью метаболизма и антигенного состава. В частности, экспрессия эмбриональных антигенов обеспечивает, видимо, опухолевой клетке возможность «ускользать» из-под иммунного надзора по законам

«антигенной мимикрии». Одновременно происходит переключение системы иммунитета с программы «отторжения чужого» на программу «охраны чужого в своём», состоящей в частичном ингибировании киллинга, с одновременным сохранением и даже активацией трофической функции системы иммунитета. Выше уже шла речь о снижении репаративной способности по мере увеличения возраста животных, и на, оборот, о повышении способности к соматическому эмбриогенезу. В результате повышения роли соматического эмбриогенеза по отношению к регенерации, наступающей к середине жизни организма, создаются условия, способствующие возникновению злокачественных новообразований. Согласно этой концепции, опухоль рассматривается как популяция клеток, образующихся из онкогерминативной клетки путем соматического эмбриогенеза. При этом озлокачествление клетки сопровождается её эмбрионализацией с экспрессией фетальных белков. Известно, что возникновение в организме клона малигнизированных клеток неизменно сопровождается включением гомеостатических механизмов защитнорегуляторного характера. Однако, особенность злокачественного опухолевого процесса состоит в том, что однажды начавшись, он продолжает своё неудержимое развитие бесконтрольно, автономно. Этим отличается рост опухоли от развития тканей при регенерации, при воспалении, при гипертрофии, когда созревание и дифференцировка клеток координируются с состоянием и функцией окружающих тканей и всего организма. Причины этого явления кроются как в свойствах самой злокачественной клетки, так и в парадоксальных особенностях взаимодействия опухоли с иммунной системой организма. Многочисленными исследованиями было показано, что по антигенному профилю опухолевые клетки значительно отличаются от клеток нормальной ткани. Однако, весь накопленный до настоящего времени экспериментальный материал свидетельствует о том, что специфические антигены опухолевых клеток не представляют собой какого-либо нового класса маркеров, а появляются вследствие дедифференцировки опухоли и возврату её к эмбриональному фенотипу. Гипотеза о «фетализме» опухолевых клеток была высказана Конгеймом более ста лет назад. Более того, было показано, что сходные механизмы индукции клеточной пролиферации обуславливают антигенное сходство гликопротеинов опухолевых и бактериальных клеток. Следует подчеркнуть, что несмотря на огромный фактический материал о генетических нарушениях, ассоциированных с неоплазиями, проблема возникающего вследствие этого антигенного своеобразия опухолевой клетки и антигенной характеристики опухолей ещё очень далека от своего решения. Но уже сейчас можно утверждать: использование антигенного сходства опухолевых и эмбриональных тканей может оказаться весьма плодотворным для поиска путей иммунологического воздействия на злокачественные клетки. Взаимодействие опухоли с иммунной системой сопровождается обоюдной реакцией с обеих сторон. Это показали многочисленные динамические исследования иммунного статуса онкологических больных. Отмечена зависимость состояния некоторых показателей клеточного звена иммунитета от распространенности процесса. Иммунный статус больных зависит как от типа опухоли, стадии процесса, так и от индивидуальных особенностей организма. Однако, применяемые в клиниках методы иммунологического анализа позволяют зафиксировать лишь общие изменения в иммунном статусе, что мало характеризует специфический процесс, а скорее зависит от типа лечения. Такое состояние дел не удовлетворяет и заставляет вести разработку чувствительных тестов для оценки реактивности организма на антигены, в том числе и онкофетальные, растущей в нем опухоли. Эта задача приобретает особое значение в свете результатов многочисленных исследований последних десятилетий, показавших, что развивающаяся в организме опухоль обладает целым спектром возможностей активного воздействия на все

звенья иммунитета. Основными клетками, способными осуществлять неспецифическую защиту являются макрофаги (Мф) и натуральные киллеры (Нк). Они способны быстро уничтожать клетки, несущие признаки чужеродности, причем этот процесс не зависит от антигенов Главного комплекса гистосовместимости (ГКГС) и не требует предварительной иммунизации. В различных экспериментальных системах показана барьерная роль этих клеток на начальных этапах злокачественного процесса. Рассмотрение проблемы противоопухолевой защиты в эволюционном аспекте подтверждает, что фагоцитирующие клетки способны противостоять опухолевому росту у наиболее древних в филогенетическом аспекте форм живого, не имеющих иммунных лимфоцитов.

Взаимосвязь этапов эмбриогенеза, канцерогенеза и репаративной регенерации. Этапы

Эмбриогенез Оплодотворение. Появление зародышевой клетки, отличающейся от материнского организма по составу трансплантационных и эмбриональных антигенов. Нарушение генного гомеостаза организма матери. Образование «критической» массы зародышевых клеток. Развитие иммунологической толерантности к зародышевым клеткам, которая обуславливается блокирующими факторами сыворотки крови, трофобласта и плода, экспрессией эндогенных вирусов типа С, гормонально – метаболическими сдвигами.

Канцерогенез Репаративная регенерация Действие канцерогенного фактора. Действие повреждающего фактора. Трансформация клеток, их размноже- Размножение незрелых клеток, появлеI ние, появление опухолевых трансплан- ние эмбриональных антигенов. Нарутационных и эмбриональных антиге- шение генного гомеостаза взрослого нов. Нарушение генного гомеостаза ор- организма. ганизма. Образование «критической» массы Образование «критической» массы реопухолевых клеток. Развитие иммуно- генерирующих клеток. Развитие иммулогической толерантности к злока- нологической толерантности к регенечественным клеткам, которая обус- рирующим клеткам, которая обуславII лавливается появлением фибриноид- ливается появлением фибриноидного ного слоя на этих клетках, бло- слоя на этих клетках, блокирующими кирующими факторами сыворотки факторами незрелых клеток, экспрескрови, блокирующими факторами сией эндогенных вирусов типа С, анопухоли, экспрессией эндогенных ви- тителами к клеткам частично удаленрусов типа С, гормонально–метабо- ного органа, гормонально – метаболилическими сдвигами. ческими сдвигами. Восстановление целостности ткани, III Роды. Изгнание плода и плаценты из Прогрессирующее развитие опухоли. дифференцировка клеток, исчезновеорганизма матери. Сенсибилизация Гибель организма. организма к трофобластическим клетние эмбриональных антигенов, нормакам и элиминация их из организма, лизация гормонально–метаболическообуславливаемая уменьшением массы го фона, восстановление генного гоэтих клеток, гормонально–метаболимеостаза организма. ческими сдвигами, способствующими сенсибилизации; деблокирующими факторами сыворотки крови. При эмбриогенезе и канцерогенезе наблюдаются однотипные гормонально-метаболические изменения (по В.Б. Винницкому,1981).

При введении агентов, стимулирующих Мф и Нк (БЦЖ, мурапилпептид, интерферон и т.д.), значительно удлинняется латентный период возникновения экспериментальных опухолей. Введение животным антимакрофагальной сыворотки усиливает рост и метастазирование опухолей. У мышей с врожденной аплазией тимуса (nude) спонтанные опухоли развиваются не чаще, чем у нормальных мышей. Арсенал противоопухолевых реакций НК разнообразен, они узнают на поверхности опухолевой клетки определенные гликипротеиды, связываются с ними и образуют литический комплекс, посредством которого в клетку - мишень вводятся протеазы и иные цитотоксические факторы. Этот процесс активируется интерфероном, ИЛ-2 и другими цитокинами. Мф способны фагоцитировать опухолевые клетки, оказывать антителозависимое и независимое цитотоксическое действие, продуцировать активные формы кислорода и фактор некроза опухоли. Однако, при длительном контакте (более 48 часов) с клетками опухоли, роль макрофагов может меняться. Известно, что опухолевые клетки выделяют широкий спектр биологически активных веществ, изменяющих иммунологическую реактивность организма. Под действием факторов опухолевых клеток макрофаги теряют цитотоксические и иммуностимулирующие свойства и превращаются в сателлитные клетки, роль которых сводится к: продукции ростовых факторов для опухоли; синтезу простагландина Е2, подавляющего противоопухолевые иммунные реакции лимфоцитов; синтезу протеаз (трипсина, эластазы, коллагеназы и др.), которые разрушают матрикс опухоли и слущивают с поверхности опухолевых клеток фибронектин. Это приводит к нарушению контактного торможения роста клеток и к усилению метастазирования. Таким образом, на основании анализа литературных данных можно сделать вывод о двойственной роли факторов неспецифической резистентности: от активной противоопухолевой защиты на ранних стадиях формирования злокачественного заболевания до прометастатических и иммуносупрессирующих функций в очаге прогрессирующей опухоли. Роль гуморального и клеточного звена иммунитета в развитии онкопатологии различается. Изучение гуморального противоопухолевого иммунитета показало, что наличие в сыворотке крови больного антител к опухолеассоциированным антигенам далеко не всегда приводит к стимуляции механизмов антитело - зависимого лизиса опухолевых клеток. При определенных условиях гуморальные антитела могут способствовать росту опухоли, связывая и экранируя ее антигенные детерминанты. Доказано, что главную роль в элиминации из организма малигнизированных клеток играют клеточно-опосредованные реакции. При этом специфический цитолиз злокачественных клеток осуществляют цитотоксические Т-лимфоциты, несущие на своей поверхности рецепторы к опухолевому антигену. В организме больного эти клетки присутствуют практически при всех онкозаболеваниях, о чем свидетельствует положительная реакция гиперчувствителности замедленного типа (ГЗТ) на опухолеассоциированные антигены и онкофетальные белки. Однако, динамическое изучение иммунологического статуса больных показывает функциональную несостоятельность цТл на начальных этапах болезни и значительное угнетение Т-клеточного звена по мере нарастания тяжести процесса. Для того, чтобы яснее представить инвертированность специфического клеточного ответа, необходимо обозначить главные этапы его формирования и особенности влияния опухолевой клетки на этот процесс.

I. В качестве запускающего сигнала отмечается экспрессия на клетке-мишени специфических опухолевых антигенов (в т.ч. и онкофетальных белков) совместно с антигенами Главного Комплекса Гистосовместимости I-класса (ГКГС-I). Этот комплекс узнается предшественниками цТл. Для дальнейшего созревания этих клеток необходимы цитокины (ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-7, ИФН-гамма и др.) которые продуцируются Т-

хелперами. При анализе большого количества первичных и вторичных опухолей человека была показана полная или частичная супрессия синтеза белков ГКГС-I, вследствие чего на этом этапе опухолевая клетка часто оказывается «неузнаваемой».

II. Ряд событий, приводящих к появлению активированных Т-хелперов, начинается со взаимодействия опухолеассоциированного антигена с вспомогательной (Acessory) клеткой, в роли которой могут выступать макрофаги, дендритные клетки, эндотелиальные клетки. Переработанный этими клетками антиген презентируется на их поверхности в комплексе с антигеном ГКГС II-класса и узнается специфическими Т-хелперами. Параллельно с процессом специфического узнавания происходит активация Т-хелперов интерлейкином-1, продуцируемым теми же макрофагами. Т-хелперы выделяют цитокины (ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-5 и др.), определяющие созревание цТл. Опухоль угнетает функции Тхелперов, секретируя простагландины, трансформирующий фактор роста, различные протеазы. Клетки опухоли и резидентные макрофаги нарабатывают значительные количества ФНО, что тоже приводит к стимуляции иммуносупрессорных факторов. В результате подавляется синтез необходимых цитокинов (ИЛ-2) и снижается наработка цТл. Таким образом, можно утверждать, что опухоль обладает широким арсеналом средств воздействия на иммунокомпетентные клетки. Этот фактор необходимо учитывать при проведении любой противоопухолевой терапии. Поэтому в настоящее время все большее значение приобретают методы воздействия на организм, стимулирующие как общую резистентность, так и специфический противоопухолевый иммунный ответ. Предупреждение рака. Последние эпидемиологические данные о том, что высокие уровни АФП у беременных женщин снижают у них последующий риск как пре-, так и постменопаузного рака груди, могут быть связаны со свойствами АФП в отношении подавления роста опухолей. Первая работа Richardson с соавторами показала, что пониженный риск возникновения постменопаузного рака груди связан с высокими уровнями АФП в третьем триместре у женщин, у которых первая беременность была раньше 28 лет. Последующая работа Melbye с соавторами подтвердила и расширила данные предыдущей работы. Таким образом, обе работы пришли к выводу, что высокие уровни АФП в сыворотке крови у матери во время любой беременности были связаны с низкой частотой заболевания раком груди; связь была особенно выраженной для беременности в молодом детородящем возрасте. Эти результаты послужили толчком к предположению, что АФП и его вторичные пептиды могут использоваться не только в терапии рака, но также для предупреждения возможных других видов опухолей. Такой защитный эффект АФП во время беременности также наблюдался у женщин с многоплодной беременностью (двойня), дефектах невральных труб и предлежании с преэклампсией. Все эти ситуации делят между собой общность повышенных уровней АФП в сыворотке, которые могут содержать достаточные количества конформационно индуцированных вариантов АФП для воздействия на супрессию роста микролокусов рака, присутствующих в тканях груди матери. Собственные исследования иммунологической и противоопухолевой активности АФП. Изучение воздействия АФП на пролиферацию стволовых кроветворных клеток при трансплантации сингенного и несингенного костного мозга. Методика исследования: опыт проводили на мышах линий СВА и C57Bl. Было изучено влияние АФП на пролиферативную активность клеток костного мозга мышей линий СВА и C57Bl. Для этого клетки костного мозга подвергали воздействию субстанции БАД АФП в двух вариантах: а) in vitro: клетки костного мозга инкубировали с 500 мкг/мл АФП в течение 1 часа перед трансплантацией летально облученным реципиентам;

б) in vitro: АФП вводили мышам внутрибрюшинно в дозе 500 мкг/мышь за сутки до выделения костного мозга. После обработки по схемам а) и б), клетки костного мозга трансплантировали летально облученным (850 Р) реципиентам сингенных линий, а также мышам (СВА х C57Bl) F1 (по 10 животных в группе). Пролиферативная активность оценивалась через 5 суток по включению Н3-тимидина. Контрольное исследование проводилось на клетках костного мозга, обработанных физ. раствором в аналогичном с опытом режиме. Результаты исследования представлены в таблице. Пролиферативная активность стволовых клеток костного мозга мышей в сингенной и в полиаллогенной системах. Группа

Доза

донор/реципиент

Условия

Пролиферативная

обработки

активность (% к контролю, M + m)

СВА/СВА

500 мкг/мл

in vitro

106,2 + 2,3

C57Bl/C57Bl

500 мкг/мл

in vitro

102,5 + 0,9

СВА/F1

500 мкг/мл

in vitro

120,1 + 2,3*

C57Bl/F1

500 мкг/мл

in vitro

123,4 + 0,5*

СВА/СВА

500 мкг/мышь

in vitro

101,3 + 1,4

C57Bl/C57Bl

500 мкг/мышь

in vitro

100,7 + 3,2

СВА/F1

500 мкг/мышь

in vitro

107,5 + 1,8

C57Bl/F1

500 мкг/мышь

in vitro

109,3 + 2,0*

Примечание: * - различия опыта и контроля статистически достоверны (P<0,05).

Как показано в таблице, АФП слегка повышает пролиферативную активность стволовых кроветворных клеток костного мозга в случае сингенных реципиентов (статистической достоверности этой тенденции не показано). При трансплантации в полиаллогенного реципиента, обработка костного мозга АФП заметно предотвращала аллогенную ингибицию пролиферации стволовых кроветворных клеток, имевшую место в контроле. Из таблицы можно сделать вывод о том, что введение АФП донорам костного мозга in vitro оказывает значительно меньший эффект, чем обработка клеток in vitro.

Влияние α-фетопротеина на функциональную активность мононуклеарных лейкоцитов и дендритных клеток человека.

В настоящее время ведутся интенсивные работы по внедрению в клиническую практику онкологии методов адоптивной иммунотерапии, основанных на экстракорпоральной активации эффекторов противоопухолевого иммунитета. Наибольший интерес представляют лимфокин-активированные киллеры (ЛАК), генерированные in vitro при инкубации мононуклеаров крови (МНК) с цитокинами и специфические вакцины на основе дендритных клеток (ДК). Как следует из данных, представленных в таблице , α-фетопротеин оказывает стимулирующее влияние на уровень цитотоксической активности МЛ по отношению к опухолевым клеткам линии К 562. Этот показатель достоверно повышается при воздействии α-фетопротеина в концентрациях 0,1–100 мкг/мл по сравнению со спонтанной цитотоксичностью МЛ (24,4±3,97%) и достигает максимальных значений (96,7±4,1%) при инкубации с препаратом в дозе 1,0 мкг/мл. Лишь самая низкая из испытанных концентраций препарата (0,01 мкг/мл) не сказывается на противоопухолевой активности МЛ. Исследуемый препарат является также мощным митогенным фактором для мононуклеарных лейкоцитов крови здоровых доноров. Количество бластных форм в культурах, пульсированных α-фетопротеином, увеличивается в 3–7 раз (в зависимости от дозы препарата) по сравнению с контрольной группой, а индекс стимуляции пролиферативной активности МЛ составляет соответственно от 3,2 (при дозе 0,1 мкг/мл) до 6,9 (при дозе 100,0 мкг/мл). При этом 97–98% мононуклеарных клеток сохраняют жизнеспособность. Изучение дендритных клеток, полученных при коинкубации МЛ с GM-CSF и IL-4 в течение 6 суток, показало, что они имеют типичные морфологические и иммунофенотипические признаки незрелых ДК. Практически все рассматриваемые клетки экспрессируют на своей поверхности характерные для ДК маркер CDla и костимулирующие молекулы (CD40, CD80 и CD86). Влияние α-фетопротеина на формирования зрелых ДК оценивали, основываясь на изменении уровня экспрессии дифференцировочных молекул CD14, CD34, CD80, CD83, CD1а, CD11с и данных световой микроскопии культур через 3 суток после добавления данного препарата к незрелым ДК. Критерием для идентификации зрелых иммуностимулирующих форм ДК как в культурах, активированных цитокинами, так и в культурах первичных тканей является наличие фенотипа: СD83+, CD80+, CD86+, HLADR+, CD14-. Наши данные по определению иммунофенотипа ДК, полученных из МЛ периферической крови доноров и активированных α-фетопротеином, показали, что при стимуляции данным фактором большая часть незрелых ДК дифференцировалась в зрелые формы, так как они приобретали высокий уровень экспрессии поверхностных молекул CD80, CD83, CD1а и CD11с. Однако при исследовании иммунофенотипа было выявлено достаточно большое количество клеток, активно экспрессирующих на своей поверхности молекулы антигенов, характеризующих популяцию клеток-предшественников — CD34 (рис. 1). При световой и фазово-контрастной микроскопии выявлялись дендритные клетки, имеющие овальную, неправильную звездчатую или вуалевидную формы с характерными цитоплазматическим отростками. Цитоплазма дендритных клеток окрашивалась

базофильно по Романовскому-Гимза, а при окраске по Браше в ней определялся исчезающий после обработки РНК-зой пиронинофильный компонент, свидетельствующий о наличии в клетках РНК. Обработка Шифф-реактивом выявляла в цитоплазме ШИК-положительные гранулы, интенсивность окраски которых слегка уменьшалась после воздействия амилазой, что говорит о наличии в клетках как гликогена, так и гликозаминогликанов. После пульсации культуры дендритных клеток, генерированных из мононуклеарных лейкоцитов периферической крови доноров, α-фетопротеином, несколько изменялись гистохимические характеристики ДК. Цитоплазма приобретала более яркую пиронинофильную окраску, отражающую повышенное содержание в ней РНК. Пиронинофильные ядрышки в ядрах становились более крупными и многочисленными. Возрастало также содержание гликогена и гликозаминогликанов (ШИК-положительные гранулы при окраске по Шабадашу имели более крупные размеры и увеличивались в количестве). В мазках появлялись клетки с морфологическими и гистохимическими характеристиками ДК в состоянии митотического и амитотического деления и многочисленные бластные формы. Таким образом, α-фетопротеин оказывает заметное действие на функциональную активность мононуклеарных лейкоцитов периферической крови человека и на процесс дифференцировки и созревания генерированных из них дендритных клеток. При введении в культуры оптимальных доз данного препарата статистически достоверно повышается и пролиферативная активность, и уровень бласттрансформации мононуклеаров периферической крови доноров. Это явление может рассматриваться как проявление дедифференцировки зрелых лимфоцитов периферической крови под влиянием α-фетопротеина, что подтверждается высоким содержанием в культурах CD34+ клеток. Очевидно также, что α-фетопротеин, индуцируя созревание ДК, усиливает их антигенпрезентирующую способность и возможность стимулировать пролиферацию МЛ. Увеличение цитотоксической активности мононуклеарных лейкоцитов может свидетельствовать о генерации под действием α-фетопротеина не только антигенпрезентирующих зрелых дендритных клеток, но и активированных лимфоидных элементов (ЛАК-клеток) с высоким уровнем цитотоксической активности. Как известно, на поверхности мембран ДК экспрессируются маркеры антигенного представления (CDla, MHC I, МНС II), костимулирующие молекулы (CD80, CD86, CD40), маркер терминальной дифференцировки CD83, маркеры моноцитов/макрофагов (CD14, CD68, CD115), адгезивные молекулы (CD54, CD58, семейство молекул CD11, CD29 и т.д.), хемокиновые рецепторы (CCR 1, 2, 5, 6, 7, CXCR4), цитокины и цитокиновые рецепторы (ИЛ-12 и CD25) и другие молекулы. Зрелые ДК обладают рядом особенностей, позволяющих им максимально эффективно, по сравнению с незрелыми формами, представлять антиген. Только зрелые ДК экспрессируют высокий уровень костимулирующих молекул, обеспечивающих формирование вспомогательных сигналов при активации лимфоцитов, и высокий уровень молекул МНС I и MHC II, обеспечивающих эффективное представление антигена. Зрелые ДК секретируют значительное количество цитокинов и хемокинов, необходимых для хемотаксиса и активации Т-клеток и других эффекторов иммунной системы. Практически все дендритные клетки, полученные в наших опытах из МЛ доноров при активации α-фетопротеином, имели иммунофенотипические признаки зрелых ДК: высокий уровень экспрессии маркёров антигенного представления (CDla), костимулирующих молекул (CD80), адгезивных молекул (CD11с) и, наконец, основной показатель зрелости ДК — высокий уровень экспрессии антигена терминальной

дифференцировки — CD83. Данные морфологических исследований соответствовали функциональным и иммунофенотипическим показателям, характеризующим клетки, полученные в культурах при действии α-фетопротеина, как зрелые ДК. Таким образом, результаты, полученные в настоящей работе, свидетельствуют о том, что α-фетопротеин в исследуемых концентрациях стимулирует созревание дендритных клеток. Следовательно, α-фетопротеин является мощным иммуностимулирующим фактором, повышающим цитотоксическую активность мононуклеарных лейкоцитов периферической крови и способным вызывать созревание дендритных клеток. Данный препарат может быть использован для генерации ЛАК и зрелых ДК с целью их использования в биотерапии онкологических и инфекционных заболеваний.

Влияние α-фетопротеина на цитотоксическую активность мононуклеаров периферической крови здоровых доноров к линии опухолевых клеток К 562 (n=15) Уровень цитотоксичности, % Концентрация препарата мкг/мл

МЛ

α-фето-протеин

10,0

78,0±4,6*

1,0

73,2±4,1*

0,1

96,7±4,1**

0,01

77,3±3,9*

0,001

24,7±2,6

24,4±3,97

Достоверность различий между контрольной (МЛ) и экспериментальными группами: * p <0,05; ** p<0,01. Влияние α-фетопротеина на пролиферативную активность и митогенез мононуклеарных лейкоцитов здоровых доноров (n=15) Бластные Индекс Жизнеспособные Условия формы, у.е стимуляции, клетки, % культивирования M±m М±m М±m Контроль

α-фетопротеин мкг/мл

–

0,095±0,02

–

98,0±0,5

10,0

0,655±0,05**

6,9

96,9±0,6

1,0

0,517±0,04**

5,4

97,5±0,8

0,1

0,510±0,07**

5,4

98,0±2,5

0,01

0,309±0,03*

3,2

98,0±2,4

Достоверность различий между контрольной и экспериментальными группами: * p <0,05; ** p <0,01

Гистограммы, отражающие экспрессию поверхностных молекул (кластеров детерминации) зрелых ДК, полученных с использованием α-фетопротеина (1,5 мкг/мл): Верхний ряд, дотплот — светорассеяние (популяция зрелых ДК в очерченной области), на гистограммах левый пик — аутофлюоресценция клеток при использовании изотипического контроля, правый — флюоресценция (FITC — флюоресциинизотиоционат и R-PE — фикоэритрин) после окрашивания соответствующими антителами. По оси ординат — количество клеток, по оси абсцисс — интенсивность флюоресценции. Обозначения: CD — дифференцировочные антигены .

А

Б

Зрелые дендритные клетки, генерированные из МЛ периферической крови доноров и меченные флюоресцирующими антителами, в культуральной взвеси на 9-е сутки инкубации (3 сутки после пульсации α-фетопротеином)

Макрофотография дендритных клеток при фазово-контрастной микроскопии: А) ДК СD83+. Окраска флюоресциинизотиоционатом (FITC). Ок. 10, об. 40. Б) ДК CD1а+. Окраска фикоэритрином (РЕ). Ок. 10, об. 40.

Дендритные клетки, генерированные из МЛ периферической крови доноров в культуре, активированной ГМ-КСФ и интерлейкином-4 (7-е сутки инкубации с АФП) Микрофотография дендритной клетки, прилипшей к дну культурального сосуда. Окраска фуксином Циля. Ок. 10, об. 100.

б

в

а

Мононуклеарные клетки периферической крови доноров в культуре на 9 сутки инкубации (3 сутки после пульсации α-фетопротеином) Микрофотография клеток при фазово-контрастной микроскопии культуральной взвеси в тёмном поле. Ок. 10, об. 40. а) зрелые ДК; б) колонии активированных лимфоцитов; в) бласты.

д

б

в

а

б

г

г в

а

А

Б

Дендритные клетки, генерированные из МЛ периферической крови доноров в культуре, активированной ГМ-КСФ и интерлейкином-4 (7-е сутки инкубации) Микрофотография клеток в мазке культуральной взвеси. А) Окраска метиловым зелёным-пиронином по Браше. Ок. 10, об. 90. а) дендритная клетка, б) лимфоциты; в) моноцит; г) макрофаг; д) гранулоцит. Б) Окраска Шифф-реактивом по Шабадашу с контрольной обработкой амилазой. Ок. 10, об. 90. а) незрелая ДК; б) зрелая ДК; в) лимфоциты; г) макрофаг.

б

б в а

а

А

Б

Зрелые дендритные клетки, генерированные из МЛ периферической крови доноров, в культуре на 9-е сутки инкубации (3 сутки после пульсации α-фетопротеином) Микрофотография клеток в мазке культуральной взвеси. А) Окраска метиловым зелёным-пиронином по Браше. Ок. 10, об. 90. а) зрелая ДК; б) макрофаг. Б) Окраска Шифф-реактивом по Шабадашу. Ок. 10, об. 90. а) зрелые ДК; б) лимфоциты; в) макрофаг.

в

б а

Мононуклеарные клетки периферической крови доноров, в культуре на 9-е сутки инкубации (3 сутки после пульсации α-фетопротеином) Микрофотография клеток в мазке культуральной взвеси. Окраска метиловым зелёным-пиронином по Браше. Ок. 10, об. 100. а) зрелая ДК; б) делящиеся ДК; в) бластные формы.

Получение активированных лимфоцитов из мононуклеарных лейкоцитов периферической крови человека под воздействием альфа-фетопротеина.

Субпопуляция натуральных киллеров (NK), представленная большими гранулярными лимфоцитами, постоянно присутствует в периферической крови в виде незначительной фракции (10–15% от общего количества всех лимфоцитов). Они лишены характерных для Т- и В-лимфоцитов поверхностных маркеров. Маркерами NK-клеток служат антигены CD16, CD56. В адгезионных взаимодействиях с клетками-мишенями наиболее значимым является маркер NK-клеток CD56. СD16 играет важную роль в антителозависимой цитотоксичности. По своей природе NK являются цитотоксическими лимфоцитами (ЦТЛ), которые способны уничтожать клетки, зараженные вирусами или внутриклеточными бактериями и опухолевые элементы. В настоящее время одним из путей, направленных на повышение эффективности противоопухолевого и противоинфекционного иммунитета, является эктракорпоральная генерация активированных цитотоксических лимфоцитов, которые используются для целей адоптивной иммунотерапии. Однако известно, что киллерная активность

лимфоцитов может быть существенно повышена при воздействии различных стимулирующих факторов, в том числе и нецитокиновой природы. Одним из таких агентов может служить АФП. В связи с этим целью работы явилось исследование возможности получения активированных цитотоксических лимфоцитов из мононуклеарных лейкоцитов периферической крови доноров под воздействием альфа-фетопротеина и изучение морфофункциональных особенностей генерированных клеток. Результаты исследования показали, что α-фетопротеин усиливает цитотоксическую активность МЛ периферической крови здоровых доноров по отношению к линии опухолевых клеток К562. АФП повышает уровень цитотоксической активности МЛ в диапазоне концентраций от 0,01 мкг/мл до 10,0 мкг/мл. При этом не отмечается четкого дозозависимого эффекта, так как и высокие (1,0 и 10,0 мкг/мл), и низкие (0,01 мкг/мл) концентрации АФП почти в равной степени усиливают цитотоксическую активность мононуклеарных лейкоцитов (до 73,2–78,0%). Однако, самой действенной оказалась доза альфа-фетопротеина 0,1 мкг/мл, при которой цитотоксическая активность МЛ достигает 96,7%. Лишь самая низкая из испытанных концентраций препарата (0,001 мкг/мл) не влияла на противоопухолевую активности мононуклеарных лейкоцитов периферической крови. Показатели цитотоксической активности МЛ, активированных ИЛ-2 (ЛАК), были несколько ниже по сравнению с полученными в опытах с альфа-фетопротеином. АФП оказывает выраженное митогенное действие на МЛ здоровых доноров. Относительное количество бластных форм в культурах в зависимости от дозы препарата повышается в 3–7 раз по сравнению с контрольной группой. Индекс стимуляции пролиферативной активности МЛ увеличивается соответственно от 3,2 (при концентрации 0,01 мкг/мл) до 6,9 (при концентрации 10,0 мкг/мл). В данных условиях 97–98% МЛ сохраняли жизнеспособность. Исследование иммунофенотипа клеток, генерированных из МЛ с помощью АФП, позволило установить, что они экспрессируют на своей мембране активационные антигены (CD38 и HLA-DR). Экспрессия данных маркеров на клетках, полученных под воздействием АФП, была более высокой по сравнению с таковой у ЛАК-клеток (табл. 6). Мононуклеарные лейкоциты, активированные АФП, характеризовались также высоким уровнем экспрессии маркеров НК (CD56, CD16) и увеличенным процентным содержанием CD8+ клеток по сравнению с интактными МЛ и ЛАК. Результаты экспериментов показали также умеренное повышение (по сравнению с контрольной серией) количества CD3+ и CD4+ Т-клеток в популяции альфа-фетопротеинактивированных мононуклеарных лейкоцитов периферической крови. Морфогистохимические исследования показали, что МЛ, активированные альфафетопротеином, представляют собой крупные клетки лимфоидного ряда типа иммунобластов и пролимфоцитов с базофильно окрашенной и содержащей пиронинофильный компонент цитоплазмой. Сохранение яркой пиронинофилии в цитоплазме и ядрышках клеток после обработки препаратов РНК-зой свидетельствует о наличии в них повышенного количества РНК. В мазках часто обнаруживаются клетки в состоянии митотического деления. При фазовоконтрастной микроскопии в культурах определяются многочисленные колонии крупных клеток округлой формы с круглым ядром и широким ободком цитоплазмы. На электронномикроскопических микрофотографиях клетки, активированные АФП, имеют вид крупных гранулярных лимфоцитов с большим количеством митохондрий, полирибосом, элементов гранулярной эндоплазматической сети и комплекса Гольджи в цитоплазме.

Таким образом, в результате наших исследований выявлено, что альфафетопротеин в значительной степени повышает функциональную активность мононуклеарных лейкоцитов периферической крови человека. Довольно высокий уровень цитотоксической активности МЛ, возникающий при инкубации их с альфафетопротеином, обусловлен, очевидно, (в отличие от ИЛ-2, вызывающего, главным образом, генерацию НК-подобных ЛАК-клеток) одновременной индукцией под его воздействием и ЦТЛ (CD8+) и NK-клеток (CD56+ и CD16+), Активация МЛ под действием АФП подтверждается также усилением экспрессии дифференцировочных, костимулирующих и адгезивных молекул (CD38, CD56, CD58, HLA-DR) на их поверхности. Следовательно, клетки, генерированные из МЛ периферической крови доноров под воздействием АФП, могут быть обозначены, по аналогии с ЛАК, как альфафетопротеин-активированные клетки (АФПАК). В настоящее время имеются данные о существовании в популяции активированных лимфоцитов также НКТ-клеток, экспрессирующих не только маркеры НК (CD16, CD56), но и Т-клеточные дифференцировочные антигены (CD3, CD4, CD8). Эта субпопуляция лимфоцитов обнаруживается, в основном, в пораженных опухолевым или инфекционным процессом органах — печени и легких, и практически отсутствует в периферической крови. По своей спонтанной киллерной активности НКТ значительно превышают МЛ и не уступают ЛАК. Весьма вероятно, что АПФАК, экспрессирющие одновременно маркеры ЦТЛ и NК представляют собой NKT-клетки. При этом содержание CD8+, CD16+, CD38+, CD56+, HLA-DR+ клеток при инкубации МЛ с альфа-фетопротеином повышается в 2– 6 раз по сравнению с контролем и примерно вдвое превышает увеличение числа CD56+ и HLA-DR+клеток при активации мононуклеарных лейкоцитов интерлейкином-2. Нарастание соотношения количества клеток СD4+/CD8+, являющегося одним из ключевых параметров иммунограммы, в эксперименте с АФП по сравнению с референсконтролем (ИЛ-2) с 0,3 до 1,3 также свидетельствует об интенсивности активации иммунного процесса. Проведенные исследования показали, что появление в культурах, активированных альфафетопротеином, большого числа клеток, характеризующихся функционально и иммунофенотипически как NK-клетки и цитотоксические лимфоциты, сопровождается усилением пролиферативного потенциала МЛ, что подтверждается данными морфогистохимических исследований. В культуральной взвеси МЛ, активированных альфа-фетопротеином, при фазовоконтрастной микроскопии выявляются колонии типичных бластных форм, а в мазках — клетки типа иммунобластов, пролимфоцитов и активирванных лимфоцитов с повышенным содержанием РНК в цитоплазме и ядрышках. На электронных микрофотографиях определяются клетки лимфоидного ряда, содержащие в цитоплазме элементы развитого синтетического аппарата: множество рибосом и полирибосом, гранулярную эндоплазматическую сеть, обилие митохондрий и компонентов аппарата Гольджи. Таким образом, в результате проведенных экспериментов установлено, что альфафетопротеин обладает способностью активировать МЛ крови человека с образованием клеток, характеризующихся высокой противоопухолевой цитотоксической и пролиферативной активностью. Эти данные свидетельствуют о целесообразности использования альфа-фетопротеина для экстракорпоральной генерации активированных киллеров — АФПАК-клеток, которые могут быть использованы в иммунотерапии злокачественных новообразований и инфекционных заболеваний наряду с традиционными ЛАК, полученными при инкубации мононуклеарных лейкоцитов с ИЛ-2. Показано, что альфа-фетопротеин повышает функциональную (пролиферативную и цитотоксическую) активность мононуклеарных лейкоцитов (МЛ) периферической крови

человека. Усиление цитотоксической активности МЛ под действием альфа-фетопротеина и данные изучения иммунофенотипа свидетельствуют о формировании в культурах субпопуляций цитотоксических лимфоцитов, NK и NKT-клеток. Использование в качестве референс-препарата ИЛ-2 выявило более высокую способность альфафетопротеина индуцировать дифференцировку клеток лимфоидного ряда в направлении формирования цитотоксических лимфоцитов. Основываясь на полученных результатах, представляется целесообразным применение альфа-фетопротеина, наряду с ИЛ-2, для получения активированных лимфоцитов, которые могут быть использованы в иммунотерапии злокачественных новообразований и инфекционных заболеваний. Влияние альфа-фетопротеина на содержание несущих кластеры детерминации МЛ периферической крови человека (Уровень экспрессии поверхностных антигенов, %)

Маркер

МЛ доноров (группа 1)

МЛ+альфафетопротеин (группа 2)

Достоверность различий между группами

CD3

51,50±2,53

64,3±4,25

Р1 и 2> 0,05

CD4

28,85±0,92

37,6±1,89

Р1 и 2 >0,05

CD8

37,61±1,24

47,7±2,36

Р1 и 2 >0,05

CD16

16,73±1,08

32,6±0,91

Р1 и 2< 0,05

CD25

9,65±1,00

10,1±0,73

Р1 и 2> 0,05

CD38

32,63±1,58

61,3±3,41

Р1 и 2< 0,05

CD56

12,05±0,13

61,0±2,93

Р1 и 2< 0,01;

CD57

23,45±1,25

23,7±1,02

Р1 и 2> 0,05

CD58

37,35±2,11

42,5±1,56

Р1 и 2> 0,05

HLA-DR

9,15±0,08

57,1±2,51

Р1 и 2< 0,01;

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 контроль

10

1

0,1

0,01

0,001

ЛАК

Влияние α-фетопротеина на цитотоксическую активность мононуклеаров периферической крови здоровых доноров к линии опухолевых клеток К 562 (референс-препарат — интерлейкин-2); По оси абсцисс — концентрация альфа-фетопротеина (в мкг/мл); По оси ординат — цитотоксичность МЛ по отношению к линии опухолевых клеток К 562 (в %).

0,7

14

0,6

12

0,5

10 Бластные формы

0,4

8

0,3

6

0,2

4

0,1

2

0

0

0

0,01

0,1

1

Индекс стимуляции

10

Влияние α-фетопротеина на пролиферативную активность и митогенез мононуклеарных лейкоцитов здоровых доноров (n=15) По оси абсцисс — концентрация альфа-фетопротеина (в мкг/мл); По левой оси ординат — относительное количество бластных форм (в у.е.) По правой оси ординат — индекс стимуляции бласттрансформации.

Гистограммы, отражающие экспрессию поверхностных молекул (кластеров детерминации) МЛ, генерированных с использованием альфа-фетопротеина (2 мкг/мл).

А. Б Мононуклеарные лейкоциты в культуре периферической крови человека, инкубированной с альфа-фетопротеином (2 мкг/мл). А. Микрофотография АФПАК-клеток в мазке культуральной взвеси МЛ (4 сутки культивирования). Окраска эозин-азуром по Романовскому-Гимза. Ок. 10, об. 100. Б. Микрофотография колоний АФПАК-клеток в культуральной взвеси МЛ (4 сутки культивирования). Фазово-контрастная микроскопия. Ок. 10, об. 20.

В результате проведенных исследований иммуномодулирующей активности АФП показано, что: 1. АФП снижает аллогенную ингибицию пролиферации стволовых кроветворных клеток в организме летально облученного реципиента, не влияя на данный показатель в сингенной системе. Данные позволяют сделать вывод о перспективности дальнейших исследований АФП в качестве специфического иммуномодулирующего агента, используемого для снижения реакции отторжения трансплантанта при пересадках органов и тканей. Особое значение может иметь тот факт, что оказывая достоверное воздействие на клеточный иммунитет в аллогенных системах, АФП не влияет на пролиферацию клеток костного мозга в сингенной системе. Этот феномен выгодно отличает данный препарат от синтетических иммуносупрессоров и может быть объяснен биологической ролью белка АФП.

2. Исследовано действие α-фетопротеина на функциональные свойства мононуклеарных лейкоцитов периферической крови здоровых доноров и возможность генерации из них зрелых дендритных клеток. Показано, что введение в культуры оптимальных доз данного препарата вызывает статистически достоверное повышение пролиферативной способности, уровня бласттрансформации МЛ и их цитотоксической активности по отношению к опухолевой линии К-562, а также индуцирует созревание антигенпрезентирующих дендритных клеток. На основании полученных данных сделан вывод, что α-фетопротеин является мощным иммуностимулирующим фактором и может быть использован для генерации лимфокин-активированных киллеров и зрелых ДК с целью их использования в биотерапии онкологических и инфекционных заболеваний.

3. Показано, что альфа-фетопротеин повышает функциональную (пролиферативную и цитотоксическую) активность мононуклеарных лейкоцитов периферической крови

человека. Усиление цитотоксической активности МЛ под действием альфафетопротеина и данные изучения иммунофенотипа свидетельствуют о формировании в культурах субпопуляций цитотоксических лимфоцитов, NK и NKT-клеток. Использование в качестве референс-препарата ИЛ-2 выявило более высокую способность альфа-фетопротеина индуцировать дифференцировку клеток лимфоидного ряда в направлении формирования цитотоксических лимфоцитов. Основываясь на полученных результатах, представляется целесообразным применение альфафетопротеина, наряду с ИЛ-2, для получения активированных лимфоцитов, которые могут быть использованы в иммунотерапии злокачественных новообразований и инфекционных заболеваний. Полученные результаты исследований по изучению иммуномодулирующих и противоопухолевых свойств альфа-фетопротеина человека позволили провести предварительные пилотные исследования у больных злокачественными опухолевыми заболеваниями III-YI стадии. Клинические примеры применения препарата АФП изолированно.

Клинико – морфологическая динамика в процессе лечения плоскоклеточного ороговевающего рака кожи правой щеки T3N1M0 у больной П., препаратом АФП. а – вид опухоли до начала лечения; б – вид опухоли через 20 суток лечения; в – вид опухоли через 40 суток лечения; г – через 60 суток лечения (резорбция опухоли); д – микроскопия биоптата опухоли до лечения («раковая жемчужина»); е – микроскопия биоптата опухоли через 20 суток лечения («замуровывание» клеток опухоли соединительной тканью); ж – микроскопия биоптата опухоли через 40 суток лечения (картина нормального плоского эпителия); з – микроскопия биоптата из места локализации опухоли через 60 суток лечения (определяются слои здоровой кожи: эпидермис, дерма, базальная мембрана); д, е, ж, з – окраска гематоксилином и эозином. Ув.: д – 800, е, ж, з – 250.

Компьютерная рентгеновская томография в динамике (позитив) больной Т., диагноз: рецидив почечноклеточного рака левой почки с метастатическим поражением V, VI, VII сегментов печени в процессе лечения препаратом АФП.

1 а, б – томограмма до лечения (рецидив опухоли в ложе левой почки, метастазы в V, VI, VII сегментах печени); 2 а,б – томограмма через 20 суток лечения (рецидив опухоли в ложе левой почки и метастазы в печени в состоянии некроза и представлены полостями, с наличием в них жидкости); 3 а,б – томограмма через 42 дня лечения (кальцификация очагов опухолевого роста в ложе левой почки и печени); а, б – идентичные анатомические срезы на томограмме.

Ренгенологическая динамика у больного Л., диагноз: метастаз перстневидно – клеточного рака желудка в нижней доле правого легкого, в процессе лечения препаратом АФП. а – ренгенограмма органов грудной полости до лечения (в нижней доле правого легкого определяется метастатический очаг); б – ренгенограмма органов грудной полости через 14 суток лечения (в нижней доле правого легкого определяется метастатический очаг в состоянии некроза с образованием полости); в - ренгенограмма органов грудной полости через 30 суток лечения (в нижней доле правого легкого определяются мелкие кальцинаты).

Обри Ди Грей

Избавление от ненужных клеток

Существует три класса клеток, накапливающихся в стареющем организме в избыточных количествах: жировые клетки, стареющие клетки и некоторые типы иммунных клеток. Жировые клетки имеют тенденцию расти или замещать мышечную массу, которую мы теряем с возрастом. Интересно, что самый заметный жир – подкожный – оказывается относительно безвредным в смысле провоцирования опасных для жизни заболеваний. Если, конечно, человек не достигает патологической тучности, когда общий вес жира и нагрузка на сердце таковы, что представляют собой угрозу для жизни. Есть и другая тенденция: накопление «висцерального» жира – жира в брюшной полости. Он играет весьма отрицательную роль. Прежде всего, вызывает снижение чувствительности наших мышц и клеток к сигналам, необходимым для усвоения сахара из крови, что в конце концов приводит к диабету второго типа. Поэтому действительно стоит избавляться от избыточного висцерального жира. Второй тип избыточных клеток – стареющие клетки. Они скапливаются в больших количествах в суставных хрящах. А также в других местах, но в меньших пропорциях. Однако и эти меньшие скопления могут быть весьма токсичны. Они не способны делиться в нужное время, и они выделяют ненормально большое количество некоторых белков.

Третий тип – иммунные клетки. Ситуация с ними значительно сложнее. С возрастом наступает дисфункция некоторых типов иммунных клеток. В них повреждается ДНК, и как защитный ответ – останавливается дальнейшее размножение. Казалось бы, в подобных обстоятельствах самое разумное для клетки – умереть. Но это могло бы

заставить другие аналогичные клетки продолжить деление, что вело бы к новым повреждениям ДНК. Поэтому для организма может быть более выгодным сохранять свои клетки, занимающие определенное жизненное пространство, даже если они не справляются со своими функциями. Избавиться от ненужных клеток – задача намного более простая, чем многие другие задачи в рамках SENS. Есть два принципиальных способа. Можно ввести препарат, который заставит ненужные клетки «покончить жизнь самоубийством», но не затронет другие клетки. Можно стимулировать адресный иммунный ответ для уничтожения ненужных клеток. И в том, и другом случае используются специфические молекулы на поверхности клеток. Но пока слишком мало исследователей работают в этой области, поскольку данной проблеме не уделяется достаточно внимания. По мнению ди Грея, проблема иммунных клеток может не выделяться в отдельное направление, поскольку ее решение, возможно, будет следствием антираковой терапии, которая описана выше, там, где речь идет про хромосомные мутации. Сергей Родионов, комментарии:

АФП – кандидат на роль «убийцы» ненужных клеток Одной из причин неукротимого роста опухолевых клеток является утрата генов, контролирующих пролиферацию. Таких анти-онкогенов в настоящий момент известно немного. Большинство их картировано на 17-й хромосоме. Наиболее изученными являются функции гена Р53. Именно с его отсутствием связывают нерегулируемость опухолевого роста. С функционированием Р53 связано явление апоптоза: запрограммированной клеточной гибели. Показано, что введение Р53 в малигнизированные клетки легких приводило к разрушению опухоли именно путем апоптоза.

L.N. Semenkova с соавт., (1997) исследовали влияние очищенного человеческого альфа-фетопротеина на рост человеческих клеток гепатокарциномы HepG2 in vitro. Синтезированный опухолевыми клетками АФП и АФП, выделенный из сыворотки пуповинной крови оказали выраженное дозозависимое ингибирование пролиферации клеток HepG2, вплоть до полной остановки деления в концентрации белка - больше чем 0.1 мг/мл. Чтобы проверить, может ли АФП вызывать эндогенную программу самоубийства в клетках гепатомы, авторы исследовали, предшествовала ли фрагментация ДНК смерти клетки. После обработки клеток гепатомы высокой дозой АФП(1.0 мг/мл), фрагментация ДНК была обнаружена, уже через 2 часа после этого. Обнаружено, что 70 % клеток подверглись апоптозу в течение 24 час от начала эксперимента. Фрагментация ДНК являлась предшественником других признаков смерти клеток в течение нескольких часов. Типичные морфологические изменения, характерные апоптоза были отмечены в течение 4 часов после обработки клеток высокими дозами АФП. Низкие концентрации опухолевого АФП и эмбрионального АФП (меньше чем 0.1 мг/мл) были не в состоянии индуцировать торможение роста HepG2 клеток, скорее демонстрируя бифазную активность АФП. Предварительная обработка клеток с актиномицином - ингибитором транскрипции не влияла на цитотоксичность АФП. Эти результаты демонстрируют, что белковый синтез не требуется для запуска этого механизма смерти ячейки. АФП без наличия лиганда имел дозозависимую, но менее интенсивную активность, подавляющую пролиферацию. Сходные эффекты торможения пролиферации опухолевых клеток эмбриональным, опухолевым АФП и его безлигандной формой, по-видимому свидетельствуют в пользу того, что основная роль в регулировании роста клетки может

быть отнесена к белковой половине полной молекулы АФП, но не к ее лигандам. Лишение фактора роста отчетливо усиливало цитостатическую активность высоких концентраций очищенного АФП и также увеличило митогенную активность низких концентраций, показывая взаимозависимость регулятивной активности пролиферации под влиянием АФП и факторов роста. Результаты этого исследования и дальнейших экспериментов (Dudich E.I., с соавторами, 2000) демонстрируют то, что АФП, непосредственно попавший во внутриклеточные пространство, индуцирует запрограммированную смерть опухолевой клетки. Авторы изучили способность изолированных протеолитически устойчивых фрагментов АФП индуцировать апоптоз на чувствительной к АФП линии клеток Raji и попытались определить возможную локализацию активной зоны, ответственной за передачу сигналов апоптоза. В отличие от интактного АФП, ни изолированные фрагменты (38 и 32 kDa), ни их эквимолекулярная смесь не были способны стимулировать апоптоз в клетках человеческой лимфомы Raji. Однако, было продемонстрировано, что оба фрагмента P23 или P26 и их эквимолекулярная смесь P23 + P26 синергично с интактным АФП подавляли пролиферацию в клетках Raji. Эти данные свидетельствуют о необходимости двух условий для опосредованного АФП триггерного запуска апоптоза: 1.Димеризация АФП для формирования гетеродимерного комплекса C-и Nконцевых доменов; 2. Участие центральной части молекулы АФП (домен II). Таким образом, белок АФП обоснованно может претендовать на роль индуктора «запрограммированной клеточной смерти» дефектных клеток. По-видимому через активизацию (экспрессию) гена Р53. Обри Ди Грей

Очистка от внеклеточного мусора

Внеклеточные шлаки отличаются от внеклеточных перекрестных связей. Они представляют из себя скопление материала, не выполняющего какой-либо функции. В идеале они должны были бы уничтожаться, но обладают огромной сопротивляемостью к разрушению. Существует два основных вида таких шлаков. Один из них – это ядра сформировавшихся атеросклерозных бляшек. В принципе, это не имеет большого значения, потому что макрофаги постоянно атакуют их, поедая частички ядра бляшки.

Единственная проблема заключается в том, что макрофаги не могут расщепить поглощенный материал. Из-за этого они в конце концов погибают и сами становятся внеклеточным мусором. Проблема была бы полностью решена, если бы ученые могли усилить деструктурирующий аппарат внутри клетки. Вторая серьезная проблема, связанная с внеклеточными шлаками, называется амилоид. Амилоидный белок образует в мозгу страдающих болезнью Альцгеймера скопления, называемые бляшками. Такой же процесс, но только более медленный, протекает в мозгу каждого человека. Существуют различные схожие скопления и в других тканях при старении или развитии заболеваний, связанных с возрастом. Самое известное из них – островковые амилоидные бляшки при диабете 2-го типа. Один научный подход, позволяющий предотвратить накопление внеклеточного мусора, уже предложен. Это вакцинация, стимулирующая иммунную систему на поглощение шлаков. Однако начальные клинические испытания вакцины пришлось прекратить из-за побочных явлений. И в настоящее время продолжается работа по ее усовершенствованию. Другой подход состоит в использовании небольших молекул для разрушения бляшек. Похоже, что поверхность бляшек может разрушаться с помощью пептидов (коротких белков), проникающих в бляшку и подрывающих ее структурную целостность. В результате целые белковые молекулы будут отрываться и покидать поверхность бляшки. Эти небольшие пептиды называются разрушители бета-слоев. Сергей Родионов, комментарии:

АФП – «мусорщик» Как уже ранее нашими исследованиями было показано, АФП активирует и индуцирует генерацию мононуклеарных лейкоцитов способных разрушать и «утилизировать» внеклеточные шлаки. Так же нами было установлено, что АФП обладает уникальными свойствами. Так, он блокирует аутоиммунный процесс системно и в эндотелии сосудов, обладает дезагрегантными свойствами, индуцирует синтез эндогенного ПГЕ2 т.о. снижает системную вазоконстрикцию, разрушает фибриноидную ткань и атеросклеротические бляшки за счет разрушения S-кальциевых мостиков связывающих фибрин, блокирует избыточную продукцию фибриногена, снижает повышенный уровень холестерина, уменьшает индекс атерогенности и обладает мембраностабилизирующими свойствами. Таким образом, АФП является универсальным соединением, способным «очищать» организм от внеклеточного «мусора».

От идеи до препарата

Очевидно, что все рассуждения, идеи и гипотезы не реализованные в конкретные продукты останутся «на территории несбывшихся надежд». В случае с белком АФП сюжет оптимистичен. Впервые в мире была создана, прошла клинические испытания, зарегистрирована лекарственная форма белка АФП в виде препарата Профеталь® (регистрационное удостоверение № ЛС-000941 от 18.11.2005г). Начато серийное производство препарата Профеталь® (альфа-фетопротеин) которое осуществляется в соответствии с требованиями стандартов качества ГОСТ Р 52249-2004 «Правила производства и контроля качества лекарственных средств» ИСО серии 90002001 и GMP (лицензия МЗ РФ на осуществление деятельности по производству лекарственных средств № 99-04-000244 от 3 ноября 2006г).