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TAXONOMÍA Y CLASIFICACION DE BACTERIAS Claudia Etchebehere Cátedra de Microbiología Facultad de Química y Facultad de Ciencias 2008


BIBLIOGRAFÍA • Brock, Biología de los microorganismos, 8a, 9a o 10a ed. (Evolución microbiana y sistemática, Diversidad de Archaea y Bacteria) • Prescott, Harley and Klein, Microbiología, cuarta edición. Capítulo 19).


TEMARIO Taxonomía y concepto de especie en procariotas Taxonomía clásica, numérica, molecular y polifásica Caracteres fenotípicos: clásicos y quimiotaxonómicos Caracteres genotípicos: clásicos y modernos (fingerprinting) Filogenética: clasificación y relación evolutiva gen del ARNr 16S, árbol filogenético y definición de dominos Relación entre taxonomía clásica y filogenética. Diversidad bacteriana. Ejemplos. Identificación de una cepa


TAXONOMÍA Taxos=estructuración u orden, nomos=ley Comprende: •Clasificación estructura los organismos en grupos (taxones) en base a su similitud •Nomenclatura asigna nombres a los taxones •Identificación determina a que taxones pertenece un organismo que se aisló


¿Para que sirve clasificar los microorganismos? Ordenar los conocimientos Lenguaje común Descubrir organismos no descriptos Caracterizar aislamientos (por ejemplo patógenos) Estudios evolutivos


Taxonomía Caracterización exhaustiva Aplicación de teoría y método de clasificación Formación de grupos taxonómicos (taxones) Nomenclatura Identificación Caracterización por número limitado de tests adecuados al problema Comparación con spp conocidas Asignación a una sp No identificado: estudio taxonómico


Identificación de un aislamiento „ Cultivo puro „ Estudios morfológicos (macro y micro, Gram) „ Estudios bioquímicos, enzimas vías de degradación,

metabolismo, relación con el oxígeno. „ Comparación con cepas ya caracterizadas „ Asignación de especie


Definición de especie „ Unidad taxonómica básica „ Grupo de cepas que tiene un alto grado de

similitud en sus propiedades y que difieren en forma significativa de otros grupos de cepas „ Cepa: población de organismos que

desciende de un único organismo o de una sola célula


Definición de especie en Bacterias „ Definición en revisión continua

• Definición metodológica estándar: - % de hibridación ADN bacteria1-ADN bacteria2 > 70% - ΔTm < 5ºC (estabilidad térmica del híbrido ADN1-ADN2)

• Actualmente el criterio es POLIFÁSICO (combinación de características fenotípicas, genómicas y filogenéticas) • En el futuro definición genómica de especie.


Absorbancia

Determinación del % de hibridación ADN-ADN ADN simple hebra ADN doble hebra

Abs. relativa 260 nm

220

260 300 Longitud de onda (nm)

ADN simple hebra desnaturalización Tm = 86ºC ADN doble hebra 80 90 100 temperatura (ºC)

Aumento de absorbancia del ADN a 260nm por desnaturalizacion Tm: punto medio del perfil de desnaturalización térmica de ADNADN o de ADNARN


Cinéticas de desnaturalización térmica de ADN homoduplex y heteroduplex


Hibridaci贸n gen贸mica como herramienta taxon贸mica


RANGOS TAXONOMICOS EN CLASIFICACION BACTERIANA Taxones:

Dominio Phylum Clase Orden Familia Género Especie Sub-especie

importancia en estudios clínicos y ecológicos


Nomenclatura Sistema binomial de nomenclatura (Linneo) Escherichia coli Escherichia coli o E. coli


Jerarquía taxonómica de la bacteria Allochromatium warmingii Dominio Phylum Clase Orden Familia Genero Especie Bacteria Proteobacteria Gamma Proteobacteria Bacterias Gram negativas Zymobacteria Bacterias fotótrofas púrpuras Chromatiales Bacterias púrpuras del azufre Chromatiaceae Allochromatium Allochromatium warmingii Secuencia del gen 16S rRNA


Categorías de clasificación a nivel de subespecie (tipificación) Variedades o tipos •serovariedad o serotipo (antígenos distintos) •fagovariedad (tipificación por fagos) •biovariedad (diferencias bioquímicas y fisiológicas) •patovariedad (patogenicidad) •morfovariedad (diferencias morfológicas) •genomovariedad (grupos con ADN similares)


Manuales de microorganismos Bergey´s Manual of Determinative Bacteriology 1923 (1ed)-1994 (9ed) Bergey´s Manual of Systematic Bacteriology 1a Ed 1984(vol 1)1989(vol 4) Bergey´s manual of Systematic Bacteriology 2a Ed 2001-2005 (vol 1-vol 5) The Prokaryotes (http:/www.prokaryotes.com)


PUBLICACIONES International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (antes IJSB). Publicado por la Sociedad General de Microbiolog铆a

Otros: Applied and Environmental Microbiology, Systematic Applied Microbiology (validaci贸n del nombre)


COLECCIONES DE MICROORGANISMOS

(cepas tipo y otras) ATCC (American Type Culture Collection) DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zelkulturen, Colecci贸n alemana) CIP (Colecci贸n del Instituto Pasteur, Francia) www.straininfo.net


Taxonomía bacteriana CLÁSICA „ caracteres fenotípicos (morfología, nutrición, etc.) „ % G+C „ ponderación de caracteres (llaves dicotómicas)


Características fenotípicas clásicas de valor taxonómico Morfología: forma, tamaño y tinción Nutrición y fisiología: fotótrofo, quimiótrofo, aerobio o anaerobio, temperatura y pH óptimos, fuentes alternativas de C, N y S Movilidad: tipo y disposición de flagelos Otros: pigmentos, inclusiones celulares, sensibilidad a antibióticos, patogenicidad


Características genotípicas clásicas Contenido G+C % G+C =

G+C x 100 G+C+A+T

Determinación por gradiente de CsCl, desnaturalización térmica o cromatografía (HPLC) Permite distinguir dos organismos, si tienen diferente % G+C entonces son de diferente especie (difieren mas del 10%) Si presentan similar G+C no se puede afirmar nada


Rangos de composici贸n de bases de ADN


TAXONOMÍA NUMÉRICA • Agrupación de unidades taxonómicas o taxones por métodos numéricos • Se basa en un gran número de caracteres • Cada carácter tiene igual peso • La similitud es función de la proporción de caracteres comunes


TAXONOMÍA NUMÉRICA - caracteres fenotípicos (no menos de 60) - coeficiente de semejanza =

a+d

.

a+b+c +d a: número de caracteres positivos en ambas cepas b: número de caracteres positivos sólo en cepa 1 c: número de caracteres positivos sólo en cepa 2 d: número de caracteres negativos en ambas cepas Se construyen matrices de semejanza y dendrogramas


Taxonomía molecular Basada en el estudio de moléculas Caracteres Genotípicos „ Hibridación ADN-ADN „ Molecular fingerprinting (huella molecular)

Caracteres Fenotípicos „ Quimiotaxonomía. Biomarcadores: lipídicos

(FAME), otros


Hibridación ADN-ADN

- depende de la secuencia completa del genoma - útil en organismos estrechamente relacionados - determinación por: % hibridación de ADN1 - ADN2 Δ Tm del híbrido - es el criterio actual de definición de especie


Molecular fingerprinting

• secuencias de ADN de un organismo son sometidas a la digestión con enzimas de restricción •resolución a nivel de sub-especie.


CARACTERES FENOTIPICOS Marcadores quimiotaxonómicos Características - análisis químico con equipamiento especializado - no son universales, muy útiles dentro de algunos grupos - alto grado de discriminación - presentes en distintas estructuras celulares


Marcadores quimiotaxonómicos - Pared: peptidoglicanos en Gram + - Membrana externa Gram negativos: -lipopolisacáridos - Membrana citoplasmática: -ácidos grasos (Fatty Acid Methyl Ester), -lípidos polares, ácidos micólicos en un grupo de bacterias Gram positivas (Actinomicetes), pigmentos carotenoides en bacterias fotótrofas anoxigénicas. - Cadena de transporte electrónico: citocromos, quinonas. - Sistema fotosintético: bacterioclorofilas. - Citoplasma: poliaminas en metanogénicas y Gram negativas


Desventajas de una clasificación artificial „ No permite inferir propiedades „ No permite comprender microorganismos que no se

han cultivado en el laboratorio „ No permite estudiar el origen y evolución de

funciones celulares (resistencia a antibióticos, aerobiosis, fotosíntesis)


Clasificaci贸n natural

Estructura los organismos en taxones cuyos miembros reflejan tanto como sea posible su naturaleza biol贸gica. Es ventajosa si adem谩s establece relaciones evolutivas


POLIFÁSICA Es la tendencia moderna. Consenso en la integración de distintos tipos de caracteres: Fenotípicos: -clásicos (morfología, nutrición, etc) - moleculares (marcadores quimiotaxonómicos) - perfil de proteínas totales y enzimas

Genotípicos:

-clásicos: % G+C - moleculares: hibridación DNA-DNA, fingerprinting

(ej. Perfiles moleculares por restricción o amplificación de ADN)

Filogenéticos: basados en el gen del ARNr 16S


Taxonomía polifásica


CARACTERIZACIÓN FILOGENÉTICA CARACTERIZACIÓN TENIENDO EN CUENTA LA EVOLUCIÓN.


Bases de la filogenética molecular

El uso de secuencias moleculares para estudios filogenéticos se basa en la premisa que los cambios en las secuencias ocurren al azar y de un modo temporal-dependiente y que cierta proporción de éstos permanece fijo en las moléculas.


CARACTERES FILOGENETICOS „ Plantean hipótesis de evolución (determina

relaciones de parentesco entre las especies)

„ Compara la secuencia de moléculas (cronómetros

evolutivos) y establece la relación entre ellas

„ Las secuencias de las moléculas son el registro

histórico de la evolución


PROPIEDADES DE UN BUEN CRONÓMETRO EVOLUTIVO „ distribución universal (presente en todos los

organismos)

„ función homóloga en todos los organismos „ capacidad de alinear „ secuencias con zonas altamente conservada

para distancias evolutivas grandes (alineamiento) y algunas zonas variables

„ ausencia de transferencia horizontal „ cantidad de información suficiente


Moléculas usadas para la determinación de relaciones filogenéticas de organismos

•ARNr: 5S, 16S y 23S (Carl Woese) •Subunidad beta de ATPasa •RecA • Factor

de Elongación Tu

•Genes funcionales


ARNr Procariotas

Nombre

Tama帽o (nucle贸tidos)

Ubicaci贸n

5S

120

Subunidad mayor del ribosoma

16S

1500

Subunidad menor

23S

2900

Subunidad mayor


Secuencia del ARNr 16S „ Estructura primaria:

Dominios de conservación universal Regiones altamente variables Dominios de nivel intermedio de conservación, con cambios de secuencia, pero conservación de estructura secundaria „ Estructura secundaria:

Similar en todos los organismos Acotada por su función en la síntesis de proteínas: función ancestral


Estructura secundaria del ARNr 16S de E. coli Líneas gruesas: dominios de conservación universal Líneas normales: dominios de conservación intermedia Líneas punteadas: regiones hipervariables


Árbol filogenético Un árbol filogenético es una hipótesis de relación evolutiva de un gen deducida a partir de la secuencia de ese gen en organismos que existen en el presente Para construirlo se deben hacer suposiciones que siempre tienen una cuota importante de error, la cuestión es si esos errores invalidan o no la hipótesis filogenética resultante.


¿Cómo se construye un árbol filogenético? 1-Extracción de ADN, PCR y secuencia


2-Alinear secuencias: determina que posiciones de las secuencias van a ser comparadas Organismos A

secuencias ARN CGU AGA CCU GAC

B

C CUU CCU AGA GCU GGC CAA

C

C CAA GAC GUG GCA

D

C CAU GCU AGA UGU GCC Posiciones mas variables

Posicion mas conservada

Posiciones que van a ser comparadas

Secuencia del organismo problema

secuencias obtenidas de la base de datos


Árboles filogenéticos „ Uso de programas para alinear secuencias y

construir árboles filogenéticos (MEGA) „ Longitud de la línea entre organismos es

proporcional a la distancia evolutiva „ Similitud de secuencias implica similitud en los genes


Secuencias sin alinear en programa Clustal IX


Secuencias alineadas en programa Clustal IX


Preparación de un árbol de distancias filogenéticas a partir del gen 16S ARN


Definiciรณn de especie bacteriana y el anรกlisis del gen ARNr 16S Definiciรณn especie: % de hibridaciรณn ADN1-ADN2 > 70% En general se cumple: secuencia del gen del ARNr 16S difiere en mas del 3% con el resto de las secuencias conocidas de bacterias entonces el % de hibridaciรณn ADN-ADN es menor al 70%

especies diferentes


Relaci贸n entre la similitud de secuencias del 16S ARNr y la hibridizaci贸n gen贸mica de ADN entre pares de organismos.


ANÁLISIS DE LA SECUENCIA DEL GEN ARNr 16S PARA LA IDENTIFICACIÓN DE UNA CEPA BACTERIANA Alineamiento y corrección de la secuencia Comparación con bases de secuencias (http://rdp.cme.msu.edu/html http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank)

Diferencia de secuencia con la cepa mas similar > 3%

< 3%

pruebas fenotípicas Confirmación con pruebas fenotípicas y genotípicas diferentes

diferentes

similares

Hibridación ADN-ADN < 70%

NUEVA ESPECIE

> 70% NUEVA CEPA DE LA MISMA ESPECIE


Caracterización de especies “nuevas”


Secuencias signaturas o firma en ARNr •Oligonucleótidos o bases presentes en determinadas posiciones en ciertos grupos de organismos •Ejemplos: •AAACUCAAA (posición 910) en Bacteria •CACACACCG (posición 1400) en Archaea •C (posición 47) en gamma-Protebacteria, Cianobacteria, Bacteroides, Grampositivos


Secuencia del gen ARNr 16S Se emplea frecuentemente para: ¾

COMPLETAR IDENTIFICACIÓN Y DESCRIPCIÓN DE CULTIVOS PUROS

¾

ANÁLISIS DE COMUNIDADES SIN CULTIVO

¾

DESCRIPCIÓN DE BACTERIAS NO CULTIVADAS: “Candidatus”

¾ METODOS RÁPIDOS DE CARACTERIZACIÓN Y CUANTIFICACION.


ESTUDIO DE COMUNIDADES MICROBIANAS

A

PCR gen especifica

Plásmidos con inserto Ligación de fragmentos de interés en el vector de clonado Transformación de cepas E. coli

Seleccion y análisis de clones por: RFLP, secuenciado, etc.

B DNA ambiental

Gen amplificado de los microorganismos A y B

„ Amplificación y clonado del gen del ARNr de 16S

para su posterior secuencia


MICROORGANISMOS NO CULTIVADOS


FISH: Fluorescence in situ hybridisation fluor贸foro

sonda

Microscopio de Epifluorescencia

muestra Fijacion

blanco (rRNA)

Fijacion permeabilizacion

Deteccion

Celulas hibridadas

Lavado Hibridaci贸n

Ribosomas

Sondas de oligonucleotido fluorescentes

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ÁRBOL FILOGENÉTICO UNIVERSAL


Caracteres fenotípicos con valor filogenético diferenciales entre Bacteria, Archaea y Eukarya Bacteria Peptidoglicano Lípidos Operones RNA polimerasa Ribosomas tRNA iniciador

Archaea

Eucarya

No

No

Enl. ester

Enl. eter

Enl. ester

No

Una (4 subun) 70S

Varias (8-12 subun) 70S

Tres (12-14 subun) 80S

Metionina

Metionina

No

Sensible

Sensible

Sensible

No

No

Formilmetionina

Ribosoma sensible a: Toxina diftérica Cloranfenicol Kanamicina Estreptomicina


Árbol del ARNr 16S „ Termofilia representada en los grupos mas

profundos de Archaea y Bacteria

„ Muchos de los linajes profundos son anerobios

o microaerofílicos

„ Fotosíntesis basada en clorofilas: distribuida en

varios linajes de Bacteria


ÁRBOL FILOGENÉTICO UNIVERSAL

Termofilia en todos los miembros de la rama Termofilia en algunos miembros de la rama


Caracteres que confirman el árbol universal construido a partir del ARNr 16S • Principales diferencias entre dominios Bacteria, Archaea y Eukarya • Procariotas actuales mas cercanos al ancestro relacionadas con las condiciones fisicoquímicas en el origen de la vida: Aquifex y Methanopyrus (termofilia, anaerobiosis) • Características de los Eukarya mas cercanos a los procariotas: Giardia y Microsporidia • Secuencias de otras moléculas, especialmente las ligadas a la replicación, transcripción y traducción


Caracteres similares en taxones filogenéticamente distantes Chloroflexus y Chlorobium (pertenecen a divisiones muy alejadas entre sí) Fotótrofos anoxigénicos Representantes de ambos géneros poseen clorosomas con similar función y estructura posibles explicaciones: transferencia lateral evolución independiente el gen del ARNr 16S aportaría información limitada


Ă rbol del Dominio Bacteria


DOMINIO BACTERIA Actualmente con mas de 50 divisiones (phylum), algunas sin organismos cultivados (secuencias ambientales) Mas de 400 géneros Phylum mejores caracterizados: Proteobacteria (α,β,γ,δ,ε) con 270 géneros Gram positivos (LowGC y HighGC) con 170 géneros


DOMINIO BACTERIA


DOMINIO BACTERIA „Aquifex

Bacterias autótrofas y termófilas „Bacterias verdes no del azufre (Chloroflexus)

Algunas fotosíntesis anoxigénica, autotrofía por vía del hidroxipropionato „Deinococci

Altamente resistentes a la radiación (D. radiodurans) „Bacterias verdes del azufre (Chlorobium)

Fototrofos anoxigénicos, anaerobios estrictos, autotrofía por ciclo reverso del ácido cítrico „Planctomycetes

Bacterias prostecadas, carecen de peptidoglicano, reproducción por gemación, compartimentalización celular (membrana nuclear),” annamox” fisiología única, “Candidatus” „Cyanobacteria

Bacterias unicelulares o filamentosas, Fotosíntesis oxigénica


DOMINIO BACTERIA „ Gram positivos bajo GC G+C < 50% Géneros: Clostridium, Bacillus, Lactobacillus, Streptococcus, Staphylococcus „ Gram positivos alto GC G+C > 50-55% Géneros: Actinomyces, Micrococcus, Mycobacterium


DOMINIO BACTERIA PROTEOBACTERIAS „ Alfa: metilótrofas y metanótrofas, oligotrofas, litótrofas (Nitrobacter), fij. N2, bacterias rojas no del S fotosínteticas „ Beta: litótrofas de NH3 (Nitrosomonas) „ Delta: Myxobacterias, Bdellovibrio, algunas sulfato reductoras


Etapas en el ciclo celular de Hyphomicrobium


Ciclo de Myxobacterias


Ejemplos de diversidad: estructura y función • Pared: bacterias sin pared (Mycoplasmas, Thermoplasmas) • Membranas: diferente composición (Mycobacterium) • Forma: Espiroquetas, bacterias con prostecas (Caulobacter), formación de hifas (Streptomyces) • Mecanismos de movimiento: bacterias deslizantes (Beggiatoa) • Diferenciación celular: microcistos de Cyanobacterias, comportamiento social (Myxobacterias) • Comportamiento frente a otras bacterias: predación (Bdellovibrio) • Obtención de energía independiente del trasporte de electrones (fosforilación oxidativa o fotosíntesis) y la fermentación, ej.: decarboxilasas en Oxalobacter formigenes


DOMINIO ARCHAEA 40 géneros 3 linajes separados: „ Euryarchaeota (halófilos y metanogénicos) „ Crenarchaeota (termófilos) „ Korarchaeota (solo secuencias ambientales)


Taxones definidos previamente coherentes filogenéticamente Actinomycetes (High GC), Spirochetes, Cyanobacteria, Myxobacteria (δ Proteobacteria)

Caracteres filogenéticamente no valiosos para definir taxones superiores: Termofilia, fototrofía, tipo de movilidad, morfología compleja (helicoidal, gemación micelio, apéndices)


¿Por qué hay tanta diversidad entre los procariotas (Archaea y Bacteria)? ¾ Son ancestrales

¾ Son ubicuos: ambientes extremos, parásitos o simbiontes de Eukarya ¾ Representan la mayor diversidad de seres vivos, mucha de la cual esta aún inexplorada


驴C贸mo surge una nueva especie bacteriana?


„ Concepto polifásico de especie:

Se define como un grupo de organismos individuales monofilético y genómicamente coherente que muestran un alto grado de similitud general en muchos caracteres independientes

„ Concepto ecotipo (Cohan, 2004):

Se define como un subgrupo de un grupo bacteriano genómicamente coherente que difiere genéticamente de otros subgrupos por adaptación a condiciones locales ecológicas.

Futuro cercano: incluir árboles filogenéticos derivados de las bases de datos proteómicas de modo de incluir los eventos de HGT en la identificación de las especies.


ORIGEN DE LA VIDA • Origen de la tierra 4600 millones de años • Condiciones de la Tierra primitiva: CH4, CO2, N2 NH3 y muy poco O2 (ambiente reductor). Trazas de FeS y H2S • Temperatura > 100°C • Evidencia de vida microbiana en la Tierra primitiva (microfósiles: estromatolitos) • Vida primitiva: ¿organismos con ARN? (sin ADN) • Célula moderna: ADN

ARN

Proteína


Estromatolitos


taxonomia bacteriana