TAXONOMÍA Y CLASIFICACION DE BACTERIAS Claudia Etchebehere Cátedra de Microbiología Facultad de Química y Facultad de Ciencias 2008
BIBLIOGRAFÍA • Brock, Biología de los microorganismos, 8a, 9a o 10a ed. (Evolución microbiana y sistemática, Diversidad de Archaea y Bacteria) • Prescott, Harley and Klein, Microbiología, cuarta edición. Capítulo 19).
TEMARIO Taxonomía y concepto de especie en procariotas Taxonomía clásica, numérica, molecular y polifásica Caracteres fenotípicos: clásicos y quimiotaxonómicos Caracteres genotípicos: clásicos y modernos (fingerprinting) Filogenética: clasificación y relación evolutiva gen del ARNr 16S, árbol filogenético y definición de dominos Relación entre taxonomía clásica y filogenética. Diversidad bacteriana. Ejemplos. Identificación de una cepa
TAXONOMÍA Taxos=estructuración u orden, nomos=ley Comprende: •Clasificación estructura los organismos en grupos (taxones) en base a su similitud •Nomenclatura asigna nombres a los taxones •Identificación determina a que taxones pertenece un organismo que se aisló
¿Para que sirve clasificar los microorganismos? Ordenar los conocimientos Lenguaje común Descubrir organismos no descriptos Caracterizar aislamientos (por ejemplo patógenos) Estudios evolutivos
Taxonomía Caracterización exhaustiva Aplicación de teoría y método de clasificación Formación de grupos taxonómicos (taxones) Nomenclatura Identificación Caracterización por número limitado de tests adecuados al problema Comparación con spp conocidas Asignación a una sp No identificado: estudio taxonómico
Identificación de un aislamiento Cultivo puro Estudios morfológicos (macro y micro, Gram) Estudios bioquímicos, enzimas vías de degradación,
metabolismo, relación con el oxígeno. Comparación con cepas ya caracterizadas Asignación de especie
Definición de especie Unidad taxonómica básica Grupo de cepas que tiene un alto grado de
similitud en sus propiedades y que difieren en forma significativa de otros grupos de cepas Cepa: población de organismos que
desciende de un único organismo o de una sola célula
Definición de especie en Bacterias Definición en revisión continua
• Definición metodológica estándar: - % de hibridación ADN bacteria1-ADN bacteria2 > 70% - ΔTm < 5ºC (estabilidad térmica del híbrido ADN1-ADN2)
• Actualmente el criterio es POLIFÁSICO (combinación de características fenotípicas, genómicas y filogenéticas) • En el futuro definición genómica de especie.
Absorbancia
Determinación del % de hibridación ADN-ADN ADN simple hebra ADN doble hebra
Abs. relativa 260 nm
220
260 300 Longitud de onda (nm)
ADN simple hebra desnaturalización Tm = 86ºC ADN doble hebra 80 90 100 temperatura (ºC)
Aumento de absorbancia del ADN a 260nm por desnaturalizacion Tm: punto medio del perfil de desnaturalización térmica de ADNADN o de ADNARN
Cinéticas de desnaturalización térmica de ADN homoduplex y heteroduplex
Hibridaci贸n gen贸mica como herramienta taxon贸mica
RANGOS TAXONOMICOS EN CLASIFICACION BACTERIANA Taxones:
Dominio Phylum Clase Orden Familia Género Especie Sub-especie
importancia en estudios clínicos y ecológicos
Nomenclatura Sistema binomial de nomenclatura (Linneo) Escherichia coli Escherichia coli o E. coli
Jerarquía taxonómica de la bacteria Allochromatium warmingii Dominio Phylum Clase Orden Familia Genero Especie Bacteria Proteobacteria Gamma Proteobacteria Bacterias Gram negativas Zymobacteria Bacterias fotótrofas púrpuras Chromatiales Bacterias púrpuras del azufre Chromatiaceae Allochromatium Allochromatium warmingii Secuencia del gen 16S rRNA
Categorías de clasificación a nivel de subespecie (tipificación) Variedades o tipos •serovariedad o serotipo (antígenos distintos) •fagovariedad (tipificación por fagos) •biovariedad (diferencias bioquímicas y fisiológicas) •patovariedad (patogenicidad) •morfovariedad (diferencias morfológicas) •genomovariedad (grupos con ADN similares)
Manuales de microorganismos Bergey´s Manual of Determinative Bacteriology 1923 (1ed)-1994 (9ed) Bergey´s Manual of Systematic Bacteriology 1a Ed 1984(vol 1)1989(vol 4) Bergey´s manual of Systematic Bacteriology 2a Ed 2001-2005 (vol 1-vol 5) The Prokaryotes (http:/www.prokaryotes.com)
PUBLICACIONES International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (antes IJSB). Publicado por la Sociedad General de Microbiolog铆a
Otros: Applied and Environmental Microbiology, Systematic Applied Microbiology (validaci贸n del nombre)
COLECCIONES DE MICROORGANISMOS
(cepas tipo y otras) ATCC (American Type Culture Collection) DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zelkulturen, Colecci贸n alemana) CIP (Colecci贸n del Instituto Pasteur, Francia) www.straininfo.net
Taxonomía bacteriana CLÁSICA caracteres fenotípicos (morfología, nutrición, etc.) % G+C ponderación de caracteres (llaves dicotómicas)
Características fenotípicas clásicas de valor taxonómico Morfología: forma, tamaño y tinción Nutrición y fisiología: fotótrofo, quimiótrofo, aerobio o anaerobio, temperatura y pH óptimos, fuentes alternativas de C, N y S Movilidad: tipo y disposición de flagelos Otros: pigmentos, inclusiones celulares, sensibilidad a antibióticos, patogenicidad
Características genotípicas clásicas Contenido G+C % G+C =
G+C x 100 G+C+A+T
Determinación por gradiente de CsCl, desnaturalización térmica o cromatografía (HPLC) Permite distinguir dos organismos, si tienen diferente % G+C entonces son de diferente especie (difieren mas del 10%) Si presentan similar G+C no se puede afirmar nada
Rangos de composici贸n de bases de ADN
TAXONOMÍA NUMÉRICA • Agrupación de unidades taxonómicas o taxones por métodos numéricos • Se basa en un gran número de caracteres • Cada carácter tiene igual peso • La similitud es función de la proporción de caracteres comunes
TAXONOMÍA NUMÉRICA - caracteres fenotípicos (no menos de 60) - coeficiente de semejanza =
a+d
.
a+b+c +d a: número de caracteres positivos en ambas cepas b: número de caracteres positivos sólo en cepa 1 c: número de caracteres positivos sólo en cepa 2 d: número de caracteres negativos en ambas cepas Se construyen matrices de semejanza y dendrogramas
Taxonomía molecular Basada en el estudio de moléculas Caracteres Genotípicos Hibridación ADN-ADN Molecular fingerprinting (huella molecular)
Caracteres Fenotípicos Quimiotaxonomía. Biomarcadores: lipídicos
(FAME), otros
Hibridación ADN-ADN
- depende de la secuencia completa del genoma - útil en organismos estrechamente relacionados - determinación por: % hibridación de ADN1 - ADN2 Δ Tm del híbrido - es el criterio actual de definición de especie
Molecular fingerprinting
• secuencias de ADN de un organismo son sometidas a la digestión con enzimas de restricción •resolución a nivel de sub-especie.
CARACTERES FENOTIPICOS Marcadores quimiotaxonómicos Características - análisis químico con equipamiento especializado - no son universales, muy útiles dentro de algunos grupos - alto grado de discriminación - presentes en distintas estructuras celulares
Marcadores quimiotaxonómicos - Pared: peptidoglicanos en Gram + - Membrana externa Gram negativos: -lipopolisacáridos - Membrana citoplasmática: -ácidos grasos (Fatty Acid Methyl Ester), -lípidos polares, ácidos micólicos en un grupo de bacterias Gram positivas (Actinomicetes), pigmentos carotenoides en bacterias fotótrofas anoxigénicas. - Cadena de transporte electrónico: citocromos, quinonas. - Sistema fotosintético: bacterioclorofilas. - Citoplasma: poliaminas en metanogénicas y Gram negativas
Desventajas de una clasificación artificial No permite inferir propiedades No permite comprender microorganismos que no se
han cultivado en el laboratorio No permite estudiar el origen y evolución de
funciones celulares (resistencia a antibióticos, aerobiosis, fotosíntesis)
Clasificaci贸n natural
Estructura los organismos en taxones cuyos miembros reflejan tanto como sea posible su naturaleza biol贸gica. Es ventajosa si adem谩s establece relaciones evolutivas
POLIFÁSICA Es la tendencia moderna. Consenso en la integración de distintos tipos de caracteres: Fenotípicos: -clásicos (morfología, nutrición, etc) - moleculares (marcadores quimiotaxonómicos) - perfil de proteínas totales y enzimas
Genotípicos:
-clásicos: % G+C - moleculares: hibridación DNA-DNA, fingerprinting
(ej. Perfiles moleculares por restricción o amplificación de ADN)
Filogenéticos: basados en el gen del ARNr 16S
Taxonomía polifásica
CARACTERIZACIÓN FILOGENÉTICA CARACTERIZACIÓN TENIENDO EN CUENTA LA EVOLUCIÓN.
Bases de la filogenética molecular
El uso de secuencias moleculares para estudios filogenéticos se basa en la premisa que los cambios en las secuencias ocurren al azar y de un modo temporal-dependiente y que cierta proporción de éstos permanece fijo en las moléculas.
CARACTERES FILOGENETICOS Plantean hipótesis de evolución (determina
relaciones de parentesco entre las especies)
Compara la secuencia de moléculas (cronómetros
evolutivos) y establece la relación entre ellas
Las secuencias de las moléculas son el registro
histórico de la evolución
PROPIEDADES DE UN BUEN CRONÓMETRO EVOLUTIVO distribución universal (presente en todos los
organismos)
función homóloga en todos los organismos capacidad de alinear secuencias con zonas altamente conservada
para distancias evolutivas grandes (alineamiento) y algunas zonas variables
ausencia de transferencia horizontal cantidad de información suficiente
Moléculas usadas para la determinación de relaciones filogenéticas de organismos
•ARNr: 5S, 16S y 23S (Carl Woese) •Subunidad beta de ATPasa •RecA • Factor
de Elongación Tu
•Genes funcionales
ARNr Procariotas
Nombre
Tama帽o (nucle贸tidos)
Ubicaci贸n
5S
120
Subunidad mayor del ribosoma
16S
1500
Subunidad menor
23S
2900
Subunidad mayor
Secuencia del ARNr 16S Estructura primaria:
Dominios de conservación universal Regiones altamente variables Dominios de nivel intermedio de conservación, con cambios de secuencia, pero conservación de estructura secundaria Estructura secundaria:
Similar en todos los organismos Acotada por su función en la síntesis de proteínas: función ancestral
Estructura secundaria del ARNr 16S de E. coli Líneas gruesas: dominios de conservación universal Líneas normales: dominios de conservación intermedia Líneas punteadas: regiones hipervariables
Árbol filogenético Un árbol filogenético es una hipótesis de relación evolutiva de un gen deducida a partir de la secuencia de ese gen en organismos que existen en el presente Para construirlo se deben hacer suposiciones que siempre tienen una cuota importante de error, la cuestión es si esos errores invalidan o no la hipótesis filogenética resultante.
¿Cómo se construye un árbol filogenético? 1-Extracción de ADN, PCR y secuencia
2-Alinear secuencias: determina que posiciones de las secuencias van a ser comparadas Organismos A
secuencias ARN CGU AGA CCU GAC
B
C CUU CCU AGA GCU GGC CAA
C
C CAA GAC GUG GCA
D
C CAU GCU AGA UGU GCC Posiciones mas variables
Posicion mas conservada
Posiciones que van a ser comparadas
Secuencia del organismo problema
secuencias obtenidas de la base de datos
Árboles filogenéticos Uso de programas para alinear secuencias y
construir árboles filogenéticos (MEGA) Longitud de la línea entre organismos es
proporcional a la distancia evolutiva Similitud de secuencias implica similitud en los genes
Secuencias sin alinear en programa Clustal IX
Secuencias alineadas en programa Clustal IX
Preparación de un árbol de distancias filogenéticas a partir del gen 16S ARN
Definiciรณn de especie bacteriana y el anรกlisis del gen ARNr 16S Definiciรณn especie: % de hibridaciรณn ADN1-ADN2 > 70% En general se cumple: secuencia del gen del ARNr 16S difiere en mas del 3% con el resto de las secuencias conocidas de bacterias entonces el % de hibridaciรณn ADN-ADN es menor al 70%
especies diferentes
Relaci贸n entre la similitud de secuencias del 16S ARNr y la hibridizaci贸n gen贸mica de ADN entre pares de organismos.
ANÁLISIS DE LA SECUENCIA DEL GEN ARNr 16S PARA LA IDENTIFICACIÓN DE UNA CEPA BACTERIANA Alineamiento y corrección de la secuencia Comparación con bases de secuencias (http://rdp.cme.msu.edu/html http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank)
Diferencia de secuencia con la cepa mas similar > 3%
< 3%
pruebas fenotípicas Confirmación con pruebas fenotípicas y genotípicas diferentes
diferentes
similares
Hibridación ADN-ADN < 70%
NUEVA ESPECIE
> 70% NUEVA CEPA DE LA MISMA ESPECIE
Caracterización de especies “nuevas”
Secuencias signaturas o firma en ARNr •Oligonucleótidos o bases presentes en determinadas posiciones en ciertos grupos de organismos •Ejemplos: •AAACUCAAA (posición 910) en Bacteria •CACACACCG (posición 1400) en Archaea •C (posición 47) en gamma-Protebacteria, Cianobacteria, Bacteroides, Grampositivos
Secuencia del gen ARNr 16S Se emplea frecuentemente para: ¾
COMPLETAR IDENTIFICACIÓN Y DESCRIPCIÓN DE CULTIVOS PUROS
¾
ANÁLISIS DE COMUNIDADES SIN CULTIVO
¾
DESCRIPCIÓN DE BACTERIAS NO CULTIVADAS: “Candidatus”
¾ METODOS RÁPIDOS DE CARACTERIZACIÓN Y CUANTIFICACION.
ESTUDIO DE COMUNIDADES MICROBIANAS
A
PCR gen especifica
Plásmidos con inserto Ligación de fragmentos de interés en el vector de clonado Transformación de cepas E. coli
Seleccion y análisis de clones por: RFLP, secuenciado, etc.
B DNA ambiental
Gen amplificado de los microorganismos A y B
Amplificación y clonado del gen del ARNr de 16S
para su posterior secuencia
MICROORGANISMOS NO CULTIVADOS
FISH: Fluorescence in situ hybridisation fluor贸foro
sonda
Microscopio de Epifluorescencia
muestra Fijacion
blanco (rRNA)
Fijacion permeabilizacion
Deteccion
Celulas hibridadas
Lavado Hibridaci贸n
Ribosomas
Sondas de oligonucleotido fluorescentes
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ÁRBOL FILOGENÉTICO UNIVERSAL
Caracteres fenotípicos con valor filogenético diferenciales entre Bacteria, Archaea y Eukarya Bacteria Peptidoglicano Lípidos Operones RNA polimerasa Ribosomas tRNA iniciador
Archaea
Eucarya
Sí
No
No
Enl. ester
Enl. eter
Enl. ester
Sí
Sí
No
Una (4 subun) 70S
Varias (8-12 subun) 70S
Tres (12-14 subun) 80S
Metionina
Metionina
No
Sensible
Sensible
Sensible
No
No
Formilmetionina
Ribosoma sensible a: Toxina diftérica Cloranfenicol Kanamicina Estreptomicina
Árbol del ARNr 16S Termofilia representada en los grupos mas
profundos de Archaea y Bacteria
Muchos de los linajes profundos son anerobios
o microaerofílicos
Fotosíntesis basada en clorofilas: distribuida en
varios linajes de Bacteria
ÁRBOL FILOGENÉTICO UNIVERSAL
Termofilia en todos los miembros de la rama Termofilia en algunos miembros de la rama
Caracteres que confirman el árbol universal construido a partir del ARNr 16S • Principales diferencias entre dominios Bacteria, Archaea y Eukarya • Procariotas actuales mas cercanos al ancestro relacionadas con las condiciones fisicoquímicas en el origen de la vida: Aquifex y Methanopyrus (termofilia, anaerobiosis) • Características de los Eukarya mas cercanos a los procariotas: Giardia y Microsporidia • Secuencias de otras moléculas, especialmente las ligadas a la replicación, transcripción y traducción
Caracteres similares en taxones filogenéticamente distantes Chloroflexus y Chlorobium (pertenecen a divisiones muy alejadas entre sí) Fotótrofos anoxigénicos Representantes de ambos géneros poseen clorosomas con similar función y estructura posibles explicaciones: transferencia lateral evolución independiente el gen del ARNr 16S aportaría información limitada
Ă rbol del Dominio Bacteria
DOMINIO BACTERIA Actualmente con mas de 50 divisiones (phylum), algunas sin organismos cultivados (secuencias ambientales) Mas de 400 géneros Phylum mejores caracterizados: Proteobacteria (α,β,γ,δ,ε) con 270 géneros Gram positivos (LowGC y HighGC) con 170 géneros
DOMINIO BACTERIA
DOMINIO BACTERIA Aquifex
Bacterias autótrofas y termófilas Bacterias verdes no del azufre (Chloroflexus)
Algunas fotosíntesis anoxigénica, autotrofía por vía del hidroxipropionato Deinococci
Altamente resistentes a la radiación (D. radiodurans) Bacterias verdes del azufre (Chlorobium)
Fototrofos anoxigénicos, anaerobios estrictos, autotrofía por ciclo reverso del ácido cítrico Planctomycetes
Bacterias prostecadas, carecen de peptidoglicano, reproducción por gemación, compartimentalización celular (membrana nuclear),” annamox” fisiología única, “Candidatus” Cyanobacteria
Bacterias unicelulares o filamentosas, Fotosíntesis oxigénica
DOMINIO BACTERIA Gram positivos bajo GC G+C < 50% Géneros: Clostridium, Bacillus, Lactobacillus, Streptococcus, Staphylococcus Gram positivos alto GC G+C > 50-55% Géneros: Actinomyces, Micrococcus, Mycobacterium
DOMINIO BACTERIA PROTEOBACTERIAS Alfa: metilótrofas y metanótrofas, oligotrofas, litótrofas (Nitrobacter), fij. N2, bacterias rojas no del S fotosínteticas Beta: litótrofas de NH3 (Nitrosomonas) Delta: Myxobacterias, Bdellovibrio, algunas sulfato reductoras
Etapas en el ciclo celular de Hyphomicrobium
Ciclo de Myxobacterias
Ejemplos de diversidad: estructura y función • Pared: bacterias sin pared (Mycoplasmas, Thermoplasmas) • Membranas: diferente composición (Mycobacterium) • Forma: Espiroquetas, bacterias con prostecas (Caulobacter), formación de hifas (Streptomyces) • Mecanismos de movimiento: bacterias deslizantes (Beggiatoa) • Diferenciación celular: microcistos de Cyanobacterias, comportamiento social (Myxobacterias) • Comportamiento frente a otras bacterias: predación (Bdellovibrio) • Obtención de energía independiente del trasporte de electrones (fosforilación oxidativa o fotosíntesis) y la fermentación, ej.: decarboxilasas en Oxalobacter formigenes
DOMINIO ARCHAEA 40 géneros 3 linajes separados: Euryarchaeota (halófilos y metanogénicos) Crenarchaeota (termófilos) Korarchaeota (solo secuencias ambientales)
Taxones definidos previamente coherentes filogenéticamente Actinomycetes (High GC), Spirochetes, Cyanobacteria, Myxobacteria (δ Proteobacteria)
Caracteres filogenéticamente no valiosos para definir taxones superiores: Termofilia, fototrofía, tipo de movilidad, morfología compleja (helicoidal, gemación micelio, apéndices)
¿Por qué hay tanta diversidad entre los procariotas (Archaea y Bacteria)? ¾ Son ancestrales
¾ Son ubicuos: ambientes extremos, parásitos o simbiontes de Eukarya ¾ Representan la mayor diversidad de seres vivos, mucha de la cual esta aún inexplorada
驴C贸mo surge una nueva especie bacteriana?
Concepto polifásico de especie:
Se define como un grupo de organismos individuales monofilético y genómicamente coherente que muestran un alto grado de similitud general en muchos caracteres independientes
Concepto ecotipo (Cohan, 2004):
Se define como un subgrupo de un grupo bacteriano genómicamente coherente que difiere genéticamente de otros subgrupos por adaptación a condiciones locales ecológicas.
Futuro cercano: incluir árboles filogenéticos derivados de las bases de datos proteómicas de modo de incluir los eventos de HGT en la identificación de las especies.
ORIGEN DE LA VIDA • Origen de la tierra 4600 millones de años • Condiciones de la Tierra primitiva: CH4, CO2, N2 NH3 y muy poco O2 (ambiente reductor). Trazas de FeS y H2S • Temperatura > 100°C • Evidencia de vida microbiana en la Tierra primitiva (microfósiles: estromatolitos) • Vida primitiva: ¿organismos con ARN? (sin ADN) • Célula moderna: ADN
ARN
Proteína
Estromatolitos