Materiales y Métodos
medio por nuevo medio de mantenimiento, evitando así que el TIRON estuviera más de 30 minutos en el cultivo. Rotenona: Sigma ref. R8875. Es un inhibidor del complejo I de la cadena respiratoria mitocondrial e inductor de la formación de radicales libres. Se diluye fácilmente en DMSO a una concentración stock de 1 mM. Como para la metformina se utilizó a distintas concentraciones de trabajo dependiendo del tipo de ensayo (ver apartado 2.2.3). Oligomicina: Sigma ref. O4876. Este agente inhibe la síntesis de ATP mitocondrial bloqueando la enzima ATPasa (complejo V). Se usó exclusivamente para ensayos de consumo de oxígeno a una concentración final de 1 µg/ml (stock 25 mg/ml en etanol absoluto). FCCP: Sigma ref. C2920. Es un desacoplante de la respiración mitocondrial. Se usó exclusivamente para ensayos de consumo de oxígeno a una concentración de 400 nM (stock 4 mM en DMSO). Se utilizó como control de la capacidad máxima respiratoria. Antimicina A: Sigma ref. A8674. Es un inhibidor del complejo III de la cadena respiratoria mitocondrial. Se usó exclusivamente para ensayos de consumo de oxígeno a una concentración de 100 nM (stock 1 mM en DMSO). -El BSA-PALMITATO se constituye preparando primero el BSA a una concentración de 0.34 mM en una solución 150 mM NaCl. Luego se prepara el palmitato sódico a una concentración de 2 mM en una solución 150 mM NaCl. Esta solución de palmitato sodico con la del BSA se mezcla manteniendo la proporción 1:1 para obtener una solución final de palmitato 1mM / BSA 0,17mM. PARTE 2 MÉTODOS 2.1 TRATAMIENTO CON METFORMINA EN RATONES C57BL/6 Para nuestros ensayos se utilizaron veinte ratones, de los cuales a la mitad de ellos se les inyectó vía introperitoneal una dosis diaria de metformina (250mg/kg de peso del animal) disuelta en solución fisiológica (NaCl 0,9%), mientras que a los otros diez ratones se les realizó una inyección de solución fisiológica (placebo) utilizando el mismo volumen empleado para las inyecciones con la metformina. Los tratamientos se efectuaron a las 10 de la mañana durante 3 días consecutivos. 1 hora después de la última inyección se sacrificaron los animales y se procedió a extraer el tejido adiposo de la zona epididimal, el 85