Tesi Master Drug Design & Synthesis 2007 by Simone Brogi

Università degli Studi di Siena Master di Secondo Livello in “Drug Design and Synthesis” Modulo: Bioinformatics, Drug Design & Drug Optimization Dipartimento Farmaco Chimico Tecnologico Facoltà di Farmacia

Modello Farmacoforico per il Recettore alfa degli Estrogeni

Simone Brogi

Relazione conclusiva per l’attribuzione del titolo sostenuta il 20 Dicembre 2007 davanti alla Commissione di Esame composta da: Professor Maurizio Taddei

Università di Siena (Coordinatore)

Dott. Alessandro Mordini

ICCOM-CNR, Firenze

Dott. Enzo Perrotta

Chemper, Prato

Anno Accademico 2006-2007

La ricerca della verità è più preziosa del suo possesso (Albert Einstein)

La scienza non puo' risolvere il mistero ultimo della natura. E cio' perche', in ultima analisi, noi stessi facciamo parte del mistero che stiamo cercando di risolvere. (Max Planck)

Se ogni cosa sulla Terra fosse razionale, non accadrebbe nulla. (Fëdor Michajlovič Dostoevskij)

I DICE

Abstract ........................................................................................................................................ 1 Introduzione................................................................................................................................. 2 Gli estrogeni ed i loro recettori .................................................................................................. 3 Selective Estrogen Receptor Modulator (SERMs)................................................................. 12 SERMs derivati dal Trifeniletilene ...................................................................................... 13 SERMs derivati dal Benzotiofene ........................................................................................ 15 SERMs derivati dal Benzopirano......................................................................................... 17 Bioattivazione dei SERMs ........................................................................................................ 17 uovi composti contro i tumori ormone-dipendenti.............................................................. 21 Binding mode di un ligando con ER-Îą .................................................................................... 24 Studi Computazionali sui SERMs ........................................................................................... 29 Materiali e Metodi..................................................................................................................... 31 Risultati e Discussione............................................................................................................... 35 Prospettive per il futuro............................................................................................................ 45 Ringraziamenti .......................................................................................................................... 46 Bibliografia ................................................................................................................................ 47

I DICE delle TABELLE

Tabella 1 Schema relativo ai sostituenti dei composti del Training e del Test set..................... 36 Tabella 2 Composti che sono stati inclusi nel Training set e nel Test set.................................. 37 Tabella 3 Parametri delle ipotesi generate con CATALYST ....................................................... 38 Tabella 4 Valori di attivitĂ osservata e predette per le Acetogenine.......................................... 43 b

I DICE delle FIGURE

Figura 1 Biosintesi del 17-β-estradiolo (E2)............................................................................... 3 Figura 2 Effetti del ligando su ER-α .......................................................................................... 6 Figura 3 Organizzazione dei recettori ER-α e ER-β .................................................................. 8 Figura 4 Cambio conformazionale del Ligand Binding Domain (LBD) di ER-α ..................... 10 Figura 5 Formule di struttura dei SERMs .................................................................................. 12 Figura 6 Bioattivazione del Tamoxifen...................................................................................... 18 Figura 7 Bioattivazione l’Alcobifene......................................................................................... 19 Figura 8 Bioattivazione del Raloxifene...................................................................................... 20 Figura 9 Formula di struttura del Fulvestrant ............................................................................ 24 Figura 10 Interazioni tra il ligando naturale 17-β-estradiolo ed il recettore ER-α..................... 25 Figura 11 Binding mode di E2 e Raloxifene con ER-α .............................................................. 27 Figura 12 Strutture dei composti usati nel Training e nel Test set............................................. 35 Figura 13 Grafico delle attività osservate e predette.................................................................. 39 Figura 14 Hypo7: features e mapping del composto più attivo del Training set ....................... 40 Figura 15 Hypo7: Disposizione spaziale delle features ............................................................. 41

Abstract

Un modello farmacoforico tridimensionale per il recettore alfa degli estrogeni (ER-α) è stato sviluppato usando il software CATALYST®, con la possibilità di individuare nuovi inibitori del target cellulare attraverso il virtual screening. Molecole con possibile attività antiestrogenica (24 composti), con diverse proprietà strutturali, e con valori di attività, espressi in IC50, compresi tra 0.02 e 267.4 µM per la lina cellulare MCF-7 (adenocarcinoma delle ghiandole mammarie), sono stati selezionati per comporre il Training set. La generazione dell' ipotesi è stata eseguita in HypoRefine utilizzando il Training set selezionato ed inserendo le seguenti features: HBD (Hydrogen Bond Donor), HBA (Hydrogen Bond Acceptor) HYDROPHOBIC, HYDROPHOBIC Aromatic e RING AROMATIC ed un valore di Uncert di 1.5. La migliore ipotesi trovata (Hypo 7) ha mostrato un coefficiente di correlazione (r2) di 0.955 un RMSD pari 2.6 ed un costo totale di 81.2. Hypo 7 è stata validata per mezzo di un Test set formato da 29 composti mostrando correlazione (r2) pari a 0.914 tra attività sperimentale e stimata. L'ipotesi generata è in grado di discriminare in modo corretto tra molecole attive ed inattive. Le features chimiche che rappresentano il modello esprimono perfettamente il binding mode sperimentale dei ligandi all’interno della tasca recettoriale di ER-α. Per questa serie di interessanti caratteristiche scaturite dall'analisi dell'ipotesi numero 7 (Hypo 7) proponiamo la possibilità di usare il modello come primo passo per la possibile identificazione di inibitori più potenti e con livelli di tossicità più bassi per il recettore degli estrogeni (ER-α) nei tumori ormone-dipendenti come quello delle ghiandole mammarie caratterizzato nella linea cellulare MCF-7.

Introduzione

Neoplasie delle ghiandole mammarie sono tra le più comuni che vengono diagnosticate tra le donne, soltanto negli Stati Uniti l'American Cancer Society ha osservato nel 2004 che approssimativamente i medici hanno diagnosticato ad oltre 215.000 donne un cancro al seno in uno stadio invasivo (Stages I-IV) e di queste almeno 40000 persone sono decedute. Su scala mondiale esistono previsioni che parlano di circa cinque milioni di donne che svilupperanno questo tipo di patologia nel prossimo decennio.1 Oggi, la malattia, come tutte le altre forme di cancro, è considerata essere il risultato finale di numerosi fattori sia ambientali che ereditari:

•

Esposizione agli estrogeni, correlata sperimentalmente alle mutazioni che provocano il carcinoma mammario.

•

Fallimento dell'immunosorveglianza che normalmente blocca i tumori maligni ad una fase precoce della loro storia naturale.

•

Anomalia nel segnale dei fattori di crescita nell'interazione fra le cellule connettive e le cellule epiteliali, come ad esempio nel processo dell'angiogenesi necessaria a favorire la crescita di nuovi vasi sanguigni in prossimità di nuovi tumori.

•

Difetti congeniti nei geni implicati nella riparazione del DNA, come BRCA1, BRCA2 e P53.

In molti casi questo tipo di patologia risulta essere ormone dipendente come riportato nel primo punto; gli estrogeni sono componenti indispensabili per la cellula che ha subito una trasformazione neoplastica. Con la produzione di questi ormoni le cellule trasformate iniziano una errata

segnalazione verso le cellule circostanti e gli estrogeni prodotti in eccesso sono in grado di produrre un effetto mitogenico sui tessuti che raggiungono. Prima di andare oltre con l'esposizione, è essenziale soffermarsi e capire meglio quale ruolo ricoprono gli estrogeni nell’organismo umano.

Gli Estrogeni ed i loro recettori

Gli estrogeni, sono una classe di ormoni sessuali steroidei che sono sintetizzati a partire dal colesterolo nelle ovaie con un contributo notevole da parte della placenta, tessuto adiposo e delle ghiandole surrenali.2 Troviamo questi ormoni correlati strutturalmente in molteplici isoforme. Tuttavia, il più abbondante ed il più attivo estrogeno endogeno è il 17-β-estradiolo (E2)3 (Figura 1) che esercita il suo effetto grazie al legame diretto con il recettore degli estrogeni (ERs-α e β).

Figura 1 Biosintesi del 17-β-estradiolo (E2).

Gli estrogeni, sono essenziali per il funzionamento del sistema riproduttivo femminile e sono indispensabili per la proliferazione e la differenziazione dell'epitelio mammario.4 I composti estrogenici hanno anche effetti benefici sul cuore,5 e sulla struttura ossea dell'organismo umano, mantenendo la densità ossea e riducendo il rischio di fratture.6 Esistono molte prove evidenti che questi composti influenzano i centri cerebrali che sono deputati al mantenimento e alla regolazione della temperatura corporea.7 L’importanza degli estrogeni nell’organismo di una donna è tangibile al momento della menopausa, la diminuzione di estrogeni innesca una serie di disagi come ad esempio l’iperidrosi notturna associata a piccoli shock termici ma anche a cambiamenti molto più seri nel sistema cardiovascolare come l’incremento del colesterolo (LDL) nel circolo sanguigno e la maggiore probabilità di essere colpiti da attacchi di cuore. La diminuzione dei composti estrogenici all’interno del corpo umano provoca anche una diminuzione della densità ossea con l’insorgenza di patologie come l’osteoporosi. Tutti questa sintomatologia, nel periodo post-menopausa derivante da una carenza di estrogeni può essere tenuta sotto controllo grazie alla terapia ormonale sostitutiva (HRT, hormon replacement teraphy). Con l’ausilio di questa terapia si hanno effettivamente dei miglioramenti per quanto riguarda l’insorgenza delle patologie sopra descritte.8 Purtroppo, questa serie di benefici vengono molto spesso messi in ombra dai rischi che l’assunzione di estrogeni comporta. La letteratura scientifica, ci informa della correlazione esistente tra l’assunzione di estrogeni nel periodo post-menopausale e il rischio di insorgenza del cancro alla mammella e all’utero.9-10 Ci sono molteplici eventi che evidenziano come il cancro alla mammella sia in stretta correlazione con gli steroidi prodotti dall’apparato genitale femminile che hanno un ruolo di fondamentale importanza nello sviluppo e nella progressione delle neoplasie al seno, con il rischio di sviluppare metastasi sia per l’esposizione ad estrogeni endogeni che esogeni.11 Il carcinoma mammario è stato il primo ad essere riconosciuto come una patologia ormone-dipendente dal medico inglese George Beatson che nel 1896, dimostrò come l’asportazione totale delle ovaie

(ovariectomia) induceva una regressione dei tumori mammari in un gruppo di pazienti nel periodo pre-menopausa.12 Da questo momento in poi, le osservazioni cliniche ed epidemiologiche si sono moltiplicate anche grazie all’ausilio di colture di cellule in vitro. Con il proseguimento degli studi, gli estrogeni sono stati individuati come uno dei principali fattori che determinano l’insorgenza e/o la progressione del cancro alla mammella.13-14 Gli estrogeni, attraverso recettori che mediano il processo, sono in grado di stimolare la proliferazione sia delle cellule normali sia delle cellule trasformate attraverso l’induzione di proteine implicate nella sintesi degli acidi nucleici e la conseguente attivazione di geni che regolano le divisioni cellulari. L’aumento della proliferazione cellulare può incrementare le possibilità per quanto riguarda gli errori di riparazione nel DNA con il risultato di un accumulo di mutazioni. Questi cambiamenti nella doppia elica di acido nucleico possono contribuire alla progressione da una cellula normale ad una cellula iperplastica fino ad arrivare alla cellula neoplastica. Esistono evidenze scientifiche che specifici metaboliti degli estrogeni chiamati catecol-estrogeni 3,4-chinoni (CE-3,4-Q) sono in grado di formare addotti sul DNA che possono portare a mutazioni che innescano la cascata di eventi che può culminare con la trasformazione cellulare.15-16 Gli addotti sul DNA funzionano in maniera simile a delle maschere, che rendono difficoltosa la lettura della sequenza nucleotidica delle basi che compongono il DNA da parte degli enzimi che devono trascriverlo o replicarlo per permettere la proliferazione cellulare. In questo modo, il DNA non viene trascritto o copiato correttamente e si vengono a formare degli errori, indicati con il termine mutazioni, che consistono in alterazioni nella sequenza del genoma. Inoltre, queste alterazioni nella conformazione della catena di acido nucleico impediscono agli apparati di riparazione della cellula di correggere le mutazioni, non solo quelle dovute direttamente agli addotti, ma anche quelle generate da altri agenti cancerogeni, come ad esempio le radiazioni ultraviolette. L’impossibilità a causa degli addotti di effettuare le correzioni conduce

irreversibilmente ad un accumulo di mutazioni il cui effetto se si verificano a carico di determinati geni critici, si manifesta con la trasformazione in cellule tumorali.16 Gli estrogeni endogeni, esercitano la loro funzione modulatoria attraverso il legame con proteine comunemente chiamate recettori per gli estrogeni (ERs). Questa interazione induce un cambio conformazionale nella struttura proteica del recettore che permette la sua omodimerizzazione e la successiva interazione con molecole che fungono da coattivatori (Figura 2).17-18 La seguente attivazione trascrizionale dei geni responsivi avviene attraverso l’interazione diretta del complesso formato dal ligando, dai coattivatori e dall’omodimero proteico con la porzione del DNA definita estrogen response elements (EREs) che si trova nella regione promotore del gene. L’attivazione trascrizionale di questa regione di acido nucleico può anche avvenire indirettamente a causa di legami con altri fattori di trascrizione.17-19-20-21-22-23

Figura 2 Il ligando mostra i suoi effetti quando si lega al recettore per gli estrogeni inducendo un cambio conformazionale nella struttura proteica rendendone possibile la dimerizzazione e l’interazione con molecole che fungono da coattivatori.

I recettori per gli estrogeni (ERs) sono membri di una superfamiglia di recettori nucleari inducibili per mezzo di un ligando ed agiscono come fattori di trascrizione mediando in questo modo gli effetti biologici dell'ormone steroideo.24 Esistono due isoforme del recettore (ER-α e ER-β): ER-α è principalmente espresso nel tessuto mammario, nel tessuto uterino e nella vagina; mentre alti livelli della isoforma ER-β sono stati rintracciati nel sistema nervoso centrale, nel sistema cardiovascolare nell’apparato gastrointestinale, nel sistema immunitario, nei reni, nei polmoni e nelle ossa.25 Composti in grado di interagire e modulare l’attività trascrizionale del recettore alfa per gli estrogeni sono impiegati nel trattamento di importanti patologie come l’osteoporosi, malattie cardiovascolari e tumori al seno.26 L’esistenza di due distinti domini tissutali di espressione per le due isoforme alfa e beta potrebbe suggerire che le due isoforme abbiano affinità diversa per ligandi specifici, ma ancora il ruolo di questa diversa distribuzione rimane da chiarire.27 Entrambi i recettori sia alfa che beta possono essere suddivisi in domini funzionali distinti (Figura 3): nella parte N-terminale è presente un dominio di transattivazione (AF-1), a seguire è presente una regione che lega il DNA (DNA-Binding Domain), vi è poi la regione che lega l'ormone (LigandBinding Domain LBD); a questa regione appartiene anche la superficie dove avviene la dimerizzazione; ed infine sulla catena proteica esiste un secondo dominio detto di transattivazione (AF-2), che è localizzato nella parte C-terminale in prossimità del dominio che lega l'ormone. Molte proteine che interagiscono con i recettori per gli estrogeni (ERs) mostrano una preferenza per uno dei due domini di transattivazione AF-1 o AF-2, e attraverso questi viene mediata l'azione del recettore. Il legame dell'ormone con il recettore induce un cambio conformazionale in quest'ultimo e inizia una serie di eventi all’interno della cellula che culminano come già detto con l'attivazione o la repressione di geni responsivi.24-28

Figura 3 Schema dell’organizzazione dei due recettori per gli estrogeni nell’uomo ER-α e ER-β. Entrambi i recettori constano di sei domini funzionali, incluso il DNA-Binding Domain (DBD), il Ligand Binding Domain (LBD), e i due domini di transattivazione AF-1 (ligando indipendente) e AF-2 (ligando dipendente).29

Le due isoforme mostrano una sorprendente omologia di sequenza nei domini funzionali. ER-α e ER-β hanno il 97 % di omologia nel dominio DBD (DNA Binding Domain) e sono identici per il 59% nella regione LBD (Ligand Binding Domain) (Figura 3).30 La regione del legame con i ligandi (LBD) riconosce numerosi composti differenti per forma, taglia, funzione e proprietà chimiche.31 Sul solito sito di legame possono interagire sia gli agonisti come il ligando endogeno 17-βestradiolo o l’estrogeno sintetico dietilstilbestrolo (DES) anch’esso agonista, ma anche altre classi di composti antagonisti come ICI-164,384.30 La possibilità di cercare antagonisti in grado di interagire con i recettori estrogenici ha aperto una strada per la ricerca di composti in grado di modulare l’attività di ER-α e ER-β. I ligandi ottenuti per via sintetica vengono definiti come SERMs (Selective Estrogen-Receptor Modulators).32 Questo termine, indica la loro abilità ad agire come agonisti estrogenici in particolari tessuti (ossa, fegato e sistema cardiovascolare) e come antagonisti in altri tessuti dell’organismo (ghiandole mammarie e cervello) mentre nell’utero possono svolgere la loro funzione sia come agonisti che come antagonisti.33-34 Il Tamoxifen (di cui

parlerò dettagliatamente in seguito), ad esempio, espleta la sua azione antagonista nel tessuto mammario bloccando la proliferazione cellulare in pazienti affetti da adenocarcinoma delle ghiandole mammarie ma riveste una funzione da agonista nel tessuto uterino e compie la sua azione stimolatoria provocando in alcuni casi nei pazienti trattati con il farmaco lo sviluppo di neoplasie (come il carcinoma dell'endometrio).35 Esistono due differenti fattori di attivazione (AFs Activation Factors) che mediano l’attivazione trascrizionale di ER-α: AF-1 nella parte N-terminale e AF-2 nella zona del legame con il ligando (LBD) (Figura 3). L’attività di AF-1 è regolata attraverso i fattori di crescita che sono coinvolti nella pathway cellulare definita delle MAP kinase (Mitogen Activated Protein).36 Mentre l’attività di AF-2 è regolata per mezzo del legame con il ligando.37 Numerosi studi strutturali suggeriscono che i ligandi sono in grado di regolare l’attività di AF-2 alterando la struttura del sito di legame per il ligando stesso (LBD) al momento della loro interazione. Come conseguenza di questa interazione si verifica un cambio conformazionale all’interno del dominio funzionale AF-2. Comparazioni di strutture tra LBDs senza ligando e quelle in cui un agonista occupa il sito di legame dimostrano, come l’agonista sia in grado di indurre un cambio conformazionale che comporta il riposizionamento dell’alfa elica numero 12, che risulta essere essenziale per l’attività di AF-2 (Figura 4).38 La cristallizzazione delle strutture di ER-α, il Ligand Binding Domain (LBD) con il 17-β-estradiolo (E2) e con un farmaco antagonista derivato dal Tamoxifen mostra come i due composti interagiscono nel solito sito nella porzione denominata LBD ma ogni ligando induce un differente cambio conformazionale dell’elica numero 12. L’alterazione dell’alfa elica numero 12 da parte dell’agonista produce come già detto un cambio conformazionale che va a nascondere quei residui aminoacidici che sono necessari per AF-2, suggerendo così che in generale gli antagonisti, bloccano la funzionalità di AF-2 sopprimendo la sua conformazione funzionale che il dominio assume nella parte più superficiale della proteina recettoriale.39

Figura 4 (a) LBD (Ligand Binding Domain) di ER-α senza ligando, (b) LBD (Ligand Binding Domain) di ER-α con la presenza di un ligando agonista, (c) LBD (Ligand Binding Domain) di ERα con la presenza di un ligando antagonista. Viene evidenziato il riposizionamento che l’alfa elica numero 12 (H 12 in rosso) compie in presenza di un agonista e di un antagonista e il movimento del loop evidenziato nella figura b.40 Come specificato dalla Figura 2 molte proteine sono in grado di associarsi in maniera dipendente dal ligando con i recettori per gli estrogeni (ERs). Queste proteine vengono indicate come coattivatori trascrizionali perché amplificano l’attivazione trascrizionale dovuta alla dimerizzazione di ER-α e ad altri recettori nucleari.41-42 I coattivatori trascrizionali SRC-1 (Steroid Receptor Coactivator-1) e GRIP-1 (Glutamate Receptor Interacting Protein 1) si legano alla regione LBD (Ligand Binding Domain) di ER-α usando apparentemente l’interazione sulla superficie del recettore.43 Questi coattivatori (SRC-1 e GRIP1) si legano nella regione LBDs attraverso il riconoscimento di una piccola sequenza di aminoacidi LXXLL (dove L è la Leucina ed X un

qualunque aminoacido); questo corto motivo viene solitamente indicato con il nome di NR-box.44 Appare così molto importante per la farmacologia degli estrogeni non solo prendere in considerazione l’interazione del ligando con ERs, ma anche prestare attenzione agli elementi che promuovono la trascrizione sul promotore del gene bersaglio e le proteine coregolatorie.45 I recettori per gli estrogeni sono in grado di interagire con il gene bersaglio legandosi direttamente al DNA nella regione definita DNA response elements o attraverso un legame indiretto mediato anche da altri fattori di trascrizione. Prendendo in considerazione tutti questi numerosi fattori, è stato dimostrato che possono esistere numerose combinazioni in ogni tessuto sulla regolazione specifica del gene bersaglio da parte dei composti definiti come SERMs. Per esempio Shang e Brown hanno osservato che l’azione agonista del Tamoxifen nel tessuto uterino potrebbe essere specificatamente attribuita al coattivatore SRC-1, il quale è presente in alte concentrazioni in questa sede, mentre in altri distretti dell’organismo, come nelle cellule provenienti dalle ghiandole mammarie (dove il farmaco Tamoxifen espleta la sua funzione antagonista) è espresso in concentrazioni di gran lunga inferiori.23 Quindi, l’attività agonista del Tamoxifen nell’utero è il risultato di una combinazione tra la conformazione del complesso ligando recettore, l’interazione indiretta con la regione promotore ed il livello elevato di uno specifico coattivatore. Questa attività estrogenica, potrebbe essere dunque il maggior contributo agli effetti carcinogenici del farmaco nell’endometrio.23

Selective Estrogen Receptor Modulator (SERMs)

Composti come il Tamoxifen sono meglio conosciuti con l’acronimo SERMs. Il Tamoxifen è il farmaco usato contro neoplasie delle ghiandole mammarie; questo composto è il primo che è stato usato per curare questo tipo di patologie fino dai primi anni settanta, ma visti gli effetti collaterali a volte anche gravi che genera, la ricerca ha tentato di trovare altri ligandi verso il recettore degli estrogeni che avessero minori effetti dannosi sull’organismo. Esistono oggi diverse categorie di SERMs suddivisi in prima, seconda, terza e quarta generazione dato il progressivo sviluppo teso ad apportare un miglioramento nei benefici e una riduzione degli effetti collaterali associati con i SERMs meno recenti.30 Come già illustrato precedentemente il prototipo SERM per eccellenza è il Tamoxifen e i suoi derivati: Toremifene, Droloxifene e Idoxifene, appartengono alla classe chimica dei derivati del trifeniletilene (figura 5A). La seconda generazione di SERM ha origine dal benzotiofene e vede come composto principale il Raloxifene da cui poi sono stati ottenuti alcuni derivati (Figura 5B). Anche la terza generazione di SERM ha come scaffold di riferimento il benzotiofene. Tra i SERMs di terza generazione ricordiamo il composto denominato Arzoxifene (Figura 5B); mentre la quarta generazione di SERM, di cui fa parte l’Alcobifene, è costituita da derivati del benzopirano (Figura 5C).35

Figura 5 Formule di struttura dei SERMs. (A) SERMs derivati dal trifeniletilene, (B) SERMs derivati dal benzotiofene, DMA (desmethylated Arzoxifene), (C) SERMs derivati dal benzopirano.35 SERMs derivati dal Trifeniletilene

I SERMs derivati dal trifeniletilene hanno molteplici usi nel trattamento di tumori ormonedipendenti delle ghiandole mammarie. Il composto denominato come Tamoxifen (Novaldex) è stato all’inizio del 1970, il primo farmaco somministrato per via orale utilizzato anche in pazienti con casi di tumori al seno complicati da metastasi.46 Sperimentazioni su larga scala sono iniziate verso la fine degli anni settanta e nei primi anni ottanta, anche per verificare se il Tamoxifen avesse proprietà antitumorali quando veniva somministrato come adiuvante nelle fasi precoci della

malattia. Nel 1992, negli U.S.A.: è partita anche la sperimentazione clinica del Tamoxifen come chemiopreventivo: è infatti stato impiegato per la prevenzione della malattia in donne potenzialmente a rischio di neoplasie al seno. L’incidenza di tumori al seno è notevolmente diminuita ma visti gli effetti collaterali riportati da numerosi report che hanno enfatizzato l’incremento di patologie neoplastiche dell’endometrio si è parlato solo di effetti negativi.47-48 Il tipo di problematica che è stato incontrato durante questa fase di sperimentazione clinica ha consegnato all’attenzione dei medici il dilemma:” i rischi valgono i benefici per questo farmaco?”.49 In seguito sugli effetti collaterali legati all’utilizzo del Tamoxifen sono stati effettuati ulteriori studi prendendo in considerazione modelli animali, ed i dati che sono stati osservati hanno indicato che il farmaco non è sicuro quando viene usato per trattare i pazienti con patologie cronicizzate. Ad esempio, un uso prolungato del Tamoxifen può portare all’insorgenza di neoplasie a carico del fegato come l’epatocarcinoma,50 frequenti e specifiche mutazioni nel gene tumorsoppressore P53 51 e tumori mammari ormone-indipendenti negli studi condotti sui ratti.52 I derivati del trifeniletilene (Figura 4A) con piccoli cambi strutturali sono comparabili al Tamoxifen e sono attualmente in uso per il trattamento delle patologie neoplastiche a carico del tessuto mammario. Il Droloxifene, il quale ha gruppo ossidrile in posizione 3 rispetto al Tamoxifen, mostra attività antiestrogenica in vitro, che è equivalente o di poco migliore rispetto al Tamoxifen.53 Il Droloxifene, però a differenza del Tamoxifen non sembra indurre tumori al fegato nei ratti e nessun addotto con la catena del DNA è stato rintracciato dopo l’utilizzo di questo analogo.54 In maniera del tutto similare il derivato 4-iodo del Tamoxifen, denominato Idoxifene, ha una attività antiestrogenica del tutto comparabile con gli altri composti appena descritti e anch’esso non genera effetti carcinogenici nel fegato nei ratti.55 Anche il Toremifene (Fareston), è in grado di esercitare un effetto antiestrogenico nel tessuto mammario e ha anche effetti positivi sulla densità ossea; però, come il Tamoxifen, ha un effetto agonista sulle cellule dell’endometrio e attualmente viene usato

solamente nelle donne che hanno il tumore al seno in fase metastatica.30 Anche il Toremifene è in grado di formare addotti del DNA nei ratti ma a livelli significativamente più bassi del Tamoxifen.56 L’utilizzo di Toremifene ha una minore effetto estrogenico sull’endometrio rispetto al Tamoxifen. L’indice di insorgenza (per 1000 pazienti/anno) di patologie neoplastiche a carico del tessuto uterino (carcinoma dell’endometrio) nei pazienti curati con il Toremifene è 1.14 mentre per i pazienti sottoposti al trattamento con il Tamoxifen è circa il doppio (2.0).57

SERMs derivati dal Benzotiofene

Grandissimo ottimismo ha circondato la scoperta di un’altra classe di SERMs, derivante dal benzotiofene (Figura 5B).58 L’entusiasmo è nato dal fatto che gli studi su questa linea di composti hanno rivelato che non possiedono attività estrogenica nell’utero ma appaiono come potenti antiestrogeni nel tessuto mammario.33-34 Il Raloxifene (Evista) è in uso come farmaco contro l’osteoporosi negli stadi di post-menopausa, ed è al centro di uno studio definito STAR (Study of Tamoxifen and Raloxifene) per comparare la sicurezza e l’efficacia di questi due composti quando vengono utilizzati per la prevenzione del tumore al seno nelle donne dopo la menopausa.59 I primi dati disponibili sullo studio hanno rivelato che il Raloxifene, così come il Tamoxifen, usato come farmaco chemiopreventivo, riduce di moltissimo il rischio di sviluppare neoplasie al tessuto mammario nelle donne dopo la menopausa e gli effetti collaterali sono molto ridotti rispetto all’uso del Tamoxifen.60 Il Raloxifene però non viene coinvolto nel trattamento chemioterapico contro il cancro al seno vista la minore efficacia rispetto al Tamoxifen negli stadi avanzati della patologia.61 Il Raloxifene, è attualmente inserito in un protocollo di sperimentazione (RUTH Raloxifene Use for The Heart trial) per prevenire malattie cardiovascolari, ed il rischio di tumori maligni al seno nelle donne dopo la menopausa che hanno patologie a carico del sistema cardiocircolatorio. I primi

risultati che sono stati osservati, ci indicano che il Raloxifene non è in grado di ridurre le malattie che interessano il sistema cardiocircolatorio, ma sembra essere un potenziale farmaco chemiopreventivo visto che riduce il rischio di sviluppare neoplasie a carico delle ghiandole mammarie.62 Un altro membro di questa famiglia di SERM, è il composto denominato Arzoxifene. Questo farmaco, dai dati riportati in letteratura sembra essere un chemioterapico che mostra degli effetti indesiderati di minore entità rispetto al Raloxifene.63-64 Oltre a ciò, a differenza del Tamoxifen, l’Arzoxifene agisce da antagonista anche nell’utero; infatti è attualmente in fase II di sperimentazione clinica in pazienti con patologie di tipo neoplastico a carico del tessuto uterino; i primi dati disponibili mostrano risultati incoraggianti anche in pazienti in cui la patologia è presente in uno stadio avanzato.65 Anche il suo utilizzo contro tumori al seno con complicazioni dovute a metastasi è in fase III di sperimentazione clinica. I primi risultati dimostrano che l’Arzoxifene ha un tempo di azione di gran lunga superiore al Tamoxifen considerando il tempo che trascorre dal primo trattamento della patologia, al momento in cui si osserva una prima risposta positiva.66 Negli esperimenti effettuati in vitro sulle linee cellulari erano stati osservati invece degli effetti antiproliferativi di gran lunga superiori a quelli rilevati quando veniva usato il Tamoxifen. Entrambi, Arzoxifene ed il suo metabolita DMA, mostrano l’elevata affinità che hanno nel legarsi ai recettori degli estrogeni (ERs) e la capacità che hanno di inibire la linea cellulare estrogeno dipendente MCF-7 (adenocarcinoma delle ghiandole mammarie).67-68 I saggi su questa linea condotti da Suh et al. riportano che il composto Arzoxifene ha una capacità di inibire la massa neoplastica molto più spiccata del Tamoxifen. Infatti i valori riportati di IC50 (Inhibitory concentration 50 %) mostrano che il composto Arzoxifene ha un valore di IC50 pari a 0.4 nM (circa come il Raloxifene), il Tamoxifen ha una IC50 pari a 480 nM, il metabolita attivo del Tamoxifen, il 4-hydroxytamoxifen, ha la IC50 pari a 1.2 nM, ed il più potente tra i SERMs testati, il composto noto come DMA, ha un valore di IC50 di 0.05 nM.67

SERMs derivati dal Benzopirano

I composti che appartengono a questa famiglia sono anche noti come SERMs di quarta generazione (Figura 4C). Derivano da uno scaffold di benzopirano ed il più conosciuto è l’Alcobifene (EM-652) che è un derivato del composto EM-800. Questo farmaco, è un potentissimo antiestrogeno in grado di inibire sia ER-α che ER-β.68 Il composto EM-800 è estremamente potente nell’inibire la proliferazione di linee cellulari derivanti da tumori al seno e all’utero.69-70-71 Il composto EM-800, è in grado di prevenire l’osteoporosi e malattie cardiovascolari nei ratti.72

Bioattivazione dei SERMs

Dopo le considerazioni su queste famiglie di composti, passiamo ad analizzare come essi vengono attivati all’interno dell’organismo umano. Esistono almeno quattro classi di metaboliti elettrofili che si possono formare dai SERMs (Selective Estrogen Receptor Modulator): carbocationi, chinon metide, dichinon metide e o-chinoni. I derivati del trifeniletilene come il Tamoxifen (Figura 4A) vengono idrossilati dal citocromo P450 (3A, 2D6, 2C9, 1A1, 1A2 e 1B1)73 nella posizione α. I derivati del trifeniletilene possono anche accettare l’ingresso di un sostituente solfato la cui successiva perdita, genera un carbocatione altamente reattivo che è in grado di interagire con il DNA (Figura 6).74

Figura 6 Il Tamoxifen viene idrossilato dal citocromo P450 nella forma 4-hydroxytamoxifen che puĂ˛ essere convertito con un meccanismo ossidativo a chinon metide. Alternativamente, il 4hydroxytamoxifen puĂ˛ subire una ulteriore idrossilazione alla posizione 3 ottenendo il 3,4dihydroxytamoxifene, che viene ossidato a o-chinone. La formazione del carbocatione si ottiene dopo la dissociazione del gruppo solfato dal composto.

La seconda pathway riguarda l’attivazione dell’Alcobifene (derivato del benzopirano) (Figura 7). Anche questo SERM è convertito a chinon metide ed a dichinon metide dal citocromo P450. Il chinon metide derivato dall’Alcobifene possiede un’emivita decisamente breve (32s)75 se la paragoniamo all’emivita del chinon metide derivato dal 4-hydroxytamoxifene(3h)76 ma non così breve come quello derivato dal Raloxifene (1s).77

Figura 7 L’Alcobifene è convertito in due classici chinoni dal citocromo P450.

I SERMs conosciuti come Raloxifene e il DMA, possono essere convertiti a dichinon metide (Figura 8).77-78 I metaboliti del Raloxifene sono implicati nell’inibizione irreversibile del citocromo P450 nella sua isoforma 3A4 e nell’alchilazione di numerose altre proteine microsomiali nel fegato.79 Questo dato suggerisce che la bioattivazione del Raloxifene da parte del citocromo P450

porta alla formazione di un intermedio elettrofilo che lega covalentemente il recettore per gli estrogeni ER-Îą modificandolo irreversibilmente.80

Figura 8 Il Raloxifene viene ossidato dal citocromo P450 producendo un dichinon metide e un o-chinone.

(uovi composti contro i tumori ormone-dipendenti

Nell’ultimo decennio oltre ai SERMs, sono stati sviluppati tutta una serie di composti con caratteristiche differenti che non possono essere inclusi in questa categoria visto il diverso meccanismo di azione rispetto ai composti fino a qui descritti. Composti come il Fulvestrant (Falsodex) agiscono sul recettore degli estrogeni ER-α ma con una modalità totalmente diversa da ogni SERMs conosciuto fino ad oggi. Altri composti come l’Anastrozolo (Arimidex) appartengono ad un’altra categoria di farmaci noti come inibitori dell’enzima aromatasi. Visto che non interagiscono direttamente con il recettore per gli estrogeni ER-α, questi composti non ricoprono interesse in questa trattazione, quindi mi limiterò solo ad accennare alla loro azione. Il ruolo di questi composti è quello di inibire le pathway metaboliche che portano alla biosintesi degli ormoni steroidei nelle cellule neoplastiche. Visto che ormai è stato definitivamente riconosciuto che gli estrogeni svolgono un ruolo cruciale nella genesi e nello sviluppo del carcinoma mammario, si è pensato a come inibire la loro sintesi. L'aromatasi è un enzima della famiglia del citocromo P450, che catalizza la reazione di sintesi degli estrogeni a partire dagli androgeni (in particolare produzione di estrone da androstenedione e di estradiolo da testosterone in Figura 1). L'aromatasi è presente nelle cellule della granulosa dei follicoli ovarici, e, in modo meno rilevante, nel grasso sottocutaneo, nel fegato e nel muscolo. La produzione di estrogeni nelle donne in postmenopausa è da ascrivere quasi completamente all'azione delle aromatasi periferiche (cioè non ovariche). Un ruolo determinante è svolto in questo senso dalle aromatasi del grasso sottocutaneo: esiste infatti una relazione diretta tra body-mass index e livelli ematici di estrogeni in donne in postmenopausa. La maggior parte dei carcinomi

mammari esprimono un'attività aromatasica intratumorale. Tale attività condiziona fortemente i livelli intratumorali di estrogeni (giustificando una concentrazione di estradiolo, all'interno del tessuto tumorale, superiore talora di 10 volte ai valori plasmatici).81 Gli inibitori dell'aromatasi inibiscono o inattivano l'enzima aromatasi, determinando conseguentemente una soppressione totale della sintesi di estrogeni, in particolare nelle donne in postmenopausa. Gli inibitori dell'aromatasi hanno una azione antiestrogenica totale e dunque sono privi dell'attività agonistica parziale propria del Tamoxifene, responsabile sì di un effetto protettivo a livello di mineralizzazione ossea, ma anche di un aumentato rischio di neoplasie uterine e di tromboembolie venose. Gli inibitori dell'aromatasi sono classificati in inibitori di tipo 1 (o inattivatori enzimatici steroidei: sono steroidi analoghi dell'androstenedione, che si legano irreversibilmente al medesimo sito della molecola dell'aromatasi) ed in inibitori di tipo 2 ( o inibitori enzimatici non steroidei: sono sostanze a struttura non steroidea, che si legano reversibilmente al gruppo eme dell'enzima aromatasi).82 Il primo inibitore dell'aromatasi utilizzato nella pratica clinica è stata l'aminoglutetimide, farmaco inizialmente usato come anticonvulsivante. L'impiego della aminoglutetimide nella terapia del carcinoma mammario è stato via via abbandonato per la sua azione inibitoria globale sulla steroidogenesi surrenalica ("adrenalectomia chimica"). Il principale inibitore dell'aromatasi di seconda generazione è rappresentato dal formestane. Il formestane è un composto appartenente agli inibitori di tipo 1 (inattivatori enzimatici). Si tratta di una molecola dotata di buona efficacia clinica, il cui limite è rappresentato principalmente dalla via di somministrazione (iniezione intramuscolare). Gli inibitori dell'aromatasi di terza generazione sono rappresentati dall'Anastrozolo (Arimidex), dal Letrozolo (Femara) e dall'Exemestane (Aromasin). Tali composti non influenzano in modo significativo la steroidogenesi surrenalica (e non modificano quindi i livelli basali di cortisolo ed

aldosterone) ed hanno il vantaggio di poter essere somministrati per via orale. L'Anastrozolo ed il Letrozolo sono inibitori dell'aromatsi di tipo 2 (inibitori non steroidei). Essi hanno una emivita plasmatica di circa 48 ore. L'Exemestane è invece un inibitore dell'aromatasi di tipo 1 (inattivatore steroideo). La sua emivita plasmatica è di 27 ore. Gli inibitori dell'aromatasi di terza generazione hanno dimostrato negli studi preclinici una elevata potenza (superiore di tre ordini di grandezza rispetto a quella dell'aminoglutetimide), associata ad una buona tollerabilità.81 L'utilizzo degli inibitori dell'aromatasi è controindicato: nelle pazienti in premenopausa visto che gli inibitori dell'aromatasi inducono, nelle donne in premenopausa, un aumento della secrezione di gonadotropine, a causa del ridotto feedback degli estrogeni a livello ipotalamico ed ipofisario. In alcuni esperimenti su animali, gli inibitori dell'aromatasi determinano in premenopausa un aumento delle dimensioni e del peso delle ovaie.82 Nelle pazienti con recettori ormonali negativi: le donne con carcinomi mammari che risultano privi di recettori per gli estrogeni sono usualmente non responsive ai trattamenti ormonali. Gli inibitori dell'aromatasi hanno dimostrato una elevata efficacia nel trattamento (terapia neoadiuvante, terapia adiuvante, terapia di prima e seconda linea del carcinoma avanzato) delle neoplasie mammarie con recettori estrogenici positivi, in donne in postmenopausa. La loro buona tollerabilità li rende farmaci discretamente maneggevoli ed adatti, almeno per quanto fino ad oggi noto, a trattamenti prolungati.81-82 Esiste invece un altro composto come indicato in precedenza denominato Fulvestrant (Figura 9) che invece espleta la sua azione legandosi ad ER-α ma non si comporta come un SERM. Infatti, il Fulvestrant è il primo di una nuova classe di agenti endocrini antagonisti del recettore per gli estrogeni ER-α che non ha alcun tipo di effetto agonista nei vari distretti dell’organismo.

Figura 9 Formula di struttura del Fulvestrant

Questo farmaco è un analogo steroideo del 17-β-estradiolo (E2) che è in grado di legarsi ad ER-α con una affinità superiore di cento volte rispetto al Tamoxifen.83 Una volta che il composto si lega al recettore ne impedisce la dimerizzazione e il suo ingresso nel nucleo.84 Il Fulvestrant è anche in grado di accelerare la degradazione del recettore ER-α.85 Fulvestrant riduce i livelli cellulari del recettore e inibisce la trasduzione del segnale mediata dagli estrogeni.86 Il farmaco è in grado di bloccare entrambi i domini di trans attivazione AF-1 e AF-2, con la conseguente inibizione della trascrizione dei geni estrogeno-responsivi. Il Tamoxifen è in grado di bloccare solo il dominio di attivazione AF-2 con una modulazione degli eventi trascrizionali in relazione ai distretti tissutali. Mentre il Fulvestrant può essere definito come un antagonista puro vista la sua azione.87

Binding mode di un ligando con ER-α

Per progettare un farmaco contro il recettore degli estrogeni, è necessario avere la conoscenza di come è strutturato il sito di legame della proteina. L' analisi computazionale con il ligando naturale (il 17-β-estradiolo) all'interno di ER-α ha evidenziato porzioni di assoluta importanza che una molecola deve possedere per avere la probabilità di interagire con il recettore. Importanza cruciale nel legame tra ligando e recettore ricoprono i legami ad idrogeno nelle estremità della tasca

recettoriale. In particolare, ad una estremità della tasca abbiamo due residui, Arg394 e Glu353, in grado di agire rispettivamente da donatore e da accettare di legami ad idrogeno, mentre all’altra estremità, His524 si comporta preferenzialmente da accettore (Figura 10). 39

Figura 10 Interazioni nella cavità recettoriale tra il ligando naturale 17-β-estradiolo ed il recettore ER-α con in evidenza le parti essenziali per avere legami ad idrogeno. La sfere gialle rappresentano aminoacidi nell'enzima in grado di accettare legami ad idrogeno (Glu353 e His524). Le sfere magenta invece indicano la capacità del gruppo in questione (Arg394) di comportarsi come donatore di legami ad idrogeno.39-88-89

La porzione idrofobica intermedia nella tasca del recettore per gli estrogeni (ER-α) forma preferenziali interazioni di tipo nono polare con il ligando esprimibili come derivanti da forze di van der Waals. La cavità dove il 17-β-estradiolo (E2) si lega ad ER-α è completamente separata dall’ambiente esterno ed occupa una porzione abbastanza consistente del centro idrofobico del ligand binding domain (LBD); è localizzata nella parte terminale della macromolecola proteica ed è formata dai residui dell’alpha elica H3 (Met342-Leu354), dell’elica H6 (Trp383-Arg394), dall’elica

H8 ed il loop precedente (Val418-Leu428), dall’elica H11 (Met517-Met528), dall’elica H12 (Leu539-His547), e anche dal loop S1/S2 (Leu402-Leu410). Il riconoscimento dell’ ormone è raggiunto attraverso la combinazione di specifici legami ad idrogeno specifici e la complementarietà della cavità di legame (Figura 11).39 Il 17-β-estradiolo (E2) si lega diagonalmente attraverso la cavità tra le eliche H11, H3 e H6. Il gruppo ossidrile del fenolo sull’anello aromatico denominato con la lettera A nella Figura 11 viene a collocarsi tra le eliche H3 e H6 e sviluppa un legami ad idrogeno con il carbossile dell’aminoacido Glu353, il residuo guanidinico dell’Arg394 e una molecola di H2O. Il gruppo ossidrile sull’anello D del 17-β-estradiolo (E2) dà origine ad un solo legame ad idrogeno con His524 localizzata nell’elica H11. Il resto della molecola è impegnata nel formare un numero di interazioni idrofobiche che sono concentrate principalmente sopra l’anello A/B e quello nominato D. L’anello aromatico A come la parte planare A/B è chiusa come in sandwich tra la catena laterale dell’aminoacido Ala350 e Leu387 su un lato e dalla Phe404 sull’altro lato. All’altra estremità della cavità di legame l’anello indicato con la lettera D sviluppa un contatto di origine non-polare con Ile424, Gly521 e Leu525. La combinazione di specifiche interazioni, polari e non-polari è essenziale affinchè il ligando E2 possa legarsi selettivamente al recettore ER con una affinità subnanomolare rispetto agli altri steroidi endogeni. Studi importanti sul legame di analoghi di E2 ci ha fornito in maniera dettagliata la descrizione delle interazioni necessarie per il legame con il recettore degli estrogeni ER-α.90 Il recettore per gli estrogeni, è l’unico fra i recettori steroidei che ha la capacità di accogliere nel suo sito di legame un’abbondante varietà di ligandi che hanno una origine di tipo non steroidea. Questo è possibile per il fatto che la parte del recettore intorno all’anello A richiede che il ligando in questione abbia per forza un anello aromatico; ma invece la rimanente parte idrofobica della tasca del recettore è in grado di “ospitare” una moltitudine di gruppi non-polari.90-91 Questa promiscuità globale può essere attribuita alla misura della cavità, che possiede un volume accessibile (450 Å3) che è quasi due volte il volume

molecolare di E2 (245 Å3).90

Figura 11 In questa immagine sono rappresentati due composti che danno tipi di interazione diversa con il recettore per gli estrogeni (ER-α). Nella figura (a) è riportata la modalità con cui interagisce il ligando naturale 17-β-estradiolo (E2) in maniera agonista, mentre nella figura (b) possiamo vedere rappresentata la modalità di legame antagonista con cui il Raloxifene si lega nella tasca recettoriale.39

Il Raloxifene è come abbiamo visto dal punto di vista clinico un rilevante antagonista selettivo per ER-α contrastando gli effetti mitogenici del 17-β-estradiolo (E2) nei tessuti riproduttivi, ed è in grado di mantenere gli effetti benefici degli estrogeni in altri distretti.92 Il Raloxifene si lega al medesimo sito di legame (ligand binding domain-LBD) per E2 (Figura 10), con il gruppo ossidrile della parte benzotiofenica che mima l’interazione che avviene con l’ossidrile fenolico dell’anello A del ligando E2. Al contrario il legame del Raloxifene alla parte terminale opposta, quella dove interagisce l’anello indicato con la lettera D del 17-β-estradiolo (E2) tra le eliche H8 e H11 è

nettamente diverso da quello di E2. Qui, un ossidrile fenolico forma il legame ad idrogeno con His524 come E2, ma è spostato di 5.1Å all’interno della tasca. Conseguentemente, l’anello imidazolico di His524 ruota nel complesso con il Raloxifene per compensare il cambiamento nella posizione dell’ ossigeno e mantenere una posizione favorevole per generare il legame ad idrogeno. Il resto della molecola è coinvolto nei contatti non-polari come abbiamo visto per E2. La catena laterale del Raloxifene produce un estensione del contatto idrofobico con le eliche H3 e H5/6 e H11, il loop tra le eliche H11 e H12 del recettore . Il Raloxifene è ancorato alla proteina per mezzo di un legame ad idrogeno diretto tra Asp351 e l’azoto dell’anello piperazinico (Figura 11). La catena laterale del Raloxifene, risulta comunque troppo lunga per essere contenuta entro i confini della cavità di legame, e invece va a sporgere dalla tasca tra le eliche H3 e H11. Questo caso fa da esempio nello studio delle caratteristiche generali di entrambi i tipi di farmaci con attività antiestrogenica di tipo steroideo e non steroideo che possiedono una lunga catena laterale come sostituente. La parte benzotiofenica occupa la stessa posizione spaziale degli anelli A e B di E2. La modalità di legame del Raloxifene, nella parte dello spazio tridimensionale occupata dall’anello D per il ligando E2 , sembra nascere dal risultato di due fattori: l’inflessibilità del core benzotiofenico e dal limitato spazio per la collocazione della catena laterale del farmaco. L’osservazione di come si orientano E2 e il Raloxifene all’interno della tasca di legame dovrebbe consentire il posizionamento della maggior parte dei ligandi per il recettore degli estrogeni.93 Si riporta in letteratura che ulteriori studi strutturali saranno necessari per poter capire sia la “plasticità” della cavità che i possibili binding mode.35

Studi computazionali sui SERMs

In questa tesi proponiamo un modello farmacoforico per il recettore alfa degli estrogeni (ER-α) al fine di avere un punto di riferimento nello sviluppo e/o nella ricerca di nuove molecole attive contro l'adenocarcinoma delle ghiandole mammarie. Questo tipo di approccio è reso possibile dall'introduzione fin dagli anni novanta di metodi computazionali che permettono l'esplorazione insilico di cavità recettoriali attraverso l’analisi comparativa di ipotetici ligandi. Il concetto di farmacoforo è basato sulle possibili interazioni osservate nel riconoscimento molecolare tra farmaco e recettore come per esempio, legami ad idrogeno, interazioni elettrostatiche, ed interazioni idrofobiche. Con un'ipotesi farmacoforica siamo in grado di visualizzare le potenziali interazione tra il ligando e il recettore. Possiamo usare un modello farmacoforico alternativamente o per fare una ricerca in un 3D-database per identificare nuove classi strutturali di composti da usare come potenziali lead compounds, o come un template per generare allineamenti per analisi del tipo 3D-QSAR.94 In letteratura sono recentemente apparsi alcuni studi computazionali finalizzati alla ricerca di nuovi SERMs. In particolare i lavori di Mukherjee et al. nel 2007 hanno riportato un approccio farmacoforico rivolto alla scoperta di nuovi hit da usare come agenti antiestrogenici.95-96 Nei loro studi computazionali effettuati con il software CATALYST, 97 i ricercatori sopra citati hanno preso in esame due differenti classi strutturali di composti per generare due modelli farmacoforici: nel primo approccio farmacoforico si sono occupati di composti derivati dal diariletilene,95 mentre nel secondo studio hanno preso come scaffold di riferimento l’arilbenzotiofene (il core del Raloxifene).96 Quindi i modelli farmacoforici sono stati ottenuti inserendo nel Training set soltanto composti polisostituiti derivanti da un'unica classe strutturale. Questa direzione di ricerca ha portato

ad avere due farmacofori completamente diversi, sia nella composizione che nella disposizione spaziale delle features, anche se entrambi avevano come scopo l’individuazione di nuovi composti con attività antagonista in grado di inibire il recettore per gli estrogeni ER-α. Riteniamo, come verrà documentato ampiamente nelle sezioni che seguono, che una tale modalità di azione non sia la migliore per affrontare uno studio computazionale finalizzato ad ottenere un modello farmacoforico predittivo. Pensiamo infatti in accordo con le linee guida del software usato, che questo per potere lavorare al meglio nel momento in cui genera un farmacoforo debba avere tra gli input, informazione su molteplici classi di molecole (e non solo una classe strutturale!!!!) con il medesimo binding mode all’interno del recettore. Questo è stato il nostro punto di vista quando abbiamo affrontato il progetto di ricerca sui composti con attività antiestrogenica. Il nostro modo di condurre l’indagine su ER-α ci ha visti impegnati a reperire tra gli articoli scientifici già pubblicati tutta una serie di composti con strutture diverse, che sono stati inseriti in CATALYST al fine di conseguire un tool chimico computazionale con un soddisfacente grado di predizione.

Materiali e Metodi

Il modello farmacoforico è stato generato grazie all'ausilio del software CATALYST 4.08

installato su una Silicon Graphics Octane con IRIX 6.5 come sistema operativo. CATALYST è dotato di due algoritmi per ricercare arrangiamenti farmacoforici in maniera automatica. HypoGen sfrutta saggi biologici, tenendo conto dell’attività (IC50 Inhibitory concentration 50%) per generare l’ipotesi che è in grado di predire quantitativamente l’attività dei composti, mentre la generazione delle ipotesi fatta con la metodologia HipHop ricerca una comune configurazione 3D delle chemical features estrapolate da una serie di molecole attive contro un determinato bersaglio. Il software dispone di un set di features chimiche, definite opportunamente, che coprono le principali interazioni che si possono verificare tra ligando e recettore: alcuni esempi sono il donatore e l’accettore di legame idrogeno, che racchiudono quei gruppi funzionali capaci di donare un protone, per formare un legame idrogeno con un residuo amino acidico del recettore o piuttosto quei gruppi che possono accettare un legame idrogeno, comportandosi cioè da basi; la feature hydrophobic, che comprende quei gruppi che danno interazioni idrofobiche come anelli aromatici, gruppi alchilici e cicloalchilici e la feature ring aromatic che comprende gli anelli aromatici. Le features sono definite o come punti o come vettori; il vettore a sua volta definisce due punti l'origine del vettore e il punto di proiezione, che nel caso della features rappresenta il sito di interazione nel recettore. Nella rappresentazione visiva dell'ipotesi poi, ogni punto che definisce la feature è inserito all'interno di una sfera più grande (sfere di tolleranza), che definisce il volume in cui la feature nella molecola deve trovarsi per mappare una corrispondente feature dell’ipotesi. Talvolta può essere necessario definire opportunamente una feature che rappresenti un’interazione specifica, che non è contenuta nel database del programma. Le features vengono scelte osservando i gruppi funzionali ricorrenti nelle molecole del Training set. Il Training set viene scelto rispettando alcuni criteri imposti dal

programma: il numero dei composti del Training set deve essere almeno 16, perché le ipotesi siano significative statisticamente e al massimo 25. L’attività deve coprire almeno quattro ordini di grandezza e ogni ordine di grandezza deve essere rappresentato da almeno tre composti; non devono esserci informazioni ridondanti, ovvero composti simili con attività simile Nel caso HypoGen similarmente al metodo 3D-QSAR tutti i membri di un Training set devono possedere il solito binding mode, il secondo metodo consente l’eliminazione automatica dei composti che possono avere un differente sito di azione. L’algoritmo della generazione delle ipotesi Hypogen è progettato in modo tale da correlare i valori di attività con la struttura per generare un modello farmacoforico. La generazione delle ipotesi effettuata con il software CATALYST consiste di tre fasi: costruttiva, sottrattiva e di ottimizzazione. Generalmente la fase costruttiva ha una procedura del tutto simile all’algoritmo HipHop. Il training set viene suddiviso in 2 subset discriminando i composti“attivi” ed “inattivi”. Inizialmente, tutti i farmacofori condivisi tra i due composti più attivi sono identificati grazie al fatto che possono sistematicamente ricoprire tutte le loro conformazioni, e successivamente solo le ipotesi che presentano caratteristiche che sono condivise anche dal resto del subset di composti attivi sono tenute in considerazione. Nella fase sottrattiva, il programma investiga le ipotesi già create e vengono rimosse le features più comuni dei composti inattivi che sono parte del Training set. I composti vengono definiti inattivi quando la loro attività è di 3.5 unità logaritmiche al di sotto del composto più attivo. La fase sottrattiva, è seguita dalla fase di ottimizzazione dove vengono simulati allineamenti per provare il potere di predizione dell’ipotesi. Vengono effettuati piccoli cambi al modello e sono segnati secondo la precisione nella stima di attività. Infine, i modelli che stimano correttamente le attività sono selezionati e le migliori N soluzioni sono visibili dall’operatore.97-98 Il software prende in esame e scarta migliaia di modelli; distingue tra modelli alternativi applicando un’analisi dei costi. L'assunzione generale, basata sul principio del rasoio di Occam, impone di scegliere, tra alternative altrimenti equivalenti,

il modello più semplice. La semplicità, è definita utilizzando il principio della minima lunghezza di descrizione dalla teoria dell'informazione. Il modello più semplice è quello che può essere descritto completamente usando la lingua più concisa. CATALYST usa bits come lingua, così il programma assegna i costi alle ipotesi in termini del numero di bits richiesti per descrivere ciascuna ipotesi completamente. Il costo totale dell'ipotesi è calcolato sommando tre fattori di costo il weight cost, l'error cost, il configuration cost. Il weight cost è un valore che cresce in forma gaussiana all'aumentare della differenza tra il peso di una feature in un modello ed il valore ideale di 2.0. Questo fattore di costo tende a favorire ipotesi dove i pesi delle features sono prossimi a 2.0. L’error cost, aumenta proporzionalmente con l’aumentare della differenza RMS tra attività stimata e sperimentale per le molecole del Training set. Questo fattore di costo favorisce le ipotesi dove la correlazione tra attività predetta e osservata sperimentalmente è migliore. Il configuration cost è un costo fisso che dipende dalla complessità dello spazio delle ipotesi, è l'entropia dello spazio delle ipotesi. L’error cost è quello che incide di più sul costo totale dell'ipotesi. Inoltre il software calcola due costi aggiuntivi il costo dell'ipotesi nulla (null cost), che è il costo di un farmacoforo con nessuna feature, che stima ogni attività uguale al valor medio delle attività sperimentali ed il fixed cost, che rappresenta il costo dell’ipotesi ideale, quella in cui il modello è il più semplice possibile e fitta i dati perfettamente. Il costo dell'ipotesi generata dovrebbe essere quanto più prossimo al costo dell'ipotesi ideale e comunque differire almeno 40-60 bits dal costo dell’ipotesi nulla per avere il 75-90% di probabilità che la correlazione tra i dati non sia casuale. Il modello farmacoforico generato, consiste in un insieme di features necessarie per l'attività biologica del ligando ma secondo un arrangiamento in uno spazio tridimensionale in grado di spiegare quali gruppi funzionali e quali strutture molecolare sono assolutamente necessari per isolare composti attivi contro questo target cellulare.99 I differrenti parametri di controllo impiegati per la generazione delle ipotesi (HypoGen) sono spacing ed

uncertainty. Spacing, rappresenta la minima distanza tra le features che può essere consentita nella ipotesi risultante. Per generare al meglio l'ipotesi è essenziale avere un Training set che abbia al suo interno composti con valori di attività compresi fra più ordini di grandezza (almeno 4). Il parametro uncertainty riflette gli errori di predizione. Il valore di default è 3 ma per questo lavoro abbiamo usato il valore di 1.5.100 La generazione delle ipotesi è stata effettuata con il metodo HypoRefine che include i volumi esclusi. I composti per la generazione del farmacoforo sono stati costruiti usando CATALYST 2D/3D visualizer in CATALYST 4.08 software package e sono stati minimizzati usando CHARMM-like force field 101 che è parte integrante del software CATALYST. Il numero di conformazioni dei composti del Training set è stato limitato al massimo a 250 usando il metodo “best conformer generation” con 20 kcal/mol come valore di cutoff per l'energia. I modelli conformazionali sono costruiti usando il metodo Monte Carlo e l'algoritmo di Poling, che considera nell'analisi le funzioni chimiche piuttosto che gli atomi e mira a coprire lo spazio conformazionale con un ridotto numero di conformazioni.102 Le attività biologiche dei composti sono espresse come IC50 ( in vitro citotoxicity 50%). Il Training set è stato creato aggiungendo a molecole di struttura originale (ma che purtroppo non coprivano che due ordini di grandezza) altre già pubblicate in merito alla loro attività contro il recettore degli estrogeni ER-α nella linea cellulare MCF-7. Ciò è stato fatto per avere valori di attività che coprissero più ordini di grandezza possibili. Infatti con questa metodica ne siamo riusciti a coprire 4, ciò è un requisito minimo fondamentale per la generazione di un modello farmacoforico attendibile con CATALYST. 103

Risultati e Discussione La generazione del modello farmacoforico Ă¨ stata possibile utilizzando un gruppo di 53 composti suddiviso in un Training set di 24 composti per la generazione del modello farmacoforico, ed un Test set di 29 composti per la validazione dello stesso (Figura 12).

Figura 12 Strutture dei composti usati nel Training e nel Test set

Cpd

B(OH)2

OCH3

CH2OH

OCH2COOH

CF3

OCH2COOH

B(OH)2

26 27 28

CH3

CH2CH2

CH2

CH2CN

CHBr

CH2CH3

CH3

FSC

CH2

CHBr

CH2COOH

CH3

1,4

1,3

CH2CH3

FSC (functional side chain): (CH2)6NMe(CH2)3SC5H11

Tabella 1 Schema relativo ai sostituenti che caratterizzano i composti riportati in Figura 12

I composti che sono stati usati hanno valori di attività che coprono 4 ordini di grandezza, con il composto più attivo numero 34 (IC50=0.02 µM) ed il composto meno attivo il numero 45 (IC50=267.4 µM) contro la linea cellulare MCF-7

e interagiscono con ER-α (Tabella 2). Le

features che abbiamo inserito per generare l’ipotesi (HypoGen HypoRefine) sono: HBD (hydrogen bond donor), HBA (hydrogen bond acceptorr) HYDROPHOBIC, HYDROPHOBIC Aromatic e RING AROMATIC. La Tabella numero 3 riporta in dettaglio quelli che sono i risultati ottenuti per le dieci ipotesi che il programma rende visibili all’operatore.

Activity Cpd 1

a,88

b,88

6 7

Exp

a,104

100 4.1 24 18 25

118.7

a,105

a,35

a,106

a,105

b,105

0.48

167.9 34.5 247.3 74.8 148.4 10.7 5 9 13 7 8.5 9.5 6 7.8

a,88

0.34

Activity

Calcd 10 2.4 20 8.7 13 160 12 1.1 87 29 820 88 89 8.4 7.8 6.5 5.8 8.2 11 11 12 13 0.46

Error -9.8 -1.7 -1.2 -2.1 -2

1.2 -1.7

Tabella 2

6.3

-1.1

9.6

-1.6

100

1.6

a,95

0.3

0.89

a,95

0.02

0.007

-2.8

b,95

0.6

0.34

-1.8

b,95

0.37

-2.7

b,96

0.3

1.3

4.4

a,109

2.3

1.5

-1.5

b,109

3.4

5.6

177.6

160

-1.1

265.4

160

-1.7

103.7

160

1.5

234.8

170

-1.4

67.2

160

2.3

267.4

820

3.1

274.6

-3.2

95.5

-3.7

104.1

-1.2

167.3

-1.9

78.3

-2.3

86.3

a,110

61.66

140

2.2

b,110

100

-3.5

1.7

1.3

4.2

6.9

b,105

1.2

1.6

1.3

0.39

1.7

1.2

3.1

-2.3

1.4

1.8

b,108

-1.4

1.5

1.6

1.06

3.3

-1.3

b,107

0.3

0.13

3.3

0.079

0.039

b,108

-1.2

b,107

-1.9

0.42

Error

2.4

a,107

Calcd

1.1

Exp

a,108

1.3

a,107

1.11

Cpd

-2.7

3.8

Composti che sono stati inclusi nel Training set. b Composti che sono stati inclusi nel

Test set. La tabella riporta i valori di attivitĂ come IC50 (ÂľM) sperimentale e predetta dal modello farmacoforico Hypo7.

Tabella 3. Costi, Parametri Statistici, e composizione delle features associate con le prime dieci ipotesi farmacoforiche generate da CATALYST. Composition featureb

Statistical Parameter Hypo

Cost a P

RMSD

r 2 tr-set P

r 2 testset

110.7

1.53

0.974

0.772

HBD

HY 1

HY 2

----

122.5

1.80

0.966

0.781

HBD

HY 1

HY 2

----

148.2

2.31

0.943

0.783

HBD

HY 1

HY 2

----

162.1

2.49

0.931

0.812

HBD

HY 1

HY 2

----

166.7

2.61

0.922

0.738

HBA

HY 1

HY 2

169.8

2.64

0.921

0.793

HBD

HY 1

HY 2

----

171.1

2.65

0.955

0.914

HBA

HBD

HY 1

HY 2

174.4

2.73

0.915

0.692

HBA

HY 1

HY 2

174.9

2.71

0.942

0.878

HBA

HBD

HY 1

HY 2

176.9

2.76

0.936

0.752

HBA

HY 1

HY 2

----

I costi sono riportati in bits: Fixed cost 81.2; è il costo dell’ipotesi teorica in grado di predirre alla

perfezione l’attività. Null cost 636.6 è il costo di una ipotesi che non dà alcun tipo di correlazione tra le attività osservate e predette. bHBA: Hydrogen Bond Acceptor; HBD: Hydrogen Bond Donor; HY1: HYDROPHOBIC Aromatic; HY2: HYDROPHOBIC; RA: RING AROMATIC. La Tabella numero 3 riporta per ogni ipotesi il costo la RMSD, i valori di correlazione ottenuta con il metodo della regressione lineare da CATALYST e le features che ogni ipotesi rappresenta. Dall’analisi dei dati e dei modelli abbiamo scelto il modello rappresentato dall’ipotesi numero 7 (Hypo 7) visto la buona correlazione sul Training set, ma soprattutto l’elevato grado di correlazione sul Test set. Quest’ultimo dato è di importanza assoluta per scegliere un modello tra i dieci generati, visto che un grado di correlazione scarso è indicativo di un inefficiente modello predittivo. Hypo 7 è perfettamente in grado di discriminare tra molecole attive ed inattive in modo pienamente soddisfacente come riportato nella Tabella numero 2.

L’ottimo grado di predizione è confermato anche nel Test set: nella tabella sopra riportata vediamo indicati i dati di attività (IC50 (µM)) osservata sperimentalmente e predetta con il relativo errore. Nella colonna che ci indica questo valore vediamo che gli errori non superano mai il valore 10. Questo valore, lo abbiamo preso come limite massimo per considerare il dato predetto come attendibile; il superamento di questa soglia per molteplici predizioni effettuate da CATALYST fa senza dubbio perdere di attendibilità e significatività al modello farmacoforico generato. Gli errori solo in un caso superano il valore 9 e nelle altre righe si nota come la stragrande maggioranza delle predizioni termini con un errore inferiore a 2. I valori delle attività osservate sperimentalmente e predette sono stati riportati in grafico in Figura 13 per il Training ed il Test set ed i valori delle attività sono riportati come pIC50, ovvero come il logaritmo in base dieci delle IC50.

Figura 13

Regressione lineare delle attività osservate sperimentalmente contro le attività

calcolate/predette (µM) con il modello farmacoforico espletato dalla Hypo7 (scala logaritmica), per ogni membro del Training set e del Test set.

Il modello farmacoforico generato è visualizzato nelle sue features in Figura 14. Coesistono in questa ipotesi cinque features: blue per HYDROPHOBIC Aromatic (HY1), ciano per HYDROPHOBIC (HY2), verde per Hydrogen Bond Acceptor (HBA), magenta per Hydrogen Bond Donor (HBD). La disposizione spaziale delle features è sicuramente in pieno accordo con le modalità di interazione di un ligando all’interno della tasca recettoriale.

HY2

HY1 HY1 HBA HBD

Figura 14 Hypo7: composizione delle features e mapping del composto 34 (il composto più attivo del set). Le sfere con le diverse colorazioni rappresentano: blue per HYDROPHOBIC Aromatic (HY1), ciano per HYDROPHOBIC (HY2), verde per Hydrogen Bond Acceptor (HBA), magenta per Hydrogen Bond Donor (HBD). Risulta infatti, indispensabile la presenza di gruppi che sono in grado di generare legami ad idrogeno alle estremità della cavità del recettore con gli aminoacidi His524 da un lato e Arg394 e Glu353 dall’altro; ed in Figura 14 le due sfere di tolleranza verde e magenta racchiudono proprio

questo tipo di interazione. Le interazioni indicate dalle due sfere di tolleranza blu e dalla sfera ciano richiamano alle interazioni di tipo idrofobico; questa disposizione di features è in accordo con il binding mode proposto per un ligando antagonista diretto contro il recettore ER-α e illustrato nelle sezioni precedenti.

Figura 15 Disposizione spaziale delle chemical features presenti in Hypo 7 e relativa distanza espressa in Å. La mappa spaziale delle cinque features riportata in Figura 15 e la relativa distanza delle sfere di tolleranza è molto ben associabile con la cavità all’interno del quale il ligando espleta la sua funzione in associazione con il recettore ER-α per gli estrogeni. Questo, in relazione al grande volume ed alla plasticità che ha il sito di legame. Le misure che si osservano nel modello computazionale potrebbero garantire un binding mode per ER-α di un ipotetico composto antagonista che il farmacoforo predice attivo. Il modello farmacoforico ottenuto è molto

soddisfacente da questo punto di vista: in esso sono racchiuse le interazioni indispensabili che un composto dovrebbe essere in grado di produrre per legarsi con un’ottima affinità al target proteico (ER-α). Contemporaneamente, abbiamo generato un tool che possiede una capacità predittiva molto soddisfacente. Ma senza ombra di dubbio il fatto rilevante che ha suscitato molto interesse per il lavoro è che un approccio farmacoforico di questo tipo, contro questo recettore non era stato mai fatto prima di adesso. I lavori riportati in letteratura, hanno mostrato che i farmacofori per ER-α sono stati generati utilizzando nel Training set composti appartenenti alla stessa classe strutturale (derivati dal diariletilene95, e dall’arilbenzotiofene96). Tali classi era già noto che avessero possibilità di annoverare tra di loro alcuni composti polisostituiti in grado di inibire la pathway di ER-α; infatti gli arilbenzotiofeni come detto in precedenza sono dei SERMs in cui figura anche il Raloxifene. Quindi il modello è stato creato conoscendo già le potenzialità delle strutture ed è stato validato con dei Test set che contenevano i soliti scaffold. Difficilmente, da un modello ottenuto con queste modalità può scaturire un elevato grado di predizione nei confronti di composti di altre classi strutturali che sia soddisfacente. Durante il nostro lavoro invece, abbiamo preso in esame molteplici classi strutturali (Figura 12) sia per comporre il Training set che il Test set proprio per far lavorare il software nel miglior modo possibile in accordo con le linee guida per la generazione di un modello farmacoforico.103 Il modello ottenuto essendo stato elaborato da CATALYST con questo insieme di classi di composti avrà secondo noi un aspetto generalista, ma sarà anche in grado di poter predirre l’attività di qualsisi composto in maniera più che accettabile. A questo riguardo, il nostro modello farmacoforico è stato utilizzato per ottenere predizioni di attività su una classe di molecole di nuova estrazione denominate Acetogenine, isolate da una Rodophyta, una alga rossa, denominata Laurencia Glandulifera. Le strutture dei nuovi composti isolati da Roussis et al. presso il Dipartimento di Chimica dei Prodotti Naturali all’interno della Facoltà di Farmacia dell’Università di Atene, ci sono pervenute con i relativi valori di attività osservata contro la linea

cellulare MCF-7 e sono riportati nella Tabella numero 4. Il nostro compito è stato sviluppare il modello chimico computazionale predittivo precedentemente descritto ed osservare le stime delle attività che ne derivavano. I saggi cellulari dei composti riportati Tabella 4 sono stati effettuati contro la linea cellulare MCF-7 e ci forniscono dei valori di attività che non sono molto soddisfacenti. Abbiamo predetto le attività dei composti con il modello farmacoforico ottenuto noto come Hypo 7 attraverso il software CATALYST (Tabella 4). Activity Compd

Exp

Calcd

Errora

>300

370

1.2

265.4

240

-1.1

>300

370

1.2

>300

320

1.1

>300

360

1.2

>300

370

1.2

>300

300

-1

>300

260

-1.1

>300

310

>300

320

1.1

Tabella 4 a Calclato rispetto ad un ipotetico valore di IC50 pari a 300 µM. La tabella riporta i valori di attività come IC50 (µM) sperimentale e predetta dal modello farmacoforico Hypo7 per le Acetogenine di nuova estrazione. Come si evince dalla Tabella numero 4 i valori di attività riportati sono, tranne nel caso del composto numero 2, tutti maggiori di 300 µM, quindi dai saggi cellulari emerge che queste molecole non hanno una attività biologica accettabile contro la linea cellulare MCF-7. Ma il nostro modello (Hypo 7) come vediamo dalle attività calcolate/predette è in grado perfettamente di

discriminare anche le molecole inattive. I numeri nella colonna relativa all’errore tra le attività osservate sperimentalmente e quelle predette da CATALYST sono tutti intorno ad uno; ed è veramente interessante notare come i composti le cui attività sono maggiori di 300 µM compaiano stimate superiori allo stesso numero; e che l’unico composto con una attività al di sotto di 300 µM (265.4 µM composto numero 2) abbia una attività stimata al di sotto dei 300 µM (240 µM). L’abilità nel discriminare così bene le molecole inattive è senza dubbio una peculiarità da non trascurare del modello farmacoforico ottenuto. Questa innata capacità del nostro farmacoforo potrebbe essere stata ottenuta grazie alla grande varietà di composti e strutture che hanno formato il Training set con cui è stato generato il modello chimico computazionale.

Prospettive per il futuro

Durante lo svolgimento della mia tesi per il Master di IIo livello in Drug Design & Synthesis ho affrontato la parte del lavoro computazionale che prevedeva la realizzazione del modello farmacoforico di cui ho spiegato le molteplici potenzialità. L’aver affrontato il problema della generazione del modello farmacoforico in senso critico ci ha permesso di raggiungere questi interessanti risultati. Purtroppo il tempo per lo stage non è stato molto e non abbiamo potuto avviare altre procedure di lavoro sul modello citato. La prima cosa da fare, che è ad oggi in corso, è avviare una procedura di Virtual Screening con il mio modello per vedere di isolare composti con gradi di attività soddisfacenti da usare come hit. Sapremo così se il modello generato è selettivo nel momento in cui realizziamo uno screening di banche di composti. Successivamente, i composti individuati con il Virtual Screening verranno usati per effettuare una procedura di docking (con i programmi AutoDock o GOLD). I composti che avranno degli score soddisfacenti dopo questa metodica potranno essere saggiati in laboratorio sulla linea cellulare MCF-7 per osservare se realmente la predizione sulle attività effettuata dal nostro modello chimico computazionale risponde ai dati ottenuti sperimentalmente. La nostra iniziativa mira a rintracciare composti che abbiano gradi di attività buoni per individuare nuovi hit contro il recettore degli estrogeni ER-α. Ancora, possiamo stabilire se i composti che attraverso il modello in silico verranno isolati hanno affinità per il recettore come e più di quelli conosciuti fino ad oggi. Riuscendo a portare a termine questa prima fase di individuazione degli hit attraverso la procedura prima descritta, potremmo passare ad una ottimizzazione per ottenere molecole con migliore attività antiestrogenica.

Ringraziamenti

Un doveroso grazie al Dipartimento FARMACO CHIMICO TECNOLOGICO dell’UNIVERSITÀ STUDI

DEGLI

SIENA nella persona del Direttore Prof. MAURIZIO BOTTA che ha reso possibile lo

svolgimento dell’interessante progetto di ricerca. La mia gratitudine va al coordinatore del Master di IIo livello in Drug Design & Synthesis Prof. MAURIZIO TADDEI per aver reso possibile il mio ingresso nel mondo della ricerca scientifica Un riconoscimento immenso va alla mia famiglia che mi ha supportato economicamente in questo anno difficile e mi ha incoraggiato in questa eccezionale avventura. Con enorme affetto ringrazio i miei grandissimi amici SIMONE TARDIOLI, STEFANO TARDIOLI e GIANLUCA GORI perché una loro parola, o un loro gesto nei miei confronti è sempre di inestimabile valore. Un eccezionale ringraziamento va al Dott. LUCA BELLUCCI, alla Dott.ssa FABIANA CAPORUSCIO, al Dott. FEDERICO FALCHI e alla Dott.ssa RITA PUGLISI per l’amicizia che mi hanno dimostrato, per il sostegno e per i preziosi consigli che mi hanno rivolto in ogni momento del progetto di ricerca. Il più unico e particolare dei ringraziamenti è per il Prof. ANDREA TAFI per il suo talento, per la sua conoscenza messa a mia completa disposizione, per la pazienza che mi ha dimostrato durante la ricerca e l’elaborazione dei dati e per avermi dato l’opportunità di avvicinarmi ad una materia interessante come la Chimica Computazionale. Grazie di cuore!!!!. Se sono arrivato a raggiungere questo difficile ed ambizioso obbiettivo lo devo anche e soprattutto a loro.

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