• En un vial de 1,5 ml prepare una mezcla que contiene los reactivos en cantidades calculadas para el total de las muestras más una. La mezcla debe contener el agua, el buffer 10 X con MgCl2, los deoxinucleótidos y los cebadores. Por último adicione la Taq-polimerasa. El buffer 10x y el MgCl2 deben ser homogenizados antes de agregarlos a la mezcla agitándolos durante unos minutos en el vortex. El buffer 10X generalmente incluye concentraciones de MgCl2 de 25mM. Para el caso de insectos acuáticos y en particular de insectos esta concentración es crítica y debe ser mayor (hasta 50 mM). • Adicione los µl correspondientes de la mezcla a cada uno de los tubos de reacción de PCR donde previamente depositó el ADN de cada muestra. • Coloque cada vial en el termociclador tan pronto como sea posible e inicie el proceso según el perfil térmico que se esté utilizando. Transporte sus muestras siempre en hielo. • Verifique que el programa a usar es realmente el suyo y no se retire del termociclador hasta que haya pasado por lo menos un ciclo. Recuerde que el perfil térmico a utilizar debe ser el previamente estandarizado para el ADN, cebadores y tipo de muestras y reactivos que se están trabajando. • Al término, retire sus muestras y almacénelas a 4 oC, mientras tanto prepare el gel de verificación para observar el resultado. Posteriormente almacene a -20°C hasta la purificación y secuenciación. En el proceso de preparación de la muestra, la reacción, la manipulación y análisis (electroforesis) post-PCR se recomienda realizarse en áreas físicas separadas y si es factible, en cuartos separados, estas áreas deben ser desinfectadas antes y después de cada uso con etanol al 70% o Hipoclorito de sodio al 10% (porcentajes más altos o más bajos no descontaminan adecuadamente). El peligro de contaminación en la reacción de PCR puede provenir de dos fuentes, contaminación cruzada entre muestras y fragmentos de ADN dispersados por aerosol. Para evitar la contaminación se debe utilizar material desechable nuevo y estéril (puntas de micropipeta con filtro, tubos eppendorf, etc.) minimizando la contaminación de los suministros y las muestras, si esto no es posible, los artículos a ser reutilizados deben ser desinfectados con una solución de etanol al 70% y las puntas deben ser autoclavadas (25 libras de presión 25 minutos) y se deben secar completamente, ya que el etanol puede inhibir la reacción de PCR.
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