Genotipificación por Melting (HRM

a) Cuantificación absoluta:

Se realiza una cuantificación total sin compararlo con ningún gen de referencia.

Un ejemplo de esta aplicación sería la cuantificación de la carga viral de VIH o de

SARS-CoV2, etc. o la cuantificación total de un ARN mensajero para saber su expresión absoluta en la muestra.

b) Cuantificación relativa:

Cuando se requiere conocer la proporción de un gen frente al total de ADN o

ARN de una muestra, es decir, es una cuantificación diferencial. Como ejemplo de esta aplicación podemos citar el estudio transcrito BCR-ABL en leucemia mieloide crónica, donde se reporta el % del RNA mensajero de BCR-ABL frente al de un gen de referencia como el ABL1 (esto sería “equivalente”al % de células tumorales mutantes frente al total de células de una muestra).

En ambos casos se debe correr una curva estándar para utilizarla como base de la cuantificación.

Curva estándar en Q-PCR. Tomado de http://sgpwe.izt.uam.mx/files/users/uami/fierrof/8ANALISIS_DE_LA_EXPRESION_GENICA_1.pdf

- Genotipificación a) Genotipificación con sondas:

Es muy utilizada, dependerá de la sonda para su interpretación. Se pueden diseñar sondas específicas (generalmente, FRET o BACON) de diferentes colores para los alelos de tipo salvaje y mutante (por ejemplo, verde y roja) donde los resultados se segerarán por interpretación de los colores (por ejemplo homocigoto normal emitirá una única señal verde, un heterocigoto una señal mixta y un homocigoto mutante una única señal roja).

https://www.nature.com/articles/s41598-019-45884-8

O también puede emplearse una sonda única (generalmente Taqman) que, conjuntamente con cebadores específicos, tenga afinidad únicamente a uno de los dos alelos (por ejemplo, el mutante), en este caso se interpreta por la cantidad de fluorescencia emitida (por ejemplo una señal nula significa un homocigoto normal, una señal a intensidad 1 significa heterocigoto y una señal al doble un homocigoto mutante). Es muy útil para la detección de variantes génicas en porcentajes muy bajos (1 entre 1000 células, por ejemplo).

a) Genotipificación por Melting (HRM):

Esta técnica es un análisis post-PCR que se basa en la comparación de la energía de disociación entre los pares de bases de una cadena bicatenaria de ADN. Así la energía requerida para el par CG es mayor al del par AT y esto puede ser medido con la adición de fluorescencia tipo SYBR Green, SYTO Dye, entre otros. Mediante un calentamiento gradual, el ADN bicatenario se desnaturaliza y emite cada vez menos fluorescencia (debido a que los colorantes usados se unen solo a ADN bicatenario), esta técnica es tan sensible que puede detectar las pequeñas variaciones entre la temperatura a la que se disiocian las bases.