Exercices sur reprogrammation cellulaire

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Module 3 Exercices sur le module 3 L’expérience du chercheur japonais Shinya Yamanaka, qui a montré que l’on peut reprogrammer des cellules différenciées (cellules cutanées par exemple) en cellules souches, peut être considérée comme le résultat le plus important à ce jour de la recherche médicale du XXIe siècle. La technologie iPS issue de cette découverte pourrait ouvrir de nouvelles portes à la recherche et au traitement de maladies. Ces exercices proposent d’entrer dans la recherche actuelle sur les cellules iPS et de découvrir les possibilités offertes par cellesci à la recherche médicale.

Exemple 1: Création d’un glossaire Exemple 2: Interview de Shinya Yamanaka sur les cellules iPS. Exemple 3: Où la recherche sur les cellules iPS pourrait-elle mener?

Exemple 4: Quelques maladies que l’on pourrait étudier ou soigner à l’aide de la technologie iPS. Exemple 5: Comparez la taille de différents types cellulaires.

Exemple 6: Cellules ES humaines clonées pour la première fois.

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Exemple 1: Création d’un glossaire 1ère mission: En vous basant sur le document, définissez les termes spécialisés suivants (deux phrases maximum par terme): Cellule souche totipotente: Cellule souche pluripotente: Différenciation cellulaire: Modèle d’expression de l’ADN: Clone: Reprogrammation: Gène maître: Oncogène: 2e mission: Expliquez avec vos propres termes la méthode de transfert nucléaire et la méthode iPS (un paragraphe par méthode).

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Exemple 2: Interview de Shinya Yamanaka sur les cellules iPS Le chercheur japonais Shinya Yamanaka (fig. 1) a reçu en 2012 le prix Nobel de médecine (avec John B. Gurdon). Il avait brillamment montré qu’il est possible de reprogrammer des cellules différenciées en cellules souches pluripotentes.

Cette interview a été publiée en 2010 dans la célèbre revue scientifique «Nature». L’interview a été réalisée par Mary Muers (traduction française à partir de la traduction allemande de Rico Kunzmann).

Question: Pourquoi avez-vous décidé d’abandonner votre carrière de médecin et de vous tourner vers la recherche médicale?

Shinya Yamanaka: Il y a des années, j’étais chirurgien orthopédique, mais je ne me trouvais pas spécialement doué. Je me disais donc que je ne pouvais pas aider autant de patients que j’aurais voulu. Même un excellent chirurgien ne peut pas aider énormément de patients. C’est pour ces deux raisons que j’ai décidé de faire de la recherche médicale plutôt que de pratiquer la médecine.

Figure 1: Photographie de Shinya Yamanaka.

(Source www.nobelprize.org) Comment en êtes-vous venu à vous intéresser aux cellules souches?

C’est une longue histoire. J’ai fait mon doctorat en pharmacologie et pendant mon travail en tant que doctorant, je me suis intéressé à la technologie des Page 3 of 16

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souris knock-out (KO). Après mon doctorat, j’ai donc décidé de poursuivre mes travaux de recherche au lieu de retourner en clinique. Pour approfondir mes connaissances sur les souris KO, j’ai décidé d’aller aux États-Unis en post-doctorat à l’Institut Gladstone de San Francisco. C’est là que j’ai fait la connaissance des cellules souches embryonnaires car nous avions besoin de cellules souches embryonnaires de souris pour produire des souris knockout. Tout ceci était il y a une quinzaine d’années. À l’époque, les cellules souches embryonnaires n’étaient qu’un outil pour produire des souris KO, on ne faisait pas de recherche sur ces cellules. Mais pendant mon post-doctorat, j’ai identifié un nouveau gène dont je pensais qu’il était important dans les cancers. Pour étudier la fonction de ce gène, j’ai produit une souris KO et il est apparu que le gène que j’étudiais était très important pour la pluripotence des cellules souches embryonnaires. C’est ainsi que je me suis mis à m’intéresser aux cellules souches.

Comment en êtes-vous arrivé à penser qu’il était possible de transformer des cellules différenciées en cellules souches?

En 1996 est née la brebis Dolly et des années auparavant, en 1962, John Gurdon avait déjà montré que des cellules de grenouille adultes pouvaient être reprogrammées. Nous savions donc qu’il était possible de reprogrammer des cellules adultes. Mais il y avait encore d’autres études importantes, dont les travaux extraordinaires réalisés sur la drosophile et qui ont permis d’identifier le gène appelé antennapedia. Il s’agit en quelque sorte d’un gène maître régulateur: si on l’exprime dans les antennes, des pattes se développent à la place des antennes. MyoD a une importance similaire dans le muscle. En raison de ces expériences, nous savions que les facteurs de transcription peuvent modifier le destin d’une cellule. Mais nous n’étions pas sûrs de pouvoir reprogrammer des cellules à l’aide de facteurs de transcription. J’étais simplement d’avis qu’il fallait essayer.

Comment avez-vous choisi les facteurs avec lesquels vous vouliez essayer?

Nous avons mis au point une méthode permettant de transformer la reprogrammation en résistance à une substance active. À l’aide de cette méthode, nous avons testé de nombreux facteurs pour voir s’ils étaient en mesure d’induire la pluripotence. Nous avions 24 candidats et au début, nous avons bien sûr testé chacun d’entre eux individuellement. Mais aucun ne fonctionnait, nous ne voyions pas de reprogrammation. Mais lorsque nous combinions tout simplement les 24 facteurs, nous obtenions des colonies résistantes à la substance active.

Pensiez-vous à l’époque que votre travail ouvrirait la voie à un domaine de recherche entièrement nouveau?

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Nous pensions que notre travail pourrait s’avérer très important, mais nous pensions surtout à l’époque à des applications en médecine régénérative.

Suite à des discussions avec de nombreux autres scientifiques, j’ai vite réalisé que les cellules iPS pouvaient aussi être utiles à la recherche de nouveaux médicaments et en toxicologie. Lorsque nous avons publié le premier article dans Cell, nous ne nous attendions pas à un accueil aussi enthousiaste, c’était plus que ce que nous avions espéré!

Où en sera la recherche sur les cellules iPS dans un an? Et dans dix ans?

Dans un an, je pense qu’il y aura un certain nombre d’applications en toxicologie et dans la recherche sur les médicaments, cela semble plausible.

Dans dix ans? C’est difficile à dire. Nous espérons pouvoir utiliser ces cellules en médecine régénérative, mais on ne sait pas encore si ce sera possible. Il y a énormément d’obstacles à surmonter avant de pouvoir faire des essais cliniques. Ces cellules sont comme des bébés: elles renferment un grand potentiel, mais nous ne savons pas encore ce qu’il en adviendra, un peu comme Tiger Woods lorsqu’il était enfant! Pour le moment, les cellules iPS sont moins sûres que les cellules souches adultes, mais bon nombre de difficultés sont purement techniques. J’espère vraiment que l’on pourra dans les prochaines années surmonter ces problèmes de sécurité et d’efficacité du processus de différenciation. J’espère que dans dix ans, on pourra utiliser ces cellules pour un traitement aux cellules souches, mais il est difficile de faire des prévisions.

Les cellules iPS ont reçu beaucoup d’attention des médias. Est-ce que cela met les scientifiques sous pression?

Je ressens parfois une pression, non seulement de la part des médias, mais aussi de la part des patients. Mais d’un certain point de vue, c’est une bonne chose. La concurrence est rude pour les scientifiques, mais je pense que pour les patients, elle est avantageuse car tout avance plus vite.

Quel serait votre conseil à un jeune qui est intéressé par une carrière scientifique?

Je pense qu’il faut être ouvert. Nous formulons une hypothèse, puis nous faisons des expériences pour vérifier cette hypothèse. Si les résultats ne confirment pas notre hypothèse, nous sommes très déçus. Mais ces résultats peuvent renfermer une nouvelle chance de faire une autre découverte, cela m’est arrivé plus d’une fois. C’est pour cela que la science est si intéressante et apporte autant de plaisir: elle est imprévisible.

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Questions: a.) Que sont les souris knock-out (KO)?

Une souris KO (de l’anglais to knock out – assommer, comme à la boxe) est une souris chez laquelle on a invalidé un gène par manipulation génétique. La protéine de ce gène n’est donc plus produite. La manipulation est par exemple réalisée dans des cellules souches. Ensuite, les cellules manipulées sont introduites dans les cellules de la lignée germinale de la souris. La souris transmet la manipulation génétique à sa descendance. Cette méthode permet d’étudier l’effet de l’absence de cette protéine sur la biologie de la souris. b.) Comment peut-on transformer la reprogrammation en résistance à une substance active?

On peut cultiver les cellules manipulées dans un milieu de culture contenant des bactéries dangereuses. Si les cellules ne sont pas reprogrammées, les bactéries les tuent. Mais si elles sont reprogrammées en cellules souches pluripotentes, elles vont, par des méthodes de génie génétique, produire un antibiotique contre ces bactéries et donc survivre. Elles sont devenues résistantes. c.) Dans quel but utilisait-on essentiellement les cellules souches il y a une quinzaine d’années? Et aujourd’hui?

Il y a une quinzaine d’années, on utilisait surtout les cellules souches pour produire des souris knock-out. Les cellules souches étaient un outil de biotechnologie. Ceci a changé depuis. Aujourd’hui, on utilise encore des cellules souches pour produire des souris KO, mais ce n’est plus qu’une utilisation parmi d’autres. La recherche sur les cellules souches est devenue un nouveau domaine de recherche. L’étude de l’identité et des propriétés des cellules souches est au premier plan. d.) La technologie iPS a donné à beaucoup de patients un espoir de guérison.

Quel est l’effet de cette pression qui s’exerce sur la recherche sur les cellules iPS? Cette technologie éveille beaucoup d’espoirs. Mais avant de pouvoir transposer sur l’être humain une découverte faite sur la souris, des années, voire des dizaines d’années peuvent s’écouler. L’avantage de cette technologie est que son principe de base est simple et qu’elle peut donc être utilisée par de nombreux laboratoires dans le monde entier. Les scientifiques sont en compétition pour aboutir à des résultats, de sorte que la recherche évolue plus vite. e.) Comment Yamanaka a-t-il eu l’idée de transformer des cellules différenciées en cellules souches?

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Les expériences de transfert nucléaire ont convaincu Yamanaka qu’il était en principe possible de réaliser une reprogrammation. L’identification de gènes maîtres régulateurs lui a donné l’idée qu’un petit nombre de protéines pourrait y suffire. f.) Où Yamanaka voit-il l’avenir de la recherche sur les cellules iPS? Yamanaka est prudent dans sa réponse sur l’avenir de la recherche sur les cellules iPS. Il les compare avec un bébé qui va pouvoir évoluer. En effet, avant de pouvoir soigner des patients, des obstacles encore imprévisibles actuellement apparaîtront. De la recherche en laboratoire au médicament que l’on peut acheter en pharmacie, il y a un long chemin incertain à parcourir. g.) Quelles sont les décisions qui ont marqué la carrière de Yamanaka?

Comment a-t-il pris ces décisions?

Une décision capitale a sans doute été celle de travailler en tant que chercheur et non en tant que médecin praticien. Une autre décision importante a été de continuer à travailler dans le domaine humain. En lisant l’interview, on constate que pour Yamanaka, le principal est ce qui l’intéresse personnellement. Il ne poursuit pas un plan de carrière tout tracé et il ne fait pas ce que d’autres personnes attendent de lui. Il s’en remet à son instinct. h.) À votre avis, quelles qualités Yamanaka attendrait-il de vous si vous travailliez pour lui en tant que jeune scientifique?

Réponse individuelle des élèves.

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Exemple 3: Où la recherche sur les cellules iPS pourrait-elle mener?

Cellules souches embryonnaires (cellules ES) vs. cellules iPS Peu après la découverte des cellules iPS, leurs similitudes avec les cellules ES pluripotentes ont été étudiées. Ces deux types de cellules sont dans une certaine mesure produits et maintenus en vie artificiellement. Les cellules ES sont directement obtenues à partir des blastocystes puis sont maintenues en vie pendant des années à 37 degrés dans une boîte de Petri contenant des solutions nutritives particulières. Un tel milieu est différent de celui qui règne dans le corps humain. Ces cellules ES ne peuvent donc pas être considérées comme identiques à des cellules souches du corps humain. On peut comparer cette situation à celle d’une équipe de football qui serait obligée de jouer pendant des années dans un stade vide. Cela modifie le comportement de l’équipe car il y a un lien entre l’équipe (la cellule) et les supporters (le milieu environnant).

On étudie actuellement quelles sont les différences entre les cellules ES en culture et celles du corps humain. On dispose de cellules ES en culture depuis les années 1980, beaucoup de connaissances ont donc déjà été acquises sur ces cellules.

Pour les nouvelles cellules iPS, c’est différent. Il s’agit de cellules fabriquées artificiellement (en dehors d’un organisme). Elles sont pluripotentes mais on ne sait pas encore dans quelle mesure elles sont similaires aux cellules ES pluripotentes. S’il y a des différences significatives, il serait capital de savoir quelles sont les conséquences de ces différences. Ces dernières années, des chercheurs du monde entier ont étudié l’identité des cellules iPS et l’ont comparée à celle de cellules ES. Il est apparu que les différents clones de cellules iPS présentent déjà entre eux des variations relativement importantes (fig. 2).

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Cellules iPS

Cellules ES

Qualité bonne

mauvaise

Figure 2: Recoupements de variations de clones de cellules ES et de cellules iPS. (Source: Yamanaka, 2012, Cell StemCell) Cellules iPS Fabriquer des cellules iPS sûres Pour fabriquer des cellules iPS, on induit l’expression de quatre gènes dans des cellules différenciées. Ces quatre gènes sont intégrés au patrimoine génétique (l’ADN) de la cellule et déclenchent alors la reprogrammation. Le problème est que ces quatre gènes restent dans la cellule et, deux d’entre eux étant des oncogènes (c’est-à-dire des gènes susceptibles de déclencher un Cellules ES cancer), on ne sait pas s’il est possible d’utiliser ces cellules iPS pour soigner des patients. En effet, il y a un risque que ces patients développent, par la suite, un cancer.

Qualité C’est pourquoi des groupes de recherche s’efforcent de développer un système mauvaise iPS sans bonne induction des oncogènes ou dans lequel on puisse supprimer l’expression des oncogènes une fois le processus de reprogrammation terminé.

Reprogrammation directe Le plus grand défi à l’avenir sera de reprogrammer directement des cellules différenciées.

Un exemple: un patient ayant subi un infarctus du myocarde a besoin de nouvelles cellules cardiaques. L’idée actuelle est de fabriquer des cellules cardiaques propres au patient de la façon suivante: Page 9 of 16

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Prélèvement d’une cellule cutanée  fabrication de cellules iPS  transformation des cellules iPS en cellules du muscle cardiaque (myocarde) Mais une voie directe serait plus simple: Prélèvement d’une cellule cutanée  transformation directe en cellule du myocarde Mais un tel raccourci est-il possible? On ne le sait pas encore. Les chercheurs essayent d’identifier des régulateurs maîtres dans le patrimoine génétique humain, capables de transformer une cellule différenciée en une autre cellule différenciée, comme c’est le cas d’antennapedia chez la drosophile.

Malheureusement, on n’a jusqu’à présent trouvé chez l’être humain que très peu de tels régulateurs maîtres. C’est pourquoi les chercheurs étudient maintenant, un peu comme Yamanaka dans son expérience, non pas un facteur unique, mais une combinaison de facteurs. Et effectivement, une telle combinaison de facteurs capable de transformer directement une cellule du tissu conjonctif en cellule du cerveau (sans passer par la cellule iPS) a déjà été identifiée.

Questions: a.) Pourquoi les différences de qualité entre cellules ES et cellules iPS sontelles si grandes? Quels en sont les effets sur des applications futures?

Un clone cellulaire se compose de nombreuses cellules, toutes issues de la même cellule de départ. La cellule iPS d’origine est donc décisive. Mais visiblement, toutes les cellules de départ ne sont pas de qualité équivalente. On peut supposer que la reprogrammation de cellules cutanées en cellules iPS ne fonctionne pas toujours aussi bien. Si l’on veut utiliser ces clones cellulaires iPS à des fins médicales, il faut sélectionner les meilleurs. b.) Avec quelles cellules pourrait-on encore comparer le modèle d’expression des gènes des cellules iPS? Par exemple avec des cellules souches issues d’un blastocyste. c.) Pourquoi les quatre facteurs doivent-ils être intégrés au patrimoine génétique?

S’ils n’étaient pas intégrés, ils ne seraient pas dupliqués lors de la duplication de l’ADN. Lors de la division cellulaire ils seraient alors transmis de manière aléatoire à l’une ou l’autre cellule fille.

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d.) Comment pourrait-on se débarrasser des quatre facteurs intégrés au patrimoine génétique?

Par des méthodes du génie génétique, on pourrait introduire une certaine séquence d’ADN devant et derrière les quatre facteurs. Plus tard, une enzyme reconnaîtrait cette séquence d’ADN, couperait l’ADN à cet endroit et recollerait les deux bouts. On pourrait ainsi découper les quatre facteurs pour les éliminer de l’ADN.

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Exemple 4: Quelques maladies que l’on pourrait étudier ou soigner à l’aide de la technologie iPS. La recherche sur les cellules iPS a fait de grands progrès ces dernières années. Au cours des prochaines années, on verra si les cellules iPS permettent le traitement de certaines maladies. Un premier essai clinique avec des cellules iPS est en cours au Japon. Ce projet a pour but d’obtenir des cellules de rétine à partir de cellules iPS et de les transplanter dans l’œil malade de patients. À part leur utilisation en médecine régénérative, les cellules iPS peuvent aussi servir à étudier les maladies. On prélève des cellules directement sur un malade et on les transforme en cellules iPS. Ces cellules spécifiques au patient sont utilisées pour mieux comprendre la maladie et pour tester des substances actives.

Exercice: Formez trois groupes. Chaque groupe choisit une maladie dans l’un des trois types ci-dessous. Faites des recherches et demandez-vous comment on pourrait utiliser la technologie iPS pour soigner cette maladie (développement de nouveaux médicaments, traitement). Sur une feuille au format A3, représentez sous forme de schéma les approches possibles grâce à la technologie iPS (inspirez-vous de la fig. 9 du document). a.) Maladies psychiques (p. ex. dépression ou schizophrénie) b.) Maladies infectieuses (p. ex. paludisme ou salmonellose) c.) Maladies génétiques congénitales (p. ex. bêta-thalassémie)

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Exemple 5: Comparez la taille de différents types cellulaires.

La technologie iPS permet de transformer une cellule en une autre. La cellule iPS peut se transformer en de multiples cellules de différentes tailles et de différentes formes.

Exercice: représentez les différentes tailles et formes de cellules à l’aide d’une ficelle.

Vous disposez de quatre fois deux mètres de ficelle pour représenter la forme d’une cellule cutanée, d’une cellule souche embryonnaire, d’une cellule iPS et d’une cellule différenciée de votre choix.

Utilisez les deux mètres de ficelle pour la plus grande cellule. Adaptez ensuite la taille des autres cellules en conséquence. Recherchez sur Internet la taille exacte des cellules ainsi que leur forme.

Photographiez les différents types cellulaires. Décrivez en quelques phrases les différences de forme des différents types cellulaires.

Cellule de départ: Cellule cutanée (fibroblaste): 15 µm de rayon Cellule souche pluripotente: Cellule iPS/cellule souche embryonnaire: 7 µm de rayon Cellule différenciée: Spermatozoïde: tête: 2 µm; flagelle: 50 µm de longueur Ovule: 60 µm Thrombocyte: 1,5 µm (sans le noyau) Erythrocyte: 4 µm (sans le noyau) Macrophage: 30 µm Neurone (cellule du cerveau): de taille variable; 40 µm; les axones peuvent mesurer de quelques µm jusqu’à plus d’un mètre de longueur (de la dernière vertèbre à l’orteil).

Cellule souche hématopoïétique: 20 µm Cellule hépatique: 10 µm Adipocyte (cellule des tissus adipeux): 50 µm (jusqu’à cinq fois plus grand chez les personnes obèses) Myocyte (cellule musculaire): 40 µm (peut s’allonger jusqu’à 50 cm) Cellule ciliée: 5 µm

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Exemple 6: Cellules ES humaines clonées pour la première fois.

Au printemps 2013, des chercheurs américains ont cloné pour la première fois des cellules souches embryonnaires (cellules ES) humaines. Ils ont employé la même technique que celle qui avait servi à cloner la brebis Dolly dans les années 90. Les chercheurs se sont servis de cellules cutanées comme point de départ. La cellule cutanée a été énucléée et son noyau a été transféré dans un ovocyte. L’embryon humain cloné a été développé jusqu’au stade de blastocyste afin d’obtenir des cellules ES. Débat: êtres humains clonés? Organes fabriqués en laboratoire?

Cet exercice consiste à employer les connaissances que vous avez acquises sur le transfert nucléaire et la technologie iPS pour participer à un débat controversé intitulé «Êtres humains clonés? Organes fabriqués en laboratoire?».

Les groupes suivants participent au débat: – un ou deux animateurs – des scientifiques (médecins, chercheurs et industrie pharmaceutique) – l’État (hommes/femmes politiques) – des spécialistes d’éthique (philosophes et représentants de l’Église) – des citoyens (patients, proches et personnes non concernées directement) Animateur-s: Le-s animateur-s détermine-nt dans quel ordre les sujets sont abordés ainsi que le poids accordé à chaque sujet dans le débat. Si un sujet semble particulièrement controversé ou intéressant, vous pouvez lui accorder plus de temps qu’à d’autres. De plus, vous devez veiller à ce que les différents groupes aient un temps de parole équivalent pour exposer et développer leurs arguments.

Domaines thématiques envisageables: – Clonage d’animaux domestiques – Clonage d’animaux de rente – Clonage d’animaux en voie de disparition – Clonage d’êtres humains – Recherche sur les cellules ES humaines. Utilisation médicale?

– Recherche sur les cellules iPS humaines. Utilisation médicale?

– Dangers de l’utilisation des cellules iPS en comparaison avec les cellules ES?

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– Fabrication d’organes en couveuse. Dangers par rapport à la greffe classique? Avantages?

Déroulement: 1.) Formez des groupes (5 élèves par groupe au maximum). Au sein d’un groupe, vous pouvez choisir un métier ou l’appartenance à un parti politique.

Cependant, dans le débat, soyez unis au sein de votre groupe pour ce qui est des principes.

2.) Préparez-vous au débat en étudiant les différents sujets et en lisant des articles de journaux. Réfléchissez à la position que va adopter votre groupe sur les différents sujets et prenez des notes sur chaque sujet.

3.) Au sein de votre groupe, préparez une petite déclaration d’introduction.

4.) Sous la direction des animateurs, débattez des différents sujets pendant 45 minutes. Au début du débat, vous présentez votre déclaration d’introduction: discutez des avantages, des problèmes, des limites et des possibilités que renferme un sujet du point de vue de votre groupe. Êtres humains clonés? http://www.atlantico.fr/decryptage/serons-vraiment-prets-cloner-etreshumains-dans-50-ans-axel-kahn-582889.html?page=0,0 http://ethique-soin.blogs.la-croix.com/on-a-clone-letre-humain-qui-sensoucie/2013/06/07/ Animaux domestiques clonés? http://en.wikipedia.org/wiki/CC_(cat), 22.06.2013 http://www.guardian.co.uk/science/shortcuts/2013/mar/11/dog-about-todie-clone-it, 22.06.2013 Organes fabriqués en laboratoire? http://www.lepoint.fr/sante/une-fillette-sauvee-par-une-veine-fabriquee-enlaboratoire-18-06-2012-1474798_40.php Page 15 of 16

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http://www.tagesanzeiger.ch/wissen/natur/Es-wird-moeglich-sein-Organeim-Labor-nachzubauen/story/23993166,22.06.2013 http://www.news.ch/Erste+Niere+aus+dem+Labor/583501/detail.htm, 22.06.2013

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