Facultad de Medicina
Carrera de Bioquímica Clinica
Manual de prácticas de Laboratorio de Bioquímica Clínica III Plan: B011
Cód. asignatura: Q0224-05
Nivel: Q108-07-70 Versión: 2.0 Página 28 de 158
PRÁCTICA 3 – DETERMINACIÓN DE CALCIO TOTAL 1. Objetivo • •
Determinar las consecuencias de usar material volumétrico no apropiado en la determinación de electrolitos o magnitudes iónica a nivel de laboratorios clínicos. Correlacionar marcadores bioquímicos en patologías óseas para aportar con el diagnóstico por el laboratorio como valores con implicancia clínica.
2. Resultados de aprendizaje esperados • • •
Describir los procesos fisiológicos y fisiopatológicos de la función ósea, del equilibrio hidroelectrolítico, a sistema endócrino, aparato genital masculino, femenino y drogas de abuso en base a referentes teóricos. Correlacionar los resultados de laboratorio con el estado de salud del paciente de acuerdo con lo descrito en la literatura médica. Ejecutar los procesos preanalíticos, analíticos y posanalítico para la determinación de marcadores óseos, electrolitos, gases sanguíneos, hormonas, marcadores tumorales y drogas de abuso, teniendo en cuenta las normas de bioseguridad y el control de calidad respectivos.
3. Fundamento teórico El calcio es el mineral más abundante en el cuerpo humano y está presente en diversos tejidos del organismo, incluyendo células del tejido nervioso, dientes, huesos, sangre y otros fluidos corporales. Su presencia está relacionada con la formación de hueso, la coagulación de la sangre, la recepción y transmisión de impulsos nerviosos, la contracción y relajación muscular, el control hormonal y la preservación del ritmo cardíaco. (Antoni Castells, 2017) 3.1 Necesidades diarias o ingesta En relación con los requerimientos de ingesta diaria, se recomienda una ingesta de 1.000 mg en población entre 19 y 50 años, y con forme se avanza en la edad, estos requerimientos aumentan, hasta los 1.200 mg/día. A diferencia de lo que ocurre con otros iones como sodio, potasio o cloro, que se absorben completamente, la absorción del calcio y fosfato es incompleta debido a dos factores: Elaboró:
Máster Oscar Puente
Revisó:
Dr. Santiago Escalante
Aprobó:
Dr. Santiago Escalante
Cargo: Fecha
Docente 11/08/2020
Cargo: Fecha:
Coordinador Carrera 20/08/2020
Cargo: Fecha:
Coordinador Carrera 20/08/2020
Facultad de Medicina
Carrera de Bioquímica Clinica
Manual de prácticas de Laboratorio de Bioquímica Clínica III Plan: B011
• •
Cód. asignatura: Q0224-05
Nivel: Q108-07-70 Versión: 2.0 Página 29 de 158
Se requiere de la intervención de la Vitamina D activa (calcitriol: 1,25-dihidroxicolecalciferol, 1,25-DHCC) El calcio se combina con ciertos aniones en el lumen del intestino para formar sales insolubles (como fosfato de calcio y oxalato de calcio) que no son absorbidas.
En este mismo sentido, un adulto que ingiera una cantidad de 1.000 mg/día, debido a estos dos factores solo podrá absorber entre 400 a 500 mg/día; de esta cantidad, 300 mg se perderán en las heces quedando una absorción neta entre 100 a 200 mg/día. 3.2 Regulación y control de las concentraciones de calcio La homeostasis de calcio está sometida a control por múltiples vías hormonales como: Vitamina D, factor de crecimiento de fibroblastos 23 (FGF-23), calcitonina, estrógenos y la Paratohormona (PTH). La PTH es un polipéptido de 84 a. a. secretado por las glándulas paratiroides como respuesta a una baja concentración sérica de calcio iónico. La PTH induce la resorción ósea y promueve la reabsorción del calcio en los túbulos renales, evitando que se excrete en orina.
La Vitamina D es una vitamina liposoluble que se presenta en las siguientes formas: • • •
•
Forma natural o Colecalciferol o Vitamina D3 (forma inactiva): su principal fuente natural es la síntesis dérmica por acción de la radiación ultravioleta sobre el 7-deshidrocolesterol. Ergocalciferol o Vitamina D2 (forma inactiva) 25-hidroxivitamina D o 25(OH)D o Calcidiol: producida por acción enzimática a nivel hepático y constituye la principal forma de circulación de la Vitamina D en plasma por lo que es el mejor indicador para estimar la suficiencia de Vitamina D. 1,25-dihidroxivitamina D o Calcitriol: única forma activa de la Vitamina D originada por el metabolismo del Calcidiol en los riñones.
En su forma activa, la Vitamina D estimula la absorción de calcio en la luz intestinal, promover la resorción ósea y disminuir la excreción renal del calcio iónico y del fosfato. En el caso de la calcitonina, hormona hipocalcemiante secretada por las células de la glándula tiroidea, inhibe la resorción ósea influyendo de manera relativamente escasa en la regulación del calcio. Los mecanismos que intervienen en la regulación del calcio se pueden apreciar en el Gráfico 5.
Elaboró:
Máster Oscar Puente
Revisó:
Dr. Santiago Escalante
Aprobó:
Dr. Santiago Escalante
Cargo: Fecha
Docente 11/08/2020
Cargo: Fecha:
Coordinador Carrera 20/08/2020
Cargo: Fecha:
Coordinador Carrera 20/08/2020
Facultad de Medicina
Carrera de Bioquímica Clinica
Manual de prácticas de Laboratorio de Bioquímica Clínica III Plan: B011
Cód. asignatura: Q0224-05
Nivel: Q108-07-70 Versión: 2.0 Página 30 de 158
Gráfico 5 Regulación del Calcio Plasmático
3.3 Calcio plasmático Una vez en el plasma, el calcio circula en diferentes formas: • • •
40% del calcio se une con albúmina para su transporte, y el grado de unión depende del pH sanguíneo. En condiciones de pH ácido, esta unión es menor y viceversa. 15% del calcio forma complejos con citratos, fosfatos o sulfatos 45% del calcio restante circula como calcio libre o ionizado, siendo esta la fracción biológicamente activa, por lo tanto, esta forma es reconocida por las glándulas paratiroides afectando la concentración de la PTH. (Gaw, 2015)
3.4 Determinación de calcio plasmático A nivel de laboratorio, normalmente se hace una cuantificación de Calcio Total (ionizado +enlazado a proteínas). Esto podría generar problemas a la hora de interpretar los resultados, ya que variaciones en la concentración de albúmina provocan cambios en la concentración total de calcio; si la concentración de albúmina disminuye, la concentración de calcio total también. En pacientes con diagnóstico de Hipoalbuminemia, trastornos del equilibrio ácido-básico y pacientes con enfermedad renal crónica, se debe tener cuidado en la interpretación del calcio plasmático. Para estos casos, se siguiere calcular el “calcio corregido”. Existen varias fórmulas, pero su Elaboró:
Máster Oscar Puente
Revisó:
Dr. Santiago Escalante
Aprobó:
Dr. Santiago Escalante
Cargo: Fecha
Docente 11/08/2020
Cargo: Fecha:
Coordinador Carrera 20/08/2020
Cargo: Fecha:
Coordinador Carrera 20/08/2020
Facultad de Medicina
Carrera de BioquĂmica Clinica
Manual de prĂĄcticas de Laboratorio de BioquĂmica ClĂnica III Plan: B011
CĂłd. asignatura: Q0224-05
Nivel: Q108-07-70 VersiĂłn: 2.0 PĂĄgina 31 de 158
interpretaciĂłn estĂĄ en que, si la concentraciĂłn de albĂşmina no es normal en el paciente, se calcula el valor del calcio total en caso de que la albĂşmina hubiese sido normal. đ??śđ?‘Žđ?‘™đ?‘?đ?‘–đ?‘œ đ?‘?đ?‘œđ?‘&#x;đ?‘&#x;đ?‘’đ?‘”đ?‘–đ?‘‘đ?‘œ (
đ?‘šđ?‘” đ?‘”đ?‘&#x; ) = đ??śđ?‘Žđ?‘™đ?‘?đ?‘–đ?‘œ đ?‘Ąđ?‘œđ?‘Ąđ?‘Žđ?‘™ đ?‘‘đ?‘’đ?‘Ąđ?‘’đ?‘&#x;đ?‘šđ?‘–đ?‘›đ?‘Žđ?‘‘đ?‘œ + (4 − đ?‘?đ?‘œđ?‘›đ?‘?đ?‘’đ?‘›đ?‘Ąđ?‘&#x;đ?‘Žđ?‘?đ?‘–Ăłđ?‘› đ?‘Žđ?‘™đ?‘?Ăşđ?‘šđ?‘–đ?‘›đ?‘Ž ( )) Ă— 0,8 đ?‘‘đ??ż đ?‘‘đ??ż
Realicemos un ejemplo para aplicar esta fĂłrmula: Tenemos un paciente con aparentemente hipocalcemia, su resultado determinado por el mĂŠtodo de Ć&#x;-cresoftaleĂna fue de 7,51 mg/dl y su determinaciĂłn de albĂşmina fue 3,1 gr/dL. Con forme dice la teorĂa, en pacientes con hipo albuminuria y se requiere conocer la concentraciĂłn de calcio total, se debe corregir el valor de calcio total, por lo tanto: đ??śđ?‘Žđ?‘™đ?‘?đ?‘–đ?‘œ đ?‘?đ?‘œđ?‘&#x;đ?‘&#x;đ?‘’đ?‘”đ?‘–đ?‘‘đ?‘œ (
đ?‘šđ?‘” ) = 7,51 đ?‘šđ?‘”/đ?‘‘đ??ż + (4 − 3,1 đ?‘”đ?‘&#x;/đ?‘‘đ??ż) Ă— 0,8 đ?‘‘đ?‘™
đ??śđ?‘Žđ?‘™đ?‘?đ?‘–đ?‘œ đ?‘?đ?‘œđ?‘&#x;đ?‘&#x;đ?‘’đ?‘”đ?‘–đ?‘‘đ?‘œ (
đ?‘šđ?‘” ) = 8,23 đ?‘šđ?‘”/đ?‘‘đ??ż đ?‘‘đ??ż
Como se puede apreciar en este caso, la condiciĂłn de hipoalbuminemia genera una pseudohipocalemia, ya que, al corregir el valor, el valor de calcio total es normal. Por el otro lado, con el mismo paciente, pero con un valor de albĂşmina normal, tendrĂamos: Calcio total de 7,51 mg/dl y albĂşmina humana de 4,1 gr/dl, aplicando la fĂłrmula: đ??śđ?‘Žđ?‘™đ?‘?đ?‘–đ?‘œ đ?‘?đ?‘œđ?‘&#x;đ?‘&#x;đ?‘’đ?‘”đ?‘–đ?‘‘đ?‘œ (
đ?‘šđ?‘” ) = 7,51 đ?‘šđ?‘”/đ?‘‘đ??ż + (4 − 4,1 đ?‘”đ?‘&#x;/đ?‘‘đ??ż) Ă— 0,8 đ?‘‘đ??ż
đ??śđ?‘Žđ?‘™đ?‘?đ?‘–đ?‘œ đ?‘?đ?‘œđ?‘&#x;đ?‘&#x;đ?‘’đ?‘”đ?‘–đ?‘‘đ?‘œ (
đ?‘šđ?‘” ) = 7,43 đ?‘šđ?‘”/đ?‘‘đ??ż đ?‘‘đ??ż
Como se puede apreciar, en este caso realmente hay un estado de hipocalcemia, ya que la albĂşmina estĂĄ normal y la deficiencia es directamente relacionada con la falta de calcio total.
4. Actividades prĂĄcticas La actividad programada para esta prĂĄctica finalizarĂĄ con la determinaciĂłn cuantitativa de Calcio total con valores simuladas y proporcionados por el profesor. En relaciĂłn con las metodologĂas analĂticas para determinar Calcio total, existen varias, desde la espectrofotometrĂa de absorciĂłn de atĂłmica, formaciĂłn de complejo de Ć&#x;-cresoftaleĂna o el mĂŠtodo de Arsenazo III.
ElaborĂł:
MĂĄster Oscar Puente
RevisĂł:
Dr. Santiago Escalante
AprobĂł:
Dr. Santiago Escalante
Cargo: Fecha
Docente 11/08/2020
Cargo: Fecha:
Coordinador Carrera 20/08/2020
Cargo: Fecha:
Coordinador Carrera 20/08/2020
Facultad de Medicina
Carrera de Bioquímica Clinica
Manual de prácticas de Laboratorio de Bioquímica Clínica III Plan: B011
Cód. asignatura: Q0224-05
Nivel: Q108-07-70 Versión: 2.0 Página 32 de 158
4.1 Método de Arsenazo III El uso del reactivo Arsenazo III (ácido 1,8-dihidroxi-3,6-disulfo-2,7-naftalenen-bis(azo)dibenzenarsónico) provoca la formación de un complejo con moléculas orgánicas, en medios ligeramente ácidos. Para el caso del calcio, forman un complejo de color azul que puede ser medido foto colorimétricamente entre 600 nm y 650 nm, siendo directamente proporcional a la concentración de calcio total en la muestra (Wiener, 2019) 4.2 Método de Ɵ-Cresoftaleína Este método provoca la formación de un complejo de Ɵ-cresoftaleína de color púrpura en presencia de un medio alcalino. Esta solución es medida en una longitud de onda entre 540 nm a 570 nm. El desarrollo del color es directamente proporcional a la concentración de calcio total en la muestra. Este será el método que vamos a usar en nuestra práctica de laboratorio. 4.2.1
Reactivos, materiales y equipos
Tabla 12 Insumos requeridos para la determinación de Calcio total Reactivos
Materiales
Equipos
Puntas amarillas sin filtro Puntas azules sin filtro Pipetas mono canal volumen variable: 10 a 100 µL Calcio Liquicolor CPC método REF 10011
Pipetas mono canal volumen variable: 100 a 1000µL Guantes descartables
Espectrofotómetro Cronómetros
Tubos plásticos 12 x 75 mm Tapones plásticos para tubos de 12 x 75 mm Agua Destilada tipo II
4.2.2
Procedimiento
El procedimiento para la determinación de Calcio total está basado en el inserto versión INF 101101 D del 02-2018-26 referencia de reactivo 10011 y los pasos principales son: 4.2.2.1 Preparación de la muestra Como se mencionó antes, el Calcio es un ion importante, por lo tanto, las únicas muestras validadas para su determinación son: •
Suero
Elaboró:
Máster Oscar Puente
Revisó:
Dr. Santiago Escalante
Aprobó:
Dr. Santiago Escalante
Cargo: Fecha
Docente 11/08/2020
Cargo: Fecha:
Coordinador Carrera 20/08/2020
Cargo: Fecha:
Coordinador Carrera 20/08/2020
Facultad de Medicina
Carrera de Bioquímica Clinica
Manual de prácticas de Laboratorio de Bioquímica Clínica III Plan: B011
•
Cód. asignatura: Q0224-05
Nivel: Q108-07-70 Versión: 2.0 Página 33 de 158
Plasma con heparina de litio
Las muestras obtenidas con citrato de calcio o con EDTA no son recomendables porque cumplen con su función de quelar el calcio. 4.2.2.2 Preparación del reactivo del trabajo (RT) El kit viene provisto de Buffer (BUF) y reactivo (RGT). Para preparar el reactivo de trabajo (RT) se deben mezclar partes iguales de los dos reactivos descritos anteriormente en función del número de pruebas a realizar. Para este caso, cada alumno preparará 3 ml de RT, lo que significa que tomarán 1.5 de BUF + 1.5 de RGT. Esta preparación se realizará en los tubos cónicos color verde proporcionados por el profesor. Esta solución debe ser conservada tapada, en posición vertical y protegida de la luz por un lapso de 30 minutos. A continuación, se describen las condiciones generales del ensayo: -
La temperatura establecida para esta actividad será a >30o C. Lectura frente a un blanco de reactivo. Usar 570 nm como filtro. Llevar todos los reactivos y muestras a temperatura ambiente. Preparar un cronómetro con cinco minutos. Concentración del estándar: 8 mg/dl
Tabla 13 Esquema de reacción para Calcio Total Reactivos y reactantes RT (µL) Muestra (µL) Estándar (µL)
CANTIDAD 1.000 20 20
Una vez realizada la mezcla, se deben realizar las lecturas del estándar y la muestra entre 5 y 30 minutos. 4.2.3
Fuentes de error
La principal fuente de errores analíticos es el uso de material de vidrio, por lo tanto, la preparación y las reacciones deben realizarse en tubos de plástico. Las muestras obtenidas de vías de hidratación no deben ser usadas para la determinación de electrolitos; en pacientes con hipoalbuminemia se debe realizar el cálculo del calcio corregido. Elaboró:
Máster Oscar Puente
Revisó:
Dr. Santiago Escalante
Aprobó:
Dr. Santiago Escalante
Cargo: Fecha
Docente 11/08/2020
Cargo: Fecha:
Coordinador Carrera 20/08/2020
Cargo: Fecha:
Coordinador Carrera 20/08/2020
Facultad de Medicina
Carrera de BioquĂmica Clinica
Manual de prĂĄcticas de Laboratorio de BioquĂmica ClĂnica III Plan: B011
4.2.4
CĂłd. asignatura: Q0224-05
Nivel: Q108-07-70 VersiĂłn: 2.0 PĂĄgina 34 de 158
Valores de alerta (crĂticos, pĂĄnico)
Las concentraciones de calcio bajas (hipocalcemia) confirmadas deben ser informadas de manera urgente al mĂŠdico, ya que pueden presentarse con signos de tetania. Las concentraciones de hipercalcemia pueden interferir otros sistemas, afectando al corazĂłn y cerebro, promover la formaciĂłn de cĂĄlculos renales y debilitar los huesos. 4.2.5
Valores de referencia
La concentraciĂłn de calcio total, para pacientes aparentemente sanos adultos es: Tabla 14 Intervalo de referencia de Calcio Total
Magnitud Calcio Total
Intervalo de referencia 8,10 a 10,4 mg/dL
5. CĂĄlculos y/o resultados Una vez obtenidas las absorbancias, se debe aplicar la fĂłrmula para aplicar la Ley de Beer: đ??śđ?‘œđ?‘›đ?‘?đ?‘’đ?‘›đ?‘Ąđ?‘&#x;đ?‘Žđ?‘?đ?‘–Ăłđ?‘› đ??śđ?‘Žđ?‘™đ?‘?đ?‘–đ?‘œ đ?‘Ąđ?‘œđ?‘Ąđ?‘Žđ?‘™ =
đ??´đ?‘?đ?‘ đ?‘œđ?‘&#x;đ?‘?đ?‘Žđ?‘›đ?‘?đ?‘–đ?‘Ž đ?‘šđ?‘˘đ?‘’đ?‘ đ?‘Ąđ?‘&#x;đ?‘Ž Ă— đ??šđ?‘Žđ?‘?đ?‘Ąđ?‘œđ?‘&#x; đ??´đ?‘?đ?‘ đ?‘œđ?‘&#x;đ?‘?đ?‘Žđ?‘›đ?‘?đ?‘–đ?‘Ž đ?‘’đ?‘ đ?‘ĄĂĄđ?‘›đ?‘‘đ?‘Žđ?‘&#x;
đ??śđ?‘œđ?‘›đ?‘?đ?‘’đ?‘›đ?‘Ąđ?‘&#x;đ?‘Žđ?‘?đ?‘–Ăłđ?‘› đ??śđ?‘Žđ?‘™đ?‘?đ?‘–đ?‘œ đ?‘Ąđ?‘œđ?‘Ąđ?‘Žđ?‘™ =
∆ đ??´ đ?‘šđ?‘˘đ?‘’đ?‘ đ?‘Ąđ?‘&#x;đ?‘Ž Ă—8 ∆ đ??´ đ?‘’đ?‘ đ?‘ĄĂĄđ?‘›đ?‘‘đ?‘Žđ?‘&#x;
Desarrollemos un ejemplo para aplicar la fĂłrmula. Absorbancia de la muestra: 0,356 Absorbancia del estĂĄndar: 0,450 ConcentraciĂłn del estĂĄndar: 8 mg/dL đ??śđ?‘œđ?‘›đ?‘?đ?‘’đ?‘›đ?‘Ąđ?‘&#x;đ?‘Žđ?‘?đ?‘–Ăłđ?‘› đ??śđ?‘Žđ?‘™đ?‘?đ?‘–đ?‘œ đ?‘Ąđ?‘œđ?‘Ąđ?‘Žđ?‘™ =
0,356 Ă—8 0,450
đ??śđ?‘œđ?‘›đ?‘?đ?‘’đ?‘›đ?‘Ąđ?‘&#x;đ?‘Žđ?‘?đ?‘–Ăłđ?‘› đ??śđ?‘Žđ?‘™đ?‘?đ?‘–đ?‘œ đ?‘Ąđ?‘œđ?‘Ąđ?‘Žđ?‘™ = 6,32 đ?‘šđ?‘”/đ?‘‘đ??ż
ElaborĂł:
MĂĄster Oscar Puente
RevisĂł:
Dr. Santiago Escalante
AprobĂł:
Dr. Santiago Escalante
Cargo: Fecha
Docente 11/08/2020
Cargo: Fecha:
Coordinador Carrera 20/08/2020
Cargo: Fecha:
Coordinador Carrera 20/08/2020
Facultad de Medicina
Carrera de Bioquímica Clinica
Manual de prácticas de Laboratorio de Bioquímica Clínica III Plan: B011
Cód. asignatura: Q0224-05
Nivel: Q108-07-70 Versión: 2.0 Página 35 de 158
6. Presentación de Informe de resultados de laboratorio El informe de resultados se debe presentar a través del Moodle, en formato pdf, con forme los requisitos descritos en el Anexo 3.
7. Conclusiones y recomendaciones Al final de esta práctica, el alumno podrá: •
•
Identificar el efecto que usar material no adecuado para la determinación de electrolitos o magnitudes iónicas a nivel de laboratorios clínicos al igual que el efecto que provoca el tipo de matriz en la determinación de calcio total. Proponer marcadores bioquímicos relacionados con patologías óseas y aportar con el diagnóstico por el laboratorio para estas patologías.
8. Anexos relacionados
Inserto calcio o-cresoftaleina.pdf
9. Bibliografía Antoni Castells, H. C. (2017). Test de Laboratorio en Gastroenterología y Hepatología (Vol. 10). (J. C.-P. Santos Santolaria, Ed.) Barcelona, España: ELSEVIER. Gaw, A. (2015). Bioquímica clínica : texto y atlas en color ([tr. 5a. ed. ing. ed.). Madrid: Elsevier. John W. Baynes, Marek H. Dominiczak. (2015). Bioquímica médica (4a. Ed. ed.). Barcelona: Elsevier. Shauna Anderson, S. C. (1995). Bioquímica Clínica. Philadelphia: Interanericana McGraw-Hill. Wiener. (6 de Septiembre de 2019). Wiener Lab Argentina. Obtenido de https://www.wienerlab.com.ar/VademecumDocumentos/Vademecum%20espanol/ca_color_arsenazo_3_aa_s p.pdf
Elaboró:
Máster Oscar Puente
Revisó:
Dr. Santiago Escalante
Aprobó:
Dr. Santiago Escalante
Cargo: Fecha
Docente 11/08/2020
Cargo: Fecha:
Coordinador Carrera 20/08/2020
Cargo: Fecha:
Coordinador Carrera 20/08/2020
C
Fosfatemia
AA
Método UV para la determinación de fósforo inorgánico (Pi) en suero, plasma u orina SIGNIFICACION CLINICA El fósforo se encuentra en el organismo formando parte de compuestos orgánicos (proteínas, lípidos, carbohidratos, ácidos nucleicos, etc.) o como fosfatos inorgánicos, cumpliendo diversas funciones (transporte de energía, estructura de los tejidos, mantenimiento del pH de los líquidos corporales). Los tejidos óseo y muscular lo contienen como constituyente esencial y es notable su participación en la composición del tejido nervioso. Su concentración en circulación está regulada entre otros factores por los niveles de vitamina D y las glándulas endócrinas, observándose variaciones fisiológicas de acuerdo a la edad, ingesta, actividad física, embarazo, etc. Existen situaciones patológicas en las que se altera este equilibrio, produciéndose anormalidades en la concentración de fósforo circulante. Niveles elevados de fósforo sérico son encontrados en el hipoparatiroidismo, mientras que el hiperparatiroidismo conduce a la situación contraria. También puede encontrarse hiperfosfatemia por hipervitaminosis D y diversos trastornos renales, mientras que la hipofosfatemia se relaciona con deficiencias de vitamina D y defectos en la reabsorción de fósforo a nivel renal. FUNDAMENTOS DEL METODO El fósforo inorgánico (Pi) reacciona en medio ácido con el molibdato para dar un complejo fosfomolíbdico que se mide espectrofotométricamente a 340 nm. REACTIVOS PROVISTOS A. Reactivo A: solución de molibdato de amonio 2 mmol/l en ácido sulfúrico 1%. S. Standard*: solución estabilizada de fosfatos equivalente a 4 mg/dl de fósforo inorgánico. REACTIVOS NO PROVISTOS Calibrador A plus de Wiener lab. INSTRUCCIONES PARA SU USO Reactivos Provistos: listos para usar. PRECAUCIONES Los Reactivos son para uso diagnóstico "in vitro". El Reactivo A es corrosivo. H315 + H320: Provoca irritación cutánea y ocular. H314: Provoca quemaduras graves en la piel y lesiones oculares graves. P262: Evitar el contacto con los ojos, la piel o la ropa. P305 + P351 + P338: EN CASO DE CONTACTO CON LOS OJOS: Enjuagar cuidadosamente con agua durante varios minutos. Quitar las lentes de contacto, si lleva y resulta * No provisto en todas las presentaciones
fácil. Seguir enjuagando. P302 + P352: EN CASO DE CONTACTO CON LA PIEL: Lavar con agua y jabón abundantes. P280: Llevar guantes/prendas/gafas/máscara de protección. Utilizar los reactivos guardando las precauciones habituales de trabajo en el laboratorio de análisis clínicos. Todos los reactivos y las muestras deben descartarse de acuerdo a la normativa local vigente. ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO Los Reactivos Provistos son estables a temperatura ambiente hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS Cuando el espectrofotómetro ha sido llevado a cero con agua destilada, la lectura de absorbancia del Reactivo A no debe ser superior a 0,500 D.O. En caso contrario, desechar. MUESTRA Suero, plasma u orina a) Recolección: obtener suero de la manera usual o plasma con EDTA o citrato. También puede realizarse la determinación en orina. En este caso, recoger orina de 24 horas en un recipiente que contenga 2 ml de ácido clorhídrico concentrado. Homogeneizar y medir la diuresis. Tomar una alícuota, centrifugar o filtrar y efectuar una dilución 1:10 en agua destilada (1 ml de orina + 9 ml de agua destilada). Proceder en la misma forma que la descripta en PROCEDIMIENTO. b) Aditivos: en caso de que la muestra a utilizar sea plasma, se recomienda el uso de Anticoagulante W o TP de Wiener lab. para su obtención. c) Sustancias interferentes conocidas: - No se observan interferencias por bilirrubina hasta 58 mg/l. - La hemólisis o lipemia son causa de resultados erróneos. Se recomienda procesar un blanco de muestras para evitar estas interferencias. Referirse a la bibliografía de Young para los efectos de las drogas en el presente método. d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: el suero o plasma debe ser separado de los glóbulos rojos dentro de las 2 horas de extraída la muestra, debido a que los eritrocitos contienen fosfatos orgánicos lábiles que pueden conducir a resultados falsamente elevados. El fósforo inorgánico es estable en el suero 8 horas a temperatura ambiente. En caso de no procesarse dentro de ese lapso, se puede refrigerar (2-10oC) hasta 7 días. La orina de 24 horas es estable 7 días refrigerada (2-10oC).
MATERIAL REQUERIDO (no provisto) - Espectrofotómetro - Micropipetas y pipetas para medir los volúmenes indicados. - Cubetas espectrofotométricas - Reloj o timer
individuos habitantes de la ciudad de Rosario (Argentina), de ambos sexos (entre 20 y 45 años), sin síntomas de enfermedad paratiroidea, renal o hepática o de deficiencia de vitamina D.
CONDICIONES DE REACCION - Longitud de onda: 340 nm (Hg 334 ó 366 nm) - Temperatura de reacción: temperatura ambiente - Tiempo de reacción: 10 minutos - Volumen de muestra: 10 ul - Volumen de reacción final: 1,01 ml
Orina 0,3 - 1,0 g/24 horas Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia. CONVERSION DE UNIDADES AL SISTEMA SI Pi (mg/dl) x 0,323 = Pi (mmol/l)
PROCEDIMIENTO En tres cubetas marcadas B (Blanco), S (Standard) y D (Desconocido), agregar:
B
S
Standard
-
10 ul
-
Muestra
-
-
10 ul
1 ml
1 ml
1 ml
Reactivo A
D
Incubar 10 minutos a temperatura ambiente. Luego leer en espectrofotómetro a 340 nm (Hg 334 ó 366 nm), llevando el aparato a cero con el blanco. ESTABILIDAD DE LA MEZCLA DE REACCION FINAL La reacción final es estable 20 minutos, por lo que la absorbancia debe ser leída en ese lapso. CALCULO DE LOS RESULTADOS Suero o plasma: Fósforo inorgánico (Pi) (mg/dl) = D x f 4 mg/dl donde f = S Orina:
D D Pi (g/24 horas) = x 0,040 x 10 x V = x 0,4 x V S S donde: 0,040 g/l = 4 mg/dl = concentración del Standard 10 = factor de dilución V = volumen de la diuresis expresado en litros/24 horas METODO DE CONTROL DE CALIDAD Si la muestra a ensayar es suero, procesar 2 niveles de un material de control de calidad (Standatrol S-E 2 niveles) con concentraciones conocidas de fósforo, con cada determinación. En el caso de muestras de orina, utilizar un control con base de orina. VALORES DE REFERENCIA Suero o plasma Adultos: 2,5 - 5,6 mg/dl Este rango se obtuvo de muestras provenientes de 120 (*)
Marca registrada de Ciba Corning Diagnostics
Niños: 4,0 - 7,0 mg/dl
LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO - Ver Sustancias interferentes conocidas en MUESTRA. - Todo el material de vidrio usado (incluso en la recolección de muestra) debe estar libre de fosfatos. Se recomienda, para su limpieza, usar Noion de Wiener lab. - Para lograr una mejor performance en los resultados, se recomienda procesar un Blanco de Muestra con cada determinación, reemplazando el Reactivo por solución fisiológica. Este procedimiento es indispensable en el caso de muestras turbias, ictéricas, lipémicas o hemolizadas. La absorbancia del Blanco de Muestra debe restarse de la obtenida para el Desconocido para efectuar los cálculos. PERFORMANCE Los ensayos fueron realizados en analizador automático Express Plus(*). a) Reproducibilidad: procesando replicados de la misma muestra, en un mismo día, se obtuvieron los siguientes datos: Nivel D.S. C.V. 3,6 mg/dl ± 0,09 mg/dl 2,64 % 7,5 mg/dl ± 0,16 mg/dl 2,18 % Procesando la misma muestra en diferentes días, se obtuvo: Nivel D.S. C.V. 3,5 mg/dl ± 0,11 mg/dl 3,09 % 7,3 mg/dl ± 0,22 mg/dl 2,98 % b) Recuperación: agregando cantidades conocidas de fosfato inorgánico a distintas muestras, se obtuvo una recuperación entre 98,4 y 103,5 %. c) Linealidad: la reacción es lineal hasta 16 mg/dl. En caso de obtener valores de fósforo inorgánico superiores, debe diluirse la muestra 1:2 con solución fisiológica y repetir la determinación multiplicando por 2 el resultado obtenido. d) Límite de detección: el menor cambio de concentración detectable será de 0,11 mg/dl. PARAMETROS PARA ANALIZADORES AUTOMATICOS Para las instrucciones de programación consulte el manual del usuario del analizador en uso. Para la calibración debe emplearse Calibrador A plus de Wiener lab. PRESENTACION - 1 x 100 ml (Cód. 1382321). - 4 x 20 ml (Cód. 1009311).
- 6 x 20 ml (Cód. 1009256). - 6 x 20 ml (Cód. 1009614). - 6 x 20 ml (Cód. 1009907). BIBLIOGRAFIA - Henry, R.J.; Cannon, D.C.; Winkelman, J.W. - "Clinical Chemistry, Principles and Techniques" - Harper and Row, Publishers, 1974. - Daly, J. A. and Ertingshausen - Clin. Chem. 18:263, 1972. - Amador, E. and Urban, J. - Clin. Chem. 18:601, 1972. - Young, D.S. - "Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests", AACC Press, 4th ed., 2001.
SIMBOLOS Los siguientes símbolos se utilizan en todos los kits de reactivos para diagnóstico de Wiener lab.
C
Este producto cumple con los requerimientos previstos por la Directiva Europea 98/79 CE de productos sanitarios para el diagnóstico "in vitro"
P Representante autorizado en la Comunidad Europea V Uso diagnóstico "in vitro" X
Contenido suficiente para <n> ensayos
H l
Fecha de caducidad
F
Riesgo biológico
Límite de temperatura (conservar a) No congelar
Volumen después de la reconstitución Cont.
Contenido
g
Número de lote
M
Elaborado por: Nocivo Corrosivo / Cáustico Irritante
i
Consultar instrucciones de uso
Calibr.
Calibrador
b
Control
b c h
Control Positivo Control Negativo Número de catálogo
M Wiener Laboratorios S.A.I.C. Riobamba 2944 2000 - Rosario - Argentina http://www.wiener-lab.com.ar Dir. Téc.: Viviana E. Cétola Bioquímica Producto Autorizado A.N.M.A.T. Cert. Nº: 38/92
Wiener lab. 2000 Rosario - Argentina