Facultad de Medicina
Carrera de Bioquímica Clinica
Manual de prácticas de Laboratorio de Bioquímica Clínica III Plan: B011
Cód. asignatura: Q0224-05
Nivel: Q108-07-70 Versión: 2.0 Página 20 de 159
PRÁCTICA 2 – DETERMINACIÓN DE TROPONINA I 1. Objetivo • •
Aplicar principios inmunológicos para la determinación de proteínas cardíacas en pacientes con posible infarto agudo de miocardio. Aplicar varios marcadores bioquímicos cuantificables a nivel de laboratorio para aportar con evidencia clínicamente relevante en pacientes con sospecha de patologías cardíacas.
2. Resultados de aprendizaje esperados • • •
Describir los procesos fisiológicos y fisiopatológicos de la función ósea, del equilibrio hidroelectrolítico, a sistema endócrino, aparato genital masculino, femenino y drogas de abuso en base a referentes teóricos. Correlacionar los resultados de laboratorio con el estado de salud del paciente de acuerdo con lo descrito en la literatura médica. Ejecutar los procesos preanalíticos, analíticos y posanalítico para la determinación de marcadores óseos, electrolitos, gases sanguíneos, hormonas, marcadores tumorales y drogas de abuso, teniendo en cuenta las normas de bioseguridad y el control de calidad respectivos.
3. Fundamento teórico Comencemos con una pequeña descripción del músculo, el ejercicio y la glucosa. El músculo es la localización principal de la eliminación de glucosa (captación desde la circulación) en el cuerpo y, por lo tanto, constituye una diana natural para el tratamiento de la hiperglucemia de la diabetes. El transportador de glucosa GLUT-4 es transportado hasta la superficie celular, no solo en respuesta a la insulina o a productos farmacéuticos, sino también en respuesta al estado de energía celular y por contracciones musculares. De este modo, el ejercicio actúa como regulador de los valores de glucemia, de hecho, el ejercicio es una excelente modalidad terapéutica en este contexto. El contenido y la actividad de la hexocinasa del músculo también aumentan con el ejercicio, tanto de forma aguda (unas 3 horas después de la primera sesión) como crónica (tras varias semanas de entrenamiento). Para comprender como las fibras musculares se relacionan con la Troponina, revisemos la tabla 7, donde se describen los elementos estructurales del músculo esquelético en función de su tamaño: Elaboró:
Máster Oscar Puente
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Dr. Santiago Escalante
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Dr. Santiago Escalante
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Docente 11/08/2020
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Tabla 7 Elementos estructurales del músculo esquelético Unidad microscópica
Fascículo: haz de células musculares
Unidad celular
Miofibra: célula multinucleada larga
Unidad subcelular
Miofibrilla: compuesta por proteínas miofilamentosas
Unidad funcional
Sarcómero: unidad contráctil, unidad repetida de la unidad de la miofibrilla
Componentes del miofilamento
Proteínas: principalmente actina y miosina
Es importante describir todas las proteínas musculares y sus funciones, por lo tanto, la tabla 8, encontraremos esta información. Tabla 8 Proteínas musculares y sus funciones Proteína
Función
Miosina
Actividad ATPasa dependiente de Ca++
Proteína C
Ensamblaje de la miosina en filamentos gruesos
Proteína M
Unión de los filamentos de miosina a las líneas M
Actina
La actina G polimeriza en actina F filamentosa Tropomiosina
estabilización y propagación de los cambios estructurales de la actina F
Troponinas C, I y T
Modulación de las interacciones actina-miosina
Actininas α y β
Estabilización de la actina F y anclaje de la línea Z
Nebulina
Posible función en la determinación de la longitud de los filamentos de actina F
Titina
Control de la tensión de reposo y longitud del sarcómero
Desmina
Organización de las miofibrillas en las células musculares
Distrofina
Refuerzo del citoesqueleto y de la membrana plasmática de la célula muscular
La actina y miosina representan alrededor del 90% de las proteínas musculares, pero se requieren diversas proteínas asociadas para el ensamblaje y la función del complejo de actomiosina.
3.1 Mioglobina La mioglobina es una proteína citoplasmática pequeña de 17 KDa capaz de transportar y reservar oxígeno y se encuentra en el músculo cardíaco y en otros músculos para promover el metabolismo Elaboró:
Máster Oscar Puente
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Dr. Santiago Escalante
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oxidativo. Cuando existen eventos de IAM, se libera relativamente rápido al torrente sanguíneo, alcanzando su pico máximo a las 2 horas del infarto. Debido a su tamaño es filtrada por el riñón para liberarse posteriormente en la orina. Como se explicó anteriormente en la Aplicación Clínica Diagnóstica de la CK, la liberación de grandes cantidades de mioglobina al torrente puede generar nefrotoxicidad. Un aumento de mioglobina en sangre es indicativo de lesión del tejido muscular, siendo muy sensible para detectar daño muscular, pero muy poco específico para e IAM. Altos concentraciones de mioglobina pueden aparecer rápidamente en la orina en varias condiciones que incluyen algunas enfermedades metabólicas: • • • •
Mioglobinuria hereditaria Mioglobinuria esporádica Sindrome de Cruch o rabdomiólisis de aplastamiento Falla cardiaca e IAM
3.2 Troponinas y Tropomiosina La activación de la contracción muscular en el músculo estriado por el calcio implica a proteínas asociadas a los filamentos finos, estas proteínas son: la tropomiosina y las troponinas. La tropomiosina es una proteína fibrosa que se extiende a lo largo de los surcos de la actina F; cada molécula contiene siete subunidades de actina G. Esta proteína interviene en la estabilización de la actina F y en la coordinación de los cambios conformacionales de las subunidades de actina durante la contracción. En ausencia de Ca++, la tropomiosina bloquea el lugar de unión de la miosina a la actina. Las Troponinas constituyen un complejo que se une a la tropomiosina: Tn-T (complejo de troponinas unida a tropomiosina), Tn-C (Troponina unida a calcio a través de 4 sitios de unión) y Tn-I (subunidad que inhibe la acción de la ATPasa actomiosina en relación con la concentración del calcio). La unión de calcio a la Tn-C (forma una proteína de tipo calmodulina), induce cambios en la Tn-I, que modifican la interacción entre tropomiosina y actina, exponiendo el sitio de unión a la miosina en la actina F y permitiendo interacciones actina-miosina. (John W. Baynes, Marek H. Dominiczak, 2015) En relación con las formas circulantes de la troponina tras un daño celular, podemos encontrar complejos ternarios que se representan con las siglas: C, T e I; complejos binarios como: C-I o I-T y formas libres de T e I, como se aprecia en el Gráfico 2.
Elaboró:
Máster Oscar Puente
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Dr. Santiago Escalante
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Gráfico 2 Estructura músculo cardíaco
3.3 Infarto agudo de miocardio El Infarto Agudo de Miocardio (IAM) ocurre cuando se bloquea el aporte de sangre, y por ende de oxígeno, al corazón. Esta isquemia provoca que las células del músculo cardiaco se alteren y dañen, liberando varias enzimas intracelulares a la sangre. El Gráfico 3 nos demuestra los niveles séricos y las varias enzimas que se pueden usar para detectar IAM.
Gráfico 3 Biomarcadores cardiacos séricos Elaboró:
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Dr. Santiago Escalante
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Sin embargo, desde la introducción de las pruebas para Troponinas (Tn) al comienzo de los noventa, se convirtieron rápidamente en el primer biomarcador completamente cardio específico, motivo por el cual ha sustituido a la CK-MB como biomarcador de elección para el diagnóstico de pacientes con sospecha de IAM. Actualmente, la sociedad de cardiología internacional recomiendas el uso de la cuantificación de Troponinas ultrasensibles (us-Tn), ya que se ha mejorado notablemente la sensibilidad analítica para cuantificar esta proteína, lo que ha permitido diferenciar diversos estados patológicos asociados al corazón sin llegar al diagnóstico de IAM. La troponina I puede ser detectada en plasma en el lapso de 3 a 6 horas después de síntomas de IAM o isquemia, registrando su pico máximo entre las 12 a 16 horas del evento, permaneciendo elevada así entre 5 y 10 días.
4. Actividades prácticas La actividad programada para esta práctica finalizará con la determinación cualitativa de Troponina I a través de la realización de una prueba inmunocromatográfica, marca ACCUBIO TECH basada en el uso de anticuerpos monoclonales contra la proteína Troponina I (anti-cTnI), la cual va a provocar la presencia de un inmunocomplejo visible en la zona de lectura. 4.1 Determinación de Troponina I 4.1.1
Reactivos, materiales y equipos
Tabla 9 Insumos requeridos para la determinación de CK NAC Reactivos
Materiales
Equipos
Rapid Troponin I Test Cassette REF: ABT-CT-B59
Puntas amarillas sin filtro
Cronómetros
Pipetas mono canal volumen variable: 10 a 100 µL Guantes descartables
4.1.2
Procedimiento
El procedimiento para la determinación de Troponina-I está basado en el inserto versión 1609-HBT referencia de reactivo ABT-CT-B59.
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Las condiciones preanalíticas son importantes en las pruebas de laboratorio, por lo tanto, la matriz recomendada para esta prueba será plasma heparinizada llevado a temperatura ambiente. Los sueros o plasmas pueden ser conservados entre 2o C a 8o C por un máximo de 3 días. Se aconseja revisar las condiciones intraindividuales e interindividual para garantizar el éxito en la determinación. Cada estudiante tendrá su propia muestra asignada. Sin embargo, los pasos principales son: 4.1.3
Desarrollo del procedimiento analítico
A continuación, se describen las condiciones generales del ensayo: -
La temperatura establecida para esta actividad será a >30o C. Llevar todos los reactivos y muestras a temperatura ambiente. Preparar un cronómetro con diez minutos.
Tabla 10 Esquema de reacción para Troponina I Reactivos y reactantes Buffer (µL) Muestra (µL)
CANTIDAD 50 40
Colocar primero la muestra en la zona de “muestra” seguida de la cantidad de buffer descrita. Cronometrar 10 minutos para realizar la lectura, con forme se describe en el Gráfico 4.
Gráfico 4 Procedimiento para determinar Troponina I
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Máster Oscar Puente
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4.1.4
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Fuentes de error
La temporización para la realización de las lecturas es vital. Es recomendable que se tenga establecido el tiempo en el cronómetro antes de empezar el ensayo. Revisar cuidadosamente el tipo de matriz que se usará para la prueba, porque la cantidad de muestra varía en función del tipo de matriz. Cualquier intensidad de colocar en la región de “test” debe ser considerada como positiva. Concentraciones < 0.04 ng/mL no van a ser detectadas por este método. La presencia de anticuerpos heterófilos o con títulos altos de Factor Reumatoideo puede afectar los resultados 4.1.5
Valores de referencia
Esta prueba es cualitativa, por lo tanto, se detecta la presencia o ausencia de Troponina I: Tabla 11 Intervalo referencia Troponina Cualitativa Analito Troponina I
4.1.6
Intervalo de referencia Negativo
Valores de alerta (críticos, pánico)
Al ser una prueba de carácter emergente, cualquier intensidad de línea debe ser informada al médico solicitante de manera urgente. Cuando se trata de us-Tn, se debe informar un valor cuantitativo al médico. Según estudios internacionales, el punto de corte es 0,04 ng/mL, por lo tanto, cualquier concentración por encima de ese valor puede sugerir de IAC o síndrome coronario agudo.
5. Cálculos y/o resultados Esta práctica no amerita de cálculo alguno.
6. Presentación de Informe de resultados de laboratorio El informe de resultados se debe presenta en a través del Moodle, en formato pdf y con forme los requisitos descritos en el Anexo 3.
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7. Conclusiones y recomendaciones Al final de esta práctica, el alumno podrá: •
Desarrollar el procedimiento técnico para procesar técnicas de inmunocromatografía respetando las instrucciones del fabricante y reporta los valores obtenidos bajo la premisa de que son pruebas que se reportan de manera urgente.
•
Sugerir la aplicación de los diversos marcadores bioquímicos para valorar a pacientes ingresados por los servicios de emergencia en sospecha de patologías cardíacas.
8. Anexos relacionados
inserto troponina I.pdf
CKMB_Creatine_Kina se_CK_MB_Isoenzyme_Serum_Test_Status_18April2018.pdf
9. Bibliografía American Association for Clinical Chemistry. (2019). LAB TESTS ONLINE. Recuperado el 26 de Agosto de 2019, de https://www.labtestsonline.es/tests/creatina-quinasa Gaw, A. (2015). Bioquímica clínica : texto y atlas en color ([tr. 5a. ed. ing. ed.). Madrid: Elsevier. John W. Baynes, Marek H. Dominiczak. (2015). Bioquímica médica (4a. Ed. ed.). Barcelona: Elsevier. Mayo Clinical Laboratories. (2019). Mayo Foundation for Medical Education and Research. Obtenido de https://www.mayocliniclabs.com/test-catalog/search.php?search=ckmb Organización Panamericana de la Salud. (2011). “Manual para la implementación de un sistema de triaje para los cuartos de urgencias (Matilde E. Molina ed.). Washington, D.C. Rodwell, V. W. (2016). Harper : bioquímica ilustrada (30a. Ed. ed.). México: McGraw-Hill. Shauna Anderson, S. C. (1995). Bioquímica Clínica. Philadelphia: Interanericana McGraw-Hill. Elaboró:
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TEST STATUS- OBSOLETE NOTIFICATION DATE: April 23, 2018 EFFECTIVE DATE: May 5, 2018
CREATINE KINASE (CK) MB ISOENZYME, SERUM Test ID: CKMB EXPLANATION: This test will become obsolete because of its limited clinical utility. Cardiac troponin (cTn) is preferred because of its clinical sensitivity and specificity for myocardial injury. Prior to development of troponin assays, creatine kinase-myocardial band (CK-MB) was useful for early evidence of myocardial injury. However, CK-MB is much less sensitive for the detection of myocardial injury than troponin as significantly more tissue injury is necessary for its detection. Therefore, according to 2012 Universal Definition of acute myocardial infarction (AMI) endorsed by the American College of Cardiology Foundation (ACCF), the European Society of Cardiology (ESC), the American Heart Association (AHA), and the World Heart Federation (WHF), cTn was deemed the preferred biomarker for the diagnosis of AMI. Additionally, the 2014 AHA/ACC guidelines concluded that CK-MB is not useful for the diagnosis of ACS (Class III, Level of Evidence: A). CK-MB has also been used to detect MI after percutaneous coronary intervention (PCI); however its utility remains controversial. RECOMMENDED ALTERNATIVE TEST:
TROPONIN T, 5TH GENERATION, PLASMA Test ID: TRPS METHODOLOGY: Electrochemiluminescent Immunoassay REFERENCE VALUES: Males: < or =15 ng/L Females: < or =10 ng/L SPECIMEN REQUIREMENTS: Container/Tube: Preferred: Lithium heparin gel Acceptable: Lithium heparin Specimen Volume: 1 mL Collection Instructions: 1. Lithium heparin gel tubes should be centrifuged within 2 hours of collection. 2. Plasma from lithium heparin tubes should be centrifuged and aliquoted within 2 hours of collection. Minimum Volume: 0.5 mL SPECIMEN STABILITY INFORMATION: Specimen Type Plasma Li Heparin
Temperature Frozen (preferred) Ambient Refrigerated
Time 365 days 24 hours 24 hours
CPT CODE: 84484 DAY(S) SET UP: Monday through Sunday; Continuously
ANALYTIC TIME: Same day/1 day
QUESTIONS: Contact your Mayo Medical Laboratories’ Regional Manager or Suha Andrea, MML Laboratory Technologist Resource Coordinator Telephone: 800-533-1710