Facultad de Medicina
Carrera de Bioquímica Clinica
Manual de prácticas de Laboratorio de Bioquímica Clínica III Plan: B011
Cód. asignatura: Q0224-05
Nivel: Q108-07-70 Versión: 2.0 Página 83 de 156
PRÁCTICA 10 – DETERMINACIÓN DE CORTISOL 1. Objetivo •
•
Determinar la concentración de la hormona cortisol en muestras biológicas para diferenciar estados salud-enfermedad en pacientes con síntomas y signos asociados a trastornos hormonales. Aplicar herramientas informáticas para la elaboración de curvas de calibración de métodos lineales y no lineales con el fin de encontrar la concentración de analitos según el nivel de su absorbancia.
2. Resultados de aprendizaje esperados •
•
•
Describir los procesos fisiológicos y fisiopatológicos de la función ósea, del equilibrio hidroelectrolítico, a sistema endócrino, aparato genital masculino, femenino y drogas de abuso en base a referentes teóricos. Seleccionar el método de análisis más adecuado para la determinación de marcadores óseos, electrolitos, gases sanguíneos, hormonas, marcadores tumorales y drogas de abuso, teniendo en cuenta las características técnicas de cada uno de ellos. Correlacionar los resultados de laboratorio con el estado de salud del paciente de acuerdo con lo descrito en la literatura médica.
3. Fundamento teórico 3.1 Glándulas suprarrenales Las glándulas suprarrenales se ubican justo por encima de los riñones y están constituidos por una capa externa, o corteza y por una capa interna, o médula. Desde el punto de visto anatómico funcional, se dividen en dos subórganos principales: la corteza suprarrenal, que secreta hormonas esteroideas y la medula suprarrenal, un ganglio nervioso modificado que secreta las catecolaminas: adrenalina y noradrenalina, como se aprecia en la Gráfica 13.
Elaboró:
Máster Oscar Puente
Revisó:
Dr. Santiago Escalante
Aprobó:
Dr. Santiago Escalante
Cargo: Fecha
Docente 11/08/2020
Cargo: Fecha:
Coordinador Carrera 20/08/2020
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Coordinador Carrera 20/08/2020
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Gráfica 13 Estructura anatómica de la Glándula Suprarrenal
3.1.1
Corteza suprarrenal
La corteza suprarrenal sintetiza y secreta hormonas esteroideas, las mismas son: •
•
Glucocorticoides: principalmente cortisol, que participa en el metabolismo de los hidratos de carbono y en respuesta al estrés. El exceso de glucocorticoides produce efectos catabólicos en el metabolismo de las proteínas. Mineralocorticoides: fundamentalmente aldosterona, que regulan el equilibrio electrolítico, regulando la homeostasis hidrosalina.
Elaboró:
Máster Oscar Puente
Revisó:
Dr. Santiago Escalante
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Dr. Santiago Escalante
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Docente 11/08/2020
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•
3.1.2
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Andrógenos: mayormente representada por la Testosterona, androstendiona, 17hidroxiprogesterona y sulfato de deshidroepiandrosterona (DHEAS), que modulan los caracteres sexuales secundarios y tienen efecto anabólico. La producción excesiva de andrógenos conlleva una virilización de la mujer.
Médula suprarrenal
La médula suprarrenal sintetiza catecolaminas. Las células cromafines de la médula suprarrenal se clasifican en almacenadoras de adrenalina y almacenadoras de noradrenalina. La adrenalina y la noradrenalina se almacenan en gránulos, que contienen además trifosfato de adenosina (ATP) y una proteína llamada cromogranina. Durante la exocitosis, los gránulos liberan todo su contenido. (Greenstein & Wood, 2016) La gráfica 14 nos muestra de mejor manera las diversas hormonas producidas por las glándulas suprarrenales y su origen.
Gráfica 14 Hormonas producidas por las glándulas suprarrenales Elaboró:
Máster Oscar Puente
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Dr. Santiago Escalante
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3.2 Síntesis de Glucocorticoides La pregnenolona se forma a partir del colesterol mediante la escisión de la cadena lateral, catalizada por el sistema enzimático de la desmolasa. Las lipoproteínas de baja densidad (LDL) son las principales trasportadoras del colesterol en la sangre, de estas la Apo-E se une a los receptores de las membranas de las células suprarrenales, lo que permite el transporte del colesterol, estimulado por la ACTH, al interior de la célula. Esta secuencia de acciones se denomina “vía del receptor de LDL”. Una vez que la pregnenolona se libera de la mitocondria, la metabolización continua en el retículo endoplasmático liso, donde el doble enlace de la posición 5´del anillo B pasa a la posición 4´del anillo A, mientras que el grupo hidroxilo (OH) de la posición 3´se oxida a un grupo ceto. El cortisol se forma a través de la hidroxilación de la posición 11´, como se aprecia en la gráfica 15. El cortisol es el principal glucocorticoide del ser humano, aunque sigue su metabolismo hacia el hígado, formando la cortisona.
Gráfico 15 Camino metabólico de la pregnenolona
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Máster Oscar Puente
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Dr. Santiago Escalante
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Coordinador Carrera 20/08/2020
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4. Actividades prácticas Para la determinación de Cortisol, es posible determinarlo en suero, orina y saliva, en condiciones de ayunas o no. Es importante considerar que la secreción de Cortisol está regida por su propio ritmo circadiano y también tiene secreción pulsátil. La hora recomendada para la recolección de cortisol está entre las 06h00 am y las 10h30 a.m, sin embargo se recomienda que la hora estándar para su recolección sea a las 08h00 a.m., sin embargo para tener un mejor panorama se requiere de una segunda toma sanguínea, recomendada a las 16h00. La práctica de laboratorio nos permitirá realizar la determinación de la hormona Cortisol en muestras biológicas asignadas a cada alumno; para el efecto se usará el kit comercial Monobind INc, con el kit código 3625-300. 4.1 Método de cuantificación La determinación de Cortisol en muestras biológicas será mediante la aplicación de un ensayo heterogéneo que corresponde a un ELISA en configuración tipo competitivo. 4.2 Reactivos, materiales y equipos Tabla 26 Materiales para la determinación de TSH REACTIVOS Reactivo para determinación de Cortisol REF 3625-300
MATERIALES
EQUIPOS
Puntas amarillas nuevas
Fotómetro HumanReader
Pipetas azules nuevas Tubos vidrio 12 x 75 nuevos Guantes descartables
Pipetas automáticas de volumen variable de 20 a 200 µ L Pipetas automáticas de volumen variable de 200 a 1000 µ L Cronómetro
Vasos para descartar puntas 1 ml de Suero fresco Papel absorbente Cinta selladora Vaso de precipitados 50 ml Agua Destilada tipo II
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Dr. Santiago Escalante
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Carrera de BioquĂmica Clinica
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4.2.1
VersiĂłn: 2.0
CĂłd. asignatura: Q0224-05
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Procedimiento
La determinaciĂłn de cortisol se llevarĂĄ a cabo siguiendo los pasos propuestos por el fabricante. Como recomendaciĂłn del fabricante, se deberĂĄ realizar una calibraciĂłn previa a la emisiĂłn de resultados, por lo tanto, se deberĂĄ correr una curva de calibraciĂłn a la par que se corren las muestras asignadas. En todo caso, las fases se resumen a continuaciĂłn: 4.2.1.1 PreparaciĂłn de la muestra: suero La muestra primaria es suero, fresco, conservado entre 2 o a 8o grados centĂgrados. Las muestras para este procedimiento no deben ser diluidas previamente. 4.2.1.2 PreparaciĂłn de la curva de calibraciĂłn El kit a usarse consta de seis calibradores, por lo tanto, se deberĂĄn procesar los 6 puntos, los mismos que constan con la siguiente concentraciĂłn: Tabla 27 Valores de los calibradores de TSH
Calibrador Cortisol calibrador 1 Cortisol calibrador 2 Cortisol calibrador 3 Cortisol calibrador 4 Cortisol calibrador 5 Cortisol calibrador 6
ConcentraciĂłn 0,0 1,0 4,0 10,0 20,0 50,0
Unidades Âľg/dl Âľg/dl Âľg/dl Âľg/dl Âľg/dl Âľg/dl
Por recomendación del fabricante, se procederå a correr por duplicada cada calibrador. 4.2.1.3 Preparación de Solución de lavado Para preparar la solución de lavado, se deben considerar las siguientes variables: • • •
a: # de pocillos usados b: # de lavadas recomendadas por cada pocillo c: Cantidad de soluciĂłn de lavado expresada en micras por cada pocillo
En tĂŠrminos generales, se puede aplicar la siguiente fĂłrmula: Âľđ??ż = (đ?‘Ž. đ?‘?. đ?‘?) ElaborĂł:
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Veamos el siguiente ejemplo: ÂżCuĂĄl es el volumen de soluciĂłn de lavado que se requiere preparar para procesar 12 muestras para cortisol, incluido el proceso de calibraciĂłn? Entonces definimos: a: 12 pacientes + 6 calibradores (2 pocillos por calibrador) = 12 + (6*2) b: 5 veces para cada pocillo (si se usa pizeta) c: 350 Âľ L por pocillo Âľđ??ż = (24.5.350) Âľđ??ż = 42.000 ≅ 42 đ?‘šđ??ż Una vez definida la cantidad total de mL que se requiere (42 mL) se procede a preparar la soluciĂłn de trabajo, considerando la concentraciĂłn de la soluciĂłn de lavado. SegĂşn la informaciĂłn de la etiqueta de la soluciĂłn de lavado, su presentaciĂłn es de 20 ml con una concentraciĂłn establecida (no proporcionada en el inserto). La recomendaciĂłn del inserto es preparar una soluciĂłn con aforando a un volumen de 1.000 ml para los 96 pocillos. En el caso del ejemplo, solo vamos a usar 24 pocillos, por lo que preparar los 1000 mL serĂa un desperdicio. Para estos casos se debe aplicar una regla de tres simple, donde se relacione:
Para calcular el valor de soluciĂłn de lavado que se debe tomar del frasco, se hace la siguiente operaciĂłn: đ?‘†đ?‘œđ?‘™. đ??żđ?‘Žđ?‘Łđ?‘Žđ?‘‘đ?‘œ đ?‘?đ?‘&#x;đ?‘’đ?‘?đ?‘Žđ?‘&#x;đ?‘Žđ?‘‘đ?‘Ž =
42 đ?‘šđ??ż đ?‘Ľ 20 đ?‘šđ??ż 1000 đ?‘šđ??ż
đ?‘†đ?‘œđ?‘™. đ??żđ?‘Žđ?‘Łđ?‘Žđ?‘‘đ?‘œ đ?‘?đ?‘&#x;đ?‘’đ?‘?đ?‘Žđ?‘&#x;đ?‘Žđ?‘‘đ?‘Ž = 0,84 đ?‘šđ??ż Esto significa que se deben medir 1,02 mL de la soluciĂłn de lavado concentrada y se debe aforar a un volumen de 51 mL, como se aprecia a continuaciĂłn:
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MĂĄster Oscar Puente
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41,16 + 0,84 42,00
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H2O (d) mL soluciĂłn lav. ml Total
Para preparar esta solución, se puede utilizar un vaso de precipitados y una bureta de 50 mL. La solución de lavado debe estar lista para usarse, apenas se termine la primera incubación. 4.2.1.4 Realización de la curva de calibración El procedimiento para realizar la curva de calibración debe considerar las siguientes recomendaciones: • • • •
Usar todos los puntos de calibraciĂłn recomendados por duplicado Correr al menos 2 controles de calidad por cada proceso de calibraciĂłn Calcular la concentraciĂłn de las muestras usando la ecuaciĂłn de la recta Revisar todos los criterios de validaciĂłn de la curva antes de aceptar los resultados
En tĂŠrminos generales, las absorbancias deben graficarse en el eje de las “yâ€? y la concentraciĂłn de los calibradores en el eje de las “xâ€?. La concentraciĂłn de las muestras desconocidas se de calcular usando la fĂłrmula de la ecuaciĂłn de la recta. Para calcular la concentraciĂłn de la muestra se sugiere usar el siguiente archivo en formato Excel: đ?‘Ś = đ?‘Žđ?‘Ľ + đ?‘? Donde cada variable representa: y = la absorbancia de la muestra a= pendiente b= intersecciĂłn x= concentraciĂłn de la muestra Al tener las absorbancias, debemos despejar de variable “xâ€? de la ecuaciĂłn, por lo tanto, tenemos: đ?‘Ľ=
(đ?‘Ś − đ?‘?) đ?‘Ž
Como este procedimiento es del tipo competitivo, se debe tener en cuenta que las absorbancias son inversamente proporcionales a las absorbancias obtenidas, por lo tanto, esto se debe tener presente cuando se realice la curva en el formato recomendado. ElaborĂł:
MĂĄster Oscar Puente
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Docente 11/08/2020
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4.2.1.5 Procedimiento para la práctica Cada alumno tendrá una tarea asignada, por lo tanto, todos vamos a participar en la construcción y procesamiento de esta técnica. Al tener tiempo limitado, los pasos deben realizarse de manera eficiente eliminando interrupciones innecesarias. Los pasos, en términos general son: 1. Preparar los materiales necesarios para el procesamiento de cortisol, esto incluye: pipetas, puntas nuevas, soportes de ELISA, agua destilada, calibradores, cronómetro y demás. 2. Definir el número total de pocillos a usarse según el número de muestras a procesar y su calibración correspondiente. 3. Pipetear 25 μ L de cada calibrador, muestra o controles en los pocillos respectivos. 4. Pipetear 50 μ L de la Enzima Cortisol a todos los pocillos. 5. Mezclar gentilmente los pocillos por un lapso de 30 segundos, evitar la presencia de burbujas o salpicaduras entre pocillos. 6. Adicionar 50 μ L de reactivo Biotina-Cortisol a todos los pocillos. 7. Mezclar gentilmente los pocillos por un lapso de 30 segundos, evitar la presencia de burbujas o salpicaduras entre pocillos. 8. Cubrir los pocillos con el cobertor de pocillos e incubar la placa por el lapso de 60 minutos a una temperatura ambiente. 9. Descartar el contenido por absorción o decantación, de ser necesario, usar papel secante para limpiar los pocillos. 10. Lavar todos los pocillos son 350 μ L de solución de lavado preparada por decantación o aspiración. Repetir el procedimiento descrito por el lapso de tres veces. Si se emplea una pizeta, se recomienda adicionar 2 lavados adicionales. 11. Pipetear 100 μ L del sustrato, el mismo que ya debe estar preparado anteriormente en partes iguales 1:1. Una vez colocado el sustrato no se recomienda movimientos gentiles de la placa. 12. Incubar la placa a temperatura ambiente por el lapso de 15 minutos. 13. Remover el cobertor de los pocillos y colocar 50 μ L de solución de lavado a cada pocillo y homogenizar gentilmente por 15 a 20 segundos. 14. Leer las absorbancias de cada pocillo con la ayuda de un fotómetro a 450 nm con un filtro diferencial de 620 a 630 nm máximo en 30 minutos después de colocar la solución de stop. 15. Registrar las absorbancias, realizar la curva de calibración y calcular la concentración de las muestras.
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4.3 Intervalos de referencia El valor normal de Cortisol recomendado por el kit es: Tabla 28 Intervalo de referencia Cortisol Cortisol
MaĂąana
Adulto
5,0 a 23,0 Îźg/dL
Tarde 3,0 a 13,0 Îźg/dL
NiĂąos
3,0 a 21,0 Îźg/dL
3,0 a 10,0 Îźg/dL
ReciĂŠn Nacidos
1,0 a 24,0 Îźg/dL
--
5. CĂĄlculos y/o resultados Como se mencionĂł en el punto 4.2.1.4. RealizaciĂłn de la curva de calibraciĂłn, se debe aplicar la siguiente fĂłrmula para calcular la concentraciĂłn de la muestra: đ?‘Ľ=
(đ?‘Ś − đ?‘?) đ?‘Ž
6. Conclusiones y recomendaciones Al final de la pråctica, el alumno deberå demostrar: • • •
Diferenciar la concentraciĂłn de cortisol en patologĂas como Enfermedad de Cushing y Enfermedad de Addison en nuestras obtenidas en diferentes momentos en el dĂa. Clasificar el origen de las hormonas esteroideas y catecolaminas y como su determinaciĂłn a nivel de laboratorio ayudan al diagnĂłstico de patologĂas establecidas. Aplicar herramientas informĂĄticas para la elaboraciĂłn de curvas de calibraciĂłn de mĂŠtodos lineales y no lineales con el fin de encontrar la concentraciĂłn de analitos segĂşn el nivel de su absorbancia
7. Anexos relacionados Se adjuntan los documentos que complementarĂĄn el entendimiento del tema desarrollado.
inserto Cortisol.pdf
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8. Bibliografía Gaw, A. (2015). Bioquímica Clínica - Texto a atlas a color (5tq ed.). Barcelona: ELSEVIER. Greenstein, B., & Wood, D. (2016). Endocrinología - Lo esencial de un vistazo (3er. ed.). Madrid: Editorial Médica Panamerica. John W. Baynes, Marek H. Dominiczak. (2015). Bioquímica médica (4a. Ed. ed.). Barcelona: Elsevier. Lange. (2013). Diagnóstico clínico y tratamiento (52a. ed.). México: McGrawHill. Lavin, N. (2003). Endocrinología y Metabolismo (3er ed.). Madrid: Marbán. Rodwell, V. W. (2016). Harper : bioquímica ilustrada (30a. Ed. ed.). México: McGraw-Hill. Shauna Anderson, S. C. (1995). Bioquímica Clínica. Philadelphia: Interanericana McGraw-Hill.
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