Facultad de Medicina
Carrera de Bioquímica Clinica
Manual de prácticas de Laboratorio de Bioquímica Clínica III Plan: B011
Cód. asignatura: Q0224-05
Nivel: Q108-07-70 Versión: 2.0 Página 73 de 156
PRÁCTICA 9 – DETERMINACIÓN de HORMONA ESTIMULANTE de TIROTROPINA 1. Objetivo • • •
Clasificar los diferentes tipos de inmunoensayos heterogéneos empleados para la determinación de hormonas de importancia clínica a nivel de un laboratorio clínico. Determinar la concentración de la hormona estimulante de tirotropina en muestras biológicas para clasificar a los pacientes en eutiroideos e hipotiroideos. Aplicar herramientas informáticas para la elaboración de curvas de calibración de métodos lineales y no lineales con el fin de encontrar la concentración de analitos según el nivel de su absorbancia.
2. Resultados de aprendizaje esperados •
•
•
Describir los procesos fisiológicos y fisiopatológicos de la función ósea, del equilibrio hidroelectrolítico, a sistema endócrino, aparato genital masculino, femenino y drogas de abuso en base a referentes teóricos. Seleccionar el método de análisis más adecuado para la determinación de marcadores óseos, electrolitos, gases sanguíneos, hormonas, marcadores tumorales y drogas de abuso, teniendo en cuenta las características técnicas de cada uno de ellos. Correlacionar los resultados de laboratorio con el estado de salud del paciente de acuerdo a lo descrito en la literatura médica.
3. Fundamento teórico 3.1 Tiroides La hormona estimulante de tiroides, referenciada también como Tirotropina o TSH es una hormona producida por la glándula tiroides, que se ubica anatómicamente hablando, debajo de la tráquea. Las células productoras de hormonas tiroideas se disponen en folículos y concentran yodo, que se utiliza para la síntesis de dichas hormonas. Estas hormonas circulantes son: la tiroxina (T 4) y la triyodotironina (T3), por lo tanto, las hormonas de interés clínico son: • • • •
TSH TT4 y TT3 – como hormonas totales fT4 y fT3 – como sus fracciones libres T3I – T3 inversa
Elaboró:
Máster Oscar Puente
Revisó:
Dr. Santiago Escalante
Aprobó:
Dr. Santiago Escalante
Cargo: Fecha
Docente 11/08/2020
Cargo: Fecha:
Coordinador Carrera 20/08/2020
Cargo: Fecha:
Coordinador Carrera 20/08/2020
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En términos generales, la función de estas hormonas está asociada al desarrollo y crecimiento normal y la homeostasis, ya que regulan la producción de energía. (Greenstein & Wood, 2016) Las células tiroideas cumplen con tres funciones principales: función exocrina (secretando sustancias al coloide), función absortiva (porque captan sustancias por pinocitosis desde el coloide) y función endócrina (al secretar hormonas tiroideas al torrente sanguíneo). 3.2 Hormonas tiroideas Las células tiroideas (denominadas células foliculares) poseen un mecanismo captador de yodo, que bombea el yoduro de la dieta al interior de la célula (gráfico 12). Esta bomba es muy potente, de modo que la concentración de yoduro es entre 25 y 50 veces mayor que en el plasma, alcanzando una concentración de yodo tiroideo de 600 mg/g de tejido. Los potenciadores que promueven la captación del yodo son: la TSH, la deficiencia de yodo, los anticuerpos antirreceptores de TSH y la retroalimentación. Por el contrario, los inhibidores de la captación son: iones I -, glucósidos cardíacos (por ejemplo, digoxina), tiocianato (SCN-) y perclorato (PCIO4).
Gráfico 12 Síntesis de hormonas tiroideas
Elaboró:
Máster Oscar Puente
Revisó:
Dr. Santiago Escalante
Aprobó:
Dr. Santiago Escalante
Cargo: Fecha
Docente 11/08/2020
Cargo: Fecha:
Coordinador Carrera 20/08/2020
Cargo: Fecha:
Coordinador Carrera 20/08/2020
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Al interior de la célula, el yoduro se oxida rápidamente por un sistema de peroxidasas y se convierte en un yodo reactivo, que reacciona de inmediato con los residuos de tirosina de una glicoproteína tiroidea llamada tiroglobulina, para formar los residuos de monoyodotirosina (T 1) o diyodotirosina (T2). Estos residuos se acoplan para formar triyodotironina (T3) o tiroxina (T4), aun unidas a la tiroglobulina que se almacena en el coloide. (Greenstein & Wood, 2016) Bajo el estímulo de la TSH, las gotitas del coloide son recaptadas mediante micropinocitosis por el citoplasma, donde se fusionan con los lisosomas y, al sufrir proteólisis, liberan los residuos de la tiroglobulina. Las deshalogenasas desyodan rápidamente la T 1 y la T2 y el yodo liberado se reciclan en las células foliculares. La triyodotironina y la tiroxina se liberan al torrente sanguíneo, donde se unen a proteínas plasmáticas como: globulina de unión a la tiroxina (TGB), prealbúmina de unión a la tiroxina (TBPA) y la albúmina. La fracción mayoritaria está ligada a proteínas y carece de actividad biológica, por lo cual solo la facción libre es activa. 3.3 Metabolismo La tiroides secreta entre 80 y 100 mg totales de T3 y T4 al día, y el cociente T4:T3 es de alrededor de 20:1. Aunque la T3 y la T4 circulan por la sangre, el 90 % de la T3 de los tejidos se obtiene por desyodación de T4. El yoduro liberado por las hormonas tiroideas se excreta por la orina o se redirige a la tiroides, donde se concentra por un mecanismo de atrapamiento. Cerca de ⅓ de T4 que sale del plasma se conjuga en el hígado con glucorónicos o sulfatos y se excreta en la bilis. La semivida de la T4 en plasma es de unos 6 a 7 días; para el caso de la T 3 es mucho menor, alcanzando solo 1 día de semivida, pero su potencia es mucho más que la T4. Existe una secreción diaria media entre 80 a 90 μg de T4, mientras que de T3, la secreción diaria media es de 20 a 30 μg. (Lavin, 2003) 3.4 Mecanismo de acción La T3 actúa sobre diferentes puntos de la célula. En la membrana, la hormona estimula la bomba Na+/K+-ATPasa, lo cual conlleva un incremento de la captación de aminoácidos y glucosa, que causa termogénesis (producción de calor). La T3 se une a receptores específicos de la mitocondria para generar energía y a receptores intranucleares moduladores de la transcripción, lo cual da lugar a una síntesis proteica alterada. En relación con los hidratos de carbono, las hormonas tiroideas ejercen acciones catabólicas en: • • • •
Estimulan la absorción intestinal de glucosa Estimulan la glucogenólisis hepática Estimulan la degradación de la insulina Potencian la acción glucogenolítica de la adrenalina
Elaboró:
Máster Oscar Puente
Revisó:
Dr. Santiago Escalante
Aprobó:
Dr. Santiago Escalante
Cargo: Fecha
Docente 11/08/2020
Cargo: Fecha:
Coordinador Carrera 20/08/2020
Cargo: Fecha:
Coordinador Carrera 20/08/2020
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Además, al ser hormonas muy lipolíticas, potencian (directa o indirectamente) la acción de otras hormonas como los glucocorticoides, el glucagón, la hormona de crecimiento o la adrenalina. 3.5 Crecimiento y desarrollo En el ser humano, una pequeña cantidad de T3 y T4 pasa desde la circulación materna a la fetal. Entre la semana 10 y 11 de gestación, cuando la tiroides del feto ya está diferenciada y funciona, la acción de las hormonas tiroideas se hace indispensable para la correcta maduración y diferenciación de los tejidos, aunque no es necesaria para el crecimiento normal del feto. Por eso, los bebés con hipotiroidismo congénito presentan un retraso en la maduración cerebral y ósea, pero su peso y talla al nacer son normales. En el cerebro, las hormonas tiroideas contribuyen a la mielinización, la síntesis de proteínas y la ramificación de los axones, en parte por activación de la síntesis del factor de crecimiento nervioso. La hormona de crecimiento resulta ineficaz en ausencia de hormonas tiroideas, que además son imprescindibles para su síntesis fisiológica.
4. Actividades prácticas Para la determinación de TSH, a nivel clínico se usan varias metodologías, como RIA (radioinmuno ensayo), ELISA (ensayo inmunosorbente ligado a enzimas), EQ (quimioluminiscencia) o ELQ (electroquimioluminiscencia), las mismas que permitieron medir concentraciones muy bajas en suero de esta hormona, por lo tanto, ayudaron a distinguir pacientes con estados de hipertiroidismo de estados de eutiroidismo. La TSH estructuralmente está formada por 1 subunidad α, una subunidad β y una cadena pesada de β- miosina. La subunidad α tiene notables semejanzas con otras hormonas y pueden provocar interferencias metodológicas. Generalmente, en los ensayos EQL se emplean 2 tipos de anticuerpos, y por lo menos uno de ellos se dirige contra la subunidad β de la TSH, ya que el primer anticuerpo se inmovilizada formando la fase sólida. (Shauna Anderson, 1995) En la práctica clínica, es posible determinar TSH en suero en condiciones de ayunas o no. Es importante considerar que la secreción de TSH está regida por su propio ritmo circadiano. La TSH experimenta un ligero aumento de concentración de 11 p.m. a 1 a.m. dándose este aumente con la inducción del sueño; por el contrario, su nivel más bajo se lo encuentra aproximadamente a las 11 a.m.
Elaboró:
Máster Oscar Puente
Revisó:
Dr. Santiago Escalante
Aprobó:
Dr. Santiago Escalante
Cargo: Fecha
Docente 11/08/2020
Cargo: Fecha:
Coordinador Carrera 20/08/2020
Cargo: Fecha:
Coordinador Carrera 20/08/2020
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La práctica de laboratorio nos permitirá realizar la determinación de la hormona TSH en muestras biológicas asignadas a cada alumno; para el efecto se usará el kit comercial InControl, con el kit código I231-3012. 4.1 Método de cuantificación La determinación de TSH en muestras biológicas será mediante la aplicación de un ensayo heterogéneo que corresponde a un ELISA en configuración tipo sánduche. 4.2 Reactivos, materiales y equipos Tabla 23 Materiales para la determinación de TSH REACTIVOS Reactivo para determinación de TSH REF I231-3012
MATERIALES
EQUIPOS
Puntas amarillas nuevas
Fotómetro HumanReader
Pipetas azules nuevas Tubos vidrio 12 x 75 nuevos Guantes descartables
Pipetas automáticas de volumen variable de 20 a 200 µ L Pipetas automáticas de volumen variable de 200 a 1000 µ L Cronómetro
Vasos para descartar puntas 1 ml de Suero fresco Papel absorbente Cinta selladora Vaso de precipitados 50 ml Agua Destilada tipo II
4.2.1
Procedimiento
La determinación de TSH se llevará a cabo siguiendo los pasos propuestos por el fabricante. Como recomendación del fabricante, se deberá realizar una calibración previa a la emisión de resultados, por lo tanto, se deberá correr una curva de calibración a la par que se corren las muestras asignadas. En todo caso, las fases se resumen a continuación: 4.2.1.1 Preparación de la muestra: suero La muestra primaria es suero, fresco, conservado entre 2o a 8o grados centígrados. Las muestras para este procedimiento no deben ser diluidas previamente.
Elaboró:
Máster Oscar Puente
Revisó:
Dr. Santiago Escalante
Aprobó:
Dr. Santiago Escalante
Cargo: Fecha
Docente 11/08/2020
Cargo: Fecha:
Coordinador Carrera 20/08/2020
Cargo: Fecha:
Coordinador Carrera 20/08/2020
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Carrera de BioquĂmica Clinica
Nivel: Q108-07-70
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CĂłd. asignatura: Q0224-05
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4.2.1.2 PreparaciĂłn de la curva de calibraciĂłn El kit por usarse consta de seis calibradores, por lo tanto, se deberĂĄn procesar los 6 puntos, los mismos que constan con la siguiente concentraciĂłn: Tabla 24 Valores de los calibradores de TSH Calibrador TSH calibrador 1 TSH calibrador 2 TSH calibrador 3 TSH calibrador 4 TSH calibrador 5 TSH calibrador 6
ConcentraciĂłn 0,0 0,5 2,5 5 10 20
Unidades ÂľUI/ml ÂľUI/ml ÂľUI/ml ÂľUI/ml ÂľUI/ml ÂľUI/ml
Por recomendación del fabricante, se procederå a correr por duplicada cada calibrador. 4.2.1.3 Preparación de Solución de lavado Para preparar la solución de lavado, se deben considerar las siguientes variables: • • •
a: # de pocillos usados b: # de lavadas recomendadas por cada pocillo c: Cantidad de soluciĂłn de lavado expresada en micras por cada pocillo
En tĂŠrminos generales, se puede aplicar la siguiente fĂłrmula: Âľđ??ż = (đ?‘Ž. đ?‘?. đ?‘?) Veamos el siguiente ejemplo: ÂżCuĂĄl es el volumen de soluciĂłn de lavado que se requiere preparar para procesar 12 muestras para TSH, incluido el proceso de calibraciĂłn? Entonces definimos: a: 12 pacientes + 6 calibradores (2 pocillos por calibrador) = 12 + (6*2) + 1 pocillo para blanco b: 5 veces para cada pocillo c: 350 Âľ L por pocillo Âľđ??ż = (25.5.350) Âľđ??ż = 43.750 ≅ 44 đ?‘šđ??ż
ElaborĂł:
MĂĄster Oscar Puente
RevisĂł:
Dr. Santiago Escalante
AprobĂł:
Dr. Santiago Escalante
Cargo: Fecha
Docente 11/08/2020
Cargo: Fecha:
Coordinador Carrera 20/08/2020
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Coordinador Carrera 20/08/2020
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Carrera de BioquĂmica Clinica
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CĂłd. asignatura: Q0224-05
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Una vez definida la cantidad total de mL que se requiere (44 mL) se procede a preparar la soluciĂłn de trabajo, considerando la concentraciĂłn de la soluciĂłn de lavado. SegĂşn la informaciĂłn de la etiqueta de la soluciĂłn de lavado, su presentaciĂłn es de 40 ml con una concentraciĂłn de 25x. La recomendaciĂłn del inserto es preparar una soluciĂłn con una concentraciĂłn de 1:25 aforada a un volumen de 1.000 ml para los 96 pocillos. En el caso del ejemplo, solo vamos a usar 25 pocillos, por lo que preparar los 1000 mL serĂa un desperdicio. Para estos casos se debe aplicar una regla de tres simple, donde se relacione:
Para calcular el valor de soluciĂłn de lavado concentrada 25x que se debe tomar del frasco, se hace la siguiente operaciĂłn: đ?‘†đ?‘œđ?‘™. đ??żđ?‘Žđ?‘Łđ?‘Žđ?‘‘đ?‘œ đ?‘?đ?‘&#x;đ?‘’đ?‘?đ?‘Žđ?‘&#x;đ?‘Žđ?‘‘đ?‘Ž =
44 đ?‘šđ??ż đ?‘Ľ 40 đ?‘šđ??ż 1000 đ?‘šđ??ż
đ?‘†đ?‘œđ?‘™. đ??żđ?‘Žđ?‘Łđ?‘Žđ?‘‘đ?‘œ đ?‘?đ?‘&#x;đ?‘’đ?‘?đ?‘Žđ?‘&#x;đ?‘Žđ?‘‘đ?‘Ž = 1,76 đ?‘šđ??ż Esto significa que se deben medir 1,76 mL de la soluciĂłn de lavado 25x y se debe aforar a un volumen de 44 mL, como se aprecia a continuaciĂłn: 42,24 H2O (d) + 1,76 mL sol. 25x 44,00 ml Total Para preparar esta soluciĂłn, se puede utilizar un vaso de precipitados y una bureta de 50 mL. La soluciĂłn de lavado debe estar lista para usarse, apenas se termine la primera incubaciĂłn. 4.2.1.4 RealizaciĂłn de la curva de calibraciĂłn El procedimiento para realizar la curva de calibraciĂłn debe considerar las siguientes recomendaciones: • • •
Usar todos los puntos de calibraciĂłn recomendados por duplicado Dejar el primer pocillo vacĂo, para tener el valor del blanco Correr al menos 2 controles de calidad por cada proceso de calibraciĂłn
ElaborĂł:
MĂĄster Oscar Puente
RevisĂł:
Dr. Santiago Escalante
AprobĂł:
Dr. Santiago Escalante
Cargo: Fecha
Docente 11/08/2020
Cargo: Fecha:
Coordinador Carrera 20/08/2020
Cargo: Fecha:
Coordinador Carrera 20/08/2020
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Manual de prĂĄcticas de Laboratorio de BioquĂmica ClĂnica III Plan: B011
• •
CĂłd. asignatura: Q0224-05
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Calcular la concentraciĂłn de las muestras usando la ecuaciĂłn de la recta Revisar todos los criterios de validaciĂłn de la curva antes de aceptar los resultados
En tĂŠrminos generales, las absorbancias deben graficarse en el eje de las “yâ€? y la concentraciĂłn de los calibradores en el eje de las “xâ€?. La concentraciĂłn de las muestras desconocidas se de calcular usando la fĂłrmula de la ecuaciĂłn de la recta. Para calcular la concentraciĂłn de la muestra se sugiere usar el siguiente archivo en formato Excel: đ?‘Ś = đ?‘Žđ?‘Ľ + đ?‘? Donde cada variable representa: y = la absorbancia de la muestra a= pendiente b= intersecciĂłn x= concentraciĂłn de la muestra Al tener las absorbancias, debemos despejar de variable “xâ€? de la ecuaciĂłn, por lo tanto, tenemos: đ?‘Ľ=
(đ?‘Ś − đ?‘?) đ?‘Ž
Por lo tanto, se debe tener muy en cuenta el valor obtenido de la intersecciĂłn, porque mientras mĂĄs cercano sea el valor a cero, habrĂĄ menor ruido de fondo que genere lecturas falsas. 4.2.1.5 Procedimiento para la prĂĄctica Cada alumno tendrĂĄ una tarea asignada, por lo tanto, todos vamos a participar en la construcciĂłn y procesamiento de esta tĂŠcnica. Al tener tiempo limitado, los pasos deben realizarse de manera eficiente eliminando interrupciones innecesarias. Los pasos, en tĂŠrminos general son: 1. Preparar los materiales necesarios para el procesamiento de la TSH, esto incluye: pipetas, puntas nuevas, soportes de ELISA, agua destilada, calibradores, cronĂłmetro y demĂĄs. 2. Definir el nĂşmero total de pocillos a usarse segĂşn el nĂşmero de muestras a procesar y su calibraciĂłn correspondiente. El inserto recomienda dejar el pocillo A1 como blanco. 3. Pipetear 50 Îź L de cada calibrador, muestra o controles en los pocillos respectivos. Si el procedimiento se realiza de forma manual, no usar mĂĄs de 32 pocillos por corrida. 4. Pipetear 100 Îź L del conjugado a todos los pocillos exceptuando el pocillo para el blanco. ElaborĂł:
MĂĄster Oscar Puente
RevisĂł:
Dr. Santiago Escalante
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Cargo: Fecha
Docente 11/08/2020
Cargo: Fecha:
Coordinador Carrera 20/08/2020
Cargo: Fecha:
Coordinador Carrera 20/08/2020
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5. Mezclar gentilmente los pocillos por un lapso de 30 segundos, evitar la presencia de burbujas o salpicaduras entre pocillos. 6. Cubrir los pocillos con el cobertor de pocillos e incubar la placa por el lapso de 60 minutos a una temperatura de 37o C, empleando un baĂąo seco o un baĂąo marĂa. 7. Retirar la placa al final de los 60 minutos del incubador, retirar el cobertor de pocillos y realizar 5 lavados a cada pocillo con un volumen de 350 Îź L de soluciĂłn de lavado en una concentraciĂłn de 1:25. Secar cuidadosamente la placa para evitar contaminaciĂłn cruzada entre los pocillos. 8. Pipetear 50 Îź L del sustrato A en cada pocillo 9. Pipetear 50 Îź L del sustrato B en cada pocillo 10. Mezclar gentilmente los pocillos, evitar burbujas y tapar los pocillos con el cobertor de pocillos. 11. Incubar la placa a temperatura ambiente por el lapso de 20 minutos. 12. Remover el cobertor de los pocillos y colocar 50 Îź L de soluciĂłn de lavado a cada pocillo. 13. Leer las absorbancias de cada pocillo con la ayuda de un fotĂłmetro a 450 nm con un filtro diferencial de 630 a 700 nm mĂĄximo en 30 minutos despuĂŠs de colocar la soluciĂłn de stop. 14. Registrar las absorbancias, realizar la curva de calibraciĂłn y calcular la concentraciĂłn de las muestras. 4.3 Intervalos de referencia El valor normal de TSH recomendado por el kit es: Tabla 25 Intervalo de referencia TSH TSH Adulto
Intervalo de referencia 0,25 a 5,0 ÎźUI/mL
5. CĂĄlculos y/o resultados Como se mencionĂł en el punto 4.2.1.4. RealizaciĂłn de la curva de calibraciĂłn, se debe aplicar la siguiente fĂłrmula para calcular la concentraciĂłn de la muestra: đ?‘Ľ=
(đ?‘Ś − đ?‘?) đ?‘Ž
6. Conclusiones y recomendaciones Al final de la pråctica, el alumno deberå demostrar: •
Diferenciar los diferentes tipos de ELISA existentes en el mercado aplicable a la determinaciĂłn de pruebas en bioquĂmica clĂnica.
ElaborĂł:
MĂĄster Oscar Puente
RevisĂł:
Dr. Santiago Escalante
AprobĂł:
Dr. Santiago Escalante
Cargo: Fecha
Docente 11/08/2020
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Coordinador Carrera 20/08/2020
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Coordinador Carrera 20/08/2020
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• •
Cód. asignatura: Q0224-05
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Calcular la concentración de una muestra usando la ecuación de la recta mediante la aplicación de Excel Clasificar a los pacientes en hipotiroideos, hipertiroideos y eutiroideos en función de sus resultados de laboratorio.
7. Anexos relacionados Se adjuntan los documentos que complementarán el entendimiento del tema desarrollado.
inserto TSH EIA.pdf 35. Anatomia y Fisiologia tiroideas.pdf
8. Bibliografía Gaw, A. (2015). Bioquímica Clínica - Texto a atlas a color (5tq ed.). Barcelona: ELSEVIER. Greenstein, B., & Wood, D. (2016). Endocrinología - Lo esencial de un vistazo (3er. ed.). Madrid: Editorial Médica Panamerica. John W. Baynes, Marek H. Dominiczak. (2015). Bioquímica médica (4a. Ed. ed.). Barcelona: Elsevier. Lange. (2013). Diagnóstico clínico y tratamiento (52a. ed.). México: McGrawHill. Lavin, N. (2003). Endocrinología y Metabolismo (3er ed.). Madrid: Marbán. Rodwell, V. W. (2016). Harper : bioquímica ilustrada (30a. Ed. ed.). México: McGraw-Hill. Shauna Anderson, S. C. (1995). Bioquímica Clínica. Philadelphia: Interanericana McGraw-Hill.
Elaboró:
Máster Oscar Puente
Revisó:
Dr. Santiago Escalante
Aprobó:
Dr. Santiago Escalante
Cargo: Fecha
Docente 11/08/2020
Cargo: Fecha:
Coordinador Carrera 20/08/2020
Cargo: Fecha:
Coordinador Carrera 20/08/2020
REF
TSH EIA Test Kit Package Insert I231-3011 English
An enzyme immunoassay (EIA) for the quantitative detection of TSH (Thyroid Stimulating Hormone) in human serum or plasma. For professional in vitro diagnostic use only. INTENDED USE The TSH EIA Test Kit is an enzyme immunoassay for the quantitative detection of Thyroid Stimulating Hormone (TSH) in human serum or plasma. It is intended as an aid in the assessment and diagnosis of thyroid or pituitary disorders as well as in the follow-up of patients undergoing therapy. SUMMARY Thyroid stimulating hormone (TSH), or thyrotropin is a glycoprotein with a molecular weight of approximately 28,000 daltons produced by the anterior pituitary.1 TSH regulates the production and release of the thyroid hormones, thyroxine (T4) and triiodothyronine (T3) from the thyroid gland which are responsible for regulating metabolism in the body. Release of TSH is regulated by T3 and T4 via negative feedback mechanism and by thyrotropin releasing hormone (TRH) which is secreted in the hypothalamus. Determining TSH levels in the blood are helpful in the differential diagnosis of primary and secondary hypothyroidism and hyperthyroidism, especially when used with the measurement of thyroid hormones. 2,3,4,5 The TSH EIA Test Kit is an immunoassay for the quantitative detection of the presence of Thyroid Stimulating Hormone (TSH) in serum or plasma specimen. The test utilizes monoclonal antibodies to selectively detect TSH in serum or plasma. PRINCIPLE The TSH EIA Test Kit is a solid phase enzyme immunoassay based on a sandwich principle for the quantitative detection of TSH in human serum or plasma. The microwell plate is coated with monoclonal antibodies specific to TSH. During testing, the specimen and the enzyme-conjugated TSH antibodies are added to the antibody coated microwell plate and then incubated. If the specimen contains TSH, it will bind to the antibodies coated on the microwell plate and simultaneously bind to the conjugate to form immobilized antibody-TSH-conjugate complexes. If the specimen does not contain TSH, the complexes will not be formed. After initial incubation, the microwell plate is washed to remove unbound materials. Substrate A and substrate B are added and then incubated to produce a blue color, indicating the amount of TSH present in the specimen. Sulfuric acid solution is added to the microwell plate to stop the reaction which produces a color change from blue to yellow. The color intensity, which corresponds to the amount of TSH present in the specimen, is measured with a microplate reader at 450/630-700 nm or 450 nm. The absorbance of the specimen is then compared to a calibration curve to obtain the amount of TSH present in the specimen. PRECAUTIONS
For professional in vitro diagnostic use only. Do not use after expiration date. Do not mix reagents from other kits with different lot numbers. Avoid cross contamination between reagents to ensure valid test results. Follow the wash procedure to ensure optimum assay performance. Use Plate Sealer to cover microwell plate during incubation to minimize evaporation. Use a new pipet tip for each specimen assayed. Ensure that the bottom of the plate is clean and dry and that no bubbles are present on the surface of the liquid before reading the plate. Do not allow wells to dry out during the assay procedure. Do not touch the bottom of the wells with pipette tips. Do not touch the bottom of the microwell plate with fingertips. Do not allow sodium hypochlorite fumes from chlorine bleach or other sources to contact the microwell plate during the assay as the color reaction may be inhibited. All equipment should be used with care, calibrated regularly and maintained following the equipment manufacturer’s instructions. HEALTH AND SAFETY INFORMATION Some components of this kit contain human blood derivatives. No known test method can offer complete assurance that products derived from human blood will not transmit infectious agents. Therefore, all blood derivatives should be considered potentially infectious. It is recommended that these reagents and human specimens be handled using established good laboratory working practices. Wear disposable gloves and other protective clothing such as laboratory coats and eye protection while handling kit reagents and specimens. Wash hands thoroughly when finished. ProClin™ 300 is included as a preservative in the Conjugate, Concentrated Wash Buffer, Substrate and Calibrators. Avoid any contact with skin or eyes. Do not eat, drink or smoke in the area where the specimens or kits are handled. Do not pipette by mouth. Avoid any contact of the Substrate and Stop Solution with skin or mucosa. The Stop Solution contains 0.5M sulfuric acid which is a strong acid. If spills occur, wipe immediately with large amounts of water. If the acid contacts the skin or eyes, flush with large amounts of water and seek medical attention. Non-disposable apparatus should be sterilized after use. The preferred method is to autoclave for
one hour at 121°C. Disposables should be autoclaved or incinerated. Do not autoclave materials containing sodium hypochlorite. Handle and dispose all specimens and materials used to perform the test as if they contained infectious agents. Observe established precautions against microbiological hazards throughout all the procedures and follow the standard procedures for proper disposal of specimens. Observe Good Laboratory Practices when handling chemicals and potentially infectious material. Discard all contaminated material, specimens and reagents of human origin after proper decontamination and by following local, state and federal regulations. Neutralized acids and other liquids should be decontaminated by adding sufficient volume of sodium hypochlorite to obtain a final concentration of at least 1.0%. A 30 minute exposure to a 1.0% sodium hypochlorite may be necessary to ensure effective decontamination. STORAGE AND STABILITY Unopened test kits should be stored at 2-8°C upon receipt. All unopened reagents are stable through the expiration date printed on the box if stored between 2-8°C. Once opened, all reagents are stable for up to 3 months after the first opening date if stored between 2-8°C. Return reagents to 2-8°C immediately after use. Allow the sealed pouch to reach room temperature before opening the pouch and remove the required number of strips to prevent condensation of the microwell plate. The remaining unused strips should be stored in the original resealable pouch with desiccant supplied at 2-8C and can be used within 3 months of the opening date. Return the remaining unused strips and supplied desiccant to the original resealable pouch, firmly press the seal closure to seal the pouch completely and immediately store at 2-8C. Concentrated Wash Buffer may be stored at room temperature to avoid crystallization. If crystals are present, warm up the solution at 37°C. Working Wash Buffer is stable for 2 weeks at room temperature. Do not expose reagents especially the Substrate to strong light or hypochlorite fumes during storage or incubation steps. Do not store Stop Solution in a shallow dish or return it to the original bottle after use. SPECIMEN COLLECTION AND PREPARATION The TSH EIA Test Kit can be performed using only human serum or plasma collected from venipuncture whole blood. EDTA, sodium heparin, and ACD collection tubes may be used to collect venipuncture whole blood and plasma specimens. The preservative sodium azide inactivates horseradish peroxide and may lead to erroneous results. Separate serum or plasma from blood as soon as possible to avoid hemolysis. Grossly hemolytic, lipidic or turbid samples should not be used. Specimen with extensive particulate should be clarified by centrifugation prior to use. Do not use specimens with fibrin particles or contaminated with microbial growth. Serum and plasma specimens may be stored at 2-8°C for up to 7 days prior to assaying. For long term storage, specimens should be kept frozen below -20C. Bring specimens to room temperature prior to testing. Frozen specimens must be completely thawed and mixed well prior to testing. Specimens should not be frozen and thawed repeatedly. If specimens are to be shipped, they should be packed in compliance with local regulations covering the transportation of etiologic agents. REAGENTS AND COMPONENTS Materials Provided Quantity No. Reagent Component Description 96 wells/kit 480 wells/kit TSH Microwell Microwell plate coated with monoclonal 1 plate 5 plates Plate Anti-TSH (96 wells/plate) (96 wells/plate) Anti-TSH bound to peroxidase; 1 TSH Conjugate 1 x 12 mL 5 x 12 mL Preservative: 0.1% ProClin™ 300 Tris-HCl buffer containing Concentrated 0.1% Tween 20; 1 x 40 mL 5 x 40 mL 2 Wash Buffer (25x) Preservative: 0.1% ProClin™ 300 Citrate-phosphate buffer containing 3 Substrate A hydrogen peroxide; 1 x 8 mL 5 x 8 mL Preservative: 0.1% ProClin™ 300 Buffer containing tetramethylbenzidine 4 Substrate B (TMB); 1 x 8 mL 5 x 8 mL Preservative: 0.1% ProClin™ 300 5 Stop Solution 0.5M Sulfuric acid 1 x 8 mL 5 x 8 mL TSH PBS buffer 1 x 1 mL 5 x 1 mL 6 Calibrator 1 Preservative: 0.1% ProClin™ 300 TSH Buffer containing 0.5 μIU/mL TSH; 1 x 1 mL 5 x 1 mL 7 Calibrator 2 Preservative: 0.1% ProClin™ 300 TSH Buffer containing 2.5 µIU/mL TSH; 1 x 1 mL 5 x 1 mL 8 Calibrator 3 Preservative: 0.1% ProClin™ 300 TSH Buffer containing 5.0 µIU/mL TSH; 9 1 x 1 mL 5 x 1 mL Calibrator 4 Preservative: 0.1% ProClin™ 300
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TSH Calibrator 5
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TSH Calibrator 6
Buffer containing 10.0 µIU/mLTSH; Preservative: 0.1% ProClin™ 300 Buffer containing 20.0 µIU/mL TSH; Preservative: 0.1% ProClin™ 300
Plate Sealers Package Insert
1 x 1 mL
5 x 1 mL
1 x 1 mL
5 x 1 mL
2 1
10 1
Materials Required But Not Provided Freshly distilled or deionized water Calibrated micropipettes with disposable tips capable of dispensing 50 and 100 μL Sodium hypochlorite solution for decontamination Graduated cylinders for wash buffer dilution Absorbent paper or paper towel Water bath or incubator capable of maintaining Vortex mixer for specimen mixing (optional) Disposable reagent reservoirs 37C. Calibrated automatic or manual microwell plate Calibrated microplate reader capable of washer capable of aspirating and dispensing reading at 450 nm with a 630-700 nm 350 μL/well reference filter, or reading at 450 nm without a reference filter Disposable gloves Timer Automated processor (optional)
DIRECTIONS FOR USE Allow reagents and specimens to reach room temperature (15-30C) prior to testing. The procedure must be strictly followed. Assay must proceed to completion within time limits. Arrange the calibrators in a horizontal or vertical configuration. The procedure below assigns specific wells arranged in a vertical configuration. Configuration may depend upon software. Step Detailed Procedure Simplified Procedure Prepare Working Wash Buffer by diluting the Prepare Working Wash Buffer by Concentrated Wash Buffer 1:25. Pour the contents diluting the Concentrated Wash Buffer of the bottle containing the concentrated wash 1:25 buffer in a graduated cylinder and fill it with freshly Remove and store unused strips at distilled or deionized water to 1000 mL for 96 2-8°C wells/plate testing. The Working Wash Buffer is stable for 2 weeks at 15-30C. Note: If crystals are present in the Concentrated Wash Buffer, warm it up at 37°C until all crystals dissolve. Remove unused strips from the microwell plate, and store in the original resealable pouch at 2-8°C. 0 Leave A1 as Blank well. Leave A1 as Blank well. Add 50 μL of Calibrator 1 in wells B1and C1. B1and C1: Add 50 μL Calibrator 1 Add 50 μL of Calibrator 2 in wells D1and E1. D1and E1: Add 50 μL Calibrator 2 Add 50 μL of Calibrator 3 in wells F1and G1. F1and G1: Add 50 μL Calibrator 3 Add 50 μL of Calibrator 4 in wells H1and A2. H1and A2: Add 50 μL Calibrator 4 Add 50 μL of Calibrator 5 in wells B2and C2. B2and C2: Add 50 μL Calibrator 5 Add 50 μL of Calibrator 6 in wells D2and E2. D2and E2: Add 50 μL Calibrator 6 1 The colors of Calibrators 1-6 gradually change from colorless to blue. Note: For manual pipetting, it is recommended that no more than 32 wells be used for each run or pipetting should be completed within 5 minutes for all calibrators, specimen, and controls. Add 50 μL of specimen to assigned wells starting at Starting F2 and G2: Add 50 μL 2 F2 and G2. specimen Add 100 μL of Conjugate to each well except for the Add 100 μL of Conjugate to each well 3 Blank well. (Red Reagent) Mix gently by swirling the microwell plate on a flat Mix gently bench for 30 seconds. Cover the microwell plate and 4 Cover the microwell plate with the Plate Sealer and Incubate at 37C for 60 min incubate at 37C in a water bath or an incubator for 60 minutes ± 2 minutes. Remove the Plate Sealer. Remove the Plate Sealer Wash each well 5 times with 350 μL of Working Wash each well 5 times with 350 μL Wash Buffer per well, then remove the liquid. of Working Wash Buffer Turn the microwell plate upside down on absorbent Turn the microwell plate upside down tissue for a few seconds. Ensure that all wells have on absorbent tissue 5 been completely washed and dried. Note: Improper washing may cause false positive results.
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Add 50 μL of Substrate A to each well. (Clear Reagent) Add 50 μL of Substrate B to each well. (Clear Reagent) Then a light blue to blue color should develop in wells corresponding to the amount of TSH present in the specimen. Mix gently then cover microwell plate with Plate Sealer and incubate at room temperature (20-30C) in a room, a water bath, or an incubator for 20 minutes ± 1 minute. Remove the Plate Sealer. Add 50 μL of Stop Solution to each well. (Clear Reagent) Read at 450/630-700 nm within 30 minutes. Note: Microwell plate can also be read at 450 nm, but it is strongly recommended to read it at 450/630-700 nm for better results.
Add 50 μL of Substrate A to each well Add 50 μL of Substrate B to each well
Mix then cover microwell plate with Plate Sealer and incubate at room temperature for 20 min
Remove Plate Sealer Add 50 μL of Stop Solution to each well Leia a 450/630-700 nm nos 30 minutos seguintes
AUTOMATED PROCESSING Automatic EIA microplate processors may be used to perform the assay after validating the results to ensure they are equivalent to those obtained using the manual method for the same specimens. Incubation times may vary depending on the processors used but do not program less incubation times than the procedure listed above. When automatic EIA microplate processors are used, periodic validation is recommended to ensure proper results. QUALITY CONTROL Control standards are not supplied with this kit; however, it is recommended that low, normal and high controls be tested with each run as a good laboratory practice to monitor assay performance. Each laboratory should establish its own criteria for establishing mean values and acceptable ranges to determine reliability of the results. CALCULATION OF RESULTS Draw the calibration curve and obtain quantitative specimen results. 1. Record the absorbance obtained from the printout of microplate reader as outlined in the Example of Specimen & Calibrators Result Calculation. 2. Plot the absorbance for each duplicate reference versus the corresponding concentration in µIU/mL on linear graph paper 3. Connect the points with a best-fit curve. 4. To determine the concentration of TSH for an unknown locate the average absorbance of the duplicates for each unknown on the vertical axis of the graph, find the intersecting point on the curve, and read the concentration (in µIU/mL) from the horizontal axis of the graph. In the following example, the average absorbance intersects the dose response curve at TSH concentration. Example of Specimen & Calibrators Result Calculation Mean TSH Concentration Item Well Absorbance (Absorbance – Blank) (µIU/mL) Blank Well A1 0.003 / / B1 0.004 Calibrator 1 0.002 0 C1 0.005 D1 0.098 Calibrator 2 0.089 0.5 E1 0.086 F1 0.406 Calibrator 3 0.391 2.5 G1 0.381 H1 0.779 Calibrator 4 0.773 5 A2 0.772 B2 1.535 Calibrator 5 1.526 10 C2 1.522 D2 2.843 Calibrator 6 2.462 20 E2 2.087 F2 0.405 Specimen 0.410 2.62 G2 0.420
LIMITATIONS 1. The TSH EIA Test Kit is used for the detection of TSH in human serum or plasma. Diagnosis should not be established based on a single test result. Further testing should be performed in assessing clinical status. Specimens containing precipitate may give inconsistent test results. 2. As with all diagnostic tests, all results must be interpreted together with other clinical information available to the physician. 3. As with other sensitive immunoassays, there is the possibility that the positive result cannot be repeated due to inadequate washing from the initial test. The results may be affected due to procedural or instrument error. 4. Unusually high titers of heterophile antibodies or rheumatoid factor (RF) may affect results. Even if test results are positive, further clinical evaluation should be considered with other clinical information available to the physician. 5. The amount of TSH in serum depends upon multiple factors including the function of the hypothalamus and thyroid gland as well as the responsiveness of pituitary to TRH. TSH concentration alone is not sufficient to assess clinical status. 6. Elevated TSH values may occur during pharmacological intervention in drugs such as domperiodone, amiodazon, iodide, phenobarbital, and phenytoin, while decreased TSH values have been reported with administration of propanolol, methimazol, dopamine, and d-thyroxine. 7. The TSH EIA Test Kit is not intended for use in screening of newborns. EXPECTED VALUES It is recommended that each laboratory establish its own range of expected values based on patient populations. A study to determine expected values using the TSH EIA Test Kit was conducted for initial reference use only. Population No. Specimens Mean (µIU/mL) Range (µIU/mL) Normal 440 1.571 0.25-5.0 PERFORMANCE CHARACTERISTICS Analytical Sensitivity The analytical sensitivity of the TSH EIA Test Kit is 0.078 µIU/mL. Accuracy The TSH EIA Test Kit has been compared to a leading commercial TSH EIA test using clinical specimens. A total of 212 clinical specimens ranging from 0.008-19.350 µIU/mL were run and analyzed using least square regression analysis. The results show that the TSH EIA Test Kit has good correlation compared to the reference method. Method Equation Correlation Acon “x” 0.959 y=0.925x+0.420 Reference ”y” Reproducibility Intra-Assay: Within-run precision has been determined by using 20 replicates of one hypothyroid serum. Inter-Assay: Between-run precision has been determined by 3 independent assays on one hypothyroid serum. Three different lots of the TSH EIA Test Kit have been tested using these specimens over a 3-day period. Inter-Assay Coefficient of Mean Standard Coefficient of Variation (%) (µIU/mL) Deviation Variation (%) 4.827 8.740 0.789 9.027% Recovery and Linearity Recovery: Known amounts of TSH were added to normal human serum with endogenous TSH concentration of 0.58 µIU/mL. The concentration of TSH was determined using TSH EIA Test Kit and the resulting percent recovery was calculated. TSH Concentration Added TSH Concentration Recovery* Specimen (µIU/mL) Obtained (µIU/mL) (%) Level 1 1.96 1.89 96.43 Level 2 2.59 2.70 104.25 Level 3 5.64 5.37 95.21 Level 4 10.97 10.05 91.61 Level 5 18.73 18.88 102.44 * Recovery = (Concentration Obtained (µIU/mL) – Endogenous Level (µIU/mL))/Concentration Added (µIU/mL) Linearity: Specimens containing known concentration of TSH were diluted with normal human serum and determined. The obtained concentrations were within ±20% of the expected values. Cross-Reactivity The specificity of the TSH EIA Test Kit was determined by testing sera containing the compounds listed below. These compounds showed less than 20% interference in the TSH EIA Test Kit at the levels indicated. Mean (µIU/mL) 8.846
Intra-Assay Standard Deviation 0.427
Substance Concentration Substance Concentration Uric cid 0.09 mg/mL Bilirubin 0.15 mg/mL Vitamin 19.80 mg/mL EDTA 0.20 mg/mL Globin 0.99 mg/mL Hemoglobin 16.67 mg/mL Gentistic cid 0.20 mg/mL Creatin 0.20 mg/mL Acetaminophen 0.20 mg/mL Cyclophosphamide 0.50 mg/mL Oxalic cid 0.99 mg/mL 5-fluorouracil 2.00 mg/mL Albumin 20.00 mg/mL Cytosine arabinoside 0.30 mg/mL Coffein 0.10 mg/mL The following substances and concentrations have also been tested using TSH EIA Test Kit and no interference was observed. Substance Concentration Follitropin (FSH) 500 mIU/mL Lutropin Hormone (LH) 500 mIU/mL Chorionic Gonadotropin (hCG) 500 mIU/mL Dose Hook Effect No dose hook effect is observed up to 562 µIU/mL of TSH. BIBLIOGRAPHY 1. Pierce, JG. The Subunits of Pituitary Thyrotropin. Their Relationship to other Glycoprotein Hormones. Endocrinology. (1971), 89 :1331-44. 2. Dumont, JE. The Action of Thyrotropin on Thyroid Metabolism. Vitam. Horm. (1971), 29: 287-412. 3. Faglia, G, Ferrari C, Neri, V, Becl-Peccoz P, Ambrosi, B, and Valentini, F. High Plasma Thyrotropin Levels in Two Patients With Pituitary Tumor. Acta Endocrinol.(Kbh) (1972), 69:649-58. 4. Lamberg, BA, Ripalti, J, Gordin, A, Juustila, H, Sivula, A, and Björkesten, G. Chromophobe Pituitary Adenoma with Acromegaly and TSH-induced Hyperthyroidism Associated with Parathyroid Adenoma. Acta Endocrinol. (1969), 60: 157-72. 5. Hamilton, CR, Adams, LC, and Maloof, F. Hyperthyroidism due to Thyrotropin-producing pituitary Chromophobe Adenoma. N. Engl. J. Med. (1970), 283: 1077-80. Index of Symbols Consult instructions for use For in vitro diagnostic use only Store between 2-8°C TSH
TSH
Wash Buffer 25x
Substrate A
Conjugate
Tests per kit
Manufacturer
Use by
Authorized Representative
Lot Number
REF
Substrate A
Substrate B
Conjugate
Calibrator
1 Calibrator 1
Calibrator
4
Wash Buffer (25x)
Calibrator
3
Calibrator 3
6
Calibrator 6
Calibrator
2
Calibrator 2
Calibrator
Calibrator
5
Calibrator 5
Stop Solution
Stop Solution
Microwell Plate
Plate Sealer
Plate Sealer
Microwell Plate
ACON Laboratories, Inc. 10125 Mesa Rim Road, San Diego, CA 92121, USA
Catalog #
Package Insert
Substrate B
Calibrator 4
Package Insert
MDSS GmbH Schiffgraben 41 30175 Hannover, Germany
Number: 1150475510 Effective date: 2017-01-26