Facultad de Medicina
Carrera de Bioquímica Clinica
Manual de prácticas de Laboratorio de Bioquímica Clínica III Plan: B011
Cód. asignatura: Q0224-05
Nivel: Q108-07-70 Versión: 2.0 Página 62 de 156
PRÁCTICA 8 – MÉTODOS DE ANÁLISIS ESPECIALES EN BIOQUÍMICA CLÍNICA 1. Objetivo • •
Describir los diferentes métodos analíticos usados para la determinación de proteínas u hormonas de interés clínico a nivel del laboratorio clínico. Establecer las ventajas y desventajas de los métodos analíticos aplicados para la determinación de proteínas u hormonas de interés clínico a nivel del laboratorio clínico.
2. Resultados de aprendizaje esperados •
•
Describir los procesos fisiológicos y fisiopatológicos de la función ósea, del equilibrio hidroelectrolítico, a sistema endócrino, aparato genital masculino, femenino y drogas de abuso en base a referentes teóricos. Seleccionar el método de análisis más adecuado para la determinación de marcadores óseos, electrolitos, gases sanguíneos, hormonas, marcadores tumorales y drogas de abuso, teniendo en cuenta las características técnicas de cada uno de ellos.
3. Fundamento teórico 3.1 Introducción Los ensayos inmunológicos son procedimientos en los cuales se utilizan anticuerpos como reactivos enlazantes “específicos” (Shauna Anderson, 1995). La aplicación de estas pruebas nos ha permitido determinar cuantitativamente la presencia de: • • • • •
Fármacos de uso terapéutico Drogas de abuso Sustancias infecciosas o anticuerpos de respuesta del huésped Hormonas esteroideas Hormonas en general
Estos ensayos se basan en la producción de un enlace reversible específico entre un antígeno y un antígeno; esta interacción da lugar a un complejo que puede diferenciarse del ligando enlazado o libre. Para medir esta interacción o formación de complejos se usan diversos marcadores en forma covalente a ligandos, lo que permite detectar y cuantificar la molécula de interés. Elaboró:
Máster Oscar Puente
Revisó:
Dr. Santiago Escalante
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Dr. Santiago Escalante
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Docente 11/08/2020
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Coordinador Carrera 20/08/2020
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Con forme la tecnología ha ido introduciéndose en la medicina del laboratorio, los marcadores han evolucionado mejorando los resultados en sensibilidad, especificidad y reproducibilidad. 3.2 Anticuerpos Un componente importante del inmunoensayo es la selección del anticuerpo. A continuación, se citan algunas características que deben ser tomadas en cuenta para la selección del anticuerpo correcto para el ensayo correcto: • • •
Policlonal, monoclonal o recombinante Purificado o nativo del suero Fragmentado, biespecífico o conjugados a proteínas
Los anticuerpos con glicoproteínas que pertenecen a la superfamilia de las inmunoglobulinas y gracias a sus propiedades, se han usado ampliamente en los inmunoensayos, sobre todo el isotipo de Ig G que posee una fuerte afinidad a sus ligandos. (Wild, 2013) Dependiendo de la producción del anticuerpo, antisuero (policlonal) o por técnicas del hibridoma (monoclonal) se deberá tener en cuenta su afinidad, por lo tanto, la fuerza de enlace entre un determinante antigénico de un antígeno o hapteno y el sitio de enlace de un solo anticuerpo corresponden a su afinidad. Una mención especial debe tener el concepto de anticuerpo conjugado, ya que el término es usado para referenciar a anticuerpos (generalmente IgG) conjugados o fusionados con ciertos marcadores como: enzimas que generan color, isótopos radiactivos, moléculas fluorescentes o luminiscentes. La tabla 21 nos indica algunos ejemplos de estos anticuerpos conjugados. Tabla 21 Tipos de anticuerpos conjugados Anticuerpo fusionado con
Fragmento de anticuerpo usado para la fusión
Fosfatasa alcalina
ScFv, F(ab′ )2
Avidina
Fab, F(ab′ )2, lgG
Proteína transportadora de Biotin-carboxilo
Fab
Fragmento de proteína A
ScFv
Unió Fc
ScFv
Se une a proteínas conjugadas con botina también útil para producir tetrámeros
Estreptavidina
Uso Desarrollo color con ciertos sustratos Une a biotina de proteínas conjugadas Biotina adherida durante la secreción
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Dr. Santiago Escalante
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3.3 Tipos de ensayos Los inmunoensayos pueden ser clasificados en función del marcador usado para la detección de la señal producida por la unión de antígeno-anticuerpo, por lo tanto, tendremos: marcadores de radiactivos, marcadores enzimáticos y marcadores fluorescentes. Otro criterio para clasificar a los inmunoensayos puede ser la disponibilidad del reactivo. Los ensayos de inmunoanálisis pueden ser de reactivo limitado (inmunoanálisis competitivo) o de reactivo en exceso (inmunoanálisis no competitivo). En los ensayos de inmunoanálisis cuyo reactivo está limitado, como se muestra en el gráfico 8, se utiliza una cantidad limitada de anticuerpo en fase sólida, insuficiente para unir todo el antígeno (hapteno) de la muestra, a fin de determinar qué cantidad de este está presente. En este tipo de pruebas, una cantidad fija de antígeno marcado (labeled analyte o tracer) compite con el antígeno sin marcar de la muestra por el número limitado de lugares de unión del anticuerpo. La concentración del antígeno sin marcar puede determinarse a partir de la proporción del antígeno marcado que está unido al anticuerpo o del que permanece libre. Es fundamental que las cantidades de antígeno marcado y de anticuerpo se mantengan constantes, de forma que la cantidad de antígeno marcado unido (o libre) pueda compararse con una serie de calibradores para obtener un resultado cuantitativo. (González, 2010)
Gráfico 8 Inmunoensayos tipo competitivo
En los ensayos de inmunoanálisis que tienen un exceso de reactivo, también llamados inmunométricos de dos lugares o «sándwich», como se aprecia en el gráfico 9, el antígeno se une a un exceso de anticuerpos a antígenos, que está ligado a una fase sólida. A continuación, se añade un segundo anticuerpo marcado que se une al antígeno o anticuerpo a través de un segundo epítopo
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diferente. Posteriormente, se determina el marcaje unido, cuya concentración o actividad es directamente proporcional a la concentración del antígeno o anticuerpo. (González, 2010)
Gráfico 9 Inmunoensayo tipo no competitivo
3.3.1
Marcadores Radiactivos
El radioinmunoensayo (RIA) es una técnica de inmunoensayo con reactivo limitado; utiliza radioisótopos para detectar antígenos o anticuerpos en muestras biológicas. El radioinmunométrico (IRMA) es un inmunoensayo heterogéneo con reactivo en exceso o tipo sánduche. Los isótopos radiactivos son variantes inestables de átomos que, al transformarse espontáneamente a un estado más estable, emiten energía en forma de partículas o pulsos electromagnéticos. La tasa de descomposición es específica para cada isótopo y se describe por la vida media, que representa el tiempo transcurrido antes de que la mitad del radioisótopo haya decaído. El radioisótopo más utilizado es el yodo 125 ( 125I) y tiene una vida media de 60 días, aunque el tritio (3H) también se usa en algunas aplicaciones; su vida media de 12,26 años. Ocasionalmente se ha usado el Cobalto 57 (57Co) en ensayos de vitamina B12, al igual que el carbono 14 ( 14C). (Shauna Anderson, 1995)
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El nivel de radiactividad se mide utilizando un contador de centelleo. La mayoría de los laboratorios que realizan RIA utilizan contadores gamma de pozos múltiples, lo que les permite determinar las emisiones radiactivas de varios tubos a la vez. La radiactividad se mide contando el número de desintegraciones por minuto (d.p.m.). No todas las desintegraciones son detectadas por un contador. La proporción detectada como recuentos por minuto (c.p.m.) es la mejor forma de realizado. 3.3.2
Marcadores enzimáticos
En general, los métodos de ELISA o EIA´s (del inglés enzyme-linked immunosorbent assay) utilizan enzimas como marcadores. Una enzima se puede medir a concentraciones muy bajas utilizando sus propiedades catalíticas para generar color, compuestos fluorescentes o luminiscentes de un sustrato "neutro", así como especies que se pueden medir eléctricamente usando una variedad de electrodos o transductores. Una sola molécula de enzima puede causar la conversión de 10 7 moléculas de sustrato por minuto, aumentando la fuerza de la señal y, por lo tanto, la sensibilidad del ensayo sobre un millón de veces en comparación con otra forma de marcar antígenos-anticuerpos que produce solo una señal por evento. La actividad enzimática es la más utilizada en inmunoensayos, es más estable que 125I, por lo que la vida útil es más larga, y las recalibraciones no son a diario. La principal desventaja de los EIA es que tienen una susceptibilidad a las interferencias y cambios en las condiciones del ensayo durante la etapa de generación de señal, mientras que los RIA son más robustos, por lo tanto, cualquier condición externa puede generar fallas en la señal, la misma que debe controlarse, optimizarse y mantenerse libre de interferencias, sobre todo en la incubación, ya que esta fase es susceptible al pH, tiempo y temperatura. En relación con el sustrato usado, este se proporciona normalmente en exceso, excepto cuando hay altas concentraciones de sustrato, que provocan la inhibición de la actividad enzimática, como es el caso con de las pruebas que usan el HRP (del inglés horseradish peroxidase) y el peróxido de hidrógeno. Las dos enzimas más utilizadas en inmunoensayo son la fosfatasa alcalina y la HRP. HRP es una enzima oxidoreductasa de 44 kDa; pertenece al grupo de la protoporfirina IX con un grupo prostético hemina y 308 aminoácidos, incluidos cuatro puentes de disulfuro y dos iones de calcio. Contiene aproximadamente 20% de carbohidratos en relación con su peso y seis residuos de lisina disponibles para conjugarse sin perder su capacidad enzimática. Esta propiedad ha sido utilizada para generar derivados coloreados, fluorescentes o luminiscentes, dependiendo del Elaboró:
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sustrato utilizado. Tiene una alta tasa catalizadora, lo que resulta en una buena amplificación de la señal. El rango de pH de la actividad de HRP es 4.0–8.0. La fosfatasa alcalina es una glicoproteína dimérica de 140 kDa que contiene muchos grupos amino libres que pueden usarse para la conjugación. Esta enzima cataliza la hidrólisis de esteres de fosfato de alcoholes primarios, fenoles y aminas. La forma utilizada en los inmunoensayos se obtiene de su purificación de células del intestino de ternera y contiene una buena cantidad de zinc. Es inhibida por el ortofosfato, quelantes de zinc, borato, carbonato y urea. La actividad óptima se da a un pH 9.5–10.5. Los ensayos inmunoenzimétricos (IEMA), que también se denominan técnica de empareado, son los ELISA más empleados para detectar antígenos que tienen por lo menos dos determinantes antigénicos. Se absorbe un exceso de anticuerpos específicos para el antígeno (con frecuencia anticuerpos monoclonales) sobre perlas de poliestireno. Este anticuerpo monoclonal reconoce al antígeno que se quiere cuantificar y el segundo anticuerpo monoclonal marcado o conjugado reconoce otro epítope del antígeno de interés en la muestra. De esta forma, al colocarlo en un sustrato determinado, la formación de producto es directamente proporcional a la concentración del analito que se quiere determinar. Los ensayos inmunológicos por multiplicación enzimática (EMIT) son análisis sin separación en el cual se emplea una enzima conjugada al hapteno de interés como marcador en una reacción enzima-sustrato como sistema de detección. Este tipo de análisis a menudo se denomina ensayo homogéneo, ya que describe un ensayo del tipo competitivo en el que no se requiere separación del hapteno enlazado con el anticuerpo y del libre. Estos ensayos, al desarrollar color, pueden llamarse ensayos colorimétricos, y están limitados a un rango espectrofotométrico que va desde 1,000 a 2,000 unidades de absorbancia. El rango se puede ampliar por lectura de altos niveles de absorbancia en un desplazamiento de longitud de onda desde el centro del pico principal. Alternativamente, la tasa de desarrollo del color se puede monitorear durante un período de tiempo en un lector cinético; este método funciona bien con peroxidasa y 3,3 ', 5,5′-tetrametilbencidina (TMB) como sustrato. (Wild, 2013) 3.3.3
Marcadores Fluorescentes
Los fluoroinmunoanálisis (FIA) utilizan para el marcaje los compuestos fluorescentes, denominados fluoróforos. Estos fluoróforos absorben luz a una determinada longitud de onda y emiten luz en otra longitud de onda, como se observa en el gráfico 10. Las características principales que deben tener estos compuestos para su uso en los FIA son: •
Poseer una intensidad de fluorescencia elevada
Elaboró:
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Docente 11/08/2020
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• •
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Que sea posible diferenciar su fluorescencia de la de fondo que producen las muestras biológicas Que su unión al antígeno o al anticuerpo no afecte de forma adversa sus propiedades
Gráfico 10 El principio de la determinación de fluorescencia
Los compuestos fluorescentes más utilizados como marcadores en este tipo de inmunoanálisis son los derivados de la fluoresceína, la rodamina y la umbeliferona. La fluorescencia se ve directamente afectada por la temperatura, la polaridad, pH y el contenido de oxígeno disuelto. Si el lavado no es efectivo antes de la etapa de generación de señal, pueden surgir interferencias por la dispersión de la luz, la fluorescencia de fondo y el enfriamiento de la muestra. La fluorescencia de fondo está naturalmente presente en las muestras de suero y plasma, causada por proteínas a menores longitudes de onda, NADH y bilirrubina en longitudes de onda más largas, por lo tanto, hay que tener cuidado con la concentración de estos metabolitos en ensayos que usen fluorescencia. El pico de emisión de fluorescencia del plasma es de 350 nm (excitación alrededor de los 280 nm) con picos más débiles (aunque más críticos) de bilirrubinas a 520 nm; el fenómeno de Quenching, (que hace referencia al proceso de desactivación de fluorescencia o cualquier proceso que produzca una disminución en la intensidad de fluorescencia emitida por una sustancia) puede ocurrir cuando estas moléculas en la muestra pueden absorber luz excitada desde el fluorómetro o luz emitida desde el fluoróforo. (Wild, 2013) El ensayo inmunofluorescente con sustrato marcado (SLFIA) es un ensayo inmunoenzimático que no requiere separación. En este análisis se utiliza un sustrato enzimático fluorescente como marcador y una reacción enzima-sustrato para detectar complejos anticuerpo-antígenos. La mayoría son competitivos y se han desarrollado para medir compuestos de bajo peso molecular, como los fármacos y las hormonas derivadas de aminoácidos. (González, 2010) Elaboró:
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El ensayo Inmunoanálisis de polarización de fluorescencia (FPIA) se usa para la determinación de moléculas de bajo peso molecular. Se basa en la cantidad de luz fluorescentes polarizada que se detecta cuando el trazador, esto es, la sustancia unida a un compuesto fluorescente (fluoróforo), se ilumina con luz polarizada plana. El grado de polarización de la fluorescencia depende del giro del complejo fluoróforo-ligando en solución. Las moléculas pequeñas giran libremente y, en consecuencia, la luz fluorescente que emiten cuando se iluminan está polarizada. Por otro lado, las moléculas grandes, como las proteínas, giran más lentamente, lo que origina un mayor grado de polarización de la fluorescencia emitida al iluminarse. Cuando el trazador se une al anticuerpo, el giro del complejo es lento y la polarización de la fluorescencia, grande. 3.3.4
Luminoinmunoanálisis
Los luminoinmunoanálisis son inmunoanálisis que utilizan la luminiscencia para detectar la reacción antígeno-anticuerpo. La luciferasa se ha utilizado como enzima marcadora en algunos luminoinmunoanálisis. Sin embargo, con frecuencia, la luciferasa se inactiva al preparar los conjugados. Otra aplicación de la bioluminiscencia en el campo de los ensayos de inmunoanálisis es el enzimoinmunoanálisis. En estos, la reacción indicadora emplea un sustrato bioluminiscente. La enzima más utilizada es la fosfatasa alcalina y el sustrato, la luciferina-O-fosfato. La fosfatasa alcalina hidroliza este sustrato, y la luciferina resultante, en presencia de luciferasa, ATP y Mg 2+, da lugar a la luminiscencia. La quimioluminiscencia (CL), (del inglés chemiluminescence) se genera en algunas reacciones químicas de oxidación. Los inmunoensayos de quimioluminiscencia (CLIA) (del inglés chemiluminescence immunoassays) usan muchos tipos de moléculas, con características estructurales muy diversas, que producen quimioluminiscencia, como se describe en el grafico 11. Los más utilizados en los inmunoanálisis son el luminol, los ésteres de acridinio, las piridopiridacinas y los dioxetanos. El acoplamiento de las moléculas luminiscentes al ligando requerido dependerá de la naturaleza de las dos especies. Cuando ambas especies sean moléculas pequeñas, se emplearán métodos de síntesis de la química orgánica. Cuando haya que unir el compuesto luminiscente a una molécula grande, como una proteína, se usarán reactivos bifuncionales. Dependiendo del fabricante, los ensayos puedes ser del tipo homogéneo, generando una fase líquida, donde ocurren todos los pasos de la reacción. Con las sales de acridina es posible acoplar la molécula quimioluminiscente de forma que la especie que emite la N-metil acridona se disocie del resto de la molécula marcada antes de la emisión. Por su parte, con los dioxetanos se consigue una señal amplificada que permite alcanzar inmunoanálisis muy sensibles. Elaboró:
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Gráfico 11 Sistema de detección directa de quimioluminiscencia
Un tipo especial de inmunoanálisis de luminiscencia es el de la electroquimioluminiscencia, en el que la luminiscencia se genera por la oxidación de un compuesto marcador de tris(bipiridil) de rutenio (II) en la superficie de un electrodo, en presencia de tripropilamina, para formar especies de rutenio (II) excitadas, que vuelven a su estado basal emitiendo luz a 620 nm. Los formatos de inmunoanálisis homogéneos explotan la diferente accesibilidad de los marcajes libre y unido a la superficie del electrodo, o el aumento de la señal electroquimioluminiscente del conjugado unido a un inmunoadsorbente microparticulado. (Pierre Reschiglian, 2010) Elaboró:
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3.4 Generación de señal El requisito principal que se debe tener en cuenta para considerar el sistema de generación y detección de señal es permitir que la detección del anticuerpo marcado o el hapteno esté por encima del ruido de fondo (background) y minimizar la unión no específica del anticuerpo marcado o el hapteno. Esto es particularmente importante para inmunoensayos diseñados con una sensibilidad muy alta, expresada en zeptomoles (10−21), equivalentes a detectar solo 1000 moléculas. Dependiendo del tipo de inmunoensayo, se han usado los siguientes marcadores: Tabla 22 Conjugados usados según tipo de inmunoensayo Método
Marcador usado
Quimioluminiscencia
Éster de acridina, sulfonamida de acridina, isoluminol
Coenzimas
ATP, FAD, NAD
Electroquimioluminiscencia
tris(bipyridyl) Rutenio
Enzimas
Fluoróforos
Acetato quinasa, fosfatasa alcalina, β-lactamasa, glucosa oxidasa, luciérnaga luciferasa, β-d-galactosidasa, HRP, glucosa 6-fosfato deshidrogenasa, lacasa, luciferasa de renilla, xantina oxidasa Europio criptato de trisbipiridina (y otros criptatos de lantánidos), fluoresceína, β-ficoeritrina, rodamina, umbeliferona derivados, Roja Texas puntos cuánticos de semiconductores de nanocristales
Radicales libres
Conjugados fusionados
Genes Metal y metaloides Micropartículas Fósforo Radioisótopo
Nitróxido Fosfatasa alcalina – anticuerpo anti-fitocromo de cadena sencilla; fosfatasa alcalina - receptor básico del factor de crecimiento de fibroblastos; apoaequorin - cadena pesada de IgG; fosfatasa alcalina bacteriana - proteína de unión a Fc de IgG; fosfatasa alcalina bacteriana - octapéptido sintético; fosfatasa alcalina bacteriana - anticuerpo anti-VIH 1 gp 41 de cadena sencilla; fosfatasa alcalina bacteriana - proinsulina humana; β-galactosidasa interferón α2; β-galactosidasa - oligopéptido específico de B19; estreptavidina central - anticuerpo de cadena sencilla (scFv); luciferasa de luciérnaga - proteína A; fosfatasa alcalina placentaria humana - ligando 4-1 BB; luciferasa bacteriana marina (subunidad β) - proteína A; metapirocatechase - proteína A; proteína A - anticuerpo antifitocromo de cadena simple; Pyrophorus plagiophthalamus luciferasa - proteína A Luciferasa de luciérnaga Oro, plata, selenio Látex, eritrocitos, liposomas, magnéticos Oxisulfuro de itrio activado por europio; Tecnología de fósforo de conversión ascendente (UPT) 125 I
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4. Actividades prácticas Este tema no genera ninguna actividad práctica. La revisión de los métodos descritos es a nivel teórico. A nivel de laboratorio, se realizará una conversación en plenaria para la discusión de las ventajas y desventajas de los métodos mencionados.
5. Cálculos y/o resultados Esta práctica, no amerita de ningún cálculo.
6. Conclusiones y recomendaciones Al final el alumno deberá: • •
Diferenciar los diferentes inmunoensayos usados para la determinación de proteínas u hormonas de interés clínico a nivel del laboratorio clínico en el área de bioquímica clínica. Aplicar las ventajas de los inmunoensayos para la determinación de proteínas u hormonas de interés clínico a nivel del laboratorio clínico.
7. Anexos relacionados Se adjuntan los documentos que complementarán el entendimiento del tema desarrollado.
Immunoassay_Comp Basic Concepts Chemiluminescence.pdf onents.pdf
8. Bibliografía Gaw, A. (2015). Bioquímica clínica : texto y atlas en color ([tr. 5a. ed. ing. ed.). Madrid: Elsevier. González, J. M. (2010). Técnicas y Métodos de Laboratorio Clínico (3er. ed.). Salamanca: Elsevier Masson. Khopkar, S. (2008). Basic concepts of analytical chemistry. Retrieved http://ebookcentral.proquest.com Created from puce on 2019-10-20 08:23:14.
from
Pierre Reschiglian, B. B. (2010). Chemiluminescence and Bioluminescence. Cambridge: Royal Society of Chemistry. Shauna Anderson, S. C. (1995). Bioquímica Clínica. Philadelphia: Interanericana McGraw-Hill. Elaboró:
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