Micropropagação em Batata Utilizando Meio de Cultura MS

FUNDAÇÃO PINHALENSE DE ENSINO UNIPINHAL CENTRO REGIONAL UNIVERSITÁRIO DE ESPIRITO SANTO DO PINHAL CURSO DE ENGENHARIA AGRONÔMICA „‟MANOEL CARLOS GONGALVES”

MICROPROPAGAÇãO EM BATATA UTILIZANDO MEIO DE CULTURA MS

Euclides Dotta Neto

ESPIRITO SANTO DO PINHAL - SP Março de 2009

ii FUNDAÇÃO PINHALENSE DE ENSINO UNIPINHAL CENTRO REGIONAL UNIVERSITÁRIO DE ESPIRITO SANTO DO PINHAL CURSO DE ENGENHARIA AGRONÔMICA „‟MANOEL CARLOS GONGALVES”

MICROPROPAGAÇãO EM BATATA UTILIZANDO MEIO DE CULTURA MS

Acadêmico: Euclides Dotta Neto Orientador: Profº Dr. Vasco Luiz Altafin

Trabalho

de

Conclusão

de

Curso apresentado como parte das exigências para obtenção do título de Engenheiro Agrônomo no curso de Engenharia Agronômica “Manoel Carlos Gonçalves” – UNIPINHAL.

ESPIRITO SANTO DO PINHAL - SP Março de 2009

iii FOLHA DE APROVAÇÃO

A Comissão Supervisora do Trabalho de Conclusão de Curso julga aprovado o trabalho de conclusão de curso do aluno Euclides Dotta Neto, com o título: Micropropagação em batata utilizando meio de cultura MS, em 3 de março de 2009.

Comissão Supervisora

Orientador

Profº Dr. Vasco Luiz Altafin____________________________________

Membros da Comissão

Engº Agr. Dra. Anamaria Cândido Ribeiro

Engº Agr. Dra. Marianna Stella Zibordi

Engº Agr. Dr. Marco Antônio Galli

Engº M.Sc. Reymar Coutinho de Andrade

Engº Agr. Roberto Garanhani Barreiros

Espírito Santo do Pinhal, 3 de Março de 2009

iv DEDICATÓRIA

Dedico este trabalho aos meus familiares, principalmente meus pais Euclides Dotta Júnior e Maria Cristina Liberali Dotta, aos meus amigos que sempre estiveram comigo e aos professores do curso de engenharia agronômica “Manoel Carlos Gonçalves” que sempre me deram apoio.

v AGRADECIMENTOS

Primeiramente gostaria de agradecer a Deus por ter me proporcionado mais uma conquista em minha vida, me indicando o caminho certo para seguir em frente com os meus objetivos mesmo nas dificuldades do dia-a-dia, a meus pais que sempre estiveram do meu lado, me ensinando, e fazendo com que eu melhorasse cada dia mais, aos amigos que tenho e os que conquistei ao passar dos anos e aos professores do curso de engenharia agron么mica que sempre estiveram dispostos a ajudar.

Enfim, agrade莽o a todos que compartilharam e ainda compartilham mais essa conquista em minha vida.

vi EPÍGRAFE

“Muitos possuem aquilo que tem, por

base

em

seus

esforços,

persistência,dinamismo,determinação, vontade de vencer e o mais importante de todos é tendo “fé”, pois a pessoa que tem todos os elementos mais não tem fé, com certeza deseja”.

não

terá

aquilo

que

vii RESUMO

TÍTULO: Micropropagação em Batata utilizando meio de cultura MS Autor: Euclides Dotta Neto Orientador: Profº Dr. Vasco Luiz Altafin

A batata (Solanum tuberosum, L.) é originária da América do Sul, pertence a família Solanaceae, sendo classificada como uma planta herbácea e

dicotiledônea,

apresentando

um

ciclo

de

desenvolvimento

de

aproximadamente 90 dias, podendo ser plantada durante todo o inverno, evitando-se, porém regiões ou épocas com altas temperaturas noturnas, e solos encharcados. No Brasil a área colhida ocupada pela cultura da batata em 2006 por ha foi 140.731,00, quantia produzida em tonelada foi 3.137.782,00 e a exportação foi de 38,2 toneladas. Os maiores produtores de batata no mundo são: Polônia, China, Estados Unidos, Alemanha e Índia. O presente trabalho tem o objetivo de apresentar o processo da micropropagação “in vitro” na cultura da batata, mostrando as formas de propagação de batata, as vantagens e desvantagens da introdução da micropropação de batata, meio de cultura MS. As atividades foram realizadas no laboratório de Biotecnologia Vegetal, do Curso de Engenharia Agronômica “Manoel Carlos Gonçalves” – Unipinhal, na cidade de Espírito Santo do Pinhal, SP. O estágio foi no período de 03 de novembro de 2008 a 20 de Fevereiro de 2009, totalizando 120 horas. Durante o estágio foi acompanhado o desenvolvimento das brotações de batatas, preparo do meio de cultura MS, retirada e desinfeção das brotações, inoculação dos explantes, condições de incubação, subcutivos das brotações, tranplantio das mudas, aclimatação, rustificação e plantio. Micropropagação “in vitro” é uma forma mais rápida de se conseguir o desenvolvimento de uma cultura em relação a reprodução vegetativa, porém ainda é inviável.

Palavras – chave: Batata, Propagação, Meio de cultura MS, Micropropagação “in vitro”.

viii ÍNDICE p.

FOLHA DE ROSTO

ii

FOLHA DE APROVAÇÃO

iii

DEDICATÓRIA

iv

AGRADECIMENTOS

v

EPÍGRAFE

vi

RESUMO

vii

1. INTRODUÇÃO

10

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

11

2.1. Propagação da Batata

11

2.1.1. Formas de Propagação

11

2.2. Obtenção da Batata-semente

11

2.3. Tamanho da Batata-semente

11

2.4. Categorias da Batata-semente

12

2.5. Brotação da Batata-semente

12

2.6. Micropropagação “reprodução in vitro”

13

2.6.1. Vantagens da Micropropagação

14

2.6.2. Desvantagens da Micropropagação

15

2.7. Meio de Cultura MS

16

2.8. Doenças da Batata

17

3. DESCRIÇÃO DE ESTÁGIO

18

3.1. Local e Período

18

3.2. Atividades Realizadas

18

4. DISCUSSÃO E CONCLUSÃO

20

5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

21

ix ÍNDICE DE FIGURAS p.

Figura 1. Início da Brotação da Batata-semente

12

Figura 2. Brotações de Batata com 5cm

13

Figura 3. Brotações submetidas à desinfeção com Álcool 70% e

14

Hipoclorito de Sódio 0,4% Figura 4. Uma semana após os explantes de batatas

14

Figura 5. Explantes de batatas contaminados por fungos

15

Figura 6. Potes contendo meio de cultura MS com brotações de batata

16

x 1. INTRODUÇÃO A batata (Solanum tuberosum, L.) é originária da América do Sul, pertence a família Solanaceae, sendo classificada como uma planta herbácea e

dicotiledônea,

apresentando

um

ciclo

de

desenvolvimento

de

aproximadamente 90 dias, podendo ser plantada durante todo o inverno, evitando-se, porém regiões ou épocas com altas temperaturas noturnas, e solos encharcados.

O cultivo da batata atualmente expandida pelo mundo todo, destaca-se principalmente no hemisfério norte, tendo a Europa como grande produtora, e agora na Ásia, sendo a China a maior produtora mundial. Países antes não produtores, tornaram-se exportadores de batata como, por exemplo, a África do Sul. Trata-se de uma cultura altamente produtiva, exigindo menor área que os cereais para atingir a mesma quantidade em peso.

No Brasil a área colhida ocupada pela cultura da batata em 2006 por ha foi 140.731,00, quantia produzida em tonelada foi 3.137.782,00 e a exportação foi de 38,2 toneladas.

Os maiores produtores de batata no mundo são: Polônia, China, Estados Unidos, Alemanha e Índia.

A batata pode ser encontrada em uma grande variedade de cores, de casca e de polpa. É

consumida

frita,

assada

ou

cozida,

servida

quente

como

acompanhamento à refeição principal, ou fria como acompanhamento para salada.

As vantagens do uso da micropropagação em comparação aos sistemas convencionais de propagação são: incremento acelerado do número de plantas; redução do tempo de multiplicação; possibilidade de multiplicar grandes quantidades de plantas em uma área reduzida a baixos custos; maior controle sobre a sanidade do material propagado; facilidade para transporte do material in vitro de um lugar para outro (país ou região); intercâmbio de germoplasma; possibilidade de multiplicar rapidamente uma variedade da qual existam poucos indivíduos; criação e manutenção de bancos de germoplasma. .

O presente trabalho tem o objetivo de apresentar o processo da

micropropagação “in vitro” na cultura da batata.

xi 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1. Propagação da Batata A qualidade da batata-semente, em termos fisiológicos e fitossanitários, são fundamentais para o sucesso da cultura.

A propagação da batata tem sido por via vegetativa, utilizando batatasemente com brotação (REIFSCHNEIDER, 1987).

2.1.1. Formas de Propagação A cultura da batata pode ser multiplicada por via sexuada, através da semente botânica, porém o problema deste método para a produção comercial é conseguir a uniformidade das populações, não atendendo as características agronômicas desejáveis (FEDALTO, 1982).

A propagação vegetativa, através de tubérculos brotados, método mais utilizado atualmente. Contudo, alojam-se patógenos sistêmicos causadores de enfermidades,

que

transmitidas

de

geração

a

geração,

ocorre

a

degenerescência da batata-semente, afetando a produção (CARDOSO, 1981).

A cultura de tecidos permite a obtenção de um grande número de plântulas sadias em um curto período. Os minitubérculos obtidos destas plântulas são utilizados como propágulos na obtenção de matrizes para a produção de sementes. A multiplicação do material pode ser feita através de seleção clonal, multiplicação rápida, multiplicação “in vitro” e seleção massal (REIFSCHNEIDER, 1987).

2.2. Obtenção da batata-semente A obtenção da semente básica inicia com um tubérculo livre de vírus, e outras enfermidades, devendo ser multiplicado rapidamente com padrões qualitativos de pureza varietal e sanidade. A multiplicação pode ser por seleção clonal (conjunto de tubérculos ou plantas provenientes de uma propagação vegetativa a partir da planta mãe), indexação de tubérculos, por ramas, gemas laterais ou multiplicação por brotos (GOTO, 2000).

2.3. Tamanho da Batata-semente Para a batata desenvolver uma haste cada gema necessita um peso

xii mínimo de substância tuberosa, e é importante saber que este mínimo é tanto para batatas-sementes miúdas, como graúdas (REIFSCHNEIDER, 1987).

Os bataticultores brasileiros visando economia de semente, preferem tubérculos-semente pequenos. (GOTO, 2000).

No

Brasil

são

recomendados

batatas-sementes de

40

–

60g

(REIFSCHNEIDER,1987).

2.4. Categorias da batata-semente As categorias de batatas-semente no Brasil são: Semente básica, subdividida nas classes AS (Alta Seleção), SE (Super Elite) e E (Elite); semente certificada e fiscalizada,

subdividida

nas classes A,

B, C

(GOTO, 2000).

2.5. Brotação da Batata-semente

Figura 1. Início da brotação da batata-semente

O broto quando se desenvolve em ambiente escuro, torna alongado e descolorido; quando desenvolve em luz difusa, torna vigoroso, curto e apresenta cores vivas (REIFSCHNEIDER,1987).

A brotação é feita em ambiente seco, com boa umidade relativa, sob temperaturas amenas, iluminado por luz indireta ou difusa, onde as sementes

xiii permanecerão em período de repouso fisiológico. Tal prática promove uma emergência mais rápida e mais uniforme (REIFSCHNEIDER,1987).

2.6. Micropropagação “reprodução in vitro” A micropropagação vem sendo amplamente utilizada, especialmente na produção de material propagativo com elevada qualidade fitossanitária, o que tem proporcionado benefícios diretos aos produtores, pelo conseqüente aumento nos níveis de produtividade da cultura. Na etapa de multiplicação in vitro, a capacidade dos explantes sobreviverem, desenvolverem e se multiplicarem é conseqüência de vários fatores, como o genético, o estado fisiológico e as concentrações endógenas de hormônios nos explantes e as condições ambientais de cultivo. Além disso, o uso de um meio de cultura apropriado para cada fase do cultivo é condição básica, devendo estes meios proporcionarem os nutrientes necessários ao metabolismo das células vegetais em cultivo para o crescimento e diferenciação dos tecidos (Kozay et al., 1997).

A técnica de cultivar tecidos de plantas in vitro é utilizada na obtenção e multiplicação de clones isentos de patógenos, com atenção especial às viroses.

A cultura de meristema é a primeira etapa na produção de material propagativo de alta qualidade. Os principais inconvenientes desta fase são a possibilidade de ocorrer contaminação e a demora na diferenciação do tecido meristemático em meio de cultura (Fortes e Pereira, 2003).

Figura 2. Brotações de batata com 5 cm

xiv

Figura 3. Brotações submetidas à desinfeção com álcool 70% e Hipoclorito de sódio 0,4%

Em torno de 25 a 30 dias, brotações apicais de 5 a 8 cm foram coletadas e submetidas à desinfeção superficial. Em seguida, foram extraídos os meristemas. Num primeiro momento, os meristemas foram inoculados em meio de isolamento de consistências líquida e sólida (Pereira et al., 2001). Após este período, o material diferenciado é transferido para meio de multiplicação onde permanece por, geralmente, mais 30 dias (Conceição et al., 1999).

2.6.1. Vantagens da Micropropagação

Figura 4. Uma semana após os explantes de batata

xv

As vantagens do uso da micropropagação comparando com sistemas convencionais de propagação são: incremento acelerado do número de plantas; redução do tempo de multiplicação; possibilidade de multiplicar grandes quantidades de plantas em uma área reduzida a baixos custos; maior controle sobre a sanidade do material propagado; facilidade para transporte do material in vitro de um lugar para outro (país ou região); intercâmbio de germoplasma; possibilidade de multiplicar rapidamente uma variedade da qual só existam poucos indivíduos; criação e manutenção de bancos de germoplasma.

2.6.2. Desvantagens da Micropropagação

Figura 5. Explantes de batatas contaminados por fungos

As desvantagens da micropropagação é o alto índice de contaminação, onde,

uma

planta

infectada

pode

produzir

clones

infectados;

outra

desvantagem é o custo elevado; variação de condições entre e dentre clones; e a dificuldade de obter meio de cultura adequado para a espécie trabalhada.

Por esta razão, muitos criadores de plantas nunca recorrerão à micropropagação (Wikipedia, 2008).

xvi

2.7. Meio de Cultura MS

Figura 6. Potes contendo meio de cultura MS com brotação de batata

O meio de cultura MS, tem sido, amplamente utilizado na cultura de tecidos, inclusive para a batata inglesa. Vários reguladores de crescimento tem sido testados para iniciação e manutenção no meio de cultura, especialmente utilizando a combinação de auxina e citocinina (CABRAL et al., 1983). As auxinas e as citocininas são reguladores de crescimento mais utilizados na cultura de tecidos; as formações de raízes, partes aéreas e colos são reguladas pela disponibilidade e interação destes reguladores (SKOOG e MILLER, 1957).

Vários ensaios tratam do assunto e muitos meios de cultura têm sido testados de modo a melhorar essas etapas. Contudo, os resultados são muitas vezes divergentes e nem sempre possíveis de serem reproduzidos. Isto se deve, principalmente, ao fato de a cultura de tecidos, como técnica de propagação vegetativa, necessitando adaptação das espécies e cultivares, pois estas

diferem

geneticamente

entre si,

podendo

apresentar

resultados

diferentes sob as mesmas condições de cultivo. O material a ser multiplicado

xvii deve ser comprovadamente livre de contaminações, pois, nesse sistema, um único explante contaminado levará à contaminação de todos (Levin et al., 1997).

2.8. Doenças da Batata As doenças causadas por vírus mais presentes na cultura da batata são: enrolamento da folha da batateira, causado pelo vírus “Potato leafroll vírus” (PLRV), esse vírus é transmitido pelo pulgão e por mosca branca; Mosaicos Y e A (PVY e PVA), causador de sintomas de mosaico nas plantas, potencial vetor do PVY é a mosca minadora; outras doenças principais causadas por vírus são Geminivirus (TOYVSV e TOSRV), transmitido pela mosca branca e o Tospovirus (TSWV, TCSV e GRSV), transmitido por tripes (Kimati et al., 1997).

As principais doenças causadas por bactérias são: Murcha bacteriana – Pseudomonas solanacearum; Canela preta ou Podridão mole – Erwinia spp.; e Sarna comum – Streptomyces scabies (Kimati et al., 1997).

Doenças causadas por fungos na cultura da batata são: Requeima – Phytophthora infestans; Pinta preta – Alternaria solani; Rizotoniose – Rhizoctonia solani; e Podridão seca – Fusarium spp (Kimati et al., 1997).

xviii 3. DESCRIÇÃO DE ESTÁGIO

3.1 Local e Período O estágio foi realizado no laboratório de Biotecnologia Vegetal, do Curso de Engenharia Agronômica “Manoel Carlos Gonçalves” – Unipinhal, na cidade de Espírito Santo do Pinhal, SP. As atividades foram coordenadas pelo Professor Doutor Vasco Luiz Altafin. O estágio foi no período de 03 de novembro de 2008 a 20 de Fevereiro de 2009, totalizando 120 horas.

3.2 Atividades realizadas Durante o estágio foi adquirido tubérculos da região de São João da Boa Vista – SP e foram selecionadas para servirem de matrizes para o presente trabalho.

Depois as batatas foram levadas ao laboratório de Biotecnologia

Vegetal, onde foram mantidas em local de baixa luminosidade, ambiente seco e

boa

umidade

relativa,

sendo

acompanhado

o

desenvolvimento

semanalmente das brotações das batatas até atingirem o tamanho de 5cm.

Foi preparado o meio de cultura MS nas concentrações de 100%. Onde os meios foram acrescidos de regulador vegetal BAP (benzil-amino-purina), sacarose (20 g L-1) e como agente gelificante foi utilizado o agar (5,0 g L-1). Os meios de culturas foram distribuídos em frascos de 300 ml em alíquotas de 50ml.

As batatas que tiveram brotações com a altura de 5cm, foram separadas de outras batatas. Logo após, essas brotações foram retiradas das batatas e foi feita a desinfeção das brotações.

As brotações foram desinfetadas superficialmente da seguinte forma: submersão durante 1 minuto em álcool (70% v/v) e em seguida submetidos a imersão por 20 minutos em hipoclorito de sódio (0,4% de cloro ativo). Após a desinfeção as brotações foram enxaguadas três vezes em água destilada esterilizada, e levadas para a câmara de fluxo laminar, onde foi distribuída e fechada uma brotação para cada frasco contendo meio de cultura MS. Os frascos contendo os explantes foram incubados em sala de crescimento com temperatura média de 25oC e fotoperíodo de 16 horas de luz.

xix Após 30 dias foi realizado o subcultivo das brotações e os explantes colocados em meios de cultura novos. Depois, as plântulas foram retiradas dos frascos e transplantadas em substrato comercial plantmax em bandejas.

Após o período de incubação as mudas foram levadas para a aclimatação em estufa coberta com filme plástico (150 microns) e tela de sombreamento artificial (transposição de 50% da irradiação solar).

O sistema de irrigação é através de nebulização (tipo foger) em uma freqüência de 3 a 4 vezes ao dia durante a primeira semana do transplantio, diminuindo-se gradativamente até o período de rustificação ao final de 60 dias do transplantio, e adubações semanais com solução nutritiva a base do meio de cultura MS líquido contendo apenas os sais e vitaminas.

Após a rustificação as mudas foram levadas ao campo para plantio em espaçamento de 0,75m entre linhas.

xx 4. DISCUSSÃO E CONCLUSÃO

Pode-se concluir que a Micropropagação “in vitro” é uma forma mais rápida de se conseguir o desenvolvimento de uma cultura em relação a reprodução vegetativa, porém ainda não há muitos estudos a respeito da micropropagação, e por enquanto é inviável, pois se tem custo elevado e dificuldade de obter meio de cultura adequado.

A micropropagação em plantas para alguns ainda é desconhecida e com o tempo, a tecnologia de micropropagação vai ampliar e melhorar, então, será viável a reprodução de plantas através da micropropagação “in vitro”.

xxi 5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

CABRAL, J. R. S.; CUNHA, G. A. P. da; RODRIGUES, E. M.Micropropagação do abacaxizeiro. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE FRUTICULTURA, 7, 1983.

Florianópolis.

Anais...

Florianópolis:

Sociedade

Brasileira

de

Fruticultura/EMPASC, V.1, p.124-127, 1984.

CARDOSO, M. R. O. Produção de batata-semente no Brasil, Informe Agropecuário, ano 7 número 76, p. 70-71, 1981.

CONCEIÇÃO, A.M.; FORTES, G.R.L.; SILVA, J.B. Influência do ácido acetilsalicílico, da sacarose e da temperatura na conservação in vitro de segmentos caulinares de batata. Horticultura Brasileira, Brasília, v.17, n.3, p.182-185, 1999.

FEDALTO, A.A. Avaliação da produtividade de tubérculos de plantas oriundas de sementes sexuadas de batata (Solanum tuberosum L.) e da primeira geração de propagação vegetativa. Tese de Mestrado, Viçosa, MG,1982.

FORTES, G.R.L.; PEREIRA, J.E.S. Batata-semente pré-básica: Cultura de Tecidos. In: PEREIRA, A.S.; DANIELS, J. (Eds.). O cultivo da batata na região sul do Brasil. Embrapa Clima Temperado. Brasília, DF: Embrapa Informação Tecnológica, p.421-433, 2003.

GOTO, M.A. Batata e Mandioca. Livro s/ editora. p. 40 – 61, 2000.

KIMATI, H; AMORIM, L; BENGAMIN FILHO, A; CAMARGO, L.E.A.; REZENDE, J.A.M. Manual de Fitopatologia. 3. Ed. São Paulo: ESALQ, p 137 – 157, 1997.

KOZAY, T.; KUBOTA, C.; JEONG, B. R. Environmental control for the largescale production of plants through in vitro techniques. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, Dordrecht, v. 51, p. 49-56, 1997.

xxii LEVIN, R.; ALPER, Y.; STAV, R.; WATAD, A. Methods and apparatus for liquid media and semiautomated micropropagation. Acta Horticulturae, Wageningen, v. 447, p. 659-663, 1997.

PEREIRA, J.E.S.; FORTES, G.R.L.; FERNANDES, H.S. In Vitro optimization of potato meristems growth by cultivation in liquid culture media.

Embrapa Clima Temperado, Pelotas, RS, 2001 (comunicado técnico).

REIFSCHNEIDER, F. J. B. Produção de batata. Linha Gráfica e Editora, 1987.

SKOOG, F. & MILLER, C. O Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissues cultured "in vitro". Symp. Soc. Exp. Biol., p.118131, 1957.

WIKIPEDIA.

Micropropagação.

http://pt.wikipedia.org/wiki/Micropropagão.

2008.

2008.

Disponível

em:

Acesso em: 12 de Dezembro de