1.2.4. Phương pháp định tính, định lượng polyphenol trong lá chè

1.2.4. Phương pháp định tính, định lượng polyphenol trong lá chè 1.2.4.1. Phương pháp định tính bằng thuốc thử

- Định tính nhóm Anthranoid bằng phản ứng Borntraeger. - Định tính nhóm Steroid – triterpenoid bằng: Thuốc thử Salkowski, Liebermann –

Burchard, Rosenthaler,... - Định tính alkaloid bằng: Thuốc thử Mayer, Wagner. - Định tính nhóm flavonoid bằng: Dung dịch FeCl3 bão hoà, H2SO4 đặc. - Định tính nhóm saponin bằng khả năng tạo bọt, định tính chỉ số tạo bọt.

Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất Anthranoid

Phản ứng Borntraeger Nguyên tắc: Trong thiên nhiên các hợp chất Anthranoid có thể tồn tại dưới dạng oxy hoá (Anthraquinone) hoặc dạng khử (Anthranol, Anthrone), dạng tự do (aglycone) hoặc dạng kết hợp (glycoside). Các hợp chất Anthranoid khi tác dụng với kiềm (amoniac, natri hydroxyd hoặc kali hydroxyd) sẽ tạo các dẫn chất phenolate có màu đỏ tím.

Khảo sát sự hiện diện của Steroid – triterpenoid

Đặc điểm: Steroid là những alcol thể rắn được phân bố rộng rãi trong tự nhiên, cấu trúc tổng quát vòng cyclopentanopentanoperhyrophenantren hoặc một vài trường hợp hiếm gặp là dạng biến đổi của hệ thống vòng nói trên. Steroid có nguồn gốc sinh tổng hợp như triterpen với chất liệu cơ bản là pharnesyl pyrophosphat. Sterol thuộc nhóm steroid, phân bố rộng rãi, thường có mặt song song với các alkaloid hoặc saponinsteroid. Chúng có nguồn gốc động vật (cholesterol) hoặc thực vật (phytosterol, β –sitosterol, ergosterol, stigmasterol,…). Sterol có mặt trong tất cả các bộ phận của cây nhưng có nhiều nhất ở các hạt có dầu dưới dạng tự do hoặc các ester. Sterol là chất không phân cực, rất ít tan trong nước, tan trong dầu béo, carotene. Tan nhiều trong các dung môi không phân cực như petroleum ether, benzen, chloroform, nên thường dùng các dung môi này để chiết sterol. Sản phẩm chiết được bằng dung môi hữu cơ thường là hỗn hợp các ester sterol kết hợp với lipid, carotene, lecitin. Phải qua giai đoạn xà phòng hóa để tách các chất này ra khỏi sterol, sau đó chiết sterol bằng dung môi hữu cơ. Tinh chế bằng kết tinh phân đoạn.

Một số thuốc thử nhận biết Steroid – triterpenoid:

Thuốc thử Liebermann – Burchard:

 Anhidrid acetic 1 ml

 H2SO4 đậm đặc

Dung dịch xuất hiện màu lục, hồng, cam hoặc đỏ và bền là phản ứng dương tính. Thuốc thử Salkowski: H2SO4 đậm đặc, nếu xuất hiện màu đỏ đậm, xanh, xanh tím là phản ứng dương tính.

Phản ứng Rosenthaler để phát hiện Steroid – triterpenoid: - Vanilin 1%/ethanol 2 giọt, 10 ml nước cất. - Hỗn hợp hai dung dịch và thêm đủ 100 ml nước cất.

Dung dịch sẽ xuất hiện tủa trắng hoặc vàng nhạt.

Khảo sát sự hiện diện của Alkaloid

Đặc điểm: Alkaloid là những hợp chất hữu cơ chứa dị vòng nitơ, có tính base, thường gặp ở nhiều loại thực vật, đôi khi còn tìm thấy trong một số loài động vật. Alkaloid tồn tại ở hai trạng thái rắn và lỏng. Đa số chúng không tan trong nước (trừ nicotin và coniine), hầu hết tan trong dung môi hữu cơ như benzen, ether, chloroform,… Các alkaloid đa số không mùi và có vị đắng, một số ít có vị cay (piperine). Đặc biệt alkaloid có hoạt tính sinh lý cao đối với cơ thể người và động vật, nhất là đối với hệ thống thần kinh. Với một lượng nhỏ, alkaloid có thể là chất độc gây chết người (như thuốc phiện, heroin), nhưng nó có khi lại là thần dược trị bệnh đặc hiệu hay thành phần quan trọng trong một số thực phẩm (như cacao, cà phê,…). Alkaloid có chứa lưu huỳnh thường có độc tính rất mạnh, có nhiều trong các loại nấm độc.

Một số thuốc thử Alkaloid: Thuốc thử Mayer: • Dung dịch 1: Hòa tan 1,36 g HgCl2 trong 60 ml nước cất. • Dung dịch 2: Hòa tan 5 g KI trong 10 ml nước cất. • Hỗn hợp hai dung dịch và thêm đủ 100 ml nước cất.

Dung dịch xuất hiện tủa trắng hoặc vàng nhạt. Thuốc thử Wagner: • I2 : 1,27g

• KI: 2 g • H2O: vừa đủ 100 ml

Dung dịch xuất hiện tủa màu nâu.

Khảo sát sự hiện diện của Flavonoid

Đặc điểm: Flavonoid là những hợp chất màu phenol thực vật, tạo nên rất nhiều màu cho rau, quả, hoa,... Phần lớn chúng có màu vàng, một số ít có màu xanh, tím, đỏ hay không màu. Một số alkaloid tan trong nước, rượu, acid vô cơ loãng và base băng. Flavonoid có cấu trúc cơ bản là 1,3 diphenylpropan, gồm 2 vòng benzen A và B nối với nhau qua một dây 3 carbon, nên thường gọi là C6-C3-C6. Nếu dây C3 đóng thì đánh số bắt đầu từ dị vòng với dị nguyên tố oxygen mang số 1, rồi đánh tiếp đến vòng A, còn vòng B đánh số phụ. Nếu dây C3 hở, đánh số chính trên vòng B và đánh số phụ trên vòng A.

Một số thuốc thử Flavnoid: Với dung dịch FeCl3 bão hòa: Nếu tạo thành dung dịch màu xanh đen là phản ứng dương tính. Với dung dịch H2SO4 đậm đặc: Xuất hiện màu vàng đậm đến cam hoặc đỏ đến xanh dương, tùy vào loại hợp chất khác nhau mà có màu khác nhau.

Khảo sát sự hiện diện của saponin

Định tính khả năng tạo bọt của saponin trong môi trường acid, base: - Thuốc thử: HCl : 0,1N NaOH : 0,1N - Nếu ống pH = 13 cột bọt cao hơn nhiều so với ống pH = 1, có thể có saponin steroid.

1.2.4.2. Phương pháp sắc ký lớp mỏng TLC

Nguyên tắc: Phương pháp sắc ký lớp mỏng được dùng để định tính, thử tinh khiết và đôi khi để bán định lượng hoặc định lượng hoạt chất thuốc. Định nghĩa: Sắc ký lớp mỏng là một kỹ thuật tách các chất được tiến hành khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh trên đó đã đặt hỗn hợp các chất cần tách. Pha tĩnh là chất hấp phụ được chọn phù hợp theo từng yêu cầu phân tích, được trải thành lớp mỏng đồng nhất và được cố định trên các phiến kính hoặc phiến kim loại.

Pha động là một hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần được trộn với nhau theo tỷ lệ quy định trong từng chuyên luận. Trong quá trình di chuyển qua lớp hấp phụ, các cấu tử trong hỗn hợp mẫu thử được di chuyển trên lớp mỏng, theo hướng pha động, với những tốc độ khác nhau.

Kết quả Ta thu được một sắc ký đồ trên lớp mỏng. Cơ chế của sự chia tách có thể là cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, sàng lọc phân tử hay sự phối hợp đồng thời của nhiều cơ chế tùy thuộc vào tính chất của chất làm pha tĩnh và dung môi làm pha động. Ðại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của chất phân tích là hệ số di chuyển Rf được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng dịch chuyển của chất thử và khoảng dịch chuyển của dung môi:

Rf = b a

Trong đó: a: là khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi đo trên cùng đường đi của vết, tính bằng cm. b: là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết mẫu thử, tính bằng cm.

. Rf: Chỉ có giá trị từ 0 đến l.

1.2.4.3. Phương pháp UV-VIS

Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử hay còn gọi là phương pháp đo quang, phương pháp phân tích trắc quang phân tử là một trong những phương pháp phân tích công cụ thông dụng với rất nhiều thế hệ máy khác nhau, từ các máy đơn giản của thế hệ trước còn được gọi là các máy so màu đến các máy hiện đại được tự động hóa hiện