Vyšetřovací metody v imunologii
3
onemocnění systémových s předpokládanou imunokomplexovou genezí. V ojedinělých případech je možné využít orientačně toto vyšetření ke sledování dynamiky onemocnění.
3.1.4.3 Interpretace výsledků Zvýšení koncentrace cirkulujících imunokomplexů provází počáteční fáze nebo reaktivace imunokomplexových onemocnění, většinou systémových autoimunit. Bývá přítomno u stavů spojených s hypergamaglobulinemií. Absence nebo velmi nízké hodnoty cirkulujících imunokomplexů bývají u stavů spojených se snížením či chyběním imunoglobulinů, vzácněji při zachycení dynamiky imunokomplexového onemocnění může snížení cirkulujících imunokompelxů znamenat ukládání těchto komplexů do tkání. Metodou precipitace s polyetylenglykolem však může být naměřena falešně vysoká hodnota u chylózních sér.
3.1.5
Proteiny akutní fáze a sedimentace erytrocytů
Jako proteiny akutní fáze se označují bílkoviny, jejichž koncentrace dynamicky stoupá v akutní fázi zánětu a jejichž měření lze tudíž využít k diagnostickým a monitorovacím účelům. Takových proteinů se ukázala být celá řada, nicméně z praktického hlediska snadného stanovení a jasné interpretace se nyní využívá hlavně stanovení CRP, popřípadě orosomukoidu a prokalcitoninu. Odrazem probíhajícího zánětu je také sedimentace erytrocytů. Stanovení rychlosti sedimentace je prastarou ale stále nenahraditelnou metodou při diagnostice a monitorování zánětlivého procesu.
3.1.5.1 Metody stanovení Sedimentace erytrocytů Stanovení rychlosti sedimentace erytrocytů se provádí standardními metodami. Nesrážlivá krev se natáhne do příslušných stojanů a následuje pasivní sedimentace. Rychlost sedimentace (měřená jako milimetry poklesu sloupce erytrocytů) se odečítá za první a druhou hodinu. Existují i zrychlené modifikace této metody. Při pečlivém provedení a po praktickém vyzkoušení metodik na daném pracovišti dávají tyto různé způsoby odpovídající a srovnatelné informace. Původní přístroj na měření sedimentace zavedený Fahraeusem a Westergreenem je v současné době nahrazen modifikovanými kapilárami, které vyžadují méně krve, ale princip zůstává stejný. Od autorů metody se uchovala zkratka pro vyšetření sedimentace – FW. Stanovení proteinů akutní fáze CRP CRP je nejvíce stanovovaným paremetrem v souvislosti s monitorováním zánětu. Stanovení CRP se nyní provádí naprostou většinou nefelometricky. Využívá se rychlosti této metodiky pro stanovení, která jsou většinou požadovaná v akutní fázi infekčních a zánětlivých onemocnění a jsou tedy nezbytně nutné rychlé i statimové výsledky. V poslední době jsou k dispozici velmi praktické malé stolní či ruční přístroje k turbidimetrickému vyšetření právě CRP, které jsou velmi jednoduché a adaptované na vyšetření krve odebrané do kapiláry. Využívají se v režimu POCT, jedná se o zkratku označující provedení vyšetření laboratorního parametru na místě ošetření pacienta (point of care testing). V případě CRP je tato metoda čím dále tím více využívána ve zdravotnických zařízeních i v terénní praxi. Na fotometrii založené přístroje na POCT vyšetření CRP jsou nyní široce dostupné, výsledky vydávají v řádu minut. Jsou velkým přínosem pro terénní praxi.
98
Ukázka elektronické knihy, UID: KOS192904
Možnosti vyšetřování složek imunity
3
Další proteiny akutní fáze Nefelometricky ev. turbidimetricky je možno stanovit i řadu dalších proteinů, které jsou někdy využívány jako proteiny akutní fáze, jako je fibrinogen, ceruloplazmin, orosomukoid, alfa-1-antitrypsin, sérový amyloid A a prokalcitonin. Většina těchto parametrů má i jiné indikace a jako proteiny akutní fáze se stanovují výjimečně s výjimkou osoromukoidu a prokalcitoninu. Orosomukoid neboli kyselý alfa-1-glykoprotein je alfa-globulin syntetizovaný převážně v játrech. Uplatňuje se v séru při transportu některých léků, ale prakticky je využívána jeho typická vlastnost řadící jej mezi klasické proteiny akutní fáze. Zvyšuje se při zánětu přibližně s obdobnou dynamikou jako CRP. Prokalcitonin je prekurzorem kalcitoninu, hormonu produkovaného štítnou žlázou, který ve spolupráci s parathormonem reguluje hladinu kalcia. Prokalcitonin je za normálních okolností nedetekovatelný, jeho hladiny se zvyšují v odpověď na infekci, a to hlavně infekci bakteriálního či mykotického původu. Z tohoto důvodu se také interpretace jeho zvýšených hladin využívá v diferenciální rozvaze mezi zánětem způsobeným bakteriální infekcí (například u septických stavů) a zánětem jiného původu. Je zajímavé, že i výrazně zvýšené hladiny prokalcitoninu vyvolané infekcí nevedou ke zvýšení hladin samotného kalcitoninu, a ani k dysregulaci hladin kalcia v séru.
3.1.5.2 Indikace k vyšetření Indikací k vyšetření jsou jednoznačně akutní zánětlivé stavy. Patří sem jak infekční onemocnění, tak onemocnění autoimunitní a další stavy provázené zánětlivým procesem, jako jsou například malignity, stavy operačního či traumatického stresu. Význam vyšetření CRP stoupl poté, co se zjistila určitá korelace s procesy postihujícími cévy (endoteliální dysfunkce, rizikový faktor infarktu myokardu). Nyní se v této indikaci CRP široce využívá. Jeho zvýšení je do určité míry spojeno se zhoršenou prognózou pacienta. Chronicky vyšší hladiny CRP jsou také spojeny s rizikem vzniku a progrese aterosklerózy. 3.1.5.3 Interpretace vyšetření Vyšetření sedimetace erytrocytů je nutno interpetovat opatrně. Její výše je závislá hlavně na koncentraci fibrinogenu, nicméně je ovlivněna i počtem a velikostí červených krvinek a dalšími parametry. Vyšetření je velmi nespecifické, nicméně jeho zvýšení je patologickou hodnotou, která je indikací k dalšímu diagnostickému procesu. Normální hodnoty sedimentace se pohybují kolem 10 mm za 1 hodinu. O středně zvýšené sedimentaci mluvíme, pokud jsou hodnoty mezi 20–50, o vysoké sedimentaci při hodnotách nad 50 mm/h. Limitem hodnoty sedimentace je hodnota hematokritu: má-li pacient sedimentaci vyšší než 120mm/h, je vždy přítomna i anémie (uvažujeme-li jako normální hodnotu hematokritu 40). Vyšetření CRP není zatíženo nespecifickými chybami. Za normálních okolností jsou hladiny CRP v séru velmi nízké, v závislosti na použité metodice obvykle nižší než 2 mg/l. Jejich zvýšení může být mírné až dramatické, má určitou dynamiku, která je rychlejší než u FW. CRP sleduje postup zánětu v řádu hodin. Interperatace výsledků musí probíhat v souvislosti s ostatními údaji v diferenciální diagnostice daného onemocnění. Jedná se o nespecifický parametr, který indikuje do jisté míry závažnost stavu, ale nepřispívá k určení podstaty onemocnění. Zajímavou dynamiku má CRP u onemocnění SLE, které je normálně provázeno ve své aktivní fázi velmi výraznou zánětlivou aktivitou, která však nevede ke zvýšení CRP. To v těchto případech bývá nízké a v jasné diskrepanci s vysokou FW. Vysoké CRP u SLE 99
Ukázka elektronické knihy, UID: KOS192904
3
Vyšetřovací metody v imunologii
svědčí pro komplikující, většinou infekční proces. U pacientů hypogamaglobulinemií je také CRP důležitým markerem zánětu, neboť u nich nedochází obvykle ke zvýšení sedimentace erytrocytů.
3.1.6
Komplement a jeho složky
Systém komplementu je velmi složitý a velmi přesně regulovaný systém, který má v imunitních reakcích řadu klíčových funkcí. Skládá se ze základní kaskády devíti složek, které při aktivaci podléhají postupnému štěpení za generace aktivních molekul s chemotaktickým, opsonizačním a membranolytickým účinkem. Tato kaskáda je spouštěna třemi základními cestami, na kterých se podílejí další molekuly zahrnuté do široké skupiny komplementu. Dále je celý systém pečlivě řízen a regulován dalšími regulačními složkami komplementu. Při vyšetření komplementu se tudíž musí přesně specifikovat situace, která vede k indikaci vyšetření komplementu a podle toho se musí určit cílová molekula a metoda, která se bude uplatňovat při vyšetření.
3.1.6.1 Metody stanovení složek a funkce komplementu Kaskáda komplementu se spouští po inicializaci velmi rychle a její jednotlivé složky mají krátký poločas a většinou i nízkou koncentraci v séru. Z těchto důvodů je stanovení jednotlivých složek problematické. Prakticky se stanovují pouze dvě klíčové složky kaskády, a to C3 a C4. Tyto složky se vyšetřují jako bílkoviny využitím některé z metod reakce proteinu se specifickým antisérem. V současné době se většinou užívá nefelometrie. Vyšetření C3 a C4 je metodicky obdobné vyšetření imunoglobulinů (viz odstavec kvantitativní stanovení protilátek). Může se tedy využívat i radiální imunodifuze, ev. metody ELISA. Vyšetření ostatních složek komplementu či vyšetření degradačních produktů komplementu se provádí pouze na specializovaných pracovištích, většinou pak na mezinárodní úrovni. Při vyšetření, zda kaskáda komplementu úspěšně probíhá po aktivaci, se využívají funkční testy klasické či alternativní dráhy aktivace komplementu, včetně lektinové. Rozdíl je ve spouštěcím mechanizmu komplementové kaskády. Tyto testy většinou končí určitou vizualizací a měřením účinku membranolytického komplexu vytvořeného na konci komplementové kaskády. Prakticky se pro tyto účely používá test nazývaný CH50 či CH100. V tomto testu se měří hemolýza cílových senzitizovaných heterologních erytrocytů, které jsou vystaveny komplementu v séru vyšetřovaného jedince. V přítomnosti aktivované komplementové kaskády jsou lyzovány cílové erytrocyty. Různými metodami, jako je například lýza měřená opticky u erytrocytů v agarovém gelu či lýza měřená množstvím uvolněného hemoglobinu z erytrocytů v suspenzi, se určí hodnota odpovídající probíhající kaskádě. Z regulačních složek komplementu je klíčovou molekulou inhibitor složky C1, který brzdí komplementovou kaskádu. Vyšetření této složky je důležité, neboť existují vrozené deficity této složky, které vyvolávají onemocnění hereditárním angioedémem. Inhibitor C1 je možné stanovit jako odpovídající protein nefelometricky. Nicméně u části pacientů je tento protein stále přítomen, i když je v těchto případech nefunkční. Z těchto důvodů je nyní k dispozici cenný funkční test. V takové situaci je sérum pacienta vystaveno exogennímu značenému C1s. V případě funkčního navázání inhibitoru C1 se tento detekuje protilátkou proti této molekule. Pokud k vazbě nedošlo, protilátka proti inhibitoru C1 nemá vazebné místo a test ukáže nefunkčnost přítomného proteinu. 100
Ukázka elektronické knihy, UID: KOS192904