V7n4

ISSN 1984-4433

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2015

Volume 7 | Número 4

SCIENTIA CHROMATOGRAPHICA

Publicação disponível na internet:

251 Determinação de nove fungicidas em suco de laranja por cromatografia líquida de ultra eficiência acoplada à espectrometria de massas tandem e extração mini-Luke

2015 | Volume 7 | Número 4

Jaqueline F. Reichert, Ionara R. Pizzutti, Jonatan V. Dias, Carmem D. Cardoso

261 Técnicas cromatográficas acessíveis para determinação de contaminantes fúngicos Eliana Badiale Furlong

275 Determinação de compostos organoalogenados em adubo orgânico empregando extração com auxílio de ultrassom e cromatografia gasosa com detecção por captura de elétrons Cristine Wickert, Martha B. Adaime, Renato Zanella

287 LC-MS/MS determination of chloramphenicol in food of animal origin in Brazil Letícia R. Guidi, Luiza H. M. Silva, Christian Fernandes, Nicki J. Engeseth, Maria Beatriz A. Gloria

297 Recentes avanços da microextração em fase sólida no tubo (in-tube SPME) e sua aplicação em análises ambientais e alimentícias Ana Lúcia de Toffoli, Fernando Mauro Lanças

Rua Princesa Isabel, 265 - Jardim Paraíso São Carlos (SP) - CEP 13561-140 Fone/ Fax: (16) 3501-4140 | www.iicweb.org

2015 | Volume 7 | Número 4

Instituto Internacional de Cromatografia

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Scientia Chromatographica Editor-in-Chief

Fernando Mauro Lanças

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Editores Associados

Maria Eugênia Queiroz Preparo de Amostras

Renato Zanella Preparo de Amostras

José Manuel F. Nogueira Preparo de Amostras

Isabel C. S. Fontes Jardim Cromatografia Líquida

CORPO EDITORIAL CONSULTIVO

Daniel Armstrong – EUA Dietrich von Bauer – Chile Fábio Augusto – Brasil Fátima Dutra – Brasil Flávio Leite – Brasil Frank Svec – EUA Harold McNair – EUA Humberto Gómez – México Isabel Cristina Sales Fontes Jardim – Brasil Jailson B. de Andrade – Brasil Janusz Pawliszyn – Canadá Kiyoratsu Jinno – Japão Luigi Mondello – Itália Marcos Eberlin – Brasil Marina Tavares – Brasil Milos Novotny – EUA Milton Lee – EUA Norberto Peporine Lopes – Brasil Phillip Marriott – Austrália Pierina Bonato – Brasil Quézia Cass – Brasil Renato Zanella – Brasil

ENDEREÇO DO PERIÓDICO

Scientia Chromatographica

Elena Stashenko Espectrometria de Massas

Fabio Augusto Cromatografia Gasosa

Alejandro Cifuentes Técnicas Eletroforéticas

Álvaro J. Santos Neto Troubleshooting

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Ficha catalográfica elaborada pela Seção de Aquisição e Tratamento da Informação do SBI/IQSC Scientia Chromatographica / Associação Internacional de Cromatografia. - vol.7 n.4 (out./dez. 2015). São Carlos: Associação Internacional de Cromatografia, 2015 Trimestral ISSN 1984-4433 1. Cromatografia. 2. Lanças, Fernando Mauro, editor chefe.

Cláudia Zini Cromatografia Gasosa

Elina B. Caramão Cromatografia Gasosa

CDD 543.8

ISSN 1984-4433

Periódico Trimestral do Instituto Internacional de Cromatografia

2014 2015 | Volume 67 | Número 14

Uma publicação do Instituto Internacional de Cromatografia www.iicweb.org

SUMÁRIO

Editorial................................................................................................................................................................................................................249 Fernando Mauro Lanças

U-HPLC-MS/MS Determinação de nove fungicidas em suco de laranja por cromatografia líquida de ultra eficiência acoplada à espectrometria de massas tandem e extração mini-Luke.......................... 251 Jaqueline F. Reichert, Ionara R. Pizzutti, Jonatan V. Dias, Carmem D. Cardoso

CROMATOGRAFIA GASOSA Técnicas cromatográficas acessíveis para determinação de contaminantes fúngicos............... 261 Eliana Badiale Furlong

PREPARO DE AMOSTRAS Determinação de compostos organoalogenados em adubo orgânico empregando extração com auxílio de ultrassom e cromatografia gasosa com detecção por captura de elétrons.................... 275 Cristine Wickert, Martha B. Adaime, Renato Zanella

LC-MS/MS LC-MS/MS determination of chloramphenicol in food of animal origin in Brazil......................... 287 Letícia R. Guidi, Luiza H. M. Silva, Christian Fernandes, Nicki J. Engeseth, Maria Beatriz A. Gloria

PREPARO DE AMOSTRAS Recentes avanços da microextração em fase sólida no tubo (in-tube SPME) e sua aplicação em análises ambientais e alimentícias.................................................................................................................. 297 Ana Lúcia de Toffoli, Fernando Mauro Lanças

Novidades Tecnológicas................................................................................................................................................................................316 Instituto Internacional de Cromatografia...............................................................................................................................................321 Biblioteca IIC......................................................................................................................................................................................................322 Normas para Publicação...............................................................................................................................................................................323

Scientia Chromatographica 2015; 7(4)

247

Scientia Chromatographica 2015; 7(4):249 Instituto Internacional de Cromatografia http://dx.doi.org/10.4322/sc.2016.006 ISSN 1984-4433

EDITORIAL

Mensagem do Editor Volume 7, Número 4

O V7N4 (volume 7, número 4) encerra o volume 7 do periódico, registrando os 8 anos (o primeiro foi o V0 e não V1) de existencia do Scientia. Também consolidou a versão eletrônica do periódico, a qual se mostrou mais prática do que a versão impressa pela eliminação da etapa de impressão e distribuição, o que agiliza a disponibilidade da informação ao leitor. O volume 7 também marcou a publicação de números especiais dedicados a um determinado assunto, seja um tema relevante ou a publicação de trabalhos de um evento especial, incluindo um “meeting report” para os interessados que não puderam comparecer ao mesmo.

Desta forma, o Scientia tem buscado uma melhora na sua diagramação; uma ampliação na área de distribuição e captação de artigos; uma maior agilidade no prazo de publicação dos artigos; um aumento nos artigos publicados na língua inglêsa e outras melhoras. Esses esforços visam uma maior internacionalização do periódico, mantendo a genética que motivaram sua criação. Para o Volume 8 – 2016, teremos grandes novidades.

Esperamos que os leitores apreciem as modificações que foram introduzidas ao longo deste ano, e que nos brindem com seus comentários visando a melhora do Scientia para os próximos números.

Fernando M. Lanças Editor chefe

Scientia Chromatographica 2015; 7(4)

249

Scientia Chromatographica 2015; 7(1):250-250 Instituto Internacional de Cromatografia http://dx.doi.org/10.4322/sc.2015.000 ISSN 1984-4433

250

CLASSIFICAÇÃO

Scientia Chromatographica 2015; 7(1)

Scientia Chromatographica 2015; 7(4):251-259 Instituto Internacional de Cromatografia http://dx.doi.org/10.4322/sc.2016.007 ISSN 1984-4433

U-HPLC-MS/MS

Determinação de nove fungicidas em suco de laranja por cromatografia líquida de ultra eficiência acoplada à espectrometria de massas tandem e extração mini-Luke Determination of nine fungicides in orange juice by ultra performance liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry and mini-Luke extraction

Jaqueline F. Reichert Ionara R. Pizzutti Jonatan V. Dias Carmem D. Cardoso* Departamento de Química Universidade Federal de Santa Maria – UFSM Av. Roraima 1000, Cidade Universitária Bairro Camobi, CEP 97105-900, Santa Maria, RS, Brasil *carmem.dickow@ceparc.com.br Recebido: 08 Set 2015 Aceito: 14 Dez 2015

Resumo

O Brasil é o maior produtor mundial de suco de laranja, porém, muitos dos agrotóxicos permitidos na citricultura brasileira, são proibidos pelos países importadores. Neste trabalho a extração mini-Luke e a cromatografia líquida de ultra eficiência acoplada à espectrometria de massas tandem (UPLC-MS/MS) foram empregados para a determinação de nove agrotóxicos da classe dos fungicidas em sucos de laranja, todos com uso permitido no Brasil. A linearidade do método foi estudada na faixa de 0,1 a 100 ng mL-1. Os resultados de recuperação e desvio padrão relativo (RSD%) ficaram dentro da faixa esperada (entre 70 a 120% e ≤ 20%, respectivamente) para todos os fungicidas, com exceção do tiofanato-metílico. Os valores de limite de quantificação de 10, 20 e 50 µg kg-1 para seis, dois e um fungicidas estudados, respectivamente, são iguais ou inferiores aos valores dos limites máximos de resíduos (LMR) estabelecidos pelas legislações brasileira, americana e européia. O método validado foi aplicado na análise de amostras de suco de laranja natural e processado (concentrado, diluído e integral), perfanzendo um total de 20 amostras. Todas as amostras apresentaram contaminação por piraclostrobina e trifloxistrobina; algumas amostras apresentaram contaminação por carbendazim, tebuconazol e tiofanato-metílico.

Palavras-chave: fungicidas, mini-Luke, suco de laranja, UPLC-MS/MS.

Abstract

Brazil is the largest producer of orange juice, however, many of the pesticides allowed in citrus in Brazil are not allowed by importing countries. In this study miniLuke extraction and ultra performance liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) were used for the determination of nine fungicide pesticides in orange juice, all allowed in Brazil. Method linearity was studied in the range of 0.1 to 100 ng mL-1. Recovery and relative standard deviation (RSD%) were within the expected range (70 to 120% and ≤ 20%, respectively) for all fungicides, except for thiophanate-methyl. Quantification limit values were 10, 20 and 50 µg kg-1 for six, two and one fungicide studied, respectively, are equal to or lower than the values of the maximum residue limits established by the Brazilian, American and European legislation. The validated method was applied in the analysis of natural and processed orange juice (concentrate, diluted and integral), in a total of 20 samples. All samples showed contamination by piraclostrobin and trifloxistrobin; some samples showed contamination by carbendazim, tebuconazole and thiophanate-methyl.

Keywords: fungicides, mini-Luke, orange juice, UPLC-MS/MS. Scientia Chromatographica 2015; 7(4)

251

Reichert JF, Pizzutti IR, Dias JV, Cardoso CD

1. Introdução

O suco de laranja é o suco de fruta mais consumido no mundo todo, apreciado por seu sabor fresco e considerado benéfico para a saúde do consumidor devido à presença de vários compostos, tais como antioxidantes naturais e, dentre eles, vitamina C (ácido ascórbico)[1].

O Brasil é o maior produtor mundial de laranjas, e destina mais de 80% dos frutos colhidos para a produção de sucos[2]. Em 2012, o país teve problemas relacionados à exportação de suco de laranja concentrado devido à presença do fungicida carbendazim, permitido pela legislação brasileira, mas proibido pela legislação de outros países[3]. Como o carbendazim, outros fungicidas também utilizados na citricultura no Brasil tem seu uso proibido em países importadores de suco de laranja brasileiro. Assim, monitoramentos são necessários para garantir a qualidade dos produtos para consumo humano e também proteger o homem, plantas, animais e ecossistemas da exposição aos agrotóxicos[4].

Métodos multirresíduos oferecem vantagens em monitoramentos, pois são capazes de identificar simultaneamente um grande número de agrotóxicos e reduzir a quantidade de resíduos e o tempo de análise.

Técnicas como cromatografia líquida com detecção por arranjo de diodos (HPLC-DAD)[5] e cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas tandem (LC-MS/ MS)[4,6-10] podem ser aplicadas na maioria dos casos para a determinação de agrotóxicos polares. LC-MS/MS é uma das técnicas mais poderosas para a determinação de agrotóxicos em uma variedade de matrizes complexas, mostrando-se muito sensível para a determinação de resíduos em frutas e sucos de frutas[9,10] e para agrotóxicos polares termoinstáveis que normalmente não podem ser determinados por cromatografia em fase gasosa ou exigem derivação antes da análise[8].

Para matrizes complexas, o preparo de amostra é uma etapa muito importante, visto sua capacidade em remover as principais interferências que possam afetar o resultado final[9-11]. A extração líquido-líquido é o método mais popular de preparo de amostras para o isolamento 252

Determinação de fungicidas em suco de laranja por UPLC-MS/MS

de resíduos de agrotóxicos a partir de várias matrizes alimentares[12]. Entretanto, nos últimos anos, foram utilizados diferentes métodos analíticos para a extração de fungicidas, como mini-Luke[8], QuEChERS[9,10], QuEChERS tamponado[7], extração em fase sólida (SPE) [13] , extração com acetato de etila[4,6] e extração assistida por microondas[14].

O objetivo deste trabalho foi validar um método analítico para a determinação dos fungicidas azoxistrobina, carbendazim, difenoconazol, famoxadona, piraclostrobina, tebuconazol, tiabendazol, tiofanatometílico e trifloxistrobina em suco de laranja (todos permitidos pela ANVISA)[15], empregando o método mini-Luke para extração dos analitos a partir da matriz e posterior análise por UPLC-MS/MS. De acordo com a classificação toxicológica estabelecida pela United States Environmental Protection Agency (US EPA), os fungicidas carbendazim, difenoconazol e tebuconazol são classificados como Grupo C, possíveis cancerígenos para os seres humanos[16]. Alguns fungicidas estudados neste trabalho apresentam toxicidade para organismos aquáticos, como também podem apresentar persistência moderada no solo e contaminar os recursos hídricos[17,18].

2. Experimental 2.1. Reagentes e materiais Os padrões analíticos (pureza > 97%) dos fungicidas selecionados, incluindo o padrão interno (P.I.) propoxur (inseticida), foram adquiridos da empresa Dr. Ehrenstorfer (Augsburg, Alemanha). Os solventes acetona (grau resíduo), acetonitrila (grau HPLC) e ácido acético glacial (grau HPLC) foram adquiridos da J. T. Baker (Nova Jersey, EUA). Diclorometano (grau HPLC), metanol (grau HPLC) e éter de petróleo (grau resíduo) foram adquiridos da Mallinckrodt (Missouri, EUA). Formiato de amônio (P.A.) foi adquirido da Fluka Analytical (Seelze, Alemanha) e sulfato de sódio anidro, da UCT (Bristol, EUA).

Scientia Chromatographica 2015; 7(4):251-259

Determinação de fungicidas em suco de laranja por UPLC-MS/MS

Reichert JF, Pizzutti IR, Dias JV, Cardoso CD

2.2. Preparo das soluções analíticas

As soluções analíticas estoque individuais, na concentração de 1000 mg L-1, foram preparadas em tolueno, metanol ou acetona, de acordo com a solubilidade de cada fungicida. Após, foi preparada uma solução mistura contendo todos os analitos na concentração de 1 mg L-1. Todas as soluções foram mantidas sob refrigeração, em temperatura controlada a -18 °C. Posteriormente foram preparadas diluições da solução mistura nas concentrações de 20 e 100 ng mL-1 e a partir destas soluções foram preparadas as soluções diluídas para a curva analítica, em metanol (contendo 0,1% de ácido acético glacial) e em extrato “branco” da matriz, nas concentrações de 0,1; 0,2; 0,5; 1,0; 2,0; 5,0; 20,0 e 100,0 ng mL-1.

2.3. Condições cromatográficas

As análises cromatográficas foram realizadas em um sistema UPLC-MS/MS, Waters Acquity (Milford, EUA), a separação ocorreu em uma coluna analítica BEH C18 (100 mm × 1,7 mm d.i., 1,7 µm) (Waters, Milford, EUA) e a fase móvel consistiu de uma solução aquosa de formiato de amônio 0,3 g L-1 (eluente A) e metanol (eluente B). O gradiente da fase móvel iniciou com 80% do eluente A, sendo levado diretamente a 15% em 11 minutos, e a proporção foi mantida durante 1 minuto,

em seguida a composição foi levada à composição inicial (80% do eluente A) em 0,5 minutos e a proporção mantida até o final da corrida cromatográfica (tempo total de 14 minutos), vazão da fase móvel de 0,45 mL min-1 e a temperatura do forno foi mantida em 60°C. O sistema de detecção utilizado foi um espectrômetro de massas (MS) com analisador do tipo triplo quadrupolo, Xevo TQS (Waters, Milford, EUA), com interface por eletronebulização (ESI) e operado no modo positivo. Utilizou-se o modo monitoramento de reações múltiplas (MRM) e para a aquisição e processamento dos dados empregou-se o software MassLynx e TargetLynx, versão 4.1.

No MS foram utilizadas as seguintes condições: tensão do capilar 3,0 kV e temperatura do gás de dessolvatação (N2) 400 °C. As vazões do gás de dessolvatação e do gás do cone de amostragem foram 500 e 150 L h-1, respectivamente. A voltagem do cone de amostragem foi de 35 V e o fluxo do gás de nebulização foi de 7,0 L h-1. Para a fragmentação dos íons, utilizou-se o gás argônio (fluxo do gás de colisão de 0,15 mL min-1).

As transições para quantificação e confirmação, voltagem do cone, energia de colisão e tempos de retenção para cada analito de interesse, estão apresentadas na Tabela 1.

Tabela 1. Fungicidas e respectivos íon precursor, tempo de retenção, voltagem do cone, íon produto e energia de colisão no sistema UPLC-MS/MS com ESI no modo positivo e monitoramento de reações múltiplas (MRM).

Transição de quantificação

Transição de confirmação

Fungicidas

Íon precursor

Tempo de retenção (min)

Voltagem do cone (V)

Íon produto

Energia de colisão (V)

Íon produto

Energia de colisão (V)

Azoxistrobina Carbendazim Difenoconazol Famoxadona Piraclostrobina Propoxur (P. I.) Tebuconazol Tiabendazol Tiofanato-metílico Trifloxistrobina

404,1 192,0 406,1 392,2 388,1 210,1 308,2 202,0 343,0 409,2

7,10 2,81 9,66 9,15 9,11 4,57 8,76 3,48 4,48 9,87

15 25 35 20 25 15 30 45 25 25

372,0 159,9 250,9 331,1 163,0 110,9 70,1 174,9 151,0 185,9

16 30 25 9 25 12 24 25 23 14

328,9 132,0 187,8 93,0 193,9 92,9 124,9 130,9 311,0 145,0

30 16 40 31 12 25 40 30 10 40

Scientia Chromatographica 2015; 7(4):251-259 253

Reichert JF, Pizzutti IR, Dias JV, Cardoso CD

2.4. Procedimento de extração

O extrato “branco” da matriz (isento dos analitos de interesse) foi obtido de amostras de laranja orgânica, adquiridas em propriedade particular, no interior do Estado do Rio Grande do Sul (RS), cujo cultivo não sofreu aplicação de agrotóxicos.

Determinação de fungicidas em suco de laranja por UPLC-MS/MS

O valor do LOQ, baseado nos valores de exatidão e precisão, foi definido como sendo o menor nível de fortificação que apresentou recuperação na faixa de 70 a 120% e RSD ≤ 20%[20].

O efeito matriz foi determinado, em cada ponto da curva analítica, de acordo com a Equação 1, na qual são utilizadas as áreas dos picos para as soluções analíticas preparadas em solvente orgânico e para as soluções analíticas preparadas em matriz, injetadas sete vezes (n=7) no sistema cromatográfico.

Pesou-se 15 g (± 0,05 g) de suco de laranja natural, em tubos de teflon® com capacidade de 250 mL, adicionou-se 30 mL de acetona, e a mistura foi submetida à homogeneização durante 20 segundos a 25200 g. Posteriormente, adicionou-se 15 g de sulfato de  inclinação da curva em matriz  = Efeito matriz (%)  –1   × 100 (1) sódio anidro e a amostra foi novamente homogeneizada  inclinação da curva em solvente     por 20 segundos a 25200 g, seguido da adição de 30 mL de éter de petróleo e 30 mL de diclorometano. Após 2.6. Análise de amostras reais homogeneização nas mesmas condições anteriores, o O método validado foi aplicado na análise de extrato foi centrifugado durante 3 minutos a 1451,5 g.

20 amostras reais. Todas as amostras foram adquiridas Uma alíquota de 1,2 mL do extrato foi transferida na cidade de Santa Maria (RS). para um tubo de evaporação e levada a banho de água, Para a aplicação do método em suco natural inicialmente à temperatura de 45 ºC, e posteriormente foram adquiridas 15 amostras de laranja (1 kg de elevada até 62 ºC, até próximo à secura. O resíduo foi cada): cinco amostras em feira de produtos orgânicos e ressuspendido em 1 mL de metanol acidificado contendo 10 amostras em dois supermercados (cinco amostras em o P.I. propoxur na concentração de 40 ng mL-1 e os cada supermercado). As amostras de suco processado extratos foram analisados por UPLC-MS/MS[8]. (embalagens de 600 mL) dos tipos concentrado (duas amostras) e integral pasteurizado (uma amostra) foram 2.5. Validação adquiridos em outros dois supermercados diferentes. O Os parâmetros linearidade, exatidão (recuperações suco diluído (duas amostras) foi preparado a partir das %), precisão (RSD%), limite de quantificação e efeito amostras do suco concentrado. matriz (%) foram avaliados durante o estudo de validação do método analítico[19].

A linearidade foi avaliada utilizando as soluções analíticas preparadas (conforme descrito no item 2.2) em solvente orgânico e em extrato da matriz e injetadas no sistema cromatográfico sete vezes (n=7). A partir dos valores médios das áreas dos picos obteve-se os coeficientes de determinação (r2) e a faixa linear para cada fungicida.

Os valores de exatidão e precisão foram obtidos a partir do estudo de fortificação e recuperação em três níveis de concentração (10, 20 e 50 µg kg-1) e sete replicatas de cada nível (n=7).

254

3. Resultados e discussão 3.1. Validação

Os resultados obtidos para as soluções dos fungicidas preparadas em solvente orgânico e em extrato “branco” da matriz, como o r2 e o intervalo linear das curvas de calibração mostraram valores aceitáveis de acordo com o valor de r (coeficiente de correlação) igual ou superior a 0,99 ou acima de 0,90, recomendados respectivamente, pela ANVISA e pelo INMETRO (Instituto Nacional de Metrologia, Qualidade e Tecnologia)[19,21]. Para todas as soluções dos fungicidas, os valores de r2 foram maiores que 0,9964, tanto para Scientia Chromatographica 2015; 7(4):251-259

Determinação de fungicidas em suco de laranja por UPLC-MS/MS

Reichert JF, Pizzutti IR, Dias JV, Cardoso CD

curva em solvente orgânico quanto em extrato “branco” da matriz. A Tabela 2 apresenta as equações da reta e os coeficientes de determinação para cada fungicida, em solvente orgânico e em extrato “branco” da matriz.

concentração, com sete repetições em cada nível. Os valores das recuperações e dos RSD% são apresentados na Tabela 3. Dos nove fungicidas estudados, seis (azoxistrobina, famoxadona, piraclostrobina, tebuco­ nazol, tiabendazol e trifloxistrobina) apresentaram valores aceitáveis de recuperação (entre 70 e 120%) e

A precisão, em termos de repetibilidade, foi avaliada por estudo de recuperação em três níveis de

Tabela 2. Equações da reta e coeficientes de determinação (r2) no estudo de linearidade para os fungicidas em solvente orgânico (metanol contendo 0,1% de ácido acético) e em extrato “branco” da matriz, com posterior análise por UPLC-MS/MS com ESI no modo positivo e monitoramento de reações múltiplas (MRM).

Solvente orgânico

Extrato “branco” da matriz

Fungicidas

Equação (Y = ax + b)

r2

Equação (Y = ax + b)

r2

Azoxistrobina Carbendazim Difenoconazol Famoxadona Piraclostrobina Tebuconazol Tiabendazol Tiofanato-metílico Trifloxistrobina

Y = 21548x + 1747,9 Y = 19616x + 902,69 Y = 7501,3x – 1347,2 Y = 828,47x – 165,94 Y = 8407,7x + 440,42 Y = 4295x + 314,39 Y = 9349,5x – 479,92 Y = 10527x – 2758,7 Y = 18634x – 1810,9

0,9985 0,9981 0,9995 0,9969 0,9982 0,9985 0,9996 0,9964 0,9988

Y = 21484x + 1239,3 Y = 18866x + 4037,3 Y = 7569,1x – 1739 Y = 749,15x – 139,83 Y = 8200,7x – 632,1 Y = 4256,2x + 103,41 Y = 8241,6x – 694,81 Y = 10101x – 1808,4 Y = 18463x – 484,57

0,9975 0,9967 0,9988 0,9978 0,997 0,9976 0,9995 0,9967 0,9986

Tabela 3. Recuperação média (%) para n = 7, desvio padrão relativo (RSD,%) e LOQ, para os nove fungicidas fortificados em extrato “branco” de matriz, nas concentrações de 10, 20 e 50 µg kg-1.

Níveis de fortificação (µg kg-1) Fungicidas

Azoxistrobina Carbendazim Difenoconazol Famoxadona Piraclostrobina Tebuconazol Tiabendazol Tiofanato-metílico Trifloxistrobina

10

20

50

Rec. média (%)

RSD (%)

Rec. média (%)

RSD (%)

Rec. média (%)

RSD (%)

116,7 141,2 89,1 109,7 112,9 111,1 118,3 7,7 112,9

5,1 11 35,5 4,8 2,7 4,4 2,6 55,1 2,7

105,9 112,9 102,3 104,8 106,3 105,1 108,9 41,6 107,8

3 3,7 2,4 4,6 3,9 2,7 2,6 27,6 2,6

100,3 99,4 99,8 102,8 100,6 101,4 100,8 74,5 102,5

5,8 11,3 5,9 5,8 6 5,8 6 22,1 6,3

LOQ (µg kg-1)

LMRa (mg kg-1)

10 20 20 10 10 10 10 50 10

15,0/15,0/0,5 b /0,2/5,0 0,6/0,1/0,5 b /0,02/0,05 2,0/2,0/0,5 b /0,9/5,0 10,0/5,0/10,0 b /0,05/5,0c 0,6/0,3/0,2

USDA (Departamento de Agricultura dos Estados Unidos)/EU (União Européia)/ANVISA Fungicida proibido nos EUA c LMR do tiofanato-metílico é expresso como carbendazim a

b

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Reichert JF, Pizzutti IR, Dias JV, Cardoso CD

Determinação de fungicidas em suco de laranja por UPLC-MS/MS

respectivos valores de RSD% (≤ 20%) para o menor nível de fortificação (10 µg kg-1) e dois (carbendazim e difenoconazol) apresentaram resultados aceitáveis para o nível de fortificação de 20 µg kg-1. O fungicida tiofanato-metílico foi o analito que apresentou valores de recuperação mais baixos. Para o nível de 10 µg kg-1, a recuperação foi menor que 70%; já o valor de recuperação para o carbendazim ultrapassou 120%. À medida que os níveis de fortificação aumentaram, as recuperações para o tiofanato-metílico também aumentaram e para o carbendazim, os valores diminuíram.

De acordo com SANCO[24], valores de recuperação entre 60 e 140% e RSD > 20%, podem ser aceitos em alguns casos justificados, como em casos de degradação de compostos. Nesse caso, o LOQ para tiofanatometílico pode ser aceito como 50 µg kg-1 considerando sua possível degradação.

De acordo com Guo et al.[22] e Fernández et al.[23], tiofanato-metílico quando submetido a condições tais como elevados valores de pH (pH > 7) ou temperatura elevada (>40 °C) é degradado rapidamente para carbendazim. Em matriz ácida, tal como suco de laranja (pH entre 3,0 e 4,5), o tiofanato-metílico e outros agrotóxicos tem apresentado mais estabilidade do que em matriz básica. No entanto, no procedimento de extração, o extrato foi aquecido em banho de água até 62 °C para remover o solvente apolar. Assim, o tiofanatometílico mostrou baixas recuperações para os níveis de 10 e 20 µg kg-1 enquanto que o carbendazim apresentou recuperação maior que 120% em 10 µg kg-1. Assim, uma hipótese que justifica os valores das recuperações para tiofanato-metílico e carbendazim é a possível degradação do primeiro, já que foi utilizada temperatura de 62 °C no método de extração.

O efeito matriz ocorre devido à co-eluição de compostos que interagem com os analitos no processo de ionização, produzindo a supressão ou o aumento do sinal analítico como consequência da competição entre os diferentes compostos (matriz/analitos) ionizados na superfície das gotas formadas na interface ESI[27]. O número de íons do analito pode ser reduzido por interação com íons da matriz, o que é chamado de “supressão de íons”, ou aumentado pela presença dos íons da matriz, resultando em um efeito matriz negativo ou positivo, respectivamente[28]. Dessa forma, o resultado do efeito matriz pode comprometer severamente uma análise quantitativa dos compostos presentes em quantidades vestigiais, bem como pode afetar grandemente a precisão e reprodutibilidade do método.

Para o valor real do LOQ (µg kg-1) considerou-se a menor concentração que, ao ser fortificada na matriz, apresentou valores de recuperação (%) e RSD (%) entre 70 e 120% e ≤ 20%, respectivamente.

Os valores de LOQ para cada um dos fungicidas, bem como os LMR no Brasil, nos EUA e na Europa, são apresentados na Tabela 3. Para seis dos nove fungicidas o LOQ foi de 10 µg kg−1 e dois apresentaram LOQ de 20 µg kg−1.

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Para todos os fungicidas estudados, com exceção do tiofanato-metílico, o valor de LOQ obtido foi menor que o valor estabelecido pelas legislações nacional e internacional[15,25,26]. O valor de LOQ obtido para o tiofanato-metílico ficou igual ao menor LMR (Europa).

A avaliação do efeito matriz foi feita por comparação das inclinações das curvas analíticas preparadas em solvente orgânico e em extrato “branco” da matriz, de acordo com a Equação 1.

Todos os fungicidas estudados apresentaram percentuais de efeito matriz aceitáveis, ou seja, na faixa entre +20 e -20%, sem comprometer o resultado da análise (Figura 1). O efeito matriz é, em sua maioria, negativo, o que significa efeito de supressão do sinal analítico, diminuindo a intensidade do sinal pela interferência dos componentes da matriz.

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estão abaixo dos LMR permitidos pelas diferentes legislações apresentadas neste trabalho. Cabe lembrar que os fungicidas carbendazim, tebuconazol e tiofanatometílico, caso encontrados em concentração acima do permitido, podem comprometer a exportação do produto para os EUA, uma vez que a legislação americana não permite o uso destas substâncias.

Figura 1. Percentual do efeito matriz (n = 7) para cada um dos nove fungicidas obtido por comparação das inclinações das curvas analíticas preparadas em solvente orgânico e em extrato “branco” da matriz suco de laranja natural.

3.2. Aplicação do método validado

A análise das 20 amostras reais proporcionou uma investigação preliminar acerca da possível presença de resíduos dos fungicidas estudados, tanto em sucos naturais quanto nos sucos processados que chegam à mesa do consumidor da cidade de Santa Maria (RS).

Todas as amostras (adquiridas em feira de produtos orgânicos e em quatro mercados diferentes) apresentaram resíduos de piraclostrobina, tebuconazol e trifloxistrobina.

O fungicida carbendazim foi encontrado no suco natural proveniente da feira e dos dois mercados, além do suco concentrado e integral de mercado.

Nas amostras de suco natural dos mercados foram encontrados os fungicidas azoxistrobina, difenoconazol e tiabendazol.

O fungicida tiofanato-metílico foi encontrado somente em suco natural proveniente da feira de produtos orgânicos.

Todos os fungicidas encontrados nas diferentes amostras apresentaram valores de concentração abaixo dos respectivos valores de LOQ. Estes, por sua vez,

Quanto às amostras de suco natural provenientes de feira de produtos orgânicos, nenhum traço de fungicida poderia ser encontrado.

4. Conclusão

O método de extração mini-Luke aliado ao moderno sistema UPLC-MS/MS foi eficiente para o método multirresíduo proposto neste estudo, com parâmetros de validação compatíveis com os valores exigidos em análises de matrizes alimentares para determinação de contaminantes.

Na aplicação do método para as 20 amostras de sucos natural e processado, todas apresentaram contaminação pelos fungicidas piraclostrobina, tebuco­ nazol e trifloxistrobina, 90% das amostras apre­sentaram traços dos fungicidas tebuconazol, 30% das amostras apresentaram contaminação por carbendazim, 5% apresentaram os fungicidas azoxistrobina, difenoconazol, tiabendazol e tiofanato-metílico. Em nenhuma das amostras foi detectado o fungicida famoxadona.

Agradecimentos

Os autores agradecem à CAPES, ao Ministério da Ciência,Tecnologia e Inovação (MCTI), ao Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) e à Financiadora de Estudos e Projetos (FINEP) pelo apoio financeiro. Agradecimentos também ao NVWA (Autoridade Holandesa em Segurança Alimentar e do Consumidor) pelo apoio científico.

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Scientia Chromatographica 2015; 7(4):261-273 Instituto Internacional de Cromatografia http://dx.doi.org/10.4322/sc.2016.008 ISSN 1984-4433

CROMATOGRAFIA GASOSA

Técnicas cromatográficas acessíveis para determinação de contaminantes fúngicos Acessible chromatographic techniques for fungal contaminants determination

Eliana Badiale Furlong* Universidade Federal do Rio Grande, Escola de Química e Alimentos, Laboratório de Micotoxinas e Ciência de Alimentos.

Av. Itália, Km 8, Rio Grande, RS *dqmebf@furg.br Recebido: 08 Set 2015 Aceito: 03 Nov 2015

Resumo

Neste texto estão comentadas aplicações de técnicas cromatográficas simples e acessíveis, como a cromatografia de camada delgada e cromatografia gasosa com detecção por ionização de chama, para determinar contaminantes fúngicos em alimentos. Estão enfatizados a importância de cuidados operacionais e a validação de métodos para geração de dados confiáveis, que possam subsidiar providência ao longo da cadeia produtiva e garantir a segurança de alimentos. Espera-se motivar a busca de informações acerca do problema micotoxicológico, independente do grau de sofisticação da instrumentação analítica, para descrever o panorama e disponibilizar soluções exequíveis.

Palavras chave: aflatoxinas, micotoxinas, ocratoxina A, tricotecenos, zearalenona.

Abstract

This text compiles simple and available chromagraphic techniques, such as thin layer chromatography and gas chromatography with flame ionization detection, as determination tools of fungal contamination in foods. Operational protocol and validation methods are emphasized, in order to ensure reliable data generation.

Trustworthy data is the cornerstone of food safety throughout the production chain.

Hopefully, this text will motivate further studies about mycotoxins contamination regardless of the analytic technique sophistication, thus ensuring a wider outlook of the situation and enable feasible solutions.

Keywords: aflatoxins, mycotoxins, ochratoxin A, trichotecenes, zearalenone.

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1. Introdução

A adoção de estratégias que garantam a segurança dos alimentos depende primeiramente de dados referentes à qualidade das matérias primas e alimentos, enfatizando a presença de contaminantes físicos, químicos ou biológicos. Pode-se salientar a determinação de contaminantes fúngicos, os pontos críticos para controle deles, estabelecimento de limites aceitáveis de exposição, formas de inativa-los e definição da sua toxicidade, dentre outras[1].

Os contaminantes fúngicos, as micotoxinas, são produzidos sob condições difíceis de serem controladas, em grãos, frutas e outras matrizes alimentares primeiramente colonizados por fungos toxigênicos pertencentes aos gêneros Fusarium, Aspergillus, Penicillium, Alternaria e outros[2,3]. Ao contrário dos fungos, as micotoxinas podem permanecer no material contaminado mesmo após a inviabilidade dos microorganismos produtores, pois possuem estruturas químicas estáveis termicamente, pouco solúveis em água, não fotossensíveis e que podem estar adsorvidas em macromoléculas como carboidratos e proteínas[4,5].

Os efeitos tóxicos destes compostos variam: sintomas gastrointestinais, danos no sistema sanguíneo e imunológico, distúrbios neurológicos e hormonais, diminuição da velocidade de crescimento, hepatotoxicidade, nefrotoxicidade e morte[1,2,6,7]. Os danos agudos são mais facilmente identificados e associados ao consumo de alimentos em animais tratados com ração ou dietas mais restritas[7]. Em humanos a diversidade da dieta dificulta a associação do sintoma a um dado contaminante, além disso, as doses de exposição podem ser menores e contínuas desencadeando danos crônicos nem sempre atribuídos aos alimentos consumidos[1,7].

Para prevenir estes riscos à saúde de humanos ou de animais de criação os órgãos responsáveis por controle da saúde em nível mundial[8] (FAO, 2004) e individualmente vários países definiram limites aceitáveis para os grupos destes contaminantes considerando a comercialização e consumo[9]. No caso do Brasil, até 262

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2011, a legislação era restrita a poucos alimentos e a um grupo de micotoxinas, as aflatoxinas[9,10].. Estes limites vem sendo revistos em função da demonstração da toxicidade dos compostos, da frequência da ocorrência e da disponibilidade de métodos confiáveis para determina-los. Junto da definição dos limites aceitáveis são necessários métodos cuja performance analítica permita monitorar os alimentos quanto a presença das micotoxinas de maior risco[9,11].

Identificar e quantificar micotoxinas é um desafio tendo em vista as características destes compostos que pertencem a várias famílias químicas, ocorrem de forma aleatória e simultânea num alimento em quantidades traços[9,11]. A diversidade tóxica e química inclusive na própria família, a localização em pontos distintos das estruturas celulares, a geração de sinais determináveis fracos gera a demanda por métodos analíticos constituídos por etapas de separação cromatográfica para determinação múltipla e sensível dos contaminantes[9,11].

O conhecimento sobre as micotoxinas em alimentos foi beneficiado pela evolução das técnicas cromatográficas. A instrumentalização da determinação em fluxo continuo com o emprego de gases como fase móvel, a eluição sob fluxo líquido controlado para determinação empregando refratometria, espectrofotométria de absorção molecular ultravioletavisivel, infravermelho, espectrometria de massas, eletroquimicas ampliaram as possibilidades de determinação simultânea, aumentaram a sensibilidade e repetibilidade dos métodos analíticos[12-16].

A evolução tecnológica chegou também a técnica de cromatografia em camada delgada, cujos efeitos da separação eram limitados pela avaliação subjetiva do analista e propriedade do analito. Fases estacionárias uniformes e com partículas com dimensões nano, detecção por densitometria ou diagnóstico fotométrico da imagem, softwares que garantem o significado quali ou quantitativo dos sinais do analito contribuem beneficamente com a aplicação da técnica de forma confiável para alguns grupos químicos de micotoxinas[12,13,15,17].

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Ao mesmo tempo, que se observa um ganho em possibilidades de monitoramento das micotoxinas ou dos fenômenos a elas associados, algumas demandas surgiram, destacando-se os materiais necessários para preparo de amostra, pureza de padrões e reagentes, padrões certificados e analistas capacitados para operar e interpretar os resultados das separações[12-15,17].

A consequência negativa destes avanços pode decorrer dos custos destas demandas, especialmente em países que precisam importar os equipamentos e insumos. Outro aspecto é que os resultados obtidos em condições menos sofisticadas são questionados, pela comunidade científica ou pelos órgãos de fiscalização, quanto a validade da informação gerada.

Com este critério, pela impossibilidade de atualizar a infraestrutura analítica alguns setores públicos e privados, que poderiam disponibilizar dados importantes sobre a situação micotoxicológica dos alimentos, podem deixar de realizar o controle ou mesmo a capacitação de pessoal com sólida compreensão das técnicas de separação e de cuidados analíticos para garantir a confiabilidade dos resultados.

Considerando o risco que a ocorrência de micotoxinas pode representar para a saúde pública, tomar providências fica limitado pelo impasse de dispor de informações seguras, geradas com recursos analíticos menos sofisticados, ou incentivar e considerar apenas os resultados obtidos em condições operacionais pouco acessíveis à maioria dos setores envolvidos com o problema. Salta a vista que esta última possibilidade restringe o monitoramento apenas a produtos de maior valor agregado e a regiões específicas aonde a infraestrutura acompanha os avanços tecnológicos de instrumentação analítica.

Neste texto estão descritas técnicas cromatográficas simples e acessíveis, como a cromatografia de camada delgada e cromatrografia gasosa com detecção por ionização de chama, aplicadas a determinação de micotoxinas em matrizes

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alimentares. Espera-se motivar a busca de informações acerca do problema micotoxicológico, independente da sofisticação da infraestrutura analítica, para descrever o panorama e disponibilizar soluções exeqüíveis ao longo da cadeia agroindustrial e efetivação do cumprimento dos limites aceitáveis de exposição às micotoxinas. É importante salientar que a proposta não é incentivar um retrocesso na tecnologia analítica, mas sim motivar a geração de informações úteis para o manejo do problema de contaminação micotoxicológica, tendo como base a experiência da rotina de um laboratório com infraestrutura de médio porte.

2. Cromatografia de Camada Delgada aplicada à determinação de Micotoxinas.

Até a década de 90 a técnica de cromatografia de camada delgada (CCD) era recomendada por órgãos oficiais para avaliação da ocorrência de corantes sintéticos, carotenoides, açúcares, aminoácidos, grupos de metais e micotoxinas em alimentos[9-13,17]. Para compostos não coloridos ou não fluorescentes serem detectados são necessárias etapas de derivação (reações químicas) que os tornem coloridos, fluorescentes para visualização, determinação densitometrica[18] ou imagem fotometrica e também para confirmação da identidade deles[13,17-19]. Em qualquer um dos casos o resultado é usualmente considerado semi–quantitativo, pois a variabilidade dos resultados pode ser superior a 20% e os limites de detecção promoverem resultados falsos negativos[9,16,17].

2.1. Aflatoxinas B1, B2, G1 e G2

As aflatoxinas B1, B2, G1 e G2 (AFAs) são micotoxinas produzidas por fungos do gênero Aspergillus que contaminam alimentos e rações sob condições de umidade elevada, temperatura variável entre outros fatores abióticos e bióticos[10,11]. Este grupo de micotoxinas vem sendo foco de estudos, pois seus efeitos tóxicos causam impacto na saúde humana e de animais de criação. Os danos mais característicos são a hepatotoxicidade e a carcinogenicidade demonstrada deles[1,2,7,9].

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Badiale-Furlong E

Quimicamente as AFAs constituem um grupo de compostos heterocíclicos (furanocumarinas) que apresentam fluorescência azul (B) ou verde (G) sob luz ultravioleta (360 nm). A diferença estrutural (penta ou hexa anéis, insaturações) e o potencial tóxico de cada uma, torna necessário conhecimento dos teores individuais delas nos alimentos[9-11]. Os métodos oficiais para determiná-las recomendam técnicas cromatográficas, incluindo, até hoje a cromatografia de camada delgada, associada a detecção por fluorescência[2,9,19,20]. Até a última década foram realizados muitos estudos colaborativos para estabelecer protocolos que propiciassem o uso eficiente da técnica[20-24]. A CCD ainda pode ser utilizada por recomendação de órgãos oficiais para monitoramento de limites legislados para elas em muitos países, inclusive no Brasil (RDC, nº7, 2011)[25], pois os limites de quantificação da CCD são da ordem de ng, devido a propriedade de fluorescência das AFAs[9,10,18,19].

Para a determinação cromatográfica destas micotoxinas em matrizes alimentares a primeira operação consiste em uniformizar a granulometria, no caso de alimentos sólidos; seguindo-se de homogeneização com água e solventes medianamente polares (acetonitrila, metanol, acetato de etila); clarificação com agentes precipitantes (soluções aquosas de sulfato de amônio, sulfato de cobre entre outros) e adsorventes (celite, C18); partição liquido-liquido, em fase sólida ou em colunas de imunoafinidade antes da determinação cromatográfica dos extratos contendo os contaminantes[9,10,15,16,18-21,23].

O método de Soares e Rodrigues-Amaya[10] é muito utilizado para determinação de AFAs. Ele consiste na extração, partindo de 50 g de amostra, homogeneização com 300 mL de metanol e solução aquosa de cloreto de cálcio; clarificação com celite e solução aquosa de sulfato de amônio 40% ou sulfato de cobre. O extrato clarificado passa por partição liquido-liquido com clorofórmio que é evaporado. O resíduo seco é ressuspenso em benzeno para posterior separação das AFAs em CCD (sílica) eluídas por uma 264

Cromatografia e Segurança de Alimentos

mistura de tolueno, acetato de etila e ácido fórmico.

A visualização é realizada sob luz UV (360 nm). Os padrões de aflatoxinas para identificação pelo tempo de retenção (Rf) e quantificação visual são preparados e quantificados em função de suas absortividades molares. Os autores ainda recomendam a confirmação da identificação da micotoxina por co-cromatografia e reação delas com anidrido trifluoroacético[18].

Para adequar a performance do método para aplicá-lo a diferentes matrizes, foram necessárias algumas adaptações no preparo das amostras (granulometria, porções analíticas e tempo de contato com o solvente), ativação das placas cromatográficas e ajustes nas proporções dos solventes de eluição[26-30].

Por exemplo, para determinação das AFAs em amostras de pães de forma foi adotado separar a crosta do miolo, pois a homogeneização de ambos resultava em variabilidade acima de 30%, como consequência da pouca uniformidade granulométrica e dos interferentes (dados não publicados).Para aplicá-lo à massas de pizzas semi-prontas foi necessário reduzir a umidade até 15%.

A melhor recuperação para as amostras de pizzas preprontas foi obtida com a remoção prévia da gordura com hexano antes de homogeneização com metanol e solução aquosa de cloreto de potássio[28].

Um detalhe operacional que melhorou a recuperação das AFAs, aumentava em 12%, em amostras de farinhas e produtos de panificação foi a homogeneização manual com a solução extratora, repouso de 20 minutos e posterior homeoeneização em blender. Atribuiu-se o efeito a maior penetração do solvente[25,28,30].

Para a determinação de AFAs em amostras de arroz branco, integral e parboilizado o principal cuidado no preparo das amostras consistiu em moer, separar as frações granulométricas e compor uma amostra analítica contendo 50% da fração de 42 mesh e proporções uniformes das frações granulométricas maiores[27,29].

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O método original de Soares e RodriguezAmaya[10] emprega volumes que geram em média 180 mL de resíduo liquido e 70g de resíduo sólido por cada determinação, pois a massa analítica inicial é elevada (50g), requerendo maiores volumes do solvente extrator durante as etapas de limpeza e clarificação para que não ocorra saturação dos extratores ou perdas do analito.

Com o surgimento das folhas cromatográficas de alta resolução (HPTLC) os limites de detecção foram diminuídos passando da média de 5 ng para 1 ng por ponto, portanto adequadas para detectar os contaminantes dentro dos limites recomendados pela FAO[8] e da ANVISA[25]. Em termos de repetibilidade os progressos foram decorrentes quantificação baseada em detecção fotométrica usando o software Image J[19].

A associação das cromatofolhas de HPTLC e a determinação fotométrica da fluorescência permitiu a miniaturização do método original, passando se a empregar 10 g para amostra analítica, mantendo as proporções de solventes extratores e clarificantes. Em função disso houve uma diminuição em torno de 4 vezes na quantidade dos resíduos gerados (relatório técnico de divulgação restrita, 2011; 2012). O método original[10] com as adaptações características para cada amostra foi validado conforme as recomendações da ANVISA[25], Wernimont[31], Horwitz[32,33].

Estando a técnica adequada para preparo das matrizes foi estudada a ocorrência de AFAs em farinhas de trigo comercial[26,30] arroz branco, integral e parboilizado[26,27,29], além de outras matrizes farelo de arroz e meios de cultivo[34-37]. A migração destas micotoxinas durante o processo de parboilização foi estudada por Coelho et al.[27] empregando o método adaptado e foi possível encontrar equações preditórias da migração das AFAs em função dos parâmetros operacionais do processo.

O efeito do tratamento térmico e da fermentação de farelo de arroz com fungos GRAS (Generally

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Recognized as Safety) para degradar AFAB1, foi estudado por Cacciamani et al.[34] e Badiale-Furlong et al.[35] ficando registrada a redução média de 68% após a fermentação conduzida sobre diferentes parâmetros.

Oliveira e Badiale-Furlong[36] e Souza et al.[37] adaptaram o método para determinação de AFAs produzida por biomassa de Aspergillus oryzae em presença e ausência de antifúngicos naturais.

Após a miniaturização o método original[10] foram monitorados, ao longo de 4 anos, a ocorrência destas micotoxinas em arroz e seus derivados de beneficiamento, cultivados em campos experimentais submetidos a condições controladas de manejo do cultivo para avaliar o impacto no arroz colhido e propor ajustes no manejo da cultura, pelo controle de fatores de risco para a contaminação fúngica (informação restrita).

A CCD ainda é utilizada na rotina no Laboratório de Micotoxinas e Ciência de Alimentos da Universidade Federal do Rio Grande para detecção de aflatoxinas em matérias primas (grãos) destinadas a alimentação humana. Sempre são observados cuidados operacionais específicos para a preparação das amostras e condução da técnica cromatográfica de determinação dos analitos após a validação, considerando no mínimo as três figuras de mérito: limite de detecção e quantificação, recuperação e repetibilidade[31-33]. Na Tabela 1 estão alguns indicativos de confiabilidade do método empregando CCD com as adaptações já descritas para as diferentes matrizes.

Para avaliar o efeito de parâmetros operacionais se adota o teste de robustez ou planejamento experimental para decidir sobre a significância das variáveis[31]. A extração baseada no método original[10] miniaturizado é empregada para a preparação de extratos para a determinação das AFAs por cromatografia líquida de alta eficiência com detecção de fluorescência[38-40] ou visando confirmar a contaminação em casos de amostras suspeitas na CCD[37].

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Badiale-Furlong E

Cromatografia e Segurança de Alimentos

Tabela 1. Indicativos de confiabilidade do método de CCD aplicado a determinação de AFA B1, B2, G1 e G2.

Amostras

LQ (ng g-1)

Repetibilidade (CV%)

Recuperação (%)

Autores

Pães e pizzas Farinha de trigo

4; 4,5; 3,5; 3 5; 4,5; 3; 5

15; 15; 18; 20 5; 4,5; 3; 5

84; 80; 80; 77 80; 70; 60; 66

Arroz parboilizado e integral

5; 4; 5; 4

15; 18; 15; 19

88; 78; 70; 72

Arroz branco Farelo de arroz fermentado Biomassa fúungica Arroz e derivados

3; 4; 5; 4 6,5; 5; 6; 6 4; 5; 5; 4 2; 1; 2; 1,5

12; 17; 15; 16 16; 19; 23; 25 8; 8; 10; 9 4; 3; 5; 4

91; 83; 78; 75 80; 70; 70; 68 86; 80; 76, 82 90; 83; 80; 86

Pinho, B-Furlong[28] Vieira et al.[30] Coelho et al.[27] Nunes et al.[29] Badiale-Furlong et al.[26] Badiale-Furlong et al.[35] Oliveira, B.Furlong[36] Relatório técnico

LQ: limite de quantificação; CV: coeficiente de variação.

2.2. Ocratoxina A

Com esta performance o método foi aplicado ao monitoramento de alimentos a base de cereais disponíveis no comércio da região sul do Rio Grande do Sul.Foi verificado que 16% das amostras, estavam contaminadas com valores entre 26 e 35 ng g-1[26].

Outros autores também empregaram CCD e detecção de OTA por fluorescência para monitorar a incidência em derivados de milho[43].

Quimicamente a OTA caracteriza-se por possuir uma estrutura de beta fenilalanina associada a isocumarina que lhe confere a propriedade de fluorescer sob luz ultra violeta, cuja detecção visual ou instrumental é possível em níveis acima de 5 ng[9,10,41,42]. A família das ocratoxinas é constituída por formas derivadas, sendo OTA, a mais tóxica e moderadamente estável a condições de beneficiamento e tratamento térmico ao longo da cadeia industrial[42]. Em vista disso tem sido propostas estratégias para limitar seus níveis a valores aceitáveis de exposição para não causar prejuízos a saúde de humanos e de animais de criação[34,35,42].

Amostras de pizza semi-pronta, coletadas na mesma região não apresentaram contaminação detectável, dentro dos limites do nosso procedimento, porém na biomassa fúngica da micota isoladas das pizzas e cultivada por 21 dias houve produção e detectável de OTA[28], evidenciando o risco

A ocratoxina A (OTA) passou a fazer parte da legislação brasileira a partir de 2011[25], mas vem sendo limitada em vários países há mais de duas décadas, pois estão demonstrados os seus efeitos nefrotóxicos, hepatotóxicos, teratogênicos e imunossupressores[1,2,7,9].

Ela é produzida em cereais e seus derivados por fungos do gênero Aspergillus e Penicillium.

O método de Soares e Rodriguez-Amaya[10] foi validado, com adaptações operacionais específicas, para extrair OTA de arroz, farinha de trigo e fubá[26]. Nestas matrizes a OTA foi detectada apenas quando acima de 6 ng g-1 para os dois primeiros e 10 ng g-1 para o último; com recuperações médias para três níveis de 78%, 83% e 77% e coeficientes de variação 19%, 16% e 23% respectivamente para amostras de arroz, farinha de trigo e fubá[26].

266

Em arroz destinado ao consumo humano OTA foi detectada nos tipos parboilizado (128 ng g-1) e polido (100 ng g-1)[27,44], fato que reforçou o já demonstrado por Coelho et al.[27] que estudando a migração de micotoxinas durante o processo de parboilização verificou que a OTA era a que mais migrava para o endosperma amiláceo, na etapa de encharcamento do grão. O risco de migração dela para o interior do grão durante a parboilização foi reforçado no estudo de Dors et al.[44].

O efeito do processo fermentativo e do tratamento térmico nos níveis de OTA em farelo de arroz artificialmente contaminado também foi avaliado empregando o método adaptado. Com os indicativos de mérito do procedimento foi possível detectar diferenças Scientia Chromatographica 2015; 7(4):261-273

Cromatografia e Segurança de Alimentos

significativas entre amostras tratadas e não tratadas com os efeitos em estudo[34,35].

Visando minimizar a geração de resíduos o método QuEChERS foi adaptado para determinação de OTA empregando CCD e cromatografia liquida de alta eficiência (HPLC). Interessante observar que para a CCD ou em HPTLC e detecção por fotometria foram encontrados limites de quantificação de 0,9 ug g-1 e 0,5ng g-1; recuperação 113 e 84% respectivamente para HPTLC e HPLC[45], portanto aplicável ao monitoramento da observação da atual legislação brasileira para este contaminante.

2.3. Zearalenona

A zearalenona (ZON), cujo nome deriva de um fungo do complexo Fusarium Giberella zeae, o principal produtor, é uma micotoxina de efeito estrogênico, cuja estrutura é derivada do ácido resorcilico, que possui fluorescência fraca, sendo assim para detectala visualmente são necessários no mínimo 30 ng por mancha[9,10]. Ela não é considerada um composto de alta toxicidade, pois estudos demonstraram que doses de 20 mg kg-1 em camundongos e ratos não ocasiona letalidade.

No entanto, pode atuar como um hormônio esteroidal em doses superiores a 1mg kg-1 diariamente promovendo hiperestrogenismo em suínos[1,2,7,9].

Em alguns países já havia legislação para limitar a presença de ZON em alimentos, principalmente naqueles destinados ao consumo animal[8,9], porém no Brasil passou a fazer parte da legislação após a RDC nº7 da ANVISA[25]. Usando a fluorescência características estão disponíveis procedimentos envolvendo a determinação dela por CCD e detecção visual, que pode ser melhorada com uso de tricloreto de alumínio ou reações que promovam o enrijecimento da estrutura[9,10,15,16].

O método de Soares e Rodriguez-Amaya[10] também foi o ponto de partida para validação e aplicação à determinação de ZON em amostras de arroz branco, farinha de trigo e fubá, com os seguintes indicativos de confiabilidade: limite de quantificação 45, 40 e 32

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ng por ponto; coeficiente de variação 20, 21 e 18% e recuperação média (três níveis de contaminação) 75, 88 e 85% respectivamente para cada derivado cereal[26].

Em levantamentos realizados em amostras de arroz, farinha de trigo e de milho disponíveis no comércio da região sul do em Rio Grande, RS, no período entre 1996 e 1997 foram detectadas 6% de amostras de farelo de trigo e farinha de trigo integral contaminadas em níveis entre 97 e 105 ng g-1[26]. Nunes et al.[29] empregaram o mesmo procedimento para realizar levantamento desta micotoxina em amostras de arroz comercializado no Rio Grande do Sul encontrando-a em arroz branco, parboilizado e integral com valores elevados para as legislações existentes, entre 559 e 1955 ng g-1.

2.4. Desoxinivalenol e toxina T-2.

Estas micotoxinas fazem parte de um grupo químico sesquiterpenico denominado tricotecenos que são produzidas principalmente por fungos do complexo Fusarium. Variações na estrutura tricotecanica (dois hexaneis associados a um anel epóxido) são a base para classificação deles em 4 grupos A, B, C, D, que também diferem quanto a toxicidade e substrato preferencial[7,9,14,46].

O deoxinivalenol (DON), um tricoteceno do grupo B é o mais estudado em grãos cereais pois promove danos no sistema gastrointestinal e imunológico demonstrado em animais e humanos[2,7,9]. Seus limites aceitáveis em alimentos estão definidos por lei em muitos países, inclusive no Brasil aonde a implantação da legislação é progressiva, com os níveis aceitáveis diminuindo até 500 ng g-1 em 2017[8,25].

A toxina T2 pertence ao grupo A é promotora de efeitos agudos que levam a morte por hemorragia, mas em função dos poucos dados sobre sua ocorrência nos alimentos faz parte da legislação de poucos países[1,2,7,9,14].

Após a demonstração da toxicidade dos tricotecenos ao sistema imunológico e neurológico foram propostos vários métodos para determina-los

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Badiale-Furlong E

isolados ou em multimétodos, mas a falta de grupos cromóforos nas suas estruturas torna difícil a detecção pela absortividade ou a fluorescência, salientando que a separação cromatográfica é indispensável[9,14].

A visualização após separação por CCD é facilitada com o emprego de reagentes de derivação que aumentam a absortividade dos tricotecenos, assim como para a determinação por cromatografia gasosa é necessário volatiliza-los[9,14,47-49].

Partindo da extração proposta por Soares e Rodriguez-Amaya[10] e Badiale-Furlong e Soares[46] foram estudados reagentes clarificantes (celite, sulfato de amônio, carvão ativo), solventes para partição (clorofórmio, diclorometano separados e em mistura) e reagentes de derivação (tricloreto de alumínio, ácido sulfúrico e ácido cromotrópico) para determinação delas por CCD em malte cervejeiro[47]. O método também foi adotado para acompanhar o efeito da fermentação alcoolica nos níveis destas toxinas presentes em malte cervejeiro[50].

Após a validação o procedimento foi aplicado para determinar as micotoxinas em amostras de arroz e farinha de trigo (dados não publicados). O limite de detecção foi 40 ng e 50 ng por mancha; recuperação de 77,9 e 80,5%; coeficiente de variação 17 e 11% respectivamente para DON e toxina T2. Num levantamento aonde foram coletadas 112 amostras de farinha de trigo e 72 duas amostras de arroz branco foram confirmadas 2 amostras de arroz e uma amostra de farinha de trigo contaminadas com DON abaixo dos limites mínimos da legislação brasileira atual para esta micotoxina[47].

Considerando os limites da legislação brasileira para o DON[25,60] a detecção de DON empregando o método de camada delgada pode ser adaptada e validada para ser realizada em laboratórios com infraestrutura mais simples ou para a triagem pois com a disponibilidade de cromatoplacas de alta performance e detecção fotométricos associadas a confirmação química os indicativos de mérito analítico podem ser otimizados.

A aplicação em amostras de alimentos destinadas ao 268

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consumo humano em especial, em trigo e arroz e seus derivados pode fornecer subsídios para providências e estratégias ao longo da cadeia produtiva destes cereais.

3. Cromatografia gasosa acoplada a detector de ionização de chama aplicada a determinação de tricotecenos

A separação de misturas químicas em cromatografia gasosa (CG) requer que os componentes da mistura sejam voláteis em temperaturas que não ocasionem a sua decomposição, fato que limita a determinação a compostos naturalmente voláteis ou que possam ser derivatizados estequiometricamente. Os eluatos podem ser detectados por condutividade térmica, ionização de chama, captura eletrônica ou espectrometria de massas[51]. O primeiro tipo de detector não é indicado para micotoxinas pois é pouco sensível e o de captura eletrônica é mais recomendado para compostos derivados como halogênio[14,52].

Os tricotecenos são os contaminantes fúngicos que melhor se adaptam a determinação empregando CG, acoplada a detectores de ionização de chama, captura eletrônica e espectrometria de massas, pois que estas micotoxinas possuem baixa absortividade na região do ultravioleta-visível sendo melhor detectadas por outras propriedades[14-16].

Partindo do método descrito por Badiale-Furlong e Soares[46] para determinação de sete tricotecenos empregando CG acoplada a detector de ionização de chama, foi adaptado e validado um procedimento para determinação de DON e toxina T2, obtendo-se recuperação média de 83 e 103%; limite de detecção 21 e 60 ng mL-1 para DON e toxina T2. O procedimento foi aplicado para verificar a contaminação em 72 amostras de cerveja, comercializadas na região sul do Brasil, das quais 5,3 e 4,5% estavam contaminadas com DON e toxina T2 respectivamente[53].

Em vista da instabilidade e do custo do reagente derivatizante empregado pelos autores[46] (heptafluorobutiril imidazol) para derivação foi testado Scientia Chromatographica 2015; 7(4):261-273

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o anidrido trifluoroacético (TFAA) tendo por catalisador o bicarbonato de sódio cujas condições reacionais foram otimizadas empregando planejamento experimental, tendo como variáveis o tempo, a temperatura e proporções de TFAA adequados para total derivação do DON[54]. As melhores condições foram obtidas quando a 20 ug do tricoteceno eram adicionados 200 uL do reagente TFAA e 18 mg de bicarbonato de sódio reagindo por 6 minutos a 75ºC. O limite de detecção aplicando as condições cromatográficas foi de 1,4 ug de DON[54].

O método padronizado também foi empregado para determinação da distribuição de tricotecenos (DON e toxina T2) durante a elaboração de cerveja[55] e para avaliar o potencial do Rhizopus oryzae e Aspergillus oryzae como agentes para descontaminação de farelo de arroz e de trigo[56,57] e para estudar a migração dos tricotecenos durante a parboilização de arroz[58].

4. As técnicas cromatográficas aplicadas a situação micotoxicologica de alimentos

Dors[59] apresentou informações sobre contaminação de arroz e seus derivados, determinados por cromatografia de camada delgada numa tabela (Tabela 2) que r ilustra numericamente o risco da contaminação por micotoxina num alimento de rotina na dieta brasileira.

As informações e dados destacados neste texto, mesmo provenientes de um grupo que atua em uma região restrita também confirmam que o problema da ocorrência das micotoxinas é um fato nos alimentos destinados ao consumo humano. Outros grupos atuando no tema reforçam a existência do risco com estes contaminantes[9,10,19,43].

Até 1996 uma instrução normativa do MARA[60], nº183, tratava apenas de limitar o nível de 20 ng g-1 para a somatória das 4 aflatoxinas, enquanto a legislação européia já estabelecia para alimentos em geral 4 ng g-1[8]. Possivelmente os dados disponibilisados pelos grupos que dispendem esforços para estudar o problema, mesmo sob condições de infraestrutura nem sempre compatíveis com os avanços de instrumentação analítica, e considerando micotoxinas para as quais não havia restrição legal foram importantes e nortearam a revisão da legislação brasileira.

Foram estabelecidas a RDC nº 7[25] de 2011, RDC nº 59[60] e ainda a Instrução normativa nº18 do MAPA[61] que ampliam o número de micotoxinas e de alimentos com limites máximos permitidos para estes contaminantes.

Foram incluídas além das AFAs, OTA, DON, fumonisinas, patulina e ZON em alimentos à base de cereais, frutas, destinados ao consumo infantil e de consumo frequente.

Tabela 2. Ocorrência de micotoxinas em arroz comercializados no sul do Brasil.

Produto (nº amostras)

Micotoxina

Arroz branco (11) Arroz integral (33) Arroz parboilizado (12) FAD (16) FAD (8) Arroz parboilizado (12) Arroz branco (15) Farinha de arroz FAD (16) Arroz integral (16) Arroz parboilizado (16) Arroz branco (24)

Nd AFA B1 e OTA OTA AFA B1 e OTA AFA B1 e OTA OTA Nd Nd ZEA e OTA Nd ZEA e OTA ZEA e OTA

Contaminação 6% 17% 19% 37% 8%

8% 18,5% 8,3%

AFA: aflatoxina; OTA: ocratoxina A; ZEA: zearalenona; FAD: farelo de arroz desengordurado; nd: não detectado. Fonte: DORS[59].

Autores Coelho, 1998 Coelho, 1998 Coelho, 1998 Furlong et al., 1999 Furlong et al., 1999 Furlong et al., 1999 Furlong et al., 1999 Furlong (2001) Furlong (2002) Nunes et al., 2003 Nunes et al., 2003 Nunes et al., 2003

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Para consolidar a eficácia da lei para diminuir a exposição aos contaminantes seria interessante que fossem realizados estudos para desenvolver métodos analíticos exequíveis em diferentes laboratórios do país, com a confiabilidade necessária para detectar estes contaminantes dentro dos limites estabelecidos.

Neste sentido todas as micotoxinas naturalmente fluorescentes, AFAs e OTA ou que podem sofrer derivação, ZON e DON, para melhorar esta propriedade podem ser determinadas após separação por CCD desde que empregando cuidados de validação e algumas sofisticações disponíveis como cromatofolhas de nanoparticulas ou determinação eletrofotometrica da fluorescência.

5. Considerações Finais

Uma legislação para promover efetivamente benefícios para a população, em termos de segurança de alimentos pelo monitoramento da ocorrência de contaminantes é dependente da disponibilidade de métodos acessíveis e validados. Num país como o Brasil

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com a desuniformidade de recursos laboratoriais, com a limitação de depender de importação de insumos e instrumentos cromatográficos, aspectos que podem ser agravados pela crise econômica, a continuidade do monitoramento seguira sendo um desafio.

Para que não haja retrocesso com os cuidados para prevenir danos a saúde da população os dados precisarão ser gerados de forma econômica para propiciar a continuidade do monitoramento. Mesmo que os informes nem sempre sejam adequadas a divulgação em periódicos de grande impacto, quer pela regionalidade ou por não adotarem técnicas cromatográficas de ponta; porém eles serão indispensáveis para efetivar o avanço das medidas de segurança, desde que validados conforme a situação específica. Eles subsidiarão a tomada de medidas estratatégicas e preventivas ao longo da cadeia agroindustrial.

Agradecimentos

CNPq, CAPES, FAPERGS pelo suporte financeiro. Aos discentes e parceiros pela dedicação ao tema.

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CLASSIFICAÇÃO

Scientia Chromatographica 2015; 7(3)

Scientia Chromatographica 2015; 7(4):275-285 Instituto Internacional de Cromatografia http://dx.doi.org/10.4322/sc.2016.009 ISSN 1984-4433

PREPARO DE AMOSTRAS

Determinação de compostos organoalogenados em adubo orgânico empregando extração com auxílio de ultrassom e cromatografia gasosa com detecção por captura de elétrons Determination of organohalogenated compounds in organic fertilizer using extraction with the aid of ultrasound and gas chromatography with electron capture detection

Cristine Wickert Martha B. Adaime Renato Zanella* Laboratório de Análises de Resíduos de Pesticidas (LARP), Departamento de Química, Universidade Federal de Santa Maria, 97105-900 Santa Maria - RS, Brasil *renato.zanella@ufsm.br Recebido: 29/09/2015 Aceito: 28/10/2015

Resumo O uso de dejetos da produção de animais, tais como camas de aviário, é muito empregado na agricultura como adubo orgânico. Entretanto, estes podem conter resíduos de preservantes de madeira, tais como compostos organoalogenados, na maravalha e serragem utilizada. No presente trabalho foi desenvolvido e validado um método para a determinação de resíduos de pentaclorofenol, 2,4,6-trichlorofenol, 2,4,6-trichloroanisol, 2,4,6-tribromofenol e 2,4,6-tribromoanisol em adubo orgânico utilizando cromatografia gasosa com detecção por captura de elétrons (GC-ECD). Vários procedimentos de extração, utilizando banho e sonda de ultrassom, bem como a associação de agitação mecânica com banho de ultrassom em diferentes condições foram avaliados e otimizados. Os melhores resultados foram obtidos com agitação mecânica associada ao ultrassom, etanol/ácido acético 9:1 (v/v) como solvente de extração e florisil® para a limpeza dos extratos antes da derivação com anidrido acético. O método validado apresentou limite de detecção entre 11,3 e 22,5 µg kg-1 e boa linearidade. A exatidão, em termos de recuperação, variou entre 81,3 e 110,8%, com adequada precisão (RSD <12,4%). Os resultados das etapas de validação e aplicação permitem concluir que o método proposto é apropriado para a determinação de compostos organoalogenados em adubo orgânico em análises de rotina.

Palavras-chave: compostos organoalogenados, adubo orgânico, GC-ECD. Abstract The use of waste from livestock, such as poultry litter, is often employed in the agriculture as organic fertilizer. However, they may contain residues of wood preservatives, like organohalogenated compounds, from the shavings and sawdust used. In the present work a method for the determination of pentachlorophenol, 2,4,6-trichlorophenol, 2,4,6-trichloroanisol, 2,4,6-tribromophenol and 2,4,6-tribromoanisol residues in organic fertilizer using gas chromatography with electron capture detection (GC-ECD) was developed and validated. Several extraction procedures, using ultrasonic bath and probe, as well the association of mechanical agitation with ultrasonic bath in different conditions were evaluated and optimized. Better results were obtained using mechanical agitation associated to the ultrasonic bath, ethanol/acetic acid 9:1 (v/v) as solvent for extraction and florisil® for the extract clean-up before derivatization with anhydride acetic. The validated method presented detection limit from 11.3 to 22.5 µg kg-1 and good linearity. Accuracy, in terms of recovery, ranged from 81.3 to 110.8%, with adequate precision (RSD <12.4%). Results from the validation and application steps allow to conclude that the proposed method is appropriate for the determination of organohalogenated compounds in organic fertilizer in routine analyses.

Keywords: organohalogenated compounds, organic fertilizer, GC-ECD.

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1. Introdução

A preocupação mundial a respeito da qualidade de vida, especialmente no que se refere à preservação e uso adequado dos recursos naturais e à qualidade dos alimentos, reflete nos sistemas produtivos. Dentro dessa nova tendência, a agroecologia desponta como uma alternativa viável. O manejo ecológico do solo, através do uso de dejetos de animais e do plantio direto, visa o equilíbrio e o fortalecimento dos sistemas produtivos.

A cama de aviários é bastante empregada com esse propósito, contudo, a maravalha pode conter resíduos de preservantes de madeira, em especial compostos organoalogenados.

Fertilizante orgânico é o resultado de um processo de fermentação, sendo classificado como adubo orgânico vegetal ou animal. De acordo com o Ministério da Agricultura, os fertilizantes orgânicos simples podem ser divididos em cinco classes de materiais: estercos animais, restos vegetais, resíduos agroindustriais, turfa e linhito[1]. O aumento do número de animais criados em sistemas intensivos contribuiu para aumentar a quantidade de esterco gerado, criando a necessidade de disposição final controlada desses resíduos. A avicultura brasileira destaca-se no mercado internacional de carnes, ocupando desde 2011 a liderança na exportação de carne de frango e a terceira posição em produção mundial desse produto. Segundo dados da União Brasileira de Avicultura (UBABEF), em 2013 o Brasil produzindo um total de 12,3 milhões de toneladas de carne de frango, ficando atrás apenas dos EUA, que produz 16,9 milhões de toneladas e a China com produção de 13,5 milhões de toneladas[2].

Para frango de corte, a produção anual de esterco por animal pode ser estimada em 2,5 kg, em base seca[3].

As camas ou forrações usadas para os animais facilitam a limpeza do local e podem ser de diferentes materiais com propriedades absorventes como capins, ramos de leguminosas, serragem de madeira, maravalha, palhas e cascas de cereais. A utilização de serragem de madeira, maravalha e o reaproveitamento de madeira usada pode 276

Determinação de compostos organoalogenados em adubo orgânico

resultar na exposição a compostos organoalogenados que foram utilizados em larga escala como preservantes de madeira.

Dentre as substâncias já empregadas como preservante de madeira destaca-se o pentaclorofenol que foi introduzido em 1936 e foi muito utilizado para esta finalidade e, inclusive como herbicida e fungicida[4].

A preocupação com a toxicidade desses compostos fez surgir uma avalanche de novos preservantes de menor toxicidade. Esses novos produtos, no entanto, têm se mostrado menos eficientes, mais caros e de efeito residual mais curto[5]. Os preservantes de madeira a base de solventes orgânicos foram introduzidos entre 1920 e 1930 e são produzidos a partir de inseticidas e/ou fungicidas dissolvidos em um solvente orgânico apolar.

Em geral, quando se fala sobre preservantes a base de solventes orgânicos, refere-se àqueles preparados a base de solventes leves ou àqueles formulados com óleo pesado, como é o caso do pentaclorofenol (PCP). Por muitos anos, pentaclorofenolato de sódio (NaPCP) foi preferencialmente usado para este propósito, mas como é muito solúvel em água seu uso foi proibido na maioria dos países[6].

Segundo Sgai[5], a única forma economicamente viável pela qual a madeira pode ser protegida contra agentes responsáveis pelo fenômeno natural de degradação é através da aplicação de preservantes.

Os prejuízos advindos do uso irracional de compostos organoalogenados são evidentes. Através do Conselho de Rotterdam, em 1998, a maioria dos países adotaram voluntariamente um procedimento de controle da comercialização de vários produtos químicos listados pela FAO, entre eles o pentaclorofenol[7]. Entretanto, a produção e a utilização desses produtos dentro de cada um dos países membros continuam sendo regulamentadas por leis federais. No Brasil, o uso de pentaclorofenol foi inicialmente restrito ao tratamento de madeiras destinadas a dormentes, postes, cruzetas, mourões para cercas rurais, esteios e vigas (Lei no 4797 de 20/10/1965; Portaria Interministerial no 292 de 28/04/1998; Portarias Scientia Chromatographica 2015; 7(4):275-285

Determinação de compostos organoalogenados em adubo orgânico

no 11 de 08/01/1998 e no 329 de 02/09/1985, do Ministério da Saúde e Resolução RE no 165 de 29/08/03). O uso do pentaclorofenol na agricultura foi proibido em 1985 e o uso como preservante de madeira foi proibido em 2007. A partir da proibição do uso do pentaclorofenol, a indústria madeireira passou a utilizar principalmente o 2,4,6-tribromofenol[8].

Os halofenóis podem ser convertidos em seus respectivos anisóis por ação microbiana, conferindo odores e sabores desagradáveis a alimentos e água, mesmo quando em concentrações muito baixas[9,10].

Em termos ambientais, os compostos organoalogenados selecionados neste estudo (Figura 1) mesmo em baixa concentração, são motivos de preocupação por apresentarem elevada toxicidade, mesmo em baixos níveis de concentração.

Pentaclorofenol, como produto comercial, apresenta pureza entre 90-95% e é contaminada com tri- (6,2%) e tetraclorofenóis (4,4%), policloradodibenzoparadioxinas, policlorado-dibenzofuranos e

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ésteres difenílicos[11]. Na tentativa de reduzir as impurezas tóxicas presentes no PCP, diferentes formulações de clorofenóis foram empregadas em vários países. A DL50 de PCP em ratos está entre 27 e 175 mg kg-1, e em macacos entre 36 e 177 mg kg-1. A CL50 de NaPCP em trutas é estimada em 0,17 mg L-1 [12].

Em 1993, a Organização Mundial da Saúde estabeleceu um limite de 9 µg L-1 para PCP em água potável[13]. Para 2,4,6-TCP o limite estabelecido é de 2 µg L-1 [14]. No Brasil, a Portaria no 2914 do Ministério da Saúde, de 12/12/2011, estabelece os limites para PCP e 2,4,6-TCP em 9 e 0,2 µg L-1, respectivamente[15].

As legislações nacionais e internacionais não fazem menção quanto à contaminação de fertilizantes orgânicos por compostos organoalogenados. No Brasil, onde PCP e TBP no foi largamente utilizado no tratamento de madeira não há norma que regulamente os limites máximos de resíduos na madeira tratada ou nos produtos que utilizam esta madeira. A Alemanha estabeleceu o LMR de PCP em madeira tratada em 5 mg kg-1 [16].

Figura 1. Estruturas químicas dos compostos organoalogenados estudados.

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Wickert C, Adaime MB, Zanella R

Determinação de compostos organoalogenados em adubo orgânico

A importância ambiental destes compostos tem movido esforços, em âmbito internacional, para o desenvolvimento de métodos analíticos adequadas para diferentes matrizes e a técnica de cromatografia gasosa tem prevalecido[10]. Não há relatos na literatura a respeito da determinação de organoalogenados em fertilizantes orgânicos, entretanto alguns destes compostos foram determinados em outras matrizes, tais como pentaclorofenol (PCP) em água[17], postes de madeira[18] e em madeira[19,20], PCP e tribromofenol (TBP) em serragem[8] e em produtos hortícolas[21]; bem como PCP, TBP e pentacloroanisol em aspargos[22]. Em geral estes métodos analíticos empregam cromatografia gasosa após um extensivo preparo de amostra.

(2,4,6-TCA), 2,4,6-triclorofenol (2,4,6-TCP) e pentaclorofenol (PCP) em fertilizante orgânico empregando cromatografia gasosa com detecção por captura de elétrons (GC-ECD). Este trabalho foi desenvolvido segundo as seguintes etapas: seleção de compostos orgânicos empregados como preservantes de madeira e alguns de seus metabólitos suspeitos de ocorrer em fertilizantes orgânicos; estudo da eficiência de extração e limpeza do extrato; otimização das condições cromatográficas; validação do método e aplicação em amostras comerciais.

Os procedimentos analíticos aplicados para a determinação de compostos organoalogenados em amostras ambientais são geralmente baseados na extração off-line dos analitos a partir da amostra por um procedimento adequado, seguido de limpeza de extrato e derivação do extrato e, finalmente, a análise.

Os métodos oficiais do EPA 604, 525 e 8270 são usados para a determinação de clorofenóis em geral. A técnica mais sensível envolve a formação de derivados éteres pentafluorbenzeno com valores de limites de detecção (LOD) de 0,5 a 5 µg L-1. Clorofenóis também podem ser determinados por GC-ECD, com LOD entre 1 e 10 µg L-1 para monoclorofenóis, 0,5 µg L-1 para diclorofenóis e 0,01 µg L-1 para triclorofenóis[14]. GC-ECD é a técnica mais utilizada para a determinação de PCP, metilado ou acetilado, após extração com solvente orgânico em meio levemente acidificado. A técnica GC-ECD possibilita a detecção de quantidades extremamente baixas de compostos organoalogenados e outros analitos eletrofílicos[23].

Os compostos 2,4,6-tribromoanisol (2,4,6-TBA), 2,4,6-tribromofenol (2,4,6-TBP), 2,4,6-tricloroanisol (2,4,6-TCA), 2,4,6-triclorofenol (2,4,6-TCP), penta­ clorofenol (PCP) e o padrão interno (PI) clorpirifós metílico, todos com purezas >98%, foram adquiridos da Sigma-Aldrich (EUA).

Considerando a importância de monitorar a presença de compostos organoalogenados em produtos contendo madeira tratada, os objetivos deste trabalho foram desenvolver e validar um método analítico para a determinação de 2,4,6-tribromoanisol (2,4,6-TBA), 2,4,6-tribromofenol (2,4,6-TBP), 2,4,6-tricloroanisol

2.2. Instrumentação

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2. Experimental 2.1. Reagentes e padrões

Os seguintes reagentes e materiais foram utilizados: sulfato de sódio anidro, grau pesticida (Merck, Alemanha), florisil® 60-100 mesh (Mallinckrodt, EUA), lã de vidro silanizada; água purificada em sistema Milli-Q®; metanol, tolueno, acetona, éter de petróleo, acetato de etila e hexano Nanograde® (Mallinckrodt, EUA); ácido sulfúrico grau analítico, carbonato de potássio, etanol 96%, ácido acético glacial 100%, anidrido acético 97%, todos grau analítico (Merck, Brasil) e diclorodimetilsilano (Sigma-Aldrich, Alemanha). Os gases foram adquiridos da White Martins (Brasil) com 99,999% de pureza: gás de arraste hélio e gás de makeup nitrogênio.

Para as análises foi empregado um cromatógrafo a gás Varian 3800 (Califórnia, EUA), equipado com amostrador automático, injector PTV 1079, controle eletrônico de fluxo, detector de captura de elétrons (ECD) com 63Ni e software Workstation Star 4.5 para Scientia Chromatographica 2015; 7(4):275-285

Determinação de compostos organoalogenados em adubo orgânico

aquisição de dados. Foi utilizada coluna capilar DB-5 (30 m x 0,25 mm d.i. x 0,25 µm de espessura de filme) da J & W Scientific (Folson, CA, EUA) com 5% fenil e 95% metilpolisiloxano. As condições do sistema GCECD foram as seguintes: temperatura do injetor, 250 °C; volume de injeção 2 µL, sem divisão de fluxo; detector ECD, 330 °C; programa de temperatura da coluna: 80 °C (1 min), 4 °C min-1 até 200 °C e 40 °C min-1até 300 °C, mantido até o final da análise.

Cada composto foi identificado injetando-se individualmente a solução analítica de cada analito.

Posteriormente, injetou-se uma solução analítica contendo todos os analitos estudados. Todas as injeções foram realizadas nas mesmas condições cromatográficas para observar e confirmar o tempo de retenção de cada composto.

Para o preparo de amostra foi utilizado agitador pendular (Tecnal, Brasil); banho de ultrassom modelo 2210 (Branson, Canadá); sonda de ultrassom modelo 500 com ponteira MicroPoint cônica para pequenos volumes (Fischer Scientific, EUA), moinho analítico modelo A11 (IKA, Alemanha); sistema de purificação de água Milli-Q® (Millipore, EUA) e balança analítica UX­ 420H (Shimadzu, Japão) e APX-200 (Denver, Brasil).

2.3. Preparo da amostra

Amostras de adubo orgânico (1 kg) foram adquiridas em estabelecimentos comerciais. As amostras foram trituradas para tornar o material mais uniforme e passadas em peneira de 1,0 mm e 300 g de amostra foram armazenadas em frasco de vidro âmbar em freezer a -18 °C. Para as análises o material foi descongelado e moído.

2.3.1. Testes para a extração dos analitos e limpeza dos extratos

Uma amostra “branco” foi usada para avaliar a eficiência dos diferentes procedimentos de extração propostos. O material de vidro foi silanizado para evitar perdas por adsorção. Ensaios de extração preliminares foram realizados com a mistura de etanol:ácido acético

Wickert C, Adaime MB, Zanella R

9:1 (v/v) em banho de ultrassom e em sonda de ultrassom por 1 h. Diferentes quantidades de amostra (2,5, 5,0 e 10,0 g) e volumes de solução de extração foram testadas (10, 15 e 20 mL). A fortificação das amostras foi efetuada no nível intermediário. Finalmente, os testes comparativos foram efetuados utilizando diferentes misturas de solventes de extração: etanol/ácido acético 9:1 (v/v); tolueno/solução aquosa de ácido sulfúrico 1 mol L-1 60:1 (v/v) e acetona/metanol 1:1 (v/v). Uma etapa de 30 min de agitação mecânica foi adicionada antes da extração empregando banho de ultrassom para aumentar a eficiência de extração.

A etapa de limpeza do extrato foi incluída em função da complexidade da matriz. Para esta etapa minicolunas de vidro de borosilicato com 1,0 cm de diâmetro interno e 12 cm de comprimento foram utilizadas, contendo florisil® na camada inferior e sulfato de sódio anidro na camada superior. Diferentes quantidades de florisil® (0,9, 1,3 e 1,7 g) foram avaliadas para cada minicoluna, com quantidade fixa de sulfato de sódio anidro (3,5 g) e volume de extrato de 5 mL. A necessidade de condicionamento do florisil® com o eluente também foi avaliada. A mistura de éter de petróleo/acetato de etila como eluente foi testada em três diferentes proporções: 2:8, 4:6 e 6:4 (v/v).

Também foi avaliada a influência do volume de eluente (10, 20 e 30 mL) empregados para remover os analitos da coluna. O volume final, após limpeza, foi aferido em balão volumétrico.

2.3.2. Etapa de derivação dos analitos

A derivação foi efetuada em condições alcalinas com 35 mL de uma solução aquosa de carbonato de potássio 0,1 mol L-1. A eficiência desta etapa foi testada com 2 e 4 mL de extrato. Uma alíquota de 1 mL de anidrido acético foi usada para a reação de derivação e 5 mL de hexano para a partição dos compostos derivados.

Os frascos com a mistura de reagentes foram agitados mecanicamente na mesa agitadora pendular por 4 min com a tampa semiaberta para permitir a libertação dos gases formados na reação de derivação. O volume final foi aferido em balão volumétrico de 5 mL.

Scientia Chromatographica 2015; 7(4):275-285 279

Wickert C, Adaime MB, Zanella R

Amostras de fertilizante selecionados como amostra “branco”, sem a presença dos compostos organoalogenados, e brancos dos solventes e reagentes foram analisados após empregar as etapas do método otimizado (extração, limpeza e derivação) para confirmação da ausência dos analitos.

2.4. Validação do método desenvolvido

Definidas as melhores condições de separação dos compostos estudados, validou-se o método proposto. Os compostos foram quantificados utilizando-se o método de padronização externa após derivação e verificou-se a linearidade do método.

Para a determinação dos limites de detecção (LOD) e de quantificação (LOQ) do instrumento foram efetuadas injeções em ordem crescente de concentração até que o pico atingisse uma altura referente a três e dez vezes o ruído da linha de base, respectivamente. A faixa de concentração usada para definição do LOD e do LOQ foi de 0,1 a 2,0 µg L-1.

A exatidão do método foi avaliada através da recuperação obtida empregando-se amostras branco fortificadas em três níveis de concentração: próximo ao LOQ, dez vezes o LOQ e em concentração intermediária

Determinação de compostos organoalogenados em adubo orgânico

da faixa linear de trabalho. A precisão do método foi avaliada em termos de desvio padrão relativo (RSD) dos resultados. A repetitividade do método (RSDrm) foi avaliada através das extrações realizadas em triplicata num mesmo dia. Para o estudo da precisão intermediária do método (RSDpim) repetiu-se o mesmo procedimento de análise em dias diferentes.

2.5. Aplicação do método desenvolvido

Para avaliar a aplicabilidade do método desenvolvido foram analisadas 8 amostras de adubo orgânico produzidas a partir de cama de aviário que utilizaram maravalha de madeira. As amostras foram adquiridas em estabelecimentos comerciais.

3. Resultados e Discussão 3.1. Otimização das condições do sistema GC-ECD

Soluções analíticas contendo a mistura de todos os analitos foram injetadas nas mesmas condições. A coluna DB-5 proporcionou a separação dos compostos, não ocorrendo a sobreposição dos picos na programação de temperatura utilizada, como demonstrado na Figura 2, sendo empregada para a separação dos compostos em estudo.

Figura 2. Cromatograma obtido por GC-ECD da solução analítica 4 µg L-1 dos 5 organoalogenados em estudo e o padrão interno clorpirifós metílico.

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Scientia Chromatographica 2015; 7(4):275-285

Determinação de compostos organoalogenados em adubo orgânico

A influência do diâmetro interno (0,5 e 2 mm) do insersor de vidro silanizado foi avaliada. Picos mais simétricos foram obtidos com o insersor de 2 mm de diâmetro interno. Conforme o fabricante, este insersor é mais indicado para compostos termolábeis menos polares, como é o caso dos compostos fenólicos após sofrerem metilação (anisóis).

As melhores condições cromatográficas para a separação dos 5 compostos organoalogenados e do PI no GC-ECD foram as seguintes: Temperatura do injetor: 250 oC; programação de temperatura do forno da coluna DB-5: 80 oC (1 min), rampa de 4 oC min-1 até 200 oC, após rampa de 40 oC min-1 até 300 oC; temperatura do detector ECD: 330 oC; volume de injeção de 2 µL (sem divisão de fluxo); pressão do gás de arraste (He) na entrada da coluna mantida constante em 24,0 psi.

3.2. Procedimento de preparo de amostra De maneira geral, o procedimento de análise de compostos organoalogenados em matrizes sólidas, como fertilizantes orgânicos, envolve uma série de etapas.

Testes preliminares foram executados, empregando volumes variáveis de etanol/ácido acético 9:1 (v/v) como solvente extrator. Banho de ultrassom foi usado para extração dos analitos em diferentes níveis de concentração e diferentes quantidades de amostra. As recuperações obtidas empregando-se estas condições não foram satisfatórias. Considerando-se que a sonicação tem recebido destaque na extração de compostos organoalogenados em matrizes ambientais[16], avaliouse comparativamente banho de ultrassom e sonda de ultrassom, empregando-se etanol/ácido acético 9:1 (v/v) como solvente extrator. O percentual de recuperação dos compostos foi similar em ambas as técnicas, ficando muito próximo de 70%. O banho de ultrassom foi escolhido para os demais testes considerando-se que o mesmo permite o preparo de várias amostras simultaneamente e tem um custo de aquisição menor que a sondas, além de ter um risco menor de contaminação cruzada pela introdução da sonda nas amostras.

Wickert C, Adaime MB, Zanella R

Das misturas de solventes etanol/ácido acético 9:1 (v/v), tolueno/solução aquosa de ácido sulfúrico 1 mol L-1 60:1 (v/v) e acetona/metanol 1:1 (v/v) testados, etanol/ácido acético 9:1 (v/v) e acetona/metanol 1:1 (v/v) apresentaram valores de recuperações adequados e semelhantes. Optou-se por trabalhar com a primeira mistura em virtude da menor toxicidade. Melhores resultados de recuperação foram obtidos associandose ao banho de ultrassom uma etapa de agitação mecânica. A proporção entre a quantidade de amostra e o volume de solvente extrator está de acordo com outros procedimentos de extração descritos na literatura[9,24].

A utilização de minicolunas preenchidas com 1,3 g de florisil® e 3,5 g sulfato de sódio anidro demonstrou ser eficiente para a limpeza dos extratos. Os volumes de 5 mL de extrato e 20 mL da mistura éter de petróleo/acetato de etila 4:6 (v/v) apresentaram os melhores resultados de recuperação. Não foi necessário o condicionamento da minicoluna com o eluente. O volume final foi aferido em balão volumétrico de 25 mL. Para a etapa de derivação dos analitos, alíquotas de 2 mL de extrato limpo foram adicionados a 35 mL solução de aquosa de carbonato de potássio 0,1 mol L-1 em frasco de vidro de 100 mL silanizado, com tampa rosca. O frasco foi fechado e agitado por 30 s. Em seguida, adicionou-se 5 mL de hexano e 1 mL de anidrido acético, agitando-se o frasco em mesa agitadora pendular durante 4 min com a tampa semiaberta para liberação dos gases formados. A fase orgânica foi transferida com o auxílio de pipeta de Pauster para um balão volumétrico de 5 mL, onde o volume foi aferido com hexano. Com auxílio de micropipetador, transferiu-se uma alíquota de 1 mL para vial de 2 mL, e adicionou-se 10 µL de solução do PI clorpirifós metílico 1 mg L-1 preparado em isoctano/ tolueno 9:1 (v/v) e procedeu-se a análise injetando-se 2 µL no sistema GC-ECD. Assim, no procedimento otimizado de preparo de amostra, transferiu-se 5 g de amostra de fertilizante orgânico para frasco de vidro silanizado de 100 mL, com tampa rosca, adicionou-se 15 mL de etanol/ácido acético

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Wickert C, Adaime MB, Zanella R

Determinação de compostos organoalogenados em adubo orgânico

9:1 (v/v) e agitou-se o frasco fechado em mesa agitadora pendular por 30 min. Em seguida, aplicou-se banho de ultrassom por 60 min. Uma alíquota de 5 mL de extrato foi limpa em minicoluna com florisil® e sulfato de sódio anidro e eluíu-se com mais 20 mL de éter de petróleo/ acetato de etila 4:6 (v/v) aferindo-se o volume final em 25 mL. Procedeu-se a derivação de 2 mL do extrato e extraiu-se em 5 mL de hexano para a análise.

das curvas analíticas, o método é linear e adequado para os todos os analitos em estudo. O coeficiente de determinação r2 é maior que 0,99, considerado satisfatório para a análise de resíduos. Os valores de LOD e LOQ do instrumento são satisfatórios e, apesar do método não apresentar nenhuma etapa de concentração, os resultados de LOD e LOQ do método são adequados.

A precisão do instrumento em termos de repetitividade apresentou valores de RSD entre 0,6 e 6,4% e de precisão intermediária entre 2,6 e 6,9%.

3.3. Validação do método proposto

A Tabela 1 apresenta os valores das faixas lineares e r das curvas analíticas, LOD e LOQ do instrumento e do método obtidos para os princípios ativos em etanol/ácido acético 9:1 (v/v). De acordo com as equações obtidas 2

A Tabela 2 apresenta resultados de recuperação e precisão obtidos empregando amostras branco fortificadas em três níveis de concentração em ensaio

Tabela 1. Parâmetros do método cromatográfico.

Composto

Faixa linear (µg L-1)

r2

2,4,6-TCA 2,4,6-TCP 2,4,6-TBA 2,4,6-TBP PCP

1,5 – 15,0 2,0 – 20,0 0,8 – 8,0 1,0 – 10,0 1,0 – 10,0

0,9986 0,9995 0,9978 0,9984 0,9996

Instrumento

Método

LOD (µg L-1)

LOQ (µg L-1)

LOD (µg kg-1)

LOQ (µg kg-1)

0,6 0,6 0,3 0,3 0,3

1,5 2,0 0,8 1,0 1,0

22,5 22,5 11,3 11,3 11,3

56,3 75,0 30,0 37,5 37,5

Tabela 2. Valores de recuperação (Rec) e RSD%, em 3 níveis de fortificação, obtidos nos ensaios de repetitividade e de precisão intermediária do método.

Composto 2,4,6-TCA

2,4,6-TCP

2,4,6-TBA

2,4,6-TBP

PCP * n= 6.

282

Nível de Fortificação (µg kg-1)

Repetitividade Rec ± RSD%*

Precisão intermediária Rec ± RSD%*

56,3 281,3 562,5 75,0 375,0 750,0 30,0 150,0 300,0 37,5 187,5 375,0 37,5 187,5 375,0

102,6 ± 2,8 88,0 ± 4,8 100,4 ± 2,5 98,7 ± 1,3 84,8 ± 1,6 97,1 ± 2,1 110,8 ± 3,4 83,0 ± 1,8 97,0 ± 2,7 106,7 ± 8,7 85,2 ± 4,4 88,2 ± 5,3 96,8 ± 5,1 85,3 ± 4,3 99,5 ± 2,6

97,1 ± 7,8 96,9 ± 5,2 98,4 ± 3,7 104,1 ± 12,4 81,3 ± 5,9 96,0 ± 4,3 102,7 ± 12,0 87,3 ± 4,8 94,1 ± 3,9 97,1 ± 10,3 82,9 ± 5,6 93,2 ± 6,1 92,5 10,3 87,9 6,2 96,8 ± 5,0 Scientia Chromatographica 2015; 7(4):275-285

Determinação de compostos organoalogenados em adubo orgânico

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Figura 3. Cromatograma obtido por GC-ECD para a amostra de comerciais de fertilizante orgânico FO 6.

Tabela 3. Concentração dos compostos estudados encontrados em três amostras comerciais de fertilizante orgânico.

Amostra

2,4,6-TBA (µg kg-1)

2,4,6-TBP (µg kg-1)

PCP (µg kg-1)

FO 6 FO 7 FO 8

< LOQ 61,6 ± 2,7 < LOD

< LOD 444,4 ± 36,3 155,2 ± 4,0

128,8 ± 7,2 1295,5 ± 164,5 691,8 ± 77,3

n= 6.

de repetitividade (interdia) e de precisão intermediária (intradia) do método (RDSpim). Os resultados de exatidão (recuperação) e precisão (RSD) dos compostos são satisfatórios para todos os níveis de concentração e ensaios pois estão dentro dos valores aceitáveis, conforme descrito recomendado para métodos cromatográficos aplicados na determinação de resíduos de pesticidas[25], os quais devem estar entre 70 e 120%, com valores de RSD ≤ 20%.

3.4. Aplicação do método desenvolvido

O método desenvolvido foi aplicado em oito amostras comerciais de fertilizante orgânico. A aplicação do método desenvolvido não apresentou dificuldades, pois durante as etapas de desenvolvimento e validação empregou-se amostra real para os testes de recuperação

dos compostos. A Tabela 3 apresenta os valores de concentração, em µg kg-1, e RSD% obtidos em três amostras que apresentaram contaminação. Nas demais amostras os compostos estudados não foram detectados.

Apenas os compostos 2,4,6-TBA, 2,4,6-TBP e PCP foram quantificados nas amostras analisadas.

A Figura 3 apresenta o cromatograma obtido por GC-ECD para uma amostra de comerciais de fertilizante orgânico que apresentou resíduos de TBA, TBP e PCP.

4. Conclusão

Nenhum trabalho referente à análise de resíduos de organoalogenados em fertilizante orgânico foi encontrado na literatura. Assim, foi desenvolvido e validado um método para a determinação simultânea dos 5 compostos organoalogenados (2,4,6-tricloroanisol, 2,4,6-triclorofenol, 2,4,6-tribromoanisol, 2,4,6-tribromofenol e pentaclorofenol) em amostras de fertilizante orgânico. As etapas de extração, limpeza do extrato e derivação mostraram-se adequadas à matriz e a quantificação utilizando GC-ECD forneceu resultados com boa precisão e sensibilidade.

Os parâmetros avaliados durante a etapa de validação do método foram considerados satisfatórios. A determinação

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Determinação de compostos organoalogenados em adubo orgânico

por GC-ECD exigiu a limpeza dos extratos para reduzir as interferências provenientes da matriz, mas isso não acarretou perdas significativas dos analitos. O emprego de anidrido acético facilita a etapa de derivação dos compostos fenólicos permitindo uma melhor separação e resposta cromatográfica. A determinação com ECD é seletiva e de elevada sensibilidade, permitindo a quantificação dos analitos em baixas concentrações.

adubos pode provocar a contaminação dos mesmos.

Levando-se em consideração a grande estabilidade e resistência dos compostos organoalogenados em matrizes ambientais, pode-se concluir também que os produtos cultivados com tais fertilizantes estão sendo expostos a concentrações consideráveis de contaminantes prejudiciais à saúde.

Avaliando-se os resultados obtidos na aplicação do método para amostras comerciais de fertilizante orgânico, conclui-se que a presença da madeira tratada com compostos organoalogenados em formulações de

Agradecimentos

284

Os autores agradecem ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) o apoio financeiro e as bolsas concedidas.

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Determinação de compostos organoalogenados em adubo orgânico

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Scientia Chromatographica 2015; 7(3):286-286 Instituto Internacional de Cromatografia http://dx.doi.org/10.4322/sc.2015.000 ISSN 1984-4433

286

CLASSIFICAÇÃO

Scientia Chromatographica 2015; 7(3)

Scientia Chromatographica 2015; 7(4):287-295 Instituto Internacional de Cromatografia http://dx.doi.org/10.4322/sc.2016.010 ISSN 1984-4433

LC-MS/MS

LC-MS/MS determination of chloramphenicol in food of animal origin in Brazil Determinação de cloranfenicol em alimentos de origem animal no Brasil empregando LC-MS/MS

Letícia R. Guidi1,2 Luiza H. M. Silva2 Christian Fernandes1,3 Nicki J. Engeseth4 Maria Beatriz A. Gloria1,4* LBqA – Laboratório de Bioquímica de Alimentos, Faculdade de Farmácia, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte (MG) 31270 901, Brasil 2 Laboratório de Medidas Físicas – LAMEFI, Faculdade de Engenharia de Alimentos, Universidade Federal do Pará, Belém (PA) 66075900, Brasil 3 Laboratório de Controle de Qualidade de Produtos Farmacêuticos e Cosméticos, Faculdade de Farmácia, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte (MG) 31270 901, Brazil 4 208 Bevier Hall, Food Science and Human Nutrition, University of Illinois, Urbana-Champaign, Illinois, USA, 61801 *mbeatriz@ufmg.br, dagloria@illinois.edu 1

Recebido: 12 Jan 2016 Aceito: 09 Fev 2016

Scientia Chromatographica 2015; 7(4)

Abstract

Chloramphenicol is a highly efficient antibiotic with broad spectrum activity. It has been banned from food producing animals because of serious adverse effects to human health. Nevertheless, it is still being used in some countries because of its high efficacy and relatively low price. There is currently a minimally required performance limit (MRPL) defined at 0.3 mg/kg. This is the reason why chloramphenicol has often been analyzed by highly efficient and sensitive single residue methods. The objective of this review is to provide the state-of-art scientific knowledge on chloramphenicol, the LC-MS/MS methods used for its analysis and its occurrence in foods of animal origin in Brazil.

Keywords: antibiotic, milk, fish, honey, liquid chromatography, mass spectrometry.

Resumo

O cloranfenicol é um antibiótico de amplo espectro e elevada eficiência. Devido à ocorrência de efeitos adversos graves à saude humana, este antibiótico teve seu uso banido em animais destinados à alimentação humana. No entanto, seu uso ainda é comum em muitos países, devido à alta eficácia e baixo custo. Atualmente, existe um limite mínimo de desempenho requerido (LMDR) de 0,3 μg/kg e, por essa razão, o clorofenicol tem sido frequentemente analisado por métodos altamente eficientes e sensíveis. O objetivo desta revisão é apresentar o estado-da-arte sobre o conhecimento científico a respeito do cloranfenicol, métodos baseados em LC-MS/MS usados para sua análise e ocorrência em alimentos de origem animal no Brasil.

Palavras-chave: antibiótico, leite, peixe, mel, cromatografia líquida, espectrometria de massas.

287

Guidi LR, Silva LHM, Fernandes C, Engeseth NJ, Gloria MBA

1. Introduction

Antibiotics are widely used in intensive agriculture. They can be a therapeutic agent in the treatment of animal diseases, a prophylactic agent to avoid or prevent sickness, and also a feed additive to promote growth and increase feed efficiencies. However, their widespread use in food producing animals can be a potential hazard to human health due to the possibility of causing bacterial resistance and potential allergic reactions to the antibiotic. Special concern has been raised with regard to chloramphenicol, which, besides the inherent problems with antibiotics, it can cause fatal health problems, among them, bone marrow aplasia, aplastic anemia and gray baby syndrome. Due to the potential harmful effects to human health, the use of chloramphenicol has been prohibited for the treatment of food-producing animals in several countries[1-3].

However, the use of chloramphenicol to treat food-producing animals remains a possibility due to its high efficiency, broad spectrum of activity, prompt availability and low cost. The occurrence of chloramphenicol in foods can be the result of authorized use but lack of compliance with the withdrawal time period, unauthorized use and also unintentional or crosscontamination[3,4]. Therefore, there is a need to constantly evaluate the occurrence of this antibiotic in food.

The control of chloramphenicol in foods can be performed by screening or confirmatory procedures.

Screening methods only provide semi-quantitative analysis and can give rise to false positives, but they are used due to simplicity in sample preparation, sensitivity, speed and low cost. On the other hand, confirmatory methods, such as those employing liquid chromatography (LC) coupled to mass spectrometry (MS) are the approaches of choice for determination of antibiotics, because they allow definitive identification, quantitative determination at very high level of specificity and sensitivity[4,5]. The objective of this review is to provide updated information on the occurrence and concentrations of chloramphenicol in food in Brazil determined by LC-MS/MS. 288

LC-MS/MS determination of chloramphenicol in food

2. Characteristics and antimicrobial activity of chloramphenicol Chloramphenicol is a naturally occurring, broadspectrum antibiotic with excellent antibacterial and pharmacokinetic properties. Its formula, structure, chemical names and numbers as well as physicochemical and spectral characteristics are described in Table 1. Chloramphenicol was isolated in 1947 from Streptomyces venezuelae, a soil bacterium, but it has been synthetically produced for a long time.

Different trade names are available and there are three common forms for systemic therapy: a free base form, chloramphenicol palmitate and chloramphenicol succinate. Other formulations are also available for topical use[2,6].

Chloramphenicol has a wide spectrum of antimicrobial activity. It is effective against Grampositive and Gram-negative cocci and bacilli (including anaerobes), Rickettsia, Mycoplasma, Chlamydia, among others. It is usually bacteriostatic, but at higher concentrations it can be bactericidal. It acts by diffusing through the bacteria cell wall, binding to the bacterial 50S ribosomal subunit and inhibiting protein synthesis and cell proliferation[1]. It was widely used as a human antibiotic and also as a veterinary drug. Nowadays, its use in human medicine has been restricted to ophthalmic and some serious infections (Salmonella typhi and other forms of salmonellosis, staphylococcal brain diseases and life threatening infections of the central nervous system and respiratory tract). The veterinary use of chloramphenicol includes administration to pets, farm and aquaculture animals.

In therapy and prophylaxis, the main infectious diseases treated with chloramphenicol are enteric and pulmonary infections, skin and organ abscesses and mastitis. It is also used in infections caused by anaerobic bacteria or those that are resistant to other antimicrobial agents[1,3].

Scientia Chromatographica 2015; 7(4):287-295

LC-MS/MS determination of chloramphenicol in food

Guidi LR, Silva LHM, Fernandes C, Engeseth NJ, Gloria MBA

Table 1. Characteristics of chloramphenicol.

Parameter

Characteristics

CAS number

56-75-7

EC number

200-287-4

IUPAC name

2,2-dichloro-N-[(1R,2R)-1,3-dihydroxy-1-(4-nitrophenyl)propan-2-yl] acetamide

Names

Chloramphenicol; chlornitromycin; chloromycetin; levomycetin; chlorocid; globenicol

Molecular formula

C11H12Cl2N2O5

Structure Molar mass (g/mol)

323.12938

Melting point (°C)

150.5-151.5

pka

11.03

Log P

1.103

Physical description

White to greyish-white or yellowish-white fine crystalline powder or fine crystals, needles or elongated plates

Taste

Bitter to taste

Spectral properties:

Specific optical rotation: +18.6˚ at 20 ˚C (ethanol); -25.5˚ at 25 ˚C (ethyl acetate).

IR: u 5174; UV: 385 nm; Mass: 236

Solubility

Very soluble in methanol, ethanol, butanol, ethyl acetate, acetone, chloroform; Water solubility - 2500 mg/L (at 25 °C)

Stability

Neutral and acid solutions are stable on heating; In solution, chloramphenicol undergoes a number of degradative changes related to pH, temperature, photolysis and microbiological effects

CAS[7]; Pubchem[8].

3. Toxicological aspects and current legislation

The widespread use of antibiotics in foodproducing animals can be a potential hazard for human health. Furthermore, the indiscriminate use of chloramphenicol can lead to bacterial resistance, allergic reactions, disruption of the balance of the gastrointestinal microbial flora, and hemotoxic effects, such as aplastic anemia, bone marrow depression and gray baby syndrome. Since it undergoes biotransformation to the inactive metabolite chloramphenicol glucuronide in the liver, individuals with subnormal liver function and infants are also at risk. Aplastic anemia is an irreversible side effect that is not dose-related; this side effect is probably the result of the reduction of its p-nitro group to the highly toxic nitroso metabolite. It is a rare but often fatal condition with no treatment. Another side effect is bone-marrow depression, suppressing bone marrow and

its production of red and white blood cells and platelets.

This effect is reversible if the treatment is discontinued.

Also, infants, especially premature babies, when exposed to high levels of chloramphenicol, can develop the ‘gray baby syndrome’. This probably occurs because the liver enzymes of an infant are not fully developed, and any chloramphenicol received across the placenta or in breast milk remains intact in the body, inducing hypotension, hypothermia, flaccidity, cardiovascular collapse, cyanosis and death within hours. There are also indications that chloramphenicol is genotoxic in vivo and could cause cancer. Although the evidence is considered limited, chloramphenicol has been categorized by the International Agency for Research on Cancer (IARC) as probably carcinogenic in humans, classified as group 2A[1,9].

Scientia Chromatographica 2015; 7(4):287-295 289

Guidi LR, Silva LHM, Fernandes C, Engeseth NJ, Gloria MBA

Based upon scientific reports about chloramphenicol, an acceptable daily intake (ADI) has never been allocated and a maximum residue limit (MRL) has not been assigned[1]. Chloramphenicol was banned for use in food-producing animals in the European Union and in many other countries including Brazil as a means to eliminate it from the food production chain and related goods[10,11]. A zero tolerance provision was established and a minimum required performance limit (MRPL), which is the concentration that laboratories should be able to detect and confirm, of 0.3 µg/kg for chloramphenicol was set by the European Commission and adopted by several countries for analytical methods to be used in testing for chloramphenicol in products of animal origin[11-14].

To warrant national public health safety and to maintain competitiveness in international trade, food producers have to ensure that the products traded are in compliance with the safety and quality criteria required by consumers. Among actions undertaken by Brazil to warrant safety and quality control, the Ministry of Agriculture, Livestock and Food Supply of Brazil created a food safety program called National Residue Control Plan (NRCP). It has the purpose of generating reliable analytical results, monitoring residues and contaminants involved in food production, including antibiotics[15].

The Brazilian Agency of Sanitary Surveillance (ANVISA) from the Ministry of Health also created a National Program for the analysis of veterinary drug residues in food available for consumers[16]. Therefore, it is of great importance to have sensitive methods for the determination and confirmation of residues and contaminants in foods.

4. LC-MS/MS methods for the analysis of chloramphenicol in foods

Several methods are available for the determination of chloramphenicol in foods, both for screening or quantification purposes. Screening methods are cost-effective and have a high sample throughput[2,17].

However, the effective control of chloramphenicol in 290

LC-MS/MS determination of chloramphenicol in food

foods requires very sensitive and reliable analytical methods to comply with the stringent requirement established for a banned compound. Due to the chemical properties of chloramphenicol, quantitative methods using gas chromatography with mass spectrometry (GCMS) require transformation of chloramphenicol into a stable volatile compound, which lengthens analysis time and may not be reproducible at trace levels[4,18]. Many of the reported liquid chromatography/ultraviolet (LCUV) methods did not reach the required sensitivity and selectivity to meet the current MRPL. The power of a mass spectrometer as a chromatographic detector results from its capacity to determine, by means of the molecular weight, the precursor ion and its fragments, which provide structural information. The combination of liquid chromatography with tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) allows definite identification and quantification of trace chloramphenicol in complex food matrices due to the specificity and sensitivity associated with this technique[4,5,19,20]. In this context, only methods and results for chloramphenicol based on LC-MS/MS will be described.

According to Table 2, several studies were undertaken on the analysis of chloramphenicol in foods

by LC-MS/MS. In most of them, analysis was carried out in the multiple reaction monitoring (MRM) mode via electrospray ionization operated in the negative mode.

Deuterated chloramphenicol (d5-chloramphenicol) was used as the internal standard. The transitions used for chloramphenicol quantification and confirmation varied among studies. However, the [M-H]- ion and at least two product ions are monitored. For example, Guidi et al.[21] used m/z 320.9→152.1 and m/z 320.9→256.9 for chloramphenicol in fish analysis.

The monitored ion for the internal standard was m/z 326.015→157.0. Matrix-matched calibration curves were used. In most of the studies, the method was validated according to the criteria established by the EC Commission Decision 657/2002[22].

Scientia Chromatographica 2015; 7(4):287-295

LC-MS/MS determination of chloramphenicol in food

Guidi LR, Silva LHM, Fernandes C, Engeseth NJ, Gloria MBA

Table 2. Methods for the extraction and separation of chloramphenicol in food of animal origin in Brazil by LC-MS/MS.

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Extraction technique

LC column & mobile phase

Recovery (%)

Limit of detection

LLE - acetonitrile:water & SPE - Captiva cartridge

C18 (3x100 mm, 3.5 µm) & 0.1% formic acid:acetonitrile with 0.1% formic acid

93.2

1 µg/kg

LLE - ethyl acetate

C18 (2.1x50 mm, 5 µm) & 2 mM ammonium acetate:methanol

>97

0.04 µg/kg

LLE - 10 mM formic acid & ethyl acetate

C18 (2x100 mm, 5 µm) & 0.1% formic acid:acetonitrile with 0.1% formic acid

95-97

0.09 µg/L

LLE - ethyl acetate LLE (acetonitrile, chloroform)

C18 (4.6x150 mm, 5 µm & 2.1x100 mm, 3.5 µm) & acetonitrile:water

85.5-115.6 89-97 87-100

0.02 µg/kg 0.06 µg/kg 0.06 µg/kg

83 83

0.00052 µg/kg 0.00052 µg/L

82.7

0.019 µg/kg

101-104 103-109 100-106 102-104 87-97 105-111

0.03 µg/kg

LLE - ethyl acetate C18 (2.1x50 mm, 3 µm) & 5 mM ammonium acetate:(methanol:water, 95:5) with LLE (acetonitrile, chloroform) 5 mM ammonium acetate & SPE LLE - 10 mM formic acid & ethyl acetate LLE - ethyl acetate

Fish Honey Rocha Siqueira et al.[30] Fish Phosphate extraction solution + LLE ethyl acetate Shrimp Bovine meat Pork meat Poultry meat Egg LLE – liquid-liquid extraction, SPE – solid-phase extraction.

LC separation of chloramphenicol was obtained by reverse phase C18 columns from different brands (Table 2). Columns dimensions varied from 50 to 150 mm length, 2 to 3 mm internal diameter and 2 to 5 µm particle size. Different mobile phases were used in gradient elution, among them methanol:water, acetonitrile:water, acetonitrile:water acidified with formic acid, and ammonium acetate:methanol. In every method, except for one, the limits of detection and quantification were below 0.3 µg/kg, which is the

C18 (2x50 mm, 5 µm) & 0.1% formic acid:acetonitrile with 0.1% formic acid

C18 (2.1x100 mm, 4 µm) & water:methanol

MRPL established for chloramphenicol. Moreover, high sensitivity was obtained, in the ng/kg or ng/L range.

Therefore, the majority of the methods were appropriate for the purpose.

Prior to LC-MS/MS analysis, sample preparation is needed to properly extract chloramphenicol from the food matrix. Concentration of the analyte and removal of interfering compounds may also be needed[31]. According to Table 2, sample preparation for chloramphenicol analysis involved mostly liquid-liquid extraction (LLE),

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Guidi LR, Silva LHM, Fernandes C, Engeseth NJ, Gloria MBA

even though solid-phase extraction (SPE) was also used in a few studies. Representative and homogeneous samples were extracted for chloramphenicol by LLE. In most of the methods, a simple extraction procedure using ethyl acetate provided good recoveries of chloramphenicol from honey, milk and fish samples.

The sample was spiked with the internal standard, vortexed for a few seconds and allowed to equilibrate.

The extracting solvent was added and sample was mixed (several minutes), centrifuged, the supernatant was transferred and the sediment was extracted once more. The supernatants were mixed and evaporated to dryness under nitrogen flow and they were dissolved in the mobile phase, vortexed for a few seconds, allowed to equilibrate and injected into the LC. In the extraction of chloramphenicol from honey, dissolution of the sample in water (1:1, w/v) was needed prior to a simple LLE procedure with ethyl acetate[24,26,27,29]. During extraction of chloramphenicol from milk, Nicolich et al.[25] and Guidi et al.[28] added water acidified with 10 mM formic acid prior to LLE with ethyl acetate. However, Martins Junior et al.[27] proposed two sequential LLE procedures, the first with acetonitrile and the second using chloroform. The supernatant was dried under nitrogen flow, dissolved into methanol, water and Na2HPO4 and submitted to SPE using a SupelcleanTM ENVITM Chrom P (Supelco, Bellefonte, PA, USA). By using this more sophisticated procedure, a detection limit in the ng/kg range was obtained.

Different procedures were used for the extraction of chloramphenicol from fish. Guidi et al.[21] used a simple LLE procedure with ethyl acetate and obtained good recoveries. Barreto et al.[26] used two LLE procedures, the first with acetonitrile and the second with chloroform, achieving similar results for fish and shrimp samples, improving recoveries. Monteiro et al.[23] used a more sophisticated procedure involving LLE with acetonitrile:water, followed by ultrafiltration (SPE) using a Captiva cartridge to remove protein and particulate matter; however, these researchers focused 292

LC-MS/MS determination of chloramphenicol in food

on multiresidue analysis of 12 drugs of different antimicrobial classes. Such a detailed procedure would not be necessary for a single antibiotic analysis.

Rocha Siqueira et al.[30] proposed a method based on the extraction of chloramphenicol using a phosphate extraction solution (containing NaCl, KCl, Na2HPO4 and KH2PO4) and ultrasound bath for 15 minutes prior to LLE with ethyl acetate. They validated this method for fish, shrimp and also for meat (bovine, pork and poultry) and egg.

Several sophisticated and complex sample preparation techniques have been used in the analysis of chloramphenicol, by using different sorbents (Oasis, molecularly imprinted polymers and multi-walled carbon nanotubes) or techniques, like QuEChERS[18,32-35].

However, efficient extraction of chloramphenicol from food matrices for LC-MS/MS analysis can be undertaken by a simple LLE procedure. The use of additional steps may not be necessary. Furthermore, they can be time-consuming, require larger quantities of chemical reagents, involve extensive manual procedures, and use cleanup columns (SPE) that increases the analysis time and cost.

5. Occurrence of chloramphenicol in food

Even though the use of chloramphenicol in food producing animals was banned several years ago, it was detected in some foods of animal origin, as indicated in Table 3. Four studies focused on honey (total of 43Â samples) indicated that samples from different regions of Brazil, from different beekeepers, floral sources and colors did not contain chloramphenicol[9,25,27,29]. Eighty six samples of fish were analyzed in four different studies, and tilapia was the main type of fish analyzed.

Chloramphenicol was only detected in one sample at levels below the MRPL[9,22,24,30]. No chloramphenicol was found in shrimp (14 samples)[30]. Samples of meat (556Â from bovine, pork and poultry) and eggs (60) were also analyzed and none of them contained chloramphenicol[30].

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LC-MS/MS determination of chloramphenicol in food

Guidi LR, Silva LHM, Fernandes C, Engeseth NJ, Gloria MBA

Table 3. Occurrence of chloramphenicol in food of animal origin by LC-MS/MS in Brazil.

Food Honey Different beekeepers and floral Brands from SP market Different regions, floral & colors Samples from MG market Milk Milk (brands from market) Dried milk (brands from market) Suspect (Elisa) milk Farm samples (raw) Fish Nile tilapia (4 farms) Aquaculture fish (Pintado, tilapia, matricha, saint peter, tambaqui, tambacu) Sarotherodon niloticus (farms) Fish Other foods Bovine meat Pork meat Poultry meat Shrimp Egg nd – not detected.

Samples analyzed (% Positive)

Concentration in positive samples

Reference

5 (0%) 4 (0%) 22 (0%) 12 (0%)

nd nd nd nd

Barreto et al.[26] Martins Junior et al.[27] Taka et al.[24] Tette et al.[29]

4 (25%) 3 (66.6%) 41 (0%) 49 (41%)

4.73 ng/L 5.9 – 6.10 ng/L nd 0.10 – 13.9 μg/kg

36 (0%)

nd

Monteiro et al.[23]

13 (7.7%)

0.063 µg/kg

Guidi et al.[21]

21 (0%) 16 (0%)

nd nd

Barreto et al.[26] Rocha Siqueira et al.[30]

149 (0%) 199 (0%) 208 (0%) 14 (0%) 60 (0%)

nd nd nd nd nd

Rocha Siqueira et al.[30]

Milk was the food product with the highest occurrence of chloramphenicol. Among studies undertaken, only the one by Nicolich et al.[25] failed to detect chloramphenicol in the 41 milk samples which were positive by ELISA. However, the samples had been stored for a long period of time prior to analysis, which could have affected the results.

Martins Junior et al.[27] observed 42% occurrence of chloramphenicol in pasteurized and dried milk (total of 7 samples) at levels varying from 0.0047 to 0.0061 µg/kg.

Guidi et al.[28] found similar prevalence (41%), at levels ranging from 0.10 to 13.9 µg/kg in samples obtained from dairy farms. Indeed, it is more likely to find antibiotics in farm samples prior to their dilution by the mixture with milk from other farms.

Martins Junior et al.[27] Nicolich et al.[25] Guidi et al.[28]

The NRCP has also been generating results for chloramphenicol and other residues in different foods of animal origin. Among the many different samples analyzed every year, only a few positive samples for chloramphenicol have been found, among them poultry meat (1 out of 76 samples from 2014, containing 0.39 µg/kg) and fish (1 out of 77 samples, containing 75.6 µg/kg)[36]. NRCP results for milk were negative for chloramphenicol in 120 samples of milk analyzed in 2009 and 2010. Results from PamVet[16] on chloramphenicol in milk also indicated no detectable levels in dried milk (139 samples) and 0.6% occurrence in UHT milk (464 samples) at levels ranging from 0.3 and 0.8 µg/kg.

Even though the number of samples analyzed was very limited, the outcome is good considering the low percentage of foods of animal origin containing

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Guidi LR, Silva LHM, Fernandes C, Engeseth NJ, Gloria MBA

detectable levels of chloramphenicol. However, the illegal utilization of chloramphenicol to treat foodproducing animals remains a possibility, either by administration of prohibited antibiotics, or failure to respect the proper withdrawal periods. The problem is more visible with milk due to its role in infant and overall human nutrition and its widespread consumption.

Furthermore, chloramphenicol in milk can be transfered to dairy products, specially those rich in fat[17,35,37].

Therefore, it is important to ensure milk quality. Brazil has a quality control program aimed at milk from individual dairy farms. Antibiotic analysis of these milk samples should be performed to be able to detect the source of contamination and to implement educational programs to warrant milk quality.

It is also important to consider that there could be other sources of food contamination with chloramphenicol. Its use as a human medicinal antimicrobial can result in its release into the environment through waste streams by which food products may be contaminated during production. For instance, chloramphenicol has been detected in the aquatic environment such as effluents of sewage treatment plant and in surface water. Another source of this as well as other antimicrobials could be the natural occurrence in soil by bacteria (e.g., Actinomycetes), which can result in a large biomass per hectare in topsoil and subsequent uptake by crops and transfer of plants to feed[3,35,38,39].

LC-MS/MS determination of chloramphenicol in food

6. Conclusion

Several methods have been developed for the analysis of chloramphenicol in food by LC-MS/ MS. Extraction of chloramphenicol from food can be undertaken by simple LLE procedures without requiring any sophisticated clean-up technique. The methods were validated according to the criteria of Commission Decision 2002/657/EC and were found appropriate for the analysis of chloramphenicol with limits of detection way below the MRPL of 0.3 mg/kg.

However, a very limited number of samples have been analyzed using this method, which became common in the last 10 years. Most of the studies performed focused on honey, milk and fish followed by shrimp, meats and egg. Chloramphenicol was detected in raw milk samples at levels above the MRPL and in trace amounts in fish.

Even though chloramphenicol has been banned for use in food-producing animals for many years, it is still being detected. Therefore, monitoring and educational programs are needed to warrant safety of consumers and international trade.

Acknowledgement

The authors acknowledge CAPES, CNPq Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (Grants 484697/2012-9 and 480110/2013‑1) and FAPEMIG - Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais (Grant APQ – 01782-13 and 02997-14) for financial support.

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Scientia Chromatographica 2015; 7(3):296-296 Instituto Internacional de Cromatografia http://dx.doi.org/10.4322/sc.2015.000 ISSN 1984-4433

296

CLASSIFICAÇÃO

Scientia Chromatographica 2015; 7(3)

Scientia Chromatographica 2015; 7(4):297-315 Instituto Internacional de Cromatografia http://dx.doi.org/10.4322/sc.2016.011 ISSN 1984-4433

PREPARO DE AMOSTRAS

Recentes avanços da microextração em fase sólida no tubo (in-tube SPME) e sua aplicação em análises ambientais e alimentícias Recent advances on in-tube solid phase micro extraction (SPME) and its application to environmental and food analysis

Ana Lúcia de Toffoli Fernando Mauro Lanças* Instituto de Química de São Carlos, Universidade de São Paulo – USP CP 780, Cep 13560-970, São Carlos, SP, Brasil *flancas@iqsc.usp.br Recebido: 08 Nov 2015 Aceito: 12 Fev 2016

Resumo

O preparo de uma amostra é usualmente necessário para isolar os analitos de interesse dos interferentes presentes. A determinação desses, em concentrações muito baixas, requer procedimentos analíticos corretos que consigam concentrar os compostos alvos antes de sua quantificação. Diante disso, tendências recentes na preparação das amostras incluem algumas características como automação, miniaturização, alto rendimento, redução no consumo de solventes e tempo de operação. Com isso, técnicas capilares de microextração online vem sendo amplamente utilizadas como é o caso da in-tube solid-phase microextraction (in-tube SPME). Esta realiza extração e concentração dos analitos de interesse, tendo sido combinada com a cromatografia líquida de alta eficiência a qual, por sua vez, pode ou não ser acoplada a espectrometria de massas. Este trabalho descreve os avanços da técnica in-tube SPME, a qual vem sendo aplicada com sucesso na determinação de diferentes analitos em matrizes ambientais e alimentícias, além de uma visão geral sobre o desenvolvimento de novas fases extratoras que resultam em maior especificidade e seletividade analítica.

Palavras-chave: in-tube SPME; fases extratoras; matrizes ambientais e alimentícias.

Abstract

Sample preparation is usually required to isolate analytes of interest from interferents aiming to determine those at very low concentrations. This procedure requires correct analytical methods that are able to concentrate the target compounds before their quantification. Therefore, recent trends in sample preparation includes as main goal some features such as automation, miniaturization, high performance, reduction in solvent consumption and operating time. As a result, online microextraction capillary techniques have been widely used as is the case of in-tube solid-phase microextraction (in-tube SPME) which performs extraction and concentration of the interest analytes combined with high-performance liquid chromatography that can be coupled or not to mass spectrometry. This paper describes recent advances in the in-tube SPME technique that has been successfully applied to the determination of different analytes in environmental and food matrices, as well as provides an overview of the development of new extraction phases that result in higher specificity and analytical selectivity.

Keywords: in-tube solid phase microextraction; extracting phases; environmental matrices and food.

Scientia Chromatographica 2015; 7(4)

297

Toffoli AL, Lanças FM

Microextração em fase sólida no tubo (in-tube SPME)

1. Introdução

extratora pelos componentes das amostras, variações analíticas entre os cartuchos extratores e o grande número de etapas para a realização dos ensaios.

Considerando as várias etapas envolvidas em uma metodologia analítica incluindo amostragem, preparo da amostra, separação, detecção e análise dos dados, o preparo da amostra é uma das mais importantes de todo o procedimento sendo, considerada uma etapa fundamental para o desenvolvimento de métodos confiáveis e robustos, gerando maior precisão, exatidão, seletividade e sensibilidade nas análises[1,2]. Mais de 80% do tempo de análise é usualmente gasto com o preparo da amostra, o qual inclui amostragem, preparação da amostra, detecção e processamento de dados[3]. No entanto, é de grande importância o pré-tratamento das amostras antes das análises cromatográficas, já que com isso é possível eliminar-se interferentes e aumentar a sensibilidade e seletividade analítica[4].

As técnicas convencionais de preparo da amostra mais utilizadas até o momento em análises químicas para diferentes aplicações são a extração líquido-líquido (LLE) e a extração em fase sólida (SPE)[5-8].

A LLE, embora seja uma técnica simples e ainda muito utilizada, apresenta algumas desvantagens, sendo a principal delas o emprego de grandes volumes de solventes orgânicos muitas vezes tóxicos, assim como a exposição dos analistas aos mesmos, além do grande volume de descarte desses solventes, sua implicação ambiental e de custos operacionais. Frequentemente, a formação de emulsões entre as fases (aquosa e orgânica) pode resultar na perda do soluto, em riscos de contaminações e na baixa exatidão do método.

A extração em fase sólida (SPE) surgiu na década de 1970 com o intuito de eliminar ou minimizar a maior parte desses inconvenientes da LLE. Várias fases extratoras têm sido utilizadas em SPE, viabilizando diferentes mecanismos de retenção dos solutos na fase e o aumento da especificidade dos métodos, além de tornar possível a automação das análises e o acoplamento em linha com técnicas cromatográficas. No entanto, a SPE tem apresentado algumas limitações resultantes de fatores como o bloqueio dos poros das partículas da fase 298

Neste contexto, destacam-se as modificações efetuadas na extração em fase sólida que geraram técnicas mais adequadas ambientalmente e que melhor preservaram a saúde dos analistas, as quais são conhecidas como técnicas miniaturizadas. Essas técnicas vêm ganhando destaque diante dos métodos convencionais, já que minimizam o consumo de solventes orgânicos e o volume de amostra a ser utilizado permitindo, também, a reutilização das fases extratoras, pré-concentração dos analitos e a possibilidade da automação com os sistemas cromatográficos.

Dentre essas técnicas, a microextração em fase sólida (SPME) e a extração sortiva em barras de agitação (SBSE) não utilizam solvente orgânico e apresentam poucas etapas em seu procedimento. Estas técnicas combinam a extração e concentração do soluto em única etapa e permitem a introdução do soluto extraído no sistema cromatográfico utilizando o mesmo dispositivo empregado na extração, reduzindo a perda do soluto e o tempo da análise. Além disso, o acoplamento das técnicas de extração com o cromatógrafo permitiu um grande avanço nessa área, diminuindo os erros experimentais ocasionados pelos analistas, a quantidade de etapas a serem desenvolvidas e a determinação de compostos em níveis de traços em diversas matrizes complexas como alimentos, ambiental e fluidos biológicos. Esses acoplamentos geram sistemas analíticos automatizados que resultam em análises exatas, rápidas, com alta sensibilidade e reprodutibilidade.

1.1. Microextração em fase sólida (SPME)

A microextração em fase sólida foi introduzida por Arthur e Pawlizyn[9] em 1990, e pode ser considerada uma miniaturização da SPE (Extração em Fase Sólida). É considerada uma microtécnica de extração, onde os processos de extração e pré-concentração dos analitos ocorrem em micro escala. A SPME apresenta diversas vantagens quando comparada a técnicas convencionais, Scientia Chromatographica 2015; 7(4):297-315

Microextração em fase sólida no tubo (in-tube SPME)

Toffoli AL, Lanças FM

permitindo a automação das análises, concentração dos analitos, reutilização das fibras de extração e simplificação da instrumentação analítica[10-12]. Essa técnica vem sendo utilizada para extrair diferentes analitos, com aplicações em diversos campos da pesquisa como química forense, ambiental, área farmacêutica, alimentícia, entre outras[13-16].

O dispositivo básico de SPME abrange um bastão de fibra ótica de sílica fundida com sua extremidade recoberta por um filme fino. A extração e concentração do soluto ocorrem através dos processos de sorção (absorção ou adsorção) do soluto em uma fina camada de fase extratora (7 a 100 µm de espessura), polímero ou sólido adsorvente, que reveste a superfície externa de uma fibra de sílica fundida (usualmente de 10 mm de comprimento e 110 a 160 µm de diâmetro)[10,11].

A SPME baseia-se em um processo de equilíbrio entre fases, onde o sistema de extração consiste das fases aquosas (amostra homogênea), polimérica extratora (fibra SPME) e gasosa (headspace do frasco)[12,17]. Durante a extração em um sistema trifásico considerado ideal, os solutos migram entre as três fases até que o equilíbrio de partição seja atingido. Desta forma, a massa extraída do soluto está relacionada ao equilíbrio de massas nas fases do sistema. No modo headspace a fibra é colocada no headspace da amostra para que os componentes voláteis sejam extraídos. No modo extração direta a fibra é colocada dentro da matriz líquida, ocorrendo à partição dos analitos entre o recobrimento e a matriz.

Já para as amostras que possuem analitos não voláteis e com interferentes de alto peso molecular, utiliza-se a extração protegida por membrana ou por materiais de acesso restrito[10-12,17,18], ilustrado na Figura 1[19].

Outras configurações da SPME estão disponíveis como barras de agitação, recipientes com paredes internas revestidas, revestimento no tubo, partículas suspensas e discos/membranas extratoras. A Figura 2 mostra outros tipos de configurações da SPME[20].

Esta técnica quando acoplada a sistemas analíticos fornece análises rápidas com baixo consumo de solventes

Figura 1. Processo de extração e pré-concentração dos analitos pela técnica de micro extração em fase sólida (SPME): a) headspace e b) direta [19].

tóxicos e com maior precisão analítica. No acoplamento com a cromatografia gasosa (SPME/GC) a fibra é inserida diretamente no injetor já aquecido após o processo de extração, onde os analitos serão termicamente dessorvidos para a coluna analítica. Desta maneira, não há necessidade de utilizar solventes orgânicos. Outra maneira de se utilizar a SPME é acoplando-a com a cromatografia líquida (SPME/LC); nesse caso há necessidade de uma interface apropriada na forma de um T, onde a fibra é inserida na parte superior e na parte lateral e inferior conecta-se a válvula de seis pórticos do HPLC[21,22]. Desta maneira há dois tipos de dessorção dos analitos: o modo dinâmico, com a fase móvel, e o modo estático, quando os analitos são fortemente sorvidos a fibra. Como nesse caso a dessorção não é direta, há algumas limitações tais como dificuldade no acoplamento da interface, poucas fibras adequadas e com baixa estabilidade, dessorção não eficaz dos analitos, entre outras[21,22].

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Microextração em fase sólida no tubo (in-tube SPME)

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baixa estabilidade das fases extratoras, número limitado de fases comercialmente disponíveis, alta fragilidade das fibras e baixa capacidade de sorção.

A escolha do recobrimento da fibra de SPME é de extrema importância para garantir boa seletividade ao analito diante dos interferentes da matriz, havendo diferentes tipos de fibras disponíveis comercialmente. A Tabela 1 mostra os tipos mais indicados para diferentes classes de compostos[24].

Imediatamente após a inserção da fibra na amostra inicia-se o transporte dos analitos da matriz para a fase extratora. Neste caso a extração por SPME se completa quando a concentração do analito atinge o equilíbrio de partição entre a matriz e a fase de extração significando, assim, que a quantidade de analito extraída se mantém constante mesmo que se aumente o tempo de extração. Por consequência, o analito é transferido para a fase extratora de forma quantitativa e não exaustiva.

Quando o equilíbrio é atingido encontra-se uma relação diretamente proporcional entre a quantidade de analito extraída e a concentração do analito na amostra[2,18,25].

Fases poliméricas do tipo dimetilpolisiloxano apresentam a condição de equilíbrio de acordo com a Equação 1.

Figura 2. Configurações SPME[20].

Em razão das vantagens das técnicas SPME/ GC para as análises de solutos voláteis e semivoláteis, o número de aplicações empregando as técnicas SPME/ LC tem sido bem menor[23]. No entanto, a maior parte das aplicações de SPME/LC tem sido desenvolvida nos últimos anos, indicando claramente o aumento de interesse na técnica. Estes acoplamentos da técnica SPME com GC ou LC vêm sendo amplamente utilizados na extração de várias classes de compostos em diferentes matrizes.

No geral, a SPME apresenta algumas desvantagens, independentemente do modo de acoplamento, como 300

n=

(K (K

) (1) +V )

fsV f Vs C0 fsV f

s

onde temos que n é a massa de analito extraída pelo recobrimento, Kfs é a constante de distribuição entre o recobrimento e a matriz, Vf é o volume do recobrimento, Vs é o volume da amostra e C0 é a concentração inicial do analito estudado na amostra[18,25].

Se o volume de amostra for grande, a Equação 1 pode ser simplificada, originando a Equação 2. Com isso, a quantidade de analito extraída corresponde diretamente a sua concentração na matriz, independendo do volume da amostra. n = K fsV f C0

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Tabela 1. Guia de seleção da fibra a ser utilizada em SPME[24].

Classe de analitos Gases e compostos de baixo peso molecular (M.M. 30-225) Voláteis (M.M. 60-275) Volatéis, aminas e compostos nitro-aromáticos (M.M 50-300) Semi-voláteis polares (M.M. 80-300) Compostos não polares de alto peso molecular (M.M. 125-600) Semi-voláteis não polares (M.M. 80-500) Álcoois e compostos polares (M.M. 40-275) Compostos aromáticos: voláteis e semi-voláteis, C3-C20 (M.M. 40-275) Análises de compostos traço (M.M. 40-275) Aminas e compostos polares (somente uso em HPLC)

1.2. In-tube SPME

A Microextração em Fase Sólida no tubo, denominada in-tube SPME, foi desenvolvida para a microextração e pré-concentração de solutos menos voláteis e/ou termicamente instáveis. É uma técnica de preparo de amostra eficiente que geralmente utiliza um tubo capilar de sílica fundida aberto, podendo ser empregada uma coluna de cromatografia gasosa (GC) revestida internamente com fase estacionária como um dispositivo SPME[26-28]. Essa técnica foi desenvolvida com o propósito de superar as desvantagens da SPME convencional, como baixa capacidade de sorção e elevada fragilidade, apresentando como vantagem a extração direta dos analitos de interesse da matriz aquosa e a concentração deles na fase estacionária que recobre internamente o capilar[4,12,29-32].

Esse sistema utiliza uma coluna capilar para extração em fase sólida, acoplando-a em linha com o sistema de HPLC (in-tube SPME-LC) permitindo, assim, a automação do processo de extração, uma

Fibra recomendada 75 µm/85 µm carboxen/polidimetilsiloxano 100 µm polidimetilsiloxano 65 µm polidimetilsiloxano/divinilbenzeno 85 µm poliacrilato 7 µm polidimetilsiloxano 30 µm polidimetilsiloxano 60 µm carbowax (PEG) 50/30 µm divinilbenzeno/carboxen e polidimetilsiloxano em fibra StableFlex 50/30 µm divinilbenzeno/carboxen e polidimetilsiloxano em fibra StableFlex de 2 cm 60 µm polidimetilsiloxano/divinilbenzeno

maior precisão do método analítico e menor tempo de análise[4,12,27].

A grande disponibilidade de diferentes colunas capilares de cromatografia gasosa, com variados comprimentos e tamanhos, para serem utilizadas como meio de extração, aumenta as áreas de aplicação da técnica permitindo, assim, analisar diferentes classes de compostos[24]. A Tabela 2 mostra algumas características da SPME convencional e do in-tube SPME, ambas combinadas a HPLC[31].

Capilares abertos de sílica fundida podem ser revestidos internamente com fase estacionária quimicamente ligada ou monolítica, da mesma maneira que as colunas capilares de cromatografia gasosa.

Além disso, capilares de poli-éter-éter-cetona (PEEK) empacotados com tubos de sílica fundida ou preenchidos com partículas sólidas sorventes vem sendo amplamente utilizados[4,12,28].

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Tabela 2. Comparação entre a SPME convencional e a in-tube SPME ambas combinadas à HPLC[31].

SPME convencional

In-tube SPME

Fase extratora

Diferentes fibras de SPME disponíveis comercialmente

Diferentes colunas de GC disponíveis comercialmente

Sítio de extração

Superfície externa da fibra

Superfície interna da coluna capilar

Tempo de equilíbrio

30 – 60 min (dependendo do composto)

10 – 15 min (dependendo do composto)

Dessorção

A fibra é exposta à fase móvel ou solvente apropriado na câmera de dessorção

O solvente de dessorção ou fase móvel é carreada para dentro do capilar

Carryover

~ 10% (dependendo do composto)

Desprezível

Amostras

Amostras limpas e sujas

Amostras limpas

Operação

Manual e automatizada

Manual e automatizada

Precaução

O recobrimento da fibra pode ser danificado na inserção e retirada da fibra da interface

A solução da amostra deve ser compatível com a fase móvel e não conter matéria insolúvel que possa entupir a tubulação.

O equipamento empregado na técnica in-tube SPME pode ser feito utilizando-se um injetor on-line e um dispositivo de comutação de coluna (Column Switching), exemplificados na Figura 3.

O injetor on-line consiste na utilização de uma válvula rotatória de seis pórticos e um “loop” (alça) para amostra. A amostra depois de um pré-tratamento é coletada no loop, com a válvula na posição 1. Com o loop preenchido, a posição da válvula é alterada para posição 2 e a amostra é levada até a coluna analítica pela fase móvel. Esse tipo de acoplamento necessita de

compatibilidade entre os solventes da fase móvel e da amostra[19,33].

Esse tipo de interface, ilustrado na Figura 3, apresenta uma coluna ou capilar de extração para retenção dos analitos de interesse. Quando a válvula permanece na posição de extração a amostra é percolada pela coluna extratora e, com isso, os analitos de interesse são aprisionados na fase, enquanto que os interferentes da matriz são eluídos e direcionados para o resíduo.

Colocando-se a válvula na posição de eluição, os analitos são eluídos da coluna extratora e transferidos

Figura 3. Possibilidades de interfaces para in-tube SPME: (I) Injetor online e (II) Comutação de coluna[19].

302

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para a coluna analítica[19]. Esse tipo de montagem do sistema para in-tube SPME vem sendo amplamente utilizado, existindo duas direções de fluxo para a eluição dos analitos retidos na coluna de extração: straightflush (direto) e back-flush (com inversão do fluxo). A eluição no modo straight-flush ocorre na mesma direção do fluxo de carregamento da amostra e no modo backflush na direção contrária do fluxo de carregamento da amostra, como exemplificado na Figura 4[19].

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de massas vem sendo largamente utilizados em linha com o sistema in-tube SPME-LC. Assim, a técnica se torna um processo automático que não necessita de uma interface especial para dessorção dos analitos, como é o caso nas análises de SPME convencional[19,32].

O modo de eluição back-flush é, frequentemente, o mais utilizado já que permite aos analitos que são retidos no início da coluna de extração serem rapidamente transferidos para a coluna analítica o que, consequentemente, minimiza o alargamento da banda cromatográfica já que evita a dispersão dos analitos na coluna de extração[19].

Do ponto de vista operacional, o sistema in-tube SPME-LC também apresenta dois modos online de extração. O modo flow through extraction, de extração única, onde a amostra passa continuamente em uma única direção, e o modo draw/eject extraction, com ciclos aspirar e dispensar, onde a amostra é aspirada e dispensada várias vezes, de acordo com a programação do injetor automático[19].

No tubo capilar ocorre o processo de partição do analito com a fase extratora, até que o equilíbrio de sorção seja atingido. No decorrer do processo de extração, a válvula do injetor deve estar na posição de extração. O capilar deve ser lavado e condicionado previamente ao processo de extração, com solução de metanol/água ou com a fase móvel. Logo que atingido o equilíbrio de sorção, os analitos, pré-concentrados são dessorvidos rapidamente da fase extratora do capilar por meio da percolação da fase móvel, após posicionar a válvula do injetor LC na posição injetar[19,32].

Os analitos dessorvidos são deslocados para a coluna analítica do LC para separação e decorrente quantificação. Detectores a base de radiação UV, fluorescência, arranjo de diodos e espectrometria

Figura 4. Sistema in-tube SPME-LC baseado em comutação de coluna, mostrando posição de extração (A) e eluição (B), com as configurações straight-flush (A1 e B1) e back-flush (A2 e B2)[19].

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processo de absorção, a quantidade de soluto extraído pode ser demonstrada de acordo com a Equação 3 a seguir: nA =

KAVf VSC ° A ( KAVf + Vs )

(3)

onde nA representa o número de mols do soluto extraído pela fase extratora quando estabelecido o equilíbrio de partição ou sorção entre as fases; Vf e Vs, os volumes da fase extratora do capilar e da solução de amostra, respectivamente; CºA a concentração inicial do analito na amostra; e KA o coeficiente de partição do analito[32].

1.3. Fases extratoras

Diferentes fases extratoras encontram-se disponíveis comercialmente para as mais variadas aplicações. Em análises ambientais fases extratoras compostas por difenilpolidimetilsiloxano em diferentes porcentagens estão sendo utilizadas (tais como TRB-5 e TRB-35); já fases como Omegawax 250 (polietilenoglicol), Supel Q-PLOT (polímeros) e OV1701 (14% cianopropilfenil metilpolisiloxano) têm sido as mais utilizadas para análise de fármacos em fluido biológicos[34-36].

Figura 5. Sistema in-tube SPME-LC baseado em comutação de coluna nos modos (A) flow through e (B) draw/eject. Posições de extração (A1 e B1) e eluição (A2 e B2)[19].

A Figura 5 mostra um esquema dos sistemas de in-tube SPME nos dois modos de operação[19].

De acordo com o número de mols do soluto extraído pela fase extratora do capilar, é determinada a eficiência da extração por SPME. Para as fases extratoras nas quais o mecanismo de extração é fundamentado no 304

Pesquisas recentes vêm desenvolvendo diversas novas fases extratoras, tais como polipirrol, material de acesso restrito, polímeros impressos molecularmente, monolíticas, entre outras para revestimento dos capilares de extração com intuito de melhorar a seletividade e sensibilidade dos métodos analíticos e eficiência da extração[34].

Polímeros condutores, em especial o polipirrol (PPy) e seus derivados, são também utilizados como fases extratoras. Em razão de sua estrutura porosa (permeabilidade) e de propriedades multifuncionais (caráter ácido-base, interação π – π, ligação de hidrogênio, grupos funcionais polares, eletroatividade, propriedades trocadoras de íons e hidrofobicidade), podem ser considerados fases extratoras mais abrangentes. A polimerização do filme de polipirrol Scientia Chromatographica 2015; 7(4):297-315

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também vem sendo feita no interior do capilar de sílica através da passagem da solução oxidante, do monômero e de gás nitrogênio[37-39].

Outro tipo de polímero que vem sendo utilizado são os polímeros impressos molecularmente (MIP).

São materiais sintéticos que apresentam sítios de reconhecimento específicos resultando, assim, em alta seletividade, estabilidade e rápida preparação quando comparados a outros materiais[40,41]. A maioria dos polímeros de impressão molecular baseiam-se em polímeros acrílicos ou acrilatos orgânicos. Os MIPs são sintetizados por polimerização na presença de uma molécula molde a ser impressa; inicialmente ocorre interações covalentes ou não covalentes das moléculas precursoras do polímero com a molécula alvo (template), formando um complexo monômero-template. Como consequência dessas interações são formadas posições específicas nas extremidades dos monômeros ao redor do template. Posteriormente, ocorre a reação de polimerização, onde acontece a formação do polímero ao redor da molécula alvo e a fixação dos grupamentos dos monômeros no material polimérico. Por fim, a molécula molde é removida das cavidades do polímero obtendose, assim, o MIP com cavidades e sítios seletivos para o reconhecimento e extração do template ou de estruturas análogas a ele[42-45].

Diversos estudos vêm demonstrando o grande potencial das fases extratoras à base de monolitos.

Essas fases apresentam estrutura sólida e altamente porosa, onde os mesoporos e macroporos desse material favorecem a alta retenção, eficiência, permeabilidade, elevados fluxos e baixos valores de pressão, além da incomplexidade em ser sintetizada in situ[46-48]. As fases monolíticas mais utilizadas em microextrações podem ser à base de polímeros orgânicos ou de sílica.

Os polímeros orgânicos apresentam estabilidade em larga faixa de pH, e os baseados em sílica demonstram elevada estabilidade mecânica e permeabilidade. Porém, podem apresentar diminuição da estabilidade mecânica e baixa reprodutibilidade, respectivamente[49,50]. Como

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alternativa, monolitos híbridos organo-sílica estão sendo utilizados; estes apresentam uma ligação covalente entre a parte orgânica - inorgânica e compatibilidade em uma ampla faixa de solventes. Para a síntese desses materiais pode-se utilizar a rota sol-gel na qual o precursor trialcoxissilano com os grupamentos orgânicos é incorporado na rede polimérica, ou a combinação de monômeros orgânicos com precursores do processo sol-gel[51,52].

As fases extratoras modificadas superficialmente com meios de acesso restrito (Restricted Access Media, RAM) são seletivas para moléculas pequenas e apresentam características sortivas mistas, já que combinam a cromatografia de adsorção e exclusão. Essas fases apresentam uma superfície hidrofílica biocompativel na parte externa e outra hidrofóbica no interior dos poros da partícula. Assim, é possível excluir as macromoléculas através de uma barreira física ou por difusão química. A exclusão por barreira física ocorre quando os poros da partícula são pequenos, não permitindo assim a entrada das macromoléculas, e a barreira química quando há a presença de grupos funcionais hidrofílicos na superfície externa da fase. Já as moléculas pequenas penetram nos poros e são sorvidas pelo processo de partição[53-56].

A Tabela 3 apresenta alguns revestimentos capilares utilizados e suas aplicações para o sistema intube SPME.

2. Aplicações

Diversos artigos na literatura vêm publicando com sucesso resultados eficientes e satisfatórios para determinar diferentes classes de compostos em matrizes alimentícias e ambientais utilizando a técnica in-tube SPME[4]. Desde o início do seu desenvolvimento, aplicações com essa técnica vêm aumentando.

Uma visão geral de aplicações da técnica intube SPME em amostras ambientais e de alimentos são mostradas na Tabela 3. Esses métodos apresentaram elevada sensibilidade, seletividade, linearidade e precisão cromatográfica. A capacidade da técnica em analisar

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Tabela 3. Aplicações da técnica in-tube SPME em análises ambientais e alimentícias.

Classe dos analitos

Matriz

Hormônios Água Pesticidas Água HPAs Água/Solo Ftalatos Sedimentos Organofosforados Água HPAs Água Pesticidas Água Micotoxina Nozes/Grãos Pesticidas Suco de Laranja Catequinas/Cafeína Chás Refrigerantes Aditivo alimentar Diferentes chás/ HPAs Alimentos secos Suco de frutas/ Micotoxina Alimentos secos

Fase capilar Sulpel Q/ Carboxen TRB-5 (FGO-PD)3PTFE TRB-5 Fe3O4-SiO2 (CTAB) Cobre TRB-5 CP-Sil 5CB e 19CB, Supel Q e Carboxen-1006 PLOT Monolito Polipirrol Monolito Quadrex 007-5, CP-Sil 5CB e 19CB, CP-Wax 52CB, Supel-Q e Carboxen 1010 PLOT CP-Sil 5CB e 19CB, CP-Wax 52CB, CP-Pora Plot amine, Supel-Q e Carboxen 1006 PLOT

compostos traços surgiu com a união das vantagens da SPME e do acoplamento com o sistema cromatográfico.

A princípio a técnica in-tube SPME foi conectada com HPLC e HPLC-MS; posteriormente, diversas pesquisas desenvolveram o acoplamento in-tube SPME com diferentes cromatógrafos e modos de detecção como, por exemplo, com UHPLC e com técnicas miniaturizadas como CapLC e NanoLC[61,69].

2.1. Aplicações da técnica in-tube SPME em amostras ambientais

Os primeiros trabalhos com a técnica utilizaram na sua maioria acoplamentos com HPLC, combinando com detecção no ultravioleta – visível (UV-Vis) ou por fluorescência; posteriormente trabalhos acoplando com HPLC-MS foram sendo desenvolvidos melhorando, assim, a quantificação e identificação dos compostos.

Alguns artigos relataram a determinação de diversos analitos em matrizes complexas, entretanto ainda existem problemas com essas matrizes mesmo quando se utiliza LC-MS-MS para a determinação[4,10].

Como já citado em outros artigos a determinação de hidrocarbonetos policíclicos aromáticos em diferentes 306

Modo In-tube SPME

Detecção

Ref.

Aspirar/Dispensar Extração única Extração única Extração única Extração única Extração única Extração única Aspirar/Dispensar Extração única Aspirar/Dispensar Extração única

HPLC-FD e DAD UHPLC-MS HPLC-FD Capilar LC - DAD Capilar LC - DAD HPLC-DAD HPLC-DAD HPLC-MS DART-MS HPLC-MS HPLC-UV

[57] [58] [59] [60] [61] [62] [63] [64] [29] [65] [66]

Aspirar/Dispensar

HPLC-FD

[67]

Aspirar/Dispensar

HPLC-MS

[68]

matrizes é frequente, já que essa classe de compostos apresenta elevada toxicidade. De maneira geral, eles estão associados ao aumento de diversos tipos de canceres, o que justifica o intenso estudo desses compostos. Como exemplo, Zhang et al. desenvolveram um método onde a técnica in-tube SPME-HPLC foi utilizada para analisar seis hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs) em amostras de água e solo utilizando como fase extratora politetrafluoretileno (PTFE) modificada com óxido de grafeno funcionalizado, apresentando limite de detecção entre 0.05-0.1 pg mL-1 com RSD abaixo de 3.4%[59]. Em outro trabalho Zhang et al. utilizaram a mesma técnica para análise de seis HPAs em amostras de água de torneira e solo, utilizando um novo material poroso como fase extratora (ZIF-8-PDA-PEEK), o qual apresentou eficiente extração dos analitos. O método também obteve resultados satisfatórios com limites de detecção variando entre 0.5-5.0 pg mL-1 e recuperações de 82.5 a 98.6%[70]. Outro exemplo na determinação de oito HPAs é o método proposto por Sun et al., onde a técnica in-tube SPME se mostrou eficiente na análise desses compostos em amostras de água apresentando limites de detecção de 0.15-0.30 µg L-1 e recuperações Scientia Chromatographica 2015; 7(4):297-315

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que variaram de 92.3 a 120%. Para extração dos analitos utilizou-se um tubo de poliéter (PEEK) revestido com nanoestruturas de prata, o qual apresenta resistência a elevadas pressões e boa flexibilidade[71].

O procedimento desenvolvido por MolinerMartinéz et al. para determinar triazinas polares e seus produtos de degradação em amostras reais de água utilizado HPLC-DAD obteve resultados satisfatórios.

Para extração das triazinas foram avaliadas três tipos de fases: TRB-5 (5% difenil 95% PDMS), c-SWCNTs e c-MWCNTs, sendo a primeira selecionada para extração dos analitos e validação do método por apresentar melhores resultados. As condições propostas no método foram utilizadas com sucesso na detecção dos analitos, apresentando valores de RSD ≤ 9 e ≤ 17%, limite de detecção entre 0.02 e 0.1 µg L-1 [63].

Aufartová et al. propôs um método para determinação de poluentes emergentes, como estrogênios em amostras de água utilizando HPLC-FD e DAD para detecção. O método apresentou valores de RSD menores que 10 e 7.6% para avaliação da reprodutibilidade inter e intra dia respectivamente. Para extração dos analitos foram testadas duas coluna capilares comerciais SupelQTM e CarboxenTM 1006 PLOT. O método proposto foi aplicado com sucesso apresentando valores de recuperações maiores que 80%[57]. Outra metodologia também desenvolvida com a técnica foi para determinar cinco disruptores endócrinos em amostras ambientais líquidas utilizando para extração uma coluna capilar Supel-Q. A identificação e quantificação dos analitos foram realizadas por HPLC-DAD e HPLC-FD. O método foi aplicado com sucesso nas amostras, apresentando valores de recuperações superiores a 86% em todos os casos. Para DAD o limite de detecção ficou entre 0.03 e 1.95 ng mL-1 e para FD entre 0.02 e 0.14 ng mL-1 [72].

Sun et al. otimizaram a técnica acoplada com HPLC-DAD para analisar hidrocarbonetos policíclicos aromáticos em amostras de água, utilizando um capilar revestido com cobre[62]. Outro trabalho publicado por Zarejousheghani et al. aplicou a técnica in-tube SPME

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acoplada com HPLC-UV para determinar 4-nitrofenol em amostras ambientais, utilizando como fase extratora polímeros impressos molecularmente[73].

Segro et al.[74] desenvolveram um método para determinação de analitos polares e moderadamente não polares em amostras de água com detecção por HPLC-UV. Foi utilizado no sistema in-tube SPME um capilar de extração sintetizado a partir do método solgel, empregando como precursor metiltrimetoxisilano (MTMS). O capilar de extração desenvolvido apresentou boa repetibilidade e limites de detecção entre 0.72 e 6.3 ng L-1. Os mesmo autores usaram novamente in-tube SPME HPLC-UV para determinar hidrocarbonetos policíclicos aromáticos em amostras de água, utilizando um capilar de extração com a fase polidimetildifenilsiloxano (PDMDPS) também sintetizada pela rota sol-gel[75].

Mais recentemente, um método online utilizando in-tube SPME acoplado com HPLC utilizou como fase extratora fibras de carbono com alta estabilidade para determinar oito hidrocarbonetos policíclicos aromáticos em amostras de água. O método apresentou boa linearidade, baixos limites de detecção (0.01- 0.1 µg L-1) e valores de recuperações que ficaram entre 92.3 a 111%[76].

Outro método simples, rápido e sensível, foi desenvolvido por Saito et al. para determinar ácido perfluorooctanóico (PFOA) e sulfonato de perfluorooctano (PFOS) em amostras ambientais de água utilizando on-line in-tube SPME e detecção por HPLCMS. O método apresentou limites de detecção para o PFOA e PFOS de 1.5 e 3.2 pg mL-1 respectivamente.

Seis colunas comerciais capilares diferentes foram testadas, CP-Sil 5CB, CP-Sil 19CB, CP-Wax 52CB, CP-Pora PLOT amina, Supel-Q PLOT e Carboxen 1006 PLOT, para avaliar a eficiência de extração. Dentre essas, a coluna CP-Pora PLOT amina apresentou maior eficiência na extração dos analitos PFOA e PFOS[77].

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Kataoka et al.[78] automatizaram a análise dos analitos oseltamivir e carboxilato de oseltamivir utilizando on-line in-tube SPME acoplado com LCMS/MS. Como fase extratora dos analitos foi utilizado a coluna CP-Pora PLOT amina. O método foi utilizado com sucesso na determinação dos analitos em amostras ambientais de água sem nenhum outro tipo de pré tratamento da amostra e/ou picos interferentes. As recuperações foram maiores que 91% e os analitos foram detectados em concentrações da ordem de pg mL-1.

Como relatado nos artigos anteriores a técnica in-tube SPME vem sendo extensivamente utilizada para a concentração de compostos como pesticidas, HPAS, hormônios, ftalatos, fármacos, entre outros, em diferentes amostras ambientais complexas. A identificação e quantificação com precisão desses compostos ou de suas classes requer métodos com elevada sensibilidade e precisão, os quais vem sendo aprimorados nos últimos anos quando acoplados com técnicas miniaturizadas mais precisas como CapLC e NanoLC e com cromatógrafos mais robustos como UHPLC[60,61].

A técnica in-tube SPME acoplada com UHPLCMS/MS foi utilizada na análise de 9 pesticidas em água, apresentando limites de detecção entre 0.025 e 2.5 µg L-1, resposta linear maior que 0,99 e precisão com RSD menor que 20%. Neste trabalho a microtécnica de extração utilizando como fase extratora TRB-5 possibilitou a concentração on-line dos analitos em baixas concentrações permitindo, assim, um aumento na sensibilidade da detecção desses compostos. Além disso, oferece vantagens como a mínima manipulação das amostras, baixo consumo de solventes no sistema e nenhum na preparação da amostra. O trabalho demonstrou que a técnica in-tube SPME acoplada com UHPLC é uma alternativa viável e que quando acoplada a detectores mais seletivos apresenta maior sensibilidade e seletividade[58].

Munõz-Ortunõ et al. desenvolveram uma meto­ dologia para análise de ftalatos em amostras de sedimentos costeiros. Os extratos obtidos foram 308

Microextração em fase sólida no tubo (in-tube SPME)

concentrados por in-tube SPME acoplados com um cromatógrafo líquido capilar e detecção por DAD, como fase extratora utilizou-se uma coluna capilar TRB-5. O parâmetro precisão apresentou valores de RSD menores que 10%. Os limites de detecção nas amostras foram de 270 e 90 µg kg-1 para 0.1 e 0.3 g de sedimentos respectivamente[60].

Um método seletivo e sensível foi desenvolvido para determinar monocloroaminas em amostras de água, utilizando como fase extratora uma coluna capilar TRB-5. Os analitos foram determinados utilizando intube SPME acoplado a um cromatógrafo liquido capilar (IT-SPME Capillary LC-DAD). O método apresentou coeficientes lineares maiores que 0.995, RSD menor que 15% para os testes de recuperação e os limites de detecção foram de 0.029 e 0.01 mg L-1 para volumes de amostras de 0.1 ou 4 mL, respectivamente[79].

A microtécnica in-tube SPME – CapLC vem sendo utilizada na determinação de analitos em matrizes ambientais. Compostos organofosforados[61], compostos carbonílicos como aldeídos alifáticos e insaturados e grupamentos cetona[80], triazinas[81], esteróis[82], entre outros, estão sendo determinados com sucesso.

A combinação da in-tube SPME com técnicas cromatográficas miniaturizadas, como a CapLC, se tornou consistente durante os anos demonstrando seu amplo uso em diferentes tipos de amostras de solos, sedimentos e águas para um ou muitos analitos. Já a combinação da técnica com a NanoLC, ainda vem sendo pouco utilizada.

Diversos exemplos na literatura utilizando a microtécnica de extração in-tube SPME para identificar e quantificar diferentes classes ou compostos em matrizes ambientais demonstram que a técnica é uma ferramenta importante no preparo das amostras apresentando grandes avanços no aumento da seletividade e sensibilidade dos métodos analíticos e com isso obtendo valores satisfatórios na validação.

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Microextração em fase sólida no tubo (in-tube SPME)

2.2. Aplicações da técnica in-tube SPME em amostras alimentícias

O controle de contaminantes e resíduos exerce papel fundamental quando se trata de amostras alimentícias, já que se faz necessário assegurar que o alimento chegue ao consumidor livre de resíduos de substâncias perigosas em níveis elevados. Assim, o aprimoramento e desenvolvimento de novas técnicas, cada vez mais sofisticadas para comprovação da qualidade dos alimentos, vem aumentando.

As amostras de alimentos são constituídas de complexas misturas de compostos orgânicos e inorgânicos; assim, faz necessário adequada preparação da amostra para que se possa extrair e concentrar os compostos de interesse. Nesse âmbito a técnica in-tube SPME vem sendo aprimorada na análise de diferentes analitos.

Como mostra a Tabela 3, diversos métodos na literatura utilizaram a técnica in-tube SPME para análise de micotoxinas[68], HPAS[67], aditivos alimentares[66] em variadas amostras de alimentos.

Análises alimentícias foram relatadas por Wu et al. na determinação de catequinas e cafeínas em diferentes amostras de chás, utilizando a técnica intube SPME para extração dos analitos com capilares comerciais (Supel-Q PLOT, Omegawax 250, SPB-1 e SPB-5) e de polipirrol. O desenvolvimento do método se mostrou satisfatório, apresentando limite de detecção de 0.01 ng mL-1 e 0.5 ng mL-1 para catequinas e cafeínas, respectivamente[65].

Hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs) foram determinados em amostras alimentícias utilizando a técnica in-tube SPME acoplada a HPLCFD. O método online desenvolvido apresentou rapidez, seletividade e sensibilidade, sendo aplicado facilmente na análise de 15 HPAs em diferentes amostras de chás e alimentos secos, sem picos interferentes, com valores de recuperações maiores que 70%. O método apresentou boa linearidade com valores de R2 > 0.9972 no intervalo

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de concentração de 0.05 a 2.0 ng mL-1 e com limites de detecção entre 0.32-4.63 pg mL-1. Quadrex 007-5, CPSil 5CB, CP-Sil 19CB, CP-Wax 52CB, Supel-Q PLOT e Carboxen 1010 PLOT foram as fases avaliadas para extração dos analitos, onde a CP-Sil 19CB apresentou os melhores resultados[67].

A identificação e quantificação de micotoxinas em matrizes alimentícias é outra importante aplicação da técnica in-tube SPME. A presença de micotoxinas, metabólitos tóxicos produzidos por algumas espécies de fungos, pode contaminar os alimentos destinados ao consumo humano e animal. Três artigos foram encontrados na literatura descrevendo metodologias baseadas no sistema online in-tube SPME como preparo das amostras para análise de micotoxinas.

Nonaka et al. desenvolveram um método para detecção e identificação de aflatoxinas (AFB1, AFB2, AFG1 e AFG2) em diferentes amostras de alimentos, utilizando a técnica in-tube SPME acoplada com LC-MS. Fases como CP-Sil 5CB, CP-Sil 19CB, CPWax 52CB, CP-Pora PLOT amina, Supel-Q PLOT e Carboxen 1006 PLOT foram avaliadas na extração dos analitos, porém a fase que apresentou melhor resposta foi a Supel-Q PLOT. A recuperação das aflatoxinas foi maior que 80% e o desvio padrão relativo menor que 11.2%. Esse método foi aplicado com sucesso, já que micotoxinas foram detectadas em amostras alimentícias em concentrações menores que 10 ng g-1[83].

Patulina, um metabólito secundário de uma micotoxina tóxica, também foi analisado pela técnica em amostras de suco de frutas e frutas secas. Fases como CPSil 5CB, CP-Sil 19CB, CP-Wax 52CB, CP-Pora PLOT amina, Supel-Q PLOT e Carboxen 1006 PLOT foram testadas, apresentando maior eficiência para essa classe de analito a Carboxen 1006 PLOT. A técnica acoplada a LC-MS apresentou alta sensibilidade com limite de detecção do analito de 23.5 pg mL-1. As recuperações apresentaram valores maiores que 92% com desvio padrão relativo menor que 4.5%, tornando possível detectar a patulina em níveis de ng mL-1 em várias

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amostras comerciais de suco de maçã[68]. Outra utilização da técnica in-tube SPME para análise de micotoxinas foi reportada por Saito et al., onde as ocratoxinas A e B foram analisadas em amostras de nozes e grãos. Quatro fases diferentes foram testadas para concentrar as micotoxinas, CP-Sil 5CB, CP-Sil 19CB, Supel-Q PLOT e Carboxen 1006 PLOT, apresentando a última melhor eficiência na extração. Mais uma vez o método apresentou resultados satisfatórios com limite de detecção de 92 e 89 pg mL-1 e desvio padrão relativo menor que 5.1 e 7.7% para ocratoxina A e B respectivamente. As recuperações para ambas foram maiores que 88% e foram detectadas em concentrações de 0.7 a 8.8 ng g-1 em diversas amostras[64].

Utilizando líquidos iônicos para preparar uma fase extratora monolítica orgânica, Wang et al. analisaram diferentes aditivos alimentares em amostras de refrigerantes. A técnica in-tube SPME acoplada com HPLC-UV apresentou resultados precisos e confiáveis como curvas de calibração com R2 > 0.99, limites de detecção variando entre 1.2 a 13.5 ng mL-1. As recuperações de cinco aditivos em refrigerante CocaCola variaram de 85.4 a 98.3% com desvio padrão relativo menor que 6.9%[66].

Determinação de estrógenos sintéticos foi relatada por Yu et al. em amostras de leite. A fase extratora foi sintetizada a partir de nanopartículas de sílica (SiO2 NP) unidas por 3- (trietoxisilil) propil metacrilato e modificadas com poli(N-isopropilacrilamida) (PNIPAm). A técnica in-tube SPME acoplada a HPLCUV apresentou valores satisfatórios na validação da metodologia com limites de detecção variando de 1.22.2 ng g-1; recuperações que variaram de 71.7 a 98.9%; e valores baixos de desvio padrão relativo, de 2.8 a 12.6%.

O método proposto comparou alguns métodos publicados anteriormente para determinação de estrógenos e foi possível perceber que o limite de detecção do artigo foi bem menor que os mostrados, exceto com detectores LC-MS. Além disso, a metodologia desenvolvida requer menores quantidades de solventes e amostras[84].

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Recentemente Asiabi et al. desenvolveram uma nova e eficiente metodologia online utilizando a técnica in-tube SPME acoplada a HPLC-UV para pré-concentrar e determinar três parabenos (metil, etil e propil parabenos) em níveis traços. Como fase extratora foi depositado eletroquimicamente sobre a superfície interna de um tubo de aço inoxidável um composto de polianilinapolipirrol. O método foi empregado com sucesso em amostras de água, leite e suco, apresentando limites de detecção variando de 0.02 a 0.04 µg L-1. O parâmetro linearidade variou de 0.07 a 50 µg L-1 para os parabenos com coeficientes maiores que 0.998 e, os valores de recuperação para extração das amostras enriquecidas ficaram na faixa aceitável de 80.3 a 90.2%[85].

O acoplamento online da técnica in-tube SPME com análise direta e em tempo real por espectrometria de massas (DART-MS) foi desenvolvido e aplicado em análises dos herbicidas triazinas em amostras de água de lago e suco de laranja. Como fase extratora foi utilizado um monolito (poly(MAA-EDMA-SWNT)) para extração das seis triazinas estudadas. Comparando a metodologia desenvolvida com modo de análise offline por DART-MS, foi possível perceber que o método online IT-SPME-DART-MS apresentou maior sensibilidade e reprodutibilidade. O método determinou seis triazinas simultaneamente e apresentou valores de recuperação entre 85 e 106% com desvio padrão relativo entre 3.1 e 10.9%[29].

Devido ao significativo aumento do consumo mundial de alimentos com o exponencial crescimento da população, o Brasil, se tornou uma das maiores potências em produção e exportação de alimentos no mundo. Com isso, o desenvolvimento de novas técnicas de extração e pré-concentração, cada vez mais sofisticadas e acopladas com equipamentos analíticos mais sensíveis, se tornam necessárias para a detecção de resíduos de substâncias indesejáveis nos alimentos trazendo, assim, maior confiabilidade e segurança ao consumo e a exportação brasileira de alimentos.

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3. Conclusão

Na maioria das vezes a preparação da amostra é necessária para que se possa isolar os analitos de interesse dos interferentes presentes em matrizes ambientais e alimentícias complexas. Essa etapa é considerada a mais complicada já que não há somente uma técnica que abrange o preparo de todas as classes de amostras.

A preparação depende do tipo de amostra, do analito a ser extraído e pré-concentrado, dos interferentes da matriz e do equipamento a ser utilizado na identificação e quantificação dos compostos de interesse.

Dentre as técnicas de microextração, nesse contexto, a técnica in-tube SPME vem se destacando no preparo das amostras por possuir diversas vantagens como fácil automatização, miniaturização, alto desempenho, sensibilidade, seletividade, acoplamento online com detectores de alta resolução, redução do volume de solventes, combinado com um menor tempo de análise, custo e menor exposição dos analistas com amostras contaminadas e se tornando, assim, uma técnica atrativa quando comparada a outras utilizadas para as mesmas análises.

A técnica in-tube SPME, discutida no presente trabalho, se apresentou consolidada na análise de diferentes analitos em matrizes complexas (ambiental e alimentícia) e apresenta grande perspectiva de utilização em diferentes áreas. Métodos desenvolvidos e validados em diferentes trabalhos utilizando a técnica mostraram resultados satisfatórios, como alta sensibilidade, seletividade, baixos limites de detecção, eficiente recuperação e baixos valores de desvio padrão relativo para as replicatas. Diferentes fases extratoras foram

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desenvolvidas nos trabalhos para aumentar a seletividade e aprimorar a pré-concentração e extração dos analitos de interesse.

A baixa estabilidade e eficiência de extração das fases extratoras convencionais é uma limitação da técnica, bem como a necessidade de longos tempos de extração devido a difusão lenta dos analitos da amostra para o capilar. Assim os desafios atuais ainda giram em torno do desenvolvimento de novas fases mais apropriadas, já que as comerciais apresentam limitações. Como consequência, pesquisas recentes vem desenvolvendo uma grande variedade de fases extratoras para revestimento dos capilares com intuito de aprimorar a seletividade, sensibilidade, estabilidade e tempo de extração, permitindo assim a utilização dessa técnica na quantificação de diferentes analitos em níveis de traços em amostras ambientais e alimentícias complexas.

Neste trabalho foram apresentados diferentes materiais para o revestimento do sistema in-tube SPME a base de polipirrol, polímeros molecularmente impressos, monólitos, materiais de acesso restrito, entre outros, em diferentes campos de aplicações ambientais e alimentícias. Mais inovações nesta área de novos materiais sorventes podem ser previstas para os próximo anos.

Agradecimentos

Os autores agradecem a CAPES pela bolsa de estudos para A. L. T. (Proc. 1480653/2015), assim como o apoio financeiro da FAPESP (Proc. 2014/07347-9) e CNPq (Proc. 307293/2014-9).

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[61] MOLINER-MARTINEZ, Y.; VITTA, Y.; PRIMA-GARCIA, H.; GONZÁLEZ-FUENZALIDA, R. A.; RIBERA, A.; CAMPÍNSFALCO, P.; CORONADO, E. Silica supported Fe3O4 magnetic nanoparticles for magnetic solid-phase extraction and magnetic in-tube solid-phase microextraction: application to organophosphorous compounds. Analytical and Bioanalytical Chemistry, v. 406, p. 2211-2215, 2014.

[62] SUN, M.; FENG, J.; BU, Y.; LUO, C. Highly sensitive copper fiber-in-tube solid-phase microextraction for online selective analysis of polycyclic aromatic hydrocarbons coupled with high performance liquid chromatography. Journal of Chromatography A, v. 1408, p. 41-48, 2015.

[63] MOLINER-MARTÍNEZ, Y.; SERRA-MORA, P.; VERDÚ-ANDRÉS, J.; HERRÁEZ-HERNÁNDEZ, R.; CAMPÍNSFALCÓ, P. Analysis of polar triazines and degradation products in waters by in-tube solid-phase microextraction and capillary chromatography: an environmentally friendly method. Analytical and Bioanalytical Chemistry, v. 407, p. 1485-1497, 2015.

[64] SAITO, K.; IKEUCHI, R.; KATAOKA, H. Determination of ochratoxins in nuts and grain samples by in-tube solid-phase microextraction coupled with liquid chromatography–mass spectrometry. Journal of Chromatography A, v. 1220, p. 1-6, 2012.

[65] WU, J.; XIE, W.; PAWLISZYN, J. Automated in-tube solid phase microextraction coupled with HPLC-ES-MS for the determination of catechins and caffeine in tea. The Analyst, v. 125, p. 2116-2222, 2000.

[66] WANG, T. T.; CHEN, Y. H.; MA, J. F.; HU, M. J.; LI, Y.; FANG, J. H.; GAO, H. Q. A novel ionic liquid-modified organicpolymer monolith as the sorbent for in-tube solid-phase microextraction of acidic food additivies. Analytical and Bioanalytical Chemistry, v. 406, p. 4955-4963, 2014.

314

Scientia Chromatographica 2015; 7(4):297-315

Microextração em fase sólida no tubo (in-tube SPME)

Toffoli AL, Lanças FM

[67] ISHIZAKI, A.; SAITOA, K.; HANIOKA, N.; NARIMATSUB, S.; KATAOKA, H. Determination of polycyclic aromatic hydrocarbons in food samples by automated on-line in-tube solid-phase microextraction coupled with high-performance liquid chromatography-fluorescence detection. Journal of Chromatography A, v. 1217, p. 5555-5563, 2010.

[68] KATAOKA, H.; ITANO, M.; ISHIZAKI, A.; SAITO, K. Determination of patulin in fruit juice and dried fruit samples by in-tube solid-phase microextraction coupled with liquid chromatography–mass spectrometry. Journal of Chromatography A, v. 1216, p. 3746-3750, 2009.

[69] WEN, Y.; WANG, Y.; FENG, Y. Q. Simultaneous residue monitoring of four tetracycline antibiotics in fish muscle by in-tube solid-phase microextraction coupled with high-performance liquid chromatograhy. Talanta, v. 70, p. 153-159, 2006.

[70] ZHANG, J.; ZHANG, W.; BAO, T.; CHEN, Z. Polydopamine-based immobilization of zeolitic imidazolate framework-8 for intube solid-phase microextraction. Journal of Chromatography A, v. 1388, p. 9-16, 2015.

[71] SUN, M.; FENG, J.; BU, Y.; LUO, C. Nanostructured-silver-coated polyetheretherketone tube for online in-tube solid-phase microextraction coupled with high-performance liquid chromatography. Journal of Separation Science, v. 38, p. 1-8, 2015.

[72] AUFARTOVÁ, J.; PADRÓN, M. E. T.; FERRERA, Z. S.; NOVÁKOVÁ, L.; SOLICH, P.; RODRÍGUEZ, J. J. S. Development of a novel in-tube solid phase microextraction based on micellar desorption followed by LC-DAD-FD for the determination of some endocrine disruptor compounds in environmental liquid samples. Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies, v. 37, p. 1654-1672, 2014.

[73] ZAREJOUSHEGHANI, M.; MODER, M.; BORSDORF, H. A new strategy for synthesis of an in-tube moleculary imprinted polymer-solid phase microextraction device: Selective off-line extraction of 4-nitrophenol as an example of priority pollutants from environmental water samples. Analytica Chimica Acta, v. 798, p. 48-55, 2013.

[74] SEGRO, S. S.; MALIK, A. Sol-gel methyl coating in capillary microextraction hyphenated on-line with high-performance liquid chromatography Counterintuitive extraction behavior for polar analytes. Journal of Chromatography A, v. 1200, p. 62-71, 2008.

[75] SEGRO, S. S.; MALIK, A. Solvent-resistant sol-gel polydimethyldiphenylsiloxane coating for on-line hyphenation of capillary microextraction with high-performance liquid chromatography. Journal of Chromaotgraphy A, v. 1205, p. 26-35, 2008.

[76] FENG. J.; SUN, M.; BU, Y.; LUO, C. Development of a cheap and accessible carbon fibers-in-poly (ether ether ketone) tube with high stability for online in-tube solid-phase microextraction. Talanta, v. 1205, p. 26-35, 2008.

[77] SAITO, K.; UEMURA, E.; ISHIZAKI, A.; KATAOKA, H. Determination of perfluorooctanoic acid and perfluorooctane sulfonate by automated in-tube solid-phase microextraction coupled with chromatography-mass spectrometry. Journal of Chromatography A, v. 148, p. 313-320, 2016.

[78] KATOKA, H.; SHIBA, H.; SAITO, K. Automated analysis of oseltamivir and oseltamivir carboxylate in environmental waters by online in-tube solid-phase microextraction coupled with liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Analytical Methods, v. 4, p. 1513-1518, 2012.

[79] PLA-TOLÓS, J.; MOLINER-MARTÍNEZ, Y.; MOLINS-LEGUA, C.; HERRÁEZ-HERNÁNDEZ, R.; VERDÚ-ANDRÉS, J.; CAMPÍNS-FALCÓ, P. Selective and sensitive method based on capillary liquid chromatography with in-tube solid-phase microextraction for determination of monochloramine in water. Journal of Chromatography A, v. 1388, p. 17-23, 2015.

[80] PRIETO-BLANCO, M. C.; MOLINER-MARTÍNEZ, Y.; LÓPEZ-MAHÍA, P.; CAMPÍNS-FALCÓ, P. Determination of carbonyl compounds in particulate matter PM2.5 by in-tube solid-phase microextraction coupled to capillary liquid chromatography/mass spectrometry. Talanta, v. 115, p. 876-880, 2013.

[81] GONZALEZ-FUENZALIDA, R. A.; MOLINER-MARTINEZ, Y.; PRIMA-GARCIA, H.; RIBERA, A.; CAMPINS-FALCO, P.; ZARAGOZA, R. J. Evaluation of superparamagnetic sílica nanoparticles for extraction of triazines in magnetic in-tube solid phase microextraction coupled to capillary liquid chromatography. Nanomaterials, v. 4, p. 242-255, 2014.

[82] MOLINER-MARTINEZ, Y.; HERRAEZ-HERNANDEZ, R.; MOLINS-LEGUA, C.; CAMPINS-FALCO, P. Improving analysis of apolar organic compounds by the use of a capillary titania-based column: Application to the direct determination of faecal sterols cholesterol and coprostanol in wastewater samples. Journal of Chromatography A, v. 1217, p. 4682-4687, 2010.

[83] NONAKA, Y.; SAITO, K.; HANIOKA, N.; NARIMATSU, S.; KATAOKA, H. Determination of aflatoxicins in food sample by automated on-line in-tube solid-phase microextraction coupled with liquid chromatography-mass spectrometry. Journal of Chromatography A, v. 1216, p. 4416-4422, 2009.

[84] YU, Q. W.; MA, Q.; FENG, Y. Q. Temperature-response polymer coating for in-tube solid-phase microextraction coupled to high-performance liquid chromatography. Talanta, v. 1216, p. 1019-1025, 2011.

[85] ASIABI, H.; YAMINI, Y.; SEIDI, S.; ESRAFILI, A.; REZAEI, F. Electroplating of nanostructured polyaniline-polypyrrole composite coating in a stainless-steel for on-line in-tube solid phase microextraction. Journal of Chromatography A, v. 1397, p. 19-26, 2015.

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NOVIDADES TECNOLÓGICAS

ANALITICA Q Exactive GC – O primeiro GC-MS/MS com tecnologia Orbitrap

Q Exactive GC Orbitrap GC-MS/MS Dados com a mais alta qualidade nas análises mais abrangentes.

A tecnologia Orbitrap inserida em um GC-MS sempre foi a maior expectativa do mercado e agora, com satisfação, a Analítica apresenta o Q Exactive GC Orbitrap GC-MS/MS, da Thermo Scientific - um sistema híbrido quadrupolo-Orbitrap com poder de resolução de até 120.000 em m/z 200 e sensibilidade de partes por trilhão (ppt).

O Q Exactive GC faz a caracterização abrangente das amostras em uma única análise, com a mais alta confiabilidade na detecção, identificação e quantificação de compostos. Apresenta as características de quantificação dos sistemas GC-MS triploquadrupolo, com as vantagens de alta precisão e full scan de alta resolução/ massa exata que somente a tecnologia Orbitrap oferece.

Saiba mais: analiticaweb.com.br Contato: revista@novanalitica.com.br Fone: (11) 2162-8080

ALLCROM – Tudo para Cromatografia Sistema YL6900 GC/MS O Sistema YL6900 GC/MS da YL Instruments possibilita um grande número de Espectros com a mais alta velocidade de Varredura (20.000 amu/seg) em cada pico do GC, oferece ainda ampla faixa de Massas (1 ~ 1.200 u), o instrumento com os mais baixos Limites de Detecção ( ← 10 fg de OFN) e a mais alta sensibilidade.

Sistema fácil e simples de operar, possui protocolos poderosos de Ajuste e Otimização permitindo uma Altissima Produtividade com o uso de Amostradores Automáticos, o equipamento que traz resultados concisos e detalhados de acordo com a sua necessidade. Pode ser acoplado a Cromatógrafos Gasosos de qualquer marca permitindo a atualização para obter resultados mais precisos.

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Scientia Chromatographica 2015; 7(4)

NOVIDADES TECNOLÓGICAS

Veolia Water Technologies Linha Elga LabWater A cromatografia é uma técnica quantitativa que tem por finalidade geral identificar as substâncias e separar ou purificar as misturas. Usando propriedades como solubilidade, tamanho e massa, essa técnica tem como um dos solventes a água ultrapura, que é utilizada para remover íons da água e promover a obtenção de água praticamente isenta de sais. O mercado de água ultrapura vem se desenvolvendo em função do avanço tecnológico dos instrumentos analíticos, devido a sua sensibilidade nos resultados. Assim, para cada técnica especifica há um equipamento. A linha Elga LabWater, da Veolia, conta com equipe especializada que ajuda os clientes a definir qual é o equipamento mais adequado.

Saiba mais: www.elgalabwater.com/portuguese Contato: elgabrasil@veolia.com Fone: (11) 4617-9900

LABWARE BRASIL – Results Count Como você controla todas as informações geradas em seu laboratório?

E os dados do seu Cromatógrafo?

A LabWare, líder mundial em Soluções para Gerenciamento de Informações Laboratoriais, permite otimizar o atendimento às normas, gerenciar os dados das amostras, integrar os equipamentos, gerar relatórios, aumentar a produtividade e reduzir os custos através da nossa plataforma de soluções – ELP, que uniu o premiado LabWare LIMS com o LabWare ELN - Caderno Eletrônico para Laboratórios.

Além do Software, a LabWare disponibiliza treinamentos e suporte técnico, para assegurar que nossos clientes alcancem o máximo valor agregado em seu processo.

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NOVIDADES TECNOLÓGICAS

ANALITICA Qmicro – O menor cromatógrafo a gás jamais antes construído

Qmicro GC – análise rápida de gases com tecnologia de microchips.

A Analítica apresenta o novo Qmicro GC, um microcromatógrafo a gás modular, destinado à análise rápida de mistura de gases. Baseado em tecnologia proprietária de microchips, o Qmicro integra o injetor, a coluna e um micro TCD em um único forno. Apresenta características exclusivas como: dimensões muito reduzidas (64x64x24 mm), pequena massa térmica, programação de temperatura até 180 °C, velocidade de aquecimento de 5°C/s e backflush para o detector. Outros aspectos dignos de destaque, como rapidez das análises (10-30 s), baixo limite de detecção (500 ppb) e operação autônoma tornam este micro GC único no mercado mundial.

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SCIEX – Answers for Science. Knowledge for Life.

X500R QTOF – Você imaginou e nós desenvolvemos para você X500R, o primeiro QTOF para análises de rotina! Um sistema simples e acessível a todos os usuários, integrando a NOVA plataforma de controle SCIEX OS, concebida para análises de rotinas de pesticidas, resíduos de medicamentos veterinários, micotoxinas, PPCP e compostos forenses. O QTOF X500R suporta um número de diferentes fluxos de trabalho de aquisição: incluindo IDA (ou DDA), a aquisição SWATH® e MRMHR. A fonte Turbo VTM que é característica dos espectrômetros da SCIEX, está mantida e suporta a máxima disponibilidade de todo o sistema.

Saiba mais: http://sciex.com/products/mass-spectrometers/qtof-systems/x-series-qtof-systems/x500r-qtof-system Contato: vendas@sciex.com Fone: 0800-885-0800 318

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NOVIDADES TECNOLÓGICAS

METROHM Metrohm Pensalab: Cromatografia de Íons A Metrohm apresenta a linha de Cromatografia de Íons Professional IC Vario.

A tecnologia do equipamento acoplada às técnicas de preparo de amostras inline (diluição, ultrafiltração, diálise, eliminação de matriz) permite grande flexibilidade e robustez nas análises para amostras complexas, em diversos segmentos. Os equipamentos possuem 3 anos de garantia, além de 10 anos de garantia do sistema de supressão. Baixo custo analítico aliado à tecnologia, resultando em uma excelente solução analítica para determinação de cátions, ânions, cianeto e sulfeto, carboidratos e ácidos orgânicos. Com mais de 25 anos de experiência em Cromatografia de Íons, a Metrohm alinha tecnologia e expertise na determinação de íons.

Saiba mais: www.metrohm.com/pt-br Contato: metrohm@metrohm.com.br Fone: (11) 3868-6599

ANALITICA AutoMate-Q40 – Novo sistema para automatizar o método de extração QuEChERS

AutoMate-Q40 – Sistema automático para QuEChERS.

A precisão e exatidão da preparação de amostras pelo método QuEChERS é maior com o emprego do AutoMate-Q40, que automatiza todas as etapas do método: pipetagem/dispensa de líquidos, agitação Vortex, abertura/fechamento de vials, adição de reagentes sólidos, identificação dos níveis de líquidos, decantação, centrifugação, spiking da matriz e cleanup por dSPE .

Uma vantagem adicional do AutoMate-Q40, garantida pela tecnologia exclusiva e inovadora VialVision™ (patente pendente Teledyne Tekmar) é a sua capacidade de identificar com segurança os níveis de líquido dentro de um vial, diferenciar entre várias fases líquidas e calcular seus respectivos volumes.

Saiba mais: analiticaweb.com.br Contato: revista@novanalitica.com.br Fone: (11) 2162-8080

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NOVIDADES TECNOLÓGICAS

SINC – Instrumentação Científica Ltda.

GCMS-TQ8040 - velocidade, precisão e fácil operação • Alta Sensibilidade e Seletividade; • Patenteado pela Shimadzu, fonte de íons de alta eficiência oferece sensibilidade incomparável; • Lentes Overdrive reduzem ruído; • Variedade de modos de análise oferecem alta seletividade e flexibilidade; • Desempenho de Alta Velocidade; • UFsweeper - 600 transições MRM por segundo; • ASSP permite scanning de alta velocidade em 20.000 u/s; • Medições em Fast Scan/MRM oferece informações qualitativas e quantitativas; • Facilidade de Uso Definitiva; • Função AART ajusta automaticamente os tempos de retenção dos analitos; • Função Easy sTop reduz tempo de manutenção do pórtico de injeção; • Fonte de Íons frontal permite manutenção fácil e rápida.

Saiba mais: www.sinc.com.br Contato: vendas@sinc.com.br Fone: (11) 3864-1411

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INSTITUTO INTERNACIONAL DE CROMATOGRAFIA

O Instituto Internacional de Cromatografia (IIC) possui como uma de suas principais missões o oferecimento de cursos de curta duração nas áreas de cromatografia e técnicas relacionadas.

Os objetivos dos cursos do IIC são o aprimoramento/formação/ atualização dos usuários das técnicas cromatográficas e afim (Preparo de Amostras, Espectrometria de Massas, Gestão da Qualidade, dentre outras), tanto do ponto de vista teórico quanto prático.

A filosofia educacional do IIC é: “ao invés de ensinar apenas como operar um equipamento específico (dar o peixe) o IIC ensina a técnica (como pescar)”.

Os cursos do Instituto Internacional de Cromatografia são coordenados pelos Diretores do IIC, e ministrados pelos coordenadores, auxiliados por uma equipe técnica e científica altamente qualificada, constituída de docentes pósgraduados nos melhores centros do país na área, e pós‑graduandos em fase de conclusão de suas teses. Na época em que cada curso for oferecido, uma relação dos instrutores é disponibilizada no website do IIC. O programa detalhado de cada curso pode ser obtido através de contacto com o IIC. Os cursos são ministrados com auxílio de recursos audiovisuais modernos (datashow‑computador; vídeos, demonstrações, resolução de problemas e outros recursos instrucionais). Os alunos recebem um livreto contendo cópia de todos os slides apresentados pelos instrutores, além de material bibliográfico de apoio. Em vários cursos também são fornecidos livros de autoria dos próprios docentes dos cursos. A maior parte dos cursos também tem aulas práticas de laboratório, conforme anunciado no folheto explicativo de cada curso.

Observações: • O I.I.C. oferece também cursos “in-house” (“in-company”). Interessados nesta modalidade devem contatar o IIC para obter mais detalhes.

• Com exceção dos cursos da área da qualidade (ISO, Validação e Auditoria) todos os demais possuem aulas teóricas e práticas de laboratório.

• O oferecimento efetivo de um curso depende de um número mínimo de inscritos no mesmo.

• O número de vagas dos cursos que envolvem laboratório está sendo limitado para melhor aproveitamento dos participantes.

• Visite o website www.iicweb.org para obter mais informações.

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BIBLIOTECA IIC

O Bookstore divulgará o material de informação e formação produzido pelo IIC, incluindo Livros, filmes, slides, material didático de cursos e outras formas de divulgação dos materiais por ele ­produzido. Esses materiais podem ser adquiridos do IIC através do website www.iicweb.org/biblioteca.php

Cromatografia Líquida Moderna - Fernando M. Lanças Livro publicado pela Editora Átomo em maio de 2009, aborda de forma simples e didática os principais assuntos relacionados à Cromatografia Líquida Moderna (HPLC ou CLAE), desde a Teoria, Instrumentação, Colunas, Detectores, até aspectos da Validação, Preparo da Amostra e Análise Quantitativa.

O IIC recomenda este livro para todos os interessados em iniciar-se ou ­atualizar-se nesta técnica.

Cromatografia em Fase Gasosa - Fernando M. Lanças Livro de autoria do Prof. Lanças, abordando todos os princípios básicos: instrumentação, análise qualitativa e quantitativa, detectores e muitos outros aspectos da Cromatografia Gasosa.

Altamente recomendado para os iniciantes na técnica, os quais encontrarão explicações detalhadas e simples a respeito da maior parte dos fundamentos básicos da técnica.

Extração em Fase Sólida - Fernando M. Lanças De autoria do Prof. Lanças, este livro apresenta e discute as várias formas de extração em fase sólida (SPE), desde a mais clássica empregando cartuchos até as mais atuais como discos, placas, ponteiras, e outras. Também discute os princípios da micro extração em fase sólida (SPME) e da extração por sorção em barras de agitação (SBSE).

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NORMAS PARA PUBLICAÇÃO

Normas para publicação de artigos no Scientia Chromatographica (a versão detalhada está disponível em nosso portal www.scientiachromatographica.com).

Escopo

Scientia Chromatographica publica trabalhos em todas as áreas da Cromatografia, incluindo GC (colunas capilares, empacotadas, preparativas), LC (convencional, HPLC, U-HPLC, Prep-LC, micro-LC, nano-LC, TLC, PC), SFC (colunas empacotadas ou capilares), Técnicas Acopladas (GC-MS, LC-MS, SFC-MS, LC-GC, SFE-CE, GCxGC, LCxLC) e Técnicas de Preparo de Amostras (SPME, SBSE, MEPS, QuEChERS, LLE, MAE,SPE, LLE, etc.). A partir de 2012 o Scientia publica os seguintes formatos de artigos: • Artigos Originais de Pesquisa • Comunicação (“Short Communication”) • Artigos de Revisão Crítica Os artigos de Revisão Crítica deverão antes de sua submissão serem discutidos com um dos c­o-editores mais relacionados ao assunto em questão. Devem conter uma contribuição nova a respeito de um assunto de grande interesse atual, incluindo uma discussão a respeito das vantagens e desvantagens do mesmo. O Scientia não publica apenas relato de artigos descritos na literatura, sem uma discussão crítica sobre os mesmos.

Os artigos Originiais de Pesquisa deverão conter resultados de laboratório e/ou teóricos, que signifiquem uma contribuição expressiva para a área de técnicas de separação, seja ela conceitual, na instrumentação, ou na aplicação.

Os artigos do tipo Comunicação deverão ter a mesma qualidade dos artigos Originais, porém devido a seu caráter de comunicação preliminar usualmente são de menor extensão.

Envio do Artigo

Os artigos deverão ser encaminhados para periodico@scientiachromatographica.com. Os artigos do tipo Revisão deverão antes de seu envio pelo website ter o aval de um dos co-Editores do periódico, caso contrário não serão avaliados.

Todos os artigos, independentemente do formato, deverão ser submetidos exclusivamente ao Scientia, com o entendimento de que eles não foram anteriormente submetidos, não estão sendo e não serão posteriormente publicados em outro veículo.

Autores que utilizarem tabelas, ilustrações, figuras, ou textos contendo mais de 25 palavras, anteriormente publicados em outro periódico – sendo ou não autores do artigo – deverão obter a devida permissão por escrito do portador dos direitos de cópia (“Copyright ”). Esse documento deverá permanecer de posse dos autores, sendo encaminhado ao Scientia, quando solicitado.

Idioma

Os artigos, com exeção dos de Revisão, podem ser escritos preferencialmente em inglês, porém em Português e Espanhol também serão aceitos. Os autores cujo idioma nativo não for o empregado na redação do artigo são orientados a solicitar a colaboração de colegas fluentes no idioma, antes de enviar o artigo para o periódico.

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NORMAS PARA PUBLICAÇÃO

Tipos de contribuições aceitas para publicação no Scientia O Scientia Chromatographica considera para publicação quatro tipos de contribuição:

Artigos Originais de pesquisa: descrevem resultados de estudos completos. Deverão conter resultados de laboratório e/ou teóricos, que signifiquem uma contribuição expressiva para a área de técnicas de separação, seja ela conceitual, na instrumentação, ou na aplicação. Este tipo de contribuição é limitado a 6.000 palavras, incluindo as legendas das figuras e as referências, e no máximo 5 tabelas e/ou figuras somados. No momento do envio da prova de impressão, caso isto ocorra o autor será consultado se prefere revisar o artigo para enquadrá-lo em até 7 páginas, ou se prefere pagar as páginas excedentes. O número de páginas de um artigo depende muito das figuras e tabelas do mesmo. Este critério não é aplicado aos artigos convidados, cujo número de páginas será informado ao autor no momento do convite.

Comunicações (“Short Communication”): são artigos completos, porém que relatam resultados mais curtos, oportunos, e/ou cuja relevância requer sua rápida publicação. Deverão ter a mesma qualidade dos artigos Originais porém, devido a seu caráter de comunicação preliminar, usualmente são de menor extensão. Este tipo de publicação deve ter no máximo quatro páginas impressas, incluindo todo o artigo, ou seja, tabelas, figuras e referências. O autor deve indicar claramente que se trata de uma comunicação no topo da primeira página do artigo.

Artigos de Revisão crítica: revisões críticas sobre uma area específica das técnicas cromatográficas e relacionadas são também consideradas para publicação. Esses artigos devem se limitar a no máximo 10.000 palavras, incluindo as legendas, e até 10 tabelas e figuras somadas. Os artigos de Revisão Crítica deverão antes de sua submissão serem discutidos com um dos co-Editores mais relacionados ao assunto em questão. Artigos não encaminhados desta forma serão antes enviados a um co-Editor da área em que se enquadre para parecer e, somente então, serão enviados aos revisores, podendo atrasar significativamente sua publicação. Devem conter uma contribuição nova a respeito de um assunto de grande interesse atual, discutindo as vantagens e desvantagens do mesmo. O Scientia não publica apenas relato de artigos descritos na literatura, sem uma discussão crítica sobre os mesmos.

Artigos de Alta Prioridade: são publicados no primeiro número disponível do periódico, recebendo prioridade máxima de todo o sistema Editorial do periódico. Para justificar sua publicação como alta prioridade, os manuscritos deverão apresentar, de forma resumida, resultados importantes de recentes desenvolvimentos na área de cromatografia e técnicas relacionadas (espectrometria de massas, preparo de amostras, eletroforese capilar e outros). Não precisam conter resultados experimentais detalhados, sendo limitados a 2.500 palavras e três figuras e/ou tabelas combinadas.

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Scientia Chromatographica 2015; 7(4)

Scientia Chromatographica Editor-in-Chief

Fernando Mauro Lanças

Universidade de São Paulo Instituto de Química de São Carlos 13560-970 São Carlos (SP) - Brasil editor@scientiachromatographica.com

Editores Associados

Maria Eugênia Queiroz Preparo de Amostras

Renato Zanella Preparo de Amostras

José Manuel F. Nogueira Preparo de Amostras

Isabel C. S. Fontes Jardim Cromatografia Líquida

CORPO EDITORIAL CONSULTIVO

Daniel Armstrong – EUA Dietrich von Bauer – Chile Fábio Augusto – Brasil Fátima Dutra – Brasil Flávio Leite – Brasil Frank Svec – EUA Harold McNair – EUA Humberto Gómez – México Isabel Cristina Sales Fontes Jardim – Brasil Jailson B. de Andrade – Brasil Janusz Pawliszyn – Canadá Kiyoratsu Jinno – Japão Luigi Mondello – Itália Marcos Eberlin – Brasil Marina Tavares – Brasil Milos Novotny – EUA Milton Lee – EUA Norberto Peporine Lopes – Brasil Phillip Marriott – Austrália Pierina Bonato – Brasil Quézia Cass – Brasil Renato Zanella – Brasil

ENDEREÇO DO PERIÓDICO

Scientia Chromatographica

Elena Stashenko Espectrometria de Massas

Fabio Augusto Cromatografia Gasosa

Alejandro Cifuentes Técnicas Eletroforéticas

Álvaro J. Santos Neto Troubleshooting

Rua Princesa Isabel, 265 - Jardim Paraíso 13.561-140 - São Carlos (SP) - Brasil Fone/Fax: (16) 3501-4140 karen.favaro@iicweb.org / info@iicweb.org www.scientiachromatographica.com

Ficha catalográfica elaborada pela Seção de Aquisição e Tratamento da Informação do SBI/IQSC Scientia Chromatographica / Associação Internacional de Cromatografia. - vol.7 n.3 (jul./set. 2015). São Carlos: Associação Internacional de Cromatografia, 2015 Trimestral ISSN 1984-4433 1. Cromatografia. 2. Lanças, Fernando Mauro, editor chefe.

Cláudia Zini Cromatografia Gasosa

Elina B. Caramão Cromatografia Gasosa

CDD 543.8

ISSN 1984-4433

www.scientiachromatographica.com

2015

Volume 7 | Número 4

SCIENTIA CHROMATOGRAPHICA

Publicação disponível na internet:

251 Determinação de nove fungicidas em suco de laranja por cromatografia líquida de ultra eficiência acoplada à espectrometria de massas tandem e extração mini-Luke

2015 | Volume 7 | Número 4

Jaqueline F. Reichert, Ionara R. Pizzutti, Jonatan V. Dias, Carmem D. Cardoso

261 Técnicas cromatográficas acessíveis para determinação de contaminantes fúngicos Eliana Badiale Furlong

275 Determinação de compostos organoalogenados em adubo orgânico empregando extração com auxílio de ultrassom e cromatografia gasosa com detecção por captura de elétrons Cristine Wickert, Martha B. Adaime, Renato Zanella

287 LC-MS/MS determination of chloramphenicol in food of animal origin in Brazil Letícia R. Guidi, Luiza H. M. Silva, Christian Fernandes, Nicki J. Engeseth, Maria Beatriz A. Gloria

297 Recentes avanços da microextração em fase sólida no tubo (in-tube SPME) e sua aplicação em análises ambientais e alimentícias Ana Lúcia de Toffoli, Fernando Mauro Lanças

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2015 | Volume 7 | Número 4

Instituto Internacional de Cromatografia

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