V7n3

ISSN 1984-4433

www.scientiachromatographica.com

2015

Volume 7 | Número 3

SCIENTIA CHROMATOGRAPHICA

Publicação disponível na internet:

157 Uma abordagem conceitual das técnicas miniaturizadas de preparo de amostra e suas aplicações na análise de resíduos e contaminantes em matrizes alimentares

2015 | Volume 7 | Número 3

Anderson Luigi Luiz, Edvaldo Vasconcelos Soares Maciel, Fernando Mauro Lanças

183 Microextração em gota única (SDME): fundamentos e aplicações Iohana Pinto de Pinto, Marcio Pozzobon Pedroso

199 Folate – Analytical properties, bioavailability and stability in foods Emmanuela Prado de Paiva, Marcella Melo Assis Costa, Clayton Anderson de Azevedo Filho

223 Derivados xantónicos quirais: aplicações em Química Medicinal e uma nova abordagem em Cromatografia Líquida Carla Fernandes, Maria Elizabeth Tiritan, Madalena M. M. Pinto

Rua Princesa Isabel, 265 - Jardim Paraíso São Carlos (SP) - CEP 13561-140 Fone/ Fax: (16) 3501-4140 | www.iicweb.org

2015 | Volume 7 | Número 3

Instituto Internacional de Cromatografia

Uma publicação do Instituto Internacional de Cromatografia www.iicweb.org

Scientia Chromatographica Editor-in-Chief

Fernando Mauro Lanças

Universidade de São Paulo Instituto de Química de São Carlos 13560-970 São Carlos (SP) - Brasil editor@scientiachromatographica.com

Editores Associados

Maria Eugênia Queiroz Preparo de Amostras

Renato Zanella Preparo de Amostras

José Manuel F. Nogueira Preparo de Amostras

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CORPO EDITORIAL CONSULTIVO

Daniel Armstrong – EUA Dietrich von Bauer – Chile Fábio Augusto – Brasil Fátima Dutra – Brasil Flávio Leite – Brasil Frank Svec – EUA Harold McNair – EUA Humberto Gómez – México Isabel Cristina Sales Fontes Jardim – Brasil Jailson B. de Andrade – Brasil Janusz Pawliszyn – Canadá Kiyoratsu Jinno – Japão Luigi Mondello – Itália Marcos Eberlin – Brasil Marina Tavares – Brasil Milos Novotny – EUA Milton Lee – EUA Norberto Peporine Lopes – Brasil Phillip Marriott – Austrália Pierina Bonato – Brasil Quézia Cass – Brasil Renato Zanella – Brasil

ENDEREÇO DO PERIÓDICO

Scientia Chromatographica

Elena Stashenko Espectrometria de Massas

Fabio Augusto Cromatografia Gasosa

Alejandro Cifuentes Técnicas Eletroforéticas

Álvaro J. Santos Neto Troubleshooting

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Ficha catalográfica elaborada pela Seção de Aquisição e Tratamento da Informação do SBI/IQSC Scientia Chromatographica / Associação Internacional de Cromatografia. - vol.7 n.3 (jul./set. 2015). São Carlos: Associação Internacional de Cromatografia, 2015 Trimestral ISSN 1984-4433 1. Cromatografia. 2. Lanças, Fernando Mauro, editor chefe.

Cláudia Zini Cromatografia Gasosa

Elina B. Caramão Cromatografia Gasosa

CDD 543.8

ISSN 1984-4433

Periódico Trimestral do Instituto Internacional de Cromatografia

2014 2015 | Volume 67 | Número 13

Uma publicação do Instituto Internacional de Cromatografia www.iicweb.org

SUMÁRIO

Editorial................................................................................................................................................................................................................155 Fernando Mauro Lanças

PREPARO DE AMOSTRAS Uma abordagem conceitual das técnicas miniaturizadas de preparo de amostra e suas aplicações na análise de resíduos e contaminantes em matrizes alimentares............................. 157 Anderson Luigi Luiz, Edvaldo Vasconcelos Soares Maciel, Fernando Mauro Lanças

PREPARO DE AMOSTRAS Microextração em gota única (SDME): fundamentos e aplicações................................................... 183 Iohana Pinto de Pinto, Marcio Pozzobon Pedroso

CROMATOGRAFIA LÍQUIDA Folate – Analytical properties, bioavailability and stability in foods................................................. 199 Emmanuela Prado de Paiva, Marcella Melo Assis Costa, Clayton Anderson de Azevedo Filho

CROMATOGRAFIA LÍQUIDA Derivados xantónicos quirais: aplicações em Química Medicinal e uma nova abordagem em Cromatografia Líquida......................................................................................................................................... 223 Carla Fernandes, Maria Elizabeth Tiritan, Madalena M. M. Pinto

Calendário de Cursos | 2016........................................................................................................................................................................238 Instituto Internacional de Cromatografia...............................................................................................................................................241 Biblioteca IIC......................................................................................................................................................................................................242 Normas para Publicação...............................................................................................................................................................................243

Scientia Chromatographica 2015; 7(3)

153

Scientia Chromatographica 2015; 7(3):155 Instituto Internacional de Cromatografia http://dx.doi.org/10.4322/sc.2016.001 ISSN 1984-4433

EDITORIAL

Mensagem do Editor Volume 7, Número 3

O V7N3 (volume 7, número 3) do Scientia inclui vários artigos nos quais são apresentadas e discutidas diferentes aplicações das técnicas cromatográficas, especialmente nas áreas de alimentos e medicamentos, duas áreas de importância vital para a saúde da população. Estes exemplos ilustram o amplo espectro de aplicações das técnicas cromatográficas e associadas (tais como a espectrometria de massas) as quais continuam evoluindo de forma acelerada.

Em se tratando da análise de amostras complexas, o preparo das amostras é uma etapa fundamental do procedimento analítico, e as técnicas miniaturizadas são novamente discutidas neste número em dois artigos: um artigo de revisão crítica discutindo o “estado-da-arte da Microextração em gota única (SDME)” e outro a “aplicação de Microtécnicas de preparo de amostras na área de alimentos”.

Outro fator importante é o aumento da diversificação regional dos autores, o que amplia a cobertura geográfica do periódico, com inclusão de artigos do exterior em praticamente todos os números recentes. Adicionalmente, o aumento no número de artigos submetidos na língua inglesa tem permitido uma maior internacionalização do Scientia.

Continuamos com nosso firme propósito de divulgar a cromatografia e técnicas associadas aos nossos leitores, sempre na expectativa de recebermos comentários construtivos que permitam a melhora do periódico.

Fernando M. Lanças Editor chefe

Scientia Chromatographica 2015; 7(3)

155

Scientia Chromatographica 2015; 7(1):156-156 Instituto Internacional de Cromatografia http://dx.doi.org/10.4322/sc.2015.000 ISSN 1984-4433

156

CLASSIFICAÇÃO

Scientia Chromatographica 2015; 7(1)

Scientia Chromatographica 2015; 7(3):157-182 Instituto Internacional de Cromatografia http://dx.doi.org/10.4322/sc.2016.002 ISSN 1984-4433

PREPARO DE AMOSTRAS

Uma abordagem conceitual das técnicas miniaturizadas de preparo de amostra e suas aplicações na análise de resíduos e contaminantes em matrizes alimentares Miniaturized sample preparation techniques and their application to the determination of residues and contaminants in food samples

Anderson Luigi Luiz Edvaldo Vasconcelos Soares Maciel Fernando Mauro Lanças* Universidade de São Paulo, Instituto de Química de São Carlos.

13560-970 São Carlos (SP) *flancas@iqsc.usp.br Recebido: 06 Jul 2015 Aceito: 17 Ago 2015

Resumo

Uma das etapas mais importantes na análise de resíduos e contaminantes (tais como pesticidas e medicamentos veterinários) em amostras complexas como alimentos é a denominada genericamente de preparo da amostra. Esta etapa da análise é crítica por envolver a extração dos analitos de interesse da matriz original, transferindo-a para um ambiente químico – geralmente um solvente - mais apropriado para sua determinação pela técnica a ser empregada. Adicionalmente, pode envolver outras ações tais como purificação do extrato (“clean-up”) visando a eliminação de interferentes; a concentração dos analitos; mudança de solvente para compatibilizar com o método analítico e outras.

Enquanto as técnicas clássicas de preparo de amostra envolviam diversas etapas, as técnicas miniaturizadas geralmente permitem a extração, “clean-up” e concentração dos analitos em uma única etapa. Adicionalmente, são simples para serem automatizadas e requerem pequena (ou nenhuma) quantidade de solventes poluentes durante toda a etapa de preparo da amostra. Este trabalho apresenta, de forma crítica, uma abordagem conceitual dessas técnicas, assim como de suas aplicações recentes na determinação de resíduos e contaminantes em amostras de alimentos.

Palavras-chave: Técnicas de extração miniaturizadas; preparo de amostra; análise de alimentos; resíduos e contaminantes em alimentos; segurança alimentar.

Abstract

One of the most important steps during the analysis of residue and contaminants (such as pesticides and veterinary drugs) is generically termed sample preparation. This step is critical because it involves the extraction of the target analytes from the original matrix and their transference to a more adequate chemical environment – usually a solvent – in order to facilitate their further determination. In addition, it may also involves aditional steps such as clean-up, aiming eliminating interfering compounds, concentration of the target analyts and back-extraction in more adequate solvents for further analysis.

While the classical sample preparation techniques use to involve several steps, modern miniaturized techniques may perform several tasks such as extraction, clean-up and analyts concentration in just one step. In addition, these techniques are easy to be automated and requires minute amounts of sample and solvents, a major advantage from both environmental and analyst health point of view. In the present work the fundamentals of these techniques will be reviewed as well as their recent applications in the determinantion of residue and contaminants in food samples.

Keywords: Miniaturized extraction techniques; sample preparation; food analysis; residue and contaminants in food samples; food safety.

Scientia Chromatographica 2015; 7(3)

157

Luiz AL, Maciel EVS, Lanças FM

1. Introdução

A determinação de resíduos e contaminantes em matrizes alimentares tem se tornado uma tarefa cada vez mais difícil devido ao nítido aumento na complexidade das amostras analisadas. Além dos resíduos tipicamente provenientes da aplicação de medicamentos veterinários (matrizes animais) e pesticidas (matrizes vegetais), resíduos de outras classes de analitos são também determinados nessas matrizes. Adicionalmente, contaminantes – propositais ou não – são detectados juntamente com adulterações visando a obtenção de benefícios comerciais. A presença desta vasta gama de compostos indesejáveis em alimentos tem tornado cada vez mais relevante a área de segurança alimentar (“food safety”), de maneira a disponibilizar à população alimentos com a qualidade necessária.

Devido à complexidade dessas matrizes e dos analitos a serem determinados, uma etapa de preparo de amostra torna-se mandatória nesta área. Apesar da existência de muitos métodos baseados em técnicas clássicas de extração para o preparo das amostras, como a Extração Líquido-Líquido (LLE), Sohxlet e Extração em Fase Sólida (SPE), os recentes apelos ambientais tem demandado sua substituição por micro-técnicas de preparo de amostras, as quais são menos agressivas ao meio ambiente e ao analista.

Miniaturização no preparo de amostras

realização de amostragem, isolamento e concentração em uma única etapa[2]. Nesta técnica uma fibra, usualmente de sílica fundida (Figura 1), recoberta com um filme fino de polímero, ou sólido adsorvente, é utilizada para extrair os analitos de interesse de uma matriz[3,4].

Após a extração, os analitos são desorvidos para dentro de um instrumento analítico[5,6]. Essa técnica pode ser hifenizada com as técnicas de separação como GC, HPLC e CE[7] e, por dispensar uso de solvente extrator, pode ser facilmente automatizada para desenvolvimento de métodos “high-throughput” de análise[3].

Dois diferentes modos de extração podem ser realizados utilizando a fibra de SPME (Figura 2).

Quando a fibra recoberta é mergulhada diretamente na amostra (Figura 2A), o modo é conhecido como imersão direta SPME (DI-SPME – “direct immersion solid-phase microextraction”). A fibra pode também ser exposta na fase gasosa acima da amostra (Figura 2B) conhecido como “headspace” SPME (HS-SPME – “headspace solid-phase microextraction”)[2]. A composição da matriz e as propriedades físico-químicas dos analitos de interesse são características importantes que devem ser levadas em conta na escolha do modo de extração a ser utilizado. Analitos com média a alta volatilidade ou baixa

O presente trabalho discute os princípios e utilização das técnicas mais modernas de preparo de amostras e sua utilização na análise de resíduos e contaminantes em alimentos.

2. Técnicas miniaturizadas de preparo de amostra 2.1. Microextração em fase sólida (SPME)

Uma das principais microtécnicas utilizadas no preparo de amostra para analise de resíduos e contaminantes em alimentos, denominada microextração em fase sólida (SPME – “solid-phase microextraction”), foi desenvolvida por Pawliszyn et al.[1] e se caracteriza por dispensar uso de solvente de extração e permitir a 158

Figura 1. O dispositivo de SPME. Scientia Chromatographica 2015; 7(3):157-182

Miniaturização no preparo de amostras

Luiz AL, Maciel EVS, Lanças FM

Figura 2. Principais modos de extração em SPME. A) HS-SPME, B) DI-SPME.

a média polaridade são usualmente analisados por HSSPME[3]. Matrizes complexas também são normalmente analisadas por HS-SPME uma vez que a amostra não entra em contato direto com a fibra, protegendo-a dos interferentes de alta massa molecular e prolongando seu tempo de vida útil[5,9]. Analitos com baixa a média volatilidade ou média a alta polaridade apresentam maior eficiência quando extraídos com imersão direta da fibra na amostra. Neste caso, os interferentes das matrizes complexas podem danificar a fibra. Uma alternativa é diluir a amostra antes de realizar a extração[3].

A extração dos analitos de interesse por SPME se dá pelo deslocamento das moléculas da amostra para a fase extratora até que seja atingido um equilíbrio de partição ou adsorção entre a fase extratora e o meio em que está exposta. Portanto, o tempo de extração deve ser o suficiente para atingir o equilíbrio, após o qual a quantidade de analito extraída será constante. A equação 1 mostra a relação entre o número de moles do analito extraído (nf) em função da constante de distribuição fibra-matriz (Kfm) e da headspacematriz (Khm). A descrição termodinâmica da SPME e sua discussão teórica é apresentada em várias revisões[3–5,8]. nf =

K fmV f CoVm K fmVm + K hmVh + Vm

(Eq. 1)

Nesta equação, Co é a concentração inicial do analito e Vf, Vm e Vh são volumes da fibra, matriz e do headspace, respectivamente. Como mostrado na equação 1, a eficiência de extração é dependente do coeficiente de distribuição matriz e fibra, o qual relaciona a seletividade da fibra em extrair o analito de interesse entre outros componentes da matriz[3]. Por isso, existem diversos tipos de fibras de SPME disponíveis comercialmente recobertas, com um material polimérico, podendo ser mistura deles ou não, possuindo diferentes polaridades, espessura e comprimento[3]. O mecanismo de extração dos analitos ocorre por absorção ou adsorção[2,3] respeitando o principio “similar dissolve similar”, ou seja, analitos de interesse e a fase que recobre a fibra de sílica devem ter polaridades parecidas. Sugestões de aplicações dos principais tipos de fibras e suas propriedades estão mostradas na Tabela 1. Apesar das fibras comerciais abrangerem uma grande faixa de compostos, elas possuem baixa estabilidade térmica, química e mecânica.

Por isso esforços focando desenvolvimento de novos materiais sorventes para suprir essas desvantagens utilizando tecnologia sol-gel[11–13], suporte de fio de aço inoxidável[14,15] e polímero molecularmente impresso (MIP-sigla em inglês)[16,17]. Líquidos iônicos também tem sido empregado como sorvente de recobrimento da fibra

Scientia Chromatographica 2015; 7(3):157-182 159

Luiz AL, Maciel EVS, Lanças FM

Miniaturização no preparo de amostras

Tabela 1. Caracteristicas das fibras empregadas em microextração e fase sólida.

Fibra

Composição química

Temperatura

Aplicação

PDMS

Polidimetilsiloxano

100 e 30 µm: 200-280 7 µm: 220-320

PA

Poliacrilato

220-300

PDMS/DVB

PolidimetilsiloxanoDivinilbenzeno

200-270

Analitos apolares, voláteis e semivolateis.

Compostos fenólicos, analitos polar semivolateis.

Analitos polares voláteis, aminas, compostos nitroaromaticos.

CAR/PDMS

Carboxen-polidimetilsiloxano

250-310

Gases e volateis.

GC

DVB/CAR/PDMS

Divinilbenzeno-carboxenpolidimetilsiloxano

230-270

Volateis e semivolateis.

Compostos C2-C20, fragâncias.

GC

CW-PEG

Carbowax-polietileno Glico

200-250

Analitos polares. Alcoóis.

GC/HPLC

de SPME para análise de pesticidas em amostras de água, porém recentemente alguns trabalhos vem mostrando seu potencial uso em matrizes alimentícias[2,18,19].

A DI-SPME e a HS-SPME são os dois modos de extração mais utilizados para análise de pesticidas em alimentos[2,3,5]. O desenvolvimento de um método utilizando essas técnicas possui diversas etapas e parâmetros a serem otimizados para que uma boa eficiência de extração seja alcançado[2]. Tipo de fibra, modo de extração. tempo de extração e dessorção, temperatura, sistema de separação e detecção, método de agitação, força ionica e pH da amostra, entre outros são parâmetros que devem ser otimizados baseados nas propriedades dos analitos de interesse e constituintes da matriz[2]. A otimização destes parâmetros é descrito amplamente na literatura[3,8–10]. A Tabela 2 mostra os principais trabalhos realizados utilizando SPME em analise de resíduos e contaminantes em alimentos.

Um método de extração utilizando HS-SPME acoplado a sistema de cromatografia gasosa com detector de captura de elétron (“GC-ECD”) foi desenvolvido por Kin e Huat[20] para determinar a presença de organofosforados e organoclorados em amostras de pepino e morango.

160

Instrumento GC/HPLC GC/HPLC GC/HPLC

Difenilamina é um composto antioxidante utilizado em frutas após suas colheitas para prevenir que estas sofram da síndrome da escaldadura superficial (“superficial scald”), um distúrbio fisiólogico que acarreta no escurecimento da casca durante a estocagem.

Sendo assim, Song et al.[21] usaram HS-SPME acoplado a um sistema GC-MS para a identificação de quantificação de tais compostos em maçãs.

Souza-Silva et al.[25] desenvolveram um método utilizando a técnica de DI-SPME acoplado a um cromatógrafo gasoso com detector por tempo de voo e espectrômetro de massas (“GC-ToF/MS”), para analisar a presença de fungicidas de triazol presentes em uvas e morango sem nenhum tratamento prévio, e compararam seus resultados com aqueles obtidos utilizando outra técnica de “clean-up” conhecida como “QuEChERS”.

Outra técnica utilizada, o HS-SPME acoplado a um cromatógrafo gasoso foi utilizado por Campillo et al.[30] para a determinação de sete compostos da classe dos organo-estânicos, em amostras de mel e vinho visando uma comparação entre detectores de emissão atômica e espectrometria de massas para a quantificação de tais compostos com propriedades fungicidas.

Scientia Chromatographica 2015; 7(3):157-182

Miniaturização no preparo de amostras

Luiz AL, Maciel EVS, Lanças FM

Tabela 2. Aplicações da SPME como técnica de preparo de amostra na análise de resíduos e contaminantes em alimentos.

Tempo Recobrimento Modo de de de extração fibra extração (min)

Analito

Matriz

DPA

Maçã

PA

“Headspace ”

Furano

Comidas enlatadas e em conservas

CAR/ PDMS

Pirimetanil/ Metil Crisoxime

Uva, morango, tomate, catchup

Furano

Desvio Padrão Separação/ Relativo detecção (%)

LDD

LDQ

60

0.13-0.72 pg.g-1

0.42-2.35 pg.g-1

1.54

GC-MS

[20]

“Headspace ”

30

8.0-70.0 pg.g-1

30.0-250.0 pg.g-1

6.0-10.0

GC-IT-MS

[21]

PA

“Headspace ”

25

1.80-3.10 ng.g-1

12.5-250.0 ng.g-1

7.4-15.0

GC-MS

[22]

Comidas chinesas enlatadas e em conservas

CAR/ PDMS

“Headspace ”

20

0.059 ng.g-1

0.175 ng.g-1

1.81-2.75

GC-MS

[23]

Isoforona

Comidas

PDMS/DVB

“Headspace ”

45

0.5 pg.mL-1

20 pg.mL-1

3.9-6.1

GC-MS

[24]

10 Triazóis

Uva, morango

PDMS/DVB

“Direct immersion ”

15

-

0.25-5.0 ng.g-1

4.0-20.0

GC-ToFMS

[25]

7 Estrubilurinas

Vegetais, cenoura, arroz, frango, carneiro

PDMS/DVB

“Direct immersion ”

40

1.0-30.0 pg.mL-1

3.0-100.0 pg.mL-1

2.3-8.4

GC-MS

[26]

7 Piretróides

Tomate, morango

PDMS/DVB

“Direct immersion ”

30

0.003-0.25 mg.kg-1

0.01-0.1 mg.kg-1

7.0-19.0

GC-MS

[27]

PDMS

“Headspace ”

30

0.01-1.0 µg.L-1

0.05-5.0 µg.L-1

0.1-4.7

GC-ECD

[28]

Grafeno/ Óxido de Grafeno

“Space Resolved ”

20

0.3-0.3 ng.L-1

1.0-250.0 ng.L-1

5.4-6.8

GC-MS

[29]

Multiclasses Morango, carambola, de goiaba, pepino, pesticidas tomate, “pakchoi ” TCA, DPB

Vinho

2.2. Microextração em fase sólida “no tubo” (“in-tube” SPME)

Em “in-tube” SPME uma coluna capilar de sílica fundida internamente recoberta ou preenchida com uma fase extratora é utilizada para realizar a extração dos analitos de interesse de uma amostra (Figura 3). O uso de coluna capilar aberta de sílica fundida foi relatada pela primeira vez por Burger e Munro em 1986[31] para realizar extração de compostos voláteis. Desde então, diversas fases extratoras tem sido desenvolvidas para melhorar a eficiência e especificidade das analises. O

Ref.

capilar pode ser recoberto internamente com um filme de polímero (Figura 3A) como no caso das colunas capilares de cromatografia em fase gasosa. Capilares de poli-éteréter cetona (PEEK) preenchidos com tubos de sílica fundida revestida interna ou externamente (Figura 3B) e colunas capilares empacotadas com sorventes extratores (Figura 3C) ou com com fase monolítica (Figura 3D) também são usados.

Uma alíquota da amostra é transportada para a coluna capilar a fim de realizar-se a extração dos

Scientia Chromatographica 2015; 7(3):157-182 161

Luiz AL, Maciel EVS, Lanças FM

Miniaturização no preparo de amostras

Figura 3. Fases extratoras para dispositivos de microextração em fase sólida no tubo (“in-tube” SPME).

analitos. Os analitos pré-concentrados são desorvidos utilizando um fluxo de fase móvel e introduzidos no cromatógrafo líquido para separação[33]. Tem sido utilizados em conjunto com esta técnica, detectores como UV, arranjo de diodos, fluorescência e de espectrometria de massas[34]. Essa técnica surgiu da necessidade de se encontrar uma alternativa para superar os problemas relacionados a automatizaçãodo acoplamento entre SPME e HPLC, especialmente devido a problemas com a fibra, tais como fragilidade, baixa capacidade de sorção e sangramento dos filmes espessos de fase extratoras[32].

No sistema “in-tube” SPME-LC normalmente utilizado, a coluna capilar de extração é colocada entre a seringa do injetor automático do LC e o loop de injeção.

Assim, é possível aspirar e dispensar a amostra no frasco dentro do injetor várias vezes até que o equilíbrio seja alcançado. A etapa é conhecida como ciclos aspirar/ dispensar[34]. Em seguida, os analitos são desorvidos e transportados para o instrumento analítico[10]. Uma outra possibilidade para montar o sistema “in-tube” SPMELC é conectar a coluna capilar a uma válvula de seis portas. A amostra passa pela coluna capilar na etapa de carregamento, seguida de uma limpeza da coluna com um solvente fraco para remoção dos interferentes.

Após a mudança na válvula para a posição de injetar, os analitos retidos são desorvidos por uma fase móvel ou um solvente de extração para serem separados no sistema de LC[32,33].

Parâmetros como velocidade de extração, volume e pH da amostra, tipo de fase estacionaria, diâmetro 162

interno da coluna capilar, comprimento e espessura do filme da coluna capilar influenciam na eficiência e seletividade da extração por “in-tube” SPME[33]. Para melhorar a eficiência da extração foram desenvolvidas variações no método utilizando, por exemplo, colunas capilares inseridas em fio de aço inoxidável também conhecida como “wire in-tube” SPME e também a “fiber-in-tube” SPME que utiliza colunas capilares empacotadas com polímeros heterocíclicos em tubos rígidos fibrosos (“fibrous rigid-rod heterocyclic polymers”)[33,35–37]. Materiais seletivos tem sido empregados como imunosorvente, polipirrol, MIPs, partículas de alquil-diol-sílica e RAM[33]. Colunas capilares monolíticas também foram desenvolvidas para aplicar em “in-tube” SPME acoplado a LC[38].

Aplicações de “in-tube” SPME para analise de resíduos e contaminantes em alimentos são mostradas na Tabela 3. Aplicando “in-tube” SPME juntamente com cromatografia líquida e detecção por arranjo de diodos, Wen et al.[39] desenvolveram um método para monitorar resíduos de tetraciclinas, presentes em músculo de peixes. Para monitorar outra classe de antibióticos, as sulfonamidas, Wen et al.[40] fizeram uso da mesma microtécnica (“in-tube” SPME), porém com cromatografia líquida acoplada a um detector ultravioleta para determinar os resíduos destes antibacterianos em leite comercial.

As quinolonas, caracterizadas por serem fármacos antimicrobianos sintéticos com largo espectro de ação, foram determinadas e quantificadas em diferentes tipos Scientia Chromatographica 2015; 7(3):157-182

Miniaturização no preparo de amostras

Luiz AL, Maciel EVS, Lanças FM

Tabela 3. Aplicações da “in-tube” SPME como técnica de preparo de amostra na análise de resíduos e contaminantes em alimentos.

Analito

Matriz

Fase

5 Fluoroquinolonas

Ovo, albumina

MAA-EGDMA

7 Quinolonas

Ovo, leite, MAA-co-EGDMA frango, peixe

Tempo Tempo de de extração eluição (min) (min)

LDD

LDQ

Recuperação Separação/ Ref. (%) Detecção

10

7

0.1-2.6 ng.g-1

0.4-8.6 ng.g-1

89-106

6

5

0.2-3.0 ng.g-1

0.6-10.0 ng.g-1

11.6-96.4

4 Fluoroquinolonas

Porco, frango

OFL-MIP

-

2

0.016-0.11 0.054-0.16 µg.L-1 µg.L-1

5 Sulfonamidas

Leite

MAA-EGDMA

16

12

1.7-22.0 ng.ml-1

4 Tetraciclinas

Peixe

MAA-EGDMA

16

6

4 Aflatoxinas

Nozes, cereais, frutas, temperos

Supel-Q PLOT

2 Ocratoxinas

Nozes, grãos

Carboxen-1006 PLOT

HPLC-FLD-UV

[41]

LC/ESI-QTOF-MS [38]

65.3-114.9

LC-FLD-UV

[42]

5.5-75.0 ng.ml-1

11.5-96.5

HPLC-UV

[40]

16-30 ng.g-1

53-100 ng.g-1

-

HPLC-DAD

[39]

25

2.1-2.8 pg.mL-1

0.05 ng.mL-1

82.6-109.1

LC-MS

[43]

30

0.089-0.092 ng.mL-1

0.5 ng.mL-1

88.8-94.6

LC/ESI-MS

[44]

de alimentos comestíveis como leite, ovos, frango e peixe, a partir de um método desenvolvido por Zheng et al.[38] utilizando “in-tube” SPME juntamente com cromatografia líquida acoplada a um detector quadrupolo por tempo de voo e um espectrômetro de massas (“LC-ESI-QTOF-MS”). Outra metodologia foi desenvolvida por Huang et al.[41] utilizando “in-tube” SPME, juntamente com cromatografia líquida e detecção por fluorescência e ultravioleta, para a determinação de resíduos de cinco antibióticos pertencentes a classe das fluoroquinolonas em amostras de ovos.

2.3. Extração sortiva em barra de agitação (SBSE)

Apresentando um mecanismo similar à SPME, a extração sortiva em barra de agitação (“Stir Bar Sorptive Extraction” – SBSE), foi desenvolvida em 1999 por Baltussen et al.[45]. Nesta técnica, a extração ocorre na superfície de uma barra magnética recoberta com uma espessa camada de polidimetilsiloxano (PDMS)[46]. Apesar de similar, essa técnica tem uma melhor capacidade de extração do que a SPME, uma vez

que a quantidade de fase extratora e a área superficial são maiores do que na fibra de SPME[47,48]. Os analitos são extraídos da amostra para o PDMS e, em seguida, a barra é retirada e os analitos são desorvidos termicamente para serem separados por GC (MS), ou desorvidos por meio de um líquido para serem transportados para o sistema de LC[46,48]. A barra magnética pode ser imersa diretamente na amostra ou no headspace dependendo da complexidade da matriz e das propriedades dos analitos de interesse.

Assim como a SPME, a SBSE também depende do coeficiente de partição dos analitos entre a matriz e a fase extratora. A técnica é melhor utilizada para compostos de baixa polaridade uma vez que esses são compostos tem interações mais fortes com o PDMS. Compostos com alta polaridade têm interações hidrofóbicas baixas e, portanto, baixa recuperação[50,51]. Uma alternativa para superar essa limitação é utilizar derivatização “insitu”[52] ou usar outras fases como RAMs, adsorventes de carbono, líquidos iônicos, materiais de duas fases,

Scientia Chromatographica 2015; 7(3):157-182 163

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monolitos porosos, polímero molecularmente impresso (MIPs), membranas microporosas e recobrimento preparado a partir da tecnologia sol-gel[52–64], permitindo a analise de maior variedade de analitos de matrizes complexas[51]. O longo tempo de dessorção dos analitos é uma outra limitação da técnica. Devido ao grande volume de fase extratora, o tempo de dessorção típico é superior a 10 minutos, aumentando a possibilidade de haver perda de analito e contaminação com interferentes[46,65].

Um sistema de dessorção térmica (“Thermal Desorption Unit” – TDU) aquece a barra magnética para realizar a dessorção dos analitos, seguido de um resfriamento para concentrar o analito antes de injetar no GC, é normalmente utilizado para superar o problema[46,49].

Os parâmetros que devem ser otimizados para alcançar uma extração eficiente, alta recuperação e fator de enriquecimento e baixos limites de detecção num desenvolvimento de método usando SBSE são os mesmos otimizados no SPME. Tipo, volume e tamanho do recobrimento da barra magnética, pH e força iônica da amostra, tempo e temperatura de extração, volume e velocidade de agitação da amostra[46,49,65]. A técnica foi aplicada com sucesso para determinar a presença de pesticidas em diversos tipos de frutas e vegetais utilizando a técnica de SBSE “stir bar sorptive extraction” com dessorção térmica com cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas[66]. Assim, Pereira et al.[67], utilizaram a técnica de extração por sorção em barra de agitação (SBSE) com dessorção líquida para determinar resíduos de vinte pesticidas organoclorados em amostras de nove diferentes vegetais, utilizando cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas (GC-MS).

Acoplando cromatografia líquida com detecção por arranjo de diodos (LC-DAD) e extração por sorção em barra de agitação (SBSE), Campillo et al.[68] desenvolveram um método para a determinação de fungicidas (estrobilurinas) em amostras de laranja, maçã, pera, uva, limão, pêssego e ameixa. Vinãs et al.[69] compararam dois novos métodos de preparo de amostra, SBSE “stir bar sorptive extraction” e MASE 164

Miniaturização no preparo de amostras

“membrane-assisted solvent extraction”, na extração de seis compostos fungicidas (oxazoles) em amostras de suco e vinho, acoplando a técnica de preparo de amostra à cromatografia líquida de alta performance com detector UV-vis (UPLC-UV). Outras aplicações da técnica se encontram na Tabela 4.

Uma variação da SBSE, a Microextração adsortiva em barra (BAμE), foi desenvolvida por Neng et al.[78].

Este consiste em utilizar-se uma barra como suporte para a fase extratora menor (18 mm em comprimento e 3 mm em largura) do que a barra utilizada na SBSE normal (10‑40 mm em comprimento). A barra é construída a base de polipropileno e tem baixa densidade, o que permite uma extração por flutuação. Com isso a barra pode flutuar abaixo do vortex formado pela agitação da amostra (Figura 4) melhorando a difusão dos analitos do “bulk” da matriz até a interface com o sorvente para que possam ser mais eficientemente extraídos. Além disso, o contato da barra com o fundo do frasco é evitado e, desta forma, a degradação mecânica das partículas do sorvente é menor e seu tempo de vida maior. A técnica tem demostrado ser estável e reproduivel para ser utilizada como alternativa para análise residual em análise de rotina[79]. Essa técnica tem sido mais utilizada para análise em matrizes aquosas[80–82] mas seu potencial em alimentos e matrizes sólidas tem sido explorado recentemente[83].

2.4. Microextração em sorvente empacotado (MEPS):

Microextração em sorvente empacotado (“Microextraction by packed sorbent” – MEPS) é uma miniaturização da extração em fase sólida (“solid-phase extraction” – SPE) desenvolvida recentemente por Mohamed Abdel-Rehim[84]. A fase extratora (1-2 mg) é colocada dentro do corpo de uma seringa de 100 μL, 250 μL ou 500 μL ou dentro de um cartucho localizado entre a agulha e o corpo da seringa (Figura 5) de forma que o método pode ser totalmente automatizado[2]. Os sorventes mais utilizados são a base de sílica (C2,C8,C18) e de troca catiônica, enquanto que, polímeros a base Scientia Chromatographica 2015; 7(3):157-182

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Tabela 4. Aplicações da SBSE como técnica de preparo de amostra na análise de resíduos e contaminantes em alimentos.

Analito

Matriz

SB fase

Tempo de extração (min)

15 HPA’s

Camarão, ostra, corvina

Tenax® TA Adsorbent tube (Supelco, Bellefonte PA, USA)

90

0.02 µg. kg-1

0.06 µg. kg-1

65-138

GC/MS

[70]

6 PEN´s

Leite, mel

PDMS (Gerstel (Mullheim an der Ruhr, Germany)

180

0.23-2.66 / 0.18-1.42 ng.kg-1

0.76-8.88 / 0.59-4.75 ng.kg-1

40.1-105.1

GC-MS/FID

[71]

4 BF’s

Bebidas e vegetais (enlatados)

PDMS*

180

0.90-1.70 ng.kg-1

3.10-5.70 ng.kg-1

86-122

GC-MS

[72]

4 ETC´s

Frango, porco

PDMS/β-CD/DVB

20

0,27-1,60 µg.L-1

-

74.5-118.9 / 69.8-109.8

HPLC-UV

[73]

7 ETB´s

7 frutas

PDMS*

20

0.30-2.00 ng.g-1

0.90-6.70 ng.g-1

80-105

HPLC-DAD

[68]

20 OCP´s

9 vegetais

PDMS*

180

0.04-44.50 µg. kg-1

-

10-110

GC-MS

[67]

4 NIT´s

Mel

PDMS*- MADB - VPED

180

0.47-1.52 µg. kg-1 1.54-5.00 µg. kg-1

71.1-114

HPLC-DAD

[74]

10 SF´s

Frango, porco

VPMB

120

2.00-14.6 / 6.60-48.7 / 1.20-6.10 ng.kg-1 4.00-20.30 ng.kg-1

55.2-109.1 / 62.4-109.9

HPLC-MS/MS

[75]

46 VOC´s

Açafrão

PDMS*

840

0.04-1.15 µg. kg-1 0.13-3.83 µg. kg-1

75,2-124

GC-MS/MS

[76]

15 HPA´s

Chá mate

PDMS*

120

24.2-87

HPLC-FLD

[77]

LDD

LDQ

0.10-8.90 ng.L-1

0.30 - 29.7 ng.L-1

Recuperação Separação/ (%) Detecção

Ref.

de poliéster também tem sido usados em analises de resíduos. Polímeros molecularmente impressos (MIP) tem sido desenvolvidos para obter maior sensibilidade nas analises em relação aos sorventes comuns[85].

Figura 4. Microextração adsortiva em barra (BAµE): Um conceito analítico inovador para microextração estática. 1: Vortex; 2: Dispositivo de BAµE; 3: Amostra; 4: Barra de agitação magnética. Adaptado de Nogueira[79].

As mesmas etapas presentes em SPE convencional estão presentes no MEPS. Elas são: aspiração da amostra, lavagem do sorvente, eluição da amostra e limpeza do sorvente[86]. A amostra pode ser aspirada uma ou mais vezes para dentro da seringa; ao passar pela fase extratora os analitos serão adsorvidos. Em seguida o cartucho deve ser lavado para remoção dos interferentes e os analitos são eluídos com um solvente (20-50 µL) e injetados em um instrumento analítico. Antes de iniciar a extração da próxima amostra, o cartucho deve ser lavado

Scientia Chromatographica 2015; 7(3):157-182 165

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Figura 5. Seringa utilizada em MEPS e câmara onde o sorvente é empacotado.

com o solvente de lavagem e o solvente de eluição[85].

Alta eficiência de extração, melhor sensibilidade e baixo limite de detecção podem ser alcançados otimizando parâmetros como natureza do sorvente utilizado, tipo e volume do solvente de eluição e lavagem, e número de ciclos de extração[86–88]. Essa técnica já foi usada para análises de pesticidas em amostras de água[89,90]. Apesar de não ser ainda muito explorada, é uma técnica promissora para analise destes contaminantes em alimentos[2].

Salami e Queiroz[91], desenvolveram um método aplicando a microextração em sorvente empacotado, juntamente com cromatografia líquida e detecção de arranjo de diodos (MEPS-LC-DAD), para a determinação de seis diferentes sulfonamidas presentes em claras de ovos. Assim como, Du et al.[92] utilizaram MEPS em conjunto com cromatografia líquida com detecção ultravioleta (HPLCUV) para desenvolver e validar um método capaz de analisar traços de ractopamina em urina e músculo suíno.

Du et al.[93] obtiveram um preparo de amostra seletivo combinando superfície polímeros molecularmente impressos (SMIPs - “surface molecularly imprinted polymers”) com o “MEPS” para analisar resíduos de clembuterol em tecidos suínos. Os analitos foram determinados utilizando um cromatografo líquido acoplado a um espectrômetro de massas (HPLC-MS).

Diferentemente dos métodos descritos anteriormente, Leça et al.[94], utilizaram microextração 166

Miniaturização no preparo de amostras

em sorvente empacotado acoplando diretamente a um sistema de cromatografia gasosa com detecção por espectrometria de massas (MEPS-GC-MS), para determinar traços de carbamato de etila (agente cancerígeno) em amostras de vinho. Além deste método, Salami e Queiroz[95] foram responsáveis pela utilização de MEPS na determinação residual de 22 pesticidas presentes em amostras de mel, utilizando um sistema automatizado de microextração em sorvente empacotado acoplado a um cromatografo gasoso com detecção por espectrometria de massas (MEPS-GC-MS). Outras aplicações desta técnica são mostradas na Tabela 5.

2.5. Microextração em fase líquida (LPME)

Microextração em fase líquida (LPME – “liquid-phase microextraction”) é uma técnica que utiliza microlitros de solvente imiscível em água (fase extratora) para extrair os analitos de interesse de uma matriz aquosa (fase doadora)[2,98], o que permite uma redução no consumo de solvente orgânico utilizado para fazer a extração quando comparada a extração em fase líquida convencional (LLE). Esse pequeno volume de fase extratora utilizado em relação ao volume da amostra também permite que altos fatores de enriquecimento sejam alcançados[99]. Existem diversas variações da LPME, usualmente divididas em três categorias: microextração em gota suspensa (SDME – “singledrop microextraction”), microextração dispersiva em fase líquida (DLLME – “dispersive liquid–liquid microextraction”) e microextração em fase líquida com fibras ocas (HF-LPME – “hollow-fiber” LPME)[2,98,100].

No desenvolvimento de métodos para analises de contaminantes utilizando a técnica de LPME alguns parâmetros devem ser otimizados. O mais importante é a seleção do solvente orgânico, que deve ser de alta pureza, pouco volátil e ter alto ponto de ebulição.

Assim a evaporação que poderia causar a concentração do analito é evitada. Além disso, o solvente deve ser imiscível com a fase aquosa. Os outros parâmetros são agitação da amostra, volume do solvente orgânico e adição de sal[2].

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Tabela 5. Aplicações da MEPS como técnica de preparo de amostra na análise de resíduos e contaminantes em alimentos.

Ciclos de extração

LDD

Matriz

Sorvente

5 ácidos hidroxibenzóicos 5 ácidos hidroxicinâmicos

Vinho

C8

5x250 µL 0.01-0.2 µg mL-1

0.03-0.7 µg mL-1

77-100

UHPLC-PDA

[96]

4 derivados furânicos

Vinho

C8

3x200 µL 4.50-285.2 ng.L-1 14.9-950.5 ng.L-1

74-99

UHPLC-PDA

[97]

22 pesticidas multi classes

Mel

M1

4x250 µL

2.50-10.0 ng.g-1

75.0-100.0 ng.g-1

82-114

GC-MS

[95]

Carbamato de etila

Vinho

C8

300 µL

1.50 µg L-1

4.50 µg L-1

97-106

GC-MS

[94]

Ractopamina

Músculo suíno e urina

M1

10x100 µL

0.003 µg mL-1

0.01 µg mL-1

82.0-91.6

HPLC-UV

[92]

Clenbuterol

Tecido suíno

SMIPs

25x300 µL

0.009 µg. kg-1

0.02 µg. kg-1

86.5-91.2

HPLC-UV

[93]

6 sulfonamidas

Ovo

M1

4x250 µL

-

30.0-300.0 ng.g-1

94-111

LC-DAD

[91]

2.5.1. Microextração em gota suspensa SDME A microextração em gota suspensa foi desenvolvida por Liu e Dasgupta[101] utilizando uma microgota (normalmente 0.5–3 μL) como fase aceptora, suspensa na ponta de uma seringa, e constituída por um solvente orgânico imiscível com a amostra[7,100]. Essa microgota pode ser imersa dentro da fase doadora (DI-SDME – “direct imerson single drop microextraction”), na qual é mais utilizada para analitos de baixa e média polaridade[100], ou suspensa no headspace (HS-SDME – headspace sigle drop microextraction), utilizado para anlitos voláteis ou semi-voláteis[99] (Figura 6). Os analitos, presentes na amostra, são extraídos por difusão entre a microgota e a amostra[7], então o solvente é recolhido através da seringa e encaminhado para sistema de GC, HPLC ou CE. O consumo de solvente da SDME é 99% menor quando comparado com o consumo da técnica de extração liquido-liquido tradicional[7].

LDQ

Recuperação Separação/ (%) detecção

Analito

Ref.

A instabilidade da gota prejudica a repetibilidade da extração e, portanto, a escolha correta do solvente é fundamental. Solventes com alta volatilidade não são estáveis, enquanto que solventes com alto ponto de ebulição limitam a aplicabilidade da técnica. Os solventes normalmente utilizados nesta técnica são acetato de octila, álcool isoamílico, undecano, octano nonano e etilenoglicol[7]. O sistema de extração com duas fases é o mais utilizado no preparo de amostra por SDME. Neste sistema, os analitos são extraídos de uma fase aquosa para um solvente orgânico. Mas, um sistema de extração trifásico também é possível. Neste caso os analitos são extraídos da fase aquosa para a fase orgânica e retro-extraídas (“back-extracted”) para uma nova fase aquosa permitindo uma extração de analitos hidrofílicos por alteração no pH entre as fases doadoras e extratoras[7].

A utilização da técnica para análise de resíduos e contaminantes em alimentos é mostrada na Tabela 6. O modo de extração de imersão direta (DI-SDME) é mais

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A)

B)

Figura 6. Modos de extração de SDME. A) Headspace (HS-SDME). B) Imersão direta (DI-SDME).

utilizado em analise de pesticidas em alimentos[98,102–106].

Utilizando SDME, Zhang et al.[104] criaram uma metodologia para a extração de nove compostos organoclorados pesticidas em amostras de legumes como repolho, repolho chinês e couve flor, utilizando cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas para a confirmação e quantificação dos analitos.

Amvrazi e Tsiropoulos[103] otimizaram um método online de SDME acoplado a cromatografia gasosa com detecção por espectrometria de massas (SDME-GC-MS), para determinar resíduos de vinte diferentes pesticidas em amostras de uvas e maças.

Aplicando uma variação da microtécnica em questão (SDME), Liu e Min[105] desenvolveram uma técnica que denominaram de DSDME (“directly suspended droplet microextraction”) para extrair e pré concentrar compostos organoclorados e piretrinas em amostras de chá com posterior análise e determinação através de cromatografia gasosa com detector por captura de elétrons (CG-ECD).

168

2.5.2. Microextração em fase líquida com fibras ocas Pedersen-Bjergaard e Rasmussen[116] basearam-se nos conceitos de extração líquido-líquido em membrana microporosa e a extração líquida suportada em membrana para desenvolver a microextração em fase líquida com fibras ocas (“hollow fiber liquid-phase microextraction” - HF-LPME)[117]. A técnica consiste em usar uma fibra polimérica porosa e oca com seus poros e interior preenchidos com um solvente orgânico[2]. Assim, a fibra atua como uma barreira física entre as fases[65], além de ser um suporte para o pequeno volume de solvente de extração utilizado na técnica[2]. A fibra utilizada é composta de polipropileno com 70% da superfície porosa, diâmetro interno de 600 µm e tamanho de poro de 0,2 µm. Quando a fibra é preenchida com o solvente e inserida dentro da amostra por uma seringa, o modo de extração é conhecido como estático. Quando a fibra é conectada a uma seringa que está conectada a uma bomba programada, o modo de extração é denominado Scientia Chromatographica 2015; 7(3):157-182

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Tabela 6. Aplicações de SDME como técnica de preparo de amostra na análise de resíduos e contaminantes em alimentos.

Amostra

Analitos

Modo de SDME

Solvente de extração

Técnica analitica

Lod (µg/L)

Ref.

Chá

21 OCPs, pesticidas piretrorides

DSDME

Isooctano (100 µL)

GC-ECD

0,04-1

[105]

Suco de laranja

7 OPPs

DI-SDME

Tolueno (1,6 µL)

GC-FPD

0,98-2,2

[107]

Suco de uva

2 pesticidas triazol

DI-SDME

Hexanol, hexano (1:1 v/v) (30 µL)

GC-FID

2

[108]

Sucos, mostos, frutas enlatadas e frutas secas (pêssego, pêssego e uva, maçã, pera, laranja, abacaxi e cenoura)

7 estrobilurina, 6 fungicida oxazole

DSDME

Octanona, undecanona (1:1 v/v) (10 µL)

GC-MS

0,01-0,31

[109]

Suco de frutas (maçã, pera e laranja).

6 OPPs

DI-SDME

Tolueno (1,5 µL)

GC-FID

0,21-056

[110]

Frutas (maçã e uva)

20 pesticidas multiclasse

DI-SDME

Tolueno (1,6 µL)

GC-MS

Maçã: 0,4-200 Uva: 0,3-200

[103]

Morango e pepino

8 OCPs, OPPs

HS-SDME

Tolueno (1,5 µL)

GC-ECD

1-1000

[111]

Tomate e aboborinhas

13 pesticidas multiclasse

DI-SDME

Tolueno (1,6 µL)

GC-NDP e GC-µECD

NPD: 0,6-30 µECD: 0,03-5.38

[102]

Couve-flor, repolho chinês

9 OCPs

DI-SDME

Xileno:acetona (8:2 v/v) (1 µL)

GC-MS

50-200

[104]

Vinho

6 pesticidas

DI-SDME

Isooctano (2 µL)

GC-MS

0,0030-0,045

[106]

Vinho tinto

4 fungicidas

DI-SDME

Xileno (1,6 µL)

GC-µECD

6,4-9,4

[112]

Tomate

12 pesticidas multiclasse

DI-SDME

Touleno (1,6 µL)

GC-µECD

4-2450

[113]

Chá

11 OCPs, 2 pesticidas piretróides

DI-SDME

N-hexano/ acetato de etila (2:1 v/v) (4 µL)

GC-ECD

0,001-0,0012

[114]

Peixe-dourado

3 OCPs

DI-SDME

Tolueno (0.6 µL)

GC-MS

0.5

[115]

dinâmico, uma vez que retira e preenche o interior da fibra com uma nova fase receptora[100,118].

(fase extratora). Também é possível realizar uma

O sistema de extração pode ser realizado com duas fases, na qual tanto os poros quanto o interior da fibra são preenchidos com um solvente orgânico e a extração ocorre a partir da fase aquosa (fase doadora) passando pelos poros e alcançando o solvente orgânico

solvente orgânico nos poros e o interior da fibra contem

extração com três fases, na qual é impregnado um uma fase aquosa (fase extratora). Assim, os analitos são extraídos da fase aquosa (fase doadora) passando pelo solvente orgânico impregnado nos poros para uma outra fase aquosa (fase extratora) dentro da fibra[119].

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A)

B)

Figura 7. Representação esquemática das formas de arranjar a fibra oca durante a extração utilizando LPME. A) Configuração em “U”. B) Configuração tipo “haste” (“rod-like”).

A fibra oca pode ser inserida na amostra por duas configurações diferentes como mostrado na Figura 7. Na configuração em U, cada extremidade da fibra é conectada a ponta de agulhas diferentes como mostrado na Figura 7. Já na configuração tipo haste (“rod-like”), apenas uma extremidade da fibra é conectada a ponta da agulha, como mostrado na Figura 7, sendo possível conectar a fibra diretamente na agulha da seringa[119].

Dentro das vantagens da técnica, uma é o fato da possibilidade de se inserir grandes volumes de solventes orgânicos dentro da fibra oca, o que aumenta a eficiência de extração. Além disso, os poros das fibras funcionam como filtro para moléculas de grande massa molecular[2]. A técnica HF-LPME foi usada com sucesso para extração de pesticidas organoclorados em amostras de tomate, morango e água, juntamente com cromatografia gasosa com detecção por captura de elétrons (“GC-ECD”)[121].

Bedendo et al.[122] desenvolveram e aplicaram um 170

método utilizando extração líquid—líquido em membrana de filme oca microporosa (HF-LLME – “hollow fiber microporous membrane liquid-liquid extraction”) para a extração simultânea de dezoito pesticidas presentes em suco de laranja natural e industrializado. Foi utilizada a cromatografia líquida acoplada com espectrometria de massas (HPLC-MS/ MS) para a determinação dos compostos em questão.

Sete diferentes pesticidas em amostras de pepino foi determinada por Wanga et al.[123] utilizando “HFLPME” juntamente com cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a espectrometria de massas (“UHPLC-MS/MS”). Por fim um trabalho, feito por Sanagi et al.[124], foi desenvolvido para a extração de pesticidas organofosforados em amostras de tomate, repolho e convólvulo (uma espécie de planta) com posterior análise por cromatografia gasosa com detector por captura de elétrons (“GC-ECD”). Outros trabalhos são mostrados na Tabela 7.

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Tabela 7. Aplicações da HF-LPME como técnica de preparo de amostra na análise de resíduos e contaminantes em alimentos.

Condições Técnica de extração analítica

Amostra

Analito

Hollow fiber

Solvente de extração (volume)

Chá verde

6 OSPs

Q3/2 Accurel PP-HFM (660 µm I.D., 200 µm espessura, 0,64 µm pore size) LM: o-xileno

o-xileno (5 µL)

1200 rpm, 25ºC, 35 min

6 OCPs

Q3/2 Accurel PP-HFM (660 µm I.D., 200 µm espessura, 0,2 µm pore size) LM: 1-octanol

Suco de laranja

3 fungicidas

Q3/2 PP-HFM (1200 µm I.D., 200 µm espessura, 0,2 µm pore size) LM: 2-octanone

Suco de laranja

Folhas de chá verde, chá

Uva

LOD (µg/L)

Ref.

GC-FPD

1,15-48,48

[125]

1-octanol (3 µL)

800 rpm, 35ºC, 40 min

GC-ECD

0,029-0,18

[126]

10 nM HCL (20 µL)

1000 rpm, 30 min

LC-MS

≤0,1

[127]

Tolueno:acetato de etila Q3/2 Accurel PP-HFM (660 µm (85:15, v/v) (400 µL) 18 pesticidas I.D., 200 µm espessura, 0,2 µm Dessorção realizada com ultrasom multiclasse pore size) LM: tolueno:acetato usando metanol:acetona de etila (85:15, v/v) (1:1 v/v) (50 µL)

35 min, 25ºC

LC-MS/MS

3-330

[122]

SiO­2 fibra oca (380 µm I.D., 25 pesticidas 100 µm thickness) preparada multiclasse por SiO2 sol method

50ºC, 50 min

GC-MS

0,9-8,4

[128]

59ºC, 60 min

GC-ECD

1,53-12,77

[121]

0,01-0,31

[123]

Morango, tomate

12 OCPs

Pepino

7 pesticidas multiclasse

Tomate, repolho e convolvulus (planta)

2 OPPs

Dessorção por ultrasom, acetato de etila 30 mim, (200 µL)

Q3/2 Accurel PP-HFM 1-octanol (20 µL) Dessorção (660 µm I.D., 200 µm espessura, sem agitação tolueno: 0,2 µm pore size) LM: 1-octanol hexano (60:40 v/v)(30 µL) PVDF (0,8 mm I.D., 0,16 µm Clorofórmio (32 µL) pore size, 0,82 porosidade de Deorption com ultrasom membrane) LM: clorofórmio metanol:água (1:1 v/v) (1 mL)

300 rpm, UHPLE-MS/ 25 ºC, MS 20 min

Q3/2 Accurel PP-HFM (660 µm I.D., 150 µm espessura, 0,2 µm pore size) LM: n-dodecano

n-dodecano (3 µL)

1360 rpm, 30 min

GC-ECD

120 (clorpirifós) [129] 99 (profenofós)

Melancia, leite

Q3/2 Accurel PP-HFM (660 µm 6 pesticidas I.D., 200 µm espessura, 0,2 µm triazinas pore size) LM: 1-octanol

1-octanol (6 µL)

1000 rpm, 30 min

HPLC-UV

0,18-0,30

[130]

Tecido de peixe

8 OPPs

PVDF (1,2 mm I.D., 0,2 µm pore size, 200 µm espessura) LM: o-xileno

o-xileno (30 µL)

500 rpm, 30 min

GC-MS

2,1-4,5

[131]

Vinho

6 OCPs

Q3/2 PP-HFM (660 µm I.D., 200 µm espessura, 0,2 µm pore size) LM: n-tetradecano

n-tetradecano

600 rpm, 25ºC, 30 min

GC-MS\MS

0,0012

[132]

Bebidas alcolicas

50 pesticidas

Q3/2 PP-HFM (660 µm I.D., 200 µm espessura, 0,2 µm pore size) LM: 1-octanol

Dessorção: Metanol 30 rpm, 5 min, agitador rotativo (1,5 mL).

Sorption UHPLC-MS/ 90 rpm, MS 45 min

0,01-2

[133]

Pepino, tomate e pimenta

50/280 Accurel PP polypropyl23 pesticidas ene hollow fiber tubing multiclasse (50 µm wall thickness, 280 µm i.d., 0.1 µm pore size)

0.06–2.7

[134]

Orgânico: éter hexílico com 1% de TOPO aceptora: 20% of methanol em 100 mM de HCl

40 osc/min, 60 min

LC-MS

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2.5.3. Microextração líquido-líquido dispersiva

Desenvolvida recentemente por Rezaee et al.[135], a técnica de microextração líquido-líquido dispersiva (DLLME, do inglês “Dispersive Liquid-Liquid Microextraction”) é realizada em duas etapas. Na primeira etapa uma mistura dos solventes de extração e de dispersão são adicionados rapidamente na amostra aquosa que contem os analitos de interesse. A turbulência causada dispersa o solvente de extração em pequenas gotas pela amostra[136,137]. Uma das vantagens da técnica é que o tempo de extração é quase instantâneo devido a alta área

superficial das gotas a extração ocorre rapidamente[138]. A segunda etapa é a centrifugação da solução. O solvente de extração sedimentado após a centrifugação, deverá ser transferido para um frasco (vial) para ser analisado[136].

A escolha do solvente de extração e dispersão e o volume utilizado de cada um são parâmetros que afetam diretamente a eficiência da extração. O solvente de extração deve ser imiscível na água, ter boa capacidade de extração dos analitos e densidade maior do que da água[137,139]. Com alta densidade[137], os solventes normalmente utilizados

Tabela 8. Aplicações da DLLME como técnica de preparo de amostra na análise de resíduos e contaminantes em alimentos.

Analito

Matriz

Técnica

Solvente de extração

Dispersante

Técnica analítica

LOD (µg/kg)

Ref.

13 pesticidas

Tomate

DLLME

400 µL clorofórmio

1 mL acetonitrila

HPLC-DAD

1,7-45

[156]

39 pesticidas

Ginseng

DLLME

100 µL clorofórmio

1 mL acetonitrila

UHPLC-MS/MS

0,01-1,0

[157]

5 inseticidas neonicotinóides

Mel

DLLME

100 µL clorofórmio

1,5 mL acetonitrila

HPLC-DAD HPLC-MS/MS

Deoxinivalenol

Farinha de trigo

DLLME

0,25 mL clorofórmio

0,8 mL acetonitrila

HPLC-DAD

50-1,0

[159]

3 compostos citocinina

Frutas e vegetais

DLLME

250 µL 1,2-dicloroetano

1,5 mL acetonitrila

LC-ESI-TOF-MS

0,1-20

[160]

7 inseticidas neonicotinóides

Mel

DLLME

2,0 mL diclorometano

0,5 mL acetonitrila

LC-MS/MS

0,5-1,0

[146]

5 lactonas macrocíclicas

Leite

DLLME

200 µL clorofómio

2 mL acetonitrila

HPLC-DAD LC-MS/MS

0,1-2,4

[161]

Benzoato e sais de sorbato

Iogurte

DLLME

60 µL 1-octanol

450 µL etanol

HPLC-DAD

0,06-0,15

[162]

19 pesticidas

Tomate e pepino de estufa

DLLME

Tetracloreto de carbono

Extrato de QuEChERS

LC-MS/MS

3,4-10,4

[163]

7 inseticidas neonicotinóides

Grãos: arroz integral, milho, milheto e aveia

DLLME

2 mL clorofómio: diclorometano (1:1)

1 mL extrato de acetonitrila

HPLC-DAD

2-5

[149]

Ocratoxina A

Cereal

pH-DLLME

1: 400 µL tetracloreto de carbono 2: 150 µL dibromometano

1 mL extrato de metanol

HPLC-FLD

0,019

[148]

6 OPPs

Maçã e pêra

IL-based VA-DLLME

50 µL [C8MIm][PF6]

1 mL metanol

HPLC-DAD

2-100

[164]

Sucos de frutas IL-DLLME

60 µL [C6MIm][PF6]

0,50 mL metanol

HPLC-DAD

3,1-10,2

[165]

200 µL 2-etil-1-hexanol

50 µL acetona

HPLC-UV

0,9-2,5

[150]

7 fungicidas

2 antioxidantes Suco de frutas fenólicos sintéticos 172

DLLME

DAD: 0,2-1 [158] MS:0,02-0,13

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são tetracloreto de carbono[140–142], clorofórmio[143–145], diclorometano[146] e tetracloroetano[147]. Também podem ser usadas misturas de solventes orgânicos para realizar a extração de analitos, como tetracloreto de carbonodibromometano[148] e clorofórmio-diclorometano[149]. O volume do solvente de extração deve ser otimizado para alcançar um alto fator de enriquecimento. Além disso, quanto maior o volume de extração, maior o volume da fase sedimentada após a centrifugação, que deve conter quantidade suficiente para as análises posteriores[137].

arranjo de diodos (“HPLC-DAD”), puderam confirmar a eficácia do método.

O solvente de dispersão deve ser solúvel tanto na solução aquosa quanto no solvente extrator para que a dispersão do solvente extrator seja facilitada[139].

Os solventes mais utilizados[137] são acetona[150,151], acetonitrila[141,145,152], 2-propanol[153], metanol[143,144,148] e etanol[140]. O volume do solvente de dispersão também tem sua importância, uma vez que influencia diretamente na formação da nuvem composta pela mistura da solução aquosa com os solventes adicionados (“cloudy solution”).

Também influencia na dispersão do solvente extrator, que está relacionada com a eficiência de extração. O volume da fase sedimentada também é influenciada pelo volume do solvente de extração. Portanto, para manter constante o volume de fase sedimentada deve-se alterar simultaneamente o volume do solvente extrator e dispersor[136,137,139].

3. Conclusões e tendências

Apesar de ser uma técnica recomendada para análise de amostras em matrizes simples, sua utilização para analise de matrizes complexas como as alimentícias vem crescendo nos últimos anos[137] (Tabela 8). Fan et al.[154] foram responsáveis pelo desenvolvimento de um método para a extração de clorofenóis em amostras de mel utilizando microextração líquido-líquido dispersiva.

Esses autores utilizaram um líquido iônico como solvente extrator, com posterior determinação dos analitos através de cromatografia líquida de alta eficiência e detecção UV-vis com arranjo de diodos. Outro método visando à determinação de neonicotinóides (uma classe emergente de inseticidas) em amostras de mel foi criado por Jovanov et al.[155] que, juntamente com o uso de cromatografia líquida de alta eficiência e detecção por

D’Orazio et al.[166] desenvolveram um método utilizando microextração dispersiva líquido-líquida (“DLLME”) acoplada à cromatografia eletrocinética micelar (MECK) com detecção por espectrometria de massas, com a finalidade de extrair compostos estrogênicos e seus metabólitos presentes em amostras de leite e iogurte.

No presente trabalho as principais técnicas miniaturizadas de preparo de amostras disponíveis atualmente foram apresentadas e discutidas, sempre procurando evidenciar suas principais vantagens e limitações. Como características genéricas e vantajosas, em relação às técnicas “clássicas” (tais como extração liquido-líquido, extração em fase sólida, extração com solventes pressurizados e outras), as micro-técnicas empregam pequenos (ou nenhum) volumes de solventes e de amostras, propiciando uma análise menos agressiva ao meio ambiente e ao analista. A facilidade de automação de quase todas elas, em menor ou maior grau, é outra vantagem significativa.

Um número expressivo de micro-técnicas foi discutido no presente estudo, evidenciando suas aplicações e potencial na determinação de resíduos e contaminantes em alimentos, área de grande relevância para a segurança alimentar (“food safety”). Apesar de não serem ainda tão empregadas quanto as técnicas clássicas nesta área, a nítida expansão recente de suas aplicações permite projetar uma tendência de que nas próximas décadas as técnicas miniaturizadas de preparo de amostras terão lugar de destaque nesta área.

Agradecimentos

Os autores agradecem ao CNPq pela bolsa de estudos para A. L. Luigi e para E.V. S. Maciel (Proc.

132224/2014-3), assim como o apoio financeiro da FAPESP (2014/07347-9) e CNPq (Proc. 307293/2014-9).

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PREPARO DE AMOSTRAS

Microextração em gota única (SDME): fundamentos e aplicações Single drop microextraction (SDME): fundamentals and applications

Iohana Pinto de Pinto Marcio Pozzobon Pedroso* Universidade Federal de Lavras Departamento de Química 37200-000 Lavras (MG) Brasil *marciopedroso@dqi.ufla.br Recebido: 08 Set 2015 Aceito: 28 Set 2015

Resumo

As técnicas clássicas de preparo de amostra têm sido substituídas por técnicas miniaturizadas devido ao baixo custo, pequeno consumo de solventes e possibilidade de automação. A primeira técnica de microextração em fase líquida desenvolvida foi a microextração em gota única (SDME) e, desde então, novos modos de operação foram desenvolvidos. O princípio da SDME está baseado na partição dos analitos de interesse entre a amostra e uma pequena gota de um solvente orgânico.

Princípios teóricos, diferentes modos de operação e aplicações recentes da SDME para a determinação de compostos orgânicos por técnicas cromatográficas são apresentados nessa revisão.

Palavras-chave: preparo de amostra, microextração em fase líquida, cromatografia, gota única.

Abstract

The classical sample preparation techniques are being replaced by miniaturized techniques due to low cost, low solvents consume and possibility of automation.

The first liquid phase microextraction technique developed was the single drop microextraction (SDME) and since then new operation modes have been developed.

The SDME principle is based on partition of the analytes between the sample and a small drop of an organic solvent. Theoretical principles, operation modes and recent applications of the SDME in the determination of organic compounds by chromatographic techniques are presented in this review.

Keywords: samples preparation, liquid phase microextraction, chromatography, single drop.

Scientia Chromatographica 2015; 7(3)

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Pinto IP, Pedroso MP

1. Introdução

O preparo da amostra se faz necessário quando a amostra não é passível de ser analisada em sua forma bruta, seja pelo fato da concentração ou natureza do analito de interesse não ser compatível com a técnica instrumental, ou porque a amostra contém componentes que possam interferir na análise e/ou danificar o equipamento. Geralmente, essa etapa prévia à análise instrumental tem por objetivo pré-concentrar e extrair da amostra os componentes de interesse. Além disso, é uma etapa que demanda grande parte do tempo total da análise e elevado consumo de recursos[1]. Portanto, o preparo de amostra é determinante para a obtenção de resultados confiáveis, bem como minimizar o tempo e os custos da análise.

Para análises por cromatografia gasosa (GC) ou cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), as técnicas de preparo de amostras tradicionais mais conhecidas e utilizadas são a extração líquido-líquido (LLE) e a extração em fase sólida (SPE)[2]. A LLE é uma técnica que demanda tempo, por ser realizada em muitos passos, utiliza uma quantidade elevada de solvente orgânico e resulta na geração de quantidades significativas de resíduos[3]. Por sua vez, a SPE surgiu para minimizar algumas limitações da LLE e, embora seja uma técnica amplamente empregada, demanda gastos com cartuchos e acessórios, além da variabilidade entre lotes de cartuchos de um mesmo fabricante[4].

As desvantagens das técnicas tradicionais levaram a diversas pesquisas relacionadas à introdução de novas tecnologias para a extração, as quais preconizam a miniaturização, redução da quantidade de solventes, automação e, quando possível, aplicação in-situ ou invivo[5]. Técnicas miniaturizadas baseadas nas extrações por LLE e SPE apresentam vantagens de estarem mais relacionadas à Química Verde e por proporcionarem ao analista maior grau de automação, o que reduz os erros cometidos durante o preparo da amostra. Dentre essas técnicas as mais comuns são microextração em fase sólida (SPME) e microextração em fase líquida (LPME ou LLME).

184

Microextração em gota única (SDME)

A LPME possui diferentes métodos de operação, de acordo com a forma que a fase líquida extratora se encontra, que nesse trabalho serão descritos como três grandes grupos[6,7]: (i) microextração com fibras ocas (HF-LPME), na qual um solvente orgânico imiscível em água é imobilizado nos poros de uma fibra oca porosa e o interior da fibra é preenchido com o solvente extrator; (ii) microextração líquido-líquido dispersiva (DLLME), na qual a fase extratora imiscível com a amostra é dispersa em solução aquosa pelo auxílio de um solvente dispersivo e, posteriormente, separada por centrifugação; (iii) microextração em gota única (SDME), na qual uma única gota do solvente extrator imiscível com a amostra é colocada em contato com a amostra. Cada uma das técnicas citadas podem apresentar subdivisões e/ou modificações das mesmas, que muitas vezes podem ser tratadas como técnicas diferentes.

Desenvolvida em 1996 por Jeannot et al. [8], a primeira descrição da SDME envolveu a extração de compostos orgânicos presentes em água através de uma gota de n-octano de 8 µL suspensa no final de um tubo Teflon imerso na solução aquosa. Após um tempo de contato entre as fases, uma alíquota da gota de solvente contido no interior do tubo foi amostrada com auxílio de uma microsseringa e injetada em um GC. Frente à LLE, a extração proposta mostrou-se mais rápida e simples, além de diminuir consideravelmente a quantidade de solvente orgânico empregada[3].

Em 1997 He e Lee[9] propuseram uma pequena modificação na técnica, a fim de facilitar seu uso em laboratório. Em substituição ao tubo de Teflon, a gota do solvente extrator foi suspensa na ponta de uma microsseringa para GC. Para a extração a amostra foi colocada em um frasco com tampa com septo de silicone e 1µL do solvente orgânico foi aspirado para o lúmen da microsseringa. Em seguida, o septo da tampa foi perfurado pela agulha da microsseringa e a ponta da agulha foi imersa na amostra. Lentamente, a gota foi Scientia Chromatographica 2015; 7(3):183-198

Microextração em gota única (SDME)

exposta na ponta da microsseringa, entrando em contato com a amostra por determinado tempo. Posteriormente, a gota foi retraída para dentro da microsseringa e introduzida diretamente no injetor do GC. Essa abordagem mostrou-se vantajosa por minimizar tempo e problemas de diluição e contaminação do extrato, pois extração e injeção são realizadas com a mesma microseringa, sem necessidade de etapas intermediárias.

Desde o primeiro trabalho, a SDME tem sido bastante empregada por apresentar simplicidade em sua operação e não exigir equipamentos específicos. Outra vantagem está relacionada a não existência de efeito de memória entre as extrações, já que a gota é renovada em cada extração. Embora tenha sido originalmente desenvolvida para aplicação em GC, a aplicabilidade dos diversos modos da SDME envolve uma ampla faixa de técnicas instrumentais de análise, sendo a GC e a HPLC as mais empregadas. Menos frequente, a determinação dos analitos pode ser feita também por eletroforese capilar (capillary electrophoresis - CE), espectrometria de absorção atômica (atomic absorption spectrometry - AAS) ou espectrometria de massas (mass spectrometry - MS), essa última em suas diferentes formas de ionização. Dessa forma, a gama de analitos passíveis de determinação utilizando a SDME compreende desde compostos orgânicos, leves ou pesados, até íons metálicos[10-14].

Nessa revisão serão abordados os fundamentos teóricos e os modos de operação da SDME, técnica que se destaca por ser simples, rápida e acessível a qualquer laboratório de cromatografia. Embora a SDME também seja muito usada para a determinação de metais, apenas aplicações recentes voltadas para análise cromatográfica serão apresentadas. De 1996 a 2015 cerca de 360 artigos versando sobre os diferentes modos de operação da SDME haviam sido publicados (excluindo revisões), dos quais apenas 8 trabalhos referentes à pesquisadores brasileiros.

Pinto IP, Pedroso MP

2. Modos de extração e aspectos teóricos da SDME

A extração por SDME pode ser realizada através de diferentes modos[7], conforme esquema apresentado na Figura 1, os quais são subdivididos em sistemas com duas ou três fases. Quando a gota do solvente extrator e a amostra estão em contato direto, considera-se o sistema de duas fases. Quanto há uma terceira fase (headpace ou outro solvente) entre as duas anteriormente citadas, assume-se o sistema de três fases[7]. Os modos para sistemas de duas fases são: i) imersão direta (direct imersion - DI), ii) fluxo contínuo (continuous flow – CF ou continuous flow microextracion – CFME), iii) gota diretamente suspensa (directly-suspended droplet – DSD ou DSDME), iv) gota sólida (solidification of floating drop – SFD ou SFDME), iv) gota a gota (drop-to-drop – DDME). Já os modos para sistema de três fases são: i) headspace (HS) e ii) líquido-líquido-líquido (liquidliquid-liquid – LLL).

A extração por DI–SDME, apresentada na Figura 1(a), é similar aquela descrita em 1997 por He e Lee[9]. Antes da extração a microsseringa é imersa

Figura 1. Classificação e esquema dos diferentes modos de operação da SDME – (a) Imersão Direta (DI-SDME), (b) Fluxo Contínuo (CFME), (c) Gota a gota (DDME), (d) Gota Suspensa (DSDME), (e) Gota Sólida (DSDME), (f) Headspace (HS-SDME) e (g) Líquido-líquido-líquido (LLLME). Adaptado de (76).

Scientia Chromatographica 2015; 7(3):183-198 185

Pinto IP, Pedroso MP

Microextração em gota única (SDME)

no solvente orgânico (imiscível em água) e o lúmen é preenchido com alguns microlitros da fase extratora.

Posteriormente, a agulha da microsseringa é inserida no frasco que contém a amostra e a ponta da agulha imersa na amostra. Lentamente o êmbolo da microsseringa é pressionado para formação da gota na extremidade da agulha, havendo contato direto entre a fase orgânica e a amostra aquosa. Após um determinado tempo, a gota é aspirada para o lúmen da microsseringa, sendo imediatamente transferida para o injetor do cromatógrafo.

Como há o contato direto entre as duas fases, o solvente extrator deve ser imiscível em água, possuir baixa pressão de vapor e ter afinidade com o analito[15].

Os solventes mais utilizados são o octanol, tolueno, hexano e decano[16]. No geral, os solventes orgânicos utilizados são compatíveis com as análises por GC, o que faz dessa a instrumentação mais associada a DI-SDME[17]. Os analitos extraídos são normalmente neutros, moderadamente básicos ou ácidos, apolares e semi-voláteis e, geralmente, são extraídos de amostras aquosas[17].

Na DI-SDME, o processo de extração ocorre, idealmente, pelo equilíbrio de partição do analito entre um volume de fase aquosa (Vaq) e um volume de fase orgânica (Vorg), tal qual uma extração líquido-líquido[15].

A razão de distribuição entre a concentração do analito entre as fases pode ser aproximada para: Kd =

Corg Caq

norg =

0 K dVorg VaqCaq

Vaq + K dVorg

(2)

A eficiência de extração em SDME geralmente é baixa, o que faz com que a técnica seja considerada como não exaustiva. A eficiência de extração depende de fatores como volume das fases, concentração inicial da amostra e Kd. Na Figura 2 está apresentada a influência de Kd na eficiência da extração, considerando uma típica extração por SDME, na qual o Vaq é 10 mL, o Vorg de 2 µL e a C0aq de 2 µg L-1. É possível verificar que para compostos com log Kd superiores a 5, caso de bifenilas policloradas, a extração pode ser considerada exaustiva.

Para a maioria dos compostos extraídos por SDME o valor de log Kd é inferior à 5, o que torna a eficiência de extração baixa e, com isso, a extração é considerada nãoexaustiva. Por isso, ao contrário das técnicas exaustivas, o sucesso de uma análise por SDME está relacionado à exatidão obtida para a concentração do analito na amostra, e não à eficiência de extração de 100%[19].

(1)

sendo Caq a concentração do analito na fase aquosa no equilíbrio e Corg a concentração do analito na fase orgânica no equilíbrio. Muitas vezes utiliza-se a constante de partição octanol/água (Kow), definida como a razão da concentração de um composto no equilíbrio em octanol em relação à sua concentração na fase aquosa, como boa estimativa para Kd. Uma vez que em grande parte as extrações por SDME o solvente deve ser imiscível em água, tal aproximação é adequada[18].

186

A quantidade do analito em cada uma das fases depende da concentração inicial da amostra aquosa (C0aq) e pode ser calculada através do balanço de massa para o analito. A quantidade total do analito (nt), originalmente presente apenas na fase aquosa, corresponde ao somatório da quantidade do analito na fase orgânica (norg) e na fase aquosa (naq) no equilíbrio. A partir da Equação 1 e do balanço de massa para o analito, pode-se obter a quantidade do analito extraída para a fase orgânica, dada por:

Figura 2. Influência de Kd na eficiência teórica de extração por SDME. Scientia Chromatographica 2015; 7(3):183-198

Microextração em gota única (SDME)

Mesmo para extrações com baixa eficiência o fator de pré-concentração, definido como a razão entre Corg e C0aq atinge valores superiores a 1000, dependendo do modo de operação da SDME[17], mas geralmente variam entre 50 e 500. Em outras palavras, como o volume da gota é muito pequeno, o pouco de analito que é extraído proporciona uma concentração elevada na fase orgânica. Experimentalmente, o fator de préconcentração pode ser determinado por meio da relação entre a área do pico cromatográfico obtido pela injeção direta de uma solução padrão do analito e pela área do pico obtido pela injeção dessa mesma solução padrão após extração por SDME[20].

Inicialmente, o modelo de transferência dos analitos da fase aquosa para a fase orgânica foi baseada em duas teorias: a teoria do filme e a teoria da penetração[21], sendo o coeficiente de transferência de massa da fase aquosa (βaq) considerado o passo determinante da extração. Num sistema em que a gota está imersa em solução aquosa e sob agitação, a teoria do filme pressupõe que há um filme de fase aquosa adjacente à gota que está estático e o movimento de convecção da fase aquosa aumenta gradualmente da interface para o seio da solução aquosa. Assim, βaq depende do coeficiente de difusão do analito no meio aquoso (Daq) e da espessura desse filme (δaq): βaq =

Daq δaq

(3)

Ao contrário da teoria do filme, na teoria da penetração há o pressuposto de que essa interface não seja estática, mas seja constantemente renovada. Durante a extração, o volume de solução aquosa que entra em contato com fase orgânica por um pequeno tempo (te) é constantemente substituído por outra parcela de solução.

Nesse caso, βaq depende de Daq e de te, conforme a Equação 4: βaq = 2

Daq π te

(4)

Pinto IP, Pedroso MP

Usando dados experimentais para a extração de malation, 4-metilacetofenona, 4-nitrotolueno e progesterona, Jeannot e Cantwell[21] observaram que a transferência de massa dos solutos é diretamente proporcional a Daq, o que leva a concluir que a teoria do filme é mais adequada para descrever a transferência de massa na SDME. Para realizar a extração em pouco tempo, a solução da amostra é agitada (geralmente com barra de agitação), visto que quanto maior for agitação, menor será a δaq e, consequentemente, maior βaq. Geralmente utilizase rotação inferior a 300 rpm, limitação relacionada à estabilidade da gota, já que quanto maior a agitação da fase aquosa maior será a tendência da gota se desprender da ponta da microsseringa[22].

Os modos mais empregados são a DI-SDME e a HS-SDME, os quais correspondem a cerca de 80% dos trabalhos realizados com SDME, o que pode ser justificado por serem os modos de mais simples operação e, também, por terem sido os primeiros apresentados[15].

No modo de extração por HS-SDME (Figura 1(f)), um sistema de três fases, a gota fica suspensa na ponta da microsseringa e acima da amostra, no espaço denominado headspace[23]. O procedimento de extração é análogo à DI-SDME, excetuando-se o fato da microsseringa não ser imersa na solução. Dessa forma, os compostos extraídos devem volatilizar da fase aquosa para o headspace e, posteriormente, do headspace para o solvente. Assim, essa técnica é direcionada para a análise de analitos voláteis e semivoláteis, polares ou não. Além disso, pode-se utilizar solventes hidrofílicos para maior seletividade na extração.

Nessa modalidade a interferência da matriz é minimizada já que não há contato direto entre gota e amostra[24]. A extração por HS-SDME permite maior agitação da amostra, já que a gota tem uma maior estabilidade por não apresentar risco de desprendimento, e permite o aquecimento da amostra, com o propósito de maximizar a transferência dos analitos da amostra para o headspace[25].

Scientia Chromatographica 2015; 7(3):183-198 187

Pinto IP, Pedroso MP

Microextração em gota única (SDME)

Como mencionado, na HS-SDME o equilíbrio ocorre em três fases (amostra/headspace/gota) até que sejam alcançadas as condições de equilíbrio[26], que pode ser descrito por: Caq  CHS  Corg

(5)

no qual o índice HS refere-se ao headspace. Assim, a constante de distribuição (Kd) entre as fases orgânica e aquosa pode ser escrita como: = kd K= org/aq

K org/HS K HS/aq

(6)

o qual, combinando com o balanço de massa para o analito nas três fases, pode-se obter norg: = k d K= org/aq

K org/HS K HS/aq

(7)

O volume do headspace apresenta influência contrária na sensibilidade do método e no tempo de extração: enquanto a sensibilidade do método é aumentada para menores volumes de headspace, o tempo de extração é minimizado com esse aumento. Dessa forma, um valor de compromisso para o volume do headspace deve ser adotado para conciliar sensibilidade do método e tempo de extração.

Os demais modos de operação são menos empregados em relação aos já descritos (DI-SDME e HS-SDME) e apresentam algumas modificações ou melhorias para contornar limitações da SDME. Esses modos correspondem a cerca de 20% dos trabalhos e serão descritos brevemente[15].

A CFME, descrita na Figura 1(b), baseia-se na exposição da gota do solvente em contato com fluxo contínuo da solução aquosa[27], na qual o mecanismo de transferência de massa é mais complexo que aquele para as técnicas de equilíbrio. Nessa técnica, a amostra é circulada sob fluxo constante em uma câmara de extração por meio de uma bomba de HPLC e tubos de polímero termoplástico de poliéter éter cetona (PEEK).

Após o preenchimento da câmera com a amostra, uma 188

gota do solvente orgânico é introduzida no sistema através de uma válvula de injeção manual para HPLC. A gota circula no sistema e fica suspensa na ponta do tubo PEEK, no centro da câmara da extração, enquanto a amostra aquosa circula continuamente ao entorno da gota[28]. Após o tempo de extração a gota é retirada com auxílio de uma microseringa e injetada na instrumentação desejada[17].

A CFME permite que os analitos da solução aquosa sejam extraídos eficientemente em comparação aos outros modos devido à presença de mecanismos de difusão e convecção resultante da circulação contínua da amostra. Consequentemente, menores tempos para extração e elevados valores de pré-concentração (de até 1600 vezes) podem ser obtidos[29]. A aplicabilidade dessa técnica é limitada a compostos pouco voláteis e apolares, já que somente solventes orgânicos não polares são estáveis no sistema de vazão constante. Além disso, existe a necessidade de equipamentos adicionais como a bomba de microinfusão e outros acessórios[27].

Outro modo de extração relativamente pouco usado é a DDME (Figura 1(c)), uma versão miniaturizada da DI-SDME, a qual é atrativa quando o volume disponível de amostra é pequeno. A extração é feita com volumes de amostra inferiores a 50 μL, o que faz com que os fatores de pré-concentração sejam pequenos, da ordem de 20 vezes. Entretanto, o equilíbrio do analito entre as fases ocorre rapidamente e, por isso, a agitação é desnecessária, resultando em um sistema muito simples no qual a estabilidade da gota é maximizada. Assim, esse modo não é o mais adequado quando baixo limite de detecção (LD) é necessário, mas sim quando rápido clean-up ou elevada seletividade são necessários[15].

Os modos DSDME[30] e SFDME[31], apresentados na Figura 1(d/e), são bastante semelhantes entre si. O procedimento de extração consiste em agitar a amostra aquosa por meio de barra de agitação até obtenção de um vórtice suave. Um pequeno volume de um solvente orgânico, menos denso que a amostra e imiscível nela, é inserido no centro do vórtice e mantido por determinado Scientia Chromatographica 2015; 7(3):183-198

Microextração em gota única (SDME)

tempo para a extração. Como a gota não fica pendente na microsseringa, o volume de solvente orgânico usado pode ser maior que nos modos por DI, HS ou DD, o que maximiza a quantidade de analito extraída. Nesse processo, a fase orgânica também é movimentada (rotação), o que aumenta a transferência de massa e reduz o tempo de extração.

As principais diferenças entre esses dois modos (DSDME e SFDME) devem-se à natureza do solvente orgânico empregado na extração e à forma que ele é removido da solução aquosa. Ao término da extração na DSDME o solvente extrator é removido da solução, ainda sob agitação, com o auxílio de uma microsseringa. Essa etapa requer bastante cuidado para que o extrato orgânico não seja contaminado pela aspiração de uma parcela da solução aquosa. Já na SFDME, após a extração o frasco que contém a amostra (e a gota) é imersa em um banho de gelo por alguns minutos até que o extrato orgânico seja solidificado. Assim, a gota sólida pode ser removida da solução com o auxílio de uma espátula e transferida para um microtubo para que ocorra a fusão desse extrato. Por isso, o solvente orgânico deve apresentar temperatura de fusão próxima da temperatura ambiente, para que a gota do extrato possa ser solidificada por uma pequena diminuição da temperatura do meio. Os solventes mais usados na SFDME são o 1-undecanol e o 1-dodecanol, por atenderem os requisitos apresentados[32].

O modo LLLME é um modo de três fases composto pela amostra aquosa (também denominada fase doadora) em contato com uma fase orgânica (interface), na qual há uma microgota aquosa imersa (fase aceptora), conforme apresentado na Figura 1(g).

Na LLLME os analitos são extraídos da amostra aquosa para uma fase orgânica e novamente extraídos para uma fase aquosa aceptora (gota), similarmente às extrações por LLE seguida de retro-extração, porém para pequenos volumes[16]. O analito encontra-se dividido nas três fases e, portanto, a quantidade extraída depende das constantes de equilíbrio fase doadora/fase orgânica e fase orgânica/ fase aceptora, tal qual a HS-SDME. A LLLME se mostra

Pinto IP, Pedroso MP

adequada para compostos orgânicos hidrofílicos e compostos polares, como fenóis, ácidos graxos e aminas.

Ajustes na composição das fases doadora e aceptora são cruciais para obtenção de elevados fatores de préconcentração[3], como adequação do pH para espécies ionizáveis. Outro parâmetro importante é o volume da fase orgânica (1-7 μL), o qual deve formar um filme que seja estável sob agitação da fase aquosa de até 2000 rpm.

Fatores de pré-concentração de 1712 vezes podem ser atingidos com a LLLME[33].

3. Parâmetros ajustáveis para a SDME

Para alcançar as condições ótimas de uma extração, em termos de tempo de análise e quantidade de analito extraída, os principais parâmetros a serem ajustados são: escolha do solvente extrator, volume da gota, tempo de extração, velocidade de agitação, temperatura e adição de sal[34].

O critério para escolha do solvente extrator mais adequado baseia-se na sua baixa solubilidade em água e na elevada solubilidade do analito no solvente orgânico em relação à solução aquosa[16]. Dentre os diversos solventes que podem ser utilizados, octano, octanol, decano e tolueno são os mais empregados[16].

Nas análises por DI-SDME o solvente precisa ter ponto de ebulição elevado o suficiente para não evaporar durante a extração, mas também que seja compatível com o sistema de análise, como a GC[15]. No caso de análise por HPLC em modo reverso, o solvente orgânico precisa ser evaporado e ressuspendido na fase móvel, o que não é necessário no modo LLLME. Na extração por HS-SDME é possível empregar um solvente extrator hidrofílico, já que não há contato entre a amostra e o solvente. Contudo, solventes muito voláteis devem ser evitados, visto que a evaporação do solvente quanto em HS é mais pronunciada que em DI. O volume da gota extratora afeta significativa­ mente o tempo e a eficiência da extração. Os volumes mais utilizados variam entre 1μL e 3μL devido a estabilidade e reprodutibilidade da gota[35]. Principalmente quando a

Scientia Chromatographica 2015; 7(3):183-198 189

Pinto IP, Pedroso MP

análise não é automatizada, o uso de padrão interno se faz necessário para corrigir variação do volume da gota entre replicatas[19]. Por meio da equação 2 é possível investigar a influência do tamanho da gota na quantidade de analito extraída sob determinadas condições para DISDME (Kd = 103, Vaq = 10 mL e C0aq de 2 µg L-1). Na Figura 3 verifica-se o aumento do Vorg implica em maior norg, embora leve à diminuição de Corg.

Figura 3. Influência do volume da gota na quantidade de analito extraída (n­org) e na concentração do analito na gota (Corg).

Nas análises por HPLC o volume da gota é muito pequeno para preencher a alça de amostragem, fazendose necessário uma diluição do extrato antes da injeção no equipamento, o que leva à perda na sensibilidade.

Maiores volumes de gota são desejáveis para HPLC, porém, para GC pode causar caudas nos picos[7]. Amde e colaboradores empregaram gotas de 10 µL para análise por HPLC[36] e maiores volumes da microgota podem ser obtidos através de adaptadores acoplados ao final da microsseringa[32]. O aumento do volume da gota implica em maior área superficial e menor estabilidade da gota, os quais influenciam no tempo de extração e na velocidade de agitação, respectivamente. O aumento na velocidade de agitação proporciona uma redução no tempo para atingir o equilíbrio termodinâmico, mas também pode causar o desprendimento da gota ou 190

Microextração em gota única (SDME)

ocasionar o surgimento de bolhas na solução aquosa, o que traz inconvenientes práticos[37,38]. A velocidade de agitação geralmente é maior para HS-SDME, mas deve ser cuidadosamente controlada para os demais modos.

A transferência de massa dependente do tempo de extração, sendo que a taxa de transferência se reduz conforme as concentrações nas fases se aproximam daquelas no equilíbrio[21]. Por ser uma técnica não exaustiva, a variação dos resultados entre as análises também está relacionado ao tempo de extração, e não apenas à variação no volume da gota. Assim, o tempo de extração deve ser aquele no qual se atinge o equilíbrio do analito entre as fases[23]. Já na HS-SDME o equilíbrio é atingido mais rapidamente que nos outros modos, visto que os coeficientes de difusão em fase gás são normalmente 104 vezes maiores que em fase líquida, além da possibilidade de maiores velocidades de agitação.

A temperatura da extração também afeta o equilíbrio entre as fases, pois altera as constantes termodinâmicas. Na maioria das extrações o aumento da temperatura influencia positivamente na quantidade extraída[34]. Porém, no caso da SDME um aumento na temperatura pode ocasionar na dissolução da gota na solução aquosa e diminuir a reprodutibilidade da extração. Sendo assim, a maioria dos pesquisadores preferem utilizar a técnica em temperatura ambiente[38], o que pode ser considerado como vantagem da SDME. Na SFDME a temperatura de extração pode ser elevada para liquefazer o solvente empregado e, ao retornar a temperatura ambiente, o extrato se solidifica. Outro parâmetro muito empregado na LLE e na SPME é a adição de sais na solução aquosa, que altera a força iônica da solução, influenciando na solubilidade dos analitos.

Porém, na SDME geralmente se observa uma diminuição na eficiência da extração[38]. Isto pode ser explicado pelo aumento da viscosidade causado pela dissolução do sal, que reduz a taxa de difusão dos analitos na fase aquosa (Daq), embora a adição de sais seja benéfica nas extrações por HS-SDME por diminuir a solubilidade dos analitos na solução aquosa.

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Microextração em gota única (SDME)

Pinto IP, Pedroso MP

4. Aplicações

A SDME tem sido empregada para extração de diferentes analitos e análise por diferentes técnicas instrumentais por apresentar bons fatores de préconcentração, baixo LD, facilidade de operação e baixo custo. Na Tabela 1 estão listados alguns trabalhos que usam a extração por SDME e análise por cromatografia gasosa ou líquida, todos publicados desde 2011.

Entretanto, para trabalhos mais antigos há levantamentos bastante abrangentes, incluindo também a determinação de metais ou o uso de nanopartículas na gota[17,39,40].

Como apresentado anteriormente, os parâmetros operacionais dos diferentes modos da SDME apresentam certa interdependência. A estabilidade da gota é influenciada pela natureza do solvente, temperatura e

Tabela 1. Aplicações da SDME para análises por HPLC e GC.

Análise Modo Instrumental

Amostra

Analito (s) Compostos fenólicos Hidrocarbonetos leves Ciclamato Fragrância Musk Compostos voláteis

Solvente extrator

Volume da gota

Extração (min)

LD

Ref

decanol

3,5 µL

25

0,35 – 5,8 µg mL-1

(24)

n-hexadecano

1,5 µL

30

0,26 – 4,33 µg L-1

(61)

dodecano

2,5 µL

9

5 µmol L-1

(62)

Líquido iônico

1 µL

45

n-heptadecano

3 µL

4

Não determinado

(64)

octadecenol

2 µL

20

1,57 – 2,94 ng mL-1

(65)

3 µL

16

0,008 – 0,021 ng g-1 (66)

12,5 µL

20

0,0044 – 0,1 µg mL-1 (67)

0,8 µL

4

4,4 µg L-1

(68)

3 µL

10

0,016 – 0,084 µg L-1

(56)

2 µL

20

6,6 – 62 ng mL-1

(69)

3,5 µl

30

0,012 – 0,020 µg L-1

(70)

4 µl

40

0,33 – 0,67 µg L-1

(71)

10 µl

40

0,13 – 0,19 ng mL-1

(36)

HS-SDME

HPLC-UV

Biomassa

HS-SDME

GC-FID

Petróleo

HS-SDME

GC-FID

Adoçantes

HS-SDME

GC-MS/MS

Água

HS-SDME

GC-MS

HS-SDME

GC-FID

HS-SDME

GC-MS

Maionese

HS-SDME

GC-MS

Sucos

HS-SDME

GC-FID

DI-SDME

HPLC-UV

Pasta de dente Água

DI-SDME

GC-FID

Água

DI-SDME

GC-NPD

Água

DI-SDME

HPLC-DAD

Água

DI-SDME

HPLC-VWD

Água

DI-SDME

GC-MS

Vinho

Pesticidas

Tolueno

1 µL

30

0,1 – 4,62 µg L

(72)

DI-SDME

GC-FID

Batata frita

Acrilamida

3,5 µL

9

57 µg kg

(73)

DI-SDME

GC-MS

Solo

Atrazina

1 µL

20

0,024 ng L-1

(74)

LLL-SDME

HPLC-MS

1,2 µL

4

0,09 – 13 ng L-1

(33)

DSDME

GC-ECD

Água Difenilamina + Clorofórmio Tolueno/Amônia (0,2:1) Isooctano

100 µL

15

0,04 – 1 µg L-1

(75)

Citrus aurantium L. Chamaecyparis Obtusa L.

Água e soro humano Chás

Terpenos

Compostos voláteis n-dodecano oxidativos Compostos Líquido iônico do aroma Fluoreto 1,3,5-trimetilbenzeno (TMS derivado) Clorofenóis Tolueno Aminas Tolueno aromáticas Organofosforados Tolueno Estrogênio e octano + octanol Alquilfenóis Fungicidas Líquido iônico

Estatina Organoclorados

0,010 – 0,030 ng mL-1 (63)

-1

-1

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Pinto IP, Pedroso MP

velocidade de agitação, os quais modificam o tempo de extração e a quantidade extraída. Por isso, a otimização multivariada torna-se extremamente adequada para investigar essa interdependência entre os parâmetros e para o ajuste adequado das melhores condições de extração. Entretanto, essa ferramenta ainda é pouco usada para SDME, ao contrário do que é observado para SPME. Pinheiro e colaboradores adotaram o planejamento fatorial 23 completo para ajustar tempo de extração, volume da gota e velocidade de agitação para a determinação multiresidual de pesticidas em água por GC com detecção por ionização em chama (GC-FID)[41], enquanto que para a determinação por GC-MS também foram avaliados o pH e a adição de sal em planejamento fatorial 22[42]. Já Martendal e colaboradores[43] empregaram planejamento fatorial fracionário e Box-Behnken para a determinação de 2,4,6-trichloroanisol e 2,4,6-tribromoanisol por GC com detecção por captura de elétrons (GC-ECD).

A SDME não possui muitas limitações quanto à natureza da amostra e pode ser utilizada para amostras líquidas, sólidas e gasosas. Entretanto, a maioria das aplicações se referem à amostras líquidas[17]. No caso de amostras sólidas faz-se uma suspensão da amostra para a extração prévia dos analitos ou, então, pode-se utilizar a extração por HS-SDME quando os analitos são voláteis. Um dos primeiros artigos aplicando a SDME à amostra sólida foi realizado por Lee e colaboradores[25] para a determinação de clorobenzenos em solo por HSSDME-GC-ECD. Primeiramente, as amostras de solo foram imersas em acetona durante a noite para permitir a extração analitos da amostra sólida para o solvente.

Após a evaporação total desse solvente foi realizada a extração por HS-SDME, obtendo-se LD da ordem de ng g-1. A extração direta da amostra foi realizada por Yu e colaboradores[11] para a determinação de resíduo de metanol e etanol em fármacos por HS-SDME-GCFID. Até íon fluoreto já foi determinado por HS-SDMEGD-FID em amostra de creme dental, após a derivação com trimetilclorosilano (TMCS). O LD e fator de préconcentração obtidos foram de 4,4 µL L-1 e 58,8 vezes, respectivamente.

192

Microextração em gota única (SDME)

Raramente água é usada como solvente extrator em vez a solventes orgânicos. O objetivo é melhorar a extração de compostos polares ou adequar o extrato à análise por cromatografia líquida em fase reversa.

Kaykhaii e Abdi[44] determinaram acrilamida em batatas fritas por meio da extração por DI-SDME empregando água como solvente extrator e determinação por GCFID. O analito foi previamente extraído da amostra sólida com hexanoato de etila e, após filtração da suspensão, a microgota de água foi imersa no solvente orgânico. A técnica apresentou boa repetibilidade e LD de 57 µg kg-1. Devido à inversão da polaridade das fases, o autor denominou a técnica como fase reversa (RP-DISDME). A desvantagem desse conceito se deve ao uso de solvente orgânico para o preparo da amostra, embora o volume utilizado seja muito inferior ao usado em LLE. Batlle e colaboradores[45] usaram água como solvente extrator na determinação de diisocianatos em mistura gasosa por diferentes variações da HS-SDME e detecção por UPLC-MS. No trabalho foram montados dois sistemas para gerar a atmosfera com isocianato e a água usada como solvente extrator continha um derivatizante (dibutilamina) e padrão interno (fenilisotiocianato).

O uso de líquidos iônicos como fase extratora, os quais são um meio iônico resultante da combinação de cátions orgânicos e vários ânions, tem recebido bastante destaque recentemente como alternativa aos solventes orgânicos, por apresentarem baixa pressão de vapor e elevada viscosidade, bem como boa estabilidade térmica e polaridade ajustável de acordo com os íons escolhidos[40]. As características intrínsecas desses líquidos iônicos proporcionam o aumento do volume da gota (maiores que 15 µL), já que a viscosidade desses líquidos permite uma maior aderência na microsseringa; maior temperatura na extração, devido à baixa volatilidade e solubilidade em água[32]. Já no caso da GC, a baixa volatilidade dos líquidos iônicos torna necessária alguma modificação no sistema de injeção, para evitar que o líquido iônico seja transferido para a coluna.

Scientia Chromatographica 2015; 7(3):183-198

Microextração em gota única (SDME)

Aguilera e colaboradores empregaram 2 μL do líquido iônico formado por 1-butil-3-metilimidazol e hexaflourofosfato para extração de diclorometano, p-xileno e undecano[46] e de benzeno, tolueno, etilbenzeno e xilenos[47] e determinação por GC-MS. Um sistema acoplado ao injetor no GC foi especialmente desenvolvido para impedir que o líquido iônico fosse transferido para a coluna. Uma alternativa ao complexo sistema se baseia apenas na exposição e retração da gota do líquido iônico no injetor, tal qual a injeção com uma fibra de SPME, a qual foi adotada na determinação de fenóis em água de lago e esgoto por HS-SDME[48]. O uso de líquidos iônicos para HPLC se mostra mais simples que para GC e, portanto, mais difundida, embora exista limitação em relação à viscosidade desses líquidos[49].

Aplicação para a determinação de pesticidas[50] e fenóis[51] em amostras de naturais, 3-benzofenona em urina[52] e formaldeído em cogumelos[53] são alguns exemplos.

Pinto IP, Pedroso MP

primeiros trabalhos com automatização da SDME para os modos DI-SDME e HS-SDME empregou um amostrador automático Combi PAL para a extração e injeção na determinação de hidrocarbonetos policíclicos aromáticos[57]. Recentemente, o uso de uma bolha intencionalmente inserida dentro de uma gota[58] usando um amostrador automático permitiu maiores fatores de pré-concentração, levando à LD de 0,024 ng L-1 e 0,013 ng L-1 para a determinação de atrazina e metolocloro, respectivamente, em água por GCMS[59]. Entretanto, a automação tem sido mais aplicada para CFME em determinações espectrofotométricas empregado sistemas em fluxo[60].

5. Conclusões

Maiores volumes de gota são alcançados pelo uso de adaptadores, geralmente posicionados na ponta da microseringa[32]. Wen e colaboradores utilizaram uma fita de Teflon® para aumentar o diâmetro da ponta da agulha proporcionando uma maior área de superfície para a formação da gota, atingindo um volume de 20 µL[54]. Outra adaptação se refere ao uso de um funil de polipropileno na ponta da microseringa para a exposição de uma gota de até 150 µL, aplicada para extração de compostos aromáticos[55].

A SDME é uma técnica que apresenta diferentes modos de operação, ampla faixa de aplicação, baixos LD e pouco onerosa, o que a torna bastante atrativa para extrações rápidas, com elevado fatores pré-concentração e clean-up da amostra. A renovação da microgota a cada análise elimina o efeito de memória e proporciona baixíssimo consumo de solvente orgânico, o que é uma tendência. Diferentes parâmetros influenciam na quantidade de analito extraída e, assim, o conhecimento dos conceitos fundamentais da técnica é fundamental para escolher o melhor modo de operação em função das características do analito ou da técnica de detecção.

Ainda, pode ser aplicada a praticamente todo o tipo de analito, orgânico ou inorgânico.

Li e colaboradores combinaram duas técnicas de microextração em fase líquida, DLLME e LLLME na determinação de clorofenóis em águas e determinação por HPLC. A extração por DLLME empregou tolueno dissolvido em metanol para a obtenção da emulsão, que foi separada por centrifugação. Uma gota de 3 µL da solução aquosa aceptora foi inserida na fase orgânica menos densa por 10 min, antes da análise por HPLC[56].

Algumas limitações da técnica também devem ser mencionadas, referentes à instabilidade da gota para volumes maiores, incompatibilidade do solvente orgânico empregado e HPLC em fase reversa, além da necessidade de passos adicionais (filtração, derivação) para certos tipos de analitos ou amostra. Entretanto, devido a grande versatilidade dessa técnica, essas limitações podem ser contornadas.

A automatização é uma possibilidade para minimizar erros provenientes de operação manual e aumentar o processamento de amostras. Um dos

A SDME é uma técnica que apresenta potencial de crescimento, em especial no Brasil, visto que apenas 8 trabalhos com SDME foram publicados. Imagina-se

Scientia Chromatographica 2015; 7(3):183-198 193

Pinto IP, Pedroso MP

que possa ser empregada até em aulas de graduação, em substituição à LLE. A maior parte das aplicações dos diferentes modos da SDME referem-se a amostras líquidas, embora amostras sólidas ou gasosa também possam ser analisadas. Os modos mais simples e mais difundidos são DI-SDME e HS-SDME, sendo que sistemas automatizados aumentam a reprodutibilidade

Microextração em gota única (SDME)

da análise sem a perda de suas vantagens iniciais.

Os modos de DSDME, SFDME e LLLME são mais recentes e de simples aplicação, os quais permitem uma maior flexibilidade de análise. A CFME apresenta a necessidade de acessórios para circular a amostra, o que a torna menos atrativo devido à sua complexidade frente aos outros modos.

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Pinto IP, Pedroso MP

Microextração em gota única (SDME)

Símbolos e Abreviaturas

βaq – coeficiente de transferência de massa da fase aquosa; Caq – concentração do analito na fase aquosa no equilíbrio; Coaq – concentração inicial da fase aquosa; CHS – concentração do analito no headspace no equilíbrio; Corg – concentração do analito na fase orgânica no equilíbrio; CFME – microextração em fluxo contínuo (do inglês continuous flow microextraction); Daq – coeficiente de difusão do analito na fase aquosa; DDME – microextração em gota única por gota a gota (do inglês drop-to-drop microextraction); DI-SDME – microextração em gota única por imersão direta (do inglês direct immersion single drop microextraction); DLLME – miroextração líquido-líquido dispersiva (do inglês dispersive liquid-liquid microextraction); DSDME – microextração em gota única diretamente suspensa (do inglês directly-suspended droplet microextraction); GC – cromatografia gasosa (do inglês gas chromatography); GC-ECD – cromatografia gasosa com detector de captura de elétrons (do inglês gas chromatography with electrons capture detection); GC-FID – cromatografia gasosa com detector de ionização de chama (do inglês gas chromatography with flame ionization detection); GC-MS – cromatografia gasosa acoplada à espectrômetria de massas (do inglês gas chromatography with mass spectrometry); GC-NPD – cromatografia gasosa com detector de nitrogrênio-fóforo (do inglês gas chromatography with nitrogen-phosphorus detector); HS-SDME – microextração em gota única por headspace (do inglês headspace-single drop micreoextraction); HF-LPME – microextração em fase líquida com fibra oca (do inglês hollow fibre liquid phase microextraction); HPLC – cromatografia líquida de alta resolução (do inglês high performance liquid chromatografy); HPLC-DAD – cromatografia líquida de alta resolução com detector de arranjo de diodos (do inglês high performance liquid chromatografy with diode array detection); HPLC-MS – cromatografia líquida de alta resolução acoplado ao espectrômetro de massas (do inglês high performance liquid chromatografy with mass spectrometry); HPLC-UV – cromatografia líquida de alta resolução com detector ultra-violeta (do inglês high performance liquid chromatografy with ultravioleta detection); HPLC-VWD – cromatografia líquida de alta resolução com detector de comprimento de onda variável (do inglês high performance liquid chromatografy variable-wavelength detection); Kd – constante de ditribuição; KHS – constante de distribuição no headspace; Kow – constante de distribuição octanol/água; LD – limite de detecção; LLE – extração líquido-líquido (do inglês liquid-liquid extraction); LLME – microextração líquido-líquido (do inglês liquid liquid microextraction); LLLME – Microextração em gota única líquido-líquido-líquido (do inglês liquid-liquid-liquid microextraction); LPME – microextração em fase líquida (do inglês liquid phase microextraction); naq – quantidade de analito na fase aquosa; norg – quantidade de analito na fase orgânica; nt – quantidade total de analito; SDME – microextração por gota única (do inglês single drop microextraction); SFDME – microextração por gota única sólida (do inglês solidification of floating drop microextraction); SPE – extração em fase sólida (do inglês solid phase extraction); SPME – microextração em fase sólida (do inglês solid phase microextraction); Vaq – volume da fase aquosa; Vorg – volume da fase orgânica; δaq – wspessura do filme da fase aquosa.

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Scientia Chromatographica 2015; 7(3):183-198

Scientia Chromatographica 2015; 7(3):199-222 Instituto Internacional de Cromatografia http://dx.doi.org/10.4322/sc.2016.004 ISSN 1984-4433

HPLC

Folate – Analytical properties, bioavailability and stability in foods

Emmanuela Prado de Paiva1* Marcella Melo Assis Costa2 Clayton Anderson de Azevedo Filho3 Departamento de Tecnologia Rural, Universidade Federal Rural de Pernambuco, Rua Dom Manoel de Medeiros, s/n, Dois Irmãos, 52171-900 – Recife, PE, Brazil 2 Departamento de Farmácia, Universidade Federal de Pernambuco, Av. Prof. Moraes Rego, s/n, Campus Universitário, 50670-901 – Recife, PE, Brazil 3 Associação Caruaruense de Ensino Superior, Av. Portugal s/n, Universitário, 55016901 Caruaru, PE, Brasil *paiva.ufrpe@gmail.com 1

Recebido: 24/11/2015 Aceito: 18/02/2016

Scientia Chromatographica 2015; 7(3)

Abstract

Folate is a term used to designate chemical forms of vitamin B9, which can be found in animal, vegetable and microbial cells at different oxidation levels from polyglutamates to monoglutamates. Its absence in diet can lead to disturbances, especially during pregnancy, which guided mandatory food enrichment. The improvement of analytical methods started in the 90’s, in order to ensure the safety of information present in food composition table and nutritional guidelines. The analysis of the different chemical forms of folate in food presents some challenges due to its low concentration, possibility of isomerization and oxidation in extraction and quantification steps, and presence of interferents, especially in complex matrices.

This raises the need for discussion on the safety of analytical methodologies available for detection, identification and quantification of folates in foods. This review has endeavored to point out the most relevant characteristics and chemical properties to the stability and bioavailability of folate in foods. In addition, spectroscopic information of trade patterns of six chemical forms in combination with the latest data were compiled from the literature aiming at guiding the development of simplified analytical methods with a lower loss of folates found in foods.

Keywords: folate, methods, extraction, food, vegetables, HPLC, bioavailability and stability.

199

Paiva EP, Costa MMA, Azevedo Filho CA

1. Relevance

Folate is the term designated to all pteroic acid derivatives exhibiting vitamin activity in humans[1].

This water-soluble compound is associated with several activities and may act as cofactor and/or coenzyme.

Besides, it exhibits biological activity in maintaining the individual´s health[2]. It can be found in nature at several oxidation levels ranging from monoglutamates to polyglutamates. Folic acid is the most stable and reduced form, presented as monoglutamate, recommended for practice of fortification, food enrichment and drug production[3].

The main function and also the oldest one related to folate is being converted to 5-methyltetrahydrofolate by action of the enzyme methylenetetrahydrofolate reductase, making it a methyl donor for conversion of homocysteine ​​to S-adenosylmethionine. This molecule is source of carbon units for the DNA metabolism, including methylation and biochemical reactions mediated in the nervous system[4].

The addition of chains of glutamic acid in folates is the mechanism by which reserves are stored in microbial, animal and plant tissues. Tetrahydrofolates and 5-methyltetrahydrofolates are the main forms in animal tissues; the latter (5-methyltetrahydrofolate) is the predominant form in plant tissue, which may represent 90% of its activity[5].

Folate deficiency was primarily recognized by Wills in 1931 through identification of a pernicious anemia prevalent in Indian women. This disease was proved through experiments in monkeys fed on a diet restricted to folates. Since its inclusion as antianaemic factor in 1938, similar other molecules were also discovered and grouped under the designation folates[3,6].

However, folic acid elucidation as cure for megaloblastic anemia occurred in 1945. Since then, folate deficiency is recognized as one of the most prevalent and common vitamin deficiencies worldwide.

This deficiency results from inadequate intake, defective 200

Folate – Analytical properties, bioavailability and stability in foods

absorption, abnormal metabolism, and special conditions such as drug therapy. Marginal deficiency produces general symptoms including tiredness, irritability, and loss of appetite. Severe deficiency produces megaloblastic anemia or high amount of immature red blood cells. Other symptoms include abdominal pain, diarrhea, ulcers in mouth and pharynx, skin changes, hair loss, and neurological disorders such as dementia and depression[6].

Megaloblastic anemia due to insufficient folates intake has long been recognized as a complication for pregnancy with 3–5% incidence in developed countries and much higher incidence in Africa, Southeast Asia, and America. The development of the syndrome is mainly due to the increased nutritional need resulting from fetus growth[3].

Absence of such compounds in the diet during pregnancy can lead to severe disturbances. Relevant studies over three decades have shown that adequate folate intake may reduce risks of developmental abnormalities from Neural Tube Defects (NTD´s) specifically in brain and spine[7,8].

NTD´s, including mostly forms of bifid spine - the most common birth defects in humans - affect 1-14 per 1000 life birthed, although numbers are much higher in some regions. NTDs are a family of birth defects involving brain or spinal cord. They arise from incomplete neural tube closure during the fourth week of pregnancy[8].

Other diseases also associated with folate deficiency include those on cardiovascular system, mediated by elevated homocysteine levels ​​in blood, currently used as indicator of cardiovascular disease.

The maintenance of adequate folate intake reduces homocysteine ​​levels - thus, the recommendation for folate consumption in the diet or supplementation has been a key clinical intervention in terms of prevention[3,9-11].

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Folate – Analytical properties, bioavailability and stability in foods

The number of benefits associated with maintenance of folate levels in all life stages and disease prevention, has triggered interest in monitoring these molecules in the 90’s[12], particularly regarding the need for recognition of the relationship between chemical species and each type of disease[1,6,7].

Considering the need for differentiating folate intake and changes in eating habits in recent years, many countries have endeavored compulsory practices of vitamin supplementation - China, Canada, Australia, New Zealand, United States, Chile and Brazil[13].

Currently, it is evident the importance of folic acid and polyglutamates in order to maintain good health.

Nutritional recommendations are usually based on the board values of the Institute of Medicine, Food and Nutrition, which indicates folate intake of 400 mg/day for men and women of childbearing age, pregnant women to 600 mg/day and lactation period of 500 mg/day. Bioequivalence is 1.0 mg natural folic acid equivalent to 0.6 mg of folic acid in fortified foods and also used for supplementation[14]. This vitamin has no bioequivalence established by the International Units of the system proposed by IUPAC-International Union Pure and Applied Chemistry.

However, control over the reliability of nutrients values in the label of fortified foods and/or vitamins have stressed the need for determination of micronutrients’ chemical composition. Thus, it is important to develop methodologies and appropriate selective recognition of bioavailable and bioactive forms[15].

Vitamins determination in foods involves some challenges due to their low concentration (below µg), possibility of isomerization, presence of various interfering in complex matrices, requiring special care due to the low stability of these micronutrients, total or partial loss of vitamin at extreme pH conditions, sensitivity to temperature and changes in values of redox potential. These factors should be taken into account when choosing the analytical method[16,17].

Paiva EP, Costa MMA, Azevedo Filho CA

Currently, the microbiological method using Lactobacillus rhamnosus is considered official by Association of Official Analytical Chemistry (AOAC) (method 992.05) for folates determination in various samples, including food[18].

However, microbiological tests are considered laborious, time consuming and require a great demand for execution. Moreover, the microorganism is not capable of distinguishing different forms of folate, and the test result obtained is the total folate content. Other common failures include: inadequate test organism maintenance, dilution failures in the growth culture medium, contamination of glassware and reagents, range in time and temperature of incubation, extraction procedures, among others[1,6,7,19].

Nevertheless, the high performance liquid chromatography (HPLC) with ultraviolet-visible and/or fluorescence detection has been widely used for folates determination, with more efficient results than other methods usually employed as microbiological assays and radioimmunoassay[20]. In addition, most protocols suggest the use of enzymes (folate conjugase, protease, α-amylase) in the extraction process associated with the cleaning of the extract by affinity chromatography and separation by reversed phase HPLC[19] combined or not with ion pairing[16].

One of the greatest difficulties in adjusting chromatographic parameters derives from the extraction process of different folate forms in distinct foods. The extraction is influenced by the use of folate conjugase, amylase and protease; thus, the enzymatic treatment is considered the main source of variation in the folates content. In addition, there is little discussion about the buffers’ pH influence on the folate stability, which has contributed to the large amount of contradictory results in the literature[21,22].

Currently, the recommended methodologies for determination of most compounds with vitaminic function such as pyridoxine, piridoxalamine,

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Paiva EP, Costa MMA, Azevedo Filho CA

Folate – Analytical properties, bioavailability and stability in foods

piridoxalfosfate, niacin, nicotinamide, nicotinic acid and folate (especially) are considered contentious, making difficult their inclusion in the nutritional composition tables. This condition has raised the need to develop better pre-chromatographic and chromatographic conditions aiming at achieving more reliable and reproducible results on the analytical point of view.

2. Chemical nomenclature and stability

The term “folate” is usually described as a series of compounds with chemical structure and nutritional activity similar to the folic acid (pteroil L-glutamic acid, vitamin B9)[23]. This consists of one L-glutamic acid group linked to α-aminobenzoic acid group, which is turned into 2-amino-4-hidroxylpteridine[24]. More details are shown in Figure 1.

Folic acid standard is a yellow crystal of molecular weight 441.4 Da. Other forms have varied from 312 Da pteroic acid, to molecules of 445 and 473 Da as tetra-hydrofolate, formyl-tetra-hydrofolate for monoglutamates (Figure 1). It is usually found in nature at very low quantities; however, due to stability of synthetic form, it is used for food fortification and enrichment[25].

Folate has low solubility in water being more soluble in alkaline and saline media solutions. Low solubility occurs in acidic solutions (pH 2-4) where neutral forms and monocations occurs[7]. In a recent study[26], it was produced a chromatographic profile separating the six forms of folate prepared in NaOH and diluted with ammonium acetate 8 mmol/L-1 pH 6.8, where the same patterns were also diluted in water. In Figure 2, it can be noted that the low solubility in water results in loss of symmetry and strength of the analytical signal in HPLC with detection by DAD. Solubility increases with increasing pH especially for folic acid and pteroic acid that present the highest values of pKa. Pteroic acid is less soluble than folic acid over most of the pH scale. Folic acid solubility 202

A.

B.

Folate form

R1

R2 R3 Molec. Water pK Chemical weight solub. formula (g/l)

Tetraydrofolate

Glu

H

5-methyltetrahydrofolate

Glu

10-formyltetrahydrofolate

Glu

5-formyltetrahydrofolate

Glu

Folic acid

Glu

Pteroic acid

H

445.43 2.69x10-1 3.86 C19H23N7O6

CH3 H

459.45 3.32x10-1 3.87 C20H25N7O6

H COH 473.44 3.00x10-1 3.76 C20H23N7O7 CHO H

473.44 3.00x10-1 3.76 C20H23N7O7

H

H

441.40 7.61x10-2 4.17 C19H19N7O6

Carboxilic H

H

312.28 2.53x10-1 11.77 C14H12N6O3

Figure 1. Structural and chemical characteristics of the most commonly folates found in foods.

is influenced by the polar hydrophilic character of the α-carboxyl group. Polyglutamyl folates are more anionic than folic acid due to the presence of additional ionizable α-carboxyl groups. In a low pH, long chains of polyglutamyl folates are more hydrophobic than shorter chain since the α-carboxyl groups are highly protonated[6].

In United States Pharmacopeia[27] folic acid is the reference molecule. Structural variations may be identified in the oxidation states of the pteridine ring structure, especially at positions 5,10. Different forms of polyglutamate can be seen in Figure 1 according to the radical chain and the number of glutamates. In order to name these molecules, the International Union of Pure and Applied Chemistry-International Union of Biochemistry[24] established the main backborn rule, summarized below.

Scientia Chromatographica 2015; 7(3):199-222

Folate – Analytical properties, bioavailability and stability in foods

Paiva EP, Costa MMA, Azevedo Filho CA

4. Tetrahydrofolate is assumed to be replaced in the 5, 6, 7, and 8 positions, and diidrofolate is assumed to be replaced in the 7 and 8 positions unless otherwise indicated; 5. Substituent groups are indicated by prefixes combined with locations of the positions substituted. Substituent prefixes indicate that the substituent replaces one hydrogen atom in the parent structure in case of formyl, methyl, or two hydrogens in case of methylene and methenyl.

Folate exhibits the specific stability as an important property to the analyst. Eitenmiller and Lander Jr.[6] described many factors affecting folate stability in biological systems and during analysis.

Figure 2. Test of solubility of folate standards in two conditions of dilutions of stock solutions. Chromatogram A in 8 mmol.L-1 ammonium acetate, C18 100 mm x 2.0 5μm column, and chromatogram B in milli-Q water, C18 150 mm x 3.2 5μm column. 1. THF (rt. 1.67); 2. 5-MTHF (rt.2.47); 3.10-FTHF (rt 3.21); 4. 5-FTHF (rt. 4.93); 5. Folic acid (rt. 7.34); 6.Pteróico acid (rt. 11.17). Isocratic elution performed in 85% of potassium phosphate buffer pH 2.0 and 15% of MeOH, flow 0.5 ml/min. Stock solutions prepared in one ml NaOH 1mol.L-1 and ammonium acetate pH 6.8. rt - retention time.

1. Pteroic acid conjugated with one or more L-glutamate units are named pteroylglutamate, pteroyldiglutamate, and so forth. Folate and folic acid are synonyms for pteroylglutamate and pteroylglutamic acid, respectively; 2. “Folates” may be used to designate any members of the family of pteroylglutamates or mixtures with various levels of pteridine ring reduction, single-C substitutions, and according to the numbers of conjugated glutamate residues; 3. Reduced compounds are indicated by prefixes dihydro-, tetrahydro-, and so forth, with numerals indicating the additional hydrogen’s positions;

a. Loss of biological activity occurs through oxidative cleavage of the C-9 and N-10 bond. p-aminobenzoylglutamate is the major oxidation product at pH´s 4, 7, and 10. The H4 Folate is more susceptible to oxidation than folic acid. Reducing agents including ascorbic acid, 2-mercaptoethanol and dithiothreitol are usually employed in order to stabilize folates. b. Folic acid is more stable than naturally occurring folates at different temperatures. Usually, it still has good stability in 100 °C when protected from light and submitted to pH 5.0–12.0. c. 5-Formyltetrahydrofolate is stable at neutral pH. Under acidic conditions with heating, it is converted to 5,10-methenyltetrahydrofolate. d. The number of glutamate residues attached to the folate does not influence stability. e. Folate is cleaved through photochemical and reductive mechanisms. Ultraviolet radiation cleaves folic acid into p-aminobenzoyl-l-glutamic acid and 6-formyl pterin. The 6-formyl pterin can be further degraded into pterin-6- carboxylic acid.

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f. Folate is the chemical form used for food processing by enrichment; however, losses are variable in food according to the variations in food matrices, such as oxygen availability, chemical environment, heating extent, and folate forms. Cooking process usually involves the presence of large amounts of water, which can cause the removal or leaching of the vitamin. The liquid of canned food may contain a significant amount of folate that is originally present in the food in nature.

To prevent losses by oxidation, as well as in particular biological systems, some of researchers have tried the use of antioxidants, but their significance was revealed only after the 60’s. The most commonly used include: ascorbic acid, 2-mercaptoethanol and sodium ascorbate, seeking to prevent the oxidative processes during stages of extraction and cleaning[12]. Concentrations of antioxidants range from 0.1 to 2%; however, according to Arcot and Shrestha, (2005) 1% ascorbic acid buffers at pH 6.0 is a good working condition.

g. Presence of reducing agents (ascorbic acid) in food can increase folate retention during thermal processing. However metals (Fe2+) and additives including sodium nitrite used in some cured products can increase folate loss.

One of the most important information in public health is the availability of nutrients in foods. The folate reference values used in Brazil are based on the American Food Composition Table since the last version of the Brazilian Food Composition Table[28], developed at the Center for Studies and Research in Food (Campinas University -Brazil) - has no values of folates and folic acid to foods analyzed. In this situation, many of the guidelines and requirements about folate intake in Brazil can be considered inadequate. In turn, nutritional composition tables should be based on the reality of each country, considering environmental conditions (soil, climate, rainfall and solar incidence) which have strong influence on the distribution of micronutrients in foods.

h. Dissolved oxygen levels have an inverse relationship with folate stability. Thus, the best condition for the stability of folates is where there is a minimal quantity of oxygen. i. Folic acid is quite stable in dry products in the absence of light and oxygen reason why they are added to cereals and meals. The vitamin is stable in flour during storage and subject to only small losses during baking. Its stability is greater than that naturally occurring in most foods. The 5-methyltetrahydrofolate form is very stable in frozen or fresh vegetables and fruits.

During analysis, the cleavage of folic acid is influenced by pH, presence of reducing agents in the buffer, type of buffer used and complexity or nature of the matrix being analyzed. Many studies have shown that under identical heating conditions (approximately 100 ºC), folic acid and 5-formyltetrahydrofolate are fairly stable, while the 5-methyltetrahydrofolate and tetrahydrofolate are extremely labile[7]. Other drastic factors include pH and oxi-reduction associated to temperature depending on the matrices.

204

Folate – Analytical properties, bioavailability and stability in foods

3. Bioavailability

Recent studies using HPLC have outlined folate sources that naturally retains 50-1250 μg/100 g food.

Some examples include: mushrooms (91 μg/100g), wheat bran (94 μg/100g); artichoke (51 μg/100g), romaine (136 μg/100g), beets (109 μg/100g), marine algae (Laminaria ochroleuca - 161 μg/100g), bean sprouts (60 μg/100g), yeast (1250 μg/100g) among others. Lesser amounts (less than 50 µg/100 g) are found in meat and poultry, some vegetables and certain roots[4,29,30].

Bioavailability has been described as the efficiency in the intestinal absorption[31]. It is generally accepted that folate bioavailability is approximately 100% for folic acid supplements taken on empty stomach; 85% for folic acid consumed in foods (based on the absorption Scientia Chromatographica 2015; 7(3):199-222

Folate â&#x20AC;&#x201C; Analytical properties, bioavailability and stability in foods

from fortified orange juice) and 50% from others foods.

Since 85% of folic acid is absorbed when consumed with food and 50% food folate is absorbed, folic acid taken with food is 1.7 times more available than food folates[32].

Some factors can influence on bioavailability: intrinsic factors such as - age of individual, health and physical and, extrinsic ones - medium dissolved vitamin, chemical form of vitamin, antagonists (some pharmaceuticals and alcohol), and composition of diets/ food. The increased polyglutamate chain is generally considered to reduce bioavailability; however, folatesbinding protein from milk may increase folate absorption by protecting dietary folate from uptake by bacteria in the gut, thus increasing absorption in the small intestine[6].

The major source of folates is fortified cereals, followed by liver, yeast, vegetables, bread and its derived products, citrus fruits, juices and meat, poultry and fish[3,4]. In foods there is significant loss of this vitamin due to processes such as blanching, cooking under water, steam and microwaves that potentially cause leaching of vitamin. Many studies seek to examine the relationship between time and cooking temperature on the loss, once it is necessary to consider that folate loss must be measured on foods in its dietary intake form[33-35].

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was this method associated with foods containing high levels of antioxidants constituents may be increased up to 10% folates[34].

Freezing and thawing or any high-pressure treatment, both followed by blanching, may result in total folate losses of more than 55%. However, these processes can generate conversion of polyglutamates to monoglutamate by activation of endogenous folate conjugase plant tissue, for example leeks, resulted in increases between 65-100% in proportion of monoglutamates[35,36].

Evidently, freezing and thawing or high-pressure treatment disrupted plant cell structure, establishing contact between endogenous conjugase and polyglutamyl folate, thereby stimulating conversion of polyglutamate to monoglutamate. The blanching, when applied as main treatment, result in leaching of monoglutamyl folate from the damaged plant tissues. Blanching before treatments, inactivates one endogenous conjugase preventing the conversion of polyglutamyl folate into monoglutamate and, therefore, can reduce folate loss[1,36].

Processing methods used in service systems (boiling and oven baking) and minimal processing (microwave, vacuum and steam boiling) were evaluated in peas, broccoli and potatoes and it was observed that all these methods, as higher as the contact with water from cooking, tend to higher losses, so the vacuum process is the most recommended[33].

Different conditions of industrial food processing can lead to significant losses of micronutrients, particularly for wheat flour refined resulted in substantial losses of vitamin B complex, which has led to the requirement of fortification and enrichment. In this case, folic acid is added since it is the most stable form with minimal degradation (5%) in products with low humidity for long storage periods[37,38].

The presence of natural antioxidants in foods has also been investigated as protective element in the cooking process. The evaluation of 10 different precooked vegetarian ready meals before and after being reheated under three different cooking processes (oven, microwave and stove) demonstrated the difficulty in establishing a pattern of losses over cooking. The use of microwaves for most samples was the least aggressive for folate loss. What most attracted attention of researchers

Pfeiffer et al.[39] evaluated wheat flour, rice and pasta fortified and unfortified with folic acid (marketed in state Florida). The content of folates ranged from 10 to 29 Âľg/100g with unfortified flour and 84 to 120 Âľg/100g for fortified samples. This study demonstrates that fortification is a good alternative for increasing folate availability in food, since cooking process can result in significant losses in many cases.

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4. Methods of analysis

The analytical methodology for determination of folate in food usually involves three steps: 1. release of folate from matrix; 2. deconjugation forms of polyglutamates to mono-and di-glutamate and 3.

Identification and quantification by microbial activity through turbidimetric response[40]; high performance liquid chromatography (HPLC) coupled to UV-Vis[41], fluorescence[30] or mass Spectrometry (MS) detection[42] and radioimmunoassay[20]. Most studies involving folate analysis has used these three basic steps, so it is necessary further discussion about this process.

4.1. Procedures for extraction (enzyme and others techniques)

During the 90´s, a large number of studies were performed aiming at improving the process of folates extraction. Eitenmiller et al.[43] developed a method considered more efficient than the traditional one. Until then, folates extraction was performed only with folate conjugase - γ-glutamyl hydrolase (GH, EC 3.4.19.9) and heating of the matrix at 100 °C in a specific buffer.

Currently, similar heating combined with the use of α-amylase, protease and folate conjugase - known as a trienzyme extraction – suppose to allow complete extraction of folates from the matrix, especially those which are tightly bound to proteins and carbohydrates[12].

The heat is used to inactivate enzymes that can catalyze folates degradation or their interconversion, and combined with the use of amylase and protease allows complete digestion of carbohydrates and proteins, releasing folates that may be closely linked to the matrix. The folate conjugase plays the additional role in hydrolyzing polyglutamates to monoglutamate; in this way folate may be used in various methods including quantification by HPLC[22,30,44].

Recent studies focusing on trienzyme treatment efficiency have identified that fruits and vegetables do not require the use of enzymes, cereal and flour can be properly treated by using amylase and folate conjugase while legumes and foods rich in protein may require the 206

Folate – Analytical properties, bioavailability and stability in foods

use of three enzymes[30,45]. Therefore, the characteristic of each matrix is what decides the sample treatment.

Regarding the plants, due to the natural conversion of polyglutamate into monoglutamate, folate conjugase can also be dispensed[33-35].

Protease and amylase can be obtained commercially.

However, folate conjugase or gamma-glutamyl hydrolase (GGH) are usually extracted from different sources such as chicken pancreas, pig kidney, human plasma and rat plasma, although it is marketed. Despite the differences in the results obtained in the literature and acquisition costs, it has been carried researches to reproduce some protocols, which are summarized in Table 1[19,21,22,29,30,33,41,46-50].

The most used source for folate conjugase is the chicken pancreas. The GGH acts under optimum pH of 7.8 and produces di-glutamate as final product[7]. However, Tamura (1998)[12] considered as the most adequate folate conjugase that one obtained from rat plasma, since it is easy to prepare and endogenous folates can be removed.

The final product is monoglutamate, which is ideal for chromatographic assays.

One of the greatest difficulties in standardizing extraction methods is the pH influence, buffer composition and nature, temperature and antioxidants required by the different food matrices. In order to complete extraction of folates from human milk, Lim et al.[52] have standardized ideal conditions: extraction temperature at 100 ºC for 5 minutes in 0.1 mol.L-1 potassium phosphate buffer, pH 4.1 enzymes action - protease and amylase and subsequent treatment with rat plasma conjugase in pH 7.0. Therefore for each matrix it is necessary optimize the ideal conditions of extraction.

Some studies have targeted the choice of extraction buffer in relation to food pH, for example for acid food is preferably the use of acetate buffer (pH 4-5).

However, due to increased folate stability in alkaline conditions, it has been practiced using phosphate buffer (K2HPO4) or combination of buffers CHES (Acid 2 Scientia Chromatographica 2015; 7(3):199-222

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Table 1. Extraction conditions of folate conjugase from different sources.

References

Source of conjugase enzyme

Extraction methodology and stability conditions

[47]

Pig kidney

Conjugase kidney pig prepared according to Gregory et al., 1984.

[46]

[48] [19]

Fresh rat plasma Rat blood was collected with heparin and centrifuged at 3000 g for 15 ‘. Plasma collected was transferred to 100 ml dialysis buffer Pig kidney - 50 mM CHES buffer and 50 mM HEPES buffer. pH 7.85 dialyzed for 24 h at 4°C. The rat plasma dialysate was stored in portions of 0.5 mL for up to 3 months at -80°C. The activity of plasma was checked with pte-glu3 in 40 mmol PteGlut3 desconjugado for 20 minutes at 37°C. The reaction environment for conjugase was 75 mM K2HPO4 containing 1% ascorbic acid and 0.1% 2-mercaptoethanol, pH 4.5. The method of Lineweaver-Burk was used to calculate the kinetic parameters of yield Km; The material obtained from a slaughterhouse and quickly stored in ice. 800g of kidney tissue were homogenized at 2°C in 2.400 ml of 10 mM 2-mercaptoethanol. The suspension was adjusted to pH 5.0 with 1M acetic acid, and then centrifuged at 10,000 g for 20 minutes at 2°C. The supernatant was heated to 50°C water bath for two hours with gentle agitation. And then recentrifuged at 10,000 g for 20 minutes at 2°C. The resulting supernatant fraction, which was precipitated in ammonium sulfate at a concentration of 50 to 75% and dialyzed overnight with 0.05 M potassium acetate, pH 5.0,containing 10 mM 2-mercaptoentanol 2°C. 24 mg protein per mL, was stored in small portions at -35 ° C until used. This preparation was stable for up to 10 months under these storage conditions.

Fresh human plasma

Fresh human plasma used in deconjugation without any pretreatment in aliquots of 10 ml.

Chicken pancreas Conjugase pancreas of chicken and of rat’s plasma prepared according to Konings, 1999, and pig kidney conjugase prepared Rat plasma fresh kidney as described by Pedersen 1988. Each preparation of conjugase activity was analyzed using PteGlu3 (35 to Pig kidney 80 nmol) as substrate - of rats plasma, 500 ul in 30 ml of 100 mM phosphate buffer pH 7, containing 1% L-ascorbic acid, 2 h at 37°C. pig Kidney: 500 ul in 30 mL of 100 mM phosphate buffer pH 4.5, containing L-ascorbic acid, 2 h at 37°C. Chicken pancreas: 5 mg in 100 ml of 30 mM phosphate buffer pH 4.5, containing L-ascorbic acid, 1 h at 37°C.

[29]

Pig kidney

[49]

Rat plasma Human plasma

[50]

Fresh human plasma

Fresh human plasma without any pretreatment purification was added to extract the food matrix. Before using the activity of human plasma conjugase was evaluated by 0:34 mmol PteGlu3 as substrate at pH 6.0 in 0.05 M CHES-HEPES buffer containing 2% sodium ascorbate and 0.01 ml of 2-mercaptoethanol at 37°C for 4h. The mixture was filtered after incubation and denaturation and injected without any purification. The conjugase activity was considered to be adequate when the peak area of ​​folic acid was greater than 90% of the total area of Pteglu3 folic acid.

[22]

Rat plasma

10 ml of rat plasma was dialyzed in three steps of 40 minutes each, using 800 ml of 50 mM phosphate buffer, pH 6.1 containing 0.1% 2-mercaptoethanol at each step. Dialysis was carried out under agitation at 4°C. The activity of folate conjugase was checked using Pteglu3 as substrate at 37°C as described by Pfeiffer, 1997. Concentrations of PteGlu3 and folic acid produced were measured by UV detection at 290 nm using HPLC methodology. The dialysate of rat plasma was stored at -20°C for 1 month. To avoid a possible adverse effect due to freezing and thawing, during storage in a freezer, the serum of rat plasma was stored in small portions (0.5 mL). The enzyme activity was always checked prior to use.

[33]

Rat plasma

Rat plasma was prepared according Patring et al., 2005.

[30]

[51]

Suspension of pig kidney conjugase was prepared according to Phillips and Wright (1983), by homogenization of 10g of pig kidney acetone powder in 100 ml of L-cysteine ​​hydrochloride (10 mg/ ml, pH 4.6 adjusted with NaOH and incubated for 4 h at 37°C and then centrifuged at 40.000 g for 30 ‘. The supernatant was added 20 ml of a mixture of charcoal and dextrin prepared by adding 1 g of dextrin per 10g of charcoal with a final volume of 100 ml of distilled water. After 30 minutes at room temperature the mixture was centrifuged and the supernatant fraction resuspended with 100 ml of L-cystein ​​hydrochloride and stored at -20°C. The enzyme was isolated from the resulting supernatant according to Gregory et al., 1984. The activity of each enzyme preparation was checked using PteGlu3 as a substrate in 0.1 M acetate buffer (pH 4.9) containing 1% sodium ascorbate at 37°C. PteGlu3 concentrations and folic acid produced were measured by HPLC with UV detection.

Rat plasma and lyophilized human plasma obtained from Sigma, reconstituted in 0.1 M potassium phosphate buffer pH 6.0.

Chicken pancreas Lyophilized chicken pancreas and of rat plasma were used as a source of folate conjugase. Suspension of chicken pancreas Rat plasma (5mg/ml) was prepared starting from 50 mg of freeze-dried chicken pancreas. Rat’s plasma was dialyzed to remove endogenous folate according Patring et al., 2005, and was stored in portions of 0.5 ml at -20°C for up to a month.

Rat plasma in pilot study

Rat’s plasma lyophilized was re-suspended in extractor solution.

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(-N-cyclohexylamine) ethane sulfonic acid) and HEPES buffers (acid 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine-ethanesulfonic acid) both with pH between 6 to 8[12].

In flour samples (high in starch) Pfeiffer et al. guided solubilization buffer CHES and HEPES combined with rat plasma folate conjugase treatment followed by protease for folates extraction.

Osseyi et al.[53] recommended phosphate buffer without conjugase treatment, but using amylase. Yazynina et al.[30] demonstrated that the combination of temperature (70°C), phosphate buffer and conjugase would be enough for a complete release of folates in the matrix.

[39]

Since the 60’s the use of antioxidants has become essential for analysis, once the high degree of instability of folates, in particular of tetrahydrofolate, has generated conflicting results in the literature. Thus, the use of 1% ascorbic acid has become common practice, combined with other antioxidant such as 2-mercaptoethanol and 2% sodium ascorbate[12].

However, few studies have been conducted on the best combination of antioxidants to ensure the stability of folates; it is little discussed mainly due to the difficulty to associating the best combination of antioxidants in relation to the buffer extractor. Patring et al.[22] evaluated the effectiveness of antioxidants as stabilizing agents of folate in extraction stage. Four antioxidants: 2-mercaptoethanol, dithiothreitol, 2,3-dimercapto-1propanol and 2-thiobarbituric acid (0.1%), in combination with sodium ascorbate 2% were tested in sodium acetate buffer (0.1 mol.L-1, pH 5.0), phosphate buffer (0.1 mol.L-1, pH 6.1) and CHES-HEPES (0.1 mol.L-1, pH 7.8).

The findings showed that the effectiveness of each antioxidant to protect folate does not depend significantly on the buffer used, despite some minor variations. However, 2,3-dimercapto-1-propanol in combination with sodium ascorbate showed the best combination for protecting of folic acid mainly due to its lower toxicity and more effective[22].

208

Folate – Analytical properties, bioavailability and stability in foods

Cleaning and pre-concentration of sample is another step usually employed, since the efficiency of HPLC studies assumes that the extraction protocol should ideally be efficient in isolating the target analyte and eliminates the interfering compounds[54]. Currently, solid phase extraction (SPE) is the most commonly used method after the extraction procedure.

The most used ligands for folate purification are strong anion exchangers and materials based on trimethyl-amino-propyl-silica as aminopropyl, phenyl, cyclohexyil and octadecylsilane, because they provide good recovery of different folate forms[55]. However, it does not allow a pre-concentration of sample, due to its capacity factor and need for a large volume of elution buffer for quantitative folate. In addition to this problem, there is low selectivity for 5-methyltetrahydrofolate, which generates co-eluting compounds that interfere with peaks obtained by the HPLC[55].

Due to such difficulties, Nilsson et al.[55] tested several materials capable of binding to silica, including trimethyl-amino-propyl, phenyl and cyclohexyl in order to find the sorbent that provide better recoveries and selectivity.

It was concluded that SPE systems consisting of phenyl cartridges were better than others, but any cartridge has offered sufficient selectivity in removing compounds that interfere in the chromatographic peaks.

One of the biggest problems during extraction and cleaning is the instability of various folate forms, due to their redox potential and low levels found in some samples[56]. For this reason the inclusion of one more step, such as the use of SPE should be analyzed and really contribute to the cleanup of the material analyzed.

Therefore, it behooves the analyst to evaluate the benefit of including the solid phase extraction (SPE) method as an additional alternative to purification.

However, the higher the number of steps the longer the sample and consequently the analyte of interest are exposed to contamination, degradation, temperature Scientia Chromatographica 2015; 7(3):199-222

Folate – Analytical properties, bioavailability and stability in foods

variation among other things, increasing the chances of analytical error in addition to there being longer time spent in the analysis[22].

Considering the importance of the extraction protocol to the success of the method, we developed in 2012 a systematic study of folate extraction conditions in vegetable samples. This was subdivided into pilot study and factorial design. The pilot study was conducted with enzyme treatment showing that the number of steps and time imposed by the enzyme treatments result in losses of vitamin content. Subsequently, a factorial design study was conducted, confirming the result observed in the pilot study. The factorial design showed that factors such as increased extraction temperature and long periods of analysis time cause significant losses of the vitamins under analysis[51].

Among the most controversial elements of this protocol, there is the lack of the enzyme conjugase folate use. It is known that the conversion of folates from polyglutamates to monoglutamates can also occur spontaneously, especially in vegetables, because they are equipped with an enzymatic system that is activated primarily after damage occurs to the plant or during the process of maturation. These bring new methodological perspectives for analysis of vegetable folates, which was adopted as a line of work by us. It is worth noting that the specificity of the matrix is usually overlooked in search of standard extraction protocols for any matrix, which is considered by us to be the one of the greatest sources of variation in published results, especially in the 1990s.

The literature contains several protocols for extraction, falling to the analyst to decide the number of stages required for each matrix and its degree of difficulty in accessing folates. In Table 2 are summarized the main processes of extraction and cleaning used for the different chemical folate forms found in foods.

4.2. Chromatographic procedures

Currently, HPLC is the most recommended method to identify the different chemical forms, in

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particular to evaluate vitamins in food and other matrices.

This is justified by the technique’s versatility that can be used for identification of complex matrices or presence of other substances such as isomers and degradation products[17].

However, the choice for the best separation performance in HPLC requires knowledge of the main chemical characteristics of the analyte of interest, which include: chemical structures, molecular mass, chromophoric units, the presence of ionic charge, and solubility index of the compound. Those characteristics, when combined with the parameters of separation capacity factor (k) in the range 1≤ k≤10, resolution (Rs) with an optimal value greater than 1.5, separation factor (α) with the ideal value greater than 1.5 and symmetry lower than 1.2, when taking 10% of peak height, allow the choice of stationary phase, mobile phase and detector[60].

The most used stationary system in HPLC separation of folate are columns filled with octadecylsilane (C18) and some cases octilsilane (C8).

The lengths ranging between 10-25 cm, 3-4.6 mm in inner diameter and 5 micrometer particle, which produce separation with mobile phase consisting of solvents with different polarities[16,23,29,30,41,53,57-59,61].

Jastrebova et al.[29], analyzing folates in raw and processed beets showed better separation of some folate forms with packed octilsilano (C8) columns resulting in more symmetrical peaks.

The mixture of aqueous and organic solvent and other agents to ensure suitable polarity has allowed good separation in some folate forms, depending on the charge and pK of the molecule[56]. Solutions using potassium phosphate and their buffers are the most commonly used in mobile phase composition, at pH range of 6.8 - 2.1.

Other conditions used included HEPES and CHES buffer pH 7.8; 2% solution of acetic acid and acetate ammonium pH 6.0[16,23,29,30,41,53,57-59].

Due to the ionic characteristic of folate, it may be necessary to add ionic additives in the mobile

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Folate – Analytical properties, bioavailability and stability in foods

Table 2. Procedure for extraction and cleaning of food matrices for folates analysis.

References

Food matrices

[16]

Vegetables and berries.

[39]

Wheat flour for bread, white bread, white rice, spaghetti, breakfast cereals, brown rice fortified and unfortified.

[53]

[57]

210

Extraction condition

Enzymatic treatment

Potassium phosphate buffer 1-α-amylase for 3 hours, adjust (pH 6.0, 4.9 and 7.85), pH 4.9 (for samples rich N2 flow, storage in starch) at -20 ° C 1 week 2 - hog kidney conjugase at before analysis.

37°C for 3-5 hours.

CHES pH 7.85 HEPES buffer (50 mM) of each, mixed for 10 minutes, 100°C.

Cleaning conditions

Antioxidant system

SPE strong anion exchange (SAX).

Was not used.

Treatment 1 - rat plasma Affinity column (Affigel conjugase 50 µl (1.2 and 4 h 10 - Folate Linked 37°C pH 6.2 to 7.5).

Protein) equilibrated Treatment 2 - rat plasma with 0.1 M potassium conjugase 50µl and α-amylase phosphate buffer (pH 7.0) (1.0 mL) 37 ° C followed by 4h mobile phase, 0.02 M protease 2.0 mL 37°C 4h. 5000 g trifluoroacetic acid and centrifugation 10 minutes.

0.01m dithiothreitol. Flow of 3 mL / min.

2% sodium ascorbate and 10 mM 2-mercaptoethanol during extraction and cleanup.

Fortified breakfast cereals based on corn, wheat and oats.

Phosphate buffer (0.1 M, α-amylase solution (25 mg / mL, SPE strong anion pH 8 - 9 with antioxidant 1 mL was used per g of sample exchange (SAX), system, stirring for 1 hour to 65 ° C for 1 hour) by 5000 g conditioned with hexane 50 minutes, adjusted pH 6.9, centrifugation for 15 minutes. and methanol. Mobile N2 flow to stock up to phase, 0.1 M sodium 3 months. acetate pH 4.5 (with antioxidant system).

0.05% ascorbic acid (cleaning) and 0.05% sodium ascorbate (extraction).

Chickpeas, beans, salami, ham and Italian reference material.

Dried vegetables: CHES and Conjugase pig kidney (pH HEPES buffer pH 7.85; samples 4.9, 37°C for 3 h. 1ml to 25 ml of animal origin: phosphate sample) + α-amylase (20mg/ml) buffer (pH 6.0 0.1 M), both After 2 hours: protease - N2, flow 10 minutes at (2mg/ml) pH 7.0, 37°C for 1 hour 100°C, centrifugation 30 min centrifugation 11,950 g for 13.500 rpm (2.5g sample to 15 minutes.

35 ml buffer).

[19]

Yeast, spinach, beef, Potassium phosphate buffer liver, peas, fruit (pH 7.0) 100°C juice, egg yolk, milk for 10 minutes powder, wheat flour, centrifugation at apple.

5000 rpm 10 minutes.

[23]

Apple juice, cherry nectar, nectar and black cherry fruit juices fortified nine.

Was not used.

A - Conjugase chicken pancreas (2 hours at 37 ° C), or rat plasma conjugase (37 ° C for 1h) B - pronase, α-amylase (pH 6.0 / 100 ° C 10 ‘), adjust pH 7.0 Centrifuge at 5000 rpm for 10 minutes. Conjugase pancreatic chicken (2 h at 37°C), or rat plasma conjugase (37°C for 1 hour).

Was not used.

Affinity column (Affi Gel 10 - Protein Linked to Folate) low pH mobile phase elution - trifluoroacetic acid at a flow rate <1μg of sample (78-113% recovery).

2% sodium ascorbate, 10 mM 2-mercaptoethanol (vegetable sample), 1% sodium ascorbate and 0.1%2-mercaptoethanol (animal samples).

Affinity column 1% of L - ascorbic acid, (Affigel 10 - Protein the extraction step and Folate Linked) pH 40% L-ascorbic 7.0. And elution with acid in pre-column trifluoroacetic acid and conversion of folates to dithiothreitol in 5-methyltetrahydrofolate.

3ml/min flow.

SPE strong anion exchange (SAX) (two cartridges in series) activated with n-hexane, methanol and water.

Mobile phase-sodium acetate containing 0.1M sodium chloride 10% (w/v) with the antioxidant system.

1% L-sodium ascorbate (in cleanup step).

Scientia Chromatographica 2015; 7(3):199-222

Folate – Analytical properties, bioavailability and stability in foods

Paiva EP, Costa MMA, Azevedo Filho CA

Table 2. Procedure for extraction and cleaning of food matrices for folates analysis.

References

Food matrices

Extraction condition

Enzymatic treatment

Cleaning conditions

Antioxidant system

[29]

Beetroot raw and processed and mixed vegetables (reference material).

Phosphate buffer (pH 6.0 with 0.1M antioxidant system and N2 flow at 100°C 10 minutes, adjust pH: 4.9.

Conjugase pig kidney (10 mg / ml - solution of L-cysteine ​​hydrochloride at pH 4.9 at 37 ° C for 3 hours) 27 000 g centrifugation for 15 minutes.

SPE strong anion exchange (SAX) anion exchanger cartridge conditioned with methanol and water mobile phase, 0.1 M sodium acetate containing 10% sodium chloride (w/v) with the antioxidant system.

2% L-sodium ascorbate and 0.1% 2-mercaptoethanol (extraction step) and 1% ascorbic acid and 0.1% 2 mercaptoethanol (cleanup step).

[49]

Orange juice concentrate, enriched refined wheat flour, frozen spinach, nonfat milk powder, infant formula SRM 1846, whole wheat flour BCR 121, BCR 421 milk powder, frozen vegetable mix BCR 485 (reference samples).

0.1 M potassium phosphate, pH 6.0.

For orange juice the initial pH of the mixture was adjusted from 4.8 to 6.0. It used 1 mL of amylase incubated at 37°C for 1 hour. 1 ml of protease solution for 3 hours incubation at 37°C and 0.2 mL of rat plasma was added and incubated at 37 ° C. Heating at 90 ° C water bath for 15 minutes. 4000 g centrifugation for 20 minutes.

SPE - silica anion exchanger cartridge (styrene-divinylbenzene). Conditioned with 0.1 M phosphate, pH 6.0 and 1M sodium chloride containing 250 mL / L acetonitrile.

10 mM mercaptoethanol, 10 mM ascorbic acid and 10 mg L sodium azide.

[41]

Seaweeds of Spain.

Phosphate buffer (pH 6.0 with 75 mM antioxidant system and N2 flow) shake 20 seconds, 100°C 10 minutes after centrifugation 11,000 g for 20 minutes, adjusting the pH to 4.9.

Conjugase pig kidney (1 mL of conjugase for 3 mL of sample with N2 flow) 3 hours 37°C pH 4.9.

SPE - anion exchanger cartridge conditioned with methanol and water. Mobile phase, 0.1 M sodium acetate containing 10% sodium chloride (w/v) with the antioxidant system.

0.1% mercaptoethanol and 2% ascorbic acid (extraction step) 1% ascorbic acid (in cleanup step).

[58]

Pig liver, milk powder and mixtures of vegetables (reference material).

Crushed material at 0.05 mol/L-1 ammonium acetate (1 g sample/ 9 mL solution), ultrasonic bath 10 minutes.

Was not used.

Purification of the extract with trichloroacetic acid and volume completed with 5μL ammonium acetate.

Was not used.

[59]

Fortified beverages (milk, fruit nectar, yogurt, sports drinks).

Was not used.

Was not used.

SPE - strong anion exchange (SAX) cartridge conditioned with methanol and water. Mobile phase - methanol (3 mL) and sodium acetate (20 mmol/L-1 50:50) pH 4.

Was not used.

Scientia Chromatographica 2015; 7(3):199-222 211

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Folate – Analytical properties, bioavailability and stability in foods

Table 2. Procedure for extraction and cleaning of food matrices for folates analysis.

References [30]

[51]

Food matrices

Extraction condition

Enzymatic treatment

Cleaning conditions

Antioxidant system

Products free of 80mL potassium phosphate gluten (corn starch, buffer in 0.1 M, pH 6.2 for potato starch, rice each 1 g sample, 1 hour flour, mix flour, three at 75°C after 15 minutes varieties of bread centrifugation 27.000 g 4°C, without the use of the supernatant obtained gluten and lactose subsequent free). to step.

Vegetables.

Treatment 1: deconjugation SPE - silica cartridge, 2% (w/v) sodium extract (5.75 ml) with 144μl of using vacuum ascorbate and 0.1% (v/ v) rat plasma dialysate at 37°C for pressure to the flow. mercaptoethanol.

3 hours. Or 750μL of chicken Conditioning with pancreas extract to 30 mL at methanol (2 x 2.5 ml) 37°C for 3 hours followed by the 0:03 Treatment 2: α-amylase mol/L-1 H3PO4 containing solution (40μL) for each 80mL 1% ascorbic acid. of extracting at 100°C for 10 minutes or 75 ° C for 1 hour.

After following a treatment 1 Treatment 3: Use the 2 treatment added 0.8 mL of protease solution at 37°C for 1 hour. Centrifugation at 27.000 g for 15 min at 4°C. 1 mL of the liquor and Rat’s plasma lyophilized was Fiber fraction was Ascorbic acid 1%. one gram of fiber were re-suspended in extractor filtered through transferred to a test tube solution and 250 µL were used qualitative filter paper and each fraction were to treatments. The tubes were (whatman paper added 20 mL of extraction incubated at 37°C for 1 h in 50 × 50). solution (ammonium water bath. The enzymes acetate 50 mmol L−1 inactivation was carried out at containing, ascorbic acid 1% 100°C for 5 min, and tubes were and 2-mercaptoethanol placed in ice bath for cooling.

10 mmol L−1 for all treatment except control), then stirred in vortex for 20 s and heated at 40°C for 10 min in water bath.

Label: H4 folate - tetrahydrofolate; 5-CH3-H4 folate - 5-methyltetrahydrofolate; 5-HCO-H4- folate - 5-formyltetrahydrofolate; 10-HCO-folate- 10 - formyl folic acid; 5,10-CH2-H4-folate 5,10-Methylenetetrahydrofolate; 5,10-CH +-H4-folate - 5.10-meteniltetraidrofolato; 10-HCO- H2-folate - 10-methyl folic acid; 10-CH3-folate - 10-methyl folic acid.

phase in order to avoid possible interactions with the repulsive negative charges of the silanol that can generate inaccessibility of molecule in its anionic form[62]. Ion pairing agents as triethylammonium can be added to change the pK of the analyte improving the resolution and separation of the different folate forms[23,53].

In reversed phase columns that use binary mobile phase - acetonitrile or methanol in combination with water, the retention time of the analyte can be decreased with increasing in the concentration of organic solvent.

This can be accomplished isocratically or gradient mode[62].

212

Folate separation has been used frequently in systems of gradient elution in order to ensure the study of the main forms, tetra-hydrofolate, 5-methyltetrahydrofolate and folic acid[29]. In contrast, this condition implies some disadvantages, such as the need for re-equilibration the column, which results in variations in the baseline, increased analysis time and solvents spent[17].

So far only Patring and Jastrebova[63] investigated the effects of buffer nature and mobile phase composition on sensitivity and selectivity in chromatographic separation of folates by detection mass spectrometry.

A ternary mixture in gradient mode of acetonitrile, Scientia Chromatographica 2015; 7(3):199-222

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methanol and aqueous acetic acid at pH 3.4 combined with gradual addition of methanol up to 8% allowed the separation of two usually overlapped forms -10-formylfolic acid and 5-formiltretrahydrofolate, stable baseline and resolution Rs≥1.5 in LC-MS. This was the first study to investigate the patterns ionization of 5-methyltetrahydrofolate, tetrahydrofolate, 10-formylfolic acid, 5-formyltetrahydrofolate and folic acid describing them on basis of its acid-base properties.

It was investigated the intensity of mass spectrometer signal in positive and negative ion mode, and despite considerable differences in pKa-values, all folate derivatives exhibited similar responses for abundant positive ions.

More recently, Jastrebova et al.[64] compared the efficiency of folates analysis in UHPLC and HPLC using columns with similar surface chemistry, however, with particle sizes of 3.5 and 1.7 μm. The use of columns filled with particles smaller than 2 μm allows the reduction of analysis time from 45 to 15 min at a temperature of 30 °C. When a 60-degree temperature is employed, the analysis time is reduced to 5 min with no degradation of the forms of folate investigated.

The use of small sub-2μm particles allowed the reduction of the analysis time from 45 min to 15 min at 30 °C and 5 min at 60 °C with no degradation of folates.

Table 3 shows the main types of mobile phases, columns and elution mode used in the analytical resolution for different folate forms.

4.2.1. Identification and quantification techniques

The low concentration of folates (below ng) in most foods limits the applicability of separation techniques and emphasizes the need for more sensitive detectors[7]. The types of detectors vary among non-destructive (UV-Vis, fluorescence, light scattering and refractive index) and destructive (mass spectrometry and flame ionization)[17].

To determine folate, UV-Vis detector at 280290 nm wavelength (λ) and fluorescence in which the

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wavelength varies with the type of folate[56] have been used. Excepting folic acid and pteroic acid, all folates forms exhibit fluorescence, allowing identification and quantification in better sensibility. For example, to tetrahydrofolate, 5-methyltetrahydrofolate, 5-formyl­ tetrahydrofolate, it is chosen 290 nm excitation and 356 nm emission and for 10-formylfolate 360 nm excitation and 460 nm emission[16,45].

UV-Vis detectors are able to distinguish most of the folate forms and show a good correlation with microbiological tests for various foods, although its sensitivity is decreased in comparison with other detectors[7]. Moreover, they can provide excellent results, especially when detectors are capable of operating at more than one wavelength (λ) by executing an alternative λ program[17].

Most detectors operating in multi-channel can also provide UV spectrum of the analytes in elution if properly programmed and measured. With this tool, it is possible to determine the homogeneity for the peak obtained from the ratio of the absorbances obtained from standards and samples, they must be constant throughout the analytical process. The normalization procedure is applied for two spectra (or more than) and then the ratio for each should be constant for homogeneous peaks[17,65].

However, it is necessary a relatively large database, capable of confirming the chemical compounds of different groups. In the case of folate acid and folates, the spectra obtained will suffer influence of the solvent used, which can lead to an increase or decrease in the signal intensities depending on the chosen solvent (Figure 2).

In Figure 3, it is presented the most frequent spectral profiles of six folate forms in food. Studying of the spectral profile is a useful tool during the process of identification and confirmation of signals. It is known that these can be modified according to the diluent; however, the areas of higher absorptivity can be confirmed accurately by DAD detection and still further

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Table 3. Mobile phases and columns used in HPLC for separation of folates.

References

Stationary phases

Mobile phases

Standard (time retention min)

[16]

Reverse phase - C18 (5µm, 250 x 4.6 mm) C18 guard column (3μm, ​​150 x 4.6 mm).

Reverse-phase C18 (4.6 x 250 mm 5.0 µm).

Acetonitrile and potassium phosphate buffer.

H4-folate (20.0), 5-CH3-H4-folate (23.0), 5-HCO-H4 folate (25.4).

[39]

[53]

[57]

[19]

[23]

[29]

[49]

214

Elution conditions

Gradient, initially 9% acetonitrile gradually increasing to 25% by 14 minutes, total time of analysis 30 minutes.

Acetonitrile and phosphoric Folic acid (27.0), 5-HCO-H4 folate (24.7) Gradient 5% acetonitrile maintained acid (33mmol/L-1 pH 2.3).

5-CH3-H4-folate (21.1), for 8 minutes then increased to 17.5% 10-HCO-folate (23.7), in 25 minutes, total time of analysis 33 10-HCO-H4-folate (21.9) minutes.

Reverse-phase C18 Methanol and potassium Folic acid (15.0) Isocratic, Methanol (24-26%) (100 x 4.6 mm, 3μm) phosphate buffer and aqueous phosphate and C18 guard column (0.0035 M KH2PO4 and buffer (76-74%).

(30 x 2.1 mm, 5µm).

0.0032 M K2HPO4 pH 6.8) containing 0.005mol/L-1 tetrabutylammonium dihydrogen phosphate.

Reverse phase - C18 column Acetonitrile and H4-folate (20.7), 5-CH3-H4-folate (24), Gradient, starting with 5% acetonitrile (150 x 4.6 mm, 3 µm). phosphate buffer 5-HCO-H4-folate (27.3), folic acid (8.28), maintained for 9 minutes, progressing (pH 2.2 30 mmol/L-1).

10-HCO-folate (5.26) to reach 17% within 30 minutes, and 5,10-CH2-H4-folate; 5,10-CH+-H4-folate, then finishing the race.

10-HCO-H4-folate (24.4).

Reverse-phase - C18 Folate monoglutamate: 10-formyltetrahydrofolate; Folate monoglutamate: Gradient, (250 x 5 mm 5 µm) Acetonitrile and phosphate 5,10-methenyltetrahydrofolate; started 8 minutes with 5% acetonitrile and C18 guard column buffer (pH 2.3) 5,10-methylenetetrahydrofolate; folic reaching 10% in 8 to 10 minutes, and (4x4 mm 5 µm).

5-methyltetrahydrofolate: acid polyglutamates; tetrahydrofolate; 20% between 10 and 17 minutes.

Acetonitrile and phosphate 5-methyltetrahydrofolate; Final composition of the mobile buffer (pH 4.6) 5-formyltetrahydrofolate; phase 20% acetonitrile maintained 10- quantum yield of some for 5 minutes. Return to initial folates present obstacles to composition in 15 minutes. Gradient 4 Formyltetrahydrofolate 5-methyltetrahydrofolate started 5-CH3-H4-folatePteglu1-18 100% phosphate buffer, increasing to (10-20 min).

10% acetonitrile in 15 minutes and 20% in 20 minutes. Return to initial composition of 45 minutes.

-1 Reverse-phase C18 Solution 5mmol/L tetra-nFolic acid Gradient; Start isocratic 10% B for (250 x 4.6 mm 5.0 µm) butilamonium hydrogen with (16.9).

10 minutes, B was increased to 36% guard column C18 25 mmol/L-1 sodium chloride in 15 minutes, 50% in 35 minutes (4.0 x 20 mm 5.0 µm). in water(a) and dihydrogen in 38 minutes turned the initial orthophosphate potassium composition, so it remained for 5 ‘. phosphate (1 mmol/L-1 in water) (b) and 65% acetonitrile.

Reverse-phase C8 Potassium phosphate buffer H4-folate (15.8), 5-HCO-H4-folate Gradient, started 6% v/ v acetonitrile (150 x 4.6 mm, 5 µm) (30 mmol/L-1 pH 2.3) and (21.7) 5-CH3-H4-folate (17). for 5 min reaching 25% in 20 minutes and guard column acetonitrile. and remained for 33 minutes.

(12.5 x 4.6 mm, 5 µm).

Reverse phase - C18 column 30 mmol/L-1 potassium Folic acid (19.0), 5 minutes with 99% mobile phase A (150 x 4.6 mm, 3 µm). phosphate pH 2.2 (mobile 5-CH3-H4-folate (15.6). and 1% mobile phase B in 20 minutes phase) with 10 mg/l sodium and then the gradient was adjusted azide and acetonitrile to 80% and 20% B, followed by a step (mobile phase b). gradient of 60% A for 5 minutes, after return to the initial condition.

Scientia Chromatographica 2015; 7(3):199-222

Folate – Analytical properties, bioavailability and stability in foods

Paiva EP, Costa MMA, Azevedo Filho CA

Table 3. Mobile phases and columns used in HPLC for separation of folates.

References [41]

[58]

[59]

[30]

[51]

Stationary phases

Mobile phases

Standard (time retention min)

Elution conditions

Reverse-phase C18 Phosphate buffer 5-CH3-H4-folate (5.09) H4-folate (5.04), Gradient: start 4 minutes 10% (5µm, 250 x 4.6 mm) 30 mmol/L-1 (pH 2.2) 5-HCO-H4-folate (8.5), folic acid (9.00). acetonitrile, 8 minutes 15% acetonitrile C18 guard column and acetonitrile. and return (5µm, 15 x 4.0 mm). the original composition.

Reverse-phase - C18 column 2% acetic acid adjusted to H4-folate (19.12) 5-CH3-H4-folate Gradient, started 100% solution (5 µm, 250x 4.6 mm) and pH 2.8 with potassium (20,50), 5-HCO-H4-folate (22.50) acidified, reaching 76% in 25 ‘, C18 guard column hydroxide (solution acidified) 10-HCO-folate (21.52) 10-CH3-folate and kept until the end of the (5 µm, 10 x 4.6 mm). and acetonitrile.

(27.72), folic acid (26.14). analysis for 31 minutes.

Reverse-phase C18 (5µm, Methanol and Folic acid Gradient, started 9% methanol for 150 x 4.6 mm) guard column ammonium acetate (5.03).

6 minutes, 7 minutes in methanol C18 (40 µm, 50 x 4.6 mm).

(8 mmol/L-1). increased to 50% and so continued for 5 minutes, return the initial composition in 5 minutes.

Reverse-phase - C18 column 30 mmol/L-1 potassium Folic acid (25.3), 5-CH2-H4-folate (); Gradient initial 6% (v / v) acetonitrile (150x 4.6 mm, 3 µm) Aquasil, phosphate buffer H4-folate (19.7), maintained isocratic for 5 minutes C18 guard column (1 mm). pH 2.3 and 5-CH3-H4-folate (21.2), then the acetonitrile was increased acetonitrile.

5-HCO-H4-folate (24.7); to 25% for 20 minutes, total 10-HCO-folate (23.7). run time was 42 minutes.

Spherisorb ODS-2 Buffer potassium phosphate H4-folate (1.67) 5-CH3-H4-folate (2.47), Isocratic mode, in ratio 85:15 (v/v), 100 mm × 2.0 mm 100 mmol L−1 10-HCO-H4-folate (3.21) with total run time not 5 µm column. pH 2.0 and methanol.

5-HCO-folate (4.93) Folic acid (7.34), superior at 20 minutes.

Pteroic acid (11.17).

Label: H4 folate - tetrahydrofolate; 5-CH3-H4 folate - 5-methyltetrahydrofolate; 5-HCO-H4- folate - 5-formyltetrahydrofolate; 10-HCO-folate- 10 - formyl folic acid; 5,10-CH2-H4-folate 5,10-Methylenetetrahydrofolate; 5,10-CH +-H4-folate - 5.10-meteniltetraidrofolato; 10-HCO- H2-folate - 10-methyl folic acid; 10-CH3-folate - 10-methyl folic acid.

evaluations performed on the database able to compare standards and samples showing similarity and purity indexes.

chosen the external standard, which can be performed by the correlation between the calibration curve equation with the peak of interest area[23,29,30,41,47,53,59].

Chromatography is considered a powerful tool in separation technique. However, for identification of peaks, it is necessary the use of better resource, combined with detectors. Among these are included: comparative study of adjusted retention times, obtained by injection of standards and samples in similar conditions; evaluation of peaks of interest for more than one detector coupled series, for example, fluorescence, electrospray ion detector (ESI) or chemical ionization by different techniques for ionic and non ionic compounds[60,66].

For internal standardization it should be chosen a chemically similar compound to that one under study, in the case of folic acid for instance, it can be used methotrexate an antagonist drug to folic[67]; which presented retention time 9.0 min in isocratic elution in 85% of potassium phosphate buffer pH 2.0 100 mmol.L-1 and 15% of MeOH (data not published).

The quantification can be obtained by comparison of areas related to known concentrations in calibration curves (external or internal standard).

In order to quantify the peaks of folates, it is usually

The internal standard must be added in concentrations similar to the compound of interest and should be eluted in unused portion of the chromatogram, being its retention time close to the peaks under consideration[17]. Among those studies aimed at quantifying folates, external standardization is mostly employed as can be observed in Table 4.

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4.2.2. Procedures for analytical validation

After the method has been developed, involving analytical separation and extraction performance of classes of folates, it must be validated with respect to different parameters which aim at assessing. In order to determine the most important parameters to be included in this process, it can be consulted to the literature, or the guidelines of regulatory agencies such as ICH - International Conference on Harmonization[68].

Obviously, laboratorial experience should be pointed and used through suitable test system accepted as statistical tool for improving methodologies.

Regardless of the source selected, six parameters must be investigated to validate a method as following: 1. accuracy, 2. precision 3. limit of detection; 4. limit of quantification; 5. specificity; 6. linearity and dynamic range.

The method accuracy is a correlation between the difference of concentration measured in the analyte from a spiked and non-spiked sample, once the analyst will know the amount of analyte added to the sample. Through this ratio is drawn the recovery rate, given by the equation: Recovery ratio (concentration in the spiked sample â&#x20AC;&#x201C; sample concentration) / spiked concentration)[68].

The method precision is an agreement measure between results of individual tests, when the procedure is repeatedly applied to multiple samples of different composition. The accuracy can be divided into three categories: repeatability or precision intraassay, intermediate precision or between days and reproducibility or inter laboratories precision[69].

Sensitivity is the method ability to respond consistently to successive decreases in the analyte amount.

Often, the detection limits (LD) and quantification limits (LQ) are used to measure the method sensitivity. For chromatographic procedures, LD is defined as the lowest analyte concentration that promotes a signal three times above the noise (variability is higher than 2%) and LQ is the lowest concentration of analyte which provides a 216

Folate â&#x20AC;&#x201C; Analytical properties, bioavailability and stability in foods

signal ten times above the noise (variability is less than 2%)[60,68].

The linearity of an analytical method is its ability to extract results that are directly, or by means of welldefined mathematical transformations, proportional to the concentration of analytes in samples within a give range, this is an interval between the lower and upper analyte concentration for which it has been demonstrated that the analytical procedures haves a suitable level of accuracy, precision, and linearity. The range is expressed in the same unit as the analytical method`s results[68].

The parameters discussed above may be classified as the most common in the validation of the analytical protocol, being decidedly indispensable. Since the advancement of computer technology and building databases, new parameters may be added to those.

For example, the spectral libraries are built from the standards spectrum registration and allow the evaluation of similarity between sample peak and the standard peak.

Another important tool, which is widely used since the 90s, is the investigation of the peak spectral record in, at least, three regions in order to check for impurities.

These two tools were used in our studies of folate quite effectively, allowing us to monitor six forms of folate[26,51].

Besides, chemometric tools have been frequently applied to the optimization and validation of analytical methods.

It consists in applying mathematical models to explain the phenomena and chemical processes involved. The most used model is the central composite design (CCD), allowing reduction in the number of experiments and therefore, less time consuming and reagents. Its basic principle consists of isolating the main factors to trigger responses known and modeling. However, unlike traditional models, CCD allows the investigation of diverse all factors at the same time[70].

For optimization of folate extraction protocol, we used a factorial design in which the main parameters identified in pilot study were tested simultaneously, (time, temperature of sample exposure and concentration of the extraction solution). This type of experimental Scientia Chromatographica 2015; 7(3):199-222

Folate â&#x20AC;&#x201C; Analytical properties, bioavailability and stability in foods

model allowed us to adjust the best extraction condition with the certainty that we are evaluating all the factors together. Furthermore, we can eliminate the use of enzymatic treatment of vegetable matrices, which leaded to a reduction of time and number of steps of the extraction protocol[51].This has been used to improve the

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separation methodologies compounds in pharmaceutical formulations[71], acid mixtures[72] and isomers[73]. The CCD may be a useful tool for folate studies since their forms have very similar chemical characteristics and 10-formyltetrahydrofolate and 5-formyltetrahydrofolate present isomer function.

Figure 3. Spectral profile of folates commonly found in foods. Data obtained by array diode detector with scan performed in region maximum and minimum of each peak in maximum Îť. Images made from LC solution software (Shimadzu).

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Folate – Analytical properties, bioavailability and stability in foods

Table 4. Usual condition of quantification for folate analysis.

References

Detection system

Limit of detection and quantification LOD/LOQ

[16]

Fluorescence, excitation 290 nm and emission 356 nm H4-folate, 5-CH3-H4 folate, 5-HCO-H4 folate, folic acid, 360 nm and emission 460 nm fluorescence 10-HCO-AF UV-Vis spectroscopy.

LOD H4-folate 0.003 ng; 5-CH3-H4 folate 0.002 ng; 5-HCO-H4-folate 0.05 ng; folic acid 1.4 ng; 10-HCO-AF 0.04 ng per injection.

[39]

Diode array detector.

10-HCO-H2- folate (7 pmol per injection) and 5-CH3-H4-folate, 10-HCO-folate, 10-HCO-H4-folate, folic acid (4.2 pmol per injection).

[53]

UV-Vis spectroscopy.

LOD 2 ng/20 µl injection of standard.

[57]

UV-Vis spectroscopy (5-HCO-H4folatos, folic acid, 10-HCO-H2); Fluorescence - excitation 290 and 365 emission for 5-CH3-H4-folate and H4-folate, 360 excitation and 460 emission 10-HCO folic.

LOD H4-folate 0.6 ng, 5-CH3-H4 folate 0.4 ng, 5-HCO-H4 folate 0.6 ng, 0.2 ng folic acid, 10-HCO-folic 0.7 ng, 10-HCO-H2- folate 0.8 ng.

[19]

Fluorescence excitation 295 nm and emission 356 nm. UV-Vis spectroscopy.

LOD: all in pmol per injection - 5-CH3-H4 folate: 2 (UV) and 0.02 (fluorescence); H4folato: 5 (UV) and 0.1 (fluorescence), folate 10-CHO-20 (UV) and 200 (fluorescence ) 5-CHO-H4folato: 2 (UV).

Recovery rate (%) 79-92 5-CH3-H4-folate, 60 – and 50-80 respectively H4- folate and 5-HCO-H4folate 50 and 80, respectively.

60-70- 10-HCO-folic.

Folic acid (87.9), 5-HCO-H4folate (85.3) 5-CH3-H4-folate (94.8), 10-HCO-folate (84.0), 10-HCO-H2- folate (84.8).

93 - 96 coefficient of variation 3.2-5.6%.

H4-folate 109 ± 13, 5-CH3-H4folate 86 ± 3, 5-HCO-H4 folate 78, Folic acid: 113 ± 9; 10-HCO-folic 102 ± 10, 10-HCO-H2 folate 106 ± 12.

78 - 10-CHO-H4-folate; 98- 5-CHO-H4-folate.

[23]

UV-Vis spectroscopy.

LOD 0,04; LOQ 0,06 mg/L.

In acetate buffer with added standard was 97; For apple juice, 92-93; For cherry nectar 92-93 and 78-79 black cherry.

[29]

Fluorescence spectroscopy excitation 290 nm and 360 nm emission 290 nm UV-Vis spectroscopy.

LOQ 5-CH3-H4-folate 0.2 ng/mL; H4-folates 0.3 ng/mL and 5-HCO-H4-folate 4 ng/mL LOD 0.1 ng/mL H4-folate, 5-CH3-H4-folate 0.07 ng/mL, 5-HCO-H4-folate 1.5 ng/mL.

85-90- H4-folate and 95-97- 5-CH3-H4-folate.

[49]

[41]

[58]

[59] [30]

[51]

Diode array detector, fluorescence detection Reference material (BCR LOD DAD 1μg/100g UV for 5-HCO-H4-folate and folic (290 nm for the excitation spectrum and 421) 90-95, folic acid and acid for 0.5 μg/100g; Fluorescence: > 0.1 μg/100g for 355 nm for the emission spectrum).

5-HCO-H4- folate 95 – 105.

5-HCO-H4-folate and folic acid.

UV-Vis spectroscopy for folic acid, 290 nm 5-CH3-H4-folate 95.93; 90.8 H4LOD 5-CH3-H4-folate 1.2 ng / mL; H4-folate 1.7 ng/mL, excitation and emission 356 nm fluorescence for folate, 5-HCO-H4-folate 94.58; 5-HCO-H4-folate 2.1 ng/mL; folic acid 0.9 ng/mL. 5-CH3-H4-folate; H4-folate, 5-HCO-H4-folate.

Folic acid 94.78.

Excitation 290 nm and emission 360 nm LOD 5 pg/mL 5-CH3-H4-folate; 7 pg/mL folate-H4; 5-CH3-H4-folate 94-108, 96-102 fluorescence for 5-CH3-H4 folate, 5-HCO-H4-folate 30 pg/mL 5-HCO-H4-folate; 10-HCO-folate; 5 ng/mL for H4-folate, 5-HCO-H4-folate and H4-folate; 360nm emission 445nm excitation folic acid and 10-CH3 – folate; LOQ 0.05 ng/mL 5-CH3-H4- 97-104, 10-HCO-H4 95-104, fluorescence for 10-HCO-folate and 10-CH3-folate folate, 0.07 ng/mL H4-folate, 0.3 ng / mL 5-HCO-H4-folate 97-102 folic acid, 10-CH3-H4and folic acid DAD at 290 nm. and 10-HCO-folate and 50 ng/mL 10 - CH3-folate. folate 98-103.

Diode array detector.

LOQ folic acid 0.10 mg/L. Was not performed.

DAD for 10-HCO-H4 folic acid and at wavelengths LOD-0.05, 0.1, 2.0, 4.0, and 1.0 ng / ml for 5-CH3-H478% 5-CH3-H4-folate and of 269, 290 and 340 nm, 290 nm excitation and folate, H4-folate, 5-HCO-H4-folate, 10-HCO-folic acid, and H4-folate 48-56%.

360 nm emission fluorescence. folic acid, respectively.

LOD - 0.06, 0.17, 0.12, 0.12, 0.03, 1.81 µg/ml-1 and LOQ - 0.2, 0.53, 0.38, 0.35, 0.11, 5.49 µg/ml-1 respective for H4Diode array detector.

Was not performed. folate, 5-CH3-H4-folate, 10-HCO-H4-folate, 5-HCO-folate, Folic acid, Pteroic acid.

Label: H4 folate - tetrahydrofolate; 5-CH3-H4 folate - 5-methyltetrahydrofolate; 5-HCO-H4- folate - 5-formyltetrahydrofolate; 10-HCO-folate- 10 - formyl folic acid; 5,10-CH2-H4-folate 5,10-Methylenetetrahydrofolate; 5,10-CH +-H4-folate - 5.10-meteniltetraidrofolato; 10-HCO- H2-folate - 10-methyl folic acid; 10-CH3-folate - 10-methyl folic acid.

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Folate – Analytical properties, bioavailability and stability in foods

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Table 4 presents the main results of the last 10 years regarding validation of methodologies for folates quantification. Research has been performed in the steps of extraction, cleaning, identification and quantification of folates, and in some cases it is possible to achieve the status of previously validated method. We believe that all these efforts need to be combined and considered by international agencies to define the best methodological working condition.

and World Health Organization as basis, since the composition tables are weak in this regard.

5. Perspectives and highlights

In this regard, the development of selective and appropriate methodologies in HPLC contributed to advances in various areas of knowledge as in studies of public health, biochemical or physiology. In addition, when performed in one short space of time, with security, can speeds up the acquisition of information that contributed to the prevention and treatment of related disorders to folate deficiency.

Folate, a water soluble vitamin, is an emerging topic, so it has been extensively studied in the last thirty years. Many studies have achieved to results that contribute to ensure establishment of most trusted food composition tables. Brazil has not even accompanied the advance, and opted for food fortification only taking the guidelines of Food and Agriculture Organization

Researches with vitamin B9 has opened other fields of discussion, as the contribution of folate intake on homocysteine levels. A better understanding of folate metabolism through the study of gamma-glutamyl hydrolase, especially with regard to the metabolism of antagonists drugs such methotrexate used to treat certain types of cancer, autoimmune diseases and others.

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Scientia Chromatographica 2015; 7(3):223-236 Instituto Internacional de Cromatografia http://dx.doi.org/10.4322/sc.2016.005 ISSN 1984-4433

CROMATOGRAFIA LÍQUIDA

Derivados xantónicos quirais: aplicações em Química Medicinal e uma nova abordagem em Cromatografia Líquida Chiral derivatives of xanthones: applications in Medicinal Chemistry and a new approach in Liquid Chromatography

Carla Fernandes#1,2 Maria Elizabeth Tiritan#2,3 Madalena M. M. Pinto*1,2 Lab. de Química Orgânica e Farmacêutica, Departamento de Ciências Químicas, Faculdade de Farmácia, Universidade do Porto, 4050-313, Porto, Portugal.

2 Centro Interdisciplinar de Investigação Marinha e Ambiental (CIIMAR/CIMAR), Universidade do Porto, 4050-123, Porto, Portugal.

3 CESPU, Inst. de Investigação e Formação Avançada em Ciências e Tecnologias da Saúde, 4585-116 Gandra PRD, Portugal.

1

Estes autores contribuíram de igual forma *madalena@ff.up.pt #

Recebido: 30 Set 2015 Aceito: 14 Nov 2015

Scientia Chromatographica 2015; 7(3)

Resumo

Os derivados xantónicos têm sido alvo de diversos estudos, essencialmente devido ao leque alargado de atividades biológicas e farmacológicas que podem exibir.

Recentemente os derivados xantónicos quirais (DXQ) têm vindo a despertar grande interesse, tanto em estudos de enantiosseletividade associados a atividade biológica, como em cromatografia quiral. Numa perspetiva de Química Medicinal, trinta enantiómeros correspondentes a quinze pares de DXQ foram sintetizados e testados para avaliação da atividade biológica/farmacológica, nomeadamente inibição do crescimento de linhas celulares tumorais humanas, revelando em alguns casos elevada eficácia. O DXQ mais ativo apresentou valores de IC50 de 32,15 ± 2,03 μM para a linha celular A375-C5, 22,55 ± 1,99 μM para a linha celular MCF-7, e 14,05 ± 1,82 μM para a linha celular NCI-H460. Além disso, o efeito de inibição do crescimento celular demonstrou ser em alguns casos dependente da estereoquímica dos DXQ. Estes, além de apresentarem potencialidade como fármacos, apresentam estruturas com potencial para aplicação em cromatografia quiral como seletores para fases estacionárias. Neste contexto alguns DXQ foram selecionados e ligados a um suporte cromatográfico surgindo assim uma nova aplicação como fases estacionárias para cromatografia líquida. As novas fases estacionárias xantónicas quirais, além de representarem um tipo completamente diferente das fases disponíveis comercialmente baseadas em pequenas moléculas, apresentaram resultados promissores, elevada estabilidade e reprodutibilidade. Assim, conclui-se que os DXQ apresentam aplicações importantes no campo da Química Medicinal como potenciais fármacos e apresentam também uma aplicação “out of the box” como seletores quirais de novas fases estacionárias para cromatografia líquida.

Palavras-chave: Xantonas; quiral; enantiosseletividade; fases estacionárias quirais; cromatografia líquida.

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Fernandes C, Tiritan ME, Pinto MMM

Derivados xantónicos quirais

Abstract

Over several years, the xanthonic derivatives have been the focus of many studies essentially, due their broad range of biological and pharmacological activities. Recently, chiral derivatives of xanthones (CDX) have come to arouse great interest considering both the enantioselectivity studies associated with biological activity as well as chiral chromatography. In a perspective of Medicinal Chemistry, thirty enantiomers corresponding to fifteen pairs of CDX (small molecules), were synthesized and tested to assess the biological/ pharmacological activity, including inhibition of growth of human tumor cell lines, showing in some cases very interesting effects. The most active compound showed values of GI50 of 32.15 ± 2.03 μM for A375-C5, 22.55 ± 1.99 μM for MCF-7, and 14.05 ± 1.82 μM for NCI-H460. Furthermore, the growth inhibitory effects, in some cases, demonstrated to be depending on the stereochemistry of the CDXs. Besides the potential as new drugs, CDX present structures with interest as chiral selectors for chromatography. In this context some CDX were selected and bound to a chromatographic support to new application as chiral stationary phase in liquid chromatography. New xanthonic chiral stationary phases represent completely different selectors based on small molecules, with promising results, high stability and reproducibility. Thus, it is concluded that CDX have important applications in the field of Medicinal Chemistry not only as potential drugs but also with an application “out of the box” as chiral selectors of new stationary phases for liquid chromatography.

Keywords: Xanthones; chiral; enantioselectivity; chiral stationary phases; liquid chromatography.

1. Introdução

Ao longo dos últimos anos, as estratégias de obtenção e análise de enantiómeros têm-se revestido de crucial importância devido às crescentes exigências legais associadas à produção e aplicação de compostos enantiomericamente puros[1].

A evolução tecnológica dos equipamentos e colunas cromatográficas, juntamente com o desenvolvimento de metodologias eficientes para a obtenção de compostos quirais bioativos com elevada pureza enantiomérica, permitiu grandes avanços em cromatografia analítica e preparativa, designadamente na resolução enantiomérica[2,3]. Atualmente, a capacidade de separar enantiómeros, quantificar a fração enantiómerica de forma correta e obter enantiómeros puros apresentam uma forte repercussão em vários aspetos de interesse económico, tal como desenvolvimento de novos fármacos, aditivos alimentares, agro-químicos, fragrâncias e produtos muito diversificados de outras áreas, como sejam industriais, do ambiente e de investigação[4,5].

Uma das metodologias mais eficazes no controlo da pureza enantiomérica, quantificação da fração enantiómerica, monitorização de reações assimétricas, estudos de biodegradação e farmacocinéticos é a cromatografia líquida (LC)[4,6]. Tendo em conta o método 224

direto, a resolução de enantiómeros recorrendo às fases estacionárias quirais (FEQ) é o mais utilizado.

De uma forma simples pode dizer-se que o sucesso para uma resolução enantiomérica eficiente é primordialmente determinado pela escolha da FEQ adequada. Neste contexto, são várias as FEQ que têm sido desenvolvidas desde a década de 1980[7-9]; sendo atualmente, as derivadas de polissacarídeos, de antibióticos e do tipo Pirkle as que apresentam poder de resolução para uma vasta gama de substâncias quirais e, portanto, as mais amplamente utilizadas[8,9].

Recentemente, o nosso grupo efetuou estudos sistemáticos de resolução enantiomérica de compostos quirais de natureza xantónica com a utilização de FEQ pertencentes a esses três grupos[10-13].

Os derivados xantónicos são compostos heterocíclicos oxigenados baseados no núcleo da dibenzoγ-pirona, em que o composto mais simples corresponde quimicamente à molécula da xantona (Figura 1). O núcleo xantónico apresenta uma estrutura 3D “quaseplanar”[14] e propriedades eletrónicas peculiares, podendo corresponder a uma grande diversidade de derivados de acordo com a natureza e posição dos diversos substituintes.

Para além disso, pode apresentar um duplo papel: pode funcionar como um grupo substituinte associado a outros Scientia Chromatographica 2015; 7(3):223-236

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Autor et al.

Figura 1. Estrutura do núcleo xantónico.

núcleos químicos e, desta forma, modular respostas biológicas ou, na maioria dos casos, o núcleo xantónico pertence à porção farmacofórica para uma dada atividade biológica (Figura 1)[15].

A importância desta classe de compostos está bem reconhecida em Química Medicinal.

Efetivamente, os derivados xantónicos são considerados estruturas privilegiadas com a capacidade de interação com diferentes classes de alvos biológicos e, consequentemente apresentar uma grande diversidade de propriedades biológicas e farmacológicas expressas em alguns artigos de revisão[15-20]. É importante destacar que nos últimos anos, compostos capazes de interagir com diversos alvos têm despertado muito interesse na comunidade científica, considerando a possibilidade de desenvolver fármacos para alvos múltiplos associados à mesma patologia[21-23].

Nesse sentido têm vindo a ser desenvolvidas várias estratégias sintéticas com o objetivo de obter de forma mais eficiente e rápida derivados xantónicos com diversos padrões de substituição[24,25].

No nosso grupo de investigação, ao longo de vários anos, os derivados xantónicos têm sido alvo de diversos estudos[26-55]. Esse interesse tem resultado, essencialmente, das atividades biológicas e farmacológicas que esse tipo de compostos é capaz de exibir. Recentemente, os derivados xantónicos quirais (DXQ) têm vindo a despertar grande interesse tanto em estudos de enantiosseletividade associados a atividade biológica assim como em cromatografia quiral. Embora já se encontrem descritas várias xantonas quirais[56-67], o seu número é ainda reduzido se considerar o universo global de derivados xantónicos de origens natural e sintética (Figura 2).

2. Derivados Xantónicos Quirais

As razões para o nosso grupo optar por trabalhar com DXQ são várias e estão exemplificadas na Figura 3.

Assim, ao obter uma biblioteca de trinta novos DXQ simples (small molecules), sob a forma de enantiómeros isolados (Figura 4)[68,69], estamos a ir ao encontro dos vários objetivos expostos, nomeadamente

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enantiosseletividade, foram também realizados estudos de avaliação da atividade biológica/ farmacológica dos DXQ, tendo sido obtidos alguns resultados significativos relativamente à enantioseletividade[68,69].

Figura 2. Origem natural e sintética de derivados xantónicos.

Tendo em conta que muitas small molecules, para além de serem fármacos potenciais, têm aplicações diversas, como probes biológicas[70,71], ou como indicadores de fluorescência[72,73], também no nosso grupo se pensou “outside of the box” no que se refere a uma nova aplicação para DXQ: como seletores quirais de fases estacionárias para cromatografia líquida (Figura 5).

2.1. Aplicação em química medicinal

Numa perspetiva de Química Medicinal, os compostos quirais obtidos foram testados para diferentes atividades, nomeadamente inibição do crescimento de linhas celulares tumorais[68] e bloqueio da condução nervosa[69], tendo revelado alguns resultados dignos de nota.

Figura 3. Razões para optar por derivados xantónicos quirais.

ampliar o espaço químico nesta área. A síntese de DXQ foi efetuada utilizando uma metodologia eficiente, prática e com condições reacionais brandas, através do acoplamento de dois derivados xantónicos adequadamente funcionalizados, com blocos construtores quirais comercialmente disponíveis, designadamente aminoálcoois, aminas e aminoésteres.

Os tempos reacionais foram curtos (0,5 a 5 h), os rendimentos obtidos foram excelentes (94 a 99%) e a pureza enantiomérica elevada (habitualmente superior a 99%)[68,69].

Com o objetivo de explorar o espaço biológico, associando a relevância da quiralidade/ 226

É de ressaltar que alguns dos DXQ exibiram efeitos interessantes na inibição do crescimento de três linhas de células tumorais humanas, nomeadamente A375-C5 (melanoma), MCF-7 (adenocarcinoma da mama), e NCI-H460 (cancro do pulmão de não pequenas células). O composto mais ativo em todas as linhas celulares foi o DXQ-13 (Figura 4) apresentando valores de IC50 de 32,15 ± 2,03 μM para a linha celular A375-C5, 22,55 ± 1,99 μM para a linha celular MCF7, e 14,05 ± 1,82 μM para a linha celular NCI-H460.

No entanto, alguns DXQ apresentaram seletividade para uma dada linha celular tumoral humana. Além disso, o efeito de inibição do crescimento celular demonstrou ser em alguns casos dependente da estereoquímica dos DXQ. Um exemplo a destacar foi observado com os enantiómeros DXQ-1 (enantiómero R) e DXQ-2 (enantiómero S) (Figura 4), que apresentaram elevada enantiosseletividade para as linhas celulares NCI-H460 e MCF-7 (Figura 6)[68].

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Os DXQ 2, 4 e 6 foram também testados no bloqueio da condução nervosa do nervo ciático isolado de rato[69]. O bloqueio da condução nervosa causada por estes DXQ foi observada numa gama de concentrações baixa (0,1-3 μM). Os resultados sugeriram que a capacidade para bloquear a condução do nervo resultaria de uma ação nas correntes iónicas de Na+, agindo de forma semelhante a fármacos anestésicas locais.

Autor et al.

2.2. Aplicação em cromatografia líquida

A necessidade em encontrar métodos eficientes no controlo da pureza enantiomérica dos DXQ sintetizados levou-nos a realizar estudos de enantiosseletividade em diversos tipos de FEQ. Assim, foram selecionadas quatro FEQ baseadas em antibióticos macrocíclicos (Chirobiotic T®, Chirobiotic R®, Chirobiotic V® e Chirobiotic TAG®)[10], duas do tipo Pirkle ((S,S)-

Figura 4. Estruturas químicas dos derivados xantónicos quirais.

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Figura 5. Diferentes aplicações dos derivados xantónicos quirais obtidas pelo nosso grupo.

Figura 6. Capacidade do DXQ-1 e do DXQ-2 inibirem o crescimento de três linhas celulares tumorais humanas.

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Whelk-O1® e L-Phenylglycine®)[13], e três baseadas em polissacarídeos (tris-3,5-dimetilfenilcarbamato de celulose, tris-3,5-dimetilfenilcarbamato de amilose e tris-3,5-dimetoxilfenilcarbamato de amilose)[12].

Comparando os resultados obtidos para um conjunto de sete misturas enantioméricas de DXQ[11], as FEQ baseadas em polissacarídeos mostraram ser as mais versáteis e com maior poder de resolução, apresentando enantiosseletividade excelente para todas as misturas enantioméricas de DXQ (com valores de α e RS variando de 1,43 a 12,40 e de 1,48 a 10,29, respetivamente).

As FEQ do tipo Pirkle revelaram especificidade na discriminação quiral: a FEQ (S,S)-Whelk-O1® apenas separou as misturas enantioméricas dos DXQ com um grupo aromático ligado ao centro estereogénico (com valores de α e RS variando de 1,91 a 7,55 e de 6,71 a 24,16, respetivamente), e a FEQ L-Phenylglycine® as misturas enantioméricas dos DXQ que não apresentavam um grupo álcool primário ligado ao centro estereogénico.

Relativamente às FEQ baseadas em antibióticos macrocíclicos, seis das sete misturas enantioméricas de DXQ foram enantiosseparadas, no entanto, a capacidade discriminatória destas FEQ foi menor comparativamente com os outros tipos de FEQ utilizadas. As FEQ Chirobiotic R® e Chirobiotic T®, em condições normais de eluição foram as mais eficientes, com valores de RS variando de 1,25 a 2,50 e 0,78 a 2,06, respetivamente.

No sentido de compreender melhor os parâmetros cromatográficos a nível molecular, assim como aspetos estruturais associados ao mecanismo de reconhecimento quiral, foram realizados estudos de docking para as FEQ baseadas em antibióticos macrocíclicos[10] e para a FEQ do tipo Pirkle (S,S)-Whelk-O1®[13].

Considerando as FEQ de antibióticos macrocíclicos, os cálculos de docking permitiram confirmar a resolução dos DXQ com uma taxa de sucesso de 92%, assim como mostrar diferentes padrões de ligação, devido à forma e à superfície molecular de cada seletor[10]; enquanto na FEQ (S,S)Whelk-O1®, os resultados foram 100% concordantes

Autor et al.

com os dados cromatográficos no que diz respeito à enantiosseletividade e 86% relativamente à ordem de eluição dos enantiómeros[13].

Estes estudos além de permitirem um melhor entendimento das interações dos DXQ com estas FEQ, confirmaram a hipótese de que as estruturas dos DXQ poderiam apresentar interações enantiosseletivas com outras small molecules quirais de forma previsível.

O “princípio da reciprocidade” aventado por Pirkle , refere que qualquer enantiómero de uma mistura enantiorresolvida por uma dada FEQ pode ser um potencial candidato a um seletor quiral eficiente, com a finalidade de resolver misturas enantioméricas similares ao seletor da FEQ. Assim, baseado nesta dedução e nos resultados de enantiosseletividade dos DXQ nas diversas FEQ ficou demonstrado que os DXQ são potenciais seletores para novas FEQ. [74]

Foram selecionados cinco enantiómeros (DXQ 4,7,8,13 e 23 – Figura 4) como seletores de novas fases estacionárias xantónicas quirais (FEXQ) para cromatografia líquida[75,76]. Consequentemente, os DXQ enantiomericamente puros foram covalentemente ligados à sílica através de um espaçador obtendo-se as correspondentes FEXQ. A comparação da estrutura geral dos DXQ com os seletores da FEQ do tipo Pirkle (Figura 7), mostra que os vários grupos químicos são susceptíveis de estabelecer interações de natureza semelhante. A estratégia utilizada na ligação ao suporte cromatográfico está de acordo com o esquema geral descrito na Figura 8.

A capacidade enantiosseletiva em cromatografia líquida das FEXQ obtidas foi avaliada utilizando compostos de diferentes classes químicas, incluindo fármacos e misturas enantioméricas de DXQ, em condições de eluição multimodal. As FEXQ apresentaram enantiosseletividade para os DXQ e para outros compostos, assim como grande versatilidade na composição da fase móvel e estabilidade numa larga gama de solventes (polares e apolares).

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Figura 7. Comparação entre as estruturas de uma FEQ baseada em DXQ e uma FEQ do tipo Pirkle.

Figura 8. Estratégia geral para obtenção das fases estacionárias xantónicas quirais (FEXQ).

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A primeira FEXQ foi desenvolvida através da ligação de um derivado sililado do DXQ-4 (Figura 4) à sílica[75,76]. O DXQ-4 foi selecionado como seletor quiral com a finalidade de obter uma FEXQ semelhante às primeiras FEQ desenvolvidas por Pirkle et col.[71]. Com esta FEXQ, os melhores resultados de enantiosseletividade e resolução foram obtidos para a mistura enantiomérica dos DXQ 7 e 8 (Figura 4), com α = 1,15 e RS = 2,24[75].

conseguinte, foi desenvolvida uma nova FEXQ com o DXQ-23 (Figura 4) como seletor quiral[75,76].

Considerando este resultado cromatográfico, e aplicando o “princípio da reciprocidade”, foi preparada uma nova FEXQ a partir do DXQ-7 (Figura 4) como seletor quiral. Este DXQ também foi selecionado tendo em conta: 1) que é estruturalmente semelhante ao seletor de uma das FEQ do tipo Pirkle de sucesso, disponível comercialmente, isto é, a Phenylglycine®[77]; 2) que o DXQ-7 contém mais um anel aromático para além do núcleo xantónico, grupos que são essenciais para o reconhecimento quiral devido à possibilidade de interações p-p o que poderá aumentar a enantiosseletividade e aplicabilidade; 3) os excelentes resultados de enantiosseletividade e resolução obtidos na separação da mistura do DXQ-7 e do seu par enantiomérico (DXQ-8) nas FEQ baseadas em antibióticos macrocíclicos[10], do tipo Pirkle[13], e baseadas em polissacarídeos[12]. Tal como esperado, esta FEXQ apresentou a melhor performance cromatográfica e versatilidade, mostrando enantiosseletividade não só para as misturas enantioméricas de DXQ, mas também para outros compostos quirais[75,76]. Neste caso, a inversão da ordem de eluição foi confirmada com a preparação de uma FEXQ com o par enantiomérico do seletor DXQ-7 (DXQ-8). Os parâmetros cromatográficos como enantiosseletividade e resolução foram idênticos aos observados com o seletor DXQ-7, o que confirma a eficácia na reprodutibilidade na preparação destas FEQ.

Reconhecendo o papel crucial das interações p-p para o reconhecimento quiral neste tipo de FEQ, e com a intenção de obter um seletor quiral com uma conformação mais rígida (tipo fenda), semelhante ao seletor da mais empregue e bem-sucedida FEQ do tipo Pirkle, isto é, a Whelk-O1®[72], o passo seguinte foi preparar uma FEXQ usando o DXQ-13 (Figura 4) como seletor. Deste modo, o DXQ-13 quando comparado com o DXQ-7 e o seu par enantiomérico DXQ-8, possui mais um grupo aromático, assim como mais um centro estereogénico.

No entanto, esta última FEXQ não apresentou os resultados cromatográficos esperados. Efetivamente, os grupos aromáticos do seletor quiral não contribuíram para aumentar o seu potencial de enantioresolução; pelo contrário, esses elementos estruturais volumosos e rígidos podem ter sido responsáveis por impedimento estérico e, como consequência, por interações nãoenantiosseletivas com os enantiómeros a separar[75].

O passo evolutivo subsequente foi desenvolver uma FEXQ com um seletor possuindo a mesma porção quiral do DXQ-7 (o seletor da nossa melhor FEXQ) mas com diferentes substituintes no núcleo xantónico. Por

Apesar desta nova FEXQ apresentar menor capacidade de discriminação enantiomérica que a FEXQ que possui o DXQ-7 como seletor, os melhores valores cromatográficos foram obtidos com esta fase na separação enantiomérica do racemato N-[1-(1-naftil) etil]-3,5-dinitrobenzamida, com um valor de α = 1,22 e de RS = 2,96[75] (Figura 9).

É interessante ressaltar que, de forma similar às FEQ do tipo Pirkle descritas na literatura[78-80], foi possível verificar para as FEXQ o fenómeno de “auto-reconhecimento” quiral. Em todos os casos, verificou-se que o enantiómero que formou o complexo diastereomérico homoquiral com a fase foi o mais retido na coluna cromatográfica[75,76].

Estas novas FEQ, baseadas num tipo completamente diferente de small molecules das existentes das fases disponíveis comercialmente, apresentaram resultados promissores, assim como elevada estabilidade e reprodutibilidade.

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Figura 9. Cromatograma da separação enantiomérica do racemato N -[1-(1-naftil)etil]-3,5-dinitrobenzamida na FEXQ que possui o DXQ-23 como seletor quiral. Fase móvel, Hexano:Etanol (80:20 v/v ), Fluxo, 0,5 mL/min, Deteção, UV 254 nm.

3. Conclusões

Considerando o descrito anteriormente poderá dizer-se que os DXQ, para além de aplicações no campo da Química Medicinal como potenciais fármacos, são, sem dúvida, uma fonte promissora de novas FEQ que poderão ser desenvolvidas de forma racional e direcionada.

Apesar do elevado número de FEQ disponíveis comercialmente, a escolha de uma FEQ estacionária é ainda feita de forma empírica. A aplicação de DXQ como seletores quirais pretende estabelecer de forma mais adequada o tipo de FEQ a escolher para resolução de um determinado par enantiomérico. É de realçar que

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as FEQ comerciais ainda apresentam baixa eficiência cromatográfica e são muitos os racematos que não podem ser resolvidos de forma direta. Assim, o desenvolvimento de fases com novos seletores quirais para cromatografia líquida é uma área que ainda necessita ser muito investigada e com grande potencial de aplicabilidade.

Agradecimentos

Os autores agradecem o suporte financeiro parcialmente fornecido pelo Strategic Funding UID/ Multi/04423/2013 through national funds provided by FCT – Foundation for Science and Technology and European Regional Development Fund (ERDF), in the framework of the programme PT2020.

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INSTITUTO INTERNACIONAL DE CROMATOGRAFIA

O Instituto Internacional de Cromatografia (IIC) possui como uma de suas principais missões o oferecimento de cursos de curta duração nas áreas de cromatografia e técnicas relacionadas.

Os objetivos dos cursos do IIC são o aprimoramento/formação/ atualização dos usuários das técnicas cromatográficas e afim (Preparo de Amostras, Espectrometria de Massas, Gestão da Qualidade, dentre outras), tanto do ponto de vista teórico quanto prático.

A filosofia educacional do IIC é: “ao invés de ensinar apenas como operar um equipamento específico (dar o peixe) o IIC ensina a técnica (como pescar)”.

Os cursos do Instituto Internacional de Cromatografia são coordenados pelos Diretores do IIC, e ministrados pelos coordenadores, auxiliados por uma equipe técnica e científica altamente qualificada, constituída de docentes pósgraduados nos melhores centros do país na área, e pós‑graduandos em fase de conclusão de suas teses. Na época em que cada curso for oferecido, uma relação dos instrutores é disponibilizada no website do IIC. O programa detalhado de cada curso pode ser obtido através de contacto com o IIC. Os cursos são ministrados com auxílio de recursos audiovisuais modernos (datashow‑computador; vídeos, demonstrações, resolução de problemas e outros recursos instrucionais). Os alunos recebem um livreto contendo cópia de todos os slides apresentados pelos instrutores, além de material bibliográfico de apoio. Em vários cursos também são fornecidos livros de autoria dos próprios docentes dos cursos. A maior parte dos cursos também tem aulas práticas de laboratório, conforme anunciado no folheto explicativo de cada curso.

Observações: • O I.I.C. oferece também cursos “in-house” (“in-company”). Interessados nesta modalidade devem contatar o IIC para obter mais detalhes.

• Com exceção dos cursos da área da qualidade (ISO, Validação e Auditoria) todos os demais possuem aulas teóricas e práticas de laboratório.

• O oferecimento efetivo de um curso depende de um número mínimo de inscritos no mesmo.

• O número de vagas dos cursos que envolvem laboratório está sendo limitado para melhor aproveitamento dos participantes.

• Visite o website www.iicweb.org para obter mais informações.

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BIBLIOTECA IIC

O Bookstore divulgará o material de informação e formação produzido pelo IIC, incluindo Livros, filmes, slides, material didático de cursos e outras formas de divulgação dos materiais por ele ­produzido. Esses materiais podem ser adquiridos do IIC através do website www.iicweb.org/biblioteca.php

Cromatografia Líquida Moderna - Fernando M. Lanças Livro publicado pela Editora Átomo em maio de 2009, aborda de forma simples e didática os principais assuntos relacionados à Cromatografia Líquida Moderna (HPLC ou CLAE), desde a Teoria, Instrumentação, Colunas, Detectores, até aspectos da Validação, Preparo da Amostra e Análise Quantitativa.

O IIC recomenda este livro para todos os interessados em iniciar-se ou ­atualizar-se nesta técnica.

Cromatografia em Fase Gasosa - Fernando M. Lanças Livro de autoria do Prof. Lanças, abordando todos os princípios básicos: instrumentação, análise qualitativa e quantitativa, detectores e muitos outros aspectos da Cromatografia Gasosa.

Altamente recomendado para os iniciantes na técnica, os quais encontrarão explicações detalhadas e simples a respeito da maior parte dos fundamentos básicos da técnica.

Extração em Fase Sólida - Fernando M. Lanças De autoria do Prof. Lanças, este livro apresenta e discute as várias formas de extração em fase sólida (SPE), desde a mais clássica empregando cartuchos até as mais atuais como discos, placas, ponteiras, e outras. Também discute os princípios da micro extração em fase sólida (SPME) e da extração por sorção em barras de agitação (SBSE).

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NORMAS PARA PUBLICAÇÃO

Normas para publicação de artigos no Scientia Chromatographica (a versão detalhada está disponível em nosso portal www.scientiachromatographica.com).

Escopo

Scientia Chromatographica publica trabalhos em todas as áreas da Cromatografia, incluindo GC (colunas capilares, empacotadas, preparativas), LC (convencional, HPLC, U-HPLC, Prep-LC, micro-LC, nano-LC, TLC, PC), SFC (colunas empacotadas ou capilares), Técnicas Acopladas (GC-MS, LC-MS, SFC-MS, LC-GC, SFE-CE, GCxGC, LCxLC) e Técnicas de Preparo de Amostras (SPME, SBSE, MEPS, QuEChERS, LLE, MAE,SPE, LLE, etc.). A partir de 2012 o Scientia publica os seguintes formatos de artigos: • Artigos Originais de Pesquisa • Comunicação (“Short Communication”) • Artigos de Revisão Crítica Os artigos de Revisão Crítica deverão antes de sua submissão serem discutidos com um dos c­o-editores mais relacionados ao assunto em questão. Devem conter uma contribuição nova a respeito de um assunto de grande interesse atual, incluindo uma discussão a respeito das vantagens e desvantagens do mesmo. O Scientia não publica apenas relato de artigos descritos na literatura, sem uma discussão crítica sobre os mesmos.

Os artigos Originiais de Pesquisa deverão conter resultados de laboratório e/ou teóricos, que signifiquem uma contribuição expressiva para a área de técnicas de separação, seja ela conceitual, na instrumentação, ou na aplicação.

Os artigos do tipo Comunicação deverão ter a mesma qualidade dos artigos Originais, porém devido a seu caráter de comunicação preliminar usualmente são de menor extensão.

Envio do Artigo

Os artigos deverão ser encaminhados para periodico@scientiachromatographica.com. Os artigos do tipo Revisão deverão antes de seu envio pelo website ter o aval de um dos co-Editores do periódico, caso contrário não serão avaliados.

Todos os artigos, independentemente do formato, deverão ser submetidos exclusivamente ao Scientia, com o entendimento de que eles não foram anteriormente submetidos, não estão sendo e não serão posteriormente publicados em outro veículo.

Autores que utilizarem tabelas, ilustrações, figuras, ou textos contendo mais de 25 palavras, anteriormente publicados em outro periódico – sendo ou não autores do artigo – deverão obter a devida permissão por escrito do portador dos direitos de cópia (“Copyright ”). Esse documento deverá permanecer de posse dos autores, sendo encaminhado ao Scientia, quando solicitado.

Idioma

Os artigos, com exeção dos de Revisão, podem ser escritos preferencialmente em inglês, porém em Português e Espanhol também serão aceitos. Os autores cujo idioma nativo não for o empregado na redação do artigo são orientados a solicitar a colaboração de colegas fluentes no idioma, antes de enviar o artigo para o periódico.

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NORMAS PARA PUBLICAÇÃO

Tipos de contribuições aceitas para publicação no Scientia O Scientia Chromatographica considera para publicação quatro tipos de contribuição:

Artigos Originais de pesquisa: descrevem resultados de estudos completos. Deverão conter resultados de laboratório e/ou teóricos, que signifiquem uma contribuição expressiva para a área de técnicas de separação, seja ela conceitual, na instrumentação, ou na aplicação. Este tipo de contribuição é limitado a 6.000 palavras, incluindo as legendas das figuras e as referências, e no máximo 5 tabelas e/ou figuras somados. No momento do envio da prova de impressão, caso isto ocorra o autor será consultado se prefere revisar o artigo para enquadrá-lo em até 7 páginas, ou se prefere pagar as páginas excedentes. O número de páginas de um artigo depende muito das figuras e tabelas do mesmo. Este critério não é aplicado aos artigos convidados, cujo número de páginas será informado ao autor no momento do convite.

Comunicações (“Short Communication”): são artigos completos, porém que relatam resultados mais curtos, oportunos, e/ou cuja relevância requer sua rápida publicação. Deverão ter a mesma qualidade dos artigos Originais porém, devido a seu caráter de comunicação preliminar, usualmente são de menor extensão. Este tipo de publicação deve ter no máximo quatro páginas impressas, incluindo todo o artigo, ou seja, tabelas, figuras e referências. O autor deve indicar claramente que se trata de uma comunicação no topo da primeira página do artigo.

Artigos de Revisão crítica: revisões críticas sobre uma area específica das técnicas cromatográficas e relacionadas são também consideradas para publicação. Esses artigos devem se limitar a no máximo 10.000 palavras, incluindo as legendas, e até 10 tabelas e figuras somadas. Os artigos de Revisão Crítica deverão antes de sua submissão serem discutidos com um dos co-Editores mais relacionados ao assunto em questão. Artigos não encaminhados desta forma serão antes enviados a um co-Editor da área em que se enquadre para parecer e, somente então, serão enviados aos revisores, podendo atrasar significativamente sua publicação. Devem conter uma contribuição nova a respeito de um assunto de grande interesse atual, discutindo as vantagens e desvantagens do mesmo. O Scientia não publica apenas relato de artigos descritos na literatura, sem uma discussão crítica sobre os mesmos.

Artigos de Alta Prioridade: são publicados no primeiro número disponível do periódico, recebendo prioridade máxima de todo o sistema Editorial do periódico. Para justificar sua publicação como alta prioridade, os manuscritos deverão apresentar, de forma resumida, resultados importantes de recentes desenvolvimentos na área de cromatografia e técnicas relacionadas (espectrometria de massas, preparo de amostras, eletroforese capilar e outros). Não precisam conter resultados experimentais detalhados, sendo limitados a 2.500 palavras e três figuras e/ou tabelas combinadas.

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Scientia Chromatographica Editor-in-Chief

Fernando Mauro Lanças

Universidade de São Paulo Instituto de Química de São Carlos 13560-970 São Carlos (SP) - Brasil editor@scientiachromatographica.com

Editores Associados

Maria Eugênia Queiroz Preparo de Amostras

Renato Zanella Preparo de Amostras

José Manuel F. Nogueira Preparo de Amostras

Isabel C. S. Fontes Jardim Cromatografia Líquida

CORPO EDITORIAL CONSULTIVO

Daniel Armstrong – EUA Dietrich von Bauer – Chile Fábio Augusto – Brasil Fátima Dutra – Brasil Flávio Leite – Brasil Frank Svec – EUA Harold McNair – EUA Humberto Gómez – México Isabel Cristina Sales Fontes Jardim – Brasil Jailson B. de Andrade – Brasil Janusz Pawliszyn – Canadá Kiyoratsu Jinno – Japão Luigi Mondello – Itália Marcos Eberlin – Brasil Marina Tavares – Brasil Milos Novotny – EUA Milton Lee – EUA Norberto Peporine Lopes – Brasil Phillip Marriott – Austrália Pierina Bonato – Brasil Quézia Cass – Brasil Renato Zanella – Brasil

ENDEREÇO DO PERIÓDICO

Scientia Chromatographica

Elena Stashenko Espectrometria de Massas

Fabio Augusto Cromatografia Gasosa

Alejandro Cifuentes Técnicas Eletroforéticas

Álvaro J. Santos Neto Troubleshooting

Rua Princesa Isabel, 265 - Jardim Paraíso 13.561-140 - São Carlos (SP) - Brasil Fone/Fax: (16) 3501-4140 karen.favaro@iicweb.org / info@iicweb.org www.scientiachromatographica.com

Ficha catalográfica elaborada pela Seção de Aquisição e Tratamento da Informação do SBI/IQSC Scientia Chromatographica / Associação Internacional de Cromatografia. - vol.7 n.3 (jul./set. 2015). São Carlos: Associação Internacional de Cromatografia, 2015 Trimestral ISSN 1984-4433 1. Cromatografia. 2. Lanças, Fernando Mauro, editor chefe.

Cláudia Zini Cromatografia Gasosa

Elina B. Caramão Cromatografia Gasosa

CDD 543.8

ISSN 1984-4433

www.scientiachromatographica.com

2015

Volume 7 | Número 3

SCIENTIA CHROMATOGRAPHICA

Publicação disponível na internet:

157 Uma abordagem conceitual das técnicas miniaturizadas de preparo de amostra e suas aplicações na análise de resíduos e contaminantes em matrizes alimentares

2015 | Volume 7 | Número 3

Anderson Luigi Luiz, Edvaldo Vasconcelos Soares Maciel, Fernando Mauro Lanças

183 Microextração em gota única (SDME): fundamentos e aplicações Iohana Pinto de Pinto, Marcio Pozzobon Pedroso

199 Folate – Analytical properties, bioavailability and stability in foods Emmanuela Prado de Paiva, Marcella Melo Assis Costa, Clayton Anderson de Azevedo Filho

223 Derivados xantónicos quirais: aplicações em Química Medicinal e uma nova abordagem em Cromatografia Líquida Carla Fernandes, Maria Elizabeth Tiritan, Madalena M. M. Pinto

Rua Princesa Isabel, 265 - Jardim Paraíso São Carlos (SP) - CEP 13561-140 Fone/ Fax: (16) 3501-4140 | www.iicweb.org

2015 | Volume 7 | Número 3

Instituto Internacional de Cromatografia

Uma publicação do Instituto Internacional de Cromatografia www.iicweb.org