V7n2

ISSN 1984-4433

www.scientiachromatographica.com

2015

Volume 7 | Número 2

SCIENTIA CHROMATOGRAPHICA

Publicação disponível na internet:

101 Extração em ponteiras descartáveis: fundamentos teóricos e aplicações Mônia Aparecida Lemos Pinto, Maria Eugênia Costa Queiroz

2015 | Volume 7 | Número 2

109 Extração em fase sólida molecularmente impressa de ácido hipúrico e ácido metil-hipúrico em amostras de urina seguido de análise por cromatografia líquida de alta eficiência Tamires Amabile Valim Brigante, Carolina dos Santos, Patrícia Penido Maia, Eduardo Costa Figueiredo

117 Determination of organochlorine pesticides in leather by solid-phase microextraction and gas chromatography-mass spectrometry Cristine Durante de Souza Silveira, Eduardo Carasek

125 Técnicas de preparo de amostras biológicas com interesse forense Dayanne Cristiane Mozaner Bordin, Fernanda F. da Silva Souza Monedeiro, Eduardo Geraldo de Campos, Marcela Nogueira Rabelo Alves, Laís Helena Picolo Bueno, Bruno Spinosa de Martinis

Rua Princesa Isabel, 265 - Jardim Paraíso São Carlos (SP) - CEP 13561-140 Fone/ Fax: (16) 3501-4140 | www.iicweb.org

2015 | Volume 7 | Número 2

Instituto Internacional de Cromatografia

Uma publicação do Instituto Internacional de Cromatografia www.iicweb.org

Scientia Chromatographica Editor-in-Chief

Fernando Mauro Lanças

Universidade de São Paulo Instituto de Química de São Carlos 13560-970 São Carlos (SP) - Brasil editor@scientiachromatographica.com

Editores Associados

Maria Eugênia Queiroz Preparo de Amostras

Renato Zanella Preparo de Amostras

José Manuel F. Nogueira Preparo de Amostras

Isabel C. S. Fontes Jardim Cromatografia Líquida

CORPO EDITORIAL CONSULTIVO

Daniel Armstrong – EUA Dietrich von Bauer – Chile Fábio Augusto – Brasil Fátima Dutra – Brasil Flávio Leite – Brasil Frank Svec – EUA Harold McNair – EUA Humberto Gómez – México Isabel Cristina Sales Fontes Jardim – Brasil Jailson B. de Andrade – Brasil Janusz Pawliszyn – Canadá Kiyoratsu Jinno – Japão Luigi Mondello – Itália Marcos Eberlin – Brasil Marina Tavares – Brasil Milos Novotny – EUA Milton Lee – EUA Norberto Peporine Lopes – Brasil Phillip Marriott – Austrália Pierina Bonato – Brasil Quézia Cass – Brasil Renato Zanella – Brasil

ENDEREÇO DO PERIÓDICO

Scientia Chromatographica

Elena Stashenko Espectrometria de Massas

Fabio Augusto Cromatografia Gasosa

Alejandro Cifuentes Técnicas Eletroforéticas

Álvaro J. Santos Neto Troubleshooting

Rua Princesa Isabel, 265 - Jardim Paraíso 13.561-140 - São Carlos (SP) - Brasil Fone/Fax: (16) 3501-4140 karen.favaro@iicweb.org / info@iicweb.org www.scientiachromatographica.com

Ficha catalográfica elaborada pela Seção de Aquisição e Tratamento da Informação do SBI/IQSC Scientia Chromatographica / Associação Internacional de Cromatografia. - vol.7 n.2 (abr./jun. 2015). São Carlos: Associação Internacional de Cromatografia, 2015 Trimestral ISSN 1984-4433 1. Cromatografia. 2. Lanças, Fernando Mauro, editor chefe.

Cláudia Zini Cromatografia Gasosa

Elina B. Caramão Cromatografia Gasosa

CDD 543.8

ISSN 1984-4433

Periódico Trimestral do Instituto Internacional de Cromatografia

2014 2015 | Volume 67 | Número 12

Uma publicação do Instituto Internacional de Cromatografia www.iicweb.org

SUMÁRIO

Editorial | Número Especial – WARPA 2015..............................................................................................................................................95 Maria Eugênia Costa Queiroz

WARPA 2015 – VI Workshop em Avanços Recentes no Preparo de Amostras Programação...............................................................................................................................................................96

PREPARO DE AMOSTRAS Extração em ponteiras descartáveis: fundamentos teóricos e aplicações...................................... 101 Mônia Aparecida Lemos Pinto, Maria Eugênia Costa Queiroz

PREPARO DE AMOSTRAS Extração em fase sólida molecularmente impressa de ácido hipúrico e ácido metil-hipúrico em amostras de urina seguido de análise por cromatografia líquida de alta eficiência................... 109 Tamires Amabile Valim Brigante, Carolina dos Santos, Patrícia Penido Maia, Eduardo Costa Figueiredo

PREPARO DE AMOSTRAS Determination of organochlorine pesticides in leather by solid-phase microextraction and gas chromatography-mass spectrometry............................................................................................................. 117 Cristine Durante de Souza Silveira, Eduardo Carasek

PREPARO DE AMOSTRAS Técnicas de preparo de amostras biológicas com interesse forense................................................ 125 Dayanne Cristiane Mozaner Bordin, Fernanda F. da Silva Souza Monedeiro, Eduardo Geraldo de Campos, Marcela Nogueira Rabelo Alves, Laís Helena Picolo Bueno, Bruno Spinosa de Martinis

Instituto Internacional de Cromatografia...............................................................................................................................................145 Biblioteca IIC......................................................................................................................................................................................................146 Calendário de Cursos | 2015........................................................................................................................................................................147 Normas para Publicação...............................................................................................................................................................................148

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Scientia Chromatographica 2015; 7(2):95 Instituto Internacional de Cromatografia http://dx.doi.org/10.4322/sc.2015.018 ISSN 1984-4433

EDITORIAL

Número Especial – WARPA 2015 Special Issue Dedicated to WARPA 2015

VI Workshop em Avanços Recentes no Preparo de Amostras

Este número especial do periódico Scientia Chromatographica é dedicado ao VI Workshop em Avanços Recentes no Preparo de Amostras e assuntos relacionados.

Iniciado em 2012, o “Workshop em Avanços Recentes no Preparo de Amostras” tem como objetivo reunir docentes, pesquisadores, discentes e pós-graduandos das Unidades de Ensino Superior e da Iniciativa Privada de diferentes áreas da ciência para discussão dos recentes avanços de técnicas analíticas para o preparo de amostras. Dentre os temas abordados neste evento, destacamos a miniaturização dos sistemas analíticos, hifenação de técnicas para automação das análises (column switching), minimização do consumo de solvente orgânico e do volume de amostra, fases extratoras seletivas, metabolômica e a utilização de tecnologias ambientalmente corretas, em direção ao cuidado preventivo do meio ambiente.

O VI WARPA será realizado no Anfiteatro da Biblioteca do Campus Dom Bosco da Universidade Federal de São João del-Rei, Minas Gerais nos dias 16 a 17 de outubro de 2015; maiores informações no site : http://quimica.ffclrp.usp.br/warpa.

Contamos com sua presença neste importante evento realizado no Brasil, agradeço e me coloco à disposição para dúvidas ou informações adicionais.

Cordialmente,

Maria Eugênia Costa Queiroz

Editora Convidada

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WARPA 2015

VI Workshop em Avanços Recentes no Preparo de Amostras Comissão Organizadora Prof. Dr. Fernando Mauro Lanças - IQSC-USP Profa. Dra. Maria Eugênia Costa Queiroz - FFCLRP-USP Prof. Dr. Keyller Bastos Borges – UFSJ Prof. Dr. Eduardo Costa de Figueiredo - UNIFAL Prof. Dr. Christian Fernandes - UFMG Local Anfiteatro da Biblioteca do Campus Dom Bosco da Universidade Federal de São João del-Rei Número máximo de inscritos: 100

Programação | 16 de outubro – sexta-feira |

08:00 – 8:45 08:45 – 9:15 09:15 – 10:15

10:15 – 11:00

11:00 – 11:45

11:45 – 14:00 14:00 – 14:45

14:45 – 15:30

15:30 – 16:15

16:15 – 16:30 16:30 – 17:30 96

Café com Biscoito – Entrega de Material Sessão de Abertura Conferência de Abertura Prof. Dr. Fernando Mauro Lanças – IQSC-USP Chairperson: Maria Eugênia Costa Queiroz – FFCLRP-USP Palestra 2 Eduardo Carasek - UFSC Chairperson: Prof. Dr. Keyller Bastos Borges - UFSJ Palestra 3 Profa. Dra. Maria Eugênia Queiroz – FFCLRP-USP Chairperson: Prof. Dr. Fernando Mauro Lanças – IQSC-USP Almoço livre Palestra 4 Prof. Dr. Fabio Augusto – UNICAMP Chairperson: Profa. Dra. Maria Eugênia Queiroz – FFCLRP-USP Palestra 5 Prof. Dr. Ricardo Orlando Mathias - UFMG Chairperson: Prof. Dr. Christian Fernandes - UFMG Palestra 6 Prof. Dr. Christian Fernandes - UFMG Chairperson: Prof. Dr. Eduardo Costa de Figueiredo - UNIFAL Café com Biscoito Sessão de Pôsteres Scientia Chromatographica 2015; 7(2)

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VI Workshop em Avanços Recentes no Preparo de Amostras Programação | 16 de outubro – sexta-feira | 20:00 – 22:00

Coquetel de Lançamento do Livro Preparo de Amostras para Análise de Compostos Orgânicos - LTC Local: Solar da Baronesa (Reservado) Elaborado por eminentes especialistas e pesquisadores da área, Preparo de Amostras para Análise de Compostos Orgânicos foi concebido com o intuito de se tornar referência nos meios acadêmico e profissional, dada a carência de bibliografia específica para o setor.

Esse esforço conjunto reuniu 55 docentes das mais importantes instituições de ensino do país – de todas as regiões – e também de Portugal. Constituída por 25 capítulos, divididos em seis Partes, a obra aborda essencialmente as técnicas de preparo de amostras para a determinação de compostos orgânicos, como a cromatografia e a eletroforese capilar, contemplando um rico conteúdo para as áreas alimentícia, ambiental, clínica, biológica e mesmo forense. Exatamente por essa razão, o livro pode ser utilizado na esfera acadêmica – nos cursos de graduação e de pós que abordem o assunto, como Química, Biotecnologia, Farmácia, Ecologia, Ciências Biológicas e nas Engenharias Química, de Petróleo, de Alimentos e de Materiais – e também no mercado industrial. A obra traz, ainda, material suplementar restrito a docentes que pode ser acessado, mediante cadastro, no site da LTC Editora – GEN | Grupo Editorial Nacional.

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VI Workshop em Avanços Recentes no Preparo de Amostras Programação | 17 de outubro – sábado | 08:30 – 9:15

Palestra 7 Prof. Dr. Álvaro José dos Santos Neto – IQSC-USP Chairperson: Prof. Dr. Marcone Augusto Leal de Oliveira - UFJF

09:15 – 10:00

Palestra 8 Prof. Dr. Eduardo Costa de Figueiredo - UNIFAL Chairperson: Prof. Dr. Ricardo Orlando Mathias - UFMG

10:00 – 10:45

Palestra 9 Profa. Dra. Isabel Cristina Fontes Jardim - UNICAMP Chairperson: Profa. Dra. Zenilda de Lourdes Cardeal - UFMG

10:45 – 11:30

Palestra 10 Profa. Dra. Zenilda de Lourdes Cardeal - UFMG Chairperson: Prof. Dr. Álvaro José dos Santos Neto – IQSC-USP

11:30 – 13:30

Almoço livre

13:30 – 14:15

Palestra 11 Prof. Dr. Marcone Augusto Leal de Oliveira - UFJF Chairperson: Prof. Dr. Keyller Bastos Borges - UFSJ

14:15 – 15:00

Palestra 12 Prof. Dr. Keyller Bastos Borges - UFSJ Chairperson: Profa. Dra. Isabel Cristina Fontes Jardim - UNICAMP

15:00 – 15:45

Palestra 13 Seminário Técnico 2

15:45 – 16:00

Café com Biscoito

16:00 – 16:20

Apresentação Oral 1

16:20 – 16:40

Apresentação Oral 2

16:40 – 17:00

Apresentação Oral 3

17:00 – 17:20

Apresentação Oral 4

98

17:20

Sessão de Encerramento.

20:00

Jantar de Confraternização (Opcional) Scientia Chromatographica 2015; 7(2)

Scientia Chromatographica 2015; 7(2):101-108 Instituto Internacional de Cromatografia http://dx.doi.org/10.4322/sc.2015.019 ISSN 1984-4433

PREPARO DE AMOSTRAS

Extração em ponteiras descartáveis: fundamentos teóricos e aplicações Disposable Pipette Extraction (DPX): fundamental principles and applications

Mônia Aparecida Lemos Pinto1 Maria Eugênia Costa Queiroz2* Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, CEP 14.040-903, Ribeirão Preto, SP, Brasil 2 Departamento de Química, Faculdade de Filosofia Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, CEP 14040901, Ribeirão Preto, SP, Brasil *mariaeqn@ffclrp.usp.br 1

Recebido: 18 Ago 2015 Aceito: 03 Set 2015

Resumo

A extração em ponteiras descartáveis – Diposable Pipette Extraction (DPX), recente técnica de preparo de amostra, é baseada no equilíbrio de sorção do analito presente na amostra com o sorvente. Esta técnica consiste em uma variante da extração em fase sólida (SPE) convencional. A DPX utiliza uma ponteira convencional de pipeta (1 ou 5 mL), na qual o sorvente está contido livremente entre dois filtros. A amostra aspirada pela ponteira é misturada dinamicamente com o sorvente por meio da aspiração de ar. A extração ocorre em fase sólida dispersiva, assegurando adequada superfície de contato (amostra/sorvente) e conseqüentemente, eficiente extração.

A DPX é uma técnica de preparo de amostra rápida e simples que utiliza reduzido volume de amostra e de solvente orgânico. Esta revisão apresenta os fundamentos teóricos da técnica DPX, as principais etapas envolvidas no processo de extração e exemplos de aplicações desta técnica de preparo de amostra, nas áreas de toxicologia forense, ambiental e clínica.

Palavras-chave: Extração em ponteiras descartáveis; preparo de amostra.

Abstract

Disposable Pipette Extraction (DPX), recent technique of sample preparation, is based on analyte sorption equilibrium between the samples and sorbent. This technique consists of a variant of conventional solid phase extraction (SPE). DPX uses a standard pipette tip (1 or 5 ml), in which the sorbent is contained loosely between two filters. Suction of air promotes dynamically mix of the sample and the sorbent inside the tip. The extraction occurs in dispersive solid phase, ensuring adequate contact surface, and consequently, efficient extraction. The DPX is a fast and simple sample preparation technique that uses small sample volume and the organic solvent. This review presents the theory fundamentals of DPX technique, the key steps involved in the extraction process and examples of applications in the areas of forensic toxicology, environmental and clinical.

Keywords: Disposable Pipette Extraction; sample preparation.

Scientia Chromatographica 2015; 7(2)

101

Pinto MAL, Queiroz MEC

1. Introdução

Nos últimos anos, notáveis avanços nas técnicas de preparo de amostras e na instrumentação analítica vêm sendo observados. Além de favorecer a seletividade e detectabilidade, a instrumentação analítica moderna tem proporcionado o desenvolvimento de rápidos métodos analíticos, permitindo alta freqüência analítica.

Dentre as técnicas modernas de análise, a cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (LC‑MS, Liquid chromatography–mass spectrometry) tem sido considerada a técnica de referência na análise de compostos de interesse, tanto na área clínica (fármacos/ metabólitos/biomarcadores), como na ambiental[1].

Embora, a LC-MS apresente as vantagens descritas em relação à instrumentação analítica moderna, a etapa do preparo de amostra é parte integrante do processo analítico. O preparo da amostra é a primeira e mais laboriosa etapa na análise cromatográfica. Geralmente, a etapa do preparo da amostra requer 80% do tempo total da análise e, de forma simples, visa o isolamento seletivo dos analitos, a eliminação de grande parte dos componentes endógenos (interferentes) da matriz da amostra, além de concentrar os analitos, quase sempre presente em níveis de traços[1].

A extração líquido-líquido (LLE), precipitação de proteínas de fluídos biológicos (PP), e extração em fase sólida (SPE) com sorventes disponíveis no comércio têm sido consideradas como técnicas convencionais de preparo de amostra. Nos últimos anos, novas estratégias de preparo de amostra, visando à simplificação, a miniaturização e minimização do uso de solventes orgânicos, foram desenvolvidas, avaliadas, validadas e comercializadas[1,3]. Neste contexto, podemos destacar a técnica de extração em ponteiras descartáveis, ou simplesmente DPX (Disposable Pipette Extraction).

A extração em ponteira descartável, outra variante da tradicional SPE e da extração em fase sólida dispersiva (D-SPE, importante etapa do método QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, Safe), permite rápida extração de amostras em soluções, 102

Extração em ponteiras descartáveis

porém emprega ponteiras descartáveis, ao invés de cartuchos ou tubos de ensaio.

A técnica DPX, quando comparada à D-SPE (empregada apenas na sorção de interferentes do método QuEChERS), permite a sorção e dessorção dos analitos, já quando comparada a SPE, requer menor massa de material sorvente, além de dispensar a utilização de vácuo[4]. Em geral, esta técnica minimiza as etapas necessárias de condicionamento e, portanto acelera o processo de preparo de amostra. Trata-se de um método único no qual o sorvente contido livremente no interior de uma ponteira é completamente misturado a solução de amostra por meio da aspiração de ar. Esta mistura dinâmica da fase sólida dispersiva-amostra favorece o rápido equilíbrio de sorção do analito. Já a menor massa de sorvente, resulta em menores volumes de amostra e de solvente orgânico[5]. Além disso, a extração por DPX pode ser facilmente automatizada. A principal vantagem da extração por DPX, especialmente quando se utiliza um aparelho semi-automatizado simples, é alta freqüência analítica.

As principais áreas de aplicação, nas quais a extração por DPX tem sido reportada são as análises forenses (drogas de abuso) e de contaminantes de alimentos (principalmente os pesticidas). No entanto, mais recentemente, a DPX vem sendo descrita como uma ferramenta essencial para a purificação e concentração de proteínas e peptídeos em genômica, proteômica, metabolômica. E embora, a literatura científica sobre a utilização da DPX na determinação de fármacos em fluidos biológicos seja ainda limitada, sua simplicidade na operação, variedade de sorventes disponíveis e capacidade de automatização geram várias vantagens também a este seguimento[2].

2. As ponteiras DPX

A extração em ponteira descartável (DPX), recente técnica de preparo de amostra, surgiu como uma alternativa a SPE convencional. Fruto de uma patente (n° US6566145 B2) de 2003 desenvolvida pelo Scientia Chromatographica 2015; 7(2):101-108

Pinto MAL, Queiroz MEC

Extração em ponteiras descartáveis

Figura 1. Esquema de uma ponteira DPX [Adaptado da referência n 7].

Dr. William Brewer (Universidade da Carolina do Sul, EUA) de maneira original e simples, a DPX trata-se de uma ponteira padrão de pipeta (1 ou 5 mL), modificada, na qual uma pequena quantidade de sorvente está contido livremente em seu interior entre dois filtros. Um dos filtros é colocado na extremidade inferior e outro na extremidade superior da ponteira. O primeiro (que pode ser uma tampa de vidro sinterizado, de lã de vidro, de polímero poroso, ou de metal), tem como finalidade proporcionar uma barreira permeável que permita a passagem livre dos fluídos em qualquer direção (aspiração/dispensação), ao mesmo tempo em que retém a fase extratora. O segundo, colocado na extremidade superior, impede a passagem de qualquer material sólido ou fluído para o interior da pipeta, assegurando

Tabela 1. Ponteiras DPX comercializadas pela DPX Labs®.

Tipos de ponteiras comercializadas

Tipo de Fase

Uso

DPX-RP

DPX-RP 1mL (30 mg) DPX-RP 5mL (60 mg) DPX-RP TA* 1mL

Estireno divinil benzeno

Adsorção de compostos apolares e pouco polares (Ex.: pesticidas)

DPX-CX

DPX-CX 1mL (20 mg) DPX-CX 5 mL (60-100 mg) DPX-CX TA* 1mL

Grupos – ácido sulfônico

Adsorção de compostos básico (Ex.: drogas de caráter básico)

DPX-WAX

DPX-WAX 1mL (20-30 mg) DPX-WAX 5 mL (60 mg) DPX-WAX TA* (20-30 mg)

Grupos poliamino

Interação com compostos ácidos (Ex.: drogas e metabólitos)

DPX-WCX

DPX-WCX 1 mL (30 mg) DPX-WCX 5mL (60 mg) DPX-WCX TA* (30 mg)

Grupos policarboxilato

Adsorção de compostos básicos (Ex: especialmente aminoglicosídeos)

DPX-Si

DPX-Si 1mL (30-100 mg) DPX-Si 5 mL (50-250 mg) DPX-Si TA* (30-100 mg)

Sílica Gel

Limpeza (cleanup ) de amostras ambientais

DPX-C18

DPX-C18 1 mL (30-100 mg) DPX-C18 5 mL (50-250 mg) DPX-C18 TA* (30-100 mg)

C18 (20% de sílica gel)

Remoção de interferentes presentes na matrix

DPX-SC

DPX-SC TA 1 mL

Vazio ou com areia (lavada com ácido)

Coleta de amostras sólidas

DPX-Blank

1 ou 5 mL

–

Desenvolvimento de métodos

*Tipo especial de ponteira com adaptador para sistemas automatizados.

Scientia Chromatographica 2015; 7(2):101-108 103

Pinto MAL, Queiroz MEC

Extração em ponteiras descartáveis

a não contaminação da mesma e a retenção do sorvente.

Este segundo filtro é de preferência constituído de vidro sinterizado, de um polímero poroso, ou de uma membrana semi-permeável[6] (Figura 1).

Figura 2. Esquema das etapas envolvidas na extração por DPX. [Esquema adaptado da publicação online da GERSTEL, http://www. gerstel.de/pdf/p-gc-an-2009-01.pdf].

A primeira ponteira DPX comercialmente disponível, se fundamentou na cromatografia clássica, com partículas C18 incorporadas com polímeros (ZipTip, Millipore, Bedford, MA, EUA)[8]. Desde então, semelhante aos cartuchos SPE tradicionais, diferentes fases com diferentes mecanismos de extração foram

Tabela 2. Aplicações da técnica DPX na determinação de contaminantes alimentares associados à análise cromatográfica.

Analito (amostra) Melamina (leite)

Pesticidas organoclorados e organofosforados (alimentos) Pesticidas organoclorados e organofosforados (frutos e vegetais) Pesticidas (frutas e vegetais) Paládio (BTU) 58 Pesticidas (produtos de Feijão) Bifenilos Policlorados – PCBs (tecido biológico) 36 Pesticidas (solo)

Processo extração Fase extratora: Troca catiônica Volume de amostra: 250 µL (2x de 30s); Lavagem: 500 µL de solução de acetonitrila 10% (ACN/H2O) + 500 µL de ACN (1x); Eluição: 1mL de uma mistura de NH4OH(4%)/ EtAC(76%)/IPOH (20%) Fase extratora: (SDVB), (DPX-RP) (DPX-PA) e (DPX-WAX) Volume de amostra: 500 µl (1 min) Eluição: Acetonitrila Fase extratora: Estireno divinilbenzeno; Volume de amostra: 1 mL (1x de 30-60s); Lavagem: 0,5 mL água deionizada; Eluição: 0,7 mL hexano/acetato de etila (50/50, v/v) Fase extratora: Fase reversa Volume de amostra: 3,5 mL de extrato – 2x ou 3x (30s) Lavagem: 1 mL de água Eluição: 700 µL de uma mistura de hexano/ acetato de etila (50:50 v/v) Solução de Pd-BTU 1mol L-1 Eluição: Metanol Fase extratora: DPX- Qg (alta quantidade de carbono grafite) Amostra: 20 g (30s) Fase extratora: Sílica Volume de amostra: Sobrenadante (10s) Eluição: 8 mL de n-hexano –

Técnica analítica

LOQ/LOD

Referências

GC/MS

<20 ng/mL

Lambert, S. (2009)[6]

GC/MS

<10 ppb

Guan, H et al.

(2009)[5]

GC/MS

100 ng/mL

Guan, H et al.

(2010)[11]

GC

<0,1 ppm

Guan, H. et. al.

(2010)[12]

GC/MS

0,012 ppb

Jaison, P. G. et al.

(2012)[13]

GC/MS

0,01-0,1 mg/Kg

Li, Z. et al.

(2012)[4]

GC/MS-MS

2-152 pg/g

Pena-Abaurrea, M. et al. (2013)[15]

GC/MS-MS

<7,6 g/kg

Fernandes, V C. et al. (2013)[16]

SIM = monitoramento do íon seletivo; SDVB = estireno-divinilbenzeno; DPX-RP= fase reversa ; DPX-PA= poliamino; DPX-WAX = troca aniônica; BTU = benzoíla tioureia; Pd=Paládio.

104

Scientia Chromatographica 2015; 7(2):101-108

Pinto MAL, Queiroz MEC

Extração em ponteiras descartáveis

Tabela 3. Aplicações da extração por DPX na determinação de drogas de abuso e fármacos associados à análise cromatográfica.

Analito (amostra)

Processo extração

Fase extratora: C18 Condicionamento: 2x de 100 µL de tampão Lidocaina e K2HPO4 0,1 M (pH 8,0); Diazepam Volume de amostra: 200 µL (água) Lavagem: 100 µL de água; Eluição: 100 µL de acetato de etila Fase extratora: monolito de sílica (C18) Condicionamento: 200 µL de metanol + 200 µL de água Mequitazina Volume de amostra: 100 µL (20x) (plasma) Lavagem: 200 µL água Eluição: Metanol (5x) Fase extratora: monolitos de sílica (C18) 10 antihistamínicos Condicionamento: 200 µL de metanol + 200 µL de água (plasma) Volume de amostra: 100 µL (25x) Eluição: 100 µL Metanol (5x) Fase extratora: monolitos de sílica (C18) Metanfetamina e Condicionamento: 200 µL de metanol + 200 µL de água Anfetamina Volume da amostra: 100 µL (25x) (sangue) Lavagem: 200 µL água Eluição: Metanol (5x) Fase extratora: monolito de sílica (C18) Metanfetamina e Condicionamento: 200 µL de metanol + 200 µL de água Anfetamina Volume de amostra: 500 µL (25x) (urina) Lavagem: 200 µL água Eluição: Metanol (5x) Fase extratora: estireno de divinilbenzeno Condicionamento: 800 µL (400 µL extração com urina) THC (sangue) e de água/acetonitrila (67:33, v/v) – 1min.

THCc (sangue e urina) Volume: 800 µL (1 min) Eluição: 800 µL (400 µL extração com urina) de acetato de etila/ acetonitrila (50:50, v/v).

Fase extratora: Troca catiônica (CX) Anfetamina, opiáceos, cocaína Condicionamento: 500 µL água e seus metabólitos; metabólito Volume de amostra: 200 µL (20 s) do tetrahidrocanabinol, Lavagem: 500 µL água destilada (2x) antidepressivos tricíclicos, Eluição: 500 µL de acetonitrila - drogas neutras e ácidas; mepiridina, metadona, 500 µL cloreto de metileno / isopropanol / fenciclidina (urina) hidróxido de amônio 78:20:2 (v/v) – drogas básicas Fase extratora: troca catiônica Condicionamento: 2 mL de água deionizada e 2 mL de CH3OH (20s) Opiáceos Volume de amostra: 100 µL (1x de 30s); (humor vítreo) Lavagem: 2,5 mL água e 2,5 mL de acetonitrila (30s cada); Eluição: 2,5 mL de uma mistura de CH2Cl2 (78%), isopropanol (20%) e hidróxido de amônio (2%);

Técnica analítica

LOQ/LOD

Ref.

GC

–

van Hout, M.W.J. et al.

(1999)[17]

GC/MS

0,5 ng/mL

Kumazawaa, T. et al.

(2006)[18]

GC/MS

0,2-50 ng/mL

Hasegawa, C. et.al.

(2006)[19]

GC/MS

0,15 ng/mL – Metanfetamina e 1,1 ng/mL – Anfetamina

Hasegawa, C. et al.

(2007)[10]

GC/MS

0,08 ng/ml – Metanfetamina e 0,10 ng/ml – Anfetamina

Kumazawaa, T. et al.

(2007)[9].

GC/MS

1 ng/mL – THC (sangue) 2 ng/mL – THCc (sangue) 3 ng/mL – THCc (urina)

Schroeder, J.L. et al.

(2008)[20].

GC/MS

<100 ng/mL

Ellison, S.T. et al.

(2009)[21]

GC

490-4350 ng/mL

Kovatsi, L. et. al.

(2011)[22]

THC = Δ9-tetrahidrocanabinol; THCc = 11-nor-Δ9-tetra-hidrocanabinol-9-carboxílico.

Scientia Chromatographica 2015; 7(2):101-108 105

Pinto MAL, Queiroz MEC

Extração em ponteiras descartáveis

Tabela 3. Aplicações da extração por DPX na determinação de drogas de abuso e fármacos associados à análise cromatográfica.

Analito (amostra)

Processo extração

Técnica analítica

LOQ/LOD

Ref.

Dextrometorfano (plasma)

Fase extratora: monolitos de sílica (C18) Condicionamento: 200 µL de metanol + 200 µL de água Volume de amostra: 100 µL (20x) Lavagem: 200 µL água Eluição: Metanol (5x)

GC/MS

1,25 ng/mL

Hasegawa, C. et al.

(2011)[23]

Clorpromazina, Olanzapina, Clozapina e Biperideno (urina)

Fase extratora: estireno divinilbenzeno Condicionamento: 3 ml metanol (1x-10s) + 3mL água (1x-10s) Volume de amostra: 1 mL (5 min) Lavagem: 3 mL água Eluição: 1,5 mL Acetonitrila (1x)

Antibióticos aminoglicosídeos (tecidos)

Cocaína e Nicotina (mecônio)

Antidepressivos – Fluoxetina e Norfluoxetina (plasma)

Fase extratora: troca catiônica Condicionamento: 3 mL de metanol (1x); 3 mL H2O (2x); Volume de amostra: 10 mL de extrato (4x de 2,5 mL – 30s cada) Lavagem: 3,0 mL água deionizada; Eluição: 0,9 solução aquosa de ácido fórmico 10% (5x) Fase extratora: Troca catiônica Condicionamento: 1mL solução de Acetonitrila (70:30, v/v) Volume de amostra: 300 mg (1 min) Lavagem: 1mL água deionizada (1min) Eluição: 1 mL (3x) de uma mistura dediclometano/ 2-propanol/hidróxido de amônio (78: 20:2, v/v/v) Fase extratora: 5 mg de cada (copolímeros de estireno divinilbenzeno e compósitos de polianilina); Volume: 200 µL (3 x de 30s); Lavagem: 3x de 500 µL de solução de água:metanol (50:50, v/v) Eluição: 200 µL (1x) acetonitrila

GC

Samanidou, V. 0, 85 - 3, 58 ng/µl et al .

(2013)[7]

> 5 ng/g

Lehotay, S.J. et.al.

(2013)[24]

GC/MS

10 - 20 ng/g

Bordin, D.C.M. et al.

(2013)[25]

LC

10 ng/ mL – Fluoxetina e 80 ng/mL - Norfluoxetina

Queiroz, M.E.C. et. al.

(2015)[8]

LC-MS/MS

THC = Δ9-tetrahidrocanabinol; THCc = 11-nor-Δ9-tetra-hidrocanabinol-9-carboxílico.

introduzidas no mercado (Tabela 1). Em 2004, uma nova ponteira DPX com sílica monolítica, a Mono Tip C18 (GL Sciences, Tóquio, Japão) foi desenvolvida e tem sido aplicada com sucesso em análises proteômicas e metabolômicas[9,10].

Além, do leito reduzido da ponteira, que requer menor volume de amostra e solvente orgânico, o fato do sorvente estar contido livremente na ponteira, permite o fluxo bidirecional (aspirar ou dispensar) dos fluidos, acelerando o processo de extração. As ponteiras DPX podem ser facilmente acopladas a uma seringa (polipropileno), podendo a extração ser realizada 106

manualmente para pequenos lotes de amostras; já para laboratórios com grande volume de amostras, sistemas automatizados já encontram-se disponíveis no mercado.

Estes possuem a vantagem de proporcionar um fluxo positivo uniforme e controlado e, por conseguinte análises mais exatas e precisas[6].

3. Etapas da extração por DPX[1-10]

Em um experimento típico de extração por DPX, inicialmente a fase extratora é condicionada com um solvente apropriado para ativação dos sítios de ligações.

Esta etapa, em alguns casos, não se faz necessária. Após o condicionamento, a amostra líquida (ou extrato) é Scientia Chromatographica 2015; 7(2):101-108

Pinto MAL, Queiroz MEC

aspirada para o interior da ponteira e misturada à fase extratora por meio da entrada de ar através da ponta da ponteira. A subsequente aspiração de ar resulta em uma completa mistura da amostra com a fase extratora formando uma suspensão, e permitindo assim uma rápida e eficiente extração. Essa etapa requer otimização, visto que a eficiência da extração está baseada no equílibrio de sorção, ou seja, no tempo de contato do analito de interesse com a fase extratora.

Normalmente, após 30s, a amostra já pode ser dispensada, seguida de uma etapa de lavagem. A escolha do solvente de lavagem é feita com base no tipo / natureza química do sorvente, na natureza do analito de interesse e nos interferentes possivelmente presentes na matriz. A lavagem com solvente é também realizada por meio da entrada de ar na ponteira. Após esta etapa, finalmente o solvente de eluição é aspirado para o interior da ponteira, seguido da aspiração de ar, várias vezes, de forma a assegurar à completa dessorção dos analitos adsorvidos. O eluato pode ser diretamente injetado em um sistema cromatográfico ou evaporado e reconstituído, visando maior detectabilidade analítica.

Todas as etapas envolvidas na extração por DPX são válidas para ambos os sistemas, manual e automatizado (Figura 2).

Extração em ponteiras descartáveis

4. Aplicações da DPX

As Tabelas 2 e 3 ilustram as principais aplicações da técnica de extração por DPX associada à análise cromatográfica na determinação de diferentes analitos para diferentes fins na área forense, clínica e ambiental.

5. Considerações Finais

As técnicas de extração miniaturizadas, como a DPX, tem se tornado uma importante ferramenta na etapa de preparo de amostra. Esta inovadora técnica, baseada nos princípios de sorção da D-SPE e nas etapas da SPE miniaturizada, minimiza o tempo de extração, pois necessita de apenas poucos minutos para a obtenção de eficiente extração e favorece o emprego de pequenos volumes de amostra e de solvente orgânico. Estas vantagens explicam a crescente aplicação da técnica DPX na etapa de preparo de amostras para a determinação de diferentes analitos, especialmente pesticidas, na área ambiental e drogas de abuso, nas análises forenses.

Os métodos reportados na literatura empregando a técnica DPX associada às técnicas analíticas GC, HPLC, LC-MS/MS e GC-MS (Tabelas 2 e 3) mostraram seletividade, alta detectabilidade analítica e linearidade adequada para análises de amostras biológicas e ambientais.

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Scientia Chromatographica 2015; 7(2):101-108 107

Pinto MAL, Queiroz MEC

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Scientia Chromatographica 2015; 7(2):101-108

Scientia Chromatographica 2015; 7(2):109-115 Instituto Internacional de Cromatografia http://dx.doi.org/10.4322/sc.2015.020 ISSN 1984-4433

PREPARO DE AMOSTRAS

Extração em fase sólida molecularmente impressa de ácido hipúrico e ácido metil-hipúrico em amostras de urina seguido de análise por cromatografia líquida de alta eficiência Molecularly imprinted solid phase extraction of hippuric and methyl hippuric acids from urine samples followed by high performance liquid chromatography analysis

Tamires Amabile Valim Brigante Carolina dos Santos Patrícia Penido Maia Eduardo Costa Figueiredo* Toxicant and Drug Analysis Laboratory, Gabriel Monteiro da Silva St. 700, Federal University of Alfenas - Unifal-MG, 37130-000 Alfenas, MG, Brazil *eduardocfig@yahoo.com.br Recebido: 18 Ago 2015 Aceito: 03 Set 2015

Resumo

Tolueno e xileno são solventes amplamente usados e podem causar vários efeitos indesejáveis no sistema nervoso central quando em altas concentrações no ambiente.

A monitorização biológica destas substâncias tem sido frequentemente realizada analisando os seus metabólitos na urina como o ácidos hipúrico (AH) e 3-metil hipúrico (3-AMH), respectivamente para tolueno e xileno. Assim, métodos de preparo de amostras seletivos e sensíveis para a extração destes metabólitos em amostras de urina são desejados. Desta forma, este trabalho descreve uma nova alternativa para a análise simultânea de AH e 3-AMH a partir de amostras de urina, utilizando extração em fase sólida molecularmente impressa e cromatografia líquida de alta eficiência. A faixa linear, limite de quantificação e coeficiente de correlação foram 0,5-8,0 mg mL-1, 0,5 mg mL-1 e >0,992 para ambos os analitos, respectivamente. Além disso, o método é confiável, preciso e exato na faixa linear e pode ser eficientemente aplicado em análises de rotina de AH e 3-AMH em amostras de urina de trabalhadores expostos ao tolueno e xileno em seu ambiente de trabalho.

Palavras-chave: ácido hipúrico, ácido metil-hipúrico, cromatografia líquida de alta eficiência, polímero de impressão molecular, tolueno, xileno.

Abstract

Toluene and xylene are widely used solvents and can cause several undesirable effects in the central nervous system when in high concentrations. The biological monitoring of these substances has often been performed analyzing their urine metabolites as hippuric (HA) and 3-methyl hippuric (3-MHA) acids, respectively for toluene and xylene. Thus, selective and sensible sample preparation methods for the extraction of these metabolites from urine samples are welcome. Therefore, this paper describes a new alternative for the simultaneous analysis of HA and 3-MHA from human urine samples using molecularly imprinted solid phase extraction and high performance liquid chromatography. The linear range, limit of quantification and correlation coefficient were from 0.5 to 8.0 mg mL-1, 0.5 mg mL-1 and >0.992 for both analytes, respectively. Moreover, the method is reliable, precise and accurate in the linear range and it can be efficiently applied in routine analysis of HA and 3-MHA in urine samples from workers exposed to toluene and xylene in their occupational environment.

Keywords: high performance liquid chromatography, hippuric acid, methyl hippuric acid, molecularly imprinted solid phase extraction, toluene, xylene.

Scientia Chromatographica 2015; 7(2)

109

Brigante TAV et al.

1. Introduction

Toluene and xylene are organic solvents widely used in industries in the production of resins, paints, paint thinners, glues, fuels, among others. In high environmental concentrations, these compounds can be easily absorbed during breathing, causing several health problems mainly in the central nervous system[1].

The biological monitoring of these solvents has often been accessed by the determination of their metabolites in urine samples, for example, the hippuric (HA) and 3-methyl hippuric acids (3-MHA) for toluene and paraxylene, respectively[2]. The biological exposure index for HA and 3-MHA in Brazil are 2.5 and 1.5 g per gram of creatinine[3].

The HA and 3-MHA quantifications frequently depend on a previous sample preparation procedure based on either solvent[1] or solid phase (SPE) extractions[4] to eliminate undesirable interferents present in urine, as for example, proteins, salts, lipids and organic compounds.

In this way, selective, sensible, simple and fast extraction procedures are welcome instead of the conventional techniques, as those based on molecular imprinting for example[5]. Molecular imprinted polymers (MIPs) are alternative materials that have been highlighted in literature due to their high selectivity when compared with other sorbents. These polymers consist of a rigid three-dimensional network synthesized around a template molecule, which is usually the analyte itself[6]. After the synthesis, the material is washed to remove the mold and the polymer acquires binding sites able to re-bind the template[6]. The sorbents commonly used in SPE present retention mechanism based on hydrophobic interactions, with the disadvantage of co-eluting interfering species.

In MIPs, these non-specific interactions are minimized, prevailing specific bonds between the polymer and the template molecule or other molecules similar to the template[7].

Several studies have been published in recent years demonstrating the usefulness of the MIPs in the extraction of several compounds from different matrices 110

MISPE to hippuric and methyl hippuric acids followed by HPLC-UV

as biological samples[8-11], food[12,13], water[14,15], etc.

However, molecularly imprinted solid phase extractions of HA and 3-MHA have not been reported so far, to the best of our knowledge. So, in the present paper we evaluate the efficiency of a new MIP for selective extraction of HA and 3-MHA from human urine samples, followed by high performance liquid chromatography analysis with UV detector.

2. Experimental 2.1. Instrumentation

A water bath from B. Braun Biotech International (Melsungen, Germany) was used for the polymers synthesis. The pH was adjusted with a NT PH2 pHmeter from Nova Técnica (São Paulo, Brazil) equipped with a combined glass electrode. A spectrophotometer UV-Vis Biomate 5 (Thermo Electron Corporation, Rochester, USA) operating at 228 nm was used during the washing and adsorption experiments. All the chromatographic analyses were performed in a HPLC Shimadzu model LC-10AV (Kyoto, Japan) equipped with a LC-10ATvp pump, a CTO-10ASvp column oven, a SIL-10AF automatic injector, a SPD-10Avp UV detector and a Supelcosil™ LC-18 reverse-phase column (150 × 4.6 mm, 5 μm particle size) from Supelco® (Bellefonte, PA, USA) protected by a similar guardcolumn (10 x 4.0 mm). A Visiprep DL vacuum manifold from Supelco® (Bellefonte, USA) was employed in the SPE.

2.2. Reagents and solutions

Ultrapure water was obtained from a Milli-Q Plus gradient water system (Millipore, São Paulo, Brazil). 3-MHA, 4-vinylpyridine, ethylene glycol dimethacrylate, 2,2’-azobisisobutyronitrile (all from Sigma-Aldrich®, Steinheim, Germany) and HPLC grade acetonitrile (Vetec, Rio de Janeiro, Brazil) were used in the synthesis as template, functional monomer, crosslinker, initiator and solvent, respectively. Ethyl acetate, methanol, acetone and hexane (all of HPLC grade) used during the extraction optimization were Scientia Chromatographica 2015; 7(2):109-115

MISPE to hippuric and methyl hippuric acids followed by HPLC-UV

purchased from Honeywell (Muskegon, USA). The sodium hydroxide and nitric acid were purchased from Labsynth (Diadema, Brazil) and Dinâmica (Diadema, Brazil), respectively. Standards solutions of 50 mg mL-1 HA and 3-MHA (Sigma-Aldrich, Louis, USA) were prepared in methanol and stored in amber flasks at -4oC.

2.3. MIP synthesis

The MIP synthesis was performed as described by Vieira et al.[9]. 2.0 mmol of 3-MHA (template), 8.0 mmol of 4-vinylpyridine (functional monomer), 40.0 mmol of ethylene glycol-dimethacrylate (crosslinking reagent), 1.5 mmol of 2,2’-azobisisobutyronitrile (initiator) and 11 mL of acetonitrile were added into a 100 mL glass flask, and the mixture was purged with nitrogen during 20 min to eliminate oxygen[16]. The flask was sealed and maintained in a water bath during 24 h at 60°C. After this, it was opened and the polymer was ground in a mortar.

A steel graduated sieve was used to select the particles <150 µm in size. Finally, 50 mg of the MIP was packed into a SPE cartridge and submitted to consecutives washing cycles with 3 mL of methanol to eliminate the template and residues from the synthesis. The polymer was considered clean when no spectrophotometric signal (at 228 nm) was observed in the eluates from washing cycles. The non-imprinted polymer (NIP) was synthesized by the same way, except for template addition step.

2.4. Samples

The urine samples handling was approved for the Ethics Committee of the Federal University of Alfenas (no: 23087.001825/2009-81). All samples were collected in an appropriate flask and filtered before the analysis. The HA and 3-MHA standard solutions were prepared by fortifying a blank urine samples (from individuals non-exposed to toluene and xylene) with specific concentrations.

2.5. Molecularly imprinted solid phase extraction

A solid phase extraction (SPE) cartridge contained 50 mg of MIP were conditioning with 3.0 mL

Brigante TAV et al.

of ethyl acetate and 5.0 mL of water at 1 mL min-1. Next, 1.0 mL of standard/sample was percolated through the cartridge and the HA and 3-MHA were retained in the MIP. Finally, 1.0 mL of mobile phase (792:200:8-v/v/v water:methanol:acetic acid) was employed to elute the analytes. 20 µL of the eluate were injected in the HPLC system.

2.6. Chromatographic conditions The guard and analytical columns were maintained at 40ºC and the UV detector was set at 228 nm. The 792:200:8 (v/v/v) water:methanol:acetic acid was used as isocratic mobile phase at 1.3 mL min-1 flow rate, and the injection volume was 20 µL.

2.7. Validation The method validation was carried out according to the Guidance for analytical methods validation of Brazilian Health Surveillance Agency (ANVISA) and the FDA’s Guidance for Industry for Bioanalytical Method Validation[17,18].

Calibration curves (linear regression analysis) were constructed by plotting peak areas of the HA and 3-MHA (subtracted from the blank) vs. the original concentrations.

Intra-assay precision and accuracy were determined by six replicates assay with blank urine spiked with three concentrations. The assays were realized at the same day. Inter-assay precision and interassay accuracy were evaluated by analyzing three values of concentration at three different days.

Robustness test was performed evaluating the method susceptibility to the changes on the experimental conditions. Younden test consists in a factorial combination of two variables from seven parameters that result in eight assays. The results of assays are statistically analyzed to estimate the influence of the chosen parameters in the analytical method[19,20].

Scientia Chromatographica 2015; 7(2):109-115 111

Brigante TAV et al.

MISPE to hippuric and methyl hippuric acids followed by HPLC-UV

3. Results and discussion

The spectrophotometric signal of each fraction of methanol (3.0 mL) used in washing procedure was gradually decreasing until its total absence after about 20 cycles. So, 20 cycles were considered enough to clean completely the MIP. All the optimization studies were carried out by using a blank urine sample (from individuals non-exposed to toluene and xylene) fortified with 0.5 mg mL-1 of HA and 3-MHA. The initial conditions were: i) conditioning with 5 mL of 0.5 mol L-1 nitric acid aqueous solution and 10 mL of water, ii) extraction of 2 mL of standard/ sample and iii) elution with 1 mL of methanol. All the solutions were flowed through a cartridge with 100 mg of MIP at 1 mL min-1.

Initially, methanol and mobile phase (792:200:8 - v/v/v water:methanol:acetic acid) were evaluated as eluent and no differences were observed in terms of analytical signal. On the other hand, when the methanol was used, the obtained chromatogram presented more peaks of concomitants attesting that this solvent was less selective as eluent in comparison with the mobile phase.

Therefore, mobile phase was selected as the working condition.

The washing step has been often used to eliminate interferents bonded to the MIP by unspecific interactions without to elute the own analytes[21]. In this way, several washing solvents were appraised and the results are presented in Figure 1. As can be seen, the analytes were almost completely eluted during the washing when polar solvents (methanol, water and acetonitrile) were used.

Additionally, the best results in terms of recoveries were found when no washing step was used. Moreover, the chromatographic profiles obtained after extraction using hexane as washing solution were very similar with those obtained without washing steps, and no interferents peaks were observed in the retention times of the analytes. Thus, the SPE procedure was optimized without any washing step.

112

Figure 1. Effect of the washing solutions in the extraction recovery.

Figure 2. Relation between the recovery rates of hippuric Acid (HA) and 3-Methyl hippuric acid (3-MHA) and the amount of MIP used into the cartridge.

The sample pH was studied from 3.0 to 10.0 (without buffer), and the best extraction efficiency was obtained for pH 3.0. Therefore, hydroxyl groups from the analytes are in their uncharged form, whereas the amine group from the 4-vinylpyridine is positively charged, resulting in an ion-dipole interaction.

The mass of MIP into the cartridge was tested from 50 mg to 150 mg, and 50 mg was selected as working condition because it presented good adsorption efficiency and a low resistance to the flow. Additionally, for masses > 50 mg, an increase in the HA retention was observed, probably due to its chemical similarity with the 3-MHA, as well as lower molecular weight. As it can be seen in Figure 2, recovery rates of HA and 3-MHA were equal by using 50 mg of MIP in the cartridge.

Scientia Chromatographica 2015; 7(2):109-115

MISPE to hippuric and methyl hippuric acids followed by HPLC-UV

The final condition of extraction was defined by A) conditioning with 3 mL of ethyl acetate; B) conditioning with 5 mL of ultra pure water; C) sample extraction; D) elution with 2 mL of water:methanol:acetic acid (792:200:8. v/v). Figure 3 shows a typical chromatogram of a urine sample fortified with 3 mg mL-1 of HA and 3-MHA, and extracted by these conditions before the HPLC analysis. As it can be seen, there are not interferent peaks in the chromatogram, attesting the selectivity of the molecularly imprinted solid phase extraction.

NIP is a polymer synthesized on the same conditions at MIP, using the same reagents e following the same procedure. However the template is not added at the synthesis mixture and the selective cavities are not formed. Due to absence of the selective cavities,

Figure 3. Chromatogram of extraction of HA (A) and 3-MHA (B) from urine by SPE using MIP as extraction phase.

Brigante TAV et al.

the efficiency of extraction using NIP cartridges were 46.05% to HA and 20.09% to 3-MHA, whereas for MIP the values were 60.53% to HA and 58.63% to 3-MHA. The lower adsorption capacity of the NIP can be explained by the absence of selective biding sites.

The limit of quantification was defined as 0.5 mg mL-1 to HA and 3-MHA. Calibration curves were established from 0.5 mg mL-1 to 6.0 mg mL-1 for both analytes. These ranges include the biological exposure index values that are 1.5 and 2.5 g g-1 of creatinine to HA and 3-MHA, respectively[3], adopting the creatinine excretion of about 1.5 g L-1. Equations and determination coefficients were y = 236064x+24718 and 0.9966 to HA and y = 177220x-46872 and 0.9921 to 3-MHA. Precision and accuracy values of both analytes are presented in Table 1. The results of precision and accuracy were expressed as a percentage of the relative standard deviation and relative error, respectively, and the obtained results attested that the method is precise and accurate.

Robustness was evaluated by Youden test as described previously. Table 2 shows the analyzed parameters, factorial combination and equations used to calculate the influence of each condition. Signal (+) was attributed to the value correspondent to nominal

Table 1. Accuracy and precision of HA and 3-MHA calculated as relative error and RSD values.

Hippuric Acid

3-metthyl hippuric Acid

1

Accuracy RE1 (%) Precision RSD2 (%) Accuracy RE (%) Precision RSD (%)

Concentration (mg.mL-1)

0.5

3.0

6.0

Intra-assay (n=5)

-2.00

10.30

-13.00

Inter-assay (n=3)

-6.00

8.70

-0.50

Intra-assay (n=5)

8.41

8.18

4.94

Inter-assay (n=3)

8.07

2.57

1.70

Intra-assay (n=5)

9.10

6.70

11.00

Inter-assay (n=3)

9.40

-0.30

8.00

Intra-assay (n=5)

7.97

7.22

8.29

Inter-assay (n=3)

0.85

9.48

3.15

Relative error, relative standard deviation.

2

Scientia Chromatographica 2015; 7(2):109-115 113

Brigante TAV et al.

MISPE to hippuric and methyl hippuric acids followed by HPLC-UV

Table 2. Analytical parameters, Youden test factorial combination and equations used to evaluated robustness.

Factorial Combination

Parameters

Nominal (+)

Variation (-)

1

2

3

4

5

6

7

8

Formula for variation effect

Methanol in mobile phase

200mL

204mL

+

+

+

+

-

-

-

-

(a+b+c+d)/4 – (e+f+g+h)/4

Column temperature

40°C

35°C

+

+

-

-

+

+

-

-

(a+b+e+f)/4 – (c+d+g+h)/4

Sample volume

1,0mL

1,1mL

+

-

+

-

+

-

+

-

(a+c+e+g)/4 – (b+d+f+h)/4

Room temperature

20ºC

no control

+

+

-

-

-

-

+

+

(a+b+g+h)/4 – (c+d+e+f)/4

Elution volume

2,0mL

1,8mL

+

-

+

-

-

+

-

+

(a+c+f+h)/4 – (b+d+e+g)/4

Urine pH

pH 3,0

pH 3,2

+

-

-

+

+

-

-

+

(a+d+e+h)/4 – (b+c+f+g)/4

Ethyl acetate volume

3,0mL

3,2mL

+

-

-

+

-

+

-

(a+d+f+g)/4 – (b+c+e+h)/4

a

b

c

d

e

f

Results

g

h

Table 3. Effects on concentration results caused by changing conditions.

Parameters

Concentration HA (%)

Concentration 3-MHA (%)

Volume de methanol in mobile phase

16.10

13.59

Column temperature

-0.29

6.58

Sample volume

-9.53

-4.17

Room temperature

6.39

3.41

Elution volume

-18.66

-9.60

Urine pH

3.63

4.05

Ethyl acetate volume

2.18

7.96

conditions and a signal (-) was attributed to value corresponding to the variation. The influence of each parameter is showed in Table 3. The more influential parameter was the elution volume, showing that more caution is required to this parameter when performing the extraction. Nevertheless the method can be considered robust because the variation values are statistically acceptable.

4. Conclusions

The method was used to analyze HA and 3-MHA in different samples from healthy volunteers from our laboratory, and the obtained concentrations were lower than the biological exposure indexes for HA and 3-MHA.

Therefore this analytical method can be employed to routine analysis of HA and 3-MHA for biological monitoring of occupationally exposed workers to organic toluene and xylene.

114

In this paper, a fast, simple and practical method to simultaneous analyzes HA and 3-MHAfrom urine samples was developed and validated. The molecular imprinted polymer showed to be a very useful tool to extract these analytes from urine. Precision, accuracy, selectivity, linearity and robustness were satisfactory.

Scientia Chromatographica 2015; 7(2):109-115

MISPE to hippuric and methyl hippuric acids followed by HPLC-UV

Brigante TAV et al.

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Scientia Chromatographica 2015; 7(2):109-115 115

Scientia Chromatographica 2015; 7(2):117-123 Instituto Internacional de Cromatografia http://dx.doi.org/10.4322/sc.2015.021 ISSN 1984-4433

PREPARO DE AMOSTRAS

Determination of organochlorine pesticides in leather by solid-phase microextraction and gas chromatography-mass spectrometry

Cristine Durante de Souza Silveira Eduardo Carasek* Departamento de Química, Universidade Federal de Santa Catarina, Florianópolis, SC 88040-900, Brazil *eduardo.carasek@ufsc.br Recebido: 18 Ago 2015 Aceito: 24 Ago 2015

Scientia Chromatographica 2015; 7(2)

Abstract

An analytical procedure based on the solid-phase microextraction technique (SPME) combined with gas chromatography-selected ion monitoring-mass spectrometry (GC-SIM-MS) for the determination of organochlorine pesticides (OCPs) extracted directly from leather samples is proposed. The extraction conditions for the headspace SPME (HS-SPME) procedure were optimized using experimental designs.

The fibers and the ionic strength were optimized by the univariate procedure, while a Doehlert matrix was used to optimize the extraction time and temperature. The best extraction conditions were obtained using a PDMS/DVB fiber with extraction time and temperature of 35 min and 80 ºC, respectively. No salt addition was necessary.

Detection limits ranging from 3.3 to 11 ng g-1 and relative standard deviations (RSD, n = 5) lower than 14.2% were obtained. The recovery was studied at three concentration levels by adding different amounts of organochlorine pesticides to the leather samples (600, 900 and 1500 ng g-1) and excellent recoveries ranging from 93.7 to 107.3% were obtained.

Keywords: organochlorine pesticides, HS-SPME, GC-MS, leather.

117

Silveira CDS, Carasek E

1. Introduction Leather quality is dependent on several factors, including careful breeding of the herd, pest control, and appropriate ways to identify, confine and transport the animals. After the slaughter, degradation of the animal hide through the action of microorganisms must be avoided, allowing efficient processing and the obtainment of leathers and skins with very high quality. The quality of the leathers is also dependent on appropriate manipulation, conservation and storing of the hide. When the time between the slaughter and hide processing is short (6 to 12 h) the hide can be stored without pretreatment, if the temperature conditions are appropriate. However, if the hide will be subjected to a long period of storage and/or transportation, especially at high temperatures, it must go through a pretreatment called tanning. In general, for the preservation of leathers the hides are stacked and layers of salt are placed between the hides. The hides can also be immersed in brine before stacking. By applying this procedure the hides can be stored for several months before they are processed. The hides can also be preserved by refrigeration or air drying, which is used for small-scale processing. Skins containing salt show good resistance against microorganisms; however, the salt can cause dehydration, eliminating water and partially the soluble proteins. Besides the use of salt, some leather suppliers use insecticides to repel insects and/or biocides to help preserve the leather during storage and transportation[1].

The use of dichlorodiphenyltrichloroethane (DDT) and lindane was first reported in 1954, mainly to protect raw hides from insect damage during the leather drying process[2]. Dieldrin, another organochlorine pesticide (OCP), was introduced to protect the leather against ectoparasites[2]. Lindane was one of the most commonly used insecticides for protecting hides and skins until 1990[2]. However, the use of DDT and other OCPs has been prohibited in many countries since the 1970s, mainly because of the widespread environmental 118

Determination of organochlorine pesticides in leather

contamination due to their persistence, bioaccumulation and high toxicity[2]. The persistence of these compounds in the environment is due to their low degradation by biotic and abiotic process, leading to a long half-live time, which can be years or even decades[3]. Because OCPs are fat-soluble they can be absorbed by living organisms through alimentation, breathing and the skin.

After absorption, these compounds are distributed to many types of tissue including blood[4]. The toxicity of these contaminants is very complex and is specific to each compound. Therefore, multiple toxic responses can occur according to the species, gender and organ affected[5].

In spite of the great importance of monitoring OCP residues in leather and leather goods, very little research has been carried out on sample preparation to quantify OCPs in skins and leathers. To the best of our knowledge, there is only one study reported in the literature for the determination of OCPs in a leather matrix. The OCPs were extracted from skins and leather in a Soxhlet extractor using hexane and the concentration and cleaning of the extract was performed in a Florisil column[2]. The use of microextraction techniques like SPME to determine contaminants in leather was proposed by Carasek et al.[6] to quantify phenols and chlorophenols.

The aim of this study was to develop a method for the simultaneous determination of eleven OCPs in leather samples employing HS-SPME and gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). The fibers PDMS 100 Âľm, PDMS 30 Âľm and PDMS/DVB 65 Âľm were selected to study the effectiveness for the extraction of the target compounds. A Doehlert design was used to select the best extraction conditions. The effect of the ionic strength on the extraction efficiency was determined using the univariate procedure. Finally, the optimized method was applied for the determination of OCPs in leather.

Scientia Chromatographica 2015; 7(2):117-123

Determination of organochlorine pesticides in leather

2. Materials and Methods 2.1. Chemicals and reagents

Certified standards of pesticides (α-BHC, β-BHC, heptachlor, aldrin, heptachlor epoxide, endosulfan I, 4,4’ DDE, dieldrin, 4,4’ DDD, 4,4’ DDT and methoxychlor) were obtained at concentrations of 250 mg L-1 in methanol, with the exception of methoxychlor for which the concentration was 1000 mg L-1 in toluene/hexane 50:50 (Supelco, Bellefonte, USA). Working solutions were prepared by diluting stock solutions with methanol (Sigma Aldrich, Steinheim, Germany). Sodium chloride (Vetec, Rio de Janeiro, Brazil) was used to study the ionic strength.

2.2. Instrumentation

All of the chromatography analysis was performed using a Shimadzu GC-2010 Plus gas chromatograph coupled to a mass spectrometer. An Rtx-5MS capillary column (30 m x 0.25 mm x 0.25 µm) manufactured

by Restek (Bellefonte, PA, USA) was used for the GC separation. Helium (99.999%) was used as the carrier gas at a constant pressure of 100 kPA. The injections were performed in the splitless mode. The initial oven temperature was 100 °C (held for 2 min) and increased to 180 °C at a rate of 6 °C min-1, and increased again at a rate of 5 °C min-1 to 220 °C (0 min), and finally to 250 °C at a rate of 3 °C min-1. The injector temperature was 260 ºC and the fiber desorption time was 5 min.

Desorption conditions were fixed so that no memory effects were observed. The transfer line and the ion source temperatures were set at 200 oC and 210 oC, respectively. The acquisition of the ionization was carried out in SIM mode to avoid overlapping of the sample peaks with those of the target analytes. The selected ions used for quantification of the target analytes (m/z ratio) were: 183-181-219 (α-BHC), 219-181-109 (β-BHC), 100-272-274 (heptachlor), 66-263-79 (aldrin), 81-353355 (heptachlor epoxido), 241-239-195 (endosulfan I), 246-318-248 (4,4’ DDE), 79-81-82 (dieldrin), 235237-165 (4,4’ DDD and 4,4’ DDT) and 227-228-152 (methoxychlor).

Silveira CDS, Carasek E

2.3. SPME procedure

The pesticides were extracted by SPME from the headspace of the matrix. The HS-SPME was performed using commercial fiber with a manual holder (Supelco, Bellefonte, USA). The extractions were carried out using a PDMS/DVB fiber with 65 µm thickness (Supelco, Bellefonte, PA, USA). The fibers were conditioned according to the temperature and time provided by the manufacturer before use.

2.4. Leather sample preparation

“Wet blue” leather samples were supplied by the Brazilian Institute for the Technology of Leather and Artifacts (Instituto Brasileiro de Tecnologia do Couro e Artefatos, Novo Hamburgo, Rio Grande do Sul, Brazil).

Leather samples weighing 100 mg, free from the target analytes, were cut into cubes of approximately 2 mm2 and placed in 4 mL vials. The samples were spiked with pesticide standard and stored for 24 hours at -18 °C to allow its interaction with the sample matrix. At the time of extraction 1 ml of distilled water was added and a magnetic stir bar was used for stirring. For all of the optimization steps the samples were spiked with 30 µL of the pesticide standard at a concentration of 3 mg L-1, with the exception of methoxychlor for which the concentration was 12 mg L-1.

2.5. Selection of the coated fiber for HS-SPME procedure

The following polymeric fibers were studied: PDMS 100 µm, PMDS 30 µm and PDMS/DVB 65 µm, all purchased from Supelco (Bellefonte, PA, USA). The pesticide extractions were performed using 100 mg of leather prepared as described in section 2.4. The different fiber coatings were evaluated in the headspace mode at 75 °C applying a time of 35 min with maximum sample agitation.

2.6. Optimization of extraction conditions

The influence of the ionic strength was investigated using saturated sodium chloride solution and distilled water. The extraction procedure was carried

Scientia Chromatographica 2015; 7(2):117-123 119

Silveira CDS, Carasek E

out at 75 °C applying a time of 35 min with maximum sample agitation. A multivariate optimization procedure to select the best extraction time (10 to 40 min) and temperature (40 to 85 °C) was performed using a Doehlert matrix. The optimization of the extraction conditions was carried out with PMDS/DVB fiber in the sodium chloride solution. The experimental design and data treatment were carried out using the software Statistica 7.0.®

3. Results and Discussion 3.1. Selection of the coated fiber for HS-SPME procedure

Figure 1 shows the chromatograms obtained for each SPME fiber used in this study. It can be observed that the PDMS/DVB fiber showed better extraction efficiency than the other fibers for all target compounds and this fiber was therefore selected to continue this study.

3.2. Optimization of extraction conditions

The effect of the ionic strength on the extraction efficiency was studied using a univariate design, adding distilled water or saturated sodium chloride solution to

Determination of organochlorine pesticides in leather

the vials containing the leather samples. The results of this study, shown in Figure 2, indicate a reduction in the extraction efficiency of the OCPs when the ionic strength was increased. This finding is in agreement with that reported by Dong[7], Prates[8] and Pawliszyn[9,10,11] who studied the salting out effect on the extraction of OCPs. Therefore, no salt was added to the vials for the next steps of this study.

In order to determine the best extraction time and temperature for the extraction of the OCPs from the leather matrix, a Doehlert design was used. The aforementioned ranges for these variables were studied.

Figure 3 shows the response surface obtained using the geometric mean of the set of peak areas observed for the target compounds as the response. Figure 3 shows that the temperatures should be higher than those studied and that extraction times of 30 - 40 min should be selected to obtain the maximum extraction of the OCPs from the leather. However, due to the exothermic nature of the SPME process temperatures higher than 85 oC were not applied in this study. In conclusion, the optimized conditions were extraction time of 35 min, 80 °C as the extraction temperature and no salt addition.

Figure 1. Chromatograms in SIM mode for three different SPME fibers for the OCP peak identification: 1 = α-BHC, 2 = β-BHC, 3 = heptachloro, 4 = aldrin, 5 = heptachloro epoxide, 6 = endosulfan I, 7 = DDE, 8 = dieldrin, 9 = DDD, 10 = DDT, 11 = methoxychlor.

120

Scientia Chromatographica 2015; 7(2):117-123

Determination of organochlorine pesticides in leather

Silveira CDS, Carasek E

Figure 2. Influence of ionic strength with NaCl and without NaCl (1 = α-BHC, 2 = β-BHC, 3 = heptachloro, 4 = aldrin, 5 = heptachloro epoxide, 6 = endosulfan I, 7 = DDE, 8 = dieldrin, 9 = DDD, 10 = DDT, 11 = methoxychlor).

3.3. Analytical figures of merit

Figure 3. Response surfaces obtained from the Doehlert design for two variables – extraction time and temperature – for the HS-SPME of OCPs in leather.

The performance of the method was verified through some analytical figures of merit using the optimized conditions. The analytical curve was built spiking 100 mg of leather sample with 5, 10, 20, 30, 40 and 50 µL of standard pesticide solution (each pesticide at 3 mg L-1 with the exception of methoxychlor at 12 mg L-1). The limit of detection was calculated as three times the standard deviation of the intercept of the calibration curve divided by the angular coefficient of the calibration curve. The limit of detection for all pesticides ranged from 3.3 ng g-1 to 11.0 ng g-1 (with the exception of methoxychlor, the value for which was 107.6 ng g-1).

The limit of quantification (LOQ) was calculated as 3.3 fold the LOD. The linear range varied from 10.9 to

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Silveira CDS, Carasek E

Determination of organochlorine pesticides in leather

Table 1. Linear range, linear correlation coefficients, relative standard deviations and detection limits for the optimized method.

Analytes α-BHC β-BHC Heptachloro Aldrin Heptachloro epox.

Endosulfan I 4’4 DDE Dieldrin 4’4 DDD 4’4 DDT Methoxychlor

Linear range (ng g-1)

R

LOD (ng g-1)

LOQ (ng g-1)

RSD%

10.94 - 1500 20.3 - 1500 25.36 - 1500 25.20 - 1500 18.02 - 1500 25.36 - 1500 21.37 - 1500 22.14 - 1500 36.60 - 1500 34.65 - 1500 32.27 - 6000

0.9993 0.9975 0.9963 0.9963 0.9974 0.9962 0.9964 0.9980 0.9946 0.9950 0.9970

3.28 6.22 7.59 7.56 5.41 7.61 6.41 6.64 10.98 10.39 10.56

9.84 20.53 22.77 24,95 17,85 25.11 21.15 21.91 36.23 34.29 34.85

7.8 9.8 10.8 9.2 6.1 6.5 10.9 6.8 13.9 13.1 14.3

R = correlation coefficients; LOD = Limit of detection; RSD = relative standard deviation (450 ng g-1; n = 5).

Table 2. Repeatability study using three different concentration levels.

Level 1 (600 ng g-1) Analytes α-BHC β-BHC Heptachloro Aldrin Heptachloro epox.

Endosulfan I 4’4 DDE Dieldrin 4’4 DDD 4’4 DDT

Level 2 (900 ng g-1)

Level 3 (1500 ng g-1)

Recovery (%) 97.1 + 5.3 103.0 + 6.1 94.7 + 6.5 95.7 + 4.8 100.7 + 7.2 101.7 + 4.6 93.2 + 4.9 102.5 + 3.2 95.0 + 8.1 107.8 + 7.7

99.7 + 4.7 97.9 + 3.5 101.8 + 4.2 98.2 + 3.6 97.7 + 8.6 100.0 + 7.1 98.9 + 2.2 99.1 + 6.2 105.4 + 7.8 105.4 + 5.5

99.6 + 3.9 101.6 + 2.9 98.9 + 5.2 102.7 + 4.2 100.2 + 7.3 101.9 + 6.5 101.0 + 3.2 98.9 + 5.6 98.8 + 9.2 106.9 + 8.1

Level 1 (2400 ng g-1)

Level 2 (3600 ng g-1)

Level 3 (6000 ng g-1)

Recovery (%) Methoxychlor

107.3 + 10.2

96.8 + 9.9

100.4 + 7.4

n = 3.

1500 ng g-1 for all target pesticides (with the exception of methoxychlor with a range of 32.3 and 6000 ng g-1) and the linear correlations ranged from 0.9946 to 0.9993.

The method repeatability was estimated by calculating the relative standard deviation (RSD%) of five replicates after spiking the leather with a concentration of 450 ng g-1 (with the exception of methoxychlor for which 122

the concentration was 1800 ng g-1). Excellent values in the range of 6.1–14.3% were obtained. The individual results for each target compound can be found in Table 1 which shows similar or better results that those reported

by Font and Marsal[2]. However, the SPME procedure showed some important advantages including shorter extraction time (35 min compared with over 24 h), less Scientia Chromatographica 2015; 7(2):117-123

Determination of organochlorine pesticides in leather

sample required (100 mg compared with 5 g) and less sample manipulation.

3.4. Method application and recovery tests

The newly developed method was applied to determine OCPs in leather acquired from tanneries in Novo Hamburgo, Rio Grande do Sul State, Brazil.

However, the leather samples were free of the target compounds or they were present below the limit of detection of the proposed method. This may be due to restrictions regarding the use of these compounds for leather treatment in Brazil, in place since 2006. In order to verify the accuracy of the method developed, the leather samples were spiked using three concentration levels, 600, 900 and 1500 ng g-1 (with the exception of methoxychlor for which the concentrations were 2400,

Silveira CDS, Carasek E

3600 and 6000 ng g-1), and the pesticide recovery was determined for each sample. The results obtained can be seen in Table 2. This study showed that the method has an excellent recovery ranging between 93.7 and 107.3%, indicating that the method is reliable for the determination of these compounds in leather samples using the matrix-matched strategy for the calibration.

4. Conclusions

The method using HS-SPME extraction followed

by GC-SIM-MS was shown to be very sensitive, precise and accurate. Furthermore, this is a simple and relatively fast method requiring very small amounts of sample and no pre-treatment of the sample prior to the HS-SPME is necessary. These findings are of particular significance given the complexity of leather samples.

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Scientia Chromatographica 2015; 7(1):124-124 Instituto Internacional de Cromatografia http://dx.doi.org/10.4322/sc.2015.000 ISSN 1984-4433

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CLASSIFICAÇÃO

Scientia Chromatographica 2015; 7(1)

Scientia Chromatographica 2015; 7(2):125-143 Instituto Internacional de Cromatografia http://dx.doi.org/10.4322/sc.2015.022 ISSN 1984-4433

PREPARO DE AMOSTRAS

Técnicas de preparo de amostras biológicas com interesse forense

Dayanne Cristiane Mozaner Bordin1 Fernanda F. da Silva Souza Monedeiro2 Eduardo Geraldo de Campos2 Marcela Nogueira Rabelo Alves1 Laís Helena Picolo Bueno2 Bruno Spinosa de Martinis2* Departamento de Análises Clínicas, Toxicológicas e Bromatológicas, Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo 2 Departamento de Química, Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, SP, 14050-140, Brasil *martinis@usp.br 1

Resumo

As análises toxicológicas forenses caracterizam-se pela investigação de compostos de interesse forense, em especial drogas de abuso, em diversas matrizes biológicas.

As características particulares de cada matriz determinam quais técnicas de preparo de amostra são requeridas, ainda, cada qual possui a esta associadas vantagens e limitações, que devem ser observadas pelo analista. São aspectos fundamentais a consideração do intervalo de concentração do analito na amostra, a janela de detecção, a complexidade e o conhecimento de como se dá a distribuição da droga pesquisada na matriz. Já as técnicas de preparo de amostra a serem utilizadas devem ser escolhidas também com base em sua capacidade de pré-concentração do analito, além da disponibilidade de materiais específicos, tempo e custo. O presente artigo visa delinear as principais matrizes biológicas utilizadas em Toxicologia Forense assim como as técnicas, clássicas e recentes, empregadas no preparo dessas amostras.

Palavras-chave: toxicologia forense, amostras biológicas, matrizes alternativas, preparo de amostra.

Recebido: 18 Ago 2015 Aceito: 08 Set 2015

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1. Introdução

A Toxicologia Forense, área da toxicologia que se aplica a propósitos legais, apresenta como objetivo principal fornecer respostas às questões que surgem durante investigações criminais. Utiliza como ferramenta as análises toxicológicas, que são requisitadas com a finalidade de se detectar a presença de substâncias exógenas, determinar sua concentração, e, por fim, relacioná-las aos seus efeitos tóxicos no organismo, a fim de se estabelecer se houve ou não a intoxicação que recai sob suspeita. Os resultados gerados por essas análises devem ser inequívocos, e o laudo irrefutável[1].

Técnicas de preparo de amostra aplicadas às análises forenses têm sido amplamente discutidas na literatura. Samanidou et al. (2011) avaliou as diversas técnicas disponíveis em função dos analitos de interesse em Toxicologia Forense. Contudo, é interessante também a discussão incluindo aspectos acerca das principais matrizes biológicas empregadas na área[2].

Diversas amostras biológicas podem ser utilizadas para realização destas análises, dentre elas sangue, urina, cabelo, saliva, suor, mecônio, entre outras.

A escolha da matriz depende de uma gama de fatores que se relacionam com a natureza, integridade da amostra submetida à análise, tipo de investigação (antemortem e postmortem), facilidade de coleta, e, as considerações analíticas e de ensaio juntamente com a interpretação dos resultados. Desafios específicos podem surgir dependendo da matriz escolhida, como por exemplo, nos casos postmortem as alterações que as amostras sofrem nos processos de autólise, redistribuição e putrefação podem conferir dificuldades adicionais no uso dessas amostras[1,3].

O sangue e a urina são as matrizes convencionais mais prevalentes e utilizadas para realização das análises toxicológicas. No entanto, nas últimas décadas as matrizes biológicas alternativas ou não convencionais têm apresentado relevante importância na toxicologia, principalmente devido às suas vantagens quando comparadas com as amostras convencionais, 126

Amostras biológicas com interesse forense

considerando que possuem características interessantes em relação à estabilidade dos analitos, método de coleta facilitado e maior janela de detecção[3,4].

Os avanços nas áreas de preparo de amostra e as técnicas analíticas modernas foram cruciais para o desenvolvimento das análises toxicológicas forenses, pois possibilitaram a detecção de drogas e seus metabólitos em baixas concentrações em amostras extremamente complexas. As técnicas mais utilizadas são a cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de massas (GC-MS) e a cromatografia em fase líquida acoplada à espectrometria de massas, ou in tandem (LC-MS, LC-MS/MS). Estas técnicas são comumente escolhidas por apresentarem maior sensibilidade, compatibilidade com as concentrações dos compostos de interesse encontradas nas diversas amostras biológicas, e por permitirem a confirmação da presença dos analitos também pela análise do espectro de massas[4-7]. Contudo, toda técnica analítica, por mais seletiva e sensível que seja apresenta limitações, as quais podem ser reduzidas com um preparo de amostra eficiente. O preparo da amostra caracteriza-se pelo processo que visa isolar o analito de interesse a partir da matriz, minimizando e eliminando os interferentes (endógenos e exógenos), além de propiciar a concentração da substância, sendo um processo geralmente indispensável para o emprego de técnicas de detecção e quantificação de substâncias de interesse forense[8-9].

2. Principais matrizes biológicas empregadas nas análises toxicológicas forenses

Com o desenvolvimento de novas tecnologias na extração de analitos, a utilização de uma variedade de amostras biológicas tornou-se ainda mais acessível e possível. Dentre as matrizes biológicas amplamente utilizadas estão urina, sangue, cabelo, fluido oral, suor, humor vítreo e mecônio. Cada uma destas matrizes será abordada em termos de sua composição, forma como o analito é incorporado e sua utilidade no âmbito das análises forenses, com base nas informações que é capaz de fornecer.

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Amostras biológicas com interesse forense

Bordin DCM et al.

2.1. Urina

2.2. Sangue

A urina é uma matriz biológica de escolha tradicional em análises toxicológicas forenses e seu uso é bem estabelecido. Consiste em um ultrafiltrado do sangue formado continuamente pelos rins a partir do qual foram reabsorvidas substâncias essenciais ao metabolismo do organismo, como glicose, aminoácidos e água. Em sua composição constam substâncias químicas orgânicas (como ureia, ácido úrico e creatinina) e inorgânicas (como íons cloreto e sódio) dissolvidas em água. Como principal via de eliminação de substâncias, esta matriz é geralmente alvo de investigação de metabólitos. A quantidade média diária de urina formada no organismo de um indivíduo saudável é 1200 mL. Fatores como quantidade de líquido ingerido, perda de líquidos por outras vias e variações na secreção do hormônio antidiurético podem alterar esse volume[10-14].

Trata-se de um fluido complexo, constituído em grande parte de água (cerca de 80%), proteínas solúveis, gorduras, sais e células suspensas. O sangue é uma matriz convencional amplamente estudada nas análises toxicológicas forenses, pois fornece de forma apropriada a correlação da concentração da droga no sangue com o estado clínico do indivíduo, além disso, o uso da razão droga original/metabólito pode ser bastante útil para predizer o período decorrido desde a administração.

Contudo, é uma amostra obtida através de método invasivo, que envolve maior risco de contaminação, além disso, possui uma janela de detecção restrita com relação às drogas de abuso, já que estas podem ser rapidamente metabolizadas, dependendo da meia vida da substância, de alguns minutos a algumas horas passadas da exposição. Dessa forma, os compostos investigados podem ser encontrados em maiores concentrações na urina[1,7].

O perfil da urina de “amostra tradicional” para análises toxicológicas se deve a alguns aspectos como a coleta fácil e não invasiva, grandes volumes disponíveis para análise e menor número de interferentes quando comparada a outras matrizes. Sob congelamento apresenta alta estabilidade permitindo o armazenamento em longo prazo de amostras positivas. No entanto, é uma amostra de fácil adulteração, uma vez que a coleta vigiada, apesar de ser recomendada, não é uma prática comum[15-17].

Drogas e metabólitos, geralmente, são encontrados em elevadas concentrações nesta matriz. As drogas metabolizadas pelo fígado formam metabólitos polares que são facilmente eliminados através da urina.

A excreção urinária da maioria dos metabólitos é mais rápida e extensa do que com os fármacos originais, e, em concentrações muito maiores que as drogas. Entretanto, como a maioria das drogas encontram-se presentes na urina por um período de 2 a 5 dias após o consumo, apenas o uso recente de drogas é detectado[17-22].

Para coleta do sangue é indispensável a adição de anticoagulante e conservante, e a escolha do anticoagulante depende dos analitos a serem investigados.

No caso da heparina sabe-se que esta pode interagir com alguns fármacos, enquanto que o EDTA é agente complexante, não sendo indicado em casos em que os analitos são metais ou compostos organometálicos[1,7,3].

A amostra de sangue pode ser avaliada na forma de sangue total, plasma (que constitui do sobrenadante obtido do sangue adicionado de anticoagulante, com o conteúdo precipitado) ou o soro (que constitui o plasma sem os fatores de coagulação, podendo ser obtido pela centrifugação do sangue já coagulado). Se o objetivo da análise compreender a quantificação da droga é mais indicada a avaliação em amostra de sangue total, pois as drogas apresentam diferentes afinidades por proteínas e uma vez que apresentam considerável afinidade, podem ser descartadas se investigadas apenas em amostra de plasma ou soro[1,7].

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Para a pesquisa de metabólitos conjugados, reações de clivagem hidrolítica são demandadas anteriormente ao processo de extração e nestas podem ser empregadas enzimas, ácidos ou bases. Já a etapa de precipitação proteica envolve a adição de agentes precipitantes, tais como sais, ácidos ou, mais comumente, solventes orgânicos como metanol, acetona ou acetonitrila, geralmente em volumes ao menos duas vezes maior do que da amostra tratada. Neste processo é possível que ocorra baixa recuperação dos analitos devido também aos fenômenos de adsorção e oclusão do composto-alvo, neste caso o analito poderá se encontrar no precipitado. A adição de tampão não só colabora para a obtenção do analito em sua forma apolar nesta amostra, possibilitando sua posterior extração com solvente orgânico, como também contribui para diminuição da viscosidade do meio[1,23].

Com relação à coleta do sangue postmortem requer-se consideração dos fenômenos de redistribuição, os quais participam a distribuição de drogas de órgãos que atuam como reservatórios, o movimento do sangue e outros processos provenientes das alterações cadavéricas[24-26]. O sangue periférico é menos suscetível à redistribuição postmortem de substâncias dos tecidos em que se concentram drogas, dessa forma, avaliar o local de onde o sangue foi coletado é de extrema importância para interpretação dos resultados das análises toxicológicas. O sangue periférico é geralmente obtido da veia femoral, enquanto que o sangue central pode ser coletado das artérias subclávias ou diretamente do coração[27]. No sangue postmortem a atividade de microorganismos, em especial as espécies Escherichia coli e Candida albicans são responsáveis pela formação endógena do etanol, na qual a glicose é o substrato, que, no entanto só é mais significativa nos estágios mais avançados de decomposição[28-30].

2.3. Fluido oral

O fluido oral é uma mistura de células da mucosa bucal, restos de alimentos e saliva, secretada pelas glândulas presentes na mucosa bucal[31]. Um indivíduo 128

Amostras biológicas com interesse forense

saudável, geralmente produz de 500 a 1500 mL de fluido por dia[32]. As drogas são transferidas do sangue para a saliva por ultrafiltração ou difusão passiva, podendo ser detectadas nesta matriz na forma não-metabolizada.

Porém, esta incorporação de drogas na saliva é restringida para moléculas de alto peso molecular, drogas ionizadas ou ligadas a proteínas plasmáticas[33-34].

Uma das principais aplicações dessa matriz é sua utilização no monitoramento de condutores no trânsito e na verificação de uso de drogas em ambiente de trabalho[35,36]. As drogas no fluido oral são pesquisadas para exposições mais recentes, dependendo de sua natureza, as substâncias podem ser detectadas até cerca de 2 dias passados da exposição, como é o caso da maconha e anfetaminas. Drogas de caráter básico tendem a ser detectadas em concentrações superiores em comparação com aquelas de caráter ácido[37].

A coleta do fluido oral caracteriza-se por ser de fácil realização no local da abordagem, além de não exigir profissional especializado. A desvantagem, no entanto, é a possibilidade de contaminação por drogas utilizadas por via oral, e o restrito número de estudos que avaliam a interferência dos coletores, adulterantes e exposição passiva[38-42]. Além disso, a coleta é um processo simples, não-invasivo e pode ser monitorado. Pode ser realizada com dispositivos disponíveis comercialmente, como Omni-Sal®, OraSure® e Salivette®, sendo este último constituído de um tubo coletor com tampa, algodão e um orifício em sua base. Quando o algodão é inserido na boca do indivíduo, o fluido oral é absorvido pelo algodão[35].

O desenvolvimento científico tornou as técnicas de extração mais sensíveis e, além disso, o avanço nos procedimentos de preparo de amostras possibilitou a análise de várias drogas de interesse forense no fluido oral, como a cocaína[43], as anfetaminas[44], os opióides[43,45], os canabinóides[46], os benzodiazepínicos[47] e o etanol[48].

A coleta de fluido oral é uma ótima alternativa ao teste realizado com o etilômetro, uma vez que permite a identificação simultânea de álcool e outras drogas de Scientia Chromatographica 2015; 7(2):125-143

Amostras biológicas com interesse forense

abuso, além de permitir que a amostra seja armazenada e reanalisada, caso haja requisição judicial[49-50].

Existem testes de imunoensaio para drogas de abuso, que podem ser realizados na saliva no local da abordagem. Estes produtos são de fácil utilização e por serem rápidos, os resultados são obtidos em apenas 1 ou 2 minutos. Um resultado positivo no teste de triagem indica o uso de substância psicoativa, o que pode ser confirmado por técnicas mais sensíveis[51].

2.4. Suor

A análise de suor tornou-se uma possibilidade útil em Toxicologia Clínica e Forense, utilizada como matriz biológica alternativa para o monitoramento do uso de drogas[52-54]. O suor é composto por 99% de solução aquosa hipertônica, e outros constituintes como lactato, albumina, gama globulina, ureia, íons de amônio, enzimas e compostos orgânicos[55-57]. Em média, o volume de suor excretado por dia em indivíduos saudáveis varia entre 300 a 700 mL. O pH encontra-se em 5,8[58,59]. As glândulas sudoríparas são amplamente distribuídas através da pele, e são classificadas em dois tipos: apócrinas e écrinas.

As glândulas apócrinas são maiores e estão localizados principalmente nas axilas, púbis e mamas. E as glândulas écrinas são mais numerosas e estão presentes nas palmas das mãos, nas plantas dos pés, na face e no peito. A pele também é banhada por secreção sebácea composta de lipídios como colesterol (75%), triglicerídeos e ácidos graxos (20%)[60,61].

As drogas são incorporadas no suor por difusão passiva e migração transdérmica. As características físico-químicas das drogas como massa molecular, pKa, grau de ligação às proteínas plasmáticas e lipofilicidade e o pH influenciam essa incorporação. Maiores concentrações de drogas são encontradas no suor quando comparadas a outras matrizes biológicas alternativas devido à composição dessa matriz[52,55,60].

A coleta do suor é simples, não invasiva, não constrangedora, com menor risco de adulteração e de modo contínuo fornecendo uma ampla janela de detecção

Bordin DCM et al.

(de até 14 dias). Apresenta poucos interferentes exigindo menos etapas no procedimento analítico e no preparo de amostra. As espécies predominantes encontradas no suor são as próprias substâncias utilizadas, ao invés de seus metabólitos[62]. Dentre as desvantagens no uso dessa matriz incluem-se a falta de informações sobre a relação dose-resposta, a quantidade limitada de amostra e a literatura sobre uso dessa matriz é limitada. Além disso, as concentrações encontradas dos analitos são relativamente baixas, exigindo técnicas analíticas com alta sensibilidade e seletividade[60,63].

Para coleta, são utilizados dispositivos próprios para detecção de drogas no suor, aprovados pelo FDA (Federal Drug Administration) dos Estados Unidos, os “patches”, constituídos basicamente de material absorvente coberto por camada adesiva, disponíveis comercialmente como PharmChek®[61].

Dentre as drogas de abuso já estudadas e detectadas no suor incluem-se o etanol, as anfetaminas, o fenobarbital, a cocaína, a heroína, a morfina, a fenciclidina, o Ácido Gama Hidroxibutírico (GHB) e a metadona. Ensaios imunoenzimáticos e radioimunoensaios estão descritos na literatura como métodos de triagem para avaliar a presença de drogas em suor. Exames confirmatórios indicados e utilizados são principalmente aqueles empregando as técnicas de GC-MS e LC-MS[2,65].

2.5. Cabelo

O cabelo é uma matriz biológica complexa composta de 65% a 95% de proteína queratina, de 15 a 35% de água, de 1 a 9% de por lipídios e ainda por uma pequena parcela de minerais. Os fios capilares têm origem no conjunto de células hermeticamente ligadas inseridas num centro germinativo denominado matriz, que está localizada na base do folículo capilar, a aproximadamente 3 a 5 mm abaixo da superfície da epiderme. Os folículos capilares localizam-se no interior da pele do couro cabeludo e são circundados por vasos capilares arteriais, assim como glândulas sudoríparas[66].

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A estrutura e fisiologia desta matriz implicam no envolvimento de mais de um mecanismo de incorporação de drogas. Os modelos incluem: a) a incorporação através da difusão ativa ou passiva do sangue presente nos vasos capilares para o folículo capilar; b) a incorporação através do suor e secreções provenientes das glândulas sudoríparas e sebáceas adjacentes à porção intradérmica do fio; c) a incorporação de substâncias externas (presentes no ambiente), que acabam por se depositar e permanecer na fibra capilar[67]. À medida que as células se alongam e envelhecem, elas morrem e coalescem, formando a fibra capilar com a droga incorporada na matriz[68]. Portanto, as drogas são incorporadas no cabelo progressivamente, assim, estas poderão estar presentes em determinado segmento do cabelo, dependendo da taxa de crescimento dos fios. Diferentes taxas de crescimento do cabelo já foram calculadas, variando de 0,6 a 1,42 cm/ mês. Tais valores são dependentes da cor do cabelo, etnia, ou região anatômica em que o cabelo se encontra[66]. O conteúdo proteico, especialmente de melanina, afeta a eficiência da ligação da droga ao cabelo, já que servem como sítios de ligação para estas substâncias[68]. Fatores, tais como lipofilicidade e basicidade das substâncias, também influenciam sua incorporação no cabelo: drogas de caráter básico, como a cocaína e as anfetaminas, tendem a se incorporar no cabelo em maior quantidade quando em comparação com drogas de caráter ácido ou neutro, como os canabinóides e benzodiazepínicos[69-71].

A principal vantagem do uso desta matriz é a possibilidade de determinação da exposição pregressa às drogas, possuindo uma ampla janela de detecção (semanas, meses, anos), mas não possibilitando identificar o uso recente, já que o processo de incorporação na matriz queratinizada pode levar dias, dependendo da natureza da substância[70].

A estabilidade e retenção das drogas no cabelo são afetadas pela realização de tratamentos cosméticos como descoloração e tinturas e permanentes. Os produtos utilizados são formulados com bases fortes, que causam danos na fibra, afetam a estabilidade ou a quantidade de droga presente na matriz capilar. Processos como estes, 130

Amostras biológicas com interesse forense

associados à contínua exposição aos fatores naturais (luz solar, clima, poluição etc) podem gerar dano considerável da cutícula capilar, acarretando na redução, de 50 a 80% da concentração inicialmente presente de drogas[68,72].

O cabelo é uma amostra coletada através de método não invasivo, de fácil transporte e armazenamento, justamente devido à sua alta estabilidade. Além disso, é uma matriz de difícil adulteração. Recomenda-se a coleta de aproximadamente 100 mg de cabelo, cortados rentes ao couro cabeludo, localizado na parte posterior e inferior da cabeça, porque nesta região, menos exposta, o cabelo é menos afetado pelas condições externas e apresenta menor variabilidade na taxa de crescimento e o número de fios na fase de crescimento é mais constante[73-77].

Considerando o processo de contaminação ambiental que ocorre especialmente quando o indivíduo entra em contato externo com pó, vapores ou fumaça, especialmente em caso de drogas cujo consumo envolve sua pirólise (como é o caso da maconha, crack e heroína), a etapa de lavagem da amostra é de grande importância para eliminar compostos externamente ligados. Neste processo podem ser aplicados surfactantes e soluções especiais de limpeza, assim como solventes orgânicos (acetona, metanol, diclorometano, entre outros) em uma ou mais etapas. Após, a amostra deve ser pulverizada, para aumento de sua área superficial. Uma etapa de digestão da amostra antes da realização de outras técnicas de extração permite a liberação dos analitos da matriz, a digestão pode ser enzimática ou mediada pela adição de solução de hidróxido de sódio e aquecimento[72].

Neste tipo de amostra, a concentração dos analitos é geralmente muito baixa, em muitos casos, quantidade inferiores a dezenas de nanogramas por miligrama de cabelo são obtidas, de modo que alta sensibilidade da análise é requerida[78,79].

2.6. Mecônio

O mecônio tem sido apontado em diversos trabalhos como matriz biológica alternativa para verificar a exposição uterina às drogas de abuso e outras Scientia Chromatographica 2015; 7(2):125-143

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substâncias. Os principais analitos já detectados nessa matriz são: nicotina, álcool, pesticidas organofosforados e organoclorados, medicamentos, cocaína, opiáceos, anfetaminas, metanfetaminas, ecstasy e maconha[80-82].

O mecônio consiste na primeira excreção do recém-nascido, a sua formação inicia-se a partir do segundo trimestre de gestação (por volta da 12ª semana) e acumulando-se no intestino do feto até o momento do parto, podendo ser excretado em até cinco dias após o nascimento. É uma matriz extremamente complexa, apresenta consistência pegajosa, coloração verde escura a negra e não possui o odor característico, geralmente presente nas fezes. É composto por água, células epiteliais descamadas do trato gastrointestinal e da pele, ácido e sais biliares, entre outros[83-85].

As drogas utilizadas pela mãe durante a gestação são incorporadas no mecônio por dois mecanismos distintos. O primeiro consiste na difusão passiva através dos vasos sanguíneos da placenta para o feto, e os fatores que influenciam esse mecanismo são a massa molecular, o grau de ionização, o grau de ligação a proteínas plasmáticas materna e/ou fetal e a lipofilicidade das drogas e o fluxo sanguíneo para a placenta. O segundo mecanismo trata-se da incorporação das substâncias por deglutição do líquido amniótico: nesse mecanismo as substâncias excretadas pelo feto no líquido amniótico via urinária ou biliar são deglutidas novamente e acumulando-se no intestino e sendo eliminadas após o nascimento através do mecônio.

A incorporação e o acúmulo de substâncias nessa matriz são resultantes do consumo, metabolismo e eliminação materna, transferência placentária e metabolismo fetal, fatores estes que tornam o mecônio uma ótima matriz para verificar exposição fetal com ampla janela de detecção gestacional[84,80].

As vantagens do uso do mecônio são a disponibilidade da amostra, coleta fácil e não invasiva, e a capacidade de fornecer informações preservadas sobre a exposição fetal à substâncias a partir do primeiro trimestre de gravidez[85,82]. As desvantagens dessa matriz são a complexidade e heterogeneidade da amostra, o

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que exige etapas adicionais de preparo, purificação e concentração dos analitos, aumentando o tempo e o custo das análises. No entanto, apesar da sua complexidade, com esta matriz já foram realizados trabalhos pioneiros e empregadas técnicas de preparo de amostra mais inovadoras, como o uso das ponteiras DPX (Disposable Pipette Tips Extraction), que auxiliaram na redução de processos envolvidos no seu preparo e permitiram uma análise rápida e sem interferentes dessa amostra[86,87,103].

Métodos de triagem imunoenzimáticos podem ser aplicados a esta matriz, requerendo técnicas de instrumentação analítica para confirmação dos resultados[85].

2.7. Humor vítreo

O humor vítreo é o líquido gelatinoso contido no interior do olho, constituído basicamente por água (cerca de 99%), além de sais e pequena porcentagem de proteína (cerca de 0,2%), especialmente colágeno. Neste fluido são ausentes as esterases, responsáveis pela rápida degradação de substâncias como a cocaína, heroína e 6-acetimorfina. As drogas e toxinas chegariam ao humor vítreo através da passagem pela barreira sangue-retina, por meio de transporte ativo e passivo. Nesta matriz a presença da droga original é predominante em relação aos metabólitos[88-90].

Trata-se de uma matriz de grande interesse nas análises toxicológicas postmortem. Sua importância reside na grande estabilidade diante dos processos de putrefação, uma vez que se encontra alocada no interior da câmara ocular, em ambiente consideravelmente estéril e protegido de traumas, disponível em casos de estado de putrefação ou carbonização parcial do corpo[91-92].

A coleta do humor vítreo pode ser feita por meio de punctura no canto lateral do olho. O volume coletado desta amostra é pequeno, em torno de 2 mL, o que limita o número de ensaios a serem realizados, além disso, drogas com alta afinidade proteica dificilmente são encontradas nesta matriz, é o caso do delta-9-THC e seus metabólitos[93].

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Por possuir alto percentual de água, o humor vítreo não requer etapas mais elaboradas de preparo de amostra, sendo uma matriz que apresenta, com relação às técnicas instrumentais, baixo ruído e reduzido efeito de matriz. Considerando os problemas relacionados à formação endógena ao sangue postmortem, o humor vítreo é uma matriz extremamente útil em exames de alcoolemia, considerando a distribuição eficiente do etanol neste fluido, de forma que as concentrações relativas encontradas no sangue periférico e as encontradas no humor vítreo chegam a valores próximos a 1, demonstrando correlação adequada[90,93].

3. Principais técnicas de preparo de amostra na toxicologia forense

O preparo de amostra é parte crucial do procedimento analítico, pois reduz os interferentes que podem comprometer a seletividade e sensibilidade ao analito de interesse na matriz biológica. Nas análises toxicológicas forenses o aperfeiçoamento de métodos tradicionais para extração de drogas de abuso em amostras biológicas é de extrema importância para otimização da análise. O processo, na maioria das vezes é intensivo, equivalendo a até 80% do tempo total da análise e sujeito a erros em geral. As técnicas de preparo de amostras exigem condições mínimas para serem aplicadas, dentre elas, a perda mínima de amostra com remoção eficaz de interferentes, a alta recuperação do analito, baixos tempo de análise e custo. Atualmente, uma ampla variedade de métodos de preparo de amostras está disponível e muitos desses métodos têm sido empregados em análises toxicológicas de drogas e/ou metabólitos nas amostras biológicas com interesse forense[8,94-96] (Tabela 1).

3.1. Precipitação proteica

A precipitação proteica é uma técnica de preparo de amostra simples e rápida. Consiste na desnaturação de proteínas (perda de estrutura terciária) presentes na matriz por adição de agentes precipitantes (ácido ou base fortes, temperatura, ou solventes orgânicos, como acetonitrila, metanol). Após adição do agente a amostra é submetida 132

Amostras biológicas com interesse forense

a agitação e centrifugação, possibilitando a separação do precipitado proteico e o sobrenadante, utilizado para análise toxicológica. Nesse processo não ocorre a extração ou pré-concentração da amostra, consistindo na separação da ligação do analito em questão (droga, metabólito ou biomarcador) com a proteína. Apesar das vantagens citadas, trata-se de um processo realizado manualmente, o que pode aumentar o tempo de preparo para um grande número de amostras[97].

3.2. Extração Líquido-Líquido (Liquid-liquid extraction, LLE)

A LLE é um dos primeiros métodos de preparo de amostras e baseia-se na partição da amostra entre duas fases imiscíveis (orgânica e aquosa). A eficiência da extração depende da afinidade do analito investigado pelo solvente de extração, da razão das fases e do número de extrações. O processo envolve a adição do solvente extrator seguida de agitação mecânica para promover o máximo de contato entre as fases orgânica e aquosa.

Posteriormente, a mistura é submetida à centrifugação para otimizar a separação entre as fases e então a fase de interesse é recolhida para análise. Atualmente, métodos mais eficientes na extração e concentração dos analitos estão disponíveis. Contudo, devido à sua rapidez, simplicidade e grande número de solventes extratores existente, a LLE ainda é amplamente aplicada em análises toxicológicas. Um dos principais problemas associados a esta técnica analítica é a geração de resíduos de solventes, muitas vezes mais tóxicos do que o próprio analito de interesse, e que pode afetar tanto o analista pela exposição durante o processo, como o meio ambiente pela dificuldade no descarte do mesmo[98,99].

3.3. Salting-out

Essa técnica caracteriza-se pela adição de um sal inorgânico à amostra aquosa e um solvente orgânico miscível em água, formando um sistema bifásico, com o objetivo de auxiliar na separação do solvente orgânico miscível em água, além de melhorar extrações em solventes orgânicos apolares. A eficácia desse procedimento depende das características físicoScientia Chromatographica 2015; 7(2):125-143

Amostras biológicas com interesse forense

químicas do analito e o tipo de sal utilizado. Apresenta várias vantagens sobre a LLE convencional tais como aplicabilidade a uma vasta gama de analitos, melhores valores de recuperação dos analitos e uma grande variedade de sais disponíveis (natureza química, peso molecular e volatilidade)[98-100].

3.4. Extração em Fase Sólida (Solid Phase Extraction, SPE)

A SPE é baseada no princípio de separação à base de afinidade como cromatografia em fase líquida, consistindo na separação líquido-sólido. Nas etapas dessa técnica incluem-se retenção e eluição de analitos do fluido biológico, remoção de interferentes e concentração da amostra. Tradicionalmente a SPE está disponível nos modos de fase normal, de fase reversa e de troca iônica; no entanto, um dos formatos mais utilizados é o de fase reversa. Devido à variação de propriedades físico-químicas de analitos de interesse estes formatos tradicionais não são sempre adequados e a disponibilidade de diferentes fases estacionárias e diferentes abordagens são necessárias. Nesta técnica, os analitos contidos numa matriz aquosa são extraídos, juntamente com os compostos interferentes, após passarem por um cartucho contendo um sólido sorvente.

Um solvente orgânico seletivo é geralmente utilizado para remover os interferentes e então, outro solvente é usado para retirar os analitos de interesse da fase. A SPE convencional oferece várias vantagens destacando-se o consumo de menores volumes de solventes em relação à LLE, o menor tempo de operação da técnica, a alta recuperação dos analitos e a possibilidade de automação.

Porém, também apresenta algumas limitações, como a etapa de dessorção dos analitos que requer o uso de solventes tóxicos e a ocorrência de efeitos de matriz[101,102].

3.5. Extração com Ponteiras DPX (Disposable Pipette Extraction tips)

A técnica de extração em fase sólida modificada com ponteiras descartáveis DPX é um novo método de extração em fase sólida utilizado para extrações rápidas em amostras em solução. Desenvolvida pelo pesquisador

Bordin DCM et al.

William Brewer (Universidade da Carolina do Sul, EUA), a DPX consiste em uma ponteira de 1,0 ou 5,0 mL apresentando fase sólida dispersa na qual os analitos entram em contato constante, promovendo um rápido equilíbrio entre a fase sorvente e a amostra a ser extraída.

A extração consiste no condicionamento da ponteira com o solvente adequado seguido da aspiração da amostra e promoção do contato com a fase estacionária contida na pipeta. Após o tempo de contato, a matriz é descartada e seguem-se então as etapas de lavagem e eluição. A utilização desta técnica combina rapidez, uso mínimo de solventes com alta recuperação, alta eficiência de extração, produtividade e rendimento e possibilidade de automação[103-105].

3.6. Extração por Headspace (HS)

Para a determinação de etanol e outros compostos voláteis (tais como inalantes e gases venenosos) em sangue, outros fluidos e homogenatos de tecidos, a técnica mais conveniente a ser aplicada é a extração por Headspace. Nesta técnica a amostra é inserida em recipiente hermeticamente fechado e termostatizado, por determinado tempo de incubação, permitindo adequado equilíbrio dinâmico entre as fases líquida e gasosa da amostra. Em seguida, uma alíquota da fase gasosa da amostra é recolhida e analisada por cromatografia em fase gasosa. Trata-se de uma técnica que permite o isolamento dos analitos voláteis da matriz de modo simples, eficiente, consideravelmente rápido e de baixo custo[106].

3.7. Microextração em Fase Sólida (SPME)

A microextração em fase sólida foi desenvolvida em 1990 por Arthur e Pawliszyn e consiste em uma técnica utilizada principalmente para a extração de compostos orgânicos voláteis e semi-voláteis em amostras aquosas empregando uma seringa modificada contendo micro tubo de aço inoxidável com uma agulha interna. O micro tubo possui cerca de 1 cm de fibra de sílica fundida revestida com um polímero orgânico. O método consiste na captura dos analitos em uma fibra capilar de sílica fundida quimicamente modificada,

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recoberta com uma película de material apropriado, com posterior análise direta por técnicas cromatográficas de alta eficiência tais como cromatografia em fase gasosa e cromatografia em fase líquida.

A fibra de SPME é introduzida no recipiente contendo a amostra, o protetor da agulha da fibra é retraído e a fibra de sílica é exposta ao meio onde ocorrerá a extração dos analitos. O revestimento polimérico da fibra atua concentrando os analitos por processos de absorção ou adsorção[107].

Vários revestimentos de fibra são disponíveis comercialmente e a escolha é determinada pelas propriedade físico-químicas dos analitos, dentre eles polidimetilsiloxano (analitos apolares), poliacrilato (analitos polares, principalmente fenóis), divinilbenzeno polidimetilsiloxano (analitos polares, principalmente aminas), polidimetilsiloxano carboxen (analitos de baixo peso molecular), carbowax-divinilbenzeno (analitos polares, principalmente álcoois) e divinilbenzenocarboxen-polidimetilsiloxano (analitos polares e apolares)[112].

O procedimento de extração empregando a SPME pode ser realizado de duas maneiras. A primeira consiste na imersão direta da fibra na amostra mantendo-a sob agitação durante a extração do analito. E a segunda é através da utilização da técnica de headspace, na qual a amostra é aquecida e os componentes voláteis são adsorvidos na fibra. É essencial que as condições para extração em fibra de SPME sejam otimizadas tais como pH, concentração de sal (para efeito de salting-out), o volume da amostra, tempo e velocidade de agitação da amostra, temperatura e tempo de extração. O espaço livre no frasco de amostra pode influenciar na extração da substância. Após o processo de extração, os analitos concentrados na fibra são dessorvidos termicamente através da introdução da fibra no injetor aquecido de um cromatógrafo em fase gasosa. A dessorção também pode ser realizada por cromatografia em fase líquida, utilizando o próprio solvente da fase móvel. As 134

Amostras biológicas com interesse forense

principais vantagens da técnica são alta sensibilidade, seletividade e precisão, possibilidade de automação e eliminação do uso de solventes. As desvantagens são os elevados custos associados à técnica, fragilidade da fibra e elevado tempo de extração[107-112].

3.8. Micro extração dispersiva líquido-líquido (Dispersive Liquid-Liquid Microextraction, DLLME) A DLLME é uma técnica de extração miniaturizada desenvolvida em 2006 por Rezaee e colaboradores. Baseia-se no equilíbrio de distribuição dos analitos entre a amostra e o solvente extrator. É caracterizada por um sistema de extração ternário, no qual o solvente extrator e o solvente dispersor são rapidamente injetados na amostra aquosa com o auxílio de uma seringa, formando uma solução turva no tubo (amostra aquosa/solvente extrator/solvente dispersor) que é submetida a centrifugação, onde as partículas do solvente extrator são sedimentadas. Essa fase sedimentada é recolhida e submetida à análise toxicológica[113].

As principais vantagens da técnica são simplicidade, rapidez, baixo custo, alta recuperação, uso de volumes reduzidos de solvente orgânico e aplicável a uma ampla gama analitos. No entanto, a desvantagem dessa técnica é a dificuldade de automação, devido à necessidade de etapas de separação de fases e centrifugação[113-115].

A composição de uma matriz biológica e os diferentes processos fisiológicos de incorporação de substâncias associados encontram-se relacionados com a forma química em que o analito se apresenta e as técnicas requeridas para eliminação dos interferentes e pré-concentração deste composto, já os compostos-alvo, em grande parte drogas e toxinas, devem ser conhecidos em função de suas propriedades físico-químicas principalmente com respeito à sua polaridade, faixa de pKa, ponto de ebulição e estabilidade no meio.

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Amostras biológicas com interesse forense

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Tabela 1. Aplicações das técnicas de preparo de amostras biológicas com interesse forense.

Amostra

Analitos Opioides, anfetaminas, cocaína e metabólitos

Humor vítreo

[92]

10-50 ng/mL

GC-MS

[116]

DPX (Fase reversa)

3 ng/mL

GC-NPD

[117]

DPX (Fase catiônica)

10 ng/mL

GC-MS

[118]

Cocaína, delta-9-tetrahidrocanabinol, anfetaminas, e os respectivos metabólitos

Extração em fase sólida com cartucho Bond Elut Certify® (fase mista)

5 ng/mL

GC-MS

[30]

Canabinóides sintéticos

LLE (clorobutano:isopropanol (90:10, v/v))

> 0,5-5 ng/mL (limite de quantificação)

LC-MS/MS

[119]

0,05-2 ng/mL

LC-MS/MS

[120]

Headspace

0,01-0,05 ng/mL

GC-MS

[121]

DPX (Fase reversa)

0,01-0,05 ng/mL

GC-MS

[122]

Extração em fase sólida com cartucho Phenomenex Strata Screen C HS-SPME com fibra PDMS (100 μm) LLE (iso-octano)/HS-SPME com fibra PDMS (100 μm) SPE com cartucho OASIS HCX/ SPME com fibra PDMS (100 μm) LLE (diclorometano:éter etílico (90:10, v/v))

> 0,1-0,03 ng/mg (limite de quantificação)

GC-MS

[123]

0,01-0,012 ng/mg

GC-MS

[124]

0,012-0,016 ng/mg

GC-MS

[125]

0,2 ng/mg

GC-MS

[126]

0,001-0,02 ng/mg

LC-MS/MS

[127]

0,13-7,1 ng/mL

LC-MS/MS

[128]

0,5-2 ng/mL

GC-MS

[129]

0,5-2 ng/mL

LC-MS

[130]

0,015-0,9 ng/mL

LC-MS/MS

[131]

0,025-0,1 ng/mL

LC-MS/MS

[132]

Heroína, morfina e 6- acetilmorfina

Opioides, cocaína, benzodiazepínicos e metabólitos Poluentes industriais (orgânicos voláteis) Δ9-THC and 11-Nor-Δ9-THC

Anfetaminas, cetamina, cocaína, cocaetileno e THC THC, canabinol, canabidiol Anfetaminas, opioides, cocaína e metabólitos Benzodiazepínicos e metabólitos Opioides, anfetaminas, cocaína, benzodiazepínicos e metabólitos THC, canabinol, canabidiol Fluido oral

Técnica de Referência análise GC-MS

Cocaína, cocaetileno e benzoilecgonina

Cabelo

Extração em fase sólida com cartucho Trace B® 335 (fase mista) LLE (acetato de etila: clorofórmio:hexano (7:2:1, v/v/v))

Limite de detecção 1-2 ng/mL

Codeína, morfina, e 6-monoacetilmofina Cocaína e metabólitos

Sangue

Técnica de extração

Opioides, cocaína e metabólitos, anfetaminas Canabinoides sintéticos Catinonas sintéticas e piperazinas

DLLME (100 μL clorofórmio e 250 μL de metanol)

LLE (acetato de etila:heptano (4:1, v/v)) SPME com fibra PDMS (100 μm) SPE automatizada com cartucho OASIS® HLB LLE (hexano:acetato de etila (99:1, v/v)) SPE com cartucho Stracta X

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Amostras biológicas com interesse forense

Tabela 1. Aplicações das técnicas de preparo de amostras biológicas com interesse forense.

Amostra

Analitos

Técnica de extração

Morfina e codeína

LLE (acetato de etila)

Canabinoides sintéticos

LLE (éter etílico)

Opioides, anfetaminas, benzodiazepínicos, barbitúricos e antidepressivos tricíclicos

SPE com cartucho BAKERBOND Narc™-2

Analgésicos e anestésicos

Limite de detecção > 25 ng/mL (limite de quatificação) > 0,1 ng/mL (limite de quantificação)

Técnica de Referência análise GC-MS

[133]

LC-MS/MS

[134]

0,05-0,20 ng/mL

GC-MS

[135]

HS-SPME com fibra PDMS (100 μm)

0,01-1,5 ng/mL

GC-NPD

[136]

Anfetaminas, cocaína, antidepressivos tricíclicos, meperidina, metadona, e fenciclidina

DPX (fase catiônica)

2-5 ng/mL

GC-MS

[137]

Sangue e urina postmortem, humor vítreo

Etanol, metanol, acetona e acetaldeído

HS - SPME Poliacrilato (85µm)

0,0001 g/dL

GC-FID

[138]

Suor

Cocaína e cocaetileno Metiledioxi derivados, metamfetamina e anfetamina

SPME PDMS (100 μm)

5-12,5 ng/patch

GC-MS

[139]

SPE (SPEC MP1® 2007)

2-5 ng/patch

GC-MS

[140]

DPX (Fase catiônica)

2,5-15 ng/g

GC-MS

[103]

Mecônio

Cocaína, nicotina e metabólitos Cocaína, derivados e metabólitos Ésteres etílicos de ácidos graxos (bioindicadores de etanol)

10-40 ng/g

GC-MS

[141]

5-100 ng/g

GC-MS

[142]

Urina

SPE com cartucho Bond Elut Certify I® Microextração em fase sólida por headspace (HS-SPME)

Matrizes queratinizadas exigem etapas de digestão da amostra, enquanto que matrizes heterogêneas requerem homogeneização prévia. A presença de uma grande quantidade de proteínas na amostra, em particular sangue total, exige a inclusão da etapa de precipitação proteica e centrifugação eficiente. Matrizes com alto percentual de água podem ser tratadas com técnicas de preparo mais simples, como a LLE ou a DLLME, ainda, é esperado que sejam adequadas para avaliação de substâncias mais polares. No entanto, se analitos de diferentes classes químicas estão sendo avaliados é necessário o emprego de métodos com recuperação mais eficiente, como é o caso da SPE com fase mista.

136

Outro limitante para escolha de uma técnica de preparo de amostra mais elaborada é a baixa concentração do analito na amostra disponível. Desse modo, com relação à seleção das técnicas de preparo de amostra necessárias, cria-se uma complexa conexão entre tempo de execução do procedimento, custo, matriz biológica, técnica de análise e analitos a serem pesquisados.

4. Considerações Finais

Em Toxicologia Forense, a complexidade das matrizes biológicas utilizadas nas análises e o aumento crescente na gama de substâncias a serem investigadas tornam particularmente importante a Scientia Chromatographica 2015; 7(2):125-143

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seleção de métodos de preparo de amostra adequados para resolução de problemas analíticos. Para tanto, é necessário o conhecimento básico dos princípios químicos e operacionais das mais variadas técnicas disponíveis e suas principais aplicações, assim como exige uma constante otimização destas técnicas, a fim de se aprimorar as etapas de extração e análise. Além disso, as propriedades dos compostos de interesse e

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as características das matrizes biológicas devem ser cuidadosamente avaliadas antes que uma técnica seja adotada para o processamento das amostras. Todos esses fatores são extremamente importantes uma vez que interferem no desempenho das análises e, portanto, direcionam a produção dos diagnósticos que podem contribuir para a elucidação de questões de interesse legal.

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Scientia Chromatographica 2015; 7(2):125-143 143

INSTITUTO INTERNACIONAL DE CROMATOGRAFIA

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Scientia Chromatographica 2015; 7(2)

INSTITUTO INTERNACIONAL DE CROMATOGRAFIA

O Instituto Internacional de Cromatografia (IIC) possui como uma de suas principais missões o oferecimento de cursos de curta duração nas áreas de cromatografia e técnicas relacionadas.

Os objetivos dos cursos do IIC são o aprimoramento/formação/ atualização dos usuários das técnicas cromatográficas e afim (Preparo de Amostras, Espectrometria de Massas, Gestão da Qualidade, dentre outras), tanto do ponto de vista teórico quanto prático.

A filosofia educacional do IIC é: “ao invés de ensinar apenas como operar um equipamento específico (dar o peixe) o IIC ensina a técnica (como pescar)”.

Os cursos do Instituto Internacional de Cromatografia são coordenados pelos Diretores do IIC, e ministrados pelos coordenadores, auxiliados por uma equipe técnica e científica altamente qualificada, constituída de docentes pósgraduados nos melhores centros do país na área, e pós‑graduandos em fase de conclusão de suas teses. Na época em que cada curso for oferecido, uma relação dos instrutores é disponibilizada no website do IIC. O programa detalhado de cada curso pode ser obtido através de contacto com o IIC. Os cursos são ministrados com auxílio de recursos audiovisuais modernos (datashow‑computador; vídeos, demonstrações, resolução de problemas e outros recursos instrucionais). Os alunos recebem um livreto contendo cópia de todos os slides apresentados pelos instrutores, além de material bibliográfico de apoio. Em vários cursos também são fornecidos livros de autoria dos próprios docentes dos cursos. A maior parte dos cursos também tem aulas práticas de laboratório, conforme anunciado no folheto explicativo de cada curso.

Observações: • O I.I.C. oferece também cursos “in-house” (“in-company”). Interessados nesta modalidade devem contatar o IIC para obter mais detalhes.

• Com exceção dos cursos da área da qualidade (ISO, Validação e Auditoria) todos os demais possuem aulas teóricas e práticas de laboratório.

• O oferecimento efetivo de um curso depende de um número mínimo de inscritos no mesmo.

• O número de vagas dos cursos que envolvem laboratório está sendo limitado para melhor aproveitamento dos participantes.

• Visite o website www.iicweb.org para obter mais informações.

Scientia Chromatographica 2015; 7(2)

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BIBLIOTECA IIC

O Bookstore divulgará o material de informação e formação produzido pelo IIC, incluindo Livros, filmes, slides, material didático de cursos e outras formas de divulgação dos materiais por ele ­produzido. Esses materiais podem ser adquiridos do IIC através do website www.iicweb.org/biblioteca.php

Cromatografia Líquida Moderna - Fernando M. Lanças Livro publicado pela Editora Átomo em maio de 2009, aborda de forma simples e didática os principais assuntos relacionados à Cromatografia Líquida Moderna (HPLC ou CLAE), desde a Teoria, Instrumentação, Colunas, Detectores, até aspectos da Validação, Preparo da Amostra e Análise Quantitativa.

O IIC recomenda este livro para todos os interessados em iniciar-se ou ­atualizar-se nesta técnica.

Cromatografia em Fase Gasosa - Fernando M. Lanças Livro de autoria do Prof. Lanças, abordando todos os princípios básicos: instrumentação, análise qualitativa e quantitativa, detectores e muitos outros aspectos da Cromatografia Gasosa.

Altamente recomendado para os iniciantes na técnica, os quais encontrarão explicações detalhadas e simples a respeito da maior parte dos fundamentos básicos da técnica.

Extração em Fase Sólida - Fernando M. Lanças De autoria do Prof. Lanças, este livro apresenta e discute as várias formas de extração em fase sólida (SPE), desde a mais clássica empregando cartuchos até as mais atuais como discos, placas, ponteiras, e outras. Também discute os princípios da micro extração em fase sólida (SPME) e da extração por sorção em barras de agitação (SBSE).

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Scientia Chromatographica 2015; 7(2)

CALENDÁRIO DE CURSOS | 2015

Código da Disciplina

Mês

Data

Nome da Disciplina

Carga Horária

LC-01

Março

25 a 27

Cromatografia Líquida Básica – (HPLC/CLAE)

24

GC-01

Abril

15 a 17

Cromatografia Gasosa Básica – (HRGC)

24

SP-01

Maio

13 a 15

Técnicas Modernas de Preparo de Amostras

24

LC-04

Junho

18 e 19

Prever, evitar e resolver problemas em LC

16

CRO-00

Junho/Julho

30/06 a 03/07

Técnicas Cromatográficas de Análise

32

LC-01

Julho

15 a 17

Cromatografia Líquida Básica – (HPLC/CLAE)

24

GC-MS-01

Julho

28 a 31

Acoplamento GC-MS e GC-MS/MS

32

LC-MS-01

Agosto

18 a 21

Acoplamento LC-MS e LC-MS/MS

32

LC-02

Setembro

02 a 04

Cromatografia Líquida Moderna – Avanços

24

LC-06

Setembro

24 e 25

Otimização de Métodos em HPLC

16

GC-MS-01

Outubro

20 a 23

Acoplamento GC-MS e GC-MS/MS

32

LC-MS-01

Novembro

17 a 20

Acoplamento LC-MS e LC-MS/MS

32

LC-01

Dezembro

02 a 04

Cromatografia Líquida Básica – (HPLC/CLAE)

24

GC-01

Dezembro

09 a 11

Cromatografia Gasosa Básica – (HRGC)

24

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NORMAS PARA PUBLICAÇÃO

Normas para publicação de artigos no Scientia Chromatographica (a versão detalhada está disponível em nosso portal www.scientiachromatographica.com).

Escopo

Scientia Chromatographica publica trabalhos em todas as áreas da Cromatografia, incluindo GC (colunas capilares, empacotadas, preparativas), LC (convencional, HPLC, U-HPLC, Prep-LC, micro-LC, nano-LC, TLC, PC), SFC (colunas empacotadas ou capilares), Técnicas Acopladas (GC-MS, LC-MS, SFC-MS, LC-GC, SFE-CE, GCxGC, LCxLC) e Técnicas de Preparo de Amostras (SPME, SBSE, MEPS, QuEChERS, LLE, MAE,SPE, LLE, etc.). A partir de 2012 o Scientia publica os seguintes formatos de artigos: • Artigos Originais de Pesquisa • Comunicação (“Short Communication”) • Artigos de Revisão Crítica Os artigos de Revisão Crítica deverão antes de sua submissão serem discutidos com um dos c­o-editores mais relacionados ao assunto em questão. Devem conter uma contribuição nova a respeito de um assunto de grande interesse atual, incluindo uma discussão a respeito das vantagens e desvantagens do mesmo. O Scientia não publica apenas relato de artigos descritos na literatura, sem uma discussão crítica sobre os mesmos.

Os artigos Originiais de Pesquisa deverão conter resultados de laboratório e/ou teóricos, que signifiquem uma contribuição expressiva para a área de técnicas de separação, seja ela conceitual, na instrumentação, ou na aplicação.

Os artigos do tipo Comunicação deverão ter a mesma qualidade dos artigos Originais, porém devido a seu caráter de comunicação preliminar usualmente são de menor extensão.

Envio do Artigo

Os artigos deverão ser encaminhados para periodico@scientiachromatographica.com. Os artigos do tipo Revisão deverão antes de seu envio pelo website ter o aval de um dos co-Editores do periódico, caso contrário não serão avaliados.

Todos os artigos, independentemente do formato, deverão ser submetidos exclusivamente ao Scientia, com o entendimento de que eles não foram anteriormente submetidos, não estão sendo e não serão posteriormente publicados em outro veículo.

Autores que utilizarem tabelas, ilustrações, figuras, ou textos contendo mais de 25 palavras, anteriormente publicados em outro periódico – sendo ou não autores do artigo – deverão obter a devida permissão por escrito do portador dos direitos de cópia (“Copyright ”). Esse documento deverá permanecer de posse dos autores, sendo encaminhado ao Scientia, quando solicitado.

Idioma

Os artigos, com exeção dos de Revisão, podem ser escritos preferencialmente em inglês, porém em Português e Espanhol também serão aceitos. Os autores cujo idioma nativo não for o empregado na redação do artigo são orientados a solicitar a colaboração de colegas fluentes no idioma, antes de enviar o artigo para o periódico.

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NORMAS PARA PUBLICAÇÃO

Tipos de contribuições aceitas para publicação no Scientia O Scientia Chromatographica considera para publicação quatro tipos de contribuição:

Artigos Originais de pesquisa: descrevem resultados de estudos completos. Deverão conter resultados de laboratório e/ou teóricos, que signifiquem uma contribuição expressiva para a área de técnicas de separação, seja ela conceitual, na instrumentação, ou na aplicação. Este tipo de contribuição é limitado a 6.000 palavras, incluindo as legendas das figuras e as referências, e no máximo 5 tabelas e/ou figuras somados. No momento do envio da prova de impressão, caso isto ocorra o autor será consultado se prefere revisar o artigo para enquadrá-lo em até 7 páginas, ou se prefere pagar as páginas excedentes. O número de páginas de um artigo depende muito das figuras e tabelas do mesmo. Este critério não é aplicado aos artigos convidados, cujo número de páginas será informado ao autor no momento do convite.

Comunicações (“Short Communication”): são artigos completos, porém que relatam resultados mais curtos, oportunos, e/ou cuja relevância requer sua rápida publicação. Deverão ter a mesma qualidade dos artigos Originais porém, devido a seu caráter de comunicação preliminar, usualmente são de menor extensão. Este tipo de publicação deve ter no máximo quatro páginas impressas, incluindo todo o artigo, ou seja, tabelas, figuras e referências. O autor deve indicar claramente que se trata de uma comunicação no topo da primeira página do artigo.

Artigos de Revisão crítica: revisões críticas sobre uma area específica das técnicas cromatográficas e relacionadas são também consideradas para publicação. Esses artigos devem se limitar a no máximo 10.000 palavras, incluindo as legendas, e até 10 tabelas e figuras somadas. Os artigos de Revisão Crítica deverão antes de sua submissão serem discutidos com um dos co-Editores mais relacionados ao assunto em questão. Artigos não encaminhados desta forma serão antes enviados a um co-Editor da área em que se enquadre para parecer e, somente então, serão enviados aos revisores, podendo atrasar significativamente sua publicação. Devem conter uma contribuição nova a respeito de um assunto de grande interesse atual, discutindo as vantagens e desvantagens do mesmo. O Scientia não publica apenas relato de artigos descritos na literatura, sem uma discussão crítica sobre os mesmos.

Artigos de Alta Prioridade: são publicados no primeiro número disponível do periódico, recebendo prioridade máxima de todo o sistema Editorial do periódico. Para justificar sua publicação como alta prioridade, os manuscritos deverão apresentar, de forma resumida, resultados importantes de recentes desenvolvimentos na área de cromatografia e técnicas relacionadas (espectrometria de massas, preparo de amostras, eletroforese capilar e outros). Não precisam conter resultados experimentais detalhados, sendo limitados a 2.500 palavras e três figuras e/ou tabelas combinadas.

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Scientia Chromatographica Editor-in-Chief

Fernando Mauro Lanças

Universidade de São Paulo Instituto de Química de São Carlos 13560-970 São Carlos (SP) - Brasil editor@scientiachromatographica.com

Editores Associados

Maria Eugênia Queiroz Preparo de Amostras

Renato Zanella Preparo de Amostras

José Manuel F. Nogueira Preparo de Amostras

Isabel C. S. Fontes Jardim Cromatografia Líquida

CORPO EDITORIAL CONSULTIVO

Daniel Armstrong – EUA Dietrich von Bauer – Chile Fábio Augusto – Brasil Fátima Dutra – Brasil Flávio Leite – Brasil Frank Svec – EUA Harold McNair – EUA Humberto Gómez – México Isabel Cristina Sales Fontes Jardim – Brasil Jailson B. de Andrade – Brasil Janusz Pawliszyn – Canadá Kiyoratsu Jinno – Japão Luigi Mondello – Itália Marcos Eberlin – Brasil Marina Tavares – Brasil Milos Novotny – EUA Milton Lee – EUA Norberto Peporine Lopes – Brasil Phillip Marriott – Austrália Pierina Bonato – Brasil Quézia Cass – Brasil Renato Zanella – Brasil

ENDEREÇO DO PERIÓDICO

Scientia Chromatographica

Elena Stashenko Espectrometria de Massas

Fabio Augusto Cromatografia Gasosa

Alejandro Cifuentes Técnicas Eletroforéticas

Álvaro J. Santos Neto Troubleshooting

Rua Princesa Isabel, 265 - Jardim Paraíso 13.561-140 - São Carlos (SP) - Brasil Fone/Fax: (16) 3501-4140 karen.favaro@iicweb.org / info@iicweb.org www.scientiachromatographica.com

Ficha catalográfica elaborada pela Seção de Aquisição e Tratamento da Informação do SBI/IQSC Scientia Chromatographica / Associação Internacional de Cromatografia. - vol.7 n.2 (abr./jun. 2015). São Carlos: Associação Internacional de Cromatografia, 2015 Trimestral ISSN 1984-4433 1. Cromatografia. 2. Lanças, Fernando Mauro, editor chefe.

Cláudia Zini Cromatografia Gasosa

Elina B. Caramão Cromatografia Gasosa

CDD 543.8

ISSN 1984-4433

www.scientiachromatographica.com

2015

Volume 7 | Número 2

SCIENTIA CHROMATOGRAPHICA

Publicação disponível na internet:

101 Extração em ponteiras descartáveis: fundamentos teóricos e aplicações Mônia Aparecida Lemos Pinto, Maria Eugênia Costa Queiroz

2015 | Volume 7 | Número 2

109 Extração em fase sólida molecularmente impressa de ácido hipúrico e ácido metil-hipúrico em amostras de urina seguido de análise por cromatografia líquida de alta eficiência Tamires Amabile Valim Brigante, Carolina dos Santos, Patrícia Penido Maia, Eduardo Costa Figueiredo

117 Determination of organochlorine pesticides in leather by solid-phase microextraction and gas chromatography-mass spectrometry Cristine Durante de Souza Silveira, Eduardo Carasek

125 Técnicas de preparo de amostras biológicas com interesse forense Dayanne Cristiane Mozaner Bordin, Fernanda F. da Silva Souza Monedeiro, Eduardo Geraldo de Campos, Marcela Nogueira Rabelo Alves, Laís Helena Picolo Bueno, Bruno Spinosa de Martinis

Rua Princesa Isabel, 265 - Jardim Paraíso São Carlos (SP) - CEP 13561-140 Fone/ Fax: (16) 3501-4140 | www.iicweb.org

2015 | Volume 7 | Número 2

Instituto Internacional de Cromatografia

Uma publicação do Instituto Internacional de Cromatografia www.iicweb.org