V7n1

ISSN 1984-4433

www.scientiachromatographica.com

2015

Volume 7 | Número 1 7

SCIENTIA CHROMATOGRAPHICA

Publicação disponível na internet:

Electrokinetic chromatography: an historical review of developments in theory and practice Christopher P. Palmer

2015 | Volume 7 | Número 1

31 Estado-da-arte na análise cromatográfica de Ocratoxina A em amostras de alimentos Mariane A. Andrade, Fernando M. Lanças

53 Determinação de açúcares em suco concentrado e néctar de uva: comparativo empregando refratometria, espectrofotometria e cromatografia líquida Bárbara Sthéfani Caldas, Leonel Vinicius Constantino, Cyntia Helena Gomes Alves Silva, Tiago Bervelieri Madeira, Suzana Lucy Nixdorf

65 Direct chiral separations of third generation b-blockers through high performance liquid chromatography: a review Anil Kumar Singh, Michele Bacchi Pallastrelli, Maria Inês Rocha Miritello Santoro

Rua Princesa Isabel, 265 - Jardim Paraíso São Carlos (SP) - CEP 13561-140 Fone/ Fax: (16) 3501-4140 | www.iicweb.org

2015 | Volume 7 | Número 1

Instituto Internacional de Cromatografia

Uma publicação do Instituto Internacional de Cromatografia www.iicweb.org

Scientia Chromatographica Editor-in-Chief

Fernando Mauro Lanças

Universidade de São Paulo Instituto de Química de São Carlos 13560-970 São Carlos (SP) - Brasil editor@scientiachromatographica.com

Editores Associados

Maria Eugênia Queiroz Preparo de Amostras

Renato Zanella Preparo de Amostras

José Manuel F. Nogueira Preparo de Amostras

Isabel C. S. Fontes Jardim Cromatografia Líquida

CORPO EDITORIAL CONSULTIVO

Daniel Armstrong – EUA Dietrich von Bauer – Chile Fábio Augusto – Brasil Fátima Dutra – Brasil Flávio Leite – Brasil Frank Svec – EUA Harold McNair – EUA Humberto Gómez – México Isabel Cristina Sales Fontes Jardim – Brasil Jailson B. de Andrade – Brasil Janusz Pawliszyn – Canadá Kiyoratsu Jinno – Japão Luigi Mondello – Itália Marcos Eberlin – Brasil Marina Tavares – Brasil Milos Novotny – EUA Milton Lee – EUA Norberto Peporine Lopes – Brasil Phillip Marriott – Austrália Pierina Bonato – Brasil Quézia Cass – Brasil Renato Zanella – Brasil

ENDEREÇO DO PERIÓDICO

Scientia Chromatographica

Elena Stashenko Espectrometria de Massas

Fabio Augusto Cromatografia Gasosa

Alejandro Cifuentes Técnicas Eletroforéticas

Álvaro J. Santos Neto Troubleshooting

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Ficha catalográfica elaborada pela Seção de Aquisição e Tratamento da Informação do SBI/IQSC Scientia Chromatographica / Associação Internacional de Cromatografia. - vol.7 n.1 (jan./mar. 2015). São Carlos: Associação Internacional de Cromatografia, 2015 Trimestral ISSN 1984-4433 1. Cromatografia. 2. Lanças, Fernando Mauro, editor chefe.

Cláudia Zini Cromatografia Gasosa

Elina B. Caramão Cromatografia Gasosa

CDD 543.8

ISSN 1984-4433

Periódico Trimestral do Instituto Internacional de Cromatografia

2014 2015 | Volume 67 | Número 1

Uma publicação do Instituto Internacional de Cromatografia www.iicweb.org

SUMÁRIO

Editorial.....................................................................................................................................................................................................................5 Fernando M. Lanças

CROMATOGRAFIA ELETROCINÉTICA Electrokinetic chromatography: an historical review of developments in theory and practice............. 7 Christopher P. Palmer

PREPARO DE AMOSTRAS Estado-da-arte na análise cromatográfica de Ocratoxina A em amostras de alimentos..............31 Mariane A. Andrade, Fernando M. Lanças

CROMATOGRAFIA LÍQUIDA Determinação de açúcares em suco concentrado e néctar de uva: comparativo empregando refratometria, espectrofotometria e cromatografia líquida.....................................................................53 Bárbara Sthéfani Caldas, Leonel Vinicius Constantino, Cyntia Helena Gomes Alves Silva, Tiago Bervelieri Madeira, Suzana Lucy Nixdorf

CROMATOGRAFIA LÍQUIDA Direct chiral separations of third generation b-blockers through high performance liquid chromatography: a review......................................................................................................................................65 Anil Kumar Singh, Michele Bacchi Pallastrelli, Maria Inês Rocha Miritello Santoro

Instituto Internacional de Cromatografia.................................................................................................................................................86 Biblioteca IIC........................................................................................................................................................................................................87 Calendário de Cursos | 2015..........................................................................................................................................................................88 Normas para Publicação.................................................................................................................................................................................89

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Scientia Chromatographica 2015; 7(1):5 Instituto Internacional de Cromatografia http://dx.doi.org/10.4322/sc.2015.013 ISSN 1984-4433

EDITORIAL

Welcome the new Associate Editors Com presente número iniciamos o Volume 7 do Scientia aproveitando para darmos as boas vindas aos novos Editores Associados Alejandro Cifuentes e José Manuel Nogueira. Assim ampliamos o grupo de colaboradores, sempre visando melhorar (qualidade) e diversificar (amplitude) a cobertura do periódico. Benvindos ao time Alejandro e José Manuel.

Alejandro Cifuentes

O Dr. Alejandro Cifuentes é “Full Research Professor” no Institute of Food Science Research (CIAL), parte do National Research Council of Spain (CSIC), Madrid, Espanha, e responsável pelo Laboratory of Foodomics. Ele definiu, pela primeira vez, a disciplina denominada Foodomics (J. Chromatogr. A 1216 (2009) 7109. Foi Diretor do Institute of Food Science Research (CIAL) e Deputy Director of Institute of Industrial Fermentations (CSIC) durante 2007-2010.

Alejandro é Editor do Electrophoresis e do TrAC-Trends in Analytical Chemistry, e membro do Editorial Board de 11 periódicos científicos.

O Dr. José Manuel F. Nogueira, é Professor Auxiliar com Agregação, Investigador do Centro de Química e Bioquímica (CQB) da Universidade de Lisboa, Portugal. Os interesses científicos centram-se no domínio da Química Analítica com destaque para o desenvolvimento e aplicação de métodos que envolvam técnicas cromatográficas (GC e LC), electroforéticas (CE) e hifenadas (GC-MS e LC-MS).

José Manuel F. Nogueira Recentemente tem desenvolvido estratégias analíticas inovadoras conducentes à micro-extração vestigial de compostos alvo em diversos tipos de matrizes complexas.

Fernando M. Lanças Editor-chefe IQSC/USP

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Scientia Chromatographica 2015; 7(1):7-29 Instituto Internacional de Cromatografia http://dx.doi.org/10.4322/sc.2015.014 ISSN 1984-4433

CROMATOGRAFIA ELETROCINÉTICA

Electrokinetic Chromatography: An Historical Review of Developments in Theory and Practice

Christopher P. Palmer Department of Chemistry and Biochemistry, University of Montana, Missoula MT 59812 USA Recebido: 22-06-2015 Aceito: 25-06-2015

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Abstract

During three decades since the introduction of electrokinetic chromatography (EKC), a large number of research and development efforts have defined the technique and demonstrated numerous applications. Theory has been developed and the fundamental factors affecting performance have been characterized, allowing rational method development and optimization. Numerous materials have been introduced for use as pseudostatonary phases, and their separation performance and selectivity characterized. EKC has been applied to numerous analytical problems, and also to characterize both analytes and pseudostationary phase materials. Although it was originally thought to be an insurmountable challenge, EKC has been combined with mass spectrometry to provide selective, qualitative and sensitive detection. EKC has also been demonstrated to be effective for online analyte focusing using various approaches, thus helping to overcome the low concentration sensitivity of the technique. This review provides introduction to EKC for the novice, and highlights important fundamental, theoretical and practical developments in the field.

Keywords: Electrokinetic Chromatography, Pseudostationary phase, Mass Spectrometric Detection, Analyte Focusing, Selectivity, Band Broadening.

7

Palmer CP

Electrokinetic Chromatography

1. Introduction

It has been 31 years since the introduction of micellar electrokinetic chromatography (MEKC) with the seminal paper by Shigeru Terabe et al.[1] That paper has been cited nearly 1,400 times. SCOPUS returns a total of more than 4,500 articles, including about 150 articles per year over the last several years, with the term electrokinetic chromatography in the title, abstract or key words. Clearly the approach has generated significant interest in the community. Yet, the technique and its advantages and limitations remain unfamiliar to many. The purpose of this review is to provide students of chromatography and other interested readers with an overview of the development of the technique, focusing on the theory and fundamentals that can be used to apply the technique to analytical problems. As such, emphasis is placed on early reports in which theory and fundamental developments were introduced and described, with significantly less emphasis on recent specific applications.

The original paper by Terabe et al.[1] presented some very nice separations of phenolic compounds (Figure 1), and the authors stated that “Electrokinetic separations with micellar solutions in open-tubular capillaries have been proved to be a high-resolution chromatographic method.” But the paper was also prescient regarding what the technique might be useful for, stating that “the use of a surfactant solution in an aqueous organic solvent will expand the applicability of this method to water-insoluble compounds,” and “electrokinetic separations with micellar solutions would be useful for studying chemistry of micelles as well as for analytical purposes.”

Published work since then does span a broad range of applications, and includes fundamental work regarding analytical performance, the introduction of novel materials as pseudostationary phases, development of methods to preconcentrate analytes before analysis, and the use of electrokinetic chromatography (EKC) to characterize micelles and other materials. Given the 8

Figure 1. MEKC separation of phenols reported in 1984 by Terabe et al. 1. water, 2. acetylacetone, 3. phenol, 4. o-cresol, 5. m-cresol, 6. p-cresol, 7. o-chlorophenol, 8. m-chlorophenol, 9. p-chlorophenol, 10. 2,6-xylenol, 11. 2,3-xylenol, 12. 2,5-xylenol, 13. 3,4-xylenol, 14. 3,5 xylenol, 15. 2,4 xylenol, 16. p-ethylphenol. 50 mM SDS in pH 7.0 borate-phosphate buffer, detection at 270 nm. Reprinted with permission from ref. 1. Copyright 1984, American Chemical Society.

breadth of work and the number of publications, it is clearly not possible to produce a comprehensive review of the topic. Rather, this review will highlight specific developments in an effort to provide the reader with an overview and understanding of the method and its unique qualities and capabilities. Readers are referred to a recent text[2] and reviews[3,4] on electrokinetic chromatography wherein the topics presented here are discussed in greater detail.

2. The Basics

EKC is a modification of capillary electrophoresis (CE) in which a material, the so-called pseudostationary phase (PSP), is added to the background electrolyte (BGE) to effect the separation of nonionic compounds and/or to alter the separation selectivity for ionic compounds.

The instrumentation and fused silica capillaries typically used are the same as those used in CE. Like CE, the capillary is filled with a buffered electrolyte solution and the separation is conducted under the influence of a strong applied electric field.

In fused silica capillaries, the negative surface charge on the internal capillary walls, combined with the Scientia Chromatographica 2015; 7(1):7-29

Electrokinetic Chromatography

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applied electric field, results in a robust electroosmotic flow (EOF) toward the cathode. This EOF represents a non-selective transport mechanism that affects all dissolved components with the same velocity. The EOF velocity veo is proportional to the electric field strength, E,

Nonionic analytes migrate in this system at a velocity (vmig ) that depends on the fraction of analyte associated with the PSP (fpsp) vs the BGE (fBGE):

veo = E µeo (1)

These fractions (fBGE + fPSP = 1) are directly related to the chemical affinity of the analyte for the PSP relative to the BGE, and thus different analytes with unique affinities migrate at unique velocities. An analyte with no affinity for the PSP (fBGE = 1) will migrate at veo, while one with very high affinity for the PSP (fpsp = 1) will migrate at vpsp. Analytes with intermediate affinities migrate at intermediate velocities.

where µeo is the electroosmotic mobility. µeo is proportional to the zeta potential at the capillary wall and inversely proportional to the viscosity of the BGE. In the standard configuration, the PSP is an amphiphilic anionic material that is dissolved or dispersed in the BGE at a uniform concentration. Terabe et al. used micelles of sodium dodecyl sulfate (SDS) when they introduced the approach, and SDS continues to be used extensively today. The electrophoretic mobility of the anionic PSP (µep,psp), combined with the strong applied field, results in a velocity relative to the BGE and against the electroosmotic flow that is also proportional to the electric field strength:

vmig = f pspv psp + f BGE veo

Separations are carried out over a capillary length, l, from the inlet of the capillary to the detector. The migration times of nonionic analytes with no affinity for the PSP (t0), with very high affinity for the PSP (tpsp), and with intermediate affinity (tmig) are given by t0 =

l veo

vrel = E µep, psp (2)

t psp =

The net velocity of the PSP is the sum of the electroosmotic and relative velocities:

t mig =

v psp = veo + vrel

(3)

Since the relative velocity is typically lower in magnitude and in the opposite direction of the EOF, the PSP migrates in the same direction as the electroosmotic flow but with a lower velocity. This configuration establishes a condition in which two uniformly-distributed phases, the BGE and the PSP, migrate from the anode toward the cathode with different velocities. The net velocity of the PSP is a significant departure from conventional chromatography, in which the stationary phase is fixed in place, that results in significant differences in the theory and applicability of EKC.

(4)

(5) l

v psp l vmig

(6)

(7)

respectively. It is important to recognize that all neutral analytes elute from the capillary in the time window between t0 and tpsp (t0 ≤ tmig ≤ tpsp), which is termed the migration range. This limited migration range is a significant departure of EKC from conventional chromatography and is a direct result of the net mobility of the PSP. The retention factor, k, is defined in the same way in EKC as in other forms of chromatography as the amount of analyte in the PSP divided by the amount of analyte in the mobile phase. fpsp and fBGE are each clearly a function of k, and rearrangement of these relationships and Equations 4 through 7 above yields Equation 8,[1]

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k=

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t mig − t 0 t mig (8) t 0 (1 − ) t psp

which is now a well-recognized equation in EKC. As in conventional chromatography, k → 0 as tmig → t0.

However, unlike conventional chromatographic techniques in which k → ∞ as the retention time tr → ∞, in EKC k → ∞ as tmig → tpsp. This is another statement of the limited migration range: k varies from its limits of zero (where fBGE = 1) to infinity (where fpsp = 1) as tmig varies from its limits of t0 to tpsp.

The separation presented in Figure 2 demonstrates the migration range. In this separation, t0 is marked by the migration of acetone, which has very low affinity for the SDS PSP, whereas tpsp has been estimated by a method first described by Bushey and Jorgenson.[5] The analytes are a homologous series of nonionic alkyl phenyl ketones of increasing hydrophobicity and increasing retention factor. All of the homologs elute between t0 and tpsp, and the tmig of the later-eluting homologs with high retention factors approach but do not exceed tpsp.

Rs =

t mig 2 − t mig 1 0.5(w1 + w2 )

(9)

where the subscripts indicate two analytes to be separated and where w refers to the widths at the base of the peak.

Substitution and rearrangement of this equation with equations for the theoretical plate count (N), retention factor, and selectivity (α = k2/k1) terms yields the master resolution equation. In EKC, the master resolution equation is[6]   1 − t0 t psp   N  α −1 k    Rs =   4   α   k + 1   kt 0     1 + t psp   

(10)

The first three parenthetical terms in this equation are the same as those found in the master resolution equation for conventional chromatography. The fourth parenthetical term accounts for the effect of the limited migration range, and is unique to EKC. Each of the factors affecting resolution can be considered separately.

3.1. Theoretical Plate Counts

A measure of success in any analytical separation is the resolution between adjacent analyte peaks, defined in EKC as in other modes of chromatography as

Equation 10 indicates that resolution is improved with higher plate counts, increasing with the square root of N. As a general rule, theoretical plate counts in EKC are much higher, by an order of magnitude or more, than those observed in conventional liquid chromatography.

This represents a significant advantage of EKC.

Figure 2. Representative MEKC separation. t0 is acetone, 1. acetophenone (k = 1.1), 2. propiophenone (k = 2.4), 3. butyrophenone (k = 5.4), 4. valerophenone (k = 12), 5. hexanophenone (k = 30), 6. heptanophenone (k = 72). 50 mM SDS in 20 mM TRIS buffer at pH 7.0.

Given the flat flow profile of the EOF and the lack of multiple path or eddy diffusion effects, the dominant band broadening mechanism in EKC (as in CE) is expected to be longitudinal diffusion, with the variance of an analyte zone increasing with migration time as s2 = 2Dtmig. If mass transfer kinetics were slow this could also have a significant effect on band broadening in EKC. If longitudinal diffusion were the only broadening mechanism, plate counts would increase with applied voltage (reduced tmig) and would be higher for compounds with smaller diffusion coefficients. The effective diffusion coefficient must be weighted to take into account the fraction of analyte in the BGE vs the PSP

3. Resolution

10

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and the different diffusion coefficients when dissolved in the two media:[7] D = f BGE DBGE + f PSP DPSP =

DBGE kD psp + k +1 k +1

(11)

Given that the analytes are generally low molecular weight compounds and PSPs are generally larger structures, DBGE is greater than DPSP, and the effective diffusion coefficients for analytes with higher retention factors are less than those with lower retention factors. This, in turn, should lead to higher plate counts for more highly retained compounds.

In a series of papers, Joe Davis and his group investigated and presented the theoretical and observed MEKC plate counts for analytes with a range of retention factors at different SDS concentrations,[7-9] and Davis presented a review of these and other efforts to characterize band broadening in MEKC shortly thereafter.[10] These authors found that, with the inclusion of instrumental band broadening due to injection and detection, broadening due solely to longitudinal diffusion was sufficient to describe the dispersion of weakly to intermediately retained neutral analytes over a wide range of SDS concentrations and field strengths. However, they observed significantly lower plate counts than predicted by theory for highly retained compounds and high SDS concentrations. They concluded that variation in SDS micellar mobility due to Joule heating effects, resulting from high current at high SDS concentrations and field strengths, was the primary source of the additional dispersion observed. They observed little or no evidence of mass transfer kinetics (non-equilibrium) affecting plate counts.

Peak asymmetry, either tailing or fronting, is also observed in some cases at high analyte concentrations and/or low PSP concentrations. This has deleterious effects on peak widths, N, and Rs. Smith and Davis performed careful studies into the cause of peak tailing in MEKC with SDS micelles. They found that Langmuirtype non-linear isotherm models could accurately predict the shape of tailing peaks, although possible effects of

changes in buffer conductivity or micellar mobility at high analyte concentrations could not be ruled out entirely.[11] Williamson and Davis observed that antiLangmuir isotherm models could explain observed peak fronting.[12,13] In a follow-on study, Liu and Davis[14] observed no systematic differences in isotherms measured by MEKC vs head-space gas chromatography, lending credence to the observation that non-linear isotherms are the primary cause of peak asymmetry.

3.2. Selectivity

Separation selectivity, Îą, is based on differences in the affinity of the analytes for the PSP vs the BGE, and can thus be altered by changing the chemistry of either or both phases. Separation selectivity for weak acids or bases can be affected by the pH of the BGE, and the addition of organic modifiers to the BGE can also affect the separation selectivity for many analytes.

A large number of PSPs with varied selectivity has been introduced and characterized, including various anionic[15-19] and cationic[20-24] surfactants, mixed micellar phases,[25-30] microemulsions,[31-33] polymers,[34-39] and nanoparticles.[36,40-46] The effect of changes in PSP selectivity on Rs and migration order can be seen in Figure 3. Recent reports allow organization of the various PSPs by the chemical interactions and separation selectivity that they offer.[47-49] The ease with which the PSP can be replaced and the separation selectivity altered is an advantage of EKC over conventional chromatography. The chemistry and characterization of PSPs is discussed in greater detail in Section 4 of this review.

3.3. Retention Factor

The final two parenthetical terms in Equation 10 describe the effect of retention factor on resolution. Like conventional chromatography, the resolution increases rapidly with increases in the retention factor in the range of zero to about one or two. However, unlike conventional chromatography, and as a direct consequence of the limited migration range, resolution is diminished as the retention factor is increased further.[6,50] This can be

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Figure 3. EKC separations of 1. chlorobenzene, 2. p-chlorophenol, 3. p-chloroacetophenone, 4. bromobenzene using anionic surfactants with different head group chemistry. LMT = N-lauroyl-N-methyltaurate, ALE = N-lauroyl-N-methyl-β-alaninate, SDCV = (S )-N-dodecoxycarbonyl valine, SLN = N-lauroylsarcosinate, LSA = laurylsufoacetate. Reproduced with permission from ref. 18.

seen by inspection of the separation in Figure 2. The plate number remains nearly constant throughout the separation, and the α between adjacent pairs of peaks in the homologous series also remains nearly constant. The resolution, however, is diminished for the later-eluting peaks with high retention factors relative to those with retention factors in the range of one to two.

indicates that the rate of decrease is related to the magnitude of the ratio t0 /tpsp.[6,50] Given constant values for N and α, the maximum resolution is obtained at an optimal k value:[50]

The decrease in resolution at higher values of the retention factor is described by the final parenthetical term in Equation 10, and further analysis of this term

The optimal values of the retention factor for maximum resolution as a function of time lie in the range of 1.2 to 2.[50]

12

kopt =

t psp

t0

(12)

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The consequences of the relationship between retention factor and resolution are significant and extensive. First, it shows that it is important to be able to adjust the separation conditions such that k values lie in an optimal range. Second, it demonstrates that EKC is most effectively applied to the separation of analytes with a limited range of affinities for the PSP; separation of a mixture of analytes having both very low and very high k values under a single set of conditions is especially challenging. Third, it is clear that the separation of a mixture of analytes with high affinity for the PSP is difficult; very hydrophobic compounds, for example, show very high affinity for SDS and it is difficult to achieve their separation by MEKC. Finally, it demonstrates the importance of the ratio t0 / tpsp; separation performance and the applicability of EKC are both improved under conditions that reduce this ratio.

Fortunately, there are a variety of means to adjust the retention factor to optimize EKC separations. The simplest approach is to adjust the concentration of the PSP, which affects the volumetric phase ratio.[6,50] The relationship between PSP concentration and retention factor in MEKC is[6] k = K v (Csurf − CMC )

(13)

where K is the equilibrium distribution coefficient for the analyte between the PSP and the BGE, –v is the partial specific volume of the surfactant, Csurf is the surfactant concentration and CMC is the critical micelle concentration of the surfactant. When nonmicellar PSPs are employed the CMC is effectively 0. The range of operative PSP concentrations is fairly broad, but is limited. At overly low PSP concentrations, peak asymmetry, migration reproducibility and analyte solubility problems can become problematic, whereas at excessively high PSP concentrations plate counts can be diminished due to Joule heating effects (see Section 3.1).

Equation 13 also suggests a second means to adjust k, which is to alter the distribution coefficient K. This is most commonly achieved through the addition

of organic modifiers such as methanol, acetonitrile or urea to the BGE, which reduce the magnitude of K. The fraction of organic modifier that can be added to micellar systems is limited, however, by instability of the micelles at modifier concentrations above ~20‑30%.[51,52] Cyclodextrins were introduced early in the development of EKC as additives to provide competitive solvation of hydrophobic analytes[53] and they have been used extensively primarily as chiral additives. The K for weak acids or bases can be changed significantly by suppression of ionization through changes in BGE pH, leading to weaker affinity for oppositely charged PSPs and stronger affinity for like charged PSPs. It is also possible to select a different PSP for which the analytes have weaker affinity. For example, bile salt micelles were demonstrated early on to be more stable in the presence of organic modifiers and to have a more polar interior, allowing separation of hydrophobic compounds difficult to analyze with SDS MEKC.[54] Polymeric PSPs were likewise demonstrated to be stable in the presence of organic modifiers and to be more polar, allowing separations of polynuclear aromatic hydrocarbons.[37,39] The range of suitable k values and overall resolution performance can be improved by reduction of the ratio t0 / tpsp, which can be accomplished by reducing the EOF or increasing the mobility of the PSP.[55] The addition of methanol to the BGE is commonly used as a means to reduce EOF in fused silica capillaries. This results in an enhancement of the migration range and can improve resolution, but also increases the analysis time.

The use of microemulsion PSPs has also been proven to allow a wide and effective migration range.[32,33,56]

4. Pseudostationary Phases

The PSP lies at the heart of EKC separations, playing the role of the stationary phase in conventional chromatography and providing the separation selectivity.

It is not surprising, therefore, that a variety of PSPs have been developed and studied, just as a variety of stationary phases have been developed for liquid and gas chromatography. The fact that the PSP is dissolved

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in the BGE and can be easily and inexpensively altered or replaced is a significant advantage of EKC over conventional chromatography, which requires exchange of expensive columns to alter the stationary phase chemistry.

When developing new PSPs, it is important to consider several important characteristics that affect their performance. The PSP must be soluble or form stable suspensions in the BGE and must be ionic at the pH of the BGE. The PSP must have sufficient electrophoretic mobility to provide a broad migration range. As the primary limitation to high plate counts is Joule heating, the PSP should not increase the conductivity of the BGE too greatly. It is important to consider that slow mass transfer or PSP polydispersity could contribute to band broadening, although this has not typically been observed.

Because the PSP migrates through the detector, it should not interfere with detector performance. The PSP should be available in pure form. If the PSP is a self-assembly such as a micelle, vesicle, or micro-emulsion, then the conditions under which the assembly forms and remains stable must be considered. Surfactants with high CMC are not suitable, since the high concentrations required to generate and maintain micelles result in high current and excessive Joule heating. The assemblies must form and be stable at temperatures close to room temperature that are accessible with commercial instrumentation.

The original work, and by far the most published work since that time, utilized SDS micelles as the PSP. It is interesting to note that, even after 30 years of development, SDS remains one of the most suitable and effective PSPs. It has a low CMC of 3 to 5 mM in most BGE, is commercially available in very high purity, has a reasonable electrophoretic mobility that provides a typical tpsp/t0 value of about three, has strongly acidic ionic head groups and is soluble in nearly all BGEs, has a Krafft temperature well below room temperature, generates monodisperse micelles, and allows for very high plate counts of a few hundred thousand. A significant limitation of SDS is that it is not compatible with electrospray ionization mass spectrometric (MS) detection, showing 14

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high background, significant ionization suppression, and fouling of the ESI interface.[57-61] Another limitation with SDS and other micellar systems is that the process of self-assembly into micelles is altered or disrupted in the presence of organic solvents at concentrations above 20Â or 30% by volume,[51,52] making it difficult to optimize the retention factors for highly hydrophobic compounds.

Finally, SDS offers only one PSP with a given separation selectivity, and this selectivity may not be ideal for all separations. These limitations have served as the primary motivations for the development and characterization of additional PSPs. Retention and selectivity characteristics are important to the applicability of different PSPs. For this reason, there has been significant effort expended to characterize different PSPs using the linear solvation energy relationships (LSER) model.[62-65] This model allows the estimation of the energy of various chemical interactions relative to the BGE, including dispersion, dipole-dipole and hydrogen bonding, and has thus provided information about the retention and selectivity characteristics of various PSPs.

4.1. Micellar PSPs

The primary interest in different surfactant micellar PSPs is in the different selectivity that they may offer relative to SDS micelles. These materials do not necessarily offer higher stability or improved compatibility with MS detection, and often have inferior aggregation behavior relative to SDS. A variety of anionic[15-19] surfactant micelles have been introduced as PSPs. Trone and Khaledi[17] observed some differences in selectivity among sodium sarcosinate surfactants with different alkyl chain lengths, but observed similar selectivity with between sodium tetradecyl sulfate and sodium dodecyl sulfate.

The range of effective alkyl chain lengths is limited by high CMCs for shorter chains and high Krafft temperatures for longer chains. The same authors also studied a series of surfactants with different ionic head groups, and found much more significant differences Scientia Chromatographica 2015; 7(1):7-29

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in selectivity among these materials.[18] The differences in selectivity are demonstrated in Figure 3. Nishi et al. also reported significant differences in separation selectivity among anionic surfactants with different head group chemistries.[15] Introduction of a chiral head group on surfactants was demonstrated to provide chiral selectivity.[66-68] Although differences in separation selectivity are observed as the chemistry of the ionic head group is changed, recent classification systems based on LSER parameters have put various anionic hydrocarbon surfactants in a single group of PSPs along with SDS,[48,49] indicating that this approach has limited promise to offer substantial variations in selectivity.

Bile salt surfactants, which have chiral centers and form micelles with greater stability in organic solvent modified BGEs, were also introduced for the separation of pharmaceuticals,[16] hydrophobic compounds[54] and enantiomers.[69] In an early example, bile salt micelles were shown to offer selective separations of compounds that were not resolved with SDS micelles.[16] Studies of retention and selectivity by LSER indicated minor differences between different bile salts, but that the bile salts as a group were significantly different from SDS micelles.[70,71] When classified by LSER parameters, bile salts fall into a different group from SDS micelles.[48,49] Lithium perfuorooctane sulfonic acid (LiPFOS) has also been shown to offer unique selectivity relative to SDS micelles,[70] and is grouped in terms of LSER characteristics with other perfluorinated surfactants.[48,49] LiPFOS and another perfluorinated surfactant, perfluorooctanoic acid, have been shown to be compatible with electrospray ionization and MS detection.[72,73] The separation selectivity can also be altered and adjusted using mixed micellar phases.[25-30] When using mixtures of ionic and nonionic surfactants, the electrophoretic mobility of the PSP and the migration range are diminished as the proportion of nonionic surfactant is increased.[25]

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The cationic surfactant cetyltrimethylammonium bromide has been used extensively as a PSP. In the case of cationic surfactants, the surfactant adsorbs to the capillary walls to form admicelles or a bilayer. This reverses the polarity of the zeta potential at the surface, and results in a reversal of the EOF direction to be in the direction of the anode. The cationic surfactants have electrophoretic mobility in the direction opposite to the EOF, toward the cathode, and thus a similar condition is established as when anionic surfactants are utilized.

CTAB micelles have been characterized by LSER,[20,74] and classification of the surfactant by LSER parameters places it in the same group as the bile salt sodium cholate.[48,49] A series of cationic surfactant micelles with different head group structures,[20-23] including an ionic liquid structure[20] and a phosphonium head group,[23] have also been characterized by LSER and shown to provide different selectivity and in some cases a broader migration range.

4.2. Microemulsions

Oil in water microemulsions consist of a surfactant like SDS, an oil (often octane or heptane), and a cosurfactant such as 1-butanol in the BGE. As PSPs, these materials offer enhanced solubilization capacity, a broad and adjustable migration window (up to 55Â min)[32,56] and a fluid interior that may enhance mass transfer rates. The presence of the organic cosurfactant in the BGE may also reduce k for hydrophobic compounds. It is possible, through variation in the composition of the microemulsion, to significantly alter the separation selectivity.[32] This approach, which has the acronym MEEKC, has become prominent in recent years with about one in four applications of EKC using microemulsion PSPs. The approach has been described in extensive reviews.[31,33]

4.3. Cyclodextrins

Cyclodextrins are nonionic cyclic oligosaccharides that are soluble in aqueous BGEs and offer a hydrophobic interior as well as multiple chiral centers. The first separations using anionic cyclodextrin derivatives as

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the PSP were reported very early in the development of EKC.[75] Neutral cyclodextrins were introduced several years later in combination with ionic micelles to effect the separation of hydrophobic compounds[53,76-78] and to offer chiral selectivity.[77,79-81] Nonionic cyclodextrins were also introduced for chiral separations of ionizable analytes.[82-84] Vigh and various coworkers introduced and commercialized a series of sulfate-modified ionic cyclodextrins for use in chiral separations.[85-88] A recent review article discusses the theory of migration when multiple selectors such as cyclodextrins are utilized.[89]

4.4. Vesicles and Liposomes Vesicles are composed of one (unilamellar) or more (multilamellar) concentric spherical bilayers of surfactants surrounding an internal cavity of solvent.

Multilamellar vesicles are not suitable for use as PSPs with UV detection because of excessive light scattering by these relatively large structures. Vesicles are often formed from double chain surfactants or a combination of anionic and cationic surfactants, while liposomes are vesicles composed of phospholipids.

Hong et al.[90] introduced vesicles formed from sodium dodecyl sulfate and n-dodecyltrimethylammonium bromide and reported a broader migration range and stronger hydrophobic interactions than observed with SDS micelles alone. Pascoe and Foley[91] studied additional mixed surfactant vesicles and characterized their retention and selectivity characteristics using LSER and also reported an extended migration range and greater lipophilicity than SDS micelles. The migration range for mixed surfactant systems is a function of the ratio of anionic to cationic surfactant in the vesicle, and the broader migration range is primarily a result of reduced electroosmotic flow rather than high electrophoretic mobility of the vesicles. Vesicles of the double chain surfactant bis(2-ethylhexyl)sodium sulfosuccinate (AOT) were introduced for the separation of antioxidants[92] and were also characterized in terms of selectivity and performance.[91] These structures also 16

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offer a broad migration range, with electrophoretic mobility similar to SDS micelles.

An early comprehensive study on the use of liposomes was published by Wiedmer et al.,[93] who compared the separation performance and selectivity of three liposome systems. A single liposome structure was also characterized by LSER in a later study.[91] The migration range and selectivity of liposomes is a function of their composition, and optimized compositions offer performance similar to SDS micelles. Because of their similarity to biological membranes, liposomes the use of liposomes as PSPs has evolved to be primarily for measurement and characterization of the interactions between solutes and phospholipid bilayers.[94-99]

4.5. Polymers

Polymeric PSPs were introduced in the early 1990s and Palmer has published a series of reviews on the topic.[34-36,100,101] The initial motivation for polymeric PSPs was to utilize a highly stable structure that would remain effective with high concentrations of organic solvent modifiers, thus allowing the separation of hydrophobic compounds.[37,39] As more polymeric materials were developed and characterized, it became apparent that they can also offer significantly different separation selectivity as well as compatibility with MS detection.[102,103] For example, a series of siloxane polymers[104-108] was shown to offer unique and adjustable selectivity, and recent studies have classified these materials in a unique group based on LSER parameters.[48,49] Statistical copolymers of an anionic acrylamide and lipophilic acrylamides and amides also offer different selectivity depending on structure,[109-111] and are classified in terms of retention and selectivity together with bile salts, cationic surfactants and microemulsions. Polymerized micelles with amino acid ionic head groups were demonstrated to offer chiral selectivity[112] and are compatible with MS detection.[103] A representative chiral separation of β-blockers using a chiral polymerized micelle and UV and MS detection can be seen in Figure 4.[113] The applicability and performance [37,38]

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Figure 4. Simultaneous chiral separation of β-blockers with a chiral polymeric surfactant as PSP using UV and ESI-MS detection. Ate = atenolol, Met = metoprolol, Car = carteolol, Pind = pindolol, Oxp = oxprenolol, Tal = talinolol, Alp = alprenolol, Prop = propranolol. Reproduced with permission from ref. 113. Copyright 2005, American Chemical Society.

of these various polymeric materials are excellent, but general adoption and application have been hampered by lack of commercial availability.

More recently, nanoparticle materials composed of polymers have received significant attention.[43-46,114-116] These PSPs also offer compatibility with MS detection[43,44,46,115] and the capability to introduce unique selectivity or alter the selectivity through changes in structure and chemical composition.[114,116] Separations utilizing a latex nanoparticle with mass spectrometric detection are presented in Figure 5. A unique feature of some nanoparticle PSPs is that they do not significantly increase the conductivity of the BGE,[44] which allows

very fast separations at high field strength without significant losses in plate counts due to Joule heating.

5. Characterization of Analytes and PSPs Although EKC has been applied primarily for analytical separations and analysis, the approach has also proven to be useful for the characterization of analyte partitioning and of various PSP properties. The materials and structures commonly used as PSPs have additional applications in e.g. catalysis and drug delivery, making their characterization of significant interest.

The primary application for characterization of analytes is to measure their affinity for the PSP as

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partition coefficients have most often been correlated with retention factors in MEEKC,[122-133] although vesicles have also been investigated for this purpose.[134] Tu et al.[131] made the MEEKC measurements in a microchip system, and Xia et al.[132,133] reported methods to obtain improved correlation of MEEKC results with Po/w values. MEEKC has also been investigated as a means to determine brain tissue partitioning of central nervous system drugs.[135] A few approaches have been reported to utilize EKC to measure the CMC of micelle-forming surfactants.

Terabe et al.,[6] in one of the original reports on EKC, utilized the relationship between k and surfactant concentration in Equation 13 to estimate the CMC of SDS. Lin et al.[136] modeled analyte mobility as function of SDS concentration to observe and report CMC values, concentrations at which premicellar aggregation begins, and the minimum concentration where micelles are stable aggegrates.

Figure 5. EKC separations with MS detection using 0.2% latex nanoparticle as the PSP in 20 mM ammonium carbonate at pH 10. A. Alkylphenyl ketones and phthalates in 20% acetonitrile, 1. diethylphthalate, 2. butyrophenone, 3. valerophenone, 4. dipropylphthalate, 5. hexanophenone, 6. dibutylphthalate: B. β-blockers in 10% acetonitrile, 7. atenolol, 8. metoprolol, 9. alprenolol, 10. propranolol; C. Pharmaceuticals in 20% acetonitrile, 11. diphenhydramine, 12. salbutamol, 13. nortriptyline. Generated with permission from ref. 44. Copyright 2010, American Chemical Society.

a proxy for affinity for biological lipid bilayers or for octanol-water partition coefficients (Po/w). Lipid bilayer affinity and Po/w values are used extensively in pharmacology and environmental chemistry. It has already been noted in Section 4.4 that measurement of solute portioning has become a primary application of EKC with liposome PSPs.[94-99] Liposome EKC has also been used to estimate skin permeability,[117,118] bloodbrain barrier transport,[119] ecotoxicity,[120] and screening of drug-induced phospholipidosis risk.[121] Octanol water 18

It has already been noted in earlier sections that LSER studies have been used extensively to characterize the solvent properties of PSPs. The results until 2008 were summarized by Poole et al.[137] and recent work has developed classification schemes for PSPs based on LSER results.[48,49] EKC has also been utilized to measure PSP diffusion coefficients. Davis reported a method based on Equation 11 and his model of diffusional and instrumental dispersion in EKC to determine self-diffusion coefficients for SDS micelles.[8,138] Muijselaar et al.[139] also utilized Equation 11 along with a stopped-flow method to measure self-diffusion coefficients for SDS micelles.

6. Mass Spectrometric Detection

No analytical separation technique can be truly competitive without being interfaced with MS detection.

MS provides for sensitive and selective detection, as well as qualitative information about the analytes. The most commonly utilized method for ionization and interfacing to MS detection in CE is electrospray ionization (ESI).

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However, this has been a significant challenge and limitation for EKC, because the BGE and PSP are both introduced into the ESI interface. With non-volatile surfactants like SDS at relatively high concentrations (~2% wt/vol), this can lead to fouling of the interface,[60] suppression of ionization[57-59] and signal interference in the mass spectrum[58] (signals for SDS are observed at +266, +289, +311, +599 and -265 m/q). In spite of these concerns, there are several reports of successful coupling of EKC with ESI-MS using SDS[60,140,141] or CTAB[142] surfactants.

A variety of approaches have been introduced to allow EKC-ESI-MS detection while minimizing or eliminating the negative consequences of the PSP entering the interface. The use of volatile surfactants has been demonstrated to minimize ion suppression and fouling of the interface.[72,73] Alternatively, partialfilling EKC under conditions where the PSP does not enter the detector can be used[143,144] as can conditions under which the PSP migrates in the opposite direction of the detector.[145] Both approaches are somewhat more difficult to optimize, and partial filling can lead to a significant loss in plate counts due to defocussing of analytes at the PSP boundary.[144] Perhaps the most successful and most frequently applied approach to EKC-ESI-MS is to utilize high molecular weight polymeric materials as the PSP. These materials typically have lower surface activity and thus do not suppress ionization as effectively as surfactants.

Further, the high molecular weight of the materials means that they do not produce interfering signals in the mass range of interest. Ozaki et al. first demonstrated this approach using an acrylate copolymer.[58,102,146] Polymerized chiral surfactants of various forms and chemistries were also demonstrated to allow EKCESI-MS of enantiomers.[103,113,147,148] This approach is illustrated in Figure 4 and has been applied in numerous analyses since.[e.g. 149] Nanoparticle PSPs have also been shown to be compatible with ESI-MS detection by several authors,[43,44,46] as illustrated in Figure 5.

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Another approach to coupling with MS detection is to use an alternative interface. EKC with SDS micelles can be conducted with little or no interference using a photoionization interface.[150] Ionization of less photoinactive compounds can be enhanced in this system through use of a photoactive dopant.[151]

7. Analyte Focusing

A significant limitation of CE and EKC methods is the relatively low concentration sensitivity of oncapillary UV detection, which is fundamentally limited by the short optical path length. It is not surprising, then, that methods to focus or preconcentrate analytes online have received and continue to receive significant attention. Quirino and Terabe initiated these efforts late in the 1990s, and developed and introduced several highly-successful approaches that continue to be used today.[152-155] The ability to effectively preconcentrate and focus analytes prior to separation and detection is one of the most significant strengths of EKC. Initial efforts by Quirino and Terabe demonstrated that analytes dissolved in low conductivity matrices containing the PSP could be focused at the interface with higher conductivity BGE due to enhancement of the electric field in the sample zone.[156,157] These methods led to up to 10 fold increases in the analyte concentration, which could be further enhanced to over 100 fold by injection of a plug of water in front of the sample zone.[158,159] In the same period, Quirino and Terabe introduced a fundamentally new approach, termed sweeping, in which the sample is injected in a matrix devoid of PSP and analytes are dissolved, transported and focused by the PSP as it migrates through the sample zone.[160-163] Analytes are focused solely by sweeping when the sample zone has the same conductivity as the BGE, and by a combination of sweeping and sample stacking when the sample zone has lower conductivity than the BGE. Palmer et al. described similar approaches shortly thereafter.[164,165] Sweeping is more effective for analytes with high affinity for the PSP, and was shown to allow up to several thousand fold enhancement in

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analyte concentration. Using a combination of field enhanced sample injection and sweeping, Quirino and Terabe were able to show concentration enhancements of nearly a million fold.[166]

have been included in reviews concerning the analysis of peptides,[178] natural products,[179] pharmaceutical impurities,[180] phthalates in environmental samples,[181] and analytical applications in toxicology.[182]

A method similar to sweeping, termed transient trapping, was introduced by Sueyoshi.[167] In this approach, the separation channel is only partially filled with micellar solution. The theory and mechanism of the approach have been investigated and described recently.[168]

A very few quite recent representative papers have been chosen to be highlighted here because they demonstrate recent applications of the methods and procedures presented in earlier sections. Xu et al. utilized a polymeric PSP for the analysis of corticosteroids in cosmetics.[183] Wang et al. developed an EKC-MS/ MS method for separation of enantiomers of warfarin and metabolites utilizing a chiral polymeric surfactant, and applied it to monitor metabolism of warfarin in clinical studies.[149] D’Orazio et al. reported a method utilizing dispersive liquid-liquid microextraction and EKC-MS with volatile perfluorooctanoic acid as the PSP for the analysis of estrogenic compounds in yogurt and milk.[184] Wu et al. utilized a combination of field amplified stacking and reversed field stacking for preconcentration and EKC separation of antibiotics, and Hsiao et al. utilized AFMC for preconcentration of UV absorbing compounds in suncreens.[185] And, in an interesting report out of Brazil, Bastos et al. utilized multivariate methods to optimize the EKC separation and analysis of the HIV drug nelfinavir mesylate and synthetic impurities.[186]

Quirino has also developed additional methods for analyte preconcentration. Analyte transported by micelles to a zone boundary where dilution of the surfactant leads to collapse of the micelles is focused at that boundary.[169-171] The method, termed analyte focusing by micellar collapse (AFMC), is able to provide two orders of magnitude enhancement in analyte concentration.

In a separate report, Quirino demonstrated conditions under which the migration direction of cationic solutes is reversed at a boundary between a micellar sample zone and a BGE containing organic solvent,[172-174] and this approach has been extended and combined with field enhanced stacking for focusing of anions.[175]

8. Applications

EKC methods and approaches continue to be developed and applied to a variety of analytical problems, with most of the 150 or more publications appearing each year describing specific applications.

Early in the development of EKC a review might cover applications of EKC to a wide variety of analyses. One such comprehensive review, for example, discussed applications of MEKC to the analysis of vitamins, amino acids, and pharmaceuticals.[176] A review from nearly ten years ago discussed a variety of applications of MEEKC.[177] More recently, however, EKC methods are more likely to be discussed along with other methods as part of a review of a particular type of analysis. This is perhaps evidence of widespread acceptance and utilization of the technique. As examples, EKC applications 20

9. Concluding Remarks

Over thirty plus years of development of theory, materials, methods and applications, EKC has progressed from a novel high performance whim to an accepted method in the separation science toolbox.

The approach continues to be investigated and applied frequently, and the development of new approaches to allow online preconcentration and MS detection of analytes continues to expand its applicability. Given a sustained level of interest and effort, combined with full understanding and application of underlying principles, strengths and limitations, the technique has a bright and promising future.

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Palmer CP

References 1.

Terabe, S., Otsuka, K., Ichikawa, A., Tsuchiya, A., Ando, T., “Electrokinetic Separations with Micellar Solutions in OpenTubular Capillaries,” Anal. Chem. 1984, 56, 111-113.

2.

Pyell, U. (Ed.), Electrokinetic Chromatography. Theory, Instrumentation and Applications, John Wiley and Sons Ltd., West Sussex, England 2006.

3.

Deeb, S. E., Dawwas, H. A., Gust, R., “Recent methodological and instrumental development in MEKC,” Electrophoresis 2013, 34, 1295-1303.

4.

Silva, M., “Micellar electrokinetic chromatography: A review of methodological and instrumental innovations focusing on practical aspects,” Electrophoresis 2013, 34, 141-158.

5.

Bushey, M. M., Jorgenson, J. W., “Separation of dansylated methylamine and dansylated methyl-d3-amine by micellar electrokinetic capillary chromatography with methanol-modified mobile phase,” Anal. Chem. 1989, 61, 491-493.

6.

Terabe, S., Otsuka, K., Ando, T., “Electrokinetic Chromatography with Micellar Solution and Open-Tubular Capillary,” Anal.

Chem. 1985, 57, 834-841.

7.

Yu, L., Davis, J. M., “Study of high-field dispersion in micellar electrokinetic chromatography,” Electrophoresis 1995, 16, 21042120.

8.

Davis, J. M., “New assessments of dispersion in micellar electrokinetic chromatography,” J. Microcol. Sep. 1998, 10, 479-489.

9.

Yu, L., Seals, T., Davis, J. M., “Reexamination of Dependence of Plate Number on SDS Concentration in Micellar Electrokinetic Chromatography,” Anal. Chem. 1996, 68, 4270-4280.

10. Davis, J. M., “Dispersion in micellar electrokinetic chromatography,” Adv.Chromatogr. 2000, 40, 115-157.

11. Smith, K. W., Davis, J. M., “Quantitative Study of Concentration Overload, Peak Asymmetry, and Efficiency Loss in Micellar Electrokinetic Chromatography,” Anal. Chem. 2002, 74, 5969-5981.

12. Williamson, Y., Davis, J. M., “Modeling of anti-Langmuirian peaks in micellar electrokinetic chromatography: Benzene and naphthalene,” Electrophoresis 2005, 26, 4026-4042.

13. Williamson, Y., Davis, J. M., “Origin of peak asymmetry and isotherm nonlinearity in micellar electrokinetic chromatography: variation of peak shape with buffer concentration,” Electrophoresis 2006, 27, 572-583.

14. Liu, S., Davis, J. M., “Comparison of micellar isotherms of benzene determined by headspace gas chromatography and micellar electrokinetic chromatography. Assessment on impact of buffer and solubilization-induced conductivity change,” J. Chromatogr.

A 2007, 1147, 111-119.

15. Nishi, H., Fukuyama, T., Matsuo, M., Terabe, S., “Effect of surfactant structures on the separation of cold medicine ingredients by micellar electrokinetic chromatography,” J. Pharm. Sci. 1990, 79, 519-523.

16. Nishi, H., Fukuyama, T., Matsuo, M., Terabe, S., “Separation and determination of the ingredients of a cold medicine by micellar electrokinetic chromatography with bile salts,” J. Chromatogr. A 1990, 498, 313-323.

17. Trone, M. D., Khaledi, M. G., “Characterization of chemical selectivity in micellar electrokinetic chromatography: V. The effect of the surfactant hydrophobic chain,” J. Microcolumn Sep. 2000, 12, 433-441.

18. Trone, M. D., Khaledi, M. G., “Influence of ester and amide-containing surfactant headgroups on selectivity in micellar electrokinetic chromatography,” Electrophoresis 2000, 21, 2390-2396.

19. Trone, M. D., Mack, J. P., Goodell, H. P., Khaledi, M. G., “Characterization of chemical selectivity in micellar electrokinetic chromatography. VI. Effects of surfactant counter-ion,” J. Chromatogr. A 2000, 888, 229-240.

20. Schnee, V. P., Baker, G. A., Rauk, E., Palmer, C. P., “Electrokinetic chromatographic characterization of novel pseudo-phases based on N-alkyl-N-methylpyrrolidinium ionic liquid type surfactants,” Electrophoresis 2006, 27, 4141-4148.

21. Schnee, V. P., Palmer, C. P., “Cationic surfactants for micellar electrokinetic chromatography: 2. Representative applications to acidic, basic, and hydrophobic analytes,” Electrophoresis 2008, 29, 777-782.

22. Schnee, V. P., Palmer, C. P., “Cationic surfactants for micellar electrokinetic chromatography: 1. Characterization of selectivity using the linear solvation energy relationships model,” Electrophoresis 2008, 29, 767-776.

23. Schnee, V. P., Palmer, C. P., “Characterization of a cationic phosphonium surfactant for micellar electrokinetic chromatography: using the linear solvation energy relationships model,” Electrophoresis 2008, 29, 761-766.

Scientia Chromatographica 2015; 7(1):7-29 21

Palmer CP

Electrokinetic Chromatography

24. Crosby, D., Elrassi, Z., “Micellar Electrokinetic Capillary Chromatography With Cationic Surfactants,” J. Liq. Chromatogr.

1993, 16, 2161-2187.

25. Rasmussen, H. T., Goebel, L. K., McNair, H. M., “Micellar electrokinetic chromatography employing sodium alkyl sulfates and Brij 35®,” J. Chromatogr. A 1990, 517, 549-555.

26. Bumgarner, J. G., Khaledi, M. G., “Mixed micellar electrokinetic chromatography of corticosteroids,” Electrophoresis 1994, 15, 1260-1266.

27. Ong, C. P., Ng, C. L., Lee, H. K., Li, S. F. Y., “The Use of Mixed Surfactants in Micellar Electrokinetic Chromatography,” Electrophoresis 1994, 15, 1273-1275.

28. Bumgarner, J. G., Khaledi, M. G., “Mixed micelles of short chain alkyl surfactants and bile salts in electrokinetic chromatography:.

Enhanced separation of corticosteroids,” J. Chromatogr. A 1996, 738, 275-283.

29. Fuguet, E., Rafols, C., Bosch, E., Abraham, M. H., Roses, M., “Selectivity of single, mixed, and modified pseudostationary phases in electrokinetic chromatography,” Electrophoresis 2006, 27, 1900-1914.

30. Khaledi, M. G., Bumgarner, J. G., Hadjmohammadi, M., “Characterization of mixed micellar pseudostationary phases in electrokinetic chromatography using linear solvation energy relationships,” J. Chromatogr. A 1998, 802, 35-47.

31. Altria, K. D., “Background theory and applications of microemulsion electrokinetic chromatography,” J. Chromatogr. A 2000, 892, 171-186.

32. Gabel-Jensen, C., Hansen, S. H., Pedersen-Bjergaard, S., “Separation of neutral compounds by microemulsion electrokinetic chromatography: Fundamental studies on selectivity,” Electrophoresis 2001, 22, 1330-1336.

33. Yang, H., Ding, Y., Cao, J., Li, P., “Twenty-one years of microemulsion electrokinetic chromatography (1991-2012): A powerful analytical tool,” Electrophoresis 2013, 34, 1273-1294.

34. Palmer, C. P.,”Polymeric Pseudostationary Phases and Dendrimers” in: Pyell, U. (Ed.), Electrokinetic Chromatography. Theory, Instrumentation and Applications, John Wiley and Sons Ltd., West Sussex, England 2006.

35. Palmer, C. P., “Recent progress in the use of ionic polymers as pseudostationary phases for EKC,” Electrophoresis 2007, 28, 164-173.

36. Palmer, C. P., “Recent progress in the use of ionic polymers as pseudostationary phases for electrokinetic chromatography,” Electrophoresis 2009, 30, 163-168.

37. Palmer, C. P., Khaled, M. Y., Mcnair, H. M., “A Monomolecular Pseudostationary Phase for Micellar Electrokinetic Capillary Chromatography,” J. High Resol. Chromatogr. 1992, 15, 756-762.

38. Palmer, C. P., Mcnair, H. M., “Novel Pseudostationary Phase for Micellar Electrokinetic Capillary Chromatography,” J. Microcol.

Sep. 1992, 4, 509-514.

39. Palmer, C. P., Terabe, S., “Micelle Polymers as Pseudostationary Phases in Mekc: Chromatographic Performance and Chemical Selectivity,” Anal. Chem. 1997, 69, 1852-1860.

40. Duan, A. H., Xie, S. M., Yuan, L. M., “Nanoparticles as stationary and pseudo-stationary phases in chromatographic and electrochromatographic separations,” TrAC - Trends in Anal. Chem. 2011, 30, 484-491.

41. Göttlicher, B., Bächmann, K., “Application of particles as pseudo-stationary phases in electrokinetic chromatography,” J. Chromatogr. A 1997, 780, 63-73.

42. Nilsson, C., Birnbaum, S., Nilsson, S., “Use of nanoparticles in capillary and microchip electrochromatography,” J. Chromatogr.

A 2007, 1168, 212-224.

43. Nilsson, C., Viberg, P., Spégel, P., Jömtén-Karlsson, M., Petersson, P., Nilsson, S., “Nanoparticle-based continuous full filling capillary electrochromatography/ electrospray ionization-mass spectrometry for separation of neutral compounds,” Anal. Chem.

2006, 78, 6088-6095.

44. Palmer, C. P., Hilder, E. F., Quirino, J. P., Haddad, P. R., “Electrokinetic chromatography and mass spectrometric detection using latex nanoparticles as a pseudostationary phase,” Anal. Chem. 2010, 82, 4046-4054.

45. Palmer, C. P., Keefer, A., Hilder, E. F., Haddad, P. R., “Retention Behavior and Selectivity of a Latex Nanoparticle Pseudostationary Phase for Electrokinetic Chromatography,” Electrophoresis 2011, 32, 588-594.

46. Viberg, P., Jornten-Karlsson, M., Petersson, P., Spegel, P., Nilsson, S., “Nanoparticles as pseudostationary phase in capillary electrochromatography/ESI-MS,” Anal. Chem. 2002, 74, 4595-4601.

22

Scientia Chromatographica 2015; 7(1):7-29

Electrokinetic Chromatography

Palmer CP

47. Fu, C., Khaledi, M. G., “Selectivity patterns in micellar electrokinetic chromatography. Characterization of fluorinated and aliphatic alcohol modifiers by micellar selectivity triangle,” J. Chromatogr. A 2009, 1216, 1901-1907.

48. Fu, C., Khaledi, M. G., “Micellar selectivity triangle for classification of chemical selectivity in electrokinetic chromatography,” J. Chromatogr. A 2009, 1216, 1891-1900.

49. Fu, C., Khaledi, M. G., “Characterization and classification of pseudo-stationary phases in micellar electrokinetic chromatography using chemometric methods,” Anal. Chem. 2014, 86, 2371-2379.

50. Foley, J. P., “Optimization of micellar electrokinetic chromatography,” Anal. Chem. 1990, 62, 1302-1308.

51. Birdi, K. S., Backlund, S., Sørensen, K., Krag, T., Dalsager, S., “The effect of additives on the micellar systems as studied by membrane osmometry,” J.Colloid Interf. Sci. 1978, 66, 118-123.

52. Pan, A., Naskar, B., Prameela, G. K. S., Kumar, B. V. N. P., Mandal, A. B., Bhattacharya, S. C., Moulik, S. P., “Amphiphile Behavior in Mixed Solvent Media I: Self-Aggregation and Ion Association of Sodium Dodecylsulfate in 1,4-Dioxane–Water and Methanol–Water Media,” Langmuir 2012, 28, 13830-13843.

53. Terabe, S., Miyashita, Y., Shibata, O., Barnhart, E. R., Alexander, L. R., Patterson, D. G., Karger, B. L., Hosoya, K., Tanaka, N., “Separation of highly hydrophobic compounds by cyclodextrin-modified micellar electrokinetic chromatography,” J. Chromatogr. A 1990, 516, 23-31.

54. Cole, R. O., Sepaniak, M. J., Hinze, W. L., Gorse, J., Oldiges, K., “Bile salt surfactants in micellar electrokinetic capillary chromatography. Application to hydrophobic molecule separations,” J. Chromatogr. A 1991, 557, 113-123.

55. Pyell, U., “Determination and regulation of the migration window in electrokinetic chromatography,” J. Chromatogr. A 2004, 1037, 479-490.

56. Dworschak, A., Pyell, U., “Widening of the Elution Window in Micellar Electrokinetic Chromatography With Cationic Surfactants: I. Selection of Surfactant ; Variation of Ph and Addition of Organic Modifiers or Inorganic Metal Salts,” J. Chromatogr. A 1999, 848, 387-400.

57. Lu, W., Poon, G. K., Carmichael, P. L., Cole, R. B., “Analysis of Tamoxifen and Its Metabolites by Online Capillary Electrophoresis-Electrospray Ionization Mass Spectrometry Employing Nonaqueous Media Containing Surfactants,” Anal.

Chem. 1996, 68, 668-674.

58. Ozaki, H., Terabe, S., “On-Line Micellar Electrokinetic Chromatography Mass Spectrometry With a High-Molecular-Mass Surfactant,” J. Chromatogr. A 1998, 794, 317-325.

59. Rundlett, K. L., Armstrong, D. W., “Mechanism of Signal Suppression by an Ionic Surfactants in Capillary Electrophoresis Electrospray Ionization Mass Spectrometry,” Anal. Chem. 1996, 68, 3493-3497.

60. Somsen, G. W., Mol, R., de Jong, G. J., “On-line micellar electrokinetic chromatography-mass spectrometry: feasibility of direct introduction of non-volatile buffer and surfactant into the electrospray interface,” J. Chromatogr. A 2003, 1000, 953-961.

61. Somsen, G. W., Mol, R., Jong, G. J., “Micellar electrokinetic chromatography-mass spectrometry: combining the supposedly incompatible,” Anal. Bioanal. Chem. 2006, 384, 31-33.

62. Abraham, M. H., “Scales of solute hydrogen-bonding: their construction and application to physicochemical and biochemical processes,” Chem. Soc. Rev. 1993, 22, 73-83.

63. Abraham, M. H., Chadha, H. S., Whiting, G. S., Mitchell, R. C., “Hydrogen Bonding. 32. An Analysis of Water-Octanol and Water-Alkane Partitioning and the.DELTA.log P Parameter of Seiler,” J. Pharm. Sci. 1994, 83, 1085-1100.

64. Abraham, M. H., Treiner, C., Roses, M., Rafols, C., Ishihama, Y., “Linear free energy relationship analysis of microemulsion electrokinetic chromatographic determination of lipophilicity,” J. Chromatogr. A 1996, 752, 243-249.

65. Abraham, M. H., Zissimos, A. M., Huddleston, J. G., Willauer, H. D., Rogers, R. D., Acree, W. E., Jr, “Some Novel Liquid Partitioning Systems: Water-Ionic Liquids and Aqueous Biphasic Systems,” Ind. Eng. Chem. Res. 2003, 42, 413-418.

66. Dobashi, A., Ono, T., Hara, S., Yamaguchi, J., “Optical resolution of enantiomers with chiral mixed micelles by electrokinetic chromatography [4],” Anal. Chem. 1989, 61, 1984-1986.

67. Dobashi, A., Ono, T., Hara, S., Yamaguchi, J., “Enantioselective hydrophobic entanglement of enantiomeric solutes with chiral functionalized micelles by electrokinetic chromatography,” J. Chromatogr. A 1989, 480, 413-420.

68. Mazzeo, J. R., Grover, E. R., Swartz, M. E., Petersen, J. S., “Novel chiral surfactant for the separation of enantiomers by micellar electrokinetic capillary chromatography,” J. Chromatogr. A 1994, 680, 125-135.

Scientia Chromatographica 2015; 7(1):7-29 23

Palmer CP

Electrokinetic Chromatography

69. Terabe, S., Shibata, M., Miyashita, Y., “chiral separation by electronkinetic chromatography while bile salt micelles,” J. Chromatogr. A 1989, 480, 403-411.

70. Yang, S., Khaledi, M. G., “Chemical Selectivity in Micellar Electrokinetic Chromatography: Characterization of Solute-Micelle Interactions for Classification of Surfactants,” Anal. Chem. 1995, 67, 499-510.

71. Poole, S. K., Poole, C. F., “Characterization of surfactant selectivity in micellar electrokinetic chromatography,” Analyst 1997, 122, 267-274.

72. Ishihama, Y., Katayama, H., Asakawa, N., “Surfactants usable for electrospray ionization mass spectrometry,” Anal. Biochem.

2000, 287, 45-54.

73. Petersson, P., Jornten-Karlsson, M., Stalebro, M., “Direct coupling of micellar electrokinetic chromatography to mass spectrometry using a volatile buffer system based on perfluorooctanoic acid and ammonia,” Electrophoresis 2003, 24, 999-1007.

74. Fuguet, E., Rafols, C., Bosch, E., Abraham, M. H., Roses, M., “Solute-solvent interactions in micellar electrokinetic chromatography III. Characterization of the selectivity of micellar electrokinetic chromatography systems,” J. Chromatogr. A 2002, 942, 237-248.

75. Terabe, S., Ozaki, H., Otsuka, K., Ando, T., “Electrokinetic chromatography with 2-O-carboxymethyl-β-cyclodextrin as a moving “stationary” phase,” J. Chromatogr. A 1985, 332, 211-217.

76. Nishi, H., Matsuo, M., “Separation of corticosteroids and aromatic hydrocarbons by cyclodextrin-modified micellar electrokinetic chromatography,” J. Liq. Chromatogr. 1991, 14, 973-986.

77. Terabe, S., Miyashita, Y., Ishihama, Y., Shibata, O., “Cyclodextrin-modified micellar electrokinetic chromatography: Separation of hydrophobic and enantiomeric compounds,” J. Chromatogr. A 1993, 636, 47-55.

78. Yik, Y. F., Ong, C. P., Khoo, S. B., Lee, H. K., Li, S. F. Y., “Separation of polycyclic aromatic hydrocarbons by micellar electrokinetic chromatography with cyclodextrins as modifiers,” J. Chromatogr. A 1992, 589, 333-338.

79. Lin, M., Wu, N., Barker, G. E., Sun, P., Huie, C. W., Hartwick, R. A., “Enantiomeric separation by cyclodextrin-modified micellar electrokinetic chromatography using bile salt,” J. Liq. Chromatogr.1993, 16, 3667-3674.

80. Nishi, H., Fukuyama, T., Terabe, S., “Chiral separation by cyclodextrin-modified micellar electrokinetic chromatography,” J. Chromatogr. A 1991, 553, 503-516.

81. Okafo, G. N., Bintz, C., Clarke, S. E., Camilleri, P., “Micellar electrokinetic capillary chromatography in a mixture of taurodeoxycholic acid and β-cyclodextrin,” J. Chem. Soc. Chem. Comm. 1992, 1189-1192.

82. Rawjee, Y. Y., Staerk, D. U., Vigh, G., “Capillary electrophoretic chiral separations with cyclodextrin additives. I. acids: Chiral selectivity as a function of pH and the concentration of β-cyclodextrin for fenoprofen and ibuprofen,” J. Chromatogr. A 1993, 635, 291-306.

83. Rawjee, Y. Y., Williams, R. L., Vigh, G., “Capillary electrophoretic chiral separations using β-cyclodextrin as resolving agent.

II. Bases: Chiral selectivity as a function of pH and the concentration of β-cyclodextrin,” J. Chromatogr. A 1993, 652, 233-245.

84. Rawjee, Y. Y., Williams, R. L., Vigh, G., “Capillary electrophoretic chiral separations using cyclodextrin additives. III. Peak resolution surfaces for ibuprofen and homatropine as a function of the pH and the concentration of β-cyclodextrin,” J. Chromatogr. A 1994, 680, 599-607.

85. Bryan Vincent, J., Sokolowski, A. D., Nguyen, T. V., Vigh, G., “A Family of Single-Isomer Chiral Resolving Agents for Capillary Electrophoresis. 1. Heptakis(2,3-diacetyl-6-sulfato)-β-cyclodextrin,” Anal. Chem. 1997, 69, 4226-4233.

86. Cai, H., Nguyen, T. V., Vigh, G., “A Family of Single-Isomer Chiral Resolving Agents for Capillary Electrophoresis. 3.

Heptakis(2,3-dimethyl-6-sulfato)-β-cyclodextrin,” Anal. Chem. 1998, 70, 580-589.

87. Vigh, G., Vincent, B., Cai, H., Nguyen, T., Maynard, D., Zhou, W., “Recent developments in the CE separation of enantiomers using single-isomer chiral resolving agents,” J. Pharm. Belg. 1998, 53, 126.

88. Zhu, W., Vigh, G., “A family of single-isomer, sulfated γ-cyclodextrin chiral resolving agents for capillary electrophoresis. 1.

Octakis(2,3-diacetyl-6-sulfato)-γ- cyclodextrin,” Anal. Chem. 2000, 72, 310-317.

89. Müllerová, L., Dubský, P., Gaš, B., “Twenty years of development of dual and multi-selector models in capillary electrophoresis: A review,” Electrophoresis 2014, 35, 2688-2700.

90. Hong, M., Weekley, B., Grieb, S. J., Foley, J. P., “Electrokinetic chromatography using thermodynamically stable vesicles and mixed micelles formed from oppositely charged surfactants,” Anal. Chem. 1998, 70, 1394-1403.

24

Scientia Chromatographica 2015; 7(1):7-29

Electrokinetic Chromatography

Palmer CP

91. Pascoe, R. J., Foley, J. P., “Characterization of surfactant and phospholipid vesicles for use as pseudostationary phases in electrokinetic chromatography,” Electrophoresis 2003, 24, 4227-4240.

92. Delgado-Zamarreño, M. M., Sánchez-Pérez, A., González Maza, I., Hernández-Méndez, J., “Micellar electrokinetic chromatography with bis(2-ethylhexyl)sodium sulfosuccinate vesicles: Determination of synthetic food antioxidants,” J. Chromatogr. A 2000, 871, 403-414.

93. Wiedmer, S. K., Holopainen, J. M., Mustakangas, P., Kinnunen, P. K. J., Riekkola, M.-L., “Liposomes as carriers in electrokinetic capillary chromatography,” Electrophoresis 2000, 21, 3191-3198.

94. Ruokonen, S.-K., Duša, F., Lokajová, J., Kilpeläinen, I., King, A. W. T., Wiedmer, S. K., “Effect of ionic liquids on the interaction between liposomes and common wastewater pollutants investigated by capillary electrophoresis,” J. Chromatogr. A. 2015, 1405, 178-87.

95. Burns, S. T., Agbodjan, A. A., Khaledi, M. G., “Characterization of solvation properties of lipid bilayer membranes in liposome electrokinetic chromatography,” J. Chromatogr. A 2002, 973, 167-176.

96. Burns, S. T., Khaledi, M. G., “Rapid determination of liposome-water partition coefficients (Klw) using Liposome Electrokinetic Chromatography (LEKC),” J. Pharm. Sci. 2002, 91, 1601-1612.

97. Carrozzino, J. M., Khaledi, M. G., “Interaction of basic drugs with lipid bilayers using liposome electrokinetic chromatography,” Pharm. Res. 2004, 21, 2327-2335.

98. Wiedmer, S. K., Kulovesi, P., Riekkola, M. L., “Liposome electrokinetic capillary chromatography in the study of analytephospholipid membrane interactions. Application to pesticides and related compounds,” J. Sep. Sci. 2008, 31, 2714-2721.

99. Wiedmer, S. K., Lokajová, J., “Capillary electromigration techniques for studying interactions between analytes and lipid dispersions,” J. Sep. Sci. 2013, 36, 37-51.

100. Palmer, C. P., “Polymeric and Polymer-Supported Pseudostationary Phases in Micellar Electrokinetic Chromatography: Performance and Selectivity,” Electrophoresis 2000, 21, 4054-4072.

101. Palmer, C. P., “Recent Progress in the Development, Characterization and Application of Polymeric Pseudo-Phases for Electrokinetic Chromatography,” Electrophoresis 2002, 23, 3993-4004.

102. Ozaki, H., Itou, N., Terabe, S., Takada, Y., Sakairi, M., Koizumi, H., “Micellar Electrokinetic Chromatography MassSpectrometry a High-Molecular-Mass Surfactant : Online Coupling With an Electrospray-Ionization Interface,” J. Chromatogr.

A 1995, 716, 69-79.

103. Shamsi, S. A., “Micellar Electrokinetic Chromatography-Mass Spectrometry Using a Polymerized Chiral Surfactant,” Anal.

Chem. 2001, 73, 5103-5108.

104. Peterson, D. S., Palmer, C. P., “Alkyl modified anionic siloxanes as pseudostationary phases for electrokinetic chromatography I. Synthesis and characterization,” J. Chromatogr. A 2001, 924, 103-110.

105. Peterson, D. S., Palmer, C. P., “Novel alkyl-modified anionic siloxanes as pseudostationary phases for electrokinetic chromatography: II. Selectivity studied by linear solvation energy relationships,” Electrophoresis 2001, 22, 3562-3566.

106. Peterson, D. S., Palmer, C. P., “Synthesis and characterization of novel anionic siloxane polymers as pseudostationary phases for electrokinetic chromatography,” Electrophoresis 2001, 22, 1314-1321.

107. Peterson, D. S., Palmer, C. P., “Novel alkyl-modified anionic siloxanes as pseudostationary phases for electrokinetic chromatography III. Performance in organic-modified buffers,” J. Chromatogr. A 2002, 959, 255-261.

108. Schulte, S., Palmer, C. P., “Alkyl-modified siloxanes as pseudostationary phases for electrokinetic chromatography,” Electrophoresis 2003, 24, 978-983.

109. Shi, W., Palmer, C. P., “Effect of pendent group structures on the chemical selectivity and performance of sulfonated copolymers as novel pseudophases in electrokinetic chromatography,” Electrophoresis 2002, 23, 1285-1295.

110. Shi, W., Peterson, D. S., Palmer, C. P., “Effect of pendant chain lengths and backbone functionalities on the chemical selectivity of sulfonated amphiphilic copolymers as pseudo-stationary phases in electrokinetic chromatography,” J. Chromatogr. A 2001, 924, 123-135.

111. Shi, W., Watson, C. J., Palmer, C. P., “Sulfonated Acrylamide Copolymers as Pseudo-Stationary Phases in Electrokinetic Chromatography,” J. Chromatogr. A 2001, 905, 281-290.

112. Shamsi, S. A., Palmer, C. P., Warner, I. M., “Molecular micelles: novel pseudostationary phases for CE,” Anal. Chem. 2001, 73, 140A-149A. Scientia Chromatographica 2015; 7(1):7-29 25

Palmer CP

Electrokinetic Chromatography

113. Akbay, C., Rizvi, S. A. A., Shamsi, S. A., “Simultaneous Enantioseparation and Tandem UV-MS Detection of Eight b-Blockers in Micellar Electrokinetic Chromatography Using a Chiral Molecular Micelle,” Anal. Chem. 2005, 77, 1672-1683.

114. Hyslop, J. S., Hall, L. M. G., Umansky, A. A., Palmer, C. P., “RAFT polyhmerized nanoparticles: Influences of shell and core chemistries on peformance for electrokintic chromatography,” Electrophoresis 2014, 35, 728-735.

115. Spegel, P., Viberg, P., Carlstedt, J., Petersson, P., Joernten-Karlsson, M., “Continuous full filling capillary electrochromatography: Nanoparticle synthesis and evaluation,” J. Chromatogr. A 2007, 1154, 379-385.

116. Priego-Capote, F., Ye, L., Shakil, S., Shamsi, S. A., Nilsson, S., “Monoclonal Behavior of Molecularly Imprinted Polymer Nanoparticles in Capillary Electrochromatography,” Anal. Chem. 2008, 80, 2881-2887.

117. Wang, Y., Sun, J., Liu, H., Liu, J., Zhang, L., Liu, K., He, Z., “Predicting skin permeability using liposome electrokinetic chromatography,” Analyst 2009, 134, 267-272.

118. Xian, D. L., Huang, K. L., Liu, S. Q., Xiao, J. Y., “Quantitative retention-activity relationship studies by liposome electrokinetic chromatography to predict skin permeability,” Chin. J. Chem. 2008, 26, 671-676.

119. Wang, Y., Sun, J., Liu, H., He, Z., “Rapidly profiling blood-brain barrier penetration with liposome EKC,” Electrophoresis 2007, 28, 2391-2395.

120. Xian, D., Huang, K., Liu, S., Xiao, J., “Liposome electrokinetic chromatography: An in vitro approach for predicting ecotoxicity,” Chromatographia 2008, 67, 407-412.

121. Wang, T., Feng, Y., Jin, X., Fan, X., Crommen, J., Jiang, Z., “Liposome electrokinetic chromatography based in vitro model for early screening of the drug-induced phospholipidosis risk,” J. Pharm. Biomed. Anal. 2014, 96, 263-271.

122. Ishihama, Y., Oda, Y., Asakawa, N., “A hydrophobicity scale based on the migration index from microemulsion electrokinetic chromatography of anionic solutes,” Anal. Chem. 1996, 68, 1028-1032.

123. Ishihama, Y., Oda, Y., Asakawa, N., “Hydrophobicity of Cationic Solutes Measured by Electrokinetic Chromatography with Cationic Microemulsions,” Anal. Chem. 1996, 68, 4281-4284.

124. Ishihama, Y., Oda, Y., Uchikawa, K., Asakawa, N., “Evaluation of solute hydrophobicity by microemulsion electrokinetic chromatography,” Anal. Chem. 1995, 67, 1588-1595.

125. Henchoz, Y., Romand, S., Schappler, J., Rudaz, S., Veuthey, J. L., Carrupt, P. A., “High-throughput log P determination by MEEKC coupled with UV and MS detections,” Electrophoresis 2010, 31, 952-964.

126. Jia, Z., Mei, L., Lin, F., Huang, S., Killion, R. B., “Screening of octanol-water partition coefficients for pharmaceuticals by pressure-assisted microemulsion electrokinetic chromatography,” J. Chromatogr. A 2003, 1007, 203-208.

127. Klotz, W. L., Schure, M. R., Foley, J. P., “Determination of octanol-water partition coefficients of pesticides by microemulsion electrokinetic chromatography,” J. Chromatogr. A 2001, 930, 145-154.

128. Øtergaard, J., Honore Hansen Steen, S., Larsen, C., Schou, C., Heegaard, N. H. H., “Determination of octanol-water partition coefficients for carbonate esters and other small organic molecules by microemulsion electrokinetic chromatography,” Electrophoresis 2003, 24, 1038-1046.

129. Poole, S. K., Durham, D., Kibbey, C., “Rapid method for estimating the octanol-water partition coefficient (log P(ow)) by microemulsion electrokinetic chromatography,” J. Chromatogr. B 2000, 745, 117-126.

130. Poole, S. K., Patel, S., Dehring, K., Workman, H., Dong, J., “Estimation of octanol-water partition coefficients for neutral and weakly acidic compounds by microemulsion electrokinetic chromatography using dynamically coated capillary columns,” Journ.

Chromatogr. B 2003, 793, 265-274.

131. Tu, J., Halsall, H. B., Seliskar, C. J., Limbach, P. A., Arias, F., Wehmeyer, K. R., Heineman, W. R., “Estimation of log Pow values for neutral and basic compounds by microchip microemulsion electrokinetic chromatography with indirect fluorimetric detection (μMEEKC-IFD),” J. Pharm. Biomed. Anal. 2005, 38, 1-7.

132. Xia, Z., Jiang, X., Mu, X., Chen, H., “Improvement of microemulsion electrokinetic chromatography for measuring octanolwater partition coefficients,” Electrophoresis 2008, 29, 835-842.

133. Xia, Z., Yang, J., Li, L., Yang, F., Jiang, X., “Determination of octanol-water partition coefficients by MEEKC based on peakshift assay,” Chromatographia 2010, 72, 495-501.

134. Klotz, W. L., Schure, M. R., Foley, J. P., “Rapid estimation of octanol-water partition coefficients using synthesized vesicles in electrokinetic chromatography,” J. Chromatogr. A 2002, 962, 207-219.

26

Scientia Chromatographica 2015; 7(1):7-29

Electrokinetic Chromatography

Palmer CP

135. Wan, H., Åhman, M., Holmén, A. G., “Relationship between brain tissue partitioning and microemulsion retention factors of CNS drugs,” J. Med. Chem. 2009, 52, 1693-1700.

136. Lin, C. E., Chen, M. J., Huang, H. C., Chen, H. W., “Capillary electrophoresis study on the micellization and critical micelle concentration of sodium dodecyl sulfate: Influence of solubilized solutes,” J. Chromatogr. A 2001, 924, 83-91.

137. Poole, S. K., Poole, C. F., “Quantitative structure-retention (property) relationships in micellar electrokinetic chromatography,” J. Chromatogr. A 2008, 1182, 1-24.

138. Davis, J. M., “Determination of micellar self-diffusion coefficients by micellar electrokinetic chromatography,” Analyst 1998, 123, 337-341.

139. Muijselaar, P. G., van Straten, M. A., Claessens, H. A., Cramers, C. A., “Determination of diffusion coefficients and separation numbers in micellar electrokinetic chromatography,” J. Chromatogr. A 1997, 766, 187-195.

140. Mol, R., Kragt, E., Jimidar, I., de Jong, G. J., Somsen, G. W., “Micellar electrokinetic chromatography-electrospray ionization mass spectrometry for the identification of drug impurities,” J. Chromatogr. B 2006, 843, 283-288.

141. Takada, Y., Sakairi, M., Koizumi, H., “Online combination of micellar electrokinetic chromatography and mass spectrometry using an electrospray-chemical ionization interface,” Rapid Commun. Mass Spectrom. 1995, 9, 488-490.

142. Varghese, J., Cole, R. B., “Cetyltrimethylammonium chloride as a surfactant buffer additive for reversed-polarity capillary electrophoresis-electrospray mass spectrometry,” J. Chromatogr. A 1993, 652, 369-376.

143. Muijselaar, P. G., Otsuka, K., Terabe, S., “On-Line Coupling of Partial-Filling Micellar Electrokinetic Chromatography With Mass Spectrometry,” J. Chromatogr. A 1998, 802, 3-15.

144. Nelson, W. M., Tang, Q., Harrata, A. K., Lee, C. S., “On-Line Partial Filling Micellar Electrokinetic Chromatography Electrospray Ionization Mass Spectrometry,” J. Chromatogr. A 1996, 749, 219-226.

145. Yang, L. Y., Harrata, A. K., Lee, C. S., “On-Line Micellar Electrokinetic Chromatography Electrospray Ionization Mass Spectrometry Using Anodically Migrating Micelles,” Anal. Chem. 1997, 69, 1820-1826.

146. Ozaki, H., “Studies on Micellar Electrokinetic Chromatography Using Polymer Surfactants and Its Combination With Mass Spectrometry,” Bunseki Kagaku 1999, 48, 1023-1024.

147. Lu, W. Z., Shamsi, S. A., Mccarley, T. D., Warner, I. M., “On-Line Capillary Electrophoresis-Electrospray Ionization Mass Spectrometry Using a Polymerized Anionic Surfactant,” Electrophoresis 1998, 19, 2193-2199.

148. Rizvi, S. A. A., Zheng, J., Apkarian, R. P., Dublin, S. N., Shamsi, S. A., “Polymeric sulfated amino acid surfactants: A class of versatile chiral selectors for micellar electrokinetic chromatography (MEKC) and MEKC-MS,” Anal. Chem. 2007, 79, 879-898.

149. Wang, X., Hou, J., Jann, M., Hon, Y. Y., Shamsi, S. A., “Development of a chiral micellar electrokinetic chromatography-tandem mass spectrometry assay for simultaneous analysis of warfarin and hydroxywarfarin metabolites: Application to the analysis of patients serum samples,” J. Chromatogr. A 2013, 1271, 207-216.

150. Mol, R., de Jong, G. J., Somsen, G. W., “Atmospheric pressure photoionization for enhanced compatibility in on-line micellar electrokinetic chromatography-mass spectrometry,” Anal. Chem. 2005, 77, 5277-5282.

151. Mol, R., de Jong, G. J., Somsen, G. W., “Online capillary electrophoresis-mass spectrometry using dopant-assisted atmospheric pressure photoionization: Setup and system performance,” Electrophoresis 2005, 26, 146-154.

152. Aranas, A. T., Guidote, A. M., Jr., Quirino, J. P., “Sweeping and new on-line sample preconcentration techniques in capillary electrophoresis,” Anal. Bioanal. Chem. 2009, 394, 175-185.

153. Breadmore, M. C., “Recent advances in enhancing the sensitivity of electrophoresis and electrochromatography in capillaries and microchips,” Electrophoresis 2007, 28, 254-281.

154. Breadmore, M. C., Thabano, J. R. E., Dawod, M., Kazarian, A. A., Quirino, J. P., Guijt, R. M., “Recent advances in enhancing the sensitivity of electrophoresis and electrochromatography in capillaries and microchips (2006-2008),” Electrophoresis 2009, 30, 230-248.

155. Kitagawa, F., Otsuka, K., “Recent applications of on-line sample preconcentration techniques in capillary electrophoresis,” J. Chromatogr. A 2014, 1335, 43-60.

156. Quirino, J. P., Terabe, S., “Online concentration of neutral analytes for micellar electrokinetic chromatography. II. Reversed electrode polarity stacking mode,” J. Chromatogr. A 1997, 791, 255-267.

Scientia Chromatographica 2015; 7(1):7-29 27

Palmer CP

Electrokinetic Chromatography

157. Quirino, J. P., Terabe, S., “Online concentration of neutral analytes for micellar electrokinetic chromatography. I. Normal stacking mode,” J. Chromatogr. A 1997, 781, 119-128.

158. Quirino, J. P., Terabe, S., “Online Concentration of Neutral Analytes for Micellar Electrokinetic Chromatography. 5. FieldEnhanced Sample Injection with Reverse Migrating Micelles,” Anal. Chem. 1998, 70, 1893-1901.

159. Quirino, J. P., Otsuka, K., Terabe, S., “Online concentration of neutral analytes for micellar electrokinetic chromatography. VI. Stacking using reverse migrating micelles and a water plug,” J. Chromatogr. B 1998, 714, 29-38.

160. Quirino, J. P., Terabe, S., “Exceeding 5000-fold concentration of dilute analytes in micellar electrokinetic chromatography,” Science 1998, 282, 465-468.

161. Quirino, J. P., Terabe, S., “Online concentration of neutral analytes for micellar electrokinetic chromatography. 3. Stacking with reverse migrating micelles,” Anal. Chem. 1998, 70, 149-157.

162. Quirino, J. P., Terabe, S., “Sweeping with an enhanced electric field of neutral analyte zones in electrokinetic chromatography,” J. High Res. Chromatogr. 1999, 22, 367-372.

163. Quirino, J. P., Terabe, S., “Sweeping of Analyte Zones in Electrokinetic Chromatography,” Anal. Chem. 1999, 71, 1638-1644.

164. Palmer, J., Burgi, D. S., Landers, J. P., “Electrokinetic stacking injection of neutral analytes under continuous conductivity conditions,” Anal. Chem. 2002, 74, 632-638.

165. Palmer, J., Munro, N. J., Landers, J. P., “A universal concept for stacking neutral analytes in micellar capillary electrophoresis,” Anal. Chem. 1999, 71, 1679-1687.

166. Quirino, J. P., Terabe, S., “Approaching a million-fold sensitivity increase in capillary electrophoresis with direct ultraviolet detection: cation-selective exhaustive injection and sweeping,” Anal. Chem. 2000, 72, 1023-1030.

167. Sueyoshi, K., Kitagawa, F., Otsuka, K., “On-line sample preconcentration and separation technique based on transient trapping in microchip micellar electrokinetic chromatography,” Anal. Chem. 2008, 80, 1255-1262.

168. Breadmore, M. C., Quirino, J. P., Thormann, W., “Insight into the mechanism of transient trapping in micellar electrokinetic chromatography,” Electrophoresis 2011, 32, 542-549.

169. Quirino Joselito, P., Haddad Paul, R., “Online sample preconcentration in capillary electrophoresis using analyte focusing by micelle collapse,” Anal. Chem. 2008, 80, 6824-6829.

170. Quirino, J. P., “Neutral analyte focusing by micelle collapse in micellar electrokinetic chromatography,” J. Chromatogr. A 2008, 1214, 171-177.

171. Quirino, J. P., “Analyte focusing by micelle collapse in CZE: nanopreparation of neutrals,” Electrophoresis 2009, 30, 875-882.

172. Quirino, J. P., “Micelle to solvent stacking of organic cations in capillary zone electrophoresis with electrospray ionization mass spectrometry,” J. Chromatogr. A 2009, 1216, 294-299.

173. Quirino, J. P., Aranas, A. T., “Micelle to solvent stacking of organic cations in micellar electrokinetic chromatography with sodium dodecyl sulfate,” J. Chromatogr. A 2011, 1218, 7377-7383.

174. Quirino, J. P., Aranas, A. T., “Simultaneous electrokinetic and hydrodynamic injection with on-line sample concentration via micelle to solvent stacking in micellar electrokinetic chromatography,” Anal. Chim. Acta 2012, 733, 84-89.

175. Tubaon, R. M., Haddad, P. R., Quirino, J. P., “High-sensitivity analysis of anionic sulfonamides by capillary electrophoresis using a synergistic stacking approach,” J. Chromatogr. A 2014, 1349, 129-134.

176. Nishi, H., Terabe, S., “Micellar electrokinetic chromatography perspectives in drug analysis,” J. Chromatogr. A 1996, 735, 3-27.

177. Huie, C. W., “Recent applications of microemulsion electrokinetic chromatography,” Electrophoresis 2006, 27, 60-75.

178. Kašička, V., “Recent developments in capillary and microchip electroseparations of peptides (2011-2013),” Electrophoresis 2014, 35, 69-95.

179. Tubaon, R. M. S., Rabanes, H., Haddad, P. R., Quirino, J. P., “Capillary electrophoresis of natural products: 2011-2012,” Electrophoresis 2014, 35, 190-204.

180. Štěpánová, S., Kašička, V., “Determination of impurities and counterions of pharmaceuticals by capillary electromigration methods,” J. Sep. Sci. 2014, 37, 2039-2055.

181. Net, S., Delmont, A., Sempéré, R., Paluselli, A., Ouddane, B., “Reliable quantification of phthalates in environmental matrices (air, water, sludge, sediment and soil): A review,” Sci. Total Environ. 2015, 515-516, 162-180.

28

Scientia Chromatographica 2015; 7(1):7-29

Electrokinetic Chromatography

Palmer CP

182. Sieradzka, E., Witt, K., Milnerowicz, H., “The application of capillary electrophoresis techniques in toxicological analysis,” Biomed. Chromatogr. 2014, 28, 1507-1513.

183. Xu, X., Ni, X., Cao, Y., Zhuo, X., Yang, X., Cao, G., “Amphiphilic polymeric micelle as pseudostationary phase in electrokinetic chromatography for analysis of eight corticosteroids in cosmetics,” Electrophoresis 2014, 35, 827-835.

184. D’Orazio, G., Asensio-Ramos, M., Hernández-Borges, J., Rodríguez-Delgado, M. A., Fanali, S., “Evaluation of the combination of a dispersive liquid-liquid microextraction method with micellar electrokinetic chromatography coupled to mass spectrometry for the determination of estrogenic compounds in milk and yogurt,” Electrophoresis 2015, 36, 615-625.

185. Hsiao, W. Y., Jiang, S. J., Feng, C. H., Wang, S. W., Chen, Y. L., “Determining ultraviolet absorbents in sunscreen products by combining direct injection with micelle collapse on-line preconcentration capillary electrophoresis,” J. Chromatogr. A 2015, 1383, 175-181.

186. Bastos, C. A., Gomes, C. R. B., De Souza, M. V. N., De Oliveira, M. A. L., “Optimization of an electrolyte system for the simultaneous separation of nelfinavir mesylate and two impurities by micellar electrokinetic chromatography,” J. Brazil. Chem.

Soc. 2015, 26, 887-898.

Scientia Chromatographica 2015; 7(1):7-29 29

Scientia Chromatographica 2015; 7(1):30-30 Instituto Internacional de Cromatografia http://dx.doi.org/10.4322/sc.2015.000 ISSN 1984-4433

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CLASSIFICAÇÃO

Scientia Chromatographica 2015; 7(1)

Scientia Chromatographica 2015; 7(1):31-52 Instituto Internacional de Cromatografia http://dx.doi.org/10.4322/sc.2015.015 ISSN 1984-4433

PREPARO DE AMOSTRAS

Estado-da-arte na análise cromatográfica de Ocratoxina A em amostras de alimentos State-of-the-art in the chromatographic analysis of Ochratoxin A in food samples

Mariane A. Andrade Fernando M. Lanças* Universidade de São Paulo, Instituto de Química de São Carlos 13560-970 São Carlos (SP) Brasil * flancas@iqsc.usp.br Recebido: 10-06-2015 Aceito: 25-06-2015

Resumo As micotoxinas são compostos produzidos por fungos, sendo potencialmente perigosos à saúde humana e animal. A Ocratoxina A (OTA) é uma das micotoxinas mais amplamente estudadas, sendo encontrada em várias matrizes, como cereais, vinho, especiarias, frutas secas, cerveja, etc. A concentração dessa micotoxina nos alimentos é geralmente muito baixa (da ordem de ng g-1), sendo, portanto, necessário o emprego de técnicas de preparos de amostras que realizem a purificação e pré-concentração no analito na amostra. Os métodos de separação e detecção empregados na análise de OTA também devem oferecer alta sensibilidade para adequada quantificação do analito. Dessa forma, esse trabalho discute as técnicas de preparo de amostra mais utilizadas na determinação dessa micotoxina em matrizes alimentícias, as quais são as colunas de imunoafinidade (Imunoaffinity Columns – IACs), Polímero Molecularmente Impresso no formato de Extração em Fase Sólida (Molecularly Imprinted Polymers – Solid Phase Extration, MIP-SPE), Microextração em Fase Sólida (Solid Phase Microextraction – SPME) e a Microextração Líquido-Líquido Dispersiva (Dispersive Liquid Liquid Microextraction – DLLME). Também é discutido os métodos separação e detecção comumente usados, sendo que para esse micotoxina a técnica mais utilizada é a Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com Detecção de Fluorescência (High Performance Liquid Chromatography – Fluorescence Detection, HPLC-FLD).

Palavras-chave: Ocratoxina A, alimentos, preparo de amostra, cromatografia líquida, fluorescência.

Abstract Mycotoxins are compounds produced by fungus, being a potential danger to human and animal health. Ochratoxin A (OTA) is a mycotoxin widely studied, being found in a varied of matrices such as cereals, wine, spices, dried fruits, beer, etc. OTA concentration in food is generally low (the order of ng g-1) being, therefore, necessary the use of sample preparation techniques to perform the analyte purification and pre-concentration in the analyzed sample. The separation and detection methods used in OTA analysis also should offer high sensitivity in order to quantify the analyte adequately. Thus, this work discusses the most used sample preparation techniques to determining this mycotoxin in food, which are Immunoaffinity Chromatography (IACs), Molecularly Imprinted Polymers – Solid Phase Extraction (MIP – SPE), Solid Phase Microextraction (SPME) and Dispersive Liquid Liquid Microextraction (DLLME). The methods of separation and detection commonly used are also presented, and for this mycotoxin the most applied technique is High Performance Liquid Chromatography with Fluorescence Detection (HPLC-FLD).

Keywords: Ochratoxin A, food, sample preparation, liquid chromatography, fluorescence.

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Andrade MA, Lanças FM

1. Introdução

Considerando sua vasta extensão territorial, solo apropriado, clima adequado, e tecnologia de ponta o Brasil tornou-se, nas últimas décadas, um dos maiores produtores e exportadores de alimentos do mundo.

Vanguarda na produção de vários alimentos de origem vegetal, consolidou-se também como um grande produtor de alimentos de origem animal, não apenas in natura como, igualmente, alimentos industrializados.

O consumo mundial de alimentos tem aumentado significativamente com o acelerado aumento da população. Atualmente, a China (nação mais populosa do mundo) e Índia (segunda mais populosa) já representam parcela significativa da população mundial (quase ¼ do total), com projeção de aumento significativo da mesma para as próximas 3 décadas – com possível inversão da “pole position” entre essas duas nações.

Várias projeções baseadas em modelos científicos atuais sugerem que a população mundial neste período deverá ser próximo de 10 bilhões de habitantes. Não é difícil imaginar a quantidade de alimentos de origem vegetal e animal que deverá ser produzida para atender a demanda gerada por este aumento populacional.

Considerando as técnicas atuais de produção de alimentos em larga escala, conforme necessidade atual e projeção de aumento para o futuro próximo, não se antevê uma diminuição da necessidade de uso de agrotóxicos e de medicamentos veterinários para assegurar a produtividade necessária para alimentar a população mundial. Portanto, as melhores previsões não conseguem excluir e nem mesmo diminuir a necessidade destes agentes químicos nos alimentos, cujos resíduos podem levar a sérios problemas de saúde para os consumidores. Esta é uma das principais preocupações da área de alimentos atualmente denominada segurança alimentar (“food safety”).

Além das fraudes, adulteração deliberada com o intuito de tirar proveito econômico, os alimentos podem também apresentar ainda resíduos provenientes do uso de substâncias químicas como agrotóxicos e medicamentos 32

Análise cromatográfica de OTA

veterinários, entre outros, além de contaminações as quais podem aparecer surgir durante a produção do alimento, estocagem inadequada ou processamento industrial dos mesmos. Um exemplo que tem se tornado muito importante recentemente é um grupo de contaminantes denominados genericamente de micotoxinas, objetivo do presente trabalho.

As micotoxinas (mykes = fungo; toxicun = veneno) são metabólitos secundários de alguns fungos, de baixa massa molecular (~ 700 u), sendo uma potencial ameaça à saúde humana e animal quando alimentos contaminados com as mesmas são ingeridos, causando várias doenças e até morte[1,2]. A produção de micotoxinas pode ocorrer durante as fases de crescimento, colheita e estocagem de alimentos, podendo ser encontradas nos mesmos ainda que os fungos que as produziram sejam destruídos[2].

O homem é contaminado pelas micotoxinas principalmente pela ingestão de alimentos processados ou in natura contaminados podendo, também, ocorrer pela ingestão de carne, leite e ovos de animais que foram alimentados com ração contaminada[3]. Os principais alimentos fonte de micotoxinas são cereais, amendoim, castanhas, frutas secas, café, cacau, temperos, óleos de sementes, ervilhas secas, feijão. Além disso, são encontradas em frutas como maçã e em bebidas como cerveja e vinho, porque usam malte de cevada e cereais e uvas possivelmente contaminados, respectivamente[1].

Na Tabela 1 são apresentados os alimentos mais comumente contaminados por micotoxinas, seus fungos produtores e seus efeitos em homens e animais.

A produção das micotoxinas é dependente das condições ambientais como temperatura, atividade de água (aw), substrato, pH, interação microbiana, entre outras. A temperatura ideal para a produção de micotoxinas está entre a temperatura mínima e máxima para o crescimento fúngico, variando entre as espécies.

Entretanto, alimentos provenientes de regiões tropicais e semi-tropicais apresentam altos níveis de contaminação, uma vez que o clima favorece o desenvolvimento de fungos toxicogênicos. As toxinas podem ser produzidas Scientia Chromatographica 2015; 7(1):31-52

Análise cromatográfica de OTA

Andrade MA, Lanças FM

Tabela 1. Principais micotoxinas com seus respectivos fungos produtores, substratos e seus efeitos no homem e animais[3].

Principais substratos

Principais fungos produtores

Principal toxina

Efeitos

Amendoim e milho

Aspergillus flavus Aspergillus parasiticus

Aflatoxina B1

Hepatotóxica, nefrotóxica e carcinogênica

Penicillium citrinum

Citrinina

Nefrotóxica para suínos

Claviceps purpurea

Ergotamina

Fusarium verticillioides Aspergillus ochraceus Aspergillus carbonarius Penicillium expansum Penicillium griseofulvum Fusarium sp Myrothecium sp Strachybotrys sp Trichothecium sp

Fumonisinas

Tricotecenos T2, Neosolaniol Fusanona x, Nivalenol Deoxinivalenol

Fusarium graminearum

Zearalenona

Trigo, aveia, cevada, milho e arroz Centeio e grãos em geral Milho Cevada, café e vinho Frutas e sucos de frutas Milho, cevada, trigo, aveia e centeio Cereais

quando os valores aw variam entre 0,60 a 0,90 em alimentos de umidade intermediária. Já os alimentos com maior pré-disposição à contaminação são aqueles com alto teor de carboidratos[2]. Os alimentos que são estocados por mais de alguns dias tornam-se alvo do crescimento desses fungos, tornando-os alimentos potencialmente contaminados[1]. Na Tabela 2 são apresentadas as condições ótimas de temperatura e aw para a produção de algumas micotoxinas.

Ocratoxina Patulina

Gangrena de extremidades e convulsões Câncer de esôfago Hepatotóxica, nefrotóxica e carcinogênica Toxicidade vagamente estabelecida Hemorragias, vômitos e dermatites Baixa toxicidade; síndrome da masculinização e feminização em suínos

Tabela 2. Condições ótimas de temperatura e atividade de água (aw) para a produção de micotoxinas[4].

Micotoxina

Temperatura (ºC)

Aflatoxina Ocratoxina Fumonisina Zearalenona Deoxinivalenol Citrinina

33 25-30 15-30 25 26-30 20-30

aw

0,99 0,98 0,9-0,995 0,96 0,995 0,75-0,85

As micotoxinas consideradas de maior risco a saúde humana e animal pela Agência Internacional de Pesquisa sobre Câncer (International Agency for Reseach on Cancer - IARC) são as Aflatoxinas (AFLA), a Ocratoxina A (OTA), a Zearalenona (ZON), o Desoxinivalenol (DON) e as Fumonisinas (FUMO)[2].

1.1. Ocratoxina A O grupo das Ocratoxinas compreende compostos que apresentam uma β-fenilalanina ligada uma diidroisocumarina através de uma ligação amida. São elas a Ocratoxina A (OTA), a Ocratoxina B e a Ocratoxina C (Figura 1)[5].

Figura 1. Estrutura Química das Ocratoxinas.

A OTA é produzida principalmente por fungos do gênero Aspergillus e Penicillium. A OTA foi detectada primeiramente em fungos da espécie Aspergillus

Scientia Chromatographica 2015; 7(1):31-52 33

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Análise cromatográfica de OTA

ochraceus, sendo que outras espécies no mesmo gênero também a produz, como o A. alliaceus, A. auricomus, A. carbonarius, A. citricus, A. ostianus, A. sulphureus, A. fonsecaeus, A. petrakii, A. glaucus, A. melleus e A. niger.

Já o principal produtor de OTA nos fungos do gênero Penicillium é o Penicillium verrucosum[6]. Algumas espécies de fungos se desenvolvem preferencialmente em alguns alimentos específicos, como mostrado na Tabela 3. A ocorrência natural desses dois fungos é ampla, uma vez que esses crescem em variadas condições de substrato, pH, temperatura e umidade[1]. Porém os dois gêneros de fungos crescem em condições distintas. Em regiões de clima temperado, a OTA é mais produzida por fungos do gênero Penicillium, enquanto que em regiões de climas tropicais e subtropicais, os do gênero Aspergillus são mais responsáveis pelo aparecimento de OTA nos alimentos[7]. Na Tabela 4 são apresentadas as principais características dos fungos produtores de OTA. Os alimentos mais facilmente contaminados por OTA são cereais e outros alimentos ricos em amido.

A OTA também tem sido encontrada em amostras de café, temperos, frutas secas, cerveja e vinho, e em carne animal[1]. Os cereais são a maior fonte de contaminação Tabela 3. Espécie de fungo responsável pela contaminação de diferentes alimentos[8].

Alimento

Espécie de Fungo

Cereais

P. verrucosum P. nordicum A. niger e A. carbonarius A.ochraceus, A. niger e A. carbonarius A. alliaceus

Carne e Queijo Uvas e Vinho Café e Temperos Figos

por OTA, sendo que 50% da ingestão humana diária dessa micotoxina é devido ao consumo de derivados de cereais. A segunda maior fonte de contaminação por OTA é o vinho, o qual colabora com a porcentagem de 10-15% do total de OTA ingerido diariamente[1,9]. Em um estudo realizado na União Européia nos anos de 1999 e 2000 foi verificado contaminação por OTA em 48% das amostras analisadas, sendo que os alimentos com maior grau de contaminação são mostrados na Tabela 5[6].

A especial estabilidade da OTA a altas temperaturas e acidez faz com que sua presença em alimentos a serem processados seja também preocupante.

Uma vez que o alimento está contaminado, é difícil a remoção dessa micotoxina da matriz[5]. Estudos têm mostrado que processo de lavagem de grãos de cevada reduz em somente 2-3% a quantidade total de OTA nos grãos. O processo de moagem tende a redistribuir e concentrar as micotoxinas nos moinhos. Assim, um teor mais alto de OTA foi encontrado em trigo, cevada e outros cereais moídos. Durante o processo cervejeiro, especialmente durante a fermentação, cerca de 20-30% de OTA pode ser removida do mosto. Ao assar um pão, cozinhar feijão sob pressão e a tostar café, todos contaminados com OTA, há diminuição de cerca de 0, 84 e 13-93% da quantidade total da micotoxina presente, respectivamente, nesses alimentos. Com esses dados pode-se observar que a OTA mostra-se moderadamente estável ao processamento, tendo sua concentração reduzida somente em condições mais extremas (ex: temperatura acima de 150 ºC)[10].

Tabela 4. Principais características do fungos produtores de OTA[6].

Gênero Aspergillus Crescimento a temperaturas mais altas: A. ochraceus - 8-37ºC (Max 31ºC); aw até 0,77 A. carbonarius - 32-35ºC; aw 0,82 A. niger - 8-47ºC (Max. 37ºC); aw até 0,72 Contaminante de café, uvas passas Regiões mais quentes e dos trópicos 34

Gênero Penicillium Crescimento a temp. <30ºC (Max. a 20ºC) aw até 0,8; pH entre 6,0-7,0 Contaminante de cereais armazenados e carne Norte e centro da Europa e Canadá Scientia Chromatographica 2015; 7(1):31-52

Análise cromatográfica de OTA

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A toxicidade da OTA foi amplamente descrita em uma monografia da IARC (International Agency for Research on Cancer) em 1993, sendo classificada na classe 2B, como possível carcinogênico humano.

O principal efeito já observado pela exposição por ingestão de OTA é o desenvolvimento de doenças nos rins, sendo ela sugerida como fator contribuinte para o desenvolvimento da Nefropatia Endêmica dos Balcãs (Balkan Endemic Nephropathy - BEN), doença crônica em que os rins são diminuídos de tamanho e peso, com difusa fibrose, e tumores no trato urinário[11]. Estudos também tem revelado uma conexão com a exposição de OTA e câncer no fígado, rins, glândulas mamárias e testículos em animais. A OTA também possui efeito neurotóxico, afetando várias áreas do sistema nervoso[12].

Além disso, efeitos imunotóxicos e teratogênicos já foram evidenciados em pesquisas. A carcinogenicidade em ratos foi observada com doses relativamente baixas (70 μg kg-1 de peso corporal). A teratogenicidade Tabela 5. OTA em diferentes gêneros alimentícios[6].

Presença de Ocratoxina A em diferentes gêneros alimentícios na União Europeia Cereais e produtos à base de cereais Vinho Especiarias Cerveja Cacau Frutas secas Carne

50% 13% 8% 5% 4% 3% 1%

foi verificada principalmente no sistema nervoso central, mas com concentrações muito superiores às normalmente presentes nos alimentos (1 mg kg-1). Podem ser observados efeitos imunotóxicos com concentrações relativamente baixas de OTA, na ordem dos ng mL-1.

Concentrações na ordem dos 5 ng de OTA/kg de peso corporal originam imunossupressão em ratos[6].

Vários países tem estabelecido os níveis máximos de OTA em alimentos, incluindo o Brasil, Israel, Suíça, Uruguai e União Europeia. Os Estados Unidos ainda não determinaram os níveis aceitáveis de OTA em alimentos e sementes[13]. No Brasil, a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) determinou através da Resolução RDC n º 7, de 18 de Fevereiro de 2011[14], os níveis de OTA em alimentos com aplicação imediata (2011) e para aplicação a partir de Janeiro de 2014. Já na União Europeia, os níveis máximos de OTA nos alimentos foi determinada pela Autoridade de Segurança Alimentar Europeia (European Food Safety Authority - EFSA) através da Comissão Reguladora EC nº 1881/2006, de 19 de Dezembro de 2006[15]. A EFSA também determina o valor de ingestão semanal tolerável provisória de OTA sendo igual a 120 ng kg -1 de peso corpóreo. Na Tabela 6 são compilados os níveis máximos permitidos para OTA em alguns alimentos no Brasil e na Europa.

Tendo em vista a importância do controle de OTA nos alimentos, os métodos de preparo de amostra, separação e detecção mais utilizados atualmente para a determinação dessa micotoxina serão discutidos nesse trabalho.

Tabela 6. Limites Máximos Tolerados (em μg kg-1) de OTA em alguns alimentos aceitos no Brasil e na União Europeia[14,15].

Alimento

Brasil

União Europeia

Cerais não processados

10,0 10,0 10,0 10,0 10,0 2,0

5,0 3,0 10,0 5,0 10,0 2,0

2,0

0,50

Não determinado

Não determinado

Derivados de cereais não processados Frutas secas Grão de café e café torrado Café solúvel Vinho e suco de uva Alimentos à base de cereais para alimentação infantil (lactentes e crianças de primeira infância) Cerveja, Cacau, Produtos com cacau

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Análise cromatográfica de OTA

2. Métodos Analíticos para a determinação de Ocratoxina A em Alimentos

Um grande número de artigos tem sido publicado todos os anos descrevendo a identificação de OTA em diferentes alimentos e bebidas. Não diferente de outras análises, um bom preparo de amostra se faz necessário para análise de micotoxinas, uma vez que essas se encontram em concentrações geralmente muito baixa (da ordem de ng g-1) nas matrizes estudadas. Por isso, métodos de preparo de amostra que realizem um bom clean-up e concentração dos analitos são priorizados na determinação desse tipo de contaminação. A escolha do método de separação e detecção também é de extrema importância para o sucesso da análise, pois esses devem garantir sensibilidade adequada ao método para a correta quantificação desses analitos.

A seguir são apresentados os principais métodos de preparos de amostra, assim como os métodos de separação e detecção mais comumente descritos na literatura para a determinação de OTA em alimentos.

Destacam-se as micro técnicas de preparo de amostra que estão em constante ascensão.

2.1. Preparo de Amostra 2.1.1. Colunas de Imunoafinidade A técnica mais utilizada ainda hoje para o preparo de amostra na determinação de OTA em alimentos envolve coluna de imunoafinidade (Immunoaffinity Columns – IACs)[16]. As IACs contém anticorpos imobilizados que exclusivamente retém certa micotoxina, ou classe de micotoxinas, através da ligação específica entre o anticorpo e o analito[17,18]. Os anticorpos antimicotoxinas são imobilizados em um suporte sólido, usualmente contido em um cartucho de plástico.

Passando a amostra através do cartucho, os anticorpos imobilizados irão capturar os analitos de interesse, extraindo-os e concentrando-os. Na etapa de lavagem, as impurezas do extrato são removidas e um solvente orgânico como, por exemplo, metanol é percolado pela 36

Figura 2. Princípio de funcionamento da Imunoafinidade para o preparo de amostras de micotoxinas[18].

coluna, liberando os analitos de interesse na etapa de eluição (Figura 2). Dessa forma, as IACs podem ser usadas para a purificação e concentração de micotoxinas antes da análise por técnicas cromatográficas ou outras, como apresentado em trabalhos publicados, utilizando fluorimetria[18-20].

Devido a sua alta especificidade, esse tipo de preparo de amostra produz um extrato limpo, com níveis mínimos de interferentes da matriz e excelente relação sinal-ruído quando comparado a sorventes menos seletivos de Extração de Fase Sólida (Solid Phase Extraction – SPE)[17].

O uso das IACs oferece cromatogramas mais limpos para a análise de OTA em cereais, uva passa e grão de café verde, o que permite a quantificação da ordem de ng g-1, enquanto que com o uso das colunas multifuncionais, os cromatogramas apresentaram múltiplos picos, muitas vezes eluindo na calda do pico da OTA. Entretanto, quando o método original da Associação Oficial de Químicos Analíticos (Association of Official Analytical Chemists – AOAC) para a determinação de OTA em grão de café verde (extração com clorofórmio e retroextração com solução de bicarbonato) foi Scientia Chromatographica 2015; 7(1):31-52

Análise cromatográfica de OTA

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comparado com o uso das IACs, alguns pesquisadores preferiram o método original. Nos testes houve alto grau de contaminação e poucos benefícios das IACs foram reconhecidos. Quando duas IACs comerciais foram comparadas (Ochraprep® e OchraTest TM) para a análise de vinho, a recuperação e precisão foram comparáveis entre as duas e resultado quantitativo similar foi obtido para amostras naturalmente contaminadas de vinho tinto e branco. Também foi proposto que a Microextração em Fase Sólida (Solid Phase Microextraction – SPME) é mais simples e oferece maior custo-benefício que as IAC para a análise de vinho, apesar de que com a SPME o limite de detecção foi sete vezes maior que com a IAC e os cromatogramas apareceram mais “sujos” que aqueles apresentados pela IAC[19].

Uma das maiores desvantagens das IACs é a desnaturação dos anticorpos imobilizados mesmo na presença de solventes orgânicos em baixas concentrações. Uma maneira de contornar esse problema é a diluição de amostra, porém isso pode causar perda da sensibilidade[21].

Algumas aplicações mais atuais das IACs como preparo de amostra para a análise de OTA em

diversas matrizes (Tabela 7) evidenciam que as taxas recuperação obtidas nas extrações são elevadas, o que se faz necessário, uma vez que a quantidade de OTA encontrada nos alimentos é baixa. Outro fato interessante é que, apesar de as IACs poderem ser fabricadas nos próprios laboratórios, a maioria dos trabalhos publicados utilizam IACs comerciais, mesmo considerando que detalhes das preparações são apresentadas em artigos[19]. Além disso, a determinação conjunta de OTA e Aflatoxinas tem ganho destaque, uma vez já existe comercialmente disponível uma IAC específica para esse fim.

Mesmo com a problemática envolvendo a comparação das IACs com outros métodos de preparo de amostra, e a crescente necessidade da análise de multi-micotoxinas, elas ainda são muito utilizadas para a determinação tanto da OTA como outras micotoxinas de modo singular, por serem de utilização rápida e adequada para a quantificação.

2.1.2. Polímero Molecularmente Impresso na Extração em Fase Sólida A Extração em Fase Sólida (Solid Phase Extraction – SPE) é também outra técnica bastante

Tabela 7. Algumas aplicações de IACs para a extração de OTA em alimentos nos anos de 2015 e 2014.

a

Matriz

Recuperaçãoa (%)

Marca

Referência

Farinha de trigo

93.6 – 93-9 92,2 – 93,7 94-1 – 95,3 71,9 – 94-2 b 94,4 93,4 – 95,1 89 – 110 c 70,6 – 76,9 94,8 – 98,0 78,5-82,6 96,5 85 – 90 68,49 – 99,28

OchraTest™ OchraTest™ OchraTest™ AflaOchra HPLC™ Ochratest™ WB Ochraprep® OchraTest™ AflaOchra HPLC™ OchraTestTM WB ToxinFast® Ochraprep ® AflaOchra-Test OchraStar COIAC 2000

[22] [22]

Farinha de milho Farinha de arroz Especiarias Farinha de Castanha Vinho Cereais Leite humano Cereais Pólen de Abelha Café solúvel Milho Café torrado e café instantâneo

para diferentes níveis de spiking; bpara várias especiarias diferentes; c para cereais diferentes.

[22] [23] [24] [25] [26] [27] [28] [29] [30] [31] [32]

Scientia Chromatographica 2015; 7(1):31-52 37

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Análise cromatográfica de OTA

utilizada para a determinação de OTA em alimentos, seja com a utilização de fases não específicas (fase normal, fase reversa, troca iônica, etc.) ou fases mais específicas como os materiais de Imunoafinidade e os Polímeros Molecularmente Impressos (Molecularly Imprinted Polymers – MIPs)[21].

As fases não específicas são mais usadas para a determinação multi-micotoxinas, seguida da análise por LC-MS/MS, onde um fator limitante da análise é a seletividade do sorvente[21]. Leitner et al.[33] demonstrou que o uso da fase C-18 combinada com a Espectrometria de Massas para a extração de OTA em vinho ofereceu bons resultados, com detecção de concentração subppb, que são comparáveis com a determinação de OTA utilizando imunosorventes específicos.

Os MIPs são materiais sintéticos que possuem sítios de ligação artificiais capazes de reconhecer moléculas-alvo[21]. A síntese típica de um MIP utiliza o modelo da molécula de interesse, monômeros funcionais, agente de ligação cruzada e iniciadores de polimerização. O método de impressão molecular envolve a polimerização dos monômeros funcionais e dos iniciadores de polimerização ao redor do modelo da molécula de interesse[34] (Figura 3).

Tipicamente, um pequena quantidade de MIP (15 – 500 mg em média) é empacotada em cartuchos de polietileno ou polipropileno. Em seguida, realizam-se as etapas de condicionamento, carregamento com amostra, lavagem e eluição, sendo que o analito eluido já pode ser introduzido no sistema analítico[36].

A principal vantagem que os MIPs tem a oferecer para a SPE é uma significativa melhora na seletividade da extração, uma vez que o sorvente fornece uma maior retenção para o analito de interesse do que para o restante dos compostos também presentes na amostra[36]. Além disso, comparado com os anticorpos utilizados em IAC, o MIP oferece alta estabilidade em altas temperaturas, valores altos e baixos de pH e alta concentração de 38

Figura 3. Esquema genérico da síntese de um MIP: MF: Monômero Funcional; MM: Molécula Modelo; ALC: Agente de Ligação Cruzada; SS: Sítio Seletivo[35,36].

solventes orgânicos. Porém, os MIPs comumente podem sofrer de efeito de memória, que acontece quando as etapas de lavagem não conseguem remover totalmente a molécula modelo do sítio de seletivo. Na determinação de analitos em baixas concentrações (nível de traços), esse efeito pode levar à erros na quantificação. Uma forma de evitar esse problema é o uso de uma molécula estruturalmente análoga ao analito de interesse, que não co-elui com com o analito de interesse durante a análise cromatográfica[37].

Jodlbauer et al.[38] sintetizou várias moléculas análogas da OTA e novos monômeros funcionais e testou diferentes solventes para obter um MIP com alta afinidade de ligação para a OTA em condição prótica polar. No trabalho seguinte[39], a aplicabilidade do MIP sintetizado foi testada como preparo de amostra para a análise OTA em vinhos tintos. Com a inserção direta da amostra no cartucho de MIP no formato SPE, baixos valores de recuperação foram obtidos (< 60 %). Por isso, foi necessária a remoção dos interferentes da amostra com uma prévia extração com C-18, o que melhorou a recuperação da extração pelo MIP (> 90%). Um teste com um Polímero Não Impresso (Non-Imprinted Polymer – NIP), mostrou que também houve retenção de OTA Scientia Chromatographica 2015; 7(1):31-52

Análise cromatográfica de OTA

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Tabela 8. Algumas aplicações de MIP-SPE para a extração de OTA em alimentos nos anos de 2012 a 2014.

Matriz

Recuperaçãoa (%)

Marca

Referência

Vinho

92 – 100 92,1 – 94,3 86,9 – 102,7 87,6 – 94,5 96,6 – 99,8 93,5 – 101,7 91,6 – 96,9

Home-made Home-made AFFINIMIP™ OTA AFFINIMIP® SPE OTA AFFINIMIP® SPE OTA AFFINIMIP® SPE OTA AFFINIMIP® SPE OTA

[40] [41]

Trigo Trigo Gengibre Cerveja Vinho Suco de uva

a

para diferentes níveis de spiking.

nesse material, evidenciando que a ligação específica da OTA com o sítio seletivo não é responsável, nesse caso, pela extração e concentração do analito.

Trabalhos publicados mais recentemente[40,41], os quais utilizam o mesmo mimético da OTA como molécula modelo e monômeros funcionais, diferentes dos utilizados por Jodlbauer et al., mostram que a OTA possui alta afinidade pelo MIP quando comparada ao NIP, garantindo que existe ligação entre o sítio de reconhecimento do polímero e o analito.

Já existe disponível comercialmente um MIP no formato SPE para a determinação de OTA. Alguns artigos retratam os resultados obtidos com a utilização desse produto, evidenciando que o polímero é capaz de reter a OTA nos sítios seletivos[42], com boa recuperação e a reutilização dos cartuchos de 14[43] a 40[44] vezes obtendo recuperação de até 80 %.

Na Tabela 8 são apresentados os trabalhos publicados nos anos de 2012 a 2014 que utilizam MIP no formato SPE feito nos próprios laboratórios, assim como os que utilizam MIP comercialmente disponível.

Mesmo ainda com a grande utilização das IACs, o MIP no formato SPE se mostra bastante interessante, pois confere a especificidade necessária para a análise de OTA em alimentos, aliada à vantagens que IACs não podem oferecer, como alta reutilização e o uso de solventes orgânicos.

[42] [43] [44] [44] [44]

2.1.3. Microtécnicas de Extração Mesmo não sendo tão comuns para a análise de OTA em alimentos, as microtécnicas de preparo de amostra vem ganhando bastante destaque nos últimos anos, por serem técnicas menos dispendiosas, mais simples e com consumo menor de solventes orgânicos.

Por isso, destacamos as principais microtécnicas de preparo de amostra para a determinação de OTA.

2.1.3.1. Microextração em Fase Sólida

A Microextração em Fase Sólida (Solid Phase Microextration – SPME) é uma microtécnica de extração e concentração de analitos, que apresenta várias vantagens com relação aos métodos convencionais de extração, incluindo o rápido processo operacional, possibilidade de automação, reutilização das fibras extratoras e uso sem solventes orgânicos (em Cromatografia Gasosa) ou diminuta quantidade de solventes orgânicos (em Cromatografia Líquida) 45,46. O dispositivo básico de SPME consiste geralmente de uma fibra de sílica fundida de 10 mm de comprimento e de 110 a 160 μm de diâmetro, recoberta com polímeros sorventes ou sólidos adsorventes, com espessuras de 7 a 100 μm[46].

Existem outras configurações da SPME (Figura 4), como o uso de um segmento de um tubo capilar de Cromatografia Gasosa (Gas Chromatography – GC) associado a um sistema de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (High Performance Liquid Chromatography – HPLC), caracterizando o sistema de extração no tubo (in-tube SPME) (Figura 5).

Scientia Chromatographica 2015; 7(1):31-52 39

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A SPME baseia-se no processo de equilíbrio entre fases, tendo duas etapas: a partição dos analitos entre o recobrimento polimérico da fibra e a amostra, seguida pela dessorção do extrato concentrado dentro do instrumento analítico. No primeiro passo, a fibra recoberta é exposta dentro da amostra, o que faz com

Análise cromatográfica de OTA

que os analitos de interesse saiam da matriz e sejam absorvidos ou adsorvidos pelo polímero que recobre a fibra. No segundo passo, a fibra, tendo os analitos concentrados é transferida para um instrumento para dessorção, onde a separação e quantificação do analito ocorre[49].

A SPME é uma técnica de extração que apresenta inúmeras vantagens em relação às técnicas convencionais, das quais se destacam: fácil manipulação, elevada sensibilidade e reprodutibilidade, extração altamente seletiva, versatilidade, tempo de extração relativamente curto, não requerer etapas prévias de limpeza da amostra, permite que a análise seja facilmente automatizada em combinação com vários tipos de equipamentos como (GC, HPLC, LC-MS etc.)[50].

Figura 4. Configurações da SPME[47].

O primeiro trabalho sobre a determinação de OTA, simultaneamente com outros compostos, utilizando a SPME foi publicado em 2003[51] sendo, portanto, uma técnica recente. Na Tabela 9 são apresentados

Figura 5. Sistema in-tube SPME em ciclos aspirar/dispensar. a) Posição carregar (extração); b) Posição injetar (dessorção)[48].

40

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os trabalhos publicados nos anos de 2006 a 2012 que utilizam SPME como preparo de amostra para a análise de OTA nas matrizes alimentícias.

A maioria dos trabalhos que utilizam SPME para a extração e pré-concentração de OTA usam a SPME convencional (fibra com recobrimento polimérico), sendo a fase extratora mais comum, nesse caso, a dimetilpolisiloxano/divinilbenzeno (PDMS/DVB) [52-54] . Existe somente um trabalho relatando o uso do sistema in-tube SPME no modo de operação em ciclos aspirar/dispensar, o qual utiliza uma coluna de GC do tipo tubular aberta com camada porosa (Porous Layer Open Tubular – PLOT)[55]. Nesse trabalho, também foram testadas colunas do tipo tubular aberta com parede recoberta (Wall Coated Open Tubular – WCOT), porém essas apresentaram menor recuperação do analito, por terem menor área superficial para a extração quando comparadas com a coluna PLOT. Apesar de ser uma microtécnica de preparo de amostra bastante importante para análises ambientais, a SPME ainda não é muito utilizada para a determinação de OTA em matrizes alimentícias. O uso do MIP para SPME, seja na forma convencional ou in-tube, agregaria seletividade à todas as vantagens que a microtécnica oferece podendo tornar-se, no futuro, uma forma imbatível de preparo de amostra, tanto do ponto de vista analítico quanto ambiental, para esse tipo de determinação.

2.1.3.2. Microextração Líquido-Líquido Dispersiva

A Microextração Líquido-Líquido Dispersiva (Dispersive Liquid Liquid Microextraction – DLLME)

é uma microtécnica de extração de pré-concentração de analitos a qual utiliza um solvente dispersor, miscível no solvente extrator (fase orgânica) e na amostra (fase aquosa), bem como um solvente extrator, imiscível na fase aquosa, sendo baseada em um sistema ternário de solventes[57].

O solvente dispersor e extrator são injetados rapidamente na amostra aquosa, formando finas gotas que são dispersadas na fase aquosa, formando uma nuvem, o que aumenta a área superficial onde ocorre a partição dos analitos. Desta forma, o equilíbrio é atingido rapidamente e a extração é quase instantânea, em uma só etapa, diferentemente da Extração Líquido- Líquido (Liquid Liquid Extraction – LLE). Depois da extração, a mistura é centrifugada e as finas gotas do solvente extrator se depositam no fundo do tubo, podendo ser injetados diretamente no sistema cromatográfico[57,58] (Figura 6).

Como nessa microtécnica o volume do solvente extrator é bem menor do que o volume da amostra, o fator de préconcentração é alto, sendo sua principal vantagem[58].

Além disso, atende aos requisitos de miniaturização, baixo custo, rapidez e eficiência de extração e com alto potencial para aplicação direta em campo[57].

Os primeiros trabalhos sobre a determinação de OTA em alimentos por DLLME começaram a serem publicados no ano de 2011[59], sendo, portanto, uma técnica muito recente. Na Tabela 10 são apresentadas algumas aplicações da DLLME nos anos de 2011 até o momento na análise de OTA em alimentos.

Na maioria das aplicações, o solvente extrator que apresentou o melhor resultado é o clorofórmio. Para

Tabela 9. Aplicações de SPME para extração de OTA em alimentos nos anos de 2006 a 2012.

a

Matriz

Recuperaçãoa (%)

Fase extratora

Referência

Cerveja

92,8 % > 80 % ~ 93 %

PDMS/DVB PDMS/DVB PDMS/DVB Carboxen-1006 PLOT (in-tube SPME) Fibra de carbono

[52] [53] [54]

Grão de café verde Vinho Grãos e Castanhas Queijo

para diferentes níveis de spiking.

[55] [56]

Scientia Chromatographica 2015; 7(1):31-52 41

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a injeção direta no sistema cromatográfico, o solvente extrator deve ser compatível com o mecanismo de separação sendo, no caso, incompatível com o mecanismo

de fase reversa[58]. No caso da análise da OTA, a maioria das publicações utiliza fase reversa, como será discutido adiante. Sendo assim, o extrato concentrado obtido

Figura 6. Diagrama simplificado das etapas da DLLME[57].

Tabela 10. Aplicações da DLLME na determinação de OTA nos anos de 2011 até o momento;[HMIM][PF6] = Hexafluorofosfato de 1-hexil-3metilimidazol.

a

Matriz

Solvente extrator (volume e/ou massa)

Solvente dispersor (volume)

Recuperaçãoa (%)*

Fator de pré concentração

Referência

Vinho

CHCl3 (100 μL)

Acetona (1,0 mL)

88

1,8

[59]

Vinho

[HMIM][PF6] (100 mg)

MeOH (700 μL)

81,3 – 94,2

5

[60]

Vinho de arroz

[HMIM][PF6] (100 μL)

EtOH (1,0 mL)

75,9 – 82,1

30

[61]

Uva passa

CHCl3 (200 μL)

MeOH (800 μL)

68,6 – 85,2 b

-

[62]

Trigo, arroz e milho

C2H4Br2 (150 μL)

MeOH (600 μL)

81,2 – 90,8

9

[63]

Vinho

CHCl3 (660 μL)

ACN (940 μL)

91,7 – 98,1

5

[64]

Bebidas maltadas

CHCl3 (150 μL)

Acetona (400 μL)

104,0 – 108,4

-

[65]

para diferentes níveis de spiking; b Recuperação intra e inter dias.

42

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em clorofórmio pela DLLME não pode ser injetado diretamente no sistema cromatográfico, fazendose necessária a evaporação do solvente e sequente reconstituição em solvente adequado, geralmente na fase móvel.

a seletividade da extração e a sensibilidade pode ser melhorada pelo aumento da relação matriz/solvente na extração de matrizes sólidas. Com esse método, os autores obtiveram boa recuperação e fator de préconcentração igual a 9.

Uma maneira de superar esse problema é realizando a DLLME em fase reversa (RP - DLLME), trocando o solvente extrator orgânico por água. Dessa forma, depois da centrifugação, a água se deposita no fundo do tubo, tendo os analitos pré-concentrados e purificados, podendo ser injetada diretamente no sistema cromatográfico. Uma desvantagem dessa forma de extração é o uso de maior quantidade de solvente orgânico; porém, ainda assim, em quantidade bem menor que técnicas convencionais, como a LLE[58].

Apesar de ser ainda uma microtécnica muito recente na determinação de OTA em matrizes alimentícias, a DLLME pode tornar-se substituinte de métodos mais convencionais como a LLE, a qual utiliza grandes quantidades de solvente, além de ser menos laboriosa, uma vez que é realizada em somente uma etapa e é de simples realização.

Os Líquidos Iônicos (Ionic Liquids –ILs) começaram também a serem utilizados na DLLME na determinação de OTA em alimentos, substituindo os solventes extratores orgânicos clorados comumente utilizados, uma vez que são ambientalmente amigáveis[60]. Além disso, são compatíveis com o mecanismo de separação em fase reversa, sendo somente diluídos em solvente apropriado antes de serem injetados no sistema cromatográfico. Até o momento dessa publicação foram encontrados somente dois artigos utilizando a IL-DLLME paro o preparo de amostra visando a determinação de OTA em vinho e vinho de arroz[60,61], sendo que o último apresentou fator de concentração igual a 30.

Campone et al.[63] propuseram uma extração de OTA em cereais por DLLME controlada por pH em duas etapas. A OTA possui caráter ácido (pKa = 4,4) estando, portanto, ionizada em meio alcalino. Nessa condição, a solubilidade da OTA no solvente orgânico é diminuída e os interferentes da matriz (compostos hidrofóbicos) são concentrados no solvente extrator, caracterizando a primeira etapa. Na segunda etapa, o pH da solução aquosa é diminuído, deixando o analito na forma neutra, o que aumenta a sua solubilidade do solvente extrator orgânico, concentrando-o. Dessa forma, aumenta-se

2.2. Método de Separação e Detecção Dentre todas as técnicas cromatográficas disponíveis hoje, a Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (High Performance Liquid Chromatography – HPLC) é a mais utilizada como ferramenta de separação nas determinações de OTA em alimentos[16], sendo que esse quadro, até o ano de 2014, não sofreu grandes alterações[66]. Porém, é crescente o interesse na análise de multi-micotoxinas, na qual a OTA também é inclusa, além da grande variedade de alimentos que estão sendo estudados como sorgo, vinho comum e vinho de arroz, carne de porco e especiarias[66].

Nas aplicações das técnicas de preparo de amostra apresentadas neste trabalho, a maioria das análises de OTA por Cromatografia Líquida envolve o mecanismo de separação em Fase Reversa. Para isso, a fase estacionária comumente utilizada é a do tipo C-18[30,26,28,43], usada em colunas empacatodas, que pode ser considerada uma fase estacionária abrangente por ser utilizada para a análise de variados compostos. Na técnica de HPLC, o tipo de partícula mais usada nas aplicações estudadas são esféricas porosas de 4 – 5 μm[22-25,27,30,32,40-42,44,53,55,56,5961,63,64] . As colunas do tipo superficialmente porosas[43] (core-shell) e monolíticas[62,65] foram pouco utilizadas até o presente, mesmo em trabalhos mais recentes, como os utilizando a DLLME.

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As partículas do tipo superficialmente porosas, por terem o seu caminho de difusão diminuído, oferecem menor alargamento da banda, sendo bastante interessantes para a análise conjunta da OTA e outras micotoxinas. Para análises mais rápidas, as colunas monolíticas podem ser empregadas, uma vez que, com o aumento da permeabilidade, fluxos maiores de fase móvel podem ser utilizados, sem a perda de eficiência[67].

Na Figura 7 é apresentada uma ilustração das partículas porosas, superficialmente porosas, e monolitos utilizados na análise de OTA por HPLC. Como fase móvel, geralmente é utilizada uma mistura de Água, Acetonitrila e Ácido Acético na proporção de 49,5:49,5:1 (v /v/ v)[26,42,61] respectivamente, tendo apenas pequenas variações. Essa proporção é utilizada quando a análise é realizada no modo isocrático, sendo necessária a realização de gradiente de eluição quando a OTA é determinada simultaneamente com outros compostos. A adição de ácido ou de tampão ácido deve ser realizada, pois a OTA é um ácido orgânico fraco, tendo valor de pKa igual a 4,4 e 7,5 para o grupo carboxílico e fenólico, respectivamente[52]. Dessa forma, para que haja adequada retenção do analito na fase estacionária, a OTA deve estar na sua forma neutra, o que ocorre em pHs menores que 4,4 (Figura 8).

Análise cromatográfica de OTA

Na Figura 9 é apresentado um gráfico com a distribuição das técnicas cromatográficas utilizadas nas aplicações apresentadas neste artigo associadas às técnicas de preparo de amostra (IACs, MIP-SPE, SPME e DLLME) empregadas na determinação da OTA. Para a maioria das técnicas de preparo de amostras discutidas, a técnica cromatográfica mais utilizada é a HPLC, como esperado. Em técnicas mais recentes, como a SPME e a DLLME, o uso da Cromatografia Líquida de Ultra Alta Eficiência (Ultra High Performance Liquid Chromatography – UHPLC) ainda não foi descrito na literatura consultada. Porém, para técnicas de preparo de amostra mais consolidadas para a determinação de OTA, como as IACs e o MIP-SPE, a UHPLC foi utilizada, com partículas de fase estacionária apresentando diâmetro médio entre 1,7 e 1,9 μm[26,28,29,43]. Na técnica de DLLME, também fez-se uso da HPLC capilar, a qual oferece melhor resolução, limites de detecção mais baixos e menor consumo de solventes[60,64].

A UHPLC desenvolveu-se a partir do emprego de colunas com partículas de fase estacionária de tamanho menor ou igual à 2 μm (sub – 2 μm), baseando-se nos mesmos princípios de separação da HPLC. Com o uso de colunas com dimensões menores (5 – 10 cm

Figura 7. Ilustração das partículas porosas e superficialmente porosas e coluna monolítica.

44

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Análise cromatográfica de OTA

de comprimento e diâmetros internos de 1 – 2,1 mm), recheadas com partículas de diâmetro sub – 2 µm, as quais, juntamente com as altas velocidades lineares de

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fase móvel aumentam a resolução e a detectabilidade, diminuem o tempo das análises, porém geram um aumento significativo na pressão cromatográfica. Por

Figura 8. Equilíbrio ácido-base envolvendo a OTA.

Figura 9. Técnicas Cromatográficas mais utilizadas nos artigos apresentados como aplicações das técnicas de preparo de amostra até o momento, para as técnicas IACs, MIP-SPE, SPME e DLLME, respectivamente.

Scientia Chromatographica 2015; 7(1):31-52 45

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isso, é necessário o uso de um equipamento adequado para operar em altas pressões (1000 bar ~ 15000 psi)[68].

Talvez esse seja um dos motivos pelas quais essa técnica foi pouco utilizada nas aplicações discutidas neste trabalho, além de já estar bem estabelecido que o uso da técnica HPLC é suficiente para a determinação da OTA em alimentos.

O uso HPLC capilar, a qual utiliza colunas de diâmetro interno de 0,15 e 0,5 mm, permite grande economia de solventes, uma vez que operam em fluxos baixos (abaixo de 10 µL/min), melhora a sensibilidade quando utilizada com detectores baseados em sensibilidade de massa (UV-vis, fluorescência e massas), acopla-se com o detector de massas sem a necessidade do uso da interface do tipo Electrospray, além de outras vantagens. Apesar de ser uma técnica que permite uma melhoraria na sensibilidade da análise, característica muito desejável para a determinação da OTA, ela exige uma instrumentação ainda menos robusta, compete com

Análise cromatográfica de OTA

técnicas similares de separação, como a eletroforese capilar, e possui um número limitado de aplicações prática[69]. Dessa forma, a HPLC capilar também mostrou-se pouco utilizada para a determinação de OTA nas aplicações apresentadas nesse trabalho.

O detector mais utilizado para a análise de OTA é o Detector de Fluorescência (Fluorescence Detector – FLD)[16,66], uma vez que ele é mais sensível, alcançando limites de detecção mais baixos que o Detector de Massas, sendo ainda de fácil operação e menor custo[70], tornando-se ideal para esse tipo de análise devido à baixa concentração de OTA encontrada no alimentos. Para a análise utilizando o FLD, o comprimento de onda de excitação e emissão utilizados são 333 e 460 nm[32,40,43,54], tendo somente pequena variação nesses valores. Já quando se utiliza o Detector de Massas, o valor de m/z utilizado é 404, referente ao íon[M+H]+. Para a análise utilizando o Detector de Massas no modo sequencial (MS/MS), os fragmentos analisados mais abundantes

Figura 10. Detectores mais utilizados nos artigos apresentados como aplicações das técnicas de preparo de amostra até o momento, para as técnicas IACs, MIP-SPE, SPME e DLLME, respectivamente.

46

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Análise cromatográfica de OTA

são com valores de m/z igual a 358 e 239, referentes aos íons[M+H-fenilalanina]+ e[M+H-HCOOH]+[24,28,29,44,56,59].

Na Figura 10 é apresentando um gráfico com a distribuição dos detectores utilizados na aplicações apresentadas neste artigo para os preparos de amostra (IACs, MIP-SPE, SPME e DLLME) na determinação da OTA. O FLD foi utilizado em todas as aplicações discutidas nesse trabalho como detector padrão, sendo que para a técnica DLLME o Detector de Fluorescência Induzida por Laser (Laser Induced Fluorescence – LIF) foi utilizado juntamente a HPLC capilar[60,64]. Poucos foram os trabalhos que utilizaram Detectores de Massas juntamente com as técnicas IACs, SPME e DLLME. Para os trabalhos que utilizam MIP-SPE, o Detector de Massas foi utilizada somente para confirmação dos resultados obtidos pelo FLD[43,44].

Brera et al. realizou um estudo comparativo na determinação de OTA em presunto curado utilizando as técnicas HPLC-FLD (método 1) e UPLC-MS/MS (método 2). No primeiro método, a extração da OTA foi realizada utilizando uma IAC e o no segundo, o extrato do presunto curado foi diretamente injetado no sistema cromatográfico. O dois métodos mostraram-se adequados para a determinação de OTA, porém o método utilizando a técnica HPLC-FLD apresentou limites de detecção e quantificação menores que os apresentados pela técnica UPLC-MS/MS, uma vez que a etapa de purificação pelo uso da IAC permitiu a separação entre o analito e os interferentes da matriz. O método 1 também mostrou melhores exatidão e precisão. Por outro lado, o método 2 apresentou a vantagem e ser mais rápido e mais barato, uma vez que não foi necessário o uso da IAC. O autor conclui que a técnica HPLC-FLD é a melhor para atividades de controle de OTA, por ser menos afetada pelo efeito de matriz e leva a menores limites de detecção e quantificação, enquanto que para pesquisa e estudos de monitoramento, o uso do espectrômetro de massas é mais indicado pela economia de tempo por análise[71].

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O uso do detector de fluorescência é suficiente para a análise de OTA em alimentos de modo singular sendo, geralmente, acompanhada por um preparo de amostra eficiente, o qual permite a purificação e a préconcentração da amostra. Quando utilizado um preparo de amostra eficiente, o uso do detector de massas não se faz necessário, uma vez que o detector de fluorescência oferece resultados adequados. Porém, quando o preparo de amostra não é altamente eficiente ou quando não se faz um preparo de amostra, o detector de massas tem papel fundamental para a correta identificação e quantificação do analito estudado. Também, o detector de massas é bastante importante quando a análise envolve multimicotoxinas.

3. Conclusões

Tendo em vista as técnicas de preparo de amostra discutidas, as quais são técnicas consolidadas (IACs e MIP-SPE) ou não (SPME e DLLME) para a análise de OTA em alimentos, pode-se dizer que o método de separação e detecção mais largamente utilizado para tal é a HPLC-FLD. Mesmo sendo o Detector de Massas uma ferramenta poderosa, a fluorescência natural da OTA permite que ela seja detectada de forma adequada e eficiente por um equipamento mais simples e com sensibilidade necessária para a detecção da OTA em níveis muito baixos.

As técnicas miniaturizadas de preparo de amostras discutidas no presente trabalho apresentam grande perspectiva de utilização no preparo de amostras para análise de OTA. Dentre suas principais vantagens destacam-se a menor (ou nenhuma) quantidade de solvente, menor exposição do analista a solventes tóxicos, maior rapidez na análise, maior facilidade de automação e custo menor por análise. Entretanto, essas técnicas ainda não ganharam popularidade na área, apesar de existirem alguns trabalhos publicados empregando-as.

Uma das possíveis razões é o fato de que algumas dessas técnicas foram desenvolvidas recentemente (última década) e ainda não possuem grande disseminação entre os analistas. Adicionalmente, como a área de segurança

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alimentar é bastante regulada por guias e legislações, é necessário um reconhecimento dos órgãos internacionais da área para que os métodos novos propostos tenham grande aceitação.

Situação similar ocorre com relação aos modos e colunas cromatográficas e detectores. Em praticamente todos os casos a análise de OTA nas mais diversas matrizes tem sido executada através de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). Apesar da comprovada superioridade de colunas mais contemporâneas como as baseadas em partículas superficialmente porosas (“core shell” ou similares), U-HPLC, monólitos e outras, a análise de OTA ainda é quase que exclusivamente efetuada, com raras exceções, empregando-se colunas com partículas de diâmetro tradicional (usualmente 5 mícrons) empacotadas em tubos de diâmetro interno de 4 ou 4,6 mm. A detecção é efetuada, em praticamente

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todos os casos, com o uso de um detector convencional de fluorescência. Espera-se que, com a divulgação de outras possibilidades e o espírito de investigação dos químicos analíticos de alimentos, em breve tanto a etapa de preparo de amostras quanto a de separação cromatográfica incorporem estas inovações já amplamente empregada em outras áreas, notadamente na de análise de fármacos em fluidos biológicos, por exemplo. Idealmente, que se faça a unificação dos dois procedimentos, com a utilização de métodos “on-line”, ou seja, preparo de amostra-análise cromatográfica. Mas esta é outra história, para o futuro.

Agradecimentos

Os autores agradecem ao CNPq pela bolsa de estudos para M.A.A. (Proc. 132224/2014-3), assim como o apoio financeiro da FAPESP (2014/07347-9) e CNPq (Proc. 307293/2014-9).

Referências

48

1.

TURNER, N. W.; SUBRAHMANYAM, S.; PILETSKY, S. A. Analytical methods for determination of mycotoxins: A review.

Analytica Chimica Acta, v. 632, p.168–180, 2009. http://dx.doi.org/10.1016/j.aca.2008.11.010

2.

IAMANAKA, B. T.; OLIVEIRA, I. S.; TANIWAKI, M. H. Micotoxinas em Alimentos. Anais da Academia Pernambucana de Ciência Agronômica, Recife, v. 7, p.138-161, 2010.

3.

FOOD INGREDIENTS BRASIL. Revista Oficial da Food Ingredients South America. As Micotoxinas, Food Ingredients Brasil, n 7, p. 32-40, 2009.

4.

MILANI, J. M. Ecological conditions affecting mycotoxin production in cereals: a review. Veterinarni Medicina, v.58, n. 8, p. 405–411, 2013.

5.

KHOURY, A.; ATOUI, A. Ochratoxin A: General Overview and Actual Molecular Status. Toxins, v.2, p. 461-493, 2010. http://dx.doi.org/10.3390/toxins2040461

6.

NOGUEIRA, S.; OLIVEIRA, M. B. B. P. Prevalência de ocratoxina A em alimentos e consequentes problemas de segurança alimentar. Revista da Sociedade Portuguesa de Ciências da Nutrição e Alimentação, v. 12, n. 2, p. 69-75, 2006.

7.

PRELLE, A.; SPADARO, D.; DENCA, A.; GARIBALDI, A.; GULLINO, M. L. Comparison of Clean-Up Methods for Ochratoxin A on Wine, Beer, Roasted Coffee and Chili Commercialized in Italy. Toxins, v. 5, p. 1827-1844; 2013. http://dx.doi.org/10.3390/toxins5101827

8.

VARGAS, J.; KOZAKIEWICZ, Z. Ochratoxin A in grapes and grape-derived products. Trends in Food Science & Technology, v.17, p. 72–81, 2006. http://dx.doi.org/10.1016/j.tifs.2005.10.007

9.

MATEO, R.; MEDINA, A.; MATEO, E. M.; MATEO, F.; JIMÉNEZ, M. An overview of Ochratoxin A in beer and wine.

International Journal of Food Microbiology, v. 119, p. 79-83, 2007. http://dx.doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2007.07.029 Scientia Chromatographica 2015; 7(1):31-52

Análise cromatográfica de OTA

Andrade MA, Lanças FM

10. BULLERMAN, L.; BIANCHINI, A. Stability of mycotoxins during food processing. International Journal of Food Microbiology, v. 119, p. 140–146, 2007. http://dx.doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2007.07.035 11. IARC – Internacional Agency for Research on Cancer. IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans.

Volume 56. Some naturally occurring substances: Food items and constituents, Heterocyclic Aromatic Amines and Mycotoxins, 1993.

12. HOPE, J.; HOPE, B. E. A Review of the Diagnosis and Treatment of Ochratoxin A Inhala-tional Exposure Associated with Human Illness and Kidney Disease including Focal Segmental Glomerulosclerosis. Journal of Environmental and Public Health, v. 2012, p. 1-10, 2012. http://dx.doi.org/10.1155/2012/835059 13. WU, F.; BUI-KLIMKE, T.; SHIELDS, K. N. Potential economic and health impacts of ochratoxin A regulatory standards.

World Mycotoxin Journal, v. 7, n. 3, p. 387-398, 2014. http://dx.doi.org/10.3920/WMJ2013.1686 14. DIÁRIO OFICIAL DA UNIÃO. RESOLUÇÃO - RDC No - 7, DE 18 DE FEVEREIRO DE 2011 Dispõe sobre limites máximos tolerados (LMT) para micotoxinas em alimentos, 2011.

15. Official Journal of the European Union. COMMISSION REGULATION (EC) No 1881/2006 of 19 December 2006 setting maximum levels for certain contaminants in foodstuffs, 2006.

16. BERTHILLER, F.; BURDASPAL, P.A.; CREWS, C.; IHA, M.H.; KRSKA, R.; LATTANZIO, V.M.T.; MACDONALD, S.; MALONE, R.J.; MARAGOS, C.; SOLFRIZZO, M.; STROKA, J.; WHITAKER, T.B. Developments in mycotoxin analysis: an update for 2012-2013. World Mycotoxin Journal, v.7, n. 1, p. 3-33, 2014. http://dx.doi.org/10.3920/WMJ2013.1637 17. KRSKA, R.; SCHUBERT-ULLRICH, P.; MOLINELLI, A.; SULYOK, M.; MACDONALD, S.; CREWS, C. Mycotoxin analysis: An update. Food Additives & Contaminants: Part A, v. 25, n. 2, p. 152–163, 2008. http://dx.doi. org/10.1080/02652030701765723 18. LI, W.; POWERS, S.; DAI, S.Y. Using commercial immunoassay kits for mycotoxins: ‘joys and sorrows’?. World Mycotoxin Journal; v. 7, n. 4, p. 417-430, 2014. http://dx.doi.org/10.3920/WMJ2014.1715 19. SENYUVA, H. Z.; GILBERT, J. Immunoaffinity column clean-up techniques in food analysis: A review. Journal of Chromatography B, v. 878, p. 115–132, 2010. http://dx.doi.org/10.1016/j.jchromb.2009.05.04 20. ABD-ELGHANY, S. M.; SALLAM, K. I. Rapid determination of total aflatoxins and ochratoxins A in meat products by immuno-affinity fluorimetry. Food Chemistry, v. 179, p. 253–256, 2015. http://dx.doi.org/10.1016/j.foodchem.2015.01.140 21. CIGIĆ, I. K.; PROSEN, H. An Overview of Conventional and Emerging Analytical Methods for the Determination of Mycotoxins. International Journal of Molecular Sciences, v. 10, p. 62-115, 2009. http://dx.doi.org/10.3390/ijms10010062 22. KARA, G. N.; OZBEY, F.; KABAK, B. Co-occurrence of aflatoxins and ochratoxin A in cereal flours commercialised in Turkey. Food Control, v. 54, p. 275-281, 2015.. http://dx.doi.org/10.1016/j.foodcont.2015.02.014 23. AINIZA, W. M. W.; JINAP, S.; SANNY, M. Simultaneous determination of aflatoxins and ochratoxin A in single and mixed spices. Food Control, v. 50, p. 913-918, 2015. http://dx.doi.org/10.1016/j.foodcont.2014.10.051 24. BERTUZZI, T.; RASTELLI, S.; PIETRI, A. Aspergillus and Penicillium toxins in chestnuts and derived products produced in Italy. Food Control, v. 50, p. 876-880, 2015. http://dx.doi.org/10.1016/j.foodcont.2014.10.047 25. STEFANO, V.; PITONZO, R.; AVELLONE, G.; FIORE, A.; MONTE, L.; OGORKA, A. Z. T. Determination of Aflatoxins and Ochratoxins in Sicilian Sweet Wines by High-Performance Liquid Chromatography with Fluorometric Detection and Immunoaffinity Cleanup. Food Analytical Methods, v. 8, p. 569–577, 2015. http://dx.doi.org/10.1007/s12161-014-9934-3 26. NGUYEN, K. T. N.; RYU, D. Concentration of ochratoxin A in breakfast cereals and snacks consumed in the United States.

Food Control, v. 40, p. 140-144. 2014. http://dx.doi.org/10.1016/j.foodcont.2013.11.041 27. IHA, M. H.; BARBOSA, C. B.; HECK, A. R.; TRUCKSESS, M. W. Aflatoxin M1 and ochratoxin A in human milk in Ribeirão Preto-SP, Brazil. Food Control, v. 40, p. 310-313, 2014. http://dx.doi.org/10.1016/j.foodcont.2013.12.014 Scientia Chromatographica 2015; 7(1):31-52 49

Andrade MA, Lanças FM

Análise cromatográfica de OTA

28. MENG, H.; WANG, Z.; SAEGER, S.; WANG, Y.; WEN, K.; ZHANG, S.; SHEN, J. Determination of Ochratoxin A in Cereals and Feeds by Ultra-performance Liquid Chromatography Coupled to Tandem Mass Spectrometry with Immunoaffinity Column Clean-up. Food Analytical Methods, v. 7, p. 854–864, 2014.. http://dx.doi.org/10.1007/s12161-013-9692-7 29. XUE, XF.; SELVARAJ, J. N.; ZHAO, L.; DONG, H.; LIU, F.; LIU, Y.; LI, Y. Simultaneous Determination of Aflatoxins and Ochratoxin A in Bee Pollen by Low-Temperature Fat Precipitation and Immunoaffinity Column Cleanup Coupled with LC‑MS/MS. Food Analytical Methods, v. 7, p. 690–696, 2014. http://dx.doi.org/10.1007/s12161-013-9723-4 30. CASAL, S.; VIEIRA, T.; CRUZ, R.; CUNHA, S. C. Ochratoxin A in commercial soluble coffee and coffee substitutes. Food Research International, v. 61, p. 56–60, 2014. http://dx.doi.org/10.1016/j.foodres.2014.04.045 31. IRAM, W.; ANJUM, T.; ABBAS, M.; A. M. KHAN, A. M. Aflatoxins and ochratoxin A in maize of Punjab, Pakistan. Food Additives & Contaminants: Part B, v. 7, n. 1, 57–62, 2014. http://dx.doi.org/10.1080/19393210.2013.843205 32. GALARCE-BUSTOS, O.; ALVARADO, M.; VEGA, M.; ARANDA, M. Occurrence of ochratoxin A in roasted and instant coffees in Chilean Market. Food Control, v.46, p. 102-107. 2014. http://dx.doi.org/10.1016/j.foodcont.2014.05.014 33. LEITNER, A.; ZOLLNER, P.; PAOLILLO, A.; STROKA, J.; PAPADOPOULOU-BOURAOUI, A.; JABOREK, S.; ANKLAM, E.; LINDNER, W. Comparison of methods for the determination of ochratoxin A in wine. Analytica Chimica Acta, v. 453, p. 33–41, 2002. http://dx.doi.org/10.1016/S0003-2670(01)01483-0 34. SONG, X.; XU, S.; CHEN, L.; WEI, Y.; XIONG, H. Recent Advances in Molecularly Imprinted Polymers in Food Analysis.

Journal of Applied Polymer Science, v. 131, n. 16, 2014. http://dx.doi.org/10.1002/app.40766 35. POLYINTELL. Solid Phase Extraction Catalog. Q4 2013. 10p.

36. SANTOS, M. G.; ABRÃO, L. C. C.; FREITAS, L. A. S.; MORAES, G. O. I.; LIMA, M. M.; FIGUEIREDO, E. C. Emprego de polímeros de impressão molecular em preparo de amostras para análise de compostos orgânicos: aplicações e tendências.

Scientia Chromatographica; v. 4, n. 3, p.161-195, 2012. http://dx.doi.org/10.4322/sc.2012.012 37. CICHNA-MARKL, M. New strategies in sample clean-up for mycotoxin analysis. World Mycotoxin Journal, v. 4 n. 3, p. 203‑215, 2011. http://dx.doi.org/10.3920/WMJ2010.1280 38. JODLBAUER, J.; MAIER, N. M.; LINDNER, W. Towards ochratoxin A selective molecularly imprinted polymers for solidphase extraction. Journal of Chromatography A, v.945, p. 45-63, 2002. http://dx.doi.org/10.1016/S0021-9673(01)01504-7 39. MAIER, N. M.; BUTTINGER, G.; WELHARTIZKI, S.; GAVIOLI, E.; LINDNER, W. Molecularly imprinted polymerassisted sample clean-up of ochratoxin A from red wine: merits and limitations. Journal of Chromatography B, v. 804, p. 103‑111. 2004. http://dx.doi.org/10.1016/j.jchromb.2004.01.014 40. GIOVANNOLI, C.; PASSINI, C.; NARDO, F.; ANFOSSI, L.; BAGGIANI, C. Determination of Ochratoxin A in Italian Red Wines by Molecularly Imprinted Solid Phase Extraction and HPLC Analysis. Journal of Agricutural and Food Chemistry, v. 62, p. 5220−5225, 2014. http://dx.doi.org/10.1021/jf5010995 41. VIDAL, J. C.; DUATO, P.; BONEL, L.; CASTILLO, J. R. Molecularly Imprinted on-line Solid-Phase Extraction coupled with Fluorescence detection for the determination of Ochratoxin a in wheat samples. Analytical Letters, v. 45, p. 51–62, 2012. http:// dx.doi.org/10.1080/00032719.2011.565449 42. ALI, W. H.; DERRIEN, D.; ALIX, F.; PÉROLLIER, C.; LÉPINE, O.; BAYOUDH, S.; CHAPUIS-HUGON, F.; PICHON, V. Solid-phase extraction using molecularly imprinted polymers for selective extraction of a mycotoxin in cereals. Journal of Chromatography A, v. 1217, p. 6668–6673, 2010. http://dx.doi.org/10.1016/j.chroma.2010.04.071 43. CAO, J.; ZHOU, S.; KONG, W.; YANG, M.; WAN, L.; YANG, S. Molecularly imprinted polymer-based solid phase cleanup for analysis of ochratoxin A in ginger and LC-MS/MS confirmation. Food Control, v. 33, p. 337-343, 2013. http://dx.doi. org/10.1016/j.foodcont.2013.03.023 50

Scientia Chromatographica 2015; 7(1):31-52

Análise cromatográfica de OTA

Andrade MA, Lanças FM

44. CAO, J.; KONG, W.; ZHOU, S.; YIN, L.; WAN, L.; YANG, M. Molecularly imprinted polymer-based solid phase clean-up for analysis of ochratoxin A in beer, red wine, and grape juice. Journal of Separation Science, v. 36, p. 1291–1297, 2013. http://dx.doi.org/10.1002/jssc.201201055 45. VALENTE, A. L. P.; AUGUSTO, F. Microextração por Fase Sólida. Química Nova, v. 23, n. 4, p. 523-530, 2000.

46. QUEIROZ, M. E. C.; LANÇAS, F. M. Análise de fármacos em material biológico: Acoplamento Microextração em Fase Sólida “no tubo” e Cromatografia Líquida de Alta Eficiência. Química Nova, v. 28, n. 5, p. 880-886, 2005.

47. PAWLISZYN, J. Theory of Solid-Phase Microextraction. Journal of Chromatographic Science, v. 38, p. 270-278, 2000.

48. KATAOKA, H.; ISHIZAKI, A.; NONAKA, Y.; SAITO, K. Developments and applications of capillary microextraction techniques: A review. Analytica Chimica Acta, v. 655, p. 8–29, 2009. http://dx.doi.org/10.1016/j.aca.2009.09.032 49. PAWLISZYN, J. Solid Phase Microextration: Theory and Practice. Canadá: Wiley-VCH, 1997.

50. ROCHA, S. M.; SALVADOR, A. C.; MARTINS, C.; BARBOSA, C.; SANTOS, M.; PETRONILHO, S. Microextração em fase sólida e cromatografia de gás: Uma combinação de elevado potencial. Scientia Chromatographica; v. 5, n. 4, p. 284-300, 2013. http://dx.doi.org/10.4322/sc.2014.011 51. ARESTA, A.; CIOFFI, N.; PALMISANO, F. ; ZAMBONIN, C.G. Simultaneous determination of ochratoxin A and cyclopiazonic, mycophenolic, and tenuazonic acids in cornflakes by solid-phase microextraction coupled to highperformance liquid chromatography. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 51, n. 18, p. 5232-5237, 2003. http://dx.doi.org/10.1021/jf034385r 52. ARESTA, A.; PALMISANO, F.; VATINNO, R.; ZAMBONIN, C. G. Ochratoxin A Determination in Beer by SolidPhase Microextraction Coupled to Liquid Chromatography with Fluorescence Detection: A Fast and Sensitive Method for Assessment of Noncompliance to Legal Limits. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 54, p. 1594-1598, 2006. http://dx.doi.org/10.1021/jf052666o 53. VATINNO, R.; ARESTA, A.; ZAMBONIN, C. G.; PALMISANO, F. Determination of Ochratoxin A in green coffee beans by solid-phase microextraction and liquid chromatography with fluorescence detection. Journal of Chromatography A, v. 1187 145–150, 2008. http://dx.doi.org/10.1016/j.chroma.2008.02.020 54. ARESTA, A.; VATINNO, R.; PALMISANO, F.; ZAMBONIN, C. G. Determination of Ochratoxin A in wine at sub ng/ mL levels by solid-phase microextraction coupled to liquid chromatography with fluorescence detection. Journal of Chromatography A, v. 1115, p. 196–201, 2006. http://dx.doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.092 55. SAITO, K.; IKEUCHI, R.; KATAOKA, H. Determination of ochratoxins in nuts and grain samples by in-tube solid-phase microextraction coupled with liquid chromatography–mass spectrometry. Journal of Chromatography A, v. 1220, p. 1-6, 2012. http://dx.doi.org/10.1016/j.chroma.2011.11.008 56. ZHANG, X.; CUDJOE, E.; VUCKOVIC, D.; PAWLISZYN, J. Direct monitoring of ochratoxin A in cheese with solidphase microextraction coupled to liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography A, v. 1216, p. 7505–7509, 2009. http://dx.doi.org/10.1016/j.chroma.2009.03.009 57. MARTINS, M. L.; PRIMEL, E. G.; CALDAS, S. S.; PRESTES, O. D.; ADAIME, M. B.; ZANELLA, R. Microextração Líquido-Líquido Dispersiva (DLLME): fundamentos e aplicações. Scientia Chromatographica, v. 4, n. 1, p. 35-51, 2012. http://dx.doi.org/10.4322/sc.2012.004 58. VIÑAS, P.; CAMPILLO, N.; LÓPEZ-GARCÍA, I.; HERNÁNDEZ-CÓRDOBA, M. Dispersive liquid–liquid microextraction in food analysis. A critical review. Analytical and Bioanalytical Chemistry, v. 406, p. 2067–2099, 2014. http://dx.doi.org/10.1007/s00216-013-7344-9 59. CAMPONE, L.; PICCINELLI, A. L.; RASTRELLI, L. Dispersive liquid–liquid microextraction combined with highperformance liquid chromatography–tandem mass spectrometry for the identification and the accurate quantification by isotope dilution assay of Ochratoxin A in wine samples. Analytical and Bioanalytical Chemistry, v. 399, p. 1279–1286, 2011. http://dx.doi.org/10.1007/s00216-010-4347-7 Scientia Chromatographica 2015; 7(1):31-52 51

Andrade MA, Lanças FM

Análise cromatográfica de OTA

60. ARROYO-MANZANARES, N.; GARCÍA-CAMPAÑA, A. M.; GÁMIZ-GRACIA, L. Comparison of different sample treatments for the analysis of ochratoxin A in wine by capillary HPLC with laser-induced fluorescence detection. Analytical and Bioanalytical Chemistry, v. 401, p. 2987–2994, 2011. http://dx.doi.org/10.1007/s00216-011-5387-3 61. LAI, X.; RUAN, C.; LIU, R.; LIU, C. Application of ionic liquid-based dispersive liquid–liquid microextraction for the analysis of ochratoxin A in rice wines. Food Chemistry, v. 161, p. 317–322, 2014. http://dx.doi.org/10.1016/j.foodchem.2014.04.033 62. KARAMI-OSBOO, R.; MIRI, R.; JAVIDNIA, K.; KOBARFARD, F.; ALIABADI, M. H. S.; MAHAM, M. A validated dispersive liquid-liquid microextraction method for extraction of ochratoxin A from raisin samples. Journal of Food Science and Technology, v. 52, n. 4, p. 2440–2445, 2015. http://dx.doi.org/10.1007/s13197-013-1215-4 63. CAMPONE, L.; PICCINELLI, A. L.; CELANO, R.; RASTRELLI, L. pH-controlled dispersive liquid–liquid microextraction for the analysis of ionisable compounds in complex matrices: Case study of ochratoxin A in cereals. Analytica Chimica Acta, v. 754, p. 61–66, 2012. http://dx.doi.org/10.1016/j.aca.2012.10.010 64. ARROYO-MANZANARES, N.; GÁMIZ-GRACIA, L.; GARCÍA-CAMPAÑA, A. M. Determination of ochratoxin A in wines by capillary liquid chromatography with laser induced fluorescence detection using dispersive liquid–liquid microextraction.

Food Chemistry, v. 135, p. 368–372, 2012. http://dx.doi.org/10.1016/j.foodchem.2012.05.009 65. MAHAM, M.; KIAROSTAMI, V.; WAQIF-HUSAIN, S.; KARAMI-OSBOO, R.; MIRABOLFATHY, M. Analysis of Ochratoxin A in Malt Beverage Samples using Dispersive Liquid–Liquid Microextraction Coupled with Liquid Chromatography-Fluorescence Detection. Czech Journal of Food Sciences, v. 31, n. 5, p. 520–525, 2013. Disponível em: <http://www.agriculturejournals.cz/publicFiles/100651.pdf>. Acesso em 06/05/2015.

66. BERTHILLER, F.; BRERA, C.; CREWS, C.; IHA, M.H.; KRSKA, R.; LATTANZIO, V.M.T.; MACDONALD, S.; MALONE, R.J.; MARAGOS, C.; SOLFRIZZO, M.; STROKA, J.; WHITAKER, T.B. Developments in mycotoxin analysis: an update for 2013-2014. World Mycotoxin Journal, v. 8, n. 1, p. 5-36, 2015.. http://dx.doi.org/10.3920/WMJ2014.1840 67. LANÇAS, F. M. Estratégias para a diminuição do tempo de análise em Cromatografia Líquida Moderna. Scientia Chromatographica, v. 1, n. 4, p. 39-47, 2009.

68. MALDANER, L.; JARDIM, I. C. S. F. UHPLC – Uma abordagem atual: desenvolvimentos e desafios recentes. Scientia Chromatographica, v. 4, n. 3, p.197-207, 2012. http://dx.doi.org/10.4322/sc.2012.014 69. LANÇAS, F. M. Vantagens e Limitações da Miniaturização em Cromatografia Líquida. Scientia Chromatographica, v. 1, n. 3, p. 51‑60, 2009.

70. FRENETTE, C.; PAUGH, R. J.; TOZLOVANU, M.; JUZIO, M.; PFOHL-LESZKOWICZ, A.; MANDERVILLE, R. A. Structure–activity relationships for the fluorescence of ochratoxin A: Insight for detection of ochratoxin A metabolites.

Analytica Chimica Acta, v. 617, p. 153–161, 2008. http://dx.doi.org/doi:10.1016/j.aca.2007.12.030 71. BRERA, C.; PANNUNZI, E.; GUARINO, C.; DEBEGNACH, F.; GREGORI, E.; SANTIS, B. Ochratoxin A determination in cured ham by High Performance Liquid Chromatography Fluorescence Fetection and Ultra Performance Liquid Chromatography tandem Mass Spectrometry: A comparative study. Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies, v. 37, p. 2036‑2045, 2014. http://dx.doi.org/10.1080/10826076.2013.825859

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Scientia Chromatographica 2015; 7(1):31-52

Scientia Chromatographica 2015; 7(1):53-63 Instituto Internacional de Cromatografia http://dx.doi.org/10.4322/sc.2015.016 ISSN 1984-4433

CROMATOGRAFIA LÍQUIDA

Determinação de açúcares em suco concentrado e néctar de uva: comparativo empregando refratometria, espectrofotometria e cromatografia líquida Comparative assessment of sugar in concentrated and nectar grape juices by refractometry, spectrophotometry and chromatography

Bárbara Sthéfani Caldas Leonel Vinicius Constantino Cyntia Helena Gomes Alves Silva Tiago Bervelieri Madeira Suzana Lucy Nixdorf* Laboratório DIA, Depto. de Química, Universidade Estadual de Londrina (UEL), Rodovia Celso Garcia Cid - Pr 445 Km 380, s/n, 86057-970, Londrina-PR, Brasil *e-mail: snixdorf@uel.br Recebido: 02/07/2015 Aceito: 31/07/2015

Scientia Chromatographica 2015; 7(1)

Resumo

O crescimento significativo na produção e consumo de sucos demanda métodos de controle, capazes de mensurar a proporção da fruta e de açúcares, em cada tipo de produto. Pelos direitos básicos dos consumidores, informações sobre a composição e riscos, devem estar claras e adequadas nas embalagens. Apesar disto, frequentemente o brasileiro é confundido, á começar pela nomenclatura dos sucos. Pela legislação, os sucos - integral e concentrado devem conter 100% da fruta sem qualquer adição.

Já, o néctar, bebida pronta para o consumo, deve ser elaborado com um mínimo de 50% da fruta, adicionado de água, sacarose, acidulantes e conservantes. Portanto, este estudo objetivou verificar se as quantidades de açúcares totais dos sucos de uva - concentrado e néctar são comparáveis e concordantes, quando determinadas por 3 técnicas/métodos distintos – refratometria, espectrofotometria e cromatografia, verificando a sua aplicabilidade. A refratometria (RF), a mais aplicada no controle industrial, emprega a leitura direta do oBrix em refratômetro. A espectrofotometria mede glicose em 490 nm pelo método convencional fenol-sulfúrico (ESP-FS).

Enquanto, a cromatografia líquida de alta eficiência determina os teores de frutose, glicose e sacarose empregando detector por índice de refração (HPLC-RID). Para fins de comparação direta, a concentração dos açúcares totais por HPLC-RID foi obtida pela soma dos teores individuais dos carboidratos. A quantidade de açúcares totais média empregando RF, ESP-FS e HPLC-RID foi considerada semelhante (Tukey p<0,05) para o néctar (14,85±0,44 g 100 mL-1) e para o suco concentrado de uva (61,74±2,60 g 100 mL-1), excetuando o concentrado analisado por ESP-FS (80,47±8,6 g 100 mL-1). A menor variação dos teores foi observada por RF (0,5-3,0%), seguida por HPLC-RID (3,4-6,3%), com ESP-FS (8,4-17,2%) apresentando a maior dispersão. Desta forma, a RF provou ser adequada para a determinação rotineira dos açúcares totais, considerando sua precisão, praticidade e simplicidade de uso.

Entretanto, o HPLC-RID apresenta um diferencial adicional, além de fornecer o teor dos açúcares totais. Baseado no perfil cromatográfico possibilita distinguir entre sucos - integral ou concentrado, elaborados só com a fruta, pelas proporções de frutose e glicose encontradas naturalmente na própria uva, de produtos adicionado de sacarose, como o néctar. Este método consiste, portanto, em uma ferramenta alternativa que poderia ser utilizada em caso de suspeita de fraudes, para atestar a autenticidade e o cumprimento da legislação.

Palavras-chave: carboidratos, frutose, glicose, autenticidade, HPLC-RID. 53

Caldas BS et al.

Determinação de açúcares em suco concentrado e néctar de uva

Abstract

Significant growth in juices production and consumption demand control methods, capable to measure fruit and sugars proportions for each kind of product. Basic consumer rights, require clear and appropriate composition and risks information’s on packaging. Despite this, Brazilians are often misleader, starting with juice’s nomenclature. By law, whole and concentrate juices must contain 100% of fruit without any addition. On the other hand, nectar, beverage ready for consumption, should be elaborated with a minimum of 50% of fruit, by adding water, sucrose, acidifiers and preservatives. Therefore, this study aimed to verify whether total sugars amounts of concentrate and nectar grape juices are comparable and consistent, as determined by 3 different techniques/methods - refractometry, spectrophotometry and chromatography, checking their applicability. Refraction (RF), the most applied in industrial control, employs oBrix direct reading in refractometer. Spectrophotometry measures glucose at 490 nm by conventional phenol-sulfuric method (FS-ESP). While, high-performance liquid chromatography determines fructose, glucose and sucrose levels using a refractive index detector (RID-HPLC). For purposes of total sugars concentration direct comparison, HPLC-RID levels were obtained by the sum of individual carbohydrates. The average of total sugars amount employing RF, ESP-FS, HPLC-RID was considered similar (Tukey p <0.05) for nectar (14.85±0.44 g 100 mL-1) and concentrate grape juice (61.74±2.60 g 100 mL-1), except for concentrate analyzed by ESP-FS (80.47±8.6 g 100 mL-1). The smallest variation levels was observed

by RF (0.5 to 3.0%), followed by HPLC-RID (3.4 to 6.3%), with ESP-FS (8.4 to 17.2%) presenting the greatest dispersion. Thus, RF proved to be suitable for routine determination of total sugars, considering the precision, practicality and simplicity of use. HPLC-RID however has an additional differential besides providing total sugars content. Based on the chromatographic profile allows distinguishing between whole and concentrating juices, made only by fruit within fructose and glucose proportions naturally found in grape itself, from products added sucrose as nectar. This method consists therefore in an alternative tool that could be use in case of counterfeit suspected, to attest for authenticity and legislation compliance.

Keywords: carbohydrates, fructose, glucose, authenticity, HPLC-RID.

1. Introdução

A uva é considerada uma excelente fonte de vitaminas e minerais, conhecida como um dos melhores agentes naturais para prevenção do câncer[1].

Seus compostos bioativos, pela sua capacidade antioxidante atribuída aos flavonoides, reduzem os radicais livres protegendo contra o estresse oxidativo e doenças crônicas[2,3], cujo consumo da fruta e seus derivados garantem uma melhor qualidade de vida[4].

Já, as antocianinas (delfinidina, cianidina, petunidina, peonidina, malvidina) determinadas por LC-MS[5] e estabilizadas por ácidos orgânicos[6], além de auxiliarem na autenticidade varietal[7,8] constituem os principais responsáveis pela cor[9,10], atributo decisivo no consumo do suco[6].

características da casta, sendo neutros e sem graça, segundo Lona[11]. Já, os elaborados a partir de uvas americanas (Vitis labrusca L.) de cultivares como Isabel, Concord, Bordô e Seibel, normalmente utilizadas em cortes para garantir cor intensa, são extremamente ricos em aromas e gosto de uva. Por essa razão, o suco brasileiro é muito apreciado, porém raro, já que na grande maioria dos países produtores de uvas, o cultivo das espécies americanas é proibido. No entanto, o patrimônio vitícola da Serra Gaúcha é formado por 80% de uvas V. labrusca e 20% de V. viniferas[11]. Segundo a avaliação setorial de 2013 foram processados 536,7 milhões de quilos de uvas V. labrusca contra apenas 73,8 de V. viniferas no Rio Grande do Sul[12].

No cenário brasileiro, os sucos de uva são de grande importância pelo volume comercializado. Os sucos elaborados com uvas finas de origem europeia (Vitis viniferas) como ‘Chardonnay’, ‘Riesling’, ‘Merlot’ e ‘Cabernet Sauvignon’, não apresentam as

As exportações de suco de uva concentrado em 2013 tiveram expansão de 110,4% em valor e 84% em volume, com a remessa de 1,78 milhões de quilos frente ao mesmo período de 2012. O Japão se manteve como principal destino do produto, representando 87,4%

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Scientia Chromatographica 2015; 7(1):53-63

Determinação de açúcares em suco concentrado e néctar de uva

do volume total comercializado pelo Brasil, com alta de 79% frente á 2012. Apesar da menor proporção de crescimento para o suco de uva pronto para consumo, este vem ganhando espaço no mercado internacional.

De janeiro a junho de 2013, foram exportados 139,5 mil quilos, alta de 883% em volume ou 9,8 vezes, um incremento de 1.102% ou 12 vezes em relação á 2012.

Três destinos concentraram 99,5% do volume exportado, sendo eles Venezuela, Líbia e Paraguai[12].

A comercialização de sucos de uva no mercado interno vem mantendo o desempenho positivo. O maior destaque ficou com os sucos prontos para consumo – os néctares que ampliaram a comercialização em 42,94%, um incremento de 9,97 milhões de litros em relação ao 1º sem/2012. O mercado do suco concentrado também registrou crescimento de 17,22%, com a venda de 2,5 milhões de quilos a mais que 2012[12]. Em 2014, os sucos de uva apresentaram incremento de produção de 10,85%, cabendo o maior aumento ao suco de uva integral (28,68%), enquanto o suco de uva concentrado teve aumento de 7%[13].

Entretanto, as denominações nos rótulos para os diferentes tipos de sucos comercializados no mercado interno, frequentemente induzem o consumidor á inferências errôneas, quanto á sua qualidade. Neste sentido, o Decreto 6.871[14] e a Instrução Normativa nº 12[15] definem o suco como a bebida não fermentada, obtida por processamento tecnológico a partir da fruta sã e madura. O suco integral deve ser composto de 100% da fruta; já, o suco concentrado é o produto parcialmente desidratado; enquanto, o suco denominado de adoçado, pode conter um máximo de 10% de adição de açúcar.

O néctar, por sua vez, é a bebida pronta para consumo, preparada pela adição de água e açúcar[14], elaborada com no mínimo 50% de suco ou polpa da fruta, segundo a IN nº 24/2012 do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento[16]. Portanto, faz-se necessário um controle dos produtos, a fim de cumprir a legislação, que exige cerca de 65 ºBrix de sólidos solúveis totais para o suco concentrado[17] e 14 ºBrix para o néctar[18].

Caldas BS et al.

Nas vinícolas, costuma-se controlar a concen­ tração de açúcar, o pH e a acidez total do suco[19]. A quantidade de sólidos solúveis (%/volume de mosto) pode ser determinada por métodos físicos não seletivos, como a refratometria medida em graus Brix[20]; ou pelo grau glucométrico medido em graus Babo, que determina a quantidade de açúcar em peso em 100 g de mosto (caldo da uva)[21]. Os poucos dados encontrados para sucos de uva elaborados com Vitis labrusca[22] seguem os protocolos analíticos estabelecidos no COMPENDIUM OF INTERNATIONAL METHODS OF ANALYSIS – International Organization of Vine and Wine[23]. A quantificação de açúcares redutores e totais em diferentes tipos de matrizes[24-26], por sua vez, pode ser mensurada por métodos químicos clássicos, fundamentados na redução dos íons cobre em meio alcalino (SomogyiNelson), ou na desidratação dos açúcares em ácido concentrado (fenol-sulfúrico), através da coloração de compostos orgânicos por espectrofotometria[20,27].

Sabe-se que nas frutas, os principais açúcares presentes são a frutose e a glicose, normalmente em partes iguais. No entanto, os açúcares diferem significantemente em doçura, influenciando diretamente no sabor e aroma da fruta e dos derivados[6]. Desta forma, um conhecimento da composição de açúcar (tipo e quantidade) possibilita a escolha mais adequada do cultivar de uva a ser empregada na elaboração dos sucos, dependendo dos atributos requeridos, como sabor, doçura e cor. A informação sobre a adição de sacarose, assim como os teores de glicose são cruciais para os diabéticos[6]. Desta forma, a determinação do tipo e concentração dos carboidratos nos alimentos é importante, visando fornecer as informações nutricionais e calóricas que são requeridas impressas nas embalagens; para o controle de qualidade de forma que assegure o cumprimento da legislação, identificando possíveis produtos adulterados[28]. Dentro da questão da rotulagem de alimentos, prevalece o princípio da “plena informação adequada e clara sobre os diferentes produtos e serviços, com especificação correta de quantidade, características, composição, qualidade, tributos incidentes e preço, bem

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Caldas BS et al.

como sobre os riscos que apresentem” (Redação dada pela Lei nº 12.741, de 2012) previsto no art. 3º o inciso III do art. 6º do Código de Defesa do Consumidor[29].

Uma técnica mais seletiva que representa um diferencial na quantificação de sacarose (açúcar nãoredutor), glicose e frutose (açúcares redutores), baseiase na cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), a qual foi empregada em análises de maça[6] e batata[30].

Para sucos de frutas, inclusive de uva, dois sistemas foram propostos por Zhang et al. (2015)[28]. Um primeiro utiliza coluna aniônica em meio básico com eletrodo de ouro e detecção pulso amperométrico (HPLC-HPAEPAD) efetuando-se apenas: diluição, filtração da amostra e injeção direta. E, um segundo que emprega coluna de interações hidrofílicas com detecção por aerossol carregado (HPLC-HILIC-CAD), detector universal para analitos não voláteis e semi-voláteis, que não exige derivatização.

Assim, devido à importância do comércio de sucos no cenário econômico brasileiro e mundial, este trabalho propõe a comparação entre técnicas que permitem determinar açúcares em matrizes alimentares - refratometria, espectrofotometria e cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE do inglês HPLC), aplicada á sucos comerciais concentrados e néctares de uva, visando encontrar técnica confiável e versátil para uso rotineiro no controle de qualidade e, que possibilite ainda fazer a distinção de produtos com açúcares naturais elaborados só com a fruta, dos adicionados.

2. Parte Experimental 2.1. Materiais

Doze amostras comerciais foram analisadas em duplicata. Destas, oito amostras eram de duas marcas distintas (4 do mesmo lote) de néctares comercias de uva, adquiridas em supermercado da cidade de Londrina (PR), e 4 amostras de suco de uva concentrado, foram cedidas por uma Cooperativa da região (PR). As amostras foram mantidas congeladas em freezer a - 12oC, visando manter as características do produto.

56

Determinação de açúcares em suco concentrado e néctar de uva

2.2. Reagentes

Foram utilizados padrões de sacarose (Synth, Diadema, Brasil), D(+) glicose e D(-) frutose (Merck, Darmstadt, Alemanha) com teores de pureza de 98,90 %, 99,50 % e 99,90 %, respectivamente. Devido à alta higroscopicidade dos carboidratos, os padrões foram mantidos em dessecador de vidro, com vácuo e pentóxido de fósforo (Merck, Darmstadt, Alemanha) tendo sido utilizados, somente depois de uma semana de dessecamento.

Os reagentes p.a. utilizados adquiridos da Prolab (São Paulo, Brasil) foram: ácido sulfúrico (Quimex, 97 %), fenol (Synth, 99 %), molibdato de amônio (Nuclear, 83 %), arseniato de sódio (Vetec, 98 %), carbonato de sódio (Synth, 99,5 %), tartarato de sódio e potássio (Merck, 99 %), sulfato de sódio (Vetec, 99 %), bicarbonato de sódio (Synth, 99,7 %) e sulfato de cobre pentaidratado (Nuclear, 98 %). A acetonitrila grau HPLC foi adquirida da J.T. Baker (Xalostoc, México).

A água ultrapura utilizada no preparo das soluções padrão e na extração foi produzida pelo Sistema Milli-Q® (Simplicity 185, Millipore, MA, EUA).

2.3. Determinação de açúcares 2.3.1. Refratometria

Foram realizadas leituras, em ºBrix, em refratômetro digital (ATAGO, Fukaya-shi, Japão, 0° a 93° Brix), colocando as amostras diretamente na célula do equipamento, após calibração com água. Os valores dados representam o teor de sólidos solúveis totais na amostra mensurados de acordo com a OIV (2012)[23].

2.3.2. Espectrofotometria

As análises espectrofotométricas foram realizadas em Espectrofotômetro (UVMini 1240 – Shimadzu, Quioto, Japão). A metodologia utilizada foi adaptada de Fournier (2001). O padrão estoque utilizado para construção da curva analítica, do método fenol-sulfúrico, foi feito com glicose nas concentrações de 20,0 a 100,0 µg L-1. A leitura foi feita em 490 nm.

Scientia Chromatographica 2015; 7(1):53-63

Determinação de açúcares em suco concentrado e néctar de uva

2.3.3. Cromatografia

Para a análise cromatográfica, os sucos concentrados e os néctares de uva foram diluídos em 50000 e 5000 vezes respectivamente, em água ultrapura.

As soluções foram filtradas em membrana de acetato de celulose 0,2 µm (φ13 mm, Sartorius Stedim Biotech, Alemanha) e injetadas no sistema cromatográfico em condições otimizadas.

Foi utilizado um sistema para cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC Série 10, Shimadzu, Quioto, Japão). As condições cromatográficas foram adaptadas de Druzian (2005). O sistema cromatográfico consistiu de uma bomba (LC-10 AT VP) com gerenciador de solventes quaternário (FCV-10AL VP), comandado pela interface (SCL-10A VP) e módulo de desgaseificação (DGU-14A).

A fase móvel usada foi uma mistura de acetonitrila: água 75:25 (v/v), na vazão de 1,0 mL min-1 empregando uma coluna Shim‑pack CLC‑NH2 (M) (4,6 x 250 mm, 5 µm, Shimadzu), mantida a 30 oC (CTO-10AS VP). O injetor manual Rheodyne 7125 continha alça de amostragem de 20,0 μL. A detecção foi feita em detector por índice de refração (RID-10A, Shimadzu) e a aquisição e integração dos picos utilizando software Class-VP. A identificação foi realizada baseando-se nos tempos de retenção e adição de padrões á amostra.

A quantificação foi feita por padronização externa utilizando-se curvas de calibração analíticas construídas a partir das áreas dos picos cromatográficos, empregandose 6 concentrações da mistura dos padrões. As curvas de calibração mostraram-se lineares (coeficiente de determinação R2 ≥ 0,99, para p < 0,001), em intervalos de concentração (faixas dinâmicas de trabalho) de 0,25 a 2,50 % (m/v) para frutose, glicose e sacarose. A concentração dos açúcares totais foi dada somando-se as áreas individuais de cada pico da corrida cromatográfica.

2.4. Análise estatística

Os resultados foram comparados dentro de cada categoria (sucos concentrados e néctares) e calculados os erros relativos. Para os néctares, também foi possível comparar os teores de açúcares totais encontrados com as

Caldas BS et al.

informações nutricionais impressas nas embalagens dos produtos. Os resultados dos teores de açúcares totais obtidos pelas 3 técnicas/métodos (RF, ESP-FS e HPLC-RID) foram submetidos à análise de variância (ANOVA), considerandose a amostra como causa de variação, e teste de Tukey em nível de 5% de significância (p ≤ 0,05), utilizando o Statistica 8.0 (Statsoft, EUA). Os tipos distintos de sucos de uva – concentrado e néctar, foram separados em grupos pela Análise de Agrupamento Hierárquico, enquanto os resultados similares e diferentes obtido pelos 3 métodos foram agrupados através da Análise de Componentes Principais, também feitas com o uso do Statistica.

3. Resultados e Discussão 3.1. Refratometria

As concentrações de açúcares totais por leitura em refratômetro estão apresentadas na Tabela 1. Estes valores foram corrigidos conforme a temperatura por Tabelas de conversão da OIV (2012)[23]. Os resultados obtidos para o total de sólidos solúveis dos sucos concentrados e néctares de uva concordaram com os obtidos na Literatura. Segundo, Santana et al. (2011)[17] para o suco integral o valor foi de 13,50 ºBrix. De acordo com Rizzon e Miele (2012)[31], o néctar de uva apresentou 14,25±1,26 ºBrix e 12,54±0,67 g 100 mL-1 de açúcares totais; e o suco integral 16,50±1,10 ºBrix e 15,48±1,20 g 100 mL-1 de açúcares totais. Já, Toaldo et al. (2015)[22] encontraram para o suco orgânico um valor de 15,03±0,06 ºBrix e de 15,24±0,27 g 100 g-1 para açúcares totais; e para o suco de uva convencional 16,73±0,06 ºBrix e 16,70±0,16 g 100 g-1 para os açúcares totais. Os teores obtidos pelas determinações deste trabalho apresentaram valores próximos á esses e superiores ao mínimo exigido pela legislação de 14 ºBrix para néctares, considerando os desvios padrão para as 3 técnicas RF, ESP-FS e HPLCRID. Os teores dos açúcares totais concordaram com os valores atestados nas embalagens de néctar de uva de 29 g de carboidratos por copo de 200 mL, equivalente aos calculados neste trabalho em gramas por 100 mL. O valor para o total de sólidos solúveis pela RF para o suco concentrado foi em média de 60,08 ºBrix, um pouco menor considerando-se as variações do desvio-padrão

Scientia Chromatographica 2015; 7(1):53-63 57

Caldas BS et al.

Determinação de açúcares em suco concentrado e néctar de uva

Tabela 1. Concentração de açúcares livres totais em amostras de sucos de uva determinadas por Refratometria (oBrix).

Suco de Uva

Refratometria o Brix (g 100 mL-1) Média ± DP

Néctar B

Concentrado

15,09 14,99

CV (%)

Média ± DP

15,12A ±0,13

0,8

12,98 12,89 12,98

15,22

13,09

15,92

15,48A ±0,47

3,0

13,42 13,69

14,94

12,85

60,03

51,63

60,40 60,20

Suco de Uva

Média ± DP

CV (%)

Néctar A

13,56 15,45 13,81 12,30

13,78 A ±2,37

17,2

Néctar B

14,19 14,40 14,86 16,82

15,07 A ±1,26

8,4

Concentrado

75,74 86,24 89,04 70,84

80,47 A ±11,91

14,8

13,15

15,09 15,82

Espectrofotometria UV-Vis Fenol Sulfúrico [Açúcares Totais] (g 100 mL-1)

Babo*

15,29 Néctar A

Tabela 2. Concentração de açúcares livres totais em amostras de sucos de uva determinadas por Espectrofotometria UV-Vis (fenol-sulfúrico).

60,08B ±0,30

59,70

0,5

51,94 51,77

13,00 ±0,11

13,31 ±0,41

51,67 ±0,25

51,34

*1 oBrix = 0,86 Babo. DP: Desvio padrão. CV: Coeficiente de variação. Letras maiúsculas diferentes na mesma linha, na comparação feita entre a média dos açúcares totais utilizando refratometria (Tabela 1), espectrofotometria UV-Vis (Tabela 2) e HPLC-RID (Tabela 3), representam diferença significativa (p<0,05) entre métodos pelo teste de Tukey.

DP: Desvio padrão. CV: Coeficiente de variação. Letras maiúsculas diferentes na mesma linha, na comparação feita entre a média dos açúcares totais utilizando refratometria (Tabela 1), espectrofotometria UV-Vis (Tabela 2) e HPLC-RID (Tabela 3), representam diferença significativa (p<0,05) entre métodos pelo teste de Tukey.

para cada método, do que o conteúdo mencionado de cerca de 65 ºBrix[17].

Os resultados por este método foram os que sofreram maiores variações com coeficientes de variação de 8,4 e 17,2 % para os néctares das marcas comerciais A e B. Entretanto, foi à única técnica que se diferenciou em relação à RF e HPLC-RID apresentando valores significativamente maiores em nível de 5 %, com um CV de 14,8% para o suco de uva concentrado. Portanto, a técnica não foi considerada indicada para o controle de qualidade para determinação dos açúcares totais para este tipo de amostra.

3.2. Espectrofotometria Na espectrofotometria, a concordância nos resultados das absorbâncias é resultante da qualidade na homogeneização das soluções, antes da leitura em espectrofotômetro, com o auxílio de um vórtex.

O método mostrou-se linear com coeficiente de correlação superior a 0,99 para a curva de calibração, obtida em função da concentração de glicose. A faixa dinâmica de trabalho foi de 8,0 a 40,0 µg mL-1.

Os teores dos açúcares solúveis determinados por espectrofotometria UV-Vis utilizando a curva de calibração para o método fenol-sulfúrico estão na Tabela 2.

58

3.3. Cromatografia

A Figura 1 mostra um cromatograma típico de um padrão de frutose, glicose e sacarose utilizando o HPLC-RID, nas condições analíticas estabelecidas. A quantificação dos carboidratos das amostras de néctares e suco concentrado de uva foi feita por calibração externa na faixa dinâmica de trabalho de 0,25 a 2,5 g 100 mL-1 Scientia Chromatographica 2015; 7(1):53-63

Determinação de açúcares em suco concentrado e néctar de uva

Caldas BS et al.

(a)

(b)

(c)

Figura 1. Cromatograma típico de padrão de frutose, glicose e sacarose a 2,5 g 100 mL-1 (a); néctar de uva (b) e suco concentrado de uva (c) por HPLC-RID. Pico: (1) Frutose; (2) Glicose; (3) Sacarose.

e os resultados para as concentrações dos açúcares individuais e totais estão apresentados na Tabela 3.

Observa-se que o suco concentrado apresenta somente os açúcares naturais da própria uva, frutose e glicose, praticamente em concentrações iguais, concordando com a Figura 1c. Observa-se que o suco concentrado de uva está de acordo com a legislação, tendo sido elaborado com 100 % da fruta pura, sem adições de outros açúcares, mostrando aumento na concentração da frutose e glicose pela desidratação em cerca de 6 vezes comparando-se aos néctares.

Não foram encontrados muitos trabalhos analisando açúcares por HPLC do suco de uva, para efeito comparativo entre os teores. Em trabalho recente,

Zhang et al. (2015)[28] embora utilizando HPLC-HPAEPAD e HPLC-HILIC-CAD não forneceram valores quantitativos, observa-se a presença de glicose e frutose e, ausência de sacarose para o suco de uva analisado, concordando com o perfil de cromatogramas obtidos neste trabalho por HPLC-RID.

3.4. Análise estatística

A análise estatística de tendências e dispersões, bem como a comparação das médias dos valores obtidos para açúcares totais em cada amostra por RF, ESP-FS e HPLC-RID estão apresentadas nas Tabelas 1, 2 e 3.

Segundo ANOVA considerando 5% de significância, a quantidade média dos açúcares totais foi semelhante para as amostras de néctares de uva empregando os 3 métodos, independente da marca comercial. Já, para o suco de uva concentrado os teores de açúcares foram semelhantes por RF e HPLC-RID, sendo significativamente diferente para a ESP-FS (Tabelas 1, 2 e 3). Estes resultados concordam com a separação em 3 grupos – néctares (a e b) pertencendo ao grupo I; concentrado por RF (ºBrix(co)) e HPLC-RID (HPLC(co)) pertencendo ao grupo II; e ESP-FS (UV-Vis) pertencendo ao grupo III, na maior distância Euclidiana (seta) dada pela Análise de Agrupamento Hierárquica (Figura 2) igualmente observada pela Análise de Componentes Principais na Figura 3, onde CP1 e CP2 explicam juntas 100 % da variância dos dados.

A técnica ESP-FS que apresentou maiores valores de dispersão dos dados também para o néctar (Tabela 2).

Por outro lado, a técnica com menores valores de dispersão foi a RF (Tabela 1), que não exige equipamento sofisticado e nem preparo da amostra, como diluição e filtração, os quais adicionam erros aleatórios e sistemáticos na quantificação do analito. Esta se baseia em uma medida física relativamente simples e, portanto, é indicada para o controle do processo. Apesar da concordância entre os dados em termos de açúcares totais, a cromatografia líquida pode tornar-se interessante quando o propósito for o de avaliar a adição de proporções da fruta e de açúcar,

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Caldas BS et al.

Determinação de açúcares em suco concentrado e néctar de uva

Tabela 3. Concentração de açúcares livres individuais e totais em amostras de sucos de uva determinados por Cromatografia Líquida (HPLC-RID).

Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com Detector de Índice de Refração HPLC-RID [Açúcares Livres] (g 100 mL-1)

Suco de Uva [Fru]

Média ± DP

CV (%)

5,94 Néctar A

Néctar B

Concentrado

5,28 5,67

[Gli]

Média ± DP

CV (%)

5,65 5,45 ±0,45

8,3

4,91 5,15

[Sac]

Média ± DP

CV (%)

3,77 5,10 ±0,41

8,0

3,43 3,52

[Tot]

3,62 ±0,17

4,8

13,61 14,33

4,70

3,75

13,36

5,34

4,32

5,86

15,52

4,99

5,20 ±0,18

3,4

5,19 4,25

4,59 ±0,43

9,3

5,67 5,89

5,69 ±0,25

4,5

16,21 15,13

5,12

4,61

5,34

15,07

35,44

31,34

N.D.

66,78

31,41 31,94 31,51

32,58 ±1,92

5,9

29,34 29,35 33,28

30,38 ±1,89

6,2

N.D. N.D. N.D.

CV (%)

14,16A ±0,90

6,3

15,48A ±052

3,4

63,40B ±2,88

4,5

15,36

4,91 5,36

Média ± DP

N.D.

–

60,75 61,29 64,79

DP: Desvio padrão. CV: Coeficiente de variação. N.D.: Não detectado. [Fru]: Concentração de frutose. [Gli]: Concentração de glicose. [Sac]: Concentração de sacarose. [Tot]: Concentração de açúcares totais obtida pela soma das concentrações de frutose, glicose e sacarose. Letras maiúsculas diferentes na mesma linha, na comparação feita entre a média dos açúcares totais utilizando refratometria (Tabela 1), espectrofotometria UV-Vis (Tabela 2) e HPLC-RID (Tabela 3), representam diferença significativa (p<0,05) entre métodos pelo teste de Tukey.

Figura 2. Análise de Agrupamento Hierárquico para as amostras de suco concentrado (co) de uva e néctares das marcas A (a) e B (b) determinados por RF (oBrix); ESP-FS (UV-Vis) e HPLC-RID. 60

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Determinação de açúcares em suco concentrado e néctar de uva

Caldas BS et al.

Figura 3. Análise de Componentes Principais para as amostras de suco concentrado (co) de uva e néctares de uva das marcas A (a) e B (b) determinados por RF (oBrix); ESP-FS (UV-Vis) e HPLC-RID.

de acordo com o exigido pela legislação. Neste quesito, o HPLC-RID possibilita reconhecer facilmente quando se utilizou somente a própria fruta na elaboração do suco, atestado pela presença somente de frutose e a glicose (Figura 1c), diferentemente dos néctares, que apresentam um pico adicional de açúcar advindo da adição de sacarose (pico 3, Figura 1b).

Espera-se, que este estudo possa introduzir os açúcares como marcadores naturais da própria uva, auxiliando com ferramentas analíticas para verificação da autenticidade, conjuntamente com outros compostos fenólicos já empregados por alguns trabalhos, como as antocianinas[5,9] e ácidos hidroxicinâmicos. Desta forma, pretende-se contribuir para que de fato se assegure ao consumidor o seu direito em saber o que está consumindo, por meio de métodos capazes de fornecer informações constantes no rótulo, que apresentam implicações maiores ainda á intolerantes ao açúcar como os diabéticos.

4. Conclusão A refratometria se mostrou a técnica mais adequada em rotina de processo para a determinação de açúcares totais em suco concentrados e néctares de uva, dada a sua precisão com menores erros relativos calculados, praticidade sem preparo de amostra e simplicidade do equipamento e da técnica. Entretanto, a RF mede o total de sólidos solúveis sem discriminação e seletividade em termos de açúcares e tipo de produto.

Por outro lado, a cromatografia além de resultados concordantes em termos de açúcares totais, é a melhor técnica para quantificá-los separadamente, propiciando através do teor de frutose e glicose verificar se o suco foi feito a partir de 100% da fruta uva, ou se foi adicionado sacarose, assegurando o acesso do consumidor à informação adequada de composição, e auxiliando no cumprimento a legislação e na coibição de adulterações.

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Caldas BS et al.

Agradecimentos

Os autores agradecem a CAPES, CNPq, Fundação Araucária e a UEL pelas bolsas de Iniciação Científica e Mestrado. Ao FINEP e ao Laboratório de Apoio a

Determinação de açúcares em suco concentrado e néctar de uva

Pesquisa Agropecuária (LAPA) da Central Multiusuária da UEL pelo uso do HPLC-RID. A Cooperativa por ceder os sucos concentrados.

Referências 1.

Shayanfar, S.; Bodbodak S. Effect of different physicochemical de-tartration methods on red grape juice quality. Journal of Food Science and Technology, 51(12), 4084-4089, 2014. <http://dx.doi.org/10.1007/s13197-012-0905-7>.

2.

Grandizoli, C.W.P.S.; Campos, F. R.; Simonelli, F.; Barison, A. Grape juice quality control by means of 1H nmr spectroscopy and chemometric analyses. Química Nova, 37, 1227-1232, 2014. <http://dx.doi.org/10.5935/0100-4042.20140208>.

3.

O’Byrne, D.J., Devaraj, S.; Grundy, S.M.; Jialal, I. Comparison of the antioxidant effects of Concord grape juice flavonoids and alpha-tocopherol on markers of oxidative stress in healthy adults. American Journal of Clinical Nutrition, 76(6), 1367-1374, 2002. <http://ajcn.nutrition.org/content/76/6/1367.full.pdf+html>.

4.

Vinho, I.-I.B.D. Estudos científicos endossam benefício da uva e seus derivados à saúde. 2015. Disponível em: <http://www. ibravin.org.br/noticias/257-estudos-cientificos-endossam-beneficios-da-uva-e-seus-derivados-a-saude>.

5.

Xu, Y.; Simon, J. E.; Ferruzzi, M. G.; Ho, L.; Passinetti, G. M.; Wu, Q. Quantification of anthocyanidins in the grapes and grape juice products with acid assisted hydrolysis using LC/MS. Journal of Functional Foods, 4(4), 710-717, 2012.<doi:10.1016/j. jff.2012.04.010>.

6.

Ma, B.; Chen, J.; Zheng, H.; Fang, T.; Ogutu, C.; Li, S.; Han, Y.; Wu, B. Comparative assessment of sugar and malic acid composition in cultivated and wild apples. Food Chemistry, 172, 86-91, 2015.< doi:10.1016/j.foodchem.2014.09.032>

7.

Hermosín-Gutiérrez, I.; Castilho-Muñoz, N.; Goméz-Alonso, S.; Garcia-Romero, E. Flavonol Profiles for Grape and Wine Authentication. Progress in Authentication of Food and Wine. ACS Symposium Series, 1081, 113-129, 2011.<Chapter doi: 10.1021/bk-2011-1081.ch008>.

8.

Nixdorf, S.L.; Hermosín-Gutiérrez, I. Brazilian red wines made from the hybrid grape cultivar Isabel: Phenolic composition and antioxidant capacity. Analytica Chimica Acta, 659(1–2), 208-215, 2010.< doi: 10.1016/j.aca.2009.11.058>

9.

Mazza, G.; Francis, F. J. Anthocyanins in grapes and grape products. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 35(4), 341‑371, 1995. <http://dx.doi.org/10.1080/10408399509527704>.

10. He, J.; Giusti, M. M. Anthocyanins: Natural Colorants with Health-Promoting Properties. Annual Review of Food Science and Technology, 1(1), 163-187, 2010. <doi: 10.1146/annurev.food.080708.100754.> 11. Lona, A. O suco de Uva. Instituto Brasileiro do Vinho, 2009. Disponível em: <http://www.ibravin.com.br/int_noticias. php?id=260&tipo=A>.

12. IBRAVIN. Avaliação Setorial 2013, IBRAVIN - Instituto Brasileiro do Vinho, 17, 2013. Disponível em: <http://www.ibravin. org.br/public/upload/statistics/1380742265.pdf>.

13. Mello, L. M. R. Panorama da Vitivinicultura brasileira 2014. Revista Campo e Negócios, 2015. Disponível em: <http://www. revistacampoenegocios.com.br/panorama-da-vitivinicultura-brasileira-2014/>.

14. BRASIL, Decreto nº 6.871, de 4 de junho de 2009 - Regulamenta a Lei nº 8.918, de 14 de julho de 1991, que dispõe sobre a padronização, a classificação, o registro, a inspecão, a produção e a fiscalização de bebidas., S.d.A.J. Presidência da República - Casa Civil, Editor. 2009: Brasil. Disponível em: <https://www.planalto.gov.br/ccivil_03/_ato2007-2010/2009/decreto/d6871. htm>.

15. BRASIL, Instrução Normativa nº 12, de 4 de setembro de 2003, P.e.d.A. Ministério da Agricultura, Editor. 2003: Brasil.

Disponível em: <http://sistemasweb.agricultura.gov.br/sislegis/action/detalhaAto.do?method=consultarLegislacaoFederal>.

16. BRASIL, Instrução Normativa nº 24, de 30 de agosto de 2012, P.e.d.A. Ministério da Agricultura, Editor. 2012: Brasil. Disponível em: <http://sistemasweb.agricultura.gov.br/sislegis/action/detalhaAto.do?method=consultarLegislacaoFederal>.

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Determinação de açúcares em suco concentrado e néctar de uva

Caldas BS et al.

17. Santana, I.; Cabral, L. M. C.; Freitas, S. C.; Freitas, S. P.; Oliveira, A.; Matta, V. M. Composição química e centesimal de suco de uva concentrado por osmose inversa: influência da temperatura do processo. Embrapa Publicações, 2011. Disponível em: <https://www.embrapa.br/agroindustria-de-alimentos/busca-de-publicacoes/-/publicacao/917017/composicao-quimica-ecentesimal-de-suco-de-uva-concentrado-por-osmose-inversa-influencia-da-temperatura-do-processo>.

18. BRASIL, Instrução Normativa nº 01, de 7 de Janeiro de 2000, P.e.d.A. Ministério da Agricultura, Editor. 2000: Brasil. Disponível em: <http://extranet.agricultura.gov.br/sislegis-consulta/consultarLegislacao.do?operacao=visualizar&id=7777>.

19. González-Mas, M. C.; Garcia-Riaño, L. M.; Alfaro, C.; Rambla, J. L.; Padilla, A. I.; Gutierrez, A. Headspace-based techniques to identify the principal volatile compounds in red grape cultivars. International Journal of Food Science & Technology, 44(3), 510-518, 2009. <doi: 10.1111/j.1365-2621.2008.01779.x> 20. Silva, R. N.; Monteiro, V. N.; Alcanfor, J. D. A. X.; Assis, E. M.; Asquieri, E. R. Comparação de métodos para a determinação de açúcares redutores e totais em mel. Food Science and Technology, 23, 337-341, 2003.<http://dx.doi.org/10.1590/S010120612003000300007 >.

21. Guerra, C. C.; Zanus, M. C. Uvas Viníferas para Processamento em Regiões de Clima Temperado. 2003 [cited 2015 April 24]; Disponível em: <http://www.cnpuv.embrapa.br/publica/sprod/UvasViniferasRegioesClimaTemperado/colheita.htm>.

22. Toaldo, I. M.; Cruz F. A.; Alves T. L.; Gois, J. S.; Borges, D. L. G.; Cunha, H. P.; Silva, E. L.; Bordignon-Luiz, M. T. Bioactive potential of Vitis labrusca L. grape juices from the Southern Region of Brazil: Phenolic and elemental composition and effect on lipid peroxidation in healthy subjects. Food Chemistry, 173(0), 527-535, 2015. <http://dx.doi.org/10.1016/j. foodchem.2014.09.171> 23. Wine, O. I. V. Evaluation by refractometry of the sugar concentration in grape musts, concentrated grape musts and rectified concentrated grape musts. Compendium Of International Methods Of Analysis - OIV. 2012. OIV. Disponível em: <http://www. oiv.int/oiv/info/enmethodesinternationalesvin>.

24. Kishio, S.; Aoyagi, Y. Cultivar- and Region-specific Differences in the Starch-Degrading Enzymes Produced During Rice Soaking. Nippon Shokuhin Kagaku Kogaku Kaishi, 61(6), 232-243, 2014. <doi: 10.3136/nskkk.61.232> 25. Gusakov, A.V.; Kondratyeva, E. G.; Sinitsyn, A. P. Comparison of Two Methods for Assaying Reducing Sugars in the Determination of Carbohydrase Activities. International Journal of Analytical Chemistry, 2011, 4, 2011. <doi: 10.1155/2011/283658>.

26. Galvão, M. A. M.; Ferreira, M. R. A.; Nunes, B. M.; Santana, A. S. C. O.; Randau, K. P.; Soares, L. A. L. Validation of a spectrophotometric methodology for the quantification of polysaccharides from roots of Operculina macrocarpa (jalapa). Revista Brasileira de Farmacognosia, 24(6), 683-690, 2014. <http://dx.doi.org/10.1016/j.bjp.2014.10.008> 27. Wrolstad, R. E.; Acree, T. E.; Decker, E. A.; Penner, M. H.; Reid, D. S.; Schwartz, S. J.; Shoemaker, C. F.; Smith, D. M.; Sporns, P. Water, Proteins, Enzymes, Lipids, and Carbohydrates. Handbook of Food Analytical Chemistry, 653-660, 2005. Disponível em: <https://books.google.com.br/books?id=98TS3dtFStAC&pg=PA653&lpg=PA653&dq=FOURNIER+E.+Determination+ of+Reducing+and+Non+reducing+Sugars+Using+the+Phenol-Sulfuric+Acid+Assay.&source=bl&ots=NS1OOvrymT&sig=f1 iNKf4yiNrXsR427LrIHbQ78Yo&hl=pt-BR&sa=X&ei=n4c6VcS_LZPlsATw8oC4BA&ved=0CB0Q6AEwAA#v=onepage& q=FOURNIER%20E.%20Determination%20of%20Reducing%20and%20Non%20reducing%20Sugars%20Using%20the%20 Phenol-Sulfuric%20Acid%20Assay.&f=false>.

28. Zhang, Q.; Bailey, B.; Thomas, D.; Plante, M.; Acworth, I. Direct Carbohydrate Analysis in Beverages and Foods Using Pulsed Amperometric Detection or Charged Aerosol Detection. Thermo Fisher Scientific Publication, 7, 2015. Disponível em: <http://www.thermoscientific.com/content/dam/tfs/ATG/CMD/cmd-documents/sci-res/posters/chrom/lc/sys/PN-71524-LCCarbohydrate-PAD-CAD-Pittcon2015-PN71524-EN.pdf>.

29. BRASIL, Decreto nº 2.181, de 20 de março de 1997 - Regulamenta a Lei nº 8.078, de 11 de setembro de 199, que dispõe sobre o Código de Defesa do Consumidor, Redação dada pela Lei nº 12.741, de 2012, S.d.A.J. Presidência da República - Casa Civil, Editor. 2012: Brasil. Disponível em: <http://www.planalto.gov.br/ccivil_03/leis/l8078.htm>.

30. Duarte-Delgado, D.; Narváez-Cuenca, C. E.; Restrepo-Sánchez, L. P.; Kushalappa, A.; Mosquera-Vásquez, T. Development and validation of a liquid chromatographic method to quantify sucrose, glucose, and fructose in tubers of Solanum tuberosum Group Phureja. Journal of Chromatography B, 975(0), 18-23, 2015. < http://dx.doi.org/10.1016/j.jchromb.2014.10.039>.

31. Rizzon, L. A.; Miele, A. Analytical characteristics and discrimination of Brazilian commercial grape juice, nectar, and beverage.

Food Science and Technology, 32, 93-97, 2012. Disponível em: < http://dx.doi.org/10.1590/S0101-20612012005000015> Scientia Chromatographica 2015; 7(1):53-63 63

Scientia Chromatographica 2015; 7(1):64-64 Instituto Internacional de Cromatografia http://dx.doi.org/10.4322/sc.2015.000 ISSN 1984-4433

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CLASSIFICAÇÃO

Scientia Chromatographica 2015; 7(1)

Scientia Chromatographica 2015; 7(1):65-84 Instituto Internacional de Cromatografia http://dx.doi.org/10.4322/sc.2015.017 ISSN 1984-4433

CROMATOGRAFIA LÍQUIDA

Direct chiral separations of third generation b-blockers through high performance liquid chromatography: a review

Anil Kumar Singh* Michele Bacchi Pallastrelli Maria Inês Rocha Miritello Santoro Department of Pharmacy, Faculty of Pharmaceutical Sciences, University of São Paulo, Caixa Postal 66083, CEP 05315-970, São Paulo, SP, Brazil * anil@usp.br Recebido: 20/07/2015 Aceito: 21/08/2015

Scientia Chromatographica 2015; 7(1)

Abstract

High performance liquid chromatography with chiral stationary phase (CSPs) is a predominant enantiomeric separation technique, widely used in the separation and analysis of chiral drugs. Wide ranges of chiral selectors of natural and synthetic origin have been studied and are effectively employed in enantioseparation of drugs and chemical compounds in diverse matrixes, including pharmaceuticals and biological fluids using either HPLC or CE. This review covers development and application in direct chiral separation of third generation β-blockers through high performance liquid chromatography using chiral stationary phases.

Keywords: Chiral separations, HPLC, Chiral stationary phases, Third generation β-blockers.

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Singh AK, Pallastrelli MB, Santoro MIRM

1. Introduction

Historically, isomerism was ignored and chiral drugs were marketed as racemates, leading to tragic consequences[1-3] as well as well-known, everlasting, side effects. However, with the advance of science, it was possible to discover that most drugs exist in the optically active form and that the biological activity differs between the pairs of enantiomers[4].

Enantiomeric drugs have become increasingly important over the last 20-30 years, since about 56% of the drugs currently in use are chiral compounds, and 88% of these chiral synthetic drugs are used therapeutically as racemates[5].

In an attempt to reduce side effects caused by drugs enantiomers, the Food and Drug Administration (FDA) and other worldwide regulatory agencies now recommend that the production of enantiomers should be made using enantioselective synthesis and the development of analytical methods to separate racemates that are of great importance[6,7].

A review on chiral separation of third generation β-blockers

The qualitative and/or quantitative enantiomeric analysis can be achieved through detection and/or separation approach. That includes techniques such as polarimetry, NMR, isotopic dilution, calorimetry, enzymatic techniques, high performance liquid chromatography (HPLC), gas chromatography (GC) and capillary electrophoresis (CE)[1,10].

HPLC with chiral stationary phase (CSPs) and CE with chiral additives are the predominant chiral analytical techniques used in the separation and analysis of chiral drugs. Wide ranges of chiral selectors have been studied and are effectively employed in chiral analysis of enantiomers in pharmaceutical preparations and biological fluids using either HPLC or CE. This review covers developments and applications in direct chiral separations of third generation β-blockers through high performance liquid chromatography using chiral stationary phases.

2. Difference of Enantiomers Activity

From analytical standpoint, chiral drugs are very intriguing and sometimes neglected due to limitations in correlating physical and biological properties, especially due to limited availability of low cost separation methods. The escalating development of chiral drugs as single enantiomers or racemate demands development of chiral separation methods in order to assure proper patient health care. It is of utmost importance being able to separate and analyze chiral racemic drugs, so that it becomes possible to obtain the optimal treatment for the patient having an adequate therapeutic control[5].

Almost half of the drugs in use are chiral. It is well known that the pharmacological activity is restricted, in most cases, to one of the enantiomers and that can differ qualitatively and/or quantitatively amongst antipodes. The distomer (enantiomer with lesser activity) can show undesired side effects and in some cases even antagonistic and/or toxic effects.

The enantiomers can differ in absorption, distribution, protein binding and affinity to the receptor.

Furthermore, can even sometime follow completely distinct metabolic pathways[8,9,11].

Many pharmaceutical compounds have chiral centers and regulatory requirement demands to prove the enantiomeric purity of chiral drugs[7]. This interest can be attributed essentially to well-known fact that enantiomers of a racemic drug may have different pharmacological activities, as well as different pharmacokinetic and pharmacodynamic profiles[8,9].

The α1-receptors cause vasoconstriction, increase of peripheral resistance, and increase of arterial pressure.

The α2 activation cause contraction of smooth muscle relaxation. The activation of the β1-receptor leads to increases in contractile force and heart rate. Activation of β2-receptors leads to vascular and nonvascular smooth muscle relaxation[12-15].

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Scientia Chromatographica 2015; 7(1):65-84

A review on chiral separation of third generation β-blockers

The therapeutic effects of β-blockers are normally explained by their capacity to block the β-adrenoceptors, hindering the access of the endogenous agonists’ noradrenaline and adrenaline[16]. These drugs can be classified based on their cardio-selectivity, β1 that act on heart adrenergic receptors and β2 that act on receptors found on bronchus, peripheral blood vessels, etc.

Most of these drugs, with or without intrinsic sympathomimetic activity can be sub-divided into three generations[17]. The first-generation is composed of nonselective drugs, which blocks β1- and β2-adrenergic receptors and includes drugs such as propranolol, timolol, pindolol, nadolol and sotalol. The secondgeneration is composed of β1-selective (cardioselective) drugs, and includes atenolol, bisoprolol and metoprolol.

The third generation β-blockers provide additional vasodilation effects, which is most effective in rapid reduction of blood pressure. The β-blockers may also have α-receptor blocking effects (labetalol, carvedilol), intrinsic sympathomimetic effects (pindolol), or class III antiarrhythmic effects (sotalol)[18].

In the 1970s and 1980s, another drug development effort aimed at improving the treatment of hypertension led to the conception of β-blockers with vasodilating activity[19]. Because of blockade of both β1 and β2 adrenergic receptors as well as other properties, third generation β-blockers possess a more comprehensive antiadrenergic profile than second-generation β1selective compounds[19]. Third generation includes bucindolol, carvedilol, labetalol and nebivolol[19], that are discussed further in following section along with their stereoselective discriminative activities.

2.1. Bucindolol

Bucindolol (Figure 1) is a non-cardioselective β-blocker. It is reported to possess weak α1-blocking activity and direct mild vasodilation activity[19,20].

However, the degree of enantioselective affinity for different sympathomimetic receptors (β1, β2, α1, α2) is unclear. The myocardial stimulant activity as well as

Singh AK, Pallastrelli MB, Santoro MIRM

Figure 1. Chemical structure of bucindolol.

Figure 2. Chemical structure of carvedilol.

vasodilator capacity of (-)-bucindolol is reported to be greater than (+)-bucindolol[9]. The racemic bucindolol hydrochloride was investigated in the management of hypertension, heart failure, and other cardiac disorders.

However, its development was brought to an end. It has been suggested that it may be of benefit in a genetically identifiable subgroup of patients[17,21].

2.2. Carvedilol Carvedilol (Figure 2) is a non-cardioselective β-blocker, which has vasodilating activity due to its α1-blocking effect. Besides potent antioxidant activity, at higher doses, it also presents calcium-channel blocking activity. Its unique properties plays multiple adrenergic blockade (β1, β2 and α1), as well as its antioxidants and anti-proliferative effect may be important to inhibit the progressive deterioration of ventricular dysfunction and heart failure[17,21]. Carvedilol is reported to have no intrinsic sympathomimetic activity and only weak membrane-stabilizing activity[20]. It is used in the management of hypertension and angina pectoris, and as an adjunct to standard therapy in symptomatic heart failure, besides being used to reduce mortality in patients with left ventricular dysfunction after myocardial infarction[9,21].

Scientia Chromatographica 2015; 7(1):65-84 67

Singh AK, Pallastrelli MB, Santoro MIRM

The selective action of carvedilol on β1-receptors is seven to eight fold greater than that on β2-receptors, and as a result, at low doses (≤6.25 mg twice a day) carvedilol predominantly presents β1 selective activity. Carvedilol and one of its metabolites have significant antioxidant properties, although in human subjects it is not clear whether blood levels are sufficient to manifest any effect. If these antioxidant properties were, in fact, active in subjects with heart failure, they would be expected to produce an anti-proliferating/growth-inhibiting effect [Bristow, 1998].

In recent years, it was found that the (S)-carvedilol is a potent competitive inhibitor at β1-adrenoceptors, whereas the R-enantiomer is considerably less potent.

In contrast, the enantiomers are essentially equipotent with respect to α1-adrenoceptor blockade. Thus, the vasodilator and antihypertensive effects of the drug arise due to α1-adrenoceptor blockade activity attributed to both enantiomers and the β1-blockade from the S-enantiomer, which prevents reflex tachycardia. This gives the drug utility in congestive heart failure owing to the combination of decreased vascular resistance (α-adrenergic antagonism) and lack of reflex tachycardia (β-blockade)[9].

Some of carvedilol metabolites have β-blocking and vasodilating activity. One metabolite has greater β-blocking activity than carvedilol but all have weaker vasodilating effects than carvedilol. The o-dimethyl-phydroxyl and m-hydroxyl metabolites possess β-blocking activity. Its metabolism is stereoselective and plasma concentrations of R (+)-carvedilol are about 2 to 3 times higher than S (−)-carvedilol. The metabolism of carvedilol is subject to genetic polymorphism with poor metabolizers of debrisoquine having plasma-R(+)-carvedilol concentrations 2- to 3–fold higher than extensive metabolizers[19,22].

2.3. Labetalol

Labetalol (Figure 3) is a non-cardioselective β-blocker, which is administered as a combination of four stereoisomers (RR, SR, RS and SS). The RR isomer is mostly responsible for the β-blocking activity where as the SR isomer has predominantly potent α-adrenoceptor 68

A review on chiral separation of third generation β-blockers

blocker activity. Both the RS and SS isomers, on the other hand, display weak antagonistic activities against α and β-receptors. The reported sequential β-blocking activity is RR>SR; RR>RS; RR>SS whereas the reported sequential α-blocking activity is SR>RR; SR>RS; SR>SS[9,21].

According to reports, labetalol possess some intrinsic sympathomimetic and membrane-stabilizing activity. In addition, it has selective α1-blocking properties that decrease peripheral vascular resistance. The ratio of α- to β-blocking activity has been estimated to be about 1:3 after oral administration and 1:7 via intravenous route.

Labetalol is available as hydrochloride and often used to induce hypotension, during surgery. Labetalol decreases blood pressure more rapidly than other β-blockers[21].

2.4. Nebivolol

Nebivolol (Figure 4) is a cardioselective β-blocker that has vasodilating activity, which appears to be due to a direct action on the endothelium, possibly involving nitric oxide release. It lacks intrinsic sympathomimetic and membrane-stabilizing activity. Nebivolol is used in the management of hypertension, and as an adjunct to standard therapy in patients aged 70 years and older with stable chronic heart failure[21]. It has selectivity for β1-receptors and vasodilatory effect is mediated through the L-arginine nitric oxide pathway. The aromatic hydroxylated and alicyclic oxidized metabolites have the same pharmacologic activity as the parent compound, whereas the N-dealkylated metabolite and glucuronides are inactive[23].

Figure 3. Chemical structure of labetalol.

Figure 4. Chemical structure of nebivolol.

Scientia Chromatographica 2015; 7(1):65-84

A review on chiral separation of third generation β-blockers

Singh AK, Pallastrelli MB, Santoro MIRM

The vasodilator properties of nebivolol are attributed to nitric oxide production. The addition of vasodilation to the pharmacologic profile of a β-blocker improves drug tolerability during initiation of therapy and up-titration by afterload reduction-related attenuation of the drop in cardiac output, which is associated with removal of β-adrenergic support of heart rate and contractility. The nitric oxide-potentiating activity of nebivolol might also produce an anti-proliferating effect[20].

observe that the (-)-SSSR enantiomer potentiates the hypotensive effect of (+)-RRRS nebivolol enantiomer[26].

3. Analytical Methods

Despite the fact that, at large, β-blockers seem to be structurally similar, analytical methods for their enantiomers determination and quantitation has to be developed individually for each drug due to their different solubility, stability, optic characteristics, and interaction with chiral HPLC phases.

Nebivolol, have 4 chiral centers and consequently 16 stereoisomers (24 = 16). Owing to the presence of a plane of symmetry, some of these isomers are identical and exist in the meso form. Accordingly, only ten stereoisomers are present namely, RSSR, SRRS, SRSR (=RSRS), SRRR (=RRRS), RSSS (=SSSR), RRRR, RSRR (RRSR), SRSS (SSRS), SSRR (RRSS), SSSS[24].

As mentioned earlier, distinct analytical approaches are used for enantiomeric analysis, including polarimetry, NMR, isotopic dilution, calorimetry and enzyme techniques beside modern separation techniques such as HPLC, GC and CE with chiral selectors. This review approaches only on direct chiral HPLC separation using chiral stationary phases (CSPs), and exclusively the method applied in the analysis of third generation β-blockers, namely bucindolol, carvedilol, labetalol and nebivolol listed in Tables 1 to 4.

Even though bucindolol is included in this review, it’s worth mention that a single analytical method was found in the literature[27], perhaps due to its discontinuation.

The β1-adrenergic receptor binding activity of nebivolol resides predominantly in the (S,R,R,R)enantiomer, the (R,S,S,S)-enantiomer have less than one hundredth of the affinity towards β1-receptor as compared to (S,R,R,R) antipode[25]. Moreover, it is interesting to

Table 1. Enantiomeric separation of bucindolol described in literature using HPLC-CSP. Analytical system (detection) LC-UV (220 nm)

Column

Matrix

Chiralpak AD-H (250 x 4.6 mm)

API

Mobile phase

Flow (mL.min–1)

Ethanol:diethylamine (100:0.2, v/v)

0.5

Temp.

Time of analysis

1st peak (min)

2nd peak (min)

15 min

N.I.

N.I.

Room temperature

Capacity Separation Resolution Author, factor factor (Rs) year (k’) (α) k1=1.0 k2=1.23

1.23

N.I.

27

LC-UV: HPLC with ultraviolet detection; API: active pharmaceutical ingredient; N.I.: not informed.

Table 2. Enantiomeric separation of carvedilol described in literature using HPLC-CSP. Analytical system (detection)

Column

Matrix

Mobile phase

LC-FL Ex: 254, Em: 356nm)

Chiralcel OD (250 x 4.6 mm)

Urine

LC-PDA

Chiralcel OD (250 x 4.5 mm)

N.I.

Heptane:isopropanol:diethylamine (80:20:0.1, v/v/v)

LC-PDA

Chiralcel OD (250 x 4.5 mm)

N.I.

Heptane:ethanol:diethylamine (80:20:0.1, v/v/v)

Flow (mL.min–1)

Temp.

Time of analysis

1st peak (min)

2nd peak (min)

Capacity factor (k’)

Separation factor (α)

Resolution (Rs)

Ref.

25

50

36.7

41.3

-

-

-

28

0.6

30

-

-

>15

-

-

-

29

0.6

30

-

-

>15

-

-

-

29

Acetonitrile:water with (trifluoroacetic 0.3 to 1.0 acid and diethylamine, 0.05% each), gradient Gradient system

LC-UV: HPLC with ultraviolet detection; LC-FL: HPLC with fluorescence detection; LC-PDA: HPLC with PDA detection; LC-MS: HPLC with mass spectrometry; API: active pharmaceutical ingredient; N.I.: not informed.

Scientia Chromatographica 2015; 7(1):65-84 69

Singh AK, Pallastrelli MB, Santoro MIRM

A review on chiral separation of third generation β-blockers

Table 2. Enantiomeric separation of carvedilol described in literature using HPLC-CSP. Analytical system (detection)

Column

Matrix

Mobile phase

Flow (mL.min–1)

Temp.

Time of analysis

1st peak (min)

2nd peak (min)

Capacity factor (k’)

Separation factor (α)

Resolution (Rs)

Ref.

LC-UV (220nm)

Chiralcel OD-H (250 x 4.6 mm)

API

Heptane:isopropanol:diethylamine (90:10:0.1, v/v/v)

1.0

N.I.

N.I.

-

-

-

-

0.00

30

LC-UV (220nm)

Chiralcel OD-H (250 x 4.6 mm)

API

Heptane:ethanol:diethylamine (90:10:0.1, v/v/v)

1.0

N.I.

N.I.

-

-

-

-

0.00

30

LC-UV (220nm)

Lux Cellulose-I (250 x 4.6 mm, 5 µm)

API

Acetonitrile:diethylamine (100:0.1, v/v)

1

20

-

-

-

k1=7.7 k2=9.64

1.25

-

31

LC-UV (220nm)

Lux Cellulose-2 (250 x 4.6 mm, 5 µm)

API

Acetonitrile:diethylamine:formic acid (100:0.1:0.1, v/v/v)

1

20

-

-

-

k1=2.0 k2=3.11

1.6

-

31

LC-UV (220nm)

Sepapak 2 (250 x 4.6 mm)

API

Acetonitrile:diethylamine:trifluoro acetic acid (100:0.1:0.1, v/v/v)

0.5

N.I.

N.I.

-

-

-

-

0.00

32

LC-UV (220nm)

Sepapak 2 (250 x 4.6 mm)

API

Methanol:diethylamine:trifluoro acetic acid (100:0.1:0.1, v/v/v)

0.5

N.I.

N.I.

-

-

-

-

0.00

32

LC-UV (220nm)

Sepapak 2 (250 x 4.6 mm)

API

Ethanol:diethylamine:trifluoroacetic acid (100:0.1:0.1, v/v/v)

0.5

N.I.

N.I.

-

-

-

-

0.00

32

LC-UV (220nm)

Sepapak 3 (250 x 4.6 mm)

API

Heptane:ethanol:diethylamine (90:10:0.1, v/v/v)

1.0

N.I.

N.I.

-

-

-

-

1.56

30

LC-UV (220nm)

Sepapak 3 (250 x 4.6 mm)

API

Acetonitrile:diethylamine:trifluoro acetic acid (100:0.1:0.1, v/v/v)

0.5

N.I.

N.I.

-

-

-

-

0.00

32

LC-UV (220nm)

Sepapak 3 (250 x 4.6 mm)

API

Methanol:diethylamine:trifluoro acetic acid (100:0.1:0.1, v/v/v)

0.5

N.I.

N.I.

-

-

-

-

0.00

32

LC-UV (220nm)

Sepapak 3 (250 x 4.6 mm)

API

Ethanol:diethylamine:trifluoro acetic acid (100:0.1:0.1, v/v/v)

0.5

N.I.

N.I.

-

-

-

-

0.00

32

LC-UV (220nm)

Lux® Cellulose-4 (250 x 4.6 mm)

N.I.

CO2/(Methanol:0.10% Isopropanol:IPA:0.10% trifluoroacetic acid), 80/20 (v/v)

3.0

30

-

-

-

-

-

1.61

33

LC-UV (220nm)

Lux Cellulose-4 (250 x 4.6 mm, 5 µm)

API

Acetonitrile:formic acid (100:0.1, v/v)

1

20

-

-

-

k1=5.1 k2=6.5

1.27

-

31

LC-UV (220nm)

Lux Cellulose-4 (250 x 4.6 mm, 5 µm)

API

Acetonitrile:diethylamine:formic acid (100:0.1:0.1, v/v/v)

1

20

-

-

-

k1=6.9 k2=9.2

1.33

-

31

LC-FL Ex: 284, Em: 343nm)

Chiralpak AD (2.0 x 250 mm)

Whole blood and plasma

Hexane:isopropanol:diethylamine (78:22:1, v/v)

0.3

45

25

10

15

-

-

-

34

LC-FL Ex: 284, Em: 343nm)

Chiralpak AD (250 x 2.0 mm, 5 µm)

Plasma

Hexane:isopropanol:diethylamine (78:22:1, v/v)

0.3

Room temp.

-

-

-

k1=1.2 k2=2.0

1.7

-

34

LC-UV (220nm)

Chiralpak AD-H (250 x 4.6 mm)

API

Ethanol (100, v/v)

0.5

Room temp.

120 min

N.I.

N.I.

N.I.

N.I.

N.I.

35

LC-UV (220nm)

Lux Amylose-2 (150 x 4.6 mm)

N.I.

Heptane:ethanol:diethylamine or triethylamine (80:20:0.1)

1.0

20

-

-

-

k1=4.40

-

2.04

36

LC-UV (220nm)

Lux Amylose-2 (150 x 4.6 mm)

N.I.

Heptane:ethanol:diethylamine or triethylamine (70:30:0.1)

1.0

20

-

-

-

k1=2.21-

-

1.67

36

LC-UV: HPLC with ultraviolet detection; LC-FL: HPLC with fluorescence detection; LC-PDA: HPLC with PDA detection; LC-MS: HPLC with mass spectrometry; API: active pharmaceutical ingredient; N.I.: not informed.

70

Scientia Chromatographica 2015; 7(1):65-84

A review on chiral separation of third generation β-blockers

Singh AK, Pallastrelli MB, Santoro MIRM

Table 2. Enantiomeric separation of carvedilol described in literature using HPLC-CSP. Analytical system (detection)

Column

Matrix

Mobile phase

Flow (mL.min–1)

Temp.

Time of analysis

1st peak (min)

2nd peak (min)

Capacity factor (k’)

Separation factor (α)

Resolution (Rs)

Ref.

LC-PDA

Lux Amylose-2 (250 x 4.6 mm)

N.I.

Heptane:ethanol:diethylamine (80:20:0.1 v/v/v)

1.0

20

-

-

-

k1= 4.40

-

2.04

37

LC-PDA

Lux Amylose-2 (250 x 4.6 mm)

API

Acetonitrile:20 mM borate buffer (pH 9)- (50:50 v/v/v)

0.5

Room temp.

N.I.

N.I.

N.I.

k2 =3.30

N.I.

1.97

38

LC-UV (220nm)

Chiralcel OD-RH (150 x 4.6 mm)

API

Acetonitrile:diethylamine:trifluoro acetic acid (100:0.1:0.1, v/v/v)

0.5

N.I.

N.I.

-

-

-

-

0.66

32

LC-UV (220nm)

Chiralcel OD-RH (150 x 4.6 mm)

API

Methanol:diethylamine:trifluoro acetic acid (100:0.1:0.1, v/v/v)

0.5

N.I.

N.I.

-

-

-

-

1.66

32

LC-UV (250nm)

Chiralcel OD-RH (150 x 4.6 mm)

API

Acetonitrile:50 mM/L sodium perchlorate, pH 5.5 (35:65)

0.3

N.I.

35

-

-

-

-

-

39

LC-FL Ex: 285, Em: 355nm)

Chiralcel OD-RH (150 x 4.6 mm)

plasma

50 mM sodium acetate, pH 6.0: acetonitrile (10:90, v/v)

1

35

18

-

-

-

-

-

40

LC-UV (220nm)

Chiralpak AD-RH (150 x 4.6 mm)

API

Acetonitrile:diethylamine:trifluoro acetic acid (100:0.1:0.1, v/v/v)

0.5

N.I.

N.I.

-

-

-

-

0.00

32

LC-UV (220nm)

Chiralpak AD-RH (150 x 4.6 mm)

API

Methanol:diethylamine:trifluoroacetic acid (100:0.1:0.1, v/v/v)

0.5

N.I.

N.I.

-

-

-

-

0.00

32

LC-UV (220nm)

Chiralcel OJ-R (150 x 4.6 mm)

API

Acetonitrile:diethylamine:trifluoro acetic acid (100:0.1:0.1, v/v/v)

0.5

N.I.

N.I.

-

-

-

-

0.00

32

LC-UV (220nm)

Chiralcel OJ-R (150 x 4.6 mm)

API

Methanol:diethylamine:trifluoroacetic acid (100:0.1:0.1, v/v/v)

0.5

N.I.

N.I.

-

-

-

-

0.00

32

LC-UV (220nm)

Chiralpak AD-H (250 x 4.6 mm, 5 µm)

API

Isopropanol:diethylamine (100:0.1, v/v/v)

1

20

-

-

-

k1=1.29 k2=3.1

2.4

-

31

LC-UV (220nm)

Chiralpak AD-H (250 x 4.6 mm, 5 µm)

API

Isoproponol:diethylamine:formic acid (100:0.1:0.1, v/v/v)

1

20

-

-

-

k1=0.61 k2=0.97

1.58

-

31

LC-UV (220nm)

Chiralpak AS-RH (150 x 4.6 mm)

API

Acetonitrile:diethylamine:trifluoro acetic acid (100:0.1:0.1, v/v/v)

0.5

N.I.

N.I.

-

-

-

-

0.00

32

LC-UV (220nm)

Chiralpak AS-RH (150 x 4.6 mm)

API

Methanol:diethylamine:trifluoroacetic acid (100:0.1:0.1, v/v/v)

0.5

N.I.

N.I.

-

-

-

-

0.00

32

Serum

Hexane:dichloromethane:ethanol (50:35:15, v/v/v), and 0.25% (v/v) trifluoroacetic acid

0.55

N.I.

25

-

-

-

-

-

41

LC-FL Phenomenex 3022 Ex: 284, (250 x 3.2 mm) Em: 343nm) LC-PDA

Chiral AGP (120 x 4.5 mm)

N.I.

Isopropanol:0.02M phosphate buffer, pH 4.6 (10:90, v/v)

0.8

Room temp.

-

-

-

-

1.23

-

42

LC-MS (407 > 100)

Chirobiotic T (250 x 4.6 mm, 5 µm)

Plasma

Methanol:acetic acid:diethylamine (100:0.15:0.05, v/v/v)

1

Room temp.

-

-

-

k1=2.0 k2=2.1

1.1

-

43

LC-UV (241nm)

Imprinted polymer (S)-propranolol CSP (Ground)

N.I.

Acetonitrile:20 mM phosphate buffer, pH 5.1 (70:30)

-

40

-

53.8

74.5

-

1.4

0.4

44

LC-UV (241nm)

Imprinted polymer (S)-propranolol CSP (Silica-grafted)

N.I.

Acetonitrile:20 mM phosphate buffer, pH 5.1 (70:30)

-

40

-

34.1

34.1

-

1.0

0.0

44

LC-UV (241nm)

Imprinted polymer (S)-propranolol CSP (Beads)

N.I.

Acetonitrile:20 mM phosphate buffer, pH 5.1 (70:30)

-

40

-

27.27

38.0

-

1.4

0.1

44

LC-UV: HPLC with ultraviolet detection; LC-FL: HPLC with fluorescence detection; LC-PDA: HPLC with PDA detection; LC-MS: HPLC with mass spectrometry; API: active pharmaceutical ingredient; N.I.: not informed.

Scientia Chromatographica 2015; 7(1):65-84 71

Singh AK, Pallastrelli MB, Santoro MIRM

A review on chiral separation of third generation β-blockers

Table 3. Enantiomeric separation of labetalol described in literature using HPLC-CSP. Analytical system

LC-UV (254nm)

Column

Matrix

Cyclobond-I

API

Acetonitrile:methanol:acetic acid:triethylamine (98:2:0.8:0.6, v/v/v/v)

Plasma

Hexane:1,2-dichloroethane:ethanol: trifluoroacetic acid (56:35:9:0.25)

LC-FL Chirex 3022 Ex: 220, (250 x 4.0 mm) Em: 412nm) LC-FL Ex: 230, Em: 400nm)

a1-acid glyco-

protein (100 x 4 mm)

Mobile phase

Flow Temp. Time of 1st –1 (mL.min ) (°C) analysis peak (min) (min) 1.0

25

N.I.

60

N.I.

N.I.

2nd Capacity Separation Resolution Ref. peak factor factor (Rs) (min) (k’) (α) N.I.

K1=8.8 k2=9.2 k3=9.5 k4=10.3

α1=1.0 α2=1.0 α3=1.1

N.I.

45

N.I.

k1=3.7 k2=4.3 k3=5.1 k4=6.3

α1=1.2 α2=1.2 α3=1.2

N.I.

46

α1=1.2 α2=1.3 α3=1.2

N.I.

47

0.6

25

Plasma

0.02 mM phosphate buffer with 0.015 M tetrabutylammonium phosphate, pH 7.1

0.5

Room temp.

40

N.I.

N.I.

k1=3.9 k2=4.9 k3=6.2 k4=7.7

LC-UV (225nm)

Teicoplanin chiral column (300 x 4.6 mm)

API

Methanol:acetic acid:triethylamine (100:0.05:0.05, v/v/v/v)

1.0

Room temp.

40

N.I.

N.I.

k1=2.0 k2=2.2 k3=2.83

α1=1.1 α2=1.3

N.I.

48

LC-UV (225nm)

Three Chirex 3022 (50mm x 4.6mm)

API

Hexane:dichloromethane:metanol: trifluoroacetic acid (55:35:9:0.5, v/v/v/v)

1.0

Room temp.

40

N.I.

N.I.

k1=2.0 k2=2.2 k3=2.83

α1=1.1 α2=1.3

N.I.

49

LC-UV (220nm)

Chiralpak AD-H (250 x 4.6 mm)

API

Heptane:ethanol:diethylamine (90:10:0.1, v/v/v)

1.0

N.I.

-

-

-

-

0.75/0.91/1.63

-

30

LC-UV (220nm)

Chiralcel OD-H (250 x 4.6 mm)

API

Heptane:isopropanol:diethylamine (90:10:0.1, v/v/v)

1.0

N.I.

-

-

-

-

0.00

-

30

LC-UV (220nm)

Chiralcel OD-H (250 x 4.6 mm)

API

Heptane:ethanol:diethylamine (90:10:0.1, v/v/v)

1.0

N.I.

-

-

-

-

0.00

-

30

LC-UV (220nm)

Sepapak 3 (250 x 4.6 mm)

API

Heptane:ethanol:diethylamine (90:10:0.1, v/v/v)

1.0

N.I.

-

-

-

-

0.56

-

30

LC-UV (220nm)

Sepapak 2 (250 x 4.6 mm)

API

Acetonitrile:diethylamine:trifluoro acetic acid (100:0.1:0.1, v/v/v)

0.5

N.I.

-

-

-

-

0.00

-

30

LC-UV (220nm)

Sepapak 2 (250 x 4.6 mm)

API

Methanol:diethylamine:trifluoro acetic acid (100:0.1:0.1, v/v/v)

0.5

N.I.

-

-

-

-

0.00

-

30

LC-UV (220nm)

Sepapak 2 (250 x 4.6 mm)

API

Ethanol:diethylamine:trifluoroacetic acid (100:0.1:0.1, v/v/v)

0.5

N.I.

-

-

-

-

0.00

-

30

LC-UV (220nm)

Sepapak 3 (250 x 4.6 mm)

API

Acetonitrile:diethylamine:trifluoro acetic acid (100:0.1:0.1, v/v/v)

0.5

N.I.

-

-

-

-

0.00

-

30

LC-UV (220nm)

Sepapak 3 (250 x 4.6 mm)

API

Methanol:diethylamine:trifluoro acetic acid (100:0.1:0.1, v/v/v)

0.5

N.I.

-

-

-

-

0.00

-

30

LC-UV (220nm)

Sepapak 3 (250 x 4.6 mm)

API

Ethanol:diethylamine:trifluoroacetic acid (100:0.1:0.1, v/v/v)

0.5

N.I.

-

-

-

-

-

-

30

LC-UV (220nm)

Chiralpak AD-RH (150 x 4.6 mm)

API

Acetonitrile:diethylamine:trifluoroac etic acid (100:0.1:0.1, v/v/v)

0.5

N.I.

-

-

-

-

-

-

30

LC-UV (220nm)

Chiralpak AD-RH (150 x 4.6 mm)

API

Methanol:diethylamine:trifluoro acetic acid (100:0.1:0.1, v/v/v)

0.5

N.I.

-

-

-

-

-

-

30

LC-UV (220nm)

Chiralcel OD-RH (150 x 4.6 mm)

API

Acetonitrile:diethylamine:trifluoro acetic acid (100:0.1:0.1, v/v/v)

0.5

N.I.

-

-

-

-

-

-

30

LC-UV (220nm)

Chiralcel OD-RH (150 x 4.6 mm)

API

Methanol:diethylamine:trifluoro acetic acid (100:0.1:0.1, v/v/v)

0.5

N.I.

-

-

-

-

-

-

30

LC-UV: HPLC with ultraviolet detection; VWD: variable wavelength detection; LC-FL: HPLC with fluorescence detection; LC-PDA: HPLC with PDA detection; API: active pharmaceutical ingredient; N.I.: not informed.

72

Scientia Chromatographica 2015; 7(1):65-84

A review on chiral separation of third generation β-blockers

Singh AK, Pallastrelli MB, Santoro MIRM

Table 3. Enantiomeric separation of labetalol described in literature using HPLC-CSP. Analytical system

Column

Matrix

Mobile phase

Flow Temp. Time of 1st –1 (mL.min ) (°C) analysis peak (min) (min)

2nd Capacity Separation Resolution Ref. peak factor factor (Rs) (min) (k’) (α)

LC-UV (220nm)

Chiralpak AS-RH (150 x 4.6 mm)

API

Acetonitrile:diethylamine:trifluoro acetic acid (100:0.1:0.1, v/v/v)

0.5

N.I.

-

-

-

-

-

-

30

LC-UV (220nm)

Chiralpak AS-RH (150 x 4.6 mm)

API

Methanol:diethylamine:trifluoro acetic acid (100:0.1:0.1, v/v/v)

0.5

N.I.

-

-

-

-

-

-

30

LC-UV (220nm)

Chiralcel OJ-R (150 x 4.6 mm)

API

Acetonitrile:diethylamine:trifluoro acetic acid (100:0.1:0.1, v/v/v)

0.5

N.I.

-

-

-

-

-

-

30

LC-UV (220nm)

Chiralcel OJ-R (150 x 4.6 mm)

API

Methanol:diethylamine:trifluoro acetic acid (100:0.1:0.1, v/v/v)

0.5

N.I.

-

-

-

-

-

-

30

LC-PDA

Chiral-HSA (100 mm x 4.0 mm)

API

0.01 M Phosphate buffer at pH 7.0

0.5

N.I.

-

k1=9.8 k2=12.4

1.26

1.87

50

LC-PDA

Chiral-AGP (100 mm x 4.0 mm)

API

Methanol:0.01M phosphate buffer at pH 7.0, 10:90 (v/v)

0.9

N.I.

-

-

-

k1=22.3 k2=25.2 k3=29.7

1.13/1.18

1.11 1.56

50

LC-PDA

Chiral-AGP (100 mm x 4.0 mm)

API

Methanol:0.01 M phosphate buffer at pH 7.0, 10:90 (v/v), 1 mM dimethyloctylamine

0.9

N.I.

-

-

-

k1=10.5 k2=12.8

1.22

-

50

LC-PDA

Chiral-AGP (100 mm x 4.0 mm)

API

Methanol:0.01 M phosphate buffer at pH 7.0, 10:90 (v/v), 2 mM dimethyloctylamine

0.9

N.I.

-

-

-

k1=8.9 k2=10.3

1.17

-

50

LC-PDA

Chiral-AGP (100 mm x 4.0 mm)

API

Methanol:0.01 M phosphate buffer at pH 7.0, 10:90 (v/v), 3 mM dimethyloctylamine

0.9

N.I.

-

-

-

k1=7.87

-

-

50

LC-PDA

Chiral-AGP (100 mm x 4.0 mm)

API

Methanol:0.01 M phosphate buffer at pH 7.0, 10:90 (v/v), 4 mM dimethyloctylamine

0.9

N.I.

-

-

-

k1=7.26

-

-

50

LC-UV (220nm)

Cellulose with benzoate at the position 2 and 3 and a meta- substituted phenylcarbamate at the 6 position

API

Hexane:isopropanol (80:20, v/v)

1.0

N.I.

-

-

-

k1=2.53

-

1.00

51

LC-UV (220nm)

Cellulose with a 3,5-dimethylphenylcarbamate ate the 2 and 3 positions and a phenylethylcarbamate at the 6 position

API

Hexane:isopropanol (80:20) containing 10 mM octanoic acid

1.0

N.I.

-

-

-

k1=2.11

-

1.27

51

LC-UV (220nm)

Cellulose with 3,5-dimethylphenylcarbamate at the 2 and 3 positions and a para- substituted benzoate at the 6 position

API

Hexane:isopropanol (80:20) containing 10 mM diethylamine

1.0

N.I.

-

-

-

k1=3.50

-

1.00

51

LC-UV: HPLC with ultraviolet detection; VWD: variable wavelength detection; LC-FL: HPLC with fluorescence detection; LC-PDA: HPLC with PDA detection; API: active pharmaceutical ingredient; N.I.: not informed.

Scientia Chromatographica 2015; 7(1):65-84 73

Singh AK, Pallastrelli MB, Santoro MIRM

A review on chiral separation of third generation β-blockers

Table 3. Enantiomeric separation of labetalol described in literature using HPLC-CSP. Analytical system

Column

Matrix

Mobile phase

Flow Temp. Time of 1st –1 (mL.min ) (°C) analysis peak (min) (min)

2nd Capacity Separation Resolution Ref. peak factor factor (Rs) (min) (k’) (α)

LC- PDA

Labmade Dinitrophenyl ether substituted β-cyclodextrin

N.I.

Methanol:water:triethylammonium acetate (20:80:0.1), pH 4.1

1.0

Room temp.

-

-

-

k1=8.54

-

1.05

52

LC- PDA

Labmade Dinitrophenyl ether substituted β-cyclodextrin

N.I.

Methanol:water:triethylammonium acetate (25:75:0.1), pH 4.1

1.0

Room temp.

-

-

-

k1=5.34

-

1.03

52

LC-PDA

Rifamycin-capped (3-(2-O-βcyclodextrin)-2hydroxypropoxy)propylsilylappended silica particles

N.I.

Methanol:water (40:60)

N.I.

Room temp.

-

-

-

k1=1.48

-

1.10

53

LC-UV (VWD)

EnantioPac (100 x 4.0 mm)

N.I.

0.32 M ethylene glycol + 0.1 M sodium chloride in 0.02 M phosphate buffer, pH 7.0

0.3

20

-

-

-

k1=27

-

1.69

54

LC-UV (VWD)

EnantioPac (100 x 4.0 mm)

N.I.

1.29 M ethylene glycol + 0.1 M sodium chloride in 0.02 M phosphate buffer, pH 7.0

0.3

20

-

-

-

k1=12

-

1.64

54

LC-UV (VWD)

EnantioPac (100 x 4.0 mm)

N.I.

0.25 M propylene glycol + 0.1 M sodium chloride in 0.02 M phosphate buffer, pH 7.0

0.3

20

-

-

-

k1=19

-

1.71

54

LC-UV (VWD)

EnantioPac (100 x 4.0 mm)

N.I.

1,2 butanediol + 0.1 M sodium chloride in 0.02 M phosphate buffer, pH 7.0

0.3

20

-

-

-

k1=8.4

-

1.27

54

LC-UV (VWD)

EnantioPac (100 x 4.0 mm)

N.I.

0.44 M ethanol + 0.1 M sodium chloride in 0.02 M phosphate buffer, pH 7.0

0.3

20

-

-

-

k1=15

-

1.45

54

LC-UV (VWD)

EnantioPac (100 x 4.0 mm)

N.I.

1.74 M ethanol + 0.1 M sodium chloride in 0.02 M phosphate buffer, pH 7.0

0.3

20

-

-

-

k1=5.2

-

1.12

54

LC-UV (VWD)

EnantioPac (100 x 4.0 mm)

N.I.

0.33 M 2-propanol + 0.1 M sodium chloride in 0.02 M phosphate buffer, pH 7.0

0.3

20

-

-

-

k1=9.7

-

1.19

54

LC-UV (VWD)

EnantioPac (100 x 4.0 mm)

N.I.

0.01 M octanoic acid in 0.02 M phosphate buffer, pH 7.0

0.3

20

-

-

-

k1=11.8

-

1.35

54

LC-UV (VWD)

EnantioPac (100 x 4.0 mm)

N.I.

0.03 M octanoic acid in 0.02 M phosphate buffer, pH 7.0

0.3

20

-

-

-

k1=9.8

-

1.17

54

LC-UV (VWD)

EnantioPac (100 x 4.0 mm)

N.I.

0.05 M octanoic acid in 0.02 M phosphate buffer, pH 7.0

0.3

20

-

-

-

k1=7.4

-

1.14

54

LC-FL Ex: 330, Em: 418nm)

Chiral-AGP

Plasma

0.02 M NaH2PO4 buffer, 0.1 M tetrabutylammonium hydrogen bromide, pH 7.1

0.7

N.I.

-

-

-

-

-

-

55

LC-UV (254nm)

Labmade cellulose tris (3,5-dimethylphenylcarbamatecoated on zirconia CSP

API

2-Propanol:n-hexane:ethanolamine (10:90:0.05 v/v)

1.0

25

-

-

-

k1=10

-

1.0

56

LC-UV: HPLC with ultraviolet detection; VWD: variable wavelength detection; LC-FL: HPLC with fluorescence detection; LC-PDA: HPLC with PDA detection; API: active pharmaceutical ingredient; N.I.: not informed.

74

Scientia Chromatographica 2015; 7(1):65-84

A review on chiral separation of third generation β-blockers

Singh AK, Pallastrelli MB, Santoro MIRM

Table 3. Enantiomeric separation of labetalol described in literature using HPLC-CSP. Analytical system

Column

Matrix

LC- PDA

Heterosubstituted polysaccharide derivatives 6-(R) Lab CSP

N.I.

LC- PDA

Heterosubstituted polysaccharide derivatives 6-(S) Lab CSP

N.I.

LC- PDA

Heterosubstituted polysaccharide derivatives 6-(R,S) Lab CSP

N.I.

LC-FL Ex: 340, Em: 389nm)

Asahipack ODP 50 (150 x 6 mm)

LC-UV (225nm)

Mobile phase

Hexane:isopropanol (80:20 v/v)

Flow Temp. Time of 1st –1 (mL.min ) (°C) analysis peak (min) (min)

2nd Capacity Separation Resolution Ref. peak factor factor (Rs) (min) (k’) (α)

1.0

N.I.

-

-

-

k1=2.65

-

1.00

57

1.0

N.I.

-

-

-

k1=1.60

-

1.00

57

Hexane:isopropanol (80:20 v/v), diethylamine 10 mM

1.0

N.I.

-

-

-

k1=3.50

-

1.00

57

Plasma

0.05 M diethylamine pH 11.5:acetonitrile (160:840 v/v), 0.036 M sodium chloride

0.9

N.I.

12

-

-

-

-

-

58

Teicoplanin chiral column (4.6 x 300 x 5 μm)

N.I.

Methanol:acetic acid:triethylamine (100:0.05:0.05 v/v/v)

1.0

Room temp.

-

-

-

k1=1.99 k2=2.20 k3=2.83

1.10/1.29

0.23/0.90

48

LC-UV (225nm)

Teicoplanin chiral column (4.6 x 300 x 5 μm)

N.I.

Methanol:acetic acid:triethylamine (100:0.10:0.10 v/v/v)

1.0

Room temp.

-

-

-

k1=1.83 k2=2.0 k3=2.60

1.09/1.30

0.18/0.93

48

LC-UV (225nm)

Teicoplanin chiral column (4.6 x 300 x 5 μm)

N.I.

Methanol:acetic acid:triethylamine (100:0.20:0.20 v/v/v)

1.0

Room temp.

-

-

-

k1=1.60 k2=1.71 k3=2.25

1.06/1.31

0.08/0.94

48

LC-UV (225nm)

Teicoplanin chiral column (4.6 x 300 x 5 μm)

N.I.

Methanol:acetic acid:triethylamine (100:0.50:0.50 v/v/v)

1.0

Room temp.

-

-

-

k1=1.50 k2=2.04

1.36

1.10/

48

LC-UV (225nm)

Teicoplanin chiral column (4.6 x 300 x 5 μm)

N.I.

Methanol:triethylamine (100:0.05 v/v)

1.0

Room temp.

-

-

-

k1=1.10 k2=1.16 k3=1.37

1.15/1.18

0.42/0.69

48

LC-UV (225nm)

Teicoplanin chiral column (4.6 x 300 x 5 μm)

N.I.

Methanol:triethylamine (100:0.10 v/v)

1.0

Room temp.

-

-

-

k1=0.67 k2=0.78 k3=0.91

1.16/1.18

0.20/0.46

48

LC-UV (225nm)

Teicoplanin chiral column (4.6 x 300 x 5 μm)

N.I.

Methanol:triethylamine (100:0.15 v/v)

1.0

Room temp.

-

-

-

k1=1.10 k2=1.16 k3=1.37

1.15/1.18

0.42/0.69

48

LC-UV (225nm)

Teicoplanin chiral column (4.6 x 300 x 5 μm)

N.I.

Methanol:acetic acid:triethylamine (100:0.05:0.05 v/v/v)

1.0

Room temp.

-

-

-

k1=0.99 k2=2.21 k3=2.83

1.10/1.29

0.23/0.90

48

LC-UV (225nm)

Teicoplanin chiral column (4.6 x 300 x 5 μm)

N.I.

Methanol:acetic acid:triethylamine (100:0.05:0.10 v/v/v)

1.0

Room temp.

-

k1=2.17 k2=2.27 1.05/1.31/1.09 0.01/0.96/0.18 k3=2.99 k4=3.26

Hexane:isopropanol (80:20 v/v), octanoic acid 10 mM

-

-

48

LC-UV: HPLC with ultraviolet detection; VWD: variable wavelength detection; LC-FL: HPLC with fluorescence detection; LC-PDA: HPLC with PDA detection; API: active pharmaceutical ingredient; N.I.: not informed.

Scientia Chromatographica 2015; 7(1):65-84 75

Singh AK, Pallastrelli MB, Santoro MIRM

A review on chiral separation of third generation β-blockers

Table 3. Enantiomeric separation of labetalol described in literature using HPLC-CSP. Analytical system

Column

Matrix

LC-UV (225nm)

Teicoplanin chiral column (4.6 x 300 x 5 μm)

N.I.

Methanol:acetic acid:triethylamine (100:0.05:0.15 v/v/v)

1.0

Room temp.

-

-

-

k1=1.66 k2=2.16 k3=2.46

1.30/1.14

0.91/0.48

48

LC-UV (225nm)

Teicoplanin chiral column (4.6 x 300 x 5 μm)

N.I.

Methanol:acetic acid:triethylamine (100:0.05:0.05 v/v/v)

1.0

Room temp.

-

-

-

k1=1.99 k2=2.21 k3=2.83

1.10/1.29

0.23/0.90

48

LC-UV (225nm)

Teicoplanin chiral column (4.6 x 300 x 5 μm)

N.I.

Methanol:acetic acid:triethylamine (100:0.10:0.05 v/v/v)

1.0

Room temp.

-

-

-

k1=1.63 k2=1.80 k3=2.37

1.11/1.32

0.18/0.94

48

LC-UV (225nm)

Teicoplanin chiral column (4.6 x 300 x 5 μm)

N.I.

Methanol:acetic acid:triethylamine (100:0.15:0.05 v/v/v)

1.0

Room temp.

-

-

-

k1=1.37 k2=1.48 k3=2.01

1.08/1.36

0.08/0.93

48

Chirobiotic V (250 x 4.6 mm)

N.I.

Methanol:acetic acid:diethylamine (100:0.3:0.1 v/v/v)

1.0

24

20

-

-

-

1.15/1.28

-

59

Lux Cellulose-3 (250 x 4.6 mm)

N.I.

Acetonitrile:100 mM KPF6 + 50 mM phosphate buffer (pH 2) (20:80 v/v)

1.0

20

-

-

-

-

-

1.28/2.10

38

N.I.

Methanol:water with 1%triethylamine adjusted to pH 4.2 (35:65 v/v)

0.7

N.I.

-

-

-

k1=3.02 k2=3.23

1.07

<0.3

60

LC-MS (329 > 311) LC-UV (220nm)

Labmade - heptakis(6LC-PDA deoxy-6-azido(200-300nm) phenylcarbamoylated)- cyclodextrin CSP

Mobile phase

Flow Temp. Time of 1st –1 (mL.min ) (°C) analysis peak (min) (min)

2nd Capacity Separation Resolution Ref. peak factor factor (Rs) (min) (k’) (α)

LC-UV (280nm)

(R)-α-Burke 2

N.I.

Ethanol:dichloromethane (10:90 v/v) with 20 mM ammonium acetate

2.0

N.I.

-

-

-

k1=2.48 k2=2.97

1.20

1.35

61

LC-UV (280nm)

(R)-α-Burke 2

N.I.

Ethanol:dichloromethane (10:90 v/v) with 20 mM ammonium acetate

2.0

N.I.

-

-

-

k1=4.44 k2=5.16

1.16

1.14

61

LC-UV (280nm)

(R)-α-Burke 2

N.I.

Ethanol:acetonitrile (20:80 v/v) with 12 mM ammonium formate

2.0

N.I.

-

-

-

k1=4.65 k2=5.13

1.10

1.68

61

LC-UV (280nm)

(R)-α-Burke 2

N.I.

Ethanol:acetonitrile (20:80 v/v) with 12 mM ammonium formate

2.0

N.I.

-

-

-

k1=7.01 k2=8.06

1.15

0.82

61

LC-UV

EnantioPac (100 x 4.0 mm)

N.I.

0.32 M ethylene glycol + 0.1M NaCl in 0.02 M phosphate buffer, pH 7.0

-

N.I.

-

-

-

k1=27

1.69

-

62

LC-UV

EnantioPac (100 x 4.0 mm)

N.I.

1.29 M ethylene glycol + 0.1M NaCl in0.02 M phosphate buffer, pH 7.0

-

N.I.

-

-

-

k1=12

1.64

-

62

LC-UV

EnantioPac (100 x 4.0 mm)

N.I.

0.25 M 1,2-butanediol + 0.1M NaCl in0.02 M phosphate buffer, pH 7.0

-

N.I.

-

-

-

k1=8.4

1.27

-

62

LC-UV

EnantioPac (100 x 4.0 mm)

N.I.

0.44 M ethanol + 0.1M NaCl in0.02 M phosphate buffer, pH 7.0

-

N.I.

-

-

-

k1=15

1.45

-

62

LC-UV

EnantioPac (100 x 4.0 mm)

N.I.

1.74 M ethanol + 0.1M NaCl in0.02 M phosphate buffer, pH 7.0

-

N.I.

-

-

-

k1=5.2

1.12

-

62

LC-UV: HPLC with ultraviolet detection; VWD: variable wavelength detection; LC-FL: HPLC with fluorescence detection; LC-PDA: HPLC with PDA detection; API: active pharmaceutical ingredient; N.I.: not informed.

76

Scientia Chromatographica 2015; 7(1):65-84

A review on chiral separation of third generation β-blockers

Singh AK, Pallastrelli MB, Santoro MIRM

Table 3. Enantiomeric separation of labetalol described in literature using HPLC-CSP. Analytical system

Column

Matrix

Mobile phase

Flow Temp. Time of 1st –1 (mL.min ) (°C) analysis peak (min) (min)

2nd Capacity Separation Resolution Ref. peak factor factor (Rs) (min) (k’) (α)

LC-UV

EnantioPac (100 x 4.0 mm)

N.I.

0.32 M ethylene glycol + 0.1M NaCl in0.02 M phosphate buffer, pH 7.0

-

N.I.

-

-

-

k1=25

1.37

-

62

LC-UV

EnantioPac (100 x 4.0 mm)

N.I.

1.29 M ethylene glycol + 0.1M NaCl in0.02 M phosphate buffer, pH 7.0

-

N.I.

-

-

-

k1=14

1.30

-

62

LC-UV

EnantioPac (100 x 4.0 mm)

N.I.

0.25 M 1,2-butanediol + 0.1M NaCl in0.02 M phosphate buffer, pH 7.0

-

N.I.

-

-

-

k1=9.6

1.17

-

62

LC-UV

EnantioPac (100 x 4.0 mm)

N.I.

0.44 M ethanol + 0.1M NaCl in0.02 M phosphate buffer, pH 7.0

-

N.I.

-

-

-

k1=19

1.28

-

62

LC-UV

EnantioPac (100 x 4.0 mm)

N.I.

1.74 M ethanol + 0.1M NaCl in0.02 M phosphate buffer, pH 7.0

-

N.I.

-

-

-

N.S.

N.S.

-

62

LC-UV: HPLC with ultraviolet detection; VWD: variable wavelength detection; LC-FL: HPLC with fluorescence detection; LC-PDA: HPLC with PDA detection; API: active pharmaceutical ingredient; N.I.: not informed.

Table 4. Enantiomeric separation of nebivolol described in literature using HPLC-CSP. Matrix

Mobile phase

Flow (mL.min–1)

Temp. (°C)

Time of analysis (min)

1st peak (min)

2nd peak (min)

Capacity factor (k’)

3-AmyCoat(amylosetris-3,5-dimethylphenyl carbamate) (250 x 4.6 mm)

API

nHeptane:ethanol:diethylamine (85:15:0.1, v/v/v)

3.0

27

12 min

-

-

k1=7.85 k2=10.90

1.39

1.83

63

LC-UV (220nm)

Cellulose Tris (3,5-dichlorolphenylcarbamate)

API

Isopropanol

0.50

23

-

-

-

k1=0.46 k2=0.79

1.72

-

64

LC-UV (220nm)

Chiralpak OZ-H

API

CO2:Methanol:Isopropyle amine:trifluroacetic acid, (75:25:0.1:0.1, v/v/v/v)

4.0

N.I.

-

-

-

1.5

-

65

LC-UV (220nm) and optical rotation detector

Chiralpak IA (250 x 4.6 mm)

API

n-Hexane:ethanolamine (100:0.1, v/v)

0.2

Room temperature

55

34.7

45.7

-

2.4

1.3

66

LC-UV (220nm)

Chiralpak AD (250 x 4.6 x 10 µm)

N.I.

Methanol

0.5

23 ± 1

-

-

-

k1=1.06 k2=1.95

1.84

0.96

24

LC-UV (220nm)

Chiralpak AD (250 x 4.6 x 10 µm)

N.I.

Methanol

1.0

23 ± 1

-

-

-

k1=1.88 k2=3.21

1.71

0.50

24

LC-UV (220nm)

Chiralpak AD (250 x 4.6 x 10 µm)

N.I.

Methanol

1.5

23 ± 1

-

-

-

k1=2.04 k2=3.38

1.66

0.41

24

LC-UV (220nm)

Chiralpak AD (250 x 4.6 x 10 µm)

N.I.

Ethanol

0.5

23 ± 1

-

33.39

43.88

k1=4.57 k2=6.32

1.38

2.63

24

LC-UV (220nm)

Chiralpak AD (250 x 4.6 x 10 µm)

N.I.

Ethanol

1.0

23 ± 1

-

-

-

k1=4.33 k2=6.06

1.40

2.28

24

LC-UV (220nm)

Chiralpak AD (250 x 4.6 x 10 µm)

N.I.

Ethanol

1.5

23 ± 1

-

-

-

k1=4.18 k2=5.77

1.38

1.40

24

LC-UV (220nm)

Chiralpak AD (250 x 4.6 x 10 µm)

N.I.

1-Propanol

0.5

23 ± 1

-

19.29

25.25

k1=4.22 k2=5.84

1.38

1.71

24

Analytical system

Column

LC-UV (225nm)

Separation Resolution factor (Rs) (α)

Ref.

LC-UV: HPLC with ultraviolet detection; LC-MS: HPLC with mass spectrometry; API: active pharmaceutical ingredient; N.I.: not informed.

Scientia Chromatographica 2015; 7(1):65-84 77

Singh AK, Pallastrelli MB, Santoro MIRM

A review on chiral separation of third generation β-blockers

Table 4. Enantiomeric separation of nebivolol described in literature using HPLC-CSP. Matrix

Mobile phase

Flow (mL.min–1)

Temp. (°C)

Time of analysis (min)

1st peak (min)

2nd peak (min)

Capacity factor (k’)

Chiralpak AD (250 x 4.6 x 10 µm)

N.I.

1-Propanol

1.0

23 ± 1

-

-

-

k1=2.10 k2=3.03

1.44

1.45

24

LC-UV (220nm)

Chiralpak AD (250 x 4.6 x 10 µm)

N.I.

1-Propanol

1.5

23 ± 1

-

-

-

k1=1.09 k2=1.86

1.71

1.21

24

LC-UV (220nm)

Chiralpak AD (250 x 4.6 x 10 µm)

N.I.

2-Propanol

0.5

23 ± 1

-

-

-

k1=1.53 k2=6.32

4.13

2.45

24

LC-UV (220nm)

Chiralpak AD (250 x 4.6 x 10 µm)

N.I.

2-Propanol

1.0

23 ± 1

-

-

-

k1=1.36 k2=5.96

4.38

2.36

24

LC-UV (220nm)

Chiralpak AD (250 x 4.6 x 10 µm)

N.I.

2-propanol

1.5

23 ± 1

-

4.88 13.72

-

k1=1.40 k2=5.85

4.18

2.53

24

LC-UV (220nm)

Chiralpak AD (250 x 4.6 x 10 µm)

N.I.

1-Butanol

0.1

23 ± 1

-

-

-

k1=3.16 k2=3.34

1.06

0.22

24

LC-UV (220nm)

Chiralpak AD-RH (150 x 4.6 mm)

N.I.

Ethanol

0.5

23 ± 1

-

22.59 30.38

-

k1=5.65 k2=7.94

1.41

1.73

24

LC-UV (220nm)

Chiralpak AD-RH (150 x 4.6 mm)

N.I.

Ethanol

1.0

23 ± 1

-

-

-

k1=3.00 k2=4.27

1.42

1.10

24

LC-UV (220nm)

Chiralpak AD-RH (150 x 4.6 mm)

N.I.

Ethanol

1.5

23 ± 1

-

-

-

k1=2.60 k2=3.75

1.44

1.15

24

LC-UV (220nm)

Chiralpak AD-RH (150 x 4.6 mm)

N.I.

1-Propanol

0.5

23 ± 1

-

-

-

k1=8.36 k2=11.5

1.38

1.76

24

LC-UV (220nm)

Chiralpak AD-RH (150 x 4.6 mm)

N.I.

1-Propanol

1.0

23 ± 1

-

-

-

k1=2.61 k2=3.83

1.47

1.20

24

LC-UV (220nm)

Chiralpak AD-RH (150 x 4.6 mm)

N.I.

1-Propanol

1.5

23 ± 1

-

13.17 17.45

-

k1=1.10 k2=1.75

1.59

1.10

24

LC-UV (225nm)

AmyCoat (150 x 4.6 x 3 µm)

API

nHeptane:ethanol:diethylamine (85:15:0.1, v/v/v)

3.0

27±1

-

10.91

16.72

NI

1.53

2.0

67

LC-MS 406 > 151

Chirobiotic V (250 x 4.6 mm)

Plasma

Methanol:acetic acid:diethylamine (100:0.15:0.05, v/v/v)

1.0

24

17

14.3

15.4

k1=2.6 k2=2.85

1.1

-

68

Analytical system

Column

LC-UV (220nm)

Separation Resolution factor (Rs) (α)

Ref.

LC-UV: HPLC with ultraviolet detection; LC-MS: HPLC with mass spectrometry; API: active pharmaceutical ingredient; N.I.: not informed.

4. Discussion and Conclusions

The high-performance liquid-chromatography with chiral stationary phase (HPLC-CSP) is a predominant technique in the separation, identification or quantification of enantiomers. The technique has been widely applied in the enantiomeric separation and optical purity determination of drugs in raw materials, pharmaceutical preparations and biological fluids, configurational instability studies of drugs (enantiomerization, racemization) and pharmacokinetics studies.

78

In recent years, numerous stereoselective materials have been studied and often made available in the marketed for the enantiomeric separation of basic, acidic and neutral properties. The most frequently used chiral selectors includes, polysaccharide derivatives, dinitrobenzoyl derivatives, proteins and glycoprotein derivatives, oligosaccharide (cyclodextrin) derivatives and macrocyclic antibiotics derivatives. These CSPs are able to separate enantiomers of large number of chemical and pharmaceutical compounds in normal phase, reverse phase and in polar organic phase. Most Scientia Chromatographica 2015; 7(1):65-84

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suppliers, of chiral columns, provide customer services and provide help in the development and assembly of tailor-made CSPs, taking into account the specific needs of the customers. Most of these columns are available for analytical (i.d. 2.1-4.6 mm) and semi-preparative (i.d.

10-100 mm) enantiomeric separation applications. The CSPs are prepacked with distinct chiral selector on 3, 5, 10, 20 µm silica.

The enantiomeric separation of carvedilol was successfully achieved on cellulose based[35-37,39,41] and amylose based[29,31,38,42] CSPs, in normal phase mode.

The cellulose tris (3, 5-dimethylphenylcarbamate) and cellulose tris (4-chloro-3-methylphenylcarbamate) chiral selector seem to have better enantioselectivity towards carvedilol, especially in polar organic mode[41].

The difference in enantioselectivity between above cited phases is due to structural difference of polysaccharides.

In recent years, cellulose and amylose derivatives with chlorine at 3 and/or 4 position of phenylcarbamate has shown to possess wider and better enantiomeric discrimination potential[30].

Typically, mobile phase composed of pure isopropanol or acetonitrile, with acidic or basic modifiers, presented results that are more efficient in the enantiomeric separation of carvedilol. Interestingly, when ethanol and methanol were used as eluents on same CSPs, only partial separations were observed. That can be explained by the fact that, the acetonitrile and isopropanol have greater steric hindrance due to their chemical conformation and molecular weight as compared to lower alcohols (methanol and ethanol), consequently showing less competition with the analytes towards CSPs[69].

Trace levels of strong acid (acetic acid, trifluoroacetic acid, formic acid) or base (diethylamine, triethylamine) in the mobile phase contribute to better selectivity amongst carvedilol enantiomer peaks.

According to literature, enantiomeric separation of acidic and basic drugs on polysaccharide based CSPs can be improved by addition of diethylamine and trifluoroacetic acid, respectively. In some cases, simultaneous use of a

Singh AK, Pallastrelli MB, Santoro MIRM

strong acid and base, at trace level, in the mobile phase can significantly improve selectivity as well as capacity factor of adjacent peaks[41,70]. It is evident that the normal phase mode presented better selectivity and efficiency in enantiomeric separations of carvedilol on cellulose and amylose based CSPs as compared to reverse phase mode[28,33,36,41].

As mentioned earlier, labetalol has two chiral centers and four enantiomers. It is evident that the cellulose and amylose based CSPs shows poor enantioselectivity towards four isomers of labetalol. A partial enantiomeric separation was obtained on amylose tris (3, 5-dimethylphenylcarbamate) CSP, in normal phase, using a mobile phase composed of heptane:ethanol, modified with diethylamine or trimethylamine[36,51,56].

Similar results were obtained in polar organic mode, on cellulose tris (3, 5-dimethylphenylcarbamate) and amylose tris (3, 5-dimethylphenylcarbamate)[31].

According to the literature, the chiral recognition mechanism of polysaccharides based columns is yet to be fully elucidated. It is believed that the chiral discrimination is possible due to the formation of inclusion complexes and polar interactions with CSPs carbamates group[71]. The carbamate group (CSP) interacts with the solute through hydrogen bonding with -NH and C=O and dipole-dipole interaction with the C=O. The number of hydroxyl groups, in drug structure, appears to be important for chiral recognition[72,73].

Baseline separation (α ≥ 1.1) of all four enantiomers of labetalol were obtained on a β-cyclodextrin based CSP, in normal as well as in polar organic phase[45,46,49,52,53]. Interestingly, the β-cyclodextrin based CSP presented partial enantioselectivity towards other third-generation β-blockers. That can be explained by the fact that, the formation of inclusion complexes depends on the shape, size and geometry of the solute and the diameter of the insertion cavity of β-cyclodextrin.

Thus, four enantiomers of labetalol were well separated while carvedilol[41], and nebivolol[52] were partially separated on β-cyclodextrin CSP.

Scientia Chromatographica 2015; 7(1):65-84 79

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A limited number of protein based CSPs have been studied for enantiomeric separation of the selected thirdgeneration β-blockers. The CSPs derived from bovine serum albumin (BSA) and human α1-acid glycoprotein (AGP) are commercially available. These CSPs are especially useful in enantioselective pharmacokinetic studies.

Originally, the first generation human α1-acid glycoprotein (AGP) based CSP was developed by Hermansson and co-workers[74] and CSP were denominated EnantioPac®. All separations obtained on EnantioPac® showed poor selectivity towards labetalol enantiomers[53,54,62].

In recent years, a new generation of α1-acid glycoprotein based CSP (CHIRAL AGP®) were introduced and presented exceptionally high enantioselectivity towards labetalol enantiomers. All four enantiomers can be separated to baseline, on new CHIRAL AGP®, with excellent selectivity between all peaks (α ≥ 1.1)[47,50].

Macrocyclic antibiotics represent a relatively new class of chiral selectors applied to enantiomeric separation of drugs with HPLC-CSPs. Since its introduction in 1994[75,76], the macrocyclic antibiotic based CSP present high degree of selectivity for large number of compounds and do not loose enantiomeric

A review on chiral separation of third generation β-blockers

separation efficiency. These CSPs have various stereogenic center and functional groups, thus allowing multiple interactions with chiral molecules. The mechanism of separation is based on hydrophobic and dipole-dipole interactions, hydrogen bonding as well as participation of steric repulsion forces[75,76].

The macrocyclic antibiotic based CSP, especially those derived from teicoplanin and vancomycin, are highly efficient in the enantiomeric separation of labetalol[48,59]. All four enantiomers were baseline separated in polar organic mode with trace levels of acetic acid and triethylamine in the mobile phase.

All ten stereoisomers of nebivolol were successfully separated on an amylose tris (3, 5-dimethylphenylcarbamate) based CSP in polar organic mode[24]. The mobile phase was composed of ethanol at a flow-rate of 0.5 ml/min[35].

In conclusion, the commercially available polysaccharide and macrocyclic antibiotic based CSPs has the broadest enantioselectivity for single (bucindolol, carvedilol) and multiple (labetalol, nebivolol) chiral center third-generation β-blockers. There is no universal CSP available on the market for enantiomeric separation of all third-generation β-blockers.

List of commercial chiral stationary phases applied to enantiomeric separation of third generation β-blockers through high performance liquid chromatography

Phenomenex 3022 = Chirex® (S)-ICA and (R)-NEA, LC Column 250 x 4.6 mm Chiral phase = (S)-indoline-2-carboxylic acid and (R)-1-( α-naphthyl)ethylamine Amphoteric glycopeptide teicoplanin (Chirobiotic T) Astec® CYCLOBOND I 2000 is β-cyclodextrin Human a-acid glycoprotein (AGP) = EnantioPac AGP = CHIRAL AGP = Bovine serum albumin (BSA) EnantioPac BSA = RESOLVOSIL-BSA Labmade – heptakis (6-deoxy-6-azidophenylcarbamoylated)- cyclodextrin (heptakis-N3-Ph-CD) Cellulose tris (3, 5-dimethylphenylcarbamate), [CHIRALCEL OD, Sepapak 1, Lux Cellulose I] Cellulose tris (3-chloro-4-methylphenylcarbamate), [CHIRALCEL OZ, Sepapak II, Lux Cellulose II] Cellulose tris (4-methylbenzoate), [CHIRALCEL OJ, Sepapak III, Lux Cellulose III] Cellulose tris (4-chloro-3-methylphenylcarbamate), [CHIRALCEL OX, Sepapak IV, Lux Cellulose IV] Amylose tris (3, 5-dimethylphenylcarbamate), [Chiralpak AD-H, Lux Amylose-1] Amylose tris (5-chloro-2-methylphenylcarbamate) [CHIRALPAK AY, Lux Amylose-2] 80

Scientia Chromatographica 2015; 7(1):65-84

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Singh AK, Pallastrelli MB, Santoro MIRM

References 1.

Kasai, H. F., Tsubuki, M., Matsuo, S. & Honda, T. Sub- and supercritical chiral separation of racemic compounds on columns with stationary phases having different functional groups. Chem. Pharm. Bull. (Tokyo). 53, 1270–1276 (2005).

2.

Eriksson, T., Björkman, S. & Höglund, P. Clinical pharmacology of thalidomide. Eur. J. Clin. Pharmacol. 57, 365–376 (2001).

3.

Hideshima, T. et al. Thalidomide and its analogs overcome drug resistance of human multiple myeloma cells to conventional therapy. Blood 96, 2943–2950 (2000).

4.

Beesley, T. E. & Lee, J. T. Method Development and Optimization of Enantioseparations Using Macrocyclic Glycopeptide Chiral Stationary Phases. Chiral Sep. Tech. A Pract. Approach, Third Ed. 1–28 (2007). doi:10.1002/9783527611737.ch1

5.

Rentsch, K. M. The importance of stereoselective determination of drugs in the clinical laboratory. J. Biochem. Biophys. Methods 54, 1–9 (2002).

6.

FDA. Drugs Development of New Stereoisomeric Drugs. (1992). at <http://www.fda.gov/drugs/GuidanceCompliance RegulatoryInformation/Guidances/ucm122883.htm>

7.

Santoro, M. I. R. M.; Singh, A. K. Development and regulation of chiral drug substances: an overview on worldwide pharmaceutical guidelines. Rev. Bras. Ciências Farm. 37, 259–268 (2001).

8.

Mehvar, R. & Brocks, D. R. Stereospecific pharmacokinetics and pharmacodynamics of β-adrenergic blockers in humans.

J. Pharm. Pharm. Sci. 4, 185–200 (2001).

9.

Reddy, I. K. & Mehvar, R. Chirality in Drug Design and Development. (CRC Press, 2004). doi:10.1201/9780203021811

10. Thompson, R. A practical guide to HPLC enantioseparations for pharmaceutical compounds. J. Liq. Chromatogr. Relat. Technol.

28, 1215–1231 (2005).

11. Gübitz, G. & Schmid, M. G. Chiral separation by chromatographic and electromigration techniques. A review. Biopharm. Drug Dispos. 22, 291–336 (2001).

12. Helfand M, Peterson K, Christensen V, Dana T, T. S. Drug Class Review on Beta Adrenergic Blockers. Drug Class Reviews (2009). at <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK47172/> 13. Consolim-Colombo FM, Irigoyen MC, K. E. in Hipertensão (ed. Brandão AA, Amodeo C, Nobre F, F. F.) 59–65 (Elsevier Ltd, 2006).

14. Weir, M. R. Beta-blockers in the treatment of hypertension: are there clinically relevant differences? Postgrad. Med. 121, 90–98 (2009).

15. Batlouni, M. & Albuquerque, D. C. de. Bloqueadores beta-adrenérgicos na insuficiência cardíaca. Arq. Bras. Cardiol. 75, 339– 349 (2000).

16. Borchard, U. Pharmacological properties of β-adrenoceptor blocking drugs.pdf. J. Clin. Basic Cardiol. 1, 5–9 (1998).

17. Firmida, C. D. C. & Mesquita, E. T. O paradoxo do tratamento do ICC com betabloqueadores. Implicaçäo para pacientes hipertensos. Rev. bras. Hipertens 8, 458–465 (2001).

18. Broeders, M. a et al. Nebivolol: a third-generation β-blocker that augments vascular nitric oxide release: endothelial β(2)adrenergic receptor-mediated nitric oxide production. Circulation 102, 677–684 (2000).

19. Bristow, M. R. β-adrenergic receptor blockade in chronic heart failure. Circulation 101, 558–569 (2000).

20. Bristow, M. R., Roden, R. L., Lowes, B. D., Gilbert, E. M. & Eichhorn, E. J. The role of third-generation β-blocking agents in chronic heart failure. Clin. Cardiol. 21, I3–I13 (1998).

21. Sweetman, S. C. Martindale: The Complete Drug Reference. (Pharmaceutical Press, 2011).

22. Moffat, A.C.; Osselton, M.D.; Widdop, B. Clarke’s analysis of drugs and poisons. (2003). doi:10.1080/00450618.2011.620006 23. Cheng, J. W. M. Nebivolol: a third-generation β-blocker for hypertension. Clin. Ther. 31, 447–462 (2009).

24. Aboul-Enein, H. Y. High-performance liquid chromatographic enantioseparation of drugs containing multiple chiral centers on polysaccharide-type chiral stationary phases. J. Chromatogr. A 906, 185–193 (2001).

25. Cockcroft JR, Chowienczyk PJ, Brett SE, Chen CP, Dupont AG, Van Nueten L, Wooding SJ, Ritter JM. Nebivolol vasodilates human forearm vasculature: evidence for an L-arginine/NO-dependent mechanism. J. Pharmacol. Exp. Ther. 274, 1067-1071 (1995).

26. Janssen WJ, X. R. and J. P. Animal pharmacology of nebivolol. Clin. Drug Investig. 3, 13–19 (1991).

Scientia Chromatographica 2015; 7(1):65-84 81

Singh AK, Pallastrelli MB, Santoro MIRM

A review on chiral separation of third generation β-blockers

27. Michael R. Bristow, J. D. P. Methods and compositions involving (S)-bucindolol. (2011). at <https://www.google.com/patents/ US8946284> 28. Magiera, S., Adolf, W. & Baranowska, I. Simultaneous chiral separation and determination of carvedilol and 5′-hydroxyphenyl carvedilol enantiomers from human urine by high performance liquid chromatography coupled with fluorescent detection. Cent.

Eur. J. Chem. 11, 2076–2087 (2013).

29. VanDenBosch, C., Massart, D. L. & Lindner, W. Evaluation of six chiral stationary phases in LC for their selectivity towards drug enantiomers. J. Pharm. Biomed. Anal. 10, 895–908 (1992).

30. Younes, A. a., Mangelings, D. & Vander Heyden, Y. Chiral separations in normal-phase liquid chromatography: Enantioselectivity of recently commercialized polysaccharide-based selectors. Part II. Optimization of enantioselectivity. J. Pharm. Biomed. Anal.

56, 521–537 (2011).

31. Mosiashvili, L., Chankvetadze, L., Farkas, T. & Chankvetadze, B. On the effect of basic and acidic additives on the separation of the enantiomers of some basic drugs with polysaccharide-based chiral selectors and polar organic mobile phases. J. Chromatogr.

A 1317, 167–174 (2013).

32. Ates, H., Mangelings, D. & Vander Heyden, Y. Chiral separations in polar organic solvent chromatography: Updating a screening strategy with new chlorine-containing polysaccharide-based selectors. J. Chromatogr. B Anal. Technol. Biomed. Life Sci. 875, 57–64 (2008).

33. De Klerck, K., Mangelings, D., Clicq, D., De Boever, F. & Vander Heyden, Y. Combined use of isopropylamine and trifluoroacetic acid in methanol-containing mobile phases for chiral supercritical fluid chromatography. J. Chromatogr. A 1234, 72–79 (2012).

34. Saito, M. et al. Enantioselective and highly sensitive determination of carvedilol in human plasma and whole blood after administration of the racemate using normal-phase high-performance liquid chromatography. J. Chromatogr. B Anal. Technol.

Biomed. Life Sci. 843, 73–77 (2006).

35. Dingenen, J. Polysaccharide phases in enatioseparation. In: A Practical Approach To Chiral Separations By Liquid Chromatography (ed. G. Subramanian) 147–150 (VCH, 1994).

36. Younes, A. a., Mangelings, D. & Vander Heyden, Y. Chiral separations in normal-phase liquid chromatography: Enantioselectivity of recently commercialized polysaccharide-based selectors. Part II. Optimization of enantioselectivity. J. Pharm. Biomed. Anal.

56, 521–537 (2011).

37. Vandenbosch, C., Lindner, W. & Massart, D. L. Evaluation of the enantioselectivity of an ovomucoid and a cellulase chiral stationary phase towards a set of β blocking agents. Anal. Chim. Acta 270, 1–12 (1992).

38. Younes, A. a., Mangelings, D. & Vander Heyden, Y. Chiral separations in reversed-phase liquid chromatography: Evaluation of several polysaccharide-based chiral stationary phases for a separation strategy update. J. Chromatogr. A 1269, 154–167 (2012).

39. Ji, B. Chiral separation of carvedilol enantiomers by HPLC using chiralcel. Fenxi Ceshi Xuebao 26, 585–586 (2007).

40. Medvedovici, A. et al. Achiral-chiral LC/LC-FLD coupling for determination of carvedilol in plasma samples for bioequivalence purposes. J. Chromatogr. B Anal. Technol. Biomed. Life Sci. 850, 327–335 (2007).

41. Clohs, L. & McErlane, K. M. Comparison between capillary electrophoresis and high-performance liquid chromatography for the stereoselective analysis of carvedilol in serum. J. Pharm. Biomed. Anal. 31, 407–412 (2003).

42. Vandenbosch, C., Hamoir, T., Massart, D. L. & Lindner, W. Evaluation of the enantioselectivity towards β-blocking agents of the α1-glycoprotein type chiral stationary phase: Chiral AGP glycoprotein type chiral stationary phase: Chiral AGP. Chromatographia 33, 454–462 (1992).

43. Poggi, J. C. et al. Analysis of carvedilol enantiomers in human plasma using chiral stationary phase column and liquid chromatography with tandem mass spectrometry. Chirality 24, 209–214 (2012).

44. Fairhurst, R. E., Chassaing, C., Venn, R. F. & Mayes, A. G. A direct comparison of the performance of ground, beaded and silicagrafted MIPs in HPLC and Turbulent Flow Chromatography applications. Biosensors and Bioelectronics 20, 1098–1105 (2004).

45. Chang, S. C., Reid, G. L., Chen, S., Chang, C. D. & Armstrong, D. W. Evaluation of a new polar—organic high-performance liquid chromatographic mobile phase for cyclodextrin-bonded chiral stationary phases. TrAC Trends Anal. Chem. 12, 144–153 (1993).

46. Dakers, J. M., Boulton, D. W. & Fawcett, J. P. Sensitive chiral high-performance liquid chromatographic assay for labetalol in biological fluids. J. Chromatogr. B Biomed. Appl. 704, 215–220 (1997).

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Scientia Chromatographica 2015; 7(1):65-84

A review on chiral separation of third generation β-blockers

Singh AK, Pallastrelli MB, Santoro MIRM

47. Doroudian, a, Yeleswaram, K., Rurak, D. W., Abbott, F. S. & Axelson, J. E. Sensitive high-performance liquid chromatographic method for direct separation of labetalol stereoisomers in biological fluids using an alpha 1-acid glycoprotein stationary phase.

J. Chromatogr. 619, 79–86 (1993).

48. Xu, B. J., Zhang, D. T., Shen, B. C. & Xu, X. Z. Enantioseparation of seven amino alcohols on teicoplanin chiral column. Chinese J. Anal. Chem. 35, 55–60 (2007).

49. Zhang, Y. & McConnell, O. Simulated moving columns technique for chiral liquid chromatography. J. Chromatogr. A 1028, 227–238 (2004).

50. Barbato, F., Carpentiero, C., Grumetto, L. & La Rotonda, M. I. Enantioselective retention of β-blocking agents on human serum albumin and α1-acid glycoprotein HPLC columns: Relationships with different scales of lipophilicity. Eur. J. Pharm. Sci. 38, 472–478 (2009).

51. Chassaing, C. & Thienpont, A. Regioselective carbamoylated and benzoylated cellulose for the separation of enantiomers in highperformance liquid chromatography. J. Chromatogr. A 738, 157–167 (1996).

52. Zhong, Q. et al. Development of dinitrophenylated cyclodextrin derivatives for enhanced enantiomeric separations by highperformance liquid chromatography. J. Chromatogr. A 1115, 19–45 (2006).

53. Zhao, J. et al. Preparation and application of rifamycin-capped (3-(2-O-β-cyclodextrin)-2-hydroxypropoxy)-propylsilylappended silica particles as chiral stationary phase for high-performance liquid chromatography. Talanta 83, 286–290 (2010).

54. Schill, G., Wainer, I. W. & Barkan, S. a. Chiral separations of cationic and anionic drugs on an alpha 1-acid glycoprotein-bonded stationary phase (EnantioPac). II. Influence of mobile phase additives and pH on chiral resolution and retention. J. Chromatogr.

365, 73–88 (1986).

55. Aboul-Enein, H. Y. & Ali, I. in Methods in molecular biology (Clifton, N.J.) (ed. Gerald Gübitz, M. G. S.) 243, 183–196 (2004).

56. Castells, C. B. & Carr, P. W. Fast enantioseparations of basic analytes by high-performance liquid chromatography using cellulose tris(3,5-dimethylphenylcarbamate)-coated zirconia stationary phases. J. Chromatogr. A 904, 17–33 (2000).

57. Felix, G. Regioselectively modified polysaccharide derivatives as chiral stationary phases in high-performance liquid chromatography. J. Chromatogr. A 906, 171–184 (2001).

58. Grellet, J., Michel-Gueroult, P., Ducint, D. & Saux, M. C. Sensitive high-performance liquid chromatographic method for the determination of labetalol diastereoisomers in plasma samples without derivatization. J. Chromatogr. B Biomed. Appl. 652, 59–66 (1994).

59. Carvalho, T. M. D. J. P. et al. Stereoselective analysis of labetalol in human plasma by LC-MS/MS: Application to pharmacokinetics.

Chirality 21, 738–744 (2009).

60. Wang, Y., Young, D. J., Tan, T. T. Y. & Ng, S. C. ‘ Click’ preparation of hindered cyclodextrin chiral stationary phases and their efficient resolution in high performance liquid chromatography. J. Chromatogr. A 1217, 7878–7883 (2010).

61. Welch, C. J. & Perrin, S. R. Improved chiral stationary phase for β-blocker enantioseparations. J. Chromatogr. A 690, 218–225 (1995).

62. Hermansson, J. Enantiomeric separation of drugs and related compounds based on their interaction with α1-acid glycoprotein.

TrAC Trends Anal. Chem. 8, 251–259 (1989).

63. Al-Othman, Z. a. & Ali, I. Rapid and economic chiral-HPLC method of nebivolol enantiomers resolution in dosage formulation.

Biomed. Chromatogr. 26, 775–780 (2012).

64. Ali, I. & Aboul-Enein, H. Y. Enantioseparation of some clinically used drugs by HPLC using cellulose Tris (3,5-dichlorophenylcarbamate) chiral stationary phase. Biomed. Chromatogr. 17, 113–117 (2003).

65. De Klerck, K., Vander Heyden, Y. & Mangelings, D. Generic chiral method development in supercritical fluid chromatography and ultra-performance supercritical fluid chromatography. J. Chromatogr. A 1363, 311–322 (2014).

66. Ghanem, A., Hoenen, H. & Aboul-Enein, H. Y. Application and comparison of immobilized and coated amylose tris-(3,5dimethylphenylcarbamate) chiral stationary phases for the enantioselective separation of β-blockers enantiomers by liquid chromatography. Talanta 68, 602–609 (2006).

67. Ali, I., Saleem, K., Gaitonde, V. D., Aboul-Enein, H. Y. & Hussain, I. Chiral separations of some β-adrenergic agonists and antagonists on AmyCoat column by HPLC. Chirality 22, 24–28 (2010).

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Singh AK, Pallastrelli MB, Santoro MIRM

A review on chiral separation of third generation β-blockers

68. Neves, D. V., Vieira, C. P., Coelho, E. B., Marques, M. P. & Lanchote, V. L. Stereoselective analysis of nebivolol isomers in human plasma by high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry: Application in pharmacokinetics. J. Chromatogr. B Anal. Technol. Biomed. Life Sci. 940, 47–52 (2013).

69. Kirkland, K. M. Optimization of chiral selectivity on cellulose-based high-performance liquid chromatographic columns using aprotic mobile-phase modifiers. J. Chromatogr. A 718, 9–26 (1995).

70. Tang, Y. Significance of mobile phase composition in enantioseparation of chiral drugs by HPLC on a cellulose-based chiral stationary phase. Chirality 8, 136–142 (1996).

71. Singh, A. K., Kedor-Hackmann, E. R. M. & Santoro, M. I. R. M. Enantiomeric separation and quantitative determination of propranolol enantiomers in pharmaceutical preparations by chiral liquid chromatography. Rev. Bras. Ciências Farm. 40, 301–308 (2004).

72. Okamoto, Y., Kawashima, M., Hatada, K. Chromatographic resolution. 11. Controlled chiral recognition of cellulose triphenylcarbamate derivatives supported on silica-gel. J. Chromatogr. 363, 173–186 (1986).

73. Okamoto, Y., Kawashima, M., Hatada, K. Useful chiral packing materials for high-performance liquid-chromatographic resolution of enantiomers: phenylcarbamates of polysaccharides coated on silica-gel. J. Am. Chem. Soc. 106, 5357–5359 (1984).

74. Hermansson, J. & Eriksson, M. Direct Liquid Chromatographic Resolution of Acidic Drugs Using a Chiral α1-Acid Glycoprotein Column (Enantiopac®). J. Liq. Chromatogr. Relat. Technol. 9, 621–639 (1986).

75. Ward, T. J. & Farris, A. B. Chiral separations using the macrocyclic antibiotics: A review. J. Chromatogr. A 906, 73–89 (2001).

76. Nyström, A., Strandberg, A., Aspegren, A., Behr, S. & Karlsson, A. Use of immobilized amyloglucosidase as chiral selector in chromatography. Immobilization and performance in liquid chromatography. Chromatographia 50, 209–214 (1999).

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Scientia Chromatographica 2015; 7(1):65-84

INSTITUTO INTERNACIONAL DE CROMATOGRAFIA

O Instituto Internacional de Cromatografia (IIC) possui como uma de suas principais missões o oferecimento de cursos de curta duração nas áreas de cromatografia e técnicas relacionadas.

Os objetivos dos cursos do IIC são o aprimoramento/formação/ atualização dos usuários das técnicas cromatográficas e afim (Preparo de Amostras, Espectrometria de Massas, Gestão da Qualidade, dentre outras), tanto do ponto de vista teórico quanto prático.

A filosofia educacional do IIC é: “ao invés de ensinar apenas como operar um equipamento específico (dar o peixe) o IIC ensina a técnica (como pescar)”.

Os cursos do Instituto Internacional de Cromatografia são coordenados pelos Diretores do IIC, e ministrados pelos coordenadores, auxiliados por uma equipe técnica e científica altamente qualificada, constituída de docentes pósgraduados nos melhores centros do país na área, e pós‑graduandos em fase de conclusão de suas teses. Na época em que cada curso for oferecido, uma relação dos instrutores é disponibilizada no website do IIC. O programa detalhado de cada curso pode ser obtido através de contacto com o IIC. Os cursos são ministrados com auxílio de recursos audiovisuais modernos (datashow‑computador; vídeos, demonstrações, resolução de problemas e outros recursos instrucionais). Os alunos recebem um livreto contendo cópia de todos os slides apresentados pelos instrutores, além de material bibliográfico de apoio. Em vários cursos também são fornecidos livros de autoria dos próprios docentes dos cursos. A maior parte dos cursos também tem aulas práticas de laboratório, conforme anunciado no folheto explicativo de cada curso.

Observações: • O I.I.C. oferece também cursos “in-house” (“in-company”). Interessados nesta modalidade devem contatar o IIC para obter mais detalhes.

• Com exceção dos cursos da área da qualidade (ISO, Validação e Auditoria) todos os demais possuem aulas teóricas e práticas de laboratório.

• O oferecimento efetivo de um curso depende de um número mínimo de inscritos no mesmo.

• O número de vagas dos cursos que envolvem laboratório está sendo limitado para melhor aproveitamento dos participantes.

• Visite o website www.iicweb.org para obter mais informações.

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Scientia Chromatographica 2015; 7(1)

BIBLIOTECA IIC

O Bookstore divulgará o material de informação e formação produzido pelo IIC, incluindo Livros, filmes, slides, material didático de cursos e outras formas de divulgação dos materiais por ele ­produzido. Esses materiais podem ser adquiridos do IIC através do website www.iicweb.org/biblioteca.php

Cromatografia Líquida Moderna - Fernando M. Lanças Livro publicado pela Editora Átomo em maio de 2009, aborda de forma simples e didática os principais assuntos relacionados à Cromatografia Líquida Moderna (HPLC ou CLAE), desde a Teoria, Instrumentação, Colunas, Detectores, até aspectos da Validação, Preparo da Amostra e Análise Quantitativa.

O IIC recomenda este livro para todos os interessados em iniciar-se ou ­atualizar-se nesta técnica.

Cromatografia em Fase Gasosa - Fernando M. Lanças Livro de autoria do Prof. Lanças, abordando todos os princípios básicos: instrumentação, análise qualitativa e quantitativa, detectores e muitos outros aspectos da Cromatografia Gasosa.

Altamente recomendado para os iniciantes na técnica, os quais encontrarão explicações detalhadas e simples a respeito da maior parte dos fundamentos básicos da técnica.

Extração em Fase Sólida - Fernando M. Lanças De autoria do Prof. Lanças, este livro apresenta e discute as várias formas de extração em fase sólida (SPE), desde a mais clássica empregando cartuchos até as mais atuais como discos, placas, ponteiras, e outras. Também discute os princípios da micro extração em fase sólida (SPME) e da extração por sorção em barras de agitação (SBSE).

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CALENDÁRIO DE CURSOS | 2015

Código da Disciplina

Mês

Data

Nome da Disciplina

Carga Horária

LC-01

Março

25 a 27

Cromatografia Líquida Básica – (HPLC/CLAE)

24

GC-01

Abril

15 a 17

Cromatografia Gasosa Básica – (HRGC)

24

SP-01

Maio

13 a 15

Técnicas Modernas de Preparo de Amostras

24

LC-04

Junho

18 e 19

Prever, evitar e resolver problemas em LC

16

CRO-00

Junho/Julho

30/06 a 03/07

Técnicas Cromatográficas de Análise

32

LC-01

Julho

15 a 17

Cromatografia Líquida Básica – (HPLC/CLAE)

24

GC-MS-01

Julho

28 a 31

Acoplamento GC-MS e GC-MS/MS

32

LC-MS-01

Agosto

18 a 21

Acoplamento LC-MS e LC-MS/MS

32

LC-02

Setembro

02 a 04

Cromatografia Líquida Moderna – Avanços

24

LC-06

Setembro

24 e 25

Otimização de Métodos em HPLC

16

GC-MS-01

Outubro

20 a 23

Acoplamento GC-MS e GC-MS/MS

32

LC-MS-01

Novembro

17 a 20

Acoplamento LC-MS e LC-MS/MS

32

LC-01

Dezembro

02 a 04

Cromatografia Líquida Básica – (HPLC/CLAE)

24

GC-01

Dezembro

09 a 11

Cromatografia Gasosa Básica – (HRGC)

24

CURSOS COM TEORIA E PRÁTICA

Os cursos promovidos pelo IIC são ministrados por docentes e convidados, e abordam vários temas de grande relevância no momento.

Consulte-nos em relação à valores e descontos especiais, bem como sobre transporte e hospedagem.

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NORMAS PARA PUBLICAÇÃO

Normas para publicação de artigos no Scientia Chromatographica (a versão detalhada está disponível em nosso portal www.scientiachromatographica.com).

Escopo

Scientia Chromatographica publica trabalhos em todas as áreas da Cromatografia, incluindo GC (colunas capilares, empacotadas, preparativas), LC (convencional, HPLC, U-HPLC, Prep-LC, micro-LC, nano-LC, TLC, PC), SFC (colunas empacotadas ou capilares), Técnicas Acopladas (GC-MS, LC-MS, SFC-MS, LC-GC, SFE-CE, GCxGC, LCxLC) e Técnicas de Preparo de Amostras (SPME, SBSE, MEPS, QuEChERS, LLE, MAE,SPE, LLE, etc.). A partir de 2012 o Scientia publica os seguintes formatos de artigos: • Artigos Originais de Pesquisa • Comunicação (“Short Communication”) • Artigos de Revisão Crítica Os artigos de Revisão Crítica deverão antes de sua submissão serem discutidos com um dos c­o-editores mais relacionados ao assunto em questão. Devem conter uma contribuição nova a respeito de um assunto de grande interesse atual, incluindo uma discussão a respeito das vantagens e desvantagens do mesmo. O Scientia não publica apenas relato de artigos descritos na literatura, sem uma discussão crítica sobre os mesmos.

Os artigos Originiais de Pesquisa deverão conter resultados de laboratório e/ou teóricos, que signifiquem uma contribuição expressiva para a área de técnicas de separação, seja ela conceitual, na instrumentação, ou na aplicação.

Os artigos do tipo Comunicação deverão ter a mesma qualidade dos artigos Originais, porém devido a seu caráter de comunicação preliminar usualmente são de menor extensão.

Envio do Artigo

Os artigos deverão ser encaminhados para periodico@scientiachromatographica.com. Os artigos do tipo Revisão deverão antes de seu envio pelo website ter o aval de um dos co-Editores do periódico, caso contrário não serão avaliados.

Todos os artigos, independentemente do formato, deverão ser submetidos exclusivamente ao Scientia, com o entendimento de que eles não foram anteriormente submetidos, não estão sendo e não serão posteriormente publicados em outro veículo.

Autores que utilizarem tabelas, ilustrações, figuras, ou textos contendo mais de 25 palavras, anteriormente publicados em outro periódico – sendo ou não autores do artigo – deverão obter a devida permissão por escrito do portador dos direitos de cópia (“Copyright ”). Esse documento deverá permanecer de posse dos autores, sendo encaminhado ao Scientia, quando solicitado.

Idioma

Os artigos, com exeção dos de Revisão, podem ser escritos preferencialmente em inglês, porém em Português e Espanhol também serão aceitos. Os autores cujo idioma nativo não for o empregado na redação do artigo são orientados a solicitar a colaboração de colegas fluentes no idioma, antes de enviar o artigo para o periódico.

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NORMAS PARA PUBLICAÇÃO

Tipos de contribuições aceitas para publicação no Scientia O Scientia Chromatographica considera para publicação quatro tipos de contribuição:

Artigos Originais de pesquisa: descrevem resultados de estudos completos. Deverão conter resultados de laboratório e/ou teóricos, que signifiquem uma contribuição expressiva para a área de técnicas de separação, seja ela conceitual, na instrumentação, ou na aplicação. Este tipo de contribuição é limitado a 6.000 palavras, incluindo as legendas das figuras e as referências, e no máximo 5 tabelas e/ou figuras somados. No momento do envio da prova de impressão, caso isto ocorra o autor será consultado se prefere revisar o artigo para enquadrá-lo em até 7 páginas, ou se prefere pagar as páginas excedentes. O número de páginas de um artigo depende muito das figuras e tabelas do mesmo. Este critério não é aplicado aos artigos convidados, cujo número de páginas será informado ao autor no momento do convite.

Comunicações (“Short Communication”): são artigos completos, porém que relatam resultados mais curtos, oportunos, e/ou cuja relevância requer sua rápida publicação. Deverão ter a mesma qualidade dos artigos Originais porém, devido a seu caráter de comunicação preliminar, usualmente são de menor extensão. Este tipo de publicação deve ter no máximo quatro páginas impressas, incluindo todo o artigo, ou seja, tabelas, figuras e referências. O autor deve indicar claramente que se trata de uma comunicação no topo da primeira página do artigo.

Artigos de Revisão crítica: revisões críticas sobre uma area específica das técnicas cromatográficas e relacionadas são também consideradas para publicação. Esses artigos devem se limitar a no máximo 10.000 palavras, incluindo as legendas, e até 10 tabelas e figuras somadas. Os artigos de Revisão Crítica deverão antes de sua submissão serem discutidos com um dos co-Editores mais relacionados ao assunto em questão. Artigos não encaminhados desta forma serão antes enviados a um co-Editor da área em que se enquadre para parecer e, somente então, serão enviados aos revisores, podendo atrasar significativamente sua publicação. Devem conter uma contribuição nova a respeito de um assunto de grande interesse atual, discutindo as vantagens e desvantagens do mesmo. O Scientia não publica apenas relato de artigos descritos na literatura, sem uma discussão crítica sobre os mesmos.

Artigos de Alta Prioridade: são publicados no primeiro número disponível do periódico, recebendo prioridade máxima de todo o sistema Editorial do periódico. Para justificar sua publicação como alta prioridade, os manuscritos deverão apresentar, de forma resumida, resultados importantes de recentes desenvolvimentos na área de cromatografia e técnicas relacionadas (espectrometria de massas, preparo de amostras, eletroforese capilar e outros). Não precisam conter resultados experimentais detalhados, sendo limitados a 2.500 palavras e três figuras e/ou tabelas combinadas.

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Scientia Chromatographica Corpo Editorial Consultivo

Editor-in-Chief

Fernando M. Lanças Universidade de São Paulo Instituto de Química de São Carlos 13560-970 São Carlos (SP) - Brasil editor@scientiachromatographica.com

Editores Associados

Carol H. Collins Pilares da Cromatografia

Isabel C. S. Fontes Jardim Cromatografia Líquida

Maria E. Queiroz Preparo de Amostras

Renato Zanella Preparo de Amostras

Daniel Armstrong – EUA Dietrich von Bauer – Chile Fábio Augusto – Brasil Fátima Dutra – Brasil Flávio Leite – Brasil Frank Svec – EUA Harold McNair – EUA Humberto Gómez – México Isabel Cristina Sales Fontes Jardim – Brasil Jailson B. de Andrade – Brasil Janusz Pawliszyn – Canadá Kiyoratsu Jinno – Japão Luigi Mondello – Itália Marcos Eberlin – Brasil Marina Tavares – Brasil Milos Novotny – EUA Milton Lee – EUA Norberto Peporine Lopes – Brasil Phillip Marriott – Australia Pierina Bonato – Brasil Quézia Cass – Brasil Renato Zanella – Brasil Endereço do Periódico

Elena Stashenko Espectrometria de Massas

José Manuel F. Nogueira Preparo de Amostras

Scientia Chromatographica Rua Princesa Isabel, 265 - Jardim Paraíso 13.561-140 - São Carlos (SP) - Brasil Fone/Fax: (16) 3501-4140 karen.favaro@iicweb.org / info@iicweb.org www.scientiachromatographica.com

Ficha catalográfica elaborada pela Seção de Aquisição e Tratamento da Informação do SBI/IQSC Alejandro Cifuentes Técnicas Eletroforéticas

Álvaro J. Santos Neto Troubleshooting

Scientia Chromatographica / Associação Internacional de Cromatografia. - vol.7 n.1 (jan./mar. 2015). São Carlos: Associação Internacional de Cromatografia, 2015 Trimestral ISSN 1984-4433 1. Cromatografia. 2. Lanças, Fernando Mauro, editor chefe.

Cláudia Zini Cromatografia Gasosa

Elina B. Caramão Cromatografia Gasosa

CDD 543.8

ISSN 1984-4433

www.scientiachromatographica.com

2015

Volume 7 | Número 1 7

SCIENTIA CHROMATOGRAPHICA

Publicação disponível na internet:

Electrokinetic chromatography: an historical review of developments in theory and practice Christopher P. Palmer

2015 | Volume 7 | Número 1

31 Estado-da-arte na análise cromatográfica de Ocratoxina A em amostras de alimentos Mariane A. Andrade, Fernando M. Lanças

53 Determinação de açúcares em suco concentrado e néctar de uva: comparativo empregando refratometria, espectrofotometria e cromatografia líquida Bárbara Sthéfani Caldas, Leonel Vinicius Constantino, Cyntia Helena Gomes Alves Silva, Tiago Bervelieri Madeira, Suzana Lucy Nixdorf

65 Direct chiral separations of third generation b-blockers through high performance liquid chromatography: a review Anil Kumar Singh, Michele Bacchi Pallastrelli, Maria Inês Rocha Miritello Santoro

Rua Princesa Isabel, 265 - Jardim Paraíso São Carlos (SP) - CEP 13561-140 Fone/ Fax: (16) 3501-4140 | www.iicweb.org

2015 | Volume 7 | Número 1

Instituto Internacional de Cromatografia

Uma publicação do Instituto Internacional de Cromatografia www.iicweb.org