v10n2

ISSN 1984-4433

www.scientiachromatographica.com

2018

Volume 10 | Número 2

SCIENTIA CHROMATOGRAPHICA

Publicação disponível na internet:

81 42nd International Symposium on Capillary Chromatography and 15th GCxGC Symposium Fernando Mauro Lanças

2018 | Volume 10 | Número 2

89 Influence of high inlet pressure gas chromatography (HIPGC) on analytes retention time Meire Ribeiro da Silva, Ana Lúcia de Toffoli, Edvaldo Vasconcelos Soares Maciel, Fernando Mauro Lanças

99 Extração líquido-líquido assistida pelo efeito salting out para análise de amostras biológicas Caroline Fernandes Grecco, Luis Felippe Cabral Miranda, Jonas Carneiro Cruz, Maria Eugênia Costa Queiroz

111 Determinação de resíduos de pesticidas em planta de arroz empregando QuEChERS modificado e cromatografia gasosa com detecção por captura de elétrons Juliana P. Cogo, Sandra C. Peixoto, Gustavo M. Teló, Enio Marchesan, Renato Zanella

Rua Princesa Isabel, 265 - Jardim Paraíso São Carlos (SP) - CEP 13561-140 Fone/ Fax: (16) 3501-4140 | www.iicweb.org

2018 | Volume 10 | Número 2

Instituto Internacional de Cromatografia

Uma publicação do Instituto Internacional de Cromatografia www.iicweb.org

Scientia Chromatographica EDITOR-IN-CHIEF

FERNANDO MAURO LANÇAS Universidade de São Paulo Instituto de Química de São Carlos 13560-970 São Carlos (SP) - Brasil editor@scientiachromatographica.com EDITORES ASSOCIADOS

MARIA EUGÊNIA QUEIROZ

RENATO ZANELLA

preparo de amostras

preparo de amostras

JOSÉ MANUEL F. NOGUEIRA

ISABEL C. S. FONTES JARDIM

preparo de amostras

CORPO EDITORIAL CONSULTIVO

Daniel Armstrong – EUA Dietrich von Bauer – Chile Fábio Augusto – Brasil Fátima Dutra – Brasil Flávio Leite – Brasil Frank Svec – EUA Harold McNair – EUA Humberto Gómez – México Isabel Cristina Sales Fontes Jardim – Brasil Jailson B. de Andrade – Brasil Janusz Pawliszyn – Canadá Kiyoratsu Jinno – Japão Luigi Mondello – Itália Marcos Eberlin – Brasil Marina Tavares – Brasil Milos Novotny – EUA Milton Lee – EUA Norberto Peporine Lopes – Brasil Phillip Marriott – Austrália Pierina Bonato – Brasil Quézia Cass – Brasil Renato Zanella – Brasil

cromatografia líquida

ENDEREÇO DO PERIÓDICO

Scientia Chromatographica

ELENA STASHENKO

espectrometria de massas

FABIO AUGUSTO

cromatografia gasosa

ALEJANDRO CIFUENTES

Técnicas Eletroforéticas

ÁLVARO J. SANTOS NETO

troubleshooting

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Ficha catalográfica elaborada pela Seção de Aquisição e Tratamento da Informação do SBI/IQSC Scientia Chromatographica / Associação Internacional de Cromatografia. - vol.10 n.2 (abr./jun. 2018). São Carlos: Associação Internacional de Cromatografia, 2018.

Trimestral ISSN 1984-4433

CLÁUDIA ZINI

cromatografia gasosa

ELINA B. CARAMÃO

cromatografia gasosa

1. Cromatografia. 2. Lanças, Fernando Mauro, editor chefe.

CDD 543.8

ISSN 1984-4433

Periódico Trimestral do Instituto Internacional de Cromatografia

2014| |Volume Volume106 | Número 12 2018

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Scientia Chromatographica 2018; 10(2):77 Instituto Internacional de Cromatografia ISSN 1984-4433

SUMÁRIO

Editorial..................................................................................................................................................................................................................79 Os Editores

MEETING REPORT 42nd International Symposium on Capillary Chromatography and 15th GCxGC Symposium.............81 Fernando Mauro Lanças

GAS CHROMATOGRAPHY Influence of high inlet pressure gas chromatography (HIPGC) on analytes retention time..............89 Meire Ribeiro da Silva, Ana Lúcia de Toffoli, Edvaldo Vasconcelos Soares Maciel, Fernando Mauro Lanças

Scientia Chromatographica

SAMPLE PREPARATION Extração líquido-líquido assistida pelo efeito salting out para análise de amostras biológicas..........99 Caroline Fernandes Grecco, Luis Felippe Cabral Miranda, Jonas Carneiro Cruz, Maria Eugênia Costa Queiroz

GC-ECD Determinação de resíduos de pesticidas em planta de arroz empregando QuEChERS modificado e cromatografia gasosa com detecção por captura de elétrons................................................................... 111 Juliana P. Cogo, Sandra C. Peixoto, Gustavo M. Teló, Enio Marchesan, Renato Zanella

Instituto Internacional de Cromatografia...............................................................................................................................................119 Bookstore............................................................................................................................................................................................................120 Normas para Publicação...............................................................................................................................................................................121

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Scientia Chromatographica 2018; 10(2):79 Instituto Internacional de Cromatografia ISSN 1984-4433

EDITORIAL

Scientia Chromatographica Volume 10, Número 2 de 2018

O número 2 do volume 10 do Scientia Chromatographica (SC V10N2) traz um relatório de um congresso (“meeting report”) popularmente conhecido como Simpósio de Riva por ser realizado cada dois anos na cidade de Riva del Garda, Itália. Trata-se do 42 o Simpósio Internacional de Cromatografia Capilar (42 nd International Symposium on Capillary Chromatography), o mais importante evento realizado bianualmente na Europa que trata de todas as formas e aspectos da cromatografia capilar (gasosa, líquida, fluido supercrítico, eletrocromatografia, e outras), assim como de técnicas associadas.

Este evento, organizado inicialmente por Rudolf Kaiser e posteriormente por Pat Sandra, passou a ser recentemente coordenado por Luigi Mondello, o qual implementou ênfase em vários assuntos, dentre os quais a cromatografia multidimensional. Lembro-me de ter assistido, em diferentes versões deste simpósio, palestras de Marcel Golay, Giddings, Huber, Horvath, Jorgenson, Cramers, Novotny, e muitos outros considerados os “pilares” da cromatografia moderna. Eventos como esses trazem muitos frutos, especialmente contatos importantes que podem perdurar por toda nossa vida professional.

Ainda em relação a eventos, gostaríamos de informar que o Congresso Latino-Americano de Cromatografia (COLACRO), depois de duas edições seguidas fora do Brasil (Lisboa, Portugal e Cartagena de Indias no Caribe Colombiano) será realizado em julho do próximo ano na simpática Aracajú prestigiando, assim, o Nordeste brasileiro. O website do evento já está no ar, e esperamos contar com a presença de todos.

Além de eventos, este número do Scientia conta com artigos enfocando aplicações das técnicas de separação, assim como relata um estudo fundamental/instrumental sobre o uso de pressões elevadas em cromatografia gasosa. Neste ultimo artigo introduzimos dados adicionais do artigo no formato de Material Suplementar, prática a qual está se tornando bastante popular entre os periódicos da área.

O Corpo Editorial do Scientia deseja a todos boa leitura, esperando que seu conteúdo seja de utilidade para os leitores do periódico.

Os Editores

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Scientia Chromatographica 2018; 10(2):81-87 Instituto Internacional de Cromatografia http://dx.doi.org/10.5935/sc.2018.004 ISSN 1984-4433

Fernando M. Lanças University of São Paulo Institute of Chemistry São Carlos, Brasil

MEETING REPORT

Resumo

O 42nd International Symposium on Capillary Chromatography and 15th GCxGC é reconhecido como um dos mais importantes forum para discussão das técnicas cromatográficas e relacionadas, assim como um dos principais e de maior longevidade em todo o mundo nesta área. Além das conferências apresentadas por pesquisadores de renome internacional na área, o evento dá uma grande oportunidade para os pesquisadores mais novos apresentarem seus trabalhos na forma de “keynotes”. Uma grande exposição de equipamentos, acessórios e literatura apresenta as recentes inovações desenvolvidas na área. Também são apresentados Pôsteres abordando tanto aspectos fundamentais quanto aplicações na área. No presente relatório é apresentado um resumo das principais atividades desenvolvidas durante a versão mais recente do evento.

Abstract

The 42nd International Symposium on Capillary Chromatography and 15th GCxGC Symposium is recognized as one of the most relevant forum for the discussion of the chromatographic and allied techniques and one of the oldest meetings on the subject worldwide. In addition to the Plenary Lectures delivered by recognized specialists in their field, the meeting gives also an important opportunity to young scientists to present their work as keynote lectures. In parallel with the scientific aspects of the meeting an important Exhibition session displaying equipment, accessories, printed literature, movies/videos and other formats brings to delegates the latest information on the area. In addition, a successful Poster session is presented along the meeting involving many fundamental works as well as application in different areas. In the present report, the author presents the main features of the most recent version of the meeting.

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Lanças FM

42nd International Symposium on Capillary Chromatography and 15th GCxGC

1. Introdução

A 42a versão do “INTERNATIONAL SYMPOSIUM ON CAPILLARY CHROMATOGRAPHY (ISCC) THE 15th GC×GC SYMPOSIUM” ou, simplesmente, Riva-2018, foi realizada entre 13 e 18 de maio, 2018, na belíssima cidade turística de Riva del Garda, localizada aos pés dos Alpes e ao redor do Lago de Garda, no norte da Itália (Figura 1).

Trata-se de um dos mais importantes fórum para discussão das recentes inovações na área de cromatografia e técnicas associadas ainda em atividade. Inicialmente com foco apenas em técnicas

cromatográficas, com o tempo incorporou também outras técnicas associadas como a espectrometria de massas, eletroforese capilar, técnicas de preparo de amostras e outras, transformando-se em um dos mais importantes eventos científicos da Europa na área de ciências da separação. Realizado a cada dois anos (anos pares), geralmente no mês de maio, o evento transformou-se em uma reunião científica e de lançamento de novos equipamentos, acessórios, literatura e encontro de pesquisadores da área para debaterem seus últimos avanços.

Figura 1. Riva del Garda, Itália.

Segundo a Comissão Organizadora, o evento de 2018 contou com cerca de 800 participantes, número considerado significativo para eventos de áreas específicas como este, sendo apresentados cerca de 350 pôsteres. Mais de 30 companhias – desde as mais conhecidas no mercado até pequenas empresas do tipo “spin-off” – estiveram presentes expondo seus mais recentes produtos.

82

2. O “Pré-Congresso” sobre técnicas multidimensionais comprehensive, denominando “GCxGC Symposium” Com a evolução das técnicas multidimensionais do tipo “comprehensive” (abrangente) o “Congresso de Riva” incorporou, antes da abertura oficial do evento, um “pré-congresso” exclusivo sobre as técnicas multidimensionais “comprehensive”, tanto GCxGC Scientia Chromatographica 2018; 10(2):81-87

42nd International Symposium on Capillary Chromatography and 15th GCxGC

Lanças FM

quanto LCxLC. O dia 13 de maio, domingo, foi dedicado a dois cursos: GCxGC e LCxLC. A abertura deste “précongresso” ocorreu no dia seguinte, 14 de maio, com a entrega do prêmio “Lifetime Achievement Award”para Jean-Françoi F. Focant, da University of Liege, Belgium, o qual apresentou a palestra “GCxGC-(HT)TOFMS: From expectations to practical applications”. Foram apresentadas 27 palestras (lectures) no período da manhã até a parada para o café da tarde (Figura 2), retornando as 16:40 com 18 apresentações orais no formato de “keynotes”.

• The ‘M.J.E. Golay Award 2018’

As seguintes premiações foram entregues durante o evento, sendo algumas no ato da abertura, outras ao longo do mesmo e outras na sessão de encerramento:

• The ‘Chromatographia-Springer Best Poster Award 2018’

• The ‘Leslie S. Ettre Award 2018’ • The ‘Giorgio Nota Award 2018’ • The ‘John Phillips Award 2018’ • The ‘GCxGC Lifetime Achievement Award 2018’ • The ‘Giovanni Dugo Award 2018’ • The ‘Best Journal of Chromatography A: Young Scientist Award 2018’ The ‘Genzo Shimadzu Best Oral/Poster Award 2018’ • The ‘Richard Sacks Best Poster Award 2018’

• The ‘Analytical Methods Best Poster Awards 2018’

Figura 2. Intervalo para o café, o qual é servido na área onde também ocorrem os Pôsteres e a Exposição de equipamentos. Notar que a estrutura é uma “barraca” coberta de lona, similar às barracas de circo.

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Lanças FM

42nd International Symposium on Capillary Chromatography and 15th GCxGC

3. O “Simpósio de Riva 2018” ou seja, o “42nd International Symposium on Capillary Chromatography, ISCC”

No dia 15 de maio, terça-feira, às 08:45 o Prof.

Luigi Mondello da Universidade de Messina coordenou a abertura oficial do ISCC, a qual foi seguida da palestra “Practical Implications of Chromatographic Theory” por Leonid M. Blumberg da Advachrom,USA, recebedor da Medalha Marcel Golay. A seguir Milton Lee, da Brigham Young University, Provo, UT, USA, apresentou a palestra de abertura “Novel Column Technologies for Portable Capillary Chromatography”. A palestra foi seguida de intervalo para café, o qual foi servido na área da Exposição de equipamentos e acessários (Figura 3), aberta neste momento.

multidimensional “comprehensive” (14 palestras) enquanto que no outro era dado início à parte do ISCC com a Sessão 1 sobre “Microcolumn Separations” com 16 palestras apresentadas. No início desta sessão Hernan J. Cortez, USA, recebeu o prêmio “Giorgio Nota Award Lecture” patrocinado pela Waters, ocasião na qual apresentou a palestra “Microcolumn Liquid Chromatography. Then And Now”. Dentre as outras apresentações que seguiram a de Hernan destacaram-se a de Gert Desmet da Vrije Universiteit Brussel, Brussels, Belgium, sobre o tema “On The Fabrication of Perfectly Ordered Chromatographic Media” e os resultados apresentados por Adam T. Woolley da Brigham Young University, USA, sobre “3D Printed Microfluidic Systems for Separation Science”.

A partir das 10:50 as atividades foram divididas em duas partes: uma parte em um auditório deu-se continuidade às apresentações sobre cromatografia

Às 16:20 foi oferecido um café na área da Exposição, onde também se encontravam montados os Pôsteres, permitindo ampla interação entre os

Figura 3. Vista parcial da Exposição.

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congressistas e visita aos trabalhos expostos neste formato. Logo após o intervalo do café houve a apresentação de seminários técnicos pelas empresas patrocinadoras do evento, seguidos da continuidade da sessão sobre “Microcolumn Separations”.

No final desta tarde houve a entrega de vários prêmios para os melhores posteres e apresentações orais, seguido do encerramento do evento sobre “cromatografia multidimensional comprehensive” às 18:30. A noite houve um concerto, seguido de um coquetel.

No dia 16 de maio, quarta-feira, houve prossegui­ mento das atividades do ISCC, agora ocupando os dois auditórios. Em um auditório (room 1000) ocorreu a sessão “Capillary GC-MS and IRMS”, enquanto que no outro (room 300) deu-se a sessão “Bio/Pharma. Foram apresentadas 22 palestras e 14 “keynote lectures” neste dia, em paralelo com as sessões de posteres, exposição de equipamentos e acessórios, e seminários técnicos coordenados pelas empresas patrocinadoras do evento.

Na sala 1000 foram apresentadas 6 palestras focalizando diferentes aspectos do acoplamento GC-MS e suas várias aplicações. Destaque para os trabalhos apresentados por Aviv Amirav sobre “GC-MS with Cold EI-extending the range of compounds and applications amenable for GCMS Analysis” e o trabalho apresentado por Torsten C. Schmidt “Sample Introduction in Compound-Specific Stable Isotope Analysis: The Quest For Isotope Integrity”.

Na sala 300 destaque foi dado às apresentações de Milos Novotny, da Indiana University, USA, um dos pioneiros da cromatografia líquida capilar moderna, sob o tema “Separation strategies for comprehensive coverage of Human Glycome” e de Christian Huber da University of Salzburg, Austria com o tema “Microscale and Capillary scale HPLC-MS methods for Biopharmaceutical Analysis”. Às 12:00 houve um coquetel de lançamento do periódico Journal of Separation Plus, o qual é editado por Frank Svec, mesmo editor do Journal of Separation (Figura 4). Trata-se de mais uma alternativa de periódico

Lanças FM

para publicação de resultados na área de separações, editado pela Wiley.

No período do almoço foram apresentados seminários técnicos pelos patrocinadores, seguidos de 5 palestras na Sessão “Capillary GC 1”, a qual ocorreu na sala 1000, e em paralelo 5 palestras na sessão “Multidimensional and other Comprehensive Techniques” na sala 300. O destaque na sala 1000 foi a apresentação “Hyphenation of High Resolution CGC with Condensed-Phase FTIR: Optimization of Resolution, Sensitivity And Solute Capacity” por Pat Sandra do RIC, Bélgica. Na sala 300 o destaque foi para os trabalhos “Comprehensive 2D-LC in the Analysis Of Food Products” por Paola Dugo e “Developing methods and devices for Multi-Dimensional Liquid Chromatography” por Peter Schoenmakers. Essas atividades foram seguidas por duas sessões em paralelo denominadas “Keynote Lectures: Young Scientists”, nas quais entre 17:00 e 18:30 foram apresentadas 16 keynotes por jovens pesquisadores, abordando vários assuntos relacionados aos assuntos do simpósio.

No final da tarde houve uma evento de confraternização acompanhado de “wine and cheese” oferecido pela Agilent, seguido de uma noite de discoteca oferecido pela Thermo.

No dia 17 de maio, quinta-feira, houve prosseguimento do evento com a apresentação de duas sessões em paralelo: na sala 1000 o assunto foi “Microfluidics” enquanto que na sala 300 o enfoque foi “Column Technology”. 22 palestras e 12 “keynote lectures” em paralelo com as sessões de posteres, exposição de equipamentos e acessórios, e seminários técnicos coordenados pelas empresas patrocinadoras do evento. Distintos e atuais enfoques para microfluidica foram abordados em 6 apresentações orais, enquanto que aspectos atuais sobre novas colunas para cromatografia gasosa capilar foram amplamente discutidos.

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42nd International Symposium on Capillary Chromatography and 15th GCxGC

Figura 4. Coquetel de lançamento do periódico Journal of Separation Science Plus, tendo ao fundo (jaqueta beje o Dr. Frank Svec, Editor).

Uma atividade de destaque neste dia foi o curso de curta duração (“short course”) “Scientific writing and publishing presenter” ministrado por Paul Haddad (Editor do periódico Electrophoresis); Frantisek Svec (Editor dos periódicos “Journal of Separation Science e “Journal of Separation Science Plus”); e Emily Hilder, no período do almoço (12:00-13:30). Os principais assuntos abordados foram (1) como preparar um artigo para publicação; (2) o processo editorial e como responder as questões dos revisores dos artigos; (3) preparação e apresentação de pôsteres; e (4) uma discussão final com todos os apresentadores.

Após o almoço duas sessões ocorreram em paralelo: na sala 1000 o assunto foi “Sample Preparation”, enquanto que na sala 300 o tema abordado foi “Electrodriven Techniques”. Na sala 1000, Janusz Pawliszyn, inventor da técnica SPME, apresentou com destaque o assunto “New SPME developments for On- Site Analysis”; enquanto que Jared Anderson abordou com maestria o tema “Exploring the Unique Chromatographic And Extraction properties offered by 86

metal-containing Ionic Liquids”. Fernando Lanças – Editor do Scientia Chromatographica – abordou o tema “Microscale sampling coupled to LC-MS/MS for highly selective determination of minor analytes in food and environmental matrices”.

Logo após o intervalo para café, foram apresentados vários seminários pelos patrocinadores, os quais foram seguidos por duas sessões em paralelo abordando diferentes assuntos no formato de “keynote lectures”.

No período noturno (21:00 – 23:00) houve uma sessão de discussão a respeito das técnicas multidimensionais do tipo “comprehensive”.

No dia 18 de maio, sexta-feira, dia de encerramento do evento, houve atividade apenas no período da manhã. Foram apresentadas 20 palestras, totalizando 80 durante todo o evento ISCC; neste dia não houveram as atividades paralelas de pôsteres (Figura 5), exposição, seminários técnicos e outros.

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Lanças FM

Figura 5. Sessão de Pôsteres

A primeira sessão, na sala 1000 abordou 5 apresentações a respeito do tema “Capillary GC 2”, enquanto que na sala 300 foi abordado o tema “Sample Preparation 2”. Após o intervalo para café na sala 1000 ocorreu a sessão “LC and SFC”, com 6 palestras, e na sala 300 o tema “Sample Preparation 3”, evidenciando a importância do tema “Preparo de Amostras” na atualidade. A partir do encerramento destas sessões concluiu-se as atividades científicas no evento, sendo seguida pelo encerramento.

4. Encerramento do “42nd International Symposium on Capillary Chromatography and 15th GCxGC Symposium”

A sessão de encerramento do evento teve início às 12:20 com a entrega do prêmio “Giovanni Dugo

Award” e apresentação da palestra “Ionic Liquids as GC Stationary Phases in The Flavour And Fragrance Field” por Carlo Bicchi, da Universidade de Torino, Itália.

A seguir foi feita a entrega da “Leslie Ettre Award” patrocinada pela Perkin Elmer, a “Genzo Shimadzu Best Oral/Poster Award”; a “Chromatographia-Springer Best Poster Award” e a “Journal of Chromatography A: Young Scientist Award”. Às 13:15 o “42nd International Symposium on Capillary Chromatography and 15th GCxGC Symposium” foi oficialmente encerrado por Luigi Mondello, sendo seguido de um coquetel de despedida oferecido pela empresa Waters.

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GAS CHROMATOGRAPHY

Influence of high inlet pressure gas chromatography (HIPGC) on analytes retention time Influência da elevada pressão de entrada em cromatografia gasosa (HIPGC) no tempo de retenção

Meire Ribeiro da Silva Ana Lúcia de Toffoli Edvaldo Vasconcelos Soares Maciel Fernando Mauro Lanças* University of São Paulo, Institute of Chemistry of São Carlos, SP, Brazil *flancas@iqsc.usp.br Received: April 17, 2018 Accepted: May 11, 2018 Abbreviations: high inlet pressure gas chromatography (HIPGC); retention time (tR); flame ionization detector (FID); reduced plate height (h); linear mobile phase velocity (vopt).

Supplementary Material can be find at https://goo.gl/X9JQYv Scientia Chromatographica 2018; 10(2)

Resumo

A cromatografia gasosa com injeção sob alta pressão é uma ferramenta analítica que oferece diversas vantagens, como alta eficiência, reduzido tempo de análise e fácil migração de compostos com alta massa molecular. Neste trabalho foi realizado um estudo básico sobre o desempenho cromatográfico de colunas capilares compactadas (comprimento de 25 cm) utilizando um cromatógrafo a gás modificado. Este sistema, desenvolvido em nosso laboratório, consistiu em um novo dispositivo conectado ao injetor visando a aplicação de cromatografia gasosa em dois modos diferentes: baixa e alta pressão de entrada (até 2000 psi). A pressão de entrada foi variada entre 500 e 2000 psi e a influência desta transição de pressão na eficiência cromatográfica foi avaliada, sendo comparada com outras abordagens para GC. Os resultados obtidos aplicando este instrumento, baseado em um cromatógrafo a gás comercial modificado, mostram que com o aumento da pressão de entrada é possível reduzir o tempo de análise, bem como aumentar a intensidade do sinal analítico. Além disso, este trabalho mostra o uso de colunas capilares empacotadas com fase estacionária de HPLC como uma abordagem alternativa para GC sem programação de temperatura.

Palavras-chave: cromatografia gasosa de alta pressão de entrada; coluna capilar empacotada; cromatografia gasosa.

Abstract

High inlet pressure gas chromatography (HIPGC) is an analytical tool that offers several advantages including high efficiency, fast analysis time, and easier elution of high molecular mass compounds. In this paper a basic study regarding the chromatographic performance of packed capillary columns (length to 25 cm) utilizing a modified commercial GC instrument was carried out. This lab-made GC system consisted in a new device connected to the GC injector aiming the application of gas chromatography in two different modes: low inlet pressure and high inlet pressure (c.a. 2000 psi). The inlet pressure was varied between 500 - 2000 psi and the influence of this pressure transition in the chromatographic efficiency was evaluated being compared with other GC approaches. The obtained results applying this modified GC instrument shows that increasing the inlet pressure is possible to reduce the analysis time as well as improve the analytes signal. In addition, this work shows the use of packed capillary columns packed with standard HPLC stationary phases as an alternative approach to GC analysis without requiring temperature programming.

Keywords: high pressure inlet gas chromatography; packed capillary column; gas chromatography.

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Silva MR et al.

Influence of high inlet pressure gas chromatography (HIPGC) on analytes retention time

1. Introduction

Over the past few years there has been a growing demand for high-throughput separations in numerous fields (e.g., environmental, food, clinical or biological analysis), where either the time response delivery must be reduced, or the productivity enhanced (or in the ideal case both), considering the large number of analyzed samples and diversity of compounds. In order to achieve these goals robust analytical techniques such as liquid chromatography and gas chromatography has been utilized[1–4]. Although gas chromatography (GC) is in some cases faster, and provides higher separation efficiency, having better properties for combination with a wide range of sensitive and selective detectors, it also has some limitations such the requirement that the molecules to be analyzed must be thermally stable and sufficiently volatile. Liquid chromatography (LC) on the other hand provides better selectivity, a much wider application range and has proved to be more rugged than GC[2,3,5–7]. Once GC and LC are complementary techniques, it is logical that the development of an ideal separation technique would combine the advantages coming from each one of these techniques. This would include the high efficiency of open tubular GC columns and the selectivity of LC packing materials, enabling the analysis of a wide range of compounds. A good example of this ideal technique stands out as high inlet pressure gas chromatography (HIPGC)[8–11].

The use of HIPGC (High Inlet Pressure Gas Chromatography) was first demonstrated in 1965[8], showing that increasing the inlet pressure would reduce the analysis time. Bartle and co-workers demonstrated later[9] that the use of liquid chromatography packing and high pressure in gas chromatography in the analysis of low molecular weight (as alkenes) at temperatures lower than 150 °C reduce the analysis time and increase the chromatographic resolution[9]. Sie and co-workers enhanced the migration of hydrocarbons using pressures up to 80 atm. Liu and Yang used different stationary phases at HIPGC and reported that for the evaluated phases it was not possible to analyze n-fatty acids[12].

90

The main difficulties in employing HIPGC are related to the instrumentation, since high pressure conditions requires appropriate connections to succeed in working at such high pressure range, while the injection system must be suitable to transport the intact sample at different pressures[13]. Although some research laboratories have developed instruments for HIPGC, a large number of instrumental drawbacks did not allow these research groups to build robust instrumentation in order to evaluate the technique further[9,14].

Along the last decades several instruments have been developed in our laboratory based upon modification of standard commercial instruments to operate under supercritical fluid chromatography, unified chromatography and other chromatographic modes[15–21].

In all this instrument, when using the mobile phase at high-pressures the injection was carried out via HPLC valves. Although the results have been satisfactory, when using gas as mobile phase the HPLC valves are unsuitable to maintain a reasonable seal system.

Employing the experience obtained in the development of different instrumentation, accessories and laboratory devices, we sought a simple, versatile and inexpensive way to develop a HIPGC instrumental system. This paper discusses the development and application of an instrumental HIPGC system by simple modification of commercial GC equipment through a new device connected to the instrument injector to be used at column inlet pressures up to 2000 psi.

2. Materials and Methods 2.1. HIPGC instrumentation

A standard gas chromatographic system from Shimadzu (Kyoto, Japan), model GC 17A, was modified to perform as a HIPGC analytical system.

The instrumental apparatus consists of an external high-pressure nitrogen supply source; a sample introduction system (standard split/splitless injector), an oven, a column, and a flame ionization detector Scientia Chromatographica 2018; 10(2):89-98

Influence of high inlet pressure gas chromatography (HIPGC) on analytes retention time

(FID) (Figure 1). A total of 5 different instruments were developed until a satisfactory experimental performance was achieved. The system described in this

Silva MR et al.

paper corresponds to the fifth developed modification.

A schematic drawing of this system containing all main parts is depicted in Figure 2.

Figure 1. Overview of the HIPGC system developed: A) gas supplier; B) device designed and built to control all gases through the system and C)Â modified GC system.

Figure 2. Main components of the HIPGC system employed in this work: 1) Manometer, 2) Micrometer valve, 3) T4 connection, 4) Three-way valve, 5) Gas filter (mobile phase), 6) Trap (purge flow), 7) Trap (split flow), 8) Buffer, 9) Syringe holder; 10) Modified injector device; 11) Injection port liner used: split liner; 12) Stainless steel union (Valco); 13) Capillary tube (restrictor); 14) Packaged capillary column; 15) FID detector and 16) Gas chromatograph.

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Silva MR et al.

Influence of high inlet pressure gas chromatography (HIPGC) on analytes retention time

The high-pressure nitrogen system consists of two standard gas cylinders used to deliver the nitrogen gas to a third empty cylinder, responsible for boosting the nitrogen mobile phase at pressures up to 2500 psi.

This latter cylinder was connected to a high-pressure regulator used to control the inlet pressure before a micrometric stainless-steel valve via 1/16´´ (HOKE series 1600) used to control the nitrogen (mobile phase) flow.

Figure 3 shows a photo detailing the developed nitrogen pressurization system. A carrier gas was used to assist the injection process (split/splitless) being this system controlled by a back-pressure regulator consisting in a three-way solenoid valve usually employed to control the mobile phase flow rate. In the case when splitless injection mode is selected this solenoid valve is maintained closed.

The injector was also modified, and new connections were built aiming to achieve a proper septum position adjustment avoiding the deleterious backpressure effect over the injection syringe and prolonging the septum life. In this case, a pre-column (fused silica tubing) had one end attached to the injector with the other end coupled to a 1/19 union (Valco) that is connected to the packed capillary analytical column.

The other end of the analytical column was connected to a capillary (fused silica tubing) restrictor placed into the FID detector set to 300 °C.

2.2. Reagents, solutions and materials Ibuprofen analytical standard was acquired from Sigma (Steinheim, Germany). Biodiesel prepared from soya bean oil were obtained from Cargill (Mairinque, Brazil). C9-C12 analytical standards were from Sigma (Steinheim, Germany) while the solvents pentane and hexane were from Mallinckrodt. Standard stock solutions of C9-C12 were prepared at 1000 µg L-1 in hexane. An intermediate standard solution was prepared by the dilution of stock solutions with hexane. Working standard solutions were prepared daily by the dilution of the intermediate standard solution in hexane. All tubing employed in the flow control system was 1/16” o.d., made from stainless steel. The data acquisition system consisted of standard PC (Personal Computer) fitted with standard Shimadzu software used for gas chromatography.

2.3. Preparation of the analytical columns To produce the capillary analytical columns, a fused silica tubing of 0.25 mm of internal diameter were used. These capillaries were cut aiming several column lengths. At one end of the tube was introduced a glass fiber filter to serve as column frit. A long tube (0.50 mm i.d. vs 10 cm) was impregnated with an epoxy resin in order to fix the frit being this capillary introduced 5 cm

Figure 3. Pressurization nitrogen system developed, which is composed by three cylinders and two returning valves.

92

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Influence of high inlet pressure gas chromatography (HIPGC) on analytes retention time

into the analytical column while other remaining 5 cm were fixed in other tube (0.25 mm i.d. vs 30 cm). This column structure was filled by the stationary phase being this same procedure necessary to seal the other column end after the packing procedure. Considering the reduced diameter applied in this work the columns was packed employing a slurry packing process. In this methodology a HPLC pump (LC-20AD from Shimadzu) was coupled to a stainless-steel tube connected to another stainlesssteel reservoir containing the stationary phase (C18) suspension (Figure 4). This reservoir was connected to the capillary tube structure previously prepared.

Afterwards, the packaging process starts with the system being purged using methanol as solvent in such a way that it pushes the particle suspension into the capillary column. After the capillary tube totally filled, the system must be turned off and the column will be taken only

Silva MR et al.

after complete depressurization system for finishing the packing step. Figure 4 displays a general view of the packing system utilized.

3. Results and Discussion

The instrumental system developed for HIPGC consists of a GC commercial instrument, a pressure system, manometer, micrometric valve, connection T, three-way valve, gas filter (mobile phase), trap (purge flow), trap (split stream), injector device modified, liner (SPME), capillary fused silica as a restrictor, packed capillary column, FID detector, as illustrated on Figure 2.

The pressure system developed consists of two cylinders of N2 gas connected to a third cylinder (capacity of 3 L) through a T connection and two return valves, which the springs from the valves were replaced by stronger springs to withstand the pressure range of 1-2000 psi

Figure 4. Simplified scheme of the packaging system with suspended particles utilized for the preparation of capillary columns: (a) gas cylinder, (b) packaging solvent reservoir, (c) pneumatic amplifier pump, (d) valves, (e) T-connection, (f) suspended particulate reservoir, (g) and (h) restrictor (fused silica tube). Modified from Rezemini, Andrea Lucia. “Study about the packaging process and evaluation of columns for capillary liquid chromatography”. Master’s dissertation in Analytical Chemistry, Institute of Chemistry of São Carlos, University of São Paulo, São Carlos, 1997.

Scientia Chromatographica 2018; 10(2):89-98 93

Silva MR et al.

Influence of high inlet pressure gas chromatography (HIPGC) on analytes retention time

Figure 5. Illustrative drawing of the injector system mechanically modified to avoid effect of backpressure under the syringe: (a) Septum entrapment, (b) needle guide, and (c) different perspective of the stainless-steel needle guide.

avoiding gas return. The purpose of this pressure system configuration was to increase the gas pressure instead of using a booster (a more expensive device) while assuring the use of higher pressures for a longer time and reducing the mobile phase flow rate (N2). As the inlet pressure on the HIPGC system is higher than that achieve in standard GC, the GC injector device is not feasible to be employed as such. In the absence of commercial availability of injection devices that support pressure in the HIPGC range, changes on the GC injector were required. The modifications were developed to increase the withstand of higher pressures avoiding possible leakage and septum deformation.

Figure 5 shows the main mechanical modifications developed at the injector connections to minimize the effect of backpressure under the syringe. The built device consists of (a) a piece designed for septum entrapment avoiding the movement of the septum and its deformation (b) a needle guide was embedded in the piece what eliminates possible leaks and (c) this device was made in stainless steel for guarantee resistance mechanical. The diameter and height of PTFE plug at the tip of the gastight syringe was modified and optimized to avoid deformation and possible leak (S1- supplementary 94

supporting). The HIPGC instrumental system and modification on syringe plug allowed the injection of liquid sample by syringe. The mobile phase flow rate was adjusted by using proper restrictors. Although there are a variety of restrictor types such as fused silica, stainless steel, Pyrex glass, in this instrumental system a fused silica restrictor was used. The restrictor dimensions were optimized according to length of column utilized.

In order to validate the HIPGC system, a packed column (250 µm x 20 cm x 3 µm, C18) has been used.

The column was connected to the injector using N2 as carrier gas for separation of a mixture containing saturated hydrocarbons (C9-C12). The restrictor was fitted using an open capillary (L = 1.5m, 50 µm I.D.) to obtain a flow rate ~ 2.5 mL/min. The oven temperature was set at 30 °C and FID temperature at 280 °C. Relative Standard Deviation (RSD) of retention times and peak areas have been measured with C9 (n = 4) and the values obtained (< 0.2% and < 2%, respectively) confirmed the suitable setup of the instrument for HIPGC pressure in the range 1-2000 bar.

Figure 6 depicts the van Deemter plots for the developed system and columns, showing the reduced plate height (h) against linear mobile phase velocity Scientia Chromatographica 2018; 10(2):89-98

Influence of high inlet pressure gas chromatography (HIPGC) on analytes retention time

Silva MR et al.

Figure 6. van Deemter plots of the reduce plate height versus linear mobile phase velocity for octane at 90 °C with inlet pressure between 500 1500 psi for two different capillary columns: Figure 1A – 250 µm x 12 cm length packed particles C18 3.0 µm (column A); and Figure 1B – 250 µm x 20 cm length packed with particles C18 3.0 µm (column B).

(vopt) for octane at 90 °C with an inlet pressure ranging from 500 to 1500 psi for two different capillary columns: Figure A – 250 µm x 12 cm length packed particles C18 3.0 µm (column A); and Figure B – 250 µm x 20 cm length packed with particles C18 3.0 µm (column B).

These results are showing an inversely proportional dependence between hr and inlet pressure while υopt are shifted to faster flow rates, for both columns. The slight difference on the efficiencies obtained for column A and B, under the pressure range (500 - 1500 psi) is expected once the total efficiency increases proportionally to the column length. Therefore, column B reported lower levels of h being consequently considered more efficient.

Despite this correlation, it must be highlighted that the longer is the packed capillary column a higher flow resistance should be expected requiring higher column inlet pressure levels to maintain the chromatographic performance as well as more robust instrumentation in order to avoid leaks[22]. Increasing the temperature reduces analysis time and column efficiency, but the maximum operating temperature at the developed system was 90 °C. The theoretical plates per meter (N/m) obtained for column A and B were 70.000 and 73.000, respectively. These results were slightly higher

Figure 7. Effect of the pressure inlet on the retention time (tr) of octane by HIPGC. Operating conditions: column 250 µm x 20 cm length packed with particles C18 3.0 µm; nitrogen at 2000 psi, column temperature 90 °C (isothermal) and FID 280 °C.

than that previously observed for packed capillary column (21.5 cm x 250 µm i.d. x 5 µm ODS-2) that was 50.000 suggesting that the particle diameter (3 µm in our case against 5 µm in the previously reported one) directly affect the column efficiency[9].

Figure 7 shows the relative retention time (tR) for octane against the inlet pressure (ranging from 500 to 2000 psi) for the capillary column (250 µm d.i. x 20 cm) packed with C18 particles of 3.0 µm.

Scientia Chromatographica 2018; 10(2):89-98 95

Silva MR et al.

Influence of high inlet pressure gas chromatography (HIPGC) on analytes retention time

From Figure 7, it is observed that the best results were achieved at higher inlet pressure conditions, similar of SFC (1200 - 2000 psi), suggesting that these conditions allowed improvements in terms of gas solvating properties as well as can reduce the retention time. In addition, the results illustrate a trend to retention time increasing with the loss of mobile phase density or decrease of pressure inlet (1000 - 500 psi) hence at low levels of pressure, the octane tR slightly increased.

Considering this fact, at pressure levels lower than 1000 psi it was observed that the retention time changes dramatically reinforcing that the octane is dependent on pressure inlet column. Measurements were also made for other hydrocarbons (C9-C12) being the trends in the retention time profiles similar. Figure 8 (A and B) shows a typical chromatogram of a mixture of these compounds at pressure inlet of 2000 and 1500 psi at

Figure 8. Chromatograms (a) and (b) showing the effect of pressure inlet on separation of hydrocarbons by HIPGC. Operating conditions: column 250 µm x 20 cm length packed with particles C18 3.0 µm; nitrogen at 2000 psi, column temperature 90 °C (isothermal) and FID 280 °C. 96

90 °C, respectively. The separation of hydrocarbons on packed capillary column confirms that the approach of using columns shorter than open tubular columns, small particles, reduced inner diameter and high-pressure inlet, decrease the analysis time becoming the analytical method faster with satisfactory levels of chromatographic efficiency.

Figure 9 illustrate a comparison between a representative chromatogram of biodiesel (B100) (Figure 8A) obtained by this developed HIPGC system and another chromatogram obtained by a GC-FID common analysis (Figure 8B). It can be seen a large difference between the obtained retention time for

Figure 9. Representative chromatograms to compare the relative retention time for triglycerides: (A) Chromatogram obtained by the proposed HPIGC method; (B) Chromatogram obtained from Pelisson, Leidimara. “Biodiesel production by pressurized fluidics with subsequent analysis by high resolution gas chromatography (HRGC)”.

PhD thesis in Analytical Chemistry, Institute of Chemistry of São Carlos, University of São Paulo, São Carlos, 2013.

Scientia Chromatographica 2018; 10(2):89-98

Influence of high inlet pressure gas chromatography (HIPGC) on analytes retention time

HPIGC isothermal analysis between 6.0 – 6.5 minutes while traditional GC analysis reporting a retention time from 22 to 25 minutes with temperature ramp. In such cases were just a triacylglycerides profile is adequate; a much shorter analysis time can be obtained to generate the required data. This fact confirms that at high-pressure conditions the analysis can be faster and perform without high temperature conditions.

Bartle et al. [9] showed the separation of several hydrocarbons on packed capillary column (21.5 cm x 250 µm i.d. x 5 µm ODS-2) at 120 bar, column temperature at 40 °C, ramping at 5 °C to 220 °C with subsequent detection by FID at 400 °C; in this work the retention time for octane was about 20 minutes.

Comparing this work to the results prior discussed, the present paper presents the results obtained by using a small column (20 cm x 250 µm i.d. x 3.0 µm C18) without temperature programming, at pressure inlet of 2000 psi, as well as reports an octane retention time of 3.0 minutes which is about 6 times shorter than previously reported under similar conditions[9]. This fact shows an important role of inlet pressure in the tR of the compounds reinforcing the applicability of HIPGC as

Silva MR et al.

an alternative for GC common analysis mainly in cases when faster analysis is required.

4. Concluding Remarks

The modified instrument used to HIPGC analysis showed experimental results reinforcing that by increasing the injector inlet pressure a reduction on the analysis time is obtained. This proposed approach was limited according to the instrumental design to an inlet pressure of 2000 psi being this insufficient for the analysis of much higher molecular compounds at temperatures up to 90 °C. The results showed that utilizing a traditional GC instrument and packed capillary columns with HPLC type stationary phase in HIPGC renders satisfactory chromatographic efficiency and faster analysis time when compared to traditional GC.

Acknowledgement

The authors would like to thank the Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Brasil (CAPES) - Finance Code 001, FAPESP (Grants 2017/02147-0, 2015/15462-5 and 2014/07347-9) and to CNPq (307293/2014-9) for the financial support provided.

References

[1] Tsizin, S., Bokka, R., Keshet, U., Alon, T., Fialkov, A. B., Tal, N., Amirav, A., Comparison of electrospray LC–MS, LC–MS with Cold EI and GC–MS with Cold EI for sample identification. Int. J. Mass Spectrom. 2017, 422, 119–125.

[2] Tian, B.-W., Feng, F., Zhao, B., Luo, F., Yang, X.-L., Zhou, H.-M., Li, X.-X., Study of Monolithic Integrated Micro Gas Chromatography Chip. Chinese J. Anal. Chem. 2018, 46, 1363–1371.

[3] Burel, A., Vaccaro, M., Cartigny, Y., Tisse, S., Coquerel, G., Cardinael, P., Retention modeling and retention time prediction in gas chromatography and flow-modulation comprehensive two-dimensional gas chromatography: The contribution of pressure on solute partition. J. Chromatogr. A 2017, 1485, 101–119.

[4] Hu, J., Qu, H., Chang, Y., Pang, W., Zhang, Q., Liu, J., Duan, X., Miniaturized polymer coated film bulk acoustic wave resonator sensor array for quantitative gas chromatographic analysis. Sensors Actuators B Chem. 2018, 274, 419–426.

[5] Taguchi, K., Fukusaki, E., Bamba, T., Simultaneous analysis for water- and fat-soluble vitamins by a novel single chromatography technique unifying supercritical fluid chromatography and liquid chromatography. J. Chromatogr. A 2014, 1362, 270–7.

[6] Dömötörová, M., Matisová, E., Fast gas chromatography for pesticide residues analysis. J. Chromatogr. A 2008, 1207, 1–16.

[7] Kaal, E., Janssen, H. G., Extending the molecular application range of gas chromatography. J. Chromatogr. A 2008, 1184, 43–60.

[8] Myers, M. N., Giddings, J. C., High Column Efficiency in Gas Liquid Chromatography at inlet Pressures to 2500 p.s.i. Anal.

Chem. 1965, 37, 1453–1457.

Scientia Chromatographica 2018; 10(2):89-98 97

Silva MR et al.

Influence of high inlet pressure gas chromatography (HIPGC) on analytes retention time

[9] Shariff, S.M., Robson, M.M., Bartle, K.D., Myers, P., Clifford, A. A., Use of Liquid Chromatography Packings in High Pressure Gas Chromatography. J. High Resolut. Chromatogr. 1996, 19, 527–529.

[10] Maniquet, A., Bruyer, N., Raffin, G., Baco-Antoniali, F., Demesmay, C., Dugas, V., Randon, J., Behavior of short silica monolithic columns in high pressure gas chromatography. J. Chromatogr. A 2016, 1460, 153–159.

[11] Maniquet, A., Bruyer, N., Raffin, G., Baco-Antionali, F., Demesmay, C., Dugas, V., Randon, J., Behavior of macroporous vinyl silica and silica monolithic columns in high pressure gas chromatography. J. Chromatogr. A 2017, 1504, 105–111.

[12] Sie, S. T.; Beersum, W.; Rijnders, G. W. A., Ppo 51714622. J. Sep. Sci. 1966, 1, 459–490.

[13] Giddings, J. C., Myers, M. N., McLaren, L., Keller, R. a, High pressure gas chromatography of nonvolatile species. Compressed gas is used to cause migration of intractable solutes. Science 1968, 162, 67–73.

[14] Myers, M. N., Glddlngs, J. C., High Inlet Pressure Micro Column System for Use in Gas Chromatography. Anal. Chem. 1966, 38, 294–297.

[15] Coutinho, C.F.B. , Coutinho, L.F.M., Lanças, F.M., Câmara, C.A.P., Nixdorf, S.L., Mazo, L. H., Development of instrumentation for amperometric and coulometric detection using ultramicroelectrodes. J. Braz. Chem. Soc. 2008, 19, 131–139.

[16] Marins Coutinho, L. F., Domingues Nazario, C. E., Monteiro, A. M., Lanças, F. M., Novel devices for solvent delivery and temperature programming designed for capillary liquid chromatography. J. Sep. Sci. 2014, 37, 1903–1910.

[17] Pinto, J.S.S., Cappelaro, E.A., Lanças, F. M., Design and Construction of an on-line SPE-SFE-CGC System. J. Braz. Chem. Soc. 2001, 12, 192–195.

[18] Pinto, J.S.S. , Lanças, F. M., Design, construction and evaluation of a simple pressurized solvent extraction system. J. Brazilian Chem. Soc. 2009, 20, 913–917.

[19] De Martinis, B. S., Lanças, F. M., An alternative supercritical fluid extraction system for aqueous matrices and its application in pesticides residue analysis. J. Environ. Sci. Health. B. 2000, 35, 539–547.

[20] Sargenti, S. R., Lancas, F. M., Design and construction of a simple supercritical fluid extraction system with semi-preparative and preparative capabilities for application to natural products. J. Chromatogr. A 1994, 667, 213–218.

[21] Coutinho, F. B., Coutinho, L. F. M., Mazo, L. H., Lanåas, F. M., Copper Microelectrode as Liquid Chromatography Detector for Herbicide Glyphosate. Electroanalysis 2007, 19, 1223–1226.

[22] Baker, L. R., Stark, M. a., Orton, A. W., Horn, B. a., Goates, S. R., Density gradients in packed columns. I. Effects of density gradients on retention and separation speed. J. Chromatogr. A 2009, 1216, 5588–5593.

98

Scientia Chromatographica 2018; 10(2):89-98

Scientia Chromatographica 2018; 10(2):99-110 Instituto Internacional de Cromatografia http://dx.doi.org/10.5935/sc.2018.006 ISSN 1984-4433

SAMPLE PREPARATION

Extração líquido-líquido assistida pelo efeito salting out para análise de amostras biológicas Salting-out assisted liquid-liquid extracion for biological sample analysis

Caroline Fernandes Grecco Luis Felippe Cabral Miranda Jonas Carneiro Cruz Maria Eugênia Costa Queiroz* Departamento de Química, Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, 14040-901, Ribeirão Preto, SP, Brasil *mariaeqn@ffclrp.usp.br Recebido: 25/04/2018 Aceito: 14/05/2018

Scientia Chromatographica 2018; 10(2)

Resumo

A extração líquido-líquido assistida pelo efeito salting out (SALLE, Salting-out assisted liquid–liquid extraction) é baseada na partição do(s) analito(s) entre o solvente orgânico miscível em água e amostras de plasma ou outros fluidos biológicos. O efeito salting-out favorece a separação entre as fases orgânica e aquosa. A SALLE é uma técnica de preparo de amostra que possibilita a extração de substâncias hidrofílicas, incluindo fármacos e seus metabólitos. Esta técnica possibilita que os extratos obtidos sejam injetados diretamente no sistema cromatográfico, ou após simples diluição. Esta revisão apresenta os fundamentos teóricos da técnica SALLE, as principais etapas envolvidas no processo de extração e exemplos de aplicações desta técnica em diversas áreas.

Palavras-chave: extração líquido-líquido assistida pelo efeito salting-out; preparo de amostra biológicas.

Abstract

Salting-out assisted liquid-liquid extraction (SALLE) extraction is based on the partition of analyte(s) between water-miscible organic solvent and plasma samples or other biological fluids. The salting-out effect induces the separation between the phases, organic and aqueous. SALLE is a sample preparation technique that enables the extraction of drugs and their metabolites, including many hydrophilic compounds. This technique allows the obtained extracts to be directly injected into the chromatographic system or by simple dilution. This review presents the theory fundamentals of SALLE technique, the key steps involved in the extraction process and examples of applications of this technique in several areas.

Keywords: Salting-out assisted liquid–liquid extraction; biological sample preparation.

99

Grecco CF et al.

Extração líquido-líquido assistida pelo efeito salting out para análise de amostras biológicas

1. Introdução

A cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas em tandem (LC-MS/MS) tem sido considerada a técnica analítica de referência para a determinação de compostos de interesse em fluidos biológicos.

O desenvolvimento de métodos bioanalíticos por LC-MS/MS inclui diferentes etapas, como preparo da amostra, análise cromatográfica e detecção[1], sendo a etapa de preparo de amostra a mais dispendiosa (cerca de 80% do tempo total de análise). Os fluidos biológicos são amostras complexas constituídas de vários componentes endógenos. Estes podem adsorver de forma irreversível junto à fase estacionária da coluna cromatográfica, diminuindo a eficiência da separação cromatográfica, ou suprimindo a ionização dos analitos, reduzindo a resposta analítica. Desse modo, a etapa de preparo de amostra visa a eliminação de grande parte dos componentes endógenos das amostras biológicas e a pré-concentração dos analitos, quase sempre presentes em níveis de traços.

A precipitação de proteínas (PPT), extração líquido-líquido (LLE) e extração em fase sólida (SPE) têm sido as técnicas de preparo de amostra convencionais utilizadas no desenvolvimento de métodos bioanalíticos. Recentemente, outras técnicas de preparo de amostra têm sido desenvolvidas visando a miniaturização, simplificação e minimização do uso de solventes orgânicos[1]. Neste contexto, podemos destacar a técnica de extração líquido-líquido assistida pelo efeito salting out, (SALLE, Salting-out assisted liquid–liquid extraction). A técnica SALLE, quando comparada à PPT, é mais seletiva e resulta em extratos mais limpos. Já quando comparada à LLE e SPE, a SALLE é mais rápida e gera menor resíduo solvente orgânico[2]. A SALLE resulta em extrações mais eficientes para substâncias hidrofílicas, quando comparada à LLE convencional, a qual geralmente emprega solventes orgânicos mais tóxicos. Além disso, a extração por SALLE pode ser facilmente automatizada utilizando uma placa de 100

96 poços, a qual pode ser integrada ao sistema LC-MS/ MS aumentando assim a frequência analítica.

A SALLE tem sido adaptada com sucesso para bioanálises[3-14] no sistema LC-MS/MS, em razão dos pequenos volumes de amostra biológica, simplicidade e injeção direta do extrato no sistema cromatográfico (Tabela 1).

2. Extração líquido-líquido assistida pelo efeito salting out (SALLE)

As primeiras aplicações da técnica SALLE para determinação de compostos hidrofílicos em amostras biológicas ocorreram na década de 1970[15-17].

Em um procedimento típico SALLE, um solvente orgânico miscível em água e uma solução concentrada de sal são adicionados à matriz biológica contendo o analito de interesse. Quando a concentração salina se torna muito alta, ocorre a diminuição da solubilidade das moléculas do solvente na fase aquosa, levando à formação de um sistema bifásico. Este fenômeno é frequentemente chamado de “separação de fases induzida por sal”[18].

Com a formação desse sistema bifásico, os analitos migram da fase aquosa em direção à fase orgânica.

O extrato orgânico obtido pode então ser injetado diretamente no sistema cromatográfico principalmente junto à cromatografia líquida por interação hidrofílica (HILIC), ou na cromatografia líquida em fase reversa por simples diluição com solução aquosa ou solução tampão.

A técnica SALLE tem sido aplicada para a extração de uma ampla gama de substâncias em matrizes biológicas, incluindo substâncias hidrofílicas, as quais apresentam baixas taxas de recuperação quando extraídas por LLE e SPE[3-8,19-24].

A eficiência da técnica SALLE está relacionada ao tipo de sal utilizado e as propriedades físico-químicas dos analitos. O efeito salting-out diminui a solubilidade na fase aquosa de substâncias parcialmente solúveis em solventes orgânicos, assim como induz a precipitação das proteínas, contribuindo para o clean up da amostra[2,3,25].

Scientia Chromatographica 2018; 10(2):99-110

Extração líquido-líquido assistida pelo efeito salting out para análise de amostras biológicas

Grecco CF et al.

Tabela 1. Aplicações da técnica SALLE na análise de fluidos biológicos por técnicas cromatográficas.

Analito

Matriz

Solvente orgânico

Sal

ABT-869 A-849529

Plasma (50µL)

200 µL de ACN

50 µL de C2H7NO2 2M

LC-MS/MS

LPV RTV

Plasma (50µL)

200 µL de ACN

100 µL de ZnSO4 3M

LC-MS/MS

Droga desconhecida

Plasma (50µL)

200 µL de ACN

50 µL de tampão NH4HCO2 5mM

LC-MS/MS

LPV RTV

Plasma (25µL)

200 µL de ACN

50 µL MgSO4

LC-MS/MS

SS SSA

Plasma (100 µL)

200 µL de ACN gelada (4 °C)

50 µL de tampão NH4HCO2 5mM (pH 4,5)

LC-MS/MS

Synergi MAX-RP (2,5 µm 2.0 mm x 50 mm)

ACN: Água: Tampão acetato de metilamônio pH 4,5

0,0966-50,1 0,0938-51,1

Zhang et al.

(2010)[7]

LC-MS/MS

Chro-HSS T3 (2,1 mm x 100 mm, 1,8 µm) a 40°C

Solução aquosa contendo 0,1% de ácido fórmico: ACN contendo 0,1% de ácido fórmico

4-400

Yanes et al.

(2012)[8]

470-20.000

Jain et al.

(2014)[37]

50-NI

Li et al.

(2014)[54]

0,02-15,0 0,02-15,0 0,01-2,0

Yang et al.

(2015)[9]

Canabinóides Urina (metabólitos) (100 µL)

200µL de ACN

50 µL de C2H7NO2 10M 500 µL uma solução de NaCl 1M 500 µL de K2SO4 1M 150 µL de (NH4)2SO4 saturado

Método cromatográfico

TMZ

Plasma (1 mL)

2 mL de ACN

BL WL

Plasma (100 µL)

200 µL de ACN

AT o-OAT p-OAT

Plasma (100 µL)

400 µL de ACN

100 µL de C2H7NO2 6M

LC-MS/MS

Trimetazidina

Plasma (50 µL)

100 µL de ACN

25 µL de NH4HCO2

LC-MS/MS

PK MK-4 MK-7

Plasma (500 µL)

1 mL de ACN

0,3 g MgCl2

HPLC-FL

AEA

Plasma (100 µL)

200 µL de ACN

50 µL de NH4HCO2 5 M

LC-MS/MS

Afatinib

Plasma (10 µL)

ACN

5 µL de MgCl2 3M

LC-MS/MS

HPLC-PDA

HPLC-DAD

Coluna

Fase móvel

Curva linear (ng mL-1)

Symertry Shield RP-8 ACN: Solução 1,2-574 (C8) (2,1 mm x aquosa contendo 0,1% 1,21-581 150 mm, 5µm) de ácido fórmico Agilent Zobax Extend-C18 Rapid ACN: Solução aquosa 19,2-16.000 resolution HT contendo 0,1% de 9,73-8.110 (1,8 µm, 2,1 mm x ácido fórmico 30 mm) ACN + formiato Symmetry300 C18 de amônio 50 mM: (4,6 x 50 mm, 5 µm) MeOH : Água (55:25:20, v/v) ACN + 0,3% ácido SynegiTM MAX-RP fórmico : Água + 9,8-310 (50 x 2,00 mm, 4 µm) formiato de amônio 4,9-160 4mM (60:40, v/v)

ODS – Hypersil ACN: Ácido acético (5 µm, 25 cm x 4,6 mm) 0,1% (v/v) XB-C18 ACN: Solução aquosa (4,6 x 250 mm, contendo 0,1% de 5 µm) ácido fórmico Kinetex XB C18 Solução aquosa (50 mm x 2.1 mm, contendo 1% de 2.6 µm) à 40°C ácido fórmico: ACN Atlantis C18 Solução aquosa (150 x 2,1mm, 5 µm) contendo 0,1% de a 35°C ácido fórmico: ACN Hypersil C18 ACN: Solução aquosa (4,6 x 150 mm2, contendo 5 µm) à 40°C 0,1% de TFA ACN: Solução aquosa SB-C18 (2,7 µm, contendo 0,1% 2,1 mm x 50 mm) de ácido fórmico Solução aquosa BEH C18 contendo 0,1% (30 x 2,1 mm, de hidróxido de 1,7 µm) a 40°C amônio: ACN

0,1-100 0,3-100 0,3-100 0,5-100

Refs.

Wu et al.

(2008)[4] Myasein et al.

(2009)[5] Zhang et al.

(2009)[6] Zhang et al.

(2009)[3]

Xiong e Yang (2015)[10] Ahmed e Mahmoud (2015)[11]

0,1-8,0

Xiong et al.

(2015)[55]

0,5-500

Sparidans et al.

(2016)[12]

Scientia Chromatographica 2018; 10(2):99-110 101

Extração líquido-líquido assistida pelo efeito salting out para análise de amostras biológicas

Grecco CF et al.

Tabela 1. Continuação...

Analito

Matriz

Solvente orgânico

Sal

FEB

Plasma (100 µL)

1000 µL de ACN

100 µL de C2H7NO2 2M

2 mL de ACN

110 µL de [C4MIM]BF4 1,0 g de K2HPO4 70 µL de [C6MIM]PF6.

200 µL de ACN ao precipitado

STZ SCP SMX SSZ

O-DMCAR CAR 5´-HCAR PRO 5-HPRO MET O-DMMET α-HMET Bifentrina Permetrina β-Ciflutrina Fenvalerato

Plasma (4 mL)

Urina (500 µL)

Urina (2 mL)

300 µL de ACN

2 mL de ACN

200 mg de (NH4)2SO4

4 mL de NaCl 5 M

Método cromatográfico

Coluna

Fase móvel

RP-HPLC-UV

Phenomenex Luna-C18 (250 x 4,60 mm, 5 µm)

Tampão KH2PO4 25mM ajustado para pH 6,8 com trietilamina: MeOH

300-20.000

Tandel et al.

(2016)[45]

HPLC-UV

Zorbax Eclipse Plus C18 (150 mm x 4,6 mm, 3,5 µm)

ACN (2,67 mol L-1 ácido fórmico): Água (2,67 mol L-1 ácido fórmico)

16,3-386,9 14,5-366,4 20,5-401,0 13,1-376,1

Liu et al.

(2016)[56]

100-4000 100-4000 200-8000 100-4000 100-4000 200-8000 200-8000 200-8000

Magiera et al.

(2016)[48]

Niu et al.

(2017)[57]

HILIC-UV

ZORBAX RRHD ACN: Solução aquosa Poroshell 120-HILIC contendo acetato (100 x 3,0 mm, de amônio 10mM 2,7 µm) a 25°C (pH 7,5)

Curva linear (ng mL-1)

Refs.

CG-MS

Coluna capilar de sílica fundida revestida Zebron TMZB - 5 MS (30 m x 0,25 mm, 0.25 µm)

Hélio

5-5.000 25-5.000 200-5.000 25-5.000

CG-MS

Coluna capilar de sílica fundida (30 m x 0,25 mm, 0,25 µm)

-

NI

Tsai et al.

(2017)[58]

Inertsil ODS‐3 (2,1 × 150 mm, 5 µm) à 30°C

Solução aquosa contendo acetato de amônio 5mM: ACN

2,0-NI 2,0-NI 2,0-NI 10,0-NI 4,0-NI

Qiu et al.

(2017)[13]

Urina

Derivatização: reação a 1000W por 5 min em pH 10 + 750W por 7 e utilizando Br-TFB como agente derivatizante.

-Res R3S R4´S R3G R4´G

Plasma (50 µL)

ACN:MeOH (80:20 v/v)

50 µL de tampão C2H7NO2 10 M

LC-MS/MS

Quizartinib

Plasma (10 µL)

ACN

5 µL de MgSO4 3M

LC-MS/MS

MeOH: Água: BEH C18 (30 x 2,1 mm, Hidróxido de amônio 1,7 µm) 2% (v/v)

2-2000

Retmana et al.

(2017)[14]

Metformina Buformina Fenformina

Plasma (200 µL) Urina (1 mL)

400 µL ACN 500 µL ACN

NaOH

HPLC-UV

ZIC-HILIC column (150 mm x 2,1 mm x 3,5 µm)

20-2000 5-2000

Alshishani et al.

(2018)[52]

Cys Hcy

ACN:15mM tampão acetate de amônio

5´-HCAR: 5-hidroxi-carvedilol; 5-HPRO: 5-hidroxi-propranolol; ACN: acetonitrila; AEA: anandamida; AT: Atorvastatina; BL: baicalin; Br-TFB: Brometo de 3,4,5-trifluoro benzilo; CAR: carvedilol; CRZ: ­carnidazol; Cys: cisteína; DCM: diclorometano; DON: desoxinivalenol; FB1: fumonisina B1; FB2: fumonisina B2; FEB: Febuxostato; FS-OP: sistema de fluxo com detecção pela sonda óptica; F-X: fusarenon-X; Hcy: homocisteína; HT-2: IPZ: ipronidazol; LPV: lopinavir; MeOH: metanol; MET: metoprolol; MK-4: menaquinona-4; MK-7: menaquinona-7; MNZ: 1-(2-hidroxietil)-2-metil-5-nitroimidazol; NI: não informado; O-DMCAR: O-desmetil-carvedilol; O-DMMET: O-desmetil-metoprolol; o-OAT: o-hidroxi atorvastatina; ORZ: ornidazol; PK: filoquinona; p-OAT: p-hidroxi atorvastatina; PRO: propanolol; R3G: trans-resveratrol-3-O-β-D-glucoronido; R3S: trans-resveratrol-3-sulfato; R4´G: trans-resveratrol-4´-O-β-D- glucoronido; R4´S: trans-resveratrol-4´-sulfato; Res: trans-resveratrol; RNZ: 1-metil-2-carbamoyloxymetil-5-nitroimidazol; RTV: ritonavir; SCP: sulfacloropiridazina; SCZ: ­secnidazol; SMX: sulfametoxazol; SS: simvastatin; SSA: ácido simvastatin; SSZ: sulfisoxazol; STZ: sulfatiazol; T-2: micotoxina T-2; TFA: ácido trifluoroacético; THF: tetrahidrofurano; TMZ: temozolomida; TNZ; tinidazole; TRZ: ternidazol; WL: wogonoside; ZEA: zearelona; α-HMET: α-hidroxi-metoprolol;

102

Scientia Chromatographica 2018; 10(2):99-110

Extração líquido-líquido assistida pelo efeito salting out para análise de amostras biológicas

As extrações LLE realizadas nas décadas de 1980/1990 utilizavam longas etapas manuais e não adequadas para a injeção direta dos extratos obtidos nos sistemas HILIC ou LC-MS/MS[2]. Em 2009, Zhang et al.[3] publicou um método para a determinação de ritonavir e lopinavir em amostras de plasma utilizando o primeiro procedimento SALLE compatível com LCMS/MS. As extrações foram realizadas utilizando um “liquid handler” com capacidade de processamento de 96 amostras simultaneamente. Os ensaios de validação do método foram realizados em apenas 1 dia (30­ 45 minutos de preparo de amostra), utilizando 25 µL de plasma, 50 µL de uma solução de sulfato de magnésio, 200 µL de acetonitrila e separação cromatográfica em menos de 1,5 min. Em trabalhos posteriores[4,6,7], o mesmo grupo desenvolveu outros métodos bioanalíticos de alto rendimento utilizando outros sais compatíveis com LC-MS/MS, como acetato e formiato de amônio.

2.1. Solventes extratores

Diferentes solventes como acetonitrila[26-30], etanol[31], tetrahidrofurano[32] e acetona[33,34] têm sido utilizados na técnica SALLE. A acetonitrila desempenha duas funções no procedimento SALLE, precipita as proteínas e atua como solvente extrator. Além de proporcionar um extrato limpo, acetonitrila é o solvente mais utilizado como um dos constituintes da fase móvel em cromatografia líquida e compatível com a detecção por espectrometria de massas. Estas vantagens resultaram no uso de acetonitrila como solvente extrator na maioria dos procedimentos SALLE/LC-MS/MS[15,16,35,36].

[35]

Tabata et al. , empregando a SALLE, avaliou a separação de fases de 14 solventes orgânicos miscíveis em água, com a adição de solução de NaCl 4 mol L-1.

Os autores observaram a separação de fases (orgânico/ aquosa) para os seguintes solventes: acetonitrila, 1,4 dioxano, acetona, THF, 1 propanol e 2 propanol. Já para os solventes metanol, etanol, 1-butanol, formamida, N-metilformamida, carbonato de propileno, N,Ndimetilformamida e N,N-dimetilsulfoxido não foi observado a separação de fases. Parâmetros como volume

Grecco CF et al.

(mL), porcentagem de água (m/m) e concentração de cloreto (mol L-1) na fase orgânica também foram avaliados. Os resultados obtidos mostraram que os diferentes solventes geraram diferentes volumes de fase orgânica com diferentes porcentagens de água.

Jain et al.[37] avaliou a extração de termozolomida em amostras de plasma por SALLE utilizando cloreto de sódio como agente salting out e diferentes solventes orgânicos extratores. As recuperações obtidas utilizando metanol, acetato de etila, diclorometano e acetonitrila foram 6,79 ± 5,56%, 52,01 ± 3,13%, 62,69 ± 2,11% e 69,20 ± 1,18%, respectivamente. A eficiência da SALLE depende da solubilidade do analito no solvente extrator, dessa forma, a baixa solubilidade da termozolomida em metanol foi responsável pela pequena fração recuperada.

A utilização de uma mistura de solventes orgânicos é uma alternativa que pode aumentar a eficiência de extração na técnica SALLE. Qiu et al.[13] realizou a extração de trans resveratrol e seus congugados glucurônicos e sulfatos em amostras de plasma de rato por SALLE. Utilizando acetonitrila como solvente extrator, recuperação melhorada foi obtida apenas para transresveratrol e sulfatos. Em seguida, os autores avaliaram a eficiência da extração dos analitos com a adição de 20% metanol (v/v) ao solvente extrator. Apesar do volume de fase orgânica ter diminuido após a separação de fases, a recuperação dos conugados glucurônicos foi satisfatória.

2.2. Sais utilizados

A técnica SALLE permite a utilização de sais de natureza orgânica ou inorgânica como agentes de salting out. Em um sistema SALLE, além de atuar como agente salting out, o sal ainda pode ser responsável por precipitar proteínas e outras macromoléculas presentes na matriz biológica, reduzir a solubilidade dos analitos na fase aquosa e separar o solvente orgânico miscível da fase aquosa[35,38-40]. Entretanto, para a escolha do sal a ser utilizado, é importante considerar o tipo de amostra, a natureza dos analitos, o solvente orgânico e a instrumentação analítica utilizada[2]. Entre os sais mais

Scientia Chromatographica 2018; 10(2):99-110 103

Grecco CF et al.

Extração líquido-líquido assistida pelo efeito salting out para análise de amostras biológicas

utilizados nas bioanálises, podemos citar o sulfato de magnésio, sulfato de zinco, sulfato de amônio e sulfato de cobre. Diversos trabalhos reportados na literatura têm utilizado o sulfato de magnésio como agente salting out[3,9,41-44]. É importante ressaltar que alguns sais podem afetar negativamente o resultado das análises em fluidos biológicos por LC-MS/MS. O uso de sais inorgânicos pode interferir no processo de separação cromatográfica e/ou suprimir a ionização dos analitos[24,43]. Desta maneira, o uso de sais voláteis compatíveis com o sistema LC­ MS/MS, como o acetato e formiato de amônio têm sido a primeira linha de escolha para bioanálises[4,9,10,45]. A utilização de solução concentrada destes sais voláteis, ao invés do sal em sua forma sólida, permite a automação da SALLE[4].

Em SALLE por LC-MS/MS, a concentração de sal pode estar próxima da saturação (como 3 mol/L ZnSO4 ou 2 mol/L MgSO4) ou a uma concentração alta o suficiente em que, após a adição de volume adequado, a concentração final de sal na fase aquosa total (amostra mais solução salina) possibilite uma clara separação de fases[2].

Wu et al.[4] sugeriu que a concentração de sal de 1 mol/L em amostras de plasma é suficiente para produzir separação da fase orgânica de forma clara e limpa, enquanto que o uso de sal em alta concentração poderá comprometer a precisão do ensaio na análise por LC-MS. Jain et al.[37] desenvolveu um método SALLEHPLC para a extração de termozolomida. A utilização de dois sais para extração (“double SALLE”) aumentou a eficiência do método convencional.

2.3. pH

A maioria dos fármacos, metabólitos e compostos endógenos das matrizes biológicas são ácidos ou bases fracas que contém ao menos um grupo funcional ionizável. Desta forma, o ajuste do pH da amostra pode 104

influenciar significativamente na eficiência de extração de um método bioanalítico. A maioria dos trabalhos que utilizam a técnica SALLE em amostras biológicas ajustam o pH da amostra duas unidades acima ou abaixo do valor de pKa de analitos, básicos ou ácidos, respectivamente. Esta estratégia tem a finalidade de deixar os compostos em sua forma não ionizada, uma vez que moléculas carregadas apresentam baixa solubilidade em solventes orgânicos[2,46].

Devido à polaridade relativamente mais alta dos solventes orgânicos usados, a técnica SALLE permite a extração de uma ampla gama de compostos hidrofílicos e hidrofóbicos. Ainda assim, um pH adequado na solução aquosa ajudará a melhorar a eficiência/recuperação da extração[2].

Rustum et al. desenvolveu métodos bioanalíticos que utiliza carbonato de potássio anidro para determinar ciclofosfamida[19], cadralazina[20] e diltiazem[21] em amostras de sangue. O pH 12 da solução saturada de carbonato de potássio favoreceu a extração dos compostos básicos cadralazina (pKa = 9,0) e diltiazem (pKa = 8,9), mas o mesmo não ocorreu para o ácido fraco ciclofosfamida (pKa = 6,0). Dessa forma, as eficiências de extração para cadralazina e diltiazem foram ≥95%, enquanto que para a ciclofosfamida foi de apenas aproximadamente 60-64%.

Wang et al.[47] investigou a eficiência de extração da varfarina racêmica (ácido fraco com pKa = 5) em função do pH. Foi verificado que em pH 4, houve uma eficiência de extração de 92,7%, enquanto que em pH 7-10 a eficiência de extração caiu abaixo de 60%.

A escolha do pH da amostra deve ser feita considerando a estabilidade dos analitos, dessa forma, o ajuste do pH não deve causar nenhuma instabilidade nos analitos e seus metabólitos. Portanto, uma compreensão completa da via metabólica do analito é essencial para evitar decomposições inesperadas. Em alguns casos, os analitos que apresentam baixa estabilidade não são extraídos em valores extremos de pH[2,46].

Scientia Chromatographica 2018; 10(2):99-110

Extração líquido-líquido assistida pelo efeito salting out para análise de amostras biológicas

Zhang et al.[7] realizou determinações quantitativas de sinvastina e seu metabólito ácido em amostras de plasma, controlando o pH da solução aquosa em 4,5.

Apesar das espécies estarem parcialmente ionizadas neste pH, este valor foi utilizado para que não houvesse a biotransforamação da sinvastatina em seu metabólito ácido.

Magiera et al.[48] estudou os efeitos do pH na extração por SALLE dos beta bloqueadores: metoprolol, propranolol e carvedilol em amostras de urina. Os autores variaram o pH de 3 a 12, utilizando ácido clorídrico e hidróxido de amônio. Os resultados mostraram melhor recuperação em pH 12, o que pode ser atribuído aos valores de pKa dos analitos, que variaram de 8.74 a 9.7.

Nestas condições, os analitos estariam em sua forma não ionizada, favorecendo sua partição junto à fase orgânica e aumentando a recuperação.

O efeito da influência do pH também foi demonstrado no trabalho de Fan et al. que desenvolveu um método SALLE para determinação de clorofenóis (pka entre 4.74-7.00) em amostras vinho. Inicialmente, os autores realizaram as extrações em pH 4,5, logo após diluição e adição do sal à amostra. A otimização do método demonstrou maior eficiência de extração utilizando pH 2, uma vez que o analito mais ácido apresentava pKa de 4,74, aumentando a taxa de recuperação em 1-5%[49].

Atlabachew et al.[50] também investigou a influência do pH em suas análises. Entretanto, os autores avaliaram apenas três diferentes valores de pH na extração de alcalóides de plantas de origem leste africana. Como condições ácidas protonariam o sítio básico contendo grupos funcionais característicos dessa classe de compostos, os autores optaram por utilizar valores alcalinos de pH (8, 10 e 12). Por conclusão o pH 10 demonstrou maiores valores de recuperação e eficiente extração.

Grecco CF et al.

2.4. Efeito matriz As investigações do efeito de matriz usando LC-MS/MS são principalmente sobre a avaliação da supressão/aumento da matriz[43,51] ou a variação do efeito da matriz nas diferentes amostras analisadas[3-5,7].

Na determinação do entecavir em amostras de plasma humano, Zhao et al. removeu os lipídeos, utilizando éter dietílico no extrato obtido por SALLE, o qual foi seco e reconstituído na fase móvel aquosa[43].

Os autores compararam os efeitos da matriz nos extratos obtidos por SALLE e por SPE, utilizando uma infusão pós-coluna. A supressão iônica foi semelhante para os dois métodos.

O efeito matriz também pode estar relacionado ao sal utilizado. Durante o desenvolvimento de um método SALLE para a análise de lorcaserin em amostras de plasma por LC-MS/MS, o efeito da matriz foi investigado usando cloreto de magnésio, formato de amônio, cloreto de sódio, acetato de sódio, sulfato de cobre, sulfato de magnésio e acetato de amônio. Os resultados mostraram que cloreto de magnésio apresentou o menor efeito de matriz (9,7%), já o efeito matriz resultante do uso de sulfato de cobre foi mais alto (28%). Formiato de amônio e o acetato de amônio geraram efeitos de matriz entre 13 e 15%.

Mais recentemente, Alshishani et al.[52] realizou a determinação de biguanidas em amostras de plasma, urina e água de rio por HILIC. Não foi observado efeito de matriz significativo. Isso pode ser explicado pelo fato de a técnica SALLE remover grande parte dos componentes polares da matriz, e os componentes remanescentes não ficarem retidos na fase estacionaria HILIC. Deste modo, a utilização de colunas HILIC com extração por SALLE geram cromatogramas limpos e com alta sensibilidade para fármacos polares[52,53].

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Grecco CF et al.

Extração líquido-líquido assistida pelo efeito salting out para análise de amostras biológicas

3. Considerações Finais A SALLE tem sido utilizada com sucesso na determinação de diversas substâncias em amostras biológicas, pois permite extrações mais eficientes e mais seletivas de analitos hidrofílicos, quando comparada à LLE clássica[4,21,22]. As características físico-químicas dos analitos e a instrumentação analítica deverão ser considerados na escolha do solvente orgânico, agente salting out e pH do meio. A separação de fases (orgânica/ aquosa) não permite a recuperação total do volume de solvente orgânico utilizado e não gera frações orgânicas isentas de água. O volume da fração orgânica recuperada

depende do solvente orgânico e do sal utilizado na extração. Solventes mais hidrofílicos geram maior volume de fase orgânica com alta concentração de água e de analitos polares, quando comparados aos solventes menos hidrofílicos[44,45,56-58]. Além disso, a taxa de recuperação é diretamente proporcional à solubilidade dos analitos na fase orgânica. Uma das vantagens da técnica SALLE é a possibilidade de extração simultânea de vários compostos de diferentes polaridades, hidrofílicos e hidrofóbicos. No entanto, interferentes das amostras biológicas podem ser extraídos de forma conjunta, aumentando os efeitos de matriz do método.

Referências [1] Nováková L, Vlčková H. A review of current trends and advances in modern bio-analytical methods: Chromatography and sample preparation. Anal Chim Acta [Internet]. 2009 Dec;656(1-2):8–35. Available from: http://linkinghub.elsevier.com/ retrieve/pii/S0003267009013555 [2] Tang YQ, Weng N. Salting-out assisted liquid–liquid extraction for bioanalysis. Bioanalysis [Internet]. 2013 Jun;5(12):1583–98.

Available from: http://www.future-science.com/doi/10.4155/bio.13.117 [3] Zhang J, Wu H, Kim E, El-Shourbagy TA. Salting-out assisted liquid/liquid extraction with acetonitrile: a new high throughput sample preparation technique for good laboratory practice bioanalysis using liquid chromatography-mass spectrometry. Biomed Chromatogr [Internet]. 2009 Apr;23(4):419–25. Available from: http://doi.wiley.com/10.1002/bmc.1135 [4] Wu H, Zhang J, Norem K, El-Shourbagy TA. Simultaneous determination of a hydrophobic drug candidate and its metabolite in human plasma with salting-out assisted liquid/liquid extraction using a mass spectrometry friendly salt. J Pharm Biomed Anal [Internet]. 2008 Dec;48(4):1243–8. Available from: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0731708508004858 [5] Myasein F, Kim E, Zhang J, Wu H, El-Shourbagy TA. Rapid, simultaneous determination of lopinavir and ritonavir in human plasma by stacking protein precipitations and salting-out assisted liquid/liquid extraction, and ultrafast LC–MS/MS. Anal Chim Acta [Internet]. 2009 Sep;651(1):112–6. Available from: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0003267009010599 [6] Zhang J, Myasein F, Rodila R, Wu H, El-Shourbagy TA. High-throughput salting-out assisted liquid/liquid extraction and ultrafast LC for same-day delivery of first-in-human bioanalytical data. Bioanalysis [Internet]. 2009 Jul;1(4):715–9. Available from: http://www.future-science.com/doi/10.4155/bio.09.71 [7] Zhang J, Rodila R, Gage E, Hautman M, Fan L, King LL, et al. High-throughput salting-out assisted liquid/liquid extraction with acetonitrile for the simultaneous determination of simvastatin and simvastatin acid in human plasma with liquid chromatography. Anal Chim Acta [Internet]. 2010 Feb;661(2):167–72. Available from: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/ pii/S0003267009017334 [8] Yanes EG, Lovett DP. High-throughput bioanalytical method for analysis of synthetic cannabinoid metabolites in urine using salting-out sample preparation and LC–MS/MS. J Chromatogr B [Internet]. 2012 Nov;909:42–50. Available from: http:// linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S1570023212005971 106

Scientia Chromatographica 2018; 10(2):99-110

Extração líquido-líquido assistida pelo efeito salting out para análise de amostras biológicas

Grecco CF et al.

[9] Yang Y, Xu Q, Zhou L, Zhong D, Chen X. High-throughput salting-out-assisted liquid-liquid extraction for the simultaneous determination of atorvastatin, ortho -hydroxyatorvastatin, and para -hydroxyatorvastatin in human plasma using ultrafast liquid chromatography with tandem mass spectrometry. J Sep Sci [Internet]. 2015 Mar;38(6):1026–34. Available from: http://doi.wiley. com/10.1002/jssc.201401227 [10] Xiong X, Yang L. Salting-out-assisted liquid-liquid extraction with acetonitrile for the determination of trimetazidine in rat plasma using liquid chromatography-mass spectrometry. Biomed Chromatogr [Internet]. 2015 Feb;29(2):268–74. Available from: http://doi.wiley.com/10.1002/bmc.3271 [11] Ahmed S, Mahmoud AM. A novel salting-out assisted extraction coupled with HPLC- fluorescence detection for trace determination of vitamin K homologues in human plasma. Talanta [Internet]. 2015 Nov;144:480–7. Available from: http:// linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S003991401530134X [12] Sparidans RW, van Hoppe S, Rood JJM, Schinkel AH, Schellens JHM, Beijnen JH. Liquid chromatography–tandem mass spectrometric assay for the tyrosine kinase inhibitor afatinib in mouse plasma using salting-out liquid–liquid extraction.

J Chromatogr B [Internet]. 2016 Feb;1012-1013:118–23. Available from: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/ S1570023216300253 [13] Qiu Z, Yu J, Dai Y, Yang Y, Lu X, Xu J, et al. A simple LC-MS/MS method facilitated by salting-out assisted liquid-liquid extraction to simultaneously determine trans -resveratrol and its glucuronide and sulfate conjugates in rat plasma and its application to pharmacokinetic assay. Biomed Chromatogr [Internet]. 2017 Nov;31(11):e4001. Available from: http://doi.wiley. com/10.1002/bmc.4001 [14] Retmana IA, Wang J, Schinkel AH, Schellens JHM, Beijnen JH, Sparidans RW. Liquid chromatography-tandem mass spectrometric assay for the quantitative determination of the tyrosine kinase inhibitor quizartinib in mouse plasma using saltingout liquid-liquid extraction. J Chromatogr B [Internet]. 2017 Sep;1061-1062:300–5. Available from: http://linkinghub.elsevier. com/retrieve/pii/S157002321730689X [15] Horning MG, Boucher EA, Stafford M, Horning EC. A rapid procedure for the isolation of drugs and drug metabolites from plasma.

Clin Chim Acta [Internet]. 1972 Mar;37:381–6. Available from: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/0009898172904585 [16] Horning MG, Gregory P, Nowlin J, Stafford M, Lertratanangkoon K, Butler C, et al. Isolation of drugs and drug metabolites from biological fluids by use of salt-solvent pairs. Clin Chem [Internet]. 1974 Feb;20(2):282–7. Available from: http://www.ncbi.nlm. nih.gov/pubmed/4813008 [17] Bastos ML, Kananen GE, Young RM, Monforte JR, Sunshine I. Detection of basic organic drugs and their metabolites in urine.

Clin Chem [Internet]. 1970 Nov;16(11):931–40. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/5473554 [18] Frankforter GB, Cohen L. EQUILIBRIA IN THE SYSTEMS, WATER, ACETONE AND INORGANIC SALTS. J Am Chem Soc [Internet]. 1914 Jun;36(6):1103–34. Available from: http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ja02183a005 [19] Rustum AM, Hoffman NE. Determination of cyclophosphamide in whole blood and plasma by reversed-phase high-performance liquid chromatography. J Chromatogr B Biomed Sci Appl [Internet]. 1987 Jan;422:125–34. Available from: http://linkinghub. elsevier.com/retrieve/pii/0378434787804450 [20] Rustum AM. Determination of cadralazine in human whole blood using reversed-phase high-performance liquid chromatography: utilizing a salting-out extraction procedure. J Chromatogr [Internet]. 1989 Apr 14;489(2):345–52. Available from: http://www. ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2753958 [21] Rustum AM. Determination of diltiazem in human whole blood and plasma by high-performance liquid chromatography using a polymeric reversed-phase column and utilizing a salting-out extraction procedure. J Chromatogr [Internet]. 1989 May 30;490(2):365–75. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2768409 [22] Rustum AM. Estimation of cyclosporin-A in whole blood by simple and rapid reversed-phase HPLC utilizing a salting-out extraction procedure. J Chromatogr Sci [Internet]. 1990 Nov;28(11):594–8. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ pubmed/2262531 Scientia Chromatographica 2018; 10(2):99-110 107

Grecco CF et al.

Extração líquido-líquido assistida pelo efeito salting out para análise de amostras biológicas

[23] Cociglio M, Alric R, Bouvier O. Performance analysis of a reversed-phase liquid chromatographic assay of lamotrigine in plasma using solvent-demixing extraction. J Chromatogr [Internet]. 1991 Dec 6;572(1-2):269–76. Available from: http://www.ncbi.nlm. nih.gov/pubmed/1818061 [24] Yoshida M, Akane A, Nishikawa M, Watabiki T, Tsuchihashi H. Extraction of Thiamylal in Serum Using Hydrophilic Acetonitrile with Subzero-Temperature and Salting-Out Methods. Anal Chem [Internet]. 2004 Aug;76(16):4672–5. Available from: http:// pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ac040065a [25] Kole PL, Venkatesh G, Kotecha J, Sheshala R. Recent advances in sample preparation techniques for effective bioanalytical methods. Biomed Chromatogr [Internet]. 2011 Jan;25(1-2):199–217. Available from: http://doi.wiley.com/10.1002/bmc.1560 [26] Ramos RM, Valente IM, Rodrigues JA. Analysis of biogenic amines in wines by salting-out assisted liquid–liquid extraction and high-performance liquid chromatography with fluorimetric detection. Talanta [Internet]. 2014 Jun;124:146–51. Available from: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0039914014001246 [27] Gupta M, Jain A, Verma KK. Salt-assisted liquid–liquid microextraction with water-miscible organic solvents for the determination of carbonyl compounds by high-performance liquid chromatography. Talanta [Internet]. 2009 Dec 15;80(2):526–31. Available from: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0039914009005797 [28] Heydari R, Zarabi S. Development of combined salt- and air-assisted liquid–liquid microextraction as a novel sample preparation technique. Anal Methods [Internet]. 2014 Sep 11;6(21):8469–75. Available from: http://xlink.rsc.org/?DOI=C4AY01723D [29] Valente IM, Ramos RM, Gonçalves LM, Rodrigues JA. Determination of ethyl carbamate in spirits using salting-out assisted liquid–liquid extraction and high performance liquid chromatography with fluorimetric detection. Anal Methods [Internet]. 2014 Sep 18;6(22):9136–41. Available from: http://xlink.rsc.org/?DOI=C4AY02075H [30] Koltsakidou A, Zacharis CK, Fytianos K. A validated liquid chromatographic method for the determination of polycyclic aromatic hydrocarbons in honey after homogeneous liquid–liquid extraction using hydrophilic acetonitrile and sodium chloride as mass separating agent. J Chromatogr A [Internet]. 2015 Jan;1377:46–54. Available from: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/ S0021967314019451 [31] Gupta M, Pillai AKKV, Singh A, Jain A, Verma KK. Salt-assisted liquid–liquid microextraction for the determination of iodine in table salt by high-performance liquid chromatography-diode array detection. Food Chem [Internet]. 2011 Feb;124(4):1741–6.

Available from: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0308814610009842 [32] Røen BT, Sellevåg SR, Lundanes E. Quantification of Nerve Agent Biomarkers in Human Serum and Urine. Anal Chem [Internet]. 2014 Dec 2;86(23):11833–40. Available from: http://pubs.acs.org/doi/10.1021/ac503408x [33] Wang H, Gao M, Wang M, Zhang R, Wang W, Dahlgren RA, et al. Integration of phase separation with ultrasound-assisted salt-induced liquid–liquid microextraction for analyzing the fluoroquinones in human body fluids by liquid chromatography. J Chromatogr B [Internet]. 2015 Mar;985:62–70. Available from: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S1570023215000458 [34] Gao M, Wang H, Ma M, Zhang Y, Yin X, Dahlgren RA, et al. Optimization of a phase separation based magnetic-stirring salt-induced liquid–liquid microextraction method for determination of fluoroquinolones in food. Food Chem [Internet]. 2015 May;175:181–8. Available from: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0308814614018706 [35] TABATA M, KUMAMOTO M, NISHIMOTO J. Chemical Properties of Water-Miscible Solvents Separated by Salting-out and Their Application to Solvent Extraction. Anal Sci [Internet]. 1994;10(3):383–8. Available from: http://joi.jlc.jst.go.jp/JST. Journalarchive/analsci1985/10.383?from=CrossRef [36] Anastassiades M, Lehotay SJ, Stajnbaher D, Schenck FJ. Fast and easy multiresidue method employing acetonitrile extraction/ partitioning and “dispersive solid-phase extraction” for the determination of pesticide residues in produce. J AOAC Int [Internet].

86(2):412–31. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12723926 [37] Jain D, Athawale R, Bajaj A, Shrikhande S. Double-salting out assisted liquid–liquid extraction (SALLE) HPLC method for estimation of temozolomide from biological samples. J Chromatogr B [Internet]. 2014 Nov;970:86–94. Available from: http:// linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S1570023214001275 108

Scientia Chromatographica 2018; 10(2):99-110

Extração líquido-líquido assistida pelo efeito salting out para análise de amostras biológicas

Grecco CF et al.

[38] Polson C, Sarkar P, Incledon B, Raguvaran V, Grant R. Optimization of protein precipitation based upon effectiveness of protein removal and ionization effect in liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci [Internet]. 2003 Mar 5;785(2):263–75. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12554139 [39] LI C-H. Recovery of Aniline from Wastewater by Nitrobenzene Extraction Enhanced with Salting-Out Effect. Biomed Environ Sci [Internet]. 2010 Jun;23(3):208–12. Available from: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0895398810600542 [40] Jenkins TF, Miyares PH. Nonevaporative preconcentration technique for volatile and semivolatile solutes in certain polar solvents.

Anal Chem [Internet]. 1991 Jul;63(13):1341–3. Available from: http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ac00013a031 [41] Tsai W-H, Huang T-C, Chen H-H, Wu Y-W, Huang J-J, Chuang H-Y. Determination of sulfonamides in swine muscle after salting-out assisted liquid extraction with acetonitrile coupled with back-extraction by a water/acetonitrile/dichloromethane ternary component system prior to high-performance liquid chromatography. J Chromatogr A [Internet]. 2010 Jan;1217(3):250– 5. Available from: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0021967309016963 [42] Song S, Ediage EN, Wu A, De Saeger S. Development and application of salting-out assisted liquid/liquid extraction for multimycotoxin biomarkers analysis in pig urine with high performance liquid chromatography/tandem mass spectrometry. J Chromatogr A [Internet]. 2013 May;1292:111–20. Available from: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S002196731201686X [43] Zhao F-J, Tang H, Zhang Q-H, Yang J, Davey AK, Wang J. Salting-out homogeneous liquid–liquid extraction approach applied in sample pre-processing for the quantitative determination of entecavir in human plasma by LC–MS. J Chromatogr B [Internet].

2012 Jan;881-882:119–25. Available from: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S1570023211007902 [44] Hamed AM, Arroyo-Manzanares N, García-Campaña AM, Gámiz-Gracia L. Determination of Fusarium toxins in functional vegetable milks applying salting-out-assisted liquid–liquid extraction combined with ultra-high-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry. Food Addit Contam Part A [Internet]. 2017 Nov 2;34(11):2033–41. Available from: https://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/19440049.2017.1368722 [45] Tandel D, Shah P, Patel K, Thakkar V, Patel K, Gandhi T. Salting-Out Assisted Liquid–Liquid Extraction for Quantification of Febuxostat in Plasma Using RP-HPLC and Its Pharmacokinetic Application. J Chromatogr Sci [Internet]. 2016 Sep 6;54(10):1827–33. Available from: https://academic.oup.com/chromsci/article-lookup/doi/10.1093/chromsci/bmw124 [46] Hendriks G, Uges DRA, Franke JP. Reconsideration of sample pH adjustment in bioanalytical liquid–liquid extraction of ionisable compounds. J Chromatogr B [Internet]. 2007 Jun 15;853(1-2):234–41. Available from: http://linkinghub.elsevier.com/ retrieve/pii/S1570023207002322 [47] Wang M, Cai Z, Xu L. Coupling of acetonitrile deproteinization and salting-out extraction with acetonitrile stacking in chiral capillary electrophoresis for the determination of warfarin enantiomers. J Chromatogr A [Internet]. 2011 Jul;1218(26):4045–51.

Available from: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0021967311005772 [48] Magiera S, Kolanowska A, Baranowski J. Salting-out assisted extraction method coupled with hydrophilic interaction liquid chromatography for determination of selected β-blockers and their metabolites in human urine. J Chromatogr B [Internet]. 2016 Jun;1022:93–101. Available from: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S157002321630229X [49] Fan Y, Hu S, Liu S. Salting-out assisted liquid-liquid extraction coupled to dispersive liquid-liquid microextraction for the determination of chlorophenols in wine by high-performance liquid chromatography. J Sep Sci [Internet]. 2014 Dec;37(24):3662– 8. Available from: http://doi.wiley.com/10.1002/jssc.201400869 [50] Atlabachew M, Chandravanshi BS, Redi-Abshiro M. Preparative HPLC for large scale isolation, and salting-out assisted liquid– liquid extraction based method for HPLC–DAD determination of khat (Catha edulis Forsk) alkaloids. Chem Cent J [Internet].

2017 Dec 17;11(1):107. Available from: http://ccj.springeropen.com/articles/10.1186/s13065-017-0337-6 [51] Liu G, Zhou N, Zhang M, Li S, Tian Q, Chen J, et al. Hydrophobic solvent induced phase transition extraction to extract drugs from plasma for high performance liquid chromatography–mass spectrometric analysis. J Chromatogr A [Internet]. 2010 Jan;1217(3):243–9. Available from: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0021967309016987 [52] Alshishani A, Salhimi SM, Saad B. Salting-out assisted liquid-liquid extraction coupled with hydrophilic interaction chromatography for the determination of biguanides in biological and environmental samples. J Chromatogr B [Internet]. 2018 Jan;1073:51–9. Available from: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S1570023217314459 Scientia Chromatographica 2018; 10(2):99-110 109

Grecco CF et al.

Extração líquido-líquido assistida pelo efeito salting out para análise de amostras biológicas

[53] Tan B, Negahban A, McDonald T, Zhang Y, Holliman C. Utilization of hydrophilic-interaction LC to minimize matrix effects caused by phospholipids. Bioanalysis [Internet]. 2012 Aug;4(16):2049–58. Available from: http://www.future-science.com/ doi/10.4155/bio.12.162 [54] Li T, Zhang L, Tong L, Liao Q. High-throughput salting-out-assisted homogeneous liquid-liquid extraction with acetonitrile for determination of baicalin in rat plasma with high-performance liquid chromatography. Biomed Chromatogr [Internet]. 2014 May;28(5):648–53. Available from: http://doi.wiley.com/10.1002/bmc.3083 [55] Xiong X, Zhang L, Cheng L, Mao W. High-throughput salting-out assisted liquid-liquid extraction with acetonitrile for the determination of anandamide in plasma of hemodialysis patients with liquid chromatography tandem mass spectrometry. Biomed Chromatogr [Internet]. 2015 Sep;29(9):1317–24. Available from: http://doi.wiley.com/10.1002/bmc.3425 [56] Liu Z, Yu W, Zhang H, Gu F, Jin X. Salting-out homogenous extraction followed by ionic liquid/ionic liquid liquid–liquid microextraction for determination of sulfonamides in blood by high performance liquid chromatography. Talanta [Internet]. 2016 Dec;161:748–54. Available from: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0039914016306774 [57] Niu Z, Yu C, He X, Zhang J, Wen Y. Salting-out assisted liquid–liquid extraction combined with gas chromatography-mass spectrometry for the determination of pyrethroid insecticides in high salinity and biological samples. J Pharm Biomed Anal [Internet]. 2017 Sep;143:222–7. Available from: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0731708517304089 [58] Tsai C-J, Liao F-Y, Weng J-R, Feng C-H. Tandem derivatization combined with salting-out assisted liquid–liquid microextraction for determination of biothiols in urine by gas chromatography–mass spectrometry. J Chromatogr A [Internet]. 2017 Nov;1524:29– 36. Available from: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0021967317314504

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Scientia Chromatographica 2018; 10(2):111-117 Instituto Internacional de Cromatografia http://dx.doi.org/10.5935/sc.2018.007 ISSN 1984-4433

GC-ECD

Determinação de resíduos de pesticidas em planta de arroz empregando QuEChERS modificado e cromatografia gasosa com detecção por captura de elétrons Determination of pesticide residues in rice plant by modified QuEChERS and gas chromatography with electron capture detection

Juliana P. Cogoa Sandra C. Peixotoa Gustavo M. Telób Enio Marchesanb Renato Zanellaa* Departamento de Química, Universidade Federal de Santa Maria, 97105-900 Santa Maria - RS, Brasil b Departamento de Fitotecnia, Universidade Federal de Santa Maria, 97105-900 Santa Maria - RS, Brasil a

*renato.zanella@ufsm.br Recebido: 20/02/2018 Aceito: 16/03/2018

Resumo

O uso intensivo de pesticidas no cultivo de arroz resulta na ocorrência de resíduos no grão, mas também na planta, a qual após a colheita é frequentemente utilizada para alimentação animal. Neste trabalho foi desenvolvido e validado um método para determinação de resíduos dos inseticidas bifentrina e lambda-cialotrina e dos fungicidas azoxistrobina e trifloxistrobina em planta de arroz empregando método QuEChERS modificado para o preparo de amostra e análise por cromatografia gasosa com detecção por captura de elétrons (GC-ECD). Após a otimização dos parâmetros de extração e análise, o método foi validado. As curvas analíticas preparadas no extrato da matriz branco apresentaram linearidade entre 0,01 e 1,0 mg L-1, com r2 >0,99. Os limites de quantificação do método foram 0,05 mg kg-1 para lambda-cialotrina, bifentrina e trifloxistrobina e 0,25 mg kg-1 para azoxistrobina. A limpeza do extrato empregando pequena quantidade de carvão ativado, além de ser de baixo custo, foi eficiente na remoção da grande quantidade de pigmentos da matriz sem perda significativa dos pesticidas em estudo. O método apresentou adequada exatidão, com recuperações entre 71,2 e 103,6%, e boa precisão, com valores de RSD <14,7%, para níveis de fortificação 0,25, 0,5, 1,25 e 2,5 mg kg-1. O método foi aplicado para avaliar a persistência dos pesticidas em planta de arroz cultivas em experimento de campo e provou ser sensível e eficiente.

Palavras-chave: pesticidas, plantas, arroz, QuEChERS, GC-ECD.

Abstract

The intensive use of pesticides in rice cultivation results in the occurrence of residues in the grain, but also in the plant, which after harvest is often used for animal feed. In this work, a method for the determination of residues of the insecticides bifenthrin and lambda-cyhalothrin and of the fungicides azoxystrobin and trifloxystrobin in rice plant was developed and validated using a modified QuEChERS method for sample preparation and analysis by gas chromatography with electron capture detection (GC-ECD). After the optimization of the extraction and analysis parameters, the method was validated. The analytical curves prepared in blank matrix extract showed linearity between 0.01 and 1.0 mg L-1, with r2 >0.99. Method limits of quantification were 0.05 mg kg-1 for lambda-cyhalothrin, bifenthrin and trifloxystrobin and 0.25 mg kg-1 for azoxystrobin. The extract clean-up using a small amount of activated charcoal, besides being of low cost, was efficient in the removal of the great quantity of pigments of the matrix without significant loss of the pesticides under study. The method presented adequate accuracy, with recoveries between 71.2 and 103.6%, and good precision, with RSD values <14.7%, for levels of fortification 0.25, 0.5, 1.25 and 2.5 mg kg-1. The method was applied to evaluate the persistence of the pesticides in rice plant cultivated in a field experiment and proved to be sensitive and efficient.

Keywords: pesticide, plant, rice, QuEChERS, GC-ECD. Scientia Chromatographica 2018; 10(2)

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Cogo JP et al.

Empregando QuEChERS modificado e cromatografia gasosa com detecção por captura de elétrons

1. Introdução

O arroz é uma das culturas mais importantes no mundo sendo a principal fonte nutricional para as pessoas que moram em países em desenvolvimento. O Brasil é o maior produtor e consumidor de arroz fora da Ásia, com produção média anual de aproximadamente 15 milhões de toneladas[1].

A agricultura brasileira tem se destacado com números cada vez mais expressivos na produção, na exportação e na quantidade de tecnologias empregadas no campo. Tal crescimento levou também à utilização de maiores quantidades de pesticidas na produção agrícola, colocando o Brasil como segundo maior consumidor mundial[2,3].

O arroz, durante todo o seu ciclo, é afetado por doenças que reduzem a produtividade e a qualidade dos grãos. O controle destas doenças visa minimizar os prejuízos na produção e, em geral, é efetuado com a utilização de pesticidas. O uso de fungicidas e inseticidas na cultura do arroz tem sido intensificado nas últimas safras devido à maior incidência de doenças foliares e pragas, destacando-se assim, a importância do desenvolvimento de métodos analíticos para a determinação dos resíduos de pesticidas em grãos e planta de arroz para garantir a segurança alimentar[4,5].

Os níveis de resíduos de pesticidas nos alimentos e no meio ambiente, dependem de diversos fatores, como: tecnologia de aplicação, volume de produto aplicado, fatores ambientais (luz, temperatura, umidade e algumas propriedades físicas e químicas do solo), período de carência ou intervalo de segurança e características físico-químicas dos pesticidas. A utilização intensiva de pesticidas na cultura do arroz irrigado além de resultar em resíduos no grão, também afeta o meio ambiente, principalmente a água[6,7] e em peixes[8,9].

Nas últimas décadas ocorreu um rápido desenvolvimento de novos métodos analíticos para a determinação de resíduos de pesticidas em alimentos.

O método mais utilizado para esta finalidade na última 112

década é o método QuEChERS[10], que envolve uma extração inicial com acetonitrila, seguida por uma etapa de partição líquido-líquido após a adição de sais que facilitam a remoção de uma quantidade significativa de componentes polares da matriz e a separação de fases[11].

Finalmente, uma etapa simples de limpeza (cleanup) empregando extração em fase sólida dispersiva (dispersive solid phase extraction, d-SPE) é efetuada, onde sorventes são adicionados diretamente no extrato da amostra[12,13].

O método QuEChERS tem sido empregado com sucesso na determinação de resíduos de pesticidas em grão de arroz, principalmente com tamponamento utilizando ácido acético/acetato na extração[14,15].

A determinação de resíduos de pesticidas em plantas de arroz tem sido pouco explorada até o momento. Viera e colaboradores[16] descrevem um método para determinação de resíduos de 72 pesticidas em plantas de arroz, dentre outras matrizes, empregando método QuEChERS e cromatografia líquida de ultraalta eficiência acoplada à espectrometria de massas em série (UHPLC-MS/MS). A extração foi efetuada com acetonitrila contendo 5% (v/v) de ácido fórmico e a etapa de limpeza do extrato empregou d-SPE com C18 e carvão grafitizado. Liang e colaboradores[17] avaliaram a dissipação do herbicida oxaziclomefona analisando por cromatografia a gás com detecção de nitrogênio e fósforo (GC-NPD) os resíduos em grão e planta de arroz, solo e água em condições de campo. As recuperações médias variaram de 84,4 a 108,2% com RSD de 2,4 a 17,2%. O limite de quantificação (LOQ) para planta de arroz foi de 0,01 mg kg-1.

A utilização de técnicas cromatográficas mais simples, porém sensíveis e seletivas, como é o caso da GC-ECD tem permitido análises eficientes e de baixo custo para resíduos de pesticidas em aplicações que envolvam pesticidas halogenados, como é o caso de vários pesticidas utilizados atualmente[18-20].

Scientia Chromatographica 2018; 10(2):111-117

Empregando QuEChERS modificado e cromatografia gasosa com detecção por captura de elétrons

Este estudo teve como finalidade otimizar e validar um método de extração para determinar resíduos dos pesticidas azoxistrobina, bifentrina, lambda-cialotrina e trifloxistrobina em planta de arroz e aplicar em amostras de um estudo de acompanhamento da concentração residual destes fungicidas e inseticidas em plantas de arroz, devido a sua utilização para a alimentação de animais, principalmente bovinos.

2. Experimental 2.1. Materiais, reagentes e solventes

Os padrões sólidos dos pesticidas azoxistrobina (99,0%), bifentrina (99,5%), lambda-cialotrina (98,2%), trifloxistrobina (99,0%) e o padrão interno bromofós metílico (98,5%) foram adquiridos da LGC Standards (Augsburg, Alemanha). As soluções estoque dos pesticidas na concentração 1000 mg L-1 e a solução com a mistura dos pesticidas na concentração 100 mg L-1 foram preparadas em tolueno e estocadas em frascos âmbar a -18 °C. As soluções analíticas foram preparadas pela diluição da solução estoque da mistura dos pesticidas em acetonitrila e armazenadas da mesma maneira. O ácido acético p.a. foi adquirido da Merck (Darmstadt, Alemanha) e os solventes acetonitrila e tolueno grau pesticida foram adquiridos da J. T. Baker (Phillipsburg, EUA). Os reagentes acetato de sódio anidro p.a., sulfato de magnésio anidro p.a. e carvão ativado p.a. foram adquiridos da J. T. Baker (Phillipsburg, EUA). Hélio (99,999%), utilizado como gás de arraste, e nitrogênio (99,999%), como gás make-up, foram adquiridos da White Martins (São Paulo, Brasil).

2.2. Instrumentação e condições cromatográficas

As análises foram efetuadas com um cromatógrafo a gás modelo CP 3800 (Varian, Palo Alto, EUA) equipado com amostrador automático CP 8410, injetor split/splitless com controle pneumático eletrônico modelo 1079 e detector por captura de elétrons. Os compostos foram separados em uma coluna capilar de sílica fundida DB-5 com 30 m de comprimento, 0,25 mm de d.i. e 0,25 µm de espessura de filme (J & W Scientific,

Cogo JP et al.

Foster City, EUA). Hélio foi utilizado como gás de arraste na vazão constante de 1,3 mL min-1. A injeção foi realizada com programação de temperatura do injetor por vaporização com temperatura programada (PTV) sendo a temperatura inicial 80 °C, mantida por 1,0 min, com incremento de temperatura de 200 °C min-1 até 300 °C, mantida por 7,2 min. O volume de injeção foi de 1 µL no modo splitless. A programação da temperatura do forno da coluna foi 80 °C (1,0 min), com incremento de 25 °C min-1 até 215 °C, e posteriormente de 5 °C min-1 até 300 °C. O detector foi operado a 300 °C, com nitrogênio como gás make-up na vazão de 30 mL min-1.

A aquisição dos dados foi efetuada através do software Star Workstation 6.0 da Varian.

2.3. Preparo da amostra

Para a extração dos pesticidas das plantas de arroz utilizou-se o método QuEChERS acetato. Inicialmente pesou-se, diretamente em tubos de polipropileno com capacidade de 50 mL e tampa rosqueável, 3 g da amostra devidamente triturada e homogeneizada. Logo após, efetuou-se a extração de amostra livre de pesticidas, e a fortificação das amostras “branco” em 4 níveis, nas concentrações de 0,25; 0,5; 1,25 e 2,5 mg kg-1. Para a extração adicionou-se 15 mL de acetonitrila contendo 1% de ácido acético (v/v) em cada tubo, e com os tubos fechados efetuou-se agitação manual e vigorosa por 1 min. Em seguida, acrescentou-se 3 g de MgSO4 e efetuou-se a agitação manual por 20 s. Logo após, adicionou-se 1,7 g de CH3COONa e novamente foi repetida a agitação manual por 1 min. Em seguida, os tubos foram levados para centrifugação a 2420 g, durante 8 min. Posteriormente, para a etapa de limpeza do extrato por d-SPE, transferiu-se 2 mL do extrato líquido para outro tubo de polipropileno de 15 mL contendo 10 mg de carvão ativado e 300 mg de MgSO4, sendo os tubos agitados vigorosamente por 1 min e centrifugados a 2420 g. Após, em frasco de 2 mL, foram adicionados 1425 µL do extrato limpo e 75 µL da solução analítica do padrão interno (10 mg L-1), obtendo-se a concentração final de 0,5 mg L-1 do padrão interno, e analisou-se por GC-ECD.

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Cogo JP et al.

Empregando QuEChERS modificado e cromatografia gasosa com detecção por captura de elétrons

2.4. Validação do método

Uma vez definidas as melhores condições para a análise dos compostos estudados, a validação do método foi realizada. A linearidade das curvas analíticas foi avaliada a partir das soluções analíticas preparadas no extrato das plantas de arroz “branco” e em acetonitrila nas concentrações 0,01; 0,05; 0,1; 0,25; 0,5; 0,75 e 1,0 mg L-1. Cada solução foi injetada 6 vezes, e cada uma das repetições da curva foi precedida pela injeção de acetonitrila, para limpeza do sistema. Logo após, realizou-se a confecção das curvas analíticas para cada composto em estudo obtendo-se a média das áreas, o RSD (%), a equação das curvas analíticas bem como os coeficientes de determinação (r2).

Os limites de detecção (LOD) e de quantificação (LOQ) foram determinados considerando como LOD e LOQ as concentrações que resultam sinais 3 e 10 vezes maior que o ruído da linha de base, respectivamente.

Para avaliar a exatidão e precisão do método foram empregados ensaios de recuperação de amostras “branco” fortificadas 6 repetições cada nível. Estes ensaios foram efetuados em condições de repetitividade (mesmo analista e dia) e de precisão intermediária (diferentes analistas e dias).

2.5. Aplicação do método em plantas de arroz

O método desenvolvido e validado foi aplicado no estudo da concentração residual dos pesticidas azoxistrobina, bifentrina, lambda-cialotrina e trifloxistrobina em plantas de arroz proveniente de um experimento de campo conduzido na área de várzea do Departamento de Fitotecnia na Universidade Federal de Santa Maria, em Santa Maria - RS. O experimento foi conduzido com dois fungicidas (azoxistrobina e trifloxistrobina) e dois inseticidas (lambdacialotrina e bifentrina) de ampla utilização na cultura do arroz. Os fungicidas e inseticidas foram aplicados no estágio R0 (início da diferenciação da panícula) de desenvolvimento da cultura. A aplicação dos produtos foi efetuada na dose recomendada (Tabela 1). Para as amostras de plantas “branco”, cultivou-se o arroz em uma parcela distinta sem a aplicação de pesticidas.

114

Tabela 1. Produto formulado dos pesticidas e dose aplicada.

Pesticida Azoxistrobina Bifentrina Lambda-cialotrina Trifloxistrobina

i.a. = ingrediente ativo.

Produto formulado Dose aplicada (marca comercial) (g i.a. ha-1) Priori Extra Talstar Karate Zeon 50 CS Stratego 205 EC

100 15 10 94

Cada parcela possuía 11 linhas espaçadas em 0,17 m, com 7 m de comprimento. Para cada parcela individual foi realizada a análise de resíduos dos pesticidas. As amostragens foram feitas no 1º, 3º, 5º, 7º, 10º, 15º, 20º, 25º, 30º, 35º e 40º dias após a aplicação dos pesticidas. As plantas de arroz foram coletadas e acondicionadas separadamente em papel alumínio e armazenadas a -5 oC até a realização das análises.

3. Resultados e Discussão 3.1. Análise por GC-ECD As soluções analíticas, para a confecção das curvas de calibração, foram preparadas em extratos da matriz para a realização das análises, devido ao método ter evidenciado um significativo efeito matriz[21,22] positivo, ou seja, um aumento de sinal, indicando a necessidade de se utilizar curvas em extrato da matriz e não em solvente puro, para a obtenção de resultados adequados[23].

A Figura 1 apresenta um cromatograma obtido por GC-ECD a partir de uma amostra “branco” fortificada com a mistura dos pesticidas no nível de 0,5 mg kg-1. Os pesticidas em estudo e o padrão interno não sofreram interferências de outros componentes da matriz e podem ser quantificados adequadamente. A técnica GC-ECD mostrou ser uma boa opção para a determinação dos pesticidas em estudo permitindo uma análise com adequada sensibilidade e seletividade, já que foram obtidas respostas cromatográficas adequadas, sem interferências.

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Os resultados de precisão em termos de repetitividade e precisão intermediária estão apresentados na Tabela 3, juntamente com os resultados de exatidão obtidos através de ensaios de recuperação.

As recuperações para todos os pesticidas estudados ficaram entre 71,2 e 103,6%, indicando uma boa exatidão do método. A precisão intermediária para os fungicidas e inseticidas em estudo foi realizada empregando-se dias e operadores diferentes daqueles dos estudos de repetitividade. Os valores de precisão para o estudo de repetitividade ficaram entre 5,3 e 14,7% e para o estudo da precisão intermediária ficaram entre 8,5 e 14,3%. Considerando os critérios de aceitabilidade para recuperações entre 70 e 120% com precisão de até 20%[24], pode-se concluir que o método é satisfatório pois os valores obtidos estão dentro desses intervalos.

Figura 1. Cromatograma obtido por GC-ECD a partir de uma amostra “branco” fortificada com os pesticidas em 0,5 mg kg-1.

3.2. Resultados da validação do método

A Tabela 2 apresenta os valores obtidos para a equação da reta, coeficiente de determinação (r2), intervalo linear para cada um dos pesticidas estudados, preparados no extrato das plantas de arroz, bem como os limites de detecção e de quantificação do instrumento e do método. O intervalo linear foi de 0,01 a 0,75 mg L-1 para todos os pesticidas estudados, exceto para azoxistrobina onde o intervalo linear ficou entre 0,05 e 1,00 mg L-1, todas com r2 >0,99.

Os resultados indicam que o método proposto é adequado para a determinação dos pesticidas em estudo na matriz planta de arroz. O método QuEChERS modificado empregado é simples e permitiu a redução do consumo de amostra, solventes e sorventes para a etapa

Tabela 2. Parâmetros relativos às curvas analíticas, obtidos para os pesticidas no extrato de plantas de arroz “branco” analisados por GC-ECD e valores de LOD e LOQ.

Pesticida

Equação da reta (y = ax + b)

r

Azoxistrobina Bifentrina Cialotrina-ƛ Trifloxistrobina

y = 969,54x – 51,731 y = 1713x + 7,233 y = 3024,2x - 53,511 y = 1708x + 20,34

0,9936 0,9995 0,9952 0,9998

2

Intervalo linear, µg L-1

Limites do instrumento, mg L-1

50 – 1000 10 – 750 10 – 750 10 – 750

LODi

LOQi

0,02 0,004 0,004 0,004

0,05 0,01 0,01 0,01

Limites do método, mg kg-1 LODm 0,1 0,02 0,02 0,02

LOQm 0,25 0,05 0,05 0,05

Tabela 3. Resultados de recuperação e precisão obtidos nos ensaios de repetitividade e precisão intermediária.

Fortificação (mg kg-1), repetitividade* Pesticida

2,5

1,25

0,5

0,25

Fortificação (mg kg-1), precisão intermediária* 2,5

Recuperação ± RSD (%) Azoxistrobina Bifentrina Cialotrina-ƛ Trifloxistrobina

* n= 6.

76,8±8,2 72,4±6,3 83,6±11,8 87,9±13,1

71,7±12,1 73,1±7,4 77,9±14,7 85,3±10,5

85,4±10,8 81,2±9,1 83,3±14,6 89,6±13,4

1,25

0,5

0,25

Recuperação ± RSD (%) 93,4±12,3 76,7±10,0 71,2±5,3 73,8±7,9

74,2±13,4 96,5±13,7 81,3±10,8 92,6±11,7

77,1±13,7 97,6±13,8 73,2±14,3 103,6±8,5

74,1±13,7 87,9±14,1 77,1±14,0 91,2±13,8

81,2±13,9% 92,8±13,6% 95,9±13,1% 88,1±12,0%

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de limpeza do extrato. A determinação por GC-ECD foi eficiente para os níveis de concentração exigidos.

3.3. Aplicação do método

O desempenho do método proposto foi avaliado pela análise de planta de arroz provenientes de lavoura de arroz irrigado de um experimento controlado. O método mostrou-se adequado para a determinação de resíduos destes pesticidas, sem a ocorrência de interferentes.

A aplicação do método validado em plantas de arroz de um experimento de campo com os pesticidas estudados indicou que os resíduos são detectados até o 20º dia após a aplicação dos produtos. Os fungicidas e inseticidas em estudo apresentaram concentrações máximas residuais no 1º e 3º dias de coleta, sendo que após 20 dias de aplicação nenhum dos pesticidas foi detectado. Sabendo-se disso, após o período de 20 dias da aplicação, desde que seja observada a dosagem recomendada dos pesticidas em estudo, as plantas de arroz podem ser utilizadas para alimentação animal.

4. Conclusão

O método de extração QuEChERS modificado proposto tem como vantagens a utilização de pouca quantidade de solvente, baixo custo, não necessita equipamentos ou vidrarias complexas; além de ser simples, rápido e eficiente. Na etapa de limpeza do

extrato por d-SPE, a ação de 10 mg de carvão ativado e 300 mg de sulfato de magnésio para 2 mL de extrato, além de ser de baixo custo, mostrou-se adequada e eficiente, conseguindo remover a maior parte dos pigmentos presentes neste tipo de matriz. Os resultados de recuperação, entre 71,2 a 103,6%, e de precisão, <14,7%, comprovam que o método proposto é adequado.

Os limites de quantificação do método de 0,05 mg kg-1 para bifentrina, lambda-cialotrina e trifloxistrobina, e de 0,25 mg kg-1 para a azoxistrobina permitem a quantificação de resíduos destes pesticidas em amostras de plantas de arroz em níveis adequados. Assim, podese concluir que o método proposto é adequado para a análise desses pesticidas em plantas de arroz, podendo ser usado na rotina visto que todos os parâmetros de validação foram satisfatórios.

A aplicação do método validado em amostras de plantas de arroz de um experimento de campo com os pesticidas estudados indicou que os resíduos são detectados até 20 dias após a aplicação dos produtos.

Os resíduos foram determinados sem a ocorrência de interferentes.

Agradecimentos

Os autores agradecem ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) o apoio financeiro e as bolsas concedidas.

Referências

[1] Telo GM, Marchesan E, Zanella R, Peixoto SC, Prestes OD, de Oliveira ML Fungicide and insecticide residues in rice grains.

Acta Sci., Agron. 39 (2017) 9-15.

[2] Silva DRO, de Avila LA, Agostinetto D, Dal Magro T, Oliveira E, Zanella R, Noldin JA Pesticides monitoring in surface water of rice production areas in southern Brazil. Cienc. Rural 39 (2009) 2383-2389.

[3] Teló GM, Marchesan E, Zanella R, de Oliveira ML, Coelho LL, Martins ML Residues of fungicides and insecticides in rice field.

Agron. J. 107 (2015) 851-863.

[4] Wang K, Wu JX, Zhang HY Dissipation of difenoconazole in rice, paddy soil, and paddy water under field conditions. Ecotoxicol.

Environ. Saf. 86 (2012) 111-115.

[5] Hou X, Han M, Dai X, Yang X, Yi SA multi-residue method for the determination of 124 pesticides in rice by modified QuEChERS extraction and gas chromatography-tandem mass spectrometry. Food Chem. 138 (2013) 1198-1205.

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Empregando QuEChERS modificado e cromatografia gasosa com detecção por captura de elétrons

Cogo JP et al.

[6] Lamers M, Anyusheva M, La N, Nguyen VV, Streck T Pesticide Pollution in Surface- and Groundwater by Paddy Rice Cultivation: A Case Study from Northern Vietnam. Clean Soil Air Water 39 (2011) 356-361.

[7] Primel EG, Zanella R, Kurz MHS, Gonçalves FF, Martins ML, Machado SLO, Marchesan E Risk assessment of surface water contamination by herbicide residues: Monitoring of propanil degradation in irrigated rice field waters using HPLC-UV and confirmation by GC-MS. J. Braz. Chem. Soc. 18 (2007) 585-589.

[8] Toni C, Loro VL, Santi A, de Menezes CC, Cattaneo R, Clasen BE, Zanella R Exposure to tebuconazol in rice field and laboratory conditions induces oxidative stress in carp (Cyprinus carpio). Comp. Biochem. Physiol. C Toxicol. Pharmacol. 153 (2011) 128-132.

[9] Cattaneo R, Moraes BS, Loro VL, Pretto A, Menezes C, Sartori GM, Clasen B, de Avila LA, Marchesan E, Zanella R Tissue biochemical alterations of Cyprinus carpio exposed to commercial herbicide containing clomazone under rice-field conditions.

Arch. Environ. Contam. Toxicol. 62 (2012) 97-106.

[10] Anastassiades M, Lehotay S, Stajnbaher D, Schenck F Fast and easy multiresidue method employing acetonitrile extraction/ partitioning and “dispersive solid-phase extraction” for the determination of pesticide residues in produce. J. AOAC Int. 86 (2003) 412-431.

[11] Prestes OD, Adaime MB, Zanella R QuEChERS: possibilities and trends insample preparation for multiresidue determination of pesticides in food. Sci. Chromatogr. 3 (2011) 51–64.

[12] Mastovska K, Lehotay SJ Evaluation of common organic solvents for gas chromatographic analysis and stability of multiclass pesticide residues. J. Chromatogr. A, 1040 (2004) 259-272.

[13] Cabrera L da C, Martins ML, Primel EG, Prestes O, Adaime MB, Zanella R Extração em fase sólida dispersiva na determinação de resíduos e contaminantes em alimentos. Sci. Chromatogr. 4 (2012) 227-240.

[14] Cabrera L da C, Caldas SS, Prestes OD, Primel EG, Zanella R Evaluation of alternative sorbents for dispersive solid-phase extraction clean-up in the QuEChERS method for the determination of pesticide residues in rice by liquid chromatography with tandem mass spectrometry. Journal of Separation Science 39 (2016) 1945-1954.

[15] Pareja L, Fernández-Alba AR, Cesio V, Heinzen H Analytical methods for pesticide residues in rice. TrAC Trends in Anal.

Chem. 30 (2011) 270-291.

[16] Viera MS, Rizzetti TM, de Souza MP, Martins ML, Prestes OD, Adaime MB, Zanella R Multiresidue determination of pesticides in crop plants by the quick, easy, cheap, effective, rugged, and safe method and ultra-high-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry using a calibration based on a single level standard addition in the sample. J. Chromatogr. A 1526 (2017) 119-127.

[17] Liang H, Li L, Ji R, Qin D, Liu F Dissipation of oxaziclomefone and residue analysis in rice, soil and water under field conditions.

Bull. Environ. Contam. Toxicol. 86 (2011) 28-32.

[18] Jiménez JJ, Bernal JL, del Nozal MJ, Martín MT, Mayo R Sample preparation methods to analyze fipronil in honey by gas chromatography with electron-capture and mass spectrometric detection. J Chromatogr A. 1187 (2008) 40-45.

[19] Chen S, Shi L, Shan Z, Hu Q Determination of organochlorine pesticide residues in rice and human and fish fat by simplified two-dimensional gas chromatography. Food Chem. 104 (2007) 1315–1319.

[20] Presta MA, Kolberg DIS, Wickert C, Pizzutti IR, Adaime MB, Zanella R. High Resolution Gel Permeation Chromatography Followed by GC-ECD for the Determination of Pesticide Residues in Soybeans. Chromatographia 69 (2009) 237-241.

[21] González FJE, Torres MEH, López EA, Cuadros-Rodríguez L, Vidal JLM Matrix-effects of vegetable commodities in electroncapture detection applied to pesticide multiresidue analysis. J. Chromatogr. A 966 (2002) 155-165.

[22] Hajslova J, Zrostliková J Matrix effects in (ultra)trace analysis of pesticide residues in food and biotic matrices. J. Chromatogr.

A 1000 (2003) 181-197.

[23] Freitas S de S, Lanças FM Matrix effects observed during pesticides residue analysis in fruits by GC. J. Sep. Sci. 32 (2009) 3698-3705.

[24] SANTE (2015) Guidance document on analytical quality control and validation procedures for pesticide residues analysis in food and feed. Document n° SANTE/11945/2015.

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Cursos 2018

IIC Calendário anual de atividades Visite www.iicweb.org

Entre no site e faça já sua inscrição: www.iicweb.org CÓDIGO

MÊS

DATA

DISCIPLINA

HORAS

LC-01

Março

14 a 16

Cromatografia Líquida Básica

24

LC-02

Abril

18 a 20

Cromatografia Líquida Moderna

24

GC-02

Maio

08 a 10

Cromatografia Gasosa Moderna (inclui GC-MS)

24

LC-MS-01

Junho

03 a 06

Acoplamento LC-MS e LC-MS/MS

32

LC-02

Agosto

22 a 24

Cromatografia Líquida Moderna

24

SP-01

Setembro

19 a 21

Técnicas Modernas para o Preparo de Amostras

24

LC-MS-01

Novembro

27 a 30

Acoplamento LC-MS e LC-MS/MS

32

LC-03

Dezembro

05 a 07

Cromatografia Líquida Avançada

24

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INSTITUTO INTERNACIONAL DE CROMATOGRAFIA

O Instituto Internacional de Cromatografia (IIC) possui como uma de suas principais missões o oferecimento de cursos de curta duração nas áreas de cromatografia e técnicas relacionadas.

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Artigos de Revisão crítica: revisões críticas sobre uma area específica das técnicas cromatográficas e relacionadas são também consideradas para publicação. Esses artigos devem se limitar a no máximo 10.000 palavras, incluindo as legendas, e até 10 tabelas e figuras somadas. Os artigos de Revisão Crítica deverão antes de sua submissão serem discutidos com um dos co-Editores mais relacionados ao assunto em questão. Artigos não encaminhados desta forma serão antes enviados a um co-Editor da área em que se enquadre para parecer e, somente então, serão enviados aos revisores, podendo atrasar significativamente sua publicação. Devem conter uma contribuição nova a respeito de um assunto de grande interesse atual, discutindo as vantagens e desvantagens do mesmo. O Scientia não publica apenas relato de artigos descritos na literatura, sem uma discussão crítica sobre os mesmos.

Artigos de Alta Prioridade: são publicados no primeiro número disponível do periódico, recebendo prioridade máxima de todo o sistema Editorial do periódico. Para justificar sua publicação como alta prioridade, os manuscritos deverão apresentar, de forma resumida, resultados importantes de recentes desenvolvimentos na área de cromatografia e técnicas relacionadas (espectrometria de massas, preparo de amostras, eletroforese capilar e outros). Não precisam conter resultados experimentais detalhados, sendo limitados a 2.500 palavras e três figuras e/ou tabelas combinadas.

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Scientia Chromatographica 2018; 10(2)

Scientia Chromatographica EDITOR-IN-CHIEF

FERNANDO MAURO LANÇAS Universidade de São Paulo Instituto de Química de São Carlos 13560-970 São Carlos (SP) - Brasil editor@scientiachromatographica.com EDITORES ASSOCIADOS

MARIA EUGÊNIA QUEIROZ

RENATO ZANELLA

preparo de amostras

preparo de amostras

JOSÉ MANUEL F. NOGUEIRA

ISABEL C. S. FONTES JARDIM

preparo de amostras

CORPO EDITORIAL CONSULTIVO

Daniel Armstrong – EUA Dietrich von Bauer – Chile Fábio Augusto – Brasil Fátima Dutra – Brasil Flávio Leite – Brasil Frank Svec – EUA Harold McNair – EUA Humberto Gómez – México Isabel Cristina Sales Fontes Jardim – Brasil Jailson B. de Andrade – Brasil Janusz Pawliszyn – Canadá Kiyoratsu Jinno – Japão Luigi Mondello – Itália Marcos Eberlin – Brasil Marina Tavares – Brasil Milos Novotny – EUA Milton Lee – EUA Norberto Peporine Lopes – Brasil Phillip Marriott – Austrália Pierina Bonato – Brasil Quézia Cass – Brasil Renato Zanella – Brasil

cromatografia líquida

ENDEREÇO DO PERIÓDICO

Scientia Chromatographica

ELENA STASHENKO

espectrometria de massas

FABIO AUGUSTO

cromatografia gasosa

ALEJANDRO CIFUENTES

Técnicas Eletroforéticas

ÁLVARO J. SANTOS NETO

troubleshooting

Rua Princesa Isabel, 265 - Jardim Paraíso 13.561-140 - São Carlos (SP) - Brasil Fone/Fax: (16) 3501-4140 periodico@scientiachromatographica.org www.scientiachromatographica.com

Ficha catalográfica elaborada pela Seção de Aquisição e Tratamento da Informação do SBI/IQSC Scientia Chromatographica / Associação Internacional de Cromatografia. - vol.10 n.2 (abr./jun. 2018). São Carlos: Associação Internacional de Cromatografia, 2018.

Trimestral ISSN 1984-4433

CLÁUDIA ZINI

cromatografia gasosa

ELINA B. CARAMÃO

cromatografia gasosa

1. Cromatografia. 2. Lanças, Fernando Mauro, editor chefe.

CDD 543.8

ISSN 1984-4433

www.scientiachromatographica.com

2018

Volume 10 | Número 2

SCIENTIA CHROMATOGRAPHICA

Publicação disponível na internet:

81 42nd International Symposium on Capillary Chromatography and 15th GCxGC Symposium Fernando Mauro Lanças

2018 | Volume 10 | Número 2

89 Influence of high inlet pressure gas chromatography (HIPGC) on analytes retention time Meire Ribeiro da Silva, Ana Lúcia de Toffoli, Edvaldo Vasconcelos Soares Maciel, Fernando Mauro Lanças

99 Extração líquido-líquido assistida pelo efeito salting out para análise de amostras biológicas Caroline Fernandes Grecco, Luis Felippe Cabral Miranda, Jonas Carneiro Cruz, Maria Eugênia Costa Queiroz

111 Determinação de resíduos de pesticidas em planta de arroz empregando QuEChERS modificado e cromatografia gasosa com detecção por captura de elétrons Juliana P. Cogo, Sandra C. Peixoto, Gustavo M. Teló, Enio Marchesan, Renato Zanella

Rua Princesa Isabel, 265 - Jardim Paraíso São Carlos (SP) - CEP 13561-140 Fone/ Fax: (16) 3501-4140 | www.iicweb.org

2018 | Volume 10 | Número 2

Instituto Internacional de Cromatografia

Uma publicação do Instituto Internacional de Cromatografia www.iicweb.org