v10n1

ISSN 1984-4433

www.scientiachromatographica.com

2018

Volume 10 | Número 1 7

SCIENTIA CHROMATOGRAPHICA

Publicação disponível na internet:

Multiresidue determination of pesticides in sweet peppers by LC-MS/MS using Si-Al(PMTDS) as a sorbent for extraction by MSPD

2018 | Volume 10 | Número 1

Elisa Helena da Costa Morais, Renata Cristiano Nome, Carol Hollingworth Collins, Isabel Cristina Sales Fontes Jardim

21 Combinación de técnicas de extracción y de análisis cromatográfico para la determinación de metabolitos secundarios en flores tropicales Lady Johanna Sierra, Jesica Julieth Mejía, Leydé Gualteros, Karol Carrillo, Yuri Córdoba, Jairo René Martínez, Elena E. Stashenko

39 UHPLC capilar: aspectos teóricos e práticos Marcio David Bocelli, João Victor Basolli Borsatto, Álvaro José dos Santos Neto

49 2018 Events on chromatography and related techniques Os Editores

Rua Princesa Isabel, 265 - Jardim Paraíso São Carlos (SP) - CEP 13561-140 Fone/ Fax: (16) 3501-4140 | www.iicweb.org

2018 | Volume 10 | Número 1

Instituto Internacional de Cromatografia

Uma publicação do Instituto Internacional de Cromatografia www.iicweb.org

Scientia Chromatographica EDITOR-IN-CHIEF

FERNANDO MAURO LANÇAS Universidade de São Paulo Instituto de Química de São Carlos 13560-970 São Carlos (SP) - Brasil editor@scientiachromatographica.com EDITORES ASSOCIADOS

MARIA EUGÊNIA QUEIROZ

RENATO ZANELLA

preparo de amostras

preparo de amostras

JOSÉ MANUEL F. NOGUEIRA

ISABEL C. S. FONTES JARDIM

preparo de amostras

CORPO EDITORIAL CONSULTIVO

Daniel Armstrong – EUA Dietrich von Bauer – Chile Fábio Augusto – Brasil Fátima Dutra – Brasil Flávio Leite – Brasil Frank Svec – EUA Harold McNair – EUA Humberto Gómez – México Isabel Cristina Sales Fontes Jardim – Brasil Jailson B. de Andrade – Brasil Janusz Pawliszyn – Canadá Kiyoratsu Jinno – Japão Luigi Mondello – Itália Marcos Eberlin – Brasil Marina Tavares – Brasil Milos Novotny – EUA Milton Lee – EUA Norberto Peporine Lopes – Brasil Phillip Marriott – Austrália Pierina Bonato – Brasil Quézia Cass – Brasil Renato Zanella – Brasil

cromatografia líquida

ENDEREÇO DO PERIÓDICO

Scientia Chromatographica

ELENA STASHENKO

espectrometria de massas

FABIO AUGUSTO

cromatografia gasosa

ALEJANDRO CIFUENTES

Técnicas Eletroforéticas

ÁLVARO J. SANTOS NETO

troubleshooting

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Ficha catalográfica elaborada pela Seção de Aquisição e Tratamento da Informação do SBI/IQSC Scientia Chromatographica / Associação Internacional de Cromatografia. - vol.10 n.1 (jan./mar. 2018). São Carlos: Associação Internacional de Cromatografia, 2018.

Trimestral ISSN 1984-4433

CLÁUDIA ZINI

cromatografia gasosa

ELINA B. CARAMÃO

cromatografia gasosa

1. Cromatografia. 2. Lanças, Fernando Mauro, editor chefe.

CDD 543.8

ISSN 1984-4433

Periódico Trimestral do Instituto Internacional de Cromatografia

2014| |Volume Volume106 | Número 1 2018

Uma publicação do Instituto Internacional de Cromatografia www.iicweb.org

Scientia Chromatographica 2018; 10(1):3 Instituto Internacional de Cromatografia ISSN 1984-4433

SUMÁRIO

Editorial.....................................................................................................................................................................................................................5 Os Editores

LC-MS/MS Multiresidue determination of pesticides in sweet peppers by LC-MS/MS using Si-Al(PMTDS) as a sorbent for extraction by MSPD...................................................................................................................................7 Elisa Helena da Costa Morais, Renata Cristiano Nome, Carol Hollingworth Collins, Isabel Cristina Sales Fontes Jardim

SAMPLE PREPARATION Combinación de técnicas de extracción y de análisis cromatográfico para la determinación de metabolitos secundarios en flores tropicales.......................................................................................................21 Lady Johanna Sierra, Jesica Julieth Mejía, Leydé Gualteros, Karol Carrillo, Yuri Córdoba, Jairo René Martínez, Elena E. Stashenko

HPLC UHPLC capilar: aspectos teóricos e práticos.........................................................................................................39 Marcio David Bocelli, João Victor Basolli Borsatto, Álvaro José dos Santos Neto

EVENTS 2018 2018 Events on chromatography and related techniques..............................................................................49 Os Editores

Instituto Internacional de Cromatografia.................................................................................................................................................70 Bookstore..............................................................................................................................................................................................................72 Normas para Publicação.................................................................................................................................................................................73

Scientia Chromatographica 2018; 10(1) 3

Scientia Chromatographica 2018; 10(1):5 Instituto Internacional de Cromatografia ISSN 1984-4433

EDITORIAL

Dez anos na divulgação da Cromatografia Volume 10, Número 1 de 2018

Com o presente número chegamos ao 10o volume do Scientia Chromatographica, continuando a ser o único periódico editado na América Latina o qual é integralmente dedicado à cromatografia, em todas suas formas, e técnicas a ela relacionadas.

Conforme nosso propósito desde o início, neste volume o periódico continua a ser disponibilizado eletronicamente sem custo para os leitores e nem para os autores dos trabalhos, tendo como principal objetivo a divulgação da técnica.

Apesar das dificuldades inerentes à manutenção desta condição, o Scientia continua recebendo muitos comentários favoráveis, sugestões para melhora, e estímulo dos leitores. Isto faz com que as dificuldades possam ser superadas de maneira mais amena para o grupo de Editores e o staff do periódico. Agradecemos as sugestões e estímulos, e continuamos valorizando sua opinião.

Esperamos que este novo volume, repleto de novidades, seja de seu agrado e contribua para com nosso objetivo: a divulgação da cromatografia e técnicas associadas entre nossos leitores.

Os Editores

Scientia Chromatographica 2018; 10(1) 5

Scientia Chromatographica 2018; 10(1):7-20 Instituto Internacional de Cromatografia http://dx.doi.org/10.5935/sc.2018.001 ISSN 1984-4433

LC-MS/MS

Multiresidue determination of pesticides in sweet peppers by LC-MS/MS using Si-Al(PMTDS) as a sorbent for extraction by MSPD Determinação multirresíduo de agrotóxicos em pimentões por LC-MS/MS usando Si-Al(PMTDS) como dispersante para extração por MSPD

Elisa Helena da Costa Morais Renata Cristiano Nome Carol Hollingworth Collins Isabel Cristina Sales Fontes Jardim* Institute of Chemistry, University of Campinas, P.O. Box 6154, 13083-970, Campinas, SP, Brazil *icsfj@iqm.unicamp.br Recebido: 09-01-2018 Aceito: 21-01-2018

Abstract

A fast, effective and environmentally safe method for multiresidue determination of pesticides in samples of sweet green peppers using matrix solid phase dispersion with a new dispersant, poly(methyltetradecylsiloxane) thermally immobilized onto alumina coated silica, Si-Al(PMTDS), with determination by liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry was developed and validated. The performance of the new dispersant was compared with others, such as C18 and SiO2. Acetonitrile and ethyl acetate were evaluated as extraction solvents.

The Si-Al(PMTDS)-based sorbent gave results similar to the commercial sorbents tested in relation to recovery. However, only the lab-made polymeric sorbent assured selectivity of the separation. With Si-Al(PMTDS) extraction, recoveries for almost all analytes were in the range of 70-120% with coefficients of variation less than 20%, acceptable values for the analysis of pesticide residues in complex samples, demonstrating accuracy and precision of results for these analytes. All quantification limits were below the listed maximum residues limits for the analyzed pesticides. The developed method was applied to sweet green pepper samples, in which some authorized pesticides were found, but at concentration levels lower than the maximum residue limits. However, several unauthorized pesticides were also encountered. The preparation of the sorbent Si-Al(PMTDS) is simple, reproducible, and the cost is compatible with commercially available sorbents used in matrix solid phase dispersion.

Keywords: liquid chromatography-tandem mass spectrometry; matrix solid phase dispersion; sweet peppers; pesticides; validation.

Resumo

Um método rápido, eficaz e ambientalmente seguro para determinação multirresíduo de agrotóxicos em amostras de pimentões verdes usando dispersão da matriz em fase sólida com um novo dispersante, poli(metiltetradecilsiloxano), imobilizado termicamente em sílica recoberta com alumina, Si-Al(PMTDS), e determinação por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas sequencial foi desenvolvido e validado. O desempenho do novo dispersante foi comparado com outros como C18 e SiO2. Também foram avaliadas acetonitrila e acetato de etila como solventes de extração. O sorvente à base de Si-Al(PMTDS) forneceu resultados semelhantes aos sorventes comerciais testados em termos de recuperação. No entanto, apenas o sorvente polimérico preparado no laboratório garantiu a seletividade da separação. Usando Si-Al(PMTDS) como dispersante na extração, as recuperações para quase todos os analitos ficaram na faixa de 70-120%, com coeficientes de variação inferiores a 20%, valores recomendáveis para a análise de resíduos de agrotóxicos em amostras complexas, demonstrando exatidão e precisão dos resultados para todos os analitos. Todos os limites de quantificação foram inferiores aos limites máximos de resíduos para os agrotóxicos analisados. O método desenvolvido foi aplicado em análises de pimentões verdes adquiridos no comércio. Alguns agrotóxicos autorizados foram encontrados, mas todos em níveis de concentração inferiores aos limites máximos de resíduos. No entanto, vários agrotóxicos não autorizados também foram encontrados. A preparação do sorvente Si-Al(PMTDS) é simples, reprodutível e o custo é compatível com sorventes comercialmente disponíveis utilizados na dispersão de matriz em fase sólida.

Palavras-chave: cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas sequencial; dispersão da matriz em fase sólida; pimentões; agrotóxicos; validação.

Scientia Chromatographica 2018; 10(1)

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Morais EHC et al.

Use of Si-Al(PMTDS) in the sample preparation for determination of pesticides in sweet peppers

1. Introduction

The application of pesticides for commercial production of fruits and vegetables is widely used for the control of diseases, disorders and weeds in various crops. However, their irregular use has been a concern to both government agencies and consumers, because it may cause food contamination and, consequently, possible adverse human health effects[1,2].

In order to control the inappropriate use of pesticides and the concentration of these residues in foods such as sweet green pepper, Capsicum annuum L.[3], national and international agencies have established the maximum residue limits (MRL) allowed for various pesticides in different cultures[4,5]. The term MRL is understood as the maximum concentration of pesticide residues that may be present in foods consumed by the population without harming human health. In recent years sweet green peppers have shown irregularities due to pesticide residues[6,7]. According to the Program for the Analysis of Pesticide Residues in Foods (PARA), conducted by the Brazilian Health Surveillance Agency (ANVISA) in 2014, 89% of the sweet peppers samples grown in Brazil were deemed inadequate, i.e., contained residues of pesticides not allowed or above the MRL[6].

The Pesticide Residue Monitoring Program 2015, conducted by the U.S. Food and Drug Administration (FDA) and released in 2017[7], revealed that 9.0% of samples obtained from diverse countries contained irregularities.

Due to negligence and the consequent exposure of the public to the pesticides, there is increased demand for food without these pesticides or food containing pesticide residues below the maximum allowed limits.

This has instigated research to monitor and evaluate the risk of consuming contaminated foods[8], such as sweet peppers.

Matrix solid phase dispersion (MSPD), introduced (and patented) by Barker et al. in 1989[9] is an efficient technique for the extraction of analytes from solid and semi-solid matrices, overcoming limitations of other 8

techniques and being used for analysis of pesticides in vegetables since 1996[10].

In the determination of analytes present in complex samples it is necessary to use a suitable dispersant and solvent(s) for elution to minimize the amount of matrix co-extractives that can interfere with the subsequent analysis, particularly the selectivity, as well as damage the equipment used. Simultaneously they must ensure high recovery of the analytes, that is, the type of sorbent (dispersant) and eluting solvent used depends on the polarity of the analytes and of the nature of the matrix. Classic applications of the technique employ reverse phase sorbents such as octadecylsilane, C18, and octylsilane, C8. For more lipophilic matrix analyses, normal phase sorbents such as alumina, florisil and silica are used to analyze more hydrophilic samples. Less polar solvents such as hexane are used to extract nonpolar analytes and more polar solvents such as acetonitrile, ethyl acetate and methanol are used for more polar compounds[11,12].

A number of papers have been published in which the technique of solid phase matrix dispersion is used in sample preparation for the multiresidue analysis of pesticides in vegetables, fruits and other food matrices[13-15], in veterinary residues[16] and for mycotoxins in grains[17,18].

Bogialli and Corcia[19] have reviewed the technique for determination of contaminants such as pesticides, veterinary drugs, naturally occurring contaminants and persistent environmental chemicals in food.

In recent years, several innovations related to the technique have been the synthesis and use of new materials. In this context, there are reports of the use of highly selective sorbents such as molecularly imprinted polymers (MIP)[20,21] and less specific ones such as multi-walled carbon nanotubes (MWCNT)[22,23] for the determination of pesticides in different matrices. In both of these, using molecularly imprinted polymers or multi-walled carbon nanotubes, the results show good selectivity and sensitivity, and no problems are reported in blend preparation[12].

Scientia Chromatographica 2018; 10(1):7-20

Use of Si-Al(PMTDS) in the sample preparation for determination of pesticides in sweet peppers

The liquid chromatography coupled to tandem mass spectroscopy (LC-MS/MS) has shown great progress in terms of technological development and application[24]. It provides increased selectivity and detectability, allowing the determination of low concentrations of pesticide residues belonging to different chemical groups in complex matrices in a single analysis, as well as permitting unequivocal analyte identification. Several recent papers report the use of liquid chromatography-tandem mass spectrometry as a technique for multiresidue determination of pesticides in food[14,22,24,25], such as sweet pepper[26,27].

Based on these considerations, and to the few complete works on multiresidue analysis of pesticides in sweet pepper, a method using LC-MS/MS and, for the first time, MSPD with a dispersant consisting of poly(methyltetradecylsiloxane) thermally immobilized on alumina coated silica, Si-Al(PMTDS), was developed, validated and applied for quantification of multiresidues of pesticides found in samples of sweet green peppers from the region of Campinas/SP/Brazil.

2. Experimental 2.1. Materials

Analytical standards for the pesticides clomazone (98.1% w/w), difenoconazole (97.0% w/w), ethion (97.8% w/w), methamidophos (98.5% w/w), methomyl (99.9% w/w), pyraclostrobin (99.9% w/w), pyriproxyfen (99.1% w/w), thiabendazole (99.8% w/w), thiacloprid (99.9% w/w), thiamethoxam (99.7% w/w), acephate (97.2% w/w), azoxystrobin (99.9% w/w), carbofuran (99% w/w), fenarimol (99.8% w/w), iprodione (99.3% w/w), metconazole (99.5% w/w) and tebuconazole (99.8% w/w) were from Fluka; carbendazim (99.1 % w/w) and methiocarb (98.5% w/w) were from Dr. Ehrenstorfer GmbH, carbaryl (99.5% w/w) was from Chem Service, and imidacloprid (99.9% w/w) was from Riedel-de Häen. The pesticides were selected from those authorized by ANVISA, for application to sweet green pepper crops, as well as from those present, although

Morais EHC et al.

not authorized, that have been reported in the PARA assessment[6,28]. Table 1 shows important information about the selected analytes and the conditions for their fragmentation and analysis.

Standard stock solutions of each pesticide in concentrations of 1000 mg L-1 were prepared by solubilizing each analytical standard in methanol.

The other solutions were prepared by diluting the stock solutions with the same solvent. All were stored in a refrigerator at a temperature of approximately 4 °C. Polyethylene membranes (0.45 µm, Millipore), a glass vacuum filtration system, vacuum pump (N° WP6111560, Millipore), water (Milli-Q, Millipore), formic acid (P.A., Synth) and methanol (chromatographic grade, J. T. Baker) were used to prepare the mobile phases, the last was also used in the preparation of standard solutions. Silica gel, SiO2, with mean particle sizes of 35-70 μm and mean-pore diameter of 6 nm (Acros Organics), aluminum isopropoxide (98.0% w/w) (Aldrich), poly(methyltetradecylsiloxane) polymer, (PMTDS, United Chemical Technologies), anhydrous toluene (99.9%, J. T. Baker), nitric acid (P.A., Synth) and hexane (95.0%) (chromatographic grade, Tedia) were used in the preparation of the sorbent. Polypropylene cartridges (6 mL capacity) having octadecylsilane, C18, on silica, with a mean particle size of 50 μm and mean pore diameter of 6 nm (Agilent Technologies); silica gel, acetonitrile and methanol (chromatographic grade, J. T. Baker), ethyl acetate (Mallinckrodt Chemicals) and Millex filters of 0.22 µm porosity (Millipore) were also used in sample preparation.

2.2. Synthesis and characterization of the support Si-Al and of the sorbent Si-Al(PMTDS) 2.2.1. Preparation of support

The preparation of the alumina-coated silica, Si-Al, was adapted from the procedure described by Faria et al.[30], for the synthesis of a zirconia-coated silica support. Briefly, for each synthesis 1.00000 g of chromatographic silica, measured on an analytical balance precise to 5 decimal places (CP225D, Sartorius),

Scientia Chromatographica 2018; 10(1):7-20 9

Morais EHC et al.

Use of Si-Al(PMTDS) in the sample preparation for determination of pesticides in sweet peppers

Table 1. Information and conditions of fragmentation for analysis of the studied pesticides.

Pesticide

log K

pK

Md (g mol-1)

methamidophosa

-0.79

−

141.1

acephate

-0.85

8.35

183.2

thiamethoxam

-0.13

−

291.7

methomyla

0.09

−

162.2

imidacloprid

0.57

−

255.7

thiacloprid

1.26

−

252.7

carbendazima

1.48

4.20

191.2

thiabendazole

2.39

4.73 12.00

201.3

carbofurana

1.80

−

221.3

carbaryla

2.36

10.40

201.2

clomazone

2.54

−

239.7

azoxystrobin

2.50

−

403.4

methiocarb

3.18

−

225.3

fenarimola

3.69

–

331.2

iprodione

3.10

–

330.2

tebuconazole

3.70

–

307.8

pyraclostrobin

3.99

–

387.8

metconazole

3.85

11.38 1.08

319.8

difenoconazole

4.36

1.07

406.3

ethion

5.07

–

384.5

pyriproxyfen

5.37

6.87

321.4

b ow

c a

MRMe transition (m/z)

141.9 > 93.1 141.9 > 124.5 184.0 > 142.5 184.0 > 124.5 292.1 > 210.9 292.1 > 180.7 163.0 > 87.3 163.0 > 105.5 256.2 > 174.8 256.2 > 209.0 253.1 > 125.4 253.1 > 89.4 192.1 > 159.8 192.1 > 131.8 202.1 > 174.8 202.1 > 130.6 222.2 > 164.9 222.2 > 122.6 202.2 > 144.7 202.2> 126.7 240.2 > 124.5 240.2 > 88.5 404.2 > 372.0 404.2 > 328.9 226.2 > 168.8 226.2 > 120.6 331.2 > 80.2 331.2 > 268.0 330.1 > 244.9 330.1 > 287.8 308.2 > 69.0 308.2 > 124.5 388.2 > 193.9 388.2 > 162.9 320.3 > 69.0 320.3 > 124.5 406.2 > 250.9 406.2 > 336.9 385.2 > 198.9 385.2 > 170.8 322.2 > 95.3 322.2 > 76.6

Cone voltage (V) 20.0 10.0 15.0 10.0 20.0 30.0 25.0 40.0 15.0 10.0 25.0 20.0 15.0 35.0 20.0 30.0 20.0 30.0 35.0 15.0 20.0

Collision energy (eV) 12.0 12.0 10.0 18.0 14.0 24.0 12.0 12.0 18.0 12.0 24.0 40.0 16.0 30.0 24.0 36.0 12.0 22.0 10.0 24.0 20.0 48.0 14.0 32.0 10.0 18.0 34.0 22.0 14.0 14.0 22.0 38.0 12.0 24.0 22.0 38.0 24.0 16.0 10.0 18.0 14.0 48.0

tRf (min)

Window (min)

Dwell time (sec)g

0-7

0.5

6-16

0.5

10-20

0.9

20-24

0.5

22-31

0,3

29-43

0.9

4.6 4.6 5.2 5.2 5.9 7.4 7.6 8.5 12.7 16.0 21.3 21.5 22.3 24.0 24.8 25.9 26.7 27.0 28.4 31.6 32.4

Pesticides found in samples analyzed by PARA but not allowed for peppers, according to the ANVISA. blog Kow: logarithm of the octanol-water partition coefficient (pH = 7, temperature = 20 °C). cpKa: co-logarithm of the acidity constant (temperature = 25 ºC). dM: molar mass. eMRM: multiple reaction monitoring. The first transition was used for quantification and the second for confirmation. ftR: retention time. gDwell time: 15 points per peak. Source[6,28,29]. a

10

Scientia Chromatographica 2018; 10(1):7-20

Use of Si-Al(PMTDS) in the sample preparation for determination of pesticides in sweet peppers

was added to a solution containing 3.70000 g of aluminum isopropoxide dissolved in 15 mL of anhydrous toluene.

This mixture was placed in a thermostated bath (MA120, Marconi) at 40 °C for 3 h. Afterwards, the solution was centrifuged (Rotofix 32 A, Analítica) for 15 min at 6000 revolutions per minute (rpm) at room temperature, the supernatant was discarded and the solid was washed with anhydrous toluene (repeated five times). The material was hydrolyzed with 15 mL of 10-3 mol/L aqueous nitric acid solution and centrifuged for 15 min at 6000 rpm, in room temperature, and then dried in a vacuum oven (ADP21, Yamato) at 100 °C for 12 h. The quantification of aluminum on the final material was determined by X-ray fluorescence (XRF) on a benchtop energy dispersive X-ray fluorescence spectrometer (EDX 700 Shimadzu) with rhodium X-ray source and Si(Li) detector, using micro sample holders[31].

2.2.2. Sorption and thermal immobilization of PMTDS on the support

The sorbent poly(methyltetradecylsiloxane) thermally immobilized on alumina-coated silica was prepared with a 50% excess loading of PMTDS (1.00000 g PMTDS/g Si). To load the PMTDS into the Si-Al pore system, a 10% w/v solution of PMTDS in hexane was added to the appropriate quantity of Si-Al, previously dried at 140 oC for 12 h. The mixture was sonicated using an ultrasonic bath (T14, Thornton) for 10 min. Afterwards the mixture was slowly stirred for 3 h at room temperature and then placed in a fume hood for evaporation of the hexane at room temperature (6 days).

Portions (2.00000 g) of the Si-Al(PMTDS) obtained after the evaporation of solvent were placed in stainless steel tubes (150 mm × 10 mm of internal diameter) fitted with frits and connectors and subjected to thermal treatment in a tubular oven (10P-S, EDG) under a nitrogen atmosphere. The optimal temperature and time for immobilization of PMTDS onto the Si-Al were 100 °C for 12 h.

After immobilization, the stainless steel tube containing the immobilized PMTDS phase was

Morais EHC et al.

connected to a pump (510, Waters) and placed in an oven with temperature control (CH-150, Eldex Laboratories) for extraction of non-immobilized polymer by passing hexane at 0.5 mL/min at 50 °C for 4 h. After extraction, the sorbent contained in the tube was removed and dried with nitrogen.

2.2.3. Physicochemical characterizations of the support and of the sorbent

Physicochemical characterizations by spectroscopic methods of SiO2, Si-Al and Si-Al(PMTDS) were performed with an infrared absorption spectrometer (IR) (FTIR 1600, Perkin-Elmer) and a nuclear magnetic resonance spectrometer (NMR) (INOVA 500, Varian).

2.3. LC-MS/MS

For the chromatographic analysis a system composed of a liquid chromatograph (Alliance 2695, Waters), a Nova-Pak C18 chromatographic column (150 x 3.9 mm, 4 µm) and a Nova-Pak C18 guard column (20 x 3.9 mm, 4 µm), all from Waters, were used with a flow rate of 0.3 mL min-1. The column was maintained at (25 ± 2) °C and 17 µL of sample were injected automatically. The mobile phase was a 0.1% aqueous solution of formic acid (A) and methanol (B).

Gradient elution was used and the amount of methanol was changed as follows: 0 min – 50%; 12 min – 50%; 13 min – 75%; 30 min – 90%; 33 min – 90%; 35 min – 50%; 43 min – 50%.

A tandem mass spectrometer (MS/MS) (Micromass Quattro MicroTM API, Waters) with a triple quadrupole and Z-spray interface using electrospray (ESI) (ESCiTM multi-mode ionization), operating in the positive mode with multiple reaction monitoring (MRM) data acquisition was coupled to the chromatographic system. Nitrogen was used as the cone and desolvation gas and argon as the collision gas at a constant pressure of 2.45 x 10-3 mbar). The parameters of the mass spectrometer for analysis were: capillary voltage: 2 kV, cone extractor voltage: 3 V, RF lens voltage: 0.2 V, source temperature: 120 °C, desolvation gas temperature:

Scientia Chromatographica 2018; 10(1):7-20 11

Morais EHC et al.

Use of Si-Al(PMTDS) in the sample preparation for determination of pesticides in sweet peppers

400 °C, desolvation gas flow rate: 500 L h-1and cone gas flow rate: 50 L h-1. The data acquisition and processing were performed using MassLynx software, V. 4.1.

2.4. Sample preparation by MSPD 2.4.1. Fortification and extraction of pesticides from samples of sweet green pepper

Sample preparation using MSPD was carried out as proposed by Rodrigues et al.[25] for onion samples.

The sweet green pepper, without washing, was cut into pieces and minced in a domestic multiprocessor (Faciclic, Arno) until complete homogenization. Then, when desired, 0.50000 g of sweet pepper were placed in a container and fortified with 100 µL of a standard solution containing the pesticides under study, so that the final concentration of each analyte in the sample was equal to the method quantification limit (MQL). Shortly thereafter, the shredded sweet pepper sample was added to 1.00000 g of sorbent. The mixture was macerated to obtain complete dispersion of the sample (approximately five minutes) and then transferred to a 6 mL polyethylene cartridge. 10 mL of the extraction solvent or mixture (acetonitrile, ethyl acetate or acetonitrile/ethyl acetate 50:50 v/v) in portions of 5 mL, were added sequentially, and elution with the aid of a vacuum system (Supelco, manifold) occurred at a rate of approximately 1 mL min1 . 50 µL of formic acid in 5% v/v acetonitrile was added to the extract and the solvent was evaporated under a stream of nitrogen gas. The solid was resuspended in 0.5 mL of methanol, filtered and stored in the freezer in a vial until analysis by LC-MS/MS.

2.4.2. Optimization of the MSPD sample preparation technique

Because sweet peppers have constituents that could interfere with the determination of the analytes, the standard solutions were prepared in a matrix extract free of the studied compounds (overlap matrix). Several factors which influence the recovery of analytes were evaluated: dispersant [C18, SiO2 and Si-Al(PMTDS)] and solvent (acetonitrile and ethyl acetate), to establish optimal analysis conditions.

12

2.5. Evaluation of the matrix effect

The influence of the constituents of sweet green pepper on the determination of analytes by LC-MS/ MS was evaluated by comparing analytical curves constructed by analysis of standard solutions containing pesticides at seven levels of concentration prepared in solvent to those prepared in extracts free from sample analytes.

2.6. Validation of the analytical method

The method was validated according to the international guideline SANTE/11945/2015[32].

The selectivity was evaluated by comparing the chromatograms obtained after injection of extracts free of pesticides with those from fortified extracts. The analytical curves constructed from the adjusting the responses (peak areas corresponding to the pesticides) resulting from the analysis of extracts from spiked samples at seven concentration levels of the analytes (1; 1,2; 2,4; 4; 6; 10 and 12 x MQL) to a linear model were used to assess the linearity through the correlation coefficients (r) of the model and residue analysis. The method quantification limit, MQL, based on the visual method, was considered as the lowest concentration of the analyte in the matrix that could be determined with accuracy and precision, given the linear working range.

For the evaluation of accuracy, recovery assays were performed in which sweet pepper samples were fortified at two concentration levels (MQL and 10 x MQL) in five replicates each, and the extracts analyzed. The accuracy was estimated in terms of recovery of the analytes obtained using the analytical curves and Equation 1.  concentration of theanalytefound in theextract  Recovery(%) =  × 100  concentration of theanalyteadded to theextract   

Precision, in terms of repeatability and intermediate precision, was evaluated by preparation, injection and analysis of five samples of sweet pepper extracts fortified with pesticides at concentrations equal to MQL and 10 x MQL on the same day and on different days (first and 14th day), respectively. For this evaluation Scientia Chromatographica 2018; 10(1):7-20

Use of Si-Al(PMTDS) in the sample preparation for determination of pesticides in sweet peppers

Morais EHC et al.

Figure 1. Infrared spectrum of (a) bare silica (SiO2), (b) alumina coated silica (Si-Al) and (c) poly(methyltetradecylsiloxane) polymer phase thermally immobilized on alumina coated silica (Si-Al(PMTDS)).

Scientia Chromatographica 2018; 10(1):7-20 13

Morais EHC et al.

Use of Si-Al(PMTDS) in the sample preparation for determination of pesticides in sweet peppers

the coefficients of variation (CV) for the recoveries of the analytes were determined.

the framework detected by the shift in the asymmetric and symmetric frequencies to lower wave numbers.

2.7. Analysis of sweet green pepper

Evidence of thermal immobilization of PMTDS onto Si-Al is shown in Figure 1c by the appearance of C-H signals at 2856 cm-1 and 2925 cm-1, corresponding to CH3 and CH2 groups of the polymer[33], as well as a decrease (when compared to the spectrum of the support) in the peak at 3500 cm-1 attributed to silica hydroxyl groups and adsorbed surface water suggesting that most silanol groups are coated.

Samples of sweet green peppers were acquired from five different supermarkets in Campinas (SP, Brazil), three of these being described as selling organic produce. They were analyzed by the proposed MSPDLC-MS/MS method. Three sweet peppers from each establishment were used to obtain the mixture for extraction, which was then analyzed.

3. Results and Discussion 3.1. Physicochemical characterizations of the support and of the sorbent Initially, 7.5% (m/m) of aluminum was incorporated onto the silica, as determined by X-ray fluorescence. Physicochemical characterizations of SiO2, Si-Al, and Si-Al(PMTDS) were carried out by several spectroscopic methods. Several different batches of the Si-Al support and of the Si-Al(PMTDS) sorbent were prepared and their physicochemical characterizations showed significant similarities. Infrared spectroscopy (FTIR) was used to (FTIR) compare bare silica, the modified support and the presence of PMTDS immobilized onto the Si-Al particles as well as the presence of residual silanol groups. These spectra are shown in Figure 1. Figure 1a presents a number of bands in the “skeletal region” (below 2500 cm-1): the very weak and broad band at a 1635 cm-1 (bending mode of H2O), the broad band at 1056 cm-1 with a shoulder at 1220 cm1 , and the bands at 800 and 470 cm-1 characteristic of SiO2, corresponding to asymmetric and symmetric Si-O stretching, and Si-O-Si bending, respectively. The peak at 975 cm-1 is characteristic of Si-OH vibrations. The only significant difference in Figure 1b is the disappearance of the small and weak signal at 975 cm-1 that corresponds to free silanols of silica. The absence of this band in Si-Al indicates the successful insertion of the aluminum cation into the silica framework, resulting in the weakening of 14

The support and sorbents were also analyzed by Si NMR and alumina by 27Al NMR employing magic angle rotation with crossed polarization (CP/MAS).

Figure 2a and Figure 2b, respectively, show the 29Si CP/MAS NMR spectra of bare silica, and the 27Al CP/ MAS NMR of bare alumina. The Qn species, which is related to the number of Si–O–Si bonds, are identified as Q4 (siloxanes), Q3 (free and vicinal silanols) and Q2 (geminal silanols) at -110, -101 and -91 ppm, respectively (Figure 2a). On the other hand, the two peaks at 60 ppm and 9 ppm shown in Fig. 2b are attributed to the two aluminum species present in alumina: Oh (octahedral aluminum) and Td (tetrahedral aluminum), related to the geometry of the coordination compounds formed between aluminum and oxygen.

29

Figure 2c shows that the Q2 band has diminished after the reaction of silica with aluminum isopropoxide while Figure 2d shows the absence of the Q2 band and a further decrease in the Q3/Q4 ratio for Si-Al(PMTDS), indicating that total quantity of free silanol groups was significantly reduced after immobilization. Figure 2d also shows peaks in the region of -6 to -18 ppm (D2, D2´ and D1H groups) due to the formation of new silicon species. These can be attributed to PMTDS adsorbed and chemically bonded onto the support particles.

There were no changes in the 27Al NMR after reaction with silica or after the deposition and immobilizion the PMTDS. Scientia Chromatographica 2018; 10(1):7-20

Use of Si-Al(PMTDS) in the sample preparation for determination of pesticides in sweet peppers

Morais EHC et al.

Figure 2. Nuclear magnetic resonance spectra of (a) 29Si of bare silica (SiO2), (b) 27Al of bare alumina (Al2O3), (c) 29Si of alumina coated silica (Si-Al) and (d) 29Si of poly(methyltetradecylsiloxane) polymer phase thermally immobilized on alumina coated silica (Si-Al(PMTDS)).

3.2. Sample preparation by MSPD 3.2.1. Evaluation of clean up sorbents To minimize the amount of matrix co-extractives that can interfere with the analyses in complex samples, it is necessary to use suitable clean up sorbents in a sample clean up step.

For this 1.00000 g of Si-Al(PMTDS) was used for each procedure, as this mass provided higher recoveries for most pesticides studied, as compared to use of a larger amount of sorbent, possibly due to less efficient elutions of some of the analyte molecules when a larger mass was used. This mass also minimized the quantity

of co-extractives in the extracts, minimizing the matrix effect, according Equation 2[34], when compared to the use of 0.75000 of sorbent.  peak area of analyte in the matrix extract  Matrix effect (%) =  –1  × 100  peak area of analyte in thesolvent   

Figure 3 shows the recoveries of the pesticides studied using the MSPD technique with different sorbents, using acetonitrile as extraction solvent. The use of either C18 or SiO2 gave recoveries between 70 and 120% and coefficients of variation less than 20%, recommended values for multi-residue analyses of pesticides in foods[32], but did not assure selectivity.

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Morais EHC et al.

Use of Si-Al(PMTDS) in the sample preparation for determination of pesticides in sweet peppers

Figure 3. Influence of sorbents in recoveries of pesticides employed in the method using the MSPD.

Under these conditions the use of Si-Al (PMTDS) showed recoveries below 70% for four analytes. Thus it was decided, to vary some parameters to obtain more adequate recoveries with the new sorbent.

3.2.2. Evaluation of the extraction solvents

In order to improve the recoveries of pesticides from samples of sweet green peppers using the new sorbent, particularly carbendazim and thiabendazole, the influence of the extraction solvent was evaluated.

Ethyl acetate caused a significant increase in recoveries of the pesticides carbendazim, thiabendazole, tebuconazole, metconazole and difenoconazole.

However, it led to a significant decrease in recoveries of the polar pesticides methamidophos and acephate.

Considering these results, a mixture of intermediate polarity, consisting of equal volumes of acetonitrile and ethyl acetate was used. Recoveries between 70 and 120% and coefficients of variation less than 20% were obtained for most target compounds, with the exceptions of carbendazim and thiabendazole, which presented recoveries in the range of 50%, but with coefficients 16

of variation less than 15%, thus not compromising their quantification. The use of the different solvents in the extraction method resulted in MSPD extracts with similar amounts of the matrix constituents that influence the ionization of the compounds tested, as evidenced by the proximity effect of the matrix values related to the analyte.

Thus, the mixture of acetonitrile and ethyl acetate was used for extraction of the analytes.

3.3. Evaluation of the matrix effect Analyzing the analytical curves, matrix effects were observed for all studied pesticides except for methomyl, since there are inclination differences between the curves fortified in the solvent and in the matrix extract. The chromatographic responses related to pesticides, from the injection of standard solutions prepared in pesticide-free matrix extract were smaller than those from the injection of standard solutions prepared in solvent. This demonstrates the influence of the co-extractives on the analyte signal.

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Use of Si-Al(PMTDS) in the sample preparation for determination of pesticides in sweet peppers

Therefore, analytical curves using external standardization with superposition of matrix were used for quantification of the pesticides in real samples.

3.4. Validation of the analytical method By comparing the chromatograms of the extracts free of the pesticides under study with the chromatograms of extracts fortified with these pesticides, there are no chromatographic peaks of coeluting compounds with the same retention times as those of the analytes, showing that the method is selective.

Table 2 presents the validation data of the analytical method developed.

Morais EHC et al.

Pesticides permitted for use in different cultures have established maximum residue limits, MRL. When applying these pesticides to these cultures the concentrations found in foods should be below the MRL. Therefore, we chose to evaluate a concentration range close to the maximum residue limit for pesticides that are allowed for sweet green peppers. For banned pesticides the linear concentration range included the method quantification limit, MQL. The analytical curves constructed using injection of extracts obtained from spiked samples in seven concentration levels of the analytes between 5 and 24000 µg kg-1 were used to evaluate linearity. Correlation coefficients greater than 0.99 indicate a good fit of

Table 2. Performance and validation data of the analytical methods developed.

Pesticide

methamidophos acephate thiamethoxam methomyl imidacloprid thiacloprid carbendazim thiabendazole carbofuran carbaryl clomazone azoxystrobin methiocarb fenarimol iprodione tebuconazole pyraclostrobin metconazole difenoconazole ethion pyriproxyfen

MRLa (µg kg-1) ANVISA − 1000 200 −b 500 200 −b 2000 −b −b 50 500 50 −b 4000 100 1000 100 500 1000 500 b

Accuracy MRLa MQLb Concentration Linearity -1 (µg kg ) (µg kg-1) range (r)d Recovery (%)e CODEX (µg kg-1) ALIMENTARIUS MQL 10xMQL b − 500 500-6000 0.9976 70 120 b − 500 500-6000 0.9925 75 119 −b 100 100-1200 0.9927 84 120 b − 50 50-600 0.9932 86 88 −b 250 250-3000 0.9959 110 120 1000 100 100-1200 0.9961 72 116 b − 10 10-120 0.9991 50 69 −b 200 200-2400 0.9975 50 68 b − 5 5-60 0.9949 85 114 5000 50 50-600 0.9914 86 106 −b 5 5-60 0.9983 81 92 b − 50 50-600 0.9956 80 98 2000 5 5-60 0.9986 70 87 500 10 10-120 0.9974 70 92 b − 2000 2000-24000 0.9980 83 114 1000 10 10-120 0.9943 78 96 b − 100 100-1200 0.9939 74 90 b − 10 10-120 0.9968 78 94 −b 50 50-600 0.9949 78 90 b − 100 100-1200 0.9993 71 87 b − 50 50-600 0.9958 90 98

Repeatability Intermediate precision Coefficient of variation (%)f MQL 10xMQL MQL 10xMQL 5 1 4 1 6 1 7 1 5 8 5 8 4 8 4 6 4 1 5 1 5 1 15 1 1 4 6 6 4 8 3 6 12 14 14 12 8 11 13 10 9 7 10 6 8 8 9 8 6 4 5 4 8 6 7 6 10 8 8 9 9 8 11 8 6 5 6 7 6 8 6 7 6 6 7 8 0 5 5 5 6 7 12 8

MRL: maximum residue limit. bUnauthorized pesticides (ANVISA and/or CODEX ALIMENTARIUS). cMQL: method quantification limit. dr: correlation coefficient. eRecovery = 100 x (concentration of analyte found in the extract/concentration of the analyte add to the extract). fCoefficient of variation = 100 x (standard deviation/mean of recovery). Source[28,35]. a

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Morais EHC et al.

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the model to the observed responses and the random distribution of residues left by adjusting the linear model, with deviation in the range of Âą 20%, indicating the linearity of the method for the pesticides studied in concentration ranges considered.

The method developed can be applied to samples of sweet green peppers for the quantification of pesticides studied at concentrations at or lower than the maximum residue limit established by ANVISA[28] and the CODEX ALIMENTARIUS[35], since the limits of quantification considered were equal to or lower than the MRL of each compound.

Satisfactory recoveries between 50 and 120% and coefficients of variation less than 15% for all analytes indicate the accuracy and precision of the method.

3.5. Comparison of methods The method using MSPD with the new sorbent Si-Al(PMTDS) and the dry ice-partitioning QuEChERS method, developed by Lee et al.[26], were compared for the extraction of pesticide residues from sweet pepper followed by determination by liquid chromatography with electrospray ionization tandem mass spectrometry.

The results show that both methods are efficient, precise and accurate for the determination of pesticide residues from sweet pepper. The matrix components using both methods affected the ionization of some analytes

by LC-ESI-MS/MS, highlighting the importance of studying the matrix effect for different extraction procedures for pesticide determination in food. In these studies, external standardization with superposition of the matrix was used to compensate for the influence of matrix effects in the quantification of analytes. In general, the MSPD method is faster, requires less mass of sample, quantity of materials and was shown to be more environmentally friendly, due to the generation of smaller quantities of waste.

18

3.6. Application of the method

The method was applied to samples of sweet green peppers, acquired from supermarkets in Campinas.

Three of these samples were classified as having organic cultivation. Each compound was identified using the two most prominent MS/MS transitions while quantification was made using the most intensive transition peak, as indicated in Table 1. The ratio of peak areas related to quantitation and confirmation were used for affirmation of the presence of the pesticides.

One of the organic samples simultaneously showed the authorized pesticides imidacloprid, azoxystrobin, tebuconazole, pyraclostrobin and difenoconazole, all below the maximum residue limit, defined by ANVISA[6], and the unauthorized pesticide carbendazim at a concentration of 23.2 Îźg kg-1 (CV = 7.4%). Another sample had the pesticide azoxystrobin at a concentration lower the MRL. A third sample contained the pesticides tebuconazole, at a concentrations below the MRL, and carbendazim, an unauthorized pesticide, at 80.7 Îźg kg-1 (CV = 3.2%).

4. Conclusions

A method was developed and validated for multiresidue determination of pesticides in sweet green peppers using liquid chromatography-tandem mass spectrometry after clean-up and concentration using a poly(methyltetradecylsiloxane) polymer phase thermally immobilized onto alumina-coated silica, Si-Al (PMTDS), as new dispersant for matrix solid phase dispersion. The preparation of the sorbent SiAl(PMTDS) proved to be easy and reproducible, with a cost compatible with commercially available sorbents used in MSPD. However, the commercial sorbents did not assure selectivity in the analysis of some pesticide residues in sweet green pepper samples.

The new technique proved to be fast, effective and environmentally safe due to the generation of small quantities of waste.

Moreover, the method showed selectivity, linear response, quantification limits lower than the limits Scientia Chromatographica 2018; 10(1):7-20

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Morais EHC et al.

of maximum residue quantification, accuracy and precision, with recoveries in the range of 50 to 120%, and coefficients of variation less than 15% (acceptable values for complex samples). The method was applied to samples of sweet green peppers obtained locally for determination of the pesticides studied, and in two of the five samples analyzed, the pesticide carbendazim, unauthorized for this culture in Brazil, and banned in the United States and European countries, was detected.

for MSPD as the sample preparation technique for

These results prove the potentiality of using SiAl(PMTDS) synthesized in the laboratory as a sorbent

(CNPq) and the Coordenação de Aperfeiçoamento de

determination of pesticides in sweet green peppers.

Acknowledgments The authors acknowledge financial support from the Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), and fellowships from the Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico Pessoal de Nível Superior (CAPES).

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SAMPLE PREPARATION

Combinación de técnicas de extracción y de análisis cromatográfico para la determinación de metabolitos secundarios en flores tropicales Extraction and chromatographic technique combination for the determination of secondary metabolites in tropical flowers

Lady Johanna Sierra Jesica Julieth Mejía Leydé Gualteros Karol Carrillo Yuri Córdoba Jairo René Martínez Elena E. Stashenko* Centro de Investigación de Excelencia CENIVAM, Centro de Cromatografía y Espectrometría de Masas, CROM-MASS, Universidad Industrial de Santander, Bucaramanga, Colombia *elena@tucan.uis.edu.co Recebido: 08-02-2018 Aceito: 19-02-2018

Resumen

Se ha usado la combinación de técnicas de aislamiento y de análisis cromatográfico de metabolitos secundarios con diferentes volatilidades y polaridades, de flores de bignonia azul (Thunbergia grandiflora Roxb., Acantáceae), rosa de monte (Brownea macrophyla, Fabáceae), y corona de reina (Petrea volubilis, Verbenácea). Micro-extracción en fase sólida (HS-SPME, por sus siglas en inglés), extracción con CO2 supercrítico (SFE, por sus siglas en inglés), extracción con solvente (SE, por sus siglas en inglés), y dispersión de la matriz en fase sólida (MSPD, por sus siglas en inglés) condujeron a extractos que se analizaron por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas, y cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas de alta resolución. Las composiciones de los extractos mostraron que las técnicas de extracción son complementarias. El uso de técnicas que difieren en los principios fisicoquímicos bajo los cuales sucede la extracción es una necesidad que imponen la variedad de volatilidades, masas moleculares y grupos funcionales encontrados en los metabolitos secundarios de flores. Los extractos de las flores de bignonia azul, rosa de monte y corona de reina, mostraron una capacidad antioxidante superior a la del butil hidroxitolueno y el α-tocoferol, sustancias de referencia.

Palabras clave: Flores, metabolitos secundarios, flavonoides, extracción con CO2 supercrítico, micro-extracción en fase sólida, dispersion de la matriz en fase sólida, Thunbergia grandiflora Roxb., Brownea macrophyla, Petrea volubilis.

Abstract

Isolation and chromatographic techniques have been combined to analyze secondary metabolites with different volatilities and polarities, from blue bignonia (Thunbergia grandiflora Roxb., Acantaceae), rose bush (Brownea macrophyla, Fabaceae), and queen wreath (Petrea volubilis, Verbenaceae) flowers. Solid phase micro-extraction (HS-SPME), supercritical CO2 extraction (SFE), solvent extraction (SE), and matrix solid phase dispersion (MSPD) led to extracts that were analyzed by gas chromatography coupled to mass spectrometry, and liquid chromatography coupled to high resolution mass spectrometry.

The compositions of the extracts showed that the extraction techniques are complementary.

The use of techniques that differ in the physicochemical principles under which extraction occurs is a necessity imposed by the variety of volatilities, molecular masses and functional groups found in the secondary metabolites of flowers. The extracts of blue bignonia, rose bush and queen wreath flowers showed an antioxidant capacity superior to that of butyl hydroxytoluene and α-tocopherol, reference substances.

Keywords: Flowers, secondary metabolites, flavonoids, supercritical fluid extraction, solidphase microextraction, matrix solid-phase dispersion, Thunbergia grandiflora Roxb., Brownea macrophyla, Petrea volubilis.

Scientia Chromatographica 2018; 10(1)

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Sierra LJ et al.

1. Introducción

Las flores desempeñan funciones importantes en la naturaleza. La reproducción es su propósito principal, pero además proveen alimento para insectos, pájaros, animales y humanos. Agregan color y fragancia a las plantas y participan en la interacción de la planta con otras especies. Estas funciones están mediadas por moléculas de estructura química diversa que en conjunto se denominan metabolitos secundarios. Las aplicaciones múltiples que han encontrado las flores y sus extractos son una motivación fuerte para determinar la naturaleza química de sus metabolitos y entender mejor los mecanismos de adaptación evolutiva de las plantas a su hábitat[1-3]. Sin embargo, su estudio es un reto analítico formidable debido al gran número de metabolitos secundarios, el amplio rango de concentraciones en que se encuentran, y la heterogeneidad de sus propiedades fisicoquímicas.

Las fragancias florales son mezclas complejas de sustancias de alta volatilidad, con masa molecular menor de 300 g/mol, y grupos funcionales diversos que les confieren propiedades fisicoquímicas distintas. El número de sustancias volátiles diferentes identificadas en fragancias florales supera las 1700[4,5]. Los pigmentos florales están constituidos generalmente por polifenoles (flavonoides, antocianinas). Algunos metabolitos secundarios florales se encuentran en concentraciones pequeñas, del orden de partes por billón, mientras que otros tienen abundancias mayores por varios órdenes de magnitud.

Bignonia Azul (Thunbergia grandiflora Roxb., familia Acanthaceae) es una planta leñosa distribuida principalmente en las islas de Hawai, Tahití, Fiji y Seychelles. Se cultiva con propósitos ornamentales, aunque, se considera una maleza en Queensland, Australia, debido a su propagación rápida, ca. 0.6 ha anuales[6]. T. grandiflora crece hasta una altura de 7 m, tiene hojas simples, opuestas, ásperas, acorazonadas de color verde intenso. Las inflorescencias son colgantes, sin ramificaciones y crecen hasta 1 m. La flor tiene corola gamopétala, es grande, vistosa, de color lavanda, y forma grupos colgantes[7].

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Determinación de metabolitos secundarios en flores tropicales

El árbol palo de cruz o rosa de monte (Brownea macrophyla) posee flores grandes de forma radial, que brotan directamente del tronco, de color brillante, entre el rojo y el naranja[8]. Aunque este género no ha sido muy estudiado, la mayoría de los reportes científicos[9,10] muestran la capacidad de los extractos acuosos e hidro-etanólicos de diferentes partes del árbol de B. macrophyla, para neutralizar el veneno de diferentes especies de serpientes.

Corona de reina (Petrea volubilis L.) es una especie ornamental de flores color lila-azul, de amplia distribución en Colombia[11]. Se adapta a diversos tipos de clima, especialmente, cálidos y tropicales, que favorecen su crecimiento. A pesar de que es fácil encontrarla, hay pocos trabajos sobre la composición química de sus metabolitos secundarios[12,13].

En este trabajo se presenta el estudio de las fracciones volátil y condensada de los metabolitos secundarios de las flores de tres especies diferentes, bignonia azul (Thunbergia grandiflora Roxb., familia Acanthaceae), rosa de monte (Brownea macrophyla, Fabácea) y corona de reina (Petrea volubilis, Verbenácea).

Dado que no existe una técnica de extracción universal, la diversidad de polaridades, abundancias relativas y masas moleculares requirió el concurso de cinco técnicas de extracción (HS-SPME, MSPD, SDE, SFE, SE). Las fracciones resultantes se analizaron por GC-MS y LC-MS.

2. Materiales y métodos 2.1. Reactivos

Clorhidrato de 2,2’-azo-bis-(2-amidino-propano) (AAPH), sal de diamonio del ácido 2,2’-azino-bis-3etilbenzotiazolin-6-sulfónico (ABTS), ácido gálico, ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromán-2-carboxílico (Trolox®), benzoato disódico de 2-(3-oxo-6-óxido3H-xanten-9-il (fluoresceína), butilhidroxitolueno (BHT), galato de epigalocatequina, quercetina-3ramnosa, quercetina-3-rutinósido, n-hexadecano, n-tetradecano, mezcla de n-parafinas C10-C25, α-tocoferol, fibras SPME recubiertas con CarboxenTM/ Scientia Chromatographica 2018; 10(1):21-38

Determinación de metabolitos secundarios en flores tropicales

Poli(dimetilsiloxano) (CAR/PDMS; 75 µm), o PDMS (100 µm), o PDMS/DVB (85 µm), se compraron a Sigma-Aldrich (St. Louis, EE.UU.). Acetato de sodio, ácido acético, ácido clorhídrico, ácido fórmico, cloruro de potasio, diclorometano, etanol, n-hexano, hidróxido de sodio, metanol, persulfato de potasio, reactivo de Folin-Ciocalteu, se obtuvieron de Merck (DarmstadtAlemania). Acetonitrilo grado LC-MS se adquirió de Honeywell Burdick & Jackson (New Jersey- EE.UU.).

Cianidina, cianidina-3-glucósido, cianidina-3rutinósido, pelargonidina-3-glucósido se consiguieron de PhytoLab, Vestenbergsgreuth, Alemania). Agua Tipo I fue producida por un equipo purificador Synergy UV, de Merck Millipore (Darmstadt, Alemania).

2.2. Material vegetal Las flores de Thunbergia grandiflora Roxb.

(COL. 578355), Brownea macrophyla (COL 582310), y Petrea volubilis (COL 569628) se recolectaron en el Complejo Agroindustrial Piloto del Centro Nacional de Investigaciones para la Agroindustrialización de Especies Vegetales Aromáticas y Medicinales Tropicales CENIVAM (977 msnm, N 07°08,422’ W 073°06,960’), localizado en el campus principal de la Universidad Industrial de Santander (Bucaramanga-Colombia).

2.3. Micro-extracción en fase sólida El monitoreo de compuestos volátiles HS-SPME se realizó según la metodología descrita por Stashenko et al.[14]. El material vegetal se utilizó en fresco; la flor (2 g), se depositó en un vial (15 mL) color ámbar, sellado, y se acondicionó durante 10 min a 60 °C. La extracción se llevó a cabo mediante la exposición de la fibra de SPME en el interior del vial durante 30 min. El muestreo por HS-SPME se realizó a diferentes horas del día (6:00 a.m., 12:00 m.; 6:00 p.m.), por triplicado. El estándar interno, n-tetradecano (ca. 2 mg), se incorporó mediante la exposición de la fibra SPME durante 5 s a 60 °C, posteriormente, la fibra SPME se llevó al interior del vial que contenía la flor.

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2.4. Extracción con CO2 supercrítico

La extracción SFE se realizó en dos equipos diferentes. La extracción sin co-solvente utilizó un equipo Soxhlet de alta presión (J & W Scientific, U.S. Pat. N° 4.006.062, 4.265.860). El material vegetal fresco (10 g), se colocó en el cuerpo del equipo Soxhlet, que se depositó en el interior de un reactor metálico rodeado de CO2 sólido (ca. 300 g). El sistema se selló, y se sumergió en un baño termostatado a 50 °C (Büchi W20, Suiza), lo que elevó la presión interna a 1100 psi. Después de 2 h el reactor se introdujo en un baño refrigerante circulatorio (Cole Palmer, Chicago, IL, EE.UU.), hasta lograr una presión interna de 500 psi. Posteriormente se permitió la salida de CO2 hasta alcanzar la presión atmosférica.

Diclorometano (1 mL) y n-tetradecano (0.5 µL) se usaron como disolvente y estándar interno respectivamente.

La extracción con co-solvente empleó un equipo de extracción supercrítica a escala piloto Thar SFE2000-50 FMC (Thar Instruments, Inc, Pittsburgh, PA, EE.UU.), provisto de un porta-muestra (flor liofilizada, 100-400 g) en acero inoxidable, un regulador automático e independiente de temperatura y presión, bombas de alta presión P-200A, para el CO2, y P-50A para el etanol, y un medidor de flujo Sitrans FC Massflo modelo MASS6000 (Siemens AG, Berlín, Alemania). Las condiciones de extracción fueron 200 bar, 40 °C, un flujo de CO2 de 40 g/min y etanol co-solvente (10%).

2.5. Extracción con solvente

La extracción con solvente se efectuó, según Londoño-Londoño et al.[15], con algunas modificaciones.

El material vegetal liofilizado (1 g) se depositó en un frasco (60 mL) color ámbar, se adicionó una solución de etanol (20 mL, 0.5 % de HCl, 1:1 v/v en agua Tipo I) y se colocó la suspensión en un baño de ultrasonido (Elmasonic S15H, Singen, Alemania), de 37 kHz y 35 W de potencia ultrasónica efectiva, durante 30 min.

El residuo se separó por filtración (papel filtro Whatman No 1) y se extrajo dos veces más. Los extractos se secaron en un liofilizador de bandejas VirTis AdVantage Plus (SP Scientific, Gardiner, New York, EE.UU.)

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y se almacenaron a 4 °C, en ausencia de luz, hasta la determinación de su capacidad antioxidante.

2.6. Extracción por dispersión de la matriz en fase sólida

Para la obtención de extractos por MSPD, se empleó la metodología propuesta por Xiao et al.[16], en la cual se mezclaron material vegetal (0,5 g), metanol (1 mL), y sílice-C18 (0,5 g) como agente dispersante.

Una mezcla metanol-agua (10 mL, 9:1) se utilizó como solvente de elución. Al extracto se le retiró el solvente por roto-evaporación (roto-evaporador, Heidolph, HeiVAP Advantage HL, Chicago, EE.UU.) y liofilización.

El extracto se almacenó a 4°C en frascos ámbar.

2.7. Análisis por GC-MS

El análisis de los componentes volátiles se realizó en un cromatógrafo de gases, GC 6890 Plus (Agilent Technologies, Palo Alto, California, EE.UU.), equipado con un detector selectivo de masas MS 5973 Network (AT, Palo Alto, CA, EE.UU.), ionización por impacto de electrones (EI, 70 eV). Se utilizó helio (99.995 %, gas AP, Linde, Bogotá, Colombia) como gas de arrastre, con presión de entrada en la cabeza de la columna de 16.47 psi, y una velocidad volumétrica de flujo constante de 1 mL/min. El modo de inyección fue split (30:1), con temperatura de 250 °C en el inyector.

La separación de los compuestos se llevó a cabo en dos columnas capilares, una con fase estacionaria (f.e.) apolar de 5%-fenil-poli(metilsiloxano) (DB-5MS, J & W Scientific, Folsom, CA, EE.UU.) de 60 m x 0.25 mm (D.I.) x 0.25 µm (df), y la otra, con fase estacionaria (f.e.) polar de poli(etilenglicol) (DB-WAX, J & W Scientific, Folsom, CA, EE.UU.) de 60 m x 0.25 mm (D.I.) x 0.25 µm (df). La programación del horno cromatográfico fue de 45 a 150 °C (4 °C/min) y luego hasta 250 °C (5 °C/min) durante 5 min, finalmente se llevó a 275 °C (10 °C/min). La temperatura de la fuente de ionización y del cuadrupolo fue 230 °C y 150 °C, respectivamente. El registro de espectros se llevó a cabo en el modo de barrido completo (full scan), en un rango de masas entre 45 y 450 uma con una velocidad 24

Determinación de metabolitos secundarios en flores tropicales

de barrido de 3.58 scan/s. Los datos obtenidos se procesaron con el software MSDChemStation G1701DA (AT, Palo Alto, CA, EE.UU.). La identificación de los compuestos se basó en los índices de retención lineales (LRI, por sus siglas en inglés) y en la comparación de los espectros de masas de cada compuesto con los de las bases de datos espectrales Adams, NIST y Wiley. Los LRI se calcularon a partir del tiempo de retención del compuesto y las sustancias de referencia certificadas de n- parafinas C10-C25.

2.8. Análisis por HPLC-ESI-TOF-MS Los extractos se analizaron en un cromatógrafo líquido de alta eficiencia, HPLC 1200 Series (AT, Palo Alto, CA, EE.UU.), equipado con un analizador de tiempo de vuelo (TOF-MS 6210 Series, AT, Palo Alto, CA, EE.UU.), con la ionización a través de una interfaz de electronebulización (ESI), operada en modo positivo, una unidad de desgasificación de solventes (G1379B), una bomba binaria (G1312A), un inyector automático (G1367B) y una unidad termostatada para la columna (G1316A). La separación se realizó en una columna Kinetex C18 (Phenomenex, Torrance, CA, EE.UU.), de 100 mm, L x 4.6 mm, D.I. x 2.6 μm de tamaño de partícula, a 35 °C. La fase móvil fue A: agua (0.2 % de ácido fórmico) y B: acetonitrilo (0.2 % de ácido fórmico).

El flujo fue de 0.2 mL/min y el volumen de inyección de 4 μL. Se usó nitrógeno (Generador N2 PEAK, Scientific, Billerica, MA, EE.UU.) como gas secante (350 °C, 7 mL/min) y gas nebulizador (40 psi); se usaron voltajes de capilar y de fragmentador de 4 kV y de 200 a 250 V, respectivamente. Los datos se procesaron con el software Mass Hunter WorkStation, Versión B.02.00-SP3. Para la identificación de los compuestos se utilizó la corriente iónica extraída (EIC, por sus siglas en inglés) del fragmentograma, según las masas exactas de los compuestos buscados y los tiempos de retención de patrones certificados.

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Determinación de metabolitos secundarios en flores tropicales

2.9. Evaluación de la actividad antioxidante por el método de capacidad de absorción de radicales de oxígeno

La metodología propuesta por Ou, B. et al.[17], con algunas modificaciones, se utilizó en este estudio.

Se empleó un lector de microplacas (Turner Biosystems Inc. ModulusTM II Microplate Multimode Reader, CA, EE.UU.) de 96 pozos, a 37 °C, en el modo fluorescencia y a una longitud de onda de 510 nm; como molécula fluorescente, se usó fluoresceína y como patrón de referencia, Trolox®. La capacidad antioxidante se midió a partir de la diferencia de disminución de fluorescencia, entre el área bajo la curva (ABC) de los extractos y el ABC del blanco. Esta diferencia, llamada área neta, se expresó en µmolTrolox®/g de extracto, por medio de una curva de calibración. Con el fin de comparar la actividad de los extractos con otros antioxidantes de uso industrial, se midió la actividad para el BHT y el α-tocoferol bajo las mismas condiciones. Cada medición se realizó tres veces.

2.10. Evaluación de la capacidad antioxidante mediante el ensayo de decoloración del catión-radical ABTS+•

La evaluación de la capacidad antioxidante por el método ABTS+, se realizó bajo la metodología reportada por Re, R. et al.[18] con algunas modificaciones. Se usó un lector de microplacas (Turner Biosystems Inc. ModulusTM II Microplate Multimode Reader, CA, EE.UU.) de 96 pozos, en el modo absorbancia, a una longitud de onda de 734 nm. El catión-radical ABTS+• se formó a partir de una solución de ABTS (7 mM) en buffer acetato de sodio (20 mM, pH 4.5) y una solución de persulfato de potasio (2.45 mM). La solución resultante se llevó a un baño de ultrasonido por 30 min, y se mantuvo a 4 °C, protegida de la luz durante 24 h, tiempo requerido para la estabilidad del catión-radical ABTS+•. Cumplido el tiempo necesario, se tomó solución de catión-radical ABTS+• (ca. 1000 µL) y se diluyó en la solución buffer hasta alcanzar una absorbancia de 0.71; logrado este valor, la solución final se almacenó en la nevera a 4 °C, durante 30 min, hasta su uso. Los extractos fueron diluidos en buffer, a cada placa del

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lector se adicionaron la muestra y la solución final del catión-radical ABTS+•. Para expresar los resultados en unidades de µmolTrolox®/g de extracto, se realizó una curva de calibración con Trolox®. Cada medición se realizó por triplicado.

2.11. Determinación del contenido fenólico por el método Folin-Ciocalteu

Para determinar el contenido total de fenoles se empleó la metodología descrita por Magalhaes et al.[19], usando ácido gálico como patrón de referencia, para realizar una curva de calibración y expresar el contenido fenólico en mg ácido gálico/g de extracto. En este ensayo se empleó un lector de placas (Turner Biosystems Inc., ModulusTM II Microplate Multimode Reader, CA, EE.UU.), con microplacas de poli(estireno) de 96 pozos, equipado con módulos de absorbancia (UV-Vis) y fluorescencia. Se preparó la solución del reactivo de Folin-Ciocalteu (2.0 N) en agua tipo I, y una solución de hidróxido de sodio (0.35 M) para obtener el medio básico. Las mediciones se realizaron en el modo de absorbancia, y a una longitud de onda de 750 nm, con una temperatura de 25 °C. Cada medición se realizó por triplicado.

3. Resultados y discusión 3.1. HS-SPME de flores

La mayor área cromatográfica total se usó como criterio para seleccionar al recubrimiento CAR-PDMS como el que permitió la mayor sensibilidad en el muestreo de las fragancias florales de las especies bajo estudio. Debido a que el perfil de compuestos volátiles en las plantas, especialmente hojas y flores, puede variar durante el día, la fragancia floral se muestreó a tres horas del día (Figura 1)[20]. El análisis HS-SPME-GC-MS de estas fracciones volátiles permitió la identificación de 13 y 46 diferentes compuestos (>0.01%) emanados por flores de T. grandiflora y P. volubilis, respectivamente (Tabla 1). Las flores de B. macrophyla no liberaron sustancias volátiles en cantidades suficientes para que con esta técnica pudiesen ser distinguidas del ruido.

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Determinación de metabolitos secundarios en flores tropicales

Figura 1. Perfiles cromatográficos de volátiles de flores de P. volubilis L., aislados por HS-SPME, utilizando fibra de CAR/PDMS; con muestreo a las 6:00 a.m., 12:00 m. y 6:00 p.m.

La fragancia floral de T. grandiflora estuvo constituida principalmente por compuestos oxigenados no terpénicos (95 %). Los componentes identificados en cantidad relativa > 0.07 %, representaron el 96 % del área cromatográfica total. El 1-octen-3-ol (74 %) fue el componente mayoritario de la fragancia de bignonia azul. Estudios realizados[24,25] sobre la interacción de la planta con herbívoros, patógenos o microorganismos, han demostrado que el 1-octen-3-ol es atrayente de insectos. Bendera et al.[26], identificaron por cromatografía de gases con detector de electroantenografía (GC-EAD, por sus siglas en inglés) y cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas los compuestos volátiles extraídos con solvente o por HS-SPME de hojas de Vigna unguiculata L. Walp.

(Fabáceae) que son detectados por antenas de Maruca vitrata Fabricius. (Lepidóptera). Los resultados de la investigación indican que el 1-octen-3-ol (~88 %) 26

es el componente mayoritario presente en hojas de V. unguiculata. También, se demostró que un aumento en la concentración de este compuesto favorece la interacción con M. vitrata.

La 3-octanona (23 %) y el sulfuro de dimetilo (31 %), fueron emitidos T. grandiflora en mayor proporción durante el atardecer en comparación con las otras horas evaluadas. El sulfuro de dimetilo es una molécula neutra, estable y con reactividad baja en sistemas biológicos[27]. Bestmann et al.[28], realizaron la caracterización química por GC y GC-MS de la fragancia floral de 11 especies que son polinizadas por murciélagos. Entre los compuestos identificados figuran disulfuro de dimetilo, trisulfuro de dimetilo, tetrasulfuro de dimetilo, entre otros compuestos azufrados; estas moléculas no se encuentran comúnmente en la fragancia floral de bignonia azul, aunque se le atribuye un olor característico a ajo.

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Determinación de metabolitos secundarios en flores tropicales

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Tabla 1. Composición química de la fracción volátil obtenida por HS-SPME/GC-MS de flores de T. grandiflora Roxb y P. volubilis.

Descripción T. grandiflora Roxb.

Acetaldehído1 Sulfuro de dimetilo1 Etanol1 trans-β-Ocimeno2 3-Octanona1 1-Octen-3-ona1 3-Octanol1 1-Octen-3-ol1 Pentadecano1 Linalol2 Salicilato de metilo2 Acetato de laurilo1 Nitrilo de bencilo1 P. volubilis β-Mirceno2 Δ3-Careno 2 Limoneno2 2-Hexenal1 cis-β-Ocimeno1 trans-β-Ocimeno2 Octan-3-ona1 3-Isopropenil-5,5-dimetil-ciclopenteno1 p -Cimeno2 Terpinoleno1 Octanal1 Oct-1-en-3-ona1 (E )-4,8-Dimetil-1,3,7-nonatrieno1 Pent-2-en-1-ol1 1-Hexanol1 cis-2-Octen-1-ol1 Pent-3-en-2-ol1 allo -Ocimeno1 cis -3-Hexen-1-ol1 3-Octanol1 1

DB-WAX

Cantidad relativa, %

LRIexp

LRIlit

6 a.m.

12 m.

6 p.m.

718

71419

0.19

766

777

20

0.75

1.26

31.43

942

92620

0.49

0.45

1.57

1248

1250

21

0.20

1253

1254

21

6.69

3.47

23.47

1300

1301

21

10.27

14.19

8.11

1389

139121

1.37

0.73

1447

1444

21

74.05

72.56

1494

1504

22

0.88

0.38

1540

1543

21

1.47

2.19

2.54

1791

178521

3.05

4.89

1.29

1885

1880

23

0.34

1939

1938

24

0.38

1162

1160

1.36

0.90

0.78

1182

1133

0.20

0.16

0.16

1200

1198

1.04

1.10

0.98

1216

1216

0.40

0.30

0.61

1230

1234

0.56

0.49

0.39

1249

1250

9.61

9.98

6.25

1253

1254

0.80

0.37

1.56

1264

-

0.19

0.16

0.16

1272

1270

0.13

1.88

0.14

1283

1282

0.24

0.20

0.14

1287

1287

0.18

0.30

0.23

1299

1301

1.12

0.30

0.47

1304

-

0.80

1.50

0.21

1314

1315

0.18

0.19

0.31

1348

1351

0.40

0.40

0.78

1353

-

0.06

1364

-

0.04

0.03

1371

1366

0.72

0.50

0.37

1380

1380

1.76

1.20

5.86

1387

1391

1.60

1.00

1.76

32.69

Identificación tentativa basada en comparación de índices de retención y espectro de masas con bases espectrales[21-23]. 2Identificación confirmatoria con sustancia patrón.

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Determinación de metabolitos secundarios en flores tropicales

Tabla 1. Continuación.

Descripción allo-neo -Ocimeno1 trans -2-Hexen-1-ol1 2-Metilbutanoato de hexilo1 Oct-1-en-3-ol1 Butanoato de cis -hex-3-enilo1 2-Metilbutanoato de cis -hex-3-enilo1 Valerato de cis -hex-3-enilo1 α-Copaeno2 Benzaldehído1 Linalol2 Octanol1 3-Metil-pentadecano1 trans -β-Cariofileno2 Non-1-en-3-ol1 1-Nonanol Angelato de cis -hex-3-enilo1 cis -Non-3-en-1-ol1 α-Terpineol2 Acetato de geranilo2 Farnesol2 Salicilato de metilo2 Nerol2 (E-,E -)-α-Farneseno1 Geraniol2 Alcohol feniletílico1 Benzoato de cis -hex-3-enilo1 1

DB-WAX

Cantidad relativa, %

LRIexp

LRIlit

6 a.m.

12 m.

6 p.m.

1394

1391

0.72

0.70

1.86

1400

1399

0.32

0.30

0.20

1427

1428

0.06

0.05

1446

1444

32.03

36.91

52.76

1460

1456

0.46

0.60

0.39

1473

-

2.40

2.10

0.45

1487

-

0.16

0.19

0.14

1503

1491

0.07

2.00

0.07

1527

1518

0.03

0.11

1539

1543

40.04

20.95

19.35

1550

1551

0.40

2.00

1.95

1559

-

0.04

0.05

0.07

1614

1598

0.32

10.97

0.39

1644

-

0.16

0.29

0.18

1655

1655

0.16

0.30

0.20

1669

-

0.18

0.30

0.10

1681

-

0.05

0.12

0.12

1699

1694

0.06

0.40

0.16

1747

1751

0.10

0.10

0.08

1778

-

0.04

1786

1767

0.16

0.23

0.20

1795

1794

0.09

0.14

0.08

1805

1743

0.24

1842

1839

0.10

0.09

0.07

1914

1903

0.14

0.19

0.06

2137

2119

0.04

Identificación tentativa basada en comparación de índices de retención y espectro de masas con bases espectrales

Las plantas liberan mezclas de metabolitos secundarios en tejidos vegetales como respuesta al ataque de herbívoros[29]. Los compuestos orgánicos volátiles (VOC, por sus siglas en inglés) pueden repeler, disuadir, afectar la fisiología y comportamiento de herbívoros debido a su toxicidad; también logran atraer a enemigos naturales de la especie atacante[29]. En la planta, mordeduras ocasionadas por herbívoros conducen a la liberación de nuevos volátiles[29].

28

. Identificación confirmatoria con sustancia patrón.

[21-23] 2

Los terpenos no se emiten inmediatamente después del ataque por herbívoros; por el contrario, aldehídos, alcoholes y ésteres, de seis carbonos, se liberan al instante[29]. Por ejemplo, el salicilato de metilo y linalol se liberan cuando la planta sufre estrés biótico[30,31]. Además, la emisión de trans-β-ocimeno a diferentes horas del día se relaciona con el proceso de fotosíntesis; por tanto, la abundancia de este compuesto es mayor en la mañana que en la noche[32].

Scientia Chromatographica 2018; 10(1):21-38

Determinación de metabolitos secundarios en flores tropicales

En la fracción volátil de flores de P. volubilis L. se encontraron compuestos oxigenados (2-hexenal, octan3-ona), monoterpenos (limoneno, trans-β-ocimeno, allo-ocimeno), monoterpenos oxigenados (linalol), sesquiterpenos oxigenados (farnesol) y sesquiterpenos (trans-β-cariofileno). El área cromatográfica más grande se observó para la fracción volátil tomada a las 6 am. Los sesquiterpenos oxigenados se detectaron a las 6:00 a.m., su aumento notorio se presentó a las 12:00 m (Tabla 1).

La fracción volátil de flores de P. volubilis L. obtenida a las 6:00 a.m. estuvo compuesta, mayoritariamente, por linalol (40%), oct-1-en-3-ol (32%), y trans-βocimeno (9.6%). Compuestos como el cis-oct-2-en-1-ol (0.06%) y farnesol (0.04%), fueron hallados sólo a esa hora de monitoreo. Farnesol posee actividad repelente contra las hormigas de los géneros Atta y Acromyrmex (Hymenóptera: Formícida), que se consideran una plaga en América, debido a que cortan indiscriminadamente hojas, flores y frutos de muchas plantas; esta podría ser una explicación del porqué la presencia de hormigas en horas de la mañana en las flores de P. volubilis L, es escasa[33].

3.2. Extracción de flores con CO2 supercrítico

El dióxido de carbono es apolar y por esto, los flavonoides y otras sustancias polares o iónicas tienen muy baja solubilidad en la corriente extractora. El uso de presiones altas y la adición de un co-solvente como el etanol, permiten aumentar estas solubilidades[34]. En este trabajo se utilizaron MSPD y la extracción con etanol, que logran un aislamiento de sustancias polares mucho mayor que SFE. Por esto, el análisis de los extractos SFE se enfocó en las sustancias apolares. La Tabla 2 presenta la composición hallada para los extractos obtenidos con CO2 de las flores de las tres especies bajo estudio. La SFE de bignonia azul se realizó sin cosolvente, mientras que para las otras dos especies de flores se empleó 10% de etanol. Los hidrocarburos fueron los compuestos más representativos de estos extractos. Otros compuestos detectados fueron compuestos oxigenados noterpénicos. Estas sustancias no son fácilmente ionizables

Sierra LJ et al.

en la interface de electronebulización, lo que reduce grandemente la sensibilidad de su análisis por la técnica LC-ESI-MS. En la extracción con fluido supercrítico de flores de T. grandiflora, se obtuvieron como compuestos mayoritarios el hentriacontano [CH3(CH2)27CH3, 34%] y el nonacosano [CH3(CH2)29CH3, 33%). Se detectaron ácidos grasos y fitoesteroles. Similarmente, en el extracto de flores de B. macrophylla, se identificaron los fitoesteroles fucosterol, campesterol y γ-sitosterol, que cumplen funciones de soporte y estructura para la célula vegetal; estos compuestos también están presentes en la soya[35].

El perfil cromatográfico del extracto SFE de flores de P. volubilis L., presenta mayoritariamente fitoesteroles, γ-sitosterol, estigmasterol, fucosterol y sitostenona; ácidos palmítico y linolénico, dihidrobenzofurano, y α-tocoferol. Según el análisis por GC-MS, el compuesto mayoritario fue el γ-sitosterol. A este metabolito, se le han atribuido actividades antidiabética, antihiperglicémica, antirreumática, anti-inflamatoria y antibacteriana, entre otras[36]. Se ha reportado[37,38] que el estigmasterol y el campesterol poseen actividades analgésica y anti-inflamatoria. Lee et al.[39] aislaron fucosterol de Pelvetia siliquosa y encontraron que este compuesto presentaba actividad antidiabética y efectos antioxidantes. Yoshida et al.[40], demostraron los efectos antioxidantes proporcionados por los fitoesteroles campesterol, sitosterol y estigmasterol.

Michielin et al.[41] realizaron el análisis por GC-MS de extractos de Cola de caballo (Equisetum giganteum L., Equisetácea) obtenidos con CO2 supercrítico y con solvente (n-hexano o diclorometano).

La composición química de extractos de E. diganteum L. estuvo conformada principalmente por n-parafinas, ácidos grasos y esteroides. Esto respalda la observación hecha de que estas técnicas de extracción favorecen la obtención de compuestos oxigenados no terpénicos, de polaridad baja, y n-parafinas.

Scientia Chromatographica 2018; 10(1):21-38 29

Sierra LJ et al.

Determinación de metabolitos secundarios en flores tropicales

Tabla 2. Composición química de la fracción volátil de extractos obtenidos con CO2 supercrítico de flores de T. grandiflora Roxb., B. macrophyla, y P. volubilis.

Descripción

1

Thunbergia grandiflora Pentacosano 1 Hexacosano 1 Heptacosano 1 Octacosano 1 Nonacosano 1 Triacontano 1 Hentriacontano 1 Estigmasterol 2 Tritriacontano 1 β-Sitosterol 2 Brownea macrophyla Ácido palmítico 2 Ácido linoleico 2 α-Ácido linolénico 2 Campesterol 1 γ-Sitosterol 1 Fucosterol 1 Petrea volubilis Dihidrobenzofurano 1 Ácido palmítico 2 Ácido linolénico 2 13-Docosenamida 1 α-Tocoferol 2 Campesterol 1 Estigmasterol 1 γ-Sitosterol 1 Fucosterol 1 Sitostenona 1

DB-5MS

Cantidad relativa, %

LRIexp

LRIlit

2510 2597 2697 2796 2898 2993 3098 3265 3295 3324

2500 2600 2700 2800 2900 3000 3100 3300 -

1.34 0.39 4.23 1.34 33.78 1.88 34.10 9.79 3.75 9.40

± ± ± ± ± ± ± ± ± ±

0.09 0.02 0.06 0.01 0.47 0.04 0.65 0.57 0.01 0.22

1955 2128 2133 3281 3325 3331

1955 2130 2134] 3305] 3351 3305

4.4 10.5 8.0 11.1 55.5 10.5

± ± ± ± ± ±

0.67 0.48 0.51 0.27 0.5 0.34

1215 1958 2137 2533 3133 3242 3267 3327 3339 3447

1226 1968.4 2134 2625 3112 3248 3290 3305 3458

2.7 6.8 17.3 1.6 1.4 1.9 3.3 55.0 4.9 5.1

± ± ± ± ± ± ± ± ± ±

0.37 0.21 0.47 0.51 0.25 0.16 0.17 0.96 0.32 0.36

Identificación tentativa basada en índices de retención y espectro de masas[21-23]. 2Identificación confirmatoria basada en comparación con sustancia patrón.

3.3. Extracciones MSPD y con solvente El análisis por LC-MS de extractos hidro-etanólicos obtenidos bajo diferentes condiciones permitió encontrar que la mayor cantidad de compuestos fenólicos se obtuvo con relación EtOH:H2O (7:1), solución acidulada con HCl (1%), baño ultrasonido (30°C, 30 min). Las mejores condiciones para la extracción de compuestos fenólicos correspondieron a los pH más bajos.

30

En el extracto hidro-etanólico de B. macrophyla se identificaron 6 compuestos de naturaleza polifenólica, antocianinas (Tabla 3). Estas son glucósidos de las antocianidinas (agliconas). Con el fin de realizar una identificación inequívoca, los tR y espectros de masas de los compuestos se compararon con los de patrones certificados. Tanto los tiempos de retención como los espectros de masas, coincidieron con los compuestos Scientia Chromatographica 2018; 10(1):21-38

Determinación de metabolitos secundarios en flores tropicales

Sierra LJ et al.

obtenidos en el extracto. No todos los compuestos encontrados pudieron confirmarse, por la ausencia de algunos patrones.

Los análisis LC-ESI+-TOF-MS del extracto aislado con solvente mostraron la presencia de antocianinas. Las antocianinas poseen dos bandas características en el rango de UV-Vis; la primera, alrededor de los 200 nm, generada por el anillo aromático, y la segunda, alrededor de los 490-550 nm, causada por el catión flavilio[42]. Las antocianinas son compuestos coloridos (rojizos), a causa de la carga positiva del catión flavilio, el cual permanece estable en medios muy ácidos (pH 1.0 aproximadamente) y absorbe energía en el rango de los 490-550 nm de longitud de onda, lo que indica que refleja en el rango de los 620-700 nm de longitud de onda aproximadamente; este rango corresponde al color rojo, el color de la flor de B. macrophylla.

La técnica de MSPD, permitió extraer diferentes clases de flavonoides además de las antocianinas. Entre los compuestos identificados en el extracto MSPD, no sólo se encontraron antocianinas (pelargonidinas y cianidinas), sino también flavonoles (quercetinas) y flavanoles (galato) (Tabla 3). Este aumento del número de compuestos aislados, puede deberse al solvente usado en la extracción. En la extracción por MSPD, el solvente de elución fue una mezcla metanol:agua (9:1), y en la extracción con solvente, se usó etanol:agua (7:1), lo que indica que el metanol actúa como mejor extractante para estas sustancias. Esto concuerda también con lo hallado por Galanakis, C.M. et al.[43], quienes obtuvieron mejores resultados de extracción con una mezcla metanólica que con una etanólica.

En el extracto hidro-alcohólico de flores de P. volubilis, se identificaron compuestos de tipo

Tabla 3. LC-ESI+-TOF-MS, de extractos de flores de B. macrophylla.

Masas Descripción

Fórmula

Experimental

Exacta

Δ ppm

Extracto hidro-etanólico Pelargonidina-3.5-diglucósido*

C27H31O15

595.1659

595.1663

0.67

449.1089

449.1084

1.11

433.1143

433.1135

1.85

271.0611

271.0606

1.8

301.0719

301.0712

2.32

Cianidina-3-glucósido** Pelargonidina-3-glucósido** Pelargonidina* Peonidina*

C21H21O11

C21H21O10 C15H11O5 C16H13O6

Cianidina**

C15H11O6

287.0559

287.0556

1.05

Extracto MSPD Pelargonidina-3,5-diglucósido*

C27H31O15

595.1669

595.1663

1.06

433.1143

433.1135

1.85

459.0930

459.0922

1.74

611.1615

611.1607

1.31

595.1659

595.1663

0.67

465.1035

465.1028

1.5

449.1089

449.1079

1.11

449.1072

449.1084

2.67

287.0559

287.0556

1.05

Pelargonidina-3-glucósido** Galato de equigalocatequina** Rutina (Quercetina-3-rutinósido)** Cianidina-3-rutinósido* Quercetina-3-galactósido* Cianidina-3-glucósido** Quercitrina (Quercetina-3-ramnosa)** Cianidina**

C21H21O10 C22H19O11

C27H31O16 C27H31O15

C21H21O12

C21H21O11

C21H21O11 C15H11O6

*Identificación tentativa, según la fragmentación del ion molecular protonado. **Identificación confirmatoria, con base en patrones y fragmentación del ion molecular protonado.

Scientia Chromatographica 2018; 10(1):21-38 31

Sierra LJ et al.

Determinación de metabolitos secundarios en flores tropicales

Tabla 4. LC-ESI+-TOF-MS, de extractos de flores de P. volubilis.

Masas Descripción

Fórmula

Experimental

Exacta

Δ ppm

C21H21O12

465.1013

465.1009

3.99

463.086

463.0864

1.59

447.0927

447.0922

1.1

491.4215

491.4511

4.8

475.1208

475.1215

1.47

287.0541

287.055

3.15

C15H11O5

271.0603

271.0601

0.73

C21H21O12

465.1013

465.1009

3.99

463.086

463.0864

1.59

447.0927

447.0922

1.1

287.0541

287.055

3.15

271.0603

271.0601

0.73

Extracto hidro-etanólico Delfinidina 3-glucósido Cianidina-3-glucorónido Apigenina 7-o -glucorónido Cianidina-3-(6-acetil-glucósido) Pelargonidina-3-(6-acetil-glucósido) Luteolina Apigenina

C21H19O12 C21H19O11 C23H23O12

C23H23O11 C15H11O6

Extracto MSPD Delfinidina 3-glucósido Cianidina-3-glucorónido Apigenina 7-o -glucorónido Luteolina Apigenina

C21H19O12 C21H19O11 C15H11O6 C15H11O5

fenólico, tales como apigenina, luteolina y apigenina 7-o-glucorónido; cuatro antocianinas, delfinidina 3-glucósido, cianidina-3-glucorónido, cianidina-3-(6acetil-glucósido) y pelargonidina-3-(6-acetil-glucósido) (Tabla 4). Los extractos de coloración más intensa se obtuvieron con el solvente acidulado a pH= 1.

En el extracto de flores de P. volubilis L. obtenido por MSPD se identificaron cinco compuestos de naturaleza fenólica, tres flavonoides, apigenina 7-o-glucorónido, luteolina y apigenina; y dos antocianinas, delfinidina 3-glucósido y cianidina-3-glucorónido (Tabla 4). La identificación de los compuestos, se confirmó mediante la medición de masas exactas (Δppm) y por comparación de tiempos de retención con los de patrones certificados.

Los polifenoles encontrados en los extractos de flores P. volubilis L., han mostrado actividad biológica.

Miean et al.[44], reportaron la presencia de la apigenina en vegetales como coles, pimientos, ajo, guisantes y calabazas. Viola et al.[45] estudiaron los extractos acuosos de flores de Matricaria recutita, y encontraron la apigenina como uno de los componentes mayoritarios, 32

al cual se le atribuye un efecto anti-inflamatorio. La apigenina ha sido encontrada en 62 plantas comestibles; entre ellas, col china y pimentón. Este flavonoide inhibe el crecimiento de células de cáncer de tiroides[46].

La Tabla 5 presenta una comparación de las composiciones de los extractos obtenidos con las diferentes técnicas de extracción empleadas. Los fitoesteroles se aislaron preferencialmente con CO2 supercrítico. Aun con el uso de co-solvente (etanol), esta técnica no logró disolver moléculas bastante hidrofílicas como los flavonoides glucosilados. En los extractos SFE se encontraron flavonas, pero no antocianinas o flavonoides que sí resultaron como constituyentes abundantes de las mezclas aisladas por extracción hidroetanólica o por dispersión de la matriz en fase sólida.

3.4. Capacidad antioxidante

La Tabla 6 contiene los resultados de la medición de la capacidad antioxidante (métodos ORAC y ABTS) y del contenido total de fenoles (método FolinScientia Chromatographica 2018; 10(1):21-38

Determinación de metabolitos secundarios en flores tropicales

Sierra LJ et al.

Tabla 5. Compuestos mayoritarios identificados por LC-MS y GC-MS, presentes en extractos y en la fracción volátil de flores de P. volubilis L. y B. Macrophyla.

Compuesto

Fórmula

Técnica de extracción MSPD

SFE

SE

SPME

Clasificación

Thunbergia grandiflora Luteolina diglucósido

C27H30O16

+

Flavonoide

Apigenina-diglucorónido

C27H26O17

+

Flavonoide

Luteolina-glucorónido

C21H18O12

+

Flavonoide

Apigenina glucóronido

C21H18O11

+

Flavonoide

Apigenina 7-(6-acetil glucósido)

C23H22O11

+

Flavonoide

Luteolina

C15H11O6

+

Flavona

Apigenina

C15H11O5

+

Flavona

Pentacosano

C25H52

+

Hidrocarburo

Heptacosano

C27H56

+

Hidrocarburo

Octacosano

C28H58

+

Hidrocarburo

Nonacosano

C29H60

+

Hidrocarburo

Triacontano

C30H62

+

Hidrocarburo

Tritriacontano

C33H68

+

Hidrocarburo

Hentriacontano

C31H64

+

Hidrocarburo

Estigmasterol

C29H48O

+

Fitoesterol

β-Sitosterol

C29H50O

+

Fitoesterol

Sulfuro de dimetilo

C2H6S

+

Tioéter

Etanol

C2H6O

+

COX

3-Octanona

C8H16O

+

COX

1-Octen-3-ona

C8H14O

+

COX

3-Octanol

C8H18O

+

COX

1-Octen-3-ol

C8H16O

+

COX

Linalol

C10H18O

+

MO

Salicilato de metilo

C8H8O3

+

COX

Petrea volubilis Delfinidina 3-glucósido

C21H21O12

+

+

Antocianina

Cianidina 3-glucorónido

C21H19O12

+

+

Antocianina

Pelargonidina 3-(6-acetil-glucósido)

C23H23O11

+

Antocianina

Cianidina-3-(6-acetil-glucósido)

C23H23O12

+

Antocianina

Apigenina 7-o -glucorónido

C21H19O11

+

+

Flavonoide

Luteolina

C15H11O6

+

+

Flavona

+

AGS: ácido graso saturado. AGI: ácido graso insaturado. MH: Hidrocarburo monoterpénico. MO: Monoterpeno oxigenado. COX: Compuesto oxigenado.

Scientia Chromatographica 2018; 10(1):21-38 33

Sierra LJ et al.

Determinación de metabolitos secundarios en flores tropicales

Tabla 5. Continuación.

Técnica de extracción

Compuesto

Fórmula

Apigenina

C15H11O5

Ácido palmítico

C16H32O2

+

AGS

Ácido linolénico

C18H30O2

+

AGI, C18:3

Campesterol

C28H48O

+

Fitoesterol

Estigmasterol

C29H48O

+

Fitoesterol

γ-Sitosterol

C29H50O

+

Fitoesterol

Fucosterol

C29H48O

+

Fitoesterol

Sitostenona

C29H48O

+

Fitoesterol

Linalol

C10H18O

+

MO

trans -β-Ocimeno

C10H16

+

MH

2-Metilbutanoato de cis -hex-3-enilo

C11H20O2

+

MH

Oct-1-en-3-ol

C8H16O

+

COX

cis -3-Hexen-1-ol

C6H12O

+

COX

3-Octanol

C8H18O

+

COX

MSPD

SFE

SE

+

+

+

SPME

Clasificación Flavona

Brownea macrophyla Ácido palmítico

C16H32O2

+

AGS

Ácido linoleico

C18H32O2

+

AGI, C18:2

α-Ácido linolénico

C18H30O2

+

AGI, C18:3

Campesterol

C28H48O

+

Fitoesterol

γ-Sitosterol

C29H50O

+

Fitoesterol

Fucosterol

C29H48O

+

Fitoesterol

Pelargonidina-3,5-diglucósido

C27H31O15

+

+

Antocianina

Pelargonidina-3-glucósido

C21H21O10

+

+

Antocianina

Pelargonidina

C15H11O5

+

Antocianidina

Peonidina

C16H13O6

+

Antocianidina

Cianidina-3-rutinósido

C27H31O15

+

Cianidina-3-glucósido

C21H21O11

+

+

Antocianina

Cianidina

C15H11O6

+

+

Antocianidina

Rutina (Quercetina-3-rutinósido)

C27H31O16

+

Flavonol

Quercetina-3-galactósido

C21H21O12

+

Flavonol

Quercitrina (Quercetina-3-ramnosa)

C21H21O11

+

Flavonol

Galato de equigalocatequina

C22H19O11

+

Flavanol

Antocianina

AGS: ácido graso saturado. AGI: ácido graso insaturado. MH: Hidrocarburo monoterpénico. MO: Monoterpeno oxigenado. COX: Compuesto oxigenado.

34

Scientia Chromatographica 2018; 10(1):21-38

Determinación de metabolitos secundarios en flores tropicales

Sierra LJ et al.

Tabla 6. Capacidad antioxidante y contenido total de fenoles de los extractos de flores de B. macrophylla y P. volubilis.

Muestra Thunbergia macrophyla SE Brownea macrophyla SE MSPD SFE Petrea volubilis SE MSPD SFE BHT α-Tocoferol

ORAC

ABTS+•

Folin-Ciocalteu

(µmolTrolox®/g sustancia)

(µmolTrolox®/g sustancia)

(mg ácido gálico/g sustancia)

1120

±

20

56.0

±

0.7

16

±

1.4

670 2900 40

± ± ±

6 50 7

710 1863 219

± ± ±

8 40 6

9,7 579 3,5

± ± ±

0.5 5 0.7

3500 1940 1640 460 550

± ± ± ± ±

100 47 46 9 13

1340 910 260 1800 920

± ± ± ± ±

40 47 47 149 63

26 50 13 27.2 16.9

± ± ± ± ±

2 10 2 0.2 0.2

Ciocalteu) para los extractos MSPD, SFE y SE de las flores bajo estudio. En el ensayo ORAC, se examina un mecanismo de transferencia de protón, en contraste con el ensayo de decoloración del catión-radical ABTS+•, basado en un mecanismo de transferencia de electrones.

Los polifenoles, especialmente, los flavonoides, deben su potencial antioxidante a la presencia de grupos hidroxilo que pueden transferir un hidrógeno lábil a los radicales: a mayor cantidad de grupos hidroxilo presentes en la muestra mayor será su capacidad antioxidante. Las antocianinas poseen una estructura química que puede actuar como antioxidante; pueden donar tanto electrones como protones a los radicales libres.

Los resultados muestran que el extracto hidroetanólico de flores de B. macrophyla posee más compuestos susceptibles a transferencia de electrones que de protones. La capacidad determinada para este extracto por el método ORAC fue mayor que la de las sustancias de referencia (BHT y α-tocoferol). El extracto aislado por MSPD mostró en ambos ensayos una actividad antioxidante superior a la de las sustancias de referencia.

Los valores de µmolTrolox®/g de sustancia, hallados para el extracto MSPD, fueron más altos que los del extracto hidro-etanólico, debido a que posee más compuestos de

naturaleza fenólica. Los extractos obtenidos con solvente de flores de P. volubilis presentaron los valores ORAC mucho más altos que los de los extractos obtenidos por otros métodos, y las sustancias de referencia BHT y α-tocoferol.

Los valores bajos de actividad antioxidante para los extractos SFE coinciden con la naturaleza de sus constituyentes, hidrocarburos, ácidos grasos y fitoesteroles.

4. Conclusiones

Los metabolitos secundarios de las flores tropicales estudiadas incluyen sustancias de muy baja polaridad, carentes de grupos funcionales (alcanos), hidrocarburos monoterpenos, fitoesteroles, flavonoides y antocianinas. La variedad de volatilidades, masas moleculares y grupos funcionales encontrados impone la necesidad de emplear técnicas de extracción que difieran en los principios bajo los cuales efectúan el aislamiento de estos metabolitos. Aunque la extracción hidroetanólica aisló sustancias en común con la dispersión de la matriz en fase sólida, la composición de los diversos extractos mostró que las técnicas empleadas son complementarias y no hay una que pueda sustituir a otra.

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Sierra LJ et al.

Agradecimientos

Los autores agradecen el apoyo financiero de la Vicerrectoría de Investigación y Extensión de la Universidad Industrial de Santander, del Patrimonio Autónomo Fondo Nacional de Financiamiento para la Ciencia, la Tecnología

Determinación de metabolitos secundarios en flores tropicales

y la Innovación, Francisco José de Caldas, contrato RC0572-2012 y del Programa Nacional de Fomento a la Formación de Investigadores, convocatoria 617 del año 2014, Doctorados Nacionales de COLCIENCIAS.

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Scientia Chromatographica 2018; 10(1):39-48 Instituto Internacional de Cromatografia http://dx.doi.org/10.5935/sc.2018.003 ISSN 1984-4433

HPLC

UHPLC capilar: aspectos teóricos e práticos Capillary UHPLC: theoretical and practical aspects

Marcio David Bocelli João Victor Basolli Borsatto Álvaro José dos Santos Neto* Departamento de Química e Física Molecular, Instituto de Química de São Carlos - Universidade de São Paulo, Avenida Trabalhador São-carlense, 400, CEP 13566-590, São Carlos - SP – Brasil *alvarojsn@iqsc.usp.br Recebido: 22-02-2018 Aceito: 14-03-2018

Resumo

A UHPLC capilar é uma ferramenta bastante interessante. Ela une as principais características da UHPLC e da cromatografia capilar, como capacidade de trabalhar com pequenas quantidades de amostra e analises rápidas e eficientes. Embora esta técnica apresente características interessantes, não possui um grande número de publicações, estando restrita basicamente a separações cromatográficas na área de proteômica. Essa revisão apresenta os principais aspectos práticos e teóricos sobre UHPLC capilar. Fundamentos relevantes como efeito do diâmetro da partícula, efeito do diâmetro interno da coluna, efeito da pressão, aquecimento ficcional e efeito da parede são abordados de forma sucinta. São apresentadas também abordagens históricas sobre a evolução da UHPLC e da miniaturização de colunas. As principais características da instrumentação também são abordadas.

Palavras-chave: UHPLC capilar, colunas empacotadas, aquecimento friccional, efeito de parede, colunas capilares.

Abstract

Capillary UHPLC is a very interesting tool. It combines the main characteristics of UHPLC and capillary liquid chromatography, such as the capability to work with small amounts of sample as well as rapid and efficient analysis. Although this technique presents interesting characteristics, it is not present in a large number of publications, being restricted, basically, to chromatographic separations in the area of proteomics. This review presents the main theoretical and practical aspects about capillary UHPLC. Relevant fundamentals such as particle diameter effect, column inner diameter effect, pressure effect, fictional heating and wall effect are concisely described. A historical approach is presented on the evolution of UHPLC and the columns miniaturization. The main features of instrumentation are also addressed.

Keywords: Capillary UHPLC, packed columns, frictional heating, wall effect, capillary columns.

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Marcio David Bocelli MD; Borsatto JVB; Santos Neto AJ

1. Introdução

A cromatografia líquida capilar é uma ferramenta extremamente interessante. Ela mantém as principais características da cromatografia líquida convencional (HPLC), porém utiliza vazões baixas (0,2 a 20 µl ml-1) em colunas de diâmetros internos inferiores a 0,5 mm.

A combinação desses dois fatores faz com que a escala capilar apresente vantagens em relação à cromatografia líquida convencional. O diâmetro reduzido facilita a aplicação de programação de temperatura em colunas capilares[1] e propicia o uso de vazões baixas, o que melhora o acoplamento com a espectrometria de massas com ionização por electrospray[2]. Adicionalmente, soma-se a esses fatores uma economia considerável no consumo de fase móvel, de amostras e também de fase estacionária.

Para um melhor entendimento sobre a evolução da UHPLC capilar, sugere-se a abordagem do assunto por duas perspectivas: a evolução da UHPLC convencional e a evolução da HPLC capilar.

1.1. Evolução da UHPLC convencional

Por volta de 1960, havia vários desafios para o desenvolvimento da cromatografia líquida. O principal

UHPLC capilar: aspectos teóricos e práticos

deles era a otimização do empacotamento das colunas, por meio de melhorias em três fatores: (i) síntese de uma variedade de fases estacionárias que fossem mecanicamente e termicamente estáveis; (ii) redução do diâmetro médio das partículas (e sua faixa de distribuição de tamanhos) e (iii) produção de partículas esféricas de fases estacionárias[3].

Nesta mesma década (1960), Horváth e colaboradores utilizaram partículas peliculares de diâmetro entre 40-50 μm produzidas a partir de pequenas esferas maciças de vidro revestidas por uma fina camada porosa de fase estacionária. Essas partículas peliculares permitiam uma rápida transferência de massa e uma considerável melhoria nas separações, embora possuíssem baixa capacidade de carga de analito[4].

Em 1970 foram produzidas e utilizadas partículas totalmente porosas com diâmetros em torno de 10 μm.

A redução do diâmetro das partículas permitiu um empacotamento mais denso, o que melhorou o leito cromatográfico[3]. Esse tipo de partícula (totalmente porosa) é um dos principais tipos de partículas utilizadas em HPLC atualmente, dividindo o espaço com partículas superficialmente porosas, estas mais recentes[5-7] (Figura 1).

Figura 1. Representação de partículas peliculares, totalmente porosas e parcialmente porosas. A região em verde representa a camada na qual os analitos podem particionar e a região branca representa a conta de vidro utilizada em partículas peliculares e o núcleo sólido (sílica fundida) para as partículas superficialmente porosas.

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Figura 2. Evolução da eficiência (A) e diâmetro de partículas (B) com o passar dos anos. Fonte: Construída a partir de dados disponíveis em [9].

Na década de 1980, popularizou-se o uso de partículas com uma faixa de diâmetros em torno de 5 μm. Essas partículas apresentavam um estrutura esférica mais aprimorada e uma faixa de distribuição de tamanho mais estreita em comparação às partículas da década anterior[8]. Nos anos 1990, essas partículas evoluíram ainda mais e partículas de diâmetros de 3 a 3,5 μm começaram a ser utilizadas (Figura 2).

A evolução das partículas usadas como fase estacionária continuou[9]. Nos anos 2000 já havia colunas cromatográficas com partículas de diâmetro médio de 2,5 μm disponíveis comercialmente (Figura 3).

Finalmente, em 2004, a Waters Corporation® produziu partículas de diâmetro médio de 1,7 μm, introduzindo assim uma nova classe de partículas: as partículas sub2 μm[10]. Atualmente, fabricantes comercializam colunas com partículas de até 1,3 µm.

Embora reduzir o diâmetro das partículas possa implicar em ganho na eficiência, também resulta na elevação da pressão necessária para que a fase móvel percole a coluna. Segundo a Lei de Darcy (Equação 1), a queda de pressão (ΔP) na coluna é inversamente

Figura 3. Curvas de van Deemter para partículas de 10, 5 e 2,5 µm.

FONTE: Adaptado com permissão de Analytical Chemistry, 77 [23], 2005, Mazzeo JR, D.Neue U, Kele M, Plumb RS. Advancing LC performance with smaller particles and higher pressure.460A 467A.

proporcional ao quadrado do diâmetro da partícula porosa. µ é a velocidade linear da fase móvel, L é o comprimento da coluna, ɳ é a viscosidade, ø é a resistência ao fluxo e dp é o diâmetro da partícula[9]. µ Lηø ∆P = 100 d 2p

(1)

Para lidar com a exigência de pressões mais altas e permitir explorar todo o potencial que as partículas sub-2 μm propiciaram, foram desenvolvidos os cromatógrafos

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líquidos a pressão ultra alta - UHPLCs (Ultra High Pressure Liquid Chromatography); também nomeados em português como cromatógrafos líquidos de ultra eficiência (CLUE). A empresa Waters® desenvolveu e lançou no mercado o primeiro cromatógrafo comercial (série Acquity) capaz de operar a pressões na ordem de 1000 bar, sob a sigla patenteada de UPLC (Ultra Pressure Liquid Chromatography). Atualmente, alguns fabricantes produzem equipamentos equivalentes à mesma finalidade, porém, poucos destes, com versões de instrumentação miniaturizadas para UHPLC capilar.

Como havia muitos cromatógrafos convencionais sendo utilizados no mundo todo e o custo de um aparelho de UHPLC era (e ainda é) elevado, as concorrentes da Waters bem como essa própria empresa desenvolveram partículas core shell de diâmetro sub-3 μm. Essas partículas superficialmente porosas apresentaram a propriedade de possuir menor resistência à transferência de massa, menor faixa de variação nos diâmetros e maior uniformidade. Portanto, apesar de não apresentarem eficiências superiores ou até mesmo idênticas àquelas das partículas sub-2 μm totalmente porosas; essas partículas core shell possuíam eficiência quase equiparável à elas, mesmo quando em uso em um cromatógrafo adequado a pressões convencionais (400 a 600 bar), desde que devidamente otimizado para baixa dispersão extracoluna da banda cromatográfica[11].

1.2. Evolução das colunas capilares

Apesar de colunas capilares para cromatografia líquida serem foco de estudos desde a década de 60. A miniaturização de sistemas cromatográficos começou a ganhar relevância a partir da década de 90, em especial pela necessidade de atender à demanda farmacêuticobioquímica, que possuía quantidade limitada de amostras[12]. Além disso, um sistema de cromatografia capilar utiliza quantidades bem menores de fase móvel comparativamente ao sistema convencional. Do mesmo modo, para a confecção de uma coluna capilar a quantidade de fase estacionária utilizada é bem menor que para uma coluna convencional. Um cromatógrafo 42

UHPLC capilar: aspectos teóricos e práticos

capilar usualmente opera com um volume de apenas 50 nL de amostras, enquanto um cromatógrafo líquido convencional opera com cerca de 10 a 400 vezes mais amostra (500 nL a 20 µL). A diferença no consumo de fase móvel também é muito grande, enquanto um cromatógrafo capilar trabalhando a 10 µL min-1 consome apenas cerca de 1,25 L ao ano (operando 8h/dia e 5 dias/ semana), um cromatógrafo convencional operando com uma vazão de 0,5 ml min-1 consome mais de 62 L ao ano.

Apesar do crescente interesse pela área, o conceito de miniaturização teve seu início atribuído a Golay em 1958, o qual estudou os efeitos da diminuição do diâmetro das colunas utilizadas em GC (Gas Chromatography)[13]. Já para cromatografia líquida, os estudos da diminuição do diâmetro interno da coluna se iniciaram com Horváth e colaboradores em 1967, que estudaram e compararam a eficiência de colunas tubulares abertas e colunas empacotadas de 0,3 e 1,0 mm de diâmetro. Quase 10 anos mais tarde, em 1973, Ishii e colaboradores utilizaram colunas empacotadas com partículas de politetrafluoretileno de 30 µm e com diâmetro interno de 0,5 mm[14].

Na década de 80 em diante, diversos estudos utilizando colunas empacotadas, monolíticas e tubulares abertas foram realizados. O desenvolvimento de colunas miniaturizadas, assim como da instrumentação necessária para sua utilização é alvo de intenso estudo nos dias de hoje[12].

Diversos autores classificaram as colunas de cromatografia líquida de forma diferente[15]; uma das mais conhecidas é a classificação apresentada por Saito[16], representada pela Figura 4.

A tecnologia de produção de colunas capilares empacotadas evoluiu tanto para colunas produzidas em laboratório, quanto para comerciais[5,6,17]. Partículas de diâmetros equivalentes a UHPLC (<2 µm) passaram a ser utilizadas em colunas capilares, elevando a eficiência dos sistemas capilares e fazendo necessário o desenvolvimento de cromatógrafos líquidos capilares aptos a trabalharem na faixa de ultra pressão (UHPLC).

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de bombas desenvolvidas para essa finalidade são as bombas de pistões e as bombas tipo seringa.

As bombas de pistões são similares às utilizadas em UHPLCs (e HPLCs) convencionais. Elas possuem, em geral, um par de pistões que trabalham alternadamente empurrando a fase móvel em direção à coluna. Estas bombas podem ser de pistões reciprocantes em série ou em paralelo. Este tipo de sistema permite a operação em modos gradiente e isocrático, sendo o tipo de bomba mais comum tanto em sistemas convencionais quanto em capilares[19].

Figura 4. Ilustração em escala (ampliações de 1, 5 e 20 vezes) dos diferentes diâmetros de colunas disponíveis para LC. O círculo externo representa o maior diâmetro dessa categoria e o círculo interno as de menor diâmetro. Elaborada a partir de dados disponíveis em [16].

As bombas do tipo seringa são menos comuns, porém também integram alguns modelos de equipamentos comerciais. Produzidas de forma semelhante a uma seringa, a fase móvel é empurrada por um êmbolo para a coluna. Este tipo de sistema não permite a utilização de modo gradiente, a menos que duas seringas sejam posicionadas em paralelo. Adicionalmente, outro limitante para este tipo de bomba está na necessidade de interrupção da sequência de análises para a recarga do dispositivo[1].

2. Instrumentação

2.2. Injetores

É desejável que a instrumentação para cromatografia líquida capilar apresente alta robustez, porém, que seja capaz de trabalhar eficientemente com volumes muito baixos nos sistemas de bombeamento, injeção e, principalmente, nas tubulações e detectores, para evitar alargamento extracoluna da banda cromatográfica[18]. A instrumentação para cromatografia líquida capilar está descrita na literatura[19], sendo aqui apresentada de forma sucinta.

2.1. Sistemas de bombeamento Um sistema de bombeamento para uso em UHPLC capilar deve possuir a capacidade de atingir altas pressões, bombear pequenos volumes, gerar o mínimo de pulso possível e, preferencialmente, ter capacidade de operar gradientes de eluição. Os dois principais tipos

Os sistemas de injeção de amostras são um ponto crucial em um sistema miniaturizado. Ele deve ser resistente a altas pressões e capaz de injetar o volume exato, fator ainda mais importante na escala capilar.

Válvulas associadas a alças de amostragem (loop) para injeção são os dispositivos padrões para a introdução de amostras em cromatografia líquida.

Geralmente elas empregam um rotor que desliza dentro de um estator circundante. O rotor fornece caminhos que se alinham com as portas do estator. É necessária uma vedação eficiente, que não permita vazamentos entre o rotor e o estator. Para isso, geralmente são utilizados polímeros de alta resistência. O principal desafio para a injeção em UHPLC capilar é a obtenção de sistemas que injetem na ordem de nanolitros (<50 a 1000 nl) de forma exata e precisa, garantindo boas figuras de mérito para as análises.

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2.3. Detectores

Os detectores usados em HPLC capilar são similares aos que são utilizados em escala convencional, porém, ajustados para vazões reduzidas, para que não haja perda na detectabilidade e alargamento de banda.

Detectores UV-Vis necessitam de uma redução no volume da cela de detecção, uma vez que o volume de fase móvel é muito pequeno. Em escala nano, existem celas com menos de 10 nL de volume; em escala capilar, na ordem de 50 nL; enquanto, em escala micro existem celas na ordem de 200 nL de volume.

A espectrometria de massas (MS – Mass Spectrometry) é um dos principais sistemas de detecção da atualidade e funciona muito bem com a UHPLC capilar. A cromatografia em escala capilar utiliza pequenos volumes na saída da coluna, o que é ideal para o sistema de ESI (electrospray ionization) do MS. A eficiência da ionização aumenta consideravelmente quando a vazão é reduzida, de forma que esse tipo de ionização é extremamente atraente para o acoplamento de UHPLC capilar-ESI-MS[2]. Na atualidade, existem diversas interfaces comerciais e de diferentes fabricantes apropriadas para operar nas vazões típicas dessa escala, com o máximo de eficiência e robustez.

3. Fundamentos

O alargamento de banda em colunas empacotadas para cromatografia gasosa foi estudado na década de 50 principalmente por van Deemter. Suas considerações permanecem válidas para cromatografia líquida, seja na escala convencional ou capilar. Van Deemter correlacionou o alargamento de banda com a altura do prato, ou seja; quanto menor o alargamento de banda, menor será a altura do prato da coluna e, por consequência, quanto menor o prato, maior a eficiência de uma coluna.

A equação de van Deemter (Equação 2) é dividida em três termos, sendo estes: o efeito dos múltiplos caminhos (A), a difusão longitudinal (B) e a resistência à transferência de massa (C). O efeito de múltiplos caminhos, termo A, é subdividido em cinco fatores: a 44

UHPLC capilar: aspectos teóricos e práticos

difusão intracoluna, (ocorre entre as paredes da coluna), a difusão intrapartícula, (ocorre dentro dos poros da partícula), a difusão intracanal (ocorre no interstício entre as partículas), e as difusões intercanais de curta e longa distância (ocorrem devido a heterogeneidade do empacotamento).

O termo B, a difusão longitudinal, representa o espalhamento longitudinal dos analitos na fase móvel.

Esse termo é estritamente dependente da viscosidade da fase móvel e, em geral, é mínimo para a cromatografia líquida, tendo contribuição considerável apenas em vazões muito reduzidas. Já o termo C é relativo à transferência de massa, ou seja, à resistência à movimentação dos analitos entre a fase móvel e a fase estacionária.

H =A +

B

µ

+ C µ (2)

3.1. Influência do diâmetro das partículas

A redução do diâmetro de partículas melhora significativamente a eficiência de uma coluna (Figura 5).

A Equação 3, uma aproximação da equação de van Deemter, mostra que a altura do prato é diretamente proporcional ao diâmetro da partícula[20]. d p 2D d 2p µ H= + m+ 2 µ 5Dm

(3)

Figura 5. Altura do prato para partículas de vários diâmetros.

FONTE: Adaptado com permissão de Journal of Separation Science 29 [12], 2006. Nguyen DT-T, Guillarme D, Rudaz S, Veuthey J-L. Fast analysis in liquid chromatography using small particle size and high pressure. J 1836–1848. Copyright (2008), com permissão de John Wiley and Sons.

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UHPLC capilar: aspectos teóricos e práticos

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3.2. Influência do diâmetro das colunas

Embora seja um assunto controverso, diversos trabalhos demonstraram a dependência da eficiência com o diâmetro interno da coluna[17,21,22]. Patel e colaboradores avaliaram a redução do diâmetro da coluna de 150 para 10 µm[23]. Em seus resultados é nítido que reduzir o diâmetro interno da coluna empacotada reduz diretamente a altura do prato (Figura 6).

Figura 6. Diminuição da altura do prato de uma coluna obtida pela redução do diâmetro da coluna. FONTE: Adaptado com permissão de Analytical Chemistry, 76 (19), 2004, Patel KD, Jerkovich AD, Link JC, Jorgenson JW. In-depth characterization of slurry packed capillary columns with 1.0-μm nonporous particles using reversed-phase isocratic ultrahigh-pressure liquid chromatography 5777‑5786 de [23].

3.3. Influência da pressão

Em condições ordinárias para a cromatografia líquida convencional, o efeito da pressão no fator de retenção é considerado desprezível ou inexistente. Por outro lado, Fallas e colaboradores demonstram que alterações (grandes) na pressão afetam o fator de retenção[24]. Em fase reversa, compostos ionizados apresentaram maior aumento no fator de retenção conforme a pressão é elevada, em comparação a compostos neutros (Figura 7). O oposto foi observado para HILIC, na qual bases ionizadas apresentaram uma redução no fator de retenção com o aumento da pressão. Isto foi atribuído à hipótese de que a variação na retenção se deve a uma redução no volume molar do soluto à medida que ele se transfere da fase móvel para a fase estacionária; e que isso poderia ser causado pela perda da camada de hidratação de soluto quando entra na rede hidrofóbica de cadeias da fase estacionária[25].

Figura 7. Cromatogramas de uma mistura de compostos neutros e básicos obtidos em diferentes pressões médias de coluna: 43 bar (A) e 739 bar (B) obtidas sem e com um capilar de restrição de 25 cm, respectivamente. Picos: 1, tioureia; 2, propranolol; 3, difenidramina; 4, acetofenona; 5, protriptilina; e 6, nitrobenzeno. FONTE: Republicado com permissão de Journal of Chromatography A, 1209(1–2), Fallas MM, Neue UD, Hadley MR, McCalley D V. Investigation of the effect of pressure on retention of small molecules using reversed-phase ultrahigh-pressure liquid chromatography, 195–205. Copyright (2008), com permissão de Elsevier.

3.4. Aquecimento friccional e efeito de parede

Quando a fase móvel passa através de um leito empacotado, ocorre atrito e uma pequena quantidade de energia térmica é gerada. Esse aquecimento é pouco significativo quando em pressões convencionais (<400 bar). Entretanto, quando partículas sub-2 μm são usadas faz-se necessário o uso de pressões ultraelevadas.

O atrito entre as fases móvel e estacionária libera energia térmica, aumentando a temperatura na coluna[26,27]. A energia térmica gerada na coluna causa um gradiente de temperatura (Figura 8). Esse gradiente de temperatura ocorre de duas maneiras diferentes. O aquecimento radial faz com que o centro da coluna fique mais quente que a região mais próxima das paredes da coluna, alterando a viscosidade da fase móvel e, por consequência, o fator de retenção dos analitos nessas diferentes regiões, causando alargamento de banda. Outra forma de aquecimento ocorre longitudinalmente, ou seja, a energia é acumulada ao longo da coluna, de forma que as porções finais da

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UHPLC capilar: aspectos teóricos e práticos

Tabela 1. Colunas de diferentes diâmetros, com L = 25 cm e empacotadas com partículas de 1 μm e P = 2000 bar. FONTE: Construído com dados de [8].

Figura 8. Formação de gradiente de temperatura axial (A) e radial (B) na coluna cromatográfica. FONTE: Adaptado com autorização de Journal of Chromatography A 1216(9), 2009, Gritti F, Guiochon G. Optimization of the thermal environment of columns packed with very fine particles, 1353–1362. Copyright (2009), com permissão de Elsevier.

coluna, mais próximas à sua saída, estejam mais quentes do que aquelas situadas próximas à sua entrada.

Esse calor gerado (Tabela 1) pelo atrito da fase móvel com o leito cromatográfico, também conhecido como frictional heating, é mais bem dissipado tanto quanto menor for o diâmetro da coluna. Consequentemente, o alargamento de banda devido a esse efeito é minimizado em colunas com diâmetros pequenos, como em capilares[8].

Colunas capilares também minimizam o alargamento de banda devido ao efeito de parede (wall effect). Apesar de todas as causas desse efeito não serem ainda inteiramente esclarecidas, observa-se que há uma tendência de as partículas menores se disporem mais perto da parede da coluna; fazendo com que o centro do leito cromatográfico abrigue partículas maiores. Dessa forma, a região próxima à parede da coluna terá uma velocidade de difusão do analito diferente da velocidade de difusão no centro do leito cromatográfico, causando assim um alargamento de banda. Diminuindo o diâmetro da coluna, essa discrepância entre as regiões é suavizada e consequentemente o alargamento é reduzido[28,29].

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Classificação

Diâmetro interno da coluna

Vazão

HPLC convencional

4,6 mm

820 μL/min

Micro LC

1,0 mm

38 μL/min

LC Capilar

0,3 mm

3,5 μL/min

LC capilar/Nano LC

0,1 mm

0,380 μL/min

Nano LC

0,05 mm

0,096 μL/min

4. Conclusão

A UHPLC capilar é uma ferramenta podero­ síssima para análises, pois mantém as principais vantagens da UHPLC convencional; como o tempo curto de análise e a elevada eficiência que pode ser obtida otimizando-se os parâmetros cromatográficos.

Porém, tem como virtude adicional a capacidade de trabalhar com quantidades muito pequenas de amostra e volumes de fases móveis bem reduzidos.

Embora apresente grande potencial, esta técnica ainda apresenta pouco uso em pesquisas aplicadas. Em várias situações ela também apresenta grande sensibilidade, além de ser bastante vantajosa para o acoplamento com a ESI-MS. Embora bastante vantajosa nos aspectos práticos, a cromatografia líquida capilar em pressões ultraelevadas tem como maior limitação o custo elevado de sua instrumentação; visto que é necessário o uso de equipamentos com elevada resistência mecânica e robustez, além de ser capaz de trabalhar com volumes pequenos; sendo este o principal fator limitante. Além disso, o usuário também deve estar mais familiarizado ao uso desse tipo de sistema, pois a escala miniaturizada pode ter alguns componentes mais delicados, além de exigir atenção para que se evitem situações de alargamento de banda extracoluna e vazamentos de fase móvel (este último mais difícil de ser detectado em situações de escala reduzida).

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UHPLC capilar: aspectos teóricos e práticos

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Scientia Chromatographica 2018; 10(1):49-69 Instituto Internacional de Cromatografia ISSN 1984-4433

EVENTS 2018

2018 Events on chromatography and related techniques Eventos na área de cromatografia e relacionadas em 2018

The Board of Editors together with the Scientia Chromatographica staff has selected a list of special events to be done during 2018 in the chromatography and related areas. A short description of each event was compiled directly from either the event website or from their promotion brochures. The information was made available to our readers in order to promote the event as well as well as to make it easier to our colleagues have the first information about the international meetings in their area of interest. The website address as well as the contact to obtain further information about the events were also included.

O Corpo Editorial do Scientia Chromatographica selecionou uma relação especial de eventos a serem realizados no ano de 2018 na área de cromatografia e técnicas relacionadas. Uma pequena descrição de cada evento foi compilada diretamente do website dos eventos e/ou de brochuras de divulgação dos mesmos, e disponibilizados como primeira fonte de informação.

Para sua conveniência, incluimos em cada anúncio o endereço do website e o contato para obtenção de mais detalhes a respeito do evento de seu interesse.

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2018 Events on chromatography and related techniques

42nd International Symposium on Capillary Chromatography (ISCC) & 15th GCxGC Symposium May 13 - 18, 2018, Riva del Garda, Italy The 42nd International Symposium on Capillary Chromatography (ISCC), the premier meeting for pressure and electrodriven microcolumn separations and related techniques, will be held May 13 - 18, 2018 in the Congress Centre, Riva del Garda, Italy.

The program will include plenary lectures, keynote lectures by young scientists, prominently featured poster presentations, an instrument exhibition displaying the latest instrumental innovations, and a highly attractive social program offering opportunities to meet with world-renown scientists.

The 15th GCxGC Symposium will be organized jointly with the ISCC meeting to allow scientists to attend both meetings. The symposium will start with a short course on Sunday May 13 covering the fundamentals and applications of comprehensive GCxGC and with a plenary session on Monday May 14. Key-note lectures and posters will be included in the program of the ISCC meeting.

Website: http://iscc42.chromaleont.it/slider.html Contact: lmondello@unime.it

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2018 Events on chromatography and related techniques

The Editors

66th ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics June 3-7, 2018, San Diego, CA, USA The conference program is coordinated by Richard A. Yost (VP Programs), University of Florida. The schedule begins on Sunday, June 3 with tutorial lectures at 5:00 pm and the opening session and plenary lecture at 6:45 pm followed by a Welcome Reception in the poster/exhibit hall. The program concludes on Thursday, June 7 with a plenary lecture followed by a Closing Event aboard the USS Midway (ticket required).

Website: http://www.asms.org/conferences/annual-conference Contact: info@asms.org

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2018 Events on chromatography and related techniques

10th SPEC Conference 10-15 June, 2018 Glasgow, UK SPEC2018Â will bring together clinicians and scientists, both industrial and academic, developing novel clinical spectroscopic instrumentation and techniques to improve world health and patient outcome. Recent advances in the biological sciences have led to an increasing demand for rapid, objective, real time and minimally invasive chemical techniques to deliver information suitable for the clinic.

This the 10th conference in the SPEC series provides an ideal opportunity for reflection on developments over the last two decades and to focus on future developments. As such there will be significant focus in the scientific programme on the development of future scientists to lead this exciting multidisciplinary field.

Website: http://spec2018.com/ Contact: spec2018@conferencepartners.com

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2018 Events on chromatography and related techniques

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ACHEMA 2018 - World Forum and Leading Show for the Process Industries 11-15 June 2018, Frankfurt am Main, Germany ACHEMA is a world forum for chemical engineering and the process industry. It became an innovationsâ&#x20AC;&#x2122; platform and technology summit as well as a trend-setting meeting point and take-off for investment decisions. Every 3 years it is an important international network of experts and executives, attracting more than 3.000 exhibitors from over 40 countries around the world.

Website: https://www.achema.de/en/ Contact: visitor@alchema.de

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2018 Events on chromatography and related techniques

ISEAC-40: 40th International Conference on Environmental and Food Monitoring 19-22 June, 2018, Santiago de Compostela Spain The 40th International Conference on Environmental & Food Monitoring is organized by the Institute for Food Analysis and Research (IIAA) of the University of Santiago de Compostela (USC), the University of Zaragoza (UNIZAR) and the International Association of Environmental Analytical Chemistry (IAEAC). It will take place in Santiago de Compostela (Spain) in June 2018.

Since 1971 the IAEAC created a forum where analytical chemists might contribute to the recent “environmental revolution” with a worldwide impact. This event is the International Symposium on Environmental Analytical Chemistry (ISEAC). Later, in 2014 Food Analytics became integrated in ISEAC. The central subject of the ISEAC-40 conference is the innovative use of analytical methods for the investigation of environmental and food relevant questions.

Website: https://www.iseac40.es Contact: info@iseac40.es

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2018 Events on chromatography and related techniques

The Editors

17th Chemometrics in Analytical Chemistry Conference June 25-29, 2018, Halifax, Canada The 17th Chemometrics in Analytical Chemistry Conference will be held in Halifax, Canada, June 25-29, 2018.

CAC-2018 will bring together leading researchers from around the world specializing in the extraction of information from chemical measurements in diverse application areas. A wide selection of short courses will also be available.

The conference will bring together leading international researchers to discuss the latest developments in methods to extract information from chemical measurements. The conference will feature both oral and poster sessions, as well as pre-conference courses.

Website: https://www.cac2018halifax.com Contact: cacconf@dal.ca

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2018 Events on chromatography and related techniques

20th International Symposium on Advances in Extraction Technologies (Extech 2018) Iowa State University, Ames, USA, June 19-22, 2018 Donâ&#x20AC;&#x2122;t miss out on your opportunity to learn about the advancements in extraction and separation technologies!

The following confirmed speakers will be taking part in the Symposium. Please check our website for the addition of more speakers.

Website: https://register.extension.iastate.edu/extech Contact: extech2018@iastate.edu

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2018 Events on chromatography and related techniques

The Editors

Copenhagen Symposium on Separation Sciences June 26-27, 2018, Copenhagen, Denmark There is a long-standing tradition for research and development of separation techniques and methods at the University of Copenhagen, and their application in different aspects within the life sciences, in particular also the pharmaceutical sciences. The motivation of this symposium is to bring together researchers from academia and industry as well as users of modern separation techniques, and provide a forum for discussions on challenges and benefits, exchange of ideas and experiences, and exploration of possible collaborations.

The symposium will showcase invited talks by leading scientists, featuring both “old tigers” and “young lions”, thus providing perspective, fundamentals, insight and glimpses of how the field of separation sciences is developing.

There will also be a poster session with submitted contributions, as well as a symposium dinner.

Website: https://cphsss.org/ Contact: jorg.kutter@sund.ku.dk

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The Editors

2018 Events on chromatography and related techniques

4th International Nanotech & Nanoscience Conference & Exhibition June 27-29, 2018, Paris, France Nanotech France 2018, the 4th edition of the international conference and exhibition, brings together leading scientists, researchers, engineers, practitioners, technology developers and policy makers in nanotechnology to exchange information on their latest research progress and innovation.

Participants from the top international academic, government and private industry labs of different disciplines participate in Nanotech France 2018 to identify new technology trends, development tools, product opportunities, R&D collaborations, and commercialization partners. It is an event for students to meet and discuss with lead researchers. The conference provides an opportunity to discover innovation in the area of nanotechnology and new business opportunities.

The conference covers all frontier topics in nanotechnology. The conference includes plenary lectures, Keynote lectures and invited talks by eminent personalities from around the world in addition to contributed papers both oral and poster presentations.

Website: https://www.setcor.org/conferences/Nanotech-France-2018 Contact: Jim.Hill@unisa.edu.au

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2018 Events on chromatography and related techniques

The Editors

International Symposium, Exhibit & Workshops on Preparative and Process Chromatography (PREP 2018) July 8-11, 2018, Baltimore, USA Four days of exciting science, technology, and education at PREP 2018, the longest running, most recognized international scientific conference and exposition driving the field of Preparative and Process Chromatography, organized by expert scientists and engineers for the separation science practitioner. Join us for a dynamic and innovative program where world renowed speakers will address in-depth the latest scientific and technological advances, critical and emerging applications and processes, and challenges and solutions in all aspects of Preparative and Process Chromatography.

The focus of this conference is the development, design, optimization, and operation of chromatographic processes and technology for a broad range of applications.

Website: http://www.prepsymposium.org/index.html Contact: janet@barrconferences.com

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The Editors

2018 Events on chromatography and related techniques

47th International Symposium on High Performance Liquid Phase Separations and Related Techniques HPLC 2018 July 29-August 2, 2018, Washington, D.C., USA HPLC 2018 provides an unparalleled opportunity for one-stop shopping at the cutting edge of separation-based analysis. You will find the worldâ&#x20AC;&#x2122;s leading experts who will deliver presentations on cutting-edge research on emerging technologies and discuss novel solutions to important problems in pharmaceutical, environmental, and industrial research and development. Vendor workshops and a series of short courses and tutorials will provide outstanding opportunities for newcomers to obtain a solid foundation in the field and veterans to update their knowledge on the latest technology and approaches. The major exposition will showcase new product launches and innovative products, and will provide opportunities to discuss challenges and solutions with experts in the booths. The social program will facilitate networking with colleagues from around the world and across a diverse range of industries, government laboratories, universities, and research institutes.

Website: http://www.hplc2018.org/ Contact: janet@barrconferences.com

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2018 Events on chromatography and related techniques

The Editors

XXII International Mass Spectrometry Conference August 26-31, 2018, Florence, Italy After 42 years, the city of Florence, one of the most beautiful cities in the world, is ready to host the 22nd edition of IMSC which will be the occasion to celebrate the 60th anniversary of this conference. The IMSC2018 venue is the historic “Fortezza da Basso”, a masterpiece of Renaissance military architecture, built in 1534-1537, fully restored and located downtown, a few steps away from many hotels and all the attractions (museums, theatres, monuments, etc) of the city.

As all the previous editions, IMSC 2018 will cover all aspects of mass spectrometry, from fundamentals to instrumentation and applications. The conference is organized with short courses, tutorial lectures, oral and poster sessions, workshops, awards, commercial exhibition, social program (including a welcome mixer, the social dinner in an exclusive place, and a program for accompanying persons), and companies user meetings. All of them will be defined shortly.

Website: http://www.imsc2018.it/ Contact: info@imsc2018.it

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The Editors

2018 Events on chromatography and related techniques

32nd International Symposium on Chromatography (ISC 2018) September 23-27, 2018, Cannes-Mandelieu, France The ISC series had been organized since its beginning in 1956 by three societies involved in separation sciences (in UK, Germany and France). Symposium of the ISC series should be organized every two years (even years) all over Europe. Since 2014, the three countries decided to devolve responsibility for the organization of the ISC series to a Permanent Scientific Committee (ISC-PSC) and its members are part of the scientific committee of each series.

Symposia in the series should take place normally during September / October on even years alternately with the HPLC series in which symposia are staged in Europe on odd years. It may be organized individually, by groups of individuals or by European National Societies (or groups thereof) involved in separation sciences.

The ISC-PSC is composed of seven members, each of whom can serve for a maximum of seven years, with a reasonable international standing as a separation scientist.

Website: http://isc2018.fr/history-of-isc/ Contact: info@isc2018.fr

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2018 Events on chromatography and related techniques

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15th Symposium on the Practical Applications of Mass Spectrometry in the Biotechnology Industry September 9-12, 2018, San Francisco, USA The focus of this Symposium is the application of mass spectrometry (MS) for product characterization, process monitoring, formulation development and release testing in the pharmaceutical industry. Since mass spectrometry is used routinely for a wide array of applications, the meeting will provide scientists in the industry an opportunity to share their data and learn from their colleagues. Although most of the applications may deal with biopharmaceuticals, applications for conventional pharmaceuticals will also be discussed. The Symposium will be held over a period of two and a half days and cover case studies and workshops (industrial, vendor and regulatory) devoted to practical concerns in the use of MS within the biotechnology and pharmaceutical industries.

Website: https://www.casss.org/page/MS1801 Contact: rolson@casss.org

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The Editors

2018 Events on chromatography and related techniques

CE in the Biotechnology & Pharmaceutical Industries: 20th Symposium on the Practical Applications for the Analysis of Proteins, Nucleotides & Small Molecules September 9-12, 2018, San Francisco, USA The goal of this Symposium is to provide a forum for the discussion of recent developments in CE analysis of protein, nucleotide and small molecule pharmaceuticals. The presentations and workshops will be devoted completely to practical concerns to strengthen the use of CE within the biotechnology and pharmaceutical industries. Applications will highlight uses of CE in various areas of product development including high throughput screening, formulation studies, process development, product characterization and validated lot release and stability testing.

Website: https://www.casss.org/page/CE1800 Contact: rolson@casss.org

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2018 Events on chromatography and related techniques

The Editors

1st International Conference on Ion Analysis September 9-13, 2018, Berlin, Germany ICIA 2018 will tie in with the concept of its forerunner (i.e. Conference on Ion Analysis, CIA) that has established as a unique platform for the meeting of scientists from universities, research centers, industry and governmental institutions with companies that produce and distribute products related to ion analysis in its widest sense. In contrast to the format of CIA which was mainly addressed to a German speaking auditorium with participation of international, English speaking, invited lecturers, ICIA 2018 will be a truly international event in any respect.

ICIA 2018 will cover all aspects of ion analysis with regard to the variety of methods, instrumental configurations and areas of application. The conference programme will be arranged with invited keynote lectures and special sessions in order to present most recent developments, to review and critically discuss analytical methodologies for ion analysis and to draw attention to practical problems and their solutions.

The Organizing Committee expects the attendance of many manufacturers of ion analysis instrumentation and supplementary equipment.

Website: https://www.icia-conference.net/ Contact: wolfgang.frenzel(at)tu-berlin.de

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The Editors

2018 Events on chromatography and related techniques

39th BMSS Annual Meeting and Exhibition 2018 11-13 September, 2018, Cambridge, UK The major scientific themes of BMSS39 will focus on the life sciences and (bio)pharma. The scientific program on Wednesday 12th September is being organised in collaboration with the Joint Pharmaceutical Analysis Group (JPAG). The University of Cambridge is the anchor point of the largest life science and (bio)pharma cluster in Europeâ&#x20AC;Ś fertile ground for mass spectrometry ! There are Ca 350 companies within a 20 mile radius of the city centre, of which 20% are in frontline therapeutic development and 80% in the associated supply chain.

Website: http://www.bmss.org.uk/bmss2018/bmss2018.shtml Contact: bmssadmin@btinternet.com

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2018 Events on chromatography and related techniques

The Editors

Supercritical Fluid Chromatography 2018 (SFC 2018) October 17-19, 2018, Strasbourg, France Join your friends and colleagues at SFC 2018, October 17-19th, 2018, conveniently located in Strasbourg, France, at the center of Europe. Mingle with world-renowned leaders in supercritical fluid technologies and learn about the latest advances in SFC and SFE. The conference will begin with a short course on SFC and SFE, followed by two full days of lectures, posters, vendor exhibits, discussion sessions, and social gatherings.

The world of SFC has grown to include application areas unimaginable just a decade ago â&#x20AC;&#x201C; encompassing polar and nonpolar mixtures of importance in widely disparate application areas: from pharmaceuticals to energy production, from nutrition to industrial chemicals, from flavor and fragrances to polymers, and much, much more.

Website: http://www.greenchemistrygroup.org/call-for-abstracts Contact: register@greenchemistrygroup.org

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The Editors

2018 Events on chromatography and related techniques

Lab Innovations 2018 October 31-November 1, 2018, Birmingham, UK Lab Innovations is the UK’s only trade exhibition dedicated to the laboratory industry and attracts laboratory professionals who are looking for the latest innovations and services. It is the nation’s largest gathering of laboratory manufacturers and suppliers, making it an important event for powering the business of Science. Supported by some of the UK’s top science institutions it has fast become the event to attend for the laboratory industry.

Website: https://www.easyfairs.com/lab-innovations-2018/lab-innovations-2018/ Contact: alison.willis@easyfairs.com

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Scientia Chromatographica 2018; 10(1):49-69

2018 Events on chromatography and related techniques

The Editors

35th International Symposium on Microscale Separations and Bioanalysis (MSB 2019) March 25-28, 2019, Corvallis Oregon, USA The 35th International Symposium on Microscale Separations and Bioanalysis (MSB 2019) will be held on March 25-28, 2019 at Oregon State University in Corvallis Oregon. Corvallis is a beautiful college town in the heart of the Willamette Valley just one hourâ&#x20AC;&#x2122;s drive from the Pacific coast in northwestern USA. MSB 2019 promises an intimate meeting format to discuss cutting-edge research at the frontiers of separation science, ranging from fundamental theory/method/technology development to applications that impact health, medicine, food, the environment and beyond.

MSB 2019 centers on science and people by creating an interactive, yet confidential, ambience that ensures dynamic exchange between delegates.

Website: https://msb2019.org/about-msb/ Contact: vincent.remcho@oregonstate.edu / karen.waldron@umontreal.ca

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Scientia Chromatographica 2018; 10(1) Instituto Internacional de Cromatografia ISSN 1984-4433

INSTITUTO INTERNACIONAL DE CROMATOGRAFIA

O Instituto Internacional de Cromatografia (IIC) possui como uma de suas principais missões o oferecimento de cursos de curta duração nas áreas de cromatografia e técnicas relacionadas.

Os objetivos dos cursos do IIC são o aprimoramento/formação/ atualização dos usuários das técnicas cromatográficas e afim (Preparo de Amostras, Espectrometria de Massas, Gestão da Qualidade, dentre outras), tanto do ponto de vista teórico quanto prático.

A filosofia educacional do IIC é: “ao invés de ensinar apenas como operar um equipamento específico (dar o peixe) o IIC ensina a técnica (como pescar)”.

Os cursos do Instituto Internacional de Cromatografia são coordenados pelos Diretores do IIC, e ministrados pelos coordenadores, auxiliados por uma equipe técnica e científica altamente qualificada, constituída de docentes pósgraduados nos melhores centros do país na área, e pós‑graduandos em fase de conclusão de suas teses. Na época em que cada curso for oferecido, uma relação dos instrutores é disponibilizada no website do IIC. O programa detalhado de cada curso pode ser obtido através de contacto com o IIC. Os cursos são ministrados com auxílio de recursos audiovisuais modernos (datashow‑computador; vídeos, demonstrações, resolução de problemas e outros recursos instrucionais). Os alunos recebem um livreto contendo cópia de todos os slides apresentados pelos instrutores, além de material bibliográfico de apoio. Em vários cursos também são fornecidos livros de autoria dos próprios docentes dos cursos. A maior parte dos cursos também tem aulas práticas de laboratório, conforme anunciado no folheto explicativo de cada curso.

Observações: • O I.I.C. oferece também cursos “in-house” (“in-company”). Interessados nesta modalidade devem contatar o IIC para obter mais detalhes.

• Com exceção dos cursos da área da qualidade (ISO, Validação e Auditoria) todos os demais possuem aulas teóricas e práticas de laboratório.

• O oferecimento efetivo de um curso depende de um número mínimo de inscritos no mesmo.

• O número de vagas dos cursos que envolvem laboratório está sendo limitado para melhor aproveitamento dos participantes.

• Visite o website www.iicweb.org para obter mais informações.

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Scientia Chromatographica 2018; 10(1) Instituto Internacional de Cromatografia ISSN 1984-4433

BIBLIOTECA IIC

O Bookstore divulgará o material de informação e formação produzido pelo IIC, incluindo Livros, filmes, slides, material didático de cursos e outras formas de divulgação dos materiais por ele ­produzido. Esses materiais podem ser adquiridos do IIC através do website www.iicweb.org/biblioteca.php

Cromatografia Líquida Moderna - Fernando M. Lanças Livro publicado pela Editora Átomo em maio de 2009, aborda de forma simples e didática os principais assuntos relacionados à Cromatografia Líquida Moderna (HPLC ou CLAE), desde a Teoria, Instrumentação, Colunas, Detectores, até aspectos da Validação, Preparo da Amostra e Análise Quantitativa.

O IIC recomenda este livro para todos os interessados em iniciar-se ou ­atualizar-se nesta técnica.

Cromatografia em Fase Gasosa - Fernando M. Lanças Livro de autoria do Prof. Lanças, abordando todos os princípios básicos: instrumentação, análise qualitativa e quantitativa, detectores e muitos outros aspectos da Cromatografia Gasosa.

Altamente recomendado para os iniciantes na técnica, os quais encontrarão explicações detalhadas e simples a respeito da maior parte dos fundamentos básicos da técnica.

Extração em Fase Sólida - Fernando M. Lanças De autoria do Prof. Lanças, este livro apresenta e discute as várias formas de extração em fase sólida (SPE), desde a mais clássica empregando cartuchos até as mais atuais como discos, placas, ponteiras, e outras. Também discute os princípios da micro extração em fase sólida (SPME) e da extração por sorção em barras de agitação (SBSE).

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Scientia Chromatographica 2018; 10(1)

Scientia Chromatographica 2018; 10(1):73-74 Instituto Internacional de Cromatografia ISSN 1984-4433

NORMAS PARA PUBLICAÇÃO

Normas para publicação de artigos no Scientia Chromatographica (a versão detalhada está disponível em nosso portal www.scientiachromatographica.com).

Escopo

Scientia Chromatographica publica trabalhos em todas as áreas da Cromatografia, incluindo GC (colunas capilares, empacotadas, preparativas), LC (convencional, HPLC, U-HPLC, Prep-LC, micro-LC, nano-LC, TLC, PC), SFC (colunas empacotadas ou capilares), Técnicas Acopladas (GC-MS, LC-MS, SFC-MS, LC-GC, SFE-CE, GCxGC, LCxLC) e Técnicas de Preparo de Amostras (SPME, SBSE, MEPS, QuEChERS, LLE, MAE,SPE, LLE, etc.). A partir de 2012 o Scientia publica os seguintes formatos de artigos: • Artigos Originais de Pesquisa • Comunicação (“Short Communication”) • Artigos de Revisão Crítica Os artigos de Revisão Crítica deverão antes de sua submissão serem discutidos com um dos c­o-editores mais relacionados ao assunto em questão. Devem conter uma contribuição nova a respeito de um assunto de grande interesse atual, incluindo uma discussão a respeito das vantagens e desvantagens do mesmo. O Scientia não publica apenas relato de artigos descritos na literatura, sem uma discussão crítica sobre os mesmos.

Os artigos Originiais de Pesquisa deverão conter resultados de laboratório e/ou teóricos, que signifiquem uma contribuição expressiva para a área de técnicas de separação, seja ela conceitual, na instrumentação, ou na aplicação.

Os artigos do tipo Comunicação deverão ter a mesma qualidade dos artigos Originais, porém devido a seu caráter de comunicação preliminar usualmente são de menor extensão.

Envio do Artigo

Os artigos deverão ser encaminhados para periodico@scientiachromatographica.com. Os artigos do tipo Revisão deverão antes de seu envio pelo website ter o aval de um dos co-Editores do periódico, caso contrário não serão avaliados.

Todos os artigos, independentemente do formato, deverão ser submetidos exclusivamente ao Scientia, com o entendimento de que eles não foram anteriormente submetidos, não estão sendo e não serão posteriormente publicados em outro veículo.

Autores que utilizarem tabelas, ilustrações, figuras, ou textos contendo mais de 25 palavras, anteriormente publicados em outro periódico – sendo ou não autores do artigo – deverão obter a devida permissão por escrito do portador dos direitos de cópia (“Copyright ”). Esse documento deverá permanecer de posse dos autores, sendo encaminhado ao Scientia, quando solicitado.

Idioma

Os artigos, com exeção dos de Revisão, podem ser escritos preferencialmente em inglês, porém em Português e Espanhol também serão aceitos. Os autores cujo idioma nativo não for o empregado na redação do artigo são orientados a solicitar a colaboração de colegas fluentes no idioma, antes de enviar o artigo para o periódico.

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Scientia Chromatographica 2018; 10(1):73-74 Instituto Internacional de Cromatografia ISSN 1984-4433

NORMAS PARA PUBLICAÇÃO

Tipos de contribuições aceitas para publicação no Scientia O Scientia Chromatographica considera para publicação quatro tipos de contribuição:

Artigos Originais de pesquisa: descrevem resultados de estudos completos. Deverão conter resultados de laboratório e/ou teóricos, que signifiquem uma contribuição expressiva para a área de técnicas de separação, seja ela conceitual, na instrumentação, ou na aplicação. Este tipo de contribuição é limitado a 6.000 palavras, incluindo as legendas das figuras e as referências, e no máximo 5 tabelas e/ou figuras somados. No momento do envio da prova de impressão, caso isto ocorra o autor será consultado se prefere revisar o artigo para enquadrá-lo em até 7 páginas, ou se prefere pagar as páginas excedentes. O número de páginas de um artigo depende muito das figuras e tabelas do mesmo. Este critério não é aplicado aos artigos convidados, cujo número de páginas será informado ao autor no momento do convite.

Comunicações (“Short Communication”): são artigos completos, porém que relatam resultados mais curtos, oportunos, e/ou cuja relevância requer sua rápida publicação. Deverão ter a mesma qualidade dos artigos Originais porém, devido a seu caráter de comunicação preliminar, usualmente são de menor extensão. Este tipo de publicação deve ter no máximo quatro páginas impressas, incluindo todo o artigo, ou seja, tabelas, figuras e referências. O autor deve indicar claramente que se trata de uma comunicação no topo da primeira página do artigo.

Artigos de Revisão crítica: revisões críticas sobre uma area específica das técnicas cromatográficas e relacionadas são também consideradas para publicação. Esses artigos devem se limitar a no máximo 10.000 palavras, incluindo as legendas, e até 10 tabelas e figuras somadas. Os artigos de Revisão Crítica deverão antes de sua submissão serem discutidos com um dos co-Editores mais relacionados ao assunto em questão. Artigos não encaminhados desta forma serão antes enviados a um co-Editor da área em que se enquadre para parecer e, somente então, serão enviados aos revisores, podendo atrasar significativamente sua publicação. Devem conter uma contribuição nova a respeito de um assunto de grande interesse atual, discutindo as vantagens e desvantagens do mesmo. O Scientia não publica apenas relato de artigos descritos na literatura, sem uma discussão crítica sobre os mesmos.

Artigos de Alta Prioridade: são publicados no primeiro número disponível do periódico, recebendo prioridade máxima de todo o sistema Editorial do periódico. Para justificar sua publicação como alta prioridade, os manuscritos deverão apresentar, de forma resumida, resultados importantes de recentes desenvolvimentos na área de cromatografia e técnicas relacionadas (espectrometria de massas, preparo de amostras, eletroforese capilar e outros). Não precisam conter resultados experimentais detalhados, sendo limitados a 2.500 palavras e três figuras e/ou tabelas combinadas.

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Scientia Chromatographica EDITOR-IN-CHIEF

FERNANDO MAURO LANÇAS Universidade de São Paulo Instituto de Química de São Carlos 13560-970 São Carlos (SP) - Brasil editor@scientiachromatographica.com EDITORES ASSOCIADOS

MARIA EUGÊNIA QUEIROZ

RENATO ZANELLA

preparo de amostras

preparo de amostras

JOSÉ MANUEL F. NOGUEIRA

ISABEL C. S. FONTES JARDIM

preparo de amostras

CORPO EDITORIAL CONSULTIVO

Daniel Armstrong – EUA Dietrich von Bauer – Chile Fábio Augusto – Brasil Fátima Dutra – Brasil Flávio Leite – Brasil Frank Svec – EUA Harold McNair – EUA Humberto Gómez – México Isabel Cristina Sales Fontes Jardim – Brasil Jailson B. de Andrade – Brasil Janusz Pawliszyn – Canadá Kiyoratsu Jinno – Japão Luigi Mondello – Itália Marcos Eberlin – Brasil Marina Tavares – Brasil Milos Novotny – EUA Milton Lee – EUA Norberto Peporine Lopes – Brasil Phillip Marriott – Austrália Pierina Bonato – Brasil Quézia Cass – Brasil Renato Zanella – Brasil

cromatografia líquida

ENDEREÇO DO PERIÓDICO

Scientia Chromatographica

ELENA STASHENKO

espectrometria de massas

FABIO AUGUSTO

cromatografia gasosa

ALEJANDRO CIFUENTES

Técnicas Eletroforéticas

ÁLVARO J. SANTOS NETO

troubleshooting

Rua Princesa Isabel, 265 - Jardim Paraíso 13.561-140 - São Carlos (SP) - Brasil Fone/Fax: (16) 3501-4140 periodico@scientiachromatographica.org www.scientiachromatographica.com

Ficha catalográfica elaborada pela Seção de Aquisição e Tratamento da Informação do SBI/IQSC Scientia Chromatographica / Associação Internacional de Cromatografia. - vol.10 n.1 (jan./mar. 2018). São Carlos: Associação Internacional de Cromatografia, 2018.

Trimestral ISSN 1984-4433

CLÁUDIA ZINI

cromatografia gasosa

ELINA B. CARAMÃO

cromatografia gasosa

1. Cromatografia. 2. Lanças, Fernando Mauro, editor chefe.

CDD 543.8

ISSN 1984-4433

www.scientiachromatographica.com

2018

Volume 10 | Número 1 7

SCIENTIA CHROMATOGRAPHICA

Publicação disponível na internet:

Multiresidue determination of pesticides in sweet peppers by LC-MS/MS using Si-Al(PMTDS) as a sorbent for extraction by MSPD

2018 | Volume 10 | Número 1

Elisa Helena da Costa Morais, Renata Cristiano Nome, Carol Hollingworth Collins, Isabel Cristina Sales Fontes Jardim

21 Combinación de técnicas de extracción y de análisis cromatográfico para la determinación de metabolitos secundarios en flores tropicales Lady Johanna Sierra, Jesica Julieth Mejía, Leydé Gualteros, Karol Carrillo, Yuri Córdoba, Jairo René Martínez, Elena E. Stashenko

39 UHPLC capilar: aspectos teóricos e práticos Marcio David Bocelli, João Victor Basolli Borsatto, Álvaro José dos Santos Neto

49 2018 Events on chromatography and related techniques Os Editores

Rua Princesa Isabel, 265 - Jardim Paraíso São Carlos (SP) - CEP 13561-140 Fone/ Fax: (16) 3501-4140 | www.iicweb.org

2018 | Volume 10 | Número 1

Instituto Internacional de Cromatografia

Uma publicação do Instituto Internacional de Cromatografia www.iicweb.org