v8n4

ISSN 1984-4433

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2016

Volume 8 | Número 4

SCIENTIA CHROMATOGRAPHICA

Publicação disponível na internet:

209 Técnicas Cromatográficas Multidimensionais na Investigação de Metabólitos Secundários Paloma Santana Prata, Noroska Gabriela Salazar Mogollón, Fabio Augusto

2016 | Volume 8 | Número 4

231 Separation of Steroids by Temperature-Programmed Capillary Liquid Chromatography Using Packed Fused-Silica Column Alessandra Maffei Monteiro, Lincoln Figueira Marins Coutinho, Carlos Eduardo Domingues Nazario, Fernando Mauro Lanças

239 Extração em Fase Sólida Magnética (MSPE): Fundamentos e Aplicações Amandha Kaiser da Silva, Eduardo Sobieski Neto, Luiz Henrique Viana, Fernando Mauro Lanças, Carlos Eduardo Domingues Nazario

257 Glossário de Termos Cromatográficos

Rua Princesa Isabel, 265 - Jardim Paraíso São Carlos (SP) - CEP 13561-140 Fone/ Fax: (16) 3501-4140 | www.iicweb.org

2016 | Volume 8 | Número 4

Instituto Internacional de Cromatografia

Uma publicação do Instituto Internacional de Cromatografia www.iicweb.org

Scientia Chromatographica EDITOR-IN-CHIEF

FERNANDO MAURO LANÇAS Universidade de São Paulo Instituto de Química de São Carlos 13560-970 São Carlos (SP) - Brasil editor@scientiachromatographica.com EDITORES ASSOCIADOS

MARIA EUGÊNIA QUEIROZ

RENATO ZANELLA

preparo de amostras

preparo de amostras

JOSÉ MANUEL F. NOGUEIRA

ISABEL C. S. FONTES JARDIM

preparo de amostras

CORPO EDITORIAL CONSULTIVO

Daniel Armstrong – EUA Dietrich von Bauer – Chile Fábio Augusto – Brasil Fátima Dutra – Brasil Flávio Leite – Brasil Frank Svec – EUA Harold McNair – EUA Humberto Gómez – México Isabel Cristina Sales Fontes Jardim – Brasil Jailson B. de Andrade – Brasil Janusz Pawliszyn – Canadá Kiyoratsu Jinno – Japão Luigi Mondello – Itália Marcos Eberlin – Brasil Marina Tavares – Brasil Milos Novotny – EUA Milton Lee – EUA Norberto Peporine Lopes – Brasil Phillip Marriott – Austrália Pierina Bonato – Brasil Quézia Cass – Brasil Renato Zanella – Brasil

cromatografia líquida

ENDEREÇO DO PERIÓDICO

Scientia Chromatographica

ELENA STASHENKO

espectrometria de massas

FABIO AUGUSTO

cromatografia gasosa

ALEJANDRO CIFUENTES

Técnicas Eletroforéticas

ÁLVARO J. SANTOS NETO

troubleshooting

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Ficha catalográfica elaborada pela Seção de Aquisição e Tratamento da Informação do SBI/IQSC Scientia Chromatographica / Associação Internacional de Cromatografia. - vol.8 n.4 (out./dez. 2016). São Carlos: Associação Internacional de Cromatografia, 2016.

Trimestral ISSN 1984-4433

CLÁUDIA ZINI

cromatografia gasosa

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cromatografia gasosa

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Periódico Trimestral do Instituto Internacional de Cromatografia

2014 2016 | Volume 68 | Número 14

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Scientia Chromatographica 2016; 8(4):205 Instituto Internacional de Cromatografia ISSN 1984-4433

SUMÁRIO

Editorial................................................................................................................................................................................................................207 Fernando Mauro Lanças

MULTIDIMENSIONAL Técnicas Cromatográficas Multidimensionais na Investigação de Metabólitos Secundários......... 209 Paloma Santana Prata, Noroska Gabriela Salazar Mogollón, Fabio Augusto

HPLC Separation of Steroids by Temperature-Programmed Capillary Liquid Chromatography Using Packed Fused-Silica Column.....................................................................................................................................231 Alessandra Maffei Monteiro, Lincoln Figueira Marins Coutinho, Carlos Eduardo Domingues Nazario, Fernando Mauro Lanças

PREPARO DE AMOSTRAS Extração em Fase Sólida Magnética (MSPE): Fundamentos e Aplicações............................................. 239 Amandha Kaiser da Silva, Eduardo Sobieski Neto, Luiz Henrique Viana, Fernando Mauro Lanças, Carlos Eduardo Domingues Nazario

GLOSSÁRIO Glossário de Termos Cromatográficos..................................................................................................................257 Instituto Internacional de Cromatografia...............................................................................................................................................269 Normas para Publicação...............................................................................................................................................................................271

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Scientia Chromatographica 2016; 8(3):206-206 Instituto Internacional de Cromatografia http://dx.doi.org/10.4322/sc.2015.000 ISSN 1984-4433

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CLASSIFICAÇÃO

Scientia Chromatographica 2016; 8(3)

Scientia Chromatographica 2016; 8(4):207 Instituto Internacional de Cromatografia http://dx.doi.org/10.4322/sc.2016.033 ISSN 1984-4433

EDITORIAL

Scientia Chromatographica Volume 8, Número 4 de 2016

Com este número (V8 N4) chegamos ao final de mais um volume do Scientia Chromatographica, com artigos que abordam diferentes assuntos de relevância na área neste momento. O número inicia com um artigo sobre o emprego de técnicas cromatográficas multidimensionais na investigação de metabólitos secundários, assunto que discute o uso de técnicas de alta eficiência para a solução de problemas práticos de relevência atual. Uma revisão crítica detalha a Extração em Fase Sólida Magnética (MSPE), abordando de forma didática seus fundamentos e principais aplicações atuais. Trata-se de uma abordagem inovadora e que tem trazido muito sucesso na área de preparo de amostras. Outro artigo trata da utilização de programação de temperatura em cromatografia líquida capilar, estado-da-arte em cromatografia líquida moderna, mostrando as vantagens deste enfoque utilizado para melhorar uma separação cromatográfica.

Ampliando suas formas de divulgação do conhecimento na área, e com a intenção de facilitar para os que se iniciam na área de cromatografia, o Scientia criou, a partir deste número, um Glossário de Termos Cromatográficos (e de técnicas relacionadas) que pretende ir ampliando nos próximos números. A intenção é abordar a terminologia, simbologia e outros elementos da área, sempre procurando uma forma didática de apresentar o tema.

Esperando que tenham gostado desde número aproveitamos, em nome dos Editores e de toda a equipe Scientia desejar a todos um excelente final de ano e um 2017 repleto de realizações.

Fernando Mauro Lanças Editor-in-chief

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Scientia Chromatographica 2016; 8(3):208-208 Instituto Internacional de Cromatografia http://dx.doi.org/10.4322/sc.2015.000 ISSN 1984-4433

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CLASSIFICAÇÃO

Scientia Chromatographica 2016; 8(3)

Scientia Chromatographica 2016; 8(4):209-229 Instituto Internacional de Cromatografia http://dx.doi.org/10.4322/sc.2016.034 ISSN 1984-4433

MULTIDIMENSIONAL

Técnicas Cromatográficas Multidimensionais na Investigação de Metabólitos Secundários Multidimensional Chromatographic Techniques on the Investigation of Secondary Metabolites

Paloma Santana Prata Noroska Gabriela Salazar Mogollón Fabio Augusto* Laboratório de Cromatografia Gasosa Instituto de Química, Universidade Estadual de Campinas (IQ/UNICAMP), São Paulo, Brasil. *augusto@iqm.unicamp.br Recebido: 27-03-2016 Aceito: 24-11-2016

Resumo

Metabólitos secundários podem ser definidos como compostos que não estão diretamente envolvidos com o crescimento e desenvolvimento dos organismos, mas são essenciais para a sobrevivência e continuidade da espécie. Devido a sua grande diversidade estrutural (alcalóides, terpenóides, glicosídeos, fenóis, policetídeos, produtos da síntese de ácidos graxos, peptídeos) e o alto grau de dificuldade de análise (matrizes de alta complexidade), o avanço instrumental para a análise de metabólitos secundários é necessária. Até o presente momento, técnicas multidimensionais não-abrangentes como LC/MS, CE/MS e GC/MS, bem como técnicas multidimensionais abrangentes como LCxLC e GCxGC são umas das mais utilizadas para este tipo de análise. Assim, o objetivo desta revisão foi mostrar a diversidade de técnicas multidimensionais não abrangentes e abrangentes, com ênfase para GCxGC, para o estudo de metabólitos secundários.

Palavras-chave: GCxGC, Metabólitos Secundários, Técnicas Multidimensionais.

Abstract

Secondary metabolites may be defined as the compounds who are not involved with the growth and development of organisms, but they are but they are essential for the survival and continuity of the species. Because of their great structural diversity (alkaloids, terpenoids, glycosides, phenols, polyketides, the synthesis of fatty acid products, peptides) and the high degree of difficulty of analysis (complex matrices), the advancing of instrumentation machines for the analysis of secondary metabolites is required. In recent decades, non-comprehensive multidimensional techniques as LC/MS, CE/MS e GC/MS and comprehensive multidimensional techniques as LCxLC e GCxGC can be considerate one of the most utilized for secondary metabolites analysis. Thus, this review reports different types of multidimensional techniques (emphasis in comprehensive two-dimensional gas chromatography) for secondary metabolites studies and discusses its advantages and limitations.

Keywords: GCxGC, Multidimensional Techniques, Secondary Metabolites.

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Prata PS et al.

Técnicas Cromatográficas Multidimensionais na Investigação de Metabólitos Secundários

1. Introdução

O conjunto de reações químicas que ocorrem em um organismo é denominado metabolismo. O metabolismo costuma ser dividido em primário e secundário. Este primeiro engloba as reações essenciais responsáveis por processos de assimilação, respiração, transporte e diferenciação que ocorrem na maior parte, se não em todas, as células de um organismo[1]. Diferente do metabolismo primário, que vêm sendo descrito há cerca de duzentos anos, o metabolismo secundário teve sua definição estabelecida em 1891 pelo fisiologista vegetal Albrecht Kossel como “opostos aos metabólitos primários”[2]. Atualmente, o metabolismo secundário é caracterizado por não participar diretamente de processos de desenvolvimento e crescimento celular e muitas vezes são sintetizados em células especializadas[1].

Pensava-se que metabólitos secundários ocorriam apenas em plantas superiores, porém estudos revelaram que são também sintetizados por bactérias, plantas inferiores e fungos[3]. Produtos do metabolismo secundário desempenham funções de relevada importância na interação de plantas com o meio ambiente, tais como adaptação à condições de clima e solo, competição entre plantas e atração de organismos benéficos (polinizadores, dispersores de sementes e microrganismos simbiontes), defesa contra herbívoros e ataque de patógenos[4]. Além disso, um vasto número de metabólitos secundários são de grande importância comercial na área farmacêutica, alimentar, agronômica, perfumaria e outras[5]. Um exemplo é o taxol, um diterpenóide produzido pela planta Taxus brevifolia e largamente utilizado no tratamento de câncer de mama e de útero. Outro exemplo de extrema significância são alguns flavonoides, metabólitos secundários da classe dos polifenóis, tais como a baicalina, robustoflavona, robinetina e miricetina (Figura 1), com eficiente atividade inibidora de enzimas envolvidas na infecção, transcrição e replicação do vírus da imunodeficiência humana (HIV)[6,7].

E a produção de diazoprogesterona, ftalato de dodecila e cloreto de 9,12-octadienoila presentes no extrato de Cynodon dactylon que servem como agente contra a diabetes retinopática[8].

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Figura 1. Flavonoides com atividade inibidora do vírus HIV.

Até o momento, mais de 200.000 metabólitos secundários foram identificados a partir de vários organismos vivos, em sua maioria plantas, entretanto, estima-se que esse número seja consideravelmente maior, sendo em parte, limitado a técnicas analíticas.

Com o avanço instrumental, compostos de alto grau de dificuldade de análise, seja devido a sua abundância, diversidade estrutural ou a complexidade da matriz, tem sido constantemente identificados[9].

Até o presente momento, a espectrometria de massas (MS) vem sendo a técnica de detecção mais escolhida para análise de metabólitos devido a sua abrangência, sensibilidade e seletividade, principalmente após o surgimento de técnicas mais suaves de ionização e de alta resolução. Entretanto, apesar do potencial da MS, por si só, esta técnica não é capaz de resolver uma mistura complexa de metabólitos, sendo altamente requerida e fundamental à elucidação estrutural, uma previa etapa de separação e simplificação da amostra para posterior detecção no MS. A cromatografia é um dos mais valiosos e difundidos métodos indicados para essa função.

2. Técnicas multidimensionais de separação utilizadas na investigação de metabólitos secundários

A necessidade de melhorar os parâmetros analíticos para atender áreas como a petroleômica, proteômica e metabolômica, e as crescentes exigências para adequada separação, identificação e quantificação Scientia Chromatographica 2016; 8(4):209-229

Técnicas Cromatográficas Multidimensionais na Investigação de Metabólitos Secundários

de biomarcadores de petróleo, proteínas, metabólitos primários e secundários, promoveram uma grande sofisticação instrumental, elevando o poder de resolução para detecção e identificação destes analitos[10]. Na análise de amostras com certo grau de complexidade, como por exemplo uma amostra contendo mais que 150 componentes relevantes, por técnicas unidimensionais, o poder de separação destes compostos, na maioria das vezes é falho, mesmo quando obtêm-se resultados aceitáveis, a utilização desta por levar muitas horas de análise. Por essas razões, o surgimento de novos sistemas multidimensionais induziu um salto exponencial na capacidade de análise dessas matrizes[11].

As técnicas multidimensionais podem ser definidas como o acoplamento de duas ou mais técnicas que aumentam a resolução em termos de separação, detecção e identificação de uma amostra[12]. Podem ser divididas em multidimensionais abrangentes e nãoabrangentes.

Para que seja considera abrangente, é necessário que, no mínimo uma fração representativa de todos os componentes da amostra sejam separados por duas técnicas de separação com seletividades diferentes, demonstrando assim um perfil distinto de retenção (é preciso que haja ortogonalidade entre as dimensões) e também que percentagens iguais de todos esses componentes passem por ambas as dimensões. Além disso, é necessário que os analitos separados em uma das dimensões não sejam recombinados na dimensão seguinte, para que seja mantido o perfil de eluição observado na primeira separação[13-15].

Na cromatografia multidimensional nãoabrangente apenas algumas frações da primeira dimensão são transferidas para o segundo sistema analítico, dessa forma, não representando os componentes da amostra em sua totalidade. Dentre as técnicas de separação multidimensionais não-abrangentes, GC-MS destaca-se como uma das principais e mais difundidas, sendo que na primeira dimensão a separação é baseada em diferentes pressões de vapor dos compostos (colunas com fase

Prata PS et al.

estacionária apolar) ou de acordo com sua polaridade (colunas com fase polar) e na segunda dimensão a separação se dá pela diferença de massa/carga entre os íons.

2.1. Técnicas multidimensionais não-abrangentes

A Cromatografia gasosa (GC) e a Cromatografia liquida (LC) acoplada a espectrometria de massas, são as plataformas mais utilizadas na análise de metabólitos, pois permitem a detecção e quantificação de maneira robusta de um grande número de compostos, seja em amostras simples ou naquelas com certo grau de complexidade[16].

A GC-MS é aplicada a metabólitos voláteis ou passíveis de volatilização por derivatização, alguns de seus grandes atrativos são o custo relativamente baixo e a reprodutibilidade e resolução cromatográfica insuperável por técnicas não-abrangentes. Além disso, as informações espectrais obtidas através da ionização por elétrons (EI) nessa técnica, quando unida ao índice de retenção, muitas vezes são suficientes para a concreta caracterização do analito devido à reprodutibilidade e ao extenso banco de dados de espectros de massas de metabolitos secundários disponíveis na literatura.

Na ausência de dados que permitam caracterizar um composto com base em seu espectro de massas aliado ao índice de retenção, a utilização de experimentos de MS sequencial (MSn) fornece informações estruturais relevantes com base no monitoramento e fragmentação de determinados íons. Gomathi et al. (2013)[17], por exemplo, analisou e identificou 16 metabólitos secundários bioativos presentes em extratos etanólicos da planta medicinal Evolvulus alsinoides (L.) L. por GC-MS. Esses compostos são de extrema importância, pois foram caracterizados como responsáveis pelas propriedades farmacológicas da planta no combate ao câncer, diabetes, bem como a sua atividade antimicrobiana e antioxidante. Contudo, foi possível apenas a identificação dos componentes mais abundantes do extrato, sem a distinção entre isômeros, o que dificulta a identificação de qual isômero é o responsável pela atividade farmacológica.

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Prata PS et al.

Técnicas Cromatográficas Multidimensionais na Investigação de Metabólitos Secundários

A utilização de um analisador de massas de alta resolução, tal como o do tipo tempo de voo (TOFMS, do inglês “Time of Flight Mass Spectrometry”) acoplado a outro método de separação, como a GC, permite determinar a massa acurada dos compostos possibilitando, dessa forma, realização de deconvolução espectral de alguns compostos que coeluem e diferenciação entre moléculas isobáricas[1]. Kim et al.[18] utilizaram a técnica GC-TOF/MS com o auxílio da quimiometria para a identificação das correlações existentes entre os metabólitos primários e secundários em arroz (Oryza sativa L.). Trabalhos como este, auxiliam na melhoria de qualidade das culturas de espécies vegetais, através do monitoramento desses metabólitos em detrimento de experimentos de melhoramento genético.

Apesar do grande potencial da técnica de GCMS para analisar metabolitos secundários, várias classes de metabólitos não são passiveis de serem analisados, tais como terpenos com mais de 30 carbonos, vários representantes dos polifenóis, alcaloides e todos os instáveis termicamente na temperatura de operação do sistema cromatográfico. A principal limitação da técnica é a necessidade de volatilização dos analitos.

A cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), apesar de possuir uma menor eficiência de separação de compostos, já que colunas capilares utilizadas em GC possuem um número pratos teóricos maior que colunas recheadas usada em sistemas de HPLC, exige apenas que o analito seja solúvel na fase móvel e, dessa forma, abrange um conjunto significativamente maior de metabólitos que podem ser analisados[19].

A cromatografia líquida ganhou um grande aliado após o surgimento de métodos de ionização à pressão atmosférica (Atmospheric Pressure Ionization)[20]. Com isso, foi possível o acoplamento de maneira eficiente da LC à MS. Dentre esses métodos de ionização, o de maior destaque e mais amplamente utilizado em sistemas LCMS para análise de metabólitos é o de ionização por eletrospray (ESI).

No processo de ionização (Figura 2), a amostra é inicialmente transmitida através de um capilar, onde é aplicada uma voltagem ocasionando acumulo de íons na superfície do capilar, gerando uma distorção da solução na forma de um cone de Taylor (a). Em seguida, a densidade de carga na ponta do capilar supera a tensão superficial e a gota se desprende, subdividindo-se e

Figura 2. Ilustração do processo de formação de íons numa fonte de electrospray. Adaptado de P. Gates (2004)[22].

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Técnicas Cromatográficas Multidimensionais na Investigação de Metabólitos Secundários

formando um spray eletrolítico (b). Com a evaporação do solvente (c), as gotas desprendidas do capilar começam a diminuir de volume e consequentemente a densidade de carga aumenta até o ponto em que as repulsões de Coulomb superam a tensão superficial. Nesse ponto, ocorre a divisão da gota. Essas etapas continuas de divisão e evaporação do solvente levam a gotículas com, em média, um íon do analito que, após dessolvatação origina o íon em fase gasosa (d) que posteriormente é analisado no MS[21]..

A fragmentação produzida por dissociação induzida por colisão (CID) em experimentos de espectrometria de massas sequencial fornece informações relevantes à elucidação estrutural. O processos de obtenção dos espectros de MS/MS em uma análise convencional de LC-TOFMS, por meio de ionização por eletrospray, consiste em uma varredura previa à baixa energia de colisão para a obtenção dos íons precursores, a partir dos quais é possível determinar a massa molecular do analito, e um segundo evento de MS onde alguns desses íons precursores são selecionados e fragmentados na célula de colisão do espectrômetro de massas por CID, gerando espectros de MS/MS, os quais fornecem informações estruturais a partir da interpretação dos padrões de fragmentações características (eliminação de água, CO, CO2, NH3, etc.) e/ou pela comparação com espectros existentes em bancos de dados, tais como METLIN, MMCD e MassBank[23].

Wajakowska et al. (2013)[24] analisou o perfil de flavonoides glicoconjudados, bem como de compostos até então inéditos, encontrados em raízes e folhas de várias espécies Lupinus utilizando dois sistemas LC-MS (um ion trap de baixa resolução e um quadrupolo-TOF de alta resolução) por dissociação induzida por colisão (CID). A união destas técnicas permitiu a separação bem como a identificação vários flavanóides glicoconjugados isoméricos e isobáricos que diferem principalmente pelo grau de hidroxilação e de glicosilação. A composição elementar das moléculas glicoconjugadas foi determinada a partir da razão massa/carga exata das

Prata PS et al.

moléculas protonadas/desprotonadas ([M+H]+ / (M-H)-] pela análise no híbrido analisador do tipo quadrupoloTOF (qTOF) em um experimento de varredura à baixa energia de colisão, o qual permite identificar os íons precursores. A partir da CID, pôde-se obter informações estruturais sobre as agliconas, o tipo de unidades de açúcares (hexoses, pentoses ou deoxihexose) ligada as agliconas e sobre os substituintes do grupo acila dos flavonóides gliconjugados. Assim foi possível, a partir do perfil de fragmentação, identificar 175 derivados de flavonoides específicos. A identificação de alguns desses compostos é, de certa forma questionável, já que apenas o perfil de fragmentação pode ser muito similar para determinados isômeros, requerendo, dessa forma, uma técnica de caracterização como a NMR para a confirmação concreta da estrutura da molécula. Porém, para esse tipo especifico de análise, seria necessário isolar os componentes, o que é uma tarefa de elevado grau de dificuldade diante da semelhança estrutural dos componentes da amostra. Alternativa para a confirmação das estruturas propostas é através do uso da técnica hifenada LC-NMR. Contudo este tipo de instrumentação não suporta a extrema coeluição, o que requer uma ótima separação, às vezes, não conseguida com a utilização de um LC; além disso, outros inconevenientes como a restrição aos solventes empregáveis como FM (especialmente tampões) e relativa baixa sensibilidade limitam essa hifenação.

Outras metodologias multidimensionais não abrangentes comumente empregadas para a análise de metabólitos são a eletroforese capilar (CE) e cromatografia de fluido supercrítico (SFC) acopladas a MS, além das técnicas convencionais com dois sistemas cromatográficos do tipo “heart-cut”, tais como a GC-GC e LC-LC. A CE-MS é um método de alta eficiência de separação e representa uma alternativa interessante a LC, se baseia na separação de partículas carregadas quando estas são submetidas a um campo elétrico externo. Em geral, a ESI (Figura 2) é utilizada para transferir os

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Prata PS et al.

Técnicas Cromatográficas Multidimensionais na Investigação de Metabólitos Secundários

metabólitos da fase líquida para a gasosa na interface do CE com o MS. Destaca-se por sua simplicidade, variedade de métodos de separação que podem ser efetuados em uma única coluna capilar e diversidade de compostos passíveis de serrem analisados em cada modo[25]. É amplamente aplicada na análise de compostos nas áreas farmacêutica, biomédica, microbiológica, alimentícia e principalmente na análise qualitativa e quantitativa de metabólitos secundários no extrato bruto de plantas e purificação de proteínas[26].

O maior aproveitamento da técnica é obtido pela análise de analitos polares e carregados, já que as espécies neutras ou não-ionizáveis não sofrem influência do campo elétrico aplicado. A LC de fase reversa e a CE, devem ser consideradas técnicas complementares e jamais competitivas já que o perfil de metabólitos analisável pela LC de fase reversa é diferente daquele analisável pela CE, como demonstrado por Saric et al. (2012)[27].

Os autores, ao analisar o perfil metabólico em urina humana, demonstraram que, embora alguns metabólitos tenham sido identificados por ambas às plataformas, individualmente cada plataforma contribuiu para um conjunto único de metabólitos, o que possibilitou a identificação de 142 compostos.

Contreras-Gutiérrez et al. (2013)[28] determinaram o perfil metabólico em Persea americana por CE-MS, com o MS operando nos modos MRM (monitoramento de reações múltiplas) e varredura (full scan), e comparou com o perfil obtido pela técnica HPLC-MS, comprovando que a CE-MS pode ser uma poderosa técnica para a caracterização de metabólitos polares em amostras complexas, fornecendo informações complementares ou suplementares sobre a composição da amostra em estudo. Neste trabalho o autor estudou alterações bioquímicas durante o desenvolvimento e maturação de frutos de abacate através do monitoramento dos 10 metabólitos (perseitol (1), epicatechina (2), catechina (3), ácido abscísico (4), ácido pantothenico (5), ácido quínico (6), ácido trans-cinâmico (7), ácido clorogênico (8), ácido ferrúlico (9) e o ácido p-coumarínico (10)). O 214

primeiro passo realizado nesse estudo foi a otimização das condições experimentais de separação por CE. O pH foi a variável que mais influenciou na separação. Com base em estudos preliminares, foi observado que valores de pH inferiores a 9,0, apesar de encurtar o tempo de análise, fornece baixas resoluções, enquanto que, valores superiores a 9,5 aumentam consideravelmente o tempo de análise sem ganho significativo de resolução.

Dessa forma, ao avaliar três diferentes valores de pH, 9,50 foi determinado ótimo para o monitoramento dos metabólitos.

A segunda etapa no estudo foi quantificar os compostos e avaliar o comportamento destes ao longo do período de maturação do fruto da espécie vegetal.

A CE-MS demonstrou eficiência na quantificação e reprodutibilidade[29]. Observou-se que o conteúdo de ácido ferrúlico e ácido p-cumárico aumenta com o amadurecimento do fruto, enquanto que, os demais metabólitos estudados demonstram tendência oposta.

Além disso, a comparação dos dados obtidos por CE-MS e por HPLC-ESI-IT-MS revelou elevada correlação na quantificação dos ácidos abscísico, pantoténico, ferúlico e p-coumarínico. Perseitol e ácido quínico, mesmo que possuíssem abundância relativamente alta na amostra, eluiriam no tempo morto da LC e seriam suprimidos íonicamente.

A análise de amostras complexas, como extratos vegetais, amostras petroquímicas, ambientais e biológicas, requer técnicas com alto poder de separação, muitas vezes não conseguido por técnicas convencionais como as discutidas até aqui. Apesar da GC, LC, CE, terem evoluído demasiadamente, ainda não são capazes de resolver componentes de amostras com certo grau de complexidade. Nessas situações, uma alternativa é aproveitar ao máximo o potencial do MS que, muitas vezes é tratado como um simples detector e seu poder de separação de íons é subutilizado. Pode ser feito, por exemplo, monitoramento seletivo de íons (SIM) e, mesmo que exista um alto grau de coeluição, o íon do analito será detectado com precisão e exatidão, Scientia Chromatographica 2016; 8(4):209-229

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exceto no caso em que um mesmo íon é proveniente de diferentes compostos. Porém, nesse caso, a informação espectral que fornece a base para a elucidação estrutural é perdida. Alternativamente, sistemas de tamden (MSn), são altamente seletivos e informativo quanto a estrutura do analito. Entretanto, mesmo aproveitando ao máximo o potencial do sistema cromatográfico e do MS, muitas vezes não é possível obter a separação requerida à caracterização dos componentes de determinada amostra.

Com o intuito de solucionar este problema, décadas atrás, juntamente com a melhoria de espectrometria de massas, técnicas hifenadas do tipo GC-GC, LC-LC e LC-GC foram utilizadas. Seu acoplamento é feito através de uma interface que permite a transferência de algumas frações de interesse da primeira para uma segunda coluna. Essas plataformas foram denominadas “heart-cut” e, apesar de serem bidimensionais, geram gráficos unidimensionais para todas as análises.

Neste tipo de sistema cromatográfico a amostra é introduzida na primeira coluna e arrastada por um fluxo de gás, sofrendo a primeira separação, até chegar a interface. Esta interface transfere o efluente primário para uma válvula limitadora de fluxo, no qual conduz a amostra para um detector ou para a segunda dimensão, até a amostra chegar ao segundo detector[30].

Recentes melhorias instrumentais em plataformas de GC convencional fizeram com que as separações em GC-GC se tornassem mais viáveis. Com o aparecimento de novas fases estacionárias, tais como as de líquido iônico e sólidos porosos, a técnica vem sendo cada vez mais difundida. Estas fases combinam alta polaridade com alto limite de temperatura, permitindo análises que discriminam os componentes da amostra de acordo principalmente com sua polaridade[30].

O parâmetro que serve como base para medir o aumento da capacidade de separação da cromatografia multidimensional, é chamada de “capacidade de pico”[31]. Idealmente a capacidade de picos de uma coluna unidimensional (1D) tem que exceder o número

Prata PS et al.

de analitos de uma matriz, o que raramente ocorre para amostras muito complexas, causando a sobreposição de picos e diminuição da qualidade da análise[14]. Uma alternativa para minimizar este problema é a escolha de uma fase estacionária compatível com a amostra a ser analisada, o que, em geral, promove uma separação mais eficiente (funcionando apenas para matrizes de baixa complexidade). Além disso, aumentar o comprimento e diminuir o diâmetro interno da coluna favorece a resolução dos componentes[32], porém, nessa situação, os gastos com consumíveis são significativamente maiores, já que o tempo de análise aumenta bastante.

A possibilidade de uma análise multidimensional, proporciona aumento da capacidade de picos em relação a 1D. Se por exemplo, a capacidade de pico da 1D for n1 e a capacidade da segunda dimensão (2D) “heart-cut” for n2, a capacidade total de picos será dada por n1 + n2 picos[13]. Dessa forma, o plano de retenção contém maior capacidade, adaptando-se a misturas um pouco mais complexas.

Diversas áreas fazem uso deste modo de análise, a indústria petroquímica com a análise de componentes traços[33], análise de amostras ambientais[34,35], análise de aromas e fragrâncias[36], e na área farmacêutica[37]. Apesar da utilização de GC-GC em todas essas aplicações, trabalhos na área de metabólitos secundários por GCGC são pouco difundidos, tendo mais relevância com a utilização de LC-LC. Assim como a GC-GC em comparação com a GC convencional, a LC-LC apresenta maior poder de separação que a LC convencional. Embora amplamente utilizada em análises de metabólitos secundários, a LC acoplada a MS de alta resolução, ainda sofre limitações devido a semelhança estrutural existente entre os componentes de extratos vegetais, por exemplo, tornando quantificação desses compostos uma tarefa difícil e muitas vezes inviável[38].

Embora a multidimensionalidade tenha sido mais complicada em LC-LC, por conta da fase móvel utilizada

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entre dois sistemas diferentes, o seu ganho em resolução é extremamente maior[39]. Assim como em GC-GC, esse ganho em separação pode ser explicado pela medida da capacidade de pico, sendo definido neste caso, pela soma da capacidade de pico em cada dimensão[40].

A LC-LC pode ser realizada no modo on-line[40] ou no modo off-line[41]. Neste primeiro modo, as frações separadas na primeira dimensão, são transferidas diretamente para a segunda dimensão, sem que haja interrupção do processo na primeira dimensão (esse processo ocorre simultaneamente entre as duas colunas).

No modo off-line, a fração contendo os compostos separados na 1D são recolhidos e separados na 2D. Neste caso, haverá somente a injeção de uma única fração[39].

Existem várias combinações de conjuntos de colunas em LC-LC, entre elas, as mais utilizadas são: coluna de troca iônica na primeira dimensão cromatográfica e uma coluna de fase reversa na segunda (RPLC) com utilização de fase móvel tamponada, colunas de cianopropil na 1D e a 2D com RPLC, cromatografia por exclusão de tamanho (1D) e RPLC (2D), RPLC com cromatografia de interação hidrofílica (HILIC), e principalmente a cromatografia em fase normal (NPLC) com a RPLC. Ren et al. (2013)[38] utilizou o conjunto de colunas HILIC + RPLC (modificada) e HILIC + FENIL na determinação de 12 metabólitos com estruturas similares e polaridades diferentes, sendo alguns compostos das classes dos flavonoides, glicosídeos fenilpropanóides, ácidos orgânicos e compostos inorgânicos. Em trabalhos anteriores feitos por seu grupo de pesquisa, foi observado que a separação destes compostos utilizando LC convencional seria possível com grande tempo de análise, não sendo uma opção muito viável. Utilizando uma cromatografia heart-cut on-line com parada de fluxo, foi possível a análise destes compostos com alta eficiência e seletividade. A otimização foi realizada individualmente para cada coluna a partir da seleção de diferentes gradientes. A HILIC foi escolhida com 1D por conta da sua alta seletividade de retenção para moléculas 216

altamente polares ou muito hidrofílicas. Após a análise de diferentes colunas na 2D, aquela com fase fenil, que apresenta uma alta seletividade para compostos aromáticos, e com fase C18 (modificada com grupos amida ligados a sílica), que apresenta maior seletividade para flavonoides, foram escolhidas devido ao melhor desempenho. Este artigo demonstrou que a utilização de duas colunas em série com diferentes fases estacionárias, proporciona uma maior eficiência de separação que os sistemas convencionais.

Um outro método alternativo para a análise de metabólitos é através da hifenização LC-GC. Esta técnica une a ampla gama de mecanismo de separação da LC com a elevada resolução da GC, assegurando a limpeza de uma amostra e/ou separação de um grupo de analitos, necessário na análise de amostras complexas[42].

Do mesmo modo que a LC-LC opera, a LC-GC pode ser manuseada no modo off-line ou no modo on-line. No sistema on-line, a análise torna-se mais sensível e mais rápida, diminuindo a manipulação de amostras, o que pode levar a erros, tais como a contaminação cruzada, formação de artefatos, etc. O modo off-line, é de mais fácil operação, no entanto requer alto tempo de análise, intensiva operacionalidade e baixa reprodutibilidade[43].

Uma grande desvantagem é a necessidade de que a fase móvel seja altamente volátil e, consequentemente, volatilize rapidamente ao ponto de não interferir na separação realizada na primeira dimensão, sendo esta a principal limitação da LC-GC. As técnicas hifenadas de heart-cut são eficientes para uma grande variedade de amostras. Porém, muitas vezes não são eficientes na separação de determinadas matrizes altamente complexas. Esses sistemas complexos são comuns em extratos vegetais devido a elevada diversidade estrutural e físico-química dos metabólitos secundários biosintetizados. Nesses casos, faz-se necessário a utilização de técnicas multidimensionais mais avançadas, abrangentes, tais como a LCxLC, GCxGC, SFCxSFC, LCxGC, SFCxGC, SFCxLC. Scientia Chromatographica 2016; 8(4):209-229

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2.2. Técnicas multidimensionais abrangentes 2.2.1. GCxGC

A cromatográfica gasosa bidimensional abrangente (GCxGC) foi inicialmente descrita por John Phillips e colaboradores em 1991[44], onde foram realizadas separações por duas colunas com diferentes seletividades conectadas em série através de uma interface denominada modulador. É considerada a maior inovação da GC após o desenvolvimento de colunas capilares em 1958. Desde o seu desenvolvimento é considerado um dos métodos de separação mais poderosos, extensivamente aplicado na separação de matrizes complexas. Os principais atrativos são a elevada capacidade de pico, o aumento do sinal dos analitos devido a reconcentração realizada pelo modulador e a habilidade em produzir um cromatograma estruturado[12,45].

A capacidade de pico, explicada anteriormente, é o parâmetro que mede a capacidade de separação das colunas a serem utilizadas. Segundo Giddings[46], para se ter uma separação de 100 picos ordenados, precisa-se que uma coluna apresente aproximadamente 40.000 pratos, ao passo que para resolver 82 de 100 picos aleatórios, precisa-se de aproximadamente 4.000.000 pratos.

A separação e análise em um sistema bidimensional abrangente é muito mais poderosa do que em um sistema unidimensional ou multidimensional não-abrangente. Se a capacidade de pico da 1D for n1 e da 2D for n2, a capacidade total de picos será n1 x n2 picos[13]. Sendo assim, o plano de retenção tem muito mais capacidade de pico do que somente uma linha de retenção (unidimensional), adaptando-se a misturas mais complexas. O componente de identificação é muito mais poderoso e confiável já que cada analito apresenta dois tempos de retenção.

Em GCxGC os dados obtidos são plotados em forma de um croamatograma tridimensional, no qual os eixos são definidos de acordo com o tempo de retenção da primeira dimensão (tR1) x tempo de retenção da segunda dimensão (tR2) x sinal registrado pelo detector

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(intensidade do sinal é dado pela altura do pico ou por escala cromáticas, como nos diagramas de cores).

A Figura 3 ilustra a comparação entre um cromatograma unidimensional obtido por GC-TOFMS (A) e cromatogramas bidimensionais obtido por GCxGCTOFMS a partir da análise de metabolitos produzidos por Escherichia coli mutante (B) e tipo selvagem (C).

A coloração e dimensão dos picos estão relacionadas à intensidade do sinal.

Nesta figura, é possível observar que os compostos leucina e glicerol coeluem no sistema unidimensional (D) e são eficientemente resolvidos no sistema multidimensional (E e F).

Uma boa estruturação do cromatograma é capaz de fornecer informações sobre classes de compostos (séries homólogas, isômeros, etc.) contidas nas amostras (geralmente aglomerados em regiões bem definidas, “clusters”) e fornecer informações qualitativas, já que é possível fazer uma análise visual de grupos de compostos e identificá-los com ajuda de um espectrômetro de massas[11,45,46].

Contudo, para obter um cromatograma bem estruturado é preciso ter uma alta capacidade de pico, ortogonalidade, resolução e sensibilidade, além de uma boa otimização desses parâmetros.

Idealmente, para que exista ortogonalidade é necessário que a separação na primeira coluna não seja correlacionada com a separação na segunda coluna.

Atenderá a este requisito sistemas multidimensionais que apresentem dois mecanismos de separação diferentes aplicados a toda a amostra[48].

Em GCxGC, a ortogonalidade é dada por anulação do que há em comum entre as dimensões. Uma maneira de ajustar o grau de ortogonalidade é com a utilização de uma programação de temperatura, por exemplo, durante a separação de uma série homóloga de n-alcanos[11].

O grau de ortogonalidade dependerá do quanto estarão relacionadas as fases estacionárias entre as duas

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Figura 3. Comparação entre cromatogramas unidimensionais e bidimensionais (Adaptado de Marriott et al., 2002)[48].

dimensões. Não se pode presumir, portanto que todas as separações em GCxGC serão verdadeiramente ortogonais, mas sim, pode-se medir o grau de ortogonalidade do sistema ou a sua ortogonalidade parcial. Uma coluna ortogonal não nos dará necessariamente uma ótima resolução dos picos, mas será possível a utilização do máximo do espaço de separação disponível. Isto somente é feito com ajuste instrumental correto[49]. Assim é possível observar que quanto mais próximo do valor teórico for a capacidade de picos do sistema real, maior será a utilização do espaço de separação, mais ortogonal será o sistema e mais estruturado será o cromatograma[49].

Desse modo, sistemas multidimensionais possuem uma grande vantagem sobre os sistemas lineares, por apresentarem uma gama de parâmetros que podem ser 218

ajustados para obter a melhor separação de compostos em uma mistura complexa[44].

O número de parâmetros necessários para separar analitos completamente em uma amostra, foi definido em 1995 por Giddings et al.[46], com o termo dimensionalidade da amostra. Um exemplo prático foi apresentado na Figura 3, em que houve a necessidade de uma segunda dimensão para que todos os compostos pudessem ser separados de maneira eficiente.

Em geral, a GCxGC se destaca da GC convencional devido ao ganho significativo de capacidade de pico, aumento da seletividade com a utilização de duas fases estacionárias diferentes, aumento da sensibilidade (normalmente conseguida com a utilização de Scientia Chromatographica 2016; 8(4):209-229

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moduladores térmicos com gases criogênicos que geram o efeito de compressão de bandas e diminuição do ruído) e a ordem espacial no qual os compostos quimicamente similares eluem[50].

A configuração de um sistema GCxGC é bastante simples e pode ser implementado em qualquer instrumento GC disponível comercialmente. Duas colunas com diferentes seletividades são conectadas em série por uma interface chamada de modulador.

O sucesso de transferência da coluna primária para a secundária deve-se a rápida e precisa transferência dos analitos entre as colunas, mantendo a ortogonalidade[51].

As principais condições operacionais que devem ser otimizadas em GCxGC são o período de modulação ou frequência, escolha da fase estacionária e dimensões da coluna, programação da temperatura e configurações do detector[52].

O período de modulação ou frequência (Pm) é o tempo que o modulador leva para coletar, focalizar e reinjetar uma fração da amostra proveniente da primeira coluna para a segunda coluna e está relacionado ao tempo necessário para que os compostos sejam eluí que que dos na 2D. Esse período tem que ser curto o suficiente para que a separação da primeira dimensão não seja perdida, ou seja, se o modulador não executasse sua função, quando os analitos separados na primeira dimensão percorressem a segunda coluna, os picos poderiam se sobrepor e coeluiriam, fazendo com que fosse perdido o principal requisito da GCxGC. Além disso, o Pm deve ser frequente em toda a corrida. Para não perder a separação, um pico deve ser no mínimo fracionado três vezes[53]. Por exemplo, se um composto demora 24 segundos para sair da primeira dimensão, então o período de modulação deve ser de no máximo 8s.

Outro parâmetro a ser estudado são as dimensões da coluna. Para que a separação na primeira coluna não seja perdida, a separação na segunda dimensão deverá ser suficiente rápida para que as frações injetadas pelo modulador não se sobreponham. Para isto é necessário

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que o mecanismo de separação na 2D seja tão rápido quanto o período de modulação, ou seja, colunas muito longas, poderiam levar a sobreposição de compostos.

Em geral, a primeira dimensão é sempre nas medidas que já eram utilizadas para a sua análise unidimensionais por GC. A escolha das dimensões da segunda coluna, dependerá da velocidade com que os analitos saem para o detector, mas em geral as dimensões variam de 0.5 m a 1 m de comprimento.

Além das dimensões do conjunto de colunas, o sucesso da separação por GCxGC depende diretamente das diversas fases estacionárias que as compõe. Por muitos anos, pensava-se que a máxima separação ocorreria com o máximo de diferença entre as fases estacionárias. Mas existem trabalhos que utilizam conjuntos de colunas com menores diferenças de polaridades e ainda assim funcionam muito bem[50].

A otimização da fase estacionária para separações de misturas complexas, é praticamente impossível sem a prévia análise no sistema cromatográfico, ou seja, é feita no modo tentativa e erro. Isto acontece devido à imensidão de compostos com diversas estruturas e polaridades presentes em amostras complexas. Colunas do tipo de polímeros monolíticos macroporosos[59] e líquido iônico, por exemplo, estão sendo cada vez mais utilizadas principalmente por possuir um alto limite de temperatura e por sua fase estacionária ser de alta polaridade, que proporciona uma maior seletividade por manter interações específicas entre analitos de alta polaridade[55]. Diferenciando-se assim, das colunas polares normais que geralmente possuem baixo limite de temperatura[54]. Dessa forma, espera-se que seja altamente seletiva para alcalóides, flavonóides e metabólitos polares em geral e menos seletivas para terpenóides, por exemplo. Ragonese et al. (2012)[56], fizeram uma breve revisão sobre a utilização de colunas de liquido iônico para diversos tipos de análises por GCxGC, no qual observou que a maior eficiência é obtida para a análise de ésteres metílicos de ácidos graxos[57,58].

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Além dos vários tipos de colunas existentes, o avanço instrumental permitiu a análise de compostos por duas fases estacionárias de diferentes polaridades em paralelo, além da cromatografia bidimensional (GCx2GC). Este sistema utiliza uma válvula que divide o fluxo entre as segundas dimensões igualitariamente após o modulador, aumentando a possibilidade de separação de diferentes classes de compostos (hidrocarbonetos, álcoois, ésteres, cetonas, compostos halogenados e aromáticos), contidas numa mesma amostra, sendo analisadas por um único detector, formando um cromatograma bidimensional com maior número de informações[60-62].

Apesar da elevada importância dos demais componentes da GCxGC, o modulador é considerado o coração da técnica, é a interface que interliga a 1D à 2D. As principais funções de um modulador são: acumular continuamente ou “aprisionar” pequenas frações provenientes da primeira separação, também chamada de fase de coleta, reconcentrar (focalização) as frações eluídas no espaço ou tempo, e reinjetar estas frações com pulsos rápidos (frações de segundos) e periódicos na segunda dimensão. Normalmente a separação na segunda dimensão termina antes que a próxima fração reconcentrada é injetada[64]. Consequentemente, o modulador é o maior responsável pela eficiência da 2D (se os analitos não forem remobilizados de maneira rápida e eficaz, haverá um alargamento dos picos adicional ao causado pela segunda separação.

de consumíveis adicionais e tem design muito mais simples que outros moduladores, como os térmicos, além de respondem muito bem a compostos altamente voláteis. A sua maior desvantagem é a ausência de aprisionamento dos analitos antes da reinjeção na coluna secundária, diminuindo a sensibilidade e resolução das análises. Além disso, são limitados a análises de amostras contendo compostos com pontos de ebulição de até 280°C[14].

Os moduladores com fluxo alternado (do inglês flow-switching modulator) substituíram os moduladores de válvulas. Neste não há a restrição térmica, sendo possível a análise de amostras contendo analitos com elevados pontos de ebulição, tais como óleo diesel, compostos orgânicos de baixa volatilidade e hidrocarbonetos aromáticos em gasolina[69,70]. Sua desvantagem é a difícil otimização, se houver qualquer variação, por exemplo mudança na vazão do gás, todos o sistema pneumático teria de ser reavaliado e novamente otimizado.

A única peça necessária para transformar um sistema 1D-GC em 2D-GCxGC é um modulador e, desde seu surgimento em 1991[65], assumiram vários formatos e tamanhos. Dentre eles os que mais se destacaram foram os de válvulas[66], térmicos[65], criogênicos[67] e os de fluxo[68].

Como alternativa para tentar melhorar o modulador de fluxo alternado, surgiu em 2006 o modulador de fluido simples[71]. Outros aprimoramentos foram surgindo tais como os moduladores de fluxo pulsado[72], modulador de parada de fluxo[73] (do inglês stop-flow) e os moduladores de chave Deans[74] (do inglês Deans switch). Em 2008, a Agilent Technologies introduziu em seu programa os moduladores de tecnologia de fluxo capilar baseado no protótipo desenvolvido por Seeley et al. em 2006[71]. Os mais novos moduladores também são versões melhoradas de antigos moduladores de fluxo, como o desenvolvido por Tranchida et al.[75], e o feito por Griffith et al.[76], ambos baseados no modelo vendido pela Agilent, e o modelo desenvolvido por Lidster et al.[77], baseado em moduladores de válvulas.

Sistemas que utilizam válvulas de alta velocidade para realizar a modulação, denominados moduladores de válvulas, não estão entre os mais empregados, mas são significativamente importantes. Uma das maiores vantagens desses moduladores é que não necessitam

A invenção dos moduladores criogênicos longitudinais permitiu um grande avanço e aceitação pela comunidade científica da GCxGC, entretanto, devido a sua complexa instrumentação, por serem utilizadas muitas partes móveis, a reposição e quebra eram

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demasiadamente constantes quando utilizados a longo prazo. Além disso, era impossível analisar de maneira satisfatória compostos orgânicos voláteis (VOCs).

Então, com o intuito de resolver esses problemas, surgiram os moduladores de duplo estágio ou conhecido como modulados de quatro jatos.

Nesses sistemas, a modulação é realizada a partir de dois jatos quentes e dois jatos frios de CO2 situados no topo da segunda coluna cromatográfica e pulsados alternadamente. O primeiro jato frio coleta os analitos provenientes da primeira dimensão. Quando o primeiro jato quente e o segundo jato frio são ligados simultaneamente, os analitos são mobilizados e focalizados (reconcentrados), para posterior remobilização e injeção na segunda dimensão com o aquecimento local através do segundo jato quente.

Uma versão comercial ainda hoje utilizada é vendida pela LECO Corporation. Dessa forma este tipo de modulador vem sendo bastamente aplicado em áreas tais como a indústria petroquímica, análises ambientais e na metabômica, entre outros.

Por fim os moduladores são a peça chave da cromatografia bidimensional abrangente, tentou-se fazer um breve levantamento histórico dos principais moduladores e das suas maiores diferenças. Abaixo

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resumidamente as maiores vantagens e desvantagens dos diversos tipos de moduladores (Tabela 1).

A utilização da GCxGC na análise de metabólitos secundários vem crescendo consideravelmente, principalmente no estudo do perfil metabólico de plantas e de suas interações com patógenos, bem como possibilitar testes eficientes para o diagnóstico precoce de doenças em plantas e vegetais.

Dentre as diversas classes de metabólitos secundários, os terpenóides tem papel importante no mecanismo de defesa de plantas. Hantao et al.

(2013a)[81], investigaram a presença de vários terpenóides provenientes da fração volátil de Eucalyptus globulus, que poderiam ser utilizados com sucesso como biomarcadores de doenças causadas pelo fungo necrotrófico Teratosphaeria nubilosa em eucaliptos, utilizando para tal experimento um protótipo de GCxGC-qMS. A otimização foi realizada buscando aumento na detectabilidade dos analitos traço, mesmo comprometendo a simetria de alguns analitos majoritários (aparecimento de caudas na primeira e segunda dimensão). O período de modulação escolhido foi de 6s, tempo necessário para que houvesse separação na 2D, e modulador do tipo criogênico de duplo estágio. Foi necessária a utilização de uma ferramenta quimiométrica para que fosse desconsiderada a presença

Tabela 1. Vários tipos de moduladores, suas vantagens e desvantagens (Fonte: Semard et al., 2011[80]).

Tipos de moduladores Térmico Criogênicos (CO2 e N2) Válvulas

Vantagens ✓ Não utiliza líquidos criogênicos ✓ 100% da conservação do peso ✓ 100% da conservação do peso

✓ Capacidade de pico na segunda dimensão ✓ Não utiliza líquidos criogênicos ✓ Não utiliza líquidos criogênicos

Fluxo diferencial Fonte: Semard et al., 2011[80].

✓ Modula compostos <C

7

(CO2)

✓ Capacidade de pico na segunda dimensão ✓ 100% da conservação do peso

Desvantagens ✓ Trabalha a uma temperatura limite de 230°C ✓ Utilização de líquido criogênico ✓ Ruim coleta de compostos <C ✓ 80% da conservação do peso

7

(CO2)

✓ Baixo período de modulação (<2s)

✓ Trabalha a uma temperatura limite de 200°C ✓ Resolução na segunda dimensão ✓ Uso de H

2

como gás de arraste

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dos componentes majoritários, já que estes reprimiam a presença dos minoritários e possíveis biomarcadores.

O autor observou ainda que, com o desenvolvimento do fungo, a espécie vegetal produziu um percentual de monoterpenos menor e biossintetizou mais sesquiterpenos. No estudo, foi possível identificar 40 compostos passíveis de serem biomarcadores para esta espécie de planta/doença por fungo.

Hantao et al. (2013b)[82], em um estudo similar, avaliaram a resistência desta mesma planta contra o fungo causador da ferrugem (Puccinia psidii), que afeta consideravelmente o crescimento de eucaliptos. Para isto, foi utilizado uma ferramenta quimiométrica chamada de PARAFAC (análise de fatores paralelos), que permite avaliar simultaneamente as informações geradas por um conjunto de dados obtidos por GCxGC. As condições experimentais em ambos trabalhos foram similares, exceto pelo fato de que indesejáveis efeitos de alargamento de cauda foi solucionado pelo uso de um período de modulação mais curto (5s) que aquele utilizado no primeiro estudo (6s). Além disso, a utilização de uma segunda dimensão de maior comprimento (200 cm) foi necessária para maior resolução dos picos, já que os metabólitos analisados apresentaram polaridades semelhantes. Neste contexto, foi possível identificar analitos relevantes para a detecção de espécies susceptíveis e não-susceptíveis à doença, destacando-se principalmente a presença de eucalipitol e acetato de α-terpenila como biomarcadores de plantas resistente ao fungo.

A detecção dos metabólitos nos trabalhos citados acima foi realizada através de um quadrupolo com velocidade de aquisição de dados de 25 Hz, o que poderia inviabilizar a realização de análises quantitativas sem a adição de padrão. Em contrapartida, analisadores de massas do tipo TOF, possuem alta velocidade de aquisição de espectros (>5 Hz), permitindo que compostos na faixa de nano até fentomolar sejam passíveis de identificação e quantificação. Sua principal desvantagem é o alto custo de aquisição.

222

Dados obtidos por GCxGC-TOFMS foram comparados com pesquisas feitas por CE-TOFMS na identificação de metabólitos produzidos pela bactéria Escherichia coli. Timischl et al. (2008)[84], identificou 58 metabólitos aniônicos (muitos destes por eletroforese e entre esses, apenas 18 foram identificados por GCxGC. Alguns compostos identificados por CE estava fora da faixa de análise da GC, tais como nucleotídeos.

Entretanto, a GCxGC demonstrou maior sensibilidade, conseguindo identificar e quantificar compostos que por CE não foi possível.

Cai et al. (2013)[85] avaliaram o perfil metabólico dos botões secos das flores de Lonicera japonica Thunb, uma erva medicinal bastante difundida na medicina tradicional chinesa através de um GCxGCTOFMS. A espécie é famosa devido a suas comprovadas atividades farmacológicas, como bactericida[85], antiinflamatória[86], antipirética, antioxidante, antiviral[87] e principalmente devido a atividade hepatoprotetora. No estudo, os autores utilizaram uma coluna apolar na 1D (DB-5ms; 30 m × 0.25 mm, 0.25 μm) e uma coluna de média polaridade (DB-17ht; 2 m × 0.1 mm x 0.1 μm) na 2D, o que permitiu separar os compostos na 1D de acordo com a pressão de vapor desses e, na 2D, principalmente devido a polaridade. O período de modulação otimizado foi de 6s e o analisador de massas operou em uma velocidade de aquisição de 100 Hz (espectos/s). Em separações de GC bidimensional onde os compostos eluem em frações de segundos, uma alta velocidade de aquisição de dados do MS é essencial, sendo a de 100 Hz, utilizada no estudo e conseguida em um analisador do tipo TOF, considerada satisfatória à quantificação. A análise permitiu identificar 73 compostos voláteis que foram subdivididos em nove grupos (furanos, compostos básicos, compostos ácidos, aldeídos, cetonas, álcoois, terpenos, ésteres e outros). Além disso, foi possível observar a eficiência do método cromatográfico ao separar três compostos estruturalmente semelhantes (2,3-dihidro-α-ionona, α-ionona e curcumeno). Sendo o mecanismo de separação da 2D baseado principalmente na polaridade dos componentes, o curcumeno, menos Scientia Chromatographica 2016; 8(4):209-229

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polar dentre os três, apresentou a menor interação com a fase de média polaridade da coluna DB-17ht, seguido por α-ionona e 2,3-dihidro-α-ionona. Este último metabólito difere da α-ionona somente por apresentar um instauração adicional no anel ciclohexeno.

Cao et al. (2011)[88] utilizou a GCxGC-TOFMS para analisar os metabólitos voláteis presentes em partes aéreas (caule, ramo, folha, inflorescência, flor e semente) de Mentha haplocalyx Brip. Na análise, foi utilizada uma coluna apolar DB-XLB (30 m x 0,25 mm x 0,1 µm) na 1D e uma coluna de média polaridade BPX-50 na 2D (1 m x 0,1 mm x 0,1 µm), período de modulação de 7s empregando um modulador térmico e o MS operando com velocidade de aquisição de 100 espectros/s. No estudo foram identificados 163 compostos, em sua maioria, pertencente a classe dos terpenos, sendo o mentol (24%) e a mentona (10%) os componentes mais abundantes. É importante destacar que a resolução de compostos em amostras complexas (>100 analitos) raramente será realizada eficientemente em sistemas unidimensionais e, quando é feita nesses sistemas, a inevitável coeluição pode levar a caracterização precipitada de compostos como reflexo da mistura de fragmentos de diferentes componentes em um único pico.

Zhaoa et al. (2012)[89] realizaram um estudo similar ao de Cao et al. (2011) ao analisar os voláteis das partes aéreas de Mentha haplocalyx Brip utilizando o mesmo método de extração (hidrodestilação em um aparelho do tipo Clevenger), mas plataformas de GC-qMS para detectar os compostos e GC-FID para quantifica-los (velocidade de aquisição similar à do TOFMS). No estudo foram analisados 37 acessos da espécie, que diferem entre si devido às diferentes regiões onde foram coletadas. A composição química e/ou do percentual dos metabólitos variou significativamente entre os acessos, permitindo a divisão destes em seis diferentes quimiotipos da espécie (linaol, mentona, pulegona, carvona e quimiotipo óxido de piperitona).

Porém, o fato a se destacar é que, apesar da diversidade de amostras da espécie estudada, o número de compostos identificados não ultrapassou 40, sendo bastante

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inferior aquele detectado na análise realizada por Cao e colaboradores[88], refletindo a necessidade de um sistema abrangente em análises de amostras complexas.

2.2.2. LCxLC

Quando uma amostra complexa não pode ser analisada por GCxGC, devido a presença de componentes termolábeis por exemplo, uma alternativa eficiente é a técnica abrangente LCxLC. Essa técnica foi desenvolvida em 1978 por Erni e Frei[90]. Assim como na GCxGC, um dispositivo na interface entre as colunas é responsável por coletar o efluente da primeira coluna em pequenas frações e transferi-lo para a segunda coluna. Os mesmos princípios de ortogonalidade e condições necessárias a multidimensionalidade discutidos para GCxGC são aplicados à LCxLC. Um grande vantagem da LCxLC, além da variedade estrutural de metabólitos passíveis de serem analisados, é que a composição da fase móvel pode ser ajustada para otimizar a separação, diferente da GCxGC. Além disso, diferente da cromatografia gasosa abrangente que, em geral, é restrita a separação por pressão de vapor e polaridade, existe uma ampla variedade de métodos de separação aplicáveis à LCxLC, como por adsorção, partição, exclusão de tamanho, troca iônica ou cromatografia por afinidade. A principal limitação da LC abrangente é a incompatibilidade da fase móvel nas duas dimensões.

Desde que os analitos sejam analisáveis tanto por GCxGC como por LCxLC, dois fatores podem ser determinantes na escolha da técnica. O primeiro é que a capacidade desta primeira é significativamente maior que a capacidade de pico da LCxLC. O segundo é que, em geral, os sistemas de detecção e ionização são melhores acoplados à GCxGC, permitindo por exemplo, a fragmentação dos analitos à 70 eV em uma fonte de EI e, dessa forma, desfrutar dos inúmeros bancos de dados existentes para esse tipo de fragmentação. Entretanto, as duas técnicas não devem ser consideradas competitivas, mas complementares já que raramente é possível analisar determinados componentes de uma amostra complexa por ambas as técnicas.

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Figura 4. Gráficos bidimensionais para a separação de saponinas extraídas das raízes de P. grandiflorum utilizando um conjunto de colunas C18xCN (a) e C18xNH2 (b). Em “a” é possível observar que a separação ocorreu apenas na primeira dimensão, enquanto que em “b” a separação é eficiente em ambas às dimensões como pode ser mais bem visualizado através da ampliação “c”, “d” e “e”. (Adaptado de Jeong et al., 2010)[91].

Jeong et al. (2010)[91] utilizaram a LCxLC-MS com ionização por eletrospray (ESI) para analisar saponinas presentes nas raízes de Platycodon grandiflorum A.DC. (Campanulaceae). No estudo, foi utilizado uma coluna de C18 (150 mm x 1 mm x 5 µm) na primeira dimensão e na segunda dimensão foram testadas duas diferentes colunas, uma revestida com ciano (Hypersil GOLD CN; 50 mm x 4 mm x 3 µm) e uma outra com fase estacionária revestida por grupos aminopropil (Luna NH2; 50 mm x 4 mm x 3 µm). O conjunto de colunas C18xNH2 permitiu separar três componentes minoritários do extrato e cinco saponinas isoméricas relativamente abundantes (Figura 4). Enquanto que, o conjunto C18xCN não demonstrou eficiência na separação, sendo o perfil obtido similar ao da análise 224

unidimensional utilizando uma coluna com fase C18. Essa observação experimental provavelmente é atribuída à falta de ortogonalidade devido a interação similar entre as saponinas com ambas as fases C18 e CN. Os picos 5 e 17 na Figura 4c foram caracterizados como deapi-poligalacina E e poligalacina D2. A eficiência da separação pode ser mais bem visualizada nas Figuras 4d e 4e. Nesta primeira, é observada na 2D a separação entre o 3-O-acetil-poligalacina D3 (pico 10) e o dexil-3-O-acetil-poligalacina D3 (pico 15i). Por outro lado a Figura 4 ilustra a separação entre o 2-O-acetilpoligalacina D3 (pico 10i; isômero do 10) e o dexil-2-Oacetil-poligalacina D3 (pico 15; isômero do 15i).

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Técnicas Cromatográficas Multidimensionais na Investigação de Metabólitos Secundários

3. Conclusão

Devido à complexa maquinaria enzimática existente em espécies vegetais, a diversidade estrutural de compostos biossintetizados por essas espécies é extremamente grande. A importância de muitos desses metabólitos, seja devido ao seu valor comercial, por possuir determinada atividade farmacológica ou por seu papel em mecanismos de defesa e adaptação das espécies, entre outras propriedades, têm impulsionado, desde sua primeira descrição[2], o desenvolvimento de técnicas capazes de caracterizá-los. Nesse âmbito, as técnicas multidimensionais abrangentes se destacam por apresentar alta capacidade de pico que permite a resolução de componentes presentes em amostras complexas, como metabólitos secundários em extratos vegetais. O uso dessas técnicas para analisar extratos

Prata PS et al.

vegetais de espécies extensivamente estudadas por técnicas não-abrangentes tem revelado compostos até então não detectados por metodologias não-abrangentes, o que demonstra seu sucesso.

Dentre as técnicas multidimensionais abrangentes, a GCxGC é a que possui maior capacidade de pico e, em geral, mais eficientemente acoplada a sistemas de detecção. Entretanto, é restrita a compostos voláteis.

Devido a grande diversidade estrutural de metabólitos secundários não existem técnicas capazes de analisar todas as classes químicas desses metabólitos.

Porém, as técnicas abrangentes disponíveis, quando utilizadas em conjunto, podem fornecer um perfil global dos metabólitos que constitui uma determinada espécie vegetal.

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Scientia Chromatographica 2015; 7(1):230-230 Instituto Internacional de Cromatografia http://dx.doi.org/10.4322/sc.2015.000 ISSN 1984-4433

230

CLASSIFICAÇÃO

Scientia Chromatographica 2015; 7(1)

Scientia Chromatographica 2016; 8(4):231-238 Instituto Internacional de Cromatografia http://dx.doi.org/10.4322/sc.2016.035 ISSN 1984-4433

HPLC

Separation of Steroids by Temperature-Programmed Capillary Liquid Chromatography Using Packed Fused-Silica Column Separação de Esteróides por Cromatografia Líquida Capilar Programada por Temperatura Usando Coluna de Sílica Fundida Empacotada

Alessandra Maffei Monteiroa Lincoln Figueira Marins Coutinhoa Carlos Eduardo Domingues Nazariob Fernando Mauro Lançasa* Institute of Chemistry of São Carlos, University of Sao Paulo, São Carlos, SP, Brazil b Institute of Chemistry, Federal University of Mato Grosso do Sul, Campo Grande, MS, Brazil *flancas@iqsc.usp.br a

Recebido: 01-11-2016 Aceito: 02-12-2016

Scientia Chromatographica 2016; 8(4)

Abstract

The miniaturization of liquid chromatography and the development of fused silica capillary packed columns have enable a fast and homogeneous heat transmission through the analytical column. Thus, the use of temperature programming instead of gradient of mobile phase becomes an alternative to decrease the analysis time. This manuscript reports on the applicability of an analytical method for the separation of five steroids by temperature programming capillary liquid chromatography.

The influence of the temperature on analytes retention time was investigated and discussed. The steroids were separated by a lab-made capillary column (RP-18) under isocratic elution. The temperature programming allowed to reduce twice the analysis time and diminished the band broadening of the most retained compound in comparison with isothermal analysis.

Keywords: capillary liquid chromatography, temperature programming, steroids.

Resumo

A miniaturização da cromatografia líquida e o desenvolvimento de colunas capilares de sílica fundida empacotadas com a fase estacionária possibilitaram a rápida e homogênea transferencia de calor na coluna analítica. Desta forma, o uso da programação de temperatura ao invés do gradiente de fase móvel torna-se uma alternativa para diminuir o tempo de análise. Este trabalho relata a aplicabilidade de um método analítico para a separação de cinco esteróides utilizando cromatografia líquida capilar com programação de temperatura. A influência da temperatura na retenção dos analitos foi investigada e discutida. Os esteróides foram separados uma coluna capilar lab-made (RP-18) utilizando eluição isocrática. A programação de temperatura permitiu a redução do tempo de análise em duas vezes e diminuiu a dispersão da banda cromatográfica do composto mais retido em comparação com análises em condições isotérmica.

Palavras-chave: cromatografia líquida capilar, programação de temperatura, esteróides.

231

Monteiro AM et al.

Separation of Steroids by Temperature-Programmed Capillary Liquid Chromatography

1. Introduction

The use of columns with reduced internal diameter in liquid chromatography (LC) has several advantages over the conventional LC column, such as low consumption of mobile phase, low sample volume injection and possibility of applying temperature programming (TP) during the analyses[1-4]. Due to the large bore of the standard LC columns (4.0 – 4.6 mm i.d.) the radial temperature gradient creates difficulties for the accomplishment of TP in such a column. However, the development of capillary LC columns using fused silica tubes whose internal diameter is equal or smaller than 0.25 mm has enabled a fast and homogeneous heat transmission through the column wall.

The first report on the effect of temperature on chromatographic retention was published in 1946[5], although TP in LC was reported only in 1966[6]. The study of the effect of temperature on miniaturized LC (both microbore and capillary LC) began in the 1980’s[7] with extensive researchers lidered by Ishii, Sumiya, Jinno and McNair groups. Thompson and Carr[8] claimed that the stability of the analytes should not be affected when the compounds were exposed to high temperatures for a relatively short time. The thermal stability of the stationary phases used in LC has been discussed in the literature[9,10]. Some papers and reviews describing the applicability of high temperature or TP for separations in LC have been reported[11-15].

In general, the effects on the analytes retention time produced by TP are similar to those observed when solvent gradient is applied. The dependence of the dielectric constant of water (kwater) as a function of temperature can be approximated by the Equation 1: kwater ≈ 80 − 0.4(T − 273)

(1)

where T is the absolute temperature (Kelvin). The Equation 1 demonstrates that increasing the analysis temperature reduces the water polarity. Thus, at elevated temperature, the aqueous solvent shows characteristics comparable with organic polar solvent (methanol or acetonitrile).

232

Another consequence of increased analysis temperature is the lowered viscosity of the mobile phase according to Equation 2[16]. η = 10

a+

b T +c

(2)

where η is the viscosity, T is the absolute temperature (Kelvin), and a, b, and c are coefficients that are specific to a solvent.

The mobile phase viscosity is directly proportional to pressure drop (η ∝ ∆P) and increasing the temperature, the pressure of the chromatographic system is diminished.

Therefore, the use of temperature programming in capillary packed liquid chromatography (TP-cLC) is considered advantageous for the reduction in the analysis time when the solvent gradient causes negative impacts on the detection (baseline variation on UV monitoring, changes in MS ionization using ESI) or when the high temperature of the eluent increases the sensitivity (ELSD). If the mobile phase is free of organic solvent, a low wavelenght UV or a FID detector can be used with HPLC[17].

Steroids comprise an important class of therapeutic compounds of similar chemical structure consisting of 17 carbon atoms arranged in the form of four interconnected rings. Among the methods developed to monitor steroids, a large number of papers employing HPLC have been published. These methods use mobile phase gradient or high temperature approach for steroids separation[18]. However, decreasing the analysis time without diminishing the resolution may be more effective when the gradient temperature is used during the chromatographic assay.

This paper reports on the discussion and applicability of TP-cLC for separation of estriol, estrone, progesterone, cortisone acetate and hydrocortisone acetate with no mobile phase gradient.

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Separation of Steroids by Temperature-Programmed Capillary Liquid Chromatography

2. Experimental 2.1. Materials and reagents

Analytical standards of estriol, estrone, progesterone and cortisone acetate were supplied by Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) and hydrocortisone acetate was obtained from Alfa Aesar (Ward Hill, USA).

HPLC-grade acetonitrile (ACN) was purchased from J. T. Baker (Phillipsburg, USA) and high-purity water was obtained from an Elga purification system (High Wycombe, UK). Stock solutions containing 500 mg L-1 of steroids were prepared dissolving each of the analytes in ACN:H2O (60:40, v/v). Subsequently, a working solution containing the five steroids at a concentration of 50 mg L-1 was prepared by diluting the stock solutions.

2.2. Chromatographic System

The analyses were performed in a chromatographic system composed of a homemade high-pressure pump and a micro-oven with high precision temperature control[19]. The sample was injected by a Valco valve (Houston, USA) of 60 nL internal loop volume connected to an electric actuator. The detection was achieved by an SPD-M10AVP Photodiode Array Detector connected to a CBM-20AD controller, in compliance with data acquisition software LabSolutions-LCsolution from Shimadzu (Kyoto, Japan). A capillary U-shaped detector cell with 8 mm light path and 35 nL (UZ-SHM-CAP) was purchased from LC Packings (Amsterdam, the Netherlands) and used in the experiments.

2.3. Preparation of the capillary column

A capillary column (150 mm x 250 μm i.d.) containing Kromasil RP-18 silica with 3.5 µm (Eka Chemicals, Bohus, Sweden) was packed in our laboratory through the slurry packing technique and according to a procedure previously described in the literature[20]. Frit of approximately 0.2 mm length was placed inside capillary by punching its tip against a glass fiber filter (Whatman GF/A, W & R Balston, UK). A 50 µm i.d. and 150 mm capillary was used to insert and retain the glass fiber frit approximately 5 mm from the column tip. Epoxy resin

Monteiro AM et al.

(Araldite 10 minutes, Brascola, Sao Paulo, Brazil) was used to keep the junction between the column capillary tubing and the connecting tubing. Slurry was composed of 8.0 mg of microparticles in a mixture containing isopropanol:tetrahydrofuran (1:6, v/v). It was sonicated for 10 minutes and placed in a stainless steel reservoir (3.5 mL) connected to the column capillary tubing.

A Shimadzu pump (model LC-20AD, Kyoto, Japan) operating at 10 MPa was used to delivery the packing solvent (MeOH) from the reservoir. When the packed bed have been achieved, the pumping process was stopped and the column was slowly depressurized to ensure minimal movement of the particles. The capillary column was connected to the chromatographic system by zero-dead-volume unions (Upchurch Scientific, Oak Harbor, WA, USA) and conditioned for two hours with ACN:H2O (70:30, v/v) before the use.

3. Results and discussion

The mobile phase used for the steroids separation was previously optimized by ACN:H2O in three different proportions under isothermal conditions (Figure 1). As a result, the mobile phase containing ACN:H2O (40:60, v/v) showed the best resolution between hydrocortisone and cortisone (Rs2,3 = 2.73) with a long analysis time (50 minutes). Then, a study using temperatures of 30°C, 60°C and 80°C under isothermal condition were performed to evaluated the influence of temperature in the chromatographic parameters of steroids (Figures 2A-C).

The influence of temperature on chromatographic retention can be expressed by van’t Hoff equation (Equation 3).  ∆H°   ∆S°  lnk = − +  + ln ∅  RT   R 

(3)

where k is the retention factor; ∆H° is the system enthalpy; ∆S° is the system entropy; T is the absolut temperature (Kelvin); R is the gas constant (8.31441 J K-1 mol-1); and φ is the volume ratio of stationary to mobile phase.

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Monteiro AM et al.

Separation of Steroids by Temperature-Programmed Capillary Liquid Chromatography

Figure 1. Comparative chromatograms obtained under isocratic conditions for the analysis of a standard mixture containing 50 mg L-1 of steroids.

Flow rate at 3.0 µL min-1 and UV detection at 234 nm. Order of elution: (1) estriol, (2) hydrocortisone acetate, (3) cortisone acetate, (4) estrone and (5) progesterone.

This equation describes the contribution of thermodynamics parameters on retention of analytes.

This relationship shows that for a given temperature variation, the retention factor for analytes with higher enthalpy is more affected than analytes with lower enthalpy values. Thus, a change in temperature can provide different selectivity and promoted the separation of analytes[21].

The Figure 3 shows the van’t Hoff plot (1/T plotted against the ln k) that express the relationship between the temperature and retention factor. A positive linear slope under reverse phase conditions was observed for all the steroids and suggests that (1) the retention 234

mechanisms are constant over the temperature range under consideration and (2) an increase in temperature causes a decrease in retention factor.

When the column chromatography was kept at 30°C (Figure 2A), the five steroids were completely separated, but as illustrated, the last eluting peak (progesterone, k = 23.59) were severely broadened and the analysis time was long (50 minutes). At 60°C (Figure 2B), the analysis time had been considerably reduced to 35 minutes with no overlapping of the chromatographic peaks (Rs2,3 = 1.90). However, when the column temperature was set to 80°C (Figure 2C), the analysis time was decreased (progesterone showed Scientia Chromatographica 2016; 8(4):231-238

Separation of Steroids by Temperature-Programmed Capillary Liquid Chromatography

Monteiro AM et al.

Figure 2. Comparative chromatograms obtained under isothermal (A-C) and TP (D) conditions for the analysis of a standard mixture containing 50 mg L-1 of steroids. Mobile phase: ACN:H2O (40:60, v/v). Flow rate: 3.0 µL min-1. Detection UV: 234 nm. Order of elution: (1) estriol, (2) hydrocortisone acetate, (3) cortisone acetate, (4) estrone and (5) progesterone.

k = 11.82), however it causes loss of the resolution and selectivity for hydrocortisone acetate and cortisone (Rs2,3 = 1.25 and α2,3 = 1.15). According to resolution master equation, the three terms in the equation (retention factor, selectivity and efficiency) are interdependent, i.e., small changes in k usually cause changes in α, therefore, apreciable changes in resolution are also observed. Since the resolution is increased with increasing values of N,

α and k, any factor that may alter these parameters may improve Rs. Change temperature affects all of them and therefore the resolution.

Since the isothermal separation of steroids at 60°C showed good results for hydrocortisone and cortisone (Rs2,3 = 1.91 and α2,3 = 1.18), this temperature was chosen to start the chromatographic analysis by TP-cLC to reduce the analysis time. During the first

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Monteiro AM et al.

Separation of Steroids by Temperature-Programmed Capillary Liquid Chromatography

Figure 3. van’t Hoff plot of steroids at temperature of 30°C, 60°C and 80°C during RP-HPLC experiments.

7 minutes, the temperature was kept at 60°C to avoid for saffisfactory resolution between hydrocortisone acetate and cortisone acetate. Subsequently, a temperature gradient of 20°C min-1 was applied to reach 100°C and remained isothermal at this temperature until the end of the analysis (Figure 2D). Under such conditions, the duration of the analysis with temperature gradient was 22 minutes (k = 9.43 for progesterone), with column efficiency of 86,104 N/m (estrone). A short temperature

Table 1. Chromatographic parameters obtained for steroids separation.

Compound

tR (min)

k

N/m

Rs2,3

α2,3

2.73

1.24

1.91

1.18

1.25

1.15

1.92

1.18

Isothermal - 30°C Estriol

3.30

0.69

10,048

Hydrocortisone acetate

8.56

3.39

22,453

Cortisone acetate

10.17

4.22

31,693

Estrone

15.93

7.17

58,539

Progesterone

47.96

23.59

64,523

Isothermal - 60°C Estriol

2.80

0.44

13,380

Hydrocortisone acetate

6.61

2.39

23,015

Cortisone acetate

7.46

2.83

29,314

Estrone

10.76

4.52

70,009

Progesterone

31.78

15.30

58,245

Isothermal - 80°C Estriol

2.80

0.44

13,380

Hydrocortisone acetate

5.93

2.04

18,523

Cortisone acetate

6.53

2.35

17,487

Estrone

8.98

3.61

33,071

Progesterone

25.00

11.82

55,096

Temperature programming – 60°C to 100°C

236

Estriol

2.97

0.52

15,054

Hydrocortisone acetate

6.86

2.52

31,373

Cortisone acetate

7.63

2.91

38,811

Estrone

9.66

3.95

86,104

Progesterone

20.34

9.43

76,402 Scientia Chromatographica 2016; 8(4):231-238

Separation of Steroids by Temperature-Programmed Capillary Liquid Chromatography

equilibrium time of 2 minutes was required in order to reset the initial conditions for next analysis. From the chromatograms, retention time (tR), retention factor (k), number of plates (N/m), resolution (Rs) and selectivity (α) were calculated. The results of the chromatographic parameters are summarized in Table 1.

Baseline variation in LC-UV experiments using mobile phase gradient has been often reported and affect the quantification. These effects were not observed during temperature programming analyses and no baseline correction was applied.

In fact, reducing peak band broading is a good strategy to improve the column efficiency. Thus, the utilization of temperature programming during the chromatographic process may decrease the peak widths and might also affect the peak intensity, especially for longer retained compounds. The comparison between the experiments in Figures 2A and 2D shows that there was a increase of 65 % in peak intensity and a reduction of 60 % in peak width (wb) for progesterone.

This approach enables the reduction of the analysis time

Monteiro AM et al.

approximately 50 % and 30 % in comparison with the chromatograms obtained at 30°C and 60°C, respectively, with no decomposition and overlapping peak of steroids.

4. Conclusion

This study has demonstrated that the use TP-cLC for the analysis of steroids is a very attractive alternative for a reduction in analysis time without the use of mobile phase gradient. The steroids were separated performed

by TP-cLC with no degradation of both analytes and column during the analysis. The TP-cLC method reduced twice the analysis time in comparison with the chromatogram at 30°C under isothermal condition.

Acknowledgements

The authors thank the São Paulo Research Foundation (FAPESP) under grants 2004/09384-7 and 2005/59360-0; the Brazilian National Council for Scientific and Technological Development (CNPq) under grants 306685/2009-4 and 162528/2013-2; and the Coordination for the Improvement of Higher Education Personnel (CAPES).

Scientia Chromatographica 2016; 8(4):231-238 237

Monteiro AM et al.

Separation of Steroids by Temperature-Programmed Capillary Liquid Chromatography

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238

Scientia Chromatographica 2016; 8(4):231-238

Scientia Chromatographica 2016; 8(4):239-256 Instituto Internacional de Cromatografia http://dx.doi.org/10.4322/sc.2016.036 ISSN 1984-4433

PREPARO DE AMOSTRAS

Extração em Fase Sólida Magnética (MSPE): Fundamentos e Aplicações Magnetic Solid Phase Extraction (MSPE): Fundamentals and Applications

Amandha Kaiser da Silva1 Eduardo Sobieski Neto1 Luiz Henrique Viana1 Fernando Mauro Lanças2 Carlos Eduardo Domingues Nazario1* Instituto de Química, Universidade Federal de Mato Grosso do Sul, Campo Grande, MS, Brasil 2 Instituto de Química de São Carlos, Universidade de São Paulo, São Carlos, SP, Brasil *carlos.nazario@ufms.br 1

Recebido: 01-11-2016 Aceito: 02-12-2016

Scientia Chromatographica 2016; 8(4)

Resumo

Diversas estratégias de preparo de amostras têm sido desenvolvidas com o objetivo de diminuir a tempo de análise e a manipulação da amostra, e maximizar a préconcentração dos analitos em matrizes complexas. O uso da tecnologia de separação magnética tem se destacado para esta finalidade pela simplificação das etapas de preparo de amostra. Neste conceito, a extração em fase sólida magnética (MSPE) baseia-se na manipulação de nanopartículas magnéticas para promover a separação das fases. Além da simplicidade e alta eficiência de extração, a MSPE supera alguns inconvenientes da SPE e d-SPE convencional. Nesta revisão, são discutidos os conceitos e estratégias de síntese das partículas magnéticas modificadas com diversos recobrimentos (sílica, MIP, surfactantes, líquidos iônicos, grafeno e derivados) para a extração e pré-concentração dos analitos em diversas matrizes.

Palavras-chave: preparo de amostra, MSPE, nanopartículas magnéticas, análise de traços.

Abstract

Several sample preparation strategies have been developed in order to decrease the analysis time and sample manipulation, and to maximize the analytes preconcentration in complex matrices. The use of magnetic separation technology has been highlighted for this purpose by the simplification of the sample preparation steps. In this concept, the magnetic solid phase extraction (MSPE) is based on the manipulation of magnetic nanoparticles to promote phase separation. In addition to simplicity and high extraction efficiency, the MSPE overcomes some drawbacks of conventional SPE and d-SPE. In this review, the authors discuss the concepts and strategies to prepare magnetic particles modified with different coatings (silica, MIP, surfactants, ionic liquids, graphene and derivatives) for the extraction and preconcentration of the analytes in several matrices.

Keywords: sample preparation, MSPE, magnetic nanoparticles, trace analysis.

239

Silva AK et al.

1. Introdução

A alta complexidade das matrizes juntamente com a baixa concentração dos analitos tem exigido um árduo trabalho de manipulação da amostra antes da análise instrumental (cromatografia líquida, cromatografia gasosa, espectroscopia atômica e espectrometria de massas)[1]. Além dessa vertente ser tediosa, pode influenciar negativamente na precisão e exatidão do método analítico. Dessa forma, diminuir o número de etapas no preparo de amostra sem reduzir a eficiência de extração é um desafio constante aos pesquisadores.

Desde a introdução da extração em fase sólida (SPE) na década de 1970, o uso de técnicas de extração baseada em sorbentes tem se destacado pela possibilidade de aumentar a seletividade dentro do preceito de química verde. Uma das variações da SPE, a extração em fase sólida dispersiva (dispersive solid phase extraction, d-SPE) possui como grande vantagem a redução do tempo de preparo de amostra[2]. Diferentemente da SPE, no qual o sorbente está empacotado no cartucho, a fase extratora da d-SPE é adicionada diretamente na matriz para extração/clean-up dos analitos. Assim, o contato imediato entre as fases proporciona uma extração mais efetiva sem a necessidade de pré-condicionar cartuchos ou a demora na percolação de grande volume de amostra.

Após atingir o tempo de equilíbrio na extração, a separação do sorbente e da matriz na d-SPE pode ser realizado por (a) centrifugação, (b) filtração ou (c) separação magnética. Essa última estratégia tem recebido enorme atenção dos pesquisadores nos últimos anos pois simplifica o processo de extração pela manipulação de um campo magnético externo.

Nanopartículas magnéticas (magnetic nanoparticles, MNPs) são os sorbentes utilizados nessa estratégia de preparo de amostra no qual são um grupo de partículas dentro da área de nanomateriais que possuem escala nanométrica com propriedades superparamagnética.

De maneira geral, as partículas são fortemente atraídas por um campo magnético externo. Entretanto, quando o campo magnético é removido, as partículas não retêm magnetismo residual[3].

240

Extração em Fase Sólida Magnética (MSPE): Fundamentos e Aplicações

Normalmente as MNPs são compostas por um núcleo rígido com propriedade magnética recoberta por uma camada de polímero que fornece a seletividade necessária para a extração dos analitos. É usual utilizar a terminologia “núcleo magnético@recobrimento” para facilitar a exemplificação do referido material de extração (Figura 1). Por exemplo, um material magnético no qual possui o núcleo baseado em óxido de ferro (Fe3O4) recoberto com sílica (SiO2) e funcionalizado com o grupamento C18 pode ser representado como Fe3O4@ SiO2-C18.

O uso de MNPs em preparo de amostra ganhou destaque no ano de 1996 com o trabalho publicado por Towler et al.[5] no qual utilizaram Fe3O4@MnO2 para a extração de metais em água do mar. Após três anos, o termo extração em fase sólida magnética (magnetic solid phase extraction, m-SPE ou MSPE) foi introduzido por Safarikova and Safarik[6] na extração de compostos orgânicos com estrutura planar (corante trifenilmetano, hidrocarbonetos poliaromáticos e alguns derivados). Como resultado, as MNPs (Fe3O4@SiO2NH2-ftalocianina de cobre) promoveram um fator de enriquecimento em torno de 460 vezes.

Em comparação à SPE e d-SPE convencional, algumas aplicações da MSPE utilizam pequena quantidade de fase extratora (10–50 mg). Assim, os termos microextração em fase sólida magnética

Figura 1. Imagem de microscopia eletrônica de transmissão (TEM) da (a) MNP de Fe3O4 e (b) MNP recoberta com sílica (Fe3O4@SiO2).

Adaptado com permissão da ref (4). Copyright (2008) American Chemical Society.

Scientia Chromatographica 2016; 8(4):239-256

Extração em Fase Sólida Magnética (MSPE): Fundamentos e Aplicações

(magnetic-micro-SPE, m-µ-SPE) ou microextração em fase sólida magnética dispersiva (magnetic dispersive micro-SPE, m-d-µ-SPE) também são comumente encontrados na literatura.

O fato de utilizar as propriedades magnéticas para separar a fase extratora da matriz analítica, na MSPE não há necessidade de centrífugas ou sistemas de filtração no processo de extração. Assim, o tempo de preparo de amostra e a perda de analitos são minimizados. Outras vantagens, tais como, a pequena quantidade de fase extratora, o baixo consumo de solvente orgânico, a reutilização do sorbentes e a possibilidade de projetar a seletividade do sorbentes também tem sido relatadas ao uso de MNPs.

Silva AK et al.

A Figura 2 demonstra a representação esquemática da MSPE. Na primeira etapa ocorre a dispersão do sorbentes na matriz líquida para a extração dos analitos.

Após atingir o tempo de equilíbrio, um magneto (imã) é utilizado para separar a matriz da fase extratora. Por fim, os analitos são eluidos em um solvente adequado e conduzidos para análise instrumental. O uso de agitação mecânica, vortex ou o uso de ultrassom nas etapas de extração/clean up são comumente utilizadas para facilitar a dispersão das MNPs. É importante ressaltar que muitos materiais baseados em nanopartículas (NPs) tem sido aplicados em métodos de preparo de amostra. Contudo, iremos centralizar nossa discussão apenas nas NPs com propriedades magnéticas.

Figura 2. Representação esquemática das etapas da extração em fase sólida magnética (MSPE). Adaptado com permissão da ref. (2). Copyright (2015) John Wiley and Sons Inc. Scientia Chromatographica 2016; 8(4):239-256 241

Silva AK et al.

2. Propriedades das MNPs e seus métodos de síntese

MNPs são aglomerados com uma dimensão característica na ordem de nanômetros (10-9 m) as quais possuem propriedades físicas e químicas diferenciadas e dependentes do tamanho, morfologia e estrutura cristalina[7]. Nas últimas décadas, houve um crescente interesse investigativo para compreensão de suas propriedades, estrutura e toxicidade devido a aplicação em diversas áreas (industrial, biomédica e separações).

Até o momento, poucas informações estão disponíveis sobre a toxicidade das MNPs. O tamanho nanométrico pode representar um risco aos seres humanos e ao meio ambiente, pois são capazes de penetrar nas células de maneira facilitada e diferenciada em relação a partículas maiores. É de conhecimento que à toxicidade das NPs é potencializada pelo método de fabricação, armazenamento, transporte e pela maneira na qual são incorporadas em produtos comercializados. Assim, sem as medidas de proteção, esses materiais podem ser inalados nos locais de trabalho (incluindo laboratórios de pesquisa), além da possível exposição dérmica em quantidades significativas. Em contato com o ser humano, as NPs podem danificar as células pela liberação de radicais livres a uma dose que supera as defesas naturais do organismo. Quanto ao impacto ambiental, atualmente poucas evidências são encontradas pela dificuldade de avaliação sobre a toxicidade em espécies não humanas, assim como os riscos de bioacumulação[8].

Na literatura são encontrados vários tipos de MNPs, tais como: óxidos de ferro (Fe3O4, γ-Fe2O3, α-Fe2O3, entre outros); ferritas de Co, Ni e Mg; e FePt, Co, Fe, Ni, CoPt, FeCo. Contudo, apenas as MNPs de óxido de ferro são aprovadas pela U.S Food and Drug Admistration (F.D.A) devido a sua biocompatibilidade com materiais orgânicos conferindo-as um grande potencial de aplicação área industrial, medicinal e ambiental. Adicionalmente, os materiais baseados em óxido de ferro são quimicamente inertes, possuem baixa 242

Extração em Fase Sólida Magnética (MSPE): Fundamentos e Aplicações

toxicidade e várias opções para síntese e modificação de sua superfície[9].

A literatura descreve uma dificuldade de distinção entre os óxidos de ferro devido à similaridade das partículas por não serem monocristais[9]. Desse modo, a caracterização das MNPs é comumente realizada através das técnicas de difração de raios X (XRD), microscopia eletrônica de transmissão (TEM) ou microscopia eletrônica de varredura (SEM). Enquanto pela XRD é possível determinar a estrutura química da MNP, a TEM e SEM são usadas para o estudo das suas características morfológicas[10].

Entre os 16 tipos de óxidos de ferro conhecidos, incluindo os hidróxidos e óxi-hidróxidos de ferro[11], a hematita (α-Fe2O3), magnetita (Fe3O4) e maghemita (γ-Fe2O3) são as MNPs comumente utilizadas devido aos seus polimorfismos, no qual a transição de fases ocorre pela indução da temperatura[12]. Apesar da mesma fórmula molecular, a hematita e maghemita diferem pelas suas estruturas cristalinas. A hematita possui célula unitária com simetria hexagonal com pares de Fe(O)6 octaedros devido ao arranjo dos cátions. Na maghemita, a célula unitária é cúbica e a maioria dos cátions presentes são de Fe(III). A diferença da magnetita em relação aos demais óxidos consiste na presença de ambos íons Fe(III) e Fe(II) podendo escrever sua fórmula como Y[XY]O4 (X = Fe(II) e Y = Fe(III)). A célula unitária é do tipo cúbica de face-centrada e sua estrutura cristalina consiste em camadas octaédricas e camadas mistas tetraédrica/ octaédrica empilhadas[11]. Os íons Fe(II) estão presentes na metade da camada octaédrica e os íons Fe(III) ocupam uniformemente a camada mista octaédrica/tetraédrica[12].

Muitos elementos de transição e/ou seus óxidos podem apresentar propriedades magnéticas, as quais são classificadas em dois tipos: substâncias que possuem momento de dipolo magnético atômico finito diferente de zero (µat ≠ 0) e substâncias que possuem µat = 0. O primeiro grupo compreende os materiais paramagnéticos com ordenamento ferromagnético, antiferromagnético ou ferrimagnético dos dipolos. O Scientia Chromatographica 2016; 8(4):239-256

Extração em Fase Sólida Magnética (MSPE): Fundamentos e Aplicações

segundo grupo corresponde aos materiais diamagnéticos no qual o momento de dipolo magnético é igual a zero (não magnéticos). Como as propriedades magnéticas de partículas com µat ≠ 0 são fortemente dependentes de sua geometria e dimensão, o óxido de ferro nanocristalino apresenta comportamento superparamagnético, enquan­ to sua escala micrométrica possui comportamento ferrimagnético. O termo superparamagnetismo está relacionado ao estudo das propriedades magnéticas de um único domínio magnético (monodomínio) com sistema análogo ao paramagnetismo[7].

Entre as estratégias para confirmação do comportamento superparamagnético de um sistema pode-se destacar: (a) a plotagem do gráfico magnetização reduzida versus campo magnético em determinada temperatura resulta na curva ideal conhecida como “lei de escala clássica do superparamagnetismo”; (b) se as isotermas de magnetização são de histerese; e (c) se a distribuição de tamanho ajustada é independente da temperatura[13].

Em relação a síntese, atualmente, diversas metodologias para preparo de MNPs baseadas em óxido de ferro têm sido desenvolvidas e, entre as mais comuns, pode-se citar os métodos de coprecipitação, síntese hidrotérmica e solvotérmica, sol-gel, decomposição térmica, microemulsão, e síntese sonoquímica. O desenvolvimento destas metodologias tem a preocupação sobre o escalonamento de produção e o controle das características das partículas, tais como a cristalinidade, estabilidade química, tamanho e estrutura. Estas características influenciam nas propriedades magnéticas das partículas e podem ser ajustadas através do controle das condições reacionais (pH, velocidade de agitação e temperatura de reação)[14].

O método clássico e usual para a obtenção de Fe3O4 ou γ-Fe2O3 é a coprecipitação no qual consiste na adição de uma solução alcalina em uma solução aquosa de Fe(II) e Fe(III) na proporção molar de 1:2 sob temperatura ambiente ou com aquecimento[14]. A reação pode ser exemplificada de acordo com a Equação 1[12].

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Fe2+ +2 Fe3+ +8 OH −  Fe ( OH )2 +2 Fe ( OH )3 → Fe3O 4 ↓ + 4 H2O

(1)

Devido ao fato das MNPs de Fe3O4 serem facilmente oxidadas para Fe2O3 na presença de oxigênio (O2), o meio reacional deve ser realizado sob atmosfera inerte. O controle do tamanho e da estrutura das NPs é realizado através da variação da velocidade de agitação, concentração e tipo de base empregada, do sal de ferro utilizado e da temperatura da reação. Uma característica desse método é a obtenção de partículas com baixa cristalinidade e ampla faixa de distribuição de tamanho. Além disso, o uso de alto valor de pH na mistura reacional pode auxiliar na obtenção de MNPs uniformes e monodispersas[14]. A maioria dos trabalhos envolvendo MNPs aplicadas em preparo de amostra utilizam o método de coprecipitação para a síntese do núcleo magnético (Fe3O4) dos sorbentes.

Tradicionalmente, após a solubilização dos cloretos de Fe(II) e Fe(III) em meio aquoso, ocorre a adição de amônia à temperatura de 75ºC-90ºC sob atmosfera inerte para a formação das MNPs[15,16].

Entretanto, variações sintéticas são relatadas na literatura, tais como o uso de sulfato de Fe(II) como substituinte do cloreto de Fe(II)[17-19], hidróxido de sódio utilizado como base[17,19] e reações realizadas à temperatura ambiente[18,19]. E Rajput et al.[20] ainda relata a adição hidróxido de tetrametilamônio após a lavagem como prevenção da formação de aglomerados.

Uma alternativa sintética é o método hidrotérmico no qual inclui várias tecnologias químicas via úmida para cristalização de substâncias em recipiente fechado. Essa cristalização ocorre a partir da alta temperatura de uma solução aquosa (130ºC - 250ºC) e alta pressão de vapor (0,3 - 4 MPa). Essa síntese tende a fornecer MNPs de óxidos de ferro com alta cristalinidade. Adicionalmente, essa metodologia possui a capacidade de criar fases cristalinas que não são estáveis no ponto de fusão[12], e também pode ser usada no preparo de nanoestruturas incomuns de óxidos de ferros (nanotubos e esferas ocas)[14].

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A diferença entre o método hidrotérmico e o solvotérmico consiste na utilização de solução aquosa e solução não-aquosa, respectivamente, no processo de cristalização. Ambas as rotas sintéticas são utilizadas para obtenção de NPs de α-Fe2O3, γ-Fe2O3 e Fe3O4 com alta cristalinidade[12]. Bao et al.[21] seguiu este método para a síntese da MNPs de Fe3O4 o qual dissolveu cloreto férrico, citrato sódio e acetato de sódio em etileno glicol.

A amostra foi aquecida à 200ºC e em seguida arrefecida à temperatura ambiente.

O método sol-gel refere-se a hidrólise e condensação dos alcóxidos metálicos os quais conduzem as dispersões estáveis de partículas coloidais (sol) de óxido catalisada por ácidos ou bases. O tipo de catalizador utilizado tem influência na característica final do gel (maior ou menor ramificação)[22]. A reação pode ser conduzida a temperatura ambiente ou com aquecimento e tratamentos térmicos são necessários para a obtenção do estado cristalino final. As MNPs de óxidos de ferro são formadas por uma transformação de fases de dois passos (Fe(OH)3 → β-FeOOH → γ-Fe2O3).

As propriedades das NPs são dependentes da estrutura criada durante o estado sol do processo sol-gel[12].

As vantagens dessa estratégia em relação ao método de coprecipitação consiste na dispersão em solventes polares (aquoso ou orgânico) devido à presença de ligantes hidrofílicos na superfície das NPs. Adicionalmente, o uso de temperatura no processo de síntese favorece a cristalinidade e magnetização saturada. Como desvantagem, pode-se citar o alto custo dos precursores alcóxidos metálicos e a necessidade de uma etapa de calcinação[12,22]. Zhang et al.[23] avaliou a influência das estruturas cristalinas dos óxidos de ferro na adsorção de metais pesados. Os óxidos foram preparados pelo método sol-gel via micelas induzidas por dodecil sulfato de sódio (SDS). Posteriormente, na etapa de calcinação, foi avaliado a estrutura dos óxidos de acordo com a temperatura utilizada. Observou-se que o aumento da temperatura de calcinação (200ºC, 350ºC e 500ºC) transformou o óxido de ferro amorfo 244

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(Fe3O4) em (α + γ)-Fe2O3 e na estrutura com alto grau de cristalização (α-Fe2O3). Além disso, a área de superfície e o volume dos poros destes óxidos diminuíram. É importante ressaltar que a estrutura amorfa do Fe3O4 apresentou maior capacidade de adsorção para Pb(II) e Cd(II) em relação às outras duas estruturas.

O método de preparo das NPs conhecido como decomposição térmica tem como princípio da técnica o uso de temperatura elevada para decompor os precursores organometálicos ou complexos metálicos.

Os precursores ([Fe(CO)5], [Fe(acac)3], ferro oleato, [Fe(cup)3], ferroceno [Fe(C5H5)2]) são solubilizados em solventes orgânicos de alto ponto de ebulição na presença de surfactantes (os ácido oleico, ácido graxo, 1-octadeceno, oleilamina e hexadecilamina).

De modo geral, os precursores podem ser introduzidos no meio reacional já aquecido, ou a mistura, incluindo o precursor, é preparada a temperatura ambiente com posterior aquecimento em sistema aberto ou fechado.

Outra característica importante está relacionada ao número de etapas da síntese: se o precursor possui metal de valência zero, é possível preparar NPs através de duas etapas; contudo, na decomposição de precursores metálicos catiônicos ocorre a formação do óxido em uma única etapa. Por exemplo, γ-Fe2O3 pode ser obtido através da decomposição térmica de [Fe(CO)5] dissolvendo-o em uma mistura de octil éter e ácido oleico na primeira etapa, e adicionando um fraco oxidante na segunda etapa. Enquanto que Fe3O4 pode ser obtido em uma única etapa pela decomposição térmica do [Fe(acac)3] em 1,2-hexadecanediol, oleilamina e ácido oleico em fenol éter. As condições reacionais (proporção dos reagente, surfactante e solvente, temperatura, tempo de reação e tempo de envelhecimento) são importantes para o controle do tamanho e morfologia das MNPs. Embora esse método tenha a vantagem da obtenção de partículas esféricas (ou cúbicas) monodispersas de óxido de ferro com diâmetro inferior a 30 nm, a desvantagem é a solubilização dessas NPs em solventes apolares[12,14,24].

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A metodologia de microemulsão consiste na dispersão dos precursores em dois líquidos imiscíveis (sistema água e óleo), no qual são estabilizados por uma película interfacial formada por moléculas do surfactante.

Nesse sistema, a fase aquosa contém os sais metálicos enquanto a fase lipofílica é formada por uma mistura complexa de diferentes hidrocarbonetos e olefinas.

As microemulsões podem ser classificadas em direta (óleo disperso na água) ou reversa (água dispersa no óleo). Na microemulsão direta, a fase aquosa é dispersa como micropartículas, geralmente entre 1 a 50 nm de diâmentro, sobre a monocamada do surfactante sob a fase orgânica. O tamanho da micela reversa é determinado pela razão molar entre a água e o surfactante. Através da mistura de duas microemulsões (reversa) idênticas contendo os reagentes desejados, as micropartículas se colidem continuamente, aglutinam e se quebram novamente formando, finalmente, o precipitado em micelas.

Com a adição de solventes, como acetona ou etanol, o precipitado obtido nessa metodologia pode ser extraído da mistura por filtragem ou centrifugação.

Apesar da presença de surfactantes, devido a agregação na produção das NPMs, geralmente, são necessários vários processos de lavagem e tratamentos de estabilização. Os surfactantes comumente usados neste caso são: bis(2etilhexil)sulfocianeto, dodecil sulfato de sódio (SDS) e brometo de cetiltrimetilamonio (CTAB). O tamanho e a formação das NPMs podem ser comumente controlados através da variação da concentração dos reagentes e a natureza dos surfactantes. Contudo, quando comparado com a coprecipitação e decomposição térmica, essa metodologia possui baixo rendimento e grandes quantidades de solventes são necessárias para a obtenção de uma quantidade considerável do material[12,14,24].

Por fim, a síntese sonoquímica consiste na utilização de efeitos químicos de ultrassom decorrente da cavitação acústica. Perante a radiação de ultrassom, a alternação entre expansão e compressão das ondas acústicas criam cavidades que podem acumular energia.

Silva AK et al.

A liberação desta energia provoca uma implosão nas cavidades gerando temperatura de 5000 K, pressão de aproximadamente 1800 bar e taxa de resfriamento acima de 1010 Ks-1. Através dessa metodologia, MNPs de magnetita podem ser sintetizadas pela sonicação de acetato de Fe(II) em água sob atmosfera de argônio. As vantagens do uso da síntese sonoquímica no preparo de MNPs estão relacionadas ao fato de ser uma síntese rápida, sem elevação da temperatura ou pressão, e com preceitos de química verde[12,14].

3. Recobrimento das MNPs

As MNPs geralmente são recobertas devido à instabilidade que este tipo de material pode apresentar, sendo vulneráveis a oxidações e com tendência a formação de aglomerados[25]. Adicionalmente, os recobrimentos também auxiliam na modificação da seletividade do sorbentes no processo de extração[26,27]. Por esta razão, o número de trabalhos aplicados em preparo de amostra que não utilizam a etapa de recobrimento das NPMs são reduzidos.

Os recobrimentos dos núcleos das MNPs podem ser realizados com materiais inorgânicos, orgânicos ou híbridos através de ligações química ou interações físicas. Para designar o recobrimento mais adequado, é importante considerar a natureza de interação analitosorbente.

Com uma grande vantagem em relação aos demais materiais, a sílica é o sorbente mais utilizado em separações analíticas devido ao fato de possuir um custo relativamente baixo, ser quimicamente inerte, ter boa estabilidade térmica, elevada área superficial e apresentar tamanho e poros uniformes[10,28]. A maioria dos trabalhos que utilizam recobrimento das MNPs com sílica (Fe3O4@SiO2) fazem uso do método de solgel[29] ou microemulsão (micela reversa)[10], mas outras metodologias também podem ser utilizadas[30-32].

O recobrimento pelo método sol-gel ocorre pelas reações de hidrólise e condensação dos precursores de sílica (alcoxissilano ou sal de silicato) na presença de

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um solvente e um catalisador (ácido ou base). O ajuste das condições reacionais é determinante para controlar a espessura da camada de sílica na MNPs[33-35]. Na síntese pelo método de microemulsão, as MNPs são dispersas em um solvente contendo água, óleo e surfactante para formar uma emulsão. O surfactante utilizado necessita apresentar baixa tensão superficial entre a água e o óleo formando uma solução transparente. Deve-se utilizar surfactantes específicos como por exemplo o AOT[36], Brij-07 ou Triton X-100[37]. Uma das vantagens desse método consiste no fato do revestimento de sílica uniforme ser sintetizado sem aglomeração dos grupos[38].

Os recobrimentos com precursores de sílica (Fe3O4@SiO2) possuem grupos silanois (Si-OH) na superfície do material que possibilitam a posterior funcionalização com diversos grupos químicos promovendo extrações mais seletivas[39]. Como exemplo, pode-se citar as MNPs modificadas com grupamento C18 (Fe3O4@SiO2-C18) no qual têm sido amplamente utilizadas na pré-concentração de matrizes ambientais[40,41]. Além disso, o uso de precursores híbridos de sílica com grupamentos reativos (Fe3O4@ SiO2-NH2[42] Fe3O4@SiO2-SH[43], Fe3O4@SiO2-PITC[44], Fe3O4@SiO2@γ-MPTS[45]) tem melhorado a interação sorbente-analito e estendido as possiblidades de modificação da superfície com outros materiais, tais como os polímeros impressos (Fe3O4@SiO2-MIP) [46], grafeno e seus derivados (Fe3O4@SiO2-G)[47] e líquidos iônicos (Fe3O4@SiO2@ILs)[48]. A Figura 3 exemplifica um esquema de preparo e recobrimento das MNPs. Recobrimentos baseados na tecnologia de polímeros impressos (polímeros molecularmente impressos (MIPs) e polímeros ionicamente impressos (IIPs)) apresentam como destaque a elevada seletividade por um analito devido a presença de cavidades seletivas.

A estratégia de síntese não-covalente é a mais utilizada pois inúmeros precursores estão disponíveis e os analitos podem ser extraídos/eluídos sem envolver quebra de ligações químicas[50]. MIPs e IIPs podem ser baseados em polímeros inorgânicos, orgânicos ou híbridos. A 246

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grande vantagem dos materiais híbridos é a característica acumulada de ambos os polímeros.

Líquidos iônicos (ILs) são sais líquidos na temperatura de 25°C e apresentam excelentes propriedades de solvatação. Os ILs são altamente miscíveis e podem dissolver simultaneamente substâncias com características orgânicas e inorgânicas[51]. Nesse contexto, o recobrimento de MNPs com ILs tem sido desenvolvido com a vantagem de unir suas características químicas com a praticidade da MSPE[52]. No trabalho de Casado-Carmona et al.[53] foi feita a funcionalização dos grupos silanóis da sílica utilizando o IL MIM-PF6, na superfície da MNP obtendo-se a Fe3O4@SiO2@MIMPF6. Óxido de grafeno (GO) é usualmente produzido através de forte oxidação do grafite, o método de obtenção amplamente utilizado é denominado de método de Hurmmers[54]. GO consiste de uma rede bidimensional baseada em anéis de carbono hexagonais que são covalentemente ligados com grupos funcionais de oxigênio (tais como hidroxila, epóxi e carboxila).

Essa rede fornece boa solubilidade e dispersão desse material em muitos solventes, através da interação eletrostática e ligações de hidrogênio. Além disso, a estrutura bidimensional e a espessura conferem uma alta área superficial e capacidade de adsorção, portanto, a aplicação de GO em recobrimentos de MNPs é promissora[55,56]. Ding et al.[57] preparou MNPs de óxido de ferro recobertas com quitosana e modificadas com GO e ILs (Fe3O4@Quitosana-GO-FGILs). A elevada capacidade de extração do sorbentes pode ser atribuído a maior superfície de contato juntamente com maior interação entre a fase extratora e os analitos. Uma crescente vertente em novos recobrimentos para as MNPs está relacionada à redução do GO para o preparo de grafeno (G)[58].

Recobrimentos baseados em carbono podem apresentar elevada área superficial, baixa densidade, excelente flexibilidade e estabilidade química[59]. Na última década a preparação e aplicação de materiais Scientia Chromatographica 2016; 8(4):239-256

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Figura 3. Esquema geral da síntese de MNPs de óxido de ferro recoberta com sílica e funcionalizada com líquido iônico (Fe3O4@SiO2-ILs). Adaptado da ref (49) com permissão da Royal Society of Chemistry.

como nanotubos de carbono (CNTs) estão em evidência em química analítica[60]. Nessa vertente, Deng et al.[61] recobriu MNPs com nanotubos de carbono de paredes multiplas (MNPs/MWCNTs) para extração de pesticidas em amostras de chá.

poros uniformes, estabilidade térmica e possibilidade de outras funcionalizações a partir de sua superfície interna. Essas características associadas as MNPs podem criar sorbentes com uma capacidade extraordinária de adsorção[62].

Outra classe de materiais híbridos que recentemente tem se destacado no recobrimento de MNPs são as estruturas Metal-Orgânica (MOFs) as quais possuem interações através das ligações coordenadas.

Entre as propriedades das MOFs, pode-se destacar a elevada área superficial, porosidade e tamanho dos

Surfactantes e ácidos orgânicos com longas cadeias alquílicas também podem ser utilizados como um tipo de recobrimento para MNPs. Estes tipos de moléculas apresentam propriedades anfifílicas, isto é, conseguem interagir com partes polares (hidrofílicas) e apolares (hidrofóbicas). Nessa estratégia de recobrimento

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ocorre a adsorção do surfactante na superfície do núcleo magnético formando admicelas e hemimicelas. Desta forma, são caracterizadas pela não formação de ligação química entre o núcleo magnético e o modificador. Nesta temática, três diferentes estratégias podem ser utilizadas para promover a adsorção do surfactante (dodecil sulfato de sódio, brometo de cetiltrimetil amônio, entre outros) no núcleo magnético[63,64].

No trabalho de Manafi et al.[65], NPs de Fe3O4@ SiO2 foram funcionalizadas com etileno glicol bismercaptoacetato. A vantagem deste trabalho está relacionada a simplicidade e ao tempo reduzido para o recobrimento das MNPs. Além da boa capacidade de extração que pode ser atribuída as propriedades que os surfactantes apresentam (interações eletrostáticas hidrofílicas, p-cátion, e interações hidrofóbicas).

4. Aplicações da MSPE

A MSPE tem sido utilizada com a finalidade de extração, pré-concentração ou clean up de analitos orgânicos e inorgânicos. Uma das maiores vantagens desta técnica está relacionada a simplicidade operacional com boa eficiência de extração.

Os trabalhos utilizando a MSPE precisam ter seus parâmetros de extração otimizados (via processos univariados ou multivariados) para alcançar a máxima eficiência de extração. Entre os principais fatores, podemos destacar a quantidade de sorbente, tempo de extração, estratégia de agitação, pH da solução, efeito salting out, volume da amostra, tipo e quantidade de solvente de eluição[41,61].

Na Tabela 1 estão listados alguns trabalhos que usam a MSPE para a determinação de analitos em diferentes matrizes (ambiental, biológica, alimentos, entre outros) seguida pelas análises instrumentais (HPLC, GC, AAS, AES).

O trabalho de Abdolmohammad-Zadeh e Talleb foi o primeiro a relatar a utilização de Fe3O4/ Mg-Al-nitrato LDH no procedimento de MSPE seguida pela detecção de quimioluminescência para separação, [66]

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pré-concentração e determinação de quantidade ultratraço de As(V) e As(III) em amostras de água. Essa metodologia apresentou vantagens como alta sorção cinética dos analitos e bons valores de precisão e exatidão.

Dimpe et al.[84] foi o primeiro a descrever a aplicação de AC@Fe2O3@MnO2 na pré-concentração de metais refratários em amostras de águas por UA-dMSPE/ICP-OES. A metodologia apresentou limite de detecção e quantificação na faixa de 0,0004-0,02 µg L-1 e 0,001-0,07 µg L-1, respectivamente, e recuperação de 96-102%.

Diniz e Tarley[85] publicaram pela primeira vez a combinação da MSPE e extração em ponto nuvem (CPE) para pré-concentração de Cr(VI) e Cr(III) em amostras de águas por FAAS. O método baseou-se na utilização de Fe3O4@SiO2-NH2 obtendo LOD de 1,1 µg L-1 para Cr(VI) e 3,2 µg L-1 para Cr(III) e valores de recuperação na faixa de 91,4-103,5%. Bagheri et al.[71] foi o primeiro a publicar estruturas organometálicas [(Fe3O4–Piridina)/ Cu3(BTC)2] magnéticas com cavidades imobilizadas por Fe3O4-Piridina para extração e pré-concentração de Pd(II) em diferentes matrizes determinado por FAAS. Os parâmetros experimentais foram optimizados pela metodologia de Box-Behnken e os resultados apresentaram altos valores de pré-concentração, recuperação e boa seletividade do método Ma et al.[45] trabalhou com amostras de água de lago, rio e cabelo humano. O intuito foi a quantificação de metil-mercúrio (CH3Hg+) e de mercúrio na forma inorgânica (Hg(II)) em razão dessas espécies serem potencialmente tóxicas. MNPs de Fe3O4@SiO2@γMPTS foram aplicadas para as matrizes em estudo utilizando ICP-MS. Camba et al.[82] utilizou uma metodologia in situ de síntese das MNPs de Fe3O4 e extração de Cd(II) em amostras de água. Nesse método, o analito foi incorporado na estrutura rígida das MNPs com posterior análise por ETAAS pela decomposição das NPs e se apresentou ultrassensível para o Cd(II) com LOD de 2,3 ng L-1.

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Tabela 1. Aplicações de nanopartículas magnéticas em preparo de amostra.

Partícula magnética (quantidade, mg)

Analito extraído

Fe3O4@SiO2-MIPs (10,0 mg) Fe3O4@TEOS-EGBMA (100 mg) Fe3O4@SiO2-C18 (60mg) Fe3O4@poliestireno (50mg)

Ácido protocatecóico Aflatoxinas totais

Fe3O4@PDA (40 mg)

Corantes sintéticos

Fe3O4@TiO2- 1-(2- piridilazo)-2-naftol (30 mg) [(Fe3O4–Piridina)/Cu3(BTC)2] (30 mg) Fe3O4@TiO2-GO (0,5 g) Fe3O4@Murexida (14 mg) Fe3O4@SiO2 (5 mg) Fe3O4@SiO2-IIP (10 mg) Fe3O4@SiO2@politiofeno (26 mg) Fe3O4@SiO2-PITC (21 mg)

Pesticidas Piretróides

Aflatoxin M1 Pb(II) Hormônios Pb(II) e Cd(II) Safranin T Pb(II) Hg(II) Cd(II) e Pb(II)

Fe3O4@CTAB (55,5 mg)

4-nitrofenol e 4-clorofenol

Fe3O4@SiO2-C18 (30 mg)

Matriz (quantidade)

Alimentos

Técnica analítica

LOD

Rec. (%)

Sucos de frutas HPLC-UV 0,5 µg mL-1 92 - 107 (50 mL) Trigo FL 0,03 ng mL-1 92 - 105 (5 g) Cenoura GC-MS 0,0200 - 0,0392 ng g-1 77 - 107 (200 mg) Vegetais HPLC-DAD 0,0200 - 0,0392 ng g-1 91,6 - 116,2 (10 g) Pirulito (0,08 g); Bebidas em pó (0,1 g); HPLC-DAD 98,2 - 111,7 0,20 - 0,25 μg L-1 Suco (16 g) Leite FAAS 13 ng L-1 94,4 - 99,5 (0,001 mL) Peixe FAAS 0,37 ng mL-1 102,6 (0,5 g) Leite (5 mL) HPLC-UV 4,3 – 7,5 ng mL-1 70,6 - 94,5 Leite em pó (3 g) -1 Melão, maçã, uva e nectarina Pb(II) = 1 µgL ; Pb(II) = 98,2; FAAS (0,5 g) Cd(II) = 0,1 µgL-1 Cd(II) = 97,5 Tomate e molho de tomate UHPLC-MS/MS 0,48 ng mL-1 96,71 – 98,26 (1 g) Músculo e fígado de boi, búfalo, alce, ovelha e bode FAAS 1,3 µg L-1 98 - 115 (2 g) Camarão, Atum enlatado e CVAAS 0,02 ng mL-1 102 - 109 peixe (0,5 g) Peixe, camarão e atum FAAS 0,05 e 0,9 ng mL-1 80-110 enlatado (0,5 g)

Ref. [67] [65] [68] [27] [69] [70] [71] [72] [73] [74] [75] [76] [44]

Ambiental Água (25 mL)

HPLC-DAD

0,05–0,1 µg L-1

71,4–98,0

[77]

microcistina-LR

Água (1000 mL)

HPLC-DAD

0,056 µg L-1

73,3-104

[41]

Fe3O4@PDA/ZIF-7 (3 mg)

Hidrocarbonetos aromáticos policíclicos

Água de rio e amostras de ar (20 mL)

GC-MS

0,71–5,79 ng L-1

>82

[78]

Fe3O4@SiO2-GO

As(III) e As(V)

Água de nascente, rio, torneira e lago (70,0 mL)

ICP-MS

Fe3O4@SiO2–SH (60 mg)

CH3Hg+ e Hg(II)

Água de torneira, lago e mar (500 mL)

HPLC-ICP-MS

0,3 – 1,0 ng L−1

96–104

[80]

Fe3O4@SiO2-N-crisina (60 mg)

Cu(II)

Água de rio, lago e torneira (300 mL)

FAAS

0,3 ng mL-1

97-107

[81]

Fe3O4

Cd(II)

Água de poço, água pótavel, torneira e mineral

ETAAS

2,3 ng L-1

98,2-100,3

[82]

Fe3O4@SiO2 (50 mg)

Benzodiaze­pinas

Efluente (Água)

HPLC-DAD

0,021 – 0,065 µg mL-1

90,5 - 98,6

[83]

As(V) = 7,9 pg mL−1 72,55–109,71 As(V) = 28,0 pg mL−1

[79]

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Tabela 1. Aplicações de nanopartículas magnéticas em preparo de amostra.

Partícula magnética (quantidade, mg)

Analito extraído

Matriz (quantidade)

Técnica analítica

LOD

Rec. (%)

Ref.

Fe3O4@SiO2-PITC (21 mg)

Cd(II) e Pb(II)

Água de torneira, oceano e rio; Solo (1 g)

FAAS

0,05 e 0,9 ng mL-1

80 - 110

[44]

Fe3O4@ SiO2-AAAPTS* (25 mg)

Bi(II) e Pb(II)

Água de torneira, água de poço

ETAAS

Bi(II) = 1,4 ng mL-1; Pb(II) = 3,7ng mL-1

Bi(II) = 101; Pb(II) = 101 - 103

[16]

Fe3O4@ SiO2NH2

Pb(II), Cu(II), Cd(II) e Hg(II)

Solução aquosa

Titulação de complexação

-

-

[42]

[(Fe3O4–Piridina)/Cu3(BTC)2] (30 mg)

Pb(II)

FAAS

0.37 ng mL-1

98,6 - 100,7

[71]

CL

2 ng L-1

As(V) = 100106; As(III) = 100104

[66]

Sedimento (1 g) Água destilada, da torneira, mineral e de rio Água de torneira, água de nascente, água de poço e água de chuva (200 mL)

Fe3O4@Mg-Al-Nitrato LDH (150 mg)

As(V) e As(III)

Fe3O4@Murexida (14 mg)

Pb(II) e Cd(II)

Água da torneira e água do mar

FAAS

Pb(II) = 1 µg L-1 Cd(II) = 0,1 µg L-1

Pb(II) = 98,2; Cd(II) = 97,5

[73]

AC@Fe2O3@MnO2 (125 mg)

Ge, Hf, Mo, Nb, Sb, Ta, Te, Sn, Ti, W e Zr

Água de rio e água residual

ICP-OES

0,0004 - 0,02 µg L-1

96-102

[84]

Fe3O4@SiO2-amina (25 mg)

Cr(VI) e Cr(III)

Água da torneira, mineral e de lago

FAAS

Cr(VI) = 1,1 µg L-1 Cr(III) = 3,2 µg L-1

91,4-103,5

[85]

Biológica CH3Hg+ = 75,6 -99,6; Hg(II) = [45] 81,3 -97,1

Fe3O4@SiO2@γ-MPTS (10 mg)

CH3Hg e Hg(II)

Cabelo

ICP-MS

1,6 - 1,9 ng L

Fe3O4@SiO2 (50 mg)

Benzodiazepinas

Cabelo (200 mg)

HPLC-DAD

0,0097 - 0,032 µg mL-1

84,9 - 90,5

[83]

Fe3O4@SiO2-MIPs (100 mg)

Paracetamol e tizanidine

Plasma Humano

UV-Vis

-

-

[86]

Fe3O4@UMS-C18 (50 mg)

Aminas aromáticas

Urina (20 mL)

UFLC-UV-Vis

1,3, 0,88, 1,1 e 1,1 ng mL−1

70 - 125

[40]

Fe3O4@ SiO2-AAAPTS* (25 mg)

Bi(II) e Pb(II)

Cabelo

ETAAS

Bi(II) = 1,4 ng mL-1; Pb(II) = 3,7 ng mL-1­

Bi(II) e Pb(II) 100

[16]

Fe3O4@OA-IL* (100 mg)

Sulfonamida

Cabelo (200 mg)

HPLC-UV

1,2 - 1,9 ng g-1

80

[87]

+

-1

Outras matrizes Fe3O4@SiO2@ILs (100 mg)

Bisphenol A

Utensílios plásticos (5 g)

HPLC - FLD-UV

90 ng·L-1

99,6 - 100,4

[48]

Fe3O4-ANI*-NA* (7 mg)

Rodamina B

Espuma de lavar louça (1 g) detergente líquido (1 g), sombra de olhos (10 mg), xampu (1 g), lápis (10 mg), fósforo (10 mg)

FL

0,1 µg L-1

94 - 99

[88]

Fe3O4@SiO2-(p(4-VPBA-co-EGDMA) (100 mg)

Brassinosteróides

Tecidos de plantas (Brassica napus L.) (100 mg)

LC-MS-MS

0,27-1,29 pg mL-1

93,0-97,4

[89]

250

Scientia Chromatographica 2016; 8(4):239-256

Extração em Fase Sólida Magnética (MSPE): Fundamentos e Aplicações

Nos estudos de Ma et al.[41] foi reportado a funcionalização com C18 em uma MNPs recoberta com sílica, Fe3O4@SiO2-C18, para a determinação de microcistina-LR em amostras de água para análise por HPLC-DAD. Com um tempo de extração de 15 minutos, o método apresentou LOD de 0,056 µg L-1 com recuperações de 73,3-104%.

Asgharinezhad e Ebrahimzadeh[77] desenvolveram MNPs de Fe3O4@CTAB para extrair 4-nitrofenol e 4-clorofenol de amostras de água seguida da análise por HPLC-DAD obtendo LOD de 0,05–0,1 μg L–1.

Mahpishanian e Sereshti[90] reportaram o uso de óxido de grafeno como sorbente para isolação e preconcentração da nicotina em amostras de água e obtiveram resultados promissores usando apenas 3 mg de fase extratora em 10 mL de amostra.

No estudo de Sheykhaghaei et al.[86], um processo simples e efetivo foi utilizado para o desenvolvimento de MNPs (Fe3O4@SiO2-MIP) para determinação de paracetamol e tizanidina em plasma humano usando espectrofotometria de UV-vis. O método proposto obteve bons resultados para determinação de tizanidina, porém não apresentou seletividade para o paracetamol.

Já Jiang et al.[40] sintetizou MNPs recobertas com sílica ultrafina funcionalizada com C18 (Fe3O4@UMS-C18) para a extração de quatro diferentes aminas aromáticas em amostras de urina por UFLC-UV obtendo-se LODs de 0,88 à 1,3 ng mL-1 e recuperações de 70-125%.

Yan et al.[87] preparou microesferas poliméricas magnéticas com líquido iônico modificado (Fe3O4@OAILs) para extração de compostos polares em urina. A alta percentagem de recuperação obtida (80 %) é resultado das interações p-p, dipolo-dipolo e atração eletrostática que ocorrem entre as sulfonamidas e o líquido iônico.

[74]

Zhang et al. analisou safranina T, um tipo de corante sintético que pode ser prejudicial para seres humanos, em amostras de tomate, molho de tomate e yuba. Para isso, o autor utilizou duas técnicas de extração na sequência: primeiro usou-se a DLLME com

Silva AK et al.

ILs seguida pela MSPE com Fe3O4@SiO2. O método proposto obteve recuperação na faixa de 96,71 à 98,26 % utilizando UHPLC-MS/MS. Binellas e Stalikas[68] relatam o uso de MNPs Fe3O4@SiO2-C18 para a extração de 26 agrotóxicos em amostras de cenoura usando CG-MS com LODs entre 1,0 - 46 µg kg-1.

Xie et al.[67] desenvolveu MNPs com a tecnologia MIP (Fe3O4@SiO2-MIP) para a extração seletiva de ácido protocatecóico em sucos por HPLC-UV. A extração magnética ocorreu rapidamente (10 s) com reutilização do sorbentes por seis vezes.

Manafi et al.[65] analisou o teor de aflatoxinas totais em amostras de trigo usando Fe3O4@TEOSEGBMA. Além de ser constatado uma boa seletividade, as interações eletrostáticas com as micelas formadas pela adição de Triton X-100 aumentaram significativamente a sensibilidade do método analítico.

Abolhasani et al.[76] descreve em seu trabalho a aplicação de Fe3O4@SiO2@politiofeno na préconcentração e determinação de íons Hg(II) em frutos do mar. O planejamento experimental por Box-Behnken foi utilizado para investigar as condições apropriadas deste método através de sua superfície de resposta. Assim, Hg(II) foi determinado por CV-AAS obtendo um LOD de 0,02 ng mL-1.

Uma abordagem diferente da aplicação das MNPs foi realizada por Tian et al.[72]. As MNPs (Fe3O4@TiO2-GO) foram aprisionadas no interior de um chip microfluídico através da manipulação de campo magnético para a extração online de hormônios em amostras de leite e leite em pó.

5. Conclusões

O uso de NMPs em preparo de amostra é uma interessante estratégia, sob a perspectiva da química verde, para a quantificação de analitos em baixas concentrações na presença de potenciais interferentes.

A MSPE é uma técnica simples e de rápida execução

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Silva AK et al.

devido a elevada área de contato do sorbente aliada a facilidade de separação das fases pela simples manipulação de um campo magnético externo.

Adicionalmente, a possibilidade de reuso do material e a redução do consumo de solventes e sorbentes sem perda do desempenho analítico são algumas das características desta técnica que tem ganhado popularidade entre os pesquisadores.

Outrossim, podemos destacar a versatilidade em planejar sorbentes com características distintas pela simples alteração dos precursores (blocos construtores) dos recobrimentos. Atualmente, inúmeros precursores e modificadores estão disponíveis para melhorar a

Extração em Fase Sólida Magnética (MSPE): Fundamentos e Aplicações

seletividade da extração pelo aumento da interação analito-sorbente.

Apesar do pequeno número de aplicações da MSPE no Brasil, as MNPs possuem um enorme potencial de crescimento nos próximos anos, principalmente no monitoramento de compostos orgânicos e inorgânicos em diversas matrizes complexas.

Agradecimentos Os autores agradecem às agências de fomento Capes, CNPq e FUNDECT pelo apoio no desenvolvimento dos projetos de pesquisa.

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Símbolos e abreviaturas

Acac - Acetitacetonato AOT - Bis (2-etil-hexil) sulfosuccinato de sódio CNTs - Nanotubos de carbono CTAB - Brometo de cetiltrimetilamônio Cup - N-nitrofenilhidroxiamina G - Grafeno GO - Oxido de grafeno IIP – Polímeros ionicamente impresso IL - Líquido iônico LDH - Dupla camada de hidróxido MIM - Hexafluorofosfato de metilimidazólio MIP - Polímeros molecularmente impresso MNP - Nanopartícula magnética MOFs - Estruturas Metal-Orgânica MWCNTs - Nanotubos de carbono de paredes multiplas Nps - Nanopartículas

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Scientia Chromatographica 2016; 8(4):239-256

Scientia Chromatographica 2016; 8(4):257-267 Instituto Internacional de Cromatografia http://dx.doi.org/10.4322/sc.2016.037 ISSN 1984-4433

GLOSSÁRIO

Glossário de Termos Cromatográficos

Apresentação A partir deste número o Scientia Chromatographica inicia a publicação de um glossário de termos cromatográficos e afins, em língua portuguesa. Em números subsequentes do periódico novos termos serão inseridos abordando, inclusive, símbolos e outros elementos ortográficos utilizados na área. A variedade de nomes em português para a mesma situação (ex: o termo inglês Gas Chromatography é grafado em português como Cromatografia Gasosa, Cromatografia em Fase Gasosa, Cromatografia com Gás, Cromatografia de Gás e até Cromatografia em Fase de Vapor, dentre outros termos) dificulta uma escolha da expressão correta, especialmente para aqueles vindos de outras áreas de atuação. Assim, a principal intenção deste glossário é servir como um primeiro contato do leitor com o jargão da área, servindo como uma introdução à nomenclatura e simbologia na área de cromatografia e técnicas relacionadas. Sempre que possível procurou-se seguir a recomendação da IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry), órgão reconhecido internacionalmente como referência em nomenclatura na área de química. Em algumas poucas situações nas quais as sugestões da IUPAC não são seguidas internacionalmente, procurou-se utilizar a nomenclatura e/ou simbologia mais comum.

Considerando-se que a cromatografia é uma área bastante abrangente, hoje sub-dividida em várias vertentes, as quais por sua vez possuem novas sub-divisões, torna-se difícil juntar todo o trabalho no espaço de um número de periódico. Daí a opção por introduzir-se o assunto em vários números, permitindo uma atualização frequente dos temas abordados.

Sugestões de outros termos, comentários e críticas serão muito bem recebidos visando aprimorar o glossário

Editor

Scientia Chromatographica 2016; 8(4)

257

Glossário de Termos Cromatográficos

Termos e Definições na área de cromatografia

denominada cromatografia gasosa (GC, do inglês “Gas

1. Cromatografia

líquida (LC, do inglês “Liquid Chromatography”) e se

A Cromatografia é uma técnica de separação geralmente utilizada na análise de misturas complexas (vários compostos) como gasolina, pesticidas em

Chromatography”), se um líquido será cromatografia for um fluido no estado supercrítico será cromatografia com fluido supercrítico (SFC, de “Supercritical Fluid Chromatography”).

Outra classificação bastante empregada baseia-

frutas, hormônios em carne, antioxidantes em vinho, drogas no sangue e muitas outras.

A Cromatografia foi proposta como técnica analítica pelo botânico russo Mikhael Tswett há pouco mais de 100 anos; desde então tem sido aplicada em praticamente todas as áreas do conhecimento humano onde a analise de espécies químicas é necessária.

A separação em Cromatografia é baseada na

se em como a fase estacionária é arranjada: se dentro de um tubo, a técnica é denominada cromatografia em coluna; se em uma superfície plana (vidro, metal, papel, etc.) a técnica é denominada cromatografia planar.

3. Cromatografia Gasosa

partição (distribuição) dos compostos entre duas fases:

A Cromatografia Gasosa (GC, CG ou HRGC)

uma permanece imóvel durante o processo, sendo

é uma técnica cromatográfica que emprega um

denominada fase estacionária, e a outra passa (percola)

gás como fase móvel. A fase estacionária pode ser

através dela, sendo chamada fase móvel. Dependendo

um material sólido (como sílica, alumina, carvão

estado físico da fase móvel (líquido, gás, fluido

ativo e outros) ou um líquido distribuído de forma

supercrítico) e composição química e mecanismo de

uniforme na superfície de um sólido. No primeiro

atuação da fase estacionária (troca iônica, adsorção,

caso a técnica é denominada cromatografia gás-sólido

etc.) existem várias formas de classificação das

(GSC), enquanto que a última tem sido designada

técnicas cromatográficas.

cromatografia gás-líquido(GLC).

2. Tipos de Cromatografia (Classificação das Técnicas Cromatográficas)

Em português, a cromatografia gasosa (em inglês “Gas Chromatography”, GC) tem recebido diversas traduções, incluindo: cromatografia em fase

A classificação mais comumente utilizada para

gasosa, cromatografia com gás, cromatografia a gás,

as técnicas cromatográficas leva em consideração o

cromatografia de gás, cromatografia em fase vapor e

estado físico da fase móvel: se for um gás a técnica é

outras.

258

Scientia Chromatographica 2016; 8(4):257-267

Glossário de Termos Cromatográficos

Uma das formas mais populares de cromatografia gasosa no momento é a denominada

5. Cromatografia com Fluido Supercrítico (SFC)

cromatografia gasosa de alta resolução (HRGC) na

A Cromatografia com Fluído Supercrítico é

qual a fase estacionária é depositada diretamente na

uma técnica de separação que emprega um fluido

parede interna de um tubo capilar – daí o nome também

no estado supercrítico como fase móvel. A coluna

de colunas tubulares abertas.

empregada nesta técnica pode ser similar às tubulares abertas empregadas em HRGC ou empacotadas como as de HPLC. Uma das grandes vantagens desta técnica

4. Cromatografia Líquida A Cromatografia Líquida (LC, CL ou HPLC) é uma técnica cromatográfica que emprega um líquido

é a possibilidade de utilizar-se como fase móvel substâncias não poluentes como CO2, um apelo da chamada “Green Chemistry” (Química Verde).

Uma das principais aplicações atuais desta

como fase móvel. A fase estacionária pode ser um

técnica é na separação de fármacos, especialmente

material sólido (como sílica, alumina, carvão ativo e

quirais (separação de isômeros ópticos).

outros) ou um líquido distribuído de forma uniforme na superfície de um sólido. No primeiro caso a

6. Cromatografia em Coluna

técnica é denominada cromatografia líquido-sólido

Em cromatografia líquida a fase estacionaria

(LSC), enquanto que a última tem sido designada

pode ser colocada dentro de um tubo (coluna) ou

cromatografia líquido-líquido(LLC).

em uma superfície plana (vidro, metal, papel e outros materiais). Em função desta diferenciação a

Em português, a cromatografia líquida (em

cromatografia líquida passou a ser classificada como

inglês “Liquid Chromatography”, LC) tem recebido

cromatografia em coluna (fase estacionária dentro

diversas traduções, incluindo: cromatografia em fase

do tubo) ou cromatografia planar (fase estacionária

líquida, cromatografia com líquido, cromatografia a

em superfície plana). Na cromatografia gasosa e

líquido, cromatografia de líquido, cromatografia em

na cromatografia com fluido supercrítico apenas a

fase líquida e outras.

modalidade em coluna tem sido utilizada.

A cromatografia em coluna é uma modalidade

Mudanças em vários aspectos desta técnica,

de cromatografia na qual a fase estacionária é colocada

ocorridas com sua evolução, conduziram à

dentro de um tubo, usualmente cilíndrico, muitas

Cromatografia Líquida Moderna (HPLC ou CLAE).

vezes denominado de coluna (na verdade, a coluna é

Scientia Chromatographica 2016; 8(4):257-267 259

Glossário de Termos Cromatográficos

constituída pelo tubo, a fase estacionária, conectores,

utilizada em escala preparativa, geralmente a mesma é

e outros elementos).

utilizada praticamente apenas em escala analítica.

O tubo, dentro do qual a fase estacionária é colocada formando então a coluna, pode ser feito de vidro, metal (aço, cobre, alumínio e outros), polímeros

8. Cromatografia em Escala Preparativa e Semi-Preparativa

(teflon, peek, etc.) ou de sílica fundida, sendo o último

Dependendo do emprego posterior do material

o material mais utilizado atualmente em cromatografia

separado pela cromatografia em coluna, a mesma pode

gasosa. Quando o interesse da análise é apenas separar

ser dividida em escala analítica ou escala preparativa.

e quantificar os compostos, a técnica é denominada cromatografia em escala analítica (ou seja, o interesse é apenas em analisar os compostos); quando o objetivo é separar os compostos para posterior uso (seja para identificação por outra técnica; determinação da atividade biológica; avaliação para outras aplicações) a técnica é denominada cromatografia em escala preparativa.

7. Cromatografia em Escala Analítica Dependendo do emprego posterior do material separado pela cromatografia em coluna, a mesma pode ser dividida em escala analítica ou escala preparativa.

A cromatografia em escala preparativa é aquela na qual o interesse maior é, além da separação e/ou quantificação dos compostos, coletar-se as frações contendo os compostos para posterior uso. Este uso poderá ser a confirmação da identidade de um compostos (por exemplo por ressonância magnética nuclear –NMR), determinação da atividade biológica de um ou mais constituintes da fração; verificação da utilização de uma fração isolada (por exemplo, como catalisador); purificação de um fármaco através do isolamento das impurezas (ex. insulina) e outras.

A cromatografia em escala preparativa é executada em colunas de comprimento e diâmetro

A cromatografia em escala analítica é

interno maiores que a analítica, uma vez que o

aquela na qual o interesse maior é na separação e/

objetivo usualmente é isolar grandes quantidades do(s)

ou quantificação dos compostos, ou seja, na qual se

composto(s) de interesse. Estas colunas podem chegar

pretende isolar um composto do outro, identificar

a vários metros de comprimento e valores superiores a

e quantificar (usualmente através de um registro

um metro para o diâmetro interno.

gráfico denominado cromatograma). Após esta etapa, geralmente o material analisado é descartado.

Atualmente a técnica que mais emprega colunas preparativas é a cromatografia líquida. O diâmetro

Apesar de em algumas aplicações muito

interno das colunas preparativas usualmente possui

específicas a cromatografia gasosa poder ser também

valores superiores a 10 cm, enquanto que as colunas

260

Scientia Chromatographica 2016; 8(4):257-267

Glossário de Termos Cromatográficos

analíticas possuem diâmetro interno de no máximo 4,6mm. Portanto, existe uma pequena faixa na qual o diâmetro interno da coluna é superior à das analíticas e inferior á das preparativas. Esta faixa intermediária é usualmente denominada de coluna semi-preparativa, e sua maior utilização tem sido para o desenvolvimento e otimização de separações cujos resultados são, posteriormente, transferidos para a escala preparativa (escalonamento ou scale up).

10. HRGC Na forma original de cromatografia gasosa (proposta por A. J. P. Martin em 1952), a fase estacionária era geralmente constituída de partículas sólidas (adsorventes) ou então de um suporte sólido sobre o qual uma substância líquida de baixa volatilidade era depositada. Estas partículas geralmente possuíam diâmetros superiores a 60 µm, e os tubos empregados diâmetros internos iguais ou

9. Cromatografia Planar A cromatografia planar é sub-dividida em cromatografia em camada delgada (também chamada de capa fina) cujo símbolo é TLC (do inglês “ThinLayer Chromatography”) e cromatografia em papel, PC (de “Paper Chromatography”).

superiores a 4 mm. Este conjunto, associado à baixa qualidade dos equipamentos da época (circuitos eletrônicos lentos, inexistência ainda do computador pessoal no laboratório, fases líquidas e suportes inapropriados) faziam com que a eficiência global do sistema fosse ruim. No final da década de 1960, Marcel Golay desenvolveu uma alternativa a estas

A cromatografia planar foi muito empregada no

colunas depositando um filme fino da fase estacionária

passado nas áreas de toxicologia, análise de corantes e

diretamente na parede interna de um tubo capilar.

determinação de metais. Uma forma mais atual desta

Golay, demonstrou tanto na teoria quanto na prática

técnica é denominada HPTLC ( “High Performance

que o uso de tubos de diâmetro interno menor (capilar)

Thin-Layer Chromatography” – Cromatografia em

e o depósito da fase estacionária na parede interna do

Camada Delgada de Alta Eficiência). Na HPTLC

tubo, aumentavam em muito a eficiência e, portanto,

emprega-se como fase estacionária partículas de

a resolução das colunas. Estas colunas rapidamente

diâmetro muito reduzido e que propicia atingir-se

se popularizaram com diferentes nomes dentre os

efeiciencia muito superior à obtida em TLC. Esta

quais: Colunas Capilares (devido ao pequeno diâmetro

técnica, HPTLC, é uma versão instrumental e mais

interno do tubo, usualmente inferior a 0,5 mm), Colunas

moderna da TLC clássica.

WCOT (do inglês “ Wall Coated Open Tubular”, ou

A forma mais utilizada de cromatografia

seja, tubulares abertos com a parede recoberta) ou

atualmente é a cromatografia em coluna, sendo as

HRGC ( “High Resolution Gas Chromatography”,

mais importantes a HRGC e a HPLC.

Cromatografia Gasosa de Alta Resolução).

Scientia Chromatographica 2016; 8(4):257-267 261

Glossário de Termos Cromatográficos

11. HPLC Conforme concebido inicialmente por Tswett no início do século passado, a cromatografia era praticada de forma muito simples, colocando um material sólido (fse estacionária) dentro de um tubo de vidro aberto nas duas extremidades (Coluna) e aplicando a amostra em uma delas. Nesta época Tswett estudava a separação de pigmentos presentes em extratos de plantas. A seguir, passava através da amostra um líquido (fase móvel) e os corantes se separavam formando manchas coloridas. As manchas eram isoladas umas das outras e analisadas posteriormente. Este procedimento era tedioso, pouco quantitativo e demorado. Ao longo da evolução da cromatografia líquida, várias inovações foram sendo adicionadas, sendo uma delas a passagem contínua de fase móvel dentro da coluna. Esta técnica é denominada eluição, e a fase móvel é chamada de eluente. Outra inovação importante ocorreu na década de 1960 com a diminuição significativa do tamanho das partículas empregadas como fase estacionária (geralmente baseadas em sílica ou óxido de silício), aumentando a eficiência das colunas. Empregando partículas menores a resistência à passagem da fase móvel ficou crítica e a técnica muito lenta.

A alternativa foi empregar-se uma bomba para pressurizar e empurrar a fase móvel através da coluna,

injeção) e de um espectrofotômetro com uma cela em fluxo do outro (denominada detector). Assim, pequenas quantidades de amostras (tipicamente 20 – 50 µL) eram introduzidas na coluna contendo partículas pequenas (tipicamente menores que 10 µm) e os compostos eluídos pela fase móvel eram detectados em um fotômetro ou espectrofotômetro e um cromatograma era desenhado em um papel de um registrador potenciométrico. Para diferenciar esta técnica da cromatografia “clássica” foi cunhado o termo HPLC (“High Pressure Liquid Chromatography”, ou seja, Cromatografia Líquida de Alta Pressão). Uma vez que rapidamente verificou-se que a pressão não era um componente importante na separação mas sim uma necessidade para empurrar-se a fase móvel através das partículas pequenas (e que continuava a diminuir em tamanho e aumentar a pressão necessária para passar a fase móvel através delas), decidiuse manter a sigla HPLC porém mudar o sgnificado para “High Performance Liquid Chromatography”.

Outra expressão proposta por Horvath para descrever esta técnica e diferenciá-la da cromatografia líquida “clássica” foi Cromatografia Líquida Moderna (“Modern Liquid Chromatography”).

12. CLAE

ao invés do uso apenas da pressão gravitacional.

O termo CLAE em cromatografia significa

Como neste caso a coluna precisava ser fechada nas

“Cromatografia Líquida de Alta Eficiência”, uma

duas extremidades, isto facilitou o emprego de uma

tradução livre para HPLC. O significado original de

válvula para introdução de pequenas quantidades de

HPLC era “High Pressure Liquid Chromatography”,

amostra em uma extremidade (chamada válvula de

posteriormente foi modificado para “High Performance

262

Scientia Chromatographica 2016; 8(4):257-267

Glossário de Termos Cromatográficos

Liquid Chromatography” para manter a mesma sigla.

U-HPLC, é necessário o uso de equipamentos de uma

Como usualmente não se mede desempenho em

nova geração, adequados para utilização em pressões

Cromatografia Líquida, ao ser cunhado o nome em

acima de 600 bars.

português preferiu-se o uso de CLAE, uma vez que a eficiência de uma coluna pode ser medida através do número de pratos (N) ou da altura do pico de um composto (H).

13. U-HPLC

14. Colunas superficialmente porosas As colunas superficialmente porosas, também denominadas de “core-shell”, “solid-core” e outros nomes, são colunas cuja fase estacionária apresenta uma parte interna rígida (na versão original para

O termo U-HPLC ( Ultra-High Pressure Liquid

cromatografia gasosa utilizava-se bolinhas de vidro

Chromatography ou Ultra-High Performance Liquid

para tal, funcionando como suporte para a fase

Chromatohgraphy) foi criado para distinguir a HPLC

estacionária) sobre a qual é depositada uma camada

normal (que utiliza pressões de até aproximadamente

porosa que será a fase estacionária. Utilizadas

600 bars) de uma nova forma da mesma técnica que

largamente em cromatografia gasosa desde a década

utiliza pressões superiores a estas, ou seja, acima de

de 1960, tornaram-se populares no início do século

600 bars. Este limite não é impositivo mas apenas uma

XXI pelo fato de exigirem baixas pressões, nas versões

referencia que auxilia na diferenciação entre as duas

utilizadas até o momento, permitindo que possam ser

técnicas (HPLC x U-HPLC). A necessidade do uso

utilizadas em equipamentos convencionais de HPLC.

de pressões superiores surgiu a partir da diminuição do tamanho das partículas empregadas como fase estacionária em U-HPLC: menores que 2 µm (sub2 como usualmente são denominadas) ao invés de 3 a 5 µm como utilizado em HPLC. A diminuição

Desta forma, permitem obter-se boa eficiência sem necessidade de equipamentos que trabalham em pressões superiores a 600 bars , típicas da U-HPLC.

15. Fluido Supercrítico (SF)

do tamanho das partículas em U-HPLC resultou

O estado crítico pode ser visto de uma forma

não apenas em um aumento na pressão do sistema

simplificada como um estado físico no qual uma

mas também na necessidade de modificação nas

substância encontra-se a uma determinada pressão

bombas, injetores, detectores e outros componentes

(P) e temperatura (T) entre o estado líquido e gasoso.

do cromatógrafo para poderem operar em pressões

Este conjunto Pc e Tc varia para cada substância

mais elevadas. Assim, para que se obtenha o melhor

(por exemplo, para CO2 a Pc = 73 atm e Tc = 43º C).

resultado possibilitado por essas colunas de elevada

Iniciando-se com uma substância no estado gasoso

eficiência e que permitem análises rápidas, típicas da

à pressão e temperatura ambientes (ex. CO2), um

Scientia Chromatographica 2016; 8(4):257-267 263

Glossário de Termos Cromatográficos

aumento na pressão do sistema deve juntar mais as

em cromatografia gasosa. Às vezes estas colunas são

moléculas de forma a ir condensando-as em direção

também denominadas colunas recheadas.

ao estado líquido. Entretanto, se a temperatura for mantida em valor apropriado, a substância não chagará ao estado líquido uma vez que a temperatura tende a afastar as moléculas, enquanto que a pressão tende a juntá-las.

Em determinado conjunto de temperatura e pressão, denominados Temperatura Crítica (Tc) e

Comparadas com as colunas denominadas tubulares abertas, as colunas empacotadas usualmente possuem menor eficiência; requerem o uso de mais fase estacionária, móvel e amostra; produzem mais descartes (“lixo”); são mais difíceis de serem acopladas a outras técnicas como espectrometria de massas (MS), ressonância nuclear magnética (NMR) e outras.

Pressão Crítica (Pc), a substância encontra-se no estado crítico, cujas propriedades são intermediárias entre o estado gasoso e líquido. Mantendo-se a temperatura e a pressão (ambos) acima do estado crítico, a substância estará no estado supercrítico.

Em se tratando de um fluído a substância é denominada Fluído Supercrítico (S.F. – “Supercrtical Fluid”).

16. Colunas empacotadas (ou recheadas) O termo coluna empacotada (do inglês “packed column”) em cromatografia é empregado para descrever o tipo de coluna na qual a fase estacionária é constituída por partículas sólidas (regulares ou não no tamanho e forma) ou por um filme polimérico depositado na superfície de partículas sólidas (então

17. Colunas tubulares abertas As duas formas mais populares de colunas em cromatografia são as denominadas empacotadas (ou recheadas) e as tubulares abertas. As colunas empacotadas são aquelas nas quais o tubo utilizado para preparo da coluna é totalmente preenchido (empacotado ou recheado) com a fase estacionária. As colunas tubulares abertas são aquelas nas quais a fase estacionária é depositada na parede interna do tubo, usualmente como um filme de um polímero estável, à (WCOT) ou na forma de uma camada porosa (PLOT).

As colunas do tipo WCOT são mais eficientes que as PLOT e estas mais do que as colunas empacotadas.

18. Colunas capilares

denominadas suporte) as quais são colocadas dentro

A primeira forma de cromatografia a se

de um tubo de forma a preenchê-lo por completo. O

desenvolver foi a cromatografia líquida, na qual

processo de colocar as partículas dentro do tubo para

eram utilizadas colunas empacotadas em escala hoje

preenchê-lo, é denominado empacotamento, sendo

denominada preparativa ou semi-preparativa. As

empregado tanto em cromatografia líquida quanto

colunas eram usualmente preparadas em tubos de

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Scientia Chromatographica 2016; 8(4):257-267

Glossário de Termos Cromatográficos

vidro de diâmetro interno superior a 2 cm, contendo

de separação, em sequencia, na mesma análise. Na

uma torneira na extremidade, similares a uma bureta.

forma mais simples e comum, utiliza-se entre as duas

Com o surgimento da cromatografia gasosa, colunas de

colunas um dispositivo (por exemplo, uma válvula)

diâmetros internos menores – usualmente inferiores a

para transferir parte ou o total dos picos separados na

4 mm – se tornaram rapidamente populares. Enquanto

primeira coluna para a segunda. Em geral esse arranjo

que em cromatografia líquida tradicional o diâmetro

é utilizado quando se pretende aumentar a eficiência e/

do tubo apresenta pequeno efeito da eficiência das

ou a seletividade da separação, notadamente na análise

colunas, em cromatografia gasosa a diminuição do

de amostras complexas. Esta forma de cromatografia é

diâmetro do tubo provoca um aumento significativo

popular há mais de 50 anos, empregando duas colunas

da qualidade das mesmas. Quando esta diminuição

de cromatografia gasosa em série. Na sua forma mais

do diâmetro interno da coluna é acompanhada do

tradicional, frações isoladas na primeira coluna são

depósito da fase estacionária diretamente na parede do

transferidas para uma segunda através do auxílio de uma

tubo (WCOT), colunas muito eficientes denominadas

válvula (geralmente denominada válvula de comuta ou

de tubulares abertas ou HRGC são obtidas. Pelo fato

“switching valve”) ou de um dispositivo sem válvulas

dos tubos terem dimensões capilares (diâmetro interno

denominado “Dean’s switching system”. Em ambos

inferior a 0,5 mm ou 500 μm) estas coluna têm sido

os casos alguns, (poucos) picos são selecionados

também denominadas de colunas capilares. Portanto,

do efluente da primeira coluna e transferidos para a

a denominação capilar refere-se mais á pequena

segunda coluna, com a ajuda da fase móvel, para uma

dimensão do tubo, e não à eficiência ou resolução da

melhor a separação. Dependendo de alguns detalhes

coluna.

experimentais a cromatografia multidimensional tem

O emprego de colunas capilares em

sido referida como cromatografia multidimensional

cromatografia líquida até presente é muito menos

clássica ou simplesmente multidimensional – aquela

comum do que em cromatografia gasosa, antevendo-

na qual alguns poucos picos da amostra (ou parte deles)

se uma expansão nesta área para o futuro próximo.

são transferidos de uma coluna para outra – ou, então, como cromatografia multidimensional abrangente na

19. Cromatografia Multidimensional (MDC) A Cromatografia Multidimensional (MDC)é uma forma de cromatografia na qual emprega-se dois

qual toda a amostra é transferida primeira coluna para ser analisada na segunda coluna.

20. Cromatografia Bidimensional (2D)

ou mais meios de separação – geralmente duas ou

A cromatografia bidimensional (2D ou 2-D) é

mais colunas , usualmente de diferentes mecanismos

uma forma de cromatografia multidimensional na qual

Scientia Chromatographica 2016; 8(4):257-267 265

Glossário de Termos Cromatográficos

são utilizadas duas separações consecutivas, geralmente

transferida, através de válvula, para a segunda coluna

empregando duas colunas, usualmente de diferentes

para uma outra separação. Notar que nesta forma de

mecanismos (ou seja, mecanismos ortogonais). Este

cromatografia utiliza-se um ífem entre os símbolos das

conceito pode ser empregado em qualquer forma de

duas técnicas, e representa que apenas parte da amostra

cromatografia como, por exemplo, duas colunas de

é transferida de uma dimensão ou coluna para a outra.

cromatografia líquida (2D-LC) ou duas de gasosa (2DGC) em série. Pode também ser empregado em outros tipos de montagem como cromatografia em camada delgada bidimensional (2D-TLC), na qual a corrida cromatográfica ocorre em uma dimensão com o emprego o

de uma fase móvel, a placa é girada 180 e submetida

Mais recentemente um novo arranjo foi desenvolvido no qual cada pico eluido da primeira coluna é segmentado e, através de uma interface apropriada, denominada modulador, os segmentos de cada pico são transferidos para uma segunda coluna e reanalisados. Para diferenciar da forma

a uma outra fase móvel, gerando uma nova separação.

clássica de bidimensional na qual apenas parte da

Portanto, a cromatografia bidimensional não requer o

amostra é transferida de um meio para outro, esta

uso de duas colunas, podendo ser em uma superfície

técnica foi denominada de cromatografia abrangente

plana e com uma única fase estacionária (neste caso a

(comprehensive chromatography). Da maneira

mudança é na fase móvel e não na estacionária). Esta

como foi originalmente concebida, esta forma de

foi a primeira forma de cromatografia bidimensional a

cromatografia estabelecia o uso de duas colunas

ser desenvolvida, ou seja, a 2D-TLC.

ortogonais – empregando mecanismos de separação

21. Cromatografia Abrangente A cromatografia bidimensional emprega dois meios de separação (colunas - ou troca de fase móvel como na cromatografia planar). O uso deste arranjo em cromatografia gasosa tem sido denominado cromatografia gasosa bidimensional (2D-GC) e

distintos – e a exigência de que toda a amostra fosse transferida da primeira coluna para a segunda.

Atualmente já se verifica na literatura o uso de colunas não ortogonais, porém com diferentes fases móveis, em cromatografia líquida, assim como a transferência de apenas parte – ainda que geralmente a maior – da fração eluida da primeira coluna para a segunda.

representado por GC-GC e em cromatografia líquida

Para diferenciar o enfoque abrangente do não

dá origem a cromatografia líquida bidimensional (2D-

abrangente, no caso da cromatografia abrangente

LC) representada por LC-LC. Pode também combinar

utiliza-se “x” entre o símbolo das duas técnicas. Assim,

dois modos diferentes como na cromatografia líquida

LCxLC significa cromatografia líquida bidimensional

acoplada a cromatografia gasosa, LC-GC, na qual

abrangente, enquanto que GCxGC representa um arranjo

uma fração da amostra eluida da primeira coluna é

do tipo cromatografia gasosa bidimensional abrangente.

266

Scientia Chromatographica 2016; 8(4):257-267

Glossário de Termos Cromatográficos

22. Cromatografia em linha O termo cromatografia em linha (on-line chromatography) tem sido utilizado para descrever sistemas cromatográficos nos quais mais de uma coluna é utilizada, sendo as mesmas unidas ou acopladas de tal forma que a amostra passa pela primeira e depois parte dela é encaminhada para a segunda coluna para um novo processo de separação. Em geral uma válvula

e a segunda no modo quiral. A amostra – por exemplo plasma contendo um fármaco quiral – é introduzida na primeira coluna (C-18) e quando chegar o tempo de retenção do composto de interesse nesta coluna o pico é transferido, através de uma válvula, para a coluna quiral. Isto evita a entrada de interferentes na coluna quiral que iriam reduzir a vida útil da coluna, além de poderem interferir na separação cromatográfica.

colocada entre as colunas efetua a transferência da

Deve ser observado que não é necessário que os dois

amostra, ou parte dela, de uma coluna para outra,

meios de separação sejam formados por colunas

de forma automatizada. Neste enfoque não se coleta

de alta eficiência (de HPLC ou de HRGC): pode-se

o efluente de uma coluna para posteriormente

usar uma coluna de extração do tipo RAM, MIP ou

introduzi-lo na segunda coluna: a transferência de uma

outro tipo como primeiro estágio da separação, e uma

coluna para outra é feita de maneira automatizada –

coluna analítica do tipo C-18 no segundo estágio.

usualmente através de uma válvula de transferência

Outra possibilidade é a utilização de um sistema de

ou comutação (transfer valve ou switching valve).

extração em fase sólida (SPE) no primeiro estágio da

Assim, em uma arranjo típico pode-se utilizar duas

separação, seguido de uma coluna analítica do tipo

colunas de cromatografia líquida on-line sendo a

C-18 no segundo, formando um sistema SPE-LC em

primeira uma coluna operando no modo fase reversa

linha (on-line).

Sugestões de leitura: [1] Lanças, F.M. “Cromatografia Líquida Moderna”, Editora Átomo, 2009.

[2] Lanças, F.M. “Cromatografia em Fase Gasosa”, Acta Editora, 1993.

[3] Lanças, F.M., “Fundamentos da Cromatografia Gasosa”, Editora Átomo, 2017.

Scientia Chromatographica 2016; 8(4):257-267 267

Scientia Chromatographica 2015; 7(3):268-268 Instituto Internacional de Cromatografia http://dx.doi.org/10.4322/sc.2015.000 ISSN 1984-4433

268

CLASSIFICAÇÃO

Scientia Chromatographica 2015; 7(3)

Scientia Chromatographica 2016; 8(4):269 Instituto Internacional de Cromatografia ISSN 1984-4433

INSTITUTO INTERNACIONAL DE CROMATOGRAFIA

O Instituto Internacional de Cromatografia (IIC) possui como uma de suas principais missões o oferecimento de cursos de curta duração nas áreas de cromatografia e técnicas relacionadas.

Os objetivos dos cursos do IIC são o aprimoramento/formação/ atualização dos usuários das técnicas cromatográficas e afim (Preparo de Amostras, Espectrometria de Massas, Gestão da Qualidade, dentre outras), tanto do ponto de vista teórico quanto prático.

A filosofia educacional do IIC é: “ao invés de ensinar apenas como operar um equipamento específico (dar o peixe) o IIC ensina a técnica (como pescar)”.

Os cursos do Instituto Internacional de Cromatografia são coordenados pelos Diretores do IIC, e ministrados pelos coordenadores, auxiliados por uma equipe técnica e científica altamente qualificada, constituída de docentes pósgraduados nos melhores centros do país na área, e pós‑graduandos em fase de conclusão de suas teses. Na época em que cada curso for oferecido, uma relação dos instrutores é disponibilizada no website do IIC. O programa detalhado de cada curso pode ser obtido através de contacto com o IIC. Os cursos são ministrados com auxílio de recursos audiovisuais modernos (datashow‑computador; vídeos, demonstrações, resolução de problemas e outros recursos instrucionais). Os alunos recebem um livreto contendo cópia de todos os slides apresentados pelos instrutores, além de material bibliográfico de apoio. Em vários cursos também são fornecidos livros de autoria dos próprios docentes dos cursos. A maior parte dos cursos também tem aulas práticas de laboratório, conforme anunciado no folheto explicativo de cada curso.

Observações: • O I.I.C. oferece também cursos “in-house” (“in-company”). Interessados nesta modalidade devem contatar o IIC para obter mais detalhes.

• Com exceção dos cursos da área da qualidade (ISO, Validação e Auditoria) todos os demais possuem aulas teóricas e práticas de laboratório.

• O oferecimento efetivo de um curso depende de um número mínimo de inscritos no mesmo.

• O número de vagas dos cursos que envolvem laboratório está sendo limitado para melhor aproveitamento dos participantes.

• Visite o website www.iicweb.org para obter mais informações.

Scientia Chromatographica 2016; 8(4) 269

Scientia Chromatographica 2016; 8(3):270-270 Instituto Internacional de Cromatografia http://dx.doi.org/10.4322/sc.2015.000 ISSN 1984-4433

270

CLASSIFICAÇÃO

Scientia Chromatographica 2016; 8(3)

Scientia Chromatographica 2016; 8(4):271-272 Instituto Internacional de Cromatografia ISSN 1984-4433

NORMAS PARA PUBLICAÇÃO

Normas para publicação de artigos no Scientia Chromatographica (a versão detalhada está disponível em nosso portal www.scientiachromatographica.com).

Escopo

Scientia Chromatographica publica trabalhos em todas as áreas da Cromatografia, incluindo GC (colunas capilares, empacotadas, preparativas), LC (convencional, HPLC, U-HPLC, Prep-LC, micro-LC, nano-LC, TLC, PC), SFC (colunas empacotadas ou capilares), Técnicas Acopladas (GC-MS, LC-MS, SFC-MS, LC-GC, SFE-CE, GCxGC, LCxLC) e Técnicas de Preparo de Amostras (SPME, SBSE, MEPS, QuEChERS, LLE, MAE,SPE, LLE, etc.). A partir de 2012 o Scientia publica os seguintes formatos de artigos: • Artigos Originais de Pesquisa • Comunicação (“Short Communication”) • Artigos de Revisão Crítica Os artigos de Revisão Crítica deverão antes de sua submissão serem discutidos com um dos c­o-editores mais relacionados ao assunto em questão. Devem conter uma contribuição nova a respeito de um assunto de grande interesse atual, incluindo uma discussão a respeito das vantagens e desvantagens do mesmo. O Scientia não publica apenas relato de artigos descritos na literatura, sem uma discussão crítica sobre os mesmos.

Os artigos Originiais de Pesquisa deverão conter resultados de laboratório e/ou teóricos, que signifiquem uma contribuição expressiva para a área de técnicas de separação, seja ela conceitual, na instrumentação, ou na aplicação.

Os artigos do tipo Comunicação deverão ter a mesma qualidade dos artigos Originais, porém devido a seu caráter de comunicação preliminar usualmente são de menor extensão.

Envio do Artigo

Os artigos deverão ser encaminhados para periodico@scientiachromatographica.com. Os artigos do tipo Revisão deverão antes de seu envio pelo website ter o aval de um dos co-Editores do periódico, caso contrário não serão avaliados.

Todos os artigos, independentemente do formato, deverão ser submetidos exclusivamente ao Scientia, com o entendimento de que eles não foram anteriormente submetidos, não estão sendo e não serão posteriormente publicados em outro veículo.

Autores que utilizarem tabelas, ilustrações, figuras, ou textos contendo mais de 25 palavras, anteriormente publicados em outro periódico – sendo ou não autores do artigo – deverão obter a devida permissão por escrito do portador dos direitos de cópia (“Copyright ”). Esse documento deverá permanecer de posse dos autores, sendo encaminhado ao Scientia, quando solicitado.

Idioma

Os artigos, com exeção dos de Revisão, podem ser escritos preferencialmente em inglês, porém em Português e Espanhol também serão aceitos. Os autores cujo idioma nativo não for o empregado na redação do artigo são orientados a solicitar a colaboração de colegas fluentes no idioma, antes de enviar o artigo para o periódico.

Scientia Chromatographica 2016; 8(4) 271

Scientia Chromatographica 2016; 8(4):271-272 Instituto Internacional de Cromatografia ISSN 1984-4433

NORMAS PARA PUBLICAÇÃO

Tipos de contribuições aceitas para publicação no Scientia O Scientia Chromatographica considera para publicação quatro tipos de contribuição:

Artigos Originais de pesquisa: descrevem resultados de estudos completos. Deverão conter resultados de laboratório e/ou teóricos, que signifiquem uma contribuição expressiva para a área de técnicas de separação, seja ela conceitual, na instrumentação, ou na aplicação. Este tipo de contribuição é limitado a 6.000 palavras, incluindo as legendas das figuras e as referências, e no máximo 5 tabelas e/ou figuras somados. No momento do envio da prova de impressão, caso isto ocorra o autor será consultado se prefere revisar o artigo para enquadrá-lo em até 7 páginas, ou se prefere pagar as páginas excedentes. O número de páginas de um artigo depende muito das figuras e tabelas do mesmo. Este critério não é aplicado aos artigos convidados, cujo número de páginas será informado ao autor no momento do convite.

Comunicações (“Short Communication”): são artigos completos, porém que relatam resultados mais curtos, oportunos, e/ou cuja relevância requer sua rápida publicação. Deverão ter a mesma qualidade dos artigos Originais porém, devido a seu caráter de comunicação preliminar, usualmente são de menor extensão. Este tipo de publicação deve ter no máximo quatro páginas impressas, incluindo todo o artigo, ou seja, tabelas, figuras e referências. O autor deve indicar claramente que se trata de uma comunicação no topo da primeira página do artigo.

Artigos de Revisão crítica: revisões críticas sobre uma area específica das técnicas cromatográficas e relacionadas são também consideradas para publicação. Esses artigos devem se limitar a no máximo 10.000 palavras, incluindo as legendas, e até 10 tabelas e figuras somadas. Os artigos de Revisão Crítica deverão antes de sua submissão serem discutidos com um dos co-Editores mais relacionados ao assunto em questão. Artigos não encaminhados desta forma serão antes enviados a um co-Editor da área em que se enquadre para parecer e, somente então, serão enviados aos revisores, podendo atrasar significativamente sua publicação. Devem conter uma contribuição nova a respeito de um assunto de grande interesse atual, discutindo as vantagens e desvantagens do mesmo. O Scientia não publica apenas relato de artigos descritos na literatura, sem uma discussão crítica sobre os mesmos.

Artigos de Alta Prioridade: são publicados no primeiro número disponível do periódico, recebendo prioridade máxima de todo o sistema Editorial do periódico. Para justificar sua publicação como alta prioridade, os manuscritos deverão apresentar, de forma resumida, resultados importantes de recentes desenvolvimentos na área de cromatografia e técnicas relacionadas (espectrometria de massas, preparo de amostras, eletroforese capilar e outros). Não precisam conter resultados experimentais detalhados, sendo limitados a 2.500 palavras e três figuras e/ou tabelas combinadas.

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Scientia Chromatographica 2016; 8(4)

Scientia Chromatographica EDITOR-IN-CHIEF

FERNANDO MAURO LANÇAS Universidade de São Paulo Instituto de Química de São Carlos 13560-970 São Carlos (SP) - Brasil editor@scientiachromatographica.com EDITORES ASSOCIADOS

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RENATO ZANELLA

preparo de amostras

preparo de amostras

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ISABEL C. S. FONTES JARDIM

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Daniel Armstrong – EUA Dietrich von Bauer – Chile Fábio Augusto – Brasil Fátima Dutra – Brasil Flávio Leite – Brasil Frank Svec – EUA Harold McNair – EUA Humberto Gómez – México Isabel Cristina Sales Fontes Jardim – Brasil Jailson B. de Andrade – Brasil Janusz Pawliszyn – Canadá Kiyoratsu Jinno – Japão Luigi Mondello – Itália Marcos Eberlin – Brasil Marina Tavares – Brasil Milos Novotny – EUA Milton Lee – EUA Norberto Peporine Lopes – Brasil Phillip Marriott – Austrália Pierina Bonato – Brasil Quézia Cass – Brasil Renato Zanella – Brasil

cromatografia líquida

ENDEREÇO DO PERIÓDICO

Scientia Chromatographica

ELENA STASHENKO

espectrometria de massas

FABIO AUGUSTO

cromatografia gasosa

ALEJANDRO CIFUENTES

Técnicas Eletroforéticas

ÁLVARO J. SANTOS NETO

troubleshooting

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Ficha catalográfica elaborada pela Seção de Aquisição e Tratamento da Informação do SBI/IQSC Scientia Chromatographica / Associação Internacional de Cromatografia. - vol.8 n.4 (out./dez. 2016). São Carlos: Associação Internacional de Cromatografia, 2016.

Trimestral ISSN 1984-4433

CLÁUDIA ZINI

cromatografia gasosa

ELINA B. CARAMÃO

cromatografia gasosa

1. Cromatografia. 2. Lanças, Fernando Mauro, editor chefe.

CDD 543.8

ISSN 1984-4433

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2016

Volume 8 | Número 4

SCIENTIA CHROMATOGRAPHICA

Publicação disponível na internet:

209 Técnicas Cromatográficas Multidimensionais na Investigação de Metabólitos Secundários Paloma Santana Prata, Noroska Gabriela Salazar Mogollón, Fabio Augusto

2016 | Volume 8 | Número 4

231 Separation of Steroids by Temperature-Programmed Capillary Liquid Chromatography Using Packed Fused-Silica Column Alessandra Maffei Monteiro, Lincoln Figueira Marins Coutinho, Carlos Eduardo Domingues Nazario, Fernando Mauro Lanças

239 Extração em Fase Sólida Magnética (MSPE): Fundamentos e Aplicações Amandha Kaiser da Silva, Eduardo Sobieski Neto, Luiz Henrique Viana, Fernando Mauro Lanças, Carlos Eduardo Domingues Nazario

257 Glossário de Termos Cromatográficos

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