Sc v6n3

ISSN 1984-4433

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2014

Volume 6 | Número 3

SCIENTIA CHROMATOGRAPHICA

Publicação disponível na internet:

155 Determinação da razão isotópica do carbono por GC-C-IRMS utilizando extração HS-SPME em matrizes complexas naturais de interesse alimentar

2014 | Volume 6 | Número 3

Ana Gabriela Buglia, Luisa Schipilliti, Luigi Mondello

166 Análise de estatinas em plasma humano por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas utilizando microextração em fase sólida e derivatização in situ no preparo de amostra Natalia M. S. Sattolo, Paulo C. F. Lima Gomes, Álvaro J. Santos-Neto, Fernando M. Lanças

175 Estudo para a determinação de herbicidas da classe das triazinas por extração no ponto nuvem (CPE) Raquel Thomaz da Silva, Bárbara Fernanda Sanchez Razaboni, Gilberto Abate

186 Microextração líquido-líquido dispersiva (DLLME): fundamentos, inovações e aplicações biológicas Bruna Juliana Moreira, Jennifer Michiko Chauca Yokoya, Cristiane Masetto de Gaitani

205 Cromatografia em fluxo turbulento (TFC) Fernando M. Lanças

Rua Princesa Isabel, 265 - Jardim Paraíso São Carlos (SP) - CEP 13561-140 Fone/ Fax: (16) 3501-4140 | www.iicweb.org

2014 | Volume 6 | Número 3

Instituto Internacional de Cromatografia

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Fernando M. Lanças Universidade de São Paulo Instituto de Química de São Carlos 13560-970 São Carlos (SP) - Brasil editor@scientiachromatographica.com

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Pierina Sueli Bonato Técnicas Eletroforéticas

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Scientia Chromatographica / Associação Internacional de Cromatografia. - vol.6 n.3 (jul./set. 2014). São Carlos: Associação Internacional de Cromatografia, 2014 Trimestral ISSN 1984-4433 1. Cromatografia. 2. Lanças, Fernando Mauro, editor chefe.

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Periódico Trimestral do Instituto Internacional de Cromatografia

2014 | Volume 6 | Número 13

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SUMÁRIO

Editorial................................................................................................................................................................................................................153 Fernando M. Lanças

PREPARO DE AMOSTRAS Determinação da razão isotópica do carbono por GC-C-IRMS utilizando extração HS-SPME em matrizes complexas naturais de interesse alimentar............................................................................... 155 Ana Gabriela Buglia, Luisa Schipilliti, Luigi Mondello

SPME-GC-MS Análise de estatinas em plasma humano por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas utilizando microextração em fase sólida e derivatização in situ no preparo de amostra...................................................................................................................................................................... 166 Natalia M. S. Sattolo, Paulo C. F. Lima Gomes, Álvaro J. Santos-Neto, Fernando M. Lanças

PREPARO DE AMOSTRAS Estudo para a determinação de herbicidas da classe das triazinas por extração no ponto nuvem (CPE)............................................................................................................................................................................ 175 Raquel Thomaz da Silva, Bárbara Fernanda Sanchez Razaboni, Gilberto Abate

PREPARO DE AMOSTRAS Microextração líquido-líquido dispersiva (DLLME): fundamentos, inovações e aplicações biológicas.................................................................................................................................................................. 186 Bruna Juliana Moreira, Jennifer Michiko Chauca Yokoya, Cristiane Masetto de Gaitani

MULTIDIMENSIONAL Cromatografia em fluxo turbulento (TFC)................................................................................................... 205 Fernando M. Lanças (a)

(b)

IIC...........................................................................................................................................................................................................................213 Biblioteca IIC......................................................................................................................................................................................................214 Calendário de Cursos | 2015........................................................................................................................................................................215 Calendário de Eventos | 2015......................................................................................................................................................................216 Normas para Publicação...............................................................................................................................................................................217

Scientia Chromatographica 2014; 6(3)

151

Scientia Chromatographica 2014; 6(3):153 Instituto Internacional de Cromatografia http://dx.doi.org/10.4322/sc.2015.001 ISSN 1984-4433

EDITORIAL

Editorial Fernando M. Lanças* Universidade de São Paulo Instituto de Química de São Carlos 13560-970 São Carlos (SP) – Brasil *flancas@iqsc.usp.br

Com a recente popularização dos meios eletrônicos de comunicação ocorreu uma grande transformação na editoriação de revistas, livros, periódicos, jornais e outras formas de divulgação de informações. O desenvolvimento de grandes sistemas de busca, a exemplo do Google e outros, permitiu a disponibilização de um vasto volume de dados de rápido acesso.

Na área científica o resultado desta agilidade foi a necessidade dos periódicos se adaptarem aos novos tempos e promoverem uma acelaração no processo global de publicação. Uma das vertentes deste novo enfoque resultou na priorização das publicações eletrônicas ao invés das tradicionais impressas. Assim, nos últimos 5 anos praticamente todos os periódicos científicos da area de cromatografia e relacionadas passaram a ofertar uma assinatura eletronica, além da impressa. Outros optaram por implementarem apenas à versão eletrônica, eliminando a impressa a qual, além de muito mais demorada (da impressão até chegar às mãos do leitor), é acentuadamente mais onerosa.

O Scientia Chromatographica foi lançado na forma impressa ampliando, posteriomente, para incorporar a forma eletrônica – mantendo, em ambos os casos, o acesso gratuito, desde seu lançamento. A cada novo número, e seguindo a tendência internacional na área de publicações científicas, vem se renovando e priorizando a versão eletrônica em relação à impressa devido à rapidez e menor custo. Esperamos que esta ênfase esteja em sintonia com a preferência dos leitores. Opiniões e sugestões a este respeito serão muito bem vindas.

Fernando M. Lanças Editor

Scientia Chromatographica 2014; 6(3)

153

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EXPECT INNOVATION

Scientia Chromatographica 2014; 6(3):155-165 Instituto Internacional de Cromatografia http://dx.doi.org/10.4322/sc.2015.002 ISSN 1984-4433

PREPARO DE AMOSTRAS

Determinação da razão isotópica do carbono por GC-C-IRMS utilizando extração HS-SPME em matrizes complexas naturais de interesse alimentar Carbon isotope ratios determination by GC-C-IRMS using HS-SPME extraction in natural complex matrices of food interest

Ana Gabriela Buglia1 Luisa Schipilliti1 Luigi Mondello1,2* Dipartimento di Scienze del Farmaco e dei Prodotti della Salute, Università degli Studi di Messina, Viale Annunziata, 98168 - Messina, Itália 2 Centro Integrato di Ricerca (C.I.R.), Università Campus Bio-Medico, Via Álvaro del Portillo 21, 00128 Roma, Itália *lmondello@unime.it 1

Recebido: 17/10/2013 Aceito: 25/11/2013

Resumo

A análise de isótopos estáveis tornou-se uma técnica poderosa, revelando práticas mais sofisticadas no controle de qualidade e na detecção de adulteração de gêneros alimentícios. O sistema composto de cromatógrafo a gás, com espectrômetro de massas de razão isotópica e interface de combustão (GC-C-IRMS), combina a potencialidade de separação de um cromatógrafo a gás com um espectrômetro de massas especializado, capaz de coletar as contribuições iônicas de diferentes razões isotópicas de um único elemento. As frações aromáticas e as razões isotópicas do carbono de alimentos foram investigadas hifenando a microextração em fase sólida por headspace (HS-SPME) ao GC-MS e posteriormente ao GC-C-IRMS, com o intuito de reduzir o tempo de análise e de obter amostras prontas para injeção no GC. A presente pesquisa visa demonstrar a aplicabilidade da técnica HS-SPME acoplada ao GC-C-IRMS e cromatografia gasosa enantioseletiva (Es-GC), para a determinação do controle de qualidade e a rastreabilidade geográfica de matrizes alimentares complexas, tais como licores cítricos, morango e produtos contendo aroma de morango. O uso do Es-GC permitiu confirmar os resultados obtidos a partir de análises precedentes feitas com o GC-C-IRMS, porém a primeira técnica empregada possui a vantagem de, além dos compostos quirais, conseguir analisar uma vasta gama de compostos não quirais. Pode-se afirmar, portanto, que tratamse de técnicas complementares. Em síntese, a importância desta pesquisa destaca a possibilidade de garantir o controle de qualidade dos alimentos usando técnicas analíticas mais diretas e imediatas.

Palavras-chave: GC-C-IRMS, Es-GC, HS-SPME, isótopos de carbono, licores cítricos, morango, alimentos aromatizados sabor morango.

Scientia Chromatographica 2014; 6(3)

155

Buglia AG et al.

Determinação da razão isotópica do carbono em alimentos por GC-C-IRMS

Abstract

Stable isotope ratio analysis has became a powerful technique, unveiling more sophisticate practices for food quality control and for the detection of frauds in food. Gas Chromatography-Combustion-Isotope Ratio Mass Spectrometer system (GC-C-IRMS) combines the power of separation of a gas chromatograph with a special mass spectrometer able to collect the ionic contributions with different isotope ratios of a single element. The aromatic fraction and its carbon isotope ratios of the food were investigated hyphenating headspace solid phase microextraction (HS-SPME) to GC-MS and then to GC-C-IRMS in order to reduce the time of analysis, obtaining samples ready to inject directly into a GC injector port. The aim of the present research is to show the applicability of HS-SPME technique hyphenated to the GC-C-IRMS system for the determination of quality control and the geographic traceability of complex food matrices, such as Citrus liqueurs, strawberry and strawberry flavoured foodstuff. Moreover, to confirm the results obtained from GC-C-IRMS analyses, Enantioselective-Gas Chromatography (Es-GC) investigations were conducted on the chiral aroma compounds, to reveal the agreement between these two complementary techniques. The importance of this research is highlighting the possibility to ensure food quality control using more immediate and focused analytical techniques like GC-C-IRMS and Es-GC coupled with HS-SPME. Keywords: GC-C-IRMS, Es-GC, HS-SPME, Carbon isotope ratio, Citrus liqueurs, strawberry, strawberry flavoured foodstuff.

1. Introdução

A segurança dos alimentos é uma das prioridades máximas de um mercado globalizado. A rastreabilidade dos alimentos precisa ser assegurada desde a exploração agrícola até a mesa do consumidor. Tal segurança não significa uniformidade e de um modo geral os Estados procuram promover a diversidade aliada à qualidade, protegendo os gêneros alimentícios tradicionais e os produtos provenientes de regiões específicas, garantindo que os consumidores os possam distinguir das imitações. De grande relevância é a atual severa atividade de regulamentação de produtos alimentares.

Esta nova sensibilidade dos consumidores presume o uso de padrões qualitativos e da rastreabilidade dos alimentos, capazes de reconstruir desde a origem do alimento em questão, cada uma das principais etapas da cadeia produtiva do mesmo, de forma direta (From Farm to Fork), ou indireta (From Fork to Farm). Existe na Europa uma imensa riqueza e variedade de produtos alimentares. Mas quando um produto adquire uma reputação que ultrapassa fronteiras, é possível que tenha que se defrontar no mercado com produtos copiados que usurpam o seu nome. Esta concorrência desleal não só desencoraja os produtores como também induz o consumidor a erro. Por essa razão a Comunidade Européia criou o Regulamento (CE) N° 2081/92,[1] 156

onde definiu sistemas de proteção e de valorização dos gêneros alimentícios do tipo Denominação de Origem Protegida (DOP), Indicação Geográfica Protegida (IGP) e Especialidade Tradicional Garantida (ETG).

O problema de detecção de adulteração em alimentos é um enorme desafio para a indústria. Visto que produtos fraudulentos possuem sofisticadas formulações de imitações, as metodologias atuais de detecção, tornaram-se obsoletas. Procurando superar este problema a análise de razão isotópica pode ser uma alternativa relevante para o reconhecimento da autenticidade dos alimentos.

Os isótopos são átomos de um mesmo elemento químico que apresentam o mesmo número de elétrons, de um mesmo número de prótons e diferentes números de nêutrons em seu núcleo, ou seja, apresentam propriedades químicas iguais e físicas diferentes[2].

Isótopos estáveis são aqueles que não emitem radiação.

Os elementos carbono, hidrogênio, oxigênio, nitrogênio e enxofre apresentam interesse biológico e ocorrem naturalmente[3]. Os isótopos mais leves (1H, 12C, 14N, 16O, 32 S) em geral, são mais abundantes que os mais pesados 2 ( H, 13C, 15N, 17O, 18O, 33S, 34S, 36S).

Scientia Chromatographica 2014; 6(3):155-165

Determinação da razão isotópica do carbono em alimentos por GC-C-IRMS

Buglia AG et al.

A Espectrometria de Massas de Razão Isotópica do Carbono (GC-C-IRMS) permite determinar a razão isotópica do carbono. Os principais passos numa análise GC-C-IRMS consistem em: i) adquirir a melhor separação através da coluna capilar do GC, ii) converter cada componente separado em CO2 através da chama de combustão, iii) coletar o CO2 ionizado no espectrômetro de massas e comparar os valores 13 12 C/ C com aqueles relativos ao padrão de trabalho. No estudo da variabilidade isotópica natural dos elementos, utiliza-se a terminologia “delta per mil” (δ‰), na qual a razão isotópica da amostra é comparada com a razão isotópica de um padrão internacional (VPDB, no caso do carbono). O Pee Dee Belemnite (PDB) consiste num carbonato de cálcio marinho de uma belemnite do Cretácio, Belemnitella americana, da formação Pee Dee, na Carolina do Sul. Em 1959, Craig[4] determinou as razões isotópicas de CO2 para o PDB, 13C/12C= 11237,2 x 10-6 e 18O/16O= 2079 x 10-6[5,6]. Como este padrão de referência internacional se esgotou, foi substituído pelo Vienna-PDB (padrão secundário), para a determinação da razão isotópica 13C/12C (Pee Dee Belemnite). Por razões práticas, é mais conveniente adotar um padrão de trabalho no laboratório, calibrando segundo este padrão de valor certificado, o VPDB.

pela enzima PEP-carboxilase, formando oxalacetato, que por sua vez é reduzido a um composto de quatro carbonos (malato ou aspartato). Estes compostos são transportados para as células da bainha, e nessas células são descarboxilados para formar o CO2 e piruvato. O CO2 concentrado por esse processo entra para o ciclo de síntese orgânica idêntico ao ciclo das plantas C3[7]. Ao longo do processo de produção de carboidratos, o carbono do CO2 sofre um fracionamento isotópico, ocorrendo diminuição da concentração de 12C[8]. A metodologia que utiliza a razão isotópica do carbono (13C/12C) é extremamente útil na quantificação de carbono de diferentes espécies botânicas, quando a composição do alimento ou bebida baseia-se na mistura de compostos produzidas a partir de plantas de diferentes ciclos fotossintéticos.

As plantas do ciclo fotossintético C3 (citros, morango, etc.), durante a fotossíntese, absorvem o CO2 por meio dos estômatos da folha pelo processo de difusão, que é transferido até as células do mesófilo (cloroplasto). Nessas células ocorre o processo de síntese orgânica, onde a reação química entre o CO2 com um composto de cinco carbonos (ribulose 1,5 difosfato) é catalizada pela enzima RuBP-carboxilase, formando duas moléculas de três carbonos (ácido 3-fosfoglicerato), que serão convertidas em açúcar. Os vegetais com ciclo fotossintético C4 (cana-de-açúcar, milho, gramíneas tropicais, etc.) possuem dois tipos de cloroplastos: o do mesófilo e o da bainha. Funcionalmente a produção de carboidratos não ocorre nas células do mesófilo, onde é fixado na forma de HCO3– . Esse composto reage com o fosfoenol-piruvato (PEP), reação esta catalizada

Com o objetivo de determinar parâmetros úteis capazes de definir a autenticidade e genuinidade de licores cítricos e de alimentos aromatizados, os componentes aromáticos da fração volátil de diferentes matrizes alimentares foram investigados, através HSSPME hifenada a cromatografia gasosa de espetrometria de massas (GC-MS), ao cromatógrafo a gás acoplado ao espectrômetro de massas de razão isotópica (GC-CIRMS) e ao cromatógrafo a gás enantioseletivo (Es-GC).

Quando necessário as análises foram realizadas com padrão interno para avaliar somente o fracionamento isotópico que ocorre durante os ciclos metabólicos secundários das plantas. A distribuição quiral foi determinada para testar os resultados adquiridos através da avaliação das razões isotópicas. Tais resultados conferiram em ambas as técnicas, demonstrando a complementaridade entre elas.

2. Parte Experimental 2.1. Amostras e Preparação de amostras As amostras dos licores analisados são as que seguem abaixo.

Scientia Chromatographica 2014; 6(3):155-165 157

Buglia AG et al.

• Licores de extrato de óleo essencial de casca de limão (limoncello), artesanal L1-L3; preparados por infusão da casca de citros biológica em etanol, água e açúcar, comercial LC1-LC5.

• Licores de extrato de óleo essencial de casca de bergamota (bergamino), comercial BC1BC4.

As amostras comerciais foram adquiridas em um mercado local.

As amostras foram diluídas na proporção de 1:1 em água saturada contendo NaCl e os voláteis foram extraídos de um frasco para SPME de 10 mL preenchido até a metade, hermetizado com septo de silicone/PTFE. As amostras dos alimentos aromatizados são as que seguem abaixo.

• Morangos orgânicos “in natura” e comeciais provenientes da região da Sicília, na Itália.

• Iogurtes aromatizados (sabor morango) sem nenhuma polpa.

• Sorvetes aromatizados (sabor morango).

Todas as amostras foram homogeneizadas e misturadas com água contendo NaCl e os compostos voláteis foram extraídos de um frasco para SPME de 10 mL, preenchido até a metade e hermetizado com um septo de silicone /PTFE.

2.2. Condições HS-SPME Para licores cítricos a fibra escolhida foi a PDMS, polidimetilsiloxano (Sigma-Aldrich/Supelco, Milão, Itália) 100 µm de espessura; tempo de extração de 10 segundos (para compostos voláteis mais abundantes) e de 20 minutos (para compostos voláteis menos abundantes); agitação com imã magnético: 2000 rpm; temperatura de extração em banho termostático de aproximadamente 30 °C; tempo de dessorção no injetor do GC de 1 min a 250 °C. 158

Determinação da razão isotópica do carbono em alimentos por GC-C-IRMS

Para morangos e alimentos aromatizados a fibra escolhida foi a DVB/Car/PDMS, divinilbenzenecarboxen-polidimetilsiloxano (Sigma-Aldrich/Supelco) 50/30 µm de espessura; tempo de pré-condicionamento de 15 minutos; tempo de extração de 60 minutos; agitação com imã magnético de 2000 rpm; temperatura de extração em banho termostático de aproximadamente 50 °C; tempo de dessorção no injetor do GC de 1 minuto a 250 °C.

3. Instrumentação 3.1. Análises GC-MS

As análises de cromatografia gasosa acoplada ao espectrômetro de massas, foram realizadas empregando o sistema Shimadzu QP2010 GC-MS (Shimadzu Corps, Japão).

Para os licores cítricos a coluna capilar empregada foi a SLB-5 ms (30 m x 0,25 mm, 0,25 µm), para o morango e alimentos aromatizados foi utilizada a coluna capilar DB-5 (30 m x 0,25 mm, 0,25 µm). A temperatura no GC foi programada de 40 °C até 125 °C com rampa de 3 °C/min, de 250 °C com rampa de 5 °C/min e de 330 °C com rampa de 10 °C/min por 2 minutos para os licores cítricos. Enquanto para o morango e alimentos aromatizados o programa de temperatura no GC foi de 50 °C até 190 °C com rampa de 3 °C/min, e em seguida de 280 °C com rampa de 10 °C/min por 2 minutos. O gás de arraste utilizado foi o He, com velocidade linear de 32,4 cm/s e a temperatura no injetor split/splitless foi de 250 °C, para todas as amostras. As condições do espectrômetro de massas foram as seguintes: temperatura na fonte de íons de 200 °C, temperatura da interface de 250 °C e intervalo de massas de íons adquiridos de 40 a 400 m/z com um tempo de varredura de 0,25 s e voltagem do detector de 0,94 kV. Os dados foram adquiridos em triplicata pelo software GCMSSolution (Shimadzu Corps, Japão), equipado com a biblioteca FFNSC 2 – Flavour and Fragance Natural and Synthetic Compounds (Shimadzu Corps, Japão) com o uso de índice de retenção linear Scientia Chromatographica 2014; 6(3):155-165

Determinação da razão isotópica do carbono em alimentos por GC-C-IRMS

Buglia AG et al.

(LRI). Os LRIs foram calculados injetando séries homólogas de alcanos (C7-C30) sob condições cromatográficas idênticas.

com rampa de 10 °C/min, mantida por 2 minutos, para os licores. De 50 °C até 190 °C com rampa de 3 °C/min, e em seguida aquecimento até 280 °C com rampa de 10 °C/min, mantida por 2 minutos, para os morangos e alimentos aromatizados. O injetor split/ splitles estava em modo splitless com temperatura de 250 °C, gás de arraste He e uma vazão de coluna de 2,0 mL/min. A velocidade linear foi de 32,4 cm/s e pressão de entrada de 101 kPa.

3.2. Es-GC

O sistema consiste de um cromatógrafo a gás GC2010. A coluna utilizada foi uma Megadex DETTBS-β (dietil-tert-butil-silil-β-ciclodextrin) com 25 m x 0,25 mm x 0,25 µm (Mega, Legnano, Itália). As condições de temperatura foram de 50 °C até 200 °C com rampa de 2,0 °C/min permanecendo nesta temperatura por 5 minutos. A temperatura no injetor split/splitless foi de 220 °C, com uma razão do divisor de fluxo (split) de 1:100 para os licores, e no modo splitless para o morango e os alimentos aromatizados. O gás de arraste foi o He com uma pressão de entrada de 96,6 kPa e com uma velocidade linear de 35,0 cm/s O detector FID com temperatura de 220 °C foi alimentado pelos seguintes gases: H2 a 40 mL/min; ar a 400 mL/min; gás auxiliar N2 a 40 mL/min. A velocidade de aquisição foi de 80 mseg.

Os dados foram adquiridos pelo software GCSsolution (Shimadzu Corps, Japão).

3.3. GC-C-IRMS

O instrumento GC-C-IRMS, conforme repre­ sentado no esquema da Figura 1, é constituido por um Trace GC Ultra equipado com um amostrador automático TriPlus, hifenado com uma interface de combustão GC/CIII e com um espectrômetro de massas de razão isotópica Delta V Advantage (Thermo Fisher Scientific, Milão, Itália).

No Trace GC foi utilizada a coluna capilar SLB5 ms (30 m x 0,25 mm x 0,25µm) tanto para avaliar os licores quanto para avaliar o morango e os alimentos aromatizados (Sigma-Aldrich/Supelco, Milão, Itália).

Os programas de temperatura para cada matriz estudada foram os seguintes: 40 °C até 125 °C com rampa de 3 °C/min, e em seguida aquecimento até 300 °C

A interface GC/CIII possui reator de oxidação (Cu/Ni/Pt) a 980 °C; reator de redução a 640 °C; He: 1 bar; O2: 0,8 bar; CO2: 0,5 bar.

As condições no IRMS foram as seguintes: voltage eletrônica de 123,99 eV; corrente eletrônica de 1,5 mA; 3 coletores Faraday em m/z 44,45 e 46; pico central pré e pós atraso 15 s no coletor 3.

Pulsos de referência de CO2 para os licores: 6080 s, 100-120 s, 140-160 s, 180-200 s; split: aberto; tipo de avaliação: CO2_SSH, tempo de referência: 155,9 s δ13C/δ12C -60,300 ‰, tempo de integração 0,2 s.

Os pulsos de referência de CO2 para o morango e alimentos aromatizados foram de: 2860-2880 s, 2900‑2920 s, 2940-2960 s, 2980-3000 s; split: aberto; tipo de avaliação: CO2_SSH, tempo de referência: 2952,5 s δ13C/δ12C -60,174‰, tempo de integração 0,2 s.

A aquisição de dados foi feita em triplicata através do software Isodat 2.5 (Thermo Fisher Scientific).

O padrão de trabalho CO2 foi calibrado através da injeção de uma mistura de alcanos de razão isotópica de referência, reconhecida e certificada, compreendendo de C16 à C30 (Indiana University, Bloomington, U.S.A.), por sua vez calibrado com relação ao padrão VPDB, conforme a Equação (1): 13

δ CVPDB =

(

13

C / 12C

)

amostra

(

13

−

(

13

C / 12C

C / 12C

)

)

CO2

× 1000

(1)

amostra

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Buglia AG et al.

Determinação da razão isotópica do carbono em alimentos por GC-C-IRMS

Figura 1. Esquema simplificado de um sistema de cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de massas de razões isotópicas com interface de combustão (GC-C-IRMS) com uso da técnica HS-SPME.

4. Resultados

Os dados apresentados abaixo tanto para os licores cítrico quanto para o morango e alimentos aromatizados, foram previamente reportados em trabalhos científicos[9,10].

As plantas produzem uma larga e diversa ordem de componentes orgânicos divididos em metabólitos primários e secundários. Os metabólitos primários possuem função estrutural, plástica e de armazenamento de energia. Os metabólitos secundários, produtos secundários ou produtos naturais, aparentemente não possuem relação com crescimento e desenvolvimento da planta. No entanto, ao contrário do que se pensava, os metabólitos secundários têm funções ecológicas nas plantas, protegendo-nas contra herbívoros e patógenos, servindo como atrativos (aroma, cor, sabor) para polinizadores e funcionando como agentes de competição entre plantas, e de simbiose entre plantas e microorganismos[11].

Os metabólitos secundários nas plantas podem ser divididos em três grupos distintos quimicamente: terpenos, compostos fenólicos e componentes contendo 160

nitrogênio, que constituem o que os químicos chamam de “produtos naturais”.

Nos licores cítricos, os compostos metabólicos secundários, hidrocarbonetos mono e sesquiterpênicos e derivados oxigenados, foram extraídos por HS-SPME e caracterizados por GC-MS. Para analisar a genuinidade destes licores, foram conduzidas análises mediante o sistema GC-C-IRMS, selecionando como marcadores aqueles que melhor os representavam em termos de abundância, de aroma e ainda que apresentavam uma resolução cromatográfica apropriada.

Os valores δ13CVPDB obtidos a partir destes marcadores foram confrontados com aqueles obtidos do óleo essencial da casca de citros naturais italianos macerados a frio, presentes na literatura [12-15].

Os valores δ13CVPDB são conseqüência do fracionamento ocorrido durante o ciclo biogenético primário da planta. A introdução de um padrão interno (pi) é necessário para comparar a razão isotópica Scientia Chromatographica 2014; 6(3):155-165

Determinação da razão isotópica do carbono em alimentos por GC-C-IRMS

Buglia AG et al.

determinada nas amostras com aquelas determinadas na construção da faixa de autenticidade, isto elimina fatores ambientais ou climáticos relacionados com o ciclo biogenético primário, tais como a fixação de CO2, a origem geográfica das plantas, e eventualmente a diferenciação dos ciclos fotossintéticos das plantas: Calvin (C3), Hatch Slack (C4) ou CAM (CAM). Os valores obtidos com o uso do padrão interno referem-se assim, somente ao fracionamento do carbono ocorrido durante a biossíntese dos metabólitos secundários nas células das plantas através dos ciclos Eritrose-4-fosfato ((MEP) e do ácido mevalônico (MVA) [16].

quanto para licores comerciais com e sem padrão interno (pimirceno). As análises no GC-C-IRMS, apresentaram valores compatíveis com a literatura para as amostras artesanais (L1-L3), com pequeno desvio na amostra L3, solucionado após adição do pimirceno, o que reflete a genuinidade dos licores artesanais, como é possível observar nas Figuras 2 A-B. Para as amostras comerciais no GC-C-IRMS, averigou-se que praticamente todas apresentaram inconformidades, com exceção da LC2 (dados não reportados). Utilizando o pimirceno (Figura 2 C) minimizou-se as diferenças das amostras comerciais com relação à faixa de autenticidade obtida a partir de óleos de limão autênticos, salientando que apenas LC4 reentra completamente nesta faixa. As amostras de bergamota, apresentaram-se pelo menos para um dos compostos fora da faixa de autenticidade (BC1-BC4), mesmo após a utilização do padrão interno (Figura 2 D).

Dentre os voláteis analisados, o mirceno foi escolhido como padrão interno para todos os licores cítricos. Na Figura 2 A-D, verifica-se os valores isotópicos do carbono tanto para licores artesanais

Figura 2. A-D: Tendência de dados do GC-C-IRMS, em comparação com a correspondente faixa de autenticidade calculada para óleos da casca de citros maceradas a frio.

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Buglia AG et al.

Determinação da razão isotópica do carbono em alimentos por GC-C-IRMS

Análises quirais, cujos resultados podem ser verificados na Tabela 1, confirmaram aqueles obtidos pelo IRMS para as amostras LC2 e LC4, com exceção para as amostras LC1 e LC3 que apresentaram diferenças não significas. Além disto, as análises efetuadas mediante GC-MS evidenciaram que na amostra LC4 demonstrou ter um baixo nível da fração terpênica,

evidenciando uma divengência com a legislação vigente. A adição de óleo essencial deterpenado, representa procedimento freqüentemente adotado pela indústria, que procura evitar tanto o efeito chamado de “colarinho”, produzido por terpenos sob refrigeração, quanto o sabor desagradável do produto armazenado, devido à oxidação terpênica.

Tabela 1. Distribuição enantiomérica determinada a partir das amostras de licores cítricos; (a) e (b): dados da literatura obtidos a partir de extratos de óleos da casca de citros genuíno macerada.

Licores de limão Componentes quirais voláteis

Licores de bergamota

LC1

LC2

LC3

LC4

L1artesanal L2artesanal L3artesanal

(a)

BC1

BC2

BC3

BC4

(b)

R-(+)-α-Pineno 20,97

26,59

34,09

26,89

26,01

35,71

25,07

25,5 -38,0

-

26,00

-

27,84

26,0 -38,4

S-(-)-α-Pineno

79,03

73,41

65,91

73,11

73,99

64,29

74,93

74,5 -62,0

-

74,00

-

72,16

74,0 -61,6

R-(+)-β-Pineno

5,74

5,87

8,76

6,82

5,44

5,59

6,17

4,2 - 7,0

9,74

8,79

14,73

9,29

6,8 -10,3

S-(-)-β-Pineno

94,26

94,13

91,24

93,18

94,56

94,41

93,83

95,8 -93,0 90,26

91,21

85,27

90,71

93,2 -89,7

R-(+)-Sabineno 16,90

17,01

15,09

14,61

14,70

15,11

16,27

12,4-15,5

17,20

16,11

-

-

13,7 -19,8

S-(-)-Sabineno

8,10

82,99

84,91

85,39

5,30

84,89

83,73

87,6 -84,5 82,80

83,89

-

-

86,3 -80,2

S-(-)-Limoneno

1,72

1,43

1,25

1,84

1,46

1,24

1,60

1,0 - 2,6

1,86

2,14

3,01

1,69

1,2 - < 3,0

R-(+)-Limoneno 98,28

98,57

98,75

98,16

98,54

98,76

98,40

99,0 -97,4 98,14

97,86

96,99

98,31 98,8 - > 97,0

R-(-)-Linalol

60,90

-

-

61,13

74,73

53,42

71,66

49,5 -74,5 89,32

71,17

99,64

68,91

99,0 -100

S-(+)-Linalol

39,10

-

-

38,87

25,27

46,58

28,34

50,5 -25,5 10,68

28,83

0,36

31,09

1,0 – 0,0

(-)-Acetato de linalilo

-

-

-

-

-

-

-

-

97,91

78,18

94,48

72,55

99,0 -100,0

(+)-Acetato de linalilo

-

-

-

-

-

-

-

-

2,09

21,82

5,52

27,45

1,0-0,0

a: Ref [13]; b: Ref [12].

As razões enantioméricas determinadas nos licores de bergamota (BC1-BC4) coincidem com as razões isotópicas. Mais detalhadamente, na amostra BC1 a distribuição enantiomérica e o valor de δ13C do linalol ficaram fora da faixa adotada como genuína de óleos da casca da bergamota para ambas as técnicas. Resultados equivalentes foram obtidos para as amostras BC2 e BC4 com desviações das razões isotópicas do carbono e das distribuições enantioméricas para vários compostos. Na amostra BC3, a distribuição enantiomérica assim como a razão isotópica do linalol não condiz com os valores dos óleos genuínos de bergamota, além disto o acetato 162

de linalilo não está presente. Isto indica uma provável mistura destes licores com aromas artificiais para incrementar a produção ou mesmo reproduzir o aroma característico da bergamota. O que é confirmado pela ausência ou baixo nível dos hidrocarbonetos mono e sesquiterpenos, detectados nestas amostras pelo GC-MS. De um modo geral, as análises feitas com o Es-GC confirmaram os resultados obtidos pelo GC-CIRMS, demonstrando tratar-se de um método confiável.

Com relação aos alimentos aromatizados sabor morango, análises qualitativas preliminares utilizando a Scientia Chromatographica 2014; 6(3):155-165

Determinação da razão isotópica do carbono em alimentos por GC-C-IRMS

Buglia AG et al.

técnica HS-SPME hifenada ao GC-MS, foram conduzidas com o intuito de escolher a fibra mais apropriada,

baseando-se na seletividade e no alcance da extração.

Sucessivamente, foram extraídos os componentes voláteis do morango orgânico italiano “in natura” para construir as faixas de autenticidade a partir dos valores isotópicos do carbono, utilizando-se o mesmo método de extração acoplado à técnica GC-C-IRMS. Compararam-se estes valores com amostras de alimentos aromatizados para descobrir se estes continham aroma natural ou sintético de morango. Os componentes estudados foram: vários ésteres alifáticos, linalol, γ-decalactona. Os principais compostos encontrados estão descritos na Tabela 2, com seus respectivos coeficientes de variação (CV%).

Tabela 2. Valores de δ13CVPDB (‰) dos compostos voláteis do aroma de morango e seus respectivos coeficientes de variação.

Compostos (GC-MS)

Morango orgânico (GC-C-IRMS)

CV%

butirato de metila butirato de etila hex-(2E)-enal hexanoato de metila butanoato de butila hexanoato de etila acetato de hexila linalol butanotato de hexila Isovalerato de octila γ-decalactona hexanoato de octila

-31,75 - -29.26 -32,60 - -31,26 -28,80 - -27,33 -28,23 - -27,56 -33,01 - -31,84 -31,190 - -29,96 -31,55 - -30,08 -28,77 - -27,97 -32,89 - -30,33 -31,87 - -31,52 -29,70 - -28,20 -31,72 - -29,85

4,18 2,66 2,90 1,22 2,56 1,59 2,68 1,42 3,52 0,79 2,60 3,14

As Figuras 3 A-C, remetem as análises realizadas no GC-C-IRMS para todas as amostras, sem e com pi.

Morangos comerciais “in natura” (Figuras 3 A-B), aparecem muito similares às faixas de autenticidade apresentadas para morangos orgânicos tanto sem quanto com o pi, o que ressalta que as condições de cultivo ou a

Figura 3. A: Valores de δ13CVPDB (‰) de alimentos comerciais aromatizados sabor morango em confronto com a faixa de autenticidade. B: Valores de δ13Cbutanoato de metila (‰) de alimentos comerciais aromatizados sabor morango em confronto com a faixa de autenticidade, utilizando o padrão interno.

C: Razão isotópica do carbono para sorvete aromatizado com utilização de pi δ13C acetato de hexila, apresenta valores fora da faixa de autenticidade.

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Determinação da razão isotópica do carbono em alimentos por GC-C-IRMS

Tabela 3. Distribuição enantioseletiva do γ-decalactona e do linalol para amostras de morango e de alimentos aromatizados sabor morango.

Compostos quirais

Morango orgânico

Iogurte 1

Iogurte 2

Sorvete

a

b

(R)-γ-decalactona

89,45 - 91,74

65,89

47,31

49,50

-

94,0 – 100,0

(S)-γ- decalactona

8,26-10,55

34,11

52,69

50,50

-

0,0 - 6,0

(R)-(-)-linalol

0,92 - 3,00

n.d.

n.d.

59,75

0,9 - 2,9

-

(S)-(+)-linalol

97,00 - 99,08

n.d.

n.d.

40,25

97,1 - 99,1

-

a Ref [17]; b Ref [18]; n.d.: não detectado.

origem geográfica dos morangos comerciais e orgânicos são similares. Para alimentos aromatizados sabor morango os valores indicam grandes discrepâncias, como pode ser observado na Figura 3 C que toma como exemplo o sorvete de morango.

Na Tabela 3 a avaliação da qualidade do aroma da fruta e das amostras de alimentos aromatizados foram adicionalmente investigadas por HS-SPME-Es-GC, determinando a distribuição enatiomérica do linalol e da γ-decalactona[17]. Os resultados foram comparados com dados da literatura.

Dos dois componentes quirais que determinam o aroma do morango, somente γ-decalactona é amplamente utilizada em aromatizantes artificiais, o que pode ser observado na Tabela 3. O resultado induz a acreditar que os alimentos aromatizados sabor morango sejam produzidos a partir de aromas sintéticos pois a distribuição rancêmica de ambos os pares enantioméricos no sorvete,

164

bem como da γ-decalactona em iogurtes possuem valores muito divergentes com relação àqueles obtidos com morangos orgânicos “in natura” demonstrando complementaridade entre as técnicas utilizadas (GC-CIRMS e Es-GC).

5. Considerações finais

As técnicas GC-C-IRMS, Es-GC e GC-MS acopladas com o método de extração HS-SPME podem ser consideradas ferramentas úteis e rápidas para a investigação de controle de qualidade das matrizes complexas estudadas.

Agradecimentos

Projeto financiado pelo “Ministério Italiano para a Universidade e Pesquisa (MIUR)” dentro do Projeto Operativo Nacional “Hi-Life Health Products from the industry of foods”. ID do Projeto: PON01_01499.

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Determinação da razão isotópica do carbono em alimentos por GC-C-IRMS

Buglia AG et al.

Referências 1.

Comissão Européia, Regulamento (CE) N° 2081/92 do Conselho de 14 de Julho de 1992 relativo à proteção das indicações geográficas e denominações de origem dos produtos agrícolas e dos gêneros alimentícios. Jornal Oficial das Comunidades Européias 1992; L 208:1

2.

Boutton TW. Stable carbon isotope ratios of natural materials: I. sample preparation and mass spectrometric analysis. In: Coleman DC, FRY B. Carbon isotope techniques. San Diego: Academic Press 1991; (10):155-171

3.

Sleiman M. Determinação do percentual de malte de cevada em cervejas tipo Pilsen utilizando os isótopos estáveis do carbono (δ13C) e no nitrogênio (δ15N). Tese –(Doutorado em Agronomia/Energia na Agricultura) Faculdade de Ciências Agronômicas, Universidade Estadual Paulista 2006; 87 f

4.

Craig H. The geochemistry of the stable carbon isotopes. Geochim. Cosmochim. Acta 1953; 3, 53

5.

Gonfiantini R, Stichler W, Rozansky K. Standards and intercomparison materials distributed by the International Atomic Energy Agency for stable isotopes measurements, in Reference and intercomparison materials for stable isotopes of light elements 1993; (825):13-29

6.

Gonfiantini R, Consultants Meeting on stable isotope standards and intercalibration in hydrology and in geochemistry. IAEA Vienna 1976; documento não publicado

7.

Lehninger AL, Nelson DL, Cox MM. Biossíntese de Carboidratos. In: Simões, AA, Lodi, WRN. Princípios de bioquímica.

Sarvier 1995; (19):444-476

8.

Rossmann A. Determination of stable isotope ratios in food analysis. Food Reviews International 2001; 17(3):347-381

9.

Schipilliti L, Bonaccorsi I, Cotroneo A, Dugo P, Mondello L. Evaluation of Gas Chromatography-Combustion-Isotope Ratio Mass Spectrometer (GC-C-IRMS) for the Quality Assessment Of Citrus Liqueurs. J Agric.Food Chem. 2013; 61(8):1661-70

10. Schipilliti L, Dugo P, Bonaccorsi I, Mondello L. Headspace-solid phase microextraction coupled to gas chromatographycombustion-isotope ratio mass spectrometer and to enantioselective gas chromatography for strawberry flavoured food quality control. J.Chromatogr. A 1218 (2011) 7481-7486 11. Taiz L, Zeiger E. Plant physiology. Sounderland Massachussetts: Sinauer Associates Inc. 2006 12. Schipilliti L, Dugo P, Santi L, Mondello L. Authentication of bergamot essential oil by Gas-Chromatography-CombustionIsotope Ratio Mass Spectometer (GC-C-IRMS). J.Essent.Oil Res.2011; 23(60):60-71 13. Schipilliti L, Dugo P, Bonaccorsi I, Mondello L. Authenticity control on lemon essential oils employing Gas ChromatographyCombustion-Isotope Ratio Mass Spectrometry (GC-C-IRMS). Food Chem. 2012; (131): 1523-1530 14. Dugo G, Bonaccorsi I, Sciarrone D, Schipilliti L, Russo M, Cotroneo A, Dugo P, Luigi L, Raymo V. Characterization of coldpressed and processed bergamot oils by using GC-FID, GC-MS, GC-C-IRMS, enantio-GC, MDGC, HPLC and HPLC-MS-ITTOF. J.Essent. Oils Res.2012; 24(2):93-117 15. Bonaccorsi I, Sciarrone D, Cotroneo A, Mondello L, Dugo P, Dugo G. Enantiomeric distribution of key volatile components in citrus essential oils. Braz. J. Pharmacogn. 2011; 21(5):841-849 16. Tholl D, Sohrabi R, Huh JH, Lee S. The biochemistry of homoterpenes- Common constituents of floral and herbivore-induced plant volatile bouquets. Phytochem. 2011; 26(1):34-46 17. Ravid U, Elkabetz M, Zamir C, Cohen K, Larkov O, Aly R. Authenticity assessment of natural fruit flavor compounds in foods and beverages by auto-HS-SPME stereoselective GC-MS. Flavour Fragr. 2010; 25 (20) 18. Kataoka H. Recent Advances in Solid-Phase Microextraction and Related Techniques for Pharmaceutical and Biomedical Analysis, Curr.Pharm.Anal 2005; 1(65)

Scientia Chromatographica 2014; 6(3):155-165 165

Scientia Chromatographica 2014; 6(3):166-174 Instituto Internacional de Cromatografia http://dx.doi.org/10.4322/sc.2015.003 ISSN 1984-4433

SPME-GC/MS

Análise de estatinas em plasma humano por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas utilizando microextração em fase sólida e derivatização in situ no preparo de amostra Analysis of statins in human plasma by gas chromatography-mass spectrometry using SPME and in situ derivatization sample preparation Natalia M. S. Sattolo* Paulo C. F. Lima Gomes Álvaro J. Santos-Neto Fernando M. Lanças Instituto de Química de São Carlos, Universidade de São Paulo – USP, CEP 13560-970, São Carlos, SP, Brasil *email: natysattolo@yahoo.com.br Recebido: 18/10/2013 Aceito: 08/11/2013

Resumo

A monitorização terapêutica permite a individualização do regime de dosagem, assegurando a eficácia clínica e minimizando os efeitos adversos dos fármacos prescritos. As estatinas pertencem ao grupo dos inibidores da enzima 3-hidroxi-3metilglutaril-coenzima A redutase (HMG-CoA). Elas induzem uma redução significativa nos níveis de colesterol total, lipoproteína de baixa densidade e triglicérides no plasma, portanto, são utilizadas no tratamento da hipercolesterolemia. Atualmente, as estatinas têm sido monitoradas, pois embora eficazes e muito utilizadas, apresentam alguns efeitos adversos não desejáveis. Neste trabalho, as técnicas microextração em fase sólida e cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (SPME-GC/MS) foram avaliadas para análise de estatinas (fluvastatina, sinvastatina e atorvastatina) em plasma humano para fins de monitorização terapêutica. As condições de extração e derivatização foram otimizadas usando planejamento experimental e avaliando a influência dos principais parâmetros envolvidos. O método apresentou linearidade na faixa de 20 a 500 ng mL-1, com precisão inferior a 14 % e limite de quantificação de 20 ng mL-1 e 50 ng mL-1 para a fluvastatina e sinvastatina, respectivamente. O método proposto foi aplicado em amostras de plasma de pacientes em tratamento com sinvastatina.

Palavras-chave: derivatização in situ, estatinas, plasma humano, SPME-GC/MS.

Abstract

Therapeutic drug monitoring allows the individualization of dosing regimen, ensuring the clinical efficacy and minimizing adverse effects caused by the prescribed drugs.

Statins belong to the group of inhibitors of the enzyme 3-hydroxy-3-methylglutarylcoenzyme A redutase (HMG-CoA). They induce a significant reduction in total cholesterol, low density lipoprotein and plasma triglycerides, therefore they are used in the treatment of hypercholesterolemia. Currently, statins have been monitored because they present undesirable side effects. This paper, describes analysis of fluvastatin, simvastatin and atorvastatin by solid phase microextraction and gas chromatography coupled to mass spectrometry (SPME-GC/MS) in human plasma for therapeutic drug monitoring. The conditions of extraction and derivatization were optimized using experimental design and evaluating the influence of the main parameters. The method presents linearity in the range of 20-500 ng mL-1 with precision lower than 14% and limit of quantification of 20 ng mL-1 and 50 ng mL-1 for fluvastatin and simvastatin, respectively. The proposed methodology was applied to samples of plasma from patients under simvastatin treatment.

Keywords: derivatization in situ, statins, human plasma, SPME-GC/MS. 166

Scientia Chromatographica 2014; 6(3)

Análise de estatinas em plasma humano por SPME-GC/MS

1. Introdução

A microextração em fase sólida (SPME), desenvolvida por Arthur e Pawliszyn[1], apresenta uma série de vantagens em relação aos métodos convencionais de preparo de amostra. Dentre essas vantagens se destacam não requerer instrumentação analítica sofisticada, apresentar processo operacional simples e rápido, permitir automação das análises, além de concentrar e extrair os analitos em uma única etapa, e reutilizar as fibras extratoras[2].

Em análises realizadas por cromatografia gasosa (SPME-GC), após o processo de extração a fibra é inserida no injetor aquecido do cromatógrafo e os analitos são dessorvidos termicamente para a coluna cromatográfica; desta forma, as análises realizadas por SPME-GC não utilizam solventes orgânicos. A técnica SPME-GC, tem sido utilizada com êxito na extração de compostos voláteis e semi-voláteis em análises de amostras biológicas, principalmente quando extraídos no modo headspace. Já compostos menos voláteis ou termicamente instáveis têm sido analisados após processos de derivatização/SPME-GC[2].

Atualmente, a análise de fármacos em fluidos biológicos tem se tornado importante devido ao desenvolvimento de fármacos mais seletivos e efetivos; e a necessidade de entender sobre seus efeitos tóxicos e terapêuticos. O conhecimento dos níveis dos fármacos em fluidos biológicos permite a otimização da terapia e fornece informações para estudos de farmacocinética, biodisponibilidade, bem como suas interações medicamentosas[3].

A monitorização terapêutica é baseada no fato de que a resposta terapêutica depende da concentração plasmática do fármaco. O uso de doses regulares em intervalos periódicos não significa que existirão níveis constantes em todos os pacientes, devido às diferenças individuais de absorção, metabolismo, excreção e biodisponibilidade para o fármaco administrado; influenciando o efeito terapêutico final. Além disso, na terapia com fármacos de baixo índice terapêutico, ou seja,

Sattolo, NMS et al.

faixa terapêutica, que indica valores de concentração para os quais a substância tem efeito terapêutico, muito próximo à faixa tóxica, complicações no quadro de saúde do paciente podem levar à intoxicação e, em alguns casos até à morte. Portanto, faz-se necessária a monitorização terapêutica do fármaco na corrente sanguínea, uma vez que essa monitorização tem como vantagem a possibilidade de ajustes nas doses do medicamento, prevenindo a intoxicação e garantindo os efeitos farmacológicos da substância[4].

A hiperlipidemia, elevação da concentração de lipídios no plasma, é a manifestação de um distúrbio na síntese e degradação de lipoproteínas plasmáticas. Os principais lipídios de relevância são o colesterol e os triglicérides. Assim sendo, elevados níveis de colesterol estão associados a condições patológicas, como a aterosclerose, caracterizada pela deposição de colesterol na parede arterial[5]. Um dos efeitos da aterosclerose é o aumento na incidência de doença arterial coronariana (DAC) e na taxa de mortalidade relacionada a ela.

Estudos mostraram que 38 a 42% das mortes estão relacionadas a doenças cardiovasculares[5].

Os principais métodos de tratamento da hiperlipidemia são dietas, mudanças no estilo de vida e administração de medicamentos hipolipemiantes[5].

Dentre estes, as estatinas são os fármacos mais utilizados para o tratamento, com o propósito de diminuir os níveis de lipoproteínas plasmáticas ricas em colesterol e reduzir os riscos de DAC. Estes efeitos são resultantes da atividade inibidora das estatinas sobre a enzima HMGCoA redutase (hidroximetilglutaril-CoA redutase), que inibe os primeiros passos da biossíntese do colesterol[6].

Assim sendo, este trabalho objetiva o desenvolvimento de um método para análise de estatinas em plasma humano usando a cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas e tendo a SPME e a derivatização in situ na etapa de preparo de amostras.

Scientia Chromatographica 2014; 6(3):166-174 167

Sattolo, NMS et al.

2. Experimental 2.1. Materiais e reagentes

Os padrões analíticos das estatinas tais como atorvastatina cálcica, fluvastatina sódica e sinvastatina foram gentilmente doados pelo professor Dr. Anil Kumar Singh da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade de São Paulo (FCF - USP). Ibuprofeno deuterado (ibuprofeno-d), utilizado como padrão interno, foi adquirido da Fluka (Steinheim, Alemanha).

Utilizou-se também, ácido fórmico da Synth (Diadema, Brasil), hidróxido de sódio da Mallinckrodt (Hazelwood, EUA), brometo de tetrabutilamônio da Vetec (Duque de Caxias, Brasil), dietil sulfato da Alfa Aesar (Karlsruhe, Alemanha) e etanol da J.T.Baker (Phillipsbourg, EUA).

Todos os solventes e reagentes usados possuíam grau HPLC ou analítico. A água utilizada para preparar todas as amostras e soluções foi purificada em um sistema Elga Purelab Ultra (High Wycombe, Inglaterra).

Utilizou-se também um holder manual para fibras de SPME e fibras de PDMS/DVB ambos da Supelco (Bellefonte, EUA). Membranas para filtração hidrofílica 0,45 µm da Schleicher & Schuell (Dassel, Alemanha) foram utilizadas para filtração das amostras de plasma.

2.2. Condições cromatográficas

As análises cromatográficas foram feitas em um GC/MS QP5000 da Shimadzu (Kyoto, Japão) equipado com o software GCMSsolution. As separações foram obtidas com coluna capilar 5% fenil dimetilpolissiloxano (15 m × 0,25 mm × 0,25 µm) RTX-5MS da Restek (Bellefonte, EUA). A dessorção da fibra de SPME foi feita no injetor a 260 ºC durante 15 minutos no modo splitless de injeção, com abertuta da válvula split após intervalo de 3 minutos. A rampa de aquecimento do forno foi de 80 ºC durante 2 minutos, aumentando 30 °C min-1 até 300 ºC e mantida, então, isotérmica por 4 minutos. A temperatura do detector foi fixada em 310 ºC. O gás de arraste utilizado foi o hélio (Linde, Barueri, Brasil), com vazão de 0,8 mL min-1. Os cromatogramas foram adquiridos por monitoramento de 168

Análise de estatinas em plasma humano por SPME-GC/MS

íon selecionado (SIM) e ionização por elétrons a 70 eV. A identificação dos analitos foi feita pelo monitoramento dos íons característicos para cada composto na forma derivatizada, sendo os íons principais de m/z 183, 211, 238, 266 e 281 para a fluvastatina, m/z 157, 159, 172, 198 e 199 para a sinvastatina e m/z 276, 292, 360, 388 e 403 para a atorvastatina conforme pode ser observado no espectro de massas apresentado na Figura 1.

2.3. Preparo das amostras de plasma As amostras de plasma humano foram adquiridas no Laboratório Médico Dr. Maricondi e na Casa de Saúde de São Carlos, centrifugadas a 8000 rpm durante 5 minutos, e filtradas com membrana hidrofílica de 0,45 µm, afim de eliminar possíveis impurezas que poderiam dificultar o processo de extração e impedir o entupimento da fibra extratora, em seguida foram estocadas em frascos e armazenadas no freezer a -20 °C. Para obter-se a concentração de 1 mg L-1, alíquotas adequadas das soluções de trabalho com concentração de 10 mg L-1 de sinvastatina, fluvastatina e atorvastatina em etanol foram transferidas para frascos de vidro transparente para SPME de 20 mL, secas sob fluxo de nitrogênio e em seguida ressuspensas em 1 mL de plasma branco.

2.4. Derivatização in situ

Para esta etapa utilizou-se o agente pareador iônico brometo de tetrabutilamônio (TBA-Br) a fim de formar um par iônico neutro com os analitos presentes na amostra, e o reagente derivatizante dietil sulfato (DES) para que o produto final estivesse na forma de éster, mais facilmente analisado por GC (Figura 2). A derivatização foi previamente realizada à etapa de extração, expondo a fibra de SPME à amostra derivatizada.

Os experimentos foram realizados adicionando o agente pareador iônico TBA-Br (I) e o reagente derivatizante DES (II) às soluções aquosas contendo cada uma das estatinas. Após a reação, os analitos foram extraídos por SPME e analisados por GC/MS. Scientia Chromatographica 2014; 6(3):166-174

AnĂĄlise de estatinas em plasma humano por SPME-GC/MS

Sattolo, NMS et al.

Figura 1. Espectro de massas no modo scan da amostra fortificada com 1000 ng mLâ&#x20AC;&#x201C;1 de (A) fluvastatina, (B) sinvastatina e (C) atorvastatina, derivatizadas de acordo com o mĂŠtodo proposto.

Scientia Chromatographica 2014; 6(3):166-174 169

Sattolo, NMS et al.

Análise de estatinas em plasma humano por SPME-GC/MS

Figura 2. Esquema geral da reação de derivatização de ácidos carboxílicos com brometo de tetrabutilamônio e dietil sulfato formando ésteres etílicos.

2.5. Otimização das condições de extração e derivatização

Primeiramente foi aplicado um planejamento fatorial fracionado[7-9] (25-2) com o objetivo de otimizar a etapa de extração variando-se o pH (3,0 e 10,0), tempo de extração (10 e 60 minutos), temperatura (25 ºC e 85 ºC), força iônica (0 e 30% de NaCl) e volume de solução tampão (4 e 10 mL). Incluiu-se nesta etapa um ponto central onde as variáveis estavam no valor médio.

O software Statistica 7.0 foi utilizado para construção do modelo e este foi avaliado por ANOVA. Após a otimização da extração, foi realizada a otimização do processo de derivatização usando planejamento fatorial completo (23) variando-se o pH (3,0 e 10,0), volume de agente pareador iônico (30 e 100 µL) e volume de reagente derivatizante (10 e 50 µL), também utilizando a adição de pontos centrais.

2.6. Extração e derivatização das amostras de plasma humano Em um frasco de vidro transparente para SPME de 20 mL contendo a amostra de plasma fortificado foram adicionados 10 mL de solução de ácido fórmico 0,5 mol L-1 pH = 3,0; 100 µL do agente pareador iônico TBA-Br 0,1 mol L-1 e 50 µL do reagente derivatizante dietil sulfato (DES). O frasco foi fechado com lacre de alumínio e septo de silicone, e submetido à agitação magnética durante 5 minutos a 55 °C a fim de homogeneizar a amostra e garantir que os analitos fossem derivatizados. Em seguida, a fibra de PDMS/DVB foi exposta diretamente na amostra durante 45 minutos a 55 °C sob agitação. A dessorção dos analitos foi realizada introduzindo a fibra de SPME no injetor do cromatógrafo gasoso durante 15 minutos a 260 °C.

Com base nas variáveis significativas encontradas foi aplicado um planejamento composto central (CCD).

Nesse planejamento as variáveis avaliadas foram temperatura de extração (25 °C, 33,73 °C, 55 °C, 76,27 °C e 85 °C) e volume de agente derivatizante (10 µL; 15,82 µL; 30 µL; 44,18 µL e 50 µL). O número total de condições experimentais nessa etapa foi de 9, totalizandose 11 experimentos com as replicatas no ponto central.

2.7. Validação

Definidas as condições ótimas para a derivatização e extração dos analitos foi realizada uma otimização univariada com objetivo de fixar o tempo necessário para extração das estatinas na fibra de SPME, variando-se os valores em 15, 30, 45 e 60 minutos.

A seletividade do método foi avaliada por meio da análise de três amostras diferentes de plasma branco. Foi analisada a presença de interferentes eluindo no mesmo tempo de retenção das estatinas. Brancos da fibra e da coluna cromatográfica utilizada foram

170

A validação do método foi realizada segundo a Resolução n° 899 de 29/05/2003 da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA)[10]. Nas análises realizadas por GC/MS foram monitorados cinco íons para cada composto, sendo um íon utilizado para a quantificação e os demais para confirmação dos analitos.

Scientia Chromatographica 2014; 6(3):166-174

Análise de estatinas em plasma humano por SPME-GC/MS

realizados periodicamente para verificação de possíveis contaminações durante o procedimento analítico.

A linearidade foi avaliada analisando amostras de plasma de referência, fortificadas com fluvastatina, sinvastatina e ibuprofeno-d como padrão interno. Os parâmetros de validação analítica para a atorvastatina não foram avaliados devido à dificuldade em detectá-la em baixos níveis de concentração. Estudos de precisão intra e inter-dia foram realizados em três níveis de concentração (baixo, médio e alto) com cinco replicatas por concentração. Foi considerado como limite máximo o valor de 15% para o desvio padrão relativo (DPR).

O limite de detecção (LOD) foi estabelecido como a concentração em que o pico do analito era três vezes maior que o ruído da linha de base. Já o limite de quantificação (LOQ) foi calculado utilizando a razão 10:1 da altura do pico em relação à altura do ruído da linha de base, com coeficiente de variação menor que 20%.

Sattolo, NMS et al.

3.2. Desenvolvimento do método SPME-GC/MS

Testou-se o uso de uma solução tampão de ácido fórmico pH = 3,0 na etapa de extração das estatinas, preparada a partir de ácido fórmico 0,5 mol L-1 e hidróxido de sódio 1,0 mol L-1. Este procedimento foi realizado para garantir que a maior parte das moléculas presentes na matriz da amostra estivesse na forma neutra, ou seja, não-ionizada, aumentando a recuperação da SPME. Dessa forma observou-se um aumento na quantidade de analito extraído para fluvastatina e atorvastatina, que são espécies ionizáveis de caráter ácido apresentando pKa em torno de 4,5.

A separação cromatográfica também foi feita conforme descrito na seção 2.2, como demonstra a Figura 3. Os compostos estão separados, não foi constatado a degradação térmica dos analitos, mesmo efetuando sua dessorção em injetor aquecido.

Para a avaliação da recuperação relativa utilizouse concentrações em três níveis: baixo, médio e alto, de acordo com a curva de calibração. Essa recuperação foi calculada através da razão entre a resposta da extração do analito fortificado em plasma e a resposta da extração da mesma concentração do analito fortificada em água.

3. Resultados e Discussão

3.1. Seleção da fase extratora

As fibras de PDMS (dimetilpolisiloxano), PDMS/DVB (dimetilpolisiloxano/divinilbenzeno) e PA (poliacrilato) foram comparadas para avaliar qual apresentaria o melhor desempenho para a extração das estatinas. Dentre as fibras avaliadas, a fibra de PDMS/ DVB apresentou melhor desempenho quando comparada com outros recobrimentos. Considerando que as estatinas são compostos que apresentam tanto grupamentos polares como não-polares, os recobrimentos de PA (fase polar) e PDMS (fase não-polar) não proporcionaram um desempenho tão bom quando comparados com PDMS/ DVB, recobrimento misto com polaridade modificada pela inserção de grupos divinilbenzeno.

Figura 3. Cromatograma representativo do método SPME-GC/MS e derivatização in situ contendo 1000 ng mL–1 de ibuprofeno-d, fluvastatina e sinvastatina.

3.3. Otimização das condições de extração e derivatização

O planejamento fatorial fracionado mostrou resultados diferentes para cada estatina estudada. Porém, verificou-se que ao aumentar o tempo, a temperatura e o volume de tampão, aumentava-se a quantidade extraída dos fármacos. Por outro lado, quanto menor a quantidade de sal adicionado à solução, melhor a extração dos

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Sattolo, NMS et al.

Análise de estatinas em plasma humano por SPME-GC/MS

compostos, pois à medida que a concentração de sal aumenta, possivelmente altera-se a viscosidade da solução, dificultando a capacidade do analito de migrar para a fase extratora.

Os resultados do planejamento fatorial completo mostraram que a variável pH atuou de modo negativo na etapa de derivatização, de maneira que o uso de pH = 3,0 favorece a reação de derivatização. Já as variáveis volume de TBA-Br e volume de dietil sulfato atuaram de modo positivo, de forma que o aumento desses volumes, aumentou a eficiência da derivatização dos fármacos.

Como os modelos obtidos para os fármacos em estudo estavam de acordo entre si e apresentaram coeficientes de correlação adequados e falta de ajuste não significativa, as variáveis volume de reagente derivatizante e temperatura foram selecionadas para o planejamento compostos central. A metodologia de superfície de resposta é usada para encontrar-se o ponto ótimo em torno da região experimental disponível. A Figura 4 ilustra a média dos resultados para a superfície de resposta considerando os modelos para os três analitos.

A partir da análise desse gráfico foi possível estimar um valor mais alto para a resposta total na condição de trabalho fixada em 50 µL de reagente derivatizante e temperatura de extração a 85 °C. O gráfico de superfície de resposta mostra que as duas variáveis estudadas, volume de reagente derivatizante e temperatura, atuam de forma positiva na extração desses fármacos.

A condição ótima do método aparece em condições extremas, altas temperaturas e grandes volumes de derivatizante. Contudo, o uso de agente derivatizante com propriedades corrosivas, nessas condições, pode causar a diminuição da vida útil da fibra de SPME. Dessa maneira, optou-se por realizar a extração a 55 ºC em detrimento da condição a 85 ºC, sendo essa uma condição de compromisso, próxima a região ótima, sem haver perdas drásticas na resposta dos analitos.

Estabelecidas as condições ótimas de derivatização e extração, avaliou-se o tempo de extração utilizando uma otimização univariada. Observou-se que no tempo de 45 minutos o equilíbrio foi atingido para a extração dos fármacos em estudo.

172

Figura 4. Gráfico de superfície de resposta para as variáveis temperatura e volume de reagente derivatizante obtido pelo planejamento composto central para as estatinas estudadas.

3.4. Validação Nesta etapa avaliou-se parâmetros como seletividade, linearidade, precisão, limite de detecção, limite de quantificação e recuperação[11-13]. Como a atorvastatina apresentou baixa resposta mesmo com a fibra de PDMS-DVB, além disso, obteve baixa ionização no sistema GC-/MS utilizado, esse composto não foi considerado no desenvolvimento da validação, por não ser possível atingir os níveis desejados de detecção. No entanto, o método desenvolvido mostrou-se seletivo para os demais compostos, pois nenhum pico eluiu no mesmo tempo de retenção da fluvastatina, sinvastatina e do IBU-d (padrão interno) quando amostras de plasma branco foram analisadas.

A linearidade do método foi de 20 a 500 ng mL-1 para a fluvastatina e de 50 a 500 ng mL-1 para a sinvastatina. Os coeficientes de correlação foram maiores que 0,98 demonstrando haver uma correlação aceitável entre concentração e resposta obtida, para finalidade de análises em fluidos biológicos. O LOD encontrado foi de 7,5 ng mL-1 para fluvastatina e 15 ng mL-1 para Scientia Chromatographica 2014; 6(3):166-174

Análise de estatinas em plasma humano por SPME-GC/MS

Sattolo, NMS et al.

a sinvastatina. O LOQ estabelecido foi de 20 ng mL-1 para a fluvastatina e 50 ng mL-1 para a sinvastatina. Os resultados de precisão intra e inter-dia demonstram que o método possui precisão adequada, conforme mostram os dados das Tabelas 1 e 2.

Tabela 1. Dados obtidos da precisão intra-dia e inter-dia para os fármacos estudados.

Precisão intra-dia

Precisão inter-dia

Compostos Concentração DPR Concentração DPR (ng mL-1) (%) (ng mL-1) (%) Fluvastatina

Sinvastatina

20 250 500 50 300 500

9,0 4,1 6,9 13,6 6,6 8,3

20 250 500 50 300 500

7,2 2,8 8,7 10,5 7,2 7,4

Tabela 2. Dados obtidos de limites de quantificação (LOQ) e limites de detecção (LOD) para os fármacos estudados.

Compostos

LOQ (ng mL-1)

DPR (%)

LOD (ng mL-1)

DPR (%)

Fluvastatina

20

8,3

7,5

11,7

Sinvastatina

50

11,0

15

14,9

As taxas de recuperação relativa do método SPME-GC/MS foram inferiores a 40%, no entanto, esta característica do método não implicou em falta de linearidade ou precisão insatisfatória. O uso do padrão interno nas amostras compensou eventuais variações na eficiência do processo SPME, tais como aquelas sujeitas à composição endógena do plasma e as propriedades da fase extratora, como a diminuição da eficiência da fibra com o aumento do número de extrações.

A ANVISA recomenda porcentagens de recuperação do soluto e do padrão interno próximas a 100%, porém admitem-se valores menores desde que a recuperação seja precisa. A análise dos resultados mostra que a SPME, quando comparada com outras técnicas de extração, apresenta baixos valores de recuperação.

No entanto, são valores comuns quando se utiliza uma técnica miniaturizada na qual a extração não é exaustiva.

Nesta técnica, a influência das proteínas foi minimizada por meio da diluição das amostras de plasma com 10 mL da solução de ácido fórmico 0,5 mol L-1 pH = 3,0. O processo de diluição das amostras de plasma diminui a viscosidade da matriz, favorecendo a difusão dos fármacos para a fase extratora da fibra de SPME.

3.5. Aplicação em amostras reais

A eficácia do método SPME-GC/MS para uso clínico foi comprometida devido ao alto valor de LOQ encontrado para a sinvastatina (50 ng mL-1), uma vez que o intervalo terapêutico para uma dose diária de 10 a 80 mg/dia do fármaco é de 10,30 a 34,50 ng mL-1. Dessa forma, analisaram-se amostras de plasma de pacientes que fizeram uso de uma dosagem maior de sinvastatina, a Figura 5 mostra o cromatograma obtido para uma dessas amostras. Na Tabela 3 estão os valores de concentrações plasmáticas acima do intervalo terapêutico, conforme obtidos nas análises usando o método proposto.

Figura 5. Cromatograma de plasma de paciente em tratamento com sinvastatina.

De acordo com as análises das concentrações plasmáticas observa-se que algumas estão abaixo do LOQ (50 ng mL-1), impossibilitando a quantificação do fármaco. No entanto, encontraram-se valores superiores às dosagens terapêuticas. Dessa maneira, este estudo

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Sattolo, NMS et al.

Análise de estatinas em plasma humano por SPME-GC/MS

Tabela 3. Concentração plasmática determinada em amostras de plasma de pacientes em terapia com sinvastatina.

Amostra

Concentração plasmática (ng mL-1)

1 2 3 4 5

< LOQ 79,8 < LOQ < LOQ 85,0

torna possível a determinação de sinvastatina em níveis acima da janela terapêutica causados por uma dosagem excessiva do fármaco.

4. Conclusões

O método SPME-GC/MS desenvolvido apresentou linearidade, seletividade e precisão adequados para a análise de estatinas em plasma humano.

Porém, o LOQ encontrado não possibilitou a análise em concentrações correspondentes ao intervalo terapêutico.

O uso de GC/MS em tandem possivelmente aumentaria

ainda mais a seletividade da análise, possivelmente melhorando a detectabilidade, e, dessa forma, o método poderia ser adequado para a aplicação em monitorização terapêutica. Diante da limitação de detectabilidade apresentada, a eficácia do método foi comprovada pela análise de plasma de pacientes em terapia com dosagens superiores às doses terapêuticas convencionais de sinvastatina. Portanto, o método, conforme apresentado, pode ser aplicado para determinação de níveis acima do intervalo terapêutico das estatinas em amostras de plasma humano.

Agradecimentos

Os autores agradecem à CAPES, ao IQSC-USP e ao Laboratório Médico Dr. Maricondi de São Carlos por fornecer as amostras de plasma humano utilizadas no desenvolvimento da metodologia. Agradecemos também ao Prof. Dr. Anil Kumar Singh por doar gentilmente os padrões analíticos de estatinas utilizados neste trabalho, além da Fapesp pelo financiamento concedido no projeto nº 2007/03844-4.

Referências 1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

10.

11.

12.

13.

174

Arthur C, Pawliszyn J. Solid phase microextraction with thermal desorption using fused silica optical fibers. Analytical Chemistry, 1990; 62(19): 2145-2148.

Queiroz M E C, Lanças F M. Análise de fármacos em material biológico: acoplamento microextração em fase sólida “no tubo” e cromatografia líquida de alta eficiência. Química Nova, 2005; 28(5): 880-886.

Kataoka H. New trends in sample preparation for clinical and pharmaceutical analysis. Trends in Analytical Chemistry, 2003; 22(4): 232-244.

Oliveira L S, Inoue J K, Machinski Junior M, Nishiyama P. Atenção farmacêutica na monitorização terapêutica de fármacos. Arquivos da Apadec, 2004; supl.8: 892-895.

Erturk S, Onal A, Cetin S M. Analytical methods for the quantitative determination of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase inhibitors in biological samples. Journal of Chromatography B, 2003; 793: 193-205.

Campo V L, Carvalho I. Estatinas hipolipêmicas e novas tendências terapêuticas. Química Nova, 2007; 30(2): 425-430.

Neto B B, Scarminio I S, Bruns R E. Como Fazer Experimentos - Pesquisa e Desenvolvimento na Ciência e na Indústria. Campinas: Unicamp, 2007.

Neto B B, Scarminio I S, Bruns R E. Planejamento e otimização de experimentos. Campinas: Unicamp, 1995.

Teófilo R F, Ferreira M M C. Quimiometria II: planilhas eletrônicas para cálculos de planejamentos experimentais, um tutorial. Química Nova, 2006; 29(2): 338-350.

Agência Nacional De Vigilância Sanitária - ANVISA (Brasil). Resolução n° 899 de 29 de maio de 2003. Guia para validação de métodos analíticos e bioanalíticos. Diário Oficial da União, Brasília, DF, 02 de jun. 2003.

Lanças F M. Validação de métodos cromatográficos de análise. São Carlos: RIMA, 2006.

Ribani M, Bottoli C B G, Collins C H, Jardim I C S F, Melo L F C. Validação em métodos cromatográficos e eletroforéticos. Química Nova, 2004; 27(5): 771-780.

Cassiano N M, Barreiro J C, Martins L R R, Oliveira V, Cass Q B. Validação em métodos cromatográficos para análises de pequenas moléculas em matrizes biológicas. Química Nova, 2009; 32(4): 1021-1030.

Scientia Chromatographica 2014; 6(3):166-174

Scientia Chromatographica 2014; 6(3):175-185 Instituto Internacional de Cromatografia http://dx.doi.org/10.4322/sc.2015.004 ISSN 1984-4433

PREPARO DE AMOSTRAS

Estudo para a determinação de herbicidas da classe das triazinas por extração no ponto nuvem (CPE) Study for the determination of triazines herbicides by cloud point extraction (CPE)

Raquel Thomaz da Silva Bárbara Fernanda Sanchez Razaboni Gilberto Abate* Departamento de Química, Universidade Federal do Paraná – UFPR, C.P. 19032, CEP 81531-990, Curitiba, PR, Brasil *gilberto@quimica.ufpr.br Recebido: 15/09/2014 Aceito: 11/11/2014

Resumo

Neste estudo, o método de extração no ponto nuvem (CPE) foi investigado para a extração de quatro herbicidas da classe das triazinas (atrazina, simazina, ametrina e prometrina), e para dois dos principais produtos de degradação da atrazina (desetilatrazina e desisopropil-atrazina). As melhores condições de extração observadas foram: concentração do agente surfactante (Triton X-114) de 2,50 % (m/v), concentração de NaCl de 3,00 % (m/v), temperatura de 30 ºC e tempo de equilíbrio de 20 min. O método proporcionou limite de detecção entre 1,1 e 3,2 µg L-1 e faixa linear de 10,0 a 500 µg L-1 empregando a técnica de cromatografia a líquido de alta eficiência (HPLC), sendo empregado com amostras de água de poço e rio originárias de região agrícola do sudoeste do estado do Paraná. Foi conduzido um estudo de recuperação com concentrações dos herbicidas de 10,0, 25,0 e 100 µg L-1 sendo obtidos resultados entre 31 e 127 %, com tendência de menores percentuais de recuperação, provavelmente em decorrência das características mais polares dos herbicidas da classe das triazinas.

Palavras-chave: herbicidas; triazinas; extração; água; CPE.

Abstract

In this study, the cloud point extraction (CPE) was investigated for the extraction of four triazines herbicides (atrazine, simazine, ametryne and prometryne), and for the two main degradation products of atrazine (deethylatrazine and deisopropylatrazine).

The best extraction conditions were: concentration of surfactant agent (Triton X-114) of 2.50 % (w/v), concentration of NaCl of 3.00 (w/v), temperature of 30 ºC and equilibrium time of 20 min. The method provided limit of detection between 1.1 e 3.2 µg L-1 and linear range from 10.0 to 500 µg L-1 using the technique of high performance liquid chromatography (HPLC), and employed for well and river water samples from the agricultural region of southwest of Paraná state. A recovery study was carried out with herbicides concentrations of 10.0, 25.0 and 100 µg L-1 with results between 31 e 127 %, and tendency of lower recovery percent, probably owing to the more polar characteristics of the class of triazines herbicides.

Keywords: herbicides; triazines; extraction; water; CPE.

Scientia Chromatographica 2014; 6(3)

175

Silva RT et al.

1. Introdução

As triazinas estão entre os herbicidas mais largamente empregados na pré-emergência ou pósemergência de ervas daninhas, interferindo no processo de fotossíntese e impedindo o seu desenvolvimento[1].

Esses herbicidas são utilizados em culturas como milho, sorgo e cana-de-açúcar[2], sendo que a atrazina (AT), simazina (SIM), e ametrina (AM) têm sido largamente empregadas no Brasil[3]. O acentuado uso e as características físico-químicas desses herbicidas como solubilidade em água e log KOW [4], além de moderada sorção em solos[5], implica em casos frequentes de contaminação de águas superficiais e subterrâneas, em especial pela AT, bem como por dois dos principais produtos de degradação da AT, desetil-atrazina (DEA) e desisopropil-atrazina (DIA)[1-6].

As técnicas de cromatografia a gás (GC – gas chromatography) e cromatografia a líquido (HPLC – high-performance liquid chromatography) são frequentemente utilizadas para a quantificação de resíduos de herbicidas em amostras de interesse ambiental.

As triazinas, bem como seus produtos de degradação apresentam solubilidade relativamente elevada em água e alta polaridade, além de alguns dos seus produtos de degradação, como os compostos hidroxilados, apresentarem baixa volatilidade, requerendo muitas vezes processos de derivatização para o uso da técnica de GC[4]. Em consequência disso, a técnica de HPLC tem sido muito utilizada para a quantificação dessa classe de herbicidas em diferentes matrizes[1,2,4-9].

As etapas de extração e concentração prévia dos compostos alvo são de grande importância para a confiabilidade dos dados obtidos. Nesse sentido, a extração por solvente e extração em fase sólida são usualmente empregadas para atender tal finalidade, para triazinas ou outros pesticidas[10]. Contudo, o elevado consumo de solventes e o tempo relativamente longo, principalmente para extração por solvente, têm motivado o estudo de diferentes abordagens de extração, geralmente baseadas em sistemas miniaturizados. Algumas das 176

Determinação de triazinas por CPE

formas apresentadas na literatura são: extração dinâmica assistida por microondas (DMAE – microwaveassisted extraction) combinada com a concentração em gota de solvente orgânico solidificada (SFO – solidification of floating organic drop)[7], microextração por emulsificação assistida por ultrassom (USAEME – ultrasound-assisted emulsification microextraction)[9], microextração em gota de solvente, com a incorporação de bolhas na gota (BID-SDME – bubble-in-drop single drop microextraction)[10], extração sortiva em barra de agitação (SBSE – stir bar sorptive extraction)[11], extração por solvente assistida por membrana (MASE – membrane-assisted solvent extraction), combinada com o emprego de polímeros de impressão molecular (MIP – molecularly-imprinted polimers)[12], microextração líquido-líquido dispersiva empregando líquido iônico (IL-DLLME – ionic liquid-dispersive liquid-liquid microextraction), assistida por microondas[13], extração em fase sólida magnética (MSPE – magnetic solid phase extraction), usando nanopartículas[14], argilominerais[15], entre outras.

Uma das alternativas de extração é o emprego da extração no ponto nuvem (CPE – cloud point extraction), que tem a vantagem de não empregar solventes tóxicos, além de ser uma estratégia simples e de baixo custo; sendo que na literatura têm sido abordada a teoria e o emprego de CPE para diferentes usos[16,17], e para aplicações analíticas com diferentes classes de pesticidas[18-20]. Na literatura têm sido reportados trabalhos por CPE para a extração e quantificação de herbicidas do grupo das feniluréias[8], carbamatos[21,22,23], inseticidas organofosforados[24,25], e herbicidas do grupo das sulfoniluréias[26]. Com relação ao emprego de CPE para a determinação de herbicidas triazínicos, a maior parte dos estudos tem feito uso do surfactante não iônico Triton X-114[27,28], sendo avaliados como parâmetros para extração, o percentual de surfactante, temperatura, tempo e adição de sais. Apesar disso, o estudo conduzido por Tan, Jin e Yang[8], para extração de prometrina (PROM) de diferentes matrizes, mostrou que o polietilenoglicol Scientia Chromatographica 2014; 6(3):175-185

Determinação de triazinas por CPE

Silva RT et al.

(PEG-6000), proporcionou melhores resultados frente ao emprego de Triton X-100 e Triton X-114.

2. Experimental

O presente trabalho teve como objetivo a avaliação do método de extração no ponto nuvem (CPE) para a determinação dos herbicidas AT, AM, SIM e PROM, bem como os produtos de degradação da atrazina, DEA e DIA, em amostras de água. Poucos estudos têm sido dedicados ao emprego de CPE para a determinação de compostos triazínicos, e de acordo com a literatura consultada, não constam relatos do estudo de extração dos produtos de degradação DEA e DIA por CPE até o presente momento.

Neste trabalho foram utilizados os padrões de atrazina com pureza de 98,9 %, simazina, prometrina e ametrina, com pureza de 99,9 % (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Alemanha) e os produtos de degradação da atrazina - desetil-atrazina com pureza de 95,5 % e desisopropil-atrazina com pureza de 97,0 % (Dr. Ehrenstorfer GmbH, Augsburg, Alemanha). A Tabela 1 apresenta algumas das principais características desses compostos.

2.1. Padrões analíticos e reagentes

Tabela 1. Principais características físico-químicas dos herbicidas e produtos de degradação estudados.

Estrutura Molecular

Massa Molar (g mol-1)

Solubilidade (mg L-1, 20ºC)

log KOW

pKa

Tempo de ½ vida (dias)

DIA

173,5

670

1,1

1,58

---

DEA

187,5

3200

1,5

1,65

---

SIM

201,5

5,0

2,1

1,62

90

AT

215,5

33

2,5

1,71

60

AM

227,0

200

2,6

4,1

60

PROM

241,0

33

3,1

4,1

50

Para a composição da fase móvel foi utilizada acetonitrila (Carlo Erba, Rodano, Itália), e metanol (JT Baker, Cidade do México, México) para preparo dos padrões, ambos de grau HPLC. O agente surfactante não iônico Triton X-114 (Sigma-Aldrich Inc., St. Louis,

EUA) foi utilizado para a formação do ponto nuvem, e o cloreto de sódio (Merck, Darmstadt, Alemanha) foi empregado para aumentar a força iônica do meio. Todos os demais reagentes necessários foram de grau analítico de marcas como Merck, Sigma-Aldrich e Carlo Erba.

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Silva RT et al.

2.2. Preparo de soluções

A água utilizada em todos os experimentos e preparo de soluções foi obtida por um equipamento de osmose reversa da marca Quimis, modelo Q842U210 (Diadema – SP, Brasil), e purificada empregando o sistema da marca Millipore, modelo SimplicityUV (Molsheim, França), proporcionando água com resistividade de 18 MΩ cm, para o preparo das soluções e da fase móvel. Essa água foi empregada também para a lavagem final das vidrarias, previamente mantidas em detergente alcalino por pelo menos 24 h.

As soluções estoque de cada herbicida foram preparadas em metanol, na concentração de 1000 mg L-1, e mantidas em frasco âmbar a -18oC. A partir dessas soluções foi preparada uma solução intermediária mista na concentração de 50,0 mg L-1, em metanol, sendo essa solução mantida a 4 oC e utilizada para o preparo das soluções de trabalho, que foram preparadas em concentração de 1,00 mg L-1 para identificação dos compostos pelos tempos de retenção.

Após a definição das melhores condições analíticas, foram preparados volumes de 10,0 mL das soluções de trabalho dos herbicidas nas concentrações (µg L-1): 10,0; 50,0; 100; 250 e 500, para proporcionar as curvas analíticas, na presença de Triton X-114 - 2,50 % (m/v) e NaCl 3,00 % (m/v), sendo filtradas em membrana de PTFE com abertura de poro de 0,45 µm, e em seguida, analisadas por HPLC. A acetonitrila e a água utilizadas para a composição da fase móvel, foram previamente filtradas em membrana de PTFE, com abertura de poro de 0,45 µm.

2.3. Instrumentação e condições cromatográficas de análise

Um HPLC da marca Waters (Milford, MA, EUA) foi utilizado, sendo constituído por um sistema de bombas (modelo 600E, Multisolvent Delivery System), um controlador (modelo Water 600), degaseificador da fase móvel (modelo In Line AF), controlador de Temperatura (modelo Module II), injetor automático de 178

Determinação de triazinas por CPE

amostras, volume de 10 µL (modelo Waters 717 plus) e um detector espectrofotométrico com arranjo de diodos (modelo Waters 2998), em comprimento de onda de 220 nm. O controle do equipamento e aquisição dos dados foi feito pelo software Empower2. As análises foram realizadas empregando uma coluna cromatográfica C-18 ACE (100 x 4,6 mm, com partículas de 5 µm), mantida a temperatura de 30 oC. A fase móvel utilizada foi constituída inicialmente por acetonitrila:água (50:50, v/v) para identificação dos compostos pelos tempos de retenção, e a composição definitiva por acetonitrila:água (35:65, v/v) para as demais determinações, com eluição no modo isocrático, com vazão de 1,0 mL min-1, empregando uma solução contendo os seis compostos de interesse.

2.4. Procedimento para a extração no ponto nuvem

Os estudos iniciais foram efetuados com 10,0 mL de uma solução mista contendo os compostos AT, AM, PROM, SIM, DEA e DIA, cada um em concentração de 500 µg L-1. As soluções foram mantidas em tubos de centrífuga de vidro (15 mL), para a formação do ponto nuvem em um banho termostático da marca Quimis, modelo Q214M2 (Diadema – SP, Brasil), sendo centrifugados em uma centrífuga da marca Evlab, modelo EV:011D (Londrina - PR, Brasil) por 5 min a 2400 rpm, para auxiliar na separação da fase sobrenadante (pobre de surfactante) da fase inferior (rica em surfactante). As fases superiores foram cuidadosamente descartadas, sendo as fases inferiores transferidas para balão volumétrico de 5 mL, filtradas em membrana de PTFE, com abertura de poro de 0,45 µm, e submetidas a determinação cromatográfica, logo em seguida. A Tabela 2 mostra as condições avaliadas nesse estudo, tendo sido utilizado um planejamento fatorial.

Após a definição das melhores condições de extração, volumes de 10,0 mL das soluções padrão dos herbicidas, ou das amostras foram mantidos por 20 min no banho termostático a 30 oC, centrifugadas e tratadas de forma similar para a determinação cromatográfica, como anteriormente.

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Determinação de triazinas por CPE

Silva RT et al.

Tabela 2. Variáveis e os níveis estudados no planejamento fatorial.

Variáveis

Nível (-)

Ponto central

Nível (+)

Triton X-114 (% m/v) Temperatura (ºC) Tempo (min) NaCl (% m/v)

0,50 30 20 1,00

1,50 40 30 2,00

2,50 50 40 3,00

2.5. Aplicação do método

Após a definição das condições de trabalho, o procedimento foi aplicado para uma amostra de água de um córrego e uma amostra de água de poço, coletadas no município de Pato Branco, no Sudoeste do Paraná, em uma região agrícola, com histórico de aplicação frequente do herbicida AT. As amostras foram coletadas em frascos âmbar de 1 litro de capacidade e mantidas sob refrigeração a 4 oC, tendo sido utilizadas nos experimentos em um prazo máximo de sete dias, sendo previamente filtradas em membranas de acetato de celulose com abertura de poro de 0,45 µm. Essas amostras de água foram fortificadas em três níveis de concentração: 10,0; 25,0 e 100 µg L-1, e submetidas ao mesmo processo por CPE e determinação cromatográfica como anteriormente.

3. Resultados e discussão 3.1. Definição das condições cromatográficas

Após determinar os tempos de retenção de cada composto, foram testadas diversas condições de fase móvel por eluição isocrática ou por gradiente,

empregando acetonitrila e água para a composição da fase móvel. Apesar de a eluição por gradiente propiciar um tempo de corrida total de 14 min para a separação dos seis compostos, era necessário no mínimo 5 min para que a linha de base ficasse estável, e mesmo assim, em menores concentrações havia uma grande dificuldade de integrar os picos com boa confiabilidade. Dessa forma, foi adotada a condição de fase móvel acetonitrila:água (35:65), que proporcionou um tempo de corrida total de 22 min, e uma resolução de 1,70, para o par de produtos de degradação DIA e DEA. Cabe ressaltar que os tempos de retenção observados foram coerentes com os valores de log KOW (Tabela 1), ou seja, os compostos com características mais hidrofílicas com menores valores de log KOW apresentaram menor tempo de retenção.

Essa condição foi utilizada para verificar o comportamento do sistema cromatográfico na presença do Triton X-114. Como o Triton X-114 absorve fortemente no comprimento de onda utilizado (220 nm), e não havia a presença de picos adicionais nos cromatogramas na presença do surfactante, havia o indício de que o mesmo estava ficando retido na coluna C-18. Apesar disso, não foram constatadas diferenças significativas nos tempos de retenção observados; entretanto, um considerável aumento das alturas e áreas dos picos foi verificado na presença do tensoativo, para uma dada concentração dos compostos, conforme mostrado na Tabela 3 e Figura 1, bem como uma perceptível elevação da linha de base em algumas partes do cromatograma, evidenciada na Figura 1.

Tabela 3. Comparação entre os tempos de retenção e áreas de pico para soluções em concentração de 500 µg L-1 na presença de NaCl 3,00 % e com triton X-114, 2,50 % e NaCl 3,00%.

Composto

NaCl tR (min) 1,83 2,37 4,11 6,80 11,11 20,51

a

a

DIA DEA SIM AT AM PROM

Tempo de retenção (minutos); b Unidades arbitrárias

NaCl + Triton X-114 Área de pico 60796 44540 61920 55857 52021 47998

b

tR (min) 1,84 2,38 4,13 6,82 11,17 20,59

a

Área de pico 80100 77136 146632 155722 170083 160958

Razão das áreas de pico b

1,3 1,7 2,4 2,8 3,3 3,4

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Silva RT et al.

Figura 1. Cromatogramas obtidos para os seis compostos. Eluição isocrática, acetonitrila:água (35:65 v/v); vazão de 1,0 mL min-1; λ = 220 nm; tr - conforme Tabela 3. Soluções de 500 µg L-1. Ausência do Triton (linha contínua) e presença do Triton (linha tracejada).

De acordo com os cromatogramas mostrados na Figura 1, e os resultados da Tabela 3, a medida que o tempo de retenção aumenta, ocorre um significativo aumento na razão entre o sinal na presença e na ausência do surfactante, chegando a cerca de 3,3-3,4 vezes para os dois últimos compostos, contra apenas 1,3 vezes para o primeiro composto (DIA). Apesar disso, uma mesma solução padrão em uma dada concentração, submetida a sucessivas determinações cromatográficas, não demonstrou mudanças nas alturas ou áreas de pico, ou seja houve boa repetitividade nos valores de área de pico para cada uma das concentrações investigadas, apesar do problema apontado conforme os resultados da Tabela 3 e Figura 1. Isso sugere ser possível conduzir as determinações, desde que a concentração de Triton X-114 seja a mesma entre os padrões e as amostras. Essa limitação não foi discutida na literatura voltada para a determinação de triazinas por CPE-HPLC [8,29]; embora, Tan, Jin e Yang[8] empregaram polietilenoglicol, e não Triton X-114. Os cromatogramas obtidos por esses autores, sugerem que esse surfactante tem menor tempo de retenção do que os compostos de interesse, apesar disso não ter sido discutido. A coluna cromatográfica foi tratada com acetonitrila:água 90:10 em vazão de 1,0 mL por pelo menos 30 min, para poder remover o Triton X-114. Isso está coerente com a literatura[30], que 180

Determinação de triazinas por CPE

cita o uso de metanol puro em vazão de 3,0 mL min-1 para a remoção desse surfactante da coluna evidenciado por uma uma larga e intensa banda entre 8,5 e 12 min.

Apesar da composição de fase móvel utilizada no presente estudo permitir que o surfactante permaneça na coluna, há a possibilidade dos herbicidas arrastarem parte do surfactante e dessa forma elevar os sinais de área de pico. Parte do aumento no sinal pode ser atribuída à existência de monômeros micelares na fase móvel, sendo que uma fração desses monômeros é adsorvida no grupo alquil da fase C-18 e assim são arrastados junto com os compostos até o detector, propiciando maiores áreas de pico[30]. Isso explicaria o aumento nas razões de área de pico na presença e na ausência do surfactante para uma dada concentração, conforme mostrado na Tabela 3, ou seja, compostos com menor polaridade arrastariam maior quantidade dos monômeros, e em consequência, maiores razões de áreas de pico foram observadas para AM e PROM. Em decorrência dessa limitação, foi adotado um critério de limpeza rotineiro da coluna, após cada dia de trabalho, utilizando uma fase móvel composta por acetonitrila:água (90:10).

3.2. Planejamento fatorial

As variáveis avaliadas foram a temperatura de equilíbrio, o tempo de equilíbrio, e as concentrações de NaCl e de surfactante. Como sistemas univariados negligenciam a interação entre as variáveis e os resultados obtidos são diferentes de sistemas multivariados optou-se por fazer um planejamento experimental 24 (16 experimentos), com triplicata do ponto central (total de 19 experimentos). Para a execução dessa etapa com um número mínimo de experimentos, foi empregado um planejamento fatorial completo[31]. Os níveis empregados para cada variável foram mostrados na Tabela 2, sendo que as variáveis e os níveis investigados, estão em conformidade com aqueles mencionados na literatura correlata envolvendo procedimentos por CPE[26,29,30].

A resposta dos experimentos foi monitorada em função das áreas de pico cromatográfico, sendo que dentre os 16 experimentos efetuados no planejamento Scientia Chromatographica 2014; 6(3):175-185

Determinação de triazinas por CPE

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fatorial, a melhor resposta foi obtida nas condições que combinou os níveis (+) das variáveis concentração de Triton X-114 de 2,50 % (m/v) e de NaCl 3,00 % (m/v) e os níveis (-) das variáveis temperatura (30ºC) e tempo de equilíbrio de 20 min. Apesar disso, pelo fato da temperatura de ponto nuvem do Triton ser entre 23 e 32 oC (conforme informações do fornecedor), foram mantidas as condições estabelecidas e realizados outros experimentos variando apenas a temperatura, nos valores de 24, 27 e 30 oC. Esse estudo mostrou que de fato a temperatura de 30 oC seria a mais apropriada para conduzir os experimentos por CPE. Um aspecto negativo relativo às melhores condições obtidas foi que o teor de Triton de 2,50 % gerou um volume de nuvem de cerca de 2 mL, devido ao arraste de água junto com o surfactante, sendo necessário avolumar para 5,00 mL o que impediu obter um fator de concentração adequado. Apesar dessa limitação, foram elaboradas curvas analíticas para os seis

compostos de interesse, nas melhores condições obtidas pelo planejamento.

3.3. Curvas analíticas e características do método As curvas analíticas foram preparadas com os padrões nas seguintes concentrações (µg L-1): 10,0; 50,0; 100; 250 e 500. Como foi verificado que a presença do surfactante superestima as áreas dos picos dos compostos nos cromatogramas, as curvas analíticas foram elaboradas nas mesmas condições obtidas pelo planejamento experimental, em triplicata. A escolha do ponto de máxima concentração foi feita em função do escopo do trabalho, ou seja, avaliar matrizes aquosas com resíduos de herbicidas em concentrações em níveis de µg L-1, ao passo que o ponto de menor concentração está atrelado ao limite de quantificação do sistema HPLC. A Tabela 4 mostra as principais figuras de mérito obtidas.

Tabela 4. Figuras de mérito obtidas para o método estudado.

Composto

Equação da curva analíticaa

r2

LD (µg L-1)

LQ (µg L-1)

DPRb (%)

DIA

Ap = -294 + 132,7CDIA Ap = 420 + 97,93CDEA Ap = 1208 + 147,7CSIM Ap = -604 + 144,8CAT Ap = 304 + 140,6CAM Ap = 1350 + 128,4CPROM

0,9994

3,1

10,3

4,9

0,9969

2,3

7,8

11,8

0,9993

1,7

5,8

3,2

0,9984

2,7

9,0

3,3

0,9985

1,1

3,7

1,8

0,9940

3,2

10,6

5,3

DEA SIM AT AM PROM a

Ap = área de pico em unidades arbitrárias, C = concentração de cada um dos analitos, b Maiores valores observados, calculados para a concentração de 10,0 µg L-1, exceto para DEA (50,0 µg L-1).

Os valores de coeficientes angulares, correspondente aos valores de sensibilidade do método obtido foram entre 97,93 para DEA e 147,7 para SIM. Com relação à linearidade, o menor valor de coeficiente de determinação (r2) foi de 0,9933 para a PROM, podendo ser considerado um valor adequado[32,33]. Como as curvas analíticas foram efetuadas em triplicata, foram calculados os valores das estimativas de desvio padrão relativo (DPR) para cada um dos compostos. O maior valor observado foi de 11,8 % para a DEA considerando a concentração de 50,0 µg L-1, sugerindo que a precisão intermediária do método foi satisfatória.

Com base nas curvas analíticas foram calculados os valores de limite de detecção (LD) e limite de quantificação (LQ). Esses parâmetros de mérito foram calculados de acordo com Ribani et al.[32], utilizando as expressões LD = 3,3 x (s/S) e LQ = 10 x (s/S), sendo que s denota a estimativa do desvio padrão relativo do coeficiente linear das curvas analíticas, e S corresponde ao coeficiente angular. Valores de LD entre 1,1 e 3,2 µg L-1 foram obtidos para AM e PROM, respectivamente, ao passo que os valores de LQ se situaram entre 3,7 e 10,6 µg L-1, para esses mesmos compostos. Cabe ressaltar que o valor de LQ calculado para a PROM foi

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Silva RT et al.

Determinação de triazinas por CPE

ligeiramente superior ao primeiro ponto utilizado para elaborar a curva analítica (10,0 µg L-1), o que também foi verificado para DIA (LQ = 10,3 µg L-1). Apesar dessa constatação, os valores de DPR observados para esses dois compostos na concentração de 10,0 µg L-1 foi de 4,9 e 5,3 %, para DIA e PROM, respectivamente, o que motivou manter essa concentração como primeiro ponto da curva analítica. Em seguida foi utilizada uma solução padrão contendo os seis compostos em concentração de 500 µg L-1 para efetuar um teste preliminar, sendo constatados percentuais de recuperação de 51 (DIA), 70 (DEA), 90 (SIM), 101 (AT), 117 (AM) e 131 (PROM). Essa tendência de aumento no valor de recuperação seguiu a mesma sequência dos valores de log KOW, sugerindo que extrações mais efetivas podem ser obtidas para os compostos com características mais hidrofóbicas. Outros estudos baseados no emprego do mesmo agente surfactante (Triton X-114) demonstraram para o herbicida simazina (log KOW 2,1) valores de recuperação ao redor de 65 %[27], e 50 %[28], o que sugere que compostos mais polares apresentam limitações no procedimento de extração; embora no presente estudo a SIM apresentou 90 % de recuperação.

3.4. Aplicação do método em amostras reais O método foi aplicado com uma amostra de água de poço e uma amostra de água de córrego, ambas pertencentes à região agrícola de Pato Branco, com histórico de aplicação do herbicida atrazina. Como o herbicida AT é largamente empregado, resíduos desse herbicida e de seus metabólitos poderiam ser encontrados em amostras de águas superficiais ou subterrâneas.

Os cromatogramas obtidos não evidenciaram qualquer sinal dos compostos, nem mesmo a AT, ou seus produtos de degradação, DIA e DEA em ambas as amostras de água avaliadas, sugerindo a ausência dos compostos, ou pelo menos que estão abaixo dos valores de LQ obtidos. Em virtude disso, foram conduzidos experimentos envolvendo a fortificação das amostras, de forma a prover concentrações de 10,0; 25,0 e 100 µg L-1 de cada um dos compostos para as amostras de água, visando avaliar a recuperação dos compostos de interesse, sendo os resultados obtidos apresentados na Tabela 5.

Tabela 5. Recuperações obtidas para os compostos estudados em amostra de água de poço e de córrego após fortificação (n = 3).

Amostras Concentração (µg L-1) Recuperação (%)

DIA DEA SIM AT AM PROM

Água de poço 10,0

25,0

100

10,0

25,0

100

62 ± 7 126 ±11 51 ± 11 64 ±11 58 ± 7 43 ± 12

101± 7 127 ± 6 59 ± 2 98 ± 6 77 ± 2 114 ± 8

37 ± 2 61 ± 4 84 ± 2 77 ± 4 81 ± 6 74 ± 4

68 ± 13 107 ±12 45 ± 5 84 ± 2 66 ± 14 37 ± 11

93 ±10 120 ± 8 55 ± 8 116 ± 2 77 ± 6 112 ±10

31 ± 2 53 ± 1 75 ± 5 71 ± 2 74 ± 5 79 ± 9

Apesar dos baixos valores de log KOW e elevada solubilidade dos compostos DIA e DEA (Tabela 1), bem como o estudo preliminar que foi efetuado, seria provável uma inadequada extração desses dois compostos. Todavia, não foi observada uma tendência de aumento no valor de recuperação com o aumento do log KOW, como observado no estudo prévio. Uma 182

Água de córrego

considerável variabilidade nos resultados foi observada, tendo sido obtidos valores relativamente baixos, em alguns casos inferiores a 50 % de recuperação, bem como valores de DPR relativamente elevados para o herbicida PROM na concentração de 10,0 µg L-1. Essa variação dos resultados pode em parte, ser decorrente das dificuldades de integração dos picos, em especial Scientia Chromatographica 2014; 6(3):175-185

Determinação de triazinas por CPE

para a menor concentração estudada. Portanto, embora os valores de LQ calculados na maioria dos casos foram inferiores a 10,0 µg L-1 com valores aceitáveis de DPR (Tabela 4), seria necessário estudar estratégias visando obter um menor volume final de surfactante, de modo a prover um melhor fator de enriquecimento, o que provavelmente melhoraria a exatidão (Tabela 5).

A Figura 2 mostra como exemplo dois cromatogramas sendo um de amostra de água de poço fortificada com os compostos em concentração de 10,0 µg L-1, e o outro em condição similar, porém na presença do Triton X-114 a 2,50 %, o que permite verificar que o elevado ruído e a perturbação na linha de base, pode ser um fator de comprometimento na aquisição dos sinais. Também é possível constatar um discreto aumento na área de pico para os compostos na presença de Triton X-114, conforme discutido anteriormente para a Figura 1. De modo geral, a concentração intermediária estudada de 25,0 µg L-1 apresentou os melhores percentuais de recuperação, bem como valores de DPR aceitáveis, de acordo com a Tabela 5. Como os resultados obtidos apresentaram a tendência de serem menores, é indicativo que a formação da nuvem (fase rica em surfactante) não tenha apresentado desempenho adequado na extração dos analitos, possivelmente pelas características mais polares dos compostos estudados, sendo provável que parte dos analitos tenha permanecido na fase pobre em surfactante. Cabe informar que maiores velocidades e tempos de centrifugação foram investigados, porém não foram constatadas diferenças significativas. Estudos de recuperação entre 70 e 120 %, podem ser considerados aceitáveis[32,33], o que em parte foi atendido no presente trabalho.

De modo geral, poucos trabalhos envolvendo compostos triazínicos são disponíveis na literatura usando a abordagem por CPE. Uma considerável variabilidade também foi observada na literatura[27], o que está em concordância com o presente estudo. Esse aspecto provavelmente seja devido à polaridade relativamente elevada dessa classe de compostos, propiciando um menor grau de interação com o interior hidrofóbico e

Silva RT et al.

Figura 2. Cromatogramas obtidos para os compostos estudados.

Eluição isocrática acetonitrila:água (35:65 v/v); vazão de 1,0 mL min-1; λ = 220 nm. Amostra de água de poço após a fortificação com os compostos na concentração de 10,0 µg L-1, na ausência do Triton (linha contínua), e na presença do Triton (linha tracejada).

apolar das micelas, sendo que de modo geral o princípio por CPE é mais efetivo para compostos hidrofóbicos [8], o que em parte, poderia implicar em uma baixa precisão e exatidão. Talvez esse seja o motivo que tem levado ao pequeno número de estudos voltados para triazinas, sendo que a PROM (log KOW = 3,1) é o herbicida que tem proporcionado os melhores resultados de recuperação; entre 85,4 e 90,6 % (água), 84,4 e 92,7 % (solo) e 89,4 e 92,1 % (repolho), utilizando polietilenoglicol (PEG6000) para a extração [8], e de 92,84 a 99,23 % (água) e de 85,48 a 93,67 % (solo), utilizando Triton X-114[29].

Com base no uso desse mesmo agente tensoativo, esses resultados diferem de modo significativo em comparação com a extração dos herbicidas triazínicos AM, AT, PROM, SIM, propazina e terbutrina apresentando recuperações aproximadas entre 65 e 120 %[27], bem como de 74 % e 50 % para AT e SIM, respectivamente [28] . Apesar dos resultados obtidos no presente estudo de modo geral não terem sido muito satisfatórios, pode-se inferir com base nos valores apresentados, que há uma boa potencialidade do método para ser empregado com herbicidas da classe das triazinas. Estudos adicionais são necessários no sentido de minimizar o volume da fase rica em surfactante, visando obter fatores de concentração mais elevados, além de investigar diferentes formas para

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Silva RT et al.

propiciar uma maior hidrofobicidade aos compostos de interesse, ou mesmo o emprego de diferentes agentes tensoativos.

4. Conclusão

De acordo com o presente estudo, foi constatado ser possível efetuar a separação cromatográfica dos compostos estudados, e sem a necessidade de separar o agente tensoativo Triton X-114. Contudo, foi verificada uma significativa elevação na resposta analítica de área de pico, o que requer que cuidados especiais sejam tomados para a adequada remoção do surfactante da coluna cromatográfica.

O planejamento de experimentos permitiu determinar as condições mais adequadas de temperatura e tempo de equilíbrio, concentração de NaCl e concentração de Triton X-114 para conduzir a extração; entretanto, o

Determinação de triazinas por CPE

teor de Triton X-114 mais apropriado proporcionou uma fase rica em surfactante de volume muito grande o que impediu obter um fator de concentração apropriado, limitando a aplicação do procedimento proposto. O método estabelecido foi empregado em duas amostras de águas naturais, não sendo detectada a presença dos herbicidas. O processo de recuperação dos compostos nessas amostras foi avaliado, e apesar dos resultados obtidos não terem sido muito satisfatórios, pode-se inferir que os mesmos são promissores, indicando ser necessário conduzir estudos adicionais, visando obter um melhor fator de concentração e melhor exatidão.

Agradecimentos

Os autores agradecem ao Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento (CNPq) pelo apoio financeiro.

Referências 1.

Smith, G.A.; Pepich, B.V.; Munch, D.J. Preservation and analytical procedures for the analysis of chloro-s-triazines and their chlorodegradate products in drinking waters using direct injection liquid chromatography tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography A, 1202, 138-144, 2008.

2.

Dick, D.P.; Martinazzo, R.; Knicker, H.; Almeida, P.S.G. Matéria Orgânica em quatro tipos de solos brasileiros: composição química e sorção de atrazina. Química Nova, 33, 14-19, 2010.

3.

Inoue, M.H.; Oliveira JR.; R.S.; Regitano, J.B.; Tormena, C.A.; Tornisielo, V.L.; Constantin, J. Critérios para avaliação do potencial de lixiviação dos herbicidas comercializados no estado do Paraná. Planta Daninha, 21, 313-323, 2003.

4.

Amadori, M.F.; Cordeiro, G.A.; Rebouças, C.C.; Peralta-Zamora, P.G.; Grassi, M.T.; Abate, G. Extraction method for the determination of atrazine, deethylatrazine and deisoproylatrazine in agricultural soils using factorial design. Journal of the Brazilian Chemical Society, 24, 483-491, 2013.

5.

De Armas, E.D.; Monteiro, R.T.R.; Antunes, P.M.; Dos Santos, M.A.P.F.; De Camargo, P.B.; Abakerli, R.B. Diagnóstico espaçotemporal da ocorrência de herbicidas nas águas superficiais e sedimentos do rio Corumbataí e principais afluentes. Química Nova, 30, 1119-1127, 2007.

6.

Vryzas, Z.; Papadakis, E.N.; Papadopoulou-Mourkidou, E. Leaching of Br-, metolachlor, alachlor, atrazine, deethylatrazine and deisopropylatrazine in clayey vadoze zone: A field scale experiment in north-east Greece. Water Research, 46, 1979-1989, 2012.

7.

Wang, H.; Li, G.; Zhang, Y.; Chen, H.; Zhao, Q.; Song, W.; Xu, Y.; Jin, H.; Ding, L. Determination of triazine herbicides in cereals using dynamic microwave-assisted extraction with solidification of floating organic drop followed by high-performance liquid chromatography. Journal of Chromatography A, 1233, 36-43, 2012.

8.

Tan, J.H.; Jin, S.F.; Yang, H. A Cloud Point Extraction Approach Developed for Analyzing Pesticides Prometryne and Isoproturon from Multi-media. Clean – Soil, Air, Water, 41, 510-516, 2013.

9.

Wu, Q.H.; Zhang, S.H.; Wang, C.; Zhang, X.H.; Wang, Z. Development of ultrasound-assisted emulsification microextraction for the determination of triazine herbicides in environmental water samples by high-performance liquid chromatography. International Journal of Environmental Analytical Chemistry, 93, 884-893, 2013.

10. Williams, D.B.G.; George, M.J.; Meyer, R.; Marjanovic, L. Bubbles in Solvent Microextraction: The Influence of Intentionally Introduced Bubbles on Extraction Efficiency. Analytical Chemistry, 83, 6713-6716, 2011.

184

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Determinação de triazinas por CPE

Silva RT et al.

11. Sanchez-Ortega, A.; Unceta, N.; Gómez-Caballero, A.; Sampedro, M. C.; Akesolo, U.; Goicolea, M.A.; Barrio, R.J. Sensitive determination of triazines in underground waters using stir bar sorptive extraction directly coupled to automated thermal desorption and gas chromatography–mass spectrometry. Analytica Chimica Acta, 641, 110-116, 2009.

12. Chimuka, L.; Van Pinxteren, M.; Billing, J.; Yilmaz, E.; Jönsson, Å. Selective extraction of triazine herbicides based on a combination of membrane assisted solvent extraction and molecularly imprinted solid phase extraction. Journal of Chromatography A, 1218, 647653, 2011.

13. Zhong, Q.; Su, P.; Zhang, Y.; Wang, R.; Yang, Y. In-situ ionic liquid-based microwave-assisted dispersive liquid–liquid microextraction of triazine herbicides. Microchimica Acta, 178, 341-347, 2012.

14. Zhao, G.; Song, S.; Wang, S.; Wu, Q.; Wang, Z. Determination of triazine herbicides in environmental water samples by highperformance liquid chromatography using graphene-coated magnetic nanoparticles as adsorbent. Analytica Chimica Acta, 708, 155159, 2011.

15. De Rezende, E.I.P.; Peralta-ZamorA, P.G.; Jardim, W.F.; Vidal, C.; Abate, G. Sorption and preconcentration of the herbicides atrazine, simazine, and ametryne on montmorillonite. Analytical Letters, 46, 439-451, 2013.

16. Maniasso, N. Ambientes micelares em química analítica. Química Nova, 24, 87-93, 2001.

17. Duarte, L.J.N.; Canselier, J.P. Extração no ponto nuvem de compostos orgânicos, homólogos e isômeros. Química Nova, 28, 426-432, 2005.

18. Faria, A.M.; Queiróz, M.E.L.R.; Neves, A.A. Extração por ponto nuvem: técnica alternativa para a extração de resíduos de agrotóxicos.

Pesticidas: Revista de Ecotoxicologia e Meio Ambiente, 15, 29-42, 2005.

19. Xie, S.; Paau, M.C.; Li, C.F.; Xiao, D.; Choi, M.M.F. Separation and preconcentration of persistent organic pollutants by cloud point extraction. Journal of Chromatography A, 1217, 2306-2317, 2010.

20. Santaladchaiyakit, Y.; Srijaranai, S.; Burakham, R. Methodological aspects of sample preparation for the determination of carbamate residues: A review Journal of Separation Science, 35, 2373-2389, 2012.

21. Jia, G.; Li, L.; Qiu, J.; Wang, X.; Zhu, W.; Sun, Y.; Zhou, Z. Determination of carbaryl and its metabolite 1-naphthol in water samples by fluorescence spectrophotometer after anionic surfactant micelle-mediated extraction with sodium dodecylsulfate. Spectrochimica Acta Part A, 67, 460-464, 2007.

22. Santalad, A.; Srijaranai, S.; Burakham, R.; Glenon, J.D.; DEming, R.L. Cloud-point extraction and reversed-phase high-performance liquid chromatography for the determination of carbamate insecticide residues in fruits. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 394, 1307-1317, 2009.

23. Zhou, Z.; Chen, J.; Zhao, D.; Yang, M. Determination of Four Carbamate Pesticides in Corn by Cloud Point Extraction and HighPerformance Liquid Chromatography in the Visible Region Based on Their Derivatization Reaction. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 57, 8722-8727, 2009.

24. Seebunrueng, K.; Santaladchaiyakit, Y.; Soisungnoen, P.; Srijaranai, S. Catanionic surfactant ambient cloud point extraction and highperformance liquid chromatography for simultaneous analysis of organophosphorus pesticide residues in water and fruit juice samples.

Analytical and Bioanalytical Chemistry, 401, 1703-1712, 2011.

25. Seebunrueng, K.; Santaladchaiyakit, Y.; Soisungnoen, P.; Srijaranai, S. Study on the effect of chain-length compatibility of mixed anionic–cationic surfactants on the cloud-point extraction of selected organophosphorus pesticides. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 404, 1539-1548, 2012.

26. Wu, Y.J.; Fu, X.W.; Yang, H. Cloud Point Extraction With Triton X-114 for Separation of Metsulfuron-Methyl, Chlorsulfuron, and Bensulfuron-Methyl From Water, Soil, and Rice and Analysis by High-Performance Liquid Chromatography. Archives of Environmental Contamination and Toxicology, 61, 359-367, 2011.

27. Carabias-Martínez, R.; Rodríguez-Gonzalo, E.; Domínguez-Álvarez, J. García Pinto, C. Hernández-Méndez, J. Prediction of the behaviour of organic pollutants using cloud point extraction. Journal of Chromatography A, 1005, 23-34, 2003.

28. Takagai, Y.; Hinze, W.L. Cloud Point Extraction with Surfactant Derivatization as an Enrichment Step Prior to Gas Chromatographic or Gas Chromatography-Mass Spectrometric Analysis. Analytical Chemistry, 81, 7113-7122, 2009.

29. Zhou, Q.; Pang. L.; Xie, G.; Xiao, J.; Bai, H. Determination of Atrazine and Simazine in Environmental Water Samples by Dispersive Liquid–Liquid Microextraction with High Performance Liquid Chromatography. Analytical Sciences 25, 73-76, 2009.

30. Babaee, S.; Beiraghi, B. Micellar extraction and high performance liquid chromatography-ultra violet determination of some explosives in water samples. Analytica Chimica Acta, 662, 9-13, 2010.

31. Barros Neto, B.; Scarminio, I.S.; Bruns, R.E. Como fazer experimentos: pesquisa e desenvolvimento na Ciência e na Indústria. Editora da UNICAMP, Campinas, 2001.

32. Ribani, M.; Bottoli, C.B.G.; Collins, C.H.; Jardim, I.C.S.F.; Melo, L.F.C. Validação em métodos cromatográficos e eletroforéticos.

Química Nova, 27, 771-780, 2004.

33. Lanças, F.M. Validação de Métodos Cromatográficos de Análise. Editora Rima, São Carlos, 2004.

Scientia Chromatographica 2014; 6(3):175-185 185

Scientia Chromatographica 2014; 6(3):186-204 Instituto Internacional de Cromatografia http://dx.doi.org/10.4322/sc.2015.005 ISSN 1984-4433

PREPARO DE AMOSTRAS

Microextração líquido-líquido dispersiva (DLLME): fundamentos, inovações e aplicações biológicas Dispersive liquid-liquid microextraction (DLLME): principles, innovations and biological applications

Bruna Juliana Moreira1 Jennifer Michiko Chauca Yokoya2 Cristiane Masetto de Gaitani1 Departamento de Ciências Farmacêuticas, Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, 14040-903, Ribeirão Preto, SP, Brasil 2 Departamento de Análises Clínicas, Toxicológicas e Bromatológicas, Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, 14040-903, Ribeirão Preto, SP, Brasil *crisgai@fcfrp.usp.br 1

Recebido: 19/12/2014 Aceito: 30/12/2014

Resumo

Para bioanálises, o processo de preparo da amostra deve ser realizado antes da determinação analítica. Esse procedimento visa eliminar componentes endógenos e/ou outros fármacos ou compostos interferentes e melhorar a detectabilidade e a seletividade. Para tanto, técnicas como a LLE e SPE são frequentemente usadas.

A miniaturização da LLE tem sido realizada visando o desenvolvimento de técnicas de preparo de amostra eficientes, rápidas e econômicas e com menor uso de solventes orgânicos. A microextração líquido-líquido dispersiva é uma técnica de microextração, desenvolvida por Rezaee et al. em 2006 que representa a maior porcentagem (59,4%) das publicações na área de microextração em fase líquida e já foi aplicada para a análise de alimentos, frutas, vegetais, amostras biológicas e ambientais. Apresenta como vantagens baixo tempo de extração, simplicidade de operação, rapidez, baixo custo, alta recuperação do analito e alto fator de enriquecimento. No entanto, devido a algumas desvantagens como uso de solvente tóxico e a etapa de centrifugação, que dificulta a automação da técnica, algumas modificações experimentais têm sido propostas. Neste artigo, os autores discutem os fundamentos da técnica, suas inovações e sua aplicação em amostras biológicas.

Palavras-chave: amostra biológica, DLLME, inovações.

Abstract

A sample preparation process must be performed before the analytical determination in bioanalysis. This procedure aims to eliminate endogenous compounds and/or other interferent drugs or compounds and to improve detectability and selectivity.

For that, techniques such as LLE and SPE are frequently used. Efficient, fast, economical and less solvent consumptive sample preparation techniques have been carried out with the miniaturization of LLE. Dispersive liquid-liquid microextraction (DLLME) is a microextraction technique, developed by Rezaee et al. in 2006. It represents the highest percentage (59.4%) of the publications in the area of liquid phase microextraction and has already been applied to the analysis of food, fruits, vegetables, biological and environmental samples. Its advantages are low extraction time, simplicity of operation, rapidity, low cost, high recovery factor and high analyte enrichment. However, due to some disadvantages such as the use of toxic solvents and centrifugation, which hinders the automation, some experimental modifications have been proposed. In this article, the authors discuss the principles of the technique, innovations and applications for biological samples.

Keywords: biological sample, DLLME, innovations.

186

Scientia Chromatographica 2014; 6(3)

DLLME: inovações e aplicações biológicas

1. Histórico

Bioanálises rotineiramente são utilizadas na medicina forense e em estudos toxicológicos. Contudo, antes da determinação analítica, os analitos devem ser submetidos a um processo de preparo da amostra[1], que é uma etapa de extrema importância para a obtenção de resultados confiáveis[2] e cujo principal objetivo consiste em extrair e concentrar o analito de interesse para tornálo compatível com o sistema analítico a ser utilizado[3,4], minimizar ou eliminar efeitos da matriz e melhorar os limites de detecção[5].

A extração líquido-líquido (LLE – liquid-liquid extraction) é amplamente aceita e utilizada como técnica de preparo de amostras para a análise de fármacos em fluidos biológicos como a urina e o plasma. Apesar de esta técnica oferecer alta reprodutibilidade, ela demanda tempo e trabalho laboratorial intenso, apresenta tendência à formação de emulsão, tem baixo potencial de automação e requer o uso de grande volume de solventes de alta pureza, o que a torna cara e tóxica, com a produção de perigosos resíduos laboratoriais[6]. Embora a extração em fase sólida (SPE – solid phase extraction) consuma menos tempo do que a LLE, esta ainda utiliza altas quantidades de solventes[7] e os cartuchos são caros e pouco reprodutíveis devido às diferenças entre os lotes de adsorventes. Portanto, sua otimização nem sempre é um procedimento simples[8].

Já a microextração em fase sólida (SPME – solid phase microextraction) é uma técnica de extração rápida e livre de solventes que tem sido amplamente utilizada para a extração de compostos orgânicos, contudo apresenta como potenciais problemas o alto custo, o efeito memória (carry over) se houver a reutilização das fibras e um declínio no desempenho da fibra com o tempo[7].

Na última década, esforços foram realizados visando o desenvolvimento de técnicas de preparo de amostra eficientes, rápidas e econômicas[4] e conside­ rando o atual enfoque na química verde, uma tendência no tratamento de amostras envolve a miniaturização da

Moreira BJ; Yokoya JMC; Gaitani CM

LLE, por reduzir significativamente a proporção entre o volume do solvente e o volume da fase aquosa, levando ao desenvolvimento de técnicas de microextração em fase líquida, como a LPME – liquid phase microextraction).

Neste contexto, diferentes técnicas de LPME têm sido exploradas como alternativas aos métodos convencionais, como a microextração em gota suspensa (SDME – single drop microextraction), a microextração em fase líquida com fibra oca (HF-LPME - hollow fiber - liquid phase microextraction), a extração sortiva em barra de agitação (SBSE – stir bar sorptive extraction) e a microextração líquido-líquido dispersiva (DLLME – dispersive liquid–liquid microextraction[7], sendo que a última tem representado a maior porcentagem (59,4%) das publicações na área de LPME[9].

2. DLLME

A DLLME é uma técnica de microextração, desenvolvida por Rezaee et al. em 2006[3] para a determinação de hidrocarbonetos policíclicos aromáticos em amostras de água. Consiste no equilíbrio de distribuição do analito entre as fases doadora (amostra) e aceptora (solvente orgânico) e é ideal para a extração de compostos com propriedades lipofílicas moderadas a altas ou que possam ter seu coeficiente de distribuição (log D) alterado pelo controle do pH (analitos ionizáveis)[2].

A maioria das técnicas de LPME necessita de um tempo longo para alcançar o estado de equilíbrio, devido à pequena área de contato entre a amostra e o solvente extrator, o que afeta de forma negativa os fatores de enriquecimento. A DLLME supera essas limitações[10], já que o estado de equilíbrio é alcançado rapidamente, devido à utilização de um sistema ternário de solventes (amostra aquosa, solvente dispersor e solvente extrator), o que torna a extração independente do tempo. A razão entre o volume de fase aceptora e de fase doadora é da ordem de microlitros e mililitros, respectivamente, o que permite a obtenção de altos valores de enriquecimento[2,11-13].

Scientia Chromatographica 2014; 6(3):186-204 187

Moreira BJ; Yokoya JMC; Gaitani CM

DLLME: inovações e aplicações biológicas

O fator de enriquecimento e a recuperação são parâmetros utilizados para demonstrar a eficiência da extração e podem ser calculados utilizando-se as equações 1 e 2, respectivamente[11].

forma uma solução turva (B). Após a centrifugação, as gotículas do solvente extrator se depositam no fundo do tubo (C) e são retiradas com uma microsseringa (D) para posterior análise (E)[2,3,14,15].

O fator de enriquecimento pode ser definido como a razão entre a concentração do analito na fase sedimentada (Csed) e a concentração inicial do analito na amostra (C0).

3. Fatores que influenciam a eficiência da extração por DLLME

EF =

Csed C0

(1)

Já a recuperação (R) é definida como a quantidade do analito, em porcentagem, que é transferida para a fase aceptora ao final da extração e pode ser calculada pela equação 2, na qual Vsed e Vaq são os volumes da fase sedimentada e da amostra, respectivamente.

R=

Csed × Vsed × 100 (2) C0 × Vaq

A Figura 1 mostra o procedimento para a realização da técnica. O solvente extrator e o solvente dispersor são injetados rapidamente na amostra aquosa com o auxílio de uma microseringa (A). A injeção da mistura

Alguns fatores podem afetar a eficiência desta microextração: o tipo de solvente extrator e dispersor escolhido, o volume de solvente extrator e dispersor utilizado, o pH da amostra e sua força iônica[3,11,16,17] e o tempo de extração[2] (Figura 2). Alguns trabalhos também analisam a influência do tempo de centrifugação e da velocidade de centrifugação[18,19].

Na DLLME convencional, o solvente extrator deve satisfazer algumas condições como ser imiscível na amostra (fase doadora), ter maior densidade que esta e possuir alta capacidade de extração do composto de interesse[2,20]. Entre os solventes mais utilizados como extratores estão os hidrocarbonetos halogenados como clorofórmio, diclorometano, clorobenzeno, tetracloreto de carbono e tetracloroetileno[2,11-13]. Estes solventes

Figura 1. Procedimento para realização da DLLME. 188

Scientia Chromatographica 2014; 6(3):186-204

DLLME: inovações e aplicações biológicas

Moreira BJ; Yokoya JMC; Gaitani CM

variações no seu volume leva a alterações no volume de fase sedimentada[16]. Nos trabalhos de Yan et al.[24,25] e de Farajzadeh et al.[24,25] foi observado que o aumento do volume de solvente dispersor promoveu o aumento da solubilidade do solvente extrator na amostra com consequente diminuição do volume de fase sedimentada.

Normalmente são usados de 0,5-1,5 mL de solvente dispersor[2].

Figura 2. Principais parâmetros que afetam a eficiência da DLLME.

podem ser substituídos por líquidos iônicos, que além de menos tóxicos, podem ser injetados diluídos no sistema analítico (HPLC)[21,22]. A seleção do solvente extrator apropriado é o parâmetro mais importante desta técnica de extração[2] e, na prática, ele representa cerca de 1-3% do volume total da mistura de solventes utilizada[23]. Em relação ao volume de solvente extrator, o aumento do volume deste solvente promove aumento do volume da fase sedimentada[3] e, embora a recuperação permaneça quase constante, o fator de enriquecimento poderá diminuir, levando a perdas na detectabilidade dos analitos de interesse. Geralmente são utilizados de 5-100 µL[2].

O solvente dispersor, por sua vez, tem como principal característica ser solúvel tanto na fase doadora quanto na fase aceptora. A seleção apropriada deste promove o aumento na eficiência de extração, pois favorece a dispersão do solvente extrator na forma de pequenas gotículas na amostra, de modo que a área superficial do solvente extrator em contato com a amostra contendo o analito seja infinitamente grande. Os solventes dispersores comumente utilizados são: metanol, etanol, acetonitrila, acetona e tetraidrofurano[2,11-13,24].

O volume de solvente dispersor afeta diretamente a formação da solução turva e, consequentemente, a eficiência da extração. Também foi constatado que

O pH da amostra é um parâmetro essencial porque afeta tanto a eficiência da extração como a seletividade da DLLME[26]. Usando como exemplo analitos básicos, é necessário manter o pH da amostra acima do valor de pKa, para que eles fiquem na forma não ionizada, aumentando assim, a tendência de serem extraídos pelo solvente extrator[27,28]. No trabalho de Melwanki et al.[20], por exemplo, foi necessária a adição de amônia na amostra de urina para facilitar a partição do 7-aminoflunitrazepam para o solvente extrator com o objetivo de melhorar a recuperação.

Outro parâmetro de interesse é a força iônica da amostra. A adição de sal pode promover melhora no rendimento da extração[29] devido à diminuição da solubilidade dos compostos de interesse na fase aquosa e aumento de sua transferência para a fase orgânica[11], fenômeno denominado de salting out, no qual moléculas de água formam esferas de hidratação ao redor das moléculas do sal dissociadas, com consequente diminuição da concentração de água disponível para dissolver as moléculas do analito[20]. Contudo, essa adição também promove redução na solubilidade do solvente extrator na amostra, o que promove aumento no volume de fase sedimentada e diminuição do fator de enriquecimento[29].

Por fim, na DLLME, o tempo de extração é definido como o intervalo entre a injeção da mistura dos solventes e a centrifugação[17,30]. Como a transferência de massa é um processo tempo-dependente, os perfis de extração em relação ao tempo devem ser estabelecidos[13].

Contudo, como o equilíbrio da extração é alcançado

Scientia Chromatographica 2014; 6(3):186-204 189

Moreira BJ; Yokoya JMC; Gaitani CM

rapidamente, vários autores consideram que o tempo não é um fator significante para a extração[13,30,31].

4. Vantagens e desvantagens

As vantagens desta técnica incluem baixo tempo de extração, simplicidade de operação, rapidez, baixo custo, alta recuperação do analito e alto fator de enriquecimento[2,4,23,30].

As desvantagens são: uso de solventes tóxicos[32,33], todo o processo de extração é manual e a centrifugação limita o volume de amostra a ser utilizado, é a etapa que demanda maior tempo no processo[12,13,15,16,34] e dificulta a automação da técnica[10]. No entanto, modificações experimentais têm superado muitas destas desvantagens[9].

5. Inovações e exemplos de aplicações em amostras biológicas

A DLLME representa uma ferramenta importante para a análise de matrizes relativamente simples como amostras aquosas. Porém, várias publicações já relataram seu uso para análise de alimentos, frutas, vegetais assim como amostras biológicas e ambientais[35].

DLLME: inovações e aplicações biológicas

Para ilustrar o uso da DLLME em matrizes biológicas foi feita uma pesquisa e seleção de trabalhos na base de dados Web of Science, considerando o período de 2010 a 2014 e utilizando como palavras-chave na busca em títulos de trabalhos: “dispersive liquid-liquid microextraction” and “urine”, “plasma”, “blood”, “serum”, “saliva” e “hair”. Com estas palavras foram encontrados um total de 103 artigos (Figura 3).

As recentes modificações na DLLME encontradas na literatura buscaram contornar certas dificuldades e/ ou problemas encontrados inerentes à técnica, como o uso de solventes extratores mais densos do que a água, que geralmente são solventes halogenados e, portanto, tóxicos; aumentar a taxa de transferência do soluto para o solvente extrator, entre outros. A Tabela 1 mostra algumas aplicações dessas variações da DLLME em matrizes biológicas.

A DLLME pode ser classificada em duas categorias: DLLME com solventes extratores de alta densidade e DLLME com solventes extratores de baixa densidade[67].

Figura 3. Pesquisa realizada na base de dados Web of Science relacionando matrizes biológicas e extração por DLLME, no período de 2010 a 2014.

190

Scientia Chromatographica 2014; 6(3):186-204

Extração por eletromembrana associada a UA-DLLME

UA- TC- IL-DLLME

Derivados de piridina/ urina

Anetol (A), estragol (E), p-anisaldeído (P)/ urina

6 fármacos psiquiátricos/ urina

Filtros solares / soro

Beta-caroteno/ soro

DLLME convencional

Agitação manualDLLME DLLME-SFO com frasco especial Agitação manualDLLME

DLLME-SFO

-

Íon azida / soro e urina

Anfetamina (ANF) e metanfetamina (MET)/ urina 16 disruptores endócrinos / urina

Agitação manual -UADLLME

Prata/ tecidos animais

Tetracloreto de carbono, 30μL

Triclorometano, 500μL

30μL 2-decanol

Triclorometano, 750μL

Acetona, 500μL Acetona, 1200μL Acetona, 3500μL Acetonitrila, 270μL

Acetonitrila, 300μL

-

1-hexil-3metilimidazolium hexafluorofosfato, 90μL 1-undecanol, 30μL

Metanol, 50μL

Acetona, 500μL Acetona, 800μL Acetona, 500μL Acetona, 400μL

Acetonitrila, 800μL

Triclorometano, 20μL

Triclorometano, 750μL Tetracloreto de carbono, 80μL Triclorometano, 80μL 1,2-diclorobenzeno, 100μL

Agitação manualDLLME

VALLME

Triclorometano, 50μL

Agitação manualDLLME

Acetona, 500μL

-

1-octil-3metilimidazolium hexafluorofosfato, 50μL Triclorometano, 100μL

Solvente dispersor e volume

Solvente extrator e volume

Agitação manual-UADLLME

IL-VALLME

Acetato de ulipristal / soro de camundongo

Betametasona (BM) e dexametasona (DM)/ soro e urina Imipramina (IMP) e trimipramina (TRP)/ urina 14 Disruptores endócrinos/ urina 5 Derivados de antraquinona/ urina

Variação da técnica de DLLME

Analito / matriz

CE - UV

HPLC-MS

HPLC-UV

UPLC-MS/MS

HPLC-UV

HPLC-UV

CG-FID

Espectrometria por absorção atômica Espectrofotome tria por absorção UV/VIS

HPLC-UV

CG-MS

HPLC-UV

HPLC-UV

HPLC-UV

Técnica analítica

Tabela 1. Trabalhos da literatura científica mostrando as aplicações da DLLME e suas variações em matrizes biológicas.

–

0,6–0,9 ng mL−1

–

0,1–0,6 ng mL−1

–

47 ng mL−1 (A), 60 ng mL−1 (E), 50 ng mL−1 (P)

–

–

–

–

0,2–0,5 ng mL−1

–

–

–

Limite de quantificação

–

97–106

99

94–106

58,5 (ANF); 62,4 (MET)

94,7–101,7

–

98,7

–

86–96,6

94–105

97 (IMP), 112 (TRP)

Soro: 96,4 (DM); 97,2 (BM). Urina: 98,3 (BM); 98,2 (DM)

95

Recuperação (%)

8760–13410

–

40

–

117 (ANF), 125 (MET)

63 (A), 58 (E), 64 (P)

40–238

24,7

70

40–153

–

161,7 (IMP), 186,7 (TRP)

–

25

Fator de enriquecimento

(47)

(46)

(45)

(39)

(44)

(33)

(43)

(42)

(41)

(40)

(39)

(38)

(37)

(36)

Referência

DLLME: inovações e aplicações biológicas Moreira BJ; Yokoya JMC; Gaitani CM

Scientia Chromatographica 2014; 6(3):186-204 191

192

Zonisamida (ZNS) e carbamazepina (CBZ) / urina e plasma

SA-DLLME 1-octanol, 50μL

1-undecanol, 30μL

1-undecanol, 90μL

DLLME-SFO

VALLME-SFO

Bisfenol A / urina

Triclorometano, 210μL

Triclorometano, 30μL

Agitação manualDLLME

Clordiazepóxido / urina e plasma

1-octil-3metilimidazolium tetrafluoroborato, 13,5μL 1-Butil-3metilimidazolium hexafluorofosfato,60μL

VALLME

IL-VALLME

Antihipertensivos/ soro de rato

Benzofenona-3 e metabólitos / soro Alcalóides do ópio / plasma

IL-VALLME

Nifurtimox (NIF) e benzonidazol (BEN) / plasma

CTAB 0,45 mmol L−1, 1500μL

Acetona, 1500μL Acetona, 70μL Acetona, 500μL

Metanol, 1800μL

Acetona, 120μL

HPLC-UV

HPLC-UV

HPLC-MS/MS

CE-UV

HPLC-UV

HPLC-UV

HPLC-UV

CG-MS/MS

Metanol, 500μL

Tricloroetileno, 100μL

UA-DLLME Metanol, 32,4μL

HPLC-UV

-

Triclorometano, 50μL + 1-undecanol, 50μL

DLLME-SFO

UA-DLLME

UPLC-UV

Clorobenzeno, 120μL

MIP-UA-DLLME Acetona, 1500μL

HPLC- fluorescência

Triclorometano, 160μL

Acetona, 600μL

Acetato de etila, 30μL + triclorometano 70μL

Técnica analítica

CG-MS

Solvente dispersor e volume

Solvente extrator e volume

Água, 2000μL

Solvente binário-DLLME

Tramadol/ urina

Ácido 3-fenóxibenzóico/ fígado e sangue de rato 7 fármacos benzodiazepínicos/ urina Nicotina (NIC) e cotinina (COT) / urina Ácido 3-fenóxibenzóico (AF) e metabólito (MET) / cérebro de rato

Variação da técnica de DLLME

Analito / matriz

Tabela 1. Continuação...

5μg L–1 (Plasma e urina, CBZ e ZNS)

–

22–28μg L−1

110,4–165 Urina: ZNS– 134; CBZ– 130. Plasma: ZNS– 131; CBZ–132

Urina: ZNS–97–97,8; CBZ– 97–98. Plasma: ZNS– 95,8–96; CBZ– 96,2–97

3,1–7,4

–

–

4,6–4,9

38,7–39,2 (NIF); 31,2–31,9 (BEN)

55,2–82,5

77–104

99,5–100,3

Urina: 91,7; plasma: 90,5

Urina: 0,0024μg mL–1; plasma: 0,0027μg mL–1 –

92,85–98,5

98,0 (NIF); 79,8 (BEN)

–

95,2; 90,5

78,0–105,0 (NIC); 72,0–86,7 (COT) 83–95

–

–

71,42

Fator de enriquecimento

96– 114

Fígado: 83–90 Sangue: 84–91

95,6–99,6

Recuperação (%)

0,04–0,06μg mL–1

0,1323μg mL–1 (NIF); 0,0784μg mL–1 (BEN)

3 ng g−1(AF); 13 ng g−1(MET)

1,8–7,4 ng mL−1

Fígado: 0,0135 ng mg−1; sangue: 5,68 ng mL−1

0,9 ng mL−1

Limite de quantificação

(57)

(56)

(55)

(32)

(54)

(21)

(53)

(52)

(51)

(50)

(49)

(48)

Referência

Moreira BJ; Yokoya JMC; Gaitani CM DLLME: inovações e aplicações biológicas

Scientia Chromatographica 2014; 6(3):186-204

IL-MA-DLLME

Sulfonamidas / plasma de porco

HPLC-fluorescência

HPLC-UV

Metanol, 1000μL Metanol, 750μL

HPLC-UV

HPLC-UV

0,062–0,104μg L−1

–

3,1μg L−1(MEHP); 10,6 1μg L−1 (DEHP)

4–6μg L−1

–

2,5 ng mL–1

4,3–14,8μg L−1

1,26–12,01μg L−1

–

Limite de quantificação

95,7–107,7

96,5–107,1

97,4–112,5

88,9–98,5

0–107

59,6–65,5

71–102

89–100

100,4–103,9

Recuperação (%)

24–38

430

164 (MEHP); 115 (DEHP)

178–197

>75

98

–

–

–

Fator de enriquecimento

(66)

(65)

(64)

(63)

(62)

(61)

(60)

(59)

(58)

Referência

CE: Eletroforese capilar (capillary electrophoresis), CG: Cromatografia gasosa, FID: Detector de ionização em chama (flame ionization detector), MS: Espectrometria de massas (mass spectrometry), UPLC: Cromatografia líquida de ultra eficiência (ultra performance liquid chromatography), UV: ultra violeta, VIS: visível, IL-MA-DLLME: Ionic liquid, microwave assisted - DLLME, UA-TC-IL-DLLME: Ultrassound assisted, temperature controlled, ionic liquid-DLLME, MIP-UA-DLLME: Molecularly imprinted polymer-ultrassound assisted-DLLME, TC-IL-DLLME: Temperature controlled- ionic liquid-DLLME.

IL- DLLME

TC IL-DLLME

UA-TC-IL-DLLME

CE-ESI-TOF-MS

HPLC-fluorescência

UPLC-UV

GC–MS

HPLC-UV

Técnica analítica

Metanol, 350μL

Metanol, 200μL

1-hexil-3metilimidazolium hexafluorofosfato, 100μL 1-hexil-3metilimidazolium hexafluorofosfato, 50μL Brometo de 1-Octil-3metilimidazolium, 22μL 1-hexil-3metilimidazolium hexafluorofosfato 100μL

Isopropanol, 1400μL

Diclorometano, 600μL

1-undecanol, 50μL

DLLME

DLLME-SFO

Íon nitrito/ saliva

30 compostos toxicológicos: anfetaminas e seus derivados, opiáceos, cocaína e seus metabólitos e produtos farmacêuticos/urina Uniconazol, penconazol, tebuconazol e hexaconazol/ sangue de rato Di(2-etilhexil)ftalato (DEHP) e metabólito (MEHP)/Urina

Duloxetina/ plasma humano

Triclorometano, 250μL

UA-DLLME

Acetonitrila, 250μL Metanol, 2000μL Acetona para precipitação de proteínas

Metanol, 20μL

1-octil-3metilimidazolium hexafluorofosfato, 20μL Tricloroetileno, 80μL

Solvente dispersor e volume

Solvente extrator e volume

UA-DLLME

IL-DLLME

Sildenafil, vardenafil e aildenafil / plasma

Aminoácidos/ cabelo, urina 7 benzodiazepínicos/ plasma

Variação da técnica de DLLME

Analito / matriz

Tabela 1. Continuação...

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Moreira BJ; Yokoya JMC; Gaitani CM

Na primeira categoria estão enquadrados: • DLLME utilizando líquidos iônicos (ILDLLME – Ionic liquid dispersive liquid– liquid microextraction). Os líquidos iônicos são sais líquidos com pontos de fusão perto ou abaixo da temperatura ambiente.

Eles consistem geralmente de um cátion orgânico de nitrogênio ou fósforo que é contrabalanceado por um ânion orgânico ou inorgânico e possuem propriedades únicas tais como pressão de vapor negligenciável, estabilidade térmica (mesmo em temperaturas elevadas)[5], baixa solubilidade em água, baixa volatilidade e toxicidade[68]. Devido à química verde, seu uso tem aumentado em química analítica, principalmente na análise de amostras biológicas[5], podendo ser utilizados como solventes extratores[69] o que permite a substituição dos solventes clorados[35], perigosos e tóxicos. Devido à alta viscosidade do IL é necessária criteriosa otimização da proporção entre os volumes de solvente extrator e dispersor[10]. Para melhorar a dispersão do IL na amostra foi proposto, por Zho et al.[70] o uso do controle da temperatura na DLLME. A aplicação em amostras biológicas pode ser exemplificada por Sun et al.[64] que desenvolveram um método para a quantificação de um plastificante e seu metabólito em amostras de urina por HPLCUV. A mistura de solventes (metanol e [C6MIM][PF6], 350 e 50 μL, respectivamente) foi injetada na amostra para a formação da dispersão. A seguir, a amostra foi colocada em banho maria à 30°C, a dispersão foi se desfazendo e a mistura gradualmente tornouse límpida, indicando a solubilidade do IL na amostra. Após isto, a amostra foi colocada em um banho de gelo por 10 minutos e a dispersão novamente formada, centrifugada e o sedimento recolhido com auxílio de uma 194

DLLME: inovações e aplicações biológicas

micro seringa, diluído em metanol e submetido à análise por HPLC. O limite de quantificação foi de 3,1 μg L-1 e de 10,6 µg L−1, recuperação de 97,4 a 112,5%, e fatores de enriquecimento de 164 e 115, para o plastificante e metabólito, respectivamente.

• DLLME utilizando solventes de baixa toxicidade (LT-DLLME – low toxicity dispersive liquid–liquid microextraction).

Desenvolvida por Leong et al.[67], esta técnica utiliza solventes bromados, iodados e outros solventes halogenados como o 1-bromo-3metilbutano ao invés dos solventes altamente tóxicos normalmente utilizados na DLLME convencional. Alguns solventes bromados, em particular, são menos tóxicos até mesmo quando comparados aos solventes de baixa densidade utilizados na DLLME da segunda categoria.

Em relação à segunda categoria, DLLME com solventes extratores de baixa densidade, são usados dispositivos especiais de extração para facilitar a coleta do solvente extrator ou um solvente auxiliar para ajuste da densidade da mistura de solventes[35]. Como exemplo, são citados na literatura: • DLLME com solidificação da gota orgânica flutuante (DLLME-SFO – Dispersive liquid– liquid microextraction based on solidification of a floating organic drop). Desenvolvida por Leong e Huang[71], é considerada simples, rápida e de baixo custo[32] e não necessita utilizar tubos especiais para a extração[72]. O solvente extrator deve ter ponto de fusão próximo à temperatura ambiente, na faixa de 10–30°C, como o 1-undecanol, o n-hexadecano, o 2-dodecanol, o 1-decanol e o difenil éter. Estes solventes são de menor toxicidade e menos densos do que a água[32,35]. Após a DLLME, o solvente extrator fica localizado na região superior do tubo e é resfriado pela colocação deste em um banho Scientia Chromatographica 2014; 6(3):186-204

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de gelo. O solvente solidificado é transferido para um frasco adequado e é imediatamente retornado ao estado líquido à temperatura ambiente, podendo ser diluído ou diretamente injetado em um sistema analítico adequado.

A DLLME-SFO é amplamente aplicada em preparo de amostras ambientais e raramente aplicada à análise de fármacos em fluidos biológicos complexos[44,72].

• DLLME com solventes de baixa densidade e quebra da emulsão com solvente (LDS-SDDLLME – low-density-solvent based solvent demulsification). Nesta microextração, os solventes extrator e dispersor são injetados na amostra e a quebra da emulsão é realizada pela adição de mais solvente dispersor, que agora atua como agente desmulsificante[73]. O solvente extrator é coletado da fase superior e analisado. A extração requer dois a três minutos e não necessita de centrifugação, portanto, é mais rápida que a DLLME convencional[67]. Como solventes extratores podem ser avaliados: 1-octanol, n-hexano, tolueno, cicloexano e orto-xileno[73].

Além disso, várias técnicas de dispersão podem ser utilizadas, modificando a DLLME convencional[67] (Figura 4): A) Microextração liquido-líquido assistida por ar (AALLME – air-assisted liquid–liquid microextraction). É uma nova versão da DLLME na qual alguns microlitros de solvente extrator são transferidos para a amostra aquosa presente em um tubo de fundo cônico e a mistura (solvente extrator e amostra) é repetidamente sugada e injetada para dentro do tubo com o auxílio de uma seringa de vidro.

Após a realização de ciclos pré-determinados, a mistura é centrifugada e a fase orgânica é coletada para análise[67,74]. Nesta extração o solvente dispersor não é utilizado e a dimensão

Figura 4. Técnicas de dispersão utilizadas na DLLME assistida.

da agulha da seringa é um parâmetro a ser avaliado[74]. No trabalho de Farajzadeh et al.[74], esta variação foi aplicada para a quantificação de ftalato de ésteres em amostras de leite de vaca.

B) DLLME utilizando tensoativos (SA-DLLME – surfactant-assisted dispersive liquid–liquid microextraction). Neste caso, o tensoativo é utilizado como solvente dispersor, pois também apresenta solubilidade em ambas as fases (orgânica e aquosa) e também diminui a tensão interfacial entre elas. A sua concentração é um importante parâmetro para uma extração efetiva, pois concentrações superiores à concentração micelar crítica promovem a diminuição da recuperação do composto de interesse por aumentar a solubilidade deste na amostra[57]. Uma das maiores desvantagens da SA-DLLME é que um pouco do tensoativo também pode ser extraído da amostra aquosa, junto com o solvente extrator, o que pode limitar a escolha do sistema de detecção[67].

No trabalho de Behbahani et al.[57], foi feita a quantificação da carbamazepina e zonisamida em urina e plasma por HPLC-UV, utilizando a SA-DLLME. Foram utilizados o CTAB

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como agente emulsificante e 1-octanol como solvente extrator, que após misturados foram injetados rapidamente no tubo contendo a amostra. O método foi preciso e exato, sendo obtidos altos valores de recuperação e de fator de enriquecimento.

C) DLLME assistida por ultrassom (UA-DLLME – Ultrasound-assisted dispersive liquid–liquid microextraction). Tem sido a mais utilizada entre as técnicas de dispersão[29]. O ultrassom pode acelerar a formação de uma solução turva fina, aumentando a eficiência de extração[60], porém, o tempo necessário para a extração é superior ao da DLLME convencional e a degradação do analito pode ocorrer sob certas condições[75]. Em contrapartida, tem-se redução no consumo de solventes[67] e melhora na eficiência da extração[72]. Um procedimento clássico dessa variação pode ser exemplificado por Fernandez et al.[50], que usaram 0,5 mL de urina contendo 7 benzodiazepínicos e análise por UPLC-UV. A extração foi realizada usando 1,5 mL de acetona (solvente dispersor) e 160 µL de clorofórmio (solvente extrator). A mistura (amostra + solventes) foi submetida à ultrassonicação por 4,5 minutos e observada a formação das gotículas dispersas. Em seguida foi feita a centrifugação e a fase sedimentada foi recuperada com auxílio de uma seringa.

A extração foi parcialmente desenvolvida com auxílio da metodologia de superfície de resposta usando design de Doehlert e atingiu limite de quantificação na faixa de 1,8 a 7,4 ng mL−1, com recuperação de 96 a 114%.

D) DLLME assistida por vórtex (VALLME – vortex-assisted liquid–liquid microextraction).

Assim como o uso de ultrassom, o uso de vórtex reduz o consumo de solventes[67] e melhora a eficiência da extração[72]. O trabalho realizado por Alshana et al.[32] determinou bisfenol A, o principal composto de resinas e 196

DLLME: inovações e aplicações biológicas

policarbonato, caracterizado como disrruptor endócrino, em amostras de urina por CEUV. Os tubos contendo a amostra e solventes extrator e dispersor (1-undecanol e acetona, respectivamente) foram submetidos à agitação em vórtex por um minuto e foi observada a formação da suspensão dos componentes. O tubo foi centrifugado e levado ao freezer à –20°C onde, após 5 minutos, a gota orgânica flutuante solidificou-se e posteriormente foi separada. Em seguida, a gota solidificada se liquefez, à temperatura ambiente, e foi realizada a análise por CE. Os autores destacam rapidez no tempo de extração (2 minutos), baixo limite de quantificação e baixos valores de coeficiente de variação (1,9%) quando comparado às outras microtécnicas de extração, como SPME e SDME. E) DLLME assistida por micro-ondas (MADLLME – microwave-assisted dispersive liquid-liquid microextraction)[67]. Assim como a SA-DLLME, a MA-DLLME também tem sido pouco utilizada. Neste caso, os efeitos do tempo e da potência do micro-ondas devem ser analisados, pois a degradação dos analitos devido a irradiação pode ocorrer, o que pode promover a diminuição da recuperação[76].

Em 2011, Xu et al.[66] fizeram o uso desta técnica associada ao uso de IL para a extração de sulfonamidas em várias matrizes. Foi observado que a temperatura, fortemente relacionada com o tempo de irradiação e potência utilizada, pode afetar a transferência de massa dos analitos e a área de contato entre o solvente extrator e a solução aquosa.

Além disso, o aumento do tempo de extração contribuiu para a diminuição da viscosidade do IL e para a transferência de massa.

F) DLLME assistida por agitação manual. Pode ser realizada para dispersão e extração ou como um passo de pré-mistura antes da extração[67].

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Chung et al.[77] utilizaram agitação manual previamente à DLLME com uso de ultrassom e verificaram que a agitação manual contribui para garantir que todos os analitos estejam dispersos na amostra, aumentando a eficiência da extração e sua precisão, já que todos os analitos tem a mesma probabilidade de entrar em contato com o solvente extrator. Aplicações da DLLME por agitação manual são bastante empregadas[37-39,41,46,54,78]. Um dos trabalhos que usa este tipo de DLLME é o de Vela-Soria et al.[78]. Nele, os autores quantificaram 14 disrruptores endócrinos em amostras de urina por CG-MS. A mistura de solvente dispersor (acetona) e extrator (triclorometano) foi adicionada à amostra e realizada a agitação manual por 10 segundos. A seguir, a amostra foi centrifugada e a fase orgânica recolhida com auxílio de uma seringa. Foram obtidos valores de recuperação na faixa de 94 a 105%, e limites de quantificação na faixa de 0,2 a 0,5 ng mL-1.

Alguns trabalhos utilizam ainda associações entre as variações da DLLME, como, por exemplo, Rajabi et al.[33] que fizeram uso de ultrassom com IL e controle de temperatura para realizar a quantificação de anetol, estagol e para-anisaldeído em amostras de urina por HPLC-UV. No método desenvolvido, a amostra de urina foi colocada em um tubo previamente contendo o IL [C6MIM][PF6] e uma barra magnética. O tubo foi aquecido em banho-maria a 70°C por 2 minutos. Nesta fase, o calor causa a dispersão do IL na amostra. Em seguida, o tubo foi colocado em banho ultrassônico contendo água gelada por 4 minutos, o que levou à formação do ponto nuvem novamente. Em seguida, o tubo foi centrifugado e a fase sedimentada coletada para posterior análise.

6. Delineamento experimental

Recentemente, vários trabalhos envolvendo a DLLME tem utilizado um delineamento experimental

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com duas etapas - delineamento Plackett–Burman (PBD – Plackett–Burman design) seguido de delineamento composto central (CCD – central composite design) para a determinação das condições experimentais. O PBD é utilizado para analisar de forma rápida quais as principais variáveis que afetam a recuperação da extração[18], enquanto que o CCD é utilizado para determinar as condições ótimas para os fatores considerados críticos nesta extração[79].

7. Pré-tratamento de amostras biológicas submetidas à DLLME

Quando se trata da extração de analitos em matrizes biológicas, as quais são altamente complexas, muitas vezes faz-se necessário um pré-tratamento da amostra. Entre esses procedimentos adicionais e compatíveis com a DLLME, especialmente quando a matriz é o plasma ou soro, está a precipitação de proteínas. Este procedimento é necessário para reduzir os interferentes da matriz e evitar o entupimento da coluna cromatográfica[56]. Um das maneiras mais utilizadas para a precipitação de proteínas consiste no uso de acetonitrila gelada ou à temperatura ambiente, acetona[45,46], álcoois como metanol ou etanol[61], ácidos como o tricloroacético 10%[40,61] ou 30%[53], clorídrico 6 M[55,56], sulfúrico, fórmico ou acético[56], ou mistura de solução de sulfato de zinco a 15% (p/v) com acetonitrila[56,61]. Entretanto, em todos estes procedimentos o sobrenadante deve ser compatível com o procedimento de extração. Por exemplo, Tarazona et al.[55] relatam que quando a precipitação de proteínas foi feita com acetonitrila, não foi observada a formação do ponto nuvem quando a mistura de solventes extrator e dispersor foi injetada na solução.

Xiao et al.[58] descrevem que, após realizar a DLLME com IL, foi necessário realizar uma back extraction para recuperar os analitos que estavam no IL para a fase aquosa e posterior injeção no sistema cromatográfico.

Huang et al.[80] relatam que quando a DLLME é usada com CE, é necessário evaporar o solvente de extração e reconstituir o resíduo em meio adequado para evitar a queda da corrente elétrica no início da análise. Para a

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remoção de lipídeos, normalmente é realizada uma etapa de filtração do sobrenadante, após centrifugação, com filtro de 0,45 μm[44,81] e posterior DLLME. Quando a matriz é urina, grande parte dos trabalhos descritos na literatura realiza apenas uma centrifugação, usando o sobrenadante para as análises[44,47,48,51,82]. Shi et al.[40] adicionaram à urina ácido tricloroacético 10% e, em seguida, foi realizada filtração em membrana de 0,45 μm. Já Shamsipur e Mirmohammadi[38] realizaram ultrassonicação das amostras de urina ao observarem um depósito lipídico no fundo do tubo. Em contrapartida, tecidos sólidos como fígado[49,83], cérebro[52], por exemplo, requerem procedimentos mais longos, dispendiosos e específicos.

A Figura 5 mostra uma amostra de 5 mL de urina (A) que foi submetida à DLLME, com consequente formação de uma solução turva (B) após a adição dos solventes extrator e dispersor e a separação do solvente

DLLME: inovações e aplicações biológicas

extrator no fundo do tubo cônico após a centrifugação (C).

8. DLLME associada a outras técnicas de extração

Além das recentes modificações inclusas na DLLME, tem-se empregado a mesma em associação com outras técnicas de extração, tais como SPE[84,85], MIP[86,87] e eletromembrana[43]. Mashayekhi et al.[84] relatam que a associação de SPE-DLLME é uma técnica hifenada eficiente, que oferece as vantagens de ambos os métodos tais como simplicidade, baixo consumo e exposição a solventes, baixos custo e tempo de extração com altos valores de recuperação e fatores de enriquecimento.

Neste caso, o eluente da SPE foi usado como solvente dispersor para a DLLME, realizada posteriormente, para a extração de ecstasy e anfetaminas em urina e análise por cromatografia gasosa.

9. Conclusões e perspectivas

Figura 5. Uso da DLLME em amostras biológicas.

198

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DLLME: inovações e aplicações biológicas

A DLLME foi inicialmente delineada para a extração de compostos em amostras aquosas e, portanto, a aplicação da mesma esteve voltada majoritariamente para a análise de resíduos de medicamentos, pesticidas, entre outros, em água. Desde o primeiro trabalho de Rezaee, em 2006[88], até o momento atual, muitas inovações foram trazidas para a DLLME. No entanto, nem todas foram aplicadas ainda às matrizes biológicas.

Alguns exemplos são a supramolecular-based-DLLME, partitioned dispersive liquid-liquid microextraction (PDLLME), entre outras[88].

As matrizes biológicas são extremamente complexas e podem conter interferentes como lipídeos, fosfolipídeos, proteínas, hormônios e minerais. Uma das matrizes mais utilizadas é o plasma, o qual possui alta viscosidade e, portanto, esta característica pode interferir na dispersão dos solventes extrator e dispersor

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na amostra quando a DLLME é utilizada. Desta forma, é necessário realizar algum pré-tratamento para que seja possível conduzir qualquer procedimento de preparo de amostra e minimizar a presença de interferentes.

Uma das tendências da DLLME é a melhora na seletividade pela associação de diferentes técnicas de preparo de amostra, como discutido nesta revisão. Apesar das vantagens da DLLME, uma grande desvantagem é a dificuldade na automação. Nesse sentido, alguns avanços têm sido avaliados, porém, ainda não aplicados às amostras biológicas[29,89]. Assim, espera-se que futuramente ainda menos solventes e em menor volume sejam usados, e que sejam desenvolvidos outros modos que simplifiquem a DLLME reduzindo ainda mais o tempo e o custo, além de torná-la uma técnica highthroughput.

Referências 1.

Nuhu A, Basheer C, Saad B. Liquid-phase and dispersive liquid-liquid microextraction techniques with derivatization: Recent applications in bioanalysis. Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences.

2011;879(17-18):1180-8.

2.

Zang X, Wu Q, Zhang M, Xi G, Wang Z. Developments of Dispersive Liquid-Liquid Microextraction Technique. Chinese Journal of Analytical Chemistry. 2009;37(2):161-8.

3.

Rezaee M, Assadi Y, Hosseinia M, Aghaee E, Ahmadi F, Berijani S. Determination of organic compounds in water using dispersive liquid-liquid microextraction. Journal of Chromatography a. 2006;1116(1-2):1-9.

4.

Rezaee M, Yamini Y, Faraji M. Evolution of dispersive liquid-liquid microextraction method. Journal of Chromatography a.

2010;1217(16):2342-57.

5.

Escudero LB, Castro Grijalba A, Martinis EM, Wuilloud RG. Bioanalytical separation and preconcentration using ionic liquids.

Anal Bioanal Chem. 2013;405(24):7597-613.

6.

Esrafili A, Yamini Y, Shariati S. Hollow fiber-based liquid phase microextraction combined with high-performance liquid chromatography for extraction and determination of some antidepressant drugs in biological fluids. Analytica Chimica Acta.

2007;604(2):127-33.

7.

Moradi M, Yamini Y, Baheri T. Analysis of abuse drugs in urine using surfactant-assisted dispersive liquid-liquid microextraction.

Journal of Separation Science. 2011;34(14):1722-9.

8.

Wille S, Lambert W. Recent developments in extraction procedures relevant to analytical toxicology. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 2007;388(7):1381-91.

9.

Kokosa JM. Advances in solvent-microextraction techniques. Trac-Trends in Analytical Chemistry. 2013;43:2-13.

10. Cruz-Vera M, Lucena R, Cardenas S, Valcarcel M. One-step in-syringe ionic liquid-based dispersive liquid-liquid microextraction.

Journal of Chromatography a. 2009;1216(37):6459-65.

Scientia Chromatographica 2014; 6(3):186-204 199

Moreira BJ; Yokoya JMC; Gaitani CM

DLLME: inovações e aplicações biológicas

11. Huo X, Li Q, Lin X, Chen X, Bi K. Application of Dispersive Liquid-Liquid Microextraction for the Analysis of Six Fungicides in Fruit Samples by GC-ECD. Chromatographia. 2011;73(3-4):313-9.

12. Liang J, Zhang X, Zhou Y, Hu Q. Determination of trace lead in environmental samples by flow injection and hydride generation atomic absorption spectrometry. Asian Journal of Chemistry. 2008;20(1):599-607.

13. Rezaei F, Bidari A, Birjandi A, Hosseini M, Assadi Y. Development of a dispersive liquid-liquid microextraction method for the determination of polychlorinated biphenyls in water. Journal of Hazardous Materials. 2008;158(2-3):621-7.

14. Farajzadeh M, Djozan D, Bakhtiyari R. Use of a capillary tube for collecting an extraction solvent lighter than water after dispersive liquid-liquid microextraction and its application in the determination of parabens in different samples by gas chromatographyFlame ionization detection. Talanta. 2010;81(4-5):1360-7.

15. Kocurova L, Balogh I, Sandrejova J, Andruch V. Recent advances in dispersive liquid-liquid microextraction using organic solvents lighter than water. A review. Microchemical Journal. 2012;102:11-7.

16. Berijani S, Assadi Y, Anbia M, Hosseini M, Aghaee E. Dispersive liquid-liquid microextraction combined with gas chromatographyflame photometric detection - Very simple, rapid and sensitive method for the determination of organophosphorus pesticides in water. Journal of Chromatography a. 2006;1123(1):1-9.

17. Caldas S, Costa F, Primel E. Validation of method for determination of different classes of pesticides in aqueous samples by dispersive liquid-liquid microextraction with liquid chromatography-tandem mass spectrometric detection. Analytica Chimica Acta.

2010;665(1):55-62.

18. Khodadoust S, Hadjmohammadi M. Determination of N-methylcarbamate insecticides in water samples using dispersive liquidliquid microextraction and HPLC with the aid of experimental design and desirability function. Anal Chim Acta. 2011;699(1):113-9.

19. Panagiotou A, Sakkas V, Albanis T. Application of chemometric assisted dispersive liquid-liquid microextraction to the determination of personal care products in natural waters. Analytica Chimica Acta. 2009;649(2):135-40.

20. Melwanki M, Chen W, Bai H, Lin T, Fuh M. Determination of 7-aminoflunitrazepam in urine by dispersive liquid-liquid microextraction with liquid chromatography-electrospray-tandem mass spectrometry. Talanta. 2009;78(2):618-22.

21. Rao R, Raju S, Vali R. Ionic-liquid based dispersive liquid-liquid microextraction followed by high performance liquid chromatographic determination of anti-hypertensives in rat serum. Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 2013;931:174-80.

22. Vazquez M, Vazquez P, Galera M, Garcia M, Ucles A. Ultrasound-assisted ionic liquid dispersive liquid-liquid microextraction coupled with liquid chromatography-quadrupole-linear ion trap-mass spectrometry for simultaneous analysis of pharmaceuticals in wastewaters. Journal of Chromatography a. 2013;1291:19-26.

23. Ojeda C, Rojas F. Separation and Preconcentration by Dispersive Liquid-Liquid Microextraction Procedure: A Review.

Chromatographia. 2009;69(11-12):1149-59.

24. Yan H, Wang H, Qin X, Liu B, Du J. Ultrasound-assisted dispersive liquid-liquid microextraction for determination of fluoroquinolones in pharmaceutical wastewater. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2011;54(1):53-7.

25. Farajzadeh M, Djozan D, Khorram P. Development of a new dispersive liquid-liquid microextraction method in a narrow-bore tube for preconcentration of triazole pesticides from aqueous samples. Analytica Chimica Acta. 2012;713:70-8.

26. Meng L, Wang B, Luo F, Shen G, Wang Z, Guo M. Application of dispersive liquid-liquid microextraction and CE with UV detection for the chiral separation and determination of the multiple illicit drugs on forensic samples. Forensic Science International. 2011;209(1‑3):42‑7.

27. Saraji M, Boroujeni M, Bidgoli A. Comparison of dispersive liquid-liquid microextraction and hollow fiber liquid-liquid-liquid microextraction for the determination of fentanyl, alfentanil, and sufentanil in water and biological fluids by high-performance liquid chromatography. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 2011;400(7):2149-58.

28. Xiong C, Ruan J, Cai Y, Tang Y. Extraction and determination of some psychotropic drugs in urine samples using dispersive liquid-liquid microextraction followed by high-performance liquid chromatography. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2009;49(2):572-8.

29. Saraji M, Boroujeni M. Recent developments in dispersive liquid-liquid microextraction. Analytical and Bioanalytical Chemistry.

2014;406(8):2027-66.

30. Yazdi A, Razavi N, Yazdinejad S. Separation and determination of amitriptyline and nortriptyline by dispersive liquid-liquid microextraction combined with gas chromatography flame ionization detection. Talanta. 2008;75(5):1293-9.

200

Scientia Chromatographica 2014; 6(3):186-204

DLLME: inovações e aplicações biológicas

Moreira BJ; Yokoya JMC; Gaitani CM

31. Shamsipur M, Fattahi N. Extraction and determination of opium alkaloids in urine samples using dispersive liquid-liquid microextraction followed by high-performance liquid chromatography. Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 2011;879(28):2978-83.

32. Alshana U, Lubbad I, Goger N, Cok I, Tamer U, Ertas N. Dispersive liquid-liquid microextraction based on solidification of floating organic drop combined with counter-electroosmotic flow normal stacking mode in capillary electrophoresis for the determination of bisphenol a in water and urine samples. Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies. 2013;36(20):2855-70.

33. Rajabi M, Haji-Esfandiari S, Barfi B, Ghanbari H. Ultrasound-assisted temperature-controlled ionic-liquid dispersive liquidphase microextraction method for simultaneous determination of anethole, estragole, and para-anisaldehyde in different plant extracts and human urine: a comparative study. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 2014;406(18):4501-12.

34. Zarei A, Gholamian F. Development of a dispersive liquid-liquid microextraction method for spectrophotometric determination of barbituric acid in pharmaceutical formulation and biological samples. Analytical Biochemistry. 2011;412(2):224-8.

35. Andruch V, Balogh I, Kocurova L, Sandrejova J. Five Years of Dispersive Liquid-Liquid Microextraction. Applied Spectroscopy Reviews. 2013;48(3):161-259.

36. Gong A, Zhu X. Dispersive solvent-free ultrasound-assisted ionic liquid dispersive liquid-liquid microextraction coupled with HPLC for determination of ulipristal acetate. Talanta. 2015;131:603-8.

37. Shamsipur M, Jouybari T, Barati A, Mahmoudi M, Amin N, Pashabadi A. A manual shaking-enhanced, ultrasound-assisted dispersive liquid-liquid microextraction for the determination of betamethasone and dexamethasone: optimization using Response surface methodology. Analytical Methods. 2014;6(13):4542-50.

38. Shamsipur M, Mirmohammadi M. High performance liquid chromatographic determination of ultra traces of two tricyclic antidepressant drugs imipramine and trimipramine in urine samples after their dispersive liquid-liquid microextraction coupled with response surface optimization. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2014;100:271-8.

39. Vela-Soria F, Ballesteros O, Zafra-Gomez A, Ballesteros L, Navalon A. UHPLC-MS/MS method for the determination of bisphenol A and its chlorinated derivatives, bisphenol S, parabens, and benzophenones in human urine samples. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 2014;406(15):3773-85.

40. Shi Z, Jiang H, Hu J, Li Z, Zhang H. Dispersive liquid-liquid microextraction and high-performance liquid chromatographic determination of anthraquinone derivatives in human urine after oral administration of San-huang tablets. Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies. 2014;37(14):2062-71.

41. Dittert I, Vitali L, Chaves E, Maranhao T, Borges D, de Favere V, et al. Dispersive liquid-liquid microextraction using ammonium O,O-diethyl dithiophosphate (DDTP) as chelating agent and graphite furnace atomic absorption spectrometry for the determination of silver in biological samples. Analytical Methods. 2014;6(15):5584-9.

42. Hajiaghabozorgy R, Zarei A, Pakdehi S. A highly sensitive spectrophotometric determination of ultra trace amounts of azide ion in water and biological samples after preconcentration using dispersive liquid-liquid microextraction technique. Journal of Analytical Chemistry. 2014;69(8):805-11.

43. Arjomandi-Behzad L, Yamini Y, Rezazadeh M. Extraction of pyridine derivatives from human urine using electromembrane extraction coupled to dispersive liquid-liquid microextraction followed by gas chromatography determination. Talanta.

2014;126:73-81.

44. Ahmadi-Jouibari T, Fattahi N, Shamsipur M. Rapid extraction and determination of amphetamines in human urine samples using dispersive liquid-liquid microextraction and solidification of floating organic drop followed by high performance liquid chromatography. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2014;94:145-51.

45. Rahimi A, Hashemi P. Development of a Dispersive Liquid-Liquid Microextraction Method Based on Solidification of a Floating Organic Drop for the Determination of Beta-Carotene in Human Serum. Journal of Analytical Chemistry. 2014;69(4):352-6.

46. Vela-Soria F, Ballesteros O, Zafra-Gomez A, Ballesteros L, Navalon A. A new method for the determination of benzophenoneUV filters in human serum samples by dispersive liquid-liquid microextraction with liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Talanta. 2014;121:97-104.

47. Dziomba S, Kowalski P, Slominska A, Baczek T. Field-amplified sample injection coupled with pseudo-isotachophoresis technique for sensitive determination of selected psychiatric drugs in human urine samples after dispersive liquid-liquid microextraction. Analytica Chimica Acta. 2014;811:88-93.

Scientia Chromatographica 2014; 6(3):186-204 201

Moreira BJ; Yokoya JMC; Gaitani CM

DLLME: inovações e aplicações biológicas

48. Kiarostami V, Rouini M, Mohammadian R, Lavasani H, Ghazaghi M. Binary Solvents Dispersive Liquid-Liquid Microextraction (BS-DLLME) Method for Determination of Tramadol in Urine Using High-Performance Liquid Chromatography. Daru-Journal of Pharmaceutical Sciences. 2014;22.

49. Mudiam M, Chauhan A, Jain R, Dhuriya Y, Saxena P, Khanna V. Molecularly imprinted polymer coupled with dispersive liquid-liquid microextraction and injector port silylation: A novel approach for the determination of 3-phenoxybenzoic acid in complex biological samples using gas chromatography-tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 2014;945:23-30.

50. Fernandez P, Regenjo M, Fernandez A, Lorenzo R, Carro A. Optimization of ultrasound-assisted dispersive liquid-liquid microextraction for ultra performance liquid chromatography determination of benzodiazepines in urine and hospital wastewater.

Analytical Methods. 2014;6(20):8239-46.

51. Wang X, Wang Y, Zou X, Cao Y. Improved dispersive liquid-liquid microextraction based on the solidification of floating organic droplet method with a binary mixed solvent applied for determination of nicotine and cotinine in urine. Analytical Methods. 2014;6(7):2384-9.

52. Mudiam M, Jain R, Singh A, Khan H, Parmar D. Development of ultrasound-assisted dispersive liquid-liquid microextractionlarge volume injection-gas chromatography-tandem mass spectrometry method for determination of pyrethroid metabolites in brain of cypermethrin-treated rats. Forensic Toxicology. 2014;32(1):19-29.

53. Padro J, Marson M, Mastrantonio G, Altcheh J, Garcia-Bournissen F, Reta M. Development of an ionic liquid-based dispersive liquid-liquid microextraction method for the determination of nifurtimox and benznidazole in human plasma. Talanta.

2013;107:95-102.

54. Khodadoust S, Ghaedi M. Optimization of dispersive liquid-liquid microextraction with central composite design for preconcentration of chlordiazepoxide drug and its determination by HPLC-UV. Journal of Separation Science. 2013;36(11):1734-42.

55. Tarazona I, Chisvert A, Salvador A. Determination of benzophenone-3 and its main metabolites in human serum by dispersive liquid-liquid microextraction followed by liquid chromatography tandem mass spectrometry. Talanta. 2013;116:388-95.

56. Ahmadi-Jouibari T, Fattahi N, Shamsipur M, Pirsaheb M. Dispersive liquid-liquid microextraction followed by high-performance liquid chromatography-ultraviolet detection to determination of opium alkaloids in human plasma. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2013;85:14-20.

57. Behbahani M, Najafi F, Bagheri S, Bojdi M, Salarian M, Bagheri A. Application of surfactant assisted dispersive liquidliquid microextraction as an efficient sample treatment technique for preconcentration and trace detection of zonisamide and carbamazepine in urine and plasma samples. Journal of Chromatography a. 2013;1308:25-31.

58. Xiao C, Tang M, Li J, Yin C, Xiang G, Xu L. Determination of sildenafil, vardenafil and aildenafil in human plasma by dispersive liquid-liquid microextraction-back extraction based on ionic liquid and high performance liquid chromatography-ultraviolet detection. Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 2013;931:111-6.

59. Mudiam M, Ratnasekhar C. Ultra sound assisted one step rapid derivatization and dispersive liquid-liquid microextraction followed by gas chromatography-mass spectrometric determination of amino acids in complex matrices. Journal of Chromatography a.

2013;1291:10-8.

60. Fernandez P, Gonzalez C, Pena M, Carro A, Lorenzo R. A rapid ultrasound-assisted dispersive liquid-liquid microextraction followed by ultra-performance liquid chromatography for the simultaneous determination of seven benzodiazepines in human plasma samples. Analytica Chimica Acta. 2013;767:88-96.

61. Suh J, Lee Y, Lee H, Kang M, Hur Y, Lee S, et al. Dispersive liquid-liquid microextraction based on solidification of floating organic droplets followed by high performance liquid chromatography for the determination of duloxetine in human plasma.

Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2013;75:214-9.

62. Kohler I, Schappler J, Sierro T, Rudaz S. Dispersive liquid-liquid microextraction combined with capillary electrophoresis and time-of-flight mass spectrometry for urine analysis. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2013;73:82-9.

63. Li Y, Zhang J, Peng B, Li S, Gao H, Zhou W. Determination of triazole pesticides in rat blood by the combination of ultrasoundenhanced temperature-controlled ionic liquid dispersive liquid-liquid microextraction coupled to high-performance liquid chromatography. Analytical Methods. 2013;5(9):2241-8.

64. Sun J, Shi Y, Chen J. Simultaneous determination of plasticizer di(2-ethylhexyl)phthalate and its metabolite in human urine by temperature controlled ionic liquid dispersive liquid-liquid microextraction combined with high performance liquid chromatography. Analytical Methods. 2013;5(6):1427-34.

202

Scientia Chromatographica 2014; 6(3):186-204

DLLME: inovações e aplicações biológicas

Moreira BJ; Yokoya JMC; Gaitani CM

65. He L, Zhang K, Wang C, Luo X, Zhang S. Effective indirect enrichment and determination of nitrite ion in water and biological samples using ionic liquid-dispersive liquid-liquid microextraction combined with high-performance liquid chromatography.

Journal of Chromatography a. 2011;1218(23):3595-600.

66. Xu X, Su R, Zhao X, Liu Z, Zhang Y, Li D, et al. Ionic liquid-based microwave-assisted dispersive liquid-liquid microextraction and derivatization of sulfonamides in river water, honey, milk, and animal plasma. Analytica Chimica Acta. 2011;707(1):92-9.

67. Leong M, Fuh M, Huang S. Beyond dispersive liquid-liquid microextraction. Journal of Chromatography a. 2014;1335:2-14.

68. Hatami M, Karimnia E, Farhadi K. Determination of salmeterol in dried blood spot using an ionic liquid based dispersive liquidliquid microextraction coupled with HPLC. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2013;85:283-7.

69. Ge D, Lee H. Ionic liquid based dispersive liquid liquid microextraction coupled with micro-solid phase extraction of antidepressant drugs from environmental water samples. Journal of Chromatography a. 2013;1317:217-22.

70. Zho Q, Bai H, Xie G, Xiao J. Trace determination of organophosphorus pesticides in environmental samples by temperaturecontrolled ionic liquid dispersive liquid-phase microextraction. Journal of Chromatography a. 2008;1188(2):148-53.

71. Leong M, Huang S. Dispersive liquid-liquid microextraction method based on solidification of floating organic drop combined with gas chromatography with electron-capture or mass spectrometry detection. Journal of Chromatography a. 2008;1211(1-2):8-12.

72. Jia S, Li J, Park S, Ryu Y, Park I, Park J, et al. Combined application of dispersive liquid-liquid microextraction based on the solidification of floating organic droplets and charged aerosol detection for the simple and sensitive quantification of macrolide antibiotics in human urine. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2013;86:204-13.

73. Guo L, Lee H. Low-density solvent-based solvent demulsification dispersive liquid-liquid microextraction for the fast determination of trace levels of sixteen priority polycyclic aromatic hydrocarbons in environmental water samples. Journal of Chromatography a. 2011;1218(31):5040-6.

74. Farajzadeh M, Djozan D, Reza M, Mogaddam A, Norouzi J. Determination of phthalate esters in cow milk samples using dispersive liquid-liquid microextraction coupled with gas chromatography followed by flame ionization and mass spectrometric detection. Journal of Separation Science. 2012;35(5-6):742-9.

75. Farajzadeh M, Mogaddam M. Air-assisted liquid-liquid microextraction method as a novel microextraction technique; Application in extraction and preconcentration of phthalate esters in aqueous sample followed by gas chromatography-flame ionization detection. Analytica Chimica Acta. 2012;728:31-8.

76. Wang J, Xiong J, Baker G, JiJi R, Baker S. Developing microwave-assisted ionic liquid microextraction for the detection and tracking of hydrophobic pesticides in complex environmental matrices. Rsc Advances. 2013;3(38):17113-9.

77. Chung R, Leong M, Huang S. Determination of nitrophenols using ultrahigh pressure liquid chromatography and a new manual shaking-enhanced, ultrasound-assisted emulsification microextraction method based on solidification of a floating organic droplet. Journal of Chromatography a. 2012;1246:55-61.

78. Vela-Soria F, Ballesteros O, Zafra-Gomez A, Ballesteros L, Navalon A. A multiclass method for the analysis of endocrine disrupting chemicals in human urine samples. Sample treatment by dispersive liquid-liquid microextraction. Talanta. 2014;129:209-18.

79. Sereshti H, Khojeh V, Samadi S. Optimization of dispersive liquid-liquid microextraction coupled with inductively coupled plasma-optical emission spectrometry with the aid of experimental design for simultaneous determination of heavy metals in natural waters. Talanta. 2011;83(3):885-90.

80. Huang S, Hsieh M, Chang S. Sensitive determination of sertraline by capillary electrophoresis with dispersive liquid-liquid microextraction and field-amplified sample stacking. Talanta. 2012;101:460-4.

81. Talebianpoor M, Khodadoust S, Rozbehi A, Toori M, Zoladl M, Ghaedi M, et al. Application of optimized dispersive liquidliquid microextraction for determination of melatonin by HPLC-UV in plasma samples. Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 2014;960:1-7.

82. Ranjbari E, Golbabanezhad-Azizi A, Hadjmohammadi M. Preconcentration of trace amounts of methadone in human urine, plasma, saliva and sweat samples using dispersive liquid-liquid microextraction followed by high performance liquid chromatography. Talanta. 2012;94:116-22.

83. Moema D, Nindi M, Dube S. Development of a dispersive liquid-liquid microextraction method for the determination of fluoroquinolones in chicken liver by high performance liquid chromatography. Analytica Chimica Acta. 2012;730:80-6.

Scientia Chromatographica 2014; 6(3):186-204 203

Moreira BJ; Yokoya JMC; Gaitani CM

DLLME: inovações e aplicações biológicas

84. Mashayekhi H, Rezaee M, Khalilian F. Solid-phase extraction followed by dispersive liquid-liquid microextraction for the sensitive determination of ecstasy compounds and amphetamines in biological samples. Bulletin of the Chemical Society of Ethiopia. 2014;28(3):339-48.

85. Rezaee M, Mashayekhi H. Solid-phase extraction combined with dispersive liquid-liquid microextraction as an efficient and simple method for the determination of carbamazepine in biological samples. Analytical Methods. 2012;4(9):2887-92.

86. Djozan D, Farajzadeh M, Sorouraddin S, Baheri T. Molecularly imprinted-solid phase extraction combined with simultaneous derivatization and dispersive liquid-liquid microextraction for selective extraction and preconcentration of methamphetamine and ecstasy from urine samples followed by gas chromatography. Journal of Chromatography a. 2012;1248:24-31.

87. Mudiam M, Chauhan A, Singh K, Gupta S, Jain R, Ch R, et al. Determination of t,t-muconic acid in urine samples using a molecular imprinted polymer combined with simultaneous ethyl chloroformate derivatization and pre-concentration by dispersive liquid-liquid microextraction. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 2013;405(1):341-9.

88. Yan H, Wang H. Recent development and applications of dispersive liquid-liquid microextraction. Journal of Chromatography a. 2013;1295:1-15.

89. Maya F, Horstkotte B, Estela J, Cerda V. Automated in-syringe dispersive liquid-liquid microextraction. Trac-Trends in Analytical Chemistry. 2014;59:1-8.

204

Scientia Chromatographica 2014; 6(3):186-204

Scientia Chromatographica 2014; 6(3):205-211 Instituto Internacional de Cromatografia http://dx.doi.org/10.4322/sc.2015.006 ISSN 1984-4433

MULTIDIMENSIONAL

Cromatografia em fluxo turbulento (TFC) Turbulent flow chromatography (TFC)

Fernando M. Lanças* Universidade de São Paulo Instituto de Química de São Carlos 13560-970 São Carlos (SP) – Brasil *flancas@iqsc.usp.br Recebido: 30/11/2014 Aceito: 30/12/2014

Resumo

A cromatografia é uma técnica de separação baseada na partição dos analitos entre duas fases: uma fase que permanence estanque durante o processo (fase estacionária) e outra que percola através dela (fase móvel). Dependendo do estado físico da fase móvel a técnica tem sido classificada em cromatografia gasosa (GC), cromatografia líquida (LC) ou cromatografia com fluido supercrítico (SFC).

Entretanto, esta classificação tem sido ampliada mais recentemente para incluir subdivisões. Assim, a cromatografia líquida possui hoje várias sub-divisões, incluindo: cromatografia líquida em pressões ultra-elevadas (U-HPLC); cromatografia líquida com fluidez aumentada (EFLC); cromatografia de transição de fase; cromatografia em fluxo turbulento (TFC) e outras. Esta última, TFC, baseia-se no uso de fluxos ou vazões elevadas (tipicamente 4 a 6 mL/min) em colunas contendo partículas de diâmetro considerado grande para os padrões atuais da LC (30-60 µm). Nestas condições, a fase móvel não apresenta um fluxo laminar como usualmente em LC mas sim um fluxo turbulento o qual leva a formação de uma turbulência na coluna com a consequente transferência de massa através dos canais e a difusão dos analitos nos poros das partículas da fase estacionária. Esta condição tem se mostrado bastante eficiente no preparo de amostras, especialmente na área de bioanálises. A TFC tem sido utilizada com sucesso em um arranjo bidimensional no qual a primeira coluna, operando em fluxo turbulento, é empregada para a etapa de preparo de amostras, enquanto que a segunda é empregada como coluna analítica e recebe a amostra tratada na primeira coluna através de uma válvula de comutação de colunas. Este trabalho apresenta uma descrição das principais características da Cromatografia em Fluxo Turbulento (TFC), a instrumentação típica utilizada na mesma e uma relação dos trabalhos publicados nos últimos 10 anos na área para o leitor interessado em mais informações a respeito da técnica.

Palavras-chave: fluxo turbulento; cromatografia líquida, HPLC, multidimensional.

Abstract

Chromatography is a separation technique based on the partition of the analytes into two phases: one phase remains still during the process (stationary phase) while the other phase percolate through it transporting the compounds under analyzes.

Depending upon the physical state of the mobile phase the technique has presented the following classification: gas chromatography (GC); liquid chromatography (LC); and supercritical fluid chromatography (SFC). In fact, this classical procedure has been recently modified to include several sub-divisions. In the case of liquid chromatography, as an example, the sub-divisions includes terms such as ultra high pressure liquid chromatography (U-HPLC); enhanced-fluidity liquid chromatography (EFLC); transition phase chromatography; turbulent flow chromatography (TFC), Scientia Chromatographica 2014; 6(3)

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Cromatografia em fluxo turbulento

among others. In the late case, TFC, the technique is based upon the utilization of high flow rates (typically 4-6mL/min) and columns packed with particles considered large (30-60 µm) for the present LC standards. Under these conditions, the mobile phase does not exhibit a laminar flow as in standard LC but instead a turbulent flow that leads to the formation of eddies thus promoting cross-channel mass transfer and the diffusion of the analytes into the stationary phase particle pores. These conditions have shown to be efficient for sample preparation, particularly in the bioanalysis arena. TFC has been successfully employed in a bi-dimensional set-up in which the first columns operating under turbulent flow conditions is employed for sample preparation and the second (analytical column) receives the treated sample coming from the first column through a switching valve. In the present work a description of the main characteristics of the turbulent flow chromatography (TFC) is presented, followed by the presentation of the typical instrumentation utilized and a list of the papers published in the last 10 years employing this technique.

Keywords: turbulent flow; liquid chromatography; HPLC; multidimensional.

1. Introdução

A cromatografia líquida moderna (HPLC) é uma técnica analítica madura e que encontra aplicações analíticas em vários setores da sociedade, especialmente na análise de amostras biológicas (tais como plasma, urina, sangue, dentre outras); alimentos de origem animal e vegetal; e meio ambiente [1]. Apresenta várias classificações, de acordo com as dimensões da coluna (capilar, preparativa, analítica), forma de colocação da fase no interior do tubo (empacotada, tubular aberta ou monolítica), pressão (LC, HPLC, U-HPLC) e outros [2-4].

Como nos demais modos cromatográficos, o fluxo (vazão) da fase móvel é um importante parâmetro que comanda a eficiência e o tempo de separação em HPLC. Apesar de que nas condições usuais em que a fase móvel é empregada em HPLC – tipicamente ao redor de 1 mL/min – o perfil do fluxo é laminar, em fluxos mais elevados - como 4 a 5 mL/min - empregando partículas de diâmetros maiores – tais como 40 a 60 mícrons - na fase estacionária, o fluxo se torna turbulento (Figura 1).

A modalidade cromatográfica que emprega fluxos turbulentos como fase móvel, tem sido denominada cromatografia em fluxo turbulento (TFC).

Os primeiros registros sobre a definição de fluxo turbulento são atribuidos a Reynolds [5], o qual propos que o fluxo de um fluido através de um tubo torna-se turbulento quando o momento (quantidade de 206

movimento) do fluido excede sua resistência em fluir por um fator entre 2.000 e 3.000.

O número de Reynolds, Re, o qual relaciona essas grandezas é dado por (Eq.1): Re =

onde:

υ ρ D f η

(Eq.1)

u = momento (massa/velocidade); r = densidade do fluido; Df = diâmetro do tubo; h = viscosidade do fluido.

No caso de uma coluna cromatográfica empacotada com partículas da fase estacionária, o tamanho das partículas também precisa ser considerado.

Uma vez que os espaços existentes entre as partículas é proporcional ao tamanho médio das mesmas (dp) as colunas empacotadas com partículas maiores irão reter uma quantidade de fase móvel maior do que partículas menores. O número de Reynolds para colunas empacotadas, levando em consideração a porosidade externa das partículas (e0 ) é dado por (Eq.2): ,

Re =

Vp d p

η ε0

(Eq. 2) Scientia Chromatographica 2014; 6(3):205-211

Cromatografia em fluxo turbulento

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(a)

(b)

Figura 1. Perfil de um fluxo laminar versus o de um fluxo turbulento.

De acordo com esta equação, a turbulência em cromatografia é favorecida com o uso de partículas maiores (maior dp). Atualmente, na cromatografia em fluxo turbulento (TFC) as partículas típicas apresentam diâmetro médio entre 30 a 60 um, ao invés de 3 a 5 µm como as utilizadas em HPLC ou inferiors a 2 um utilizadas em U-HPLC [3,4]. Pelo fato de empregarem partículas menores, as colunas utilizadas na cromatografia em fluxo turbulento (TFC) apresentam menor eficiência (N, número de pratos) do que as empregadas em HPLC e U-HPLC, servindo em um método analítico mais como uma etapa de preparo de amostras do que propriamente para o isolamento e quantificação do analito de interesse presente em amostras complexas.

2. Instrumentação

Apesar de fluxos turbulentos terem sido empregados inicialmente em cromatografia gasosa, e existirem algumas aplicações na cromatografia com fluido supercrítico, atualmente a grande maioria das publicações estão no nicho da cromatografia líquida.

Considerando a menor eficiência das colunas TFC em relação às de HPLC e U-HPLC, apesar desta técnica poder ser empregada com apenas uma coluna o enfoque mais usual atualmente é o emprego de uma coluna TFC em linha com uma de HPLC, em um

arranjo do tipo bi-dimensional (2D) (Figura 2). Na maioria das aplicações da TFC amostras biológicas são injetadas diretamente, sem prévia extração ou outro prétratamento, em uma coluna empacotada com partículas de tamanho maior – tipicamente entre 30 e 60 um – as quais operam em fluxos (vazões) superiors a 2 mL/min, gerando fluxos turbulentos. Como no caso de amostras biológicas a fase móvel, nesta etapa, é constituida de tampões aquosos, as moléculas dos analitos pequenos são retidas através de processos de difusão nos poros da fase estacionária, enquanto que o material proteico é removido e direcionada para o descarte (Fig. 2a). Após a remoção dos compostos de interesse da matriz para a coluna TFC eles são eluidos dela para a coluna analítica com um volume de solvente armazenado em uma alça (“loop”) instalada na primeira válvula (a da esquerda na Fig. 2), com auxílio de uma bomba operando em fluxos bastante inferiores aos empregados anteriormente. De forma a evitar alargamento da banda, os analitos são agora focalizados na forma de uma banda estreita na cabeça da coluna de HPLC (Fig.2b). Concluida esta etapa de focalização, através de um giro de válvula as colunas são isoladas e a coluna turbo é lavada e a alça preparada para a próxima etapa; enquanto isso a análise na segunda coluna é realizada usualmente com detecção por espectrometria de massas (MS).

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Cromatografia em fluxo turbulento

analitos presentes em baixas concentrações em um meio complexo.

Atualmente a técnica que emprega uma coluna de fluxo turbulento acoplada em linha com HPLC para a separação dos componentes de interesse e a análise qualitativa e quantitiva dos mesmos por espectrometria de massas em tandem, tem sido referida na literatura de forma simplificada como TFC-MS/MS.

3. Aplicações

Figura 2. Posição das válvulas de comutação emu ma montage típica empregada para Cromatografia em Fluxo Turbulento (TFC) bidimensional. A figura superior ilustra o arranjo das válvulas quando a amostra está no modo carga, enquanto que a figura inferior mostra o arranjo no modo transferência.

As primeiras colunas comercializadas para TFC apresentavam tamanho médio de particulas ao redor de 40 a 60 um, empacotadas em tubos de 5cm x 1 mm, e operavam em fluxos ao redor de 4 mL/min. A tendência atual consiste na diminuição do diâmetro interno da coluna para 0,5 mm, possibilitando atingir-se fluxos turbulentos operando a fase móvel ao redor de 1,5 mL/min. Um grande número de fases estacionárias para TFC, tanto baseadas em sílica quanto em polímeros sintéticos, é atualmente disponível comercialmente, possibilitando uma ampla seleção em função dos analitos de interesse.

Apesar de que em princípio qualquer detector de cromatografia liquida pode ser usado com a técnica, a escolha tem recaido quase que exclusivamente sobre a espectrometria de massas (MS ou MS/MS), devido à complexidade das amostras analisadas pela técnica e a necessidade de informações qualitativas a respeito de 208

Apesar do fluxo turbulento ser conhecido e estudado há mais de 100 anos [5] e haver sido discutido por vários pesquisadores na segunda metade do século XX [6-13], especialmente em seus aspectos teóricos, a técnica começou a despertar maior atenção como uma ferramente analítica prática somente após o trabalho de Quinn e colaboradores [14,15] envolvendo o acoplamento em linha entre a cromatografia em fluxo turbulento e a espectrometria de massas. Esses pesquisadores observaram que seriam capazes de separar moléculas pequenas de macromoléculas empregando uma coluna com tamanho de partículas e diâmetro interno apropriados, operando em fluxos elevados. As moléculas menores eram retidas na fase estacionária devido a seu coeficiente de transferência de massa elevado, e as macromoléculas não conseguiriam difundir dentro dos poros da fase estacionária devido ao elevado fluxo, sendo eliminadas para o descarte. No caso de amostras biológicas, onde a principal fonte de interferentes da matriz é a grande quantidade de proteinas, sua eliminação da presença dos analitos de interesse é uma das principais etapas de métodos analíticos “on-line”.

Os principais trabalhos referentes ao uso de cromatografia em fluxo turbulento publicados nos últimos 10 anos (2005-2014), encontra-se nas referencias 16 a 79. Grande parte destas aplicações encontra-se nas áreas de fluidos biológicos, resíduos de pesticidas e medicamentos veterinários em alimentos, e contaminantes em amostras ambientais.

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Cromatografia em fluxo turbulento

4. Conclusões

A cromatografia em fluxo turbulento (TFC) é uma variante das várias técnicas existentes com o objetivo de empregar duas dimensões acopladas em linha (on-line), também denominadas de cromatografia bi-dimensional (2D) ou, frequentemente, multidimensional. Neste caso, na primeira dimensão procura-se efetuar o que tradicionalmente é denominado genericamente de preparo da amostra: eliminação dos interferentes da matriz, concentração dos analitos de interesse e operações similares. Para tal pode-se empregar uma pequena coluna de HPLC com diferentes fases e mecanismos (RAM, MIP, NP, SEC,…), uma micro-técnica de preparo de amostra como SPME, SBSE, MEPS, e outras, ou uma coluna normal de HPLC, formando com a segunda dimensão um sistema LC-LC ou LCxLC, dependendo da montagem e operação da instrumentação. Na presente mini revisão discutiu-se o emprego de uma coluna operando em fluxo turbulento, como primeira dimensão.

Na segunda dimensão, geralmente emprega-se uma coluna analítica padrão, contendo fase estacionária que permite a separação do analito de interesse transferido

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da primeira para a segunda dimensão, através de uma válvula (por isso às vezes este enfoque é também denominado de “column switching”, além de 2D).

O uso deste arranjo, com uma coluna operando em fluxo turbulento na primeira dimensão, apresenta características importantes cujas vantagens podem ser exploradas a favor do analista. Uma das principais vantagens é o fato de permitir a eliminação do sistema de “clean up” das amostras, usualmente demorado, tedioso, sujeito a erros, e caro. Permite ainda um aumento da produtividade, através da automatização, e uma redução no uso de solventes sem perda da sensibilidade analítica. Frequentemente, também permite uma redução considerável no volume de amostra, e uma diminuição na degradação dos analitos de interesse pelo menor tempo de permanência dos mesmos no sistema.

Considerando os fatores a favor e contra, a TFC apresenta-se como uma alternativa bastante interessante e viável para a automatização de análises em matrizes complexas, como as de natureza biológica, sem necessidade de etapas prévias de tratamento da amostra.

Referências 1.

Lanças, F. M., “Cromatografia Líquida Moderna”, Editora Átomo, Campinas, 2009.

2.

Lanças, F.M., Scientia Chromatographica; 3(1), 17-23 (2011). DOI: 10.4322/sc.2011.002 ISSN 1984-4433

3.

Lanças, F.M., Scientia Chromatographica Vol.2 (2), 47-54, (2010).

4.

Lanças, F.M., v. 1 (4), 39-47 (2009).

5.

Reynolds,O (1883). Philosophical Transactions of the Royal Society 174: 935–982 (1883). DOI:10.1098/rstl.1883.0029. JSTOR.

6.

Knox, J. H., Anal. Chem., 38, 253 (1966)

7.

Myers, M. N., Giddings, J. C., Anal. Chem., 38, 294 (1966)

8.

Myers, M. N. Giddings, J. C., ibid,. 37, 1453 (1965)

9.

Smuts, T. W., Pretorius, V., Gas Chromatography, 1966, page 75 ( Littlewood, A. B., Ed., Elsevier, New York, 1967).

10. Pretorius, V., Smuts, T.W., Anal. Chem. 38, 275 (1966).

11. Purnell, J.H., Annu. Rev. Phys. Chem. 1967.18:81-98.

12. Ayrton, J., Clare, R. A., Dear, G. J., Mallett, D. N., Plumb, R. S., Rapid Commun. Mass Spectrom. (1999) 13, 1657.

13. Bauer, H., Chromatographia 27, 238 (1989).

14. Quinn, H.M., Takarewski, J.J., Int. Patent WO 97/16724 (1997).

15. Quinn, H.M., Takarewski, J.J., US Patent 5.919.368 de 6 de Julho de 1999.

Scientia Chromatographica 2014; 6(3):205-211 209

Lanças FM

Cromatografia em fluxo turbulento

16. Petrides,A.K., Moskowitz,J., Johnson-Davis,KL, Jannetto,P.J., Langman, L.J., Clarke,W., Marzinke, M.A., Clinical Biochemistry 47, 73-79 (2014).

17. Helfer,A.G., Meyer,R.M., Michely,J.A., Maurer,H.H., Journal of Chromatography A, 1325, 92-98 (2014).

18. Guo,F;, Liu,Q., Shi,J., Wei,F., Jiang,G., Talanta 119, 396-400 (2014).

19. De Pauwa, R., Choikhetb,K., Desmeta, G., Broeckhovena,K., Journal of Chromatography A, 1361, 277-285 (2014).

20. Gorga,M., Insab,S., Petrovic,M., Barcelo,D. Journal of Chromatography A, 1352, 29-37 (2014).

21. Fustinoni, S., Poledri, E., Mercadante, R., Rapid Commun. Mass Spectrom. 27, 1450-1460 (2013).

22. Füzéry, A.K., Breaud,A.R., Emezienna,N., Schools, S., Clarke,W.A., Clinica Chimica Acta 421, 79-84 (2013).

23. Modick,H., Schütze,A., Pälmke,C., Weiss,T., Brüning,T., Koch,H.M., Journal of Chromatography B, 925, 33-39 (2013).

24. Marzinke,M.A., Breaud,A.R., Clarke,W., Clinica Chimica Acta 417, 12-18 (2013).

25. Bousova, K., Senyuva, H., Mittendorf, K., Journal of Chromatography A, 1274, 19-27 (2013).

26. Bousova, K., Senyuva, H., Mittendorf, K., Food Add. & Contam. A 29, 1901-1912 (2012).

27. Perez, F., Llhorca, M., Farré, M., Barcelo, D., Anal. Bioanal. Chem. 402, 2369-2378 (2012).

28. Llorca,M., Pérez,F., Farré,M., Agramunt,S., Kogevinas,M., Barcelo, D., Science of the Total Environment 433, 151-160 (2012).

29. Lucci,P., Pacetti,D., Núñez,O., Frega,N.G., “Current Trends in Sample Treatment Techniques for Environmental and Food Analysis”, in Chromatography – The Most Versatile Method of Chemical Analysis, Ch.5, pg. 127-164, Intech (2012) http://dx.doi. org/10.5772/47736.

30. Xin,GZ, Cao,L., Shi,ZQ, Li,HJ, Wen,XD, Chen,J., Qi,LW, Li,P., Journal of Chromatography B, 899, 127-134 (2012).

31. Moeller,B.C., Stanley,S.D., Journal of Chromatography B, 905, 1-9, (2012).

32. Herman, J.L., Edge, T., Majors, R., LCGC 3, Issue 30, pp. 200-215 (2012).

33. Mueller, D.M., Rentsch, K.M., J Chromatogr B, 883-884, 189-97 (2012) doi: 10.1016/j.jchromb.2011.08.022. Epub 2011 Aug 24.

34. Couchman,L., Birch,M., Ireland, R., Corrigan, A., Wickramasinghe, S., Josephs, D., Spicer, J., Flanagan, R.J., Anal. Bioanal.

Chem. 403(6):1685-95. (2012) doi: 10.1007/s00216-012-5970-2.

35. He, X., Kozak, M., Anal. Bioanal. Chem. 402, 3003 (2012).

36. Yuan,C., Heideloff,C. Kizak,M., Wang, S., Clinical Chem. Lab. Med. 2011 Oct 8;50(1):95-103. doi: 10.1515/CCLM.2011.739.

37. Shi, Y., Chang J.S., Esposito, C.L., Lafontaine, C., Berube, M.J., Fink, J.A., Espourteille, F.A., Food Addit. Contam. Part A. 28, 1383-1393 (2011).

38. Schebb, N.H., Inceoblu, B., Rose, T., Wagner, K., Hammock, B.D., Anal. Meth. 3, 420-428 (2011).

39. Roach, J.A., DiBussolo, J.M., Krynitsky,A., Noonan, G.O., J. Chromatogr.A., 1218, 4284-4290 (2011).

40. Mueller, D.M., Duretz, C., Espourteille, F.A., Rentsch, K.M., Anal. Bioanal. Chem. 400, 89-100 (2011).

41. Rudewicz, P.J., Bioanalysis 2(4), 745-753(2010) 42. Browning, M.R., Drexler, D.M., Olah, T.V., Morgan D.G., Bioanalysis, 2, 745-753 (2010).

43. Kasper, D.C., Herman, J.L., De Jesus, V.R., Mechtler, T.P., Metz, T.F., Shushan, B., Rapid Commun. Mass Spectrom. 24, 986-994 (2010).

44. Bunch, D.R., Heideloff, C., Ritchie, J.C., Wang, S., J. Chromatogr. B., 878, 3255-3258 (2010).

45. Harlan, R., Clarke, W., Di Bussolo, J.M., Kozak, M., Straseski, J., Meany, D.L., Clin. Chim. Acta, 411, 1728-1734 (2010).

46. Stolker, A.A., Peters, R.J., Zuiderent, R., DiBussolo, J.M., Martins, C.P., Anal. Bioanal. Chem. 397, 2841(2010).

210

Scientia Chromatographica 2014; 6(3):205-211

Cromatografia em fluxo turbulento

Lanças FM

47. Michopoulos, F., Edge, A.M., Theodoridis, G., Wilson, I.D., J. Sep. Sci. 33, 1472-1479 (2010).

48. Mueller, D.M., Rentsch, K.M., J. Chromatogr.B, 878, 1007-1012 (2010).

49. Breaud, A.R., Harlan, R., Di Bussolo, J.M., McMillin, G.A., Clarke, W., Clin. Chim, Acta 411, 825-832 (2010).

50. Siemerink, M., Schell, N.H., Liesener, A., Perchuc A.M., Schoni, R., Wilmer, M., Hayen,H., Harst, U., Vogel, M., Rapid Commun.

Mass Spectrom. 24, 687-697 (2010) 51. Xin, G.Z., Zhou, J.L., Qi, L.W., Liu, C.Y., Liu, P., Li, H.J., Wen, X.D., Li, P., J. Chromatogr. B. 878, 435-441 (2010).

52. Verdirame, M., Veneziano, M., Alfieri, A., Di Marco, A., Monteagudo, E., Bonelli, F., J. Pharm. Biomed. Anal. 51, 834-841 (2010).

53. Kinsella B, Oâ&#x20AC;&#x2122;Mahony J, Malone E, Moloney M, Cantwell H, Furey A, Danaher M J. Chromatogr. A 1216, 7977-8015 (2009).

54. Chassaing, C., Robinson, S., Chromatography Today, 2 (3) 20-24 (2009).

55. Bunch, D.R., Miller, A.Y., Wang, S., Clin. Chem. Lab. Med. 47, 1565-1572 (2009).

56. Presta, M.A., Bruyneel, B., Zanella, R., Kool, J., Krabbe, J.G., Lingeman, H., Chromatographia 69, 167-173 (2009).

57. Xu, Y;, Wilson, K.J., Anderson, M.D., Musson, D.G., Miller-Stein, C.M., Woolf, E.J., J. Chromatogr. B. 877, 1634-1642 (2009).

58. Krebber, R., Hoffend, F.J., Ruttmann, F., Anal. Chim. Acta 637, 208-213 (2009).

59. Zhou, J.L., An, J.J., Li, P., Li, H.J., Jiang, Y., Cheng, J.F., J. Chromatogr. A 1216, 2394-2403 (2009).

60. Segura, P.A., Gagnon, C., Sauve, S., Chromatographia 70, 239-245 (2009).

61. Marazuela, M.D. & Bogialli, S., Anal. Chim. Acta, 645:5-17 (2009).

62. Wang, S., Miller, A., Clin. Chem. Lab. Med. 46, 1631-1634 (2008).

63. Du, L., White, R.L., Rapid Commun. Mass Spectrom. 22, 3363-3370 (2008).

64. Xu, Y., Wilson, K.J., Musson, D.G., J. Chromatogr.B. 863, 64-73 (2008).

65. Zeng, W., Musson, D.G., Fisher, A.L., Chen, L., Schwartz, M.S., Woolf, E.J., Wang, A.Q., J. Pharm. Biomed. Anal. 46, 534-542 (2008).

66. Mottier, P., Hammel, Y.A., Gremaud, E., Guy, P.A., J. Agric. Food Chem., 56, 35-43 (2008).

67. Turpenny, P., Fraier, D., Chassaing, C., Duckworth, J., J. Chromatogr. B. 856, 131-140 (2007).

68. Smalley, J., Marino, A.M., Xin, B., Olah, T., Balimane, P.V., J. Chromatogr. B. 854, 260-267 (2007).

69. Xu, R.N., Fan, L., Rieser, M.J., El-Shourbagy, T.A., J. Pharm. Biomed. Anal. 44, 342-355 (2007).

70. Mullet, W.M., J. Biochem. Biophys. Meth. 70, 263-273 (2007).

71. Sauvage, F.L., Gaulier, J.M., Lachatre, G., Marquet, P., Ther. Drug Monit. 28, 123-130 (2006).

72. Smalley, J., Kadiyala, P., Xin, B., Balimane, P., Olah, T., J. Chromatogr. B. 830, 270-277 (2006).

73. Zeng, W., Musson, D.G., Fisher, A., Wang, A.Q., Rapid Commun. Mass Spectrom. 20, 1169-1175 (2006).

74. Liesener, A., Karst, U., J. Sep. Sci. 28, 1658-1665 (2005).

75. Zhou, S., Zhou, H., Larson, M., Miller, D.L., Mao, D., Jiang, X., Naidong, W., Rapid Commun. Mass Spectrom. 19, 2144-2150 (2005).

76. Herman J.L., Rapid Commun. Mass Spectrom. 19, 696-700 (2005).

77. Xu, X.S., Yan, K.X., Song, H., Lo, M.W., J. Chromatogr. B. 814, 29-36 (2005).

78. Chassaing, C., Stafford, H., Luckwll, J., Wright, A., Edgington, A., Chromatographia 62, 17-24 (2005).

79. Vintiloiu,A., Mullett,W.M., Papp,R., Lubda,D., Kwong, E., Journal of Chromatography A, 1082, 150-157 (2005).

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Publicação disponível na internet:

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IIC

O Instituto Internacional de Cromatografia (IIC) possui como uma de suas principais missões o oferecimento de cursos de curta duração nas áreas de cromatografia e técnicas relacionadas.

Os objetivos dos cursos do IIC são o aprimoramento/formação/ atualização dos usuários das técnicas cromatográficas e afim (Preparo de Amostras, Espectrometria de Massas, Gestão da Qualidade, dentre outras), tanto do ponto de vista teórico quanto prático.

A filosofia educacional do IIC é: “ao invés de ensinar apenas como operar um equipamento específico (dar o peixe) o IIC ensina a técnica (como pescar)”.

Os cursos do Instituto Internacional de Cromatografia são coordenados pelos Diretores do IIC, e ministrados pelos coordenadores, auxiliados por uma equipe técnica e científica altamente qualificada, constituída de docentes pósgraduados nos melhores centros do país na área, e pós‑graduandos em fase de conclusão de suas teses. Na época em que cada curso for oferecido, uma relação dos instrutores é disponibilizada no website do IIC. O programa detalhado de cada curso pode ser obtido através de contacto com o IIC. Os cursos são ministrados com auxílio de recursos audiovisuais modernos (datashow‑computador; vídeos, demonstrações, resolução de problemas e outros recursos instrucionais). Os alunos recebem um livreto contendo cópia de todos os slides apresentados pelos instrutores, além de material bibliográfico de apoio. Em vários cursos também são fornecidos livros de autoria dos próprios docentes dos cursos. A maior parte dos cursos também tem aulas práticas de laboratório, conforme anunciado no folheto explicativo de cada curso.

Observações: • O I.I.C. oferece também cursos “in-house” (“in-company”). Interessados nesta modalidade devem contatar o IIC para obter mais detalhes.

• Com exceção dos cursos da área da qualidade (ISO, Validação e Auditoria) todos os demais possuem aulas teóricas e práticas de laboratório.

• O oferecimento efetivo de um curso depende de um número mínimo de inscritos no mesmo.

• O número de vagas dos cursos que envolvem laboratório está sendo limitado para melhor aproveitamento dos participantes.

• Visite o website www.iicweb.org para obter mais informações.

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O IIC recomenda este livro para todos os interessados em iniciar-se ou ­atualizar-se nesta técnica.

Cromatografia em Fase Gasosa - Fernando M. Lanças Livro de autoria do Prof. Lanças, abordando todos os princípios básicos: instrumentação, análise qualitativa e quantitativa, detectores e muitos outros aspectos da Cromatografia Gasosa.

Altamente recomendado para os iniciantes na técnica, os quais encontrarão explicações detalhadas e simples a respeito da maior parte dos fundamentos básicos da técnica.

Extração em Fase Sólida - Fernando M. Lanças De autoria do Prof. Lanças, este livro apresenta e discute as várias formas de extração em fase sólida (SPE), desde a mais clássica empregando cartuchos até as mais atuais como discos, placas, ponteiras, e outras. Também discute os princípios da micro extração em fase sólida (SPME) e da extração por sorção em barras de agitação (SBSE).

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CALENDÁRIO DE CURSOS | 2015

Código da Disciplina

Mês

Data

Nome da Disciplina

Carga Horária

LC-01

Março

25 a 27

Cromatografia Líquida Básica – (HPLC/CLAE)

24

GC-01

Abril

15 a 17

Cromatografia Gasosa Básica – (HRGC)

24

SP-01

Maio

13 a 15

Técnicas Modernas de Preparo de Amostras

24

LC-04

Junho

18 e 19

Prever, evitar e resolver problemas em LC

16

CRO-00

Junho/Julho

30/06 a 03/07

Técnicas Cromatográficas de Análise

32

LC-01

Julho

15 a 17

Cromatografia Líquida Básica – (HPLC/CLAE)

24

GC-MS-01

Julho

28 a 31

Acoplamento GC-MS e GC-MS/MS

32

LC-MS-01

Agosto

18 a 21

Acoplamento LC-MS e LC-MS/MS

32

LC-02

Setembro

02 a 04

Cromatografia Líquida Moderna – Avanços

24

LC-06

Setembro

24 e 25

Otimização de Métodos em HPLC

16

GC-MS-01

Outubro

20 a 23

Acoplamento GC-MS e GC-MS/MS

32

LC-MS-01

Novembro

17 a 20

Acoplamento LC-MS e LC-MS/MS

32

LC-01

Dezembro

02 a 04

Cromatografia Líquida Básica – (HPLC/CLAE)

24

GC-01

Dezembro

09 a 11

Cromatografia Gasosa Básica – (HRGC)

24

CURSOS COM TEORIA E PRÁTICA

Os cursos promovidos pelo IIC são ministrados por docentes e convidados, e abordam vários temas de grande relevância no momento.

Consulte-nos em relação à valores e descontos especiais, bem como sobre transporte e hospedagem.

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CALENDÁRIO DE EVENTOS | 2015

ISCC GCxGC 2015 “39th International Symposium on Capillary Chromatography and 12th GCXGC Symposium” 17-21 May 2015 Information: http://www.isccgcxgc2015.com/ 63rd ASMS Conference “Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics”.

31 May 2015 - 04 Jun 2015 St Louis, USA Information: http://www.asms.org/ HPLC 2015 “42nd International Symposium on High Performance Liquid Phase Separations and Related Techniques” 21-25 Jun 2015 Geneva, Switzerland Information: http://www.imsc2014.ch/ PEFTEC 2015 “Monitoring and analytical technologies for the Petroleum, Refining and Environmental Industries”.

18-19 Nov 2015 Antwerp, Belgium Information: http://www.peftec.com/

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NORMAS PARA PUBLICAÇÃO

Normas para publicação de artigos no Scientia Chromatographica (a versão detalhada está disponível em nosso portal www.scientiachromatographica.com).

Escopo

Scientia Chromatographica publica trabalhos em todas as áreas da Cromatografia, incluindo GC (colunas capilares, empacotadas, preparativas), LC (convencional, HPLC, U-HPLC, Prep-LC, micro-LC, nano-LC, TLC, PC), SFC (colunas empacotadas ou capilares), Técnicas Acopladas (GC-MS, LC-MS, SFC-MS, LC-GC, SFE-CE, GCxGC, LCxLC) e Técnicas de Preparo de Amostras (SPME, SBSE, MEPS, QuEChERS, LLE, MAE,SPE, LLE, etc.). A partir de 2012 o Scientia publica os seguintes formatos de artigos: • Artigos Originais de Pesquisa • Comunicação (“Short Communication”) • Artigos de Revisão Crítica Os artigos de Revisão Crítica deverão antes de sua submissão serem discutidos com um dos c­o-editores mais relacionados ao assunto em questão. Devem conter uma contribuição nova a respeito de um assunto de grande interesse atual, incluindo uma discussão a respeito das vantagens e desvantagens do mesmo. O Scientia não publica apenas relato de artigos descritos na literatura, sem uma discussão crítica sobre os mesmos.

Os artigos Originiais de Pesquisa deverão conter resultados de laboratório e/ou teóricos, que signifiquem uma contribuição expressiva para a área de técnicas de separação, seja ela conceitual, na instrumentação, ou na aplicação.

Os artigos do tipo Comunicação deverão ter a mesma qualidade dos artigos Originais, porém devido a seu caráter de comunicação preliminar usualmente são de menor extensão.

Envio do Artigo

Os artigos deverão ser encaminhados para periodico@scientiachromatographica.com. Os artigos do tipo Revisão deverão antes de seu envio pelo website ter o aval de um dos co-Editores do periódico, caso contrário não serão avaliados.

Todos os artigos, independentemente do formato, deverão ser submetidos exclusivamente ao Scientia, com o entendimento de que eles não foram anteriormente submetidos, não estão sendo e não serão posteriormente publicados em outro veículo.

Autores que utilizarem tabelas, ilustrações, figuras, ou textos contendo mais de 25 palavras, anteriormente publicados em outro periódico – sendo ou não autores do artigo – deverão obter a devida permissão por escrito do portador dos direitos de cópia (“Copyright ”). Esse documento deverá permanecer de posse dos autores, sendo encaminhado ao Scientia, quando solicitado.

Idioma

Os artigos, com exeção dos de Revisão, podem ser escritos preferencialmente em inglês, porém em Português e Espanhol também serão aceitos. Os autores cujo idioma nativo não for o empregado na redação do artigo são orientados a solicitar a colaboração de colegas fluentes no idioma, antes de enviar o artigo para o periódico.

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NORMAS PARA PUBLICAÇÃO

Tipos de contribuições aceitas para publicação no Scientia O Scientia Chromatographica considera para publicação quatro tipos de contribuição:

Artigos Originais de pesquisa: descrevem resultados de estudos completos. Deverão conter resultados de laboratório e/ou teóricos, que signifiquem uma contribuição expressiva para a área de técnicas de separação, seja ela conceitual, na instrumentação, ou na aplicação. Este tipo de contribuição é limitado a 6.000 palavras, incluindo as legendas das figuras e as referências, e no máximo 5 tabelas e/ou figuras somados. No momento do envio da prova de impressão, caso isto ocorra o autor será consultado se prefere revisar o artigo para enquadrá-lo em até 7 páginas, ou se prefere pagar as páginas excedentes. O número de páginas de um artigo depende muito das figuras e tabelas do mesmo. Este critério não é aplicado aos artigos convidados, cujo número de páginas será informado ao autor no momento do convite.

Comunicações (“Short Communication”): são artigos completos, porém que relatam resultados mais curtos, oportunos, e/ou cuja relevância requer sua rápida publicação. Deverão ter a mesma qualidade dos artigos Originais porém, devido a seu caráter de comunicação preliminar, usualmente são de menor extensão. Este tipo de publicação deve ter no máximo quatro páginas impressas, incluindo todo o artigo, ou seja, tabelas, figuras e referências. O autor deve indicar claramente que se trata de uma comunicação no topo da primeira página do artigo.

Artigos de Revisão crítica: revisões críticas sobre uma area específica das técnicas cromatográficas e relacionadas são também consideradas para publicação. Esses artigos devem se limitar a no máximo 10.000 palavras, incluindo as legendas, e até 10 tabelas e figuras somadas. Os artigos de Revisão Crítica deverão antes de sua submissão serem discutidos com um dos co-Editores mais relacionados ao assunto em questão. Artigos não encaminhados desta forma serão antes enviados a um co-Editor da área em que se enquadre para parecer e, somente então, serão enviados aos revisores, podendo atrasar significativamente sua publicação. Devem conter uma contribuição nova a respeito de um assunto de grande interesse atual, discutindo as vantagens e desvantagens do mesmo. O Scientia não publica apenas relato de artigos descritos na literatura, sem uma discussão crítica sobre os mesmos.

Artigos de Alta Prioridade: são publicados no primeiro número disponível do periódico, recebendo prioridade máxima de todo o sistema Editorial do periódico. Para justificar sua publicação como alta prioridade, os manuscritos deverão apresentar, de forma resumida, resultados importantes de recentes desenvolvimentos na área de cromatografia e técnicas relacionadas (espectrometria de massas, preparo de amostras, eletroforese capilar e outros). Não precisam conter resultados experimentais detalhados, sendo limitados a 2.500 palavras e três figuras e/ou tabelas combinadas.

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Scientia Chromatographica Corpo Editorial Consultivo

Editor-in-Chief

Fernando M. Lanças Universidade de São Paulo Instituto de Química de São Carlos 13560-970 São Carlos (SP) - Brasil editor@scientiachromatographica.com

Editores Associados

Carol H. Collins Pilares da Cromatografia

Maria E. Queiroz Preparo de Amostras

Cláudia Zini Cromatografia Gasosa

Elina B. Caramão Cromatografia Gasosa

Daniel Armstrong – EUA Dietrich von Bauer – Chile Fábio Augusto – Brasil Fátima Dutra – Brasil Flávio Leite – Brasil Frank Svec – EUA Harold McNair – EUA Humberto Gómez – México Isabel Cristina Sales Fontes Jardim – Brasil Jailson B. de Andrade – Brasil Janusz Pawliszyn – Canadá Kiyoratsu Jinno – Japão Luigi Mondello – Itália Marcos Eberlin – Brasil Marina Tavares – Brasil Milos Novotny – EUA Milton Lee – EUA Norberto Peporine Lopes – Brasil Phillip Marriott – Australia Pierina Bonato – Brasil Quézia Cass – Brasil Renato Zanella – Brasil Endereço do Periódico

Elena Stashenko Espectrometria de Massas

Pierina Sueli Bonato Técnicas Eletroforéticas

Scientia Chromatographica Rua Princesa Isabel, 265 - Jardim Paraíso 13.561-140 - São Carlos (SP) - Brasil Fone/Fax: (16) 3501-4140 karen.favaro@iicweb.org / info@iicweb.org www.scientiachromatographica.com

Ficha catalográfica elaborada pela Seção de Aquisição e Tratamento da Informação do SBI/IQSC Fabio Augusto Cromatografia Gasosa

Álvaro J. Santos Neto Troubleshooting

Scientia Chromatographica / Associação Internacional de Cromatografia. - vol.6 n.3 (jul./set. 2014). São Carlos: Associação Internacional de Cromatografia, 2014 Trimestral ISSN 1984-4433 1. Cromatografia. 2. Lanças, Fernando Mauro, editor chefe.

Isabel C. S. Fontes Jardim HPLC

Renato Zanella Preparo de Amostras

CDD 543.8

ISSN 1984-4433

www.scientiachromatographica.com

2014

Volume 6 | Número 3

SCIENTIA CHROMATOGRAPHICA

Publicação disponível na internet:

155 Determinação da razão isotópica do carbono por GC-C-IRMS utilizando extração HS-SPME em matrizes complexas naturais de interesse alimentar

2014 | Volume 6 | Número 3

Ana Gabriela Buglia, Luisa Schipilliti, Luigi Mondello

166 Análise de estatinas em plasma humano por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas utilizando microextração em fase sólida e derivatização in situ no preparo de amostra Natalia M. S. Sattolo, Paulo C. F. Lima Gomes, Álvaro J. Santos-Neto, Fernando M. Lanças

175 Estudo para a determinação de herbicidas da classe das triazinas por extração no ponto nuvem (CPE) Raquel Thomaz da Silva, Bárbara Fernanda Sanchez Razaboni, Gilberto Abate

186 Microextração líquido-líquido dispersiva (DLLME): fundamentos, inovações e aplicações biológicas Bruna Juliana Moreira, Jennifer Michiko Chauca Yokoya, Cristiane Masetto de Gaitani

205 Cromatografia em fluxo turbulento (TFC) Fernando M. Lanças

Rua Princesa Isabel, 265 - Jardim Paraíso São Carlos (SP) - CEP 13561-140 Fone/ Fax: (16) 3501-4140 | www.iicweb.org

2014 | Volume 6 | Número 3

Instituto Internacional de Cromatografia

Uma publicação do Instituto Internacional de Cromatografia www.iicweb.org