Sc v5n3

Scientia Chromatographica Revista Trimestral do Instituto Internacional de Cromatografia

2013 | Volume 5 | NĂşmero 3

SUMÁRIO

Editorial ................................................................................................................... 165

PREPARO DE AMOSTRAS Recentes avanços da in-tube SPME-LC para bioanálises .............. 167 Maria Eugênia C. Queiroz, Lidervan P. Melo

PREPARO DE AMOSTRAS Perspective: Hollow fibre liquid-phase microextraction – principles, performance, applicability, and future directions ...............................181 Astrid Gjelstad, Stig Pedersen-Bjergaard

PREPARO DE AMOSTRAS Avanços recentes da MSPD para extração de resíduos de agrotóxicos, PPCPs, compostos inorgânicos e organometálicos....................... 190 Sergiane Souza Caldas, Caroline Rombaldi, Maristela Barnes Rodrigues Cerqueira, Bruno Meira Soares, Ednei Gilberto Primel

PREPARO DE AMOSTRAS Análise enantiosseletiva de fármacos e metabólitos em matrizes biológicas empregando técnicas miniaturizadas de preparação de amostras .................................................................................. 214 Nayara Cristina Perez de Albuquerque, Marcela Armelim Bortoleto, Anderson Rodrigo Moraes de Oliveira

CROMATOGRAFIA GASOSA Avaliação de fragrância em detergente em pó por microextração em fase sólida e cromatografia gasosa ............................................ 229 Robson Bonfim Godinho, Carla Beatriz Grespan Bottoli

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Scientia Chromatographica 2013; 5(3)

Scientia Chromatographica 2013; 5(3):165 Instituto Internacional de Cromatografia http://dx.doi.org/10.4322/sc.2014.001

EDITORIAL

ISSN 1984-4433

O 15th International Symposium on Advances in Extraction Technologies (ExTech-2013) reuniu em João Pessoa-PB, entre os dias 05 e 07 de agosto de 2013, especialistas da área de preparo de amostras de diferentes setores de atuação, tais como acadêmico e industrial, bem como estudantes de graduação e pós-graduação. O evento reuniu mais de 200 participantes de diversas regiões do Brasil e do exterior, levando a interação, troca de experiências e discussão de trabalhos de ponta na área de preparo de amostras. Além disso, minicursos sobre diversos assuntos na área de preparo de amostras – desde fundamentos até a automação do preparo – foram oferecidos. O evento contou com diversas palestras de especialistas nacionais e do exterior da academia, sessões orais apresentadas por estudantes de graduação e pós-graduação, e seminários técnicos apresentados por especialistas de empresas. Diversas atividades sociais e a concentração dos participantes no Hotel Tambaú permitiram um maior contato entre especialistas e entre especialistas e estudantes, tornando o evento mais produtivo para todos e possibilitando a formação de novas redes de cooperação entre grupos nacionais e internacionais.

Maria Eugênia Queiroz Nassur Eduardo Carasek da Rocha Editores Convidados

Scientia Chromatographica 2013; 5(3)

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Scientia Chromatographica 2013; 5(3):167-179 Instituto Internacional de Cromatografia

PREPARO DE AMOSTRAS

DOI: http://dx.doi.org/10.4322/sc.2014.002 ISSN 1984-4433

Recentes avanços da in-tube SPME-LC para bioanálises Maria Eugênia C. Queiroz*, Lidervan P. Melo Departamento de Química, Faculdade de Filosofia Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo – USP, Cep 14040-901, Ribeirão Preto, SP, Brasil e-mail: mariaeqn@ffclrp.usp.br

Resumo O sistema in-tube SPME-LC realiza extração contínua, concentração e injeção utilizando o injetor automático. Esta técnica é usualmente usada em combinação com a cromatografia líquida de alta eficiência ou com a cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas. Esta técnica tem sido aplicada com sucesso na determinação de fármacos em fluidos bilógicos. Neste artigo de revisão, os autores discutem os recentes avanços no desenvolvimento de fases estacionárias para o aumento da sensibilidade de métodos cromatográficos para bioanálises.

Palavras-chave Microextração em fase sólida; drogas; fluidos biológicos; fases estacionárias seletivas.

Recent advances on in-tube SPME-LC for bioanalysis Abstract On-line in-tube SPME-LC performed continuous extraction, concentration, desorption, and injection using an autosampler. This technique is usually used in combination with high performance liquid chromatography and liquid chromatography-mass spectrometry. This technique has successfully been applied to the determination of drugs in biological fluids. In this review, the authors discuss the recent advances in the development of selective stationary phases to increase the sensitive of the chromatography methods for bioanalysis.

Keywords In-tube solid-phase microextraction; drugs; biological fluids; selective stationary phases.

Queiroz MEC, Melo LP

1 Introdução Os fluidos biológicos são amostras complexas constituídas por ácidos, bases, sais, proteínas, enzimas, assim como outras substâncias orgânicas com estruturas químicas similares aos analitos, como os fármacos de uso concomitante. Desta forma, estas amostras biológicas não podem ser introduzidas diretamente, no seu estado in natura, em sistemas cromatográficos.

Estes interferentes podem suprimir a ionização dos analitos, durante o processo de ionização nas análises por cromatografia líquida com detector de espectrometria de massas (LC-MS), coeluir com os analitos durante a separação cromatográfica (LC-UV), ou adsorver de forma irreversível junto à coluna analítica, modificando a retenção dos analitos e diminuindo o tempo de vida útil da coluna.

1.1 In-tube SPME-LC A in-tube SPME-LC utiliza uma coluna capilar como dispositivo de extração em fase sólida (Figura 1), a qual tem sido acoplada em linha com os sistemas de HPLC, LC-MS ou CE, permitindo a automação do processo de extração.

A técnica in-tube SPME-LC, geralmente, utiliza um capilar de sílica fundida aberto revestido internamente com fase estacionária quimicamente ligada (Figura 1A), como as colunas capilares de cromatografia em fase gasosa.

Capilares de poli-éter-éter cetona (PEEK) recheados com tubos de sílica fundida com revestimento interno ou externo (Figura 1B), capilares de PEEK recheados com partículas sólidas adsorventes (Figura 1C), ou ainda capilares de sílica fundida com fase monolítica (Figura 1D)

Desta forma, a análise de fármacos em fluidos biológicos requer a etapa do preparo da amostra, para a eliminação da maioria dos interferentes e pré-concentração dos fármacos, quase sempre presente em níveis de traços.

também têm sido utilizados.

Em razão da baixa volatilidade e caráter mais polar da maioria dos fármacos, a cromatografia líquida de alta eficiência tem sido a técnica analítica de referência para a análise de fármacos e seus metabólitos em fluidos biológicos.

utilizadas como dispositivo extrator, ampliando

A química analítica moderna tem sido direcionada para a simplificação através da miniaturização dos sistemas analíticos. Este procedimento facilita a hifenação de técnicas, a minimização do consumo de solvente orgânico, do volume da amostra, do tempo da análise, e a utilização de tecnologias ambientalmente corretas, em direção ao cuidado preventivo do meio ambiente.

Neste contexto, destacamos a microextração em fase sólida acoplada à cromatografia líquida, denominada in-tube SPME-LC que permite a extração, dessorção e injeção contínua, utilizando o injetor automático LC. 168

Avanços da in-tube SPME-LC

Uma das vantagens desta técnica é a disponibilidade de várias colunas capilares de GC (diferentes seletividades), as quais podem ser assim o leque das aplicações.

Geralmente, o sistema in-tube SPME-LC é montado fixando-se a coluna capilar de sílica fundida aberta, revestida internamente com a fase extratora (como por exemplo, um pedaço de coluna capilar GC, 60-70 cm), entre a alça de amostragem e a agulha do injetor automático do LC. Para o processo de extração (válvula do injetor LC na posição carregar), uma alíquota da amostra, presente no frasco do injetor automático LC, é aspirada, transportada para a coluna capilar e dispensada novamente no frasco, à vazão constante, Figura 2a. Estas etapas são denominadas como ciclos aspirar/dispensar, as quais são executadas repetitivamente, segundo programa do injetor automático.

Scientia Chromatographica 2013; 5(3):167-179

Avanços da in-tube SPME-LC

Quando atingido o equilíbrio de sorção, os analitos pré-concentrados no capilar são rapidamente dessorvidos da fase estacionária através da percolação da fase móvel, após posicionar a vál-

Queiroz MEC, Melo LP

vula do injetor LC na posição injetar (Figura 2b).

Os analitos dessorvidos são transportados para a coluna analítica (LC) para separação cromatográfica e posterior detecção. Diferentes detectores, tais como UV, arranjo de diodos, fluorescência e de espectrometria de massas têm sido utilizados em linha com o sistema in-tube SPME-LC. Outra forma de montar o sistema in-tube SPME-LC é conectar a coluna capilar junto à válvula de seis pórticos do LC. Com a válvula do injetor LC na posição carregar, a amostra é injetada no capilar e após limpeza do sorvente com solvente fraco para a remoção dos compostos endógenos da matriz, a válvula é colocada na posição injetar e a fase móvel é percolada pelo capilar para dessorção dos analitos e transporte para a coluna analítica (Figura 3).

As condições experimentais in-tube SPME (fase estacionária, dimensões do capilar, volume de amostra, pH e força iônica da amostra, vazão da amostra, número de ciclos aspirar/dispensar

Figura 1 Configurações dos dispositivos de extração in-tube SPME (A) coluna capilar de sílica fundida com revestimento polimérico, (B) capilar PEEK recheado com tubos de sílica fundida com revestimento interno ou externo, (C) capilar de PEEK recheado com sólidos adsorventes e (D) capilar recheado com fase monolítica. Adaptado de Kataoka et al.[1] (2009).

e modo de dessorção) têm sido otimizadas para aumentar a eficiência da extração e diminuir o tempo da análise. Ensaios realizados em condições experimentais que representam o equilíbrio de sorção do analito com a fase extratora apresentam maior precisão analítica.

Figura 2 Esquema do processo in-tube SPME. (a) extração e (b) dessorção. Adaptado de Kataoka et al.[2] (1999).

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Queiroz MEC, Melo LP

Avanços da in-tube SPME-LC

Figura 3 Sistema in-tube SPME-LC com a fase RAM (partículas hidrofóbicas revestidas com albumina sérica bovina) para análise de interferon em amostras de plasma. Adaptado de Chaves et al.[3] (2011).

2 Fases estacionárias

com solução etanóica de aminopropiltrietoxisilano (APTES) foi revestido com polipirrol por

Dentre as fases estacionárias disponíveis

polimerização química através da percolação das

no comércio, a Omegawax 250 (polietilenogli-

soluções do monômero e da solução oxidante [Fe

col) (Tabela 1)[4], Sulpel Q-PLOT (polímeros

(ClO4)3] sob fluxo de N2, (Figura 4). Este capilar

porosos derivados de estireno-divinilbenzeno) (Tabela 1)[5-8] e OV1701 (14% cianopropilfenil metilpolisiloxano) (Tabela 1)[9], têm sido as mais utilizadas para análises de fármacos em fluidos biológicos. Com o objetivo de aumentar a sele-

mitindo a reutilização em centenas de extrações.

O método PPY in-tube SPME-LC apresentou limites de quantificação de 10 a 15 ng mL–1, os quais permitiram análise enantiosseletiva de

tividade dos métodos cromatográficos, algumas

fluoxetina e seu principal metabólito em níveis

fases estacionárias, tais como, poli(pirrol), mate-

plasmáticos que contemplam o intervalo tera-

rial de acesso restrito, imunossorvente, políme-

pêutico, Figura 5.

ros impressos molecularmente e monolítica têm sido desenvolvidos (Labmade) para análises de fármacos em fluidos biológicos.

O desenvolvimento de fases sorbentes com material de acesso restrito (RAM – restricted acess media), tem permitido a introdução direta

O poli(pirrol) (PPY), em razão de sua per-

de fluidos biológicos em sistemas cromatográfi-

meabilidade (estrutura porosa) e propriedades

cos, reduzindo o tempo da análise. As fases de

multifuncionais, que resultam em interações

acesso restrito possuem uma superfície hidrofí-

intermoleculares

dipolo-dipolo,

lica biocompatível na parte externa e hidrofóbica

hidrofóbica, π−π e ligação de hidrogênio com os

(suportes de sílica, C8 ou C18) no interior dos

analitos foi avaliado como fase extratora para in-

poros da partícula do sorbente. As macromolé-

-tube SPME para análise de enantiosseletiva de

culas são excluídas por uma barreira física ou de

fluoxetina e seu principal metabólito (norfluoxe-

difusão química. Já as moléculas pequenas (fár-

tina) em amostras de plasma para fins de moni-

macos) penetram nos poros (hidrofóbicos) e são

ácido-base,

[10]

170

mostrou-se estável nas condições de análise, per-

torização terapêutica . Um capilar de sílica

sorvidos, através do processo de partição. Mullett

fundida (60 cm × 0,25 mm d.i.), após silanização

and Pawliszyn[11] desenvolveram um capilar de Scientia Chromatographica 2013; 5(3):167-179

Avanços da in-tube SPME-LC

Queiroz MEC, Melo LP

PEEK recheado com fase a RAM, ou seja, super-

(BSA)[3]. O material biocompatível (C18-BSA)

fície hidrofílica (diol, ADS) na parte externa e

permitiu análise direta das amostras de plasma

hidrofóbica (octadecilsilano, C18) no interior dos

diluídas em solução tampão, sem remoção pré-

poros da partícula do sorvente para análises de

via das proteínas.

benzodiazepínicos em amostras de soro.

As fases imunossorventes, onde o meca-

Os interferons, biofármacos, são um grupo

nismo de sorção é baseado no reconhecimento

de glicoproteínas que atuam nas imunidades

molecular, têm sido desenvolvidas através da

inata e adaptativa, e possuem diversas proprieda-

imobilização (ligações covalentes) de anticorpos

des, como antiviral/antibacteriana, antitumoral,

(específicos do analito) na superfície interna do

antiproliferativa e imunomoduladora. A Figura 3

capilar de sílica fundida[12]. Chaves and Queiroz[13]

ilustra o sistema in-tube SPME-LC montado

(Tabela 1) comprovaram a especificidade das

para análise de interferon em amostra de plasma

interações antígeno-anticorpo (monoclonais)

com a fase biocompativel composta por partícu-

através das análises in-tube SPME/LC de inter-

las C18 revestidas com albumina sérica bovina

feron em amostras de plasma para fins de monitorização terapêutica. O tubo capilar de sílica fundida foi primeiramente ativado com APTES e glutaraldeído, liberando o grupo amina primário sobre a superfície. Após extensa lavagem com água nanopura, a superfície de glutaraldeído ativada foi reagida com uma solução de anticorpo monoclonal em solução salina tamponada com fosfato. Os grupos aldeídos remanescentes na superfície, foram desativados com uma solução

Figura 4 Desenvolvimento do capilar de PPY por polimerização química.

de etanolamina. A linearidade do método desenvolvido in-tube SPME-LC imunossorvente para

Figura 5 Cromatogramas referentes às análises por in-tube SPME-LC com a fase de PPY (a) Amostra de plasma (branco de referência), (b) amostra de branco de referência enriquecida com fluoxetina e norfluoxetina na concentração de 300 ng/mL, (c) amostra de plasma de paciente em terapia com fluoxetina. Adaptado de Silva et al.[10] (2009).

Scientia Chromatographica 2013; 5(3):167-179

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Queiroz MEC, Melo LP

Avanços da in-tube SPME-LC

análises de α-interferon em amostras de plasma

soro. Zhang et al.[16] sintetizaram a fase MIP em

resultou em concentrações que variam de 0,006

capilar de sílica fundida para a in-tube SPME off-line para análises LC-UV de 8-hidroxi-2`-deoxiguanosina em amostras de urina. O sistema in-tube SPME (off-line) foi montado com o auxílio de uma bomba seringa.

(limite de quantificação) a 3,0 MIU mL–1. O capilar in-tube SPME imunosorvente foi reutilizado 10 vezes sem perda significativa da eficiência de extração.

Já os polímeros de impressão molecular (MIP) são materiais sintéticos com propriedades de reconhecimento molecular baseados em sistemas biomiméticos, semelhante aos sistemas específicos enzimas-substratos ou antígeno-anticorpo. De acordo com a literatura, a maioria dos polímeros de impressão molecular é baseada em polímeros acrílicos ou acrilatos orgânicos, os quais são sintetizados através da polimerização radicalar. A síntese dos MIP consiste, basicamente, em três etapas: (a) Formação de um complexo pré-polímero através de interações covalentes ou não covalentes entre a molécula molde (soluto) e o monômero funcional; (b) Etapa de polimerização em torno do complexo molde-monômero, gerando uma cadeia polimérica tridimensional altamente entrecruzada; (c) Remoção da molécula molde das cavidades do polímero. Após a etapa de remoção da molécula molde, cavidades seletivas ao molde são estabelecidas, tanto em tamanho e forma, quanto à presença de grupos funcionais. Estas cavidades constituem os sítios específicos de ligação que atuam no reconhecimento do molde e/ou compostos com estrutura química semelhante ao soluto [14].

Mullett et al.

[15]

desenvolveram um capilar

de PEEK recheado com a fase MIP (processo radicalar) para análises in-tube SPME/LC-UV de propranolol em fluidos biológicos. O capilar foi reutilizado mais de 500 vezes com boa precisão analítica (RSD < 5,0%) na faixa linear de 0,5-100 μg/mL para análises de propanolol em 172

Yuling Hu et al.[17] desenvolveram o método fiber-in-tube SPME-LC utilizando um capilar PEEK recheado com fibras (capilares de sílica fundida) revestidas externamente com polímeros de impressão molecular de diferentes tipos, ou seja, desenvolvidos com diferentes templates (moléculas molde), ofloxacin (fibra OFL-MIP) e sulfametazina (fibra SM-MIP). O sistema fiber-in-tube SPME-LC foi conectado aos detectores UV e fluorescência em sequência. O método fiber-in-tube SPME com o capilar PEEK recheado com fibras híbridas resultou em alta seletividade (fase MIP) e excelente dinâmica fluídica, o qual permitiu a determinação de antibióticos (ofloxacin, norfloxacin, cifloxacin, sulfadiazina, sulfamerazina, sulfametazina e sulfamato) em amostras de alimentos de origem animal com baixos limites de detecção (0,016 e 0,11 μg. L–1).

Recentemente, os pesquisadores têm sintetizados sorventes seletivos MIP através do processo sol-gel como fase extratora para in-tube SPME-LC. O polímero impresso sintetizado pelo método sol-gel apresenta alta afinidade, seletividade e rápida taxa de transferência de massa[18].

As fases monolíticas também têm sido avaliadas nas análises in-tube SPME-LC, pois possuem estrutura sólida e altamente porosa, de pequenos domínios e canais relativamente grandes, que resultam em alta permeabilidade e eficiente extração[19]. Estas fases apresentam algumas vantagens, tais como, não necessitam de filtros nas extremidades, bom controle da Scientia Chromatographica 2013; 5(3):167-179

Avanços da in-tube SPME-LC

Queiroz MEC, Melo LP

porosidade, facilidade de incorporação de dife-

reações de condensação e reduzindo tempo de

rentes grupos (moléculas hidrofóbicas, molécu-

gelatização. A dodecilamina também atua como

las carregadas, moléculas para interações espe-

supramolecular template para formar poros na

cíficas, etc.) durante seu preparo e capacidade

matriz monolítica. Este procedimento foi ado-

de sorção superior às colunas capilares de tubos

tado para a síntese de monolitos com grupos

abertos.

cianoetil e octil incorporados, os quais foram

As fases monolíticas com polímeros orgânicos

[20,21]

ou à base de sílica

[22-24]

têm sido utili-

zadas para análises in-tube SPME. Os polímeros monolíticos orgânicos apresentam boa estabilidade em ampla faixa de pH, no entanto, o intumescimento desses polímeros na presença de solventes orgânicos pode levar à diminuição da estabilidade mecânica. Já os monolitos à base de sílica apresentam altas permeabilidade e estabilidade mecânica e não apresentam intumescimento na presença de solventes orgânicos, mas o preparo convencional é moroso e de baixa reprodutibilidade. Uma alternativa promissora

utilizados, respectivamente, para análises in-tube SPME/LC de antidepressivos[27] em amostras de plasma e de PAHs[26].

A coluna capilar monolítica híbrida inorgânica-orgânica

molecularmente

impressa

(MIP monolítico híbrido) foi sintetizada pelo processo sol-gel e radicalar “one-pot” (num só reator), e empregada para a extração seletiva de lisozima (proteína) em amostras biológicas complexas[28]. Para a síntese das colunas monolíticas híbridas tetrametilsiloxano e 3-metacriloxipropiltrimetoxisilano foram utilizados

tem sido os monolitos híbridos organo-silica

como co-precursores inorgânicos, acrilamida e

para as análises in-tube SPME[25-27]. Estes apre-

N, N’-metilenobisacrilamida como monôme-

sentam uma ligação covalente entre a parte orgâ-

ros orgânicos funcionalizados, e lisozima como

nica (trialcoxisilano organo-funcionalizado) e a

molde. A reprodutibilidade da síntese das colu-

parte inorgânica (tetrametoxisilano, TMOS ou

nas monolítica hibridas impressas foi demons-

tetraetoxisilano, TEOS). Os grupos alcóxidos

trada (n=5) e o desvio padrão relativo foi inferior

sob reações de hidrólises e policondensação,

a 3,87%.

processo sol-gel, resultam na matriz de sílica

A Tabela 1 ilustra as aplicações recentes da

híbrida com grupos orgânicos covalentemente

técnica in-tube SPME-LC para análise de fárma-

incorporados. O meio ácido favorece as reações

cos em fluidos biológicos.

de hidrólise, enquanto que o meio alcalino favorece as reações de condensação. Geralmente, os monolitos híbridos são sintetizados via reações sol-gel, em duas etapas. Inicialmente, os silanos são hidrolisados em altas temperaturas em solução água/metanol (co-solvente), na presença de um catalisador ácido (ácido clorídrico, ácido acético). Em uma segunda etapa, dodecilamina é adicionada à solução como um catalizador secundário, aumentando o pH e acelerando as Scientia Chromatographica 2013; 5(3):167-179

3 Conclusão O desenvolvimento de sorventes seletivos aumenta a eficiência e seletividade da in-tube SPME-LC, permitindo a utilização desta técnica na quantificação de fármacos em níveis de traços (mesmo com detectores convencionais, como por exemplo, o UV) em amostras complexas, como os fluidos biológicos.

173

174

Urina e saliva

Nicotina, cotinina, e alcalóides 10 µm)

(60 cm × 0.32 mm d.i,

CP-Pora PLOT amina

(80 cm × 250 µm d.i)

OV-1701

40 μL, D/E = 20, 150 μL/min

Supel-Q Plot

17 μm)

(60 cm × 0.32 mm d.i,

LC-MS

LC-FLD

LC-MS

LC-UV

LC/MS

LC/MS

Capilar de silica imobilizado com anticorpos

Coluna Supel Q Plot

Sistema de detecção

Fase extratora

Polipirrol pH 9,0, 100 µL, (60 cm × 0.25 mm D/E = 20, d.i, 315 µL/min 0.2 µm)

150 µL/min

pH 5,0, 40 µL, D/E = 25,

315 µL/min

pH 9,0, 100 µL, D/E = 15,

150 µL/min

pH 4,0

400 µL/min

pH 7,4

Condições intube SPME

LOD = 9-182 pg/mL

LOQ = 10-15 ng/mL

LOD = 15-40 pg/mL

LOQ = 20-50 ng/mL

5 pg/mL (LOD)

5 ng/mL

LOQ

Colunas PLOT – Maior área superficial (adsorção), extração mais eficiente quando comparada às fases líquidas.

Saito et al.[7] (2010)

Polipirrol – alta estabilidade do revestimento de poliprrol na presença de solventes orgânicos, alta robustez (100 ciclos de Silva et al.[10] (2009) extraçao), interações iônicas com os fármacos, fluoxetina e norfluoxetina.

Kataoka et al.[6] (2009)

Silva et al.[9] (2008)

Grupos ciano (CN) – características polares e apolares, alta robustez (mais de 100 extrações sem perda da eficiência).

Coluna CP-Pora PLOT amina -maior interação de fármacos básicos.

Kataoka et al.[5] (2007)

Queiroz et al.[12] (2007)

Fase imunorbente - interações específica com a fluoxetina, alta especificidade analítica.

Colunas PLOT – Maior área superficial (adsorção), extração mais eficiente quando comparada às fases líquidas.

Referências

Inovação analítica

D/E: Ciclos aspirar/dispensar, MPTS: 3-mercapto propiltrimetoxisilano, AAPTS: N-(2-aminoetil)-3-aminopropiltrimetoxisilano, PSP: parcialmente sulfonados poli(estireno), VPBA: ácido 4-vinilfenilboronico, EDMA: etileno glicol dimetacrilato, RAM – material de acesso restrito, BSA: albumina soro bovino, OFL: ofloxacina, SUF: sulfametazina.

Urina

Plasma

Antidepressivos

Estereóides

Saliva

Cortisol

Plasma

Plasma

Fluoxetina

Fluoxetina e Norfluoxetina enantiômeros

Matriz

Analito

Tabela 1 Aplicação da técnica in-tube SPME-LC para análises de fármacos em fluidos biológicos.

Queiroz MEC, Melo LP Avanços da in-tube SPME-LC

Scientia Chromatographica 2013; 5(3):167-179

pH 5,9, 315μL/ min

Polipropileno pH 7,4, 1.5 mL, imobilizado em 0,2 mL/min fibra- MPTS– AAPTS/PSP (20 cm)

Urina e plasma

Plasma

Plasma

Plasma

Urina

Antidepressivos

Scientia Chromatographica 2013; 5(3):167-179

Rifampicina

Interferon α

Interferon α

Arsênio

Capilar de silica imobilizado com anticorpos

(5 cm × 0.50 mm i.d.)

RAM-BSA

(60 cm × 0.32 mm d.i, 0.05 μm)

Polietileno glicol

(15 cm × 250 µm)

Capilar de silica molítico híbrido

HPLC-ICPMS

LC-FD

LC-FLD

LC-UV

LC-MS

LC-MS/MS

Sistema de detecção

LOD = 0,017 – 0,053 μg/L

LOQ = 1,25 IU/ mL

LOQ = 0,06 IU/ mL

LOQ = 0,1 μg/ mL

LOD = 0,06 a 2,95 ng/mL

LOD = 1,2 ng/ mL LOQ = 4.0 ng/mL

LOQ

Zheng et al.[30] (2010)

He et al.[29] (2010)

Referências

Chaves e Queiroz[13] (2013)

Chaves et al.[3] (2011)

Fiber in-tube SPME (revestimento misto com grupos multifuncionais), maior área Chen et al.[31] (2012) superficial, maior eficiência de extração.

Fase imusorbente - interações específica com o interferon α, alta especificidade analítica.

Revestimento biocompatível RAM - processo de exclusão de proteínas, injeção direta das amostras de plasma.

Polietileno glicol – ligações entrecruzadas com a sílica, alta estabilidade na presença de Melo et al.[4] (2011) solventes orgânicos, interações com grupos polares (ligações de hidrogênio).

Extração mais eficiente quando comparada às colunas de tubos abertos, alta permeabilidade - Controle da porosidade e seletividade (grupos funcionais específicos).

Maior área superficial (adsorção), alta especificidade, extração e liberação controlada de cis-diol biomoléculas.

Inovação analítica

D/E: Ciclos aspirar/dispensar, MPTS: 3-mercapto propiltrimetoxisilano, AAPTS: N-(2-aminoetil)-3-aminopropiltrimetoxisilano, PSP: parcialmente sulfonados poli(estireno), VPBA: ácido 4-vinilfenilboronico, EDMA: etileno glicol dimetacrilato, RAM – material de acesso restrito, BSA: albumina soro bovino, OFL: ofloxacina, SUF: sulfametazina.

pH 7,4, 250 μL

D/E = 10, 315 μL/min

pH 7,0, 200 μL,

pH 7.0, 300 μL, 0.04 mL/min

(45 cm × 75 μm d.i,

100 μL/min (10 min) 0.5 μm)

Poli(VPBA-coEDMA)

pH 9,0,

Urina

Fase extratora

Cis-diol biomoléculas

Condições intube SPME

Matriz

Analito

Tabela 1 Continuação...

Avanços da in-tube SPME-LC Queiroz MEC, Melo LP

175

176

Alimentos para animais

Plasma

Amostras biológicas complexas

Matriz

200 μL/min

Acetonitrila como solvente de extração

0,2mL/min

pH 7,0

0,05 mL/min

pH 7,0

Condições intube SPME

LC-UV

Polidopamina funcionalizada poli(eter eter cetona)

LC-UV

LC-UV

Coluna monolítica híbrida molecularmente impressa

Fibras monolíticas híbridas molecularmente impressas

Sistema de detecção

Fase extratora

0,05 a 0,36 μg/L

LOD = 0,05 a 50 ng/mL

-

LOQ

Hu et al. [17] (2012)

Zhang e Chen[32] (2013)

Ligações entrecruzadas com a superfície de sílica, alta estabilidade na presença de solventes orgânicos, ácidos e bases fortes, maior superfície de adsorção.

Fiber in-tube SPME redução do volume interno do capilar - ligações específicas para (OFL/SUL-MIP-fibras)

Lin et al.[8] (2013)

Referências

Alta especificidade e seletividade analítica (cavidades seletivasMIP), estrutura altamente porosa e permeável.

Inovação analítica

D/E: Ciclos aspirar/dispensar, MPTS: 3-mercapto propiltrimetoxisilano, AAPTS: N-(2-aminoetil)-3-aminopropiltrimetoxisilano, PSP: parcialmente sulfonados poli(estireno), VPBA: ácido 4-vinilfenilboronico, EDMA: etileno glicol dimetacrilato, RAM – material de acesso restrito, BSA: albumina soro bovino, OFL: ofloxacina, SUF: sulfametazina.

Antibióticos

Alcalóides

Lisozima

Analito

Tabela 1 Continuação...

Queiroz MEC, Melo LP Avanços da in-tube SPME-LC

Scientia Chromatographica 2013; 5(3):167-179

Avanços da in-tube SPME-LC

A robustez do sorvente PPY (mais de 100 extrações sem perda da eficiência) e as interações iônicas com os fármacos fluoxetina e norfluoxetina permitiu as análises (in-tube SPME/ LC) enantiosseletivas em níveis plasmáticos sub-terapêuticos.

Queiroz MEC, Melo LP

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O sorvente biocompatível (RAM-BSA) permitiu injeções diretas e múltiplas de amostras de plasma sem nenhum tratamento prévio da amostra biológica, exceto a diluição com solução tampão, simplificando e reduzindo o processo in-tube SPME/LC. O método in-tube SPME-LC com a fase imunossorvente, em razão das interações específicas (antígeno-anticorpo), apresentou baixos limites de quantificação. Já os polímeros de impressão molecular, os quais apresentam propriedades de reconhecimento molecular específicas para as moléculas moldes, são uma alternativa de baixo custo e versátil aos imussorventes

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Recebido: 18/09/2013 Aceito: 14/10/2013

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179

Scientia Chromatographica 2013; 5(3):181-189 Instituto Internacional de Cromatografia DOI: http://dx.doi.org/10.4322/sc.2014.003

PREPARO DE AMOSTRAS

ISSN 1984-4433

Perspective: Hollow fibre liquid-phase microextraction â&#x20AC;&#x201C; principles, performance, applicability, and future directions Astrid Gjelstad1, Stig Pedersen-Bjergaard1,2* 1

2

School of Pharmacy, University of Oslo, P.O. Box 1068 Blindern, 0316 Oslo, Norway Department of Pharmacy, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen, Universitetsparken 2, 2100 Copenhagen, Denmark e-mail: stig.pedersen-bjergaard@farmasi.uio.no

Abstract This paper discusses the recent development of hollow-fibre liquid-phase microextraction (HF-LPME).

The principles of HF-LPME are presented with focus on both two- and three-phase extractions. Typical performance data are reported with major emphasis on recovery, enrichment, and sample clean-up, and the applicability of HF-LPME is discussed in relation to the performance data. Finally, several examples of new directions of HF-LPME are discussed to give a flavour of the future for the technique.

Keywords Sample preparation; miniaturized liquid-liquid extraction; hollow-fibre liquid-phase microextraction

Gjelstad A, Pedersen-Bjergaard S

1 Principle and performance Hollow fibre liquid-phase microextraction (HF-LPME) was presented for the first time in 1999[1], and was originally intended as a sample preparation technique for high-performance liquid chromatography (HPLC), capillary gas chromatography (GC), and capillary electrophoresis (CE). The general principle and a photo of a HF-LPME set-up are illustrated in Figure 1. A short piece of a porous hollow fibre is attached to a pipette tip in one end, and closed by mechanical pressure in the other end. Typically, this porous hollow fibre is made of polypropylene.

Prior to HF-LPME, the hollow fibre is dipped for a few seconds into a water immiscible organic solvent, like 1-octanol. The organic solvent is immediately immobilized in the pores of the hollow fibre by capillary forces, forming a supported liquid membrane (SLM). The internal lumen of the hollow fibre is then filled with an acceptor solution, and the hollow fibre is placed in the sample. With strong agitation or stirring of the sample, target analytes are extracted from the sample, through the SLM, and into the acceptor solution. After a certain period of time, the

Figure 1

182

LPME-perspective

acceptor solution is removed from the hollow fibre, and injected in HPLC, GC, or CE for the final analysis.

In one configuration, the acceptor solution can be the same organic solvent as used for the SLM. In this configuration, HF-LPME is performed as a two-phase extraction where target analytes are extracted from an aqueous sample and into the organic solvent based on classical partition. Since the acceptor solution is organic, it can normally be injected directly into GC. Therefore, two-phase HF-LPME is well suited for low and medium polar analytes which are to be analysed by GC. In another configuration, the acceptor solution can be an aqueous solution, providing a three-phase extraction system. For HF-LPME of basic substances, pH in the sample is made alkaline (to suppress ionization of target analytes), whereas the aqueous acceptor solution is acidified. Thus, target analytes are extracted from the sample and into the SLM in their neutral state, whereas protonation occurs when entering the acceptor solution. The protonation ensures a high solubility in the acceptor solution, and prevents back-extraction into the SLM. For extraction of acidic substances, the pH-gradient is reversed; the sample is acidified, whereas the

Principle and photo of LPME.

Scientia Chromatographica 2013; 5(3):181-189

LPME-perspective

Gjelstad A, Pedersen-Bjergaard S

acceptor solution is alkaline. Since the acceptor solutions in three-phase HF-LPME are aqueous, they can be injected directly into HPLC and CE. Three-phase HF-LPME is ideally suited for acidic or basic analytes which are to be analysed by HPLC or CE. To further illustrate the principle of HF-LPME, a typical HF-LPME-extraction is summarized in Table 1[2]. In this example, the acidic drugs ibuprofen, naproxen, and ketoprofen were extracted from human urine. Because the target analytes are acidic, and because the final analytical method was CE, three-phase HF-LPME was selected. The sample volume was 2.5 mL, and prior to extraction, the urine sample was acidified with HCl to suppress the ionization of the target analytes. Dihexylether was used as the SLM. The common HF-LPME solvents dihexylether, 1-octanol, and 2-octanone were tested during method optimization, and the highest extraction recoveries were obtained with dihexylether. When the hollow fibre was dipped into dihexylether for 5 seconds, approximately 15 μL was immobilized as SLM in the porous wall of the hollow fibre. The internal lumen of

Table 1 Typical conditions for LPME of ibuprofen, naproxen, and ketoprofen from urine[2].

Sample

2500 µL urine + 250 µL 1 M HCl

SLM

 15 µL dihexylether

Acceptor solution

25 µL 10 mM NaOH

Extraction time Stirring

45 min 1200 rpm

the hollow fibre was filled with acceptor solution, which in this case was 25 μL of 10 mM NaOH. The strongly alkaline conditions served to de-protonate the target analytes when entering the acceptor solution. HF-LPME was accomplished in 45 minutes by strong agitation (1200 rpm).

Agitation was important to induce convection in the sample, for efficient transfer of target analytes from the bulk sample and to the surface of the SLM. After extraction, the acceptor solutions were collected by a micro-syringe or a pipette and transferred to the final analysis by CE. Performance data for the extraction of ibuprofen, naproxen, and ketoprofen from urine are illustrated in Table 2. These data are representative for HF-LPME in general. Extraction recoveries ranged between 77 and 100 %. HF-LPME is a microextraction technique, and in most cases HF-LPME extractions are not exhaustive.

Extraction recoveries are compound-dependent in HF-LPME, and are related to distribution coefficients. Generally, extraction recoveries decrease with the polarity of the compound, and highest recoveries can be expected for compounds with a log P-value (1-octanol-water partition coefficient) above 2. For quantification, calibration is performed based on HF-LPME from spiked (blind) samples to incorporate the exact extraction recovery into the calibration graph. Since the target analytes were extracted from 2.5 mL of urine and into 25 μL of acceptor solution, the HF-LPME system provided a 100 times analyte enrichment in case of exhaustive extraction. As illustrated in Table 2, this was

Table 2 Typical performance for LPME of ibuprofen, naproxen, and ketoprofen from urine[2].

Analyte

Extraction recovery (%)

Enrichment factor

Ibuprofen

101

101

Naproxen

84

84

Ketoprofen

77

77

Scientia Chromatographica 2013; 5(3):181-189

Linearity

20 ng/mL-5 µg/mL (R2=0.9993)

183

Gjelstad A, Pedersen-Bjergaard S

accomplished for ibuprofen, whereas enrichment factors for naproxen and ketoprofen were somewhat lower (84 and 77 times, respectively) due to lower recoveries. Because the acceptor solution and the sample were separated by a non-polar and organic liquid membrane (SLM), most matrix components remained in the sample and were unable to pass the SLM. Thus, the HF-LPME process also cleaned up the samples very efficiently.

2 Applicability Basically, HF-LPME has been developed for extraction of organic substances from aqueous samples. As discussed above, recoveries generally increase with decreasing polarity of the substances, and HF-LPME is most suited for substances with log P >1-2. For more polar substances, HF-LPME is less efficient due to unfavourable distribution coefficients. However, by addition of ion-pair reagents either to the sample or to the SLM, also polar analytes have been extracted successfully by HF-LPME[3]. If target analytes are neutral substances, two-phase HF-LPME has to be applied using an organic solvent as acceptor solution. The acceptor solution can be injected directly into GC after extraction, or can be evaporated and reconstituted in mobile phase for HPLC. If the target analytes are acidic or basic substances, three-phase HF-LPME can be used.

In three-phase HF-LPME, the acceptor solution is directly injectable in HPLC or CE. A major incentive for using HF-LPME is the high enrichment which can be obtained.

The enrichment (Enrichment factor (E)) in HF-LPME is determined by the extraction recovery (R), and by the volume ratio between the sample (Vs) and the acceptor solution (Va) as shown in Equation 1: 184

LPME-perspective

E=

R=

Ca , final Cs ,initial na , final ns ,initial

=

R VS 100% Va

100%

(1)

(2)

Ca,final is the final concentration of target analyte in the acceptor solution, Cs,initial is the initial concentration of target analyte in the sample, na,final is the final amount of target analyte in the acceptor solution, and ns,initial is the initial amount of target analyte in the sample. By increasing the volume of the sample while keeping the acceptor solution volume at a few μL, the enrichment can be increased significantly. Under extreme conditions, with a sample volume of 1.1 L and an acceptor solution volume of 20 μL, 27,000 time enrichment has been reported with HF-LPME[3].

Combined with highly sensitive MS-techniques, this has enabled drug substances to be detected down to the low pg/L level in sea water as an example[3]. Under more standard HF-LPME conditions, enrichment factors typically range between 50 and 500 times[3].

Another major incentive for using HF-LPME is sample clean-up. Especially in the three-phase mode, HF-LPME give a high degree of sample clean-up. The reason for this is that most water-soluble matrix components are not able to penetrate the SLM, and are excluded from the acceptor solution. Thus, salts, polar organic substances, and macromolecules (among others) all remain in the sample during HF-LPME. Finally, the consumption of organic solvent is extremely low by using HF-LPME. In a typical three-phase HF-LPME extraction, 10-20 μL organic solvent is used for the SLM, and this represent the total volume of organic solvent used per sample. In other words, HF-LPME is a green chemistry approach to liquid-liquid extraction.

Enrichment, sample clean-up and low solvent consumption represent the major advantages of HF-LPME. As with all other sample Scientia Chromatographica 2013; 5(3):181-189

LPME-perspective

preparation techniques, there are also some disadvantages with HF-LPME. First, HF-LPME is a relatively slowly process, and typically extraction times from 15 to 45 minutes are required.

The transfer of target analyte through the SLM is normally the rate limiting step in HF-LPME, and target analytes may partly be trapped in the SLM. Recently, a solution to speed up extraction kinetics was proposed by the introduction of Electromembrane Extraction (EME)[3]. The set-up for EME is very close to HF-LPME, but in EME an external electrical potential is sustained over the SLM, and target analytes are extracted as charged species across the SLM. Due to this electrokinetic transfer, extraction times can typically be reduced to 5 to 10 minutes[3].

Another current disadvantage of HF-LPME is the lack of commercially available equipment.

Thus, HF-LPME has up to date been performed with home-built equipment. The hollow fibres used are commercially available, but have to be cut to appropriate length and sealed as exemplified in Figure 1. This has limited the implementation of HF-LPME in routine laboratories and applications. However, as discussed in the next section, HF-LPME has recently been performed with flat membranes in a slightly modified commercially available 96-well plate, and this may open for more general acceptance and application of the technique[4].

Gjelstad A, Pedersen-Bjergaard S

Since 1999, more than 450 scientific papers have been published on HF-LPME (with hollow fibres). The field of HF-LPME and the applications have been reviewed several times recently[5-12]. Most papers have been focused on environmental and bioanalytical applications of HF-LPME, but several other application fields like food and beverages have also been covered.

It is not the purpose of the current perspective to review the HF-LPME applications, but information is available in several recent review articles[5-12].

3 Future directions In addition to being developed towards routine applications, HF-LPME is currently also being developed in new and more specialized directions. To give a flavour of this progress, a few examples should be given from our own work.

The first example is related to the development of HF-LPME into the 96-well format. This idea was presented recently, and termed Parallel Artificial Liquid Membrane Extraction (PALME)[4]. The set-up for PALME is illustrated in Figure 2.

Samples are filled into wells in a 96-well donor plate. The typical sample volume is 200-400 μL, and PALME is ideally suited for small volumes of biological fluids. The PALME set-up is not based on porous hollow fibres, but utilizes flat porous polypropylene membranes to support the SLM.

Figure 2 Principle of PALME (Reprinted with permission[4]).

Scientia Chromatographica 2013; 5(3):181-189

185

Gjelstad A, Pedersen-Bjergaard S

LPME-perspective

These flat membranes are located in the bottom of each well in a corresponding 96-well acceptor plate. Thus, after pipetting the samples into the donor plate (step #1), the SLMs are pipetted directly into the membranes in the bottom of the acceptor plate (step #2). I step #3, the acceptor solutions are pipetted above the SLMs in the acceptor plate. The donor and acceptor plates are clamped together, and the whole assembly is agitated for 15 to 30 minutes. During this period of time, target analytes are extracted from the sample in the donor plate, through the SLM and into the acceptor solutions located in the acceptor plate. Finally, the acceptor solutions are collected, and typically analysed by LC-MS. Performance data for PALME are illustrated in Table 3, where the basic drugs pethidine, haloperidol, methadone, and nortriptyline were extracted from human plasma[4]. In this application, each sample was 200 μL, and prior to PALME, the samples were diluted with 200 μL of 20 mM NaOH. The SLM comprised 2 μL of dihexylether, and the acceptor solutions were 50 μL of 20 mM HCOOH. The extraction time was 30 minutes, and the PALME plates were agitated at 900 rpm. As seen from Table 3, recoveries from plasma ranged between 34 and 74 %.

PALME can be performed with a very simple work-flow, and in 15-30 minutes, 96 samples can be extracted simultaneously. PALME provides a high degree of sample clean-up, similar to traditional HF-LPME, with a minimal consumption of organic solvent. Since PALME can be performed with commercially available 96-well plates, the technique will most probably be auto-

mated in the near future. The 96-well donor and acceptor plates we used for our experiments were commercially available, but were manufactured for filtration and membrane permeation assays.

In the near future, we expect dedicated PALME plates to be commercially available, which are especially made and optimized for PALME. Another example of a recent development is the implementation of LPME on a micro-chip[13].

The principle for this LPME-chip is illustrated in Figure 3. In this set-up, the SLM is located inside a micro-chip between a sample channel and an acceptor channel. The sample is pumped with a micro-syringe pump into the sample channel, and target analytes are extracted from the sample channel, across the SLM, and into the acceptor solution on the other side of the SLM. The acceptor solution is pumped with another micro-syringe pump, and the acceptor solution is either collected in a small vial for analysis by CE, or is pumped via an electro-spray ionization interface and directly into a mass spectrometer.

In the latter case, the LPME process is followed and measured continuously with the mass spectrometer.

One interesting aspect of the LPME-chip is illustrated in Figure 4, where the enrichment of amitriptyline was studied versus extraction time. In this case, the acceptor solution flow was turned off during extraction, whereas the sample (alkaline) was pumped continuously into the LPME-chip with a flow rate of 3 μL/min. Under these conditions, the model analyte amitriptyline was extracted into 600 nL of acceptor solution

Table 3 Typical performance for PALME of pethidine, haloperidol, methadone, and nortriptyline from plasma[11].

Extraction recovery (%)

%-RSD (n=6)1

Linearity

Pethidine

74

6

50-1000 ng/mL (R2=0.9994)

Haloperidol

37

9

5-100 ng/mL (R2=0.9983)

Methadone

70

5

50-750 ng/mL (R2=0.9955)

Nortriptyline

34

12

10-250 ng/mL (R2=0.9984)

Analyte

1

100 ng/mL assayed by LC-MS/MS.

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Figure 3 Principle of LPME-chip (Reprinted with permission[13]).

(10 mM HCl) inside the acceptor channel. The enrichment factor increased linearly with the extraction time. After 10 minutes of LPME, the enrichment factor was 42, and at this time-point only 30 μL of sample has been pumped through the LPME-chip. After 120 minutes of operation, amitriptyline was enriched by a factor of 500 from 360 μL of sample solution. In other words, with the LPME-chip, very high enrichment factors can be obtained even from very small volumes of sample.

A final example of a recent development is illustrated in Figure 5, where LPME was combined with direct desorption electro-spray ionization mass spectrometry (DESI-MS)[14]. In this set-up, samples are filled into extraction wells with a porous Teflon membrane in the bottom. Prior to extraction, 1.5 μL of hexadecane is pipetted into the Teflon membrane, and this serve as the SLM. After loading the SLM, the sample is filled into the well above the SLM. This initiate extraction, and target analytes are transferred into the SLM. Because the SLM is very thin (200 μm), the analytes rapidly distribute within the entire membrane volume. After extraction, the target analytes are measured by DESI-MS directly in the SLM. The analysis is performed on the backScientia Chromatographica 2013; 5(3):181-189

Figure 4 Enrichment of amitriptyline as function of extraction time with LPME-chip (Reprinted with permission[13]).

Figure 5 Principle of TLME-DESI-MS. Reproduced from[14] with permission from The Royal Society of Chemistry.

-side of the SLM, on the side which has not been in contact with the sample, to avoid ion-suppression from matrix components potentially fouling the membrane. Since the final analysis is perfor187

Gjelstad A, Pedersen-Bjergaard S

med within the SLM, this concept was termed “Thin Liquid Membrane Extraction” (TLME).

The TLME step is performed in 5 to 10 minutes, which is followed by rapid analysis by DESI-MS. Thus, the time from initiating the extraction and completing the DESI-MS was typically 10 to 15 minutes.

Some results with TLME-DESI-MS are illustrated in Figure 6. Figure 6a) show a mass spectrum after TLME-DESI-MS of a human urine sample from a patient treated with 50 mg diphenhydramine. The signal at m/z 256 corresponded to diphenhydramine, whereas the signal at m/z 242 was from the metabolite nordiphenhydramine. The signal observed at m/z 261 was due to a deuterated diphenhydramine, which was added to the sample for exact quantification. Figure 6b) shows a corresponding mass spectrum from a saliva sample from the same patient. As illustrated by Figure 6a) and b), and as confirmed by comprehensive reliability testing, it was concluded that TLME-DESI-MS can be used as a very rapid tool for identification[14]. TLME-DESI-MS was also evaluated for quantitative purposes. For quantification, the

LPME-perspective

DESI-spray was scanned across series of SLMs from multiple extractions, resulting in ion chronograms as illustrated in Figure 6c) and 6d). In both cases, the mass spectrometer was locked to the molecular ion of diphenhydramine at m/z 256. Each time the DESI-spray scanned across a SLM containing diphenhydramine from a biological sample, the signal increased as illustrated in Figure 6c) and 6d). The signals were integrated and used for quantification, measured relative to the deuterated internal standard. By using deuterated internal standards, calibration curves were linear (0.989-0.999), and accuracy was tested in a reliability study. In average, the deviation between the true concentration and the determined value was 17%. This demonstrated that TLME-DESI-MS potentially can be used for quantification in the future.

4 Conclusions Since 1999, hollow fibre liquid-phase microextraction (HF-LPME) has been developed, evaluated, and published in more than 450 scientific research papers. This research has documented

Figure 6 TLME-DESI-MS analysis of biological samples. A) Mass spectrum of extracted urine sample from patient treated with 50 mg diphenhydramine. B) Mass spectrum of extracted saliva sample from patient treated with 50 mg diphenhydramine. C) Extracted ion chronogram of diphenhydramine in urine. D) Extracted ion chronogram of diphenhydramine in saliva. Reproduced from[14] with permission from The Royal Society of Chemistry.

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that HF-LPME is an attractive sample preparation technique, providing high enrichment of target analytes and excellent sample clean-up. In addition, the consumption of hazardous organic solvents is reduced to only 10-20 μL per sample, making HF-LPME a potential green chemistry approach for the future. The scientific literature contains more than 450 optimized applications of HF-LPME, especially related to environmental and biological samples, describing exact experimental conditions and performance. Commercially available equipment for LPME is hopefully available in the near future, making LPME available to routine laboratories.

In parallel to this, LPME is also expected to be developed into more specialized directions, as exemplified in this perspective by the LPMEchip and TLME-DESI-MS applications.

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Received: 10/17/2013 Accepted: 10/30/2013

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PREPARO DE AMOSTRAS

Instituto Internacional de Cromatografia DOI: http://dx.doi.org/10.4322/sc.2014.004 ISSN 1984-4433

Avanços recentes da MSPD para extração de resíduos de agrotóxicos, PPCPs, compostos inorgânicos e organometálicos Sergiane Souza Caldas, Caroline Rombaldi, Maristela Barnes Rodrigues Cerqueira, Bruno Meira Soares, Ednei Gilberto Primel* Escola de Química e Alimentos, Universidade Federal do Rio Grande – FURG, Cep 96203900, Rio Grande, RS, Brasil e-mail: dqmednei@furg.br

Resumo Para a determinação de agrotóxicos, fármacos e produtos de higiene e cuidado pessoal (PPCPs), compostos inorgânicos e espécies organometálicas em amostras sólidas, semissólidas e viscosas tem se empregado uma vasta gama de técnicas de preparo de amostra. O enfoque dado atualmente é para técnicas com baixo custo, alta eficiência, reduzida quantidade de solvente, e possibilidade de automação. Dentre estas técnicas, a Dispersão da Matriz em Fase Sólida (MSPD) apresenta-se como uma interessante alternativa para o preparo de amostra e está baseada na dispersão da amostra com auxílio de um suporte sólido que atua como abrasivo, promovendo a ruptura da estrutura física da amostra. A MSPD apresenta como principais vantagens o uso de pequenos volumes de solventes, alta eficiência de extração e a possibilidade da realização da limpeza e a extração em uma única etapa. Esta revisão apresenta fundamentos e aplicações da MSPD para determinação de agrotóxicos, PPCPs, contaminantes inorgânicos e organometálicos em diferentes tipos de amostras.

Palavras-chave Preparo de amostra; matrizes complexas; Compostos orgânicos; metais; MSPD.

Recent advances in MSPD for the extraction of pesticide residues, PPCPs, inorganic and organometallic compounds Abstract Determination of pesticides, Pharmaceuticals and Personal Care Products (PPCPs), inorganic compounds and organometalic species in solid, semi-solid and viscous samples have been carried out using a wide number of sample preparation techniques. Low cost, high efficiency, low consumption of solvent, besides the possibility of automation have been the target. The Matrix Solid Phase Dispersion (MSPD) technique seems to be an interesting alternative for the sample preparation. MSPD is based on the sample homogenization with a solid support, which acts as an abrasive, and promotes the disruption of the physical structure of the sample. MSPD shows as the main advantages the low consumption of solvent and the high extraction efficiency. Besides, there is the possibility to carry the clean-up and the extraction in only one step. This review presents the fundamentals and applications of MSPD for the determination of pesticides, PPCPs, inorganic and organometalics contaminants in different complex samples.

Keywords Sample preparation; complex samples; organic compounds; inorganic compounds; MSPD.

Avanços da MSPD para extração de compostos orgânicos e inorgânicos

1 Introdução Nos últimos anos, as técnicas de preparo de amostra vêm se modernizando com o objetivo de desenvolver métodos miniaturizados, mais rápidos e simples, visando um menor consumo de solventes e o emprego de materiais alternativos e/ou renováveis, que tenham o melhor custo-benefício.

Na determinação de compostos orgânicos como agrotóxicos, fármacos e produtos de higiene e cuidado pessoal (PPCPs, do inglês Pharmaceutical and Personal Care Products), de compostos inorgânicos e organometálicos, a etapa de preparo de amostra é fundamental, uma vez que estes compostos geralmente estão presentes em matrizes complexas e em níveis traço.

Os PPCPs se referem, em geral, a qualquer produto usado pelos indivíduos para a saúde humana, para fins cosméticos, ou empregados no agronegócio para promover o crescimento e a saúde da pecuária. Os PPCPs compreendem um conjunto diversificado de milhares de substâncias químicas, incluindo drogas, medicamentos veterinários, perfumaria e cosméticos[1].

A etapa de preparo da amostra tem como objetivo principal isolar os componentes de interesse de outros compostos presentes na matriz, os quais podem interferir posteriormente na determinação analítica[2]. No caso da determinação de resíduos, é desejável que, além do isolamento dos analitos, a técnica de preparo de amostra permita a pré-concentração e enriquecimento destes compostos.

Quando se trata de matrizes complexas, como amostras ambientais, fluidos biológicos e de alimentos, a etapa de limpeza da amostra (clean up) é desejável, uma vez que nesta etapa o objetivo é a eliminação de um maior número possível de interferentes proporcionando melhor Scientia Chromatographica 2013; 5(3):190-213

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seletividade durante a análise, diminuindo interferentes durante a determinação e possíveis efeitos de matriz (ME, do inglês matrix effect).

Para a determinação de agrotóxicos e PPCPs em amostras sólidas e semissólidas existe uma variedade de técnicas de preparo de amostra, e, entre elas, pode-se destacar a Dispersão da Matriz em Fase Sólida (MSPD, do inglês Matrix Solid Phase Dispersion). A grande vantagem está na possibilidade de realizar, em uma única etapa, a extração e a limpeza da amostra. Além disso, esta etapa geralmente é realizada à temperatura ambiente e pressão atmosférica, não necessitando de instrumentação para o controle destes parâmetros[3].

A técnica de MSPD foi introduzida por Barker et al. em 1989, para a extração de resíduos de drogas em tecidos[4]. A técnica surgiu como uma alternativa à Extração em Fase Sólida (SPE, do inglês Solid Phase Extraction) para extração de contaminantes de amostras viscosas, sólidas e semissólidas, uma vez que na SPE a amostra necessita ser homogênea e estar em estado líquido antes da eluição pelo cartucho ou disco.

Além disso, amostras com particulados podem representar complicações na SPE, já que a presença de material particulado impede e bloqueia a eluição, pois estes podem ocupar espaços vazios existentes no suporte sólido[5].

A MSPD está baseada na dispersão da amostra com auxílio de um suporte sólido que atua como abrasivo causando a ruptura da estrutura física da amostra, a qual sofre uma dispersão na superfície do material suporte, formando uma nova fase o que proporciona o isolamento dos analitos em várias matrizes[2,5].

A instrumentação necessária para o emprego da técnica é bastante simples, necessitando somente de gral, pistilo, tubos para empacotamento da mistura e um sistema de vácuo, o qual é opcional, pois é possível seu emprego apenas com auxílio de uma seringa.

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Avanços da MSPD para extração de compostos orgânicos e inorgânicos

Outra grande vantagem da técnica é que o extrato final, na maioria das vezes, é compatível com as técnicas de determinação mais comumente utilizadas, como a Cromatografia Gasosa (GC, do inglês Gas Chromatography) com detecção por Espectrometria de Massas (MS, do inglês Mass Spectrometry) ou por Captura de Elétrons (ECD, do inglês Electron Capture Detector), a Cromatografia Líquida (LC, do inglês Liquid Chromatography) com detecção por MS, por Ultravioleta Visível (UV, do inglês ultraviolet), por Arranjo de Diodos (DAD, do inglês Diode Array Detection), além da Cromatografia Eletrocinética Micelar (MEKC, do inglês Micellar Electrokinetic Chromatography) e da Eletroforese Capilar com detecção por Eletroquimioluminescência (CE-ECL, do inglês Capillary Electrophoresis with Electrochemiluminescence Detection).

A técnica tem recebido atenção crescente de pesquisadores, como pode ser verificado em diversos artigos de revisão publicados nos últimos anos[3,5-8].

Nesse artigo, é apresentada uma revisão atualizada sobre a técnica de MSPD, aplicada para a extração de agrotóxicos, PPCPs, compostos inorgânicos e organometálicos de amostras complexas, como alimentos, fluidos biológicos, solos, sedimentos e lodos de Estação de Tratamento de Efluentes (ETE), enfatizando as características da MSPD para cada amostra e discutindo as inovações da técnica. As tabelas de revisão resumem a aplicação da técnica desde 2008.

2 Princípios da MSPD 2.1 Princípios básicos O princípio básico da MSPD está baseado na pesagem da amostra em um gral, que pode ser de porcelana, ágata ou vidro, seguido da maceração da amostra com o suporte sólido. A dispersão é realizada por um tempo suficiente para que 192

ocorra a completa homogeneização da amostra no suporte sólido e a ruptura da amostra em pequenas partículas. Após a dispersão, a amostra e o suporte sólido formam uma fase única, que é então empacotada em uma coluna vazia, na qual é colocada uma frita (filtro de polietileno) antes e após o empacotamento. As colunas mais empregadas são seringas vazias ou tubos de SPE. Após esta etapa, é realizada a eluição e o extrato está pronto para análise[5].

Na Figura 1, estão mostradas imagens de Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV), representando a morfologia de partículas de (a) Florisil; (b) Florisil + amostra; (c) sílica; (d) sílica + amostra, após 5 min de dispersão/maceração com amostras de sedimento marinho. É possível visualizar as pequenas partículas de amostra dispersas na superfície dos suportes sólidos após 5 min de dispersão.

2.2 Suporte sólido O suporte sólido empregado na técnica possui várias funções e a seletividade da MSPD está diretamente relacionada com a combinação entre o suporte sólido e o solvente empregado[7]. O suporte sólido atua primeiramente como um abrasivo, o qual promove, juntamente com a maceração, a ruptura da estrutura geral da amostra. Além disso, quando uma fase lipofílica do tipo C18 é empregada, o suporte sólido age como um solvente, auxiliando na ruptura das membranas celulares de amostras biológicas e de alimentos[2].

Materiais clássicos de fase reversa como C18 e C8, assim como suportes sólidos de fase normal como alumina, Florisil e sílica encontram grande aplicação na MSPD. Além destes suportes tradicionalmente utilizados, materiais alternativos como Polímeros Molecularmente Impressos (MIPs, do inglês Molecularly Imprinted Polymers) [9] , Nanotubos de Carbono de Paredes Múltiplas Scientia Chromatographica 2013; 5(3):190-213

Avanços da MSPD para extração de compostos orgânicos e inorgânicos

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Figura 1 Imagens de Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) representando a etapa de dispersão, utilizando amostras de sedimento marinho: (a) Florisil; (b) Florisil + amostra; (c) sílica; (d) sílica + amostra.

(MWCNTs, do inglês Multiwalled Carbon Nanotubes)[10], terra diatomácea[11] e areia[12] também têm sido empregados na MSPD. O caráter lipofílico de materiais de fase reversa facilita a ruptura, dispersão e retenção de compostos lipofílicos. No caso de suportes sólidos apolares, a amostra e o suporte sólido formam uma fase ligada, a qual consiste do suporte, dos lipídeos e da própria amostra associada com os compostos que ficam adsorvidos na fase ligada de acordo com suas polaridades[4].

Uma alternativa interessante que pode ser observada nos trabalhos é o reaproveitamento do C18 de cartuchos de SPE, os quais foram previamente empregados para extração de compostos orgânicos em amostras de água. O suporte é Scientia Chromatographica 2013; 5(3):190-213

retirado dos cartuchos usados, colocado em uma coluna de vidro e lavado com solventes de diferentes polaridades. Após a limpeza, o C18 é seco em estufa e reaproveitado como suporte sólido para MSPD apresentando a mesma eficiência que o C18 novo[13,14].

A proporção entre a massa de suporte sólido e a massa de amostra é um dos parâmetros otimizados durante o estudo da técnica.

Originalmente, Barker et al.[4] utilizaram uma proporção de amostra:suporte sólido de 1:4 (m/m), mas ultimamente diferentes proporções tem sido utilizadas.

Algumas características do suporte sólido, como o capeamento e o percentual de carbono têm demonstrado não ter grande influência no 193

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Avanços da MSPD para extração de compostos orgânicos e inorgânicos

resultado analítico, assim como o tamanho do poro do suporte sólido[5]. O tamanho de partícula também é um parâmetro bem robusto para a MSPD. Tamanhos de partículas variando entre 40 e 100 μm têm demonstrado boa eficiência de extração. De acordo com Barker et al.[5], o uso de tamanhos de partículas de 3 a 20 μm levam a um baixo ou inexistente fluxo para eluição, devendo ser evitadas.

2.3 A natureza do solvente de eluição e a sequência de adição Assim como na SPE, a polaridade do solvente de eluição e do suporte sólido tem um papel importante na seleção do que permanece na “coluna” e o que é eluído. O ideal é que ocorra uma eluição seletiva, de maneira a eluir os compostos de interesse e deixar os componentes da matriz retidos na coluna. Muitas vezes isso não ocorre de maneira eficiente, sendo necessária uma nova etapa para realizar a limpeza do extrato; entretanto, em outros casos, após simples eluição com o solvente adequado, o extrato está pronto para determinação[14].

A eluição também pode ocorrer de maneira que, primeiramente seja percolado um solvente que remova os interferentes do material empacotado (solvente de lavagem), e depois sejam eluídos os compostos de interesse com outro solvente[7].

Com relação à extração de PPCPs e agrotóxicos, o solvente mais utilizado é a acetonitrila.

Mas aplicações utilizando hexano[15], acetato de etila[16], metanol[17], água[18], acetona[19] e diclorometano[20] também têm sido relatadas.

2.4 Limpeza da amostra Uma característica desejável da amostra resultante da dispersão é que esta esteja seca, pois a presença de água durante o empacotamento e 194

a eluição da amostra pode dificultar estas etapas[5]. Em muitos trabalhos, sais como o sulfato de sódio são empregados para realizar a secagem da amostra[21,22].

A limpeza da amostra pode ser realizada em uma única etapa ou em uma etapa adicional ao final da extração. Muitas vezes a lavagem da coluna com um solvente antes da eluição é suficiente para remoção dos interferentes.

O procedimento mais empregado é o uso de materiais sorbentes na parte inferior da coluna, e com isso, os interferentes ficam retidos neste material durante a eluição. Florisil é o suporte sólido mais empregado na etapa de limpeza, mas podemos citar ainda o uso de C18[23], sílica[24], alumina[25] e amina primária secundária (PSA, do inglês Primary Secondary Amine)[26]. Além destes, com menos frequência, mas também utilizado é o carbono grafitizado (GCB, do inglês Graphitized Carbon Black)[21].

3 Aplicações da MSPD 3.1 Amostras biológicas Estudos de MPSD para tecidos de animais e fluidos humanos têm sido empregados com sucesso[3]. Os trabalhos apresentam discussões a respeito do uso de diferentes suportes sólidos, da eficiência da etapa de limpeza, do tipo de solvente de eluição, entre outros, os quais são determinantes na eficiência da extração, sendo afetados diretamente pela natureza e composição da amostra em estudo.

Um dos principais obstáculos na análise de amostras biológicas é a interferência causada por lipídios e proteínas. Recentemente, foi estudado o uso do Florisil para a extração de agrotóxicos organoclorados em amostras de pulmão humano[27]. Os autores concluíram que o uso do Florisil é indispensável para a remoção dos Scientia Chromatographica 2013; 5(3):190-213

Avanços da MSPD para extração de compostos orgânicos e inorgânicos

coextrativos polares como os lipídeos e que a sua proporção com relação à massa de amostra é determinante para obter boas recuperações.

Empregando uma proporção de amostra/suporte sólido de 1:4 (m/m), recuperações entre 65 e 106% e RSDs menores que 9% foram obtidos para todos os analitos. Em outro estudo, foi comparada a eficiência entre C18, C8 e GCB para a extração de agrotóxicos de amostras de abelhas.

Embora as recuperações não tenham demonstrado muita variação entre os três suportes sólidos, os autores relatam que C18 gerou extratos mais limpos devido à afinidade com os lipídios[28].

Similarmente, em outros trabalhos, foi utilizado C18 para a extração de resíduos de agrotóxicos organofosforados assim como para fluoroquinolonas, sulfonamidas e tetraciclinas em amostras de tecido bovino e suíno[23,24,29]. Nesses estudos, as recuperações variaram na faixa entre 80 e 99% para todos os analitos.

Em um estudo desenvolvido para tecido de peixe, C18 foi considerado o melhor sorbente, apresentando aplicabilidade para sulfonamidas e alta resistência mecânica. Recuperações entre 69 e 96% foram obtidas, com valores de RSD menores que 10%[30]. Sendo assim, tanto C18 quanto Florisil são largamente utilizados como suporte sólido na etapa de dispersão e também na etapa de limpeza, pois retêm interferentes não polares devido à capacidade de adsorção[31]. Alumina[15,32] também mostrou boa aplicabilidade em amostras de tecido suíno e cabelo humano. As proporções mais empregadas de massa de amostra/suporte sólido para amostras biológicas estão entre 1:1 e 1:4 (m/m)[15,26].

Na etapa de limpeza, suportes sólidos como o GCB

[21]

e PSA

[26]

mostraram boa aplicabilidade

em amostras de peixe e pólen de abelha, respectivamente.

Scientia Chromatographica 2013; 5(3):190-213

Caldas SS, Rombaldi C, Cerqueira MBR, Soares BM, Primel EG

Novos suportes sólidos, mais baratos e de fácil obtenção, têm sido o foco de alguns estudos. Como exemplo, podemos citar os MIPs, os quais atuam seletivamente por reconhecimento molecular[33]. Ainda que poucos, já existem trabalhos com resultados promissores empregando MIPs para extração em tecido de galinha e em soro humano[34,35], como para extração de agrotóxicos em músculo de galinha[9,36]. Qiao et al.

[34] sintetizaram um suporte a base de MIP e empregaram como suporte sólido para extração de enrofloxacina e ciprofloxacina em tecidos de galinha. O suporte apresentou alta afinidade pelos compostos e enriqueceu seletivamente os compostos, mantendo o extrato suficientemente limpo para as determinações cromatográficas.

As recuperações ficaram entre 83 e 102%, com RSDs menores que 7%.

A eficiência da eluição frente a natureza do solvente também tem sido estudada. A eluição de agrotóxicos e PPCPs de amostras biológicas têm sido realizada principalmente com hexano, acetato de etila, metanol e diclorometano. Hexano foi empregado para extração de agrotóxicos em amostra de tecido de peixe. A amostra (1,5 g) foi macerada com 1,5 g de C18 e depois colocada em um tubo contendo 2 g de sílica ácida e 1,5 g de alumina. A eluição foi realizada com 30 mL de hexano, devido à lipofilicidade dos compostos em estudo[37]. Solventes com características mais polares, como a acetonitrila, também tem sido muito utilizados, pois reduzem a coextração de lipídios e de açúcares uma vez que não os dissolvem; além disso, colaboram com a precipitação de proteínas muito polares e com a desnaturação de enzimas, reduzindo significativamente o efeito matriz em diversos casos[31].

Alguns autores empregaram misturas de solventes. Totti et al.[28], avaliaram o uso de diferentes solventes para a eluição de agrotóxicos de amostras de abelhas. Com 100% de 195

Caldas SS, Rombaldi C, Cerqueira MBR, Soares BM, Primel EG

Avanços da MSPD para extração de compostos orgânicos e inorgânicos

metanol foram obtidas as maiores recuperações (R>100%), mesmo com o extrato contendo ceras e pigmentos inerentes da amostra. Com 100% de diclorometano, recuperações médias menores que 50% foram obtidas. Então, as melhores recuperações (entre 61 e 99%) com RSDs menores que 14% foram obtidas com a mistura de metanol e diclorometano (85:15, v/v), a qual gerou extratos mais limpos do que os gerados apenas com metanol.

Para a extração de agrotóxicos de amostras de algas marinhas, os autores utilizaram uma mistura de hexano e acetato de etila. No procedimento, 1 g de amostra foi homogeneizada com 4 g de sulfato de sódio anidro. A amostra macerada foi colocada em um tubo contendo 0,4 g de GCB e 3,6 g de Florisil. Para eluição foram testados os solventes acetato de etila, hexano e misturas de hexano/acetato de etila. Os testes foram realizados com o objetivo de extrair o maior número de agrotóxicos sem necessidade de etapas de limpezas adicionais. O uso de hexano gerou baixas recuperações (<20%) enquanto que o uso de acetato de etila resultou em recuperações entre 70 e 170%. Empregando as misturas, recuperações menores que 120% foram atingidas, indicando que para eluição destes compostos o solvente deve ter polaridade intermediária. Então, a eluição foi realizada empregando hexano e acetato de etila (60:40, v/v), pois esta mistura permitiu ampliar a faixa de polaridade dos analitos e reduzir o efeito de interferentes[21].

A etapa de eluição da amostra é comumente conduzida em cartuchos de SPE. Entretanto, buscando diminuir o tempo durante o empacotamento e as variações decorrentes deste processo, modificações têm sido realizadas. Como exemplo, podemos citar a MSPD assistida por vórtex (Figura 2), a qual foi aplicada para amostras de fígado de peixe e hepatopâncreas de siri.

Nesta modificação, após a dispersão da amostra com C18, a mistura foi colocada em tubos de polipropileno de 50 mL e neste, foi adicionado o solvente de eluição. As recuperações ficaram entre 56 e 122%, demonstrando a eficiência do método otimizado[13].

Com relações às técnicas de determinação, os extratos provenientes de amostras biológicas têm sido determinados por GC-ECD[27,38,39], HPLC-DAD[23,24,29,40] e HPLC-UV[9]. No entanto, predominam os métodos acoplados à espectrometria de massas[13,32,37,40], os quais permitem LOQs na faixa de μg g–1 de acordo com a matriz e os analitos analisados (Tabela 1).

3.2 MSPD para amostras de solos, sedimentos e lodo A MSPD tem sido aplicada para extração de agrotóxicos e PPCPs em amostras de solos, sedimentos e lodos provenientes de estações de tratamento de esgoto, principalmente nos últimos anos.

Figura 2 Esquema da MSPD assistida por vórtex (modificado de Caldas et al.[13]).

196

Scientia Chromatographica 2013; 5(3):190-213

Scientia Chromatographica 2013; 5(3):190-213

soro humano

pulmão humano

pólen de abelha

peixe e marisco

peixe

fluoroquinolonas

6

organoclorados

20 agrotóxicos

organoclorados

8 agrotóxicos

estrogênio

bisfenol a e

alquifenólicas,

MIP (1:1)

Florisil (1:4)

C18 (1:1)

C18 (1:4)

(1:10)

substâncias

GCB

20 agrotóxicos

C18 (1:4)

C18 (1:4)

Heptapâncreas (1:2)

C18 Fígado (1:5)

C18 (1:3)

Alumina (1:3)

anidro (1:4)

Sulfato de sódio

Sorbente (massa de amostra:massa de sorbente, m/m)

organoclorados

6 agrotóxicos

organocloraodos

berbigão

17 agrotóxicos

7 agrotóxicos

13 sulfonamidas

abuso

6 drogas de

17 agrotóxicos

Analitos

mexilhão e

músculo bovinos

fígado e

de siri

hepatopâncreas

fígado de peixe

peixe

cabelo humano

algas

Amostra

Tabela 1 Aplicações da MSPD em amostras biológicas.

-

Florisil

PSA

Alumina

Florisil

Florisil

Sílica gel

-

-

C18

grafitizado

carbono

Florisil e

Limpeza

acetonitrila

diclorometano

hexano e

acetonitrila

metanol e acetona

de etila

hexano e acetato

acetonitrila e água

acetonitrila

acetonitrila

acetonitrila e água

ácido clorídrico

de etila

hexano e acetato

Solvente

HPLC-DAD

GC-ECD

GC-MS

UHPLC-MS-MS

GC-ECD

GC-ECD

MS

HPLC-DAD GC-

GC-MS

HPLC-MS/MS

GC-MS

GC-MS

Técnica de determinação

72 -114 (1-7)

65-106 (1-9)

41-101 (5-30)

Marisco 30-111 (4-18)

Peixe 26-109 (2-15)

75-130 (<15)

55-130 (1-23)

>94 (11-15)

(<21)

57-107 (<26) 56-122

69-96 (2-10)

87-99 (1-13)

82-113 (2-13)

Rec. (RSD) %

-

-

-

Marisco 27-66

Peixe 43-68

-

-

-

<10%

Hepatopancreas

Fígado >50%

supressão do sinal

Detectou

-

-

ME (%)

36

27

26

41

39

38

40

13

30

32

21

Ref.

Avanços da MSPD para extração de compostos orgânicos e inorgânicos Caldas SS, Rombaldi C, Cerqueira MBR, Soares BM, Primel EG

197

198

tartaruga

tecido de

coração)

músculo e

(fígado, rim,

tecido de porco

tecido de porco

tecido de porco

galinha

tecido de

galinha

tecido de

tecido de boi

soro humano

Amostra

cloranfenicol

2 piretróides

carbamatos

e n-metil

organofosforados

fluoroquinolonas,

5

1 tetraciclina

2 sulfonamidas e

fluoroquinolonas,

2

clenbuterol

ciprofloxacina

enrofloxacina e

organofosforados

9 agrotóxicos

xantina

e 2 derivados de

fluoroquinolonas

3

Analitos

Tabela 1 Continuação...

C18 (1:3)

Alumina (1:4)

C18 (1:4)

C18 (1:4)

MIP (1:1)

MIP (1:1)

C18 (1:4)

MIP (1:1)

Sorbente (massa de amostra:massa de sorbente, m/m)

água ultrapura

Lavagem com

diatomácea

Terra

C18

-

Silica Gel

-

Limpeza

acetonitrila e água

hexano

acetonitrila

hexano e

diclorometano

acetonitrila

acético

acetonitrila ácido

trifluoracético

e ácido

acetonitrila

acetonitrila

trifluoracético

e ácido

acetonitrila

Solvente

HPLC-MS/MS

HPLC-UV

HPLC-DAD

HPLC-DAD

HPLC-UV

HPLC-DAD

HPLC-DAD

HPLC-DAD

Técnica de determinação

92-98 (3-4)

84-109 (2-6)

60–108 (1-8)

81-99 (0-6)

92-99 (3-4)

82-96 (4-7)

91-101 (0,1-12)

90-104 (3-5)

Rec. (RSD) %

-

-

-

-

-

-

-

-

ME (%)

30

15

23

29

9

34

24

35

Ref.

Caldas SS, Rombaldi C, Cerqueira MBR, Soares BM, Primel EG Avanços da MSPD para extração de compostos orgânicos e inorgânicos

Scientia Chromatographica 2013; 5(3):190-213

Avanços da MSPD para extração de compostos orgânicos e inorgânicos

Uma das variáveis mais importantes na MSPD é o tipo de suporte sólido utilizado como dispersor[42]. Para a extração de agrotóxicos e PPCPs de amostras de solos, sedimentos e lodos, tem sido reportado o uso de Florisil para determinação de compostos fenólicos, inseticidas e agrotóxicos organofosforados[43-45]; C18 para extração de hormônios, fármacos, inseticidas, parabenos e alquilfenóis[46-49], C8 para extração de hormônios e compostos fenólicos em sedimentos[41], alumina desativada com 3% de água para extração de agrotóxicos organoclorados em lodo de Estações de Tratamento de Efluentes (ETE) [22] ; terra diatomácea para extração de filtros UV, triclosan e metiltriclosan em sedimentos e lodo de ETE[11,50], sílica para extração de piretróides em solo[19] e MIPs para extração de cloranfenicol e triazinas em solos[51,52]. Vale ressaltar que muitas vezes, durante a dispersão da amostra, o sulfato de sódio anidro é utilizado como agente secante[43], assim como em alguns trabalhos o cobre em pó também tem sido empregado para a remoção de interferências causadas pelo enxofre presente nas amostras de lodo[22].

As proporções entre massa de suporte sólido e massa de amostra podem variar de 1:1 até 10:1 (m/m), conforme podemos observar na Tabela 2.

Na determinação de piretróides em solo, foram avaliadas as proporções de massa de suporte sólido e massa de amostra variando de 2:1 a 4:1, e os resultados indicaram que os melhores valores de recuperação foram obtidos utilizando uma proporção de 3:1. Os autores relataram que proporções maiores que 3:1 não resultaram em aumento nos valores de recuperação. Entretanto, relações de suporte sólido/amostra menores do que 2:1 resultaram na diminuição da recuperação[19].

Em relação à etapa de limpeza, diferentes tipos de suportes sólidos vêm sendo empregados. Para a extração de triclosan e metiltriclosan Scientia Chromatographica 2013; 5(3):190-213

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de amostras de lodo e sedimentos, foi utilizado na etapa de limpeza sílica impregnada com 15% de H2SO4, a qual tem por objetivo oxidar a matéria orgânica presente na amostra[20]. Sílica desativada com 10% de água foi utilizada para limpeza na extração de filtros UV em sedimentos, pois foi observado que os analitos ficaram retidos na sílica ativada (provavelmente devido a fortes interações por ligações de hidrogênio)[50]. Já em lodo de ETE foi empregado PSA como sorvente de limpeza[11]. Florisil também pode ser empregado na etapa de limpeza durante a extração de compostos fenólicos[43,49]. Sulfato de sódio anidro foi utilizado na etapa de limpeza para determinação de inseticidas[44,47], agrotóxicos organofosforados[45] e piretróides[19] em amostras de solos.

Em amostras de lodo de ETE foi empregado C18 e sulfato de sódio anidro para determinação de agrotóxicos organoclorados[22] bem como para determinação de triazinas em solo[52].

Como solvente de eluição, a mistura de acetonitrila e metanol (90:10, v/v) tem sido utilizada[46,47]. Albero et al.[46] desenvolveram um método para a extração de hôrmonios de 2 g de amostra de lodo homogeneizada com 1 g de C18, onde foram obtidas recuperações entre 80 e 110%, com RSDs menores que 9%. No estudo realizado por Ettiene et al.[47], foi observado que embora o uso de metanol fosse adequado para a maioria dos inseticidas em estudo, o metabólito ácido 6-cloronicotínico (6-CNA), obteve um aumento siginificativo de recuperação quando empregada a mistura de acetonitrila e metanol (90:10, v/v).

Acetonitrila mostrou-se um solvente de eluição adequado para a extração de compostos fenólicos em lodo de ETE e sedimentos[43], bem como de parabenos e alquilfenóis em solo[49].

Acetato de etila foi utilizado para extração de filtros UV em sedimento[11] e metanol para cloranfenicol[51] e triazinas[52] em solos. Também foram 199

200

lodo de ETE

solo tratado com

solo

solo

solo

solo

solo

sedimentos

sedimentos

sedimento

lodo e sedimentos

lodo de ETE

lodo de ETE

lodo de ETE

Amostra

C18

(1:2)

sintéticos e naturais

-

Na2SO4 anidro

(1:1) C18

C18 e

-

Na2SO4 anidro

Florisil

Na2SO4 anidro

-

purificada)

com 10% H2O

Sílica (desativada

Alumina ácida

(1:2) MIP

10 hormônios sexuais

6 triazinas

cloranfenicol

(1:3) MIP

(1:1) Sílica

alquilfenóis

3 piretróides

C18

(1:1)

7 parabenos e 2

4 inseticidas

(1:4)

C18

(1:2)

(benzotriazóis)

12 fármacos

terra diatomácea

(1:4)

C8

com H2SO4 15%

(1:2)

6 filtros UV

bisfenol-a

4 hormônios

5 alquilfenois

Sílica impregnada

Na2SO4 anidro

C18 e

PSA

Florisil

Limpeza

terra diatomácea

(2:3)

triclosan e metiltriclosan

Alumina

16 agrotóxicos

(1:4)

organoclorados

terra diatomácea

9 filtros UV

(1:2)

metabólitos clorados

(benzotriazóis)

C18

7 parabenos e 2

Analitos

Sorbente (massa de amostra:massa de sorbente, m/m)

Tabela 2 Aplicações da MSPD em amostras de solo, sedimentos e lodos de ETE.

Scientia Chromatographica 2013; 5(3):190-213

v/v)

metanol (90:10,

acetonitrila e

metanol

metanol

acetona

acetonitrila

(90:10, v/v)

metanol

(6:4, v/v) acetonitrila e

ácido oxálico 5%

acetonitrila e

diclorometano

(1:1, v/v)

acetona

metanol e

diclorometano

diclorometano

acetato de etila

(90:10, v/v)

e metanol

acetato de etila

Solvente

GC-MS/MS

MEKC

LC-MS/MS

GC-ECD

GC-MS

MEKC

LC-MS/MS

GC-MS/MS

UHPLC-MS/MS

GC-MS

GC-MS

GC-MS

GC-MS/MS

Técnica de determinação

(5-8)

80-110

(1-5)

(3-8) 61-96

(<7,3) 87-93

(<8) 84-98

92-109

(<3,5)

63-99

(<29)

30-130

(2-14)

79-110

(<14)

44-102

(2 -13)

86-113

(1-8)

(1-13) 86-104

70-111

(3-12)

80-125

%

(RSD)

Recuperação

<20-64

57-97

9-110

ME (%)

46

52

51

19

49

47

48

50

41

20

22

11

53

Ref.

Caldas SS, Rombaldi C, Cerqueira MBR, Soares BM, Primel EG Avanços da MSPD para extração de compostos orgânicos e inorgânicos

Avanços da MSPD para extração de compostos orgânicos e inorgânicos

empregadas as misturas de metanol e acetona (1:1, v/v) para determinação de hormônios em sedimentos[41].

Diclorometano foi empregado para a extração de triclosan e metiltriclosan em lodo e sedimentos[20]. Para extração de filtros UV em sedimentos foi avaliado o uso de acetato de etila, diclorometano e a mistura de hexano e diclorometano (1:1, v/v) e foi observado que as maiores recuperações foram obtidas quando diclorometano foi utilizado[50]. Em estudo realizado por Shen et al.[45] para determinação de agrotóxicos organofosforados em solo, os autores avaliaram o uso de acetato de etila e diclorometano como solvente de eluição e foi obseravada uma maior extração dos componentes presentes na matriz quando utilizando acetato de etila. A eluição de agrotóxicos organoclorados empregando diclorometano foi realizada em banho de ultrassom e observou-se um aumento de 13 a 28% na recuperação dos analitos[22].

Já no estudo realizado por Pavlović et al.[48], foram extraidos fármacos em sedimentos empregando a mistura de acetonitrila e água (6:4, v/v), a qual forneceu as maiores recuperações (37 a 115%) com RSDs menores que 15%. No entanto, a roxitromicina apresentou baixa eficiência de extração e as flouroquinolonas não foram extraídas. O aumento na eficiência de extração para estes compostos, principalmente para a roxitromicina e febantel, foi obtido quando 5% (v/v) de ácido oxálico foi adicionado para a eluição.

Para a extração de piretróides em solo, as melhores recuperações foram obtidas empregando a mistura de acetona e hexano (2:8, v/v).

No entanto, o cromatograma obtido indicou que muitos interferentes presentes na matriz foram eluídos simultaneamente. Sendo assim, os autores avaliaram apenas acetona como solvente de eluição, onde também foram obtidos valores de Scientia Chromatographica 2013; 5(3):190-213

Caldas SS, Rombaldi C, Cerqueira MBR, Soares BM, Primel EG

recuperação dentro dos níveis aceitáveis, e com extratos mais limpos, sendo este, o solvente selecionado[19].

No trabalho desenvolvido por Albero et al. foram testados diclorometano, metanol, acetato de etila e a mistura metanol e acetato de etila como solventes de eluição para a extração de parabenos e metabólitos clorados em lodo de ETE. A mistura acetato de etila e metanol (90:10, v/v), apresentou valores de recuperação maiores que 80% para todos os compostos. Portanto, esta mistura foi selecionada como solvente de eluição. Em relação aos suportes sólidos utilizados na etapa de limpeza, foram avaliados PSA, alumina e Florisil. O uso de PSA mostrou-se inadequado, uma vez que a recuperação de metabólitos clorados foi menor que 10%. No caso da alumina, os valores de recuperação para a maioria dos parabenos foram inferiores a 70%.

Florisil foi o suporte sólido que forneceu, de um modo geral, os melhores resultados para todos os parabenos estudados e, por isso, foi escolhido para ser empregado na etapa de limpeza. O efeito do ultrassom na extração dos parabenos também foi avaliado, e a análise dos extratos mostrou que o uso do ultrassom foi considerado inadequado, pois as recuperações obtidas foram, em geral, superiores a 125%. Uma possível explicação seria o aumento de interferentes extraídos e, por isso, a extração foi realizada sem o auxílio de ultrassom.

[53]

Podemos observar em alguns trabalhos, a comparação da MPSD com outras técnicas de extração. Perez et al.[49], realizaram um estudo comparativo entre a MSPD e a Extração Assistida por Micro-ondas (MAE,do inglês Microwave Assisted Extraction) para a extração de parabenos e alquilfenóis de amostras de solo. Os valores de LOQ foram menores para a MSPD (0,3-0,9 ng g–1) quando comparada à MAE (1,3-3,7 ng g–1).

Além disso, os autores observaram que componentes presentes na matriz podem afetar forte201

Caldas SS, Rombaldi C, Cerqueira MBR, Soares BM, Primel EG

Avanços da MSPD para extração de compostos orgânicos e inorgânicos

mente o comportamento de parabenos e alquilfenóis na extração por MAE (recuperações entre 9 e 110%, com RSDs menores que 6%), quando comparada à MSPD (recuperações entre 90 e 107%, com RSDs menores que 8%).

A modificação na MSPD proposta para a determinação de agrotóxicos organofosforados em solos, foi a combinação com a extração sólido-líquido contínua, chamada de MMSPD (do inglês, Modified Matrix Solid-Phase Dispersion) [45] . Esta técnica consistiu da dispersão da amostra de solo (10 g) com o suporte sólido (10 g de Florisil). Após esta etapa, a mistura homogenizada foi transferida para um aparato para a extração dos analitos. Este aparato consiste em um balão de fundo redondo aquecido em banho-maria, contendo o solvente extrator (diclorometano). A circulação do solvente extrator fez com que o mesmo estivesse sempre em contato com a amostra, eluindo os analitos da matriz. Durante este processo, o sorvente atuou na etapa de limpeza, removendo interferentes que poderiam eluir com os analitos. Os autores compararam esta técnica com a MSPD tradicional e extração sólido-líquido contínua e observaram que a eluição realizada por refluxo de maneira contínua na MMSPD apresentou maiores valores de recuperação quando comparados com a eluição realizada na MSPD tradicional (92-98% para MMSPD e 25-73% para MSPD). Vale ressaltar que foi empregado o mesmo volume de solvente e o mesmo tempo de extração nas duas técnicas.

Para a determinação de piretróides em solos, foi proposto um método combinando a MSPD com UA-DLLME (do inglês, Ultrasound-assisted Dispersive Liquid–Liquid Microextraction). As amostras sólidas (0,1 g) foram homogeneizadas com 0,3 g de sílica e eluídas com 3 mL de acetona. O extrato da MSPD foi concentrado a 0,5 mL e juntamente com 50 μL de tetracloroetileno injetado em 5 mL de água. A DLLME foi empre202

gada para purificação e pré-concentração do extrato. Este método proporcionou recuperações entre 84 e 98%, com RSDs menores que 7%[19].

3.3 MSPD em alimentos Desde a sua descoberta, a MSPD tem ganhado uma vasta aplicação em matrizes alimentícias. No que diz respeito ao emprego da MSPD para extração de agrotóxicos e PPCPs em alimentos, aplicações recentes tem sido encontradas em amostras de frutas[25,54-63], hortaliças[14,60,64-66], cereais[17,25,56,65], produtos lácteos[12,67,68], ovo[18,69], carne de frango[9], e ração bovina[16], conforme mostrado na Tabela 3.

Dentre as técnicas mais utilizadas para quantificação desses compostos após extração por MSPD em alimentos, a LC-MS/MS[12,14,17,18,55,59,60], e a GC-MS[57,58,61,62,66,68,69] tem sido as mais utilizadas, além da GC-ECD[16,25,64], LC-UV[9,54,63], LC-DAD[56,67] e CE-ECL[65]. O emprego de técnicas cromatográficas muitas vezes exige uma etapa de limpeza dos extratos provenientes da MSPD, visando minimizar possíveis efeitos de matriz.

Alguns autores têm utilizado entre 1,0 e 2,0 g de Florisil (ver Tabela 3) na parte inferior do cartucho, para a limpeza de amostras de azeitona[55], ração bovina[16], coco[58] e ovo[69], obtendo recuperações de 50-70%, >75%, 70-99% e 70-110%, respectivamente. Abhilash et al.[25], desenvolveram um método para extração de isômeros do hexaclorociclohexano em frutas, legumes, trigo e plantas medicinais empregando a MSPD e determinação por GC-ECD. Neste trabalho foram utilizados como suporte sólido 0,5 g de florisil juntamente com 5,0 g de amostra e 10 mL de uma mistura de hexano e acetato de etila (70:30, v/v) como solvente de eluição. Como etapa de limpeza, 2,0 g de alumina neutra foram adicionados no cartucho. Embora o Florisil tenha sido utilizado como agente dispersante, neste trabalho os autores relatam que o Florisil tem a característica Scientia Chromatographica 2013; 5(3):190-213

Scientia Chromatographica 2013; 5(3):190-213

a

15 agrotóxicos

triazinas

organofosforados e 9 (1:1)

C8

Terra diatomácea (1:1)

(1:1)

clenbuterol

15 agrotóxicos

MIM

(1:2)

C18

(1:2)

C18

(2:1)

Sílica

aminopropílicos (1:2)

com grupos

-

-

água

Lavagem com

Florisil

-

-

Florisil

neutra

(1:2) Sílica funcionalizada

Alumina

cloridrato de

8 agrotóxicos

5 agrotóxicos

3 agrotóxicos

multiclasses

104 agrotóxicos

linuron)

(isoproturon, diuron e

v/v)

água (20:80,

metanol e

-

-

Limpeza

C18

(1:2)

(Imidacloprido)

agrotóxicos

MIP

(1:2)

Florisil

(1:5)

C18

Sorbente (massa de amostra: massa de sorbente, m/m)

agrotóxico

fenólicos

HPAs e estrógenos

13 agrotóxicos, PPCPs,

3 agrotóxicos

Analitos

acetato de etila

diclorometano

acético (95:5, v/v)

acetonitrila e ácido

com hexano

acetonitrila saturada

acetonitrila

etila (1:4, v/v)

hexano e acetato de

acetonitrila

diclorometano

metanol

(1:1, v/v)

acetona e hexano

acetonitrila

Solvente

Valores maior que 1,0 inidicam enriquecimento do sinal, e valor menores que 1 indicam um decréscimo.

frutas

frutas

frango

coco

cebola

banana

azeitona

arroz e vegetais

arroz

alface

água de coco

Amostra

Tabela 3 MSPD aplicada a extração de agrotóxicos e PPCPs em alimentos.

GC-MS

LC-MS/MS

LC-UV

GC-MS

LC-MS/MS

GC-MS

LC-MS/MS

CE-ECL

LC-MS/MS

GC-MS

LC-UV

Técnica de determinação

(8-24)

73-115

(1-23)

71-125

(3-4)

92-99

(3-15)

70-99

(1-20)

78-120

(7-20)

68-111

(3-19)

50-70

(5-10)

87-103

(4-7)

84-92

(0,2-21)

31-117

(0,4-9)

74-116

Recuperação (RSD) %

-

–33 a 66

-

informado

Valor de EM não

58-116

informado

Valor de EM não

–69 a 379

-

como sorbente

utilizando C18

Supressão

-

1,2-1,25a

ME (%)

57

59

9

58

14

62

55

65

17

66

54

Ref.

Avanços da MSPD para extração de compostos orgânicos e inorgânicos Caldas SS, Rombaldi C, Cerqueira MBR, Soares BM, Primel EG

203

204

a

C18 (1:1)

Agrotóxicos

(carbaril)

(1:2)

multiclasses

-

-

Florisil

(10% m/m)

SiO2-H2SO4

-

acetato de etila

etila (4:1, v/v)

hexano e acetato de

acetato de etila

diclorometano

mmol l-1

ácido fórmico 50

água acidificada com

v/v)

diclorometano (1:1,

acetato de etila e

etila (1:1, v/v)

hexano -

metanol e acetato de

água

etila (70:30, v/v)

hexano e acetato de

metanol

etila (1:1, v/v)

acetona e acetato de

Solvente

Lavagem com

-

neutra

Alumina

-

-

Limpeza

Valores maior que 1,0 inidicam enriquecimento do sinal, e valor menores que 1 indicam um decréscimo.

tomate

Florisil

36 agrotóxicos

(1:2)

multiclasses

semente de lotus

Alumina

36 agrotóxicos

ração bovina

(1:3)

Sílica

(1:4)

Areia

(2:3)

Sílica

metiltriclosan

Triclosan e

7 quinolonas

7 agrotóxicos

macrolídeos

Areia do mar (1:4)

(1:4)

quinolonas

7 antibióticos

Areia

(10:1)

Florisil

(1:1)

8 antimicrobianos

4 agrotóxicos

DCA

DCPMU, DCPU e 3,4-

Florisil

(1:2)

Linuron, diuron,

Nanotubos de carbono

9 agrotóxicos

Sorbente (massa de amostra: massa de sorbente, m/m)

organofosforados

Analitos

biota

queijo, presunto e

ovo

manga e mamão

leite de ovelha

leite

e plantas medicinais

legumes, frutas, trigo,

laranja

de trigo e suco de

frutas, cereais/farinha

frutas e hortaliças

Amostra

Tabela 3 Continuação...

LC-UV

GC-ECD

GC-µECD

GC-MS/MS

LC-MS/MS

GC-MS

LC-DAD

LC-MS/MS

GC-ECD

LC-DAD

LC-MS/MS

Técnica de determinação

78-85

(0,3-12)

71-102

(0,2-16)

32-121

(4-12)

77-120

(8-13)

89-103

(1-28)

80-146

(2-9)

72-97

(4-10)

93-110

(5-10)

93-103

(5-15)

55-96

(2-12)

71-103

Recuperação (RSD) %

-

87-105

-

-

de sinal

enriquecimento

supressão e

Encontrou

Encontrou EM

-

-

-

-

-

ME (%)

63

64

16

68

18

61

67

12

25

56

60

Ref.

Caldas SS, Rombaldi C, Cerqueira MBR, Soares BM, Primel EG Avanços da MSPD para extração de compostos orgânicos e inorgânicos

Scientia Chromatographica 2013; 5(3):190-213

Avanços da MSPD para extração de compostos orgânicos e inorgânicos

de reter espécies polares, eliminando interferências como pigmentos e clorofila, obtendo recuperações que variaram entre 93 e 103%, com RSDs menores que 10%. Da mesma forma, alumina neutra também tem sido utilizada na etapa de limpeza na MSPD, para extração de isoproturon, diuron e linuron de arroz e vegetais, com recuperações entre 87 e 103% e RSDs menores que 9%[65]. Para a remoção de gordura de amostras de queijo, presunto e biota, 1,0 g de sílica com H2SO4 10% (m/m) foi utilizado na etapa de limpeza durante a extração de triclosan e metiltriclosan com recuperações entre 77-120% e RSDs menores que 12%[68]. Outra forma de limpeza é a utilização de uma etapa de lavagem para remoção de interferências que antecede a etapa de eluição. Como solventes de lavagem, água[9], metanol 20% (v/v)[17] e hexano[67] têm sido utilizados em amostras de frango, arroz e leite de ovelha, respectivamente.

Rodrigues et al.[14] compararam o uso de acetonitrila, metanol, acetato de etila e a mistura acetato de etila:metanol (4:1, v/v) para a eluição de 5 agrotóxicos de amostras de cebola, as quais foram maceradas com C18. Como pode ser observado na Figura 3, os solventes, acetato de etila e acetonitrila, apresentaram maior poder de eluição dos agrotóxicos. Embora as recuperações empregando acetato de etila tenham sido superiores (105 a 122%), os autores optaram por utilizar acetonitrila (84 a 108%), uma vez que este último apresentou melhor resolução cromatográfica quando comparado com o acetato de etila.

Como suporte sólido, a sílica funcionalizada com grupamentos C18[14,54,57,58,63,65,69] e o Florisil[56, 64,66] tem sido os mais utilizados durante a etapa de dispersão em amostras de alimentos, em proporções que variam entre 1:1 e 1:5 entre massa de amostra e massa de suporte sólido. Suportes sólidos alternativos como terra diatomácea[59], Scientia Chromatographica 2013; 5(3):190-213

Caldas SS, Rombaldi C, Cerqueira MBR, Soares BM, Primel EG

Figura 3 Recuperações dos agrotóxicos empregando diferentes solventes de eluição; 0,5 g de amostra de cebola; 1,0 g de C18 reutilizada; 1 h de tempo de interação; 5 min dispersão e 10,0 mL de solvente. As barras de erro indicam valores de RSD (Modificado de Rodrigues et al.[14]).

microesferas impressas molecularmente (MIM, do inglês Molecularly Imprinted Microspheres)[9], MIPs[17], nanotubos de carbono[60], sílica funcionalizada com grupamentos aminopropílicos[55] e areia[12,18,67] também tem sido utilizados. Embora a MSPD possua uma grande aplicação no preparo de amostras sólidas e semissólidas, Bogialli et al.

[12] , desenvolveram um método para extração de antimicrobianos em leite bovino, utilizando 1,5 mL de amostra, 6,0 g de areia, 10 min de dispersão e água como solvente de eluição, com determinação por LC-MS/MS. Durante a etapa de eluição, a célula de extração foi inserida em um forno e a eluição foi realizada a 90 °C, obtendo recuperações que variaram entre 93 e 110%, com RSDs menores que 10%. Neste procedimento, os autores utilizaram um aquecimento durante a etapa de eluição, com o objetivo de diminuir a tensão superficial da água e, assim, melhorar as recuperações de analitos com baixa solubilidade em água. Por outro lado, o uso de água aquecida pode decompor alguns analitos e, por isso, foram avaliadas as temperaturas de 60, 90 e 120 °C. O aumento de 60 °C para 90 °C resultou em um aumento nas recuperações de 56-85% para 77-90%, para a maioria dos analitos. Entretanto, 205

Caldas SS, Rombaldi C, Cerqueira MBR, Soares BM, Primel EG

Avanços da MSPD para extração de compostos orgânicos e inorgânicos

a 120 °C foi observada uma diminuição na recuperação (53-76%) para todos os analitos. Da mesma forma, Ramos et al.[57], testaram a MSPD no formato tradicional (sem aquecimento), com aquecimento convencional, banho de ultrassom e um reator ultrassônico para auxiliar a extração dos analitos durante etapa de eluição para determinação de 15 agrotóxicos organofosforados e 9 triazinas em amostras de frutas, com determinação por GC-MS. Durante o preparo da amostra, foram utilizados 700 mg de amostra, 700 mg de C8 (suporte sólido) e 700 μL de acetato de etila como solvente de eluição. Entre os três métodos de eluição testados, a MSPD assistida por ultrassom (UA-MSPD), utilizando reator ultrassônico, apresentou a melhor faixa de recuperação, entre 73 e 115%, com RSDs menores que 24%. De forma geral, a UA-MSPD mostrou uma melhor eficiência comparada aos outros métodos testados, mostrando que o uso do ultrassom pode ser uma alternativa interessante para ser utilizada juntamente com a MSPD para outras aplicações.

arsenobetaína (AsB) e arsenocolina (AsC) em peixes e frutos do mar empregando a MSPD e determinação por Cromatografia Líquida acoplada à Espectrometria de Massas com Plasma Indutivamente Acoplado (LC-ICP-MS). Os melhores resultados foram obtidos utilizando 0,25 g de amostra, 1,75 g de terra diatomácea, metanol 50% (v/v) como solvente de eluição, eluição em cartuchos empacotados com a mistura, nos quais foram previamente adicionados 2 g de C18 para ser utilizado como uma etapa de limpeza simultaneamente à etapa de eluição. O método foi aplicado em materiais de referência (CRMs, do inglês Certificate Reference Materials) de tecido de atum (BCR-627) e músculo de peixe (DORM-2). Quando aplicado ao BCR-627, o método apresentou 95, 100 e 105% de concordância com os valores certificados para as espécies AsB, DMA e As(III), respectivamente. Para o DORM-2, o método apresentou 99% de concordância para a espécie AsB, com RSDs menores que 9%.

3.4 MSPD aplicada à extração de compostos inorgânicos e organometálicos

Este mesmo método também foi aplicado pelos mesmos autores para o estudo da biodisponibilidade das mesmas espécies citadas anteriormente, presentes em amostras de frutos do mar, através do método de digestão in vitro[71].

Desde o primeiro trabalho desenvolvido por Barker et al. em 1989[4], a MSPD tem sido aplicada à extração de um grande número de compostos orgânicos em diferentes tipos de matrizes sólidas e semissólidas. Recentemente, a MSPD também tem ganhado algumas aplicações na extração de compostos inorgânicos e organometálicos, principalmente no que diz respeito à análise de especiação. O primeiro trabalho a utilizar a MSPD para extração de espécies inorgânicas e organometálicas foi o trabalho desenvolvido por Moreda-Piñeiro et al. em 2008[70]. Neste trabalho, os autores desenvolveram um método para extração de As(III), As(V), ácido monometilarsênico (MMA), ácido dimetilarsônico (DMA), 206

Recentemente, Duarte et al.[72] desenvolveram um método para extração das espécies CH3Hg+ e Hg2+ em tecidos de peixe empregando a MSPD com determinação por GC-MS. Neste trabalho, foram utilizados 0,5 g de sílica como suporte sólido e 0,2 g de amostra. A etapa de eluição/extração foi feita de forma alternativa, onde a mistura, após maceração, foi transferida para tubos de centrífuga, no qual foram adicionados 5,0 mL de uma mistura de HCl 4,2 mol L–1 e NaCl 0,5 mol L–1, seguido de agitação em vortex por 1 min e centrifugação por 10 min a 3000 rpm. Esta modificação no método trouxe vantagens como rapidez e simplicidade quando Scientia Chromatographica 2013; 5(3):190-213

Avanços da MSPD para extração de compostos orgânicos e inorgânicos

comparado com métodos que utilizam extrações assistidas por ultrassom[73] e radiação micro-ondas[74] para extração de espécies de mercúrio em tecidos de peixe. Além disso, a substituição da etapa de eluição em cartuchos eliminou a possibilidade de formação de caminhos preferenciais e a necessidade da utilização de manifolds e bombas de vácuo durante a extração, tornando o método relativamente mais rápido e simples.

O método foi aplicado em materiais de referência de fígado (DOLT-3) e músculo (DORM-2) de peixe, apresentando concordâncias em torno de 99% para ambas as espécies de mercúrio, com RSDs menores que 9%. Neste trabalho, também foi observado um efeito de matriz de 43% (CH3Hg+) e 16% (Hg2+) quando comparadas curvas analíticas preparadas em solução aquosa e utilizando o extrato proveniente da MSPD e, por isso, a quantificação foi feita através de curvas analíticas preparadas no extrato[72]. Cabe ressaltar, que foram encontrados apenas os três trabalhos citados anteriormente, que empregaram a MSPD para análise de especiação até o momento.

No entanto, Martínez-Fernández et al.[75] propuseram uma modificação no protocolo BCR EUR 14763 EM, da Comunidade Bureau de Referência da União Europeia, o qual é utilizado para o fracionamento de metais em sedimento.

Com o objetivo de tornar o método mais simples e rápido, os autores propuseram a inserção da MSPD no protocolo para a extração sequencial de Cd, Co, Cr, Mn, Ni, Sr e Zn em 3 estágios, visando extrair os metais nas frações solúvel (1º estágio), redutível (2º estágio) e oxidável (3º estágio), com determinação por ICP-MS. Para a MSPD, foram utilizados 0,5 g de amostra, 1,0 g de areia do mar (suporte sólido) e 5 min de dispersão, utilizando o método tradicional de eluição. Como solventes de eluição, foram utilizados ácido acético 0,11 mol L–1 (1º estágio), cloridrato de hidroxilamina 0,1 mol L–1 acidificado a pH 2,0 Scientia Chromatographica 2013; 5(3):190-213

Caldas SS, Rombaldi C, Cerqueira MBR, Soares BM, Primel EG

(2º estágio) e H2O2 8,8 mol L–1 e acetato de amônio 1,0 mol L–1 (3º estágio). O método foi aplicado em CRMs de sedimento (CRM 601 e CRM 701) e boas concordâncias com valores certificados foram obtidas, exceto para a fração redutível (2º estágio), com RSDs menores que 10%.

Estes trabalhos abriram um importante precedente para a utilização da MSPD no preparo de amostras visando à determinação de compostos inorgânicos e organometálicos, onde até então, só havia aplicações para extração de compostos orgânicos. A utilização de solventes de eluição/ extração adequados, como soluções aquosas ácidas, alcalinas, salinas ou através do uso de complexantes, aplicados à MSPD, pode ser uma interessante alternativa para a extração destes compostos, mas ainda existem poucos trabalhados relatados na literatura.

4 Conclusões e perspectivas A técnica de MPSD apresenta uma aplicação direta para a extração de agrotóxicos e PPCPs de amostras sólidas, semissólidas e viscosas, na qual ocorre a ruptura e dispersão da amostra sobre um suporte sólido o qual é usado como recheio de uma coluna formando uma fase cromatográfica única que é eluída com o solvente adequado.

A partir desta revisão, fica evidente que a aplicação da MSPD, desde o primeiro trabalho, para a extração de agrotóxicos e PPCPs de matrizes complexas, apresenta vantagens como rapidez e baixo custo. Algumas modificações, como o uso de suportes sólidos alternativos tanto na etapa de dispersão quanto na etapa de limpeza têm proporcionado melhorias na eficiência de extração e limpeza da amostra. Estas modificações tiveram como objetivo garantir a eficiência da extração, diminuir o número de interferentes, dar mais rapidez e aumentar a precisão da técnica.

207

Caldas SS, Rombaldi C, Cerqueira MBR, Soares BM, Primel EG

Avanços da MSPD para extração de compostos orgânicos e inorgânicos

Com relação à determinação de compostos inorgânicos e organometálicos, os poucos e pioneiros trabalhos demonstraram uma nova aplicação para extração destas classes de compostos, a qual representa ser uma alternativa interessante.

As desvantagens da técnica continuam sendo a manipulação da amostra, o grande número de variáveis a serem otimizadas e a dificuldade de automação. Essas desvantagens vêm sendo contornadas em alguns trabalhos, e, por exemplo, o uso de ferramentas relacionadas com a estatística multivariada tem auxiliado no sentido de extrair o maior número de informações com o menor número de experimento e com maior rapidez. Além disso, o uso do vortex ao

Agradecimentos Os autores agradecem as agências brasileiras CAPES, CNPq, e FURG pelo apoio financeiro e bolsas concedidas, e ao Centro de Microscopia Eletrônica da Zona Sul (CEME-SUL), em especial ao doutorando Msc. Tito Roberto Sant’Anna Cadaval Junior, pelas análises de Microscopia Eletrônica de Varredura.

Parte deste estudo foi financiada pelo projeto CNPq/CAPES (processo nº 552318/20116), FAPERGS (processo nº 11/0816-3), CAPES/ PNPD (processo nº 3038.028239/2009-69).

E.G. Primel recebe uma bolsa de produtividade em pesquisa financiada pelo CNPq (DT 310517/2012-5).

invés da etapa de eluição (vortex-assisted) possibilitou a diminuição no tempo de eluição e a melhoria da repetibilidade, uma vez que a etapa de empacotamento possui influência significa-

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Kristenson EM, Ramos L, Brinkman UAT. Recent advances in matrix solid-phase dispersion. TrAC

tiva na precisão do método.

As perspectivas em relação à técnica podem ser bastante otimistas, no que diz respeito à obtenção de resultados satisfatórios na extração de um número cada vez maior de agrotóxicos e PPCPs em diferentes tipos de amostras complexas, uma vez que este método tem sido bem sucedido na extração destes compostos em matrizes bem diversas como frutas, algas, vegetais, cereais, ovos, leite, entre outros.

Além disso, cabe ressaltar a versatilidade da técnica quando aplicada à determinação de compostos orgânicos, inorgânicos e organometálicos. Esta versatilidade é bastante importante, principalmente no que diz respeito ao grande número de novos resíduos e contaminantes, o que, consequentemente tem gerado uma crescente demanda para o desenvolvimento de novos métodos.

208

Scientia Chromatographica 2013; 5(3):190-213

Avanços da MSPD para extração de compostos orgânicos e inorgânicos

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Recebido: 14/10/2013 Aceito: 19/11/2013

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PREPARO DE AMOSTRAS

Instituto Internacional de Cromatografia DOI: http://dx.doi.org/10.4322/sc.2014.005 ISSN 1984-4433

Análise enantiosseletiva de fármacos e metabólitos em matrizes biológicas empregando técnicas miniaturizadas de preparação de amostras Nayara Cristina Perez de Albuquerque, Marcela Armelim Bortoleto, Anderson Rodrigo Moraes de Oliveira* Departamento de Química, Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo – USP, Cep 14040-901, Ribeirão Preto, SP, Brazil e-mail: deoliveira@usp.br

Resumo Este trabalho tem como objetivo revisar o emprego de técnicas miniaturizadas de preparação de amostras na análise enantiosseletiva de fármacos e metabólitos em matrizes biológicas. Nesta revisão foram abordados os trabalhos envolvendo a microextração em fase sólida, a microextração em fase líquida empregando membranas cilíndricas ocas e a microextração líquido-líquido dispersiva.

Palavras-chave Análise enantiosseletiva; microextração em fase sólida; microextração em fase liquida; microextração liquidoliquido dispersiva; fármacos; metabólitos.

Enantioselective analysis of drugs and metabolites in biological matrices using miniaturized sample preparation techniques Abstract This paper aims to review the use of miniaturized sample preparation techniques in the enantioselective analysis of drugs and metabolites in biological matrices. In this review, it was addressed papers involving solid-phase microextraction, hollow fiber liquid-phase microextraction and dispersive liquid-liquid microextraction.

Keywords Enantioselective analysis; solid-phase microextraction; liquid-phase microextraction; dispersive liquid-liquid microextraction; drugs; metabolites.

Análise enantiosseletiva de fármacos e metabólitos em matrizes biológicas

1 Introdução Um fármaco é toda substância de estrutura química conhecida que seja capaz de modificar ou explorar o sistema fisiológico ou estado patológico, em benefício do paciente[1]. Quando um fármaco apresenta um ou mais centros quirais, os enantiômeros podem apresentar diferenças nas propriedades farmacodinâmicas e farmacocinéticas quando administrado ao paciente.

A farmacodinâmica estuda os efeitos fisiológicos e bioquímicos dos fármacos e seus mecanismos de ação. Pode ser que apenas um enantiômero seja responsável pela atividade farmacológica, enquanto o outro pode ser considerado impureza, pode ser inativo ou até mesmo responsável por efeito colateral ou adverso[2]. Já a farmacocinética se refere às etapas de absorção, distribuição, metabolismo e excreção do fármaco. A estereosseletividade em farmacocinética é, em grande parte, observada durante a etapa de metabolismo[2]. Recomenda-se que o enantiômero com maior atividade seja chamado de eutômero, enquanto que o enantiômero que apresente o efeito indesejado seja chamado de distômero[3].

Existem diversos exemplos de enantiosseletividade na farmacocinética ou farmacodinâmica de fármacos. Como exemplo, pode-se citar o propranolol, um medicamento anti-hipertensivo

Albuquerque NCP, Bortoleto MA, Oliveira ARM

cial desfavorável à interação, sendo, portanto, destituído de atividade biológica β-bloqueadora, ou seja, de atividade farmacológica[4].

Devido à complexidade da matriz biológica, a análise de fármacos e metabólitos nessas matrizes requer uma técnica de preparação de amostra bem elaborada e seletiva, além de ser capaz de pré-concentrar os analitos, pois muitas vezes, eles estão presentes em baixas concentrações. As técnicas de extração mais tradicionais são a extração líquido-líquido (LLE – LiquidLiquid Extraction) e a extração em fase sólida (SPE – Solid Phase Extraction). No entanto, essas técnicas apresentam como desvantagem o uso de grande volume de solvente orgânico durante o preparo da amostra. Visando atingir maior seletividade no processo de extração juntamente com a redução no consumo de solventes, vem-se aumentando a tendência por técnicas de extração miniaturizadas. Entre essas podemos destacar a microextração em fase líquida empregando membranas cilíndricas ocas (HF-LPME – Hollow Fiber Liquid Phase Microextration), a microextração em fase sólida (SPME – Solid Phase Microextration) e a microextração líquido-líquido dispersiva (DLLME – Dispersive LiquidLiquid Microextration). Com base no exposto, este artigo tem como objetivo fazer uma revisão do uso das técnicas miniaturizadas descritas acima na análise enantiosseletiva de fármacos e metabólitos em matrizes biológicas.

empregado largamente no controle da hipertensão arterial. Esse fármaco tem sua ação terapêutica nos receptores β-adrenérgicos. O enantiômero (S)-propranolol é reconhecido por esses receptores por meio de interações hidrofóbicas, ligações de hidrogênio e interações tipo íon-dipolo. Já o enantiômero (R)-propranolol possui menor afinidade pelos receptores, pois apresenta a hidroxila da cadeia lateral em um arranjo espaScientia Chromatographica 2013; 5(3):214-228

2 Microextração em fase líquida empregando membranas cilíndricas ocas (HF-LPME) A HF-LPME foi desenvolvida em 1999 por Pedersen-Bjergaard e Rasmussen[5] como uma alternativa para a microextração em gota suspensa (SDME – Single Drop Microextration). Esta técnica baseia-se no uso de uma membrana capi215

Albuquerque NCP, Bortoleto MA, Oliveira ARM

Análise enantiosseletiva de fármacos e metabólitos em matrizes biológicas

lar cilíndrica e porosa para a extração e concentração dos analitos. Os poros desta membrana são impregnados com um solvente orgânico e o lúmen da membrana é preenchido com uma fase aceptora, que pode ser aquosa ou orgânica.

Esta membrana é então mergulhada na amostra aquosa, sob agitação, de forma a permitir a extração dos analitos.

A HF-LPME pode ser realizada no modo duas ou três fases. No modo duas fases, a fase aceptora é composta por um solvente orgânico, o mesmo que foi utilizado para impregnar os poros da membrana (Figura 1A). Esse modo é recomendado quando o analito apresenta uma maior hidrofobicidade. Para o modo três fases, a fase aceptora é uma solução aquosa com pH oposto ao da fase doadora (Figura 1B). Esse modo é empregado para analitos hidrofílicos ionizáveis.

Quando o analito possui características básicas, a fase doadora deve possui um pH maior que o pKa do analito, para que ele esteja em sua forma neutra, permitindo sua passagem pelo solvente orgânico impregnado nos poros da membrana, que atua como uma barreira entre as fases doadora e aceptora. Quando o analito alcança o interior da fibra e atinge a fase aceptora ele é ionizado e, dessa forma, concentrado nessa fase. Em se tratando de um analito com caráter ácido, as mesmas considerações podem ser realizadas, no

entanto a fase doadora deve ser suficientemente ácida, e a fase aceptora suficientemente alcalina[6].

Há duas configurações frequentemente utilizadas para a HF-LPME, a do tipo “haste” e a do tipo “U”. Na configuração do tipo “U”, as duas extremidades da membrana são conectadas com microponteiras ou microsseringas (Figura 2A).

Na configuração tipo “haste”, uma das extremidades da membrana é fechada, e na outra extremidade é inserida uma microponteira para introdução e coleta da fase aceptora (Figura 2B)[6].

Uma nova modalidade da HF-LPME foi desenvolvida por Pedersen-Bjergaard e Rasmussen em 2006, denominada extração por eletromembrana (EME - Electromembrane Extraction) (Figura 2C)[7]. Esta técninca baseia-se na migração de compostos carregados quando expostos a uma diferença de potencial (ddp). A escolha do solvente orgânico nessa modalidade é mais crítica, pois ele deve apresentar uma determinada polaridade, para que se alcance uma condutividade elétrica suficiente.

Para o caso de analitos básicos, a amostra deve ser acidificada para que eles estejam ionizados, os poros da membrana devem ser impregnados com um solvente orgânico adequado; a fase aceptora também deve ser ácida para que os ana-

Figura 1 Modos de extração em HF-LPME. (A) duas fases. (B) três fases. (●) Analito, (B) Analito básico, (BH+) Analito básico protonado.

216

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Figura 2 Configurações disponíveis em HF-LPME. (A) Em “U”; (B) Tipo “haste”; (C) extração por eletromembrana (EME).

litos permaneçam ionizados. Um eletrodo positivo é inserido na fase doadora, e um eletrodo negativo na fase aceptora. Após aplicação de uma diferença de potencial, os analitos que estão carregados positivamente na fase doadora migram para a fase aceptora em direção ao eletrodo negativo. Ao final da extração, a ddp é encerrada, a fase aceptora é coletada e levada ao sistema de análise[7]. Desta forma, altos valores de recuperação podem ser atingidos em pouco tempo de extração.

Para o desenvolvimento do método de extração empregando a HF-LPME, alguns parâmetros devem ser avaliados, como comprimento da membrana, o pH da fase doadora, aditivos na fase doadora, o tipo de solvente orgânico, o tipo e pH da fase aceptora, o tempo de extração e a agitação[8]. Mais detalhes sobre a otimização de métodos empregando a HF-LPME podem ser encontrados no trabalho de Ghambarian et al.[9].

2.1 Emprego da HF-LPME em estudos enantiosseletivos em matrizes biológicas A análise de fármacos e metabólitos em matriz biológica é realizada com a finalidade de monitorizarão terapêutica e também em estudos

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de disposição cinética. A enorme variedade de compostos endógenos presentes na matriz biológica torna esta análise um desafio. Dessa forma, a HF-LPME tem se mostrado muito vantajosa nesses estudos, não somente pelo baixo consumo de solvente orgânico gerado pela técnica, mas também pela elevada seletividade e altos fatores de enriquecimento conseguidos pela técnica.

Fonseca et al. desenvolveram um método enantiosseletivo para quantificação da venlafaxina e seus metabólitos O-desmetilvenlafaxina e N-desmetilvenlafaxina em plasma utilizando a HF-LPME no modo três fases e análise por LC-MS/MS. Nesse estudo foi empregado 1-octanol como solvente orgânico impregnado na membrana e uma solução de ácido acético 0,1 mol L–1 como fase aceptora. Um limite de quantificação de 5 ng mL–1 foi atingido, com recuperação de aproximadamente 14% para os enantiômeros da O-desmetilvenlafaxina, 26% para os enantiômeros da N-desmetilvenlafaxina e 54% para os enantiômeros da venlafaxina[10].

Magalhães et al. desenvolveram uma método enantiosseletivo para análise da mefloquina e seu metabólito majoritário carboximefloquina em plasma empregando a HF-LPME e análise por HPLC-UV. Devido à característica básica

217

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da mefloquina e a característica ácida da carboximefloquina, fica impossível realizar a extração simultânea de ambos analitos por HF-LPME de três fases convencional. Nesse sentido, a extração foi feita em duas etapas. Primeiro a amostra foi alcalinizada ajustando o pH da fase doadora para 12 com 100 μL de NaOH 5 mol L–1, e diluída com água para um volume total de 4 mL. A membrana foi impregnada com n-hexil éter, e o lúmen foi preenchido com 50 μL de uma solução 0,01 mol L–1 de ácido perclórico. A extração foi realizada por 30 minutos a 1750 rpm. A fase aceptora foi então coletada e transferida para um tubo de ensaio. Na segunda etapa da extração, a mesma amostra foi acidificada, ajustando o pH da fase doadora para 3 com 200 μL de HCl 5 mol L–1; manteve-se o mesmo solvente orgânico e substituiu-se a fase aceptora por uma solução 0,05 mol L–1 de NaOH. A extração foi realizada da mesma forma descrita anteriormente. A fase aceptora foi coletada e posta juntamente com a anterior. Posteriormente foram evaporadas sob fluxo de ar comprimido, ressuspendidas e analisadas. Nesse método, a recuperação foi entre 35-38% e o limite de quantificação atingido foi de 50 ng mL–1 para cada analito[11,12].

Microssomas hepáticos de ratos vêm sendo extensivamente usado para estudos de biotransformação de fármacos e produtos naturais. Nesse sentido, Barth et al. desenvolveram um método enantiosseletivo para análise do bufuralol e seus metabólitos 1’-oxobufuralol e 1’-hidroxibufuralol de meio microssomal utilizando HPLC-UV e HF-LPME de três fases. Nesse método foi empregado 1-octanol como solvente extrator. A fase doadora foi mantida alcalina e ácido acético 0,2 mol L–1 foi utilizado como fase aceptora. A recuperação obtida por esse método situou-se entre 63-69% e limite de quantificação foi de 100 ng mL–1 para todos analitos[13].

218

Uma alternativa para a obtenção de compostos com atividade farmacológica é a biotransformação empregando micro-organismos.

Esse processo é definido como transformações microbianas de compostos orgânicos ou inorgânicos, que provocam alterações na estrutura química do composto de partida[14]. Em processos de biotransformação os fungos são usados com maior frequência, pois são capazes de realizar diversos tipos de reações, tais como oxidação, redução e hidrólise, o que torna possível a obtenção de grande variedade de produtos[15].

Contudo, devido à complexidade dessa matriz biológica torna-se necessário um procedimento de preparação da amostra bem elaborado e seletivo antes da análise. Nesse sentido, a HF-LPME vem sendo empregada.

Hilário et al. desenvolveram um método para análise do albendazol e seus metabólitos albendazol sulfóxido e albendazol sulfona em meio de cultura para posterior estudo de biotransformação enantiosseletivo e análise por HPLC-UV. Nesse método foi empregado a HF-LPME como técnica de extração. O modo empregado foi o de três fases, empregando 1-octanol como solvente orgânico e uma solução de HCl 0,1 mol L–1 como fase aceptora. A recuperação foi de 9, 33 e 20% para o albendazol, albendazol sulfóxido e albendazol sulfona, respectivamente. O limite de quantificação foi de 25 ng mL–1 para cada enantiômero do albendazol sulfóxido, 200 ng mL–1 para o albendazol e 50 ng mL–1 para o albendazol sulfona. Nesse estudo, os fungos que biotransformaram estereosseletivamente o ABZ foram: Nigrospora sphaerica (Sacc.) E. W. Mason (SS67), Pestalotiopsis foedans (VR8), Papulaspora immersa Hotson (SS13) e Mucor rouxii (NRRL 1894). Entre esses, o fungo Mucor rouxii merece destaque, visto que o processo de biotransformação rendeu um excesso enantiomérico de 91,2% para o enantiômero (+)-albendazol sulfóxido[16].

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A Figura 3 apresenta um cromatograma referente à biotransformação do albendazol pelo fungo SS13. Como pode ser observado, houve um consumo enantiosseletivo do substrato, dada a diferença na altura dos picos do ABZSOX. Carrão et al. desenvolveram um método para a determinação enantiosseletiva do metabólito ativo albendazol sulfóxido (ricobendazol) em meio de cultura líquido empregando a eletroforese capilar como técnica de análise e a HF-LPME. Nessa técnica foi empregado o modo de três fases, alcalinizando a fase doadora para um pH = 10 e como solvente orgânico foi empregado o 1-octanol. O limite de quantificação foi de 250 ng mL–1 e os valores de recuperação foram de 29%. Nesse estudo foi observado um processo de biotransformação enantiosseletiva pelo fungo endofítico Penicillium crustosum (VR4) e pelo fungo Mucor rouxii a partir do fármaco albendazol. O excesso enantiomérico obtido pelo fungo VR4 foi de 50,4% para o enantiômero (−)-albendazol sulfóxido[17]. A Figura 4 apresenta um eletroferograma referente a biotransformação do albendazol pelo fungo Mucor rouxii. Como

Figura 3 Cromatograma relativo à análise do ABZ após 72 horas de incubação com o fungo SS13. Em linha em preto apresenta a biotransformação pelo fungo; a linha em azul corresponde à extração do meio de cultura com o fungo na ausência do fármaco; e a linha em vermelho corresponde a extração do meio de cultura na ausência do fungo e do fármaco.

(1) ABZ, (2) (−)-ABZSOX, (3) (+)-ABZSOX.

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pode ser observado, houve uma biotransformação enantiosseletiva pelo fungo, com um enorme excesso enantiomérico para o (+)-albendazol sulfóxido (ABZSOX).

De Jesus et al. desenvolveram um método para análise enantiosseletiva dos metabólitos da risperidona, (9)-hidroxirisperidona e (7)-hidroxirisperidona em meio de cultura empregando a eletroforese capilar como técnica de análise e a HF-LPME como técnica de preparação de amostras. Nessa técnica foi empregado o modo de três fases e como solvente orgânico foi usado o 1-octanol. Os estudos de biotransformação empregando o fungo Mucor rouxii mostrou a formação preferencial do enantiômero (−)-9-hidroxirisperidona a partir da risperidona. Nesse estudo o excesso enantiomérico foi de 79,6%[18].

Com todas as vantagens já discutidas, a HF-LPME tem sido frequentemente aplicada para análise enantiosseletiva de fármacos e metabólitos em matrizes biológicas. Na Tabela 1 estão resumidos alguns exemplos dessa aplicação.

Figura 4 Eletroferograma relativo à análise do ABZ e biotransformação pelo fungo Mucor rouxii e extração por HF-LPME. (A) Análise após 96 horas de incubação; (B) Extração do meio de cultura com o fungo na ausência do fármaco; (C) Controle do meio de cultura estéril com ABZ. (1) (−)-ABZSOX, (2) (+)-ABZSOX, (PI) Padrão interno.

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Tabela 1 Aplicações da HF-LPME na análise enantiosseletiva de fármacos e metabólitos em matrizes biológicas.

Analito

Modo

Matriz

Solvente Extrator

Recuperação

Limite de Quantificação

Ref.

Venlafaxina e metabólitos

3 fases

Plasma

1-octanol

54% VF

5 ng mL–1

10

26% NDV

para todos

14% ODV Albendazol e metabólitos

3 fases

Meio de

9% ABZ

200 ng mL–1 ABZ

33% ABZSOX

25 ng mL (+) e (−) ABZSOX

20% ABZSO2

50 ng ml-1 ABZSO2

63-69%

100 ng mL–1

para todos

para todos

1-octanol

29%

250 ng mL–1

17

Acetato

19% ISR

50 ng mL–1 (R)- e (S)-ISR

19

1-octanol

cultura

Bufuralol e metabólitos

3 fases Microssoma

Ricobendazol

3 fases

Isradipina e metabólito

2 fases Microssoma

1-octanol

de rato Meio de

16

–1

13

cultura

Risperidona e metabólitos

de rato 3 fases

Meio de

de hexila 1-octanol

cultura

-1

23% PDI

50 ng mL PDI

60%

100 ng mL–1 Risp

para todos

50 ng mL–1 E1 e E2-7-RispOH

18

50 ng.ml-1 (+) e (−)-9-RispOH Venlafaxina e metabólitos

3 fases Microssoma

Mefloquina e metabólito

3 fases

Mirtazapina e metabólitos

3 fases

Cloroquina e metabólitos

3 fases

47% NDV

para todos

n-hexil éter

36% (SR) e (RS)-MQ 39% CMQ

50 ng mL–1

11

para todos

12

43% MTZ 32% DMR

1,25 ng mL–1

21

31% (+)-8-OHM

para todos

2 vezes Plasma

20

41% ODV

de rato Plasma

200 ng mL–1

1-octanol

n-hexil éter

18% (-)-8-OHM Plasma

1-octanol

29% CQ

5 ng mL–1 para

48% DCQ

cada enantiômero

22

66% BDCQ Oxibutinina e metabólitos

3 fases Microssoma n-hexil éter

Mirtazapina e metabólitos

3 fases

de rato Urina

n-hexil éter

312 ng mL–1 (R)- e (S)-OXY

58% OXY

23

-1

73% DEO

250 ng mL (R)- e (S)-DEO

78% MTZ

62,5 ng mL–1

23% DMR

para todos

24

23% 8-OHM Hidroxicloroquina 3 fases e metabólitos

Mirtazapina Citalopram e metabólito

2 fases 3 fases

Urina

1-octanol

10 ng mL–1 (R)- e (S)-HCQ

85% HCQ, 92% DCQ

21 ng mL (R)- e (S)-DHCQ, DCQ, BDCQ

29%

6,25 ng mL–1 (R)- e (S)-MTZ

DHCQ e BDCQ Plasma Plasma

Tolueno

25

–1

–1

Acetato de

46% CIT

5 ng mL (R)- e (S)-CIT

dodecila

29% DCIT

10 ng mL–1 (R)- e (S)-DCIT

26 27

VF: Venlafaxina; NDV: N-desmetilvenlafaxina; ODV: O-desmetilvenlafaxina; ABZ: Albendazol; ABZSOX: Albendazol sulfóxido; ABZSO2: Albendazol sulfona; ISR: Isradipina; PDI: Derivado piridínico da isradipina; Risp: Risperidona; 7-RIspOH: 7-hidroxirisperidona; 9-RispOH: 9-hidroxirisperidona; MQ: Mefloquina; CMQ: Carboximefloquina; MTZ: Mirtazapina; DMR: Demetilmirtazapina; 8-OHM: 8-hidroximirtazapina; HCQ: Hidroxicloroquina; DHCQ: Desetilhidroxicloroquina; DCQ: Desetilcloroquina; BDCQ: Bisdesetilcloroquina; OXY: Oxibutinina; DEO: N-desetiloxibutinina; CIT: Citalopram; DCIT: Desmetilcitalopram.

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3 Microextração em fase sólida (SPME - Solid Phase Microextraction ) A SPME foi desenvolvida pelo grupo de Pawliszyn em 1990 com o objetivo de extrair os analitos com maior seletividade e rapidez.

A aplicabilidade da técnica vem sendo extensivamente explorada e seu emprego é variado, desde determinação de poluentes em amostras ambientais como ar, água, solo; determinação de fármacos em fluidos biológicos como urina, sangue, cabelos; até mesmo na determinação de compostos aromáticos ou tóxicos presentes em alimentos[28,29]. Além disso, possibilitou o desenvolvimento de um sistema simples e capaz de ser levado ao local onde se encontra a amostra o que possibilita a extração “in situ” dos analitos de interesse[30].

A SPME é uma técnica de extração e pré-concentração não exaustiva com base nas condições de equilíbrio ou pré-equilíbrio dos analitos após um determinado tempo de contato entre os analitos e a fase extratora. As extrações são realizadas por polímeros (fase extratora) que estão suportados geralmente por fibras de sílica fundida. Quanto maior a afinidade do analito pela fase extratora, maior a quantidade de analito extraído[31]. Assim, o processo de extração é controlado pelas características físico-químicas do analito, da amostra e do polímero extrator.

As extrações podem ser feitas por dois modos: o modo de extração direta onde a fibra é mergulhada diretamente na amostra ou pelo modo indireto (headspace) de extração onde a fibra extrai os analitos voláteis presentes no interior de um frasco hermeticamente fechado.

Na extração direta, a fibra entra em contato com a matriz e os analitos são sorvidos na fase extratora até atingir o equilíbrio. Em amostras líquidas, é necessária a agitação para facilitar o Scientia Chromatographica 2013; 5(3):214-228

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transporte dos analitos até a fibra extratora; já em amostras gasosas a convecção do ar é suficiente para carregar os analitos até a fibra. Na configuração headspace os analitos voláteis chegam à fibra enquanto as macromoléculas e interferentes não voláteis não entram em contato com ela.

Além disso, a amostra pode possuir características como pH fora da faixa recomendada sem que haja danos à fibra[32]. Se os analitos de interesse tiverem baixa volatilidade e a matriz for complexa e/ou prejudicial à fibra, utiliza-se a extração indireta com uma membrana para proteção da fibra. Além disso, o uso da membrana pode adicionar certa seletividade ao método apesar de dificultar o transporte dos analitos até a fibra. O equilíbrio é atingido independente da posição da fase extratora[32]. Mais recentemente foi desenvolvido o método in tube SPME que consiste em um capilar, geralmente de sílica fundida, revestido internamente por uma membrana extratora. Um injetor automático apropriado pode ser adaptado ao sistema para que a amostra entre e saia do capilar até extração satisfatória[32].

Em SPME, assim que o equilíbrio de extração é atingido, a extração é encerrada e a fibra pode ser introduzida diretamente no instrumento analítico e os analitos serem dessorvidos termicamente (quando as análises são realizadas por GC). É possível também mergulhar a fibra contendo os analitos em um solvente apropriado, que posteriormente pode ser analisado por HPLC ou eletroforese capilar (CE)[33]. No caso da dessorção na técnica in tube SPME um solvente apropriado passa pelo capilar e dessorve os analitos que foram sorvidos em sua parede, carregando-os até o sistema de análise. Existem diversos tipos de revestimentos extratores nas fibras. A escolha das fibras é baseada na compatibilidade da fibra com as propriedades físico-quí221

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micas do analito a ser extraído, mas, em certos casos, também deve considerar a resistência à matriz da amostra.

3.1 Emprego da SPME em estudos enantiosseletivos em matrizes biológicas Bocato et al. desenvolveram um método para análise da risperidona e seus metabólitos quirais em meio de cultura empregando LC-MS/ MS e como técnica de preparação de amostras foi empregada a SPME. A fibra utilizada foi a C18 45 μm. Nesse método, foi adicionado 10% de NaCl ao meio de cultura e o pH foi ajustado para 7,0 com solução tampão fosfato. As amostras foram agitadas durante 30 minutos a 600 rpm. O estudo de efeito residual (carryover) apresentou resultados superiores a 15%. Dessa forma, após o procedimento de dessorção, as fibras foram lavadas com metanol durante 30 minutos. Com esse procedimento, o efeito residual foi eliminado. Nesse estudo o limite de quantificação alcançado foi de 25 ng mL-1 para os metabólitos e 50 ng mL–1 para a risperidona. Os valores de recuperação foram de 26% para os todos os analitos. Os estudos de biotransformação enantiosseletiva mostraram que os fungos Cunninghamella echinulata var. elegans ATCC 8688A e Cunninghamella elegans ATCC 10028B foram capazes de biotransformar estereosseletivamente a risperidona em seu metabólito ativo 9-hidroxirisperidona, sendo que o Cunninghamella echinulata foi capaz de produzir o enantiômero (+)-9-hidroxirisperidona com excesso enantiomérico de 100%[28,34].

Nesse trabalho, o sistema de agitação empregado (Figura 5) permitiu a extração de 36 amostras ao mesmo tempo, levando assim a uma economia substancial de tempo.

De Santana et al. desenvolveram uma método para análise enantiosseletiva da mirtazapina e seu metabólitos em urina empregando 222

Figura 5 Esquema de extração por SPME empregando fibras C18 e agitador tipo Vibrax®. Possibilidade de extrair 36 amostras ao mesmo tempo.

LC-MS/MS e SPME. Nesse trabalho, as amostras de urina foram alcalinizadas para um pH = 8 e o procedimento de extração foi realizado por imersão direta da fibra PDMS-DVB 60 μm na amostra durante 30 minutos a 1100 rpm. Os valores de recuperação variaram de 0,8 a 5,5% e o limite de quantificação alcançado para mirtazapina e metabólitos foi de 62 ng mL–1. Os resultados da análise de amostras de urina humana coletados após uma dose oral de mirtazapina foram plotados em um gráfico de quantidade excretada acumulada versus intervalo de coleta. Os resultados mostraram que uma porcentagem elevada da dose administrada foi excretada na forma do análogo 8-hidroximirtazapina sendo que o enantiômero (+)-(S)- foi excretado em uma quantidade maior do que o enantiômero (−)-(R)- no período estudado[35].

De Oliveira et al. desenvolveram um método para análise enantiosseletiva da hidroxicloroquina e seus metabólitos em urina empregando Scientia Chromatographica 2013; 5(3):214-228

Análise enantiosseletiva de fármacos e metabólitos em matrizes biológicas

HPLC-UV e SPME. Nesse trabalho, os autores empregaram como fibra de extração a PDMSDVB 60 μm e o pH da amostra foi ajustado para 10. O tempo total de extração foi de 40 minutos.

O efeito salting out foi avaliado e mostrou que o máximo de eficiência de extração foi obtido com adição de 10% de NaCl para os enantiômeros da hidroxicloroquina (HCQ) e desetilcloroquina (DCQ). Porém, para a desetilidroxicloroquina (DHCQ), o máximo de recuperação foi atingido com a adição de 20% de NaCl. Com quantidades maiores de sal houve decréscimo na recuperação devido, provavelmente, à maior viscosidade do meio e/ou a interação dos analitos com o NaCl. Portanto, 10% de NaCl foi utilizado nas análises. Os valores de recuperação ficaram em torno de 10% para os analitos e o limite de quantificação para HCQ e seus metabólitos foram, respectivamente, 50 e 42 ng mL–1. Do total da dose administrada, 2,6, 0,08 e 0,08% foram excretados como HCQ, DHCQ e DCQ, respectivamente.

Além disso, a excreção mostrou ser estereosseletiva, no tempo estudado, com o enantiômero (+)-(S)- sendo excretado em uma maior quantidade do que o enantiômero (−)-(R)- para todos os analitos[36].

De Oliveira et al. desenvolveram um método para a análise enantiosseletiva do ibuprofeno[37] e de seus principais metabólitos[38] em urina empregando a cromatografia líquida de alta eficiência com detecção por UV e a SPME como técnica de preparação de amostras. Na análise enantiosseletiva do ibuprofeno em urina, o uso da fibra polar CW-TPR 50 μm demonstrou a maior eficiência de extração. Porém, essa fibra não possui uma estabilidade adequada para valores ácidos de pH, já que o pH ideal de extração foi de 2,5. Dessa forma, optou-se pelo emprego da fibra PDMS-DVB 60 μm, a qual possui resistência a um maior intervalo de pH. A força iônica da amostra foi ajustada com 10% de NaCl e o tempo Scientia Chromatographica 2013; 5(3):214-228

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final de extração foi de 30 minutos. Com essas condições, os autores obtiveram uma recuperação de 19,8 e 19,1% para o (−)-R-ibuprofeno e (+)-(S)-ibuprofeno, respectivamente37.

Baseado no sucesso obtido no trabalho anterior, de Oliveira et al., desenvolveram um método para análise enantiosseletiva dos principais metabólitos do ibuprofeno, carboxi-ibuprofeno e 2-hidroxi-ibuprofeno, em urina. Nesse trabalho os autores empregaram a HPLC-UV acoplada à SPME off-line. Devido à elevada polaridade dos analitos, foi necessário o uso da fibra polar CW-TPR 50 μm em pH ácido. Portanto, na tentativa de prolongar o uso da fibra, as extrações foram realizadas controlando o pH das amostras de urina em 3,8. A força iônica da amostra foi ajustada com 20% de NaCl e o tempo final de extração foi de 30 minutos. Com essas condições, os autores obtiveram uma recuperação de, aproximadamente, 1,5% para os metabólitos do ibuprofeno. Mesmo sendo considerada baixa a quantidade recuperada, o método foi capaz de quantificar os analitos até um período de 24 horas. Do total da dose administrada, 20,1 e 40,2% (expresso como porcentagem da dose administrada) foram excretados como 2-hidroxi e carboxi- metabólitos, respectivamente[38].

A Tabela 2 resume os trabalhos envolvendo análise enantiosseletiva de fármacos e metabólitos em matrizes biológicas empregando SPME como técnica de preparação de amostras.

3.2 Microextração líquido-líquido dispersiva (DLLME – dispersive liquid-liquid microextraction ) A DLLME foi apresentada por Rezaee et al. em 2006[39]. É uma técnica baseada na dispersão de dois solventes (extrator e dispersor) em uma solução aquosa contendo o analito. Uma mistura dos solventes dispersor e extrator é injetada rapi223

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Análise enantiosseletiva de fármacos e metabólitos em matrizes biológicas

Tabela 2 Aplicações da SPME na análise enantiosseletiva de fármacos e metabólitos em matrizes biológicas.

Analito

Matriz

Risperidona e metabólitos

Meio de cultura

Mirtazapina e metabólitos

Fibra extratora Recuperação

Urina

C18

28% Risp

Limite de Quantificação 50 ng mL–1 Risp

34

–1

11% 7-RispOH

25 ng mL E1 e E2 7-RispOH

16% 9-RispOH

25 ng mL-1 (+) e (−)-9-RispOH

5,4% MRT

62 ng mL–1

1,7% DMR

para todos

PDMS-DVB

Ref.

35

1% 8-OHM Hidroxicloroquina e metabólitos Ibuprofeno 2-hidroxi-ibuprofeno

Urina

Urina Urina

PDMS-DVB

9,3% HCQ

50 ng mL–1 HCQ

14,4% DCQ

42 ng mL–1 DCQ

9,2% DHCQ

42 ng mL-1 DHCQ

19%

0,25 µg mL–1

CWTPR CWTPR

Carboxi-ibuprofeno

1,5% 2-OHIbu

5 µg mL

5% COOHIbu

para todos

Risp: Risperidona; 7-RispOH: 7-hidroxirisperidona; 9-RispOH: 9-hidroxirisperidona; Desmetilmirtazapina; 8-OHM: 8-hidroximirtazaina; HCQ: Hidroxicloroquina; DCQ: Desetilidroxicloroquina; 2-OHIbu: 2-hidroxi-ibuprofeno; COOHIbu: carboxi-ibuprofeno.

damente, com auxílio de uma microseringa, na solução aquosa, causando a turvação do meio (ponto nuvem-PN), o qual passa a conter a dispersão de microgotas[39-44]. Essas microgotas representam a dispersão do solvente extrator na fase aquosa fornecendo uma grande área superficial o que facilita a partição do analito a ser extraído e, assim, permite que o equilíbrio seja atingido rapidamente. A amostra é então centrifugada e a fase sedimentada é coletada com uma microseringa para ser analisada pelo método escolhido. Vários fatores influenciam a extração por DLLME, como volume e tipo de solventes extrator e dispersor, pH da amostra e tempo de extração (DLLME assistida)[40].

3.3 Emprego da DLLME em estudos enantiosseletivos em matrizes biológicas Para possibilitar a formação do ponto nuvem, o solvente dispersor deve ser solúvel no solvente extrator e também na fase aquosa.

224

–1

36

37 38

MRT: Mirtazapina; DMR: Desetilcloroquina; DHCQ:

Geralmente, pequenos volumes do solvente dispersor não são suficientes para a dispersão do solvente extrator e formação apropriada do ponto nuvem. Em contrapartida, volumes muito grandes podem aumentar a solubilidade do analito na fase aquosa diminuindo, assim, a recuperação. Simões et al. desenvolveram um método para análise enantiosseletiva da ranolazina (RNZ) e seu metabólito desmetilranolazina (DRNZ) em microssomas hepático de ratos empregando LC-MS/MS e DLLME. Os solventes utilizados foram acetona (dispersor) e clorofórmio (extrator) nos volumes de 800 μL e 100 μL respectivamente. O volume total da amostra foi de 2 mL e o pH ajustado para 7,4. A centrifugação foi realizada por 3 minutos a 4000 rpm. O método foi validado obtendo-se recuperação de 55 e 45% para a ranolazina e seu metabólito, respectivamente. O LOQ obtido foi de 25 ng mL–1 para a RNZ e 10 ng mL–1 para DRNZ. Nesse trabalho foi avaliada a influência do emprego do ultrassom (US) na recuperação dos analitos variando o tempo em que as amostram ficaram Scientia Chromatographica 2013; 5(3):214-228

Análise enantiosseletiva de fármacos e metabólitos em matrizes biológicas

Albuquerque NCP, Bortoleto MA, Oliveira ARM

em contato com o US entre 0 a 5 minutos. Esse tipo de artifício vem sendo chamado de DLLME assistida (quando a amostra é agitada após a formação do ponto nuvem). Não só ultrassom vem sendo empregado, mas também a agitação em agitadores tipo “vórtex” (VX). Nesse trabalho, não houve diferença na eficiência com o uso do ultrassom levando à conclusão de que a formação do ponto nuvem foi suficiente para atingir o [45]

equilíbrio de extração .

Fortes et al. desenvolveram um método para análise enantiosseletiva da hidroxizina (HZ) e da cetirizina (CTZ) em meio de cultura para pos-

Figura 6 Eficiência da extração no método por DLLME usando ponto nuvem (PN), ponto nuvem + vórtex (PN + VX), ponto nuvem + ultrassom (PN + US) e ponto nuvem + vórtex + ultrassom (PN + VX + US) para extração dos enantiômeros da hidroxizina e seu metabólito cetirizina de meio de cultura liquido.

E = Enantiômero.

terior estudo de biotransformação com fungos.

Nesse método, a separação enantiosseletiva foi realizada por eletroforese capilar e a DLLME foi empregada como técnica de preparação de amostras. Como solvente dispersor foi empregado etanol (400 μL) e como solvente extrator clorofórmio (300 μL). Após a injeção dos solventes e formação do ponto nuvem, as amostras foram agitadas durante 30 segundos a 2000 rpm em vórtex (DLLME assistida) e centrifugadas durante 5 minutos a 3000 rpm. O resíduo foi coletado e levado para análise. Nesse trabalho também foi avaliada a influência do ultrassom na eficiência da extração. Contudo, provavelmente, devido a perda de solvente extrator por evaporação, a eficiência foi menor utilizando ultrassom após a formação do ponto nuvem (Figura 6). As recuperações médias para os analitos situaram-se entre 87-91% e o limite de quantificação foi de 250 ng mL–1 para hidroxizina e 125 ng mL–1 para cetirizina. Dentre os fungos estudados, três foram capazes de converter a HZ em CTZ enantiosseletivamente, especialmente o fungo Cunninghamella elegans ATCC 10028 que converteu 19% de (E1)-HZ em (S)-CTZ com excesso enantiomérico de 65%[46].

Scientia Chromatographica 2013; 5(3):214-228

4 Conclusões O artigo apresentou uma revisão das aplicações da HF-LPME, SPME e DLLME na análise enantiosseletiva de fármacos e metabólitos em matrizes biológicas, tais como plasma, urina, meio de cultura, entre outros. O emprego da HF-LPME oferece muitas vantagens frente a outras técnicas convencionais, como excelente limpeza da matriz, elevada pré-concentração, reduzido consumo de solvente orgânico, baixo custo, simplicidade, possibilidade de injeção direta da fase aceptora no equipamento de análise e ausência de contaminação entre as extrações (carryover).

Além disso, geralmente apresenta altos valores de recuperações. A HF-LPME ainda é considerada uma técnica recente, e está em desenvolvimento no sentido de se obter extrações mais seletivas e com maior recuperação, como é o caso da EME. A técnica miniaturizada, SPME, apresenta vantagens como a possibilidade de uso on site, que permite a análise direta de amostras biológicas in vivo, e também permite a análise de pequenas quantidades de amostra. Além disso, empregando o formato apresentado na Figura 5 é possível a extração de 36 amostras ao mesmo tempo, conferindo assim uma grande economia de tempo.

Comparado a outras técnicas miniaturizadas, o 225

Albuquerque NCP, Bortoleto MA, Oliveira ARM

Análise enantiosseletiva de fármacos e metabólitos em matrizes biológicas

processo por SPME, normalmente, resulta em baixos valores de recuperação o que limita muito a utilização da técnica na análise de fármacos e metabólitos em matriz biológica, devido aos baixos limites de quantificação requeridos nessas análises. Nesse caso, o emprego de detectores com elevado poder de detecção é fundamental. A técnica DLLME exibe diversas vantagens, principalmente os altos valores de recuperações atingidos e a rapidez nas extrações, além do elevado fator de enriquecimento. Além disso, a DLLME promove satisfatória limpeza das amostras e não depende da disponibilidade de fibras comerciais como a HF-LPME e SPME. Contudo, nessa técnica, o uso de solventes orgânicos ainda é considerável frente a SPME e HF-LPME. Em resumo, o uso de técnicas de preparação de amostras miniaturizadas vem sendo cada vez mais empregados na análise enantiosseletiva de fármacos e metabólitos; contudo o aumento no número de aplicações nessa área dependerá, principalmente, do desenvolvimento da automação dessas técnicas, permitindo um maior processamento no número de amostras (highthroughput).

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Agradecimentos Os autores gostariam de agradecer a FAPESP (Processo no 2011/17508-1, Processo no 2012/21578-8), CPNq e CAPES pelos auxílios financeiros concedidos.

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Recebido: 11/09/2013 Aceito: 14/10/2013

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Scientia Chromatographica 2013; 5(3):229-242 Instituto Internacional de Cromatografia DOI: http://dx.doi.org/10.4322/sc.2014.006

CROMATOGRAFIA GASOSA

ISSN 1984-4433

Avaliação de fragrância em detergente em pó por microextração em fase sólida e cromatografia gasosa Robson Bonfim Godinho, Carla Beatriz Grespan Bottoli* Departamento de Química Analítica, Instituto de Química, Universidade Estadual de Campinas – UNICAMP, Cep 13083-970, Campinas, SP, Brasil e-mail: carlab@iqm.unicamp.br

Resumo Fragrância é uma mistura de moléculas orgânicas como ésteres, cetonas, aldeídos, hidrocarbonetos, alcoóis, entre outras, tendo como fontes substâncias de origem natural ou sintética, que quando combinadas em proporções harmônicas conferem uma característica odorífera ímpar em um perfume ou em um produto perfumado. Considerando essa característica, este trabalho teve como objetivo o desenvolvimento de um método de análise para compostos voláteis provenientes de uma fragrância aplicada em detergente em pó, utilizando a técnica de microextração em fase sólida no headspace, (em inglês, Headspace – Solid Phase Micro Extraction, HS-SPME) e análise por cromatografia gasosa.

Palavras-chave Fragrância; micro-extração em fase sólida; compostos voláteis.

Evaluation of fragrance detergent powder by solid-phase microextraction and gas chromatography Abstract Fragrance is a mixture of organic molecules such as esters, ketones, aldehydes, hydrocarbons and alcohols, among others, using as sources substances of natural or synthetic origin, which, when combined in harmonious proportions, confer a unique characteristic to a perfume or a scented product.

Considering this feature, the objective of this work was the development of a method of analysis of volatile compounds from a fragrance applied in powder detergent by gas chromatography using the technique of Headspace - Solid Phase Micro Extraction, HS-SPME. Keywords Fragrance; solid phase micro extraction; volatile compounds.

Godinho RB, Bottoli CBG

1 Introdução As novas exigências dos consumidores no mercado de limpeza doméstica, que se resume em produtos mais eficazes, de maior praticidade, melhor desempenho e preço acessível, têm alavancado o setor no país, com crescimento tanto no volume produzido quanto em seu faturamento. Em 2010 foram produzidos aproximadamente 3,3 milhões de toneladas de produtos de limpeza gerando um faturamento de aproximadamente 13,5 bilhões de reais[1].

De acordo com um levantamento divulgado pela ABIPLA, Associação Brasileira das Indústrias de Produtos de Limpeza e Afins, em seu anuário 2011, os produtos de limpeza estão presentes na maioria dos lares brasileiros, independente da classe social. Alguns itens, no entanto, têm maior penetração, como é o caso dos detergentes em pó, que está presente em 99,6% dos domicílios, representando um faturamento de 3,7 bilhões de reais em 2010[1]. Dentre os componentes que fazem parte desse produto a fragrância possui papel importante nesse resultado. Geralmente o perfume não contribui diretamente para a função de limpeza do detergente, entretanto é um importante fator para atrair consumidores, já que, geralmente, quando estão adquirindo produtos de limpeza, os consumidores primeiro sentem o perfume do produto antes de decidirem pela compra.

230

Avaliação de fragrância em detergente em pó

mistura homogênea de produtos naturais e sintéticos. Geralmente uma fragrância consiste de uma mistura contendo entre 20 a 200 diferentes compostos[3]. A demanda mundial por produtos naturais para fabricação de fragrâncias está entre 20-30%, enquanto para produtos sintéticos varia entre 70-80%[3]. Com relação à quantidade de diferentes compostos disponíveis, esse número supera 3000 ingredientes, em sua maioria líquidos e não cristalinos.

O pré-requisito de uma substância química para realizar um estímulo olfativo é ter uma volatilidade suficiente para se apresentar no ar. Por essa razão a natureza dos grupos funcionais, a estrutura e a massa molar são fatores importantes a serem considerados, pois influenciam a capacidade de difusão dessa substância no ambiente.

A fragrância aplicada em produtos dessa natureza apresenta três funções básicas: cobrir o odor da base e o odor dos sólidos dissolvidos na solução de lavagem, transmitir sensação de limpeza e perfumar.

A percepção de um perfume depende da presença de moléculas odorizantes, de sua natureza e concentração[4]. Assim, conhecer a interação entre uma fragrância e o produto que se deseja perfumar tem se tornado um elemento fundamental na perfumaria moderna. Como os perfumes de composição conhecida possuem uma grande variedade de compostos voláteis, cada um com características físico-químicas diferentes, a determinação inequívoca de cada componente da fragrância deve ser bem criteriosa. Como os compostos apresentam volatilidade diferenciada devido à natureza química, o odor de uma fragrância se modifica durante sua evaporação. Por esse motivo pode ser classificada em nota de topo, nota intermediária ou de corpo e nota de fundo ou nota seca, que consiste basicamente nos períodos de evaporação dos componentes na mistura[2].

Fragrâncias são substâncias orgânicas com características odoríferas relativamente fortes e normalmente agradáveis sendo, portanto, usadas em perfumes e produtos perfumados[2]. Após sua formulação apresenta-se como uma complexa

Com os recentes avanços nas técnicas de extração de compostos voláteis, novos métodos e técnicas estão sendo desenvolvidos e podem ser aplicadas para conhecer melhor o comportamento das fragrâncias[5], auxiliando na criação de Scientia Chromatographica 2013; 5(3):229-242

Avaliação de fragrância em detergente em pó

novas fórmulas que apresentem melhor desempenho quando aplicado em detergente em pó ou em qualquer outra base que se deseja perfumar.

Além disso, as indústrias que produzem fragrâncias devem disponibilizar aos seus clientes produtos com qualidade, sendo que as variáveis sensoriais e físico-químicas dessas misturas odoríferas bem como dos componentes naturais e sintéticos de que compõem as fragrâncias, devem ser comparados com padrões e especificações pré-definidos. Uma grande parte dessas especificações, principalmente às relacionadas à matéria prima, está estabelecida em literatura oficial, como Farmacopéia, International Organization for Standardization (ISO), Associação de Óleos Essenciais e Índex Merck[2].

Compostos considerados mais simples e bem conhecidos são caracterizados normalmente por constantes físicas, como densidade, índice de refração, rotação óptica e ponto de fusão. As vantagens desses parâmetros estão relacionadas à rapidez das análises e a possibilidade de comparação entre diferentes laboratórios e, por isso são indispensáveis. No entanto, para compostos mais complexos que requerem identificação e quantificação, são empregadas técnicas mais sofisticadas, como as cromatográficas e espectroscópicas.

O desenvolvimento e aplicação de métodos para a determinação da composição química de fragrâncias é uma tarefa desafiante, devido à algumas propriedades inerentes a essas amostras, dentre as quais se destacam[6]: • A concentração de analitos relevantes em amostras perfumadas pode estar em concentrações extremamente baixas; • Muitas fragrâncias são derivadas de misturas bastante complexas, como os óleos essenciais; Scientia Chromatographica 2013; 5(3):229-242

Godinho RB, Bottoli CBG

• Alguns compostos possuem limitada estabilidade química, devido à fotólise, oxidação e outras reações.

Para a realização das análises das amostras, um isolamento adequado e uma pré-concentração do analito ativo para o odor são mandatórios e crítico na metodologia para caracterização química de fragrâncias. Para isso, podem ser empregados métodos clássicos como extração direta[7], na qual a extração com um solvente puro ou misturas de solventes é seguida da evaporação deste solvente, ou pela técnica de destilação[6].

As técnicas mais recentes de amostragem de voláteis utilizam pouco ou nenhum solvente orgânico. Como em outras técnicas, dependem da partição entre os analitos da matriz e uma fase extratora que pode ser um gás, um líquido ou um adsorvente. Estas técnicas incluem: amostragem estática no espaço livre – headspace estático, amostragem dinâmica no espaço livre – headspace dinâmico, extração com fluido supercrítico e microextração em fase sólida (SPME).

SPME é uma técnica de preparação de amostra introduzida em 1990[8], que ganhou popularidade para análises de fragrâncias, especialmente como uma alternativa para a técnica de amostragem dinâmica no espaço livre. É especialmente adequada para análises qualitativas e quantitativas de amostras odoríferas, sendo que o requisito é a exposição de uma fibra no headspace contido acima da amostra por um período de tempo, seguido pela dessorção térmica direta no sistema de injeção aquecido do cromatógrafo a gás. Por esta razão, a técnica de SPME é considerada a melhor escolha disponível para preparação de amostras em análises de fragrâncias.

Poucos trabalhos podem ser encontrados na literatura que demonstram a aplicação da técnica de SPME para análise de fragrâncias incorporadas em produtos de higiene pessoal, como xampus[9] e sabonetes[10] ou produtos para cuidados 231

Godinho RB, Bottoli CBG

Avaliação de fragrância em detergente em pó

domésticos como detergente líquido, amaciante e cera[11]. Há exemplos de estudos que avaliaram o impacto da fragrância em embalagens cosméticas[12] e o perfil de evaporação de um perfume na pele humana[13]. No entanto, o número de trabalhos publicados com esse fim é bastante limitado.

utilizados os seguintes compostos: manzanate

O objetivo deste trabalho foi desenvolver um método de extração e quantificação de uma mistura de compostos provenientes de uma fragrância aplicada em uma base de detergente em pó. A matriz do detergente em pó é composta principalmente de um surfactante no qual as fragrâncias são adicionadas para dar ao produto uma agradável sensação de limpeza. Esta complexa matriz representa um desafio para os analistas e, apesar da importância deste mercado, não há métodos oficiais para a quantificação dos componentes das fragrâncias. Além disso, a forte afinidade dos analitos pela matriz, torna o processo de extração uma tarefa difícil.

tato de metilbenzila), dimethyl benzyl carbinyl

(2-metil pentanoato de etila), tetrahydro linalol (3,7-dimetiloctan-3-ol), dihydro myrcenol (2,6-dimetil-7-octen-2-ol), tetrahydro geraniol (3,7-dimetil-1-octanol), ethyl benzoate (benzenocarboxilato de etila), styrallyl acetate (aceacetate (acetato de 1,1-dimetil-2-fenil etila), pivarose (2,2-dimetilpropanoato de 2-feniletila), phenyl ethyl alcohol (2-fenil-1-etanol), ethyl cinnamate (3-fenilpropenoato de etila), alcohol C12 (dodecanol), dimethyl phenyl ethyl carbinol (2-metil-4-fenil-2-butanol), diphenyl oxide (fenoxibenzeno), eugenol [2-metiloxi-4-(2-propenil)-fenol], rosacetone (acetato de 2,2,2-tricloro-1-feniletila),

methyl

antrani-

late (2-aminobenzoato de metila), tonalid 2 [1-(5,6,7,8-tetrahidro-3,5,5,6,8,8-hexametil-2-naftil)etan-1-ona], benzophenone (fenilcetona), vanillin (4-hidroxi-3-metoxi-benzaldeido), ras-

2 Experimental

pberry ketone [4-(4-hidroxifenil)-2-butanona)].

Esses padrões foram fornecidos pela Quest

2.1 Materiais Para análise dos compostos voláteis, foi utilizado um holder de SPME para amostragem manual da Supelco (Bellefonte, PA, USA) e quatro fibras comerciais recobertas com 100 μm polidimetilsiloxano (PDMS), 65 μm polidimetilsiloxano/divinilbenzeno (PDMS/DVB), 65 μm carbowax/divinilbenzeno (CW/DVB) e 75 μm carboxen/polidimetilsiloxano (CAR / PDMS).

Esses materiais foram adquiridos da Sulpelco.

Foram utilizados frascos de vidro de 20 mL com tampa de plástico e septo de silicone/teflon também da Supelco.

International (Vinhedo, SP, Brasil) e possuem grau de pureza superior a 99%.

2.3 Instrumental As análises foram realizadas em um cromatógrafo a gás com detector por ionização em chama (GC-FID) 6890N, Agilent Technologies (China), equipado com duas colunas conectadas a um injetor split/splitless. A primeira coluna capilar CP-WAX 58 (FFPA) CB (ácido nitrotereftálico quimicamente ligado com polietilenoglicol), 25 m × 0,25 mm × 0,2 μm, Varian (SP, Brasil), foi conectada a um dos detectores

232

2.2 Reagentes

(FID_1). A segunda coluna BP1, (100% dime-

O detergente em pó sem perfume (base) foi fornecido pela Quest International (Vinhedo, SP, Brasil). Para composição do perfume foram

tilpolisiloxano), 25 m × 0,22 mm, 0,25 μm, SGE (Austrália), foi conectada ao segundo detector do equipamento (FID_2).

Scientia Chromatographica 2013; 5(3):229-242

Avaliação de fragrância em detergente em pó

Na aquisição e avaliação dos dados foi utilizado o software Chemstation Rev. A.10.01, Agilent Technologies (USA).

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sendo que em cada aplicação foi pesado 130 g do detergente e incorporado 0,3% m/m do óleo.

Após a aplicação, a substância foi homogeneizada em sacos de polietileno permanecendo por

2.4 Otimização das condições de extração e avaliação das amostras de detergente em pó A fragrância foi elaborada misturando-se os 20 compostos citados no item 2.2 com a massa necessária para que tivessem a mesma concentração na mistura (5% m/m) obtendo-se o óleo da fragrância sintética.

Para a otimização das condições de extração foram separadas três amostras de 100 g do detergente em pó sem perfume e incorporado 0,3% m/m do óleo em cada amostra. Essas amostras foram embaladas em cartuchos de papelão – que reproduzem as embalagens comerciais de detergente em pó com um volume menor de amostra (130 g) - e mantidas em temperatura ambiente por duas semanas para incorporação do perfume à base.

24 h nessa embalagem. Passado esse período, as amostras foram armazenadas em cartuchos. Um cartucho foi submetido à temperatura de 4 °C, na geladeira; um cartucho foi submetido à temperatura de 37 °C e umidade relativa 70%, na estufa de temperatura e umidade controlada; e um cartucho foi submetido à temperatura de 45 °C, na estufa de temperatura controlada. Os cartuchos ficaram armazenados em cada uma destas condições por duas semanas. Para as análises destas amostras, foram pesados 3,0 g do detergente em pó em um frasco de 20 mL e as condições de extração foram aquelas otimizadas na etapa anterior.

Para a quantificação foi empregado o método de calibração externa. As curvas analíticas foram construídas a partir das áreas obtidas pelas extra-

Após esse período, iniciou-se a investigação dos parâmetros que afetam as condições de extração por SPME, como a seleção de fibra, o efeito da massa de amostra, o efeito da temperatura, do tempo de pré-equilíbrio e do tempo de adsorção. A etapa de otimização foi feita em duplicata. As quatro fibras comercialmente disponíveis, 100 μm PDMS, 65 μm PDMS/DVB, 65 μm CW/DVB e 75 μm CAR/PDMS foram usadas para verificação da capacidade de extração dos compostos em estudo. Antes do uso, as fibras foram condicionadas por aquecimento no injetor do cromatógrafo a gás a uma temperatura de 200 °C por 1 h para remover os contaminantes.

Todas as extrações foram realizadas no headspace da amostra em frasco de vidro de 20 mL.

ções de 3,0 g do detergente em pó com diferentes

Para a etapa de quantificação dos compostos em diferentes amostras de detergente em pó, foi aplicado o óleo em um grupo de 3 amostras,

injetor e detector foram mantidas a 200 °C e 300

Scientia Chromatographica 2013; 5(3):229-242

concentrações do óleo. Esse procedimento foi repetido usando sempre a mesma quantidade de detergente em pó e variando a massa de óleo.

2.5 Análise cromatográfica Após a extração, a fibra de SPME foi removida do frasco com amostra e imediatamente inserida no injetor do cromatógrafo a gás onde ocorreu a dessorção térmica a 200 °C, deixando a fibra exposta no injetor por 10 min. As condições de separação foram as seguintes: temperatura inicial do forno, 70 °C, aquecimento 10 °C/min até 150 °C e 13 °C/min até a temperatura final de 250 °C mantida por 8 min. Temperatura do °C, respectivamente. O hidrogênio, pureza 5,0, White Martins (Osasco, SP, Brasil), foi utilizado 233

Godinho RB, Bottoli CBG

como gás de arraste com pressão 15,0 psi e vazão de 3,2 mL/min para coluna 1 e 1,9 mL/min para coluna 2.

O hidrogênio e ar sintético, pureza 5.0, White Martins, foi utilizado no detector 1 com vazão de 28,7 mL/min para o H2 e 450,0 mL/min para o ar sintético e, no detector 2, 26,8 mL/min para o H2 e 450,0 mL/min para o ar sintético.

Avaliação de fragrância em detergente em pó

colunas acopladas ao mesmo injetor. A Figura 1 mostra o perfil dos cromatogramas obtidos após definição dos principais parâmetros que permitiram uma boa resolução cromatográfica.

3.1 Otimização das condições cromatográficas e de extração

A identificação de cada pico foi realizada após a injeção individual de cada composto. Esse processo foi facilitado pelo fato de cada composto apresentar dois picos por análise, ou seja, um pico para cada coluna, em tempos de retenção diferentes. Assim, os compostos com tempos de retenção muito próximos em uma coluna foram separados e identificados pela segunda coluna. A Tabela 1 contém o tempo de retenção para todos esses componentes.

A otimização das condições cromatográficas visando a separação de todos os componentes foi avaliada em duas colunas com polaridades distintas e essa avaliação foi possível devido à configuração do cromatógrafo, que possui duas

Com base nos cromatogramas observou-se que o tempo de análise para a coluna capilar BP1 foi menor e a resolução foi mais adequada, uma vez que apenas dois compostos não separaram completamente. Já na coluna CP-WAX o número

3 Resultados e discussão

Figura 1 Cromatogramas obtidos da fragrância pura. (A) coluna capilar CP-WAX 58 (FFPA) CB, 25 m × 0,25 mm × 0,2 µm, temperatura inicial 70 °C, aquecimento 10 °C/min até 150 °C e 13 °C / min até a temperatura final 250 °C mantida por 8 min. Temperatura do injetor e detector foram mantidas a 200 °C e 300 °C, hidrogênio com gás de arraste com pressão 15,0 psi e vazão de 3,2 mL/min. (B) coluna capilar BP1, 25 m × 0,22 mm × 0,25 µm, temperatura inicial de 70 ºC, aquecimento 10 °C / min até 150 °C e 13 °C/min até a temperatura final de 250 °C mantida por 8 min, temperatura do injetor e detector foram mantidas a 200 °C e 300 °C, hidrogênio com gás de arraste com pressão 15,0 psi e vazão de 1,9 mL/min.

234

Scientia Chromatographica 2013; 5(3):229-242

Avaliação de fragrância em detergente em pó

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Tabela 1 Fórmula molecular dos compostos utilizados na elaboração da fragrância e o tempo de retenção para as duas colunas.

Descrição

Fórmula Molecular

tR FID_1 (min)

tR FID_2 (min)

Manzanate

C8H16O2

2,08

1,75

Tetrahydro Linalol

C10H22O

4,75

3,22

Dihydro Myrcenol

C10H20O

5,17

2,91

Tetrahydro Geraniol

C10H22O

7,47

4,34

Ethyl Benzoate

C9H10O2

7,51

3,89

Styrallyl Acetate

C10H12O2

7,90

4,14

Dimethyl Benzyl Carbinyl Acetate

C12H16O2

8,71

5,81

Pivarose

C13H18O2

9,58

7,08

Phenyl Ethyl Alcohol

C8H10O

10,16

3,19

Alcohol C12

C12H26O

10,67

7,91

Dimethyl Phenyl Ethyl Carbinol

C11H16O

10,67

5,43

Diphenyl Oxide

C12H10O

11,11

6,78

Ethyl Cinnamate

C11H12O2

12,13

7,55

Eugenol

C10H12O2

12,41

6,22

C10H9CL3O2

12,75

8,68

Methyl Anthranilate

C8H9NO2

13,01

5,91

Tonalid 2

C18H26O

14,22

11,87

Benzophenone

C13H10O

14,86

9,37

C8H8O3

15,38

6,49

C10H12O2

18,93

8,45

Rosacetone

Vanillin Raspberry Ketone

de componentes que não apresentaram completa separação foram quatro. Outra vantagem da coluna BP1 foi o sinal mais intenso para todos os picos. Portanto, a coluna BP1 mostrou as melhores condições para a separação dos compostos da fragrância e foi a coluna escolhida para a otimização das condições de extração.

Para a extração dos compostos do detergente em pó, o modo headspace foi escolhido para evitar a degradação da fibra que poderia ser causada pelos componentes da base do detergente.

A seleção das fibras deve ser baseada inicialmente nas características de polaridade e volatilidade dos analitos de interesse. No entanto, nos casos em que as amostras possuem um grande número de analitos, com propriedades físicas e Scientia Chromatographica 2013; 5(3):229-242

químicas diferentes, a avaliação de diferentes fibras é importante para conhecer qual fibra possui maior afinidade com os analitos.

Quatro tipos de fibras foram avaliados nesse trabalho. Na Figura 2 pode-se verificar que as fibras que apresentaram melhor desempenho foram as de PDMS e de PDMS/DVB. Todas as extrações foram realizadas a temperatura de 80 °C, 5 min para pré-equilíbrio e 5 min de equilíbrio.

A Figura 3 mostra a extração de cada composto obtido pelas fibras de PDMS e PDMS/ DVB. Pode ser visto que a maioria dos compostos desta fragrância possue maior afinidade pela fibra de PDMS/DVB. A associação do polidimetilsiloxano com divinilbenzeno ampliou a capacidade de sorção dos compostos com caracterís235

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Avaliação de fragrância em detergente em pó

ticas de média e alta polaridade. Componentes de média polaridade como o dihydro myrcenol e o tetrahydro linalol apresentaram grande afinidade por ambas as fibras, sendo maior na PDMS/DVB, o que se reproduz para a maioria das moléculas estudadas. No entanto, compostos mais polares, como vanillin, raspberry ketone e rosacetone não foram adsorvidas de maneira satisfatória pelas fibras. Isso pode estar associado à grande interação entre estes compostos e a base Figura 2 Área total dos picos da fragrância para as quatro fibras. PDMS (100 µm polidimetilsiloxano); PDMS/DVB (65 µm polidimetilsiloxano/divinilbenzeno); CW/DVB (65 µm carbowax/divinilbenzeno) e CAR / PDMS (75 µm carboxen/polidimetilsiloxano).

Figura 3

236

do detergente e também pela baixa volatilidade dos componentes, o que desfavorece o deslocamento do equilíbrio desses ingredientes para o headspace.

Extração de cada componente pelas fibras PDMS/DVB e PDMS empregando a coluna BP1 (FID_2).

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Avaliação de fragrância em detergente em pó

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Para evitar o efeito memória da fibra, esta foi mantida no injetor a 200 °C por diferentes tempos, sendo 10 min o valor selecionado para eliminar este efeito.

Bothe et al. no qual desenvolveram um método

A quantidade de amostra utilizada para extração é importante, pois pode ocorrer tanto a competição entre os analitos pelos sítios ativos da fibra quanto sua saturação. No caso específico de amostras de detergente em pó, uma maior quantidade de amostra colocada no interior do frasco melhorou a reprodutibilidade entre as análises. A massa de amostra com maior quantidade de analito extraída foi 3,0 g. Não foi possível aumentar mais a quantidade devido ao volume do frasco empregado que dificultaria a extração no headspace.

fibra PDMS também foi de 80 °C[11].

A eficiência da extração do perfume no headspace em função da temperatura também foi avaliada. Para isto, foi utilizada uma faixa de temperatura de 40 a 90 °C com a fibra PDMS/DVB. O tempo adotado para o pré-equilíbrio e para o equilíbrio foi de 5 min. Na Figura 4 é possível constatar que a melhor temperatura de extração foi de 80 °C, pois temperaturas maiores não mostraram vantagens em relação à quantidade extraída. Temperatura de extração semelhante pode ser encontrada no trabalho publicado por

da matriz e dos analitos, o aumento da tempera-

de determinação de fragrância em diferentes matrizes como detergente líquido, amaciante e cera. A temperatura ótima para extração com a A otimização da temperatura de extração é importante porque o processo de dessorção do analito da amostra e a adsorção na fibra é afetado pela temperatura. O coeficiente de partição fibra/ ar (Kfa) diminui com a temperatura, reduzindo a massa do analito na fibra. Por outro lado, há um aumento no coeficiente de partição ar/solução (Kas), o qual aumenta a concentração do analito no headspace, favorecendo o aumento da adsorção do analito pela fibra[8]. Portanto, dependendo tura favorece a dessorção do analito da amostra para o headspace, aumentando a extração.

Na Figura 5, pode-se observar com mais detalhes o perfil de extração de cada composto e constatar que para a maioria dos componentes houve uma melhora na resposta em função do aumento da temperatura.

O tempo de pré-equilíbrio foi avaliado para identificar qual a influência desta etapa na extração, que é o tempo em que a amostra fica no interior do frasco fechado antes da exposição da fibra. O tempo considerado mais adequado foi de 10 min, pois após esse período não foi observado aumento considerável na variação da quantidade extraída.

Uma condição considerada ótima para extração por SPME é quando a concentração do analito na amostra e na superfície da fibra está em equilíbrio. Para determinação do tempo de equilíbrio de adsorção foi variado o tempo de 5 a

Figura 4 Efeito da temperatura na extração dos componentes da fragrância.

Scientia Chromatographica 2013; 5(3):229-242

60 min. O perfil de adsorção pode ser visto para todos os picos na Figura 6.

237

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Avaliação de fragrância em detergente em pó

Figura 5 Efeito da temperatura na extração de cada componente da fragrância.

3.2 Quantificação dos componentes da fragrância no detergente em pó

Figura 6 Resposta dos picos relacionados à fragrância nos dois detectores, FID_1 e FID_2, em função do tempo de adsorção.

Considerando os resultados mostrados na Figura 6, foi definido o tempo de equilíbrio em 30 min, embora esta condição não tenha sido alcançada para todos os analitos, como por exemplo, para o Tonalid 2 e para a Benzophenone.

Após esses estudos, as condições consideradas mais adequadas para a extração da fragrância foram: fibra PDMS/DVB, quantidade de amostra 3,0 g, temperatura de 80 °C, tempo de pré-equilíbrio de 10 min e tempo de adsorção de 30 min.

238

Uma das maiores preocupações no desenvolvimento de uma nova fragrância está relacionada à sua estabilidade quando aplicada a qualquer produto em seu período de validade. Muitas são as variáveis que podem prejudicar a fixação da fragrância na base e algumas mudanças químicas ou físicas podem ocorrer quando esses produtos são comercializados, sendo estocados nas prateleiras das lojas, na casa do consumidor, ou em qualquer lugar com grandes variações de temperatura e umidade, como também durante o período de transporte dos produtos. Na tentativa de prever o comportamento dos produtos após fabricação, as indústrias de fragrâncias desenvolveram protocolos de testes de estabilidade acelerados, baseando-se na teoria de Arrhenius para fornecer aos clientes informações que auxiliem na identificação do prazo de validade das mercadorias. A teoria define que a cada 10 °C no aumento da temperatura a velocidade de uma reação dobra, ou seja, 12 meses de uma reação a Scientia Chromatographica 2013; 5(3):229-242

Avaliação de fragrância em detergente em pó

20 °C corresponde a 12 semanas a 40 °C, 6 semanas a 50 °C ou 3 semanas a 60 °C. Na prática, as indústrias testam todos os produtos a 0-4 °C, 20 ou 25 °C e 37 ou 40 °C por 12 meses como um requisito mínimo para verificação. A avaliação é realizada comparando as amostras armazenadas em maior temperatura contra aquelas estocadas a 0-4 °C, que são consideradas os padrões. Uma escala de 0-5 ou A-E pode ser utilizada para sinalizar as variações na aparência física ou no odor da amostra. Entretanto, tal método de avaliação não permite descrever de maneira detalhada qual componente está influenciando mais significativamente na amostra, uma vez que a avaliação é apenas sensorial5.

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Neste trabalho, o método de extração de SPME otimizado foi aplicado em amostras de detergente em pó armazenadas em diferentes condições de estocagem, para avaliar a variação que ocorre na dessorção dos compostos nestas condições.

A Tabela 2 apresenta os parâmetros analíticos calculados a partir das curvas analíticas, os quais foram empregados na etapa de quantificação.

Na Tabela 3 estão os resultados obtidos para diferentes condições de armazenamento das amostras de detergente em pó e a Figura 7 mostra a variação percentual da área do pico cromatográfico dos compostos da fragrância em cada condição de armazenamento.

Tabela 2 Parâmetros obtidos através das curvas analíticas. (a: inclinação da curva, b: intercepto, r: fator de correlação, LQ: limite de quantificação).

Composto

Intervalo linear (mg)

a

b

r

LQ (mg)

Manzanate

0,0075-0,7500

1406,8

17,3

0.9995

0,00053

Tetrahydro Linalol

0,0075-0,7500

1803,3

32,5

0.9955

0,00122

Dihydro Myrcenol

0,0075-0,4500

1432,0

31,9

0.9968

0,00127

Tetrahydro Geraniol

0,0075-0,1500

5300,9

58,0

0.9949

0,00292

Ethyl Benzoate

0,0037-0,1500

3020,8

24,2

0.9974

0,00180

Styrallyl Acetate

0,0075-0,1500

3903,8

18,4

0.9967

0,00160

Dimethyl Benzyl Carbinyl Acetate

0,0075-0,1500

5555,9

74,2

0.9930

0,00126

Pivarose

0,0075-0,0750

11776,0

26,7

0.9855

0,00119

Phenyl Ethyl Alcohol

0,0075-0,3000

941,2

41,5

0.9913

0,00255

Alcohol C12

0,0075-0,0750

4030,7

54,3

0.9991

0,00164

Dimethyl Phenyl Ethyl Carbanol

0,0022-0,0750

4481,7

87,1

0.9909

0,00356

Diphenyl Oxide

0,0075-0,0750

11842,0

142,0

0.9935

0,00171

Ethyl Cinnamate

0,0022-0,0750

9988,3

141,7

0.9908

0,00227

Eugenol

0,0075-0,0750

3047,6

44,8

0.9898

0,00265

Rosacetone

0,0075-0,7500

5768,3

75,6

0.9921

0,00582

Methyl Anthranilate

0,0075-0,0750

3498,6

68,1

0.9964

0,00201

Tonalid 2

0,0075-0,0750

2680,1

130,0

0.9931

0,00117

Benzophenone

0,0075-0,0750

9519,4

187,5

0.9907

0,00127

Vanillin

0,0075-0,0750

277,5

-1,7

0.9895

0,00405

Raspberry Ketone

0,0075-0,0750

823,9

5,9

0.9830

0,00002

Scientia Chromatographica 2013; 5(3):229-242

239

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Tabela 3 Quantidade dos componentes da fragrância após diferentes condições de armazenamento.

Composto

4 °C

37 °C/70% UR

45 °C

Manzanate

0,06

NQ

NQ

Tetrahydro Linalol

0,24

0,24

0,08

Dihydro Myrcenol

0,23

0,23

0,08

Tetrahydro Geraniol

0,04

0,05

NQ

Ethyl Benzoate

0,17

0,03

0,05

Styrallyl Acetate

0,15

NQ

0,07

Dimethyl Benzyl Carbinyl Acetate

0,15

0,14

0,09

Pivarose

0,09

0,10

0,08

Phenyl Ethyl Alcohol

0,10

0,06

0,09

Alcohol C12

0,05

0,04

0,05

Dimethyl Phenyl Ethyl Carbanol

NQ

NQ

NQ

Diphenyl Oxide

0,09

0,08

0,06

Ethyl Cinnamate

0,04

NQ

0,04

Eugenol

NQ

NQ

NQ

Rosacetone

NQ

NQ

NQ

Methyl Anthranilate

0,04

NQ

0,03

Tonalid 2

0,01

0,04

0,01

Benzophenone

0,04

0,04

0,04

Vanillin

NQ

NQ

NQ

Raspberry Ketone

0,02

NQ

0,01

NQ = abaixo do limite de quantificação. UR = Umidade relativa.

Figura 7 Variação percentual da área do pico cromatográfico dos compostos da fragrância em cada situação de armazenagem. Os dados foram calculados considerando a amostra a 4 °C como referência.

240

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Avaliação de fragrância em detergente em pó

Estes resultados mostram que a perda de alguns compostos da fragrância em diferentes condições de armazenagem é óbvia e mensurável. A técnica de SPME-GC fornece informações quantitativas que podem auxiliar na identificação das condições em que o produto foi submetido durante sua estocagem, possibilitando com isso a avaliação das condições de embalagem, armazenamento e tempo de vida útil do produto.

Ao conhecer a variação quantitativa dos compostos com o tempo nas diferentes condições de estocagem, é possível desenvolver fragrâncias com características mais estáveis, principalmente para produtos mais agressivos como a base de detergente em pó. Com o conhecimento do comportamento dos compostos aplicado na base, podem-se utilizar ingredientes de alto impacto olfativo e de menor variação em sua concentração com o tempo, substituindo componentes de maior variação. Tal informação representa um diferencial competitivo na criação de novas fragrâncias e produtos com uma melhor qualidade sensorial.

4 Conclusões A proposta deste trabalho foi encontrar um método analítico que pudesse reproduzir a avaliação sensorial realizada na indústria, e oferecesse resultado tanto qualitativo quanto quantitativo de cada componente de uma fragrância. O método de extração empregando SPME no headspace mostrou esta possibilidade apresentando as seguintes vantagens: possibilidade de extração no headspace da amostra, perda reduzida do analito extraído, simplicidade na manipulação do equipamento, a não necessidade de manipulação de solventes orgânicos, habilidade de concentrar os compostos voláteis e a facilidade de injeção direta no cromatógrafo, reduzindo o tempo Scientia Chromatographica 2013; 5(3):229-242

Godinho RB, Bottoli CBG

de extração e análise das amostras. Todas essas características puderam ser avaliadas e confirmadas neste trabalho.

Com a possibilidade de quantificação dos compostos da fragrância aplicada no detergente em pó, novos estudos relacionados à estabilidade da fragrância em diferentes períodos de tempo de armazenagem poderão ser avaliados, auxiliando não somente na elaboração de novas fragrâncias, já que será possível identificar os componentes que mais influenciam na fragrância, como também avaliar os períodos e condições que as amostras foram submetidas durante sua estocagem. É importante considerar que o conhecimento do desempenho da fragrância com as condições de armazenagem permite à indústria de fragrâncias caracterizar seus desempenhos e desenvolver novos produtos com características direcionadas às necessidades de cada aplicação.

Agradecimentos Os autores agradecem a Quest International (atual Givaudan) pela fornecimento do detergente em pó sem perfume (base) e pelos padrões para composição do perfume. C.B.G. Bottoli agradece ao CNPq pela bolsa de pesquisa.

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Recebido: 06/09/2013 Aceito: 05/11/2013

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