Sc v5n2

Scientia Chromatographica Revista Trimestral do Instituto Internacional de Cromatografia

2013 | Volume 5 | NĂşmero 2

Colunas para Cromatografia Gasosa Lançamento ZB - SemiVolatiles

Uma nova geração de performance para análise de SemiVoláteis

Colunas de HPLC com Aplicação Específicaa Tecnologia Core-Shell para Proteínas e Peptídeos

O Novo Padrão para análise por Exclusão de Tamanho de Alta Resolução

Fácil Desenvolvimento de método Quiral

Coluna de HPLC para Análise de Carboidratos, Oligossacarídeos e Ácidos Orgânicos.

Purificação e Análises de Peptídeos em HPLC Fase Reversa

Preparação de Amostras

Placas de Remoção ç de Fosfolipídeos p

Extração xtração em fase sólida lida (SPE) para paração de suas amostras. amos preparação

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Análise de multiresíduos em alimentos

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SUMÁRIO

Editorial ..................................................................................................................... 87

PREPARO DE AMOSTRAS Determinação de resíduos de herbicidas em águas de lavoura de arroz irrigado empregando Extração em Fase Sólida e Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com detecção por Arranjo de Diodos ..... 89 Fábio Ferreira Gonçalves, Fábio da Silva de Matos, Renato Zanella

TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS Técnicas cromatográficas e o desafio na determinação de compostos presentes em matrizes complexas: Relato de um caso prático do produto natural piperlongumina....................................................................101 Lucas Maciel Mauriz Marques, Anderson Rodrigo Moraes de Oliveira

HPLC Suportes cromatográficos e fases estacionárias para cromatografia líquida: preparo, evolução e tendências ..................................... 111 Carlos Eduardo Domingues Nazario, Fernando Mauro Lanças

HPLC Desenvolvimento e validação de método para extração e quantificação através de HPLC com índice de refração para lactose em leite pasteurizado ............................................................................. 137 Vinicius Ricardo Acquaro Jr., Tiago Bervelieri Madeira, Drielle Caroline Castilho, Lycio Shinji Watanabe, Yuri Renan Bovolenta, Suzana Lucy Nixdorf

PREPARO DE AMOSTRAS Técnicas de preparo de amostra empregadas na determinação de agrotóxicos carbamatos em água e solo .................................... 146 Elisa Helena da Costa Morais, Fernanda Ribeiro Begnini, Isabel Cristina Sales Fontes Jardim

Scientia Chromatographica 2013; 5(2)

85

Scientia Chromatographica 2013; 5(2):87 Instituto Internacional de Cromatografia http://dx.doi.org/10.4322/sc.2013.006

EDITORIAL

ISSN 1984-4433

A coluna tem sido considerada por muitos como o “coração” do sistema cromatográfico, uma vez que é nela onde ocorrerá (ou não) a tão desejada separação dos componentes que motivou a realização da análise cromatográfica. Em função desse fato, a busca por colunas cada vez mais eficientes, seletivas, e que proporcionem análises mais rápidas, tem sido um dos grandes objetivos dos pesquisadores na área de cromatografia em geral.

Os estudos clássicos de van Deemter na década de 1950 anteciparam que a diminuição no tamanho das partículas ocasionaria uma consequente diminuição no termo A da famosa equação cromatográfica que leva seu nome, o que aumentaria a eficiência da coluna.

Entretanto, a tecnologia disponível na época não permitia grandes avanços na área, sendo necessário mais de meio século para a produção comercial de partículas com diâmetro médio abaixo de 2 mícrons. Um dos fatores limitantes para este avanço foi a instrumentação inadequada para uso dessas colunas, uma vez que a diminuição no tamanho das partículas ocasiona um aumento na pressão nas mesmas e requer equipamentos mais adequados ao uso de pressões elevadas. Estes equipamentos surgiram comercialmente apenas no início do século XXI. O material mais empregado para preencher as modernas colunas de cromatografia líquida continua sendo a silica. Inicialmente preparada a partir de silicatos (silica A), passou por um processo sol-gel (silica B) até o surgimento da silica hídrica, com maior estabilidade hidrolítica (silica C). Neste número do Scientia, uma revisão detalhada discute a evolução no preparo dos modernos materiais e colunas de HPLC. Ainda neste número, soluções de grande interesse envolvendo as diferentes técnicas cromatográficas em aplicações como pesticidas em alimentos e no meio ambiente, em produtos naturais, leite pasteurizado e outras, são apresentadas por especialistas em suas áreas de atuação. Esperamos que este número possa trazer uma contribuição relevante para os usuários das técnicas cromatográficas, refletindo a contínua evolução da área e sua ampliação constante para novos horizontes.

Fernando M. Lanças Editor

Scientia Chromatographica 2013; 5(2)

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Scientia Chromatographica 2013; 5(2):89-100 Instituto Internacional de Cromatografia DOI: http://dx.doi.org/10.4322/sc.2013.007

PREPARO DE AMOSTRAS

ISSN 1984-4433

Determinação de resíduos de herbicidas em águas de lavoura de arroz irrigado empregando Extração em Fase Sólida e Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com detecção por Arranjo de Diodos Fábio Ferreira Gonçalves, Fábio da Silva de Matos, Renato Zanella* Laboratório de Análises de Resíduos de Pesticidas, Departamento de Química, Universidade Federal de Santa Maria - UFSM, Cep 97105-900, Santa Maria, RS, Brasil e-mail: larp_rz@yahoo.com.br

Resumo Os herbicidas aplicados nas lavouras são, em geral, persistentes e podem poluir os mananciais hídricos.

Portanto, o presente trabalho objetivou o desenvolvimento e a validação de um método para a determinação de resíduos dos herbicidas clomazona, imazapique e imazetapir em água de lavoura de arroz irrigado. O método envolve o preparo de amostra empregando Extração em Fase Sólida, para permitir um fator de concentração adequado, e a quantificação por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com detecção por Arranjo de Diodos. Após otimização dos parâmetros de extração e análise, o método foi validado avaliando-se curva analítica, linearidade, limites de detecção e de quantificação, precisão (repetitividade e precisão intermediária) e exatidão. Os resultados mostraram excelente linearidade para todos os compostos (r2 > 0,99) na faixa entre o limite de quantificação e 2,5 mg L–1. O método apresentou recuperações entre 81% e 107%, com RSD < 9%, e foi aplicado na determinação de resíduos dos herbicidas em água de lavoura irrigada, com limites de quantificação (LOQ) de 0,12 μg L–1 para imazapique e imazetapir, e de 0,25 μg L–1 para clomazona.

Palavras-chave Agrotóxicos; água de superfície; SPE; HPLC-DAD.

Determination of herbicide residues in rice paddy water by Solid Phase Extraction and High Performance Liquid Chromatography with Diode Array Detection Abstract The herbicides used on crops are generally persistent and can pollute water supplies. Therefore, this study aimed to develop and validate a method for the determination of residues of the herbicides clomazone, imazethapyr and imazapic in rice paddy water. The method involves sample preparation using Solid Phase Extraction, to allow an appropriate concentration factor, and quantification by High Performance Liquid Chromatography with Diode Array Detection. After optimization of the extraction and analysis parameters, the method was validated by evaluating analytical curve, linearity, limits of detection and

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Determinação de resíduos de herbicidas em águas de lavoura de arroz irrigado

quantification, precision (repeatability and intermediate precision) and accuracy. The results showed excellent linearity for all compounds (r2 > 0.99) in the range between the limit of quantification and 2.5 mg L–1. The method showed recoveries between 81 and 107%, with RSD < 9%, and was applied for the determination of residues of herbicides in rice paddy water with limits of quantification (LOQ) of 0.12 μg L–1 for imazapic and imazethapyr, and of 0.25 μg L–1 for clomazone.

Keywords Pesticides; surface water; SPE; HPLC-DAD.

1 Introdução A determinação de resíduos de agrotóxicos em amostras ambientais tem atraído a atenção de pesquisadores devido ao amplo uso de tais compostos, bem como seu impacto ambiental[1].

O uso intensivo de agrotóxicos pode levar à sua retenção nas culturas e no solo e, assim, principalmente por escoamento ou lixiviação, eles podem atingir as águas superficiais e subterrâneas[2]. As concentrações baixas de agrotóxicos permitidas pela legislação fazem com que aumente a busca por limites de quantificação cada vez menores, com o desenvolvimento de métodos de extração cada vez mais sensíveis[3].

O preparo de amostra é fundamental para o desenvolvimento de um método analítico. A Extração em Fase Sólida (Solid Phase Extraction, SPE) tem se tornado uma das técnicas de concentração e limpeza de extratos mais empregada em métodos analíticos, principalmente no preparo de amostras de água visando a determinação de compostos orgânicos[4]. A SPE apresenta as vantagens de baixo consumo de solvente, altos fatores de concentração e boas recuperações. Apesar de ser a técnica mais empregada para compostos com ampla faixa de polaridade em amostras aquosas[5-8], Pichon et al.[9] descreveram a dificuldade de trabalhar com analitos que apresentam polaridades muito diferentes, principalmente em relação à eluição e fortes retenções.

90

Segundo Caldas et al.[10], os sorventes mais usados na SPE para extração de agrotóxicos em água são: C18, usado na extração de herbicidas[11,12], inseticidas[13,14] e para diversas classes químicas[15,16], bem como os sorventes poliméricos que são empregados para diferentes classes de agrotóxicos[17,18]. Uma das principais vantagens da SPE é a vasta gama de sorventes disponíveis, que abrange uma ampla gama de propriedades de analitos, inclusive analitos polares e apolares[19,20].

Os agrotóxicos retidos nos cartuchos de SPE são eluídos com um pequeno volume de solvente adequado para a análise. É importante a escolha do solvente de eluição, pois ele deve eluir os analitos e minimizar a eluição de interferentes, principalmente de moléculas com alta massa molar, que podem afetar a análise cromatográfica. A escolha do solvente de eluição é um parâmetro importante e está diretamente relacionada com a polaridade do agrotóxico e do sorvente escolhido[10].

O aumento do uso de agrotóxicos de caráter mais polar, considerados mais facilmente degradáveis, influencia nas técnicas de determinação que podem ser empregadas. Esses compostos, bem como seus metabólitos, dificilmente podem ser determinados por Cromatografia Gasosa (Gas Chromatography, GC) sem uma etapa de derivatização[3], demandando o desenvolvimento de métodos que utilizam a Cromatografia Scientia Chromatographica 2013; 5(2):89-100

Determinação de resíduos de herbicidas em águas de lavoura de arroz irrigado

Líquida de Alta Eficiência (High Performance Liquid Chromatograhy, HPLC)[21-23]. Publicações recentes destacam a tendência de se utilizarem técnicas sofisticadas como Cromatografia Líquida e Cromatografia Gasosa acopladas a Espectrometria de Massas na determinação de resíduos de agrotóxicos em matrizes ambientais[24,25]. No entanto, métodos que utilizam HPLC com detecção por arranjo de diodos (Diode Array Detection, DAD) ainda são empregados, principalmente para a análise de herbicidas mais polares, pois não demandam um elevado investimento em instrumentação[23,26-29].

Herbicidas do grupo das imidazolinonas, com amplo espectro de atuação no controle de plantas daninhas e alta persistência no solo e na água[30], tais como imazapique e imazetapir, são empregados em larga escala na agricultura pela sua eficiência, mesmo em baixas doses de aplicação. Apesar de sua baixa toxicidade para mamíferos e outros animais, para muitos herbicidas desse grupo, uma concentração de 0,1 μg L–1 em água tem sido considerada como tóxica para plantas não alvo[31]. O herbicida clomazona pertence ao grupo das isoxazolidinonas e é muito utilizado na cultura do arroz irrigado. De aplicação pré-emergente, esse herbicida também é bastante utilizado no Brasil para culturas de soja, cana-de-açúcar, fumo e algodão.

O herbicida clomazone, 2-[(2-clorofenil) metil]-4,4-dimetil-3-isoxazolidinona, é altamente solúvel em água (1.100 mg L–1) e seu tempo de meia-vida em estudos de campo em diversos tipos de solo variou de 4 a 12 semanas[32].

Consequentemente, as propriedades físico-químicas da clomazona apontam-na como uma potencial poluidora do meio ambiente aquático e de águas subterrâneas[33]. A clomazona foi detectada na maioria das amostras de água de rio coletadas nas regiões produtoras de arroz irrigado do sul do Brasil[12].

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Os herbicidas imazapique, ácido 2-[(RS)4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2il]-5-metil nicotínico, e imazetapir, ácido 5-etil-2-[(RS)-4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il]nicotínico, pertencem ao grupo das imidazolinonas aplicados, em alguns casos, em formulações contendo a mistura dos dois compostos. No Brasil, o herbicida imazapique tem uso autorizado para as culturas arroz, cana-de-açúcar, amendoim e milho e o imazetapir, para arroz, feijão e soja. Imazapique e imazetapir são altamente solúveis em água, com 2.200 e 1.400 mg L–1, respectivamente[30]. Os valores da constante de dissociação ácida (pKa) para imazapique são 2,0 e 3,6 e para imazetapir são 2,1 e 3,9, indicando que os dois são herbicidas ácidos[30].

Estudo desenvolvido por Santos et al.[34] demonstrou que o período de detecção dos herbicidas na água de irrigação foi mais longo para imazetapir que para clomazona. A meia-vida do imazetapir na água variou conforme a dosagem aplicada, com valores entre 1,6 e 6,2 dias, e para clomazona foi de cinco dias. Os herbicidas clomazona, imazetapir e imazapique dissolvidos em água apresentam alto potencial de contaminação de águas superficiais pelo transporte. Os três herbicidas avaliados apresentam risco potencial de contaminação de águas subterrâneas, tanto avaliando-se pelos critérios do EPA como pelo método de GUS[35].

A Figura 1 apresenta as estruturas dos herbicidas estudados, onde se destaca o grupamento carboxílico do grupo das imidazolinonas.

Neste trabalho foi desenvolvido e validado um método para a determinação de resíduos dos herbicidas clomazona, imazapique e imazetapir em água de lavoura irrigada, uma vez que são amplamente utilizados no cultivo do arroz irrigado e possuem considerável persistência no meio ambiente. Para o preparo de amostra avaliaram-se a eficiência dos sorventes a base de sílica 91

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Determinação de resíduos de herbicidas em águas de lavoura de arroz irrigado

Figura 1 Estruturas dos herbicidas estudados.

modificada com C18 e a eficiência do sorvente

superfície modificada), 200 mg/3 mL e tamanho

polimérico. A análise por HPLC-DAD permitiu

médio das partículas de 33 μm, ambos adquiri-

a confirmação da presença e a quantificação, pelo

dos da Phenomenex (EUA).

espectro de absorção molecular, dos agrotóxicos estudados, com boa resposta e baixo custo.

2 Experimental

2.2 Instrumentação e análise cromatográfica Cromatógrafo a líquido Varian (EUA), composto por bomba modelo ProStar 210 e detector

2.1 Reagentes e materiais Foram utilizados padrões dos herbicidas clomazona, imazetapir e imazapique com 93,0, 98,0 e 99,0% de pureza, respectivamente, obtidos da firma Dr. Ehrenstorfer (Alemanha). A solução estoque, na concentração de 1.000 mg L–1, foi

aquisição de dados Star Workstation 6.0, coluna analítica Synergi 4 μ Fusion RP-80 (250 × 4,6 mm, d.i.; 4 μm) e coluna de guarda do mesmo material (4 × 3 mm), ambas da firma Phenomenex (EUA). A fase móvel consistiu de uma mistura de

preparada em acetonitrila e mantida a –16 °C. As

acetonitrila: água (60: 40, v/v), pH 3,0 ajustada

soluções analíticas foram preparadas por dilui-

com ácido fosfórico, na vazão de 0,8 mL min–1.

ção da solução estoque em acetonitrila.

Foi utilizado um volume de injeção de 20 μL e

Foram utilizados como solventes acetonitrila e metanol, grau HPLC, bem como diclorome-

a detecção foi efetuada em 220 nm para clomazona e 254 nm para imazetapir e imazapique. Os

tano, grau resíduos de pesticidas (Mallinckrodt,

espectros de absorção molecular foram adquiri-

EUA), água purificada em sistema Direct-Q

dos entre 200 nm e 350 nm.

UV3® da Millipore (EUA) e ácido fosfórico grau analítico 85% (Merck, Brasil).

Os sorventes avaliados em SPE em cartucho

92

por arranjo de diodos ProStar 335, sistema de

2.3 Avaliação das condições para o preparo de amostra por SPE

foram: Strata C18-E (sorvente à base de octade-

Na etapa de SPE empregou-se um sistema

cilsilano), 500 mg/3 mL e tamanho médio das

manifold com capacidade para 12 cartuchos

partículas de 55 μm, e Strata-X (sorvente poli-

(Phenomenex, EUA) e uma bomba de vácuo

mérico à base de estireno-divinilbenzeno com

modelo TE-058 (Tecnal, Brasil). Foram realizaScientia Chromatographica 2013; 5(2):89-100

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das as seguintes etapas na SPE: (i) condicionamento; (ii) percolação da amostra na vazão de cerca de 5 mL min–1 e (iii) eluição.

O procedimento de extração foi otimizado em termos do cartucho de extração, pH e volume da amostra e do solvente de eluição, empregando amostras branco fortificadas com os herbicidas em estudo. Foram avaliados os sorventes Strata C18 e o sorvente polimérico Strata-X, contendo 500 mg e 200 mg, respectivamente. O volume de amostra foi escolhido em função do volume de breakthrough, o qual ocorre quando os agrotóxicos não são fortemente retidos pelo sorvente ou quando a capacidade do sorvente é excedida. Foram estudados volumes de amostra entre 50 mL e 500 mL, com massa dos analitos constante. Considerando que os herbicidas imazetapir e imazapique podem se ionizar e, assim, afetar a retenção nos sorventes, foram avaliados os valores de pH da amostra ajustados em 2,0 e 3,0, bem como sem correção de pH (6,0).

Foi analisada uma amostra de água de lavoura irrigada que não apresentou nenhum interferente no tempo de retenção dos compostos de interesse. Essa amostra foi usada para realizar as fortificações necessárias para avaliar a recuperação do método.

2.4 Procedimento de extração SPE otimizado Os cartuchos de extração em fase sólida foram primeiramente condicionados com 3 mL de metanol, 3 mL de água purificada para retirar o excesso de metanol e 3 mL de água purificada pH 2,0. Um volume de 100 mL de água de superfície branco, com pH ajustado em 2,0, fortificada com os analitos de interesse, foi percolada através do cartucho, em sistema manifold, a uma vazão de aproximadamente 5 mL min–1, com auxílio de vácuo. Após a etapa de concentração, 3 mL de água purificada foram percolados e o cartucho Scientia Chromatographica 2013; 5(2):89-100

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foi seco pela aplicação de vácuo por 15 min. Na sequência foi efetuada a eluição dos analitos retidos no cartucho, utilizando-se duas alíquotas de 1,0 mL da mistura diclorometano: metanol (65: 35, v/v), com tempo de interação de 1 min após cada alíquota. Para injeção no sistema HPLCDAD, o solvente foi evaporado com o auxílio de nitrogênio e o residual redissolvido em 500 μL da fase móvel, resultando em um fator de concentração de 200 vezes.

2.5 Validação do método A garantia de métodos analíticos confiáveis é cada vez mais reconhecida e exigida. Para garantir que o método proposto gere informações com qualidade, ele foi submetido a um procedimento de validação. Definidas as melhores condições para análise dos herbicidas, foi efetuada a validação do método segundo os parâmetros descritos a seguir: • Linearidade e curva analítica: A linearidade do método foi observada pela equação da regressão linear (y = ax + b), sendo considerado como evidência de um ajuste ideal um coeficiente de determinação (r2) maior que 0,99. A curva analítica foi obtida pela análise em triplicata de soluções analíticas contendo a mistura dos herbicidas numa faixa de concentração de 0,02 mg L–1 a 2,5 mg L–1, para imazapique e imazetapir, e de 0,04 mg L–1 a 2,5 mg L–1 para clomazona.

• Limite de detecção (LOD) e de quantificação (LOQ): Os limites foram estabelecidos considerando-se LOD e LOQ como sendo a concentração que produz uma relação sinal-ruído correspondentes a 3 e 10 vezes, respectivamente[36].

• Exatidão (recuperação): A exatidão foi avaliada pela realização de ensaios de recuperação[37], aplicando-se o método proposto em amostras branco fortificadas, em triplicata e em três diferentes níveis de forti93

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Determinação de resíduos de herbicidas em águas de lavoura de arroz irrigado

ficação, correspondendo a 1, 5 e 10 vezes o limite de quantificação do método. Foram consideradas aceitáveis recuperações entre 70% e 120%[38].

• Precisão (repetitividade e precisão intermediária): A precisão do método, em termos de repetitividade (RSDr), foi efetuada no mesmo dia, pelo mesmo operador e com extração em triplicata das amostras fortificadas – cada extrato foi analisado três vezes.

Para avaliar a precisão intermediária (RSDpi) do método, utilizaram-se dias e operadores diferentes para a análise.

2.6 Aplicabilidade do método O método desenvolvido e validado foi aplicado para a determinação de resíduos dos herbicidas imazetapir, imazapique e clomazona em amostras de água de rios e lagos, além de estudos de dissipação em água de lavouras de arroz irrigado. A aplicação do método em diferentes águas visa avaliar a eficiência do método e a ocorrência de interferentes. As amostras foram coletadas em frascos de vidro âmbar e armazenadas em temperatura entre 1 °C e 4 °C, ao abrigo da luz.

3 Resultados e discussão 3.1 Análise cromatográfica por HPLCDAD Os cromatogramas da Figura 2, obtidos por HPLC-DAD de uma mistura dos três herbicidas na concentração de 1,0 mg L–1, apresentaram uma boa separação entre os herbicidas em estudo. A Figura 2 apresenta também os espectros de absorção molecular entre 200 nm e 350 nm obtidos por HPLC-DAD para os herbicidas em estudo. Esses espectros foram utilizados para obter-se o comprimento de onda máximo de absorção de cada herbicida, nas condições da separação cromatográfica, e para confirmar a identidade dos picos, através da comparação dos espectros obtidos para os padrões e amostras.

O comprimento de onda para a detecção de clomazona foi selecionado no máximo de absorção (220 nm). Para imazetapir e imazapique o máximo de absorção ocorre em 212 nm, entretanto, para a quantificação desses herbicidas, optou-se pelo comprimento de onda de segunda

Figura 2 Cromatogramas de uma solução analítica contendo 1,0 mg L–1 de imazapique (tR 4,3 min), imazetapir (tR 4,7 min) e clomazona (tR 8,6 min), obtidos em 220 nm (linha azul) e 254 nm (linha vermelha), com os respectivos espectros de absorção na região entre 200 nm e 350 nm.

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absorção máxima (245 nm), que minimiza o risco de interferentes da matriz e apresenta uma boa resposta para esses compostos.

nados, desde que a ionização dos herbicidas imi-

O HPLC-DAD confirmou ser uma boa opção para a análise dos herbicidas em água, permitindo a análise com boa detectabilidade em 10 min.

e é um sorvente que possui um custo mais baixo

3.2 Otimização do procedimento SPE

de diclorometano: metanol (80: 20, v/v) e diclo-

dazolinonas seja suprimida. Considerando que o sorvente C18 é mais frequentemente empregado que os poliméricos, esse foi o escolhido para o preparo das amostras dos herbicidas em água.

Quanto ao solvente de eluição, as misturas rometano: acetonitrila (50: 50, v/v) proporciona-

Os resultados de recuperação obtidos com os dois cartuchos avaliados e com três diferentes solventes de eluição estão apresentados na Tabela 1.

ram bons resultados. No entanto, percentuais de recuperação mais próximos de 100% foram obtidos com a mistura de diclorometano: metanol 65: 35 (v/v), a qual foi escolhida para a eluição

Tanto o sorvente C18 quanto a fase polimérica proporcionaram recuperações para os herbicidas clomazona, imazapique e imazetapir dentro da faixa de 70% a 120%, resultados que estão em concordância com os obtidos por Vigna et al.[39] empregando cartuchos C18 e poliméricos para extração desses agrotóxicos. Entre os materiais de extração testados, o sorvente apolar (Strata C18) ofereceu forte retenção hidrofóbica com interações polares nos grupos silanóis remanescentes, já o sorvente polimérico (Strata-X) é um material funcionalizado com N-vinilpirrolidona, que oferece vários modos de retenção, com interações π-π, ligações de hidrogênio, dipolo-dipolo e hidrofóbicas. Assim, ambos sorventes podem ser aplicados para os herbicidas selecio-

dos analitos. Metanol e acetonitrila, sem diclorometano, também foram testados, mas não proporcionaram boas recuperações para imazetapir e imazapique. A adição de diclorometano aumenta a solubilidade dos analitos e favorece a eluição dos analitos.

Definidos o sorvente e o solvente de eluição, foi testado o volume de solvente necessário para a eluição dos herbicidas. Os resultados estão na Tabela 2.

A eluição com 2 × 1 mL da mistura diclorometano: metanol (65: 35, v/v) foi a que proporcionou melhores resultados. Esse volume foi posteriormente evaporado e o extrato foi redis-

Tabela 1 Recuperações obtidas com diferentes sorventes e solventes de eluição.

Recuperação (%)* Herbicidas

Strata C18

Strata-X

S1

S2

S3

S1

S2

S3

Imazapique

93 ± 2

74 ± 2

75 ± 2

106 ± 9

82 ± 2

78 ± 2

Imazetapir

83 ± 3

66 ± 4

88 ± 10

89 ± 1

46 ± 4

74 ± 2

Clomazona

86 ± 3

70 ± 2

71 ± 2

94 ± 3

72 ± 1

58 ± 8

–1

*100 mL de amostra branco (pH 2,0) fortificada com os herbicidas em 5 µg L , volume de eluição 2 mL, evaporação com auxílio de N2 e redissolução em 500 µL de fase móvel; S1 = diclorometano: metanol (65: 35, v/v); S2 = diclorometano: metanol (80: 20, v/v); S3 = diclorometano: acetonitrila (50: 50, v/v).

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Determinação de resíduos de herbicidas em águas de lavoura de arroz irrigado

Tabela 2 Recuperações obtidas para os herbicidas utilizando-se diferentes volumes do solvente de eluição diclorometano: metanol, 65: 35 (v/v) e sorvente Strata C18.

Tabela 3 Recuperações obtidas para os herbicidas empregando-se diferentes valores de pH da amostra.

Herbicidas

pH 2,0

pH 3,0

pH 6,0

Imazapique

100 ± 4

71 ± 8

72 ± 10

Imazetapir

90 ± 6

75 ± 6

81 ± 7

Clomazona

96 ± 3

97 ± 10

99 ± 10

Recuperação (%)*

Herbicidas

1 mL

2 mL

Imazapique

67 ± 10

93 ± 2

Imazetapir

72 ± 9

83 ± 3

112 ± 8

86 ± 3

Clomazona

Recuperação (%)*

*Fortificação: 5 µg L–1; 100 mL de amostra de água branco; pH 2,0.

–1

*Fortificação: 5 µg L ; 100 mL de amostras de água branco; pH 2,0.

solvido em 500 μL de fase móvel, para que o volume final fosse exato e para aumentar o fator de concentração.

Os resultados para os testes empregando diferentes valores para o pH da amostra (2,0, 3,0 e 6,0) estão na Tabela 3.

Os herbicidas do grupo das imidazolinonas são normalmente determinados em amostras com valores de pH entre 2,0 e 3,0[39,40]. Nessa faixa de pH, os compostos ácidos passam a ter maior interação com o sorvente, entretanto podem surgir nos cromatogramas picos interferentes devido aos ácidos húmicos e fúlvicos. Com pH ajustado em 3,0 e amostra sem correção de pH foram obtidas recuperações entre 72% e 98%.

No entanto, como os herbicidas imidazolinonas estudados apresentam valores de pKa baixos, os melhores resultados foram obtidos com pH 2,0, sendo esse o valor escolhido para a validação e aplicação do método.

A Tabela 4 apresenta os resultados de recuperação obtidos em função de diferentes volumes de amostra empregando uma massa constante dos analitos.

Para imazetapir e imazapique ocorreu diminuição significativa na recuperação com o aumento do volume da amostra acima de 150 mL, sendo que a partir de 200 mL as recuperações ficaram abaixo dos valores aceitáveis. Para 96

Tabela 4 Recuperações obtidas para os herbicidas utilizando-se diferentes volumes de amostra.

Recuperação (%)*

Volume (mL)

Imazapique

Imazetapir Clomazona

50

101 ± 8

105 ± 11

109 ± 5

100

93 ± 2

83 ± 9

99 ± 2

150

82 ± 2

70 ± 3

93 ± 2

200

61 ± 1

63 ± 4

101 ± 4

250

55 ± 1

61 ± 4

106 ± 3

300

40 ± 5

51 ± 6

103 ± 1

500

33 ± 5

43 ± 2

72 ± 2

*Massa de cada herbicida: 0,1 µg; amostra branco (pH 2,0); eluição com 2 mL da mistura DCM: MeOH (65: 35, v/v), evaporação com auxílio de N2 e redissolução em 500 µL de fase móvel.

clomazona, a diminuição na recuperação ocorreu apenas com um volume de amostra acima de 300 mL, porém ficou no intervalo aceito na literatura. O volume de breakthrough está relacionado com a hidrofobicidade do soluto e a massa de sorvente usada e pode ser baixo quando os compostos não são fortemente retidos pelo sorvente. Isso justifica os resultados obtidos, uma vez que clomazona, com Kow de 350, é o mais hidrofóbico dos herbicidas avaliados, enquanto imazetapir e imazapique, com Kow de 31 e 0,01, respectivamente, são menos hidrofóbicos.

3.3 Validação do método As equações de regressão linear obtidas para os herbicidas imazapique, imazetapir e clomazona nos cinco níveis de concentração apresenScientia Chromatographica 2013; 5(2):89-100

Determinação de resíduos de herbicidas em águas de lavoura de arroz irrigado

taram coeficiente de determinação (r2) > 0,999, indicando que a resposta do sistema HPLC-DAD é linear na faixa de concentração entre 0,025 mg L–1 e 2,5 mg L–1 para imazetapir e imazapique e entre 0,05 e 2,5 mg L–1 para clomazona.

O LOD estimado para o método foi de 0,04 μg L–1 para imazapique e imazetapir e de 0,08 μg L–1 para o clomazona. Os valores de LOQ para os herbicidas em amostras de água de superfície, empregando o método desenvolvido, foram de 0,12 μg L–1 para imazapique e imazetapir e de 0,25 μg L–1 para clomazona.

A repetitividade (RSDr) e a precisão intermediária (RSDpi) para o instrumento (n = 6), para os níveis de concentração utilizados na elaboração das curvas analíticas dos herbicidas, ficaram entre 3,1% e 7,0% e 0,1% e 9,5%, respectivamente, sendo consideradas adequadas.

Os resultados de precisão e exatidão do método, obtidos no ensaio de recuperação em três níveis de fortificação, estão na Tabela 5. A precisão do método apresentou RSD entre 1,3% e 7,7% para repetitividade e entre 2,5% e 9,0% para a precisão intermediária. Neste trabalho seguiu-se a recomendação para validação de métodos cromatográficos aplicados a determinação de resíduos de agrotóxicos, a qual adota recuperações entre 70% e 120%, com valores de RSD ≤

Gonçalves FF, Matos FS, Zanella R

20%[41]. Todos os valores obtidos estão dentro desse intervalo e, portanto, o método está de acordo com os parâmetros exigidos.

Os herbicidas avaliados não estão contemplados na Portaria MS n. 2.914 de 2011, que dispõe sobre a qualidade da água para consumo humano e seu padrão de potabilidade, e na Resolução n. 357 do CONAMA de 2005, que dispõe sobre a classificação dos corpos de água e estabelece padrões de qualidade. Para águas superficiais, geralmente os limites são da ordem de 1 μg L–1 a 3 μg L–1[42].

3.4 Aplicação do método desenvolvido O método desenvolvido foi aplicado em um estudo de dissipação dos herbicidas em experimento realizado em lavoura de arroz irrigado na Universidade Federal de Santa Maria. Com os resultados obtidos no estudo de dissipação dos herbicidas foi possível concluir que há persistência dos herbicidas na lâmina de água e que a concentração aplicada e as condições climáticas influenciam diretamente nas concentrações residuais dos herbicidas. Nas amostras analisadas não foram observadas interferências da matriz, sendo possível determinar os três herbicidas de forma adequada.

Tabela 5 Recuperação RSDr e RSDpi do método para três níveis de fortificação.

Herbicida

Imazapique

Imazetapir

Clomazona

Repetitividade

Precisão intermediária

Nível de fortificação (µg L–1)

Recuperação (%)

RSDr (%)

Recuperação (%)

RSDpi (%)

0,12

98

3

95

9

0,60

81

5

93

7

1,20

107

5

89

6

0,12

89

1

94

2

0,60

95

5

101

3

1,20

107

7

96

3

0,25

86

8

95

7

1,25

106

1

91

5

2,50

94

3

105

4

Scientia Chromatographica 2013; 5(2):89-100

97

Gonçalves FF, Matos FS, Zanella R

Determinação de resíduos de herbicidas em águas de lavoura de arroz irrigado

4 Conclusão A SPE com sorvente C18 possibilitou o preparo de várias amostras simultaneamente, permitindo a concentração de resíduos dos herbicidas imazetapir, imazapique e clomazona de forma eficiente e com baixo consumo de solvente. O método empregando HPLC-DAD mostrou-se adequado para a determinação dos herbicidas em 10 min. A validação do método forneceu resultados de recuperação entre 81% e 107% e precisão (RSD < 9%), considerados satisfatórios. Os limites de quantificação do método (0,12 μg L–1 para imazapique e imazetapir e 0,25 μg L–1 para clomazona) foram adequados para análise de agrotóxicos em água de superfície.

Apesar das propriedades físico-químicas distintas dos herbicidas analisados e da complexidade da matriz, o método mostrou-se adequado para o monitoramento dos herbicidas avaliados e para o acompanhamento de estudos conduzidos em lavoura de arroz irrigado com herbicidas largamente empregados nessa cultura, permitindo assim estimar o risco de contaminação dos mananciais hídricos por herbicidas aplicados na lavoura.

Agradecimentos

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Recebido: 27/08/2013 Aceito: 07/10/2013

100

Scientia Chromatographica 2013; 5(2):89-100

Scientia Chromatographica 2013; 5(2):101-109 Instituto Internacional de Cromatografia DOI: http://dx.doi.org/10.4322/sc.2013.008

TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS

ISSN 1984-4433

Técnicas cromatográficas e o desafio na determinação de compostos presentes em matrizes complexas: Relato de um caso prático do produto natural piperlongumina Lucas Maciel Mauriz Marques1, Anderson Rodrigo Moraes de Oliveira2* 1

Departamento de Física-Química, Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de São Paulo – USP, Cep 14040-903, Ribeirão Preto, SP, Brasil 2 Departamento de Química, Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras, Universidade de São Paulo – USP, Cep 14040-901, Ribeirão Preto, SP, Brasil e-mail: deoliveira@usp.br

Resumo A elevada diversidade química dos produtos naturais de plantas representa um desafio para os métodos analíticos de separação e detecção, sendo difícil empregar um procedimento único de análise para todos os compostos presentes em um extrato. Atualmente, métodos cromatográficos como a CLAE, a CLUE e a CG têm desempenhado um importante papel quanto à eficiência de separação. A vantagem de cada uma dessas técnicas dependerá do propósito experimental requerido. No presente trabalho analisar-se-ão as vantagens e desvantagens de cada uma dessas técnicas cromatográficas na análise do(s) metabólitos(s) do produto natural piperlongumina, após essa ser metabolizada por microssomas de fígado de ratos.

Mediante as comparações, conclui-se que as técnicas não se excluem e não são competitivas, pelo contrário, são complementares, cada uma com suas especificidades e limitações.

Palavras-chave CLAE; CLUE; CG; produto natural.

Chromatographic techniques and the challenge for the determination of compounds in complex matrices: Report of a case study of the natural product piperlongumine Abstract The chemical diversity of the natural products from plants represents a challenge for analytical methods of separation and detection. It is difficult to employ a single procedure to analise all compounds.

Currently, chromatographic methods such as HPLC, GC and UHPLC have played an important role on the separation efficiency. The advantage arising from each one will depend on the experimental requirements. In this study, it will be analyzed the advantages and disavantages of these chromatographic techniques for determination of piperlongumine, as well as the resulting metabolites from the in vitro metabolism performed by rat liver microsomes. Regarding to the comparison, it is concluded that the techniques do not compete with them, unlike; they are complementary to each other.

Keywords HPLC; UHPLC; GC; natural products.

Técnicas cromatográficas e o desafio na determinação de compostos presentes em matrizes complexas

1 Introdução 1.1 Produtos naturais e técnicas cromatográficas Desde o início da história da humanidade, os produtos naturais (PN) sempre foram investigados e utilizados para tratamento de inúmeras doenças, sendo fonte para o desenvolvimento da maioria dos medicamentos utilizados[1]. A razão para isso pode ser explicada pela elevada diversidade química, a qual representa um desafio para os métodos analíticos de separação e detecção[2], sendo difícil empregar um procedimento único de análise para todos os compostos, levando-se em conta que os analitos podem estar presentes em pequenas ou grandes quantidades e, dependendo do tipo de estudo (quantificação, fingerprinting, análise de traços etc.), requerem-se elevada sensibilidade e seletividade para a sua detecção[3,4].

Ao longo dos últimos 100 anos, a cromatografia se desenvolveu a partir de uma ferramenta rudimentar para a separação dos pigmentos em um conjunto de técnicas capazes de enfrentar os mais complexos problemas de análise, separação e purificação dos componentes de uma amostra.

No decurso do seu crescimento, podem-se destacar basicamente três importantes referências: a introdução da cromatografia, a contribuição dos estudos de Martin, na década de 1950, e a introdução do equipamento de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), na década de 1970[5].

Até o advento da CLAE, as separações de compostos, principalmente os oriundos de plantas, eram realizados por cromatografia em coluna aberta, em papel ou em camada delgada. Suas desvantagens: a grande quantidade de amostra requerida e o tempo gasto no caso da cromatografia em coluna aberta, o que foi melhorado com o emprego de menores quantidades de 102

Marques LMM, Oliveira ARM

amostra na cromatografia em papel e em camada delgada; no entanto, a quantificação era ainda inadequada e havia dificuldade na resolução de compostos similares[5].

Atualmente, métodos cromatográficos como a CLAE, a CLUE (cromatografia líquida de ultra eficiência) e a CG (cromatografia gasosa) têm desempenhado importante papel quanto à eficiência de separação[5-7]. A vantagem advinda de cada um deles dependerá do propósito experimental requerido[8].

1.2 CLAE, CLUE e CG A análise de PN exige métodos de separação eficientes antes da sua detecção. A CLAE tem sido reconhecida desde o início da década de 1980 como a técnica mais versátil para esse fim.

Ao longo dos anos, ela vem passando por aprimoramentos em termos de velocidade de análise, tipos de fases estacionárias empregadas, detectabilidade, aplicabilidade a uma variedade de amostras, além da capacidade de hifenação com detectores espectrométricos. Do ponto de vista cromatográfico, colunas com diferentes fases vêm permitindo uma melhor separação de compostos e o desenvolvimento mais recente inclui o emprego de colunas estáveis em uma maior faixa de pH, contendo partículas com tamanho menores que 5 m[4,9]. Isso porque as propriedades químicas do material de enchimento e as propriedades da coluna necessitam ser levadas em consideração[4]. Muitas vezes, o uso de pH elevado é necessário a fim de se evitar, por exemplo, a coeluição de picos ou o aparecimento de picos assimétricos.

Essas tendências na cromatografia líquida estão permitindo uma adequada seletividade e redução no tempo de análise sem comprometer a qualidade da separação, gerando picos com resolução aceitável. Desse modo, em 2004 foi lançado o primeiro sistema de CLUE disponível Scientia Chromatographica 2013; 5(2):101-109

Técnicas cromatográficas e o desafio na determinação de compostos presentes em matrizes complexas

no mercado (Waters Corporation), sendo possível encontrar vários nomes para essa técnica: resolução rápida, separação rápida e separação ultrarrápida[10].

A CLUE é uma ferramenta de separação rápida ideal para análise de amostras complexas em ambos os modos: gradiente e isocrático. Em comparação com a CLAE, a eficiência é maior, com menor alargamento de banda, maiores valores de resolução, maior velocidade de análise e melhor detectabilidade por meio da utilização de partículas de sub-2 m, o que gera picos mais finos, melhorando assim a relação sinal/ruído[11].

Essa redução no tamanho das partículas resultou, segundo o modelo teórico descrito por van Deemter, na diminuição dos caminhos múltiplos e da resistência à transferência de massa, fatores esses responsáveis pelo alargamento de bandas em CLAE. Embora a CLAE apresente algumas vantagens relacionadas à especificidade e detectabilidade, o tempo necessário para análise é relativamente longo, de 20 min a 80 min.

A CLUE, por sua vez, o reduz marcadamente em até 20 vezes, sem que isto comprometa a resolução[12-14]. Um benefício adicional da CLUE é o baixo consumo de fase móvel[10].

A alteração deu-se não somente no tamanho, mas foram desenvolvidas partículas híbridas com pontes de etileno (Acquity BEH – Waters Corporation), obtidas por meio da cocondensação de 1,2-bis-(trietoxissilil)-etano (BTE) com tetraetoxissilano (TEOS). Com a presença dessas pontes, a maioria dos grupos silanóis livres está protegida[15], conferindo elevada estabilidade química ao longo de quase toda a faixa de pH (1 a 12), diminuição de interações secundárias indesejáveis com esses grupamentos[10] e maior estabilidade mecânica, por meio das ligações silício-carbono, que garante resistência a altas pressões[11].

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Além da cromatografia líquida, emprega-se também a cromatografia gasosa (CG) na análise de PN. Sessenta anos se passaram desde que o seu princípio foi demonstrado pela primeira vez por James e Martin[16]. É uma técnica analítica bem estabelecida, comumente utilizada para a caracterização e identificação de compostos voláteis.

Possui excelente poder de resolução, tornando possível, muitas vezes, a análise de dezenas de substâncias de uma mesma amostra[17,18]. A restrição para análise de amostras voláteis (menos de 20% dos compostos orgânicos podem ser separados) faz com que a cromatografia líquida seja uma técnica alternativa para separação de compostos não voláteis e termolábeis5.

No presente trabalho serão discutidas as vantagens e desvantagens de cada uma dessas técnicas cromatográficas no desenvolvimento de um método para análise do(s) metabólitos(s) do produto natural piperlongumina (Figura 1), obtido após metabolismo por microssomas de fígado de ratos.

2 Parte experimental 2.1 Reagentes e solventes Acetato de etila, acetonitrila (ACN) e metanol grau HPLC foram obtidos da J.T. Baker (Phillipsburg, EUA). D-Glicose 6-fosfato monossódico, glicose 6-fosfato desidrogenase

Figura 1

Estrutura química da piperlongumina.

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Técnicas cromatográficas e o desafio na determinação de compostos presentes em matrizes complexas

tipo VII, -nicotinamida adenina dinucleotídeo foram obtidos da Sigma-Aldrich (Darmstadt, Alemanha). Fosfato de sódio monobásico anidro PA foi comprado da Synth (SP, Brasil).

Hepes, Tris (base) foram obtidos da J.T. Baker (Phillipsburg, EUA). A piperlongumina (isolada de Piper tuberculatum) foi gentilmente cedida pelo prof. dr. Massuo Jorge Kato, do IQ-USP.

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(50 mm × 2,1 mm, 1,7 m) e temperatura de análise de 32 °C. Como fase móvel, foi utilizado modo de eluição por gradiente, empregando acetonitrila e água, ambas com 1% de ácido acético (v/v), que iniciava com 10% de ACN e atingia 100% em 4 minutos. A vazão empregada foi de 0,3 mL min–1 e o volume de injeção de 5 L. 2.2.3 CG-EM

2.2 2.2 Análises cromatográficas 2.2.1 CLAE-DAD [19] Equipamento de CLAE marca Shimadzu® (Kioto, Japão), composto de uma bomba LC-20AT, operando a uma vazão de 1 mL min–1, degaseificador DGU-20A5, injetor com amostrador de 50 L SIL-10AF, detector por arranjo de diodo SPD-M20A (190 nm a 800 nm), controladora CBM-20A e forno para coluna modelo CTO-20A, temperatura de análise de 32 °C. As injeções foram realizadas automaticamente (20 L) e o programa empregado na aquisição dos dados foi o software LC solution, SPDM20A PDA utility (Shimadzu®, Kioto, Japão).

Utilizou-se a coluna cromatográfica Shim-pack VP-ODS Shimadzu® (250 mm × 4,6 mm d.i., 4,6 m) e coluna de guarda Shim-pack GVPODS Shimadzu® (10 mm × 4,6 mm d.i., 4,6 m) (Kioto, Japão). Como fase móvel, foi utilizada acetonitrila 40% e água 60% (v/v) para o modo de eluição isocrático. Para o modo por gradiente foi utilizado acetonitrila e água, ambos com 1% de ácido acético (v/v), que iniciava com 10% de ACN e atingia 100% em 30 minutos, a uma vazão de 1 mL min–1.

2.2.2 CLUE-DAD [19] Equipamento de CLUE: Acquity UPLC™DAD da Waters® Corporation (Milford, Massachusetts, EUA), coluna Acquity™ UPLC BEH C18 (Bridged Ethylsiloxane Hybrid) 104

Empregou-se um cromatógrafo CG-EM QP2010 série C704643 equipado com autoinjetor AOC-5000, ambos da Shimadzu® (Kioto, Japão).

Foi utilizada coluna capilar de sílica fundida, DB-1MS (30 m × 0,25 mm, 0,25 m, Agilent Technologies, J & W Scientific, Folsom, CA, EUA). Um L foi injetado no modo splitless com temperatura de injeção de 250 °C e o intervalo de massas analisadas foi de m/z 40-400, energia de ionização de 70 eV. As análises das amostras teste foram feitas no modo full scan, sendo empregado hélio como gás de arraste, a uma velocidade linear de 42,9 cm s–1. A temperatura da fonte de íons e da interface foi de 250 °C e 280 °C, respectivamente. A temperatura inicial de análise foi de 100 °C, sendo mantida durante cinco minutos.

Após, a temperatura foi aumentada a 5 °C min–1 até atingir 290 °C, assim permanecendo por sete minutos.

2.3 Procedimento de incubação para o estudo de metabolismo in vitro e preparo das amostras [19,20] A mistura de incubação (1 mL) consistiu de: 725 L de tampão fosfato de sódio 0,25 mol L–1 (pH 7,4), 250 L da solução de incubação contendo NADP+ (fosfato de dinucleótido de nicotinamida e adenina) (0,25 mM), glicose-6-fosfato (5 mM) e glicose-6-fosfato desidrogenase (0,5 unidades mL–1) em tampão Tris-HCl 0,05 mol L–1 (pH 7,4) com 0,15 mol L–1 KCl[20].

Adicionou-se a fração microssomal do fígado de rato (Protocolo CEUA n. 11.1.1047.53.4), a Scientia Chromatographica 2013; 5(2):101-109

Técnicas cromatográficas e o desafio na determinação de compostos presentes em matrizes complexas

fim de obter-se uma concentração protéica de 1 mg mL–1. Esse meio foi fortificado com 25 L das soluções padrão da piperlongumina (concentração alta 1 mg mL–1 e baixa 250 g mL–1) e o procedimento de metabolismo in vitro iniciou-se. A incubação foi realizada sob agitação a 37 °C, em banho-maria, modelo SL 157 (Solab, SP, Brasil), durante 50 minutos. A reação foi encerrada ao adicionarem-se 4 mL de solvente orgânico extrator (acetato de etila); em seguida as amostras foram agitadas por 15 minutos a 1.000 rpm (modelo VRX, IKA®, Stafuen, Alemanha). Após essa etapa, centrifugaram-se os tubos a 2.000 g durante cinco minutos a 5 °C (modelo Himac CF16RXII, Hitachi, Tóquio, Japão). Retiraram-se 3 mL de solvente orgânico, e transferidos para outro tubo. Por fim, as amostras foram evaporadas até secura sob fluxo de ar comprimido. Os resíduos foram ressuspensos em 100 L de fase móvel e levados para análise. Amostras controles foram preparadas contendo microssomas inativos e sem o sistema de regeneração de NADPH. Amostras branco também foram preparadas sem adição da piperlongumina. Ambas foram submetidas ao mesmo procedimento de incubação anteriormente descrito.

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a fim de obterem-se resolução aceitável, picos simétricos e curto tempo de análise. A proporção escolhida foi ACN: H2O (40: 60 v/v). Conforme apresentado na Figura 2, há a presença de dois picos, bem resolvidos e simétricos, um relacionado à piperlongumina em tR = 15,41 min, o qual também apareceu na amostra controle, e o outro em tR = 7,12 min, relacionado ao produto do metabolismo in vitro, que não apareceu na amostra controle. Por questão de detectabilidade dos compostos, injetou-se uma solução de concentração 1 mg mL–1 obtida a partir de um pool de 30 replicatas, uma vez que os detectores ópticos de CLAE (UV – ultravioleta e DAD – arranjo de diodos) são projetados para suportar injeções de grandes quantidades de amostra, por longos períodos de análise, sem que isso cause sua saturação14.

Com o emprego dessa condição, o tempo total da análise foi de 18 minutos; entretanto, com o intuito de desenvolver um método mais rápido, visando os diversos ensaios futuros que exigiriam muitas replicatas, e também a economia de fase móvel, partiu-se para o desenvolvi-

3 Resultados e discussão Inicialmente desenvolveu-se um método de análise no modo isocrático em equipamento de CLAE-DAD, para detecção da piperlongumina e os possíveis produtos formados no metabolismo in vitro e, assim, verificação do perfil do meio reacional. Levando-se em conta que os fatores responsáveis pela alteração do tempo de retenção de um composto são composição da fase móvel, afinidade do analito pela fase estacionária e tipo de eluição empregada[10], diferentes proporções entre os solventes foram utilizadas: ACN: H2O 40: 60, 50: 50, 60: 40 e 70: 30 (v/v), Scientia Chromatographica 2013; 5(2):101-109

Figura 2 Cromatograma da piperlongumina no meio microssomal: tR = 7,12 minutos (produtos de oxidação), tR = 15,41 minutos (piperlongumina), I*: impureza da piperlongumina; condição cromatográfica: coluna Shim-pack VP-ODS Shimadzu® (250 mm × 4,6 mm, 4,6 m), vazão da fase móvel 1 mL min–1; o comprimento de onda foi fixado em 325 nm; volume injetado: 20 L; fase móvel acetonitrila: água 40: 60, (v/v).

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mento de um método por CLUE-DAD. Apesar de na literatura haver descrições de softwares ou equações para conversão das condições entre as duas técnicas, preferiu-se elaborar uma a partir de várias tentativas e assim otimizar-se a separação dos compostos. A condição final foi: modo de eluição por gradiente com acetonitrila e água, ambas com 1% de ácido acético (v/v), que iniciava com 10% de ACN e atingia 100% em 4 minutos.

Conforme apresentado na Figura 3, há três picos, um relacionado à piperlongumina em tR = 2,79 min, o qual também apareceu na amostra controle, e, surpreendentemente, outros dois em tR = 1,99 min e tR = 2,23 min, relacionados aos produtos do metabolismo in vitro, os quais não apareceram na amostra controle, resultado diferente do apresentado anteriormente por CLAEDAD. O tempo para que ocorresse a separação foi inferior a três minutos e a análise total durou oito minutos (considerando o tempo de recondicionamento da coluna); muito inferior aos 18 minutos anteriormente relatados para CLAE, além de não haver perda de resolução entre os

Figura 3 Cromatograma da piperlongumina no meio microssomal: tR = 1,99 minuto e tR = 2,23 minutos (produtos de oxidação), tR = 2,79 minutos (piperlongumina), I*: impureza da piperlongumina; condição cromatográfica: coluna Acquity™ UPLC BEH C18 (Bridged Ethylsiloxane Hybrid) (50 mm × 2,1 mm, 1,7 m), vazão fase móvel 0,3 mL min–1; o comprimento de onda foi fixado em 325 nm; volume injetado: 5 L; eluição por gradiente empregando acetonitrila e água, ambos com 1% de ácido acético (v/v), que iniciava com 10% de ACN e atingia 100% em 4 minutos.

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picos. Diferentemente do experimento com CLAE convencional, utilizou-se uma solução de concentração menor, 250 g mL–1, sem a necessidade do pool das replicatas, porque os detectores ópticos em CLUE são projetados com volume da cela menor e um caminho óptico longo, o que mantém o sinal, causando baixa dispersão da amostra e obtendo-se alta detectabilidade[11,14].

O exame desses resultados gerou uma dúvida: houve a formação de apenas um ou de dois metabólitos? Retornou-se à CLAE-DAD convencional para o desenvolvimento de outro método, dessa vez utilizando-se eluição por gradiente para, assim, comparar resultados com a CLUE. Após muitas tentativas, chegou-se à condição: acetonitrila e água, ambas com 1% de ácido acético (v/v), que iniciava com 10% de ACN e atingia 100% em 30 minutos, a uma vazão de 1 mL min–1.

Conforme mostrado na Figura 4, há a presença de apenas dois picos, um relacionado à piperlongumina em tR = 18,50 min e outro em tR = 14,80 min, relacionado aos produtos do metabolismo in vitro.

Os demais picos referem-se a interferentes graxos presentes na matriz.

Diante do exposto, chega-se a uma primeira hipótese de que realmente seriam formados dois produtos[19] oriundos de reação de oxidação, a qual é possível pelo sistema microssomal[21]. Tal reação os torna mais polares que a piperlongumina e, portanto, eles eluem em tempo anterior a ela. Outra conclusão foi a de que os compostos formados apresentam estruturas muito semelhantes, dado o comportamento cromatográfico idêntico no CLAE-DAD. Dessa forma, sugeriu-se que esses compostos tratavam-se de isômeros[19], pois a separação completa deles só foi conseguida com o emprego da CLUE, a qual possui um menor tamanho de partícula (1,7 m), elevado número de pratos e, portanto, uma maior eficiência. Dessa forma, o uso da CLUE foi fundamental nesse estudo, pois possibilitou uma maior separação dos analitos, ao contrário Scientia Chromatographica 2013; 5(2):101-109

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Figura 4 Cromatograma da piperlongumina no meio microssomal: tRv = 14,80 minutos (produtos de oxidação) e tR = 18,50 minutos (piperlongumina); condição cromatográfica: coluna Shim-pack VP-ODS Shimadzu® (250 mm × 4,6 mm, 4,6 m), vazão da fase móvel 1 mL min–1; o comprimento de onda foi fixado em 325 nm; volume injetado: 20 L; fase móvel: acetonitrila e água, ambos com 1% de ácido acético (v/v), que iniciava com 10% de ACN e atingia 100% em 30 minutos.

da CLAE convencional, que com emprego de uma coluna recheada com partículas de 4,6 m de tamanho, não foi eficiente para separá-los no modo isocrático (coeluição) e nem no modo por gradiente (novamente coeluição), sendo que nesse último modo consumiram-se mais de 30 minutos na análise (levando-se em conta o tempo para o recondicionamento da coluna).

Apesar dessa desvantagem, o emprego da CLAE convencional seria proveitoso para uma aplicação em escala preparativa, com a finalidade de isolamento dos compostos e sua caracterização.

Na hipótese de que seriam isômeros, desenvolveu-se um novo método, agora por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas, baseado no trabalho de Schaab et al.[22].

No ajuste da rampa de aquecimento, preferiu-se trabalhar com baixas taxas de aquecimento, mesmo que isso acarretasse maior tempo de análise, a fim de obter-se uma melhor capacidade de pico[23], e optou-se pelo modo splitless, pois como os metabólitos estavam presentes em menor quantidade era necessário que toda a amostra fosse introduzida na coluna. Houve o aparecimento de três picos: um relacionado à Scientia Chromatographica 2013; 5(2):101-109

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piperlongumina em tR = 38,99 min, o qual também apareceu na amostra controle, e outros dois, em tR = 39,93 min e em tR = 41,07 min, relacionados aos produtos do metabolismo in vitro, os quais não apareceram na amostra controle[19].

Em todas as três técnicas não houve aparecimento de nenhum pico na amostra branco. Com isso confirma-se a hipótese de dois metabólitos e não apenas um. Por se tratar de produtos oxidados, há a formação de ligação de hidrogênio nas novas estruturas, que aumentam o ponto de fusão dos compostos e por isso eluem em tempo posterior à piperlongumina.

A técnica de cromatografia gasosa foi capaz de resolver todos os compostos presentes, contudo o tempo total requerido foi de 50 minutos e, por questões de detectabilidade (baixo volume de injeção e baixa capacidade da coluna) dos metabólitos, foi necessário injetar uma solução de concentração 1 mg mL–1, obtida a partir de um pool de 30 replicatas, devido à baixa concentração do substrato e, portanto, dos possíveis produtos. Esses dados confirmam a elevada eficiência apresentada pela CG devida, principalmente, ao longo comprimento da coluna cromatográfica, ao reduzido diâmetro da coluna e à rápida taxa de transferência de massa que ocorre entre a fase estacionária e o gás de arraste, levando, portanto, a uma maior eficiência na separação.

4 Conclusão Conclui-se que as técnicas empregadas não se excluem e não são competitivas, pelo contrário, são complementares, cada uma com suas especificidades e limitações. É inevitável não destacar a economia de tempo e de solvente conseguida nas análises por CLUE, além da resolução e eficiência de separação entre picos com estruturas similares. Há que se levar em consideração a realidade de cada laboratório e a finalidade do analista em sua rotina quando se escolhe uma delas.

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Agradecimentos Os autores gostariam de agradecer à FAPESP (Processos n. 2011/13560-9 e 2011/17508-1), ao CPNq e à CAPES pelo auxílio financeiro concedido.

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Recebido: 12/09/2013 Aceito: 04/10/2013

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Pharmaceutical & Life Sciences | Food | Environmental | Clinical | Chemical Materials Scientia Chromatographica Scient Sci entia ia Chr Ch om tog oma ogrraphic r ap hica 2013; 5(2):101-109 5(( 2): 2):101 101-10 101 -109 -10 9 ©2013 Waters Corporation. Waters and The Science of What’s Possible are registered trademarks of Waters Corporation.

ACQUITY QDa and Separating Beyond Question are trademarks of Waters Corporation.

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HPLC

ISSN 1984-4433

Suportes cromatográficos e fases estacionárias para cromatografia líquida: preparo, evolução e tendências Carlos Eduardo Domingues Nazario, Fernando Mauro Lanças* Instituto de Química de São Carlos, Universidade de São Paulo – USP, CP 780, Cep 13560-970, São Carlos, SP, Brasil e-mail: flancas@iqsc.usp.br

Resumo Desde o surgimento da instrumentação dedicada à HPLC, essa técnica analítica tem se destacado na separação e análise de uma grande variedade de compostos em diferentes campos de atuação. Nesse contexto, a área de pesquisa e desenvolvimento (P&D) de suportes cromatográficos e de fases estacionárias para HPLC tem recebido atenção de pesquisadores, objetivando análises rápidas, colunas eficientes e seletividade adequada. Neste trabalho discutem-se os métodos utilizados no preparo de suportes cromatográficos para HPLC (principalmente os baseados em sílica) e as estratégias de modificação de sua superfície no preparo de fases estacionárias.

Palavras-chave HPLC; suporte cromatográfico; sílica; fase estacionária.

Chromatographic supports and stationary phases for liquid chromatography: preparation, evolution and trends Abstract Since the development of instrumentation for HPLC, this analytical technique has been widely employed in the separations and analysis of a large variety of compounds in different fields. In this context, research and development (R & D) area of chromatographic supports and stationary phases for HPLC have been receiving attention from researchers aiming the decrease in analysis time, increase column efficient and promote adequate selectivity. In this paper, we focused on the methods for the preparation of chromatographic supports for HPLC (especially silica-based materials) and strategies for modifying its surface in the preparation of stationary phases.

Keywords HPLC; chromatographic support; silica; stationary phase.

Nazario CED, Lanças FM

1 Introdução O desenvolvimento da cromatografia líquida moderna como se conhece hoje iniciou-se na década de 1960 por dois grupos de pesquisa: Csaba Horváth, nos Estados Unidos, e Josef Huber, na Europa. Esses pesquisadores conduziram estudos voltados para o desenvolvimento de um sistema instrumental de cromatografia líquida hoje conhecida como cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC)[1]. Desde o surgimento da instrumentação apropriada, a HPLC tem se destacado rapidamente como uma técnica analítica eficiente na área química, farmacêutica, alimentar, ambiental e biológica. Em HPLC, diferentes modos de separação estão disponíveis tais como modo normal, reverso, iônico, exclusão, interação hidrofílica, quiral, bioafinidade etc[2,3].

A base para o desenvolvimento dos modos de separação em HPLC é o suporte cromatográfico presente no interior da coluna. Assim, pesquisas voltadas para o desenvolvimento de suporte cromatográfico e fases estacionárias para HPLC têm sido conduzidas por pesquisadores acadêmicos e da indústria com o objetivo de aprimorar a seletividade e diminuir o tempo de análise sem comprometer a resolução cromatográfica.

2 Síntese de suporte cromatográfico Um bom suporte cromatográfico para HPLC deve possuir algumas características fundamentais como ser mecanicamente estável, ou seja, suportar altas pressões exigidas no sistema HPLC, possuir grande concentração de grupos ativos na superfície, a fim de promover melhor desempenho cromatográfico, ser inerte em relação aos compostos a serem analisados, possuir área superficial e diâmetro de poros adequados (fator dependente da aplicação)[4].

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Suportes cromatográficos e fases estacionárias para HPLC

Em cromatografia líquida, os suportes cromatográficos podem ser baseados em polímeros inorgânicos, orgânicos ou híbridos[5]. Entre os polímeros inorgânicos pode-se destacar o óxido de silício (sílica), que é o suporte mais utilizado nas separações cromatográficas[6]. A sílica apresenta-se em unidades tetraédricas (SiO4) aleatórias unidas por grupos siloxanos e sua superfície apresenta grupos silanois[7,8]. O destaque da sílica como suporte cromatográfico em HPLC ocorre devido às suas características favoráveis como, por exemplo, boa resistência mecânica, estabilidade química térmica, área superficial e estrutura de poros controláveis e grupos silanois suscetíveis a posteriores modificações no preparo de diferentes fases estacionárias[9-14].

As características do suporte cromatográfico baseado em sílica são extremamente dependentes da estratégia utilizada para o seu preparo. Entre as metodologias de síntese de sílica podem-se destacar o método de gelificação das soluções de sal de silicato (sil-gel), o método de hidrólise de organossilanos (sol-gel) e o método de agregação controlada de sílica coloidal estável. O termo sol é utilizado para definir uma dispersão de partículas coloidais (diâmetro entre 1-100 nm), enquanto o termo gel é caracterizado como um sistema formado por estruturas rígidas das partículas coloidais ou de cadeias poliméricas que imobiliza a fase líquida nos seus interstícios[15].

2.1 Processo sil-gel Pela rota sílica gel (também chamada de sil-gel) usualmente se utiliza o silicato de sódio como material de partida. A descoberta da sílica gel foi realizada por Thomas Graham (1861): ele preparou a sílica a partir de uma mistura de uma solução aquosa de silicato de sódio, normalmente preparada através do aquecimento de areia e soda cáustica a temperatura elevada[7], que depois sofre um processo de hidrólise com Scientia Chromatographica 2013; 5(2):111-135

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a adição do ácido clorídrico, formando o ácido silícico. Posteriormente, ocorre a reação de condensação do ácido silícico formando dímeros, trímeros e, consequentemente, uma rede polimérica de ácido silícico (Figura 1). Nesse processo, a rede polimérica continua crescendo e formando partículas esféricas primárias de alguns angstrons de diâmetro (Figura 2a). As partículas primárias continuam a aumentar de tamanho e, posteriormente, sofrem condensação através dos grupos silanois presentes em sua superfície (Figura 2b). Como resultado, as partículas primárias ficam aderidas umas às outras (aglomeração) e a solução começa o processo de gelificação para formar o hidrogel (Figura 2c).

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Após a formação do hidrogel, o material sintetizado é submetido a um período de envelhecimento no qual as partículas primárias de sílica continuam o processo de polimerização.

Essa etapa é importante, pois confere resistência mecânica ao material final. Em seguida o hidrogel passa para a etapa de desidratação (secagem), na qual é transformado em xerogel[7].

A característica final da sílica sintetizada através desta rota é extremamente dependente das condições reacionais (concentração dos reagentes, temperatura da reação, pH da solução, tempo e condições de envelhecimento e processo de secagem) e, muitas vezes, difícil de controlar e reproduzir. A influência do pH no tempo de gelificação está representada na Figura 3.

Figura 1 Etapas do processo sil-gel: hidrólise e condensação.

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Figura 2 Representação da formação da sílica gel: (a) formação das partículas primárias; (b) aumento de tamanho das partículas primárias; e (c) formação do hidrogel.

Figura 3 Influência do pH no tempo de gelificação no processo sil-gel.

Pode-se observar que em baixos valores de pH, o tempo de gelificação aumenta rapidamente com o aumento do pH (próximo a 2). Na faixa de pH entre 2 e 4, a solução é estável e muitas horas são necessárias para promover a formação do hidrogel. Em contrapartida, se o pH da solução é ajustado entre 4 e 8, a solução se torna instável e a formação do hidrogel ocorre em poucos minutos. Acima de pH 8, o tempo de gelificação começa a aumentar novamente e ocorre a competição com a quebra da rede polimérica da sílica, devido à sua solubilização[7].

Partículas de sílica formadas na faixa de pH entre 1-4 apresentam grande área superficial (aproximadamente 800 m2 g–1). Em contrapartida, na medida em que o pH é aumentado de 4 para 8 ocorre uma diminuição dos valores de

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área superficial (800 m2 g–1 para 200 m2 g–1). De forma geral, a área superficial das partículas de sílica é inversamente proporcional às dimensões das partículas primárias provenientes da polimerização do ácido silícico. Como resultado, as partículas primárias são relativamente menores quando preparadas em pH entre 1-4, quando comparadas com a faixa de pH 4-8.

Quando a solução de silicato de sódio com o pH ajustado é submetida a agitação magnética ocorre o fenômeno chamado maturação de Otswald (também conhecido como envelhecimento de Otswald). Esse processo consiste no aumento do diâmetro de partículas a custa de partículas primárias com diâmetro menor.

Adicionalmente, o processo de maturação/envelhecimento do gel formado leva ao aumento do tamanho das partículas primárias. Além disso, logo após a formação do gel, o mesmo não apresenta rigidez e, durante o processo de maturação por alguns dias, reações de condensação das partículas primárias continuam ocorrendo e o hidrogel se torna firme e com boa resistência mecânica[7].

O processo de lavagem do hidrogel após o envelhecimento também altera as características finais da sílica. Estudos demonstram que a lavagem do hidrogel com solução ácida (pH = 3) promove uma diminuição da área superficial do polímero quando comparada com a lavagem com água em pH = 6,5. Além disso, a imersão do hidrogel em diferentes solventes também promove alterações no material sintetizado.

Após todas essas etapas, o hidrogel é submetido a aquecimento para se transformar em xerogel.

Para serem utilizadas como suporte cromatográfico em LC, as partículas do xerogel são trituradas e separadas em faixas de diâmetros de partículas com aplicabilidade em LC. Ajustes nas condições sintéticas devem ser realizados de acordo com os parâmetros desejados para o polímero final.

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Esse método permite obter partículas irregulares classificadas como sílica gel tipo A por utilizar precursor de baixa pureza e, portanto, apresentar maior quantidade de metais (Na, Ca, Fe, Al, Mg, Cu, Zn)[16,17]. Dessa forma, um tratamento dos materiais de partida com resina catiônica antes do preparo do hidrogel[18] e/ou tratamento pós-síntese em meio ácido[19] promovem uma maior homogeneidade na superfície da sílica. Adicionalmente, esse processo diminui a acidez dos silanois devido à presença de metais incorporados na rede polimérica da sílica. Além da utilização do silicato de sódio sólido[20] ou em solução (waterglass)[21] como material de partida no processo sil-gel, na literatura encontram-se trabalhos descrevendo outras fontes de sílica de baixo custo, tais como areia[8], casca de arroz[22] e argila[23]. Pode-se destacar a utilização desses materiais como suporte em técnicas de preparo de amostra.

2.2 O processo sol-gel O processo sol-gel é uma segunda abordagem empregada para preparar partículas de sílica. Nessa rota sintética geralmente utilizam-se precursores alcoxissilano (tetrametoxissilano (TMOS) ou tetraetoxissilano (TEOS)) dissolvidos em álcool. Posteriormente, com a adição de água e catalisador (ácido ou básico) ocorre a reação de hidrólise e condensação. É importante ressaltar que a hidrólise dos alcoxissilanos ocorre com maior eficiência e rapidez quando catalisadores são utilizados no processo. Normalmente, as reações de hidrólise e condensação ocorrem simultaneamente, assim que os reagentes são misturados. A reação de hidrólise leva à formação de grupos silanois e as reações de condensação levam à formação de ligações siloxano. A Figura 4 ilustra as reações químicas que ocorrem durante a transformação sol-gel. A reação de Scientia Chromatographica 2013; 5(2):111-135

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condensação possui um mecanismo complexo, pois se inicia antes do término da reação de hidrólise.

No processo sol-gel, a sílica obtida é classificada como do tipo B por apresentar maior pureza em relação à sílica tipo A (concentração de metais < 0,3%). As características finais da sílica também são dependentes das condições experimentais de síntese (concentração dos precursores, velocidade de agitação, temperatura reacional, natureza do catalisador). Um método amplamente conhecido para a obtenção de partículas esféricas e monodispersas de sílica é o método de Stöber, o qual se baseia na hidrólise e condensação de alcoxissilano em uma solução contendo água, álcool e amônia, formando partículas de hidrogel que, posteriormente, são calcinadas para aumentar a estabilidade do material[24]. Normalmente, as partículas obtidas nesse processo são consideradas não porosas e possuem diâmetro em escala nanométrica. O aumento no diâmetro médio pode ser obtido através do método de crescimento de partícula, o qual consiste em adicionar o precursor da sílica na suspensão das partículas.

Segundo Chang et al.[25], as partículas de sílica começam a aumentar de tamanho quando a concentração de TEOS no sistema alcança o nível saturado (CS). Entretanto, se a concentração de TEOS ultrapassar um valor limite de saturação (CS*) ocorrem novas nucleações, comprometendo a monodispersão das partículas. Chou e Chen[26] avaliaram o aumento no tamanho dos materiais, relacionando a velocidade de geração de novas nucleações e a velocidade de consumo do TEOS no crescimento de partículas. Se a velocidade de consumo do TEOS for maior que a de formação de novas partículas, ocorrerá aumento no diâmetro das partículas sem o surgimento de novas nucleações (secundárias). Contudo, se o inverso ocorrer, aparecerão novas nucleações (Figura 5).

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Figura 4 Etapa de hidrólise e condensação no processo sol-gel.

Uma forma de obter partículas porosas empregando o método de Stöber é incorporando, no processo sintético, compostos formadores de poros. Nesse procedimento, moléculas volumosas são utilizadas como template de poros e incorporadas na rede polimérica de 116

sílica. Assim, após sua remoção por calcinação, a partícula de sílica apresenta maior porosidade.

Unger et al.[27] realizaram trabalhos empregando alquilaminas (dodecilamina e hexadecilamina) para produzir poros nas partículas de sílica sintetizadas pelo método de Stöber modificado.

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Figura 5 Esquema da geração e consumo do intermediário sintético no processo de crescimento de partícula.

Similarmente, outros trabalhos têm mostrado bons resultados ao utilizar cloreto de hexadeciltrimetilamônio (CTAC)[28] ou brometo de hexadeciltrimetilamônio (CTAB)[29] como surfactante porogênico. Após sua síntese, o material é submetido a calcinação (500 °C-600 °C) para remoção da cadeia orgânica e geração dos poros na partícula de sílica. Com esse procedimento, materiais com mesoporos são usualmente sintetizados. Adicionalmente, trabalhos têm relatado que o tamanho dos poros pode ser expandido para a faixa de meso e macroporos através do tratamento das partículas de sílica com hidróxido de sódio, carbonato de sódio ou agentes complexantes orgânicos em temperatura elevada.

Pode-se considerar que esse processo de adequação dos poros está relacionado e fundamentado no processo de maturação de Ostwald[29,30].

Nesse contexto, em 1992 foi desenvolvida a sílica mesoporosa do tipo MCM-X (Mobile Crystalline Material) utilizando-se alquilamônio como surfactante em meio básico, por pesquisadores da Mobil Corporation. Em 1998, utilizando surfactantes catiônicos em meio ácido, Zhao et al. sintetizaram SBA-X (Santa Barbara Amorphous), sílica mesoporosa, utilizando copolímero tribloco como molde. Sílica com mesoporos altamente ordenados (SBA-15 e SBA16) foi obtida utilizando-se surfactantes não Scientia Chromatographica 2013; 5(2):111-135

iônicos. Em 2000, outros materiais denominados MSU-X (Michigan State University) foram obtidos utilizando-se surfactantes não iônicos em pH neutro; contudo sua estrutura é mais desorganizada em comparação com a das outras sílicas mesoporosas. Dessa forma, a sílica mesoporosa é um material interessante como suporte cromatográfico em HPLC devido à sua grande área superficial (1.000 m2 g–1) e estrutura organizada de poros[31,32].

2.3 O processo de agregação controlado Uma terceira abordagem para a preparação de partículas de sílica porosa para LC é o método de agregação controlado. Nessa rota sintética pode ser utilizada a agregação reativa ou a agregação de gotículas (gotas) dispersas.

2.3.1 O processo de agregação reativa Esse processo foi desenvolvido por Iler e McQueston em 1977, que o chamaram de coacervação (coacervation). Nesse procedimento, uma solução aquosa e estável de partículas de sílica coloidal (centenas de angstrons) é misturada com monômeros orgânicos miscíveis na solução. Após o processo de polimerização dos monômeros, as partículas coloidais de sílica são 117

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microencapsuladas em agregados esféricos na matriz polimérica orgânica (Figura 6). Por exemplo, ureia e formaldeído podem ser adicionados a uma solução coloidal em que, após ajuste do pH em faixas ácidas, ocorre o encapsulamento das partículas de sílica em escala nanométrica para a formação de partículas na escala micrométrica com polímero orgânico. Posteriormente, o material formado é tratado termicamente à temperatura de 500 °C, para remoção do polímero orgânico. Adicionalmente, a temperatura é elevada até 1.000 °C para a sinterização das micropartículas e aumento da resistência mecânica[30].

2.3.2 O processo de agregação de gotículas dispersas O processo de agregação de gotículas (gotas) dispersas inclui o método de secagem por nebulização (spray drying) e o método de emulsão. O spray drying consiste na dispersão de uma suspensão coloidal de sílica através de um bocal, formando pequenas gotículas do líquido (Figura 7).

A pulverização da suspensão ocorre dentro de um forno com temperatura em torno de 400 °C. Essa etapa resulta na evaporação da água das gotículas, empregando-se um gás de secagem quente, e na policondensação simultânea dentro das gotículas. As partículas obtidas após esse processo podem ser submetidas a um tratamento hidrotérmico para ajuste de porosidade. Tipicamente,

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a maioria das partículas sintetizadas por esse procedimento é esférica, contudo a morfologia depende das condições experimentais ajustadas.

O tamanho das partículas produzidas varia de acordo com a concentração dos reagentes, temperatura do forno de secagem, abertura do bocal de pulverização, tamanho das gotículas e outros parâmetros. Os materiais obtidos por essa metodologia geralmente apresentam grande faixa de distribuição de partículas e necessitam de classificação (elutriação, sedimentação em líquido ou fluxo de ar) para obterem-se faixas estreitas de diâmetro de partícula para uso em LC[5,30].

Partículas esféricas porosas também podem ser obtidas através do método de emulsão de uma suspensão coloidal, organossilano ou solução de silicato em solvente apolar no qual gotículas são formadas e, em seguida, solidificadas, formando as partículas esféricas que são separadas do meio reacional e submetidas a um tratamento térmico. É importante ressaltar, no entanto, que a distribuição do tamanho de partículas pode ser bastante ampla, dependendo das condições de emulsificação utilizadas para regular o tamanho das gotas[5,30]. Nesse contexto, Unger desenvolveu e patenteou uma metodologia para a síntese de partículas de sílica esférica em duas etapas. A síntese envolve a hidrólise parcial do TEOS em polietoxissilano (PES), formando um líquido viscoso que, posteriormente, é emulsificado por agitação em uma mistura etanol-água. Nesse sis-

Figura 6 Esquema do processo de agregação reativa.

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Figura 7 Representação esquemática do equipamento de spray drying.

tema reacional, esferas de PES são convertidas a sílica hidrogel através de catálise básica. As partículas esféricas de sílica são, posteriormente, convertidas para xerogel através de tratamento térmico (Figura 8)[33].

2.4 A sílica híbrida Os suportes baseados em sílica apresentam faixa de pH aplicável limitada (usualmente entre pH 2 e pH 8) e análise em temperatura superior a 60 °C, o que favorece a solubilização da sílica. Assim, outros materiais foram desenvolvidos com o objetivo de ampliar a faixa de pH e a temperatura nas aplicações. Dessa forma foi desenvolvido um suporte cromatográfico no qual a superfície da sílica é recoberta com uma camada de grupamentos hidreto (-Si-H), grupos formados pela reação dos silanois na superfície da sílica com o produto de hidrólise do preScientia Chromatographica 2013; 5(2):111-135

Figura 8 Processo de emulsificação no preparo de partículas de sílica.

cursor trietoxissilano (TES). Assim, os grupos polares presentes na superfície da sílica reagem, formando uma superfície apolar, e as interações indesejáveis dos analitos com os silanois residuais são minimizadas. Esses novos materiais são chamados de sílica tipo C, caracterizados por serem materiais híbridos de alta pureza e com maior estabilidade química (Figura 9a)[34,35].

Nessa mesma linha, outros materiais híbridos foram desenvolvidos utilizando-se precursores que continham a ligação silício-carbono (Si-C).

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Assim, essa ligação faz parte do suporte cromatográfico e melhora a estabilidade química dos materiais em uma faixa mais ampla de pH. A reação de TEOS com metiltrietoxissilano leva à incorporação do grupo metil na rede polimérica

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da sílica (Figura 9b). Um segundo exemplo de materiais híbridos observa-se na reação de TEOS com bis(trietoxissiletano) formando suportes que contêm ligações de etano na estrutura do polímero (Figura 9c). Adicionalmente, outra

Figura 9 Representação do preparo de sílica híbrida: (a) com grupamento hidreto na superfície; (b) com ligações silício-metil; (c) com ligações de etano; e (d) com um organossilano na superfície.

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metodologia utiliza a modificação da superfície da partícula de sílica com um organossilano para ampliar a faixa de pH utilizada sem perder a estabilidade mecânica do material (Figura 9d) [1,11,36] . Além disso, a inserção de um grupo organossilano [aminopropiltrietoxissilano (APTES) ou viniltrimetoxissilano (VTMES)] é interessante, pois a presença desses grupos funcionais facilita a reação química com outros grupamentos orgânicos. Esse fator torna possível o desenvolvimento de novas fases estacionárias[37].

2.5 Óxidos inorgânicos Em LC, os suportes cromatográficos também podem ser obtidos a partir de óxidos metálicos, que se destacam pela estabilidade química e térmica (Figura 10). Os materiais baseados em óxido de alumínio (alumina - Al2O3) apresentam boa estabilidade em uma faixa mais ampla de pH (1-13). Entretanto, esse suporte cromatográfico apresenta eficiência cromatográfica inferior aos materiais baseados em sílica e, consequentemente, esse fator contribuiu para a utilização moderada desse suporte[38,39]. Suportes cromatográficos baseados em óxido de zircônio (zircônia, ZrO2)[40] e óxido de titânio (titânia, TiO2)[41,42] apresentam boa estabilidade em pH entre 1 e 14 e

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sob temperaturas de até 200 °C. A superfície desses materiais apresenta sítios ácidos de Lewis e, consequentemente, fases estacionárias baseadas nesses óxidos têm demonstrado modo misto de retenção (fase reversa e troca iônica, por exemplo). Além disso, analitos com características básicas podem interagir fortemente com esses sítios ácidos, provocando caudas cromatográficas[30]. Outros óxidos metálicos também vêm sendo explorados como suportes cromatográficos. Podem-se destacar os materiais baseados em óxido de cério (céria, CeO2)[43] e óxido de tório (tória, ThO2)[44] Apesar das vantagens de estabilidade química e térmica, os suportes cromatográficos baseados em óxidos metálicos apresentam como desvantagem dificuldade de síntese e de funcionalização de partículas com propriedades adequadas para LC quando comparados com materiais baseados em sílica[11,45,46].

Na tentativa de conciliar as vantagens individuais desses materiais, trabalhos vêm sendo conduzidos na preparação de óxidos mistos, os quais combinam as propriedades da sílica e dos óxidos metálicos. Nesse conceito, materiais mistos como sílica-alumina, sílica-zircônia, sílica-titânia e sílica-magnésia foram sintetizados e apresentaram área superficial e diâmetro de

Figura 10 Suportes cromatográficos para LC: (a) óxidos inorgânicos; e (b) óxidos mistos.

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poros adequados, melhores desempenhos em temperaturas elevadas e operação em uma faixa mais ampla de pH[44,47,48].

2.6 Outros materiais Partículas esféricas porosas, baseadas em polímeros orgânicos naturais (polissacarídeos) e sintéticos também são utilizadas como suporte cromatográfico em LC[5]. Os polissacarídeos são produzidos a partir da celulose, agarose e dextran (Figura 11a). A presença de grupos hidroxila em sua estrutura possibilita posterior derivatização, alterando a seletividade do material final. Entre os polímeros orgânicos sintéticos, pode-se destacar o uso de poliestireno-divinilbenzeno (PS-DVB) em cromatografia líquida em fase reversa, troca iônica e exclusão por tamanho (Figura 11b). Outros polímeros, como metacrilatos substituídos, alcoóis polivinílicos e poliacrilamida também têm sido preparados por diferentes processos tecnológicos de fabricação.

Como exemplo, pode-se citar o preparado de suporte cromatográfico baseado em poliestireno preparado pela polimerização em suspensão óleo em água, enquanto a poliacrilamida é obtida em suspensão água em óleo[5]. Assim como os polissacarídeos, a presença de grupos funcionais nas partículas permite posterior funcionalização, modificando a seletividade do material.

Apesar de possuírem uma ampla faixa de pH aplicável, esses materiais apresentam baixa eficiência cromatográfica quando comparados com suportes cromatográficos baseados em sílica[49].

Adicionalmente, a facilidade de encolhimento e de expansão do polímero orgânico com baixo grau de ligações cruzadas (crosslinking) diminui sua resistência mecânica e, como consequência, ocorre uma limitação na pressão máxima de análise[50]. Por outro lado, polímeros orgânicos têm se destacado como bons suportes cromatográficos em cromatografia por exclusão de tama122

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nho e cromatografia de troca iônica. Polímeros orgânicos têm apresentado melhor robustez em sistemas com pH elevado da fase móvel e tampões fortes quando comparados com trocadores iônicos baseados em sílica[51].

Suportes baseados em carbono grafitado poroso (PGC) consistem em partículas esféricas de carbono totalmente porosas formadas a partir de folhas planas de átomos de carbono dispostos de forma hexagonal (Figura 11c). PGC não apresentam em sua estrutura grupos funcionais que promovam interações secundárias e são estáveis a pH entre 1-14 e, também, sob temperaturas de até 200 °C. No entanto, as partículas desse material não possuem resistência mecânica elevada e, consequentemente, apresentam uma limitação em termos de pressão máxima[1].

2.7 Materiais superficialmente porosos Além dos suportes cromatográficos totalmente porosos e dos não porosos, também são utilizados materiais superficialmente porosos.

O princípio tecnológico foi utilizado na década de 1960 nos trabalhos de Horváth, no desenvolvimento de partículas de sílica peliculares (30 μm-50 μm). O suporte cromatográfico era composto por um núcleo sólido, rígido e não poroso (contas de vidro), revestido com uma película de aproximadamente 1 μm de sílica porosa.

A camada pelicular fina permitiu uma rápida transferência do analito na camada porosa do suporte cromatográfico e, assim, promoveu uma melhora na eficiência cromatográfica, comparada à das partículas porosas empregadas na época[1,7].

Já as partículas de sílica superficialmente porosas modernas (fused-core silica particles ou core-shell silica particles) foram desenvolvidas principalmente por Kirkland na década de 1990 e receberam destaque a partir do ano 2000. O preparo das partículas ocorre em duas etapas distintas. A primeira envolve a síntese de partículas de sílica Scientia Chromatographica 2013; 5(2):111-135

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Figura 11 Suportes cromatográficos para LC baseados em: (a) polissacarídeos; (b) polímeros orgânicos sintéticos; e (c) carbono grafitado poroso (PGC).

não porosa (núcleo), através de tratamento térmico. A segunda etapa é o recobrimento da sílica não porosa com uma camada de sílica porosa (Figura 12). Dessa forma, a camada porosa permite rápida percolação da fase móvel e, conse-

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quentemente, análise rápida sem pressão elevada do sistema cromatográfico[52,53]. Adicionalmente, existem os materiais superficialmente porosos que empregam polímeros orgânicos[54], ainda pouco explorado em cromatografia.

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Figura 12 Partícula superficialmente porosa.

2.8 Materiais monolíticos Diferentemente de materiais particulados (Figura 13a), outra possibilidade de suportes cromatográficos envolve o uso de materiais monolíticos (Figura 13b)[55]. Uma coluna monolítica possui estrutura sólida e altamente porosa que fornece alta permeabilidade da fase móvel através dos canais porosos (Figura 13b).

Esses podem ser classificados como microporos, mesoporos e macroporos, dependendo do molde utilizado na síntese do monolito[56]. De acordo com a metodologia utilizada no preparo, pode-se classificá-los em de colunas monolíticas baseadas em polímeros orgânicos[57,58] e de colunas monolíticas baseadas em polímeros inorgânicos[59,60].

As primeiras colunas monolíticas orgânicas foram preparadas no início da década de 1990 por Svec e Fréchet. O preparo do material monolítico envolve a mistura de monômeros, agentes de ligação cruzada, solvente porogênico e catalisador radicalar que é ativado por calor ou luz UV. As colunas monolíticas inorgânicas são, em sua maioria, baseadas em sílica e obtidas pelo processo sol-gel. O primeiro trabalho bem-sucedido demonstrando a aplicação de monolito de sílica em separação cromatográfica foi realizado em 1996 por Tanaka, no qual se fez a modificação do material com o grupo C18 para atuar em cromatografia líquida em fase reversa[61].

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Figura 13 Característica estrutural de colunas cromatográficas: particulada (a); e monolítica (b).

A principal vantagem das colunas monolíticas em relação a colunas com preenchimento de materiais particulados é a redução do tempo de análise devido à possibilidade de utilizar vazões elevadas sem um grande aumento na pressão do sistema. As primeiras colunas monolíticas disponíveis comercialmente (2000) não apresentavam alta eficiência na separação quando comparadas com as colunas particuladas. Entretanto, recentemente (2012) foram desenvolvidas colunas monolíticas de segunda geração, chamadas de colunas monolíticas de alta resolução, as quais possuem um maior número de pratos por metro, sem comprometer a vantagem do fluxo elevado e de pressões compatíveis com os sistemas convencionais de LC[62].

2.9 Polímeros molecularmente impressos Uma abordagem de preparo de suporte cromatográfico seletivo é o uso de polímeros molecularmente impressos (MIP), fundamentada no reconhecimento molecular. Esses materiais têm se destacado pela vantagem de serem seletivos para um composto ou uma classe de compostos[63-65]. Na primeira etapa da síntese, há uma interação das moléculas precursoras do polímero com a molécula alvo (molde - template), formando um complexo monômero-template. Essa Scientia Chromatographica 2013; 5(2):111-135

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interação leva a posições específicas das extremidades dos monômeros ao redor do template. A próxima etapa é a reação de polimerização, na qual ocorre a formação do polímero ao redor do template. Nesta etapa ocorre a fixação dos grupamentos dos monômeros no material polimérico. Por fim, após a remoção do template, tem-se o MIP com cavidades e sítios seletivos para a interação do template ou de estruturas análogas a ele (Figura 14)[66]. Os suportes cromatográficos baseados em MIP podem ser particulados (irregulares ou esféricos) ou monolíticos empregando precursores orgânicos, inorgânicos ou híbridos através de interações não covalentes[37,61,66-68].

3 Fases estacionárias A fase estacionária determina a retenção e a seletividade dos analitos na análise cromatográfica. Os grupos silanois na superfície da sílica apresentam polaridade e suas ligações de hidro-

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gênio têm a capacidade de interagir com diversas moléculas, tornando possível a separação de substâncias.

Devido às primeiras separações cromatográficas terem sido realizadas utilizando-se a sílica (que possui superfície polar) como suporte cromatográfico, esta modalidade de cromatografia líquida foi denominada fase normal, sendo caracterizada por apresentar fase estacionária mais polar em relação à fase móvel; quando a fase estacionária for menos polar do que a fase móvel é denominada de cromatografia líquida em fase reversa[69]. Adicionalmente, tem-se a cromatografia por exclusão de tamanho, cromatografia de troca iônica, cromatografia por par iônico e cromatografia por interação hidrofílica.

Em HPLC, as fases estacionárias podem ser classificadas em sorvidas, imobilizadas ou quimicamente ligadas. A primeira caracteriza-se por ser um líquido de baixa massa molar apenas sorvido na superfície do suporte cromatográfico, porém essas fases estacionárias são difíceis de serem mantidas quando submetidas às pressões

Figura 14 Ilustração esquemática de preparo do MIP.

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utilizadas na HPLC. Assim, é necessário empregar fases móveis saturadas com a fase estacionária e fazer um controle de temperatura e vazão para diminuir a remoção da fase estacionária e garantir um resultado confiável nas análises[70].

Si-O-C, a ligação Si-N ainda apresenta faixa de

Outra metodologia utilizada para modificar a superfície de um suporte cromatográfico é o recobrimento com polímeros orgânicos[9].

Primeiramente, o polímero é sorvido no suporte cromatográfico e, posteriormente, imobilizado por reações de entrecruzamento catalisadas por agente químico[71] ou por processos físicos[72] (radiação térmica, gama ou micro-ondas). Essa técnica tem a vantagem de preparar fases estacionárias estáveis, além de isolar os sítios ativos residuais dos suportes cromatográficos. Entre os polímeros utilizados como fases estacionárias destacam-se polietileno, poliestireno e polissiloxanos. A maior dificuldade nessa técnica é a obtenção de um filme fino e homogêneo[73].

organossilanização que utiliza modificadores

A grande concentração de grupos silanois na superfície da sílica possibilita a sua modificação química, obtendo-se as chamadas fases estacionárias quimicamente ligadas (FEQL), que possuem propriedades específicas relacionadas aos grupos ligados na superfície da sílica (Figura 15). A síntese dessas fases teve início na década de 1960, através da reação de esterificação dos grupos silanois com álcool alifático de cadeia longa (Figura 15a). Contudo, a ligação Si-O-C é relativamente fraca em soluções aquosas, sendo hidrolisada rapidamente, regenerando os grupos silanois na sílica[2,7,44].

Na tentativa de obter FEQL estáveis foram preparados materiais a partir da reação da sílica com cloreto de tionila (SOCl2) e, posteriormente, com reagente de Grignard, gerando ligações Si-C, ou com aminas gerando as ligações Si-N (Figura 15b). Apesar de serem ligações mais estáveis, comparadas com a ligação 126

Suportes cromatográficos e fases estacionárias para HPLC

pH restrita (4 a 8) e as fases obtidas por Grignard apresentam interferentes provenientes da rota sintética. A metodologia mais empregada atualmente no preparo de FEQL é a da reação de do tipo cloro (Cl) ou alcoxissilano, podendo ser mono, di ou trifuncional (Figuras 15c e 15d)[7].

Adicionalmente, tem-se também a sílica tipo C, na qual um grupamento alquílico pode ser ligado quimicamente na superfície do suporte cromatográfico, através da reação dos grupamentos hidretos (Si-H), com grupamentos alquílicos terminalmente insaturados, em presença de um catalisador (Figura 15e).

Quando um reagente funcionalizante silano monofuncional [clorodimetiloctadecilssilano (ODS) por exemplo] reage com o grupo silanol na superfície da sílica, ocorre a formação da fase estacionária C18 monomérica (Figura 16). Fases obtidas por esse procedimento são reprodutíveis e apresentam boa eficiência cromatográfica devido à rápida difusão do analito na camada da fase monomérica.

Entretanto, as fases monoméricas apresentam grande quantidade de silanol residual após o processo de funcionalização. Esses grupos silanois podem promover interações secundárias com os analitos e provocar alargamento do pico cromatográfico. Além disso, o uso dessa fase em pH baixo leva a hidrólise do grupo funcionalizador e, consequentemente, a perda de seletividade da coluna cromatográfica. Uma maneira de minimizar esses efeitos é promover uma segunda etapa de funcionalização com um reagente silano de volume menor [trimetilclorossilano (TMS)]. Esse procedimento, denominado capeamento (endcapping), diminui 20% a 30 % dos silanois residuais nas partículas de sílica.

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Suportes cromatográficos e fases estacionárias para HPLC

Assim, é importante ressaltar que a interação silanol-analito é minimizada e não completamente eliminada[1].

Outra estratégia para bloquear os grupos silanois da sílica é utilizar reagentes funcionalizantes com proteção estérica. Esses precursores são uma variação das fases monoméricas, pois os grupos metila ligados ao átomo de silício são substituídos por grupos volumosos (i-propil ou i-butil). Esses grupamentos dificultam o processo de hidrólise das fases estacionárias e, por-

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tanto, são mais apropriados para análise em pH baixo. Entretanto, as fases com proteção estérica possuem menor concentração dos ligantes na superfície do suporte cromatográfico e, consequentemente, apresentam menor retenção quando comparadas com fases estacionárias monoméricas contendo o grupamento dimetil.

Fases estacionárias bidentadas apresentam maior estabilidade em meio básico e, portanto, são utilizadas em aplicações nas quais é necessário pH acima de 8.

Figura 15 Obtenção de fase estacionária quimicamente ligada: (a) reação de esterificação; (b) reação com SOCl2; (c) reação de organossilanização com reagente monofuncional; (d) reação de organossilanização com reagente difuncional; e (e) reação do hidreto com grupo alquílico.

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Suportes cromatográficos e fases estacionárias para HPLC

Figura 16 Estratégias para modificação da superfície da sílica.

Se um reagente silano bi ou trifuncional é empregado, dependendo das condições utilizadas, podem-se obter fases estacionárias com polimerização vertical ou horizontal. Essas fases tendem a ser mais estáveis do que as fases monoméricas em pH baixo e alto. Entretanto, esses materiais possuem menor reprodutibilidade de retenção e seletividade, devido à dificuldade de controlar o processo de polimerização do organossilano. Adicionalmente, as colunas contendo as fases poliméricas possuem uma menor eficiência na separação, principalmente quando vazão elevada é empregada[1].

128

Atualmente, diversas fases estacionárias foram preparadas para HPLC (Figura 17) atuando no modo normal (diol, ciano, amino, SiO2), reverso (C30, C18, C8, C4, fenil, cicloexil, fluoradas, grupos polares embutidos) e iônico (SAX, SCX, WAX, WCX). Adicionalmente pode-se destacar a possibilidade de sintetizar fases suportadas na superfície da sílica com seletividade diferenciada. Como exemplo prático, pode-se citar o preparo de fases estacionárias contendo líquidos iônicos (ILs). Uma das principais vantagens da superfície imobilizada com fases estacionárias contendo IL é a possibilidade de alterar os cátions, ânions e a cadeia alquílica do líquido iônico. Essa vantagem fornece a capaciScientia Chromatographica 2013; 5(2):111-135

Suportes cromatográficos e fases estacionárias para HPLC

Figura 17

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Representação de fases estacionárias utilizadas em HPLC.

dade de manipular a estrutura de IL na sílica e, consequentemente, as propriedades da fase estacionária[10]. Outro exemplo é a síntese de fases zwiteriônicas, as quais possuem grupos com carga positiva e negativa que permitem mudar a seletividade da separação cromatográfica. Além disso, fases estacionárias seletivas, tais como quirais, bioafinidade, MIP, meio de acesso restrito (RAM), ampliam a aplicabilidade da HPLC e têm recebido grande atenção da comunidade científica[2,3].

4 Perspectivas futuras no desenvolvimento de suportes cromatográficos Desde o surgimento da técnica de separação denominada HPLC, os suportes cromatográficos utilizados no preparo de fases estacionárias vêm evoluindo. Na década de 1950, as partículas para LC eram baseados em materiais poroScientia Chromatographica 2013; 5(2):111-135

sos (100 μm-200 μm de diâmetro) e com formato irregular. Já na década de 1960 surgiram as partículas de sílica peliculares (30 μm-50 μm).

A transição de partículas peliculares para partículas porosas com diâmetro menor iniciou-se na década de 1970. Nesse período foram sintetizadas micropartículas de sílica irregular e porosa com diâmetro médio de 10 μm. Com o passar do tempo e o melhor entendimento/ aperfeiçoamento dos métodos de síntese, partículas esféricas porosas foram desenvolvidas com sucesso. Posteriormente surgiram as partículas esféricas porosas de 5 μm (decênio 1980), 3,5 μm e 3,0 μm (decênio 1990) e sub-2,0 μm (decênio 2000). Nesse período (anos 1990), partículas não porosas de 1,5 μm também estavam disponíveis comercialmente; na década seguinte surgiram as partículas superficialmente porosas (sub2,0 μm) e as colunas monolíticas. Atualmente, uma grande variedade de suportes cromatográficos está disponível comercialmente para HPLC. 129

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Suportes cromatográficos e fases estacionárias para HPLC

Tabela 1 Diminuição do tamanho das partículas em LC e sua influência na eficiência da coluna (N).

Ano

Tamanho da partícula

Morfologia

N/15 cm

Anos 1950

100 µm-200 µm

Irregular porosa

200

1967

50 µm

Pelicular esférica

1.000

Anos 1970

10 µm

1985

5 µm

Esférica porosa

12.000

1992

3 µm e 3,5 µm

Esférica porosa

22.000

1996

1,5 µm

Esférica não porosa

30.000

2000

-

Monolítica

15.000

2000

2,5 µm

Esférica porosa

25.000

Irregular porosa Esférica porosa

2004

1,7 µm

Esférica porosa

35.000

2007

1,6 e 2,6 µm

Superficialmente porosa

30.000

2012

-

Monolítica de segunda geração

22.500

Cada material possui suas vantagens e desvantagens, consequentemente, o conhecimento de cada suporte cromatográfico é fundamental para o sucesso da separação na aplicação escolhida.

De forma resumida, a Tabela 1 apresenta a evolução dos suportes cromatográficos, a redução no tamanho das partículas e o aumento na eficiência das colunas.

A tendência tecnológica na área de separação é a diminuição do tamanho da partícula e também do diâmetro interno das colunas cromatográficas (capilar e nano-LC)[74-79]. Se o foco do trabalho for análise rápida, colunas menores que 100 mm de comprimento podem ser utilizadas com essas partículas, sem gerar pressões exageradamente elevadas para os padrões atuais. Por outro lado, se o objetivo da análise é aumentar a eficiência e resolução de um método, colunas com tamanho tradicional (L = 150 mm-300 mm) empacotadas com as partículas pequenas têm demonstrado ser uma boa opção, apesar da limitação instrumental, devido à pressão elevada.

Nesse contexto, diversos trabalhos na literatura têm demonstrado resultados interessantes. Jorgenson et al.[80,81] realizaram uma sepa130

6.000

ração empregando uma coluna com dimensões 430 mm × 30 μm × 1,0 μm e C18 não poroso. A pressão do sistema foi de 7.000 bar (103.000 psi) e o tempo de análise foi inferior a quatro minutos, com um número de pratos de aproximadamente 300.000, considerado elevado para HPLC, de acordo com os padrões atuais. Lee et al.[82] utilizaram uma coluna capilar contendo partículas C18 não porosas (150 mm × 50 μm × 1,0 μm), temperatura de 80 °C e pressão de 2.413 bar e obtiveram tempo de análise de 36 segundos. Mellors e Jorgenson[83] realizaram a comparação de colunas, uma contendo partículas de sílica não porosa de 1 μm com uma contendo partículas de sílica híbrida porosa de 1,5 μm. Foi observado que ambas as colunas apresentaram resultados similares para eficiência da coluna e resistência mecânica em pressão de 4500 bar.

Cintron e Colon[84] realizaram a síntese de partículas não porosas de sílica, com diâmetro médio de 0,67 μm, e, após a funcionalização com C18, prepararam uma coluna de 90 mm × 50 μm, contendo as partículas sub-1 μm. Empregando um sistema de cromatografia líquida de ultra eficiência (UHPLC) capaz de trabalhar em 3.500 bar Scientia Chromatographica 2013; 5(2):111-135

Suportes cromatográficos e fases estacionárias para HPLC

(50.000 psi), foi possível promover a separação cromatográfica em 3,2 minutos, com uma eficiência de 500.000 pratos por metro. Apesar da alta pressão utilizada, a velocidade linear empregada na análise (1,3 mm s–1) foi inferior à velocidade linear ótima para a coluna (3,0 mm s–1).

A principal limitação para o uso de colunas capilares e nano com partículas altamente eficientes está relacionada com a não disponibilidade de equipamentos comerciais adequados para trabalhar nessas condições. Atualmente, os sistemas suportam pressões máximas ao redor de 1.000 a 1.350 bar. Uma vez superada essa problemática, as possibilidades de uma marcante evo-

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Futuramente, a evolução dos sistemas miniaturizados (capilar e nano-LC) permitirá seu uso rotineiro nos laboratórios com partículas pequenas (sub-2 μm), gerando uma eficiência cromatográfica elevada, com um tempo de análise curto, sem a limitação de pressão existente atualmente (1.350 bar). Por fim, deve-se considerar que a próxima etapa de evolução das colunas de HPLC seja a consolidação de colunas tubulares abertas em LC (OT-LC), similarmente ao grande sucesso que alcançaram em GC. Dessa forma, a cromatografia caminha para a vertente de junção dos modos de separação (cromatografia líquida, fluido supercrítico e a gás) no desenvolvimento da cromatografia unificada[85,86].

lução nas diversas áreas de aplicação (ambiental, biológica, farmacêutica, proteômica, metabolômica, genômica) poderão, finalmente, serem

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Recebido: 04/10/2013 Aceito: 07/11/2013

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Scientia Chromatographica 2013; 5(2):137-145 Instituto Internacional de Cromatografia DOI: http://dx.doi.org/10.4322/sc.2013.010

HPLC

ISSN 1984-4433

Desenvolvimento e validação de método para extração e quantificação através de HPLC com índice de refração para lactose em leite pasteurizado Vinicius Ricardo Acquaro Jr., Tiago Bervelieri Madeira, Drielle Caroline Castilho, Lycio Shinji Watanabe, Yuri Renan Bovolenta, Suzana Lucy Nixdorf* Laboratório DIA, Departamento de Química, Centro de Ciências Exatas, Universidade Estadual de Londrina – UEL, Jardim Portal de Versalhes 1, Campus Universitário, CP 10011, Cep 86057970, Londrina, PR, Brasil e-mail: snixdorf@uel.br

Resumo Um método simples, preciso, exato, linear em ampla faixa de trabalho e baseado em princípios da Química Verde foi desenvolvido e validado para a extração e determinação da lactose utilizando cromatografia líquida com detecção por índice de refração. A lactose, no teor mínimo definido pelo MAPA (Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento), foi o marcador de qualidade escolhido, por definir o preço do leite e auxiliar na detecção de fraudes. O leite como uma matriz de composição complexa, rica em proteínas, lipídios, carboidratos, sais minerais e vitaminas, exige um pré-tratamento adequado da amostra. Este trabalho visou desenvolver e validar uma metodologia que estabelecesse os parâmetros e condições analíticas, objetivando maximizar a porcentagem de lactose extraída do leite.

Para isso, um planejamento estatístico do tipo composto central foi aplicado, considerando o tempo de centrifugação, a intensidade de rotação e a proporção de diluição entre solvente/amostra como variáveis independentes. Os tratamentos estatísticos permitiram determinar a condição de extração otimizada, com taxa de recuperação média de 105%, onde a proporção de etanol: leite foi de (4: 1, v/v), com rotação de 10.000 rpm por 37 minutos. O método proposto apresenta resolução cromatográfica adequada entre a lactulose e a lactose, emprega somente água como fase móvel e etanol no preparo da amostra, em substituição a reagentes dispendiosos e solventes tóxicos. Seu uso representa uma alternativa viável e diferenciada para a determinação do teor de lactose no leite pasteurizado comercial.

Palavras-chave Carboidrato; etanol; lactose; planejamento experimental; adulteração.

Development and validation of method for extraction and quantification by HPLC with refractive index to lactose in pasteurized milk Abstract A simple, precise and accurate method was developed and validated to extract and determine lactose over a wide linear working range using liquid chromatography with refractive index detection based on the principles of green chemistry. With its minimum level established by the MAPA (Ministry of Agriculture,

Acquaro Jr VR et al.

Desenvolvimento e validação de método para extração e quantificação através de HPLC

Livestock and Food Supply of Brazil), lactose has been chosen as a quality marker to set milk prices and facilitate fraud detection. Since milk is a complex matrix rich in proteins, lipids, carbohydrates, mineral salts and vitamins, it requires proper sample pretreatment. The present work was aimed at developing and validating a methodology for establishing parameters and analytical conditions in order to increase lactose percentage extracted from milk. For this purpose, a central composite statistical design with three independent parameters (centrifugation time, rotation intensity and solvent/sample dilution ratio) was employed. The statistical treatments allowed finding optimum extraction conditions - average recovery rate 105 %, ethanol: milk ratio 4:1 (v/v), and rotation 10,000 rpm for 37 min. The proposed method with appropriate chromatographic resolution between lactulose and lactose, using water as the mobile phase, and only ethanol for sample pretreatment, instead of expensive reagents and toxic solvents, is a distinct and feasible alternative to determine lactose contents of pasteurized milk.

Keywords Carbohydrates; ethanol; lactose; experimental design; adulteration.

1 Introdução O Brasil é um dos maiores produtores mundiais de leite, detendo a quarta posição, atrás dos Estados Unidos, Índia e China. O leite, dentre as commodities agropecuárias, vem depois da soja, cana-de-açúcar e milho. A sua produção em 2011 alcançou 32,1 bilhões de litros, frente aos 27,6 bilhões ofertados em 2008, representando uma taxa de crescimento anual de 5,3%.

Essa produtividade tem impulsionado a elevação do consumo, que está em 173 litros de leite per capita por ano[1].

O leite é considerado o mais nobre dos alimentos, como uma importante fonte nutritiva para o ser humano, devido a sua composição rica em proteínas, gorduras, carboidratos, sais minerais e vitaminas[2,3]. Essa composição pode variar em função da fisiologia, raça, estado de saúde e alimentação dos animais[3-5]. Todavia, nos últimos anos têm-se verificado alterações por constantes adulterações, com adição de água ou neutralizantes ou substâncias que ameaçam a segurança alimentar como: melaminas, ureia, nitrato de amônia, urina e peróxido de hidrogênio[4,6].

138

O Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento (MAPA), visando dar um norte ao setor quanto à qualidade, determina valores mínimos em termos de variação dos componentes do leite. Para a gordura e a lactose são exigidos teores mínimos de 3,0% e 4,3%, respectivamente. Para o extrato seco total é requerido um mínimo de 11,5%, enquanto para o extrato seco desengordurado o teor mínimo é de 8,5%, com quantidade mínima de proteína de 3,0%4.

Nesse sentido, determinar o teor de lactose, o carboidrato mais abundante no leite, é importante, uma vez que esse açúcar contribui para as propriedades funcionais e sensoriais do produto; agrega valor econômico, já que o preço do leite baseia-se no teor de sólidos; e é um dos parâmetros de qualidade, que pode auxiliar na detecção das fraudes. Portanto, é fundamental para a saúde pública que estudos relacionados a métodos capazes de comprovar a autenticidade do leite e de detectar adulterações pela incorporação de substâncias desconhecidas sejam desenvolvidos[7].

O método oficial para a determinação de lactose em leite, o 984.15 da AOAC (The Association of Analytical Communities) é Scientia Chromatographica 2013; 5(2):137-145

Desenvolvimento e validação de método para extração e quantificação através de HPLC

complexo e demorado, requerendo o preparo semanal de dois dos sete reagentes utilizados.

Envolve a hidrólise enzimática da lactose em glicose e galactose em pH 6,6 pela β-galactosidase, com subsequente oxidação da β-galactose, liberando o ácido galacturónico em pH 8,6, e redução do dinucleótido de nicotinamida-adenina (NAD+), catalisado pela β-galactose desidrogenase. A concentração da lactose é calculada pela quantidade formada do NAD reduzido medida

Acquaro Jr VR et al.

ção, relativamente de baixo custo, e apresentar baixa toxicidade, preceitos fundamentais da Química Verde[8,10].

O objetivo do presente estudo foi maximizar a extração da lactose, seguindo os preceitos da química limpa e planejamento fatorial, utilizando o etanol como solvente no preparo das amostras e empregando a água como fase móvel na cromatografia líquida de alta eficiência a fim de determinar seu teor no leite pasteurizado.

a 340 nm[8].

Um método mais simples, rápido e preciso

2 Materiais e métodos

empregando HPLC é descrito na literatura[8], porém utiliza o detector específico Corona charged aerosol detector (CAD Thermo Scientific Dionex, EUA), o detector eletroquímico com amperometria pulsada[9] e de espalhamento de luz evaporativo[10], equipamento nem sempre disponível nos laboratórios de controle de qualidade. Outra possibilidade apontada está em quantificar a lactose por cromatografia líquida de alta eficiência com índice de refração (HPLCRID)[11].

2.1 Materiais Para as análises, utilizaram-se: um padrão de lactose obtido da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA); etanol grau p.a. (Synth, Brasil); e água ultrapura obtida através de um sistema Milli-Q® (Millipore, Billerica, MA, EUA). As amostras foram de leite pasteurizado, fornecidas pelo centro mesorregional de excelência em tecnologia do leite do Norte Central da Universidade Estadual de Londrina, Paraná, Brasil.

Entretanto, a complexidade da matriz do leite exige que se realize um clean-up na fase

2.2 Equipamentos

do preparo da amostra, visando evitar danos à

Na centrifugação, empregou-se uma ultracentrífuga (Hitachi, Tóquio, Japão) CP 70MX com rotor P70AT, de velocidade máxima de 70.000 rpm, pertencente ao Laboratório Multiusuário LAPA da UEL.

coluna cromatográfica. Diferentemente da literatura, ao invés de se utilizar de 70% a 75% de acetonitrila na fase móvel[11,12], neste estudo utiliza-se somente água na fase móvel. Outra diferença é que se realiza a desproteinização etanólica em substituição à precipitação, utilizando-se ácido acético, acetato de zinco e ferrocianeto de potássio, acetato de chumbo, oxalato de sódio e hidrogeno fosfato de sódio[11], ou ela é feita com o reativo de Carrez[12]. O etanol foi selecionado como pré-tratamento organossolvente por: desnaturar as proteínas alterando o grau de hidratação no soro do leite, ser um reagente de fácil obtenScientia Chromatographica 2013; 5(2):137-145

A determinação da lactose foi feita no sistema cromatográfico a líquido de alta eficiência (Shimadzu, Quioto, Japão) composto por bomba LC-10A, com sistema gerenciador de gradiente e desgaseificador, e detector por índice de refração RID-10A, gerenciados pelo software Class-VP. Utilizou-se uma válvula injetora Rheodyne 7125 com alça de amostragem de 20,0 μL e uma coluna de troca catiônica de Pb (II) – Aminex HPX-87P 139

Acquaro Jr VR et al.

Desenvolvimento e validação de método para extração e quantificação através de HPLC

(300 mm × 7,8 mm, 9,0 μm, Biorad, EUA), mantida a 80 °C. A vazão da água, empregada como fase móvel, foi de 0,8 mL min–1.

2.3 Planejamento estatístico Avaliou-se o efeito do tempo de centrifugação, da intensidade da rotação da centrífuga e da proporção de diluição (solvente: amostra, v/v), seguindo um planejamento estatístico composto central, com três variáveis independentes e cinco níveis de variação, conforme Tabela 1. Foram realizados 16 experimentos: oito nos pontos fatoriais (–1, +1); seis nos pontos axiais (–1,68, +1,68); e dois no ponto central (0, 0), inteiramente aleatorizados.

2.4 Extração Para a extração partiu-se de cinco mililitros de leite pasteurizado, adicionando-se o solvente (etanol) em diferentes proporções de diluição (Tabela 1), e agitando-se manualmente por cerca de um minuto. O tubo foi levado à ultracentrífuga (CP 70MX) e submetido a diferentes tempos e rotações (Tabela 1). O sobrenadante foi passado por papel filtro qualitativo e por cartucho SepPak® Vac 3cc (500 mg) C18 (Waters®). Após a filtração, a amostra foi levada à evaporação completa no speed vacuum (Thermo Jouan RC10-22).

Em seguida, foi ressuspendida em 10 mililitros de água ultrapura e analisada por cromatografia líquida de alta eficiência com detector de índice de refração (HPLC-RID).

2.5 Validação A metodologia foi validada avaliando-se a seletividade, precisão (repetitividade e intermediária), linearidade, faixa dinâmica de trabalho, limite de detecção e de quantificação e a exatidão pelas taxas de recuperação.

3 Resultados e discussão A validação da metodologia foi realizada de acordo com parâmetros e critérios de procedimentos da International Conference on Harmonization[13].

3.1 Seletividade A seletividade foi comprovada pelo tempo de retenção da lactose idêntico para o padrão externo e para as amostras e pelo aumento proporcional das áreas dos picos, quando efetuadas as adições de padrão. A ausência de resposta analítica, quando injetada água ultrapura no tempo de retenção da lactose, comprova que não houve interferentes[13].

3.2 Precisão (repetitividade) A precisão foi determinada pela repetitividade de 10 injeções sucessivas do padrão analítico[14] de 65,0 g L–1 de lactose, obtendo-se um desvio padrão de ± 0,03 e desvio padrão relativo (DPR) de 0,80%, já para o tempo de retenção o desvio padrão foi de ± 0,04 e o DPR, de 0,51%.

Tabela 1 Variáveis independentes e níveis de variação do planejamento fatorial composto central.

Variáveis independentes

–1,68

–1

0

+1

+1,68

X1 = Tempo de rotação (min)

3,12

10

20

30

36,80

X2 = Rotação (rpm)

3.200

5.000

7.500

10.000

11.700

0,32: 1

1: 1

2: 1

3: 1

3,68: 1

X3 = Proporção da diluição (mL)

140

Níveis de variação

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3.3 Linearidade e faixa dinâmica de trabalho As três curvas analíticas foram levantadas injetando-se aleatoriamente em três dias distintos a triplicata das concentrações dos padrões de lactose a 10,0; 20,0; 30,0; 40,0; 50,0 e 65,0 g L–1, escolhidas de forma a cobrir uma faixa de 50% a 150% do valor que se espera encontrar na amostra de estudo[15]. Essas curvas foram utilizadas para verificação da: linearidade; faixa dinâmica de trabalho; limites de detecção e quantificação; e precisão intermediária. O coeficiente de correlação (r) estabelecido para os seis pontos da triplicata das três curvas foi de 1,000, considerando-se essa a faixa dinâmica de trabalho, que foi de 10,0-65,0 g L–1 (Figura 1a).

3.4 Limite de detecção e de quantificação

Acquaro Jr VR et al.

empregando-se a água como o branco[13]. Para o método proposto, o LD para a lactose foi de 0,05 g L–1 e o LQ, de 0,15 g L–1.

3.5 Precisão intermediária A precisão intermediária do método proposto para a lactose foi considerada adequada, uma vez que não houve desvios nas áreas dos padrões utilizados, o que pode ser observado pela Figura 1a para as três curvas de calibração feitas em três dias distintos e pelo gráfico dos resíduos (Figura 1b), que não apresenta tendências pela distribuição equitativa com baixa dispersão. Já a precisão intermediária calculada a partir dos desvios padrão relativos de uma amostra extraída e analisada em triplicata, em três dias diferentes, por três analistas distintos foi de 9,5%.

Portanto, o método foi considerado preciso, uma vez que os coeficientes de variação foram inferiores a 15%, valor adotado como referência de acordo com a resolução da ANVISA[16].

O limite de detecção (LD) foi definido como a concentração do analito que produziu um sinal

3.6 Taxas de recuperação

igual a 3s e o limite de quantificação (LQ), a con-

O método de extração e determinação proposto demostrou-se exato, uma vez que as taxas de recuperação para a adição de padrão em con-

centração do analito que produziu um sinal igual a 10s, onde s é o desvio padrão do ruído medido

Figura 1 Curva de calibração para os padrões de lactose de 10,0 g L–1 a 65,0 g L–1 (N = 3) em três dias distintos (a); gráfico de resíduos (b).

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Acquaro Jr VR et al.

Desenvolvimento e validação de método para extração e quantificação através de HPLC

centrações baixa (1,0 g L–1), média (4,3 g L–1) e alta (6,5 g L–1) foram de 104,1%, 104,6% e 106,3%, respectivamente. Esses valores estão dentro do intervalo de 70% a 120%, aceito pela ANVISA[16], com desvios padrão médios de 1,1%, 1,0% e 0,35%, nas triplicatas, respectivamente.

3.7 Planejamento fatorial Pela análise de variância (ANOVA), o único efeito significativo em nível de 5% (p < 0,05) foi de X3 (Tabela 2), confirmado pelas superfícies de resposta para as três variáveis (Figura 2), que demostram o efeito linear significativo sem curvatura somente para a proporção da diluição (Figura 2b).

As variáveis independentes foram analisadas visando-se obter uma equação capaz de predizer a resposta dentro de um dado intervalo.

Assim, somente as variáveis de maior influência foram conservadas no modelo de regressão para a extração de lactose (Y), dado pela Equação 1: Y = −2,759 + 0,0739 X1 − 0,133 X22 + 0,4618 X3 + 0,1165 X1 X2

(1)

Os valores experimentais de lactose em função dos calculados pelo modelo preditivo (Equação 1) apresentaram um bom ajuste[17], com coeficiente de determinação (R2) de 0,8304, explicando 83,04% da variância dos dados (Figura 3).

A análise da desejabilidade indicou os pontos ótimos de extração como sendo: tempo (+1,68), rotação (+1) e diluição (+1,68). O valor teórico predito pela Equação 1 foi de 3,72% (m/m) de lactose na amostra do leite pasteurizado, enquanto o valor experimental foi de 3,74% (m/m).

Tabela 2 Análise de variância dos parâmetros de regressão (ANOVA).

SS

df

MS

F

p

Tempo (L)

0,07467

1

0,0746

1,2126

0,294332

Rotação (Q)

0,21937

1

0,2193

3,5624

0,085753

Diluição (L)

2,91300

1

2,9130

47,305

0,000027

Tempo X Rotação

0,10850

1

0,1085

1,7621

0,211260

Erro

0,67737

11

0,0615

Total SS

3,99292

15

Fatores

*(L): Efeito linear; (Q): Efeito quadrático; SS: Soma dos quadrados; df: Graus de liberdade; MS: Quadrado da média; F: Valor calculado; p: Nível de significância.

Figura 2 Superfícies de resposta para os efeitos de rotação X tempo (a), diluição X tempo (b) e diluição X rotação (c).

142

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Desenvolvimento e validação de método para extração e quantificação através de HPLC

Considerando-se o efeito linear significativo para a diluição (Figura 2b) com ausência de máximo, novos testes em relação ao efeito de quantidade de solvente foram realizados com diferentes diluições (4: 1, 4,5: 1 e 5: 1 de etanol: leite, v/v), fixando-se a rotação e o tempo nas condições ótimas da análise de desejabilidade.

Os valores de lactose encontrados foram de 4,12% (m/m), 4,02% (m/m) e 3,71% (m/m), respectivamente. Nota-se um abaixamento na porcentagem de lactose, atribuída à saturação, já que a solubilidade da lactose em etanol 80% a 25 °C é de 0,054 g/100 g de solvente[18].

A lactose apresenta alta estabilidade no leite, não sofrendo degradação em condições normais (pH 6,6-6,8) ou em consequência da mastite, quando a inflamação das glândulas mamárias

Acquaro Jr VR et al.

do animal o torna mais alcalino (pH 7,3-7,5)[19].

A presença de microrganismos e a utilização de elevadas temperaturas no processo[10] também não são capazes de converter a lactose em seus monossacarídeos – galactose e glicose, hidrólise essa que ocorre somente no trato intestinal[20,21], pela ação da enzima lactase[10]. Por outro lado, durante severos tratamentos térmicos ocorre a produção de um epímero – a lactulose (4-O-β-dgalactopiranosil-d-frutose)[22], formada a partir da lactose (4-O-β-d-galactopiranosil-d-glicose) pelo rearranjo de Lobry de Bruyn-Alberda van Ekenstein[12], ou pela isomerização alcalina[5,21].

Portanto, elevados teores de lactulose indicam uso excessivo de temperatura no processo[12].

Em leite pasteurizado, a concentração de lactulose é de cerca de 0,3 g L–1[5,10,23], observada no cromatograma da amostra, no tempo de retenção de 6,9 minutos, em baixa concentração em relação à lactose (Figura 4b). Já a ausência de degradação da lactose como exposto, embora com coeluição para a lactose e galactose, pode ser comprovada pelo pico da glicose que aparece no cromatograma da mistura de padrões injetada (Figura 4c), enquanto não é detectado na amostra (Figura 4b). Portanto, o aparecimento

Figura 3 Correlação dos valores experimentais com os previstos pelo modelo.

de picos adicionais indica forte indício de fraude, que se recomenda seja investigada.

Figura 4 Cromatograma do padrão de lactose 5,0% (m/v) (a); leite pasteurizado integral comercial com extração realizada utilizando leite: etanol (4: 1, v/v), em 10.000 rpm, por 37 minutos (b); padrão de lactose 1,5%, galactose 0,25% e glicose 0,25% (m/v) (c); pico (1) lactulose, (2) lactose, (3) lactose e galactose, (4) glicose.

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Desenvolvimento e validação de método para extração e quantificação através de HPLC

4 Conclusões O planejamento fatorial composto central propiciou encontrar as condições otimizadas de máxima extração da lactose para o leite pasteurizado, empregando o etanol como diluente de pré-tratamento, permitindo sua quantificação utilizando água como fase móvel no sistema cromatográfico.

O método desenvolvido e validado para determinação da lactose empregando cromatografia líquida com índice de refração mostrou-se adequado por ser preciso, linear em uma ampla faixa dinâmica, seletivo, específico e exato, com recuperação dentro dos limites aceitáveis.

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Agradecimentos Aos órgãos financiadores: CAPES, CNPq, Fundação Araucária e FINEP. Ao professor dr.

Fábio Yamashita pelo auxílio com o planejamento experimental. Ao Laboratório Multiusuário LAPA da UEL, pelo uso da ultracentrífuga e sistema cromatográfico.

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Recebido: 16/10/2013 Aceito: 12/11/2013

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PREPARO DE AMOSTRAS

Instituto Internacional de Cromatografia DOI: http://dx.doi.org/10.4322/sc.2013.011 ISSN 1984-4433

Técnicas de preparo de amostra empregadas na determinação de agrotóxicos carbamatos em água e solo Elisa Helena da Costa Morais, Fernanda Ribeiro Begnini, Isabel Cristina Sales Fontes Jardim* Instituto de Química, Universidade Estadual de Campinas – UNICAMP, CP 6154, Cep 13083-970, Campinas, SP, Brasil e-mail: icsfj@iqm.unicamp.br

Resumo Atualmente, dentre os diferentes tipos de agrotóxico aplicados na agricultura, os carbamatos têm se destacado em virtude de sua elevada eficiência, facilidade de síntese e baixo custo. No entanto, o uso desregrado desses agrotóxicos, não seguindo as Boas Práticas Agrícolas (BPA), tem levado à contaminação do meio ambiente, destacando-se o acúmulo desses compostos nas águas superficiais (rios e lagos), subterrâneas e no solo. Além disso, muitos desses agrotóxicos são tóxicos para os seres vivos, principalmente por inibirem a ação de enzimas biológicas, como as colinesterases. Nesse contexto, o monitoramento de resíduos de agrotóxicos no solo e nas águas tornou-se imprescindível para a redução do impacto ambiental e aumento da segurança da saúde humana e animal, sendo realizado através da confirmação e quantificação desses resíduos, empregando-se diferentes técnicas analíticas. As técnicas de preparo de amostra mais empregadas e modernas para determinação analítica de resíduos de agrotóxicos carbamatos serão abordadas neste artigo.

Palavras-chave Preparo de amostra; carbamatos; água; solo.

Sample preparation techniques for determination of carbamate pesticides in water and soil Abstract Currently, among the several kinds of pesticides employed in agriculture, carbamates have been widely used because of their high efficiency, ease of synthesis and low cost. However, the unjudicious use of these pesticides, not following Good Agricultural Practices, can have adverse effects on the environment, especially the accumulation of these compounds in surface waters (rivers and lakes), groundwater and soil. Furthermore, many of these pesticides are toxic to humans and animals, mainly due to their inhibition of enzymes, like cholinesterases. In this context, the monitoring of pesticide residues in soils and waters has become essential to reduce the environmental impact and improve the safety of human and animal health, being performed through the confirmation and quantification of these residues, employing different analytical techniques. The most frequently used techniques and modern sample preparation for analytical determination of carbamate pesticide residues will be discussed in this paper.

Keywords Sample preparation; carbamates; water; soil.

Técnicas empregadas na determinação de agrotóxicos carbamatos em água e solo

1 Introdução Define-se agrotóxicos como produtos de processos químicos ou biológicos, naturais ou sintéticos, destinados ao uso nos setores de produção; no armazenamento e beneficiamento de produtos agrícolas; nas pastagens; e na proteção de florestas e de ambientes urbanos, hídricos e industriais, que possuem a finalidade de alterar a composição da flora ou fauna, a fim de preservá-las da ação danosa de seres vivos nocivos, de acordo com a Lei Federal Nº 7802, de 11 de julho de 1989, regulamentada pelo Decreto Nº 98816[1].

A aplicação de agrotóxicos em diversas culturas é inevitável, pois acarreta diminuição significativa de perdas na produção e melhora na qualidade dos produtos, devido ao controle de doenças, pragas e ervas daninhas. De acordo com pesquisas realizadas pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) e pelo Sindicato Nacional da Indústria de Produtos para Defesa Agrícola (SINDAG), o Brasil é o maior consumidor de agrotóxicos do mundo, sendo que em 2009 gerou uma receita de US$ 7 bilhões para essa indústria, utilizando 700 mil toneladas desses compostos, e que, em 2011, a venda de agrotóxicos foi recorde, aumentando 10% em relação às vendas em 2010[2].

No entanto, se por um lado a utilização de agrotóxicos em larga escala é benéfica ao desenvolvimento da agricultura, por outro o uso indiscriminado, irregular e pouco criterioso de agrotóxicos, não seguindo as Boas Práticas Agrícolas, geralmente provoca a contaminação dos alimentos, devido à alta concentração dos agrotóxicos, afetando a saúde humana e animal[3]. Além disso, a aplicação de agrotóxicos na agricultura é uma das principais causas da contaminação ambiental, especialmente o solo e as águas superficiais e subterrâneas. Essas contaminações ocorrem Scientia Chromatographica 2013; 5(2):146-162

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especialmente pela ação das águas de irrigação ou da chuva, que provocam lixiviação, drenagem ou escoamento desses compostos presentes nas plantações e no solo[4]. De acordo com Alves Filho[4], não mais que 10% dos agrotóxicos aplicados às culturas por pulverização aérea ou terrestre atingem o organismo alvo, sendo sua maior parte lixiviada para o meio ambiente, contaminando-o e interferindo nos processos básicos do ecossistema, como a respiração do solo, a ciclagem de nutrientes e o ciclo da água.

Vários agrotóxicos, pertencentes a diferentes grupos químicos, são aplicados nas diversas culturas. Atualmente, os agrotóxicos do grupo químico dos carbamatos são mundialmente utilizados na agricultura, em virtude de seu baixo custo, de serem altamente eficientes no combate aos insetos, fungos e ervas daninhas e de possuírem menor potencial de bioacumulação, comparados aos organoclorados e organofosforados, apesar de serem altamente tóxicos para o meio ambiente e seres vivos, principalmente por inibirem a ação de enzimas biológicas, como as colinestereases[5-7].

Embora os carbamatos e outros agrotóxicos sintéticos tenham sido introduzidos no mercado mundial na década de 40[4], somente em anos mais recentes o conhecimento científico e as novas tecnologias da área laboratorial permitiram a avaliação do impacto desses compostos no meio ambiente, como a influência nos processos básicos do ecossistema e na saúde humana e dos animais. O monitoramento dos resíduos de agrotóxicos no solo e nas águas tem se tornado imprescindível para a redução do impacto ambiental, podendo ser realizado através da identificação e quantificação desses resíduos empregando-se diferentes técnicas e métodos analíticos. Com o objetivo de controlar a segurança do consumidor e do meio ambiente, órgãos nacionais e internacionais estabeleceram 147

Morais EHC, Begnini FR, Jardim ICSF

Técnicas empregadas na determinação de agrotóxicos carbamatos em água e solo

o limite máximo de resíduo (LMR) correspondente à quantidade máxima de resíduo de agrotóxico ou afim oficialmente aceita[8] em matrizes como alimento e água, em decorrência da aplicação adequada, expressa em partes do agrotóxico, afim ou seus resíduos, por milhão de partes da matriz, que, consequentemente, torna-se um indicador da qualidade da produção agrícola e do meio ambiente.

No Brasil, a portaria n. 2.914 do Ministério da Saúde, de 12 de dezembro de 2011[9], estabelece procedimentos para o controle da qualidade da água que garanta um padrão de potabilidade como, por exemplo, ações para a redução da quantidade de poluentes no meio ambiente e limites máximos de resíduos para substâncias químicas que representam risco à saúde, como os agrotóxicos, estabelecendo limites na faixa de 0,03 μg L–1 a 500 μg L–1 para esses compostos. A Comunidade Européia não restringe quais tipos de agrotóxicos são permitidos em água potável e subterrânea, mas estipula o LMR de 0,1 μg L–1 para qualquer agrotóxico e de 0,5 μg L–1 para o total de agrotóxicos[10,11].

A determinação de resíduos de agrotóxicos em amostras ambientais é difícil de ser realizada, já que esses, na maioria das vezes, pertencem a diferentes grupos químicos e encontram-se em concentrações menores que os compostos interferentes[12,13]. Portanto, para análise satisfatória dos compostos de interesse é necessário realizar uma etapa fundamental, o preparo de amostra[14], que inclui o isolamento e a concentração desses compostos, porém gera grande quantidade de resíduos. Diante disto, seguindo as diretrizes da Química Verde, iniciou-se o desenvolvimento de técnicas miniaturizadas de preparo de amostra[15], uma vez que, além de exigirem consumo mínimo de solvente orgânico, diminuindo, portanto, o custo, são rápidas, precisas, exatas e possíveis de serem automatizadas.

No entanto, às vezes, somente a utilização da técnica de preparo de amostra não é suficiente para a concentração do analito e limpeza da amostra, requerendo, portanto, técnicas analíticas sensíveis, seletivas, além de rápidas, de baixo custo e impacto para o ambiente e que garantam a detecção de analitos em baixos níveis de concentração.

Em relação ao monitoramento da qualidade do solo e das águas subterrâneas, a legislação brasileira é omissa. Muitos estudos ainda devem ser realizados, principalmente no que diz respeito ao solo, uma vez que cada tipo de agrotóxico interage diferentemente com essa matriz, dependendo das suas propriedades físico-químicas, das condições climáticas da região e do tipo de solo. Além disso, os agrotóxicos estão susceptíveis a uma variedade de transformações, podendo ocasionar a formação de produtos de degradação muitas vezes mais tóxicos que os de origem e difíceis de serem analisados em virtude de suas particularidades e da indisponibilidade de padrões analíticos desses compostos[12].

148

2 Agrotóxicos carbamatos Os agrotóxicos orgânicos sintéticos começaram a ser utilizados em grande escala na década de 1940, durante a Segunda Guerra Mundial, destacando-se os organoclorados, como o DDT (1,1,1-tricloro-2,2-di(ρ-clorofenil) etano), o aldrin, o dieldrin, o heptacloro e o toxafeno[16].

No entanto, o uso desses agrotóxicos tornou-se restrito no Brasil desde 1985 [17], devido à sua alta estabilidade no meio ambiente, ocasionando a contaminação das águas, solos e sedimentos; ao acúmulo desses agrotóxicos no meio ambiente, uma vez que se degradam lentamente; e à sua Scientia Chromatographica 2013; 5(2):146-162

Técnicas empregadas na determinação de agrotóxicos carbamatos em água e solo

elevada solubilidade em meio apolar, gerando a acumulação desses compostos nos tecidos adiposos dos organismos vivos[5].

Nesse contexto, os carbamatos foram rapidamente difundidos e utilizados mundialmente em substituição aos organoclorados, por serem compostos de baixo custo, ampla faixa de aplicação, combatendo insetos e ervas daninhas de diferentes espécies, e por serem menos persistentes no meio ambiente, degradando-se facilmente[5]. No entanto, seu uso desregrado e em grandes quantidades tem trazido efeitos adversos, contaminando o meio ambiente e afetando a saúde humana e animal.

Os carbamatos, compostos que possuem o grupo funcional -NHCOO- (Figura 1), são agrotóxicos altamente tóxicos para os seres vivos e difundem-se rapidamente no meio ambiente, uma vez que são solúveis em água. Além disso, são compostos polares e termicamente instáveis.

Em virtude de sua grande utilização na agricultura, embora menos persistentes no ambiente, esses agrotóxicos se acumulam no meio ambiente, principalmente nas águas superficiais (rios e lagos), subterrâneas e nos solos.

Além disso, os carbamatos possuem efeito tóxico

Morais EHC, Begnini FR, Jardim ICSF

agudo para os seres humanos e outros mamíferos, pois inibem a enzima acetilcolinesterase, além de serem agentes potencialmente carcinogênicos e mutagênicos. Esses agrotóxicos interagem com os centros ativos (grupos hidroxila) da enzima acetilcolinesterase, provocando a sua inativação e, consequente descontrole na transmissão de impulsos nervosos nos seres vivos, gerando uma série de efeitos, como convulsões e paradas respiratórias, devido o acúmulo do neurotransmissor acetilcolina[18]. Essa ação de inibição causada por esses agrotóxicos explica a sua alta eficiência no controle de pragas, principalmente para extinção de insetos indesejados em diversas culturas[19].

Nesse contexto, torna-se de extrema importância o desenvolvimento de metodologias para a análise desses compostos nas matrizes ambientais água e solo.

A Tabela 1 apresenta os principais agrotóxicos do grupo químico dos carbamatos e algumas de suas propriedades toxicológicas e físico-químicas, de acordo com a IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry) e a ANVISA.

3 Técnicas de preparo de amostra para determinação de resíduos de agrotóxicos carbamatos em água e solo Basicamente, os métodos utilizados para a determinação de agrotóxicos envolvem as seguintes etapas: homogeneização da amostra, extração, clean-up (limpeza para remoção dos interferentes), concentração dos analitos e determinação analítica, a partir de análise instrumental.

Figura 1 Representação esquemática da estrutura dos agrotóxicos carbamatos.

Scientia Chromatographica 2013; 5(2):146-162

A etapa de preparo de amostra, que envolve as quatro primeiras etapas acima, é de suma importância no desenvolvimento de uma metodologia analítica, pois além de permitir a extra-

149

Morais EHC, Begnini FR, Jardim ICSF

Técnicas empregadas na determinação de agrotóxicos carbamatos em água e solo

Tabela 1 Propriedades de alguns agrotóxicos carbamatos, de acordo com a IUPAC e a ANVISA. Carbamatos Fórmula química

Classificação toxicológicaa

SH2O (mg L–1)b

log Pc

pKa (25 °C)d

I

4.930

1,15

ND

Inseticida/Regulador de crescimento

II

9,1

2,36

10,4 (af)

Classe agronômica Inseticida/Acaricida/

Aldicarbe

C7H14N2O2S

Carbaril

C12H11NO2

Carbetamida

C12H16N2O3

Herbicida

-

3.270

1,78

11,3 (af)

Carbofurano

C12H15NO3

Inseticida/Nematicida/ Acaricida

I

322

1,8

ND

Cloroprofam

C10H12ClNO2

Herbicida/Regulador de crescimento

-

110

3,76

ND

Metiocarbe

C11H15NO2S

Inseticida

II

27

3,18

ND

Metomil

C5H10N2O2S

Inseticida/Acaricida

I

55.000

0,09

ND

Pirimicarbe

C11H18N4O2

Inseticida

II

3.100

1,7

4,4 (bf)

Profam

C10H13NO2

Herbicida/Regulador de crescimento

-

250

2,6

-

Propoxur

C11H15NO3

Inseticida/Acaricida

II

1.800

0,14

-

Nematicida

a

Classificação toxicológica de acordo com a ANVISA: I – extremamente tóxico, II – altamente tóxico e III – medianamente tóxico; bsolubilidade em água a 20 oC; clog P: logaritmo do coeficiente de partição octanol-água a pH 7 e 20 oC; dND: não dissocia; af: ácido fraco; bf: base fraca

ção dos analitos por um solvente orgânico, possibilita a remoção de interferentes da matriz, os quais podem afetar a concentração, a identificação e a quantificação dos analitos, uma vez que esses podem estar presente em baixas concentrações na matriz[20].

A extração líquido-líquido (Liquid-Liquid Extraction – LLE), baseada na partição da amostra entre duas fases imiscíveis, e a extração sólido-líquido (Liquid-Solid Extraction – LSE) são técnicas tradicionais empregadas na extração de agrotóxicos em amostras líquidas e sólidas, respectivamente, como água e solo[21]. Porém, são técnicas laboriosas, requerem grande quantidade de solventes orgânicos tóxicos, acarretam a extração de muitos interferentes da matriz e, consequentemente, se torna necessário realizarem-se etapas adicionais de clean-up e concentração dos analitos[12,22], desfavorecendo seu emprego.

A LSE por Soxhlet, desenvolvida em 1879[23], é atualmente pouco utilizada para solos, pois além 150

das desvantagens citadas acima, por utilizar altas temperaturas pode ocasionar a degradação de agrotóxicos termicamente lábeis[12]. Devido a essas limitações e às exigências cada vez maiores dos órgãos nacionais e internacionais, novas técnicas foram desenvolvidas e introduzidas, com o intuito de reduzir significativamente o consumo de solvente orgânico, o custo, o tempo no preparo de amostra e extração de interferentes, garantir o clean-up e a concentração dos analitos e melhorar a eficiência de sua extração[24]. As técnicas mais utilizadas e relevantes para determinação de resíduos de agrotóxicos em água e solo são descritas a seguir.

3.1 Extração assistida por micro-ondas e por ultrassom Várias técnicas têm sido aplicadas para extração de agrotóxicos do solo e cada uma apresenta suas vantagens e limitações.

Scientia Chromatographica 2013; 5(2):146-162

Técnicas empregadas na determinação de agrotóxicos carbamatos em água e solo

A LSE pode ser auxiliada com solvente, sob agitação e/ou aquecimento, para melhorar a eficiência de extração dos analitos, utilizando-se um micro-ondas ou um ultrassom, sendo conhecida como extração assistida por micro-ondas (Microwave-Assisted Extraction – MAE) ou extração por ultrassom (Ultrasonic Extraction – USE), respectivamente[22]. Ambas as técnicas foram desenvolvidas como alternativas à extração Soxhlet, sendo mais rápidas e requerendo menores quantidades de solvente.

A MAE pode ser realizada com o uso de um micro-ondas industrial ou caseiro, sendo muito empregada para determinação de resíduos de organofosforados em solo[25], mas principalmente para análise de carbamatos e agrotóxicos da classe herbicida[21]. De forma semelhante à técnica MAE, a USE utiliza solventes orgânicos ou misturas desses com água, com pH modificado ou não, visando melhorar a eficiência de extração. Além disso, apresenta a vantagem de poder ser realizada à temperatura ambiente, o que permite a determinação de compostos termolábeis[22].

A Tabela 2 mostra as principais vantagens e desvantagens das técnicas MAE e USE.

Morais EHC, Begnini FR, Jardim ICSF

Apesar das desvantagens, como necessidade de realização de etapas de clean-up do extrato e/ou concentração dos analitos, o ultrassom é muito utilizado para extração de agrotóxicos do solo pela boa eficiência de extração e, principalmente, pela disponibilidade dos materiais necessários e pelo equipamento utilizado ser simples e de baixo custo.

3.2 Extração em fase sólida A extração em fase sólida (Solid-Phase Extraction – SPE), extração líquido-sólido, foi introduzida em meados de 1970[26] e baseia-se nos mecanismos de separação da cromatografia líquida clássica (baixa pressão). é uma das técnicas de preparo de amostra mais utilizadas para determinação de agrotóxicos em matrizes ambientais, especialmente água[24], devido ao baixo consumo de solvente, se comparada à LLE e LSE, ao tempo reduzido para obtenção dos extratos, à facilidade de automatização e clean-up das amostras e, principalmente, por garantir a concentração dos analitos.

Basicamente, as etapas da técnica resumem-se na ativação e condicionamento do sorvente contido em um cartucho ou em um disco

Tabela 2 Vantagens e desvantagens das técnicas MAE e USE para amostras sólidas.

Técnica de extração

Vantagens • Rapidez • Baixo consumo de solvente

MAE

Desvantagens • Possibilidade de degradação de alguns compostos

• Extração de várias amostras simultaneamente • São necessárias etapas adicionais de cleanup e concentração dos analitos • Aumento de seletividade • Baixa eficiência de extração para compostos apolares • Possibilidade de degradação de alguns compostos (se a extração utilizar altas • Baixo consumo de solvente • Extração de várias amostras simultaneamente temperaturas) • São necessárias etapas adicionais de clean• Aumento de seletividade up e concentração do extrato • Equipamento simples • Rapidez

USE

• Baixo custo

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151

Morais EHC, Begnini FR, Jardim ICSF

Técnicas empregadas na determinação de agrotóxicos carbamatos em água e solo

impregnado com esse material[27], percolação da amostra/sorção dos analitos no sorvente, lavagem do sorvente para remoção dos interferentes (clean-up), eluição dos analitos, utilizando-se solventes orgânicos adequados, e posterior concentração dos compostos de interesse, quando necessário, para submetê-los a análise instrumental[26,28]. Os extratos obtidos, na maioria das vezes, são analisados por cromatografia líquida (Liquid Chromatography – LC) ou por cromatografia gasosa (Gas Chromatography – GC)[29], acopladas a um detector apropriado. É uma técnica muito versátil devido à grande disponibilidade de sorventes, como octil (C8), octadecil (C18), sílica gel, carvão ativado ou grafitizado, polímeros, como o copolímero de estireno entrecruzado com divinilbenzeno, entre outros, sendo que a escolha da fase sólida depende das características dos analitos e dos interferentes da matriz[26]. Em análises ambientais, particularmente no isolamento e pré-concentração de agrotóxicos presentes em águas, os sorventes hidrofóbicos não seletivos, como C18 e estireno divinilbenzeno, são os mais empregados[24]. Além disso, diferentes sorventes podem ser utilizados em conjunto para a extração de uma mesma amostra, aumentando-se a eficiência da extração.

Apesar das várias vantagens, a técnica de extração em fase sólida apresenta algumas limitações, como: cartuchos de custo elevado e descartáveis, em virtude da ocorrência do efeito de memória (dessorção incompleta dos analitos do cartucho, interferindo em outras análises), requer consumo significante de solventes, embora em menor quantidade que as técnicas clássicas; apresenta dificuldade de seleção do(s) sorvente(s) e do(s) solvente(s) que serão utilizados, principalmente quando se trabalha com analitos de diferentes propriedades; e dificuldades no emprego em matrizes sólidas, como 152

solo, já que essas provocam a saturação dos sítios adsorventes ou bloqueiam os poros do sorvente, resultando em extrações ineficientes[30].

Dependendo da complexidade da matriz e das características e concentrações dos compostos de interesse, os sorventes convencionais de SPE podem ser inadequados, devido à sua baixa seletividade, o que pode acarretar retenção e posterior eluição simultânea das substâncias interferentes e de interesse de polaridades similares. No entanto, essa dificuldade pode ser contornada através do uso de polímeros de impressão molecular (Molecularly Imprinted Polymers – MIP), também chamados de materiais biomiméticos[31], como sorventes seletivos para SPE. A impressão molecular é uma tecnologia capaz de produzir polímeros dotados de sítios específicos de reconhecimento, preparados a partir de uma molécula molde, por exemplo, o agrotóxico de interesse. Para a síntese dos MIP, o analito utilizado como molde, denominado template, é adicionado a uma solução contendo monômeros apropriados. Por meio de ligações covalentes, iônicas, ou interações intermoleculares, as moléculas molde interagem estrategicamente em posições específicas e complementares com as moléculas do monômero funcional. Em seguida, pela adição de um agente reacional, que promove ligações cruzadas entre as moléculas do monômero e de um indicador radicalar, responsável por gerar radicais reativos, inicia-se a reação de polimerização em torno do template.

Após o término dessa reação, o template é removido, por meio de solvente ou clivagem química, da matriz polimérica, e essa é usada como um meio seletivo de ligação para a molécula molde ou compostos estruturalmente semelhantes[31-34].

O emprego do MIP como material sorvente em SPE, técnica conhecida como extração em fase sólida molecularmente impressa (Molecularly Scientia Chromatographica 2013; 5(2):146-162

Técnicas empregadas na determinação de agrotóxicos carbamatos em água e solo

Imprinted Solid-Phase Extraction – MISPE), vem se destacando, pois oferece alto grau de seletividade.

Os procedimentos realizados com MISPE não diferem dos da técnica de SPE, no entanto a espécie de interesse fica retida seletivamente quando se utiliza o MIP como sorvente. Uma etapa de clean-up, com solvente apropriado, é realizada com a finalidade de extrair os componentes interferentes ligados ao MIP por interações não específicas, formadas devido ao excesso de monômeros no meio reacional de produção do polímero. Na etapa final, pela adição de um solvente adequado no cartucho, o analito é eluído na ausência dos interferentes. Portanto, a técnica MISPE garante, além de clean-up das amostras, devido à alta seletividade, a concentração do composto de interesse[34-36].

No entanto, a técnica MISPE apresenta algumas limitações, uma vez que, durante a síntese do MIP, algumas moléculas molde podem não ser removidas e, consequentemente, há formação de polímeros irregulares, com baixa afinidade com os analitos. Além disso, após a interação dos compostos de interesse com a superfície do MIP, a remoção rápida e quantitativa desses pode ser ineficiente, uma vez que os analitos possuem elevada afinidade com esse tipo de sorvente[37].

4 Técnicas miniaturizadas de preparo de amostra para determinação de resíduos de agrotóxicos carbamatos em água e solo Na década de 1990 surgiu um novo conceito denominado Green Chemistry, Química Verde, cujos princípios básicos são extinguir ou minimizar a utilização ou geração de substâncias prejudiciais à saúde humana e ao meio ambiente[38]. A partir disso, iniciaram-se várias Scientia Chromatographica 2013; 5(2):146-162

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pesquisas com o objetivo de desenvolver novas técnicas analíticas ambientalmente corretas[15].

Dentre as técnicas miniaturizadas de preparo de amostra para determinação de agrotóxicos carbamatos, destacam-se a microextração em fase sólida (Solid-Phase Microextraction – SPME) e a microextração em fase líquida (Liquid-Phase Microextraction – LPME).

4.1 Microextração em fase sólida A microextração em fase sólida, SPME, desenvolvida no início da década de 1990 por Arthur e Pawliszyn[39], é uma técnica que supera as desvantagens e limitações, do ponto de vista analítico e ambiental, apresentadas pelas técnicas LLE, LSE e SPE. Além disso, é uma técnica que permite extrair e concentrar simultaneamente os analitos de amostras, incluindo as complexas, como as de solo[40,41].

A técnica baseia-se na sorção dos analitos em uma fibra de sílica fundida quimicamente modificada, revestida por um filme de material sorvente, como poli(dimetilsiloxano), poliacrilato, MIP, entre outros, e na dessorção deles em uma fase líquida, para análise por cromatografia líquida ou na dessorção térmica no injetor de um cromatógrafo a gás, sendo essa última mais comum e ambientalmente correta, já que elimina completamente o uso de solventes orgânicos[29,42].

Existem dois modos principais de operação em SPME: a extração direta e a extração via headspace (HS-SPME). Na extração direta, a fibra é exposta e inserida diretamente na amostra líquida ou gasosa, e, após certo tempo, necessário para que se estabeleça um equilíbrio entre as fases envolvidas, a fibra é reposicionada para o interior da agulha, para posterior dessorção. Na extração via headspace, a fibra é exposta sobre a amostra líquida ou sólida, aquecida e sob agitação, não havendo interação entre elas, fato que prolonga a vida útil da fibra. Após estabelecido 153

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Técnicas empregadas na determinação de agrotóxicos carbamatos em água e solo

o equilíbrio entre a fase vapor, contendo os analitos voláteis, e a amostra, a fibra é recolhida[15].

Portanto, esse último modo de operação da SPME só é aplicado para determinação de analitos de volatilidade média e alta e termicamente estáveis, o que origina uma limitação de uso[26].

A quantidade de analito adsorvido na fibra, após atingido o equilíbrio de sorção, está linearmente relacionada à concentração inicial do soluto na amostra, permitindo a análise quantitativa. É importante destacar que se pode trabalhar fora das condições de equilíbrio, principalmente nos casos em que o tempo de extração é muito longo. No entanto, as condições de extração devem ser bem controladas para garantir a precisão e a exatidão da técnica.

Quando os analitos são retirados da fibra usando-se um solvente orgânico, como a acetonitrila, a dessorção pode acontecer por dois modos, dinâmico ou estático[42]. No primeiro, os analitos estão fracamente adsorvidos na fibra e a dessorção ocorre pela passagem da fase móvel.

No modo estático, utilizado quando os compostos estão fortemente adsorvidos, a fibra é mergulhada na fase móvel ou em outro solvente por um determinado período de tempo[26].

Alguns parâmetros experimentais devem ser otimizados e controlados na SPME, como: material sorvente, temperatura e tempo de extração, velocidade de agitação, pH, força iônica do meio, tempo de dessorção e volume de amostra[26,43].

A microextração em fase sólida apresenta algumas limitações, como: obtenção de baixas porcentagens de recuperação, não reprodutibilidade do revestimento da fibra em diferentes lotes, instabilidade da fibra devido à exposição a solventes orgânicos e/ou a temperaturas elevadas (acima de 280 °C), fragilidade e custo elevado da fibra e possibilidade de ocorrência do efeito de memória.

154

4.2 Microextração em fase líquida A microextração em fase líquida, LPME, é uma miniaturização da LLE e engloba diferentes técnicas de extração que utilizam pouca quantidade de solventes, sendo a microextração em fase líquida com fibras ocas (Hollow Fiber Liquid Phase Microextraction – HF-LPME), também denominada de membrana líquida suportada em fibra oca (Hollow Fiber Supported Liquid Membrane – HFSLM), e a microextração líquido-líquido dispersiva (Dispersive LiquidLiquid Microextraction – DLLME)[44] as técnicas mais empregadas para a determinação de agrotóxicos carbamatos em amostras ambientais.

4.2.1 Microextração em fase líquida com fibras ocas A técnica microextração em fase líquida com fibras ocas foi inicialmente desenvolvida por Pedersen-Bjergaard e Rasmussen em 1999[45]. Fundamentalmente, os poros de uma membrana capilar porosa e hidrofóbica (fibra oca) são impregnados com um solvente orgânico de extração e o seu interior é preenchido com microlitros de uma fase aceptora aquosa ou orgânica. Essa fibra é imersa na matriz aquosa contendo os compostos de interesse, denominada fase doadora, sem que haja contato direto entre a fase aceptora e a amostra, sendo também possível aplicar agitação constante durante o processo de extração[46,47].

Essa técnica é controlada por equilíbrios de partição, podendo ser empregada em dois modos diferentes, dependendo da natureza da fase aceptora e das características dos analitos a serem extraídos. Para compostos de caráter hidrofóbico, a técnica HF-LPME em duas fases é utilizada, sendo a fase aceptora composta pelo mesmo solvente orgânico imobilizado nos poros da membrana. Para analitos com funções ácidas ou básicas, a configuração em três fases é a Scientia Chromatographica 2013; 5(2):146-162

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mais utilizada, sendo a fase aceptora uma solução aquosa com pH controlado. Nessa última configuração, os analitos devem estar em sua forma não ionizada na solução doadora, a fim de interagirem com a membrana orgânica e atingirem a fase aceptora, que por sua vez ionizará os analitos, impedindo-os de retornarem à solução doadora.

A HF-LPME promove a concentração dos analitos e o clean-up das amostras, fazendo com que macromoléculas não atinjam o interior das fibras, além de ser possível de ser automatizada.

Para o desenvolvimento de um método empregando a HF-LPME, diferentes parâmetros são importantes, como o ajuste do pH da amostra e da solução aceptora, o tempo e a temperatura de extração, a composição da solução aceptora, a agitação do sistema e a seleção do tipo de solvente orgânico, que deve ser pouco solúvel em água e de baixa volatilidade.

A HF-LPME também é empregada em duas configurações principais, sem que haja necessidade de nenhuma instrumentação específica: a configuração em U, que utiliza duas microsseringas conectadas à fibra (mais empregada), e a configuração tipo haste, que utiliza somente uma microsseringa para injetar e coletar a fase aceptora[48].

As principais vantagens dessa técnica são: baixo custo de cada unidade de extração, o que possibilita o seu uso uma única vez, evitando problemas de contaminação; obtenção de altas porcentagens de recuperação; utilização de pouca quantidade de solventes orgânicos; rapidez; e elevada flexibilidade, que permite a criação de diferentes unidades extratoras.

No entanto, a HF-LPME também apresenta algumas limitações, como a dificuldade de se analisar compostos altamente polares e hidrofílicos, sendo necessário adicionar agentes carreadores na amostra, a fim de aumentar a permeabiScientia Chromatographica 2013; 5(2):146-162

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lidade dos analitos na membrana hidrofóbica, e a redução da precisão do método, ocasionada pela operação manual do procedimento de preparo das unidades extratoras.

4.2.2 Microextração líquido-líquido dispersiva A microextração líquido-líquido dispersiva, DLLME, foi desenvolvida em 2006 por Rezaee et al.[49], primeiramente para ser empregada na determinação de compostos orgânicos em água, por cromatografia gasosa com detecção por ionização em chama. A DLLME consiste nos mesmos princípios da extração líquido-líquido, baseada nos coeficientes de partição do analito no solvente extrator e na solução da amostra, porém em escala miniaturizada, com a utilização de pequeno volume de solventes.

A técnica fundamenta-se na injeção rápida, em um recipiente contendo a amostra aquosa e os compostos de interesse, de uma mistura de solvente extrator (geralmente de maior densidade e pouco miscível em água) e solvente dispersor (miscível em água e no solvente extrator), sendo esse último responsável pela dispersão do primeiro e, consequentemente, pelo grande contato com a solução contendo os analitos. Após agitação branda forma-se uma mistura turva com microgotas, constituídas pelo solvente extrator e compostos de interesse. Posteriormente, a solução é centrifugada, ocorrendo a deposição das microgotas, que são removidas e submetidas à análise por técnica instrumental apropriada[49,50].

O processo de extração por DLLME é influenciado por alguns parâmetros, entre os quais volume e tipo dos solventes extrator e dispersor, tempo de extração, tempo e velocidade de centrifugação, força iônica (que influencia na separação das fases) e pH da amostra, que devem ser otimizados para maximizar a recuperação dos compostos de interesse.

155

Morais EHC, Begnini FR, Jardim ICSF

Técnicas empregadas na determinação de agrotóxicos carbamatos em água e solo

Na extração de agrotóxicos em água por DLLME, os solventes extratores mais utilizados são os clorados, pois são imiscíveis em água e de maior densidade. No entanto, a elevada toxicidade desses solventes levou à introdução de líquidos iônicos como solventes alternativos, originando-se a IL-DLLME (Ionic Liquid Dispersive Liquid-Liquid Microextraction)[51].

Liu et al.[52] utilizaram a DLLME para determinação de inseticidas em água, sendo que o solvente orgânico extrator foi substituído pelo líquido iônico hexafluorfosfato de 1-hexil-3-metilimidazólio. Para a escolha do solvente dispersor, a principal característica a ser considerada é a sua miscibilidade na fase orgânica (solvente extrator) e na fase aquosa, sendo mais comum o uso de metanol e acetonitrila.

As vantagens da DLLME em relação às técnicas convencionais de extração com solventes são: fácil manipulação, devido à simplicidade de operação, rapidez, baixo custo, principalmente pelo consumo reduzido de solventes orgânicos, obtenção de altas recuperações, compatibilidade com as análises cromatográficas, entre outras.

No entanto, a técnica apresenta dificuldade de automatização, devido à necessidade de etapas para separação de fases, e não isola os analitos dos coextrativos solúveis no solvente extrator, o que pode ocasionar erros na quantificação e afetar a exatidão e precisão dos resultados devido ao efeito matriz[53,54].

5 Aplicações de métodos para determinação de resíduos de agrotóxicos carbamatos em água e solo Nos últimos anos, vários estudos e determinações de resíduos de agrotóxicos carbamatos em amostras de interesse ambiental (água e 156

solo) empregando diferentes técnicas de preparo de amostra têm sido relatadas na literatura, conforme descrito na Tabela 3.

Como se pode observar na Tabela 3, as microextrações em fase líquida, como a microextração líquido-líquido dispersiva e a microextração em fase líquida com fibras ocas, têm se destacado para a análise de água, uma vez que fornecem resultados exatos e precisos, atingem baixos limites de detecção e quantificação, fornecem elevadas porcentagens de recuperação, consomem pequeno volume de solventes e permitem a eliminação de interferentes e a concentração dos analitos. Em relação à análise de carbamatos em solos, a extração por ultrassom, com o auxílio de solventes, tem se destacado, uma vez que é eficiente e rápida, permitindo alcançar elevadas porcentagens de recuperação e baixos limites de detecção e quantificação.

6 Conclusões O uso intenso de agrotóxicos na agricultura tem causado grandes impactos em virtude da mobilidade desses compostos no meio ambiente, contaminando o solo, as águas subterrâneas, os rios e lagos. Em virtude disso, torna-se indispensável o desenvolvimento constante de metodologias para monitoramento de agrotóxicos nessas matrizes.

Através dessa revisão foi possível abordar as principais técnicas desenvolvidas para a determinação de resíduos de agrotóxicos carbamatos em amostras de água e solo, destacando-se a utilização de técnicas modernas e eficientes de preparo de amostra.

A técnica tradicional de extração em fase sólida é comumente utilizada para determinação de agrotóxicos em água e solo, pois atende às exigências de uma análise a nível de traços, devido à concentração e ao clean-up das amostras. Dentre Scientia Chromatographica 2013; 5(2):146-162

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Água

Água

Água

Água

Água

Água

Água

Água

Água

Água

1

3

3

6

4

5

4

5

1

1

2) 10

2) SPE

-

Extração com solvente

-

-

-

USE e SPE

USE

-

-

-

1) 1-8

1) HFSLM LLE

-

57-138

SPME

10-25

LPME automatizada

-

-

-

80-177

101-145

148-189

70,7

37-144

3) 500

2) 31,2

Fator de concentração

IL-DLLME

IL-DLLME

DLLME

-

DLLME

DLLME

DLLME

DLLME

HF-LPME

3) SPE

2) SPE-SPME

1) SPME

Técnica de preparo de amostra

-

0,45-1,40 µg L–1

LC-FLD

LC-UV

LC-FLD

Biossensor

Biossensor

GC-MS

–1

0,21-1,12 ng g–1

0,01-0,4 ng g–1

1,6-3,7 µg kg

10 µg L–1

5,32.10 g L

–1

0,84-4,47 ng g–1

0,03-1,20 ng g–1

10 µg kg

-

-

7-28 ng L–1

2-9 ng L–1 –8

-

0,64-2,0 ng L–1

-

-

–1

0,04-1,5 ng L–1

GC-MS/ MS LC-MS

0,05-0,1 µg L–1

2-40 µg L -

-

0,1-0,5 µg L–1 –1

-

1.10–12 g L–1

0,1-0,5 ng mL -

1,3-3,3 ng mL–1

0,4-1,0 ng mL–1 –1

-

-

-

0,1-0,9 µg L–1

1,0 ng mL

–1

0,2-0,8 µg L–1

3) 0,020-0,038 µg L

0-121,1

93-110

82-99

-

-

79,2-117,3

2) 8-98

1) 8-58

70,8-125

81-125

87-116

82,6-108,7

63,45-105,30

99,8

86,0-97,2

76-94

74,2-94,4

> 90

83,04-127,93

0,1-38

5-11

0,4-10

2,3-3,4

2,3-3,9

2,61-15,0

1) 0,02-1,46

1,0-9,0

1,0-6,0

0,6-10,2

1,0-1,8

2,18-5,06

2,7

3,5-8,7

4,7-6,5

1,8-4,6

2,6

4,86-7,81

3) 15

2) 10-21

–1

2) 64-85

Precisão DPRc (%) 1) 10-17

-

Exatidão Recup.b (%)

2) 0,05-0,46 µg L–1

Limite de quantificação

1) 0,6-19 µg L–1

Limite de detecção

GC-MS

LC-UV

LC-DAD

LC-UV

Biossensor

LC-DAD

LC-DAD

LC-UV

LC-DAD

GC-MS

GC-MS

Técnica de análisea

73

72

71

70

69

68

67

66

65

64

63

62

61

60

59

58

57

56

55

Ref.d

a GC-MS (Gas Chromatography-Mass Spectrometry): cromatografia gasosa-espectrometria de massas; LC-DAD (Liquid Chromatography-Diode Array Detector): cromatografia líquidadetector por arranjo de diodos; UV: detector por ultravioleta; FLD (Fluorescence Detector): detector por fluorescência; bRecup.: porcentagem de recuperação; cDPR: desvio-padrão relativo; dRef.: referência.

Solo

Água

5

10

Água

4

Solo

Água

3

Solo

Água

1

6

Água

5

6

Água

7

Número de Amostra carbamatos

Tabela 3 Levantamento bibliográfico das técnicas de preparo de amostras empregadas na determinação de carbamatos em água e solo.

Técnicas empregadas na determinação de agrotóxicos carbamatos em água e solo Morais EHC, Begnini FR, Jardim ICSF

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Morais EHC, Begnini FR, Jardim ICSF

Técnicas empregadas na determinação de agrotóxicos carbamatos em água e solo

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as tendências observadas na literatura, destacam-se os polímeros de impressão molecular (MIP), novos materiais utilizados como sorvente na SPE, que proporcionam aumento da seletividade.

A microextração em fase sólida, apesar de ser uma técnica ambientalmente segura, utiliza fibras que, dependendo do material, são relativamente caras, além dos parâmetros de extração e dessorção terem de ser rigorosamente otimizados para garantir a precisão dos resultados, já que na maioria dos casos trabalha-se fora das condições de equilíbrio. Além disso, é uma técnica por meio da qual são obtidas baixas recuperações.

Do ponto de vista econômico e ambiental, a microextração líquido-líquido dispersiva, miniaturização da extração líquido-líquido, apresenta várias vantagens em relação às técnicas convencionais de extração por solvente, como simplicidade de operação, rapidez, baixo custo devido ao baixo consumo de solvente orgânico, alta recuperação, fator de concentração elevado e compatibilidade com as técnicas cromatográficas.

Agradecimentos

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